Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 46 (3) 357-363, 2020 DOI: https://doi.org/10.32708/uutfd.823410 ÖZGÜN ARAŞTIRMA Oksitosin Nöronlarında Kainat Reseptör Alt Birimlerinin Sentezi: İmmünohistokimyasal Çalışma Zehra MİNBAY, Özhan EYİGÖR Bursa Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Bursa. ÖZET Oksitosin nöronları, gebe dişide doğumu başlatan ve sürdüren, ayrıca meme bezlerinden süt enjeksiyonunu sağlayan nöroendokrin mekaniz- manın en önemli kısmını oluştururlar. Hipotalamik supraoptik (SON) ve paraventriküler (PVN) çekirdeklerde yerleşik olan bu nöronların regülasyonunda merkezi sinir sisteminde yer alan glutamaterjik sistemin önemli rolü olduğu bilinmektedir. Glutamat etkisini hücre memb- ranları üzerinde bulunan reseptörlerine bağlanıp onları aktive ederek gösterir. Bu reseptörlerin üç ayrı alt grubundan biri olan kainat reseptör- lerine ait alt birim proteinlerinin oksitosin nöronlarınca sentezlendiğine dair bilgi henüz raporlanmamıştır. Bu çalışmada, oksitosin nöronla- rında kainat reseptör alt birimlerinin (GluK1, GluK2, GluK3, GluK5) eksprese edilip edilmediğinin belirlenmesi amaçlandı. Bu amaçla dişi sıçan hipotalamusunda oksitosin ve reseptör ko-lokalizasyonunun belirlenmesinde ikili immünofloresan işaretleme tekniği kullanıldı. Bu boyamaların sonucunda, SON ve PVN’deki oksitosin nöronlarının sayıca çok büyük bir kısmının aynı zamanda GluK5 proteini sentezledik- leri belirlendi. Her iki çekirdekte yer alan tüm oksitosin nöronlarının yaklaşık yarısının GluK2 sentezlendiği görüldü. Preparatların incelen- mesi sonucunda oksitosin nöronlarında GluK1 ve GluK3 proteinlerinin ekspresyonu izlenmedi. Sonuç olarak çalışmamızda oksitosin nöron- larının fonksiyonel reseptör kanalı oluşturabilecek kainat reseptör alt birimleri eksprese ettiklerinin belirlenmesi, endojen glutamatın oksito- sin nöronları üzerindeki etkilerini bu reseptörlere bağlanarak gerçekleştirebileceğini düşündürmektedir. Oksitosin nöronlarında kainat resep- tör alt birimlerinin ekspresyonun gösterilmesi bu konudaki literatüre önemli katkılar sağlayacağı ön görüsündeyiz. Gelecekte yapılacak olan fizyolojik ve farmakolojik çalışmalarla veya transgenik hayvanlardan elde edilebilecek bulgulara çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçlar eklendiğinde, kainat reseptörlerinin oksitosin sentez ve salgılama mekanizmasındaki rolü açıklığa kavuşacaktır. Anahtar Kelimeler: Oksitosin. Glutamat. Kainat reseptörleri. GluK2. GluK5. İmmünohistokimya. Synthesis of Kainate Receptor Subunits in Oxytocin Neurons: An Immunohistochemical Study ABSTRACT Oxytocin neurons are the most important part of the neuroendocrine mechanism which starts and maintains the parturition as well as the milk ejection. These neurons are localized in the hypothalamic supraoptic (SON) and paraventricular (PVN) nuclei and glutamatergic system plays an important role in the regulation of these neurons in the central nervous system. Glutamate exerts its effects by binding and activating its receptors on the plasma membrane. There is a lack of knowledge in the literature on the synthesis of kainate receptors, as one of the glutamatergic subfamilies, by oxytocin neurons. In this study the aim is to determine if the kainate receptor subunits (GluK1, GluK2, GluK3, GluK5) were expressed in oxytocin neurons. For this purpose, double immunofluorescence labeling technique was employed in order to assess the co-localization of oxytocin with respective receptor in the female rat hypothalamus. The results of this staining showed that almost the vast majority of oxytocin neurons were immuno-reactive for GluK5 protein in both SON and PVN. It was determined that almost half of the oxytocin neurons in both of the nuclei synthesize GluK2. Analyses of the preparations revealed no expression of GluK1 and GluK3 proteins in the oxytocin neurons. As a result, the determination of the oxytocin neurons can synthesize kainate receptor subunits which can form functional kainate receptor channels suggests that the endogenous glutamate can exert its effects on oxytocin neurons by binding these receptors. We anticipate that showing the oxytocin neurons express kainate receptor subunits would be an important addition to the literature. The future physiological and/or pharmacological studies as well as the possible findings from the transgenic animals would enlighten the role of kainate receptors in the regulation of oxytocin synthesis and/or releasing mechanism. Key Words: Oxytocin. Glutamate. Kainate receptors. GluK2. GluK5. Immunohistochemistry. Geliş Tarihi: 09.Kasım.2020 Oksitosin nöronları, gebe dişide doğumu başlatan, Kabul Tarihi: 03.Aralık.2020 sürdüren1,2 ve meme bezlerinden süt ejeksiyonunu Dr. Özhan EYİGÖR sağlayan3 nöroendokrin mekanizmanın en önemli Bursa Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, bölümünü oluşturur. Somaları hipotalamusta paravent- Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Bursa. riküler ve supraoptik çekirdeklerde yerleşik olan bu Tel: 0 224 295 40 65 nöronların aksonları nörohipofizde sonlanır ve oksito- E-posta: oeyigor@uludag.edu.tr sin burada hipofizer dolaşım sistemine salgılanır4,5. Yazarların ORCID ID Bilgisi: Oksitosin nöronlarının regülasyonunda periferden Zehra MİNBAY: 0000-0001-5757-8450 gelen uyarıcı sinyaller kadar merkezi sinir sisteminde Özhan EYİGÖR: 0000-0003-3463-7483 357 Z. Minbay ve Ö. Eyigör bulunan bazı nörotransmitter sistemlerin de önemli 90 günlük) Sprague Dawley cinsi dişi sıçanlar kulla- rolü olduğu bilinmektedir6. Noradrenerjik7, histami- nıldı. Sıçanların bulunduğu ortam ısısı 20-24⁰C’de nerjik8 ve glutamaterjik9-13 ve gama aminobütirik asit sabit tutulup, 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık (GABA) içeren sistemler14, oksitosin salgılayan mag- (07.00-19.00 arası aydınlık) döngüsü uygulandı ve nosellüler nöronların regülasyonunda yer alan en hayvanlar ad libitum olarak su ve yemle beslendi. önemli sistemlerdir. Glutamaterjik sistemin, hipotala- Denekler derin eter anestezisi altında, 0,13 M fosfat mus-hipofiz-gonadal, hipotalamus-hipofiz-adrenal ve tamponu (pH 7,4) ile hazırlanan %2 paraformaldehit hipotalamo-nörohipofizer sistemler gibi farklı nöroen- ile perfüzyon fiksasyonu yöntemi ile sakrifiye edildi. dokrin döngülerin çalışmasında eksitasyon yapıcı çok Perfüzyon fiksasyon öncesi deneklerin göğüs kafesi önemli roller aldığı, son yıllarda yapılan çalışmalarda açıldı ve kalp apeksinden uygulanan kateter aorta içine gösterilmiştir12,15,16. yerleştirilerek sabitlendi. Solüsyonlar damar içine Glutamat etkisini hücre membranları üzerinde bulunan uygun basınca ayarlanan perfüzyon pompası ile verildi. reseptörlerine bağlanıp onları aktive ederek gösterir. Fiksasyon öncesi deneğin dolaşım sistemi fizyolojik Glutamat reseptörleri iki grupta toplanmıştır. Metabot- tuzlu su ile temizlendi (50 ml). Denek başına 400 ml ropik glutamat reseptörleri yedi transmembran parçası fiksatif solüsyonu kullanıldı. Fiksasyon işlemi sonra- olan G-proteine bağlı reseptörlerden oluşurken, iyo- sında deneklerin kraniumları açılarak beyinler çıkar- notropik reseptörler iyonlara özgül reseptör kanalları tıldı. Çıkartılan beyinlere aynı fiksatif içerisinde gece oluştururlar6,17. İyonotropik glutamat reseptörleri far- boyu post-fiksasyon uygulandı. Ertesi gün beyinlerden makolojik özelliklerine göre üç alt ailede toplanmıştır6. vibratom ile 50 µm’lik koronal kesitler alındı. Hipota- N-metil D-aspartat (NMDA, GluN1-3) reseptörleri lamusun rostro–kaudal ekseninin tamamını içerecek genel olarak, alfa-amino-3-hidroksi-5-metil- izoksa- şekilde alınan kesitler, 5 seri halinde tampon solüsyon zol-propionik asit (AMPA, GluA1-4) ve kainat resep- içerisine toplandı. Tampon solüsyonunda yıkanarak törlerinden (GluK1-5) ayrı olarak değerlendirilmekte- fiksatiften arındırılan kesitler antifriz madde içerisinde dir ve bu nedenle AMPA ve kainat reseptörleri “non– –200C’de saklandı. NMDA” reseptörleri olarak da bilinmektedir18. Oksitosin nöronlarında kainat reseptör alt birimleri Elektron mikroskopik çalışmalarda19 oksitosin nöron- ikili immünofloresan yöntemi ile belirlendi. Bu ları üzerinde glutamat içeren sinapsların varlığının amaçla kesitler –20 0C’den oda sıcaklığına çıkartıldı ve gösterilmesi, glutamaterjik sistemin oksitosin sentezi antifiriz maddenin oda sıcaklığına düşmesi beklendi. ve salgılanmasında rol aldığını düşündürmektedir. Takiben kesitler antifiriz maddeden arındırılmak üzere Bunlara ek olarak elektrofizyolojik ve histolojik me- tampon ile yıkandı. Çalışmanın tüm aşamalarında totların kullanıldığı çalışmalarda glutamat20 ve gluta- tampon madde olarak 0,05 M Tris-HCl solüsyonu (pH mat reseptör agonistlerinin magnosellüler oksitosin 7,6) kullanıldı. İmmünohistokimyasal süreçlerden nöronlarını uyarabildiği21 ve depolarize edebildiği22; önce kesitlere antijenin yeniden kazanılması işlemi farmakolojik çalışmalarda verilen spesifik agonistin uygulandı. Bu işlemde kesitler 50 mM trisodyum sitrat oksitosin salınımını arttırdığı belirlenmiştir23,24. Glu- tamponu (pH 6) içerisinde mikrodalga fırında 600 tamat reseptör tipine özgül antagonistlerin kullanımı W’da 90 saniye ışınlandı (son sıcaklık 80-83°C). Ke- ise glutamatın etkilerini bloke edebilmektedir21,25-28 sitler daha sonra aynı solüsyonda 40-43°C’ye soğu- . yuncaya kadar bekletildi. Tampon solüsyonda yıkanan Söz konusu bu çalışmaların çoğu glutamat reseptörle- kesitlere spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için rinin üç alt grubundan özellikle NMDA ve AMPA bloklama tamponu uygulandı. Bu solüsyon, Tris-HCl reseptör etkileri üzerine yoğunlaşmışsa da üçüncü tamponu içerisinde bloklayıcı ajan olarak %10 normal grup olan kainat reseptörlerinin de bu mekanizma at serumu, bakteri oluşumunu engellemek amacıy- içinde yer aldığı belirlenmiştir26,29,30. Histolojik çalış- la %0,1 sodyum azid ve yüzey gerilimini azaltıp anti- malarda AMPA31 ve NMDA32 reseptörlerinin bazı alt korların hücre içine geçişini kolaylaştırmak için %0,2 birimlerinin oksitosin nöronlarınca sentezlendiği gös- Triton–X 100 içerecek şekilde hazırlandı. Tüm ikincil terilmiştir. Kainat reseptör alt birimlerinin oksitosin antikorların eşekte üretilmiş olması göz önünde bu- nöronlarında eksprese edildiğini gösteren bir çalışma lundurularak bloklayıcı ajan olarak normal at serumu- literatürde mevcut değildir. Bu çalışmada oksitosin nu seçildi. Çalışmada kullanılan tüm birincil ve ikincil nöronlarında eksprese edilen kainat reseptör alt birim- antikorlar bloklama tamponu içerisinde sulandırılarak lerinin immünohistokimyasal metotlarla belirlenmesi uygulandı. Bloklama işlemini birincil antikor inkübas- amaçlanmıştır. yonu takip etti. Bu aşamada kobay anti-oksitosin anti- koru ile kainat reseptör alt birimlerinden birine ait antikoru içeren karışımda inkübasyon uygulandı. Ça- Gereç ve Yöntem lışmalarda kullanılan birincil antikorlarla ilgili detaylı bilgi Tablo I’de verilmiştir. Birincil antikor inkübas- Çalışma, Üniversitemiz Hayvan Bakım ve Kullanım yonunu takiben tamponda yıkanan kesitler floresan Komitesi’nin 19.04.2005/1 sayılı kararı ile etik yön- işaretli birincil antikorun üretildiği türe uygun ikincil den uygun bulunarak yapıldı. Çalışmada, erişkin (60- antikor solüsyonuna alındı. Çalışmalarımızda Jackson Immunoresearch Laboratuvarları’ndan (West Grove, 358 Oksitosin Nöronlarında Kainat Reseptörleri PA) elde edilen ikincil antikorlar kullanıldı. Kullandı- leştirildi. İncelenen preparatta oksitosin nöronlarının ğımız tüm antikorlar eşekte üretilmiştir. Bu antikorlar büyük çoğunluğu ilgili reseptörle ko-lokalize olduğu çoklu işaretleme çalışmaları için uygun antikorlardır. belirlenmişse “+++” skoru kullanıldı. Buna karşılık Antikorlar üretici firma tarafından afinite pürifikasyo- eğer bir kısım oksitosin nöronu reseptör proteinini nu ile özgülleştirilmiş, türler arası reaksiyon açısından eksprese ederken, diğer bir kısım nöronda reseptör incelenmiş ve bu reaksiyonlar minimal düzeyde bu- immünoreaktivitesi görülmemişse, “++” skoru kulla- lunmuştur. Floresan işaretlemelerde oksitosin için nıldı. Çok az sayıda ikili işaretlenme belirlendiyse fluorescein (FITC), reseptör alt üniteleri için Teksas skorlama “+” şeklinde gerçekleştirildi. kırmızısı ile işaretli ikincil antikorlar kullanıldı. GluK3 incelemeleri için, konfokal mikroskopta daha güçlü sinyal elde etmek amacıyla biyotin işaretli ikin- Bulgular cil antikor inkübasyonunu takiben, Cy5 florokromu ile işaretli streptoavidin kompleksi tercih edildi. Bu aşa- Supraoptik ve paraventriküler çekirdeklerde yer alan madan sonra kesitler tamponda yıkanarak lamlara oksitosin nöronları incelendiğinde, bu nöronlarda alındı ve karanlık ortamda kurutuldu. Hazırlanan pre- GluK1 reseptörüne ait ekspresyon sinyali görülmedi. paratlar mikroskobik incelemeden hemen önce kapa- Yapılan ikili işaretlemeler GluK2 kainat reseptör alt ma materyali (ProLong AntiFade, Molecular Probes, birim proteininin oksitosin nöronlarınca sentezlendi- Eugene, CA) ile kapatıldı. ğini ortaya çıkardı. Gerçekleştirilen yarı-kantitatif inceleme sonucunda SON’de ve PVN’de yer alan tüm Tablo I. Çalışmada kullanılan antikorların özellikleri oksitosin nöronlarının yaklaşık yarısının GluK2 prote- Katalog numarası inini eksprese ettiği belirlendi (Şekil 1). İkili işaretle- Birincil Antikorlar Dilüsyon Marka Lot Numarası me görülen bu nöronların SON ya da PVN’de belirli Kobay anti-oksitosin GHC 8152 1:2000 Peninsula Labs. bir yerleşim motifi göstermediği, çekirdeklerin rostro– (IgG) Lot No: 031089 Santa Cruz N–19 kaudal ekseni boyunca dağınık olarak yer aldıkları Keçi anti-GluK1 (IgG) 1:1.000 Biotechnology Lot No: D240 gözlendi. Oksitosin ile yapılan ikili boyamalarda, Santa Cruz C–18 Keçi anti-GluK2 (IgG) 1:100 GluK3 immünreaksiyonunun arttırılması amacıyla Biotechnology Lot No: A289 sadece lazer taramalı konfokal mikroskopta eksitasyo- Santa Cruz N–18 Keçi anti-GluK3 (IgG) 1:1000 Biotechnology Lot No: H180 nu belirlenebilen Cy5 fluorokromu kullanıldı. Birincil Jenens ve Eyigör antikor, biyontinlenmiş ikincil antikor ile bağlandıktan Tavşan anti-GluK5 Antikor referans 1:6000 tarafından (IgG) ş numarası: R52–4 sonra, kesitler biyotine çok yüksek afinitesi olan strep- üretilmi tir toavidinle konjuge edilmiş Cy5 ile inkübe edildiğinde, GluK3 sinyalinin biraz daha arttığı görüldü. Ancak Çalışma kapsamında yapılan işaretlemeler sonucu preparatlar incelendiğinde PVN ve SON’de yer alan hazırlanan preparatlarda koronal beyin kesitleri Swan- oksitosin nöronlarında GluK3 sinyali görülmedi. Oksi- son’un sıçan beyin atlasının koordinatlarına göre ince- tosin ve GluK5 reseptör proteinleri için yapılan ikili lendi33. İncelenen kesitler, oksitosin nöronlarının sıçan immünohistokimyasal boyama sonucunda hem SON beyninde yerleşimi göz önünde tutularak SON için hem de PVN’de yer alan oksitosin nöronlarının sayıca bregma –0,5 ile bregma –1,33 ve PVN için bregma – çok büyük bir kısmının aynı zamanda GluK5 proteini 1,08 ile bregma –1,78 koordinatları arasından seçildi. sentezledikleri belirlendi (Şekil 2). Sunulan çalışmada Çalışma kapsamında gerçekleştirilen ikili işaretleme- gerçekleştirilen yarı-kantitatif analizler Tablo II’de lere ait preparatlar Kentucky Üniversitesi Anatomi ve özetlenmiştir. Nörobiyoloji Departmanı Görüntü Analiz Ünitesi’nde kurulu bulunan lazer taramalı konfokal mikroskobu kullanılarak incelendi. İncelemelerde, işaretleyici florokroma uygun dalga boyunda lazer kaynakları kullanıldı. Tüm lazer taramaları ardaşık tarama olarak gerçekleştirildi. Bu yöntemle lazerlerin her biri tek başına açılarak, aynı anda kullanıldığında doğabilecek florokromlar arası spesifik olmayan sinyal geçişimleri problemi ortadan kaldırılmış oldu. İncelenen alanlar dijital resimler olarak kaydedildi. Preparatların incelenmesi, her denek için, yukarıda belirtilen koordinatlar arasında yer alan, birbirine eşit uzaklıktaki beş kesitte yapıldı. Oksitosin nöronlarında Şekil 1: glutamat reseptör alt birimlerinin ekspresyonunun SON'de ve PVN'de oksitosin ve kainat reseptör alt belirlendiği ikili floresan işaretli kesitlerden elde edi- ünitesi GluK2 proteini içeren nöronlarının konfokal len resimler bilgisayar ortamında grid kullanılarak lazer taramalı mikroskop ile elde edilen fotomikrog- değerlendirildi. Bu aşamada iki araştırmacı tarafından rafları. u, GluK2 proteini eksprese eden oksitosin incelenen kesitlerde yarı-kantitatif bir analiz gerçek- nöronlarını göstermektedir. 359 Z. Minbay ve Ö. Eyigör Tablo II. Kainat reseptör alt birimlerinin oksitosin mRNA dağılım paterninin belirlendiği çalışmaların nöronlarında ekspresyonu. bulgularıyla35,36 benzer bir hipotalamik yerleşim gös- terdikleri izlendi. Oksitosin nöronları açısından değer- Reseptör Supraoptik Çekirdek Paraventriküler Çekirdek Alt birimi lendirildiğinde ise, yaptığımız ikili işaretleme çalışma- ları sonucunda SON’de GluK1 immünreaktif hücrele- GluK1 - - rin bulunmaması ve PVN’de çok küçük bir grup oluş- GluK2 ++ ++ turan GluK1-pozitif hücrelerin oksitosin-negatif olma- GluK3 - - sı nedeniyle bu alt birimin oksitosin nöronlarında GluK5 +++ +++ sentezlenmediği düşünüldü. GluK2 ve GluK5 alt bi- “-”: İkili işaraetlenen nöron yok. “+”: Çok az sayıda ikili rim proteinlerinin hipotalamusta yerleşik hücre grup- işaretlenen nöron mevcut. “++”: Nöronların yarıya yakını larındaki dağılım paterninin, literatürde yer alan rapor- ikili işaretli, “+++”: Çok sayıda ikili işaretlenen nöron mev- ları desteklediği belirlendi37. Bu dağılım mRNA eksp- cut. resyonu ile de aynı doğrultuda olduğu görüldü35,36,38. Çalışmamızda oksitosin sentez ve salgılanmasından sorumlu olan nöronların bulunduğu supraoptik ve paraventriküler çekirdeklerde, yoğun GluK2 ve GluK5 protein ekspresyonu belirlenmiştir ve bu bulgu Petra- lia ve ark’nın raporlarını desteklemektedir37. GluK2 ve GluK5 proteinlerinin SON ve PVN nöronlarının ço- ğunda eksprese olduğu ve yaptığımız ikili işaretleme sonucunda çok sayıda oksitosin nöronunun bu alt birimleri eksprese ettiği görüldü. GluK3 immünoreak- tivitesinin GluK3 mRNA ekspresyonu görülmeyen35,38 SON ve PVN’de belirlenmesi beklenilmeyen bir so- nuçtur. Bu farklılığın, çalışmalarda in situ hibridizas- yon ve immünohistokimya gibi iki farklı yöntemin kullanılmış olmasından kaynaklanabileceği düşünüldü. Ancak bulgular kısmında da belirtildiği gibi GluK3 ekspresyonuna SON ve PVN’de yer alan oksitosin nöronlarında rastlanmadı. Glutamat reseptör alt birim proteinlerinin oksitosin nöronlarında belirlenmesi amacıyla yapılan immüno- histokimyasal çalışmalar göreceli olarak azdır. Cur- ras–Collazo ve arkadaşları32, oksitosin nöronlarının NMDA reseptör alt birimi olan GluN2B proteinini Şekil 2: eksprese ettiklerini göstermişlerdir. Literatürde SON'de ve PVN’de oksitosin ve kainat reseptör alt AMPA/kainat reseptörlerinin oksitosin nöronlarında ünitesi GluK5 proteini eksprese eden nöronlarının ekspresyonunun immünohistokimyasal olarak araştı- konfokal lazer taramalı mikroskop ile elde edilen rıldığı çalışma sayısı da çok azdır. Primatlarda yapılan fotomikrografları. u, GluK5 proteini eksprese eden bir çalışmada AMPA reseptör alt birimlerinden oksitosin nöronlarını, , sadece GluK5 immünopozitif GluA3’ün oksitosin nöronlarında eksprese edildiği " nöronları göstermektedir. hem ışık hem de elektron mikroskopik düzeyde göste-rilmiştir31. Bilgimiz dahilinde çalışmamız, literatürde oksitosin nöronlarında kainat reseptör protein sentezi- nin belirlenmesinin amaçlandığı ve gösterildiği ilk Tartışma ve Sonuç çalışmadır. Çalışmamızın bulguları, oksitosin nöronlarının sıçan Merkezi sinir sisteminde yer alan eksitatör ve inhibitör hipotalamusunda iki ana çekirdekte (SON ve PVN) nörotransmitterlerin, süt ejeksiyonu ve doğum sırasın- yerleşik olduğunu gösterdi. Bu sonuçların, literatürde da oksitosin sentez ve salgısı üzerine etkileri olduğu bilinmektedir1,3,39yapılmış olan çalışmaların5,34 bulgularına paralellik . Oksitosin metabolizmasında yer gösterdiği saptandı. İkili işaretlemelerin incelenme- alan en önemli eksitatör nörotransmitter glutamattır 13. sinden önce hipotalamusta kainat reseptör alt birim Doğumda ilk 15 dakikada supraoptik çekirdek gluta- proteinlerinin varlıkları ve dağılımları açısından pre- mat konsantrasyonunda anlamlı bir artma görülmüş-40 paratlar incelendiğinde, GluK1’in sınırlı bir dağılım tür . SON ve PVN’de lokal eksitatör sinaptik oluşum- gösterdiği, GluK2 ve GluK5’in ise hipotalamik alanlar ların varlığı özellikle elektofizyolojik çalışmalarla 41 ve çekirdeklerde yaygın olarak eksprese edildiği gö- belirlenmiştir. Boudaba ve arkadaşları , glutamat rüldü. Çalışmamızda GluK1-pozitif hücrelerin, GluK1 mikrostimülasyonu ile SON ve PVN nöronlarında 360 Oksitosin Nöronlarında Kainat Reseptörleri eksitatör postsinaptik potansiyasyon belirlemişlerdir. mat antagonisti CNQX ile bloklanabildiği gösterilmiş- Bu etki iyonotropik glutamat reseptör antagonistleri tir21. Yukarıda sunulan çalışma sonuçları da bu bulgu- ile bloke edilebilmiştir. Stern ve arkadaşları22, yaptık- yu destekleyecek şekilde oksitosin nöronlarının glu- ları elektrofizyolojik çalışmalarda SON nöronlarında tamatın etki gösterebileceği fonksiyonel iyon kanalı NMDA ve non–NMDA reseptörlerinin aktivasyonu- oluşturabilecek kainat reseptör alt birimlerinden nun farklı etkiler gösterdiğini belirlemişlerdir. SON ve GluK2 ve GluK5’i sentezlediğini göstermiştir. PVN’de yer alan nöronların dörtte birinin glutamat Sonuç olarak, çalışmamızda oksitosin nöronlarının içeren sinapslarla kontakt yaptığı bildirilmiştir19,42. fonksiyonel reseptör kanalı oluşturabilecek kainat SON’de oksitosin nöronları üzerindeki sinapsla- reseptör alt birimlere ait proteinleri eksprese ettikleri- rın %20’si glutamaterjikken, laktasyon gibi fizyolojik nin belirlenmesi, endojen glutamatın oksitosin nöron- oksitosin sentez ve salınımının yoğunlaştığı koşullarda ları üzerindeki etkilerini bu reseptörlere bağlanarak bu oranın arttığı görülmüştür43,44. Bu bilgiler ışığında, gerçekleştirebileceğini düşündürmektedir. Her ne glutamaterjik sistemin oksitosin nöronlarını direkt kadar bu bulgular oksitosin nöronlarının foksiyonları- olarak etkileyebileceği kainat reseptörlerinin oksitosin nın düzenleniminde kainat reseptörlerinin rolü oldu- nöronlarında var olduğunun bu çalışmada gösterilmesi ğunu doğrudan göstermese de oksitosin nöronlarında önemli bir bulgudur. kainat reseptör alt birimlerinin ekspresyonun göste- Fonksiyonel glutamat reseptörleri, alt ailelere ait alt rilmesi bu konudaki literatüre önemli katkılar sağlaya- birimlerin homomerik ve/veya heteromerik dizilimleri cağı düşüncesindeyiz. Literatürde yer alan ve gelecek- ile iyon kanalları şeklinde oluşurlar. NMDA reseptör- te yapılacak olan fizyolojik ve farmakolojik çalışma- leri sadece kendi alt birimlerinin yer aldığı fonksiyo- larla veya transgenik hayvanlardan elde edilebilecek nel kanallar oluştururken, AMPA ve kainat reseptör bulgulara çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçlar eklen- alt birimlerinin kendi aralarında heteromerik reseptör diğinde, kainat reseptörlerinin oksitosin sentez ve kanalları oluşturdukları belirlenmiştir18. Kainat resep- salgılama mekanizmasındaki rolü açıklığa kavuşacak- tör alt birimlerinden GluK5’in homomerik kanal oluş- tır. turmadığı, ancak GluK1, GluK2 ve GluK4 ile birlikte eksprese edildiğinde fonksiyonel iyon kanalı yaptığı farmakolojik çalışmalarda belirlenmiştir18,45. Çalış- Teşekkür mamızın sonuçlarının oksitosin nöronlarında GluK2 ve GluK5 alt birimlerinin sentezlendiğini göstermesi, Bu çalışma TÜBİTAK tarafından desteklenmiştir oksitosin nöronlarında fonksiyonel olarak aktif kai- (101S058 [SBAG–2459]). GluK5 antikoru için Prof nat–seçici glutamat reseptör kanallarının oluşabilece- Dr. Lothar JENNES’e (University of Kentucky) ve ğini düşündürmektedir. lazer taramalı konfokal mikroskop kullanımımızı Reseptör bağlama çalışmaları SON ve PVN nöronları- sağlayan Kentucky Üniversitesi Görüntüleme Ünitesi nın radyoaktif glutamata afinite gösterdiğini belirle- sorumlusu Prof. Dr. Bruce MALEY’e teşekkür ederiz. miştir. SON’de yapılan bir çalışmada, radyoaktif glu- tamatın daha çok non-NMDA reseptörlerine bağlandı- Etik Kurul Onay Bilgisi: ğı, bağlanma oranının NMDA reseptörlerinde daha Onaylayan Kurul: Uludağ Üniversitesi Hayvan Bakım ve düşük, metabotropik reseptörlerde ise en az seviyede Kullanım Komitesi. olduğu gösterilmiştir46. Magnosellüler hücrelerde Onay Tarihi: 19.04.2005 Karar No: 19.04.2005/1 glutamaterjik iletinin oluştuğunu gösteren ilk çalışma- larda, AMPA reseptörlerinin önemli bir rol aldığı belirlenmiştir47. Young ve arkadaşları48, magnosellüler nöronların glutamaterjik etkileniminde AMPA resep- Kaynaklar törlerine ek olarak NMDA reseptörlerinin de rol aldı- 1. Challis JRG, Lye SJ. Parturition. In: The physiology of repro- ğını göstermiştir. Elektrofizyolojik çalışmalar, sup- duction. Knobil E, Neill JD (eds). New York: Raven Press;1994. raoptik çekirdek nöronlarında glutamaterjik etkinin 985-1031. algılanmasında kainat reseptörlerinin rolü olduğunu 2. Higuchi T, Okere CO. Role of Supraoptic nucleus in regulation ortaya koymuştur49. Oksitosin nöronlarının, vazopres- of parturition and milk ejection revisited. Microsc Res Tech sin nöronlarının aksine kainik asite yanıt olarak spon- 2002;56:113-121. tane deşarj gösterdikleri ve bu deşarjların CNQX ile 3. Wakerley JB, Clarke G, Summerlee AJ. Milk ejection and its bloke edilebildiği bildirilmektedir25,50,51. Bu da oksito- control. In: The physiology of reproduction. Knobil E, Neill JD (eds). New York: Raven Press; 1994. 1131-1177. sin nöronlarına glutamaterjik etkinin iletilmesinde 4. Gainer H, Wray S. Cellular and molecular biology of oxytocin non-NMDA reseptörlerinin esas rol oynadığını gös- and vasopressin. In: The physiology of reproduction. Knobil E, termektedir. Laboratuvarımızda gerçekleştirilen ça- Neill JD (eds). New York: Raven Press; 1994.1099-1129. lışmada özellikle kainat reseptörleri üzerinden etkili 5. Hatton GI. Emerging concepts of structure-function dynamics olduğu bilinen kainik asidin oksitosin nöronlarında in adult brain: the hypothalamo-neurohypophysial system. Prog aktivasyona neden olduğu ve bu aktivasyonun gluta- Neurobiol 1990;34:437-504. 361 Z. Minbay ve Ö. Eyigör 6. Hollmann M, Heinemann S. Cloned glutamate receptors. Ann oxytocin-sensitive pattern-generating network governing oxy- Rev Neurosci 1994;17:31-108. tocin neurons in vitro. J Neurosci 1998;18:6641-6649. 7. Daftary SS, Boudaba C, Szabó K, Tasker JG. Noradrenergic 26. Olazabal DE, Ferreira A. Maternal behavior in rats with kainic excitation of magnocellular neurons in the rat hypothalamic pa- acid-induced lesions of the hypothalamic paraventricular nuc- raventricular nucleus via intranuclear glutamatergic circuits. J leus. Physiol Behav 1997;61:779-784. Neurosci 1998;18:10619-10628. 27. Richardson CM, Wakerley JB. Glutamate excitation of oxyto- 8. Bealer SL, Crowley WR. Stimulation of central and systemic cin neurons in vitro involves predominantly non-NMDA recep- oxytocin release by histamine in the paraventricular hypotha- tors. Brain Res 1997;767:158-161. lamic nucleus: Evidence for an interaction with norepinephrine,. 28. Yagi K, Onaka T, Yoshida A. Role of N-methyl-D-aspartate Endocrinology 1999;140:1158-1164. (NMDA) receptors in vasopressin and oxytocin responses to 9. Gribkoff VK. Electrophysiological evidence for N-methyl-D- emotional stimuli. Adv Exp Med Biol 1998;449:131-134. aspartate excitatory amino acid receptors in the rat supraoptic 29. Israel JM, Poulain DA. 17-Oestradiol modulates in vitro elect- nucleus in vitro. Neurosci Lett 1991;131:260-262. rical properties and responses to kainate of oxytocin neurones 10. Inenaga K, Honda E, Hirakawa T, Nakamura S, Yamashita H. in lactating rats. J Physiol (Lond) 2000;15:457-470. Glutamatergic synaptic inputs to mouse supraoptic neurons in 30. Sun Q, Pretel S, Applegate CD, Piekut DT. Oxytocin and calcium-free medium in vitro. J Neuroendocrinol, 1998;10:1-7. vasopressin mRNA expression in rat hypothalamus following 11. Meeker RB, Greenwood RS, Hayward JN. Glutamate is the kainic acid-induced seizures. Neuroscience 1996;71:543-554. major excitatory transmitter in the supraoptic nuclei. Ann NY 31. Ginsberg SD, Price DL, Blackstone CD, Huganir RL, Martin Acad Sci 1993;22: 636-639. LJ. The AMPA glutamate receptor GluR3 is enriched in oxyto- 12. Van Den Pol AN, Trombley PQ. Glutamate neurons in hypo- cinergic magnocellular neurons and is localized at synapses. thalamus regulate excitatory transmission. J Neurosci Neuroscience 1995;65:563-575. 1993;13:2829-2836. 32. Curras-Collazo MC, Chin C, Diaz G, Stivers C, Bozzetti L, 13. Van Den Pol AN, Wuarin JP, Dudek F.E. Glutamate neurot- Tran LY. Immunolabeling reveals cellular localization of the ransmission in the neuroendocrine hypothalamus. In: Excitatory N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2B in neurosecretory Amino Acids The Role in Neuroendocrine Function. Brann cells but not astrocytes of the rat magnocellular nuclei. J Comp DW, Mahesh B, (eds). Boca Raton: CRC Press; 1996. 1-54. Neurol 2000;427:93-108. 14. Voisin DL, Herbison AE, Chapman C, Poulain DA. Effects of 33. Swanson LW. Brain Maps: Structure of the rat brain. Amster- central GABAB receptor modulation upon the milk ejection ref- dam: Elsevier; 1998. lex in the rat. Neuroendocrinology 1996;63:368-376. 34. Jirikowski GF, Caldwell JD, Pikgrim C, Stumpf WE, Pedersen 15. Brann DW. Glutamate: A major excitatory transmitter in neu- CA. Changes in immunostaining for oxytosin in the forebrain roendocrine regulation. Neuroendocrinology 1995;61:213-225. of the female rat during late pregnancy, parturition and early 16. Brann DW, Mahesh VB. Excitatory amino acids: Function and lactation. Cell Tissue Res 1980;256:411-417. significance in reproduction and neuroendocrine regulation. 35. Eyigor O, Centers A, Jennes L. Distribution of ionotropic Front Neuroendocrinol 1994;15:3-49. glutamate receptor subunit mRNAs in the rat hypothalamus. J 17. Seeburg PH. The molecular biology of mammalian glutamate Comp Neurol 2001;434:101-124. receptor channels. Trends Neurosci 1993;16:359-365. 36. Herman JP, Eyigor O, Ziegler DR, Jennes L. Expression of 18. Bettler B, Mulle C. Review: neurotransmitter receptors II. ionotropic glutamate receptor subunit mRNAs in the hypotha- AMPA and kainate receptors. Neuropharmacology 1995;34: lamic paraventricular nucleus of the rat. J Comp Neurol 123-139. 2000;422:352-362. 19. Meeker RB, Swanson DJ, Greenwood RS, Hayward JN. Quan- 37. Petrelia RS, Wang YX, Wenthold RJ. Histological and ultra- titative mapping of glutamate presynaptic terminals in the su- structural localization of the kainate receptor subunits, KA2 and praoptic nucleus and surrounding hypothalamus. Brain Res GluR6/7, in the rat nervous system using selective antipeptide 1993;600:112-122. antibodies. J Comp Neurol 1994;349:85-110. 20. Jourdain P, Dupouy B, Bonhomme R, Theodosis DT, Poulain 38. Van Den Pol AN, Hermans-Borgmeyer I, Hofer M, Ghosh P, DA, Israel JM. Electrophysiological studies of oxytocin neu- Heinemann S. Ionotropic glutamate-receptor gene expression in rons in organotypic slice cultures. Adv Exp Med Biol hypothalamus: Localization of AMPA, kainate, and NMDA re- 1998;449:135-145. ceptor RNA with in situ hybridization. J Comp Neurol 1994;343:428-444. 21. Minbay FZ, Eyigor O, Cavusoğlu I. Kainic acid activates oxytocinergic neurons through non-nmda glutamate receptors. 39. Crowley WR, Armstrong WE. Neurochemical regulation of Int J Neurosci 2006;116:587-600. oxytocin secretion in lactation. Endocr Rev 1992;13:33-65. 22. Stern JE, Galarreta M, Foehring RC, Hestrin S, Armstrong WE. 40. Pak CW, Curras-Collazo MC. Expression and plasticity of Differences in the properties of ionotropic glutamate synaptic glutamate receptors in the supraoptic nucleus of hypothalamus. currents in oxytocin and vasopressin neuroendocrine neurons. J Microsc Res Tech 2002;56:92-100. Neurosci 1999;19:2267-3375. 41. Boudaba C, Schrader LA, Tasker JG. Physiological evidence 23. Parker SL, Crowley WR. Central stimulation of oxytocin for local excitatory synaptic circuits in the rat hypothalamus. J release in the lactating rat by N-methyl-D-aspartate: Require- Neurophysiol 1997;77:3396-3400. ment for coactivation through non-NMDA glutamate receptors 42. Van Den Pol AN, Wuarin JP, Dudek FE. Glutamate, the domi- or the glycine coagonist site. Neuroendocrinology 1995;62:467- nant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Sci- 478. ence 1990;250:1276-1278. 24. Parker SL, Crowley WR. Stimulation of oxytocin release in the 43. El Majdoubi M, Poulain DA, Theodosis DT. The glutamatergic lactating rat by central excitatory amino acid mechanisms: evi- innervation of oxytocin- and vasopressin-secreting neurons in dence for specific involvement of R,S-α-amino-3-hydroxy-5- the rat supraoptic nucleus and its contribution to lactation- methylisoxazole-4-propionic acid-sensitive glutamate receptors. induced synaptic plasticity. Eur J Neurosci 1996;8:1377-1389. Endocrinology 1993;133:2847-2854. 44. Theodosis DT, El Majdoubi M, Gies U, Poulain DA. Physio- 25. Jourdain P, Israel JM, Dupouy B, Oliet SH, Allard M, Vitiello logically-linked structural plasticity of inhibitory and excitatory S, Theodosis DT, Poulain DA. Evidence for a hypothalamic synaptic inputs to oxytocin neurons. Adv Exp Med Biol 1995;395:155-171. 362 Oksitosin Nöronlarında Kainat Reseptörleri 45. Cui C, Mayer ML. Heteromeric kainate receptors formed by 49. Gribkoff VK, Dudek FE. Effects of excitatory amino acid coassembly of GluR5, GluR6, and GluR7. J Neurosci antagonists on synaptic responses of supraoptic neurons in slic- 1999;19:8281-8291. es of rat hypothalamus. J Neurophysiol 1990;63:60-71. 46. Meeker RB, Greenwood RS, Hayward JN. Glutamate receptors 50. Nissen R, Hu B, Renaud LP. N-methyl-D-aspartate receptor in the rat hypothalamus and pituitary. Endocrinology antagonist ketamine selectively attenuates spontaneous phasic 1994;134:621-629. activity of supraoptic vasopressin neurons in vivo. Neurosci- 47. Wuarin JP, Dudek FE. Patch-clamp analysis of spontaneous ence 1994;59:115-120. synaptic currents in supraoptic neuroendocrine cells of the rat 51. Nissen R, Hu B, Renaud LP. Regulation of spontaneous phasic hypothalamus. J Neurosci 1993;13:2323-2331. firing of rat supraoptic vasopressin neurons in vivo by gluta- 48. Yang QZ, Smithson KG, Hatton GI. NMDA and non-NMDA mate receptors. J Physiol 1995;484:415-424. receptors on rat supraoptic nucleus neurons activated mon- osynaptically by olfactory afferents. Brain Res 1995;680:207- 216. 363