31 Uludag Univ. J. Fac. Vet. Med. 32 (2013), 1: 31-38 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Optimizasyonu Serpil KAHYA1* Esra BUYUKCANGAZ1 K. Tayfun CARLI1 Geliş Tarihi: 14.06.2013 Kabul Tarihi: 26.06.2013 Özet: Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir deoksiribo nükleik asit (DNA) zincirinin bilinen iki parçası arasın- da uzanan özel bir DNA bölümünün enzimatik olarak çoğaltıldığı in vitro bir teknik olarak her geçen gün yay- gınlaşmaktadır. PCR metodu, teşhis, epidemiyolojik ve DNA miktarı belirleme çalışmaları gibi birçok amaçla kullanılmakta ve geliştirilmeye devam edilmektedir. PCR’ın kullanıldığı tüm alanlarda meydana gelen gelişme- lerden, mikrobiyoloji alanı da önemli oranda payını alarak gelişmeye devam etmektedir. İnsan ve hayvan kay- naklı patojenik mikroorganizmalar için pek çok amaçla kullanılan PCR aynı zamanda günümüzde kullanılan birçok moleküler metodun temelini oluşturmaktadır. Reaksiyon her ne amaçla çalışılırsa çalışılsın, her gen böl- gesi için, kullanılacak reagent ve PCR parametrelerinin optimizasyonunun yapılması gerekmektedir. Hatta yapı- lan optimizasyonun, PCR’ın gerçekleştirileceği farklı aletler ve laboratuvarlar arasında bile tekrar yapılması gerekebilmektedir. Bu derlemede, kısaca PCR’ın mikrobiyolojide kullanımı, PCR dizayn edilirken ve PCR’ın tüm aşamalarında kullanılan reagentler ve malzemelerde uyulması gereken ana standartlardan bahsedilecektir. Anahtar Kelimeler: Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), mikrobiyoloji, optimizasyon. Optimization of Polymerase Chain Reaction (PCR) Abstract: Polymerase chain reaction (PCR), a deoxyribonucleic acid (DNA) that lies between two known chain enzymatically amplify a specific DNA region as an in vitro technique becoming common everyday. PCR meth- od, used for many purposes such as diagnosis, epidemiology and studies to determine the amount of DNA, are still under development. Microbiology is taking a significant proportion in PCR usage, like innovations of appli- cation in other fields. Furthermore, PCR is the fundamental molecular method that being used today for many purposes in detection of human and animal pathogenic microorganisms. It is needed to optimization of PCR parameters of each gene, regardless even what was targeted. PCR may be required to perform it again, even between different instruments and laboratories. In this review, PCR application in microbiology, the preperation of main standards must be followed at all stages of PCR reagents and materials when PCR a designed, will be mentioned. Key Words: Polymerase Chain Reaction (PCR), microbiology, optimization. 1 Uludag University Faculty of Veterinary Medicine Microbiology Department, Bursa, Türkiye. serpilkahya@uludag.edu.tr 3 2 Giriş ya sokulmasıyla olağanüstü bir hız kazanmıştır. Bakteri, virüs, mantar veya parazitin izolasyonu PCR ve Mikrobiyolojide Kullanımı ve identifikasyonu için, oldukça uzun ve zah- Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), De- metli bir dizi laboratuvar işleminin yapılmasını oksiribo Nükleik Asit (DNA) aranması amacıy- gerektiren uygulamalara PCR’ın devreye girme-8 la ilk kez 1985 yılında Kary Mullis tarafından siyle gerek kalmamıştır . keşfedilmiş, yüksek ölçüde duyarlı ve özgün bir PCR Optimizasyonu teknik olarak tanımlanmış ve bu tekniğin bulu- cusu, tanı ve araştırma olanaklarında evrime yol Örneklerde inhibe edici maddelerin bu- açan bu başarısından ötürü Nobel ödülünü al- lunması, çevresel kontaminasyon riski, kullanı- maya hak kazanmıştır29. Bu evrimsel buluştan lan bileşenlerin miktarının yanlış kullanılması, sonra diyagnostik mikrobiyoloji yeni bir sürece sıcaklık parametrelerinin ayarlanamaması gibi girmiş, nükleik asit amplifikasyon teknolojileri problemler PCR yapılırken her zaman karşılaşı- mikroorganizmaların fenotipik özelliklerinin labilecek sorunlardır. Ayrıca oligonükleotit tanımlanması temeline dayanan standart tanı primerlerinin dizaynı ancak mikroorganizmala- tekniklerinin yerini almaya, hatta bazı mikroor- rın bilinen suşları ve bu suşların bilinen dizileri ganizmaların tespiti için altın-standart olmaya ile mümkün olabilmektedir. PCR’ın işlevlerinde başlamıştır. PCR teknikleri infeksiyonların teş- sorun yaratabilecek bir diğer etmen de mikrobi- hisi, özel amaçlarla genlerin belirlenmesi, özel yal genomlarda oluşan beklenmedik mutasyon- DNA parçalarının klonlanmasında önem ka- lardır. Teşhis laboratuvarlarındaki rutin PCR zanmış, bakteri kontaminasyonu, genetiği değiş- uygulamalarında, karşılaşabilecek en önemli tirilmiş DNA’nın varlığı ve gıda içeriklerinin problemlerden biri de, kontaminasyonlardan özgünlüğünün kontrolü gibi yeni alanlarda da dolayı olabilecek yanlış pozitifliklerdir. Bu incelemelere olanak sağlamıştır5. problem, PCR yapılacak laboratuvarların çok sıkı bir şekilde kontrol edilmesi gerektiğini gös- Mikrobiyoloji alanında kullanılan, mik- termiştir9,34,50. roskobik ve kültürel teknikler, antijen arayan metotlar ve serolojik testler geleneksel diyag- Yukarıda bahsettiğimiz rutin olarak nostik mikrobiyolojik analizleri oluşturmakta- PCR’ın kontrolü ve değerlendirilmesi sırasında dırlar. Bu tekniklerin kullanımlarını düşük öz- karşılaşabileceğimiz problemlerdir. Bunlar dı- günlük oranı, yavaş üreyen, üremesinde çok şında, bahsedilen kullanılacak reagent ve mal- hassas ortamlar gerektiren ya da apatojen ve zemelerin optimizasyonu için bilinmesi gereken saprofitik mikroorganizmalar gibi sebepler kısıt- standartlar ve kurallar vardır. Kısaca yapılacak lamaktadır. İmmunosupresyon, antimikrobiyal işlemler sırasıyla, kullanılan reagentlerin mik- tedaviler veya spesifik olmayan kros reaksiyon- tarlarının ve malzemelerin kalitesinin optimize lar da geleneksel diyagnostik mikrobiyolojik edilmesinde kullanılan standartlar ve parametre- analizlerin önemli sorunlarındandır1,3,24,10. lerden aşağıda bahsedilmektedir. PCR geleneksel metotların yerini her za- 1- DNA Ekstraksiyonu man tamamen alamaz. Fakat yavaş üreyen ve Genetik materyalle yapılacak çalışmalar- teşhisi günler/haftalar alan mikroorganizmalar da moleküler biyoloji tekniklerinin uygulana- ile, doğal konaklarının dışında üretilmesi çok bilmesi için, PCR öncesinde kullanılacak marazi zor olan ve bu nedenle tespit edilemeyen mik- maddelerin yüksek molekül ağırlıklı DNA ve roorganizmaların teşhisinde PCR’ın kullanımı Ribo Nükleik Asit (RNA) moleküllerinin, inhi- çok önem kazanmıştır. PCR ile yakın türler bitörleri de içereceği göz önünde bulundurula- arasında ya da alt tipler arasında ayırım yapıla- rak, saf bir şekilde elde edilebilmesi gerekir36. bilir ve klinik örnekler ön zenginleştirmeye PCR, örneklerden DNA ve RNA ekstraksiyonu gereksinim duymadan hızlı şekilde test edilebi- 34 yapılarak ya da günümüzde yeni geliştirilen ve lirler . PCR’ın en büyük avantajlarından biri de geliştirilmeye devam eden kitler ve sistemlerle, transport nedeniyle ölmüş olduğundan kültürle ekstraksiyon yapılmaksızın direkt olarak klinik üretilemeyecek durumlarda ve kronik persistent örneğin kullanımıyla yapılabilen bir metod- etkenlerde kullanılabilmesidir4. tur21,23. DNA ve RNA ekstraksiyonu yapılmaz- Günümüzde insan ve hayvanların infek- sa, sonuçlar örnekteki taq polimeraz enzimi siyöz hastalıklarının teşhisi ve epidemiyolojik inhibitörleri tarafından maskelenebilir13. Bu çalışmaları, PCR tabanlı tekniklerin uygulama- problem DNA ve RNA ekstraksiyonu ile ya da 33 örneklerin sulandırmaları yapılarak ortadan 2-1- Mg+2 Konsantrasyonu kaldırılabilir. Sulandırma, örnekteki mikroorga- nizma sayısı az olduğunda problem yaratabilir. Kit üreticileri standart reaksiyon reagent-+2 DNA ve RNA ekstraksiyonu ise çok örnekle leri yanında Mg ‘u ayrı olarak sağladıkları için +2 çalışıldığında oldukça fazla iş gücü gerektirir ve Mg konsantrasyonu aslında optimize edilecek kit kullanıldığında test maliyetini artırabilir. koşullar arasında en kolayıdır. Tek bir reaksi- Fakat ekstraksiyon yapıldığında PCR’ın analitik yonda her örneğe farklı miktarlarda Mg +2 koyu- ve diyagnostik duyarlılığı artacaktır. Hatta ör- larak yapılan denemeler kısa süre içinde sonuç-32 nekte inhibe edici maddeler çoksa, kitle DNA landırılabilinir . PCR reaksiyon karışımında +2 ve RNA ekstraksiyonunu yapıldıktan sonra bile ortalama 0.5-2.5 mM Mg olması gereklidir. +2 bu inhibitörler azaltamayabilmekte ve kitle ekst- Mg iyonları enzim aktivitesine, primer bağ- raksiyondan sonra bile sulandırma yapılması lanmasına ve DNA erime ısısına etki edebi-31,42 gerekebilmektedir41. lir . dNTP’ler Mg +2 iyonunu bağladıkları için dNTP konsantrasyonundaki artış serbest Mg+2 Nükleik asit ekstraksiyonu amacıyla kul- konsantrasyonunda azalmaya yol açabileceğin- lanılan pek çok metod ve hazır kitler bulunmak- den optimizasyon bu durum göz önüne alınarak tadır. Bu amaçla kendi ekstraksiyon yöntemimi- yapılmalıdır32. Mg+2 iyonları dNTP’ler ile çözü- zi kullanabileceğimiz gibi, maliyeti biraz artırsa nebilir kompleksler oluştururlar, polimeraz en- da hazır ekstraksiyon kitleri de kullanabilinmek- zimi aktivitesini uyarır, çift iplikli DNA’nın tedir. DNA ve RNA ekstraksiyon yöntemlerinde erime derecesini (Tm) arttırırlar ve primer- kullanılan maddeler, yöntem ya da kit ne olursa templeyt DNA hibridizasyonunu sağlarlar. Bu olsun genel olarak 3 aşamayı amaçlamaktadır. nedenle Mg+2’un PCR’ın özgünlüğü ve ürün Bunlardan ilki hücrenin parçalanması ile verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. DNA’nın açığa çıkması, denaturasyon veya Düşük Mg+2 konsantrasyonu ürün oluşumunda proteoliz ile DNA/RNA-protein kompleksinin azalmaya, yüksek Mg+2 konsantrasyonu ise spe- ayrılması, ikincisi DNA-RNA’nın çözünür du- sifik olmayan ürün oluşumuna neden olmakta- ruma getirilmesi ve son olarak da DNA- dır5,31. RNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer makro 2-2- Primerler moleküllerden ayrılması işlemleridir39. Tekrarlanan dizilerden oluşmayan, sente- 2- PCR Reaksiyonun Temel Bileşenleri tik olarak kolayca hazırlanabilen ve 15-40 oli- ve Optimizasyonları gonükleotitden oluşan primerler, kullanım amaçlarına göre değişiklik göstermektedirler. PCR’da kullanılan temel bileşenler hedef Primerlerin üzerinde bulunan baz sıraları, sade- DNA veya RNA (templeyt), taq DNA polime- ce hedef DNA üzerinde bir bölgede bulunmalı, raz enzimi, primerler, deoksinükleotitler, tam- +2 5,45 başka yerlerde veya başka hedef DNA sekansla-pon sıvı, pH, Mg iyonlarıdır . PCR reaksi- rında bulunmamalıdır38,32,37. Primer tasarımı yonundaki optimal olmayan koşullar sadece yapılırken dört bazın da eşit oranda kullanımına kullanılan bileşenlerden değil birçok sebepten özen gösterilmeli, primerler tekrarlı bölgeler kaynaklanabilir. Uygun olmayan primerlerin, içermemeli ve primer çiftlerinin 3’ uçları birbir- zaman ve sıcaklık parametrelerinin kullanımı lerine komplementer yapıda olmamalıdır5. Pri- (özellikle annealing sıcaklığı), polimeraz enzimi +2 merlerin yapısında %50-60 kadar G+C bazları kalitesi ve Mg konsantrasyonu en önemli pa- rametrelerdendir. Reaksiyon koşullarının opti- bulunması, hedef DNA ile daha kuvvetli bağla- mize edilmesi ve reaksiyon karışımına koyulan rın kurulmasına yardımcı olur. Ayrıca böyle tüm maddelerin uygun miktarları için denemeler birleşmeler, yüksek sıcaklıkta oluşturulan reak- yapılarak en uygun miktarlar ve reaksiyon ko- siyon sırasında görülebilecek non-spesifik bağ- şulları bulunmasıyla, aynı zamanda inhibe edici lanmaları da azaltmaktadır 32, 36, 37. Primer kon- etkiler de azaltılabilir. Bu faktörlerin optimizas- santrasyonunun genel olarak 0.1-0.5 µM arasın- yonu pozitif kontrolle erime noktasına göre da olması tavsiye edilmiştir. Yüksek primer farklı sıcaklıklarda ve konsantrasyonlarda reak- konsantrasyonları primer-dimer olarak adlandı- siyon çalışılarak ya da bu maddelerin veya rılan spesifik olmayan bantların oluşumuna yol templeytin (şüpheli örnekten elde edilen DNA açmaktadır. Primer-dimerler, küçük DNA ürün- veya RNA) çeşitli oranda sulandırmalarıyla ayrı leri olup primerlerin birbirleriyle bağlanması ya ayrı denemeler yapılarak karşılaştırmalarla sağ- da DNA polimeraz enziminin spesifik olmayan lanabilmektedir2,32. nükleotitleri, kullanılmayan primerlerin uçlarına bağlaması neticesinde oluşan bantlardır31,37. 3 4 Son yıllarda oldukça yaygın olarak kulla- Denaturasyonun tam olmaması halinde verim nılan PCR sistemi ise, birden fazla primerin düşer. DNA’nın uzun süre yüksek sıcaklıkta aynı anda çalışılmasıyla oluşan multiplex-PCR bekletilmesi ise DNA polimeraz enziminin akti- sistemleridir. Aynı reaksiyonda, birden fazla vitesini düşürmektedir15,16,27. Primerlerin yapış- bölgenin çalışılarak, birden fazla bölge için ma sıcaklığı (annealing) 55-72 °C arasında de- sonuçların kısa sürede alınabildiği bu PCR sis- ğişmektedir ve optimize edilmesi gereken en temi oldukça yaygın bir biçimde kullanılmakta- önemli parametrelerden biridir. Primer yapış- dır. ması için gerekli zamanın uzunluğu ve uygula- Çok pratik sonuçlar veren multiplex-PCR nacak sıcaklık, amplifikasyon primerlerinin baz sistemlerinin optimizasyonu tek bir primer ile içeriğine, büyüklüğüne bağlıdır. Primer yapış- çalışılan PCR’a göre, kullanılacak primerler ması için gerekli olan sıcaklık hesaplanırken her arasındaki uyumun sağlanması ve diğer para- bir Adenine (A) ve Thymine (T) nükleotiti için 2 °C hesaplanır11,15,16,27,31metrelerin düzenlenmesi gerektiğinden daha zor . Yapışma sıcaklığının, olsa da, elde edilen sonuçların kalitesi nedeniyle teorik olarak spesifik DNA eşleşmesinin sağ- PCR sisteminin günümüzdeki devrim niteliğin- lanması amacıyla, 2 primerin erime sıcaklığının deki bu şekli multiplex-PCR yaygın biçimde birkaç derece altında olması gerekir 20,40. Bu kullanılmaya ve geliştirilmeye devam etmekte- yüzden yapışma sıcaklığının optimizasyonu, dir. primer-templeyt kompleksinin erime sıcaklığı- nın [basit formülle Tm = (G+C)4 + (A+T)2)] 2-3-dNTP’ler hesaplanmasıyla başlamaktadır. Daha kompleks 25,33,40 Geleneksel PCR’da ayrı reagent olarak formüller kullanılabilir . Fakat pratikte kullanılan dNTP’lerin final konsantrasyonları erime sıcaklığı, tampon içeriği hatta primer ve 20-200 µM arasında olmalı ve 4 nükleotit de templeyt konsantrasyonundan etkilenebildiği aynı oranda bulunmalıdır. Hedef olmayan alan- için formüllerle sadece ortalama bir değer he- larda yanlış bağlanmaları azaltmak için uygun saplanabilir. Bazı primerler nedeni bulunama- olan en düşük dNTP konsantrasyonu kullanıl- yan sebeplerden 14 optimizasyona açıkça direnç 32 malıdır. Ancak bazı mikroorganizmalar vardır gösterirler . Yüksek sıcaklığın kullanılması ki, çoğaltılacak gen bölgesinden dolayı bazı yanlış nükleotitlerin primerlerin 3’ uçlarına bazların diğerlerinden az yada çok olması gere- bağlanmasını önler. Hibridizasyon sıcaklığının kebilir26 (çok Adenin-Timin, az Guanin-Sitozin düşük tutulduğu durumlarda ise spesifik olma- gibi). Nükleotitlerin optimal konsantrasyonunu yan küçük DNA fragmentlerinin oluşumu söz 11 tespit etmek için amplifiye edilecek ürünün konusudur . Uzama (ekstensiyon) sıcaklığı ve uzunluğu, MgCl2 ve primer konsantrasyonları, zamanı, yine seçilen bölge ve bu bölgenin G+C çoğaltılmış ürünün büyüklüğü ve PCR döngü oranına bağlı olarak taq polimeraz enziminin sayısı dikkate alınmalıdır. Nükleotitlerin düşük optimum çalışma sıcaklığı olan 72-78°C’lerde 40 konsantrasyonda kullanılması PCR’ın özgünlü- gerçekleştirilir . Uzama hızı 35-100 nükleo- ğünü arttırmaktadır5,6. tit/saniyedir. Uzama süresi de yine hedef dizinin konsantrasyonuna, uzunluğuna ve sıcaklığa 3- PCR Reaksiyonunda Kullanılan Sı- bağlıdır. En uygun uzama süresi ortalama 1 caklık Parametreleri dakikadır. Siklus sayısı ise, templeytin DNA PCR, ön denaturasyon ve tekrarlanan sik- konsantrasyonuna, primer ekstensiyonu ve amp- luslardan oluşan, denaturasyon-annealing- lifikasyonunun etkinliğine (kullanılan enzimin ekstansiyon aşamaları ve final ekstansiyon aşa- kalitesine) bağlıdır. Az miktarda DNA ile baş- malarından oluşur. RNA tespiti yapılacaksa, ladığında en fazla 40 siklus, daha fazla DNA ile önce RNA, ön aşamalarla DNA’ya dönüştürülür başladığında ise ideal siklus sayısı 30 olmalıdır. ve reaksiyona yukarıda sayılan DNA çoğaltma Siklus sayısının fazla olması hatalara yol açarak aşamalarıyla reaksiyona devam edilir. Ön dena- spesifik olmayan ikincil ürünlerin (primer- turasyon 5-10 dakika boyunca 94-95°C’de ger- dimer) oluşumuna neden olur40,43. çekleştirilir. Denaturasyon zamanı ve sıcaklığı, PCR reaksiyonunda kullanılan parametre- G+C oranına dolayısıyla da çoğaltılmak istenen ler ve reagentler genel olarak ele alınırsa, PCR bölgenin büyüklüğüne bağlıdır. G+C’ce zengin amplifikasyonunun etkinliğine etki etmeleri dizilerde denaturasyon sıcaklığı artırılabilir40. bakımından 4 gruba ayırmak mümkündür. Bi- Ayrıca yeni kullanılan hot-start enzimlerde de, rinci grup PCR reaksiyonundaki siklus sayısıdır. enzimin aktif hale gelebilmesi için ön denatu- Her ne kadar hedef DNA’nın amplifiye edilecek rasyonun mutlaka kullanılması gerekmektedir. miktarını siklus sayısı belirlese de DNA kon- 35 santrasyonu arttıkça, primer bağlanmasından bağlandıktan sonra açığa çıkan floresanı tespit ziyade PCR reaksiyonu neticesinde meydana eden sistemlerle çalışmaktadırlar. Bu test sis- gelen sarmalların birbirine bağlanması söz ko- temleri, Real-Time (RT) PCR olarak adlandırı- nusu olur. Bunun sonucu olarak geç PCR siklus- lır10. Ayrıca RT PCR sistemleri sayesinde aza- larının erken sikluslara oranla daha az etkili lan ve kısalan işlemler, kontaminasyon ve ma- olduğu bildirilmiştir38. İkinci önemli faktör nipülasyonlarda yapılan yanlışlık ihtimallerini amplifiye edilecek hedef DNA miktarıdır. PCR de engellemiş olmaktadır. RT PCR’ın en önemli reaksiyonu, yüksek konsantrasyonda hedef yararlarından birisi de araştırıcının DNA’nın DNA (>107) ihtiva eden numunelerle çalışıldı- başlangıç seviyesi çok az miktarda olsa dahi bu ğında düşük konsantrasyondakilere (<104) naza- seviyenin belirlenmesine imkan vermesidir. ran daha düşük bir düzeyde amplifikasyonla Amplifikasyon sürecinde örnekteki DNA ne neticelenir30,35. Üçüncü faktör hedef DNA se- kadar yüksekse, floresan sinyal o kadar çabuk kansının uzunluğudur. PCR’ın etkinliği ile se- eşik seviyesine çıkmakta bu da miktar tayinini kans uzunluğu arasında ters orantılı bir ilişki mümkün kılmaktadır50. DNA’nın başlangıç mevcuttur. Dördüncü önemli faktör ise primer seviyesinden bağımsız olarak, sadece negatif ve bağlanması ve hibridizasyon için kullanılan pozitif olarak sonuç veren geleneksel PCR’da sıcaklık ile ilgilidir38. Hibridizasyon sıcaklığı ile ise miktar tayini oldukça zor olmaktaydı. Bu PCR’ın özgünlüğü arasında pozitif bir korelas- sistemler miktar tayinini de olanak sağlayarak yon mevcuttur. Yüksek ısıda PCR’da önemli bir çalışmaları çok daha ileri boyutlara ulaştırmak- problem olarak kendini gösteren yanlış hibridi- tadırlar. zasyon oluşma ihtimali düşmektedir11. RT PCR, PCR’ın ortaya çıkarılması kadar 4- PCR Makinaları olmasa da ona yakın bir teknolojik gelişme ola- rak tüm dünyadaki araştırmacılara yeni bir güç Temelde hava ısıtmalı ve blok ısıtmalı ve çalışma alanı sağlamıştır. PCR’la sağlanan olmak üzere iki çeşit PCR makinası vardır. Bu kolaylık ve gücün, RT teknolojisi ile birleşmesi iki sistem arasında önemli farklar bulunmakta- çalışmalara aşırı derecede kolaylık ve sensitivite dır. Öncelikle hava bloğa göre çok daha hızlı sağlamıştır50. ısınıp soğuduğu için PCR zamanı minimuma inmektedir. Geleneksel blok ısıtmalı PCR ma- 5- PCR Reaksiyonun Gerçekleştirildiği kinelerinde aksesuarların sıcaklık geçirgenliği- Tüpler nin az olması, arzu edilen sıcaklığa uzun zaman- PCR makinası kadar PCR reaksiyon ha- larda erişilebilmesi, dolayısıyla zamanın çoğu- cimleri ve kullanılan PCR tüplerinin özellikleri nun denaturasyon, annealing ve ekstensiyon de PCR performansını etkileyen diğer önemli basamaklarına geçişte harcanması, bu aletlerin öğelerdir. İyi bir PCR tüpünün sahip olması kullanımlarıyla ilgili büyük dezavantajlar getir- gereken özellikler tüpün kapağı kapandıktan mektedir. Günümüzde artık pek kullanılmayan sonra buharlaşma olmaması, düşük ısıl kütleye blok ısıtmalı thermalcycler makinelerinde PCR sahip olması, sıcaklık geçirgenliğinin yüksek süresi 2-4 saat almaktadır45,47. olması ve çapraz reaksiyonlara izin vermeksizin Yeni kullanılan PCR makinalarının he- reaksiyon reagentlerinin tüplere konulabilmesi- men hepsi hava ısıtmalı sistemlerdir. Bu sistem- dir. Kalın çeperli PCR tüplerinin, içerdikleri ler sayesinde testlerin performansı artmakta ve örneklere sıcaklık transferini randımanlı bir süresi azalmaktadır. Son zamanlarda PCR amp- şekilde yapamaması, tüpün yüzeyine temas eden lifikasyonunu ve amplifiye olmuş ürünün (amp- örnek hacminin sınırlı olması, PCR protokolle- likon) kontrolünü aynı kapalı sistemlerde ger- rinde belirlenen sıcaklıkların örneklerde sağla- çekleştiren ve amplikonun görüntülenmesine namaması veya örneğin belirlenen zamandan izin veren yeni sistemler geliştirilerek gıdalar- daha kısa bir süre final sıcaklığına maruz kal- dan, memeli genomundan, genetik olarak geliş- ması gibi özellikler PCR’ın verimli bir şekilde tirilmiş organizmalardan, insan ve veteriner uygulanmasını engelleyen etmenlerdir. Bunlar- mikrobiyoloji alanlarındaki çok değişik örnek- dan dolayı ince çeperli 200 µl’lik tüpler PCR’da lerden nükleik asitlerin aranmasında kullanıl- tercih edilmelidir47. maya başlanmıştır1,17,28. Bu aletler sıcaklık deği- PCR amplifikasyonu için kullanılan farklı şimini geleneksel hava ısıtmalı termocyclerlara bir taşıyıcı ortam ise borosilikat cam borucuk- göre bile çok daha hızlı bir şekilde gerçekleşti- lardır. Bunlar içerisinde PCR yapmanın avantaj- rirler ve her PCR siklusu sonunda, hedef ları şu şekilde özetlenebilir: borosilikat kapiller DNA’ya nükleik problar veya floresan boyalar cam PCR borucukların yüzeylerinin geniş olma- 3 6 sı nedeniyle reaksiyon hızının ve veriminin her geçen gün eklenen yeni PCR metodlarıyla yüksek olması, kapiller borucukların plastik da önümüzdeki yıllarda gittikçe yükselen bir kapaklarla uçlarının kapatılması sonucu buhar- ivmeyle gelişimini devam ettirecektir. laşma ve çapraz kontaminasyon oranının en aza indirgenmesi ve borucukların sıcaklık geçirgen- Kaynaklar liğinin yüksek olması sonucu PCR lehine çe- virmektedir. Cam kapiller PCR’da zamanın kısa 1. Ahmed F.E., 2002. Detection of genetically mo- olmasının nedeni, kapiller borucukların çevre- dified organisms in foods. Trends in Biotechno- sinde havanın dönerek hızla ısıtılmasıdır46-48. logy, 20, 215-223. Tüm bunların yanında borosilikat cam borucuk- 2. Aldemir O.S., Uçan U.S., 2001. Polimeraz zincir ların silindirik yapısı dolayısıyla yüzey arttırıl- reaksiyonu (PZR), Temel prensipler. Hayvancılık mış ve sıcaklık reaksiyona daha çok etkimiş Araştırma Dergisi, 1, 53-59. olur7,12,22,44,47,48. Bu durum annealing, ekstensi- 3. Anonim, 2008. Avian Mycoplasmosis (Mycop- yon ve denaturasyon sürelerinin de kısalmasına lasma gallisepticum, M. synoviae). Manual of neden olmaktadır. Bu sistemlerde PCR süresi 10 Standards for Diagnostic Tests and Vaccines for kat kadar kısaltılmış olmaktadır. Kapiller Terrestrial Animals. Chapter 2.3.5, Ofis Interna- PCR’da, PCR basamaklarında oluşan süre kı- tional Epizootic terrestrial manual, Paris. salmasıyla primerlerin yanlış bağlanma olasılığı 4. Anonim, 2009. Biotechnology in the diagnosis of en aza indirgendiği için spesifik PCR ürünü infectious diseases and vaccine developments. oluşma olasılığı ve miktarında da artış sağlama- Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Chapter 1.1.7. Office International sı bir başka avantajdır46-48. Cam tüplerin diğer Epizootics Terrestrial Manual, Paris. avantajı, PCR reaksiyon hacminin konvansiyo- 5. Arı Ş., 2004. DNA’ nın polimeraz zincir reaksi- nel PCR’a göre yarı yarıya azalması ve dolayı- yonu ile çoğaltılması. Editörler: Temizkan G., sıyla test maliyetinin düşmesidir. Bunlar dışında Arda N. Moleküler biyolojide kullanılan yöntem- cam kapiller cam fiber optiklere benzer biçimde ler. Biyogem yayınları, Nobel Tıp Kitabevleri, ışığı çekerek ve sinyali kapillerin ucunda yo- No:1, Bölüm 5, İstanbul, pp. 101-120. ğunlaştırarak sinyal toplamaya hizmet eder. Bu 6. Bilgehan H., 1992. Klinik mikrobiyoloji Tanı. etki kapiller içindeki mikro hacimdeki sıvıda Barış yayınları, Fakülteler Kitabevi, Ankara, pp. floresan izlemeye ve görüntülemeye yaramakta- 56-68. dır. Bu özellik RT-PCR sistemlerinde, boya ve 7. Caplin B.E., Rasmussen R., Bernard P.S., ışıma teknoloji ile çalışılan sistemler için olduk- Wittwer C.T., 1999. The most direct way to mo- ça önemlidir49. nitor PCR amplification for quantification and mutation detection. Biochemica, 1, 5-8. Sonuç 8. Carlı K.T., 2008. Hayvan İnfeksiyonlarında Lig- Sürekli geliştirilen alet, malzeme ve hazır htCycler PCR Kullanımı. Uludağ Üni Vet Med., olarak sunulan kitlerle geliştirilen PCR tabanlı 27, 1-10. yöntemler başlangıçta tanı amaçlı geliştirilse de, 9. Cockerill F.R., Smith T.F., 2002. Rapid-cycle şu anda birçok bilim dalı ve alanında kullanıl- real-time PCR: A revolution for clinical microbi- maktadır. Optimize edilmeleri için uzmanlaşmış ology. American Society for Microbiology News, moleküler çalışanların gerektiği PCR tabanlı 68, 77-83. yöntemler, optimize edilme aşamalarına kadar 10. Cockerill F.R., 2003. Application of rapid-cycle laboratuvarlarda oldukça zorluklar çıkartmakta, real-time polymerase chain reaction for diagnos- zaman ve malzeme kaybına neden olabilmekte- tic testing in the clinical microbiology laboratory. dirler. Optimize edilmiş literatürlerden alınan Archieves of Pathology and Laboratory Medici- bilgiler kullanılarak, taklit çalışmalar yapılsa ne, 127, 1112-1120. bile, malzemelerin ve aletlerin markası, kulla- 11. Çetinkaya B., 1998. Polimeraz zincir reaksiyonu nım şartları, yanlış kullanımları ve deneyimli (PCR) temel prensipler. Fırat Üniversitesi Sağlık olmayan personelle taklit edilen reaksiyonlar Bilimleri Dergisi, 12, 149-156. aynı sonuçları vermeyebilir. Deneyimli perso- 12. Elenitoba-Johnson O., David D., Crews N., nelle, aynı alet ve markalarla bile farklı labora- Wittwer C.T., 2008. Plastic versus glass capilla- tuvarlar arasında farklı sonuçlar alınmaktadır. ries for rapid-cycle PCR. Biotechniques, 44, 487-492. Tüm bunlar göz önünde bulundurulduğunda bile, PCR tekniği dezavantajları ve zorluklarına 13. Greenfield L., White T.J., 1993. Sample prepara- rağmen günümüzde diagnostik mikrobiyoloji tion methods. Editörler: Persing D.H., Smith T.F.S., Tenover F.C., White T.J. Diagnostic mo- diğer alanlarda gittikçe artan önemde ve pratik bir teknik olmaya devam etmektedir. Teknik, 37 lecular microbiology, 1 baskı. American society 26. Marenda M.S., Sagne E., Poumarat F., Citti C., for microbiology, Washington, pp. 122-137. 2005. Suppression substractive hybridization as a 14. He Q., Marjamaki M., Soini H., Mertsola J., basis to assess Mycoplasma agalactia and My- Viljanen M.K., 1994. Primers are decisive for coplasma bovis genomic diversity and species- sensitivity of PCR. BioTechniques, 17, 82-87. specific sequences. Microbiology, 151, 475-489. 15. Howe C.J., Ward E.S., 1989. Nucleic acids sequ- 27. Mcpherson M.J, Hames B.D., Taylor G.R., 1995. encing. IRL Pres at Oxford University Pres, A practical approach. Oxford Univresity Pres, Oxford, page 53-114. Amerika, pp. 7-118. 16. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., 1995. 28. Mhlanga M.M., Malmberg L., 2001. Using Mo- Optimization of PCR’s. Editörler: Innis M.A., lecular beacons to detect single-nucleotide poly- Gelfand D.H., Sninsky J.J. PCR Applications morphisms with real-time PCR. Methods, 25, protocols for fanctional genomics. Academic 463-471. pres, San Diego, pp. 39-67. 29. Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn 17. Klein D., 2002. Quantification using real-time G., Erlich H., 1986. Spesific enzymatic amplifi- PCR technology: Applications and limitations. cation of DNA in vitro: polymerase chain reac- Trends in Molecular Medicine, 8, 257-260. tion. Cold Spring Harbor Symposia on Quantita- 18. Kleven S.H., Yoder H.W., 1984. Mycoplasmosis. tive Biology, 51, 263-273. Editörler: Purchase H.G., Arp L.H., Domermuth 30. Mullis K.B., Faloona F.A., 1987. Spesific synthe- C.H., Pearson J.E. A laboratory manual for the sis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed isolation and identification of avian pathogens, chain reaction. Methods of Enzimology, 155, 3th edition, American Association of Avian Pat- 335-351. hologists, Kenet Square, Pennsylvania, pp. 57-62. 31. Persing D.H., 1993. Diagnostic molecular micro- 19. Kleven S., Jordan H.F.T.W., Bradbury J.M., biology, principles and applications. Editörler: 1996. Avian Mycoplasmosis (Mycoplasma galli- Persing D.H., Smith T.F., Tenover F.C., White septicum). Manual of Standards for Diagnostic T.J. American Society for Microbiology, Was- Tests and Vaccines. Office International Des hington, pp. 88-104. Epizootics, Paris, pp. 512-521. 32. Roux K.H., 1995. Optimization and troubleshoo- 20. Kubista M., Andrade J.M., Bengtsson M., Foroo- ting in PCR. Genome Research, 4, 185-194. tan A., Jonak J., Lind K., 2006. The real-time 33. Rychlik W., Rhoads R.D., 1989. A computer polymerase chain reaction. Molecular Aspects in program for choosing optimal oligonucleotides Medicine, 27, 95-125. for filter hybridization, sequencing and in vitro 21. Lauerman L., Hoerr F.J., Sharpton A.R., Shah amplification of DNA. Nucleic Acids Research, S.M., Santen V.L.V., 1993. Development and 17, 8543-8549. application of polymerase chain reaction assay 34. Sachse K., 2004. Specifity and performance of for Mycoplasma synoviae. Avian Diseases, 37, PCR detection assays for microbial pathogens. 829-834. Molecular Biotechnology, 26, 61-79. 22. Lee D.S., Tsai C.Y., Yuan W.H., Chen P.H., 35. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., 2004. A new thermal cycling mechanism for ef- 1985. Enzymatic amplification of B-Globin ge- fective polymerase chain reaction in microliter nomic sequences and restriction site analysis for volumes. Microsystem Technologies, 10, 579- diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230, 584. 1350-1354. 23. Ley D.H., Avakian A.P., Berkhoff J.E., 1993. 36. Saiki K.R., Gelfand H.D., Stoffi S., Scharf J.S., Clinical Mycoplasma gallisepticum infection in Higuchi R., Horn T.G., 1988. Primer-directed multiplier breeder and meat turkeys caused by F enzymatic amplification of DNA with a thermos- strain: identification by sodium dodecyl sulfate- table DNA polymerase. Science, 239, 487-491. polyacrylamide gel electrophoresis, restriction 37. Saiki K.R., Walsh P.S., Leverson C.H., Erlich endonuclease analysis and the polymerase chain H.A., 1989. Genetic analysis of amplified DNA reaction. Avian Diseases, 37, 854- 862. with immobilized sequence-spesific oligonucleo- 24. Ley D.H., 2003. Mycoplasma gallisepticum in- tide probes. Proceedings of National Academic fection. Editörler: Saif Y.M., Barnes H.J., Fadly Sciences, USA, 86, 6230-6234. A.M., Glisson J.R., Mcdougald L.R., Swayne 38. Saiki K.R., Gelfand H.D., Stoffi S., Scharf J.S., D.E. Diseases of poultry, Iowa State University Higuchi R., Horn T.G., 1988. Primer-directed Press, 11. edition, pp. 722-743. enzymatic amplification of DNA with a thermos- 25. Lowe T., Sharefkin J., Yang S.Q., Diefenbach table DNA polymerase. Science, 239, 487-491. C.W., 1990. A computer program for selection of 39. Sarikaya A.T., 2004. DNA’nın izolasyonu ve oligonucleotide primers for polymerase chain re- analizi. Editörler: Temizkan G., Arda N. Molekü- actions. Nucleic Acids Research, 18, 1757-1761. ler biyolojide kullanılan yöntemler. Biyogem ya- 3 8 yınları, Nobel Tıp Kitabevleri, No:1, Bölüm 2, 45. Wilson I.G., 1997. Inhibition and facilitation of İstanbul, pp. 55-80. nucleic acid amplification. Applied and Envi- 40. Sambrook J., Russell D.W., 2001. Molecular ronmental Microbiology, 63, 3741-3751. cloning, A laboratory manual. Third edition, Vo- 46. Wittwer C.T, Fillmore G.C, Hillyard D.R., 1989. lume 2, chapter 8, New York. Automated polymerase chain reaction in capillary 41. Silveira R.M., Fiorentin L., Marques E.K., 1996. tubes with hot air. Nucleic Acids Research, 17, Polymerase chain reaction optimization for My- 4353-4357. coplasma gallisepticum and M. synoviae diagno- 47. Wittwer C.T., Fillmore G.C., Garling D.J., 1990. sis. Avian Diseases, 40, 218-222. Minimazing the time required for DNA amplifi- 42. Steffan R.J., Atlas R.M., 1991. Polymerase chain cation by efficient heat transfer to small samples. reaction: Applications in environmental microbi- Analytical Biochemistry, 186, 328-331. ology. Annual Review of Microbiology, 45, 137- 48. Wittwer C.T., Garling D.J., 1990. Rapid cycle 161. DNA amplification: Time and temperature opti- 43. Şahin F., Çiftçi M., Pirim İ., 2000. Polimeraz mization. Biotechniques, 10, 76-83. zincir reaksiyonu (PCR). II. Uygulamalı molekü- 49. Wittwer C.T., Rine K.M., Andrew R.V., David ler biyoloji teknikleri kurs notları. Ankara Üni- D.A., Gundry R.A., Balis U.J. 1997. The Lig- versitesi Biyoteknoloji Uygulama ve Araştırma htCycler: A microvolume multisample fluorime- Merkezi, ter with rapid temperature control. Biotechniques, 44. Teo I.A., Choi J.W., Morlese J., Taylor G., Shau- 22, 176-181. nak S., 2002. LightCycler QPCR optimization for 50. Valasek M.A., Repa J.J., 2005. The power of low copy number target DNA. Journal of Immu- real-time PCR. Advances in Physiology Educa- nological Methods, 270, 119-133. tion, 29, 151-159.