Deneysel fekal peritonit oluşturulan sıçan beyinlerinde apoptotik değişikliklerin incelenmesi

Abstract

Sepsis, yoğun bakım ünitelerinde yatan hastaların %14-37’sinde görülmekte ve günümüzdeki ilerlemiş tıbbi tedavi olanaklarına rağmen hala korkulan bir sağlık problemi olma özelliğini sürdürmektedir. Sepsis tanısı konan yoğun bakım hastalarının %8 ila 70’inde ise sepsisle ilişkili ensefalopati (SİE) gelişmektedir. Çalışmamızda yaygın bir sepsis modeli olarak uygulanan çekal ligasyon ve perforasyon (ÇLP) yöntemi kullanılarak sıçanlarda oluşturulan septik tabloda vital parametrelerin, kan tablosu ve kan kültürü sonuçlarının, beyin elektriksel aktivitesinin ve beynin değişik bölgeleri üzerinde apoptotik hücre ölümleri açısından oluşturduğu etkilerin araştırılması ve insanlarda görülen tablo ile olan benzerlik ve farklılıkların irdelenmesi amaçlandı. Bu amaçla 24 erkek Wistar sıçanı kullanıldı ve ÇLP, sham-opere ve opere edilmeyen kontrol grubu olmak üzere üç ayrı gruba ayrıldı. Vital parametreler her üç deney grubunda 0, 2, 6, 12 ve 24. saatleri kapsayacak şekilde non invaziv olarak monitorize edildi. Eş zamanlı olarak, beyin elektriki aktivitesinin değerlendirilmesi amacı ile her üç gruptaki deney hayvanlarının Elektrokortikografik (ECoG) ve Somatosensoriyel Uyarılmış Potansiyel (SEP) kayıtları alındı. Ayrıca operasyon sonrası 24. saatte çıkarılan beyinlerden elde edilen parafin kesitler, TUNEL yöntemine ek olarak kaspaz-3 ve transglutaminaz immunohistokimya yöntemleri ile işaretlenerek gyrus dentatus (DG), cornu ammonis (CA), subventriküler bölge (SVZ) ve çeşitli otonomik merkezlerdeki apoptotik değişiklikler araştırıldı. ÇLP grubunda, kontrol ve sham grublarıyla karşılaştırıldığında çalışmanın 24. saatinde kan basıncında belirgin bir düşme ve kalp atım hızında ise bunun tersi olarak artış gözlendi. Deney hayvanlarından elde edilen ECOG kayıtları, ÇLP grubunda spektral edge frekansı (SEF95) ve medyan frekans (MF) değerlerinde bir miktar azalmayı ve delta aktivitesinde artışı gösterirken; SEP kayıtlarında ise U-P1 ve N1-P2 mesafelerinde uzama ve P1 dalgasına ait amplitüdde düşüş gözlendi. ÇLP grubunda pozitif kan kültürü sonuçlarının yanı sıra trombositopeni ve artmış kan laktat seviyeleri gözlendi. İmmünohistokimyasal boyama sonuçlarına bakıldığında ise ÇLP grubunda TUNEL yöntemiyle işaretlenen apoptotik hücre sayısının median preoptik nükleus (MnPO), subventriküler bölge (SVZ), gyrus dentatus (DG), cornu ammonis-1 (CA1) ve cornu ammonis-3 (CA3) alanlarında anlamlı oranda yüksek olduğu belirlendi. Bununla birlikte nucleus tractus solitarius (NTS), ventroposterior parvosellüler nükleus (VPPC), anteroventral periventriküler nükleus (AVPC), granüler insular korteks (GI), agranüler insular korteks (AGI), perifornikal nükleus (PeF), zona inserta (ZI), dorsomedial hipotalamik nükleus (DMD) ve rostral ventrolateral medulla (RVLM)’da ise TUNEL pozitif hücre sayısı açısından gruplar arasında anlamlı bir farklılık saptanmadı. Kesitlerin kaspaz-3 immünohistokimya boyaması sonucu ÇLP grubunda, TUNEL boyamasını destekler şekilde SVZ, median preoptik nükleus, CA1 ve CA3 alanlarında kaspaz-3 ve transglutaminaz immünohistokimya yöntemiyle pozitif boyanmanın olduğu görüldü. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, sıçanlarda uygulanan ÇLP modelinin yaklaşık olarak 24 saatlik dönem açısından sepsisli hastalarda ortaya çıkan klinik sepsis tablosuna benzerlik gösterdiğini ortaya koymaktadır. Buna ek olarak immünohistokimyasal yöntemlerle boyanmış histolojik kesitlerden elde edilen veriler doğrultusunda SİE’deki patofizyolojik değişikliklerde en azından SVZ, DG, CA1, CA3 ve MNPO alanları için apoptotik hücre ölümlerinin de rol oynayabileceğine ilişkin önemli deliller elde edilmiştir. Mevcut çalışmanın sonuçları, beyinde gerçekleşen apoptotik hücre ölümlerinin engellenmesine yönelik tedavi yaklaşımları sayesinde sepsisli hastaların beyin fonksiyonlarında düzelme ve mortalitede ise azalma sağlayabileceğini düşündürmektedir.Sepsis occurs in 14-37% of patients admitted to non-cardiac intensivecare units and despite substantial recent progress in medical treatment; itcontinues to be a serious clinical challenge. Sepsis AssociatedEncephalopathy (SAE) occurs in 8 to 70% of all critically ill patients sufferingfrom sepsis. The primary aim of this study is to characterize the cecal ligationand puncture (CLP) model, which is one of the most widely used models ofsepsis, and define its similarities to and differences in human disease usingthe vital and hematologic parameters, blood cultures and brain electricalactivity as well as investigating the apoptotic effect of CLP on the differentbrain regions. For this aim, 24 male Wistar rat divided into the three groups;CLP, sham operated and non-operated control groups, were used.Noninvasive methods were used for the monitorization of vital parameters at0, 2, 6, 12 and 24 hours for all three groups. Electrocorticographic (ECoG)and somatosensorial evoked potentials (SEP) were further recorded foranalysis of the brain electrical activity at corresponding times. Furthermore,apoptotic cell death in the dentate gyrus (DG), cornu ammonis (CA),subventricular zone (SVZ) and central autonomic centers were investigatedusing TUNEL, caspase-3 and transglutaminase immunohistochemistrymethods.A significant reduction in mean arterial pressure and an increase inheart rate was observed in CLP group compared the sham-operated and unoperatedgroups at the 24 hours of the experimental period. ECOGrecordings revealed a slight decrease in median frequency (MF) and spectraledge frequency (SEF95) and an increase in delta activity while decreased P1amplitude and elongated U-P1 and N1-P2 latencies observed within SEPrecordings for CLP group. In addition to positive blood culture results,thrombocytopenia and increased blood lactate levels also found in CLPgroup. Immunohistochemical examination of brain tissues from CLP groupshowed significantly higher number of TUNEL positive apoptotic cells in themedian preoptic nucleus, SVZ, DG, CA1 and CA3. However, there were nosignificant difference between the groups at nucleus tractus solitarius (NTS),ventroposterior parvocellular nucleus (VPPC), anteroventral periventricularnucleus (AVPC), granular insular cortex (GI), agranular insular cortex (AGI),perifornical nucleus (PeF), zona incerta (ZI), dorsomedial hypothalamicnucleus (DMD) and rostral-ventrolateral medulla (RVLM) for the TUNELpositive cells. Caspase-3 and transglutaminse positive cells further detectedat the SVZ, median preoptic nucleus, DG, CA1 and CA3 within CLP group inline with the results obtained using TUNEL staining.The results of the current study have demonstrated that the CLP ratsclosely resemble the clinical condition of human sepsis in a period of 24hours following CLP procedure. Furthermore, immunohistochemicalobservations support the hypothesis that apoptotic cell deaths wouldcontribute to the pathophysiology of the SE observed at least in the SVZ,DG, CA1, CA3 and MNPO regions. The results of the current study wouldsuggest that the therapeutic strategies that would specifically inhibit theapoptotic cell death in various brain regions may improve clinical outcome ofpatient with sepsis.