Poli (etilen glikol dimetakrilat-n-vinil imidazol) polimerine α-amilaz ve invertaz enzimlerinin immobilizasyonu

Abstract

Endüstriyel işlemlerde katalizör olarak immobilize enzimlerin kullanımı son zamanlarda büyük önem kazanmıştır. Endüstriyel uygulamalarda immobilize enzimlerin kullanılması kontrollü ürün oluşumu, elde edilen ürünlerin kolayca izole edilebilmesi ve tekrar kullanım gibi işlemi daha ekonomik hale getiren bir çok avantaj sağlamaktadır. Enzim immobilizasyonu için adsorbsiyon, polimerik jeller yada membranlar içerisine hapsetme, bifonksiyonel bir madde ile çapraz bağlama yada kovalent bağlama gibi bir çok kimyasal ve fiziksel metod kullanılmaktadır. Bunlar arasında polimerik matriks üzerine adsorbsiyon yapılması en eski ve en genel tekniktir. Bu tekniğin en önemli avantajları immobilize edilen enzimin aktifliğini büyük ölçüde veya tamamıyla koruması ve tersinir bir metod olduğundan destek maddesinin ve enzimin başka amaçlarla tekrar kullanımına imkan sağlamasıdır. Çalışmamızda ; a-amilaz ve invertaz enzimlerinin, Cu(H) iyonlarımın adsorbsiyonu ile hazırlanmış (poli(etilen glikol dimetakrilat N- vinil imidazol) poli (EGDMA- VIM)-Cu(II) şelat matriks üzerine immobilizasyonu hedeflenmiştir. Cu(H) iyonları şelat oluşturucu ligand olan VIM üzerine koordine olmuş ve enzimler polimerik matrikse, Cu(II) iyonları aracılığı ile bağlanmıştır. a-amilaz enzimi için poli (EGDMA-VIM) ve poli (EGDMA-VIM)-Cu(II) mikrokürelerinin protein bağlama kapasiteleri, immobilize enzim aktivitesi, immobilize enzimin tekrar kullanım ve depolanma özellikleri araştırıldı, immobilize a-amilaz için maksimum aktiflik %32.1, poli (EGDMA-VIM) ve poli (EGDMA-VIM)-Cu(II) mikrokürelerinin protein bağlama kapasitesi ise sırasıyla %54 ve %86 olarak belirlendi. Ayrıca immobilize enzimin başlangıçtaki aktifliğinin %50.4'ünü koruyarak 8 kez tekrar kullanılabildiği ve 20 günlük depolama süresi sonunda aktifliğini % 57 koruduğu gözlendi. İnvertaz enzimi için poli (EGDMA-VIM)-Cu(II) mikrokürelerinin protein bağlama kapasitesi, protein bağlama kapasitesine pH etkisi, serbest ve immobilize invertaz aktivitesine pH, sıcaklık gibi değişkenlerin etkisi, serbest ve immobilize invertazm depolanma kararlılıkları ve immobilize enzimin tekrar kullanım özellikleri incelendi. İnvertaz enziminin maksimum protein bağlanma kapasitesi 35.5 mg/g olup pH 4,5 'da gerçekleşti. Serbest enzim pH 4,5 'da maksimum aktivite gösterirken immobilize invertaz için bu değer pH 5.0 olarak belirlendi. Sıcaklık etkisi incelendiğinde ise hem serbest hemde immobilize invertazm 55 °C 'de maksimum aktivite gösterdiği tespit edildi. Immobilize invertaz enziminin başlangıçtaki aktivitesinin % 67 'sini koruyarak 6 kez tekrar kullanılabildiği ve 1 ay depolama süresince aktivitesini %99 koruduğu gözlendi.

Recently, there is an increasing trend in use of immobilized enzyme as catalysts in industrial proseses. In industrial applications, immobilized enzymes have general advantages which decrease process costs such as controlled product formation, easy seperation of the formed product and reusability. Many different procedures have been developed for enzyme immobilization : these include adsoption to insoluble materials, entrapment in polymeric gels, encapsulation in membranes, crosslinking with a bi&nctional reagent, or covalent linking to an insoluble carrier. Among these, adsorption to a solid support material is the most general and oldest protocol of physical immobilization methods. The most important advantages of this immobilization method are that the stability of enzyme activity after immobilization and reuse of the enzyme and support material for different purposes because of reversibility of the method. In our study, a-amylase and invertase were immobilized Cu(II)-chelated poly (EGDMA-VIM) (poly (ethyleneglycol dimethacrylate N-vinyl imidazole)). Cu (II) ions coordinate to the vinyl imidazole chelating-ligand and the enzyme binds the polymer via the chelated-metal ions. For a-amylase, protein coupling efficiency of poly (EGDMA-VIM) and Cu(II)- chelated poly (EGDMA-VIM) microspheres, immobilized enzyme activity, reuse and storage capability of immobilized enzyme were investigated. Maximum activity of immobilized enzyme was determined 32.1%, protein coupling efficiency of poly (EGDMA-VIM) and Cu(II)- chelated poly (EGDMA-VIM) microspheres was found 54% and 86%, respectively. In addition, it was observed that 50.4% of the original activity was preserved when immobilized a-amylase was used repeatedly 8 times and 57% retained activity was obtained after 20 days at storage. For invertase, protein coupling efficiency of Cu(H)-chelated poly (EGDMA-VIM) microspheres, effect of pH on protein coupling efficiency, effect of pH and temperature on free and immobilized invertase, reuse and storage capability of immobilized enzyme were investigated. Maximum protein coupling efficiency was 35.5 mg/g and determined at pH 4,5. While optimum pH was 4,5 for free enzyme, maximum activity for immobilized enzyme was observed at pH 5. Both free and immobilized invertase had same optimum temperature at 55°C. In addition, it was observed that 67 % of the original activity was preserved when immobilized invertase was used repeatedly 6 times and 99% retained activity was obtained after 20 days at storage.