Sulandırıcıya ilave edilen mitokinon ve kafeik asitin koç spermasının dondurulabilirliği ve sperm OGG1/ROMO1 gen ekspresyonu ve metilasyonu üzerine etkileri

Abstract

Bu çalışmanın amacı, mitokinon (MitoQ) veya kafeik asit (KA) içeren sulandırıcılarla koç spermasının dondurulabilirliğinin araştırılmasıdır. Elektroejakülatör ile alınan koç sperması numuneleri pooling yapılarak yedi eşit hacime ayrılmıştır. Her bir hacim, Tris bazlı sulandırıcı ile kontrol ve antioksidan gruplarına (Kontrol, MitoQ 100 nM, 150 nM, 200 nM; KA 50 μM, 100 μM, 150 μM) göre sulandırılmıştır. Eritme sonrası spermatolojik ve antioksidatif parametreler ile OGG1/ROMO1 gen ekspresyonu ve metilasyonu değerlendirilmiştir. CASA ile değerlendirilen eritme sonrası motilite, MitoQ200, KA100 ve KA150 gruplarında kontrol grubuna kıyasla istatistiksel olarak daha yüksek bulunmuştur (P<0,05). MitoQ gruplarının eritme sonrası plazma membran bütünlüğü KA gruplarıyla karşılaştırıldığında, antioksidan gruplar arasında en düşük plazma membran bütünlüğü KA100 grubunda saptanmıştır. Eritme sonrası akrozom membran bütünlüğünün, KA50 ve KA100 grupları hariç olmak üzere tüm antioksidan gruplarında kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu tespit edilmiştir (P<0,05). Eritme sonrası mitokondriyal membran potansiyeli, KA50 grubu dışında tüm gruplarında kontrol grubuna göre daha iyi korunmuştur (P<0,05). Eritme sonrası DNA fragmentasyonu, MDA ve TAC düzeyleri bakımından kontrol grubu dahil tüm grupların benzer olduğu gözlenmiştir. MitoQ’nun, DNA metilasyonu yoluyla OGG1 gen ekspresyonunu anlamlı düzeyde değiştirdiği belirlenmiştir (P<0,05). Ayrıca, kafeik asidin ROMO1 gen ekspresyonunu etkileyebileceği saptanmıştır (P<0,05). MitoQ’nun artan dozları OGG1 gen ekspresyonunu baskılamış ve bu baskılama artan DNA metilasyonu ile ilişkilendirilmiştir (P<0,05). KA artan dozları ise OGG1 ekspresyonunu artırmış, fakat metilasyon düzeylerini değiştirmemiştir. MitoQ’nun ROMO1 geni üzerinde OGG1 geninde olduğu gibi doza bağımlı bir etki gözlenmemiştir, MitoQ doz gruplarının ROMO1 metilasyon düzeylerinin de ROMO1 gen ekspresyonu gibi benzer desenler sergilediği belirlenmiştir (P>0,05). Artan KA dozlarının ROMO1 gen ekspresyonunu anlamlı düzeyde artırmış olduğu gözlenerek (P<0,05), en düşük KA dozu ile en yüksek KA dozu arasında belirgin düzeyde fark tespit edilmiştir. Sonuç olarak, özellikle 200 nM mitokinon ve 150 µM kafeik asit dozlarının, koç spermasının dondurulması ve eritme sonrası sperm kalitesinin korunmasında etkili olduğu belirlenmiştir.The aim of this study was to determine the freezability of ram semen with extenders containing mitoquinone or caffeic acid. Collected ram semen samples were pooled and divided into seven equal aliquots. Each aliquot was diluted with Tris-based extender according to control and antioxidant groups (Control, Mitoquinone (MitoQ) 100 nM, 150 nM, 200 nM; Caffeic Acid (CA) 50 µM, 100 µM, 150 µM). The postthaw spermatological, antioxidant parameters and OGG1/ROMO1 gene expression and methylation were evaluated. The CASA post-thaw motility of MitoQ200, CA100 and CA150 antioxidant groups were statistically higher than the control group (P<0.05). The post-thaw plasma membrane integrity of MitoQ groups was compared with CA groups, the CA100 group, which had the lowest plasma membrane integrity among the antioxidant groups. The post-thaw acrosome membrane damage of all the antioxidant groups was statistically lower than the control group, except the CA50 and CA100 groups (P<0.05). For the post-thaw mitochondrial membrane potential, all groups except the CA50 group were determined to be superior to the control group (P<0.05). No statistical difference was observed among all groups including the control group in terms of post-thaw DNA fragmentation, MDA and TAC values. It was determined that MitoQ significantly altered OGG1 gene expression through DNA methylation (P<0.05). Additionally, it was found that CA modified ROMO1 gene expression (P<0.05). Increasing doses of MitoQ suppressed OGG1 gene expression, and this suppression was associated with increased DNA methylation levels (P<0.05). In contrast, increasing doses of CA enhanced OGG1 expression without altering methylation levels. Unlike its effect on OGG1, MitoQ did not exhibit a dose-dependent effect on ROMO1. However, the methylation levels of ROMO1 in MitoQ dose groups followed a similar pattern to its gene expression levels (P>0.05). Increasing doses of CA significantly elevated ROMO1 gene expression (P<0.05), with a notable difference observed between the lowest and highest doses. Based on the spermatological parameters gene expression and methylation levels obtained in the current study, it was determined that mitoquinone 200nM and caffeic acid 150 µM doses had a positive effect on the freezability of ram semen.