BİYOMETAL İYONLARININ GPD1 GENİ TRANSKRİPSİYONUNA VE HÜCRE DÖNGÜSÜNE ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Günay İBRAHİMOVA T. C BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOMETAL İYONLARININ GPD1 GENİ TRANSKRİPSİYONUNA VE HÜCRE DÖNGÜSÜNE ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Günay İBRAHİMOVA ORCID 0000-0003-1709-5758 Prof. Dr. Sezai TÜRKEL (Danışman) YÜKSEK LİSANS TEZİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI BURSA-2021 Her Hakkı Saklıdır ÖZET Yüksek Lisans Tezi BİYOMETAL İYONLARININ GPD1 GENİ TRANSKRİPSİYONUNA VE HÜCRE DÖNGÜSÜNE ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Günay İBRAHİMOVA Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Sezai TÜRKEL Hücresel faaliyetlerin gerçekleştirilebilmesi için çeşitli metal iyonları gereklidir. Fakat metal iyonlarının hücrelere fazla alınması veya toksik metal iyonlarının hücreye taşınması çeşitli hücresel faaliyetleri engelleyebilir, çeşitli sitotoksik ve bazı genotoksik etkiler de gösterebilir. Bu araştırmada bakır, demir, çinko ve magnezyum iyonlarının S. cerevisiae hücrelerinde hücre döngüsüne etkileri ve GPD1 geni transkripsiyonuna etkileri incelendi. Metal iyonları çözünür bileşikler olarak letal seviyenin altında olan konsantrasyonlarda maya kültürlerinin üreme ortamına ilave edildi. Bu araştırmada elde edilen sonuçlar bakır ve kalsiyum iyonlarının GPD1 geni transkripsiyonunu baskıladığını göstermektedir. Bu metal iyonlarının glukoz repres şartlarda GPD1 transkripsiyonunda yaklaşık %30 kadar azalmaya neden olduğu tayin edildi. Buna karşın, magnezyum ve demir iyonlarının ise GPD1 transkripsiyonunu düşük seviyede aktive ettiği belirlendi. GPD1 geni transkripsiyonunun metal iyonları ile kontrolünde stres ile aktive edilen transkripsiyon faktörleri olan Msn2p ve Yap1p’nin herhangi bir işlevi olmadığı da gösterildi. Msn2p’nin GPD1 transkripsiyonu için normal şartlarda gerekli olduğu, stres yanıtı için ise gerekli olmadığı tayin edildi. GPD1’in metal stresi ile kontrolü için çok fonksiyonlu ve genel bir protein kinaz olan Snf1p’nin gerekli olduğu belirlendi. Anahtar Kelimeler: Biyometal, Hücre döngüsü, Maya, Transkripsiyon. 2021, XII + 47 sayfa v ABSTRACT M. Sc. Thesis INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF BIOMETAL IONS ON THE TRANSCRIPTION OF GPD1 GENE AND CELL CYCLE Gunay IBRAHIMOVA Bursa Uludag University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Molecular Biology and Genetics Supervisor: Prof. Dr. Sezai TÜRKEL Various metal ions are required to perform cellular activities. However, excessive absorption of metal ions into cells or the transport of toxic metal ions into the cell can interfere with various cellular activities, and may exhibit various cytotoxic and some genotoxic effects. In this study, the effects of copper, iron, zinc and magnesium ions on cell cycle in S. cerevisiae cells and their effects on GPD1 gene transcription were investigated. Metal ions as soluble compounds to the growth medium of the yeast cultures at concentrations below the toxic levels were added. The results obtained in this research show that copper and calcium ions represses GPD1 gene transcription. It was determined that these metal ions caused approximately 30% repression in GPD1 transcription under glucose repression conditions. In contrast, magnesium and iron ions were found to activate GPD1 transcription at a low level. It has also been shown that stress-activated transcription factors Msn2p and Yap1p have no function in the control of GPD1 gene transcription with metal ions. It was determined that Msn2p was required for GPD1 transcription under normal conditions and not for stress response. It was determined that Snf1p, a multifunctional and general protein kinase, is required for the control of GPD1 with metal stress. Key words: Biometals, Cell cycle, Transcription, Yeast. 2021, XII + 47 pages vi TEŞEKKÜR Başta, yüksek lisans eğitimim boyunca yardımları için danışmanım ve bölüm başkanımız Prof. Dr. Sezai Türkel’e ve laboratuvar çalışmalarımda bana yardımcı olan değerli yüksek lisans arkadaşım Gözde Arslan’a teşekkür ederim. Bu tez araştırmasında kullandığımız GPD1-LacZ gen füzyonu vektörünü sağlayan değerli bilim insanı Prof. Dr. Stefan Hohmann’a (University of Goetburg Sweeden) sonsuz teşekkülerimi sunarım. Ayrıca, tez çalışmalarımda önemli bir yeri olan S. cerevisiae hücrelerinin mikroskop görüntülerinin alınmasında teknik yardımları için Prof. Dr. Sevcan Çelenk ve onun yüksek lisans öğrencilerine teşekkürlerimi Günay İBRAHİMOVA 12 / 02 / 2021 vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET................................................................................................................................. v ABSTRACT ..................................................................................................................... vi TEŞEKKÜR .................................................................................................................... vii İÇİNDEKİLER .............................................................................................................. viii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ...................................................................... ix ŞEKİLLERİN DİZİNİ ..................................................................................................... xi ÇİZELGELER DİZİNİ ................................................................................................... xii 1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ ................................................................................................. 2 2. 1. Saccharomyces cerevisiae’nın Genom Yapısı ve Hücresel Özellikleri .................... 2 2. 2. Biyometal İyonları ve Hücresel Önemi..................................................................... 7 2. 3. Metal İyonlarının S. cerevisiae’da Etkileri ............................................................... 8 2. 4. GPD1 Geni Yapısal Özellikleri ............................................................................... 11 3. MATERYAL ve YÖNTEM ........................................................................................ 15 3. 1. Araştırmada Kullanılan Maya Suşları ve Üreme Koşulları .................................... 15 3. 2. GPD1-LacZ Raportör Vektörünün Yapısı ve Transformasyonu ............................ 16 3. 3. S. cerevisiae Transformantlarına Biyometal Stresi Uygulaması............................. 18 3. 4. GPD1-LacZ Gen Füzyonundan Promotor Aktivitesi Tayini .................................. 18 3. 5. Biyometal İyon Stresinin Hücre Fenotipi ve Üremesine Etkilerinin Tayini ........... 19 4. BULGULAR ............................................................................................................... 21 4. 1. Farklı Biyometal İyonlarının GPD1 Transkripsiyonuna Etkileri............................ 21 4. 2. Msn2p’nin Biyometal Stresinde GPD1 Transkripsiyonuna Etkileri ...................... 23 4. 3. Hog1p ve Hot1p’nin Biyometal Stresinde GPD1 Transkripsiyonuna Etkileri ....... 25 4. 4. Aft1p’nin Biyometal Stresinde GPD1 Transkripsiyonuna Etkileri ........................ 26 4. 5. Yap5p’nin Biyometal Stresinde GPD1 Transkripsiyonuna Etkileri ....................... 27 4. 6. Biyometal İyonları Stresinin Hücre Fenotipine ve Üremeye Etkileri ..................... 28 5. TARTIŞMA ve SONUÇ ............................................................................................. 33 KAYNAKLAR DİZİNİ .................................................................................................. 37 EKLER ............................................................................................................................ 41 Ek 1. Besiyeri ve Çözeltilerin Hazırlanması ................................................................... 42 Ek 2. β- Galaktozidaz Aktivitesi Hesaplanması .............................................................. 45 Ek 3. Metal İyon Çözeltilerinin Hazırlanması ................................................................ 46 ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................... 47 viii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama Ca++ Kalsiyum 2+ iyonu Fe++ Demir 2+ iyonu Cu++ Bakır 2+ iyonu α Alfa β Beta Δ Delta, delesyon μg Mikrogram μL Mikrolitre μm Mikrometre °C Santigrat derece % Yüzde Kısaltmalar Açıklama ATP Adenosin trifosfat cDNA kopya DNA, komplementer DNA Dk Dakika DNA Deoksiribonükleik asit DR Glukoz baskısı altında olmayan, (Derepressed) GPD1 Gliserol 3-Fosfat Dehidrogenaz-1 geni Gpd1p Gliserol 3-Fosfat Dehidrogenaz-1 proteini/enzimi GRAS Generally Recognized as Safe, Genellikle Güvenli Organizma HOG High Osmolarity Glycerol response Kbp Kilo baz çifti LacZ Beta–Galactozidaz geni LiOAc Lityum asetat kısa sembolü Leu Lösin M Molar MAT Mating type, S. cerevisiae’da eşleşme tipi Mbç Mega baz çifti mg Miligram mm Milimetre mL Mililitre mM Milimolar mRNA Mesajcı ribonükleik asit OD Optical Density ONPG Orto Nitro Phenyl Galactoside ORF Open Reading Frame (Açık okuma Penceresi) PEG Polyetilen glikol pH Hidrojen iyonu konsantrasyonu PKA Protein Kinaz A R Glukoz baskılaması (Repressed) ix RNA Ribonükleik Asit RPM Rotation per minute S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SC- Ura Urasil içermeyen sentetik tam üreme ortamı SGD Saccharomyces Genome Database SDS Sodyum dodesil sülfat SOD Süperoksit dismutaz SNF Sucrose non-fermenting tRNA Taşıyıcı RNA URA Uracil yAP Yeast Aktivatör Protein YEp Yeast Epizomal plazmit YPK Yeast Protein Kinase YNB Yeast Nitrogen Base YPD Yeast extract Pepton Dextrose x ŞEKİLLERİN DİZİNİ ........Sayfa Şekil 2.1. S. cerevisiae’nın yaşam döngüsü........................................................... 6 Şekil 2.2. S. cerevisiae’da hücre döngüsü aşamaları morfolojileri................…… 6 Şekil 2.3. GPD1 geni transkripsiyonuna etki eden bazı transkripsiyon faktörleri. 14 Şekil 2.4. S. cerevisiae’da gliserol biyosentezi yolağı ve Gpd1’in işlevi............... 14 Şekil 4.1. Sodyum stresinin farklı maya suşlarının üremesine etkileri...........…… 29 Şekil 4.2. Kalsiyum ve demir stresinin farklı maya suşlarında üremeye etkileri… 29 Şekil 4.3. Farklı maya suşlarında bakır stresinin üremeye etkileri.................…… 30 Şekil 4.4. Kalsiyumun yaban tip hücrede morfolojik etkisi...........................…… 31 Şekil 4.5. Bakır ve demir iyon stresinin yaban tip hücrede morfolojik etkisi....… 32 xi ÇİZELGELER DİZİNİ ......Sayfa Çizelge 2.1. S. cerevisiae filogenetik sınıflandırılması.......................................... 2 Çizelge 3.1. Araştırmada kullanılan S. cerevisiae suşları ve özellikleri....……….. 16 Çizelge 4.1. Farklı biyometal iyonlarının repres şartlarda GPD1’de transkripsiyona etkileri....................................................................... 22 Çizelge 4.2. Farklı biyometal iyonlarının derepres şartlarda GPD1’de transkripsiyona etkileri...................................................................... 22 Çizelge 4.3. İkili metal iyon stresinin GPD1’de transkripsiyona etkileri...…….. 23 Çizelge 4.4. Msn2p’nin biyometal iyonu stresinde GPD1’de transkripsiyona etkileri.....................................................................................…….. 24 Çizelge 4.5. Hog1p sinyal iletim yolağının biyometal iyonu stresinde GPD1’de transkripsiyona etkileri..........................................................…….. 24 Çizelge 4.6. Transkripsiyon faktörü Aft1’in biyometal iyonu stresinde GPD1’de transkripsiyona etkileri...........................................…….. 27 Çizelge 4.7. Transkripsiyon faktörü yAP5p’nin biyometal iyonu stresinde GPD1’de transkripsiyona etkileri...........................................…….. 28 xii 1. GİRİŞ Biyometaller bütün hücrelerde bulunan ve önemli hücresel işlevleri olan metallerdir. Bu metal iyonlarından özellikle demir, bakır, çinko ve magnezyum çeşitli yapısal ve düzenleyici proteinlerin yapılarında bulunur. Ayrıca gen işleyişinin kontrolü ve enzimatik aktivitelerin düzenlenmesi gibi önemli işlevleri olan temel elementlerdir. Bu metal iyonlarının hücreye girişi ve hücre içi konsantrasyonları toksik seviyede olmayacak şekilde ayrıca kontrol edilir, normal şartlarda da hücre içinde hücresel faaliyetleri engelleyecek seviyede birikmez. Biyometalleden demir Fe2+ ve Fe3+ olarak hücreye taşınır metalloenzimlerin yapısında bulunur. Demir iyonları ayrıca elektron taşıma zincirinde sitokromların yapısında bulunarak ökaryotlarda mitokondriyel faaliyetlerin yürütülmesi için gereklidir. Bakır iyonları ise bazı metalloproteinlerin yapısında bulunmakla birlikte demir iyonlarının hücreye alınması ve depolanmasında işlevi bulunan bir biyoelementtir. Çinko; özellikle bazı transkripsiyon faktörlerinin yapısal ve işlevsel bütünlüğü için gereklidir. Bu araştırmada GPD1 geninde seçilen biyometallere yanıt olarak genin transkripsiyonel kontrolünde nasıl bir değişiklik olacağı incelendi. GPD1 geni NAD+ bağımlı gliserol 3-fosfat dehidrogenaz enzimini kodlar. Bu enzimin aktivitesi, sitoplazmik NADH/NAD+ dengesinin (redoks dengesi=redox balance) sağlanması ve dolayısıyla metabolizmanın devamlılığı için mutlaka gereklidir. Ayrıca bu enzim faaliyeti sonucu sentezlenen gliserol de hem membran lipidlerinin sentezi hem de ozmotik strese dayanıklılık için gereklidir. GPD1 geni transkripsiyonunun fermentatif ve oksidatif üreme koşullarında metal iyonlarından nasıl etkilendiği bilinmemektedir. Ökaryotik hücrelerin bölünerek çoğalması da çevresel, hücresel sinyallere ve hücrenin metabolik durumuna göre kontrol edilmektedir. Araştırmamızda bazı biyometal iyonlarının sub-letal seviyede bulunması durumunda hücre döngüsüne etkileri de asenkronize S. cerevisiae kültürlerinde incelenmiştir. 1 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Saccharomyces cerevisiae’nın Genom Yapısı ve Hücresel Özellikleri Saccharomyces cerevisiae antik çağlardan bugüne ekmek, bira vb. yapımında kullanılan bir maya mantarı türüdür. Saccharomyces cerevisiae’nın milattan önce 6000 yıllarında Sümer ve Babil de fermente içecek yapımında, mısırda ise ekmek mayalamada kullanıldığına ilişkin yazılı kayıtlar vardır (Feldman 2012). Daha sonra S. cerevisiae’nın fermentasyonla olan ilişkisi 1835’de tanımlanmıştır ve ilk kez hücre lizatı kullanılarak in-vitro olarak şekerden etanol ve karbondioksit üretilebildiği de S. cerevisiae’da gösterilmiştir. Bu maya türüne Saccharomyces cerevisiae adı 1837’de Meyen tarafından verilmiştir. Endüstride yaygın olarak kullanıldığından günümüzde halen önemini sürdürmektedir. Ekmek yapımı, içecek üretimi, yemek atıkları işleme ve gıda maddeleri üretimi gibi endüstriyel alanlarda kullanılmaktadır. Saccharomyces cerevisiae türünün filogenetik sınıflandırılması ise aşağıda verildiği şekildedir (Çizelge 2.1). Çizelge 2.1. S. cerevisiae filogenetik sınıflandırılması. Taksonomik Grup Grup/kategori Adı Şube Ascomycota Sınıf Saccharomycetes Takım Saccharomycetales Familya Saccharomycetacae Cins Saccharomyces Tür Saccharomyces cerevisiae 2 S. cerevisiae’nın hücresel yapısı ise küresel şekilli, hücre çapı ~5-10 μm olan ökaryotik bir mikroorganizmadır (Goffeau ve ark. 1996). S. cerevisiae tomurcuklanarak ürer. Tomurcuklanma ökaryotlardaki mitoz bölünmeyle özdeştir. Ancak ökaryotlardaki mitozdan farklı olarak S. cerevisiae’da bölünme sırasında nükleus zarı kaybolmaz. Buna kapalı mitoz denir (Feldman 2012). Hücre döngüsünü kontrol eden genetik faktörler olan siklinler ilk önce CDC (cell Division Cycle) genleri olarak S. cerevisiae’da tayin edilmiştir (Hartwell 1973). S. cerevisiae ökaryotik mikroorganizmalar içerisinde belki de bilimsel anlamda en çok çalışılmış olanıdır. Tek hücreli ökaryotik bir mikroorganizma olması, insan hücreleriyle birçok yönden benzerlik taşıması, kolayca kültüre edilebilmesi, kısa sürede çoğalabilmesi, mayoz bölünme geçirebilmesi, homolog rekombinasyon, gen delesyonu gibi manipülasyonlara uygun olduğundan rekombinant uygulamalara açık olması, çok uzun yıllardır biliniyor ve kullanılıyor olması, üzerinde birçok çalışma yapılıp, karakteristiklerinin ve genomunun iyi biliniyor olması, bunun başlıca sebeplerindendir (Goffeau ve ark. 1996). Model organizma olarak bu tür özelliklerinden dolayı S. cerevisiae 21. yüzyılın organizması olarak da tanımlanmıştır (Botstein ve Fink 2011). S. cerevisiae ile yapılmış olan çalışmalar sayesinde, ökaryot hücre fizyolojisi ve genetik mekanizmaları üzerine çok değerli bilimsel bilgiler literatüre kazandırılmıştır. Tüm genom sekanslama ile genomu dizilenen ilk ökaryotik organizma Saccharomyces cerevisiae olmuştur (Feldman 2012, Goffeau ve ark. 1996). S. cerevisiae genom dizilimi bilgisi 24 Nisan 1996 yılında kamu erişimine açılmıştır (Goffeau ve ark. 1996). O günden beri, S. cerevisiae veri bankasında (SGD: Saccharomyces Genome Database) düzenli olarak güncellemeler yapılmaktadır (Anonim 2020a). SGD içeriği ve veri bankası olarak yapısıyla genomik çalışmalara da örnek teşkil etmiştir. Günümüzde birçok organizmaya ait genom veri tabanlarının SGD örneğinden hareketle hazırlandığı bilinmektedir. S. cerevisiae genomunda protein kodlayan yaklaşık 6000 gen bulunur. Tüm genom ~12 MB büyüklüğündedir. Bunlardan yaklaşık 2000 tanesinin fonksiyonu tanımlanmamıştır, “orphan genes” olarak bilinmektedir. S. cerevisiae genomunda protein kodlanan açık 3 okuma çerçeveleri de (ORF: Open Reading Frame) tespit edilerek genomik DNA dizilimleri belirlenmiştir. Bu açık okuma çerçeveleri yani ORF bölgeleri farklı aminoasit uzunluklarında olabilmektedir (Anonim 2020a). Haploid S. cerevisea’da bütün sekansları bilinen 16 kromozom vardır. Genon büyüklüğü ise 12x106 baz çifti kadardır. Yalnız ribozomal DNA tekrarlarının bulunduğu XII kromozomda bu DNA’ların tekrar sayısı maya suşlarında değişkenlik göstermektedir (Feldman 2012). S. cerevisiae hücreleri glukozu, glikoliz yoluyla üç karbonlu pürüvat molekülüne parçalar. Ortamda yeterli miktarda oksijenin bulunmadığı durumda pirüvat asetaldehit üzerinden etanole dünüştürülür. Bu metabolik yolağın sonucunda bir molekül glukozdan iki molekül etanol üretirler (Feldman 2012). Ortamda oksijen yeterli miktarda bulunuyorsa, piruvat, AsetilCoa üzerinden Krebs Döngüsüne girebilir ve yüksek enerji elde edilir. Bu yönüyle S. cerevisiae, fakültatif anaerobdur. Bu şekilde aerob etkinlik sonucu, maya hücreleri daha fazla enerji üretirler ve hızlı bir şekilde çoğalırlar. Maya biyokütlesi elde edilmek istendiği zaman, aerobik metabolizmayı kullanması teşvik edilir. Ancak, bira, ekmek üretimi vb. işlemleri ilgilendiren, S. cerevisiae’nın endüstriyel etkinliği, büyük oranda anaerob metabolik yolu kullanarak fermentatif etkinlik göstermesinden ileri gelir. S. cerevisiae hücreleri, diğer birçok fungal organizma gibi, kendilerine has bir yaşam döngüsü gösterirler ve vegetatif olarak bölünebildikleri gibi, eşeyli olarak da çoğalabilirler. Aslında, çoğunlukla çevresel koşullar bu hücrelerin hangi metot ile çoğalacaklarını tayin eder. S. cerevisiae hücrelerinin eşeysiz olarak üremesi tomurcuklanmayla, eşeyli olarak üremesi sporla olur. S. cerevisiae diploid ya da haploid olarak yaşamına devam edebilir (Feldman 2012). Sporulasyon sadece dipliod hücrelerde görünür, haploid S. cerevisiae hücreleri spor oluşturmaz. Ayrıca, azot açlığı gibi stres koşullarında S. cerevisiae hücreleri mitotik olarak bölündükten sonra birbirine bağlı kalarak psödohif olarak tanımlanan yapıyı da oluştururlar (Gimeno ve ark. 1993) Tomurcuklanma işlemi sırasında, ana hücrenin çekirdeği bölünür ve kendisini yeni hücreye doğru konumlandırır. Tomurcuk sürekli büyür ve tamamen olgunlaştığında, ana hücreden ayrılabilir ve bağımsız bir hücre olarak işlev görebilir (Şekil 2.1 ve Şekil 2.2). S. cerevisiae’da hücre döngüsü aşamalarını ışık mikroskobu ile ayırt etmek de mümkündür 4 (Şekil 2.2). G1 aşamasındaki hücreler hiç tomurcuk içermez. S fazında ise tomurcuklanma başlar. G2 aşamasında yavru hücreyi oluşturacak tomurcuk ana hücrenin yaklaşık yarısı kadardır. Mitoz sonundaki maya hücrelerinde ise yavru hücre büyüklüğü yaklaşık olarak ana hücre kadardır (Şekil 2.2). 5 Şekil 2.1. S. cerevisiae’nın yaşam döngüsü (Anonim 2020b). Şekil.2.2. S. cerevisiae’da hücre döngüsü aşamaları morfolojileri (Herskowitz 1988). 6 2.2. Biyometal İyonları ve Hücresel Önemi Bütün canlı organizmalar büyüme, gelişme ve metabolik kontrolleri için çeşitli biyometallere ihtiyaç duyarlar. Bu nedenle canlı organizmalar bulundukları ortamlardan çeşitli taşıma mekanizmaları ile hücre içine ihtiyaçları olduğu kadar biyometal iyonlarını alırlar. Ancak biyolojik sistemlerde bulunan biyometaller iyonlaşmış şekilde pozitif veya negatif yüklü olarak bulunur. Bu nedenle biyometal iyonlarının hücre içine taşınması ve hücrede farklı biyolojik olaylar için kullanımı sıkı düzenleme gerektirir (Cyert ve ark. 2013). Biyometal iyonları hücre içi pH kontrolünde, sinyal iletiminde ve çeşitli enzimatik reaksiyonlarda ko-faktör olarak kullanılırlar. İnsanda biyometal iyonlarının düzensiz olarak hücrede bulunması veya eksikliğinin çeşitli metabolik hastalıklara yol açtığı da bilinmektedir (Pokusa ve Trancikova 2017). Canlı sistemleri için çok sayıda metal iyonu çeşitli metabolik faaliyetler için gerekmektedir. Ancak doğada bulunan minerallerden magnezyum (Mg2+), çinko (Zn2+), sodyum (Na+), potasyum (K+) demir (Fe2+), ve bakır (Cu2+) birçok metabolik olayın kontrolünde merkezi işlevi olduğu bulunmuştur. Bu nedenle bu tür metal iyonlarına biyolojik sistemlerdeki önemleri dolayısıyla biyometal iyonları denir. Biyometal iyonları enzimlerde kofaktör olarak yer aldıklarında enzim-substrat etkileşiminin sağlanmasında da önemli işlev görürler. Katalaz ve peroksidaz demir, sitokrom oksidaz bakır, ve karbonik anhidraz ise çinko içeren önemli metallo enzimlerdir. Çinko ayrıca transkripsiyon faktörlerinin yapısında da yer alır ve bu proteinlerde çinko parmak yapısı (zinc finger) oluşumuna neden olur (Brown 2013). Demir birçok enzim yapısında bulunmakla birlikte özellikle ökaryotlarda mitokondride elektron taşıma zincirindeki işlevi dolayısıyla hücre içine kontrollü olarak taşınması gerekir. Mitokondride oksidatif solunumda demir-sülfür kompleksi olarak bulunan demir farklı canlılarda farklı şekillerde depolanır. İnsanda başta karaciğer olmak üzere ferritin ve hemosiderin olarak depolanır. Ayrıca hemoglobin yapısında heme kompleksi olarak bulunur (Nelson ve Cox 2013). S. cerevisiae’da ise demir mitokondiryel işlevine ek olarak ko-faktör olarak da kullanılır ve vokuolde depolanır. S. cerevisiae’da demir taşınımı bakır iyonlarına bağlıdır (Cyert ve Philpott 2013). 7 Sodyum potasyum ise hücrelerde elektrolit dengesini korumak için oldukça önemlidir. Canlılarda su dengesi dokularda ve vücut sıvılarında asit-baz dengesinin korunması hücre zarında bulunan sodyum potasyum pompaları aracılığı ile sağlanır. Potasyumun hücre içi dengesi aynı zamanda insanda kardiovasküler fonksiyon ve sinir iletisinin normal olarak gerçekleşmesi için gereklidir. Hücrelerde sodyum potasyum dengesi ATPaz olan membran transport sistemlerince sağlanır (Nelson ve Cox 2013). Kalsiyum diğer önemli bir biyometaldir. Ökaryotlarda çok fonksiyonlu bir biyometal iyonu olup hem yapısal olarak ve hem de sinyal aktive edici iyon olarak işlevleri vardır. Kalsiyum-kalmodulin sinyal yolağı hem maya hücrelerinde hem de insanda moleküler bileşenleri iyi aydınlatılmış bir sinyal yolağıdır. Kalsiyum iyonları kalmoduline bağlanarak kalsiyum kalmodulin yolağını aktive ederler. Bu yolak tarafından apoptoz, T-hücre aktivasyonu, insanda hafıza oluşumu gibi çok çeşitli biyolojik süreçler kondrol edilir. Kalsiyum kalmodulin yolağı bütün ökaryotlarda korunmuştur ve özellikle S. cerevisia’da bu sinyal yolağı bileşenleri transkriptom seviyesinde oldukça iyi aydınlatılmıştır (Cyert ve Philpott 2013, Goldman ve ark. 2014, Theves 2014). 2.3. Biyometal İyonlarının S. cerevisiae’da Etkileri Biyometal iyonlarının farklı gen ifadelerine etkileri S. cerevisiae’da oldukça ayrıntılı olarak incelenmiştir. S. cerevisia’da yapılan bir transkriptom çalışmasında bu organizmadaki genlerin en az %22’sinin transkripsiyon seviyesinde araştırmada uygulanan metal iyonlarına yanıt olarak en az 2 kat değişiklik olduğu bulunmuştur (Jin ve ark. 2008). Farklı metal iyonlarının S. cerevisiae’da farklı mekanizmalar ile hücre içine taşındığı bilinmektedir (Wysocki ve Tamas 2010, Cyert ve Philpott 2013). Bu araştırmada incelenecek olan biyometal iyonlarının S. cerevisiae için metabolik önemi ve hücre içine taşınma, transport mekanizmaları aşağıda özetlenmiştir. Metal iyon stresine yanıt olarak S. cerevisiae’da aktive edilen diğer bir genetik yolak ise genel stres sinyal yolağıdır. Bu sinyal yolağı ile aktive edilen transkripsiyon faktörleri olan Msn2p ve Msn4p (Msn2/4) hedef genlerin aktivasyonunu sağlayıp maya hücrelerinin strese tolerans göstermelerini sağlar. Toksik metal iyon stresine yanıt 8 olarak aktive edilen diğer transkripsiyon faktörü ise yAP (Yeast Activator Protein) grubu transkripsiyon faktörleridir (Morano ve ark. 2012). Transkripsiyon faktörü Msn2/4 kontrol ettiği genlerin promotor bölgesinde strese yanıt olarak Stres yanıt elementi (Stres response element: STRE) olarak bilinen sekansa bağlanır. Bu DNA sekansı (5’-CCCT-3’) olup Msn2/4 ile kontrol edilen bütün promotorlarda bulunmaktadır (Martinez-Pastor ve ark. 1996). yAP grubu transkripsiyon faktörlerinin bağlandığı DNA dizileri de bilinmekte olup yAP faktörüne göre değişiklik gösterebilmektedir. S. cerevisiae’da çok sayıda yAP grubu transkripsiyon faktörü vardır (yAP1-yAP8)( Fernandez ve ark. 1997). Bu faktörlerden bazıları aktivatör, bazıları ise represördür. Bunlardan yAP5’in demir stresine yanıt olarak aktive edilip hedef genlerin trasnkripsiyonlarını aktive ettiği bilinmektedir (Li ve ark. 2008). yAP7 ise nitrik oksid sinyaline yanıt olarak aktive edilen represördür (Merhej ve ark. 2015). yAP grubu transkripsiyon faktörlerinin hedef promotorlarda bağlanma dizileri (5′-TGACTCA-3′) ve benzeri sekanslardır (Anonim 2020c). Bu genel transkripsiyon faktörlerine ek olarak S. cerevisiea’da biyometal iyonlarına spesifik olarak aktive edilen transkripsiyon faktörleri de vardır. Bunlardan birisi ise kalsiyum stresine yanıt olarak aktive edilen Crz1p (Calcineurin-Responsive Zinc finger) transkripsiyon faktörüdür (Thewes 2014). Demir iyonlarının kullanımı ile ilgili hedef genleri kontrol eden transkripsiyon faktörü ise Aft1’dir (Activator of Ferrous Transport). Ayrıca bakır iyonlarının da Mac1p ve Ace1p adlı transkripsiyon faktörleri aracılığı ile hedef genlerin transkripsiyonunu kontrol ettiği bilinmektedir (Cyert ve Philpott 2013). Metal iyon stresine yanıt olarak S. cerevisiae’da bazı metabolik adaptasyon mekanizmaları da gelişmiştir. Maya üreme ortamına özellikle toksik seviye biyometal iyonları uygulandığında maya hücreleri buna yanıt olarak metal iyonlarının hücreye girişinin önlenmesi veya metal iyonunu detoksifiye edici mekanizmalar da geliştirmiştir (Wysocki ve Tamas 2010) Kalsiyum bütün ökaryotlarda sinyal iletici biyometal olarak kalsiyum-kalmodulin sinyal yolağında aktivatördür. Kalsiyum maya hücrelerine hem yüksek afiniteli ve hem de 9 düşük afiniteli taşıma sistemleri ile alınır. Hücre içine alınan kalsiyumun %90 kadarı maya hücrelerinde vokuolde depolanır. Bu durum insan hücrelerinden farklılık gösterir (Cyert 2013). Kalsiyum biyometal iyonu olarak S. cerevisiae’da bölünmenin kontrol edilmesinde işlevseldir. Kalsiyum-kalmodulin sinyal yolağı S. cerevisia’da Crz olarak adlandırılan transkripsiyon faktörünü aktive ederek hedef genlerin transkripsiyonunu kontrol eder (Thewes 2014, Cyert ve Philpott 2013, Cyert 2001). Demir hücrelerde çoklu işlevleri olan bir biyometal iyonudur. S. cerevisiae’da hem mitokondride elektron taşıma zinciri bileşenlerinde hemde bazı enzimlerin yapısında kofaktör olarak bulunur. Bu nedenle hücre içi seviyesi de oldukça sıkı şekilde kontrol edilir. Demirin hücre içine taşınması ve vokuolde depolanması ile ilgili faktörleri aktive eden traskripsiyon faktörleri Aft1p ve Aft2p’dir. Bu transkripsiyon faktörleri tarafından S. cerevisiae’da ekspresyonu kontrol edilen genlere topluca demir regulonu (ıron regulon) denir. Demir önce maya hücre duvarında bulunan bazı proteinlere bağlanarak lokal konsantrasyonu zenginleştirilir. Daha sonra ise maya hücrelerine membranda bulunan transporter protein Fet3p-Ftr1p kompleksi tarafından aktif olarak hücre içine aktarılır. Fet3p-Ftr1p sistemine ek olarak S. cerevisia’da hücre duvarı kompleksinde bulunan demir iyonu kompleksleri ayrıca Arn/Sit sistemi olarak bilinen transport sistemi ile de hücreye alınır. S. cerevisiae’da demir vocuolde depo edilir (Cyert ve Philpott 2013). Diğer bir biyometal iyonu olan çinko ise S. cerevisiae’da Zrt2 (Zinc-Regulated Transporter) aracılığı ile sitoplazmaya alınır ve vokuolde depolanır. S. cerevisiae’da çinkoya bağlı olarak aktivitesi kontrol edilen 476 farklı metallo protein olduğu belirlenmiştir. Çinko taşınımı ve kullanımı ile ilgili genler Zap1p (Zinc-responsive Activator Protein 1) tarafından kontrol edilir. Çinko bazı transkripsiyon faktörlerinin yapısında yer alır. Ayrıca karbonik anhidraz gibi önemli metabolik enzimlerin işlevi de kofaktör olarak bulunan çinko iyonuna bağlıdır (Cyert ve Philpott 2013) Sodyum S. cerevisiae hücrelerinde aktif olarak depolanmaz ve hücre içi konsantrasyonu da oldukça sıkı kontrol edilir. Sodyum iyonunun hücre içine taşınması membran transporteri olan Nha1 taşıyıcı sistem ile gerçekleşir. Bu sistem sodyum potasyum 10 taşıma sistemi olarak bilinmektedir (Cyert ve Philpott 2013). Sodyum iyonu yüksek konsantrasyonda bulunduğunda S. cerevisiae’da HOG (High Osmolarity Glycerol) sinyal yolağı olarak bilinen yolağı aktive ederek hücrede gliserol biyosentezini aktive eder. Sodyuma bağlı olarak aktive edilen genlerden birisi de bu araştırmada incelenen GPD1 genidir. Biyometal iyonu olarak bakır iyonları hücrede demir ve çinkoya nazaran çok daha az miktarda gereklidir. Bakır metalloproteinlerin yapısında bulunur. Bakır iyonlarının hücre içine taşınması ve hücrede kullanımı ile ilgili faktörler bakıra bağlı olarak aktive edilen transkripsiyon faktörleri Mac1p ve Ace1p tarafından kontrol edilmektedir. Bakır iyonları hücre zarından Fre1p ve Fre7p olarak bilinen transporterler ile hücre içine taşınır. Hücre içi bakır konsantrasyonu oldukça düşüktür ve bakır iyonları sitoplazmada protein kompleksi olarak bulunurlar ve metallo enzimlere bağlanırlar (Cyert ve Philpott 2013). 2.4. GPD1 Geni Yapısal Özellikleri GPD1 geni NAD-bağımlı gliserol-3-fosfat dehidrojenaz ailesinin üyesi bir enzim olan Gpd1p’yi kodlar (Albertyn ve ark. 1994). GPD1 geni S. cerevisiae genomunda 4. kromozomda yer alır. İntron içermez ve 391 amino asit uzunluğunda kodlama bölgesi vardır. Gpd1 enzimi dihidroksiaseton fosfatın (DHAP) ve indirgenmiş nikotin adenin dinükleotitinin (NADH) gliserol-3-fosfata (G3P) ve NAD+’a dönüşümünü katalize ederek karbonhidrat ve lipid metabolizmasında kritik bir rol oynar (Şekil 2.4). Bu şekilde S. cerevisiae için hem gliserol biyosentezini sağlarken aynı zamanda sitoplazmik NAD+ konsantrasyonunun yenilenmesine de katkı sağlayan bir enzimdir (Ansell ve ark. 1997, Björkqvist ve ark. 1997). NADH/NAD+ dengesinin korunması bütün ökaryotlarda başta glikolitik yolak olmak üzere metabolizmanın devamı için gereklidir. 11 S. cerevisiae mayasında da bu gen gliserol metabolizması için gereklidir. Gliserol, S. cerevisiae sitozolunda, sırasıyla gliserol-3-fosfat dehidrojenaz (Gpd1p) ve gliserol-3- fosfataz (Gpp) ile katalize edilen iki aşamada glikolitik ara dihidroksiaseton fosfattan sentezlenir (Şekil 4.2). Gpd’nin iki izoenzimi vardır. Bunlar Gpd1p ve Gpd2p’dir. Gpd1p ozmotik stresle aktive edilir ve bazal seviyede ekspresyonu da çok yüksetir (Hohman 2002). Gpd2p ise oksijensiz ortam koşullarında (anoxic) aktive edilir. Sitoplazma ve mitokondride bulunur (Jung ve ark, 2010, Valadi ve ark, 2004). Gliserol-3-fosfat dehidrojenazı kodlayan GPD1 ve GPD2 genleri S. cerevisiae, S. diastaticus, Schizosaccharomyces pombe, Candida glycerinogenes ve Zygosaccharomyces rouxii gibi farklı maya türlerinden klonlanmıştır ve sekansları da bilinmektedir (Chen ve ark. 2008). Bu maya türlerinde de işlevi gliserol metabolizmasının kontrolüdür. GPD1 geni transkripsiyonunu kontrol eden faktörler farklı araştırma grupları tarafından ayrıntıları ile çalışılmıştır. GPD1 transkripsiyonunu kontrol eden transkripsiyon faktörleri ve bu faktörlerin genin promotor bölgesindeki bağlanma sekansları ve transkripsiyona etkileri SGD ve YEASTRACT veri tabanında ayrıntıları ile verilmiştir (Anonim 2020a, Anonim 2020c). YEASTRACT kayıtlarında olan ve GPD1 geni transkripsiyonuna etkileri olan faktörlerden bazıları şunlardır: Msn1p, Msn2p, Msn4p, Hot1p, Aft1p, Tup1p, Sko1p, Yap1p, Yap6p, Pdr1p, Gcrp, Fkh1p vd. Bu transkripsiyon faktörlerinin bazıları represördür (Tup1 ve Fkh1 gibi). Pd1p ise çinko’nun hücre içi kullanımı ile ilgili faktörleri kodlayan genleri de kontrol eder ve çoklu ilaç dirençliliği yanıt sekansına (Pleiotropic Drug Response Element PDRE) bağlı faktörler ile birlikte hedef promotorlara etki eder. Msn2p ve Msn4p (Msn2/4 olarak gösterilir) transkripsiyon faktörleri ise metal iyon stresi dahil olmak üzere çok çeşitli streslerle aktive edilen transkripsiyon faktörleridir. Aktive ettikleri genlerin promotor bölgesindeki stres yanıt elementi STRE: Stress Response Elements) olarak bilinen DNA sekanslarına bağlanırlar (Martinez-Pastor ve ark. 1996). Hot1p ise ozmotik strese yanıt olarak GPD1 geni transkripsiyonunu aktive eder (Rep ve ark. 2000). Hot1p bir çeşit protein kinaz olan ve ozmotik stresle aktive olan Hog1p protein kinazı tarafından aktive edilir (Hohmann 2002). GPD1 promotorunun çok sayıda faktörle kontrol ediliyor 12 olması bu genin farklı stres koşullarına ve metabolik değişikliklere yanıt olarak aktive edildiğini veya transkripsiyonunun baskılandığını da göstermektedir. Biyometal iyonlarının sıvı çözeltilerde pozitif yüklü olarak bulunmaları bunların hücreye taşınması sonucu sitoplazmada da net yükü değiştirmektedir. Sitoplazmada ve vokuol gibi organellerde iyonik net yükün belirli aralıklarda sabit tutulabilmesi için hücreler belirli yanıt mekanizmaları geliştirmişlerdir. Biyometal iyonları metallo enzimlerde yapısal işlevlerine ek olarak sinyal iletici elementler olarak da hücre metabolizması ve hücre bölünmesine etki edebilmektedirler. Bu tez araştırmasında bazı biyometal iyonlarının hücrede bölünme, hücre döngüsü ve GPD1 geni transkripsiyonuna etkileri incelenmiştir. 13 Şekil 2.3. GPD1 geni transkripsiyonuna etki eden bazı transkripsiyon faktörleri (Anonim 2020a). Şekil 2.4. S. cerevisiae’da gliserol biyosentezi yolağı ve Gpd1’in işlevi (Anonim 2020d). 14 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3. 1. Araştırmada Kullanılan Maya Suşları ve Üreme Koşulları Bu tez araştırmasında kullanılan S. cerevisiae’nın yaban tip ve mutant suşları ve özellikleri çizelge 3. 1’de verildi. Bu S. cerevisiae suşları Frankfurt Üniversitesi tarafından kontrol edilen EUROSCARF maya koleksiyonundan satın alındı. Bu S. cerevisiae suşlarının tüm genomları sekanslanmış olup Çizelge 3.1’de verilen delesyonlardan başka mutasyon içermedikleri bilinmektedir. Araştırmamızda yaban tip suş olarak kabul edilen BY4741 (Y00000) (laboratuvar kodu olarak YST124) suşu biyometallarin hücre içine taşınımında ve hücresel özelliklerin incelenmesinde standart referans suş olarak kabul edilmiştir. EUROSCARF’dan sağlanan yaban tip ve mutant S. cerevisiae suşlarına ait örnekler ayrı ayrı YPD (Yeast Extract, Peptone, Dextrose) petrilerine çizgi ekimi yapılarak yeniden üretilmek ve canlılıklarını doğrulamak için 30 °C’de, 48 saat inkübatörde üremeye bırakıldı. Delesyonlu suşların ilgili gende delesyon içerdikleri satın alınan S. cerevisiae suşları G418 (Geneticin) içeren petrilerde üretilerek doğrulandı. KanMX4 markör geni içeren delesyonlu suşların G418 antibiyotiğine direçli oldukları doğrulandı. Delesyonulu suşlar daha önce üretici kurum tarafından açıklandığı şekilde elde edilmiştir (Brachmann ve ark. 1998). YPD petrilerinde üretilen maya suşlarından steril şartlarda kürdan ile bir miktar örnek alınarak uzun süreli saklamak için 1 mL %20’lik gliserol içeren mikrofüj tüplerinde süspanse edildikten sonra –80 °C’de depo edildi. Normal veya zengin besiyeri olarak da adlandırılan YPD (yeast Extract, Peptone, Dextrose) ortamında üretilen maya suşları tez deneyleri sırasında sıvı kültür başlatmak için +4 °C’de buzdolabında muhafaza edildi. S. cerevisiae suşlarının üretilmesinde kullanılan besiyeri içerikleri ve bu besiyerlerinin hazırlanmasında uygulanan standart yöntemler Rose ve ark. (1990) tarafından açıklandığı şekilde yapıldı (Rose ve ark. 1990). Araştırma kullanılan besiyeri içerikleri ve diğer çözeltilerin hazırlanması Ek 1’de verildi. 15 Çizelge 3.1. Araştırmada kullanılan S. cerevisiae suşları ve özellikleri ST Lab Genotipi ve ilgili mutasyonlar Kodu YST124 MATa, his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0. YST240 MATa, ura3Δ0; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; YLR113w: : kanMX4 (hog1 mutantı) MATa, ura3Δ0; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; YMR172w: : kanMX4 YST241 (hot1 mutantı) MATa, ura3Δ0; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; YGL071w: : kanMX4 YST297 (aft1 mutantı) MATa, ura3Δ0; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; YMR037c: : kanMX4 YST299 (msn2 mutantı) MATa, ura3Δ0; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; YIR018w: : kanMX4 YST300 (yap5 mutantı) 3. 2. GPD1-LacZ Raportör Vektörünün Yapısı ve Transformasyonu Araştırmamızda biyometal stresinin etkileri araştırılacak olan GPD1 geni raportör gen füzyonu olarak daha önce hazırlanmıştır (Rep ve ark. 2000). Bu gen füzyonu Prof. Dr. S. Hohmann (university of Gothenburg) tarafından laboratuvarımızdaki araştırmalar için daha önceden sağlanmıştır. GPD1-LacZ gen füzyonu YEp (Yeast Epizomal plasmid) türü bir ekspresyon vektörü olan 2m-URA3 plazmit vektörü üzerine klonlanmıştır. Bu raportör gende GPD1 geni promotor bölgesi olan 516 bç’lik bölge (-693’den -177 bç’lik bölgesi) bulunmaktadır ve daha önce yapılan delesyon çalışmalarında normal GPD1 geni transkripsiyonunun kontrolü için gerekli olan bütün düzenleyici bölgeleri içerdiği gösterilmiştir (Rep ve ark. 2000). YEp vektörlerinin transformasyonla aktarıldıkları maya suşlarında seçici üreme ortamında stabil olarak bulundukları da daha önce gösterilmiştir (Farabaugh ve ark. 1989). 16 GPD1-LacZ raportör plazmitinin yukarıda verilen yaban tip ve mutant maya suşlarına transformasyonu daha önce açıklanan şekilde lityum asetat-polietilen glikol metodu ile yapıldı (Gietz ve ark. 1995). Bu yöntem kısaca aşağıda özetlendiği şekilde uygulandı. Maya suşları standart şartlar olarak adlandırılan 30C’de 140 devir/dk dönüş hızında inkübatörde bir gece üretildi. Ertesi sabah bu maya suşlarınndan 20 mL’lik YPD besiyerine 500 ml ekim yapıldı ve maya suşları tekrar standart şartlarda logaritmik aşamaya kadar (yaklaşık OD600= 1-1.5) üretildi. Bu aşamada maya kültürleri masaüstü santrifüjde 1600 rpm’de 5 dk çöktürüldü ve 25 ml steril saf suda suspanse edildi tekrar yanı hızda çöktürüldü. Sıvı faz atıldı, maya pelletleri bu kez 1 ml steril 0.1 M lityum asetat çözeltisinde supanse edilerek mikrofüj tüplerine alındı. Bu kez maya supansiyonları 12500 rpm’de 1 dk çöktürüldü sıvı faz atıldı. Maya pelletleri bu kez 500 L 0.1 M Lityum asetat’da suspane edildi. Bu maya süspansiyonlarından mikrofüj tüpüne 50 L alınarak üzerine aşağıda verilen miktarda ve sırada transformasyon çözeltileri ve plazmit DNA’sı ilave edildi. 240 μL PEG (%50’lik stoktan) 36 μL 1 M LiAOc (taze stok) 6 μL denatüre Herring sperm DNA’sı 4-5 μL (1-2 g) plazmid DNA’sı 64 μL dsH2O Toplam hacim 350 μL olacak şekilde su eklendi. Elde edilen transformasyon karışımı vortekle karıştırıp önce 30 C’de 30 dk, daha sonra 42 C’de 20 dk bekletildi. Daha sonra transformasyon karışımı mikrofüjde 12500 rpm’de 30 sn çöktürüldü. Sıvı faz atıldı. Pellet olan maya hücreleri 500 L stersil saf suda suspanse edildi. Bu transformant maya süspansiyonlarından Sc-Ura+%2 dekstroz içeren petriler steril cam baget ile 100 L yayma ekimi yapıldı. Petrilerin yüzeyleri kuruduktan sonra 30 C’de etüvde transformants maya kolonileri gelişinceye kadar inkübe edildi. Koloniler 1-2 mm çapında geliştikten sonra tekrar Sc-Ura+%2 dekstroz içeren petrilere 0.5 cm ebatlarında pasajlar yapıldı. Bu pasajlar da 30 C’de 2-3 gün inkübe edildi. Pasaj yapılan maya transformantları bir sonraki aşmada sıvı kültürlerin hazırlanmasında stok olarak kullanıldı. Transformant petriler deneyler süresince +4 C’de buz dolabında bekletildi. 17 3. 3. S. cerevisiae Transformantlarına Biyometal Stresi Uygulaması GPD1 promotor aktivitesine biyometal iyonlarının etkisini belirlemek için önce maya transformantları 10 mL Sc-Ura+%2 dekstroz içeren seçici üreme ortamında ikişerli olarak logaritmik aşamaya kadar üretildi. Log aşamasında maya kültürleri 5’er mL’lik iki kısma bölündü. Bir bölümü normal koşullarda üreme ortamında inkübe edildi. Maya kültürlerinin ikinci 5’er mL’lik kısımlarına ise son konsantrasyonları daha önce belirlenen miktarlarda biyometal iyonları ilave edildi ve maya kültürleri 4-5 saat standart üreme şartlarında üremeye bırakıldı (Schmidt ve ark. 2009). Üreme süresi sonunda maya kültürleri masa üstü santrifüjde 1600 rpm’de 5 dk çöktürüldü, sıvı faz atıldı. Maya pelletleri 1 mL steril saf suda süspanse edilerek steril mikrofüj tüplerine aktarılarak tekrar 12500 rpm’de 1 dk çöktürüldü, sıvı faz atıldı. Maya pelletleri bir sonraki aşamada -galaktozidaz aktiviteleri tayini için 200 L -galaktozidaz lizis tampon çözeltisinde suspanse edildi. Daha sonraki aşamalarda -galaktozidaz aktivitesi tayini için ise maya suspansiyonları −80 C’de derin dondurucuda bekletildi. GPD1 promotoru glukoz baskılaması ile kontrol edilmektedir. GPD1 transkripsiyonuna biyometal iyonlarının derepres koşullarda etkisini analiz etmek için yukarıda açıklanan şekilde üretilen maya kültürleri logaritmik aşamada masa üstü santrifüjde 1600 rpm’de 5 dk çöktürüldü sıvı faz atıldı. Maya pelletleri 10 mL steril saf suda suspanse edilerek tekrar aynı şekilde santrifüjde çöktürüldü, sıvı faz atıldı. Maya pelletleri derepres üreme koşulları için Sc-Ura+%0.1 dekstroz üreme ortamında suspanse edildi. Bu şekilde hazırlanan maya kültürlerinin bir kısmına yukarıda açıklanan şekilde biyometal stresi uygulandı. 3. 4. GPD1-LacZ Gen Füzyonundan Promotor Aktivitesi Tayini GPD1-LacZ gen füzyonunda yer alan GPD1 promotorundan yapılan transkripsiyonun kantitatif tayini bu gen füzyonundan maya suşlarında ekspres edilen -galaktozidaz aktiviteleri ölçülerek belirlendi. Bölüm 3.3’de açıklandığı şekilde hazırlanan maya transformantları önce lizat elde etmek için daha önce açıklanan şekilde SDS ve kloroform ile permeabilized edildi (Rose ve ark. 1990, Gurantee 1983). -galaktozidaz 18 aktivitesi tayininde her bir transformants için üçlü olarak deney tüpleri hazırlandı. Bu tüplere önce 980 L Z-tampon çözletisi ve üzerien de 20 L permebilize edilmiş hücre liaztı eklendi. Bu karışım 30 C’de su banyosunda 3 dk bekletildi ve üzerine 200 L ONPG ilave edilerek başlangıç zamanı kronometre ile tayin edildi. Deney tüplerinde belirli tonda (açık sarı renk) sarı renk gelişinceye kadar beklendi. Bu süre sonunda geçen zaman dakika olarak kayıt edildi ve reaksiyonu durdurmak için deney tüplerine 500 L 1 M Na2CO3 ilave edildi. Deney tüpleri masa üstü santrifüjde 1600 rpm’de 5 dk santrifüj edilerek çözeltideki lizat parçaları çöktürüldü, sıvı faz 2 mL’lik spektrofotometre hücrelerine aktarıldı ve 420 nm’deki absorbansları lizat içermeyen kontrol sıvıya karşı ölçülerek kayıt edildi. GPD1-LacZ gen füzyonlarından yapılan - galaktozidaz ekspresyonunu normalize etmek için lizatlardaki toplam çözünür protein konsantrasyonları da daha önce açıklanan şekilde Lowry testi ile belirlendi (Lowry ve ark. 1951). Protein tayinleri için test tüplerine 180 L steril saf su ve 20 L transformantlardan elde edilen ve -galaktozidaz aktivitesi tayininde kullanılan lizatlardan 20 L bu test tüplerine ilave edildi. Daha sonra bu tüplere taze hazırlanmış 1 mL Lowry-C çözeltisi ilave edildi, vorteksle kısaca karıştırldı ve 10 dk beklendi. Daha sonra bu tüplere 1N folin çözeltisinden 100 L ilave edildi, vortekle birkaç sn karıştırıldı ve 30 dk oda sıcaklığunda bekletildi. Bekleme süresi sonunda test tüpleri 1600 rpm’de 5 dk masa üstü santrifüjde santrifüj edilerek çözeltideki maya lizatları çöktürüdü. Sıvı faz 2 mL’lik spektrofotometre tüplerine aktarılarak oluşan mavi rengin absorbansı spektrofotometrede 750 nm’de lizat içermeyen kontrole göre okunarak kayıt edildi. GPD1-LacZ gen füzyonundan yapılan -galaktozidaz aktiviteleri ek-2’de verildiği şekilde hesaplandı. -galaktozida ünitesi nm ONPG/dk/mg protein olarak ifade edildi. -galaktozidaz aktivite tayinleri 3’lü olarak yapıldı. Transformant kültürler de ikişerli olarak üretildi. Bütün deneyler en az iki kez tekrarlandı. Sonuçlar bölümünde verilen -galaktozidaz aktivitelerinde standart sapma değerleri %10-15 aralığındadır. 3. 5. Biyometal İyon Stresinin Hücre Fenotipi ve Üremesine Etkilerinin Tayini Biyometal iyonlarının S. cerevisiae’da hücre fenotipine etkileri logaritmik aşamadaki normal ortamda ve biyometal iyonu uygulanmış ortamdaki kültürlerden 4. saatte örnek alınarak ışık mikroskobunda direkt görüntülenme ile 10x40 büyütme ile incelendi. 19 Maya hücrelerinin ışık mikroskobu görünlerinin fotoğrafları alınarak sonuçlar bölümünde verildi. Biyometallerin S. cerevisiae hücrelerinin üreme özelliklerine etkileri ise kalitatif olarak petri testleri ile tayin edildi. Bunun için logaritmik aşamaya kadar sıvı kültürlerde üretilen maya suşlarından 3-4 L alınarak direkt olarak normal üreme ortamı olan YPD petrisine ve ayrıca sıvı kültürlerde verilen konsantrasyonlarda biyometal iyonlarını içeren YPD petrilerine çizgi ekimi yapıldı. Ekim yapılan maya petrilerinin yüzeyleri kuruduktan sonra 30 C etüvde 24-48 saat inkübe edildi. Petrilerdeki maya hücrelerinin üreme durumları inkübasyon süreleri sonunda fotoğraflandı. Bunlarla ilgili fotoğraflar sonuçlar bölümünde verildi. 20 4- BULGULAR 4. 1. Farklı Biyometal İyonlarının GPD1 Transkripsiyonuna Etkiler Biyometal iyonlarının normal üreme ortamı koşullarında GPD1 geni bazal transkripsiyonuna etkileri GPD1-LacZ raportör gen füzyonu kullanılarak test edildi. Bu çalışmada etkisi test edilen biyometaller sırasıyla; Ca+2, Cu+2, Fe+3, Zn+2 ve Na+2’dır. Elde edilen sonuçların karşılaştırmalı analizinde GPD1 transkripsiyonunun çinko hariç olmak üzere diğer biyometal iyonlarınca en az iki kat aktive edildiğini göstermektedir (Çizelge 4.1). Sodyumun ozmotik stres dolayısıyla GPD1 transkripsiyonunu önemli derecede aktive ettiği ve bu aktivasyonun moleküler bileşenleri daha önce tanımlanmıştır (Albertyn ve ark. 1994). Bu nedenle GPD1 transkripsiyonunun sodyum iyonu ile aktive edilmiş olması da bir çeşit pozitif kontrol olarak araştırmada kullanılan GPD1-LacZ raportör gen füzyonunun doğru şekilde çalıştığını göstermektedir. Diğer biyometal iyonlarının etkileri analiz edildiğinde en fazla aktivasyonun kalsiyum ile gerçekleştiği, bakır ve demir iyonlarının ise yaklaşık iki kat aktivasyona neden olduğu görülmektedir (Çizelge 4.1). Çinkonun verilen konsantrasyonlarda GPD1 transkripsiyonuna etkisi görülmediğinden araştırmanın bundan sonraki aşamalarında incelenmemiştir. GPD1 geni transkripsiyonu bazal seviyesi oldukça yüksek olmasına rağmen kısmen de olsa glukoz baskılaması altındadır (Albertyn ve ark. 1994). Bu nedenle test edilen biyometal iyonlarının GPD1 geni transkripsiyonuna etkileri derepres koşullarda da test edildi. Bunun için logaritmik aşamaya kadar %2 glukoz içeren ortamda üretilen GPD1 transformantı yaban tip maya hücreleri (YST124 suşu) bu aşamada Sc-Ura +%0.1 glukoz içeren ortama aktarıldı ve farklı biyometal iyonlarının etkileri karşılaştırmalı olarak analiz edildi (Çizelge 4.2). Derepres şartlarda tamamen aktif promotor üzerine sadece bakır iyonunun etkin olduğu, bakır iyonunun bazal transkripsiyon durumdan derepres duruma geçişi engellendiği elde edilen sonuçlardan görünmektedir. Derepres şartlarda demir iyonunun GPD1 transkripsiyonuna herhangi bir etkisinin olmadığı, kalsiyumun etkisinin de düşük seviyede kaldığı (%25 kadar artış) görülmektedir. Bu sonuçlardan dolayı araştırmanın bundan sonraki aşamasında biyometallerin GPD1 21 transkripsiyonuna etkilerinin normal üreme koşullarında analiz edilmesinin daha uygun olduğuna karar verildi. Çizelge 4.1. Farklı biyometal iyonlarının repres şartlarda GPD1’de transkripsiyona etkileri. Biyometal iyonu -Galaktozidaz Aktiviteleri*± SD Normal ortam 1762 ± 92 +100 mM Ca2+ 5355 ± 355 +1 mM Cu2+ 3166 ± 87 +1 mM Fe3+ 3460 ± 41 +4. 4 mM Zn2+ 1618 ± 13 +400 mM Na2+ 7679 ± 335 *-Galaktozidaz aktiviteleri nmol ONPG/dakika/mg protein olarak verilmiştir. ± SD: Standart sapma değerlerini göstermektedir. Çizelge 4.2. Farklı biyometal iyonlarının derepres şartlarda GPD1’de transkripsiyona etkileri. Biyometal iyonu -Galaktozidaz Aktiviteleri*± SD Normal derepres ortam 3442 ± 89 +100 mM Ca+2 4583 ± 291 +1 mM Cu+2 1385 ± 42 +1 mM Fe+3 3641 ± 175 +400 mM Na+2 5783 ± 105 *-Galaktozidaz aktiviteleri nmol ONPG/dakika/mg protein olarak verilmiştir. ± SD: Standart sapma değerlerini göstermektedir. 22 Bu araştırmada incelenen biyometal iyonlarının GPD1 transkripsiyonuna etkilerinin kümülatif olup olmadıkları da test edildi. Bunun için normal üreme ortamında bulunan yaban tip GPD1 transformantları aynı anda ikili metal iyon streslerine maruz bırakıldı. Sonuçlar Çizelge 4. 3’de verildi. İkili olarak test edilen biyometal iyon stresinin GPD1 transkripsiyonu üzereine kümülatif etki göstermediği bulundu. Kalsiyum ve demir stresinin eş zamanlı olarak uygunlanması durumumda GPD1 transkripsiyonunun kalsiyum stresi kadar aktive edildiği bulundu (Çizelge 4.3). Buna benzer şekilde kalsiyum ve sodyum stresinde de GPD1 transkripsiyonunun tek başına sodyum iyon stresi seviyesine kadar aktive edildiği bulundu. Kalsiyum ve bakır stresi ortamının da GPD1 transkripsiyonunun yaklaşık olarak kalsiyum ile aktive edilen seviyede gerçekleştiği görüldü (Çizelge 4.3). Bu sonuçlar araştırmada uygulanan biyometal iyonu stresi şartlarının etkilerinin kümülatif veya sinerjistik olmadığını göstermektedir. Çizelge 4.3. İkili metal iyon stresinin GPD1’de transkripsiyona etkileri. Biyometal iyonu -Galaktozidaz Aktiviteleri*± SD Normal derepres ortam 1762 ± 92 Ca+2 + Fe+3 5016 ± 545 Ca+2 + Na+2 7174 ± 226 Ca+2 + Cu+2 4825 ± 294 *-Galaktozidaz aktiviteleri nmol ONPG/dakika/mg protein olarak verilmiştir. ± SD: Standart sapma değerlerini göstermektedir. 4. 2. Msn2p’nin Biyometal Stresinde GPD1 Transkripsiyonuna Etkileri Transkripsiyon faktörü Msn2p genel stres şartları altında aktive edilip stres koşullarında ilgili genlerin transkripsiyonel aktivasyonu için gereklidir. Msn2p STRE (Stress Response Element) olarak bilinen DNA sekansına (5’-CCCT-3’) bağlanmaktadır (Martinez-Pastor ve ark. 1996). GPD1 promotorunda potansiyel transkripsiyon faktörü 23 bağlanma dizileri YEASTRACT veritabaında analiz edildiğinde Msn2p/Msn4p faktörleri için bağlanma sekansı olduğu görülmektedir (Anonim 2020c). Msn2p’nin biyometal iyon stresine bağlı olarak da GPD1 transkripsiyonunu aktive edip etmediği MSN2 geni delesyonlu maya suşunda test edildi ve elde edilen sonuçlar yaban tip maya suşu ile karşılaştırıldı. Msn2p faktörünü içermeyen mutant S. cerevisiae suşunda normal koşullarda ölçülen transkript miktarının yaklaşık olarak yaban tip maya suşunda görülen seviyede gerçekleştiriği bulundu (Çizelge 4.4). Ancak msn2 mutant maya suşunda biyometal iyonları stresine yanıt olarak yaban tip maya suşuna göre çok daha düşük seviyede aktivasyon gerçekleştiği bulunudu (Çizelge 4.4). Kalsiyum ve demir iyon stresine yanıt olarak GPD1 transkripsiyonunda yaklaşık %40-50 kadar bir artış olduğu görüldü. Bakır stresi uygulandığında ise bu mutant suşta hiçbir aktivasyon gerçekleşmediği görüldü. GPD1 promotorunun sodyumla aktivasyonunun da yaban tip suşa göre sadece iki kat kadar gerçekleştiği görüldü. Bu sonuçlar transkripsiyon faktörü Msn2p’nin kısemn de olsa biyometal iyonları stresine yanıt olarak GPD1 geni transkripsiyonu aktivasyonunda yer aldığını göstermektedir. Çizelge 4.4. Msn2p’nin biyometal iyonu stresinde GPD1’de transkripsiyona etkileri. Biyometal iyonu -Galaktozidaz Aktiviteleri*± SD Normal derepres ortam 1739 ± 92 +100 mM Ca+2 2450 ± 10 +1 mM Cu+2 1581± 105 +1 mM Fe+3 2590 ± 175 +400 mM Na+2 3855 ± 199 *-Galaktozidaz aktiviteleri nmol ONPG/dakika/mg protein olarak verilmiştir. ± SD: Standart sapma değerlerini göstermektedir. 24 4. 3. Hog1p ve Hot1p’nin Biyometal Stresinde GPD1 Transkripsiyonuna Etkileri Protein kinaz Hog1p S. cerevisiae’da çeşitli çevresel streslere yanıt olarak aktive edilen ve etkileştiği faktörleri fosforlayıp aktivitelerini değiştiren önemli bir sinyal iletim faktörüdür. Hog1p’nin GPD1 transkripsiyonunu sodyum iyon stresine bağlı olarak aktive ettiği ve bunun sonucu olarak da S. cerevisiae’da gliserol biyosentezi sağladığı bilinmektedir (Hohmann 2002). Araştırmamızda protein kinaz Hog1p’nin biyometal iyonlarına yanıt olarak da GPD1 transkripsiyonuna etkisi olup olmadığı test edildi. Bu amaçla HOG1 geni delesyonlu mutant suş kullanılarak elde edilen sonuçlar yaban tip maya suşu sonuçları ile karşılaştırıldı. Hog1 mutant suşunda bazal seviyede GPD1 transkripsiyonun da yaban tip seviyeye göre yaklaşık 2 kat azaldığı görüldü (Çizelge 4.5). Biyometal iyonlarına maruz bırakılan hog1 mutantında GPD1 transkripsiyonunda hiçbir aktivasyon olmadığı gibi bakır stresi koşullarında GPD1 transkripsiyonunda %50 kadar azalma olduğu bulundu (Çizelge 4.5). Kalsiyum, demir ve sodyum iyon stresine maruz bırakılan hog1 mutant suşunda GPD1 geni traskripsiyonunun yaklaşık olarak 850-936 seviyelerinde gerçekleştiği görüldü. Çizelge 4.5. Hog1p sinyal iletim yolağının biyometal iyonu stresinde GPD1’de transkripsiyona etkileri. Maya suşları ve -Galaktozidaz Aktiviteleri*(± SD) Biyometal iyonları hog1 mutantı hot1 mutantı Normal ortam 850 ± 54 1917 ± 161 +100 mM Ca+2 829 ± 26 3621 ± 272 +1 mM Cu+2 458 ±27 1028 ± 116 +1 mM Fe+3 860 ± 5 3519 ± 8 +400 mM Na+2 939 ± 8 NA 25 Hop1p kinazın etkisi ile aktive edilen çok sayıda transkripsiyon faktörlerinden birisi de Hot1p’dir. Hot1p’nin ozmotik stres koşullarında GPD1 transkripsiyonu aktivasyonu için gerekli olduğu da daha önceki çalışmalarda bulunmuştur (Rep ve ark. 2000). Araştırmamızda biyometal iyon stresine yanıt olarak GPD1 geni transkripsiyonunda Hot1p’nin de işlevi olup olmadığı incelendi (Çizelge 4. 5). Normal üreme koşullarında hot1 mutant suşunda GPD1 transkripsiyonunun yaban tip maya suşunda olduğu seviyede gerçekleştiği bulundu. Biyometal iyon stresi uygulanan hot1p mutantı maya suşunda kalsiyum ve demir iyon stresine karşı GPD1 transkripsiyonunda kısmen aktivasyon gerçekleştiği fakat bakır iyon stresine karşı bu mutant suşta aktivasyon görülmediği bulundu (Çizelge 4. 5). Elde edilen sonuçlar biyometal iyonu stresine karşı, bakır iyon stresi hariç, Hot1p’nin de kısmen işlevsel olduğunu göstermektedir. 4. 4. Aft1p’nin Biyometal Stresinde GPD1 Transkripsiyonuna Etkileri Transkripsiyon faktörü Aft1p S. cerevisiae’da demir iyonu taşınımı ve dengesi için gerekli olan bir transkripsiyon faktörü olup bu metal iyonunun S. cerevisiae’da kullanımı ile ilgili faktörleri kodlayan genlerin aktivatörüdür (Yamaguchi-Iwai ve ark. 1996). Araştırmamızın bu bölümünde Aft1p’nin GPD1 transkripsiyonunda işlevi olup olmadığı bu faktörü içermeyen mutant suş kullanarak incelendi. Normal ortamda üretilen aft1 mutant suşunda yaban tip maya suşuna göre GPD1’in bazal transkripsiyonunda artış olduğu görüldü. Fakat kalsiyum ve demir iyon stresine yanıt olarak GPD1 transkripsiyonunda artış olduğu görülmektedir (Çizelge 4.6). Bakır stresine yanıtta ise bu mutant suşta GPD1 transkripsiyonunun yaklaşık 2 kat azaldığı bulundu (Çizelge 4.6). 26 Çizelge 4.6. Transkripsiyon faktörü Aft1’in biyometal iyonu stresinde GPD1’de transkripsiyona etkileri. Biyometal iyonu -Galaktozidaz Aktiviteleri*± SD Normal ortam 2149 ± 191 +100 mM Ca+2 4053± 205 +1 mM Cu+2 824± 25 +1 mM Fe+3 3301 ± 112 *-Galaktozidaz aktiviteleri nmol ONPG/dakika/mg protein olarak verilmiştir. ± SD: Standart sapma değerlerini göstermektedir. 4. 5. Yap5p’nin Biyometal Stresinde GPD1 Transkripsiyonuna Etkileri Transkripsiyon faktörü Yap5p stresle aktive edilen faktör olup demir iyonlarına yanıtta bazı genlerin aktivasyonu için gereklidir (Li ve ark. 2008). S. cerevisiae’da sitoplazmik demir iyonlarının vokuol’e taşınmasını sağlayan CCC1 geni aktivasyonunu da sağlar (Li ve ark. 2008). Araştırmamızda Yap5’nin biyometal iyonu stresine yanıt olarak GPD1 geni transkripsiyonuna etki edip etmediği de yap5 mutant S. cerevisiae suşu kullanılarak incelendi. Bu mutant suşta normal ortamda üretilen GPD1’de bazal transkripsiyone seviyesinin yaban tip suşa oranla artış gösterdiği görülmektedir. Biyometal iyonları kalsiyum ve demir stresi uygulandığında yap5 mutant suşunda yaklaşık 2 kat artış meydana geldiği görüldü (Çizelge 4.7). Bakır stresi uygulanan mutants suşta ise GPD1 transkripsiyonunda azalma olduğu bulundu. Bu sonuçlar Yap5p’nin biyometal iyonları stresine yaban tip suşa benzer şekilde yanıt verdiğini göstermektedir. 27 Çizelge 4.7. Transkripsiyon faktörü yAP5p’nin biyometal iyonu stresinde GPD1’de transkripsiyona etkileri. Biyometal iyonu -Galaktozidaz Aktiviteleri*± SD Normal ortam 2766 ± 290 +100 mM Ca+2 5130± 176 +1 mM Cu+2 2052± 26 +1 mM Fe+3 4515 ± 230 *-Galaktozidaz aktiviteleri nmol ONPG/dakika/mg protein olarak verilmiştir. ± SD: Standart sapma değerlerini göstermektedir. 4. 6. Biyometal İyonları Stresinin Hücre Fenotipine ve Üremeye Etkileri Bu araştırmada incelenen biyometal iyonlarının hücre morfolojilerine etkileri direkt olarak ışık mikroskobunda incelendi ve normal ortamda üreyen maya hücreleri ile karşılaştırıldı. Biyometal iyonlarının üremeye etkileri ise kalitatif olarak metal iyonlarını içeren petrilerde tayin edildi. Farklı biyometal iyonlarını sıvı kültürlerde uygulanan konsantrasyonlarda içeren tam besiyeri (YPD) ortamına ekilen yaban tip ve mutant maya suşlarının biyometal iyonlarına karşı olan duyarlıklıklarında da farklılıklar görüldü. Sodyum stresi uygulanan üreme ortamında hog1 ve aft1 mutantlarında üreme olmadığı görüldü (Şekil 4.1). Hog1p’nin sodyum stresine yanıt için gerekli olduğu bilindiğinden 400 mM sodyum içeren ortamda hog1 mutant suşunda beklendiği şekilde üreme olmadığı görülmektedir. Ancak bu üreme ortamında aft1 mutant suşunda da üreme olmaması beklenmeyen bir sonuçtur. Araştırmada kullanılan mutant maya suşlarının demir stresi uygulanan ortamda üreme durumlarının etkilenmediği herbirinin normal yaban tip maya seviyesinde üreme gösterdikleri bulundu (Şekil 4.2). 28 Şekil 4.1. Sodyum stresinin farklı maya suşlarının üremesine etkileri. Şekil 4.2. Kalsiyum ve demir stresinin farklı maya suşlarında üremeye etkileri. 29 Kalsiyum stresine karşı da sadece aft1 mutant suşunda üreme görülmedi. Bu durum Aft1p’nin sadece demir iyonu taşınımı ve hücresel dengesi için değil kalsiyum ve sodyum iyonlarının oluşturduğu strese yanıt için de işlevleri olabileceğini öne sürmektedir. Sıvı kültür ortamında GPD1 transkripsiyonunun en çok etkilendiği bakır iyonu stresine karşı da araştırmada kullanılan maya suşlarında üreme durumlarına önemli bir etkisinin olmadığı bulundu. Ancak aft1 mutant suşunda 24 saatlik inkübasyon sonucu üreme yaban tip suşa göre yavaş ve yetersiz durumda iken 48. saat sonunda bu mutants suşta da bakır stresinin üremeye etkisi olmadığı görüldü (Çizelge 4.3). Şekil 4.3. Farklı maya suşlarında bakır stresinin üremeye etkileri. Araştırmamızda incelenen biyometal iyonlarının hücre morfolojilerine olan etkileri de mikroskobik olarak incelendi. Ancak tez araştırmasının bu aşaması için sıvı kültür ortamında GPD1 transkripsiyonunun en fazla etkilendiği mutant suş olan hog1 mutant 30 suşunun fenotipik özellikleri için yaban tip hücre morfolojileri ile karşılaştırmalı olarak inceleme yapıldı. Biyometal iyonlarının hücre morfolojisine etkilerinin incelenmesinde bu metal iyonlarının hücre büyüklükleri ve tomurcuklanma durumuna etkileri dikkate alındı. Kalsiyum stresinin normal hücrede araştırmada kullanılan inceleme koşullarında hücre morfolojine önemli bir etkisi görülmedi (Şekil 4.4). Kalsiyum stresi uygulanan hücrelerde tomurcuklanmamış hücre sayılarının daha fazla olduğu dikkat çekmektedir. Ancak bakır ve demir iyon stresinin maya hücrelerinde hücre büyüklüklerinde önemli artışa neden olduğu ve anormal tomurcuklanmaya neden olduğu görüldü (Şekil 4.5) Şekil 4.4. Kalsiyumun yaban tip hücrede morfolojik etkisi. A panelinde normal üreme ortamı, B panelinde ise kalsiyum stresi uygulanmış ortamdaki hücre şekilleri görülmektedir. 31 Şekil 4.5. Bakır ve demir iyon stresinin yaban tip hücrede morfolojik etkisi. A panelinde bakır stresi uygulanmış üreme ortamı, B panelinde ise demir stresi uygulanmış ortamdaki hücre şekilleri görülmektedir. Elde edilen sonuçlar özellikle demir ve bakır iyon stresinin maya hücrelerinde hücre büyüklüklerinde artışa ve bölünme şeklinde anomaliye yol açabildiğini göstermektedir. Bakır stresinde bazı hücrelerde G1 aşaması tamamlanmadan yani hücreler belirli bir büyüklüğe erişmeden tomurcuklanma yani S fazının başladığı da görülmektedir (Şekil 4.5 A paneli). Farklı bir anomali olarak yine bakır stresi uygulanmış hücrelerde bir S fazı tamamlanmadan aynı ana hücrede ikinci bir S fazı (tomurcuklanma) olduğu da görülmektedir (Şekil 4.5). 32 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Biyometal iyonları bütün organizmalar için büyüme ve gelişme için gereklidir. Bu iyonların hücre içine taşınması ve hücredeki konsantrasyonlarının da sıkı şekilde kontrol edilmeleri gerekir. Kadmiyum, krom gibi bazı toksik metal iyonlarının düşük seviyede (sub-letal) hücreye uygulanması ile maya hücrelerinde genlerin %22’sinde (6000 maya geninden 1320 tanesinde) transkripsiyon seviyesinde en az iki kat değişiklik olduğu daha önce gösterilmiştir (Jin ve ark. 2008). Toksik metal iyonlarına karşı maya hücrelerinde çeşitli detoksifikasyon mekanizmaları geliştirilmiştir. Ancak hücre metabolizması için hücreye alınması gereken biyometal iyonlarının da konsantrasyonlarının belirli aralıklarda olması gerekir. Bu durum S. cerevisiae’da biyometal iyonlarının hücreye taşınımı ve hücre içinde farklı organellerde (Vokuol ve mitokondri gibi) belirli konsantrasyonlarda depolanması ile sağlanır (Cyert ve Philpott 2013). Bu araştırmada bazı biyometal iyonlarının (Ca2+, Cu2+, Fe3+, Zn+, Na+) S. cerevisiae’da hücresel etkileri ve GPD1 geni transkripsiyonuna etkileri araştırıldı. Araştırmada kullanılan biyometal iyonları daha önceden tanımlanan konsantrasyonda petrilerde veya sıvı kültürde üretilen maya hücrelerine uygulandı (Schmidt ve ark. 2009). Araştırmamızda öncelikle yaban tip laboratuvar suşu olarak kullanlan S. cerevisiae hücrelerinde verilen biyometal iyonlarının GPD1 geni transkripsiyonuna etkileri incelendi. Bu incelemede GPD1 geni promotor bölgesini içeren GPD1-LacZ raportör gen füzyonu kullanıldı. Bu gen füzyonunda transkripsiyonel aktivasyonun normal GPD1 geninde olduğu gibi kontrol edildiği daha önce yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir (Rep ve ark. 2000). Logaritmik aşamada glukoz baskılaması olan koşullarda üretilen S. cerevisiae hücrelerinde uygulanan biyometal iyonu stresi koşullarında GPD1 transkripsiyonunun iyon çeşidine göre değişmekle birlikte 2-4 kat aktive edildiği bulundu. En yüksek aktivasyonun ise sodyum iyonları ile sağlandığı görüldü. Sodyum’un ozmotik stres yolağını aktive ederek GPD1 transkripsiyonunu aktive ettiği daha önceden gösterilmiştir (Eriksson ve ark. 1995). GPD1 transkripsiyonunun sodyum iyon stresi ile aktivasyonu araştırmamızda pozitif kontrol olarak da değerlendirilebilir. Demir, bakır ve özellikle kalsiyum stresine yanıt olarak 33 GPD1 transkripsiyonunun 2-3 kat aktive edilmesi bu genin transkripsiyonunun biyometal iyonlarına yanıt olarak da kontrol edildiğini göstermektedir. GPD1 geni transkripsiyonu aynı zamanada glukoz baskılaması ile de kontrol edilmektedir. Diğer ifade ile yüksek glukoz konsantrasyonlarında transkripsiyonu daha düşük seviyede, düşük glukoz konsantrasyonlarında ise transkripsiyonu daha fazla gerçekleşmektedir. Biyometal iyonlarının glukoz baskılamasının olmadığı koşullarda (üreme ortamında +0.1 glukoz varlığında) GPD1 transkripsiyonuna etkileri de incelendi. Elde edilen sonuçlarda biyometal iyonlarının glukoz baskılamssının olmadığı koşullarda aktive edilmiş GPD1 transkripsiyonuna çok fazla etkisi olmadığını gösterdi (Çizelge 4.1 ve 4.2). Ancak buna rağmen sodyum ve kalsiyum stresinin glukoz baskılamasının olmadığı koşullarda da GPD1 transkripsiyonuna düşük seviyede de olsa etkilerinin olduğu görüldü. Bakır iyonlarının ise glukoz baskılamssının olmadığı koşullarda GPD1 transkripsiyonunun aktivasyonu engellediği ortaya konuldu. Biyometal iyonlarının olmadığı koşullarda 1618 üniteden 3492 üniteye çıkan GPD1 transkripsiyonunun ortamda bakır iyonu bulunduğunda derepres koşullarda transkripsiyonun aktive edilemediği bulundu (Çizelge 4.2). Bu durum bakır iyonlarına bağlı olarak glukoz derepressed koşullarda GPD1 transkripsiyonun baskılandığını göstermektedir. Bakır iyonları ile aktive edilen transkripsiyon faktörlerinden bir veya birkaçının (örneğin yAP grubu faktörler) GPD1 transkripsiyonunu derepres koşullarda baskılıyor olabilir (Çizelge 4.2). Araştırmada uygulanan biyometallerden GPD1 transkripsiyonuna en yüksek etkisi olan kalsiyum ve sodyumdur. Araştırmada uygulanan biyometal iyonu stresinin GPD1 transkripsiyonuna etkilerinin kümülatif veya sinerjistik olup olmadığını da test etmek için bu metal iyonları S. cerevisiae suşuna ikili kombinasyonlar olarak da uygulandı. Kalsiyumla birlikte uygulanan demir, bakır ve sodyum iyonlarının herhangi bir kümülatif etkilerinin olamdığı görüldü (Çizelge 4.3). Bu durum incelenen biyometal iyonlarının farklı yolaklar üzerinden değil ortak bir faktör üzerinden etki ettiğini göstermektedir. Biyometal iyonlarının hangi transkripsiyon faktörleri aracılığı ile GPD1 transkripsiyonuna etki ettiklerini de analiz etmek için biyometal iyonları ile aktive 34 edildiği bilinen transkripsiyopn faktörlerinin olmadığı mutant maya suşları kullanıldı ve sonuçlar yaban tip maya suşundan elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldı. Genel stres yanıtı transkripsiyonel aktivatörü olduğu bilinen Msn2 faktörünü içermeyen mutant maya suşunda biyometal iyonu stresi uygulanması sonucu GPD1 transkripsiyonunda kısmen azalma olduğu görüldü. Bu durum biyometal iyonu stresine yanıt olarak gerçekleşen GPD1 transkripsiyonel aktivasyonunun kısmen Msn2/4’e bağlı olduğunu göstermektedir. Hog1p protein kinaz olup başta sodyum stresi olmak üzere farklı stresler ile aktive edilip hücre döngüsünü kontrol eden protein kinazdır. Araştırmamızda Hog1 kinaz mutantında GPD1 transkripsiyonunda biyometal iyonlarına bağlı olarak GPD1 transkripsiyonunda hiçbir aktivasyon olmadığı hatta bakır stresine yanıt olarak en az 2-kat baskılama olduğu bulundu. Bu durum biyometal iyonları stresine yanıt olarak GPD1 transkripsiyonu aktivasyonunun tamamen Hog1p kinaza bağlı olduğunu göstermektedir (Çizelge 4.5). Hog1p protein kinaz olarak hücrede farklı transkripsiyon faktörlerini aktive etmektedir. Bu faktörlerden birisi de Hot1p’dir. Hot1p mutant suşunda yapılan çalışmada kalsiyum ve demir iyonlarına bağlı aktivasyonun Hot1p’den bağımsız olduğunu ancak bakır iyonlarına bağlı olan aktivasyonun Hot1p’ye bağlı olduğu görüldü. Çünkü, yaban tip maya susuşunda bakır stresi koşullarında 3166 ünite olan GPD1 transkripsiyonunun hot1 mutant suşunda aktive edilemediği ve 1028 ünite olarak bazal seviyede kaldığı görülmektedir (Çizelge 4.1 ve Çizelge 4.5). Aft1 transkripsiyon faktörü demir iyonlarının hücreye alınması ile ilgili faktörleri kodlayan genlerin aktivatörüdür. Bu transkripsiyon faktörünü içermeyen aft1 mutant suşunda da GPD1 transkripsiyonu normal ve biyometal iyonu stresi koşulşlarında analiz edildi. Kalsiyum stresine bağlı aktivasyonun Aft1 mutasyonundan etkilenmedi ancak bakır stresine bağlı aktivasyonun Aft1p’ye bağlı olduğu görüldü. Demir stresine bağlı aktivasyonun da Aft1 mutasyonundan etkilenmedi görüldü. Bu durum GPD1 transkripsiyonunun demir stresine bağlı aktivasyonun Aft1p’den bağımsız olarak gerçekleştiğini de göstermektedir. Aynı zamanda bakır stresine bağlı aktivasyonun hem Hot1p ve hem de Aft1p’ye bağlı olduğu görülmektedir (Çizelge 4.6). Bu faktörler eke olarak transkripsiyon faktörü yAP5’in de biyometal iyonlarına bağlı olarak GPD1 transkripsiyonuna etkileri incelendi. Kalsiyum ve demir stresine bağlı aktivasyonun yAP5’den bağımsız olarak gerçekleştiği ancak bakır stresine yanıtın yAP5’e bağlı 35 olduğu görüldü (Çizelge 4.7). Yapılan bu incelemeler sonucu özellikle bakır stresine yanıt olarak GPD1 transkripsiyonunun kontrol edilmesinde Msn2, Hot1p, Aft1p ve Yap5’nin direkt veya dolaylı olarak etkileri olduğu bulundu. Biyometal iyonlarına bağlı stresin S. cerevisiae’da üreme hızı petri testleri ile hücre morfolojilerine olan etkileri ise mikroskobik olarak incelendi. Biyometal iyonlarına bağlı olarak yaban tip maya hücrelerinde (YST124) üreme hızında petrilerde herhangi bir önemli fark görülmedi (Şekiller 4.1-4.3). Ancak özellikle Daft1 mutantı maya suşunun kalsiyum ve sodyum stresi uygulanan ortamlarda üremediği bulundu. Bu durum Aft1’in hücre döngüsünü ve bölünmesini kontrol eden faktörlere de etki ettiğini göstermektedir. Beklendiği şekilde hog mutantı maya suşunda sodyum stresi uygulanan ortamda üreme olmadığı bulundu. Ayrıca, aft1 mutant suşunun bakır stresine yanıt olarak başlangıçta (ilk 24 saat) üremesinin gerçekleşmediği ancak daha sonra bu mutant suşun bakır stresine adapte olarak üremesinin gerçekleştiği de görüldü (Şekiller 4.1-4.3). Biyometal stresi uygulanan hücrelerde ise bazı morfolojik anomaliler olduğu görüldü. Demir ve bakır stresi uygulanan hücrelerde normal üreme ortamına göre hücre büyüklüklerinde artış ve çoklu tomurcuklanma gibi fenotipler görüldü (Şekil 4.4-4.5). Özellikle çoklu tomurcuklanma olması bakır stresinin G1 ve S aşamalarında önemli anoliler olduğunu G1 tamamlanmadan tekrar S fazına geçildiği veya aynı hücrede iki kez S fazı oluşumuna yol açtığı şeklinde değerlendirildi. Araştırmada elde edilen sonuçlar GPD1 geni transkripsiyonunun biyometal iyon çeşidine bağlı olarak farklı transkripsiuyon faktörleri ile kontrol edildiğini ve bazı biyometal iyonlarının (örneğin bakır) hücre morfolojisinde anomaliye neden olduğunu göstermiştir. 36 KAYNAKLAR Albertyn, J., Hohmann, S., Thevelein, J.M., Prior, B.A. 1994. GPD1, which encodes glycerol-3-phosphate dehydrogenase, is essential for growth under osmotic stress in Saccharomyces cerevisiae, and its expression is regulated by the high-osmolarity glycerol response pathway. Mol. Cell. Biol., 14: 4135–4144. Anonim, 2020a. Saccharomyces cerevisiae Genome Database (SGD). https://www.yeastgenome.org (Erişim tarihi: 15.12.2020) Anonim, 2020b. Saccharomyces cerevisiae. https://tr.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae (Erişim tarihi: 15.12.2020) Anonim, 2020c. YEASTRACT (Yeast Search for Transcriptional Regulators And Consensus Tracking). http://www.yeastract.com/ (Erişim tarihi: 15.12.2020) Anonim, 2020d. Yeast pathways. https://pathway.yeastgenome.org/YEAST/NEW-IMAGE?type=PATHWAY&object=PWY3O- 48&detail-level=2 (Erişim tarihi: 15.12.2020) Ansell, R., Granath, K., Hohmann, S., Thevelein, J.M., Adler, L. 1997. The two isoenzymes for yeast NAD+-dependent glycerol 3-phosphate dehydrogenase encoded by GPD1 and GPD2 have distinct roles in osmoadaptation and redox regulation. EMBO J., 16: 2179–2187. Björkqvist, S., Ansell, R., Adler, L., Liden, G. 1997. Physiological response to anaerobicity of glycerol-3-phosphate dehydrogenase mutants of Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 63:128–132. Botstein, D., Fink G.R. 2011. Yeast: An experimental organism for 21st Century Biology. Genetics, 189: 695−704. Brachmann, C.B., Davies, A., Cost, G.J., Caputo, E., Li, J., Hieter, P., Boeke, J.D. 1998. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a Useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast, 14: 115–132. Brown, T.A. 2013. Genomlar 3. Ed. Bardakçı, F., Ülger, C. Nobel Akademik yayıncılık Eğitim danışmanlık Tic. LTD.ŞTİ. Türkiye, 705 pp. Chen, X., Fang, H., Rao, Z., Shen, W., Zhuge, B., Wang, Z., Zhuge, J. 2008. Cloning and characterization of a NAD+-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene from Candida glycerinogenes, an industrial glycerol producer.FEMS Yeast Research, 8: 725−734. Cyert, M.S. 2001. Genetic analysis of calmodulin and its targets in Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Genetics, 35: 647–672. 37 Cyert, M.S., Philpott, C.C. 2013. Regulation of cation balance in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 193: 677−713. Eriksson P., André L, Ansell R, Blomberg A, Adler, L. 1995. Cloning and characterization of GPD2, a second gene encoding sn-glycerol 3-phosphate dehydrogenase (NAD+) in Saccharomyces cerevisiae, and its comparison with GPD1. Mol Microbiol., 17 :95-107. Farabaugh, P.J., Liao, X.B., Belcourt, M., Zhao, H., Kapakos, J., Clare, J. 1989. Enhancer and silencerlike sites within the transcribed portion of a Ty2 transposable element of S. cerevisiae. Mol Cell Biol., 9 :4824−4834. Feldman, H. 2012. Yeast: Molecular and Cellular Biology, Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany, 1650pp. Fernandez, L., Rodrigues-Pousada, C., Struhl, K. 1997. Yap, a novel family of eight bZIP proteins in Saccharomyces cerevisiae with distinct biological functions. Mol Cell Biol., 17: 6982–6993 Gietz, R.D., Schiestl, R.H., Willems, A.R., Woods, R.A. 1995. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast, 11: 355–360. Gimeno, C.J., Ljungdahl, P.O., Styles, C.A., Fink, G.R. 1993. Characterization of Saccharomyces Cerevisiae Pseudohyphal Growth. Dimorphic Fungi in Biology and Medicine, 83-103. Goffeau, A., Barrell, B.G., Bussey, H., Davis, R. W., Dujon, B., Feldmann, H., Louis, E.J. 1996. Life with 6000 genes. Science, 274: 546−567. Goldman, A., Roy, J., Bodenmiller, B., Wanka, S., ve ark. 2014. The Calcineurin signaling network evolves via conserved kinase–phosphatase modules that transcend substrate identity. Mol Cell., 55: 422–435. Hartwell, L.H. 1973. Genetic control of the cell division cycle in yeast: V. genetic analysis of cdc mutants. Genetics, 74: 267–286. Herskowitz, I. 1988. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. rev., 52: 536–553. Hohmann, S. 2002. Osmotic stress signaling and osmoadaptation in yeasts. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66: 300–372. Jin, Y.H., Dunlap, P.E., McBride, S.J., Al-Refai, H., Bushel, P.R., vd. 2008. Global transcriptome and deletome profiles of yeast exposed to transition metals. PLoS Genet., 4(4): e1000053. 38 Jomova, K., Valko, M. 2011. Advances in metal-induced oxidative stress and human disease. Toxicology, 283: 65−87. Jung, S., Marelli, M., Rachubinski, R.A., Goodlett, D.R., Aitchison, J.D. 2010. Dynamic changes in the subcellular distribution of Gpd1p in response to cell stress. J. Biol. Chem., 285: 6739–6749. Li, L., Bagley, D., Ward, D.M., Kaplan, J. 2008. Yap5 is an iron-responsive transcriptional activator that regulates vacuolar iron storage in yeast. Mol Cell Biol., 28: 1326−1337. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem., 193: 265−275. Martinez-Pastor, M.T., Marchler, G., Schuller, C., Marchler-Bauer, A., Ruis, H., Estruch, F. 1996. The Saccharomyces cerevisiae zinc finger proteins Msn2p and Msn4p are required for transcriptional induction through the stress-response element (STRE). EMBO J. 15: 2227–2235. Merhej, J., Delaveau, T., Guitard, J., Palancade, B. ve ark. 2015. Yap7 is a transcriptional repressor of nitric oxide oxidase in yeasts, which arose from neofunctionalization after whole genome duplication. Molecular Microbiol., 96: 951– 972. Morano, K.A., Grant, C.M., Moye-Rowley, W.S. 2012. The response to heat shock and oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 190: 1157-1195. Nelson, D.L., Cox, M.M. 2013. Biyokimyanın İlkeleri. Ed. Elçin, M., Palme Yayıncılık, Türkiye, 1158pp. Pokusa, M., Trancikova, A.K. 2017. The central role of biometals maintains Oxidative balance in the context of metabolic and neurodegenerative disorders. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, Volume 2017, Article ID 8210734. Rep, M., Krantz, M., Thevelein J.M., Hohmann, S. 2000. The transcriptional response of Saccharomyces cerevisiae to osmotic shock. J. Biol. Chem., 275: 8290– 8300. Rose, M.D., Winston, F., Heiter, P. 1990. Methods in Yeast Genetics. A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA. Rivera –Mancía, S., Pérez-Neri, I., Ríos, C., Tristán-López, L., Rivera-Espinosa, L., Montes, S. 2010. The transition metals copper and iron in neurodegenerative diseases. Chem Biol Interact., 186: 184–199. Schmidt, K., Wolfe, K.D., Barbara Stiller, B., Pearce, D.A. 2009. Cd2+, Mn2+, Ni2+ and Se2+ toxicity to Saccharomyces cerevisiae lacking YPK9p the orthologue of human ATP13A2. Biochem Biophys Res Comm., 383: 198–202. 39 Stearman, R., Yuan, D.S., Yamaguchi-Iwai, Y., Klausner, R.D., Dancis, A. 1996. A permease-oxidase complex involved in high-affinity iron uptake in yeast. Science, 271: 1552–1557. Thewes, S. 2014. Calcineurin-Crz1 signaling in lower eukaryotes. Eukaryotic Cell, 13: 694–705. Valadi, A., Granath, K., Gustafsson, L., Adler, L. 2004. Distinct intracellular localization of Gpd1p and Gpd2p, the two yeast isoforms of NAD+-dependent glycerol- 3-phosphate dehydrogenase, explains their different contributions to redox-driven glycerol production. J. Biol. Chem., 279: 39677–39685. Wysocki, R., Tamas, M. J. 2010. How Saccharomyces cerevisiae copes with toxic metals and metalloids. FEMS microbiology reviews, 34: 925-951. Xie, J., Ye, J., Cai, Z., Luo, Y., Zhu, X., Deng, Y., ... & Liang, Y. (2020). GPD1 Enhances the Anticancer Effects of Metformin by Synergistically Increasing Total Cellular Glycerol-3-Phosphate. Cancer Research, 80(11), 2150−2162. Yamaguchi-lwai, Y., Stearman, R., Dancis, A., Klausner, R.D. 1996. Iron-regulated DNA binding by the AFT1 protein controls the iron regulon in yeast. EMBO J., 15: 3377−3384. 40 EKLER EK 1. Besiyeri ve Çözeltilerin Hazırlanması EK 2. β- Galaktozidaz Aktivitesi Hesaplanması EK 3. Metal İyon Çözeltilerinin Hazırlanması 41 EK 1. Besiyeri ve Çözeltilerin Hazırlanması 1: Yeast Ekstrakt, Pepton, Dekstroz (YPD) (Tam Besiyeri) 10 g yeast ekstrakt ve 20 g pepton saf suda çözüldü. Katı besiyeri (petriler) için, sıvı besiyeri ortamına 20 gram/litre oluşturacak şekilde Agar agar eklendi ve 121°C sıcaklıkta, 25 dk steril edildi. Karbon kaynağı olarak %20’lik stok çözelti halinde glikoz hazırlandı, 121°C’de 25 dakika otoklavda steril edildi. Glikoz, kullanımından önce besiyerlerine son konsantrasyonu %2 olacak şekilde ortama ilave edildi. Tam besiyeri S. cerevisiae suşlarının transformasyon öncesi rutin üremesi için kullanıldı. 2: Urasil İçermeyen Sentetik Tam Besiyeri (Sc-Ura) Sc-Ura besiyerini hazırlamak için 1.7 gram/litre Yeast Nitrogen Base (YNB), 5 gram/litre Amonyum sülfat distile suda çözülüp, otoklavda steril edildi. Otoklavdan sonra Sc-Ura amino asit karışımı 1 gram/litre olacak şekilde saf suda çözüldü ve 0.45 mm’lik disk filtre ile steril edilerek verilen konsantrasyonlarda besiyerine eklendi. Sc-Ura katı besiyerleri için 20 gram/litre olacak şekilde Agar agar ilave edildi. Glukoz son konsantrasyonu %2 olacak şekilde %20’lik steril stok çözeltiden deneydeki kullanımdan hemen önce ilave edildi. Derepres şartlar için son konsantrasyon %0.1 olacak şekilde steril glukoz ilavesi yapıldı. 3: Lityum Asetat Çözeltileri (1M ve 0, 1M) Lityum asetat (Molekül ağırlığı: 102,02) 1M olacak şekilde saf suda hazırlandı ve 0,45 μm por çaplı steril disk filtreler ile steril edildi. Maya transformasyonu için kullanıldı. 4: Polietilen Gilikol (%50 PEG) Polietilen Glikol (PEG) (Molekül ağırlığı: 3350) distile suda %50’lik stok çözelti olarak hazırlanıp, 121°C’de 25 dk otoklavda steril edildi. Maya transformasyonu için kullanıldı. 5: Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) (%0, 1) ve Kloroform Çözeltileri 42 Sodyum dodesil sülfat (SDS), steril distile suda % 0,1’lik stok çözelti olarak hazırlandı. Kloroform seyreltilmeden, doğrudan stoktan kullanıldı. Bu çözeltiler maya hücrelerini permeabilized ederek hücre lizatı hazırlamak için kullanıldı. 6: Lizis Tampon Çözeltisi ( Break Buffer) Lizis Tampon Çözeltisinin (Break Buffer) Bileşenleri: 100 mM Tris. HCl (pH: 8) 1 mM 1,4-Dithio-DL-threitol (DTT) %20 Gliserol 4 mM Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF). 7: -Galaktozidaz Tampon Çözeltisi (Z Buffer) Z Buffer içeriği: 60 mM Na2HPO4. 7H20, 40 mM NaH2PO4. H2O, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4. 7H20 50 mM β-Merkepto-etanol çözeltisi Yukarıda belirtilen son konsantrasyonlarda, steril distile su ile hazırlanıp +4°C’de saklandı 8: Lowry Çözeltileri I: Lowry A çözeltisi: 20 g Na2CO3 ve 4g NaOH, toplam hacim 1 litre olacak şekilde distile suda çözüldü. II: Lowry-B1 çözeltisi: 1 g CuSO4, toplam hacim 100 ml olacak şekilde distile su ile çözülüp, +4 °C’de depolandı. III: Lowry-B2 çözeltisi: 2 g Sodyum potasyum tartarat, toplam hacim 100 ml olacak şekilde distile su ile çözülüp, +4 C’de depo edildi. (Stok çözelti) IV: Lowry-C çözeltisi: Her deney için, Lowry-A, Lowry-B1 ve Lowry-B2 stok çözeltilerden belirlenen konsantrasyonda taze olarak hazırlandı. 43 Lowry-C Çözeltisinin İçeriği: 24,5 ml Lowry A, 250 μl Lowry B1, 250 μl Lowry B2. 9: ONPG (O-Nitrofenil β-D-Galaktopiranozid) ONPG (Sigma N1127), en son konsantrasyonu 4 mg/ml olacak şekilde Z-tampon çözeltisi içinde hazırlanıp, +4°C’de saklandı. 44 EK 2. β- Galaktozidaz aktivitesi hesaplanması β-Galaktozidaz aktivitesi aşağıda verilen formüle göre hesaplandı. Aktivite: (OD420x 1. 7/0. 0045)/(txVxP) OD420: Sarı rengin absorbansı 1. 7: Sarı rengin bulunduğu tüpün hacmi (980µL Z buffer, 20µL lizat, 200µL ONPG, 500 µL NaCO3) 0,0045: ONPG’nin molar absorbsiyon katsayısı t: β-galaktozidaz reaksiyon süresi (dakika) V: -Galaktozidaz ölçümünde kullanılan hücre lizatı hacmi (mL) P: Hücre lizatlarının protein konsantrasyonları (mg/mL) β-Galaktozidaz aktivitesi biririmi, dakika başına hücre lizatındaki 1 mg çözünür protein içindeki β-Galaktozidaz enzimince hidroliz edilen nmol ONPG (nmol ONPG/dk/ mg protein) cinsinden verilmiştir 45 EK 3. Metal İyon Çözeltilerinin Hazırlanması Biyometal iyonları aşağıda verilen şekilde stok çözeltiler olarak deiyonize saf suda hazırlandı ve 0.45 m’luk membran filtre ile steril edildi. Metal iyonları bu stok çözeltilerden materyal metod bölümünde verilen son konsantrasyonları sağlayacak şekilde S. cerevisiae üreme ortamlarına ilave edildi (Schmidt ve ark. 2009). a-) Cu2+ (CuSO4. 5H2O, Formül ağırlığı (FW): 249.69) Son konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde kullanıldı. Stok: 100 mM’dır. 0.745 gr CuSO4. 5H2O, 25 mL dH2O’da çözüldü. Bu 100 mM’lık stoktan 5 mL’lik kültürler için 50 L eklendi ve 4 saat inkübe edildi. b-) Fe3+ (Fe2(SO4)3. H2O, Fw: 399.88) Son konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde kullanıldı. Stok: 50 mM’dır. 0.5 gr Fe2(SO4)3, 25 mL dH2O’da çözüldü. Bu 50 mM stoktan 5 mL’lık kültürlere 100 L eklendi. c-) Zn2+ (ZnCl2, FW: 136.3) Son konsantrasyonu 4.4 mM olacak şekilde kullanıldı. Stok: 100 mM’dır. Stok Zn çözeltisi hazırlamak için 0.34 gr ZnCl2 25 mL dH2O’da çözüldü. Bu 100 mM’lık stoktan 5 mL’lik kültürlere 220 L eklendi ve standart şartlarda 4 saat beklendi. d-) Ca2+ (CaCl2, FW: 147.02) Son konsantrasyonu 100 mM olarak kullanıldı. Stok: 2 M’dır. 2 M stok hazırlamak için 7.35 gr CaCl2, 25 mL dH2O’da çözüldü. Bu 2 M stoktan 5 mL’lik kültürlere 250 L eklendi ve 4 saat beklendi. e-) Na2+ (NaCl, FW: 58.5) Son konsantrasyonu 400 mM olarak kullanıldı. Stok: 4 M’dır. 4 M stok hazırlamak için 11,7 gr NaCl, 50 mL dH2O’da çözüldü. Bu 4 M stoktan 5 mL’lik kültürlere 500 L eklendi ve 4 saat beklendi. 46 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Günay İBRAHİMOVA Doğum Yeri ve Tarihi : 16. 05. 1991. Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Balaken Rayon Humanitar ve Teknik Lisesi/2008 Lisans : Azerbaycan Devlet Pedegoji Üniversitesi/2014 Yüksek Lisans : Bursa Uludağ Üniversitesi/ 2021 Çalıştığı Kurum/Kurumlar : -- İletişim (e-posta) : gunayibrahimova009@gmail.com Yayınları : Türkel, S., Arslan, G., İbrahimova, G. 2018. Citric acid stress results with cell cycle abnormalities and activates GPD1 expression in MAPK Hog1p/p38 dependent manner. 6th. International Congress of the Molecular Biology Association of Turkey. 05-08 Eylül 2018, Dokuz Eylül Üniversitesi-İBG, İzmir. Türkel, S., Arslan, G., İbrahimova, G., Peters, T.S. 2018. Saccharomyces cerevisiae’da organik asit stresinin CYC1 ve GPD1 genleri transkripsiyonuna etkilerinin incelenmesi. III. Ulusal Uygulamalı Biyolojik Bilimler Kongresi, 3-5 Mayıs 2018, Anadolu Üniversitesi, Eskişehir. 47