Köpek meme kanseri hücrelerinde histon deasetilaz inhibitörlerinin (HDACi) kemoterapotik ajanlarla kombinasyonlarının sitotoksik etkilerinin ve moleküler mekanizmalarının araştırılması

Abstract

Meme kanseri, hem insanlarda hem de köpeklerde, genetik ve epigenetik değişikliklerin birikimi ile birlikte çok sayıda moleküler mekanizmanın etkili olduğu oldukça yaygın ve kompleks bir hastalıktır. Ancak köpek meme karsinomlarında histon deasetilaz inhibitörleri gibi epigenetik ilaçlar ve kemoterapi ilaçları ile kombinasyonların etkinliği hakkında yeterli bilgi mevcut değildir. Bu nedenle, bu tez çalışmasında, bir histon deasetilaz inhibitörü olan valproik asitin, köpek meme epitel-benzeri karsinom hücrelerindeki etkinliği değerlendirilmiştir. Aynı zamanda, valproik asitin yaygın olarak kullanılan kemoterapötikler olan vinkristin sülfat ve dosetaksel ile ikili ve üçlü kombinasyonlarının sitotoksik etkileri ve mekanizmaları araştırılmıştır. Valproik asit, vinkristin sülfat ve dosetaksel ve kombinasyonların sitotoksik aktiviteleri, XTT hücre canlılık testiyle taranmıştır. Hücrelerde apoptoz ve nekroz varlığı Hoechst 33342/Anneksin-V/Propidyum iyodür üçlü floresan boyama yöntemi ile belirlenmiştir. Hücre ölüm yolaklarında önemli rol oynayan genler olan BCL-2, NOXA, MCL-1, BAX, BID, PUMA, ATM, CASP3, P53, P21’e ait ekspresyon profilleri gerçek zamanlı PCR kullanılarak değerlendirilmiş ve deneysel koşullar temelinde karşılaştırılmıştır. Elde edilen bulgulara göre, valproik asitin ve aynı zamanda dosetaksel ile kombinasyonunun çok güçlü bir sitotoksik etki yarattığı gözlenmiştir. Bu kombinasyonda, BCL-2 ve MCL-1 gibi anti-apoptotik genlerde çok belirgin aşağı regülasyon ve buna karşın NOXA, BAX, BID ve PUMA gibi pro-apoptotik genlerde dikkat çekici bir yukarı regülasyon hücrelerin apoptozis lehine programlandığını ve direnç geliştirme kapasitesinin azaldığını göstermektedir. Bu durum, ATM, CASP3, P53 ve P21 gibi genlerdeki aktivasyon ve aynı zamanda BAX/BCL-2 eksenindeki rölatif artış ile doğrulanmıştır. Sonuç olarak, bu araştırmada valproik asit ve dosetaksel kombinasyon tedavisinin, köpek meme karsinomunda etkin bir tedavi seçeneği potansiyeli olabileceği ortaya konulmuştur.Breast cancer, both in humans and dogs, is a highly prevalent and complex disease influenced by numerous molecular mechanisms alongside the accumulation of genetic and epigenetic alterations. However, there is insufficient information regarding the efficacy of epigenetic drugs such as histone deacetylase inhibitors in combination with chemotherapeutic agents in canine mammary carcinomas. Therefore, this thesis study evaluated the effectiveness of valproic acid, a histone deacetylase inhibitor, on canine mammary epithelial-like carcinoma cells. Furthermore, the cytotoxic effects and mechanisms of valproic acid in dual and triple combinations with widely used chemotherapeutic agents, vincristine sulfate and docetaxel, were investigated. The cytotoxic activities of valproic acid, vincristine sulfate, docetaxel, and their combinations were screened using the XTT cell viability assay. The presence of apoptosis and necrosis in the cells was determined using the triple fluorescence staining method with Hoechst 33342/Annexin-V/Propidium iodide. Expression profiles of genes playing crucial roles in cell death pathways, including BCL-2, NOXA, MCL-1, BAX, BID, PUMA, ATM, CASP3, P53, and P21, were evaluated using real-time PCR and compared under experimental conditions. The findings revealed that valproic acid, particularly in combination with docetaxel, exhibited a potent cytotoxic effect. In this combination, significant downregulation of anti-apoptotic genes such as BCL-2 and MCL-1 and marked upregulation of pro-apoptotic genes like NOXA, BAX, BID, and PUMA indicated a shift in cellular programming towards apoptosis and reduced resistance capacity. This was corroborated by the activation of genes such as ATM, CASP3, P53, and P21, as well as a relative increase in the BAX/BCL-2 axis. In conclusion, this study demonstrated the potential of valproic acid and docetaxel combination therapy as an effective treatment option for canine mammary carcinoma.