39 Uludag Univ. J. Fac. Vet. Med. 32 (2013), 2: 39-44 Enfeksiyöz Hayvan Hastalıklarının Teşhisinde Gerçek Zamanlı (Real-Time) PCR’ın Geleneksel PCR’a göre Avantajları Serpil KAHYA1 Özge YILMAZ2 K. Tayfun CARLI1 Geliş Tarihi: 13.03.2014 Kabul Tarihi: 28.04.2014 Özet: Enfeksiyöz hayvan hastalıkları, hayvan hastalıkları içerisinde en önemli grubu oluşturmakta ve enfeksiyöz hastalıklarının önemli bir bölümü, insan sağlığı için de tehlike arz etmektedir. Zaman kısıtlılığı, pratiklik, sensi- tivite ve spesifite yüksekliği gibi birçok sebeplerle, teşhis ve epidemiyolojik çalışmalar, günümüzde daha çok moleküler yöntemlerle devam ettirilmektedir. Son yıllarda en hızlı gelişim gösteren, kendisinden önce ve sonra geliştirilen birçok moleküler metotun temelini oluşturan, hem teşhis hem de epidemiyolojik çalışmalarda en çok kullanılan moleküler metot, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)’dır. İlk gelişiminden bu yana birçok temele da- yanılarak çalışılmış olan PCR, son geliştirilen gerçek zamanlı (real-time) sistemlerle, artık daha çok gerçek za- manlı [Real Time (RT)] olarak çalışılmaya devam edilmektedir. PCR’ın ilk şekli olan, geleneksel PCR, birçok laboratuarda kullanılmaya devam etmekte ve sonraları geliştirilen RT PCR teknolojisi de, kullanılan alet ve kitlerde her geçen gün yapılan güncelleştirmelerle, pek çok alanda yaygınlığını artırmaya devam etmektedir. Bu derlemede; geleneksel PCR’a göre birçok yönden avantajlar sağlayan RT PCR’ın özellikle sonuçların; kalitesi, ortaya çıkış süresi ve yorumlamalarına sağladığı avantajlardan bahsedilecektir. Anahtar Kelimeler: Enfeksiyöz Hayvan Hastalıkları, Teşhis, Konvansiyonel PCR, Real-Time PCR. Advantages of Real-Time PCR than Conventional PCR in Diagnosis of Infectious Animal Disease Abstract: Infectious animal diseases are the most important disease group among all the animal diseases and also have risks for human health. Because of time, practicality, high sensitivity and specificity etc., diagnosis and epidemiologic studies are going on molecular field. Polymerase Chain Reaction (PCR) is most fast-developing molecular method, also basic of lots of molecular methods developed before and/or after PCR and the most wide-using molecular method in diagnosis and epidemiologic studies at the present day. Basis of PCR has dif- ferent systems from past to present and now it is using generally with real-time (RT) systems developed lately. Conventional PCR and its systems are still using in lots of laboratory, but RT technology is developing at tool and kits and is going to up-to-date and common with this evolutions. In this review will be mentioned the ad- vantage of RT PCR than conventional PCR, especially at quality of results, time-saving and advantages at result- cover. Key Words: Infectious animal diseases, diagnosis, conventional polymerase chain reaction (PCR), Real-Time (RT) PCR. 1 Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji ABD, Bursa, 16059, Türkiye, serpilkahya@uludag.edu.tr 2 Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Mikrobioloji ABD, 16059, Bursa, Türkiye. 40 Giriş spesifik reaksiyonlara neden olduğu bildirilmiş- tir10,41. Örneğin, özellikle inaktif aşılardan sonra, Enfeksiyöz Hastalıkların Teşhisinde 2-4 hafta süreyle serolojik testlerin yapılmaması Kullanılan Metotlar gerekmektedir. Aşıdan dolayı olan bu yanlış pozitiflikler, aşılamadan 4-8 hafta ya da daha Hayvan hastalıkları teşhisinde kullanılan uzun süre devam edebilmektedir19,25. Kanatlı farklı temellere dayanan birçok yöntem bulun- hayvanlarda, dehidrasyon ve lipitlerle ilgili yan- maktadır. Bu yöntemler genel olarak; etkenin lış pozitifliklerden dolayı ve esas aglutinasyon kendisinin tespitine dayanan izolasyon yöntem- veren antikor olan IgM, günlük civcivlere geç- leri (bakteriyolojik yada virolojik yöntemler), mediği için günlük civcivlerde ÇLA testi geçerli etkenin vücutta oluşturduğu immun sistem tep- olmaz. Bunun dışında enfeksiyon sonrası örnek- kisi sonucu oluşan antikorların tespitine daya- leme çok yakın olmamalıdır, antibiyotik tedavi nan serolojik yöntemler ve etkenin nükleik asi- sonrası, etken tam giderilememiş olsa da antikor tinin tespitine dayanan moleküler yöntemler cevabı azalmış olabilir, tüm mikroorganizmalar olarak gruplandırılabilir. Geleneksel teşhis me- humoral immun yanıtı aynı düzeyde uyarama- totlarından en önemlisi olan etkenin direkt ola- yabilirler, yaşlı kanatlı hayvanların gençlere rak kendisinin tespitine dayanan izolasyon yön- göre serumlarında daha fazla non-spesifik faktö- temleri, altın-standart yöntemler olarak kabul rün bulunabileceği gibi birçok sebebin ÇLA ve edilirler. Ancak bakteriyel izolasyonun birçok diğer serolojik testlerin kullanımını kısıtladığı, dezavantajı bulunmaktadır. Bakteriyel izolasyo- serolojik çalışmalarla kanıtlanmıştır1,8,14,17,26,35,37. nun mutlaka sadece bu amaçla kurulmuş çok iyi Bu ve bunun gibi pek çok nedenlerden dolayı, koruma şartlarına sahip laboratuvarlarda çalı- serolojik testlerin sonuçları yorumlanırken tüm şılması gerekmektedir. Elde edilecek etkene bu faktörler göz önünde bulundurulmalıdır22. göre, izolasyon-identifikasyon ve istenirse daha sonra yapılabilecek antibiyogram sonuçlarının Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) elde edilmesi, 3 günden 2 aya kadar bir süre Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), nük- gerektirmektedir. Alınan örneklerde canlı etke- leik asitlerin tespitinde ve nükleik asitlerle ilgili nin olmamasından kaynaklanan yada örneklerin çalışmalarda kullanılan oldukça sensitif ve spe- alınırken başka mikroorganizmalarla kontamine sifik bir moleküler tekniktir27. Spesifik DNA ve edilmesi sonucu yanlış negatiflikler meydana RNA bölgelerinin tespiti, DNA sekanslanması, gelebilmektedir. İzolasyon sonrası yapılacak parmak izi tabanlı amplifikasyon yöntemleri, identifikasyon testleri, çoğu durumda yetersiz kültür edilemeyen mikroorganizmaların teşhisi kalmakta ve kesin sonuç elde edebilmek için, ve mutasyonların tespiti gibi daha birçok amaçla saf kültürlerle ve büyük bir özen içinde çalışıl- kullanılmaktadır22. maları gerekir. Bu kadar özenle yapılan identi- fikasyon testleri, yeterli sonuçlar veremeyip Deoksiribonükleik asit (DNA) veya ribo- tekrar ek biyokimyasal testler yapılmasını bile nükleik asit (RNA) dizilerinin sayısal olarak gerektirebilmektedir. Kısaca bahsedilen tüm bu artırılması esasına dayanan PCR’ın en önemli nedenler, izolasyon ve identifikasyonun, çok yönü, özel bir DNA dizisinin seçilip çoğaltıla- uzun süren ve dolayısıyla acil sonuç alınması rak istenmeyen dizilerin ortaya çıkmasının ön- gereken durumlarda, çok uygun olmayan yön- lenebilmesidir. Bu özellik, test edilen örnekler tem olduğunu göstermektedir3,7. içerisinde aranan bölgenin olup olmadığının görülmesini kolaylaştırmakla kalmayıp, aynı Serolojik metotlar da hastalıkların farklı zamanda bölgenin çok miktarda kopyası elde açıdan teşhisini sağlayan (antikor miktarı) gele- edileceğinden, daha ileri tekniklerle DNA’nın neksel metotlar olarak kabul edilmektedirler. analiz edilmesini de sağlamaktadır33,38. Hedef Serolojik metotların da sağladıkları avantajlar genetik materyaller çok az sayıda ve hatta bir- kadar dezavantajları da bulunmaktadır. Antikor çok ilgisiz DNA’lar arasında olsa bile PCR’la tespitine dayanan serolojik yöntemlerde de [ça- homojen bir DNA materyali haline getirilip buk lam aglütinasyon (ÇLA), enzyme-linked çoğaltılabilir ve böylece kolayca identifiye edi- immunosorbent assay (ELISA) vb...] antikorla- lebilirler6,33,34,38. rın tespit edilebilmesi için, antikorların yüksek olduğu dönemlerde örnek alınmasının gereke- Doğal enfeksiyonlarda kuluçka süresinin bilmesi gibi nedenlerle, yine yanlış negatiflik çok uzayabilmesi, bulaşmanın yavaş olması ve sorun oluşturabilmektedir. Yetiştiricilikte viral klinik semptomlar gözlendiğinde çok gecikmiş ve bakteriyel hastalıklar için kullanılan inaktif olunabileceği için enfeksiyonun sık taramalarla aşıların da, ELISA ve ÇLA testinde non- takibi çok önem kazanır. PCR ile yakın türler 41 arasında ya da alt tipler arasında ayırım yapıla- daha yüksek olduğunu bildirilmiştir. Çalışılan bilir ve klinik örnekler ön zenginleştirmeye örneklerde aranan etkenin, birçok sebepten kay- gereksinim duymadan, kısa sürede çalışılabilir- naklanabilecek az miktarda olması durumu söz ler. Doğal konaklarının dışında üretilmesi çok konusu ise, RT PCR yüksek tespit limiti ile zor olan ve bu nedenle tespit edilemeyen mik- doğru sonuçlar verebilmektedir. Bu ve buna roorganizmaların teşhisinde de, PCR testinin benzer birçok sebep ve kullanılması gereken ek çok büyük önemi bulunmaktadır32. malzeme, zaman kaybı, iş gücü kaybı gibi daha Günümüzde insan ve hayvanların enfek- birçok sebep de geleneksel tabanlı PCR testleri- siyöz hastalıklarının teşhisi ve epidemiyolojik nin kaçınılmaz dezavantajlarını oluşturmaktadır. çalışmaları, PCR tabanlı tekniklerin uygulama- PCR reaksiyonu kinetik olarak 3 fazda ya sokulmasıyla olağanüstü bir hız kazanmıştır. gerçekleşir. Bunlar eksponensiyal, lineer ve Bakteri, virüs, mantar veya parazitin izolasyonu plato fazlarıdır. PCR reaksiyonu tüm sikluslarda ve identifikasyonu için, oldukça uzun ve zah- mükemmel etkinlikle devam etmez. Belirli bir metli bir dizi laboratuvar işleminin yapılmasını siklustan sonra ortamda kullanılan reagentler ve gerektiren uygulamalara PCR’ın devreye girme- bu reagentlerin etkinlikleri azalmaya başlar ve siyle gerek kalmamıştır8. reaksiyon son faz olan plato fazına ulaşır. İste- nilen ürünün 0.3-1 pmol civarına ulaşması ile Real Time PCR birlikte, oluşan ürünün logaritmik olarak azal- İlk geliştirdiği yıllardan beri takip edil- masına plato etkisi denir. Bu etkinin nedeni, mesi oldukça zor olan, sürekli güncellemeler ve substrat kullanımının azalması, enzimin kararsız geliştirilen sistemlerle, kullanımı yaygınlaşmaya hale gelmesi, son ürün inhibisyonu, spesifik devam eden PCR tabanlı sistemler, genel olarak ürün inhibisyonu veya primer-dimer yapışması geleneksel ve Real-Time (RT) tabanlı sistemler ve ürünün tam olarak denatüre olamamasıdır36. olarak 2 gruba ayrılarak değerlendirilebilirler. Zaten reaksiyon bileşenleri, DNA’yı ancak belli Geleneksel PCR tabanlı testler, çoklu kompleks bir miktara kadar etkili bir şekilde amplifiye basamaklar ve bu nedenle uzmanlaşmış kişiler edebilir ve PCR reaksiyonunun sonunda reaksi- gerektiren, örneklerin dışarıdan başka yonun başlangıcındaki DNA’yı doğru bir şekil- DNA’larla kontaminasyon riskini artıran açık de ölçebilmek mümkün değildir. Yani reaksiyo- reaksiyon sistemleridir. Bu testlerin kompleksli- nun başında ne kadar spesifik DNA’nın olduğu liğine bir de maliyet yüksekliği eklenmekte- ve dolayısıyla reaksiyonun sonunda bununla dir9,13. Ayrıca, PCR reaksiyonundan sonra olu- orantılı olarak ne kadar spesifik DNA oluştuğu- şan PCR ürününü görebilmek için, agaroz jel nu, geleneksel PCR’la ölçüm yaptığımız son faz elektroforezis, sourthern blot, ELISA benzeri olan plato fazında ölçmek mümkün değildir40. sistemlerden yararlanılması gerekebilmektedir. Real-Time PCR etkin ve doğru ölçümün yapıla- Bu sistemler tatminkar sonuçlar verseler de bildiği eksponensiyal faz boyunca spesifik PCR sonrası oluşan ürünü ortaya koymak için DNA’nın ölçümünü yaparak geleneksel PCR’a yapılan bu işlemlerin yoruculuğu, iş gücü kaybı karşı avantaj sağlamaktadır. Bu ölçüm, reaksi- ve artan kontaminasyon riski kaçınılmaz olmak- yonun başlangıcındaki spesifik DNA miktarıyla tadır12,15,28. Aynı zamanda, aynı büyüklükte orantılı olduğu için, miktar tayini yapılmasına nonspesifik amplifikasyon ürünleri de yanlış da imkan sağlamaktadır31,40. pozitif sonuçlara neden olabilmektedir. RT PCR, 1980 yılında Karry Mullis tara- Bu sebeplerle PCR sonrası oluşan ürünle- fından geliştirilen, araştırmacılara istenilen ge- rin özgünlüğünü artırmak için proba dayalı so- nin spesifik bölgesinin 1 milyondan fazla kez uthern ya da mikropleyt hibridizasyon teknikleri çoğaltılmasını sağlayan PCR’ın, çok önemli ve de kullanılabilmektedir. Bu teknikler ise, ancak yeni bir versiyonudur11,40. RT PCR sistemleri, büyük miktardaki örneklerle kolay ve hızlı so- amplifikasyonunu ve amplifiye olmuş ürünün nuçlar sağlayabilmektedirler. Ayrıca bu metot- (amplikon) kontrolünü aynı kapalı sistemlerde ların bazıları, amplifikasyon ve deteksiyonun gerçekleştiren ve amplikonun görüntülenmesine aynı yerde olmasından kaynaklanan kontami- izin veren, gıdalardan, memeli genomundan, nasyon riski taşımaktadırlar. PCR uygulamala- genetik olarak geliştirilmiş organizmalardan, rının ana problemlerinden birini de zaten farklı insan ve veteriner mikrobiyoloji alanlarındaki kaynaklardan gelebilecek kontaminasyonlardan çok farklılık gösterebilen örneklerden nükleik kaynaklanan yanlış pozitif sonuçlar oluşturmak- asitlerin aranmasında kullanılmaya devam edil- tadır15,28,40. PCR’ın tespit limitinin kültür ve mektedir2,24,30. geleneksel PCR metotlarına göre 10-1000 kat 4 2 1966’dan beri etidyum bromürün nükleik rak, sadece negatif ve pozitif olarak sonuç veren asitlere bağlandığında floresanını artırdığı bi- geleneksel PCR’da ise miktar tayini oldukça zor linmektedir. Bu floresan kimyası PCR’la ve olmaktadır. RT PCR ile kros kontaminasyon ve gerçek zamanlı videografiyle birleşince çevresel kontaminasyon riski çok aza indirgenir. 1990’ların başlarında RT PCR’ın doğmasını Testi yapan kişiden kaynaklanan yanlışlıklar sağlamıştır11,16. Bu aletler, sıcaklık değişimini olasılığı da, test süreci içinde yapılan işlem sa- konvansiyonel termocyclerlara göre çok daha yısı azaldığı için düşmektedir4,5,28. hızlı bir şekilde gerçekleştirirler ve her PCR siklusu sonunda, hedef DNA’ya nükleik problar Sonuç veya floresan boyalar bağlandıktan sonra açığa çıkan floresanı tespit eden sistemlere sahiptir- Morbidite ve mortalitesi yüksek, etken ler13. EtBr ya da SG I gibi DNA bağlayan boya- izolasyonu zor yada imkansız olan ya da özel lar, hidroliz problar, hibridizasyon problar, mo- laboratuar sistemleri ve her mikroorganizma leküler beaconlar, sunrise ve scorpion primerler için uzmanlaşmış kişileri ve acil teşhisi gerekti- ve peptit nükleik asit light-up problar gibi çeşitli ren durumlarda, enfeksiyonların yaygınlaşma- sistemler mevcuttur. Bu sistemlerin hepsi mey- dan kontrol altına alınabilmesi için PCR sistem- dana gelen ürünün her siklusta analizini sağla- leri günümüzde en önemli teşhis metodlarıdır. maktadır40. Gen anlatımının analizini değistiren, RT Roche moleküler sistemler özel şirketine PCR ile geleneksel PCR yöntemi ve gen analizi bağlı olarak Higuchi ve arkadaşları20 RT PCR birleştirilmişdir. Birçok isimlendirme yapılan sistemlerini ilk kez geliştiren kişilerdir. Daha Real-Time teknolojisi literatürde ‘kinetik PCR’, sonra ticari olarak satılan birçok RT cihazı piya- ‘homojen PCR’, ‘kantitatif Real-time PCR’ gibi saya çıkartılmıştır ve çıkartılmaya devam et- çeşitli adlarla da isimlendirilmektedir11,18. Biyo- mektedir. Birbirleri arasındaki temel farklılıklar lojik örneklerden elde edilen DNA’nın kopya cihazların optik sistemleri ve özellikle kullanı- sayısını sayısal değerlere dönüştürme, lan floresan boyaların eksitasyon ve emisyon mRNA’nın düzeyini sayısal olarak belirleye- dalga boyları, ısıtma türüne bağlı olarak reaksi- bilme, tek nokta mutasyonlarını belirleme, pato- yon hızları ve aynı anda paralel uygulanabilen jen belirleme, DNA hasarı belirleme, metilas- reaksiyon sayısı kapasiteleridir. Ticari olarak yon tespiti, single nükleotid polimorfizm (SNP) satılanlardan Stratagene M × 3000 p, M × analizi ve kromozom bozukluklarının tespiti 3005p ve M×4000, Applied Biosystems 7300 ve gibi pek çok alanda da RT PCR’ın kullanımı 7500, Chromo4, Smart Cycler, Rotor-Gene, LC mümkündür18,23. Bu metot, protein seviyesi ve en fazla kullanılanlardır15. fonksiyonlarındaki potansiyel farklılıklar gibi RT PCR, geleneksel PCR’ın uygulama biyolojik proseslerin daha iyi anlaşılması için de alanlarını genişletirken, PCR ile ilgili pek çok oldukça kullanışlıdır. Geleneksel PCR’a göre laboratuvar sorununa da çözüm getirmiştir. Bu daha çok avantaja sahip olan RT PCR teknoloji- yöntem sayesinde, DNA ve RNA örnekleri kali- si, günümüzde en hızlı gelişen ve oldukça fazla tatif ve kantitatif olarak kısa sürede analiz edil- alanlarda avantaj sağlayan teknik olarak teşhis mekte, çok sayıda örnek son derece az kontami- ve epidemiyolojik alanlardaki tüm çalışmalara nasyon riskleriyle, güvenle çalışılabilmektedir. da temel olmaya ve hız kazandırmaya devam RT PCR’da, PCR reaksiyonu sırasında oluşan etmektedir. ürünleri görünür hale getiren ve monitorize edebilen floresan işaretli prob ve boyalar kulla- Kaynaklar nılmakta, ve oluşan flouresan DNA ile doğru orantılı olarak arttıkça reaksiyon sırasında so- 1. Ahmad I., Kleven S.H., Glisson J.R., Avakian A.P.,1989. Further studies of Mycoplasma galli- nuçlar görülebilmekte, tüm bunlar tek bir tüpte septicum serum plate agglutination antigen ve tek bir işlemle belirlenebilmektedir11,16,29,39. growth in medium with artificial liposomes subs- RT PCR’ın en önemli yararlarından birisi tituting for serum. Avian Diseases, 33, 51-526. de araştırıcının DNA’nın başlangıç seviyesi çok 2. Ahmed F.E., 2002. Detection of genetically mo- az miktarda olsa dahi bu seviyenin belirlenme- dified organisms in foods. Trends in Biotechno- sine imkan vermesidir. Amplifikasyon sürecin- logy, 20, 215-223. de örnekteki DNA ne kadar yüksekse, floresan 3. Akgün Y., 1996. Mikrobiyolojik Tanı Yöntem- sinyal o kadar çabuk eşik seviyesine çıkmakta leri. Editör: Nuray Serter. Mikrobiyoloji. T.C. bu da miktar tayinini mümkün kılmaktadır40. Anadolu Üniversitesi Yayınları, No: 490, DNA’nın başlangıç seviyesinden bağımsız ola- 43 Açıköğretim fakültesi yayınları, No: 219. Ünite nostic methods. İnternational Journal of Poultry 16, Eskişehir, pp. 259-265. Science, 8, 104-107. 4. Anonim, 2008. Validation and quality control of 16. Gibson U.E., Heid C.A., Williams P.M., 1996. A polymerase chain reaction methods used for the novel method for real-time quantitative RT-PCR. diagnosis of infectious diseases. Manual of Stan- Genome Research, 6, 995-1001. dards for Diagnostic Tests and Vaccines, Chapter 17. Güler L., 1995. Konya bölgesinde kanatlıların 1.1.5, Ofise International Epizootic terrestrial kronik solunum yolu hastalığı (chronic respira- Manual, Paris. tory diseases-CRD)’ nin serolojik ve etken izo- 5. Anonim, 2009. Biotechnology in the diagnosis of lasyonu ile karşılaştırmalı teşhisi üzerine çalışma- infectious diseases and vaccine developments. lar. Veterinarium, 6, 7-15. Manual of Standards for Diagnostic Tests and 18. Günel T., 2007. Gen anlatımının kantitatif analizi Vaccines, Chapter 1.1.7. Office International “Real-Time PCR”. Türkiye Klinikleri Journal of Epizootics Terrestrial Manual, Paris. Medical Sciences, 27, 763-767. 6. Arda M., 1995. Biyoteknoloji (bazı temel ilke- 19. Gökçelik G., 2008. Mycoplasma infeksiyonları- ler). Kükem Derneği Bilimsel Yayınları, No: 3, nın teşhisi ve serolojik izleme programlarının Ankara. önemi. Veteriner Tavukçuluk Derneği Dergisi, 1, 7. Arda M., 2000. Bakteriyal İzolasyon, İdentifi- 6-11. kasyon. Temel Mikrobiyoloji, 28. Bölüm. 20. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S., Griffith R., Medisan Yayın Serisi, No: 46, genişletilmiş 2. 1992. Simultaneous amplification and detection baskı, Medisan Yayınevi, Ankara, pp. 268-272. of specific DNA sequences. Biotechnology, 10, 8. Avakian A.P., Kleven S.H., Glisson J.R.,1988. 413–417. Evaluation of the specificity and sensitivity of 21. Johnson J.R., 2000. Development of polymerase two commercial enzyme-linked immunosorbent chain reaction-based assays for bacterial gene de- assay kits, the serum plate agglutination test and tection. Journal of Microbiological Methods, 41, the hemaglutination-inhibition test for antibodies 201-209. formed in response to Mycoplasma gallisepticum. 22. Kahya S., 2009. Tavuklarda Mycoplasma galli- Avian Diseases, 32, 262-272. septicum aranması için LightCycler (LC) Poly- 9. Berry O., Sarre S.D., 2007. Gel-free species merase Chain Reaction (PCR) sisteminin optimi- identification using melt-curve analysis. Molecu- zasyonu. Uludağ Üniversitesi Sağlık Bilimleri lar Ecolology Notes, 7, 1-4. Enstitüsü, Veteriner Mikrobiyoloji Anabilim Da- 10. Bradbury J.M., McCarthy J.D., Metwalf lı, Doktora Tezi, Bursa. A.Z.,1990. Microimmunofluorescence for the se- 23. Kubista M., Andrade J.M., Bengtsson M., Foroo- rological diagnosis of avian Mycoplasma infecti- tan A., Jonak J., Lind K., 2006. The real-time ons. Avian Pathology, 19, 213-222. polymerase chain reaction. Molecular Aspects in 11. Bustin S.A., 2000. Absolute quantificatication of Medicine, 27, 95-125. m RNA using real-time reverse transcription 24. Klein D., 2002. Quantification using real-time polymerase chain reaction assays. Journal of Mo- PCR technology: Applications and limitations. lecular Endocrinology, 25, 169-193. Trends in Molecular Medicine, 8, 257-260. 12. Cockerill F.R., Smith T.F., 2002. Rapid-cycle 25. Kleven S.H., Yoder H.W., 1984. Mycoplasmosis. real-time PCR: A revolution for clinical microbi- Editörler: Purchase H.G., Arp L.H., Domermuth ology. American Society for Microbiology News, C.H., Pearson J.E. A laboratory manual for the 68, 77-83. isolation and identification of avian pathogens, 13. Cockerill F.R., 2003. Application of rapid-cycle 3th edition, American Association of Avian Pat- real-time polymerase chain reaction for diagnos- hologists, Kenet Square, Pennsylvania, pp. 57-62. tic testing in the clinical microbiology laboratory. 26. Kleven S.H., 1975. Antibody response to avian Archieves of Pathology and Laboratory Medici- Mycoplasmas. American Journal of Veterinary ne, 127, 1112-1120. Research, 36, 563-565. 14. Ewing M.L., Kleven S.H., Brown M.B., 1996. 27. Leutenegger C.M., 2001. The Real-Time Taqman Comparision of enzyme linked immunosorbent PCR and Applications in Veterinary Medicine. assay and hemaglution inhibition for detection of Veterinary Sciences, Tomorrow, 1-15. antibody to Mycoplasma gallisepticum in com- 28. Mackay I.M., 2004. Real time PCR in the micro- mercial broiler, fair and exhibition and experi- biology laboratory. Clinical Microbiology and mentally infected birds. Avian Diseases, 40, 13- Infection, 10, 190-212. 22. 29. Mekkes D.R., Feberwee A., 2005. Real time 15. Evans J.D., Thornton D.L., Branton S.L., 2009. polymerase chain reaction for qualitative and qu- Diagnosis of Mycoplasma gallisepticum from antitave detection of Mycoplasma gallisepticum. broiler breeder flock: comparision of three diag- Avian Pathology, 34, 348-354. 44 30. Mhlanga M.M., Malmberg L., 2001. Using Mo- 36. Şahin F., Çiftçi M., Pirim İ., 2000. Polimeraz lecular beacons to detect single-nucleotide poly- zincir reaksiyonu (PCR). II. Uygulamalı molekü- morphisms with real-time PCR. Methods, 25, ler biyoloji teknikleri kurs notları. Ankara Üni- 463-471. versitesi Biyoteknoloji Uygulama ve Araştırma 31. Raymaekers M., Smets R., Maes B., Cartuyvels Merkezi. R., 2009. Checklist for optimization and validatin 37. Türkaslan J., Salihoğlu H., 1989. Çeşitli besiyer- of Real-Time PCR assays. Journal of Clinical leri kullanılarak Mycoplasma gallisepticum’un Laboratory Analysis, 23, 1445-151. bakteriyolojik yöntemlerle izolasyon ve identifi- 32. Sachse K., 2004. Specifity and performance of kasyonu. Pendik Hayvan Hastalıkları Merkezi PCR detection assays for microbial pathogens. Araştırma Enstitüsü Dergisi, 2, 53-59. Molecular Biotechnology, 26, 61-79. 38. Walker J., Douan G., 1989. DNA Probes: A new 33. Saiki K.R., Gelfand H.D., Stoffi S., Scharf J.S., role in diagnostic microbiology. Journal of App- Higuchi R., Horn T.G., 1988. Primer-directed lied Microbiology, 67, 229-230. enzymatic amplification of DNA with a thermos- 39. Walker N.J., 2002. A technique whose time has table DNA polymerase. Science, 239, 487-491. come. Science, 296, 557-559. 34. Schochetman G., Jones K.W., 1998. Polymerase 40. Valasek M.A., Repa J.J., 2005. The power of Chain Reaction. Journal of Infectious Diseases, real-time PCR. Advances in Physiology Educa- 158, 1154-1157. tion, 29, 151-159. 35. Snell G.C., Cullen G., 1978. An evaluation of 41. Yoder H.W.,1989. Nonspesific reactions to My- rapid serum agglutination inhibition tests for My- coplasma serum plate antigens induced by inacti- coplasmosis in Turkeys. Brazilian Veterinary Jo- vated poultry disease vaccines. Avian Diseses, urnal, 138, 198-204. 33, 60-68.