Yüksek verimli selülaz üreten bir mutant suş geliştirmek için Etil Metan Sülfonat (EMS) yoluyla Bacıllus subtilis 171ES mutajenezi ve mutant enzim karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Bacillus subtilis ES171 suşu kullanılarak yapılan EMS mutasyon çalışması sonucu olarak toplamda 538 adet mutant suş elde edilmiştir. Bu mutant suşların, uygulanan EMS dozları sonrası koloni ve selülaz hidroliz zonları ölçülerek Eİ değerleri hesaplanmış ve en yüksek Eİ değerleri sırasıyla 3.8 ile IE1, 3.7 ile IE3, 3.5 ile IE4 ve 2.7 ile IE2 mutantları ile elde edilmiştir. Selülaz zon çapları ölçüldüğünde, ana suşa (12 mm) kıyasla IE1 (19 mm), IE2 (19 mm), IE3 (17 mm) ve IE4 (14 mm) daha iyi sonuçlar vererek, ana suşun maksimum aktivite gösterdiği modifiye ortamda mutantların enzim üretim kapasitesi test edilmiştir. Mutant IE3’de ana suşa göre enzim veriminin %82 oranında arttığı, mutant IE1’de %39, mutant IE2’de %11 ve mutant IE4’de %2 oranında artış gösterdiği tespit edilmiştir. 64. Saatte optimum enzim aktivitesi gösteren IE3 mutant enzimi (857 U/mL), ana suşa kıyasla (453 U/mL) yaklaşık olarak 2 kat daha fazla enzim aktivitesi göstermiş, çalışmalara IE3 mutantı ile devam edilmiştir. Mutant suş IE3’ün enzim özelliklerini belirlemek amacı ile enzim kısmi olarak saflaştırılmıştır. Saflaştırma işleminde; amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve ultrafiltrasyon basamakları uygulanmıştır. Bu işlem basamakları sonunda enzim %3 verimle 8,1 kez saflaştırılmıştır. Kısmi saf enzimin fiziksel parametrelerde 50°C sıcaklıkta, pH 5.0 değerinde optimum değer gösterdiği tespit edilmiş ve enzimin termostabil olduğu belirlenmiştir. MnSO4, NaCl, KCl metal iyonlarının enzim aktivitesi üzerine aktivatör etki yaptığı saptanmış, Vmax ve Km kinetik değerleri 909 U/mL ve 0,01 mM olarak bulunmuştur. Enzimin moleküler ağırlığı 63 kDa olarak saptanıp, depolanma stabilitesinde -20 ºC’de 120 günde yalnızca %15 oranında bir aktivite kaybı gözlenmiştir.In this study, a total of 538 mutant strains were obtained using Bacillus subtilis ES171 through EMS mutagenesis. The enzyme index (EI) values of these mutant strains were calculated by measuring their colony and cellulase hydrolysis zones after applying various EMS doses. The highest EI values were achieved with mutants IE1 (3.8), IE3 (3.7), IE4 (3.5), and IE2 (2.7). When measuring cellulase zone diameters, mutants IE1 (19 mm), IE2 (19 mm), IE3 (17 mm), and IE4 (14 mm) showed improved results compared to the parent strain (12 mm). The enzyme production capacity of the mutants was tested in a modified medium where the parent strain exhibited maximum activity. It was found that the enzyme yield in mutant IE3 increased by 82% compared to the parent strain, while mutant IE1 showed a 39% increase, mutant IE2 an 11% increase, and mutant IE4 a 2% increase. The IE3 mutant enzyme exhibited optimal enzyme activity of 857 U/mL at the 64th hour, which is approximately twice that of the parent strain (453 U/mL). Further studies were conducted using the IE3 mutant. To determine the enzyme characteristics, IE3 was partially purified through ammonium sulfate precipitation, dialysis, and ultrafiltration, resulting in an enzyme that was 8.1 times purified with a 3% yield. The partially purified enzyme exhibited optimal activity at 50°C and pH 5.0, demonstrating thermostability. Metal ions such as MnSO4, NaCl, and KCl activated the enzyme, with kinetic values of Vmax 909 U/mL and Km 0.01 mM. The molecular weight of the enzyme was determined to be 63 kDa, and it showed good storage stability, losing only 15% activity over 120 days at -20°C.