Rekombinant Chlamydomonas reinhardtii suşları kullanılarak ısı şoku yanıtına bazı fiziksel ve kimyasal parametrelerin etkisinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada ısı şok yanıtında etkili olduğu düşünülen çeşitli kimyasal ve fiziksel parametreler moleküler araçlardan faydalanılarak C.reinhardtii üzerinde araştırılmıştır. Sürekli ekspresyona sahip 160 adet, ısıyla indüklenebilir ekspresyona sahip 96 tadet olmak üzere toplamda 256 adet transformant elde edilmiş ve bu transformantlar ARS aktivitesi bakımında kalitatif ve kantitatif olarak taranmıştır. Çalışmalara seçilen βTub II-32 ve HSP70A III-1 transformantları ile devam edilmiştir. Fiziksel parametre olarak sıcaklık, ışık şiddeti ve UV-B radyasyonun, kimyasal parametre olarak ise tuzluluğun, kalsiyumun ve kalsiyum şelatlayıcıları ve bloklayıcıların etkisi araştırılmıştır. Sıcaklığın etkisini incelemede hücreler 23 °C'den 35 °C, 37 °C, 40 °C ve 42 °C'ye kaydırılmış ve hücrelerin 35°C' ye dahi çıkarıldığında ısı şok yanıtının indüklendiği görülmüştür. Kalsiyumun 100 mM'ın üstünde ARS aktivitesini arttırdığı belirlenmiştir. Kalsiyum şelatlayıcıları olan EGTA ve BAPTA varlığında ısı stres yanıtının tetiklendiği gözlenmiştir. 100 µM lantan ve 250 µM gadolinyumun yükselen ARS aktivitesini düşürmede etkili olduğu saptanmıştır. Ancak verapamilin etki göstermediği belirlenmiştir. 2 000 lux ve üzeri ışık şiddetinin ise ARS aktivitesini arttığı saptanmıştır. UV-B uygulamasının ve tuzluluğun ARS aktivitesine herhangi bir etkisi bulunmamıştır. Tüm ARS enzim aktivite sonuçları RT-qPCR sonuçları ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilmiş, paralel sonuçlar elde edildiği görülmüştür. Rekombinant C. reinhardtii ile elde edilen bu veriler bitki stresi ve ekolojik çalışmalar için önem taşıyabilir.

In this study, various chemical and physical parameters which could be effective in heat shock response were investigated on C.reinhardtii by using molecular tools. In total 256 transformants were obtained, among them 160 transformants had continuous expression while 96 of them had heat-inducible expression and these transformants were screened for ARS activity qualitatively and quantitatively. Further studies were performed with selected transformants βTub II-32 and HSP70A III-1. As physical parameters the effect of temperature, light intensity and UV-B radiation; as chemical parameters salinity, calcium and calcium chelators and blockers were investigated. To investigate the effect of temperature, the cells were shifted from 23 °C to 35 °C, 37 °C, 40 °C and 42 °C. The heat shock response was induced even at 35 °C. It was determined that above 100mM of calcium concentration ARS activity was increased. In the presence of calcium chelators EGTA and BAPTA, heat stress response was triggered. 100µM lanthanum and 250 µM gadolinium were found effective in decreasing ARS activity. However, verapamil was not effective. It was found that light intensity of 2 000 lux and above increased ARS activity. UV-B and salinity had no effect on ARS activity. All ARS enzyme activity results were compared with the results of RT-qPCR and partially parallel results were obtained. These data obtained with recombinant C. reinhardtii might be important for plant stress and ecological studies.