BAZI LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN KEÇİBOYNUZU UNU İLE ENKAPSÜLASYONU Elif TÜLEK T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN KEÇİBOYNUZU UNU İLE ENKAPSÜLASYONU Elif TÜLEK 0009-0006-9844-3353 Prof. Dr. Saliha ŞAHİN (Danışman) YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI BURSA – 2025 Her Hakkı Saklıdır TEZ ONAYI Elif TÜLEK tarafından hazırlanan “BAZI LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN KEÇİBOYNUZU UNU İLE ENKAPSÜLASYONU” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Başkan : Prof. Dr. Saliha ŞAHİN 0000-0003-2887-5688 Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı İmza Üye : Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ ERSAN 0000-0002-8482-5055 Bursa Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı İmza Üye : Prof. Dr. Şule DİNÇ ZOR 0000-0002-9703-6768 Yıldız Teknik Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı İmza Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Ali KARA Enstitü Müdürü 24/02/2025 B.U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; − tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, − görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, − başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, − atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, − kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, − ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 24/02/2025 Elif TÜLEK TEZ YAYINLANMA FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezin/raporun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kâğıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma izni Bursa Uludağ Üniversitesi’ne aittir. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet hakları ile tezin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları tarafımıza ait olacaktır. Tezde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanılması zorunlu metinlerin yazılı izin alınarak kullandığını ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederiz. Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” kapsamında, yönerge tarafından belirtilen kısıtlamalar olmadığı takdirde tezin YÖK Ulusal Tez Merkezi / B.U.Ü. Kütüphanesi Açık Erişim Sistemi ve üye olunan diğer veri tabanlarının (Proquest veri tabanı gibi) erişimine açılması uygundur. Prof. Dr. Saliha ŞAHİN 24/02/2025 Elif TÜLEK 24/02/2025 BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ LİSANSÜSTÜ TEZ TANITIMI ÖĞRENCİ VE DANIŞMAN FORMU FR 3.4.6_27 BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ YÜKSEK LİSANS/DOKTORA EĞİTİMİ BOYUNCA BİLİMSEL ÇALIŞMALARI VE FAALİYETLERİ 1. Karkar, B., Patır, İ., Tülek, E., Eyüboğlu, S., & Şahin, S. (2024). Improving viability in the in vitro gastrointestinal system by encapsulation of Lacticaseibacillus paracasei probiotic bacteria on chestnut (Castanea sativa Mill.) fruit. Erzincan University Journal of Science and Technology, (SUIC), 52-70. https://doi.org/10.18185/erzifbed.1534543 2. Tülek, E., Şahin, S. Probiyotik bakterilerin keçi boynuzu (Ceratonia Siliqua L.) ile enkapsülasyonu, 10.Ulusal Analitik Kimya Kongresi, 7-11 Eylül 2022, Muğla. (Poster Sunumu) 3. Tülek E., Şahin, S. Keçiboynuzu (Ceratonia siliqua L.) ununun fenolik bileşik içeriği ve antioksidan özelliğinin belirlenmesi. XXI. Kromatografi Kongresi, 14-16 Haziran 2023, Aydın. (Poster Sunumu) 4. Patır, İ., Tülek E., Şahin, S. Amaranthus/aljinat hidrojellerin boya biyosorpsiyonunda kullanımı; kemometrik optimizasyon (RSM-CCD), denge ve kinetik çalışmaları. XXI. Kromatografi Kongresi, 14-16 Haziran 2023, Aydın. (Poster Sunumu) 5. Küçükdağ E., Tülek E., Şahin S. Kızılçam (Pinus Brutia) kabuğundan antioksidan maddelerin ultrasonik ekstraksiyon parametrelerinin kemometrik optimizasyonu. 9. Ulusal Kimya Öğrenci Kongresi, 27-29 Mayıs 2024, Bursa. (Sözlü Sunum) 6. Bağlı Ş., Zeyrek K., Zeytinoğlu B., Tülek E., Şahin S. Farklı kimyasal içeriğe sahip C vitamini takviye ürünlerinin antioksidan özelliklerinin belirlenmesi. 9. Ulusal Kimya Öğrenci Kongresi, 27-29 Mayıs 2024, Bursa. (Poster Sunumu) 7. Bazı probiyotik bakterilerin keçiboynuzu unu ile enkapsülasyonu ve hayvan beslemede yem katkı maddesi olarak kullanımının araştırılması. Bursa Uludağ Üniversitesi, Araştırma Üniversiteleri Destek Programı Projesi (ADEP), Proje No: FGA-2023-1272 (Bursiyer), 25 Mayıs 2023-devam ediyor 8. Lacticaseibacillus paracasei probiyotik bakterisinin kestane (Castanea sativa Mill) meyvesi üzerine enkapsülasyonu ile in-vitro gastrointestinal sistemde bakteri canlılığının geliştirilmesi. Bursa Uludağ Üniversitesi, Hızlı Destek Projesi (HZP), Proje No: FHIZ-2023- 1699 (Araştırmacı), 15 Aralık 2023-17 Haziran 2024 (tamamlandı) DANIŞMAN Adı SOYADI : Saliha ŞAHİN ÜNVANI : Prof. Dr. FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ABD E-POSTA : salihabilgi@uludag.edu.tr YÖKSİS ARAŞTIRMACI ID : 157825 ORCID : 0000-0003-2887-5688 TÜBİTAK ID : TBT-00083303 WOS RESEARCHER ID : AAH-2892-2021 SCOPUS AUTHOR ID : 15027401600 Google Scholar ID : g6KUAQkAAAAJ ÖĞRENCİ Adı SOYADI : Elif TÜLEK ÜNVANI : Öğrenci FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ABD E-POSTA : elftlek@gmail.com PROGRAMI : YÜKSEK LİSANS ORCID : 0009-0006-9844-3353 TÜBİTAK ID : TBTK-0121-5646 WOS RESEARCHER ID : GXH-4199-2022 Google Scholar ID : XpKOmEwAAAAJ https://doi.org/10.18185/erzifbed.1534543 BİRLEŞMİŞ MİLLETLER SÜRDÜRÜLEBİLİR KALKINMA HEDEFLERİ Anahtar kelimeler aşağıdaki bağlantı üzerinden seçilecektir. https://incites.help.clarivate.com/Content/Reso urces/Docs/SDG2023.xlsx Anahtar Kelimeler Chemometrics Lactic Acid Bacteria, Gut Microbiota, Antioxidant Activity Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler https://incites.help.clarivate.com/Content/Resources/Docs/SDG2023.xlsx https://incites.help.clarivate.com/Content/Resources/Docs/SDG2023.xlsx i ÖZET Yüksek Lisans Tezi BAZI LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN KEÇİBOYNUZU UNU İLE ENKAPSÜLASYONU Elif TÜLEK Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Probiyotik bakterilerin konakçı sağlığı üzerine faydalı etkiler gösterebilmeleri için gıda üretimi, depolanması ve tüketimi sonrası gastrointestinal sindirim sisteminde canlılıklarını yüksek oranda koruyabilmeleri gerekmektedir. Bunun için de probiyotik bakterilerin özellikle prebiyotik özellikteki maddelerle enkapsüle edilmesi önemlidir. Bu çalışmada öncelikle keçiboynuzu ununun (Ceratonia siliqua L.) fenolik bileşik içeriği, antioksidan özelliği ve fizikokimyasal içeriği (toplam şeker, toplam yağ, toplam protein, toplam diyet lif, kuru madde, nem, titre edilebilir asitlik ve kül) belirlenerek kaplama materyali olarak kullanılabilirliği araştırılmıştır. Keçiboynuzu ununun yüksek fenolik bileşik içeriğinin yanı sıra %35,3±1,35 diyet lifi içeriği ile fonksiyonel bir kaplama materyali olarak seçilmesinin uygun olduğu ortaya koyulmuştur. Lacticaseibacillus rhamnosus ve Lacticaseibacillus paracasei probiyotik bakterileri potansiyel olarak prebiyotik özellikteki keçiboynuzu unu ile emülsiyon yöntemi kullanılarak enkapsüle edilmiştir. Her iki bakteri için enkapsülasyon koşulları Box-Behnken Dizayn ile kemometrik olarak optimize edilmiştir. L. rhamnosus ve L. paracasei kapsüllerinin enkapsülasyon verimleri sırasıyla %79,51±0,36 ve %74,98±0,20 olarak belirlenmiştir. Hazırlanan probiyotik bakteri kapsüllerinin yapı karakterizasyonları FTIR ve SEM analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Serbest ve enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin, +24C, +4C ve -24C’de 28 günlük depolama sürecindeki canlılıkları incelenmiş ve kapsüllerin bakteri canlılıklarının +4C ve -24C’de önemli ölçüde korunduğu tespit edilmiştir. In vitro gastrointestinal sindirim sürecinde ise kapsüllerin serbest probiyotik bakterilere göre sindirim koşullarına karşı daha dayanıklı olduğu gözlemlenmiştir. Sonuç olarak keçiboynuzu unu-probiyotik bakteri kapsüllerinin fonksiyonel gıda ürünlerinde kullanımı sağlanarak hem insan sağlığına hem de gıda endüstrisine katkı sağlanabileceği öngörülmektedir. Anahtar Kelimeler: L. rhamnosus, L. paracasei, Ceratonia siliqua L., enkapsülasyon, optimizasyon 2025, x + 109 sayfa. ii ABSTRACT MSc Thesis ENCAPSULATION OF SOME LACTIC ACID BACTERIA WITH CAROB FLOUR Elif TÜLEK Bursa Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN For probiotic bacteria to exert beneficial effects on host health, they must be able to maintain high levels of viability in the gastrointestinal digestive system after food production, storage, and consumption. For this purpose, it is important to encapsulate probiotic bacteria, especially with prebiotic substances. In this study, the phenolic compound content, antioxidant properties, and physicochemical content (total sugars, total fat, total protein, total dietary fiber, dry matter, moisture, titratable acidity, and ash) of carob flour (Ceratonia siliqua L.) were determined, and its usability as a coating material was investigated. It was found that carob flour, with its high phenolic compounds and dietary fiber content of 35.3±1.35%, is suitable to be selected as a functional coating material. The probiotic bacteria Lacticaseibacillus rhamnosus and Lacticaseibacillus paracasei were encapsulated by the emulsion method with carob flour, potentially prebiotic. The encapsulation conditions for both bacteria were chemometrically optimized using the Box-Behnken Design. The encapsulation efficiencies of L. rhamnosus and L. paracasei capsules were determined to be 79.51±0.36% and 74.98±0.20%, respectively. The structural characterization of the prepared probiotic bacterial capsules was carried out using FTIR and SEM analyses. The viability of free and encapsulated probiotic bacteria was analyzed at +24C, +4C, and -24C during 28 days of storage, and it was found that the bacterial viability of the capsules was significantly preserved at +4C and -24C. In vitro gastrointestinal digestion showed that the capsules were more resistant to digestive conditions than free probiotic bacteria. As a result, it is predicted that carob flour-probiotic bacteria capsules can be used in functional food products and contribute to both human health and the food industry. Key words: L. rhamnosus, L. paracasei, Ceratonia siliqua L, encapsulation, optimization 2025, x + 109 pages. iii TEŞEKKÜR Tez çalışmamın tüm süreçlerine bilgi, destek ve rehberlikleriyle ışık tutan; akademik rehberliğinin ötesinde, cesaretlendirici sözleri ve sabırlı yaklaşımıyla bana katkı sağlayan değerli danışman hocam Prof. Dr. Saliha ŞAHİN’e teşekkür ederim. Bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan ve çalışmamın ilerlemesine destek veren değerli hocalarım Doç. Dr. Önder AYBASTIER ve Doç. Dr. Aslı GÖÇENOĞLU SARIKAYA’ya teşekkür ederim. Çalışmam sırasında bana daima yardımcı olan, fikirleriyle yön veren ve çalışma ortamımı keyifli hale getiren değerli hocam Dr. Büşra KARKAR ve değerli arkadaşlarım Yüksek Kimyager İlkyaz PATIR ÇELİK, Yüksek Kimyager Gizem BAYAÇLI UYGUN, Yüksek Kimyager Serenay EYÜBOĞLU, Açelya AKLAN, Gamze YILDIZ ve Melike GÜR’e teşekkür ederim. Yakın veya uzak fark etmeksizin manevi destekleri, samimiyetleri ve içten dostluklarıyla yanımda olan sevgili arkadaşlarım Sevde KUREYŞ, Merve ADSOY ve Duygu ULU’ya teşekkür ederim. Hayatımın her anında bana koşulsuz sevgi, sabır ve destek veren canım annem Ayşe TÜLEK, babam Şevket TÜLEK ve abim Furkan TÜLEK’e teşekkür ederim. Bana olan sevgisi, inancı ve desteğiyle her zaman yanımda olan ve bu zorlu yolculukta bana her daim güç veren nişanlım Gökmen KESEN’e sonsuz teşekkür ederim. Tez çalışmamı FGA-2023-1272 numaralı proje kapsamında destekleyen Bursa Uludağ Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri birimine teşekkür ederim. Elif TÜLEK 24/02/2025 iv İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET................................................................................................................................. i ABSTRACT ..................................................................................................................... ii TEŞEKKÜR .................................................................................................................... iii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ..................................................................... vi ŞEKİLLER DİZİNİ ....................................................................................................... viii ÇİZELGELER DİZİNİ .................................................................................................... x 1. GİRİŞ............................................................................................................................ 1 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI ...................................... 3 2.1. Probiyotikler .............................................................................................................. 3 2.2. Laktik asit bakterileri (LAB) ..................................................................................... 4 2.2.1. Lacticaseibacillus rhamnosus ................................................................................ 5 2.2.2. Lacticaseibacillus paracasei .................................................................................. 5 2.3. Enkapsülasyon .......................................................................................................... 7 2.3.1. Sprey kurutma yöntemi .......................................................................................... 9 2.3.2. Dondurarak kurutma yöntemi .............................................................................. 10 2.3.3. Ekstrüzyon yöntemi ............................................................................................. 10 2.3.4. Emülsiyon yöntemi .............................................................................................. 11 2.4. Probiyotik bakteri enkapsülasyonu ......................................................................... 13 2.5. Prebiyotikler ............................................................................................................ 17 2.5.1. Fenolik bileşikler .................................................................................................. 18 2.5.2. Diyet lifleri ........................................................................................................... 19 2.6. Sinbiyotikler ............................................................................................................ 19 2.7. Keçiboynuzu (Ceratonia siliqua L.) ....................................................................... 20 3. MATERYAL ve YÖNTEM ....................................................................................... 24 3.1. Materyal .................................................................................................................. 24 3.1.1. Keçiboynuzu unu (KBU) ..................................................................................... 24 3.1.2. Çalışmada kullanılan cihazlar .............................................................................. 24 3.1.3. Çalışmada kullanılan kimyasallar ........................................................................ 27 3.1.4. Çalışmada kullanılan sarf malzemeler ................................................................. 28 3.1.5. Çalışmada kullanılan çözeltiler ............................................................................ 29 3.2. Yöntem .................................................................................................................... 31 3.2.1. KBU ekstraksiyonu .............................................................................................. 31 3.2.2. KBU ekstraktlarının spektroskopik analizleri ...................................................... 33 3.2.3. KBU ekstraktlarının kromatografik analizi .......................................................... 35 3.2.4. KBU sterilizasyonu .............................................................................................. 35 3.2.5. Probiyotik bakterilerin geliştirilmesi ve aktive edilmesi ..................................... 36 3.2.6. Probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonu ................................................ 38 3.2.7. Probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analizi ..................................................... 40 3.2.8. Enkapsülasyon koşullarının optimizasyonu ......................................................... 42 3.2.9. KBU ve KBU-probiyotik bakteri kapsüllerinin fizikokimyasal analizleri .......... 44 3.2.10. KBU ve KBU-probiyotik bakteri kapsüllerinin karakterizasyonu ..................... 44 3.2.11. Probiyotik bakterilerin in vitro gastrointestinal sindirimdeki canlılıkları .......... 44 3.2.12. Probiyotik bakterilerin depolama koşullarındaki canlılıkları ............................. 48 4. BULGULAR ve TARTIŞMA .................................................................................... 49 4.1. Spektroskopik Bulgular ........................................................................................... 49 4.2. Kromatografik Bulgular .......................................................................................... 52 v 4.3. Probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonunun optimizasyonu ..................... 59 4.4. KBU ile KBU-LR ve KBU-LPC kapsüllerinin fizikokimyasal özellikleri ............. 70 4.5. KBU ile KBU-LR ve KBU-LPC kapsüllerinin karakterizasyonu .......................... 73 4.6. In vitro gastrointestinal sindirimde LR ve LPC probiyotik bakterilerinin canlılıkları ........................................................................................................................................ 81 4.7. Depolama koşullarında LR ve LPC probiyotik bakterilerinin canlılıkları .............. 88 5. SONUÇ....................................................................................................................... 96 KAYNAKLAR .............................................................................................................. 98 ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................. 108 vi SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama A β dk rpm cm-1 T g v/v kg kcal kob R2 w/v L log m µg µL µm mbar mg mL mm mM mAU ppm M nm N sa s ℃ cm % Absorbans Beta Dakika Dakikadaki devir sayısı Dalga sayısı Geçirgenlik Gram Hacim/hacim Kilogram Kilokalori Koloni oluşturan birim Korelasyon katsayısı Kütle/hacim Litre Logaritma Metre Mikrogram Mikrolitre Mikrometre Milibar Miligram Mililitre Milimetre Milimolar Milli absorbans birimi Milyonda bir kısım Molarite Nanometre Normalite Saat Saniye Santigrat derece Santimetre Yüzde Kısaltmalar Açıklama ABTS APİ AH BBD Ç 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) Apigenin Asidik hidroliz Box-Behnken Dizayn Çözücü vii MRS WHO EPGCG EPCG FTIR GA GAE FAO HYP CE KBU KBU-LPC KBU-LR QE QU LPC LR LABIP LAB NH SIF SGF SA SEM LOQ te LOD TCA TE UV-GB ISAPP ANOVA RSM HPLC-DAD De Man Rogosa ve Sharpe Dünya Sağlık Örgütü Epigallokateşin gallat Epikateşin gallat Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi Gallik asit Gallik asit eşdeğeri Gıda ve Tarım Örgütü Hiperozid Kateşin eşdeğeri Keçiboynuzu unu Keçiboynuzu unu-L. paracasei Keçiboynuzu unu-L. rhamnosus Kuersetin eşdeğeri Kuersitrin L. paracasei L. rhamnosus Laktik Asit Bakteri Endüstriyel Platformu Laktik asit bakterileri Neohesperidin Simüle bağırsak sıvısı Simüle mide sıvısı Siringik asit Taramalı elektron mikroskobu Tayin sınırı Tespit edilemedi Tespit sınırı trans-sinnamik asit Troloks eşdeğeri Ultraviyole/Görünür bölge Uluslararası Probiyotik ve Prebiyotik Bilimsel Derneği Varyans analizi Yanıt yüzey yöntemi Yüksek performanslı sıvı kromatografisi-diod serili dedektör viii ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Enkapsülasyon işlemi……………………………………............. 7 Şekil 2.2. Emülsiyon yönteminin şematik gösterimi...................................... 12 Şekil 2.3. Keçiboynuzu (Ceratonia siliqua L.) ağacı………………………. 20 Şekil 2.4. Keçiboynuzu meyvesi ve temel bileşenleri...……………………. 21 Şekil 2.5. Gallik asidin kimyasal yapısı …………………………………..... 22 Şekil 3.1. KBU’nun çözücü ekstraksiyonunun şematik gösterimi………….. 32 Şekil 3.2. KBU’nun asidik hidroliz içeren çözücü ekstraksiyonunun şematik gösterimi......................................................................................... 32 Şekil 3.3. Probiyotik bakterilerin geliştirilmesi ve aktive edilmesi………… 37 Şekil 3.4. Probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonu………………... 39 Şekil 3.5. Probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analizi…………………... 41 Şekil 3.6. SGF ortamında sindirimin analiz şeması ……………………....... 45 Şekil 3.7. SIF ortamında sindirimin analiz şeması ……………………......... 46 Şekil 3.8. Ardışık olarak SGF ve SIF ortamında sindirimin analiz şeması.... 47 Şekil 4.1. KBU’nun çözücü ekstraktının kromatogramı (280 nm)…………. 56 Şekil 4.2 KBU’nun asidik hidroliz içeren çözücü ekstraktının kromatogramı (280 nm).…………………………………………. 57 Şekil 4.3. LR probiyotik bakterisinin KBU ile enkapsülasyonu için üç boyutlu yanıt-yüzey grafikleri. A) Karıştırma zamanı ve karıştırma sıcaklığının enkapsülasyon verimine etkisi B) KBU miktarı ve karıştırma sıcaklığının enkapsülasyon verimine etkisi............................................................................................... 64 Şekil 4.4. LPC probiyotik bakterisinin KBU ile enkapsülasyonu için üç boyutlu yanıt-yüzey grafikleri. A) Karıştırma zamanı ve karıştırma sıcaklığının enkapsülasyon verimine etkisi B) KBU miktarı ve karıştırma zamanının enkapsülasyon verimine etkisi........................……………………………………............... 66 Şekil 4.5. FTIR spektrumları. A) Pektin B) Sterilize edilmiş KBU C) KBU D) KBU-LPC kapsülü E) KBU-LR kapsülü................................... 75 Şekil 4.6. KBU SEM görüntüleri. A) 2000X büyütme B) 3000X büyütme C) 5000X büyütme......................................................................... 77 Şekil 4.7. Sterilize edilmiş KBU SEM görüntüleri. A) 2000X büyütme B) 3000X büyütme C) 5000X büyütme............................................... 78 Şekil 4.8. KBU-LR kapsülü SEM görüntüleri. A) 2000X büyütme B) 3000X büyütme C) 5000X büyütme............................................... 79 Şekil 4.9. KBU-LPC kapsülü SEM görüntüleri. A) 2000X büyütme B) 3000X büyütme C) 5000X büyütme............................................... 80 Şekil 4.10. In vitro gastrointestinal sindirimin LR canlılığına etkisi. A) SGF ortamı B) SIF ortamı C) Ardışık olarak SGF ve SIF ortamı............ 85 Şekil 4.11. In vitro gastrointestinal sindirimin LPC canlılığına etkisi. A) SGF ortamı B) SIF ortamı C) Ardışık olarak SGF ve SIF ortamı............ 86 ix Şekil 4.12. Depolama süresinin ve farklı sıcaklıkların LR canlılığına etkisi. A) +24C B) +4C C) -24C……………………………………... 92 Şekil 4.13. Depolama süresinin ve farklı sıcaklıkların LPC canlılığına etkisi. A) +24C B) +4C C) -24C……………………………………... 93 x ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. L. rhamnosus ve L. paracasei probiyotik bakterilerinin özellikleri…………………………………………………….….. 6 Çizelge 2.2 Probiyotik bakteri enkapsülasyon yöntemleri................................ 14 Çizelge 2.3. Probiyotik bakteri enkapsülasyonuna ait çalışmalar………...…… 15 Çizelge 2.4. Keçiboynuzu ununun besinsel özellikleri………...………...……. 21 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları…………….. 24 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları (devam)…… 25 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları (devam)…… 26 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan kimyasallar………...………...………........ 27 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan kimyasallar (devam) ………...………...….. 28 Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan sarf malzemeler………...………...……….. 28 Çizelge 3.4. Analizlerde kullanılan çözeltiler ve hazırlanışları……….............. 29 Çizelge 3.4. Analizlerde kullanılan çözeltiler ve hazırlanışları (devam) ……... 30 Çizelge 3.5. HPLC-DAD gradient hareketli faz programı………...………...… 35 Çizelge 3.6. BBD için faktörler ve kodlanmış seviye değerleri………...…….. 42 Çizelge 3.7. BBD çizelgesi………...………...………...……............................ 43 Çizelge 4.1. Spektroskopik yöntemler için kalibrasyon verileri………...…….. 49 Çizelge 4.2. KBU ekstraktlarının spektroskopik analiz sonuçları………...…... 50 Çizelge 4.3. Fenolik bileşiklerin HPLC-DAD validasyon parametreleri…....... 53 Çizelge 4.4. KBU ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg/g KBU).………... 55 Çizelge 4.5. ANOVA analizi sonuçları………...………...………...…………. 61 Çizelge 4.6. LR ve LPC probiyotik bakterilerinin ikinci dereceden polinom denklemleri………...………...………...……................................ 62 Çizelge 4.7. LR ve LPC probiyotik bakterilerinin tahmini ve deneysel enkapsülasyon verimi.......………………………………….......... 63 Çizelge 4.8. Optimum koşullar ve optimum koşullarda belirlenen tahmini ve deneysel enkapsülasyon verimi...................................................... 68 Çizelge 4.9. KBU ile KBU-LR ve KBU-LPC kapsüllerinin fizikokimyasal özellikleri ....................................................................................... 72 Çizelge 4.10. LR ve LPC probiyotik bakterilerinin in vitro gastrointestinal sindirim sonrası belirlenen canlı hücre sayısı................................. 83 Çizelge 4.11. LR ve LPC probiyotik bakterilerinin in vitro gastrointestinal sindirim sonrası belirlenen canlılığı (%)......................................... 84 Çizelge 4.12. LR ve LPC probiyotik bakterilerinin depolama sonrası belirlenen canlı hücre sayısı............................................................................ 90 Çizelge 4.13. LR ve LPC probiyotik bakterilerinin depolama sonrası belirlenen canlılığı (%).................................................................................... 91 1 1. GİRİŞ Probiyotikler “yeterli miktarda alındığında konakçı sağlığı üzerine olumlu etkiler sağlayan canlı mikroorganizmalar” olarak tanımlanmaktadır (Markowiak ve Slizewska, 2017; Bilginer ve Çetin, 2019). Gıda fermentasyonunda yaygın olarak kullanılan ve fermentasyon süreçleri sayesinde ürünlerin duyusal özelliklerini ve kalitesini artıran Bifidobacterium ve Lactobacillus türleri sağlık üzerinde çeşitli etkilerle önemli bir rol oynayan ve yaygın olarak kullanılan probiyotik mikroorganizmalardır (Ayivi ve diğerleri, 2020; Zheng ve diğerleri, 2020; Latif ve diğerleri, 2023). Alerjik hastalıklar, kanser, hiperkolesterolemi, laktoz intoleransı, inflamatuar bağırsak hastalıkları, ishal ve huzursuz bağırsak sendromu gibi sağlık sorunlarının önlenmesi ve yönetimindeki faydaları sayesinde, tüketicilerin probiyotik içeren ürünlere olan ilgisi artmıştır (Grom ve diğerleri, 2020). Enkapsülasyon, katı, sıvı veya gaz haldeki gıda bileşenleri, enzim, hücre ve diğer mikroorganizmaların protein, karbohidrat veya lipit esaslı bir kaplama materyaliyle kaplanması ya da kaplama materyalinin içine hapsedilmesi prensibine dayalı bir yöntemdir (Gökmen ve diğerleri, 2012; Serna-Cock ve Vallejo-Castillo, 2013; Chawda ve diğerleri, 2017; Roshanzamir ve diğerleri, 2017). Bu yöntem oksijen, yüksek sıcaklık, düşük pH, sindirim enzimleri ve safra tuzları gibi olumsuz faktörler nedeniyle probiyotik bakterilerin işleme ve depolama gibi süreçlerde dayanıklı hale gelmesini sağlamak ve gastrointestinal sistemden geçerken canlılıklarını korumak amacıyla son yıllarda yaygın olarak kullanılmaktadır (Luo ve diğerleri, 2022). Prebiyotikler, “konağın bağırsak mikrobiyotasındaki mikroorganizmaların seçici olarak kullandığı ve sağlık üzerinde olumlu etkileri bulunan substratlar” olarak tanımlanmaktadır. Karbohidratlar en çok bilinen prebiyotikler olmasına rağmen, literatürde mineraller, polifenoller ve yağ asitleri gibi karbohidrat olmayan bileşenlerin prebiyotik potansiyeline dair umut verici sonuçlar içeren çalışmalar bulmak mümkündür (Ferreira ve diğerleri, 2023). Prebiyotikler sindirilmeksizin kalın bağırsağa ulaşarak, probiyotiklerin gelişimini ve aktivitelerini destekler. Probiyotik ve prebiyotiklerin birlikte kullanıldığı sinerjik etkileşim, sinbiyotik olarak adlandırılır. Sinbiyotikler, ürün 2 stabilitesini artırmada avantaj sağlayarak sindirim sistemini daha sağlıklı hale getirir. Sinbiyotiklerin alımı, çiğ sebzeler, meyveler, fermente gıdalar veya süt ürünleri gibi doğal kaynaklardan sağlanabileceği gibi, farmasötik ürünler ve fonksiyonel gıdalardan da temin edilebilir (Pandey ve diğerleri, 2015; Markowiak ve Śliżewska, 2017). Keçiboynuzu (Ceratonia siliqua L.), Leguminoseae (Fabaceae) familyasının bir üyesi olup, Akdeniz ve Ege bölgesinde yaygın olarak yetiştirilen bir bitkidir (Petkova ve diğerleri, 2017; Pazır ve Alper, 2018). Keçiboynuzu meyvesi yüksek şeker, diyet lif, fenolik bileşik ve mineral içeriği nedeniyle sağlık açısından çok değerli bir besin kaynağıdır. Keçiboynuzu ununun gıdalarda doğal bir tatlandırıcı olarak kullanılmasının yanı sıra, yüksek miktarda çözünmeyen diyet lif içeriği ve antioksidan aktivitesi ile potansiyel prebiyotik özelliklere sahip olduğu bilinmektedir (Fadel ve diğerleri, 2006; Durazzo ve diğerleri, 2014; El Batal ve diğerleri 2016; Petkova ve diğerleri, 2017; Arab ve diğerleri, 2022; Ziar ve diğerleri, 2022). Bu çalışmada fonksiyonel gıdalarda kullanılabilecek olan probiyotik bakteri kapsüllerinin elde edilmesi amaçlanmıştır. Bunun için probiyotik bakteriler potansiyel olarak prebiyotik özelliğe sahip olan keçiboynuzu unu ile enkapsüle edilerek depolama şartları ve sindirim süreçlerinde bakteri canlılıklarının arttırılması hedeflenmiştir. Bu doğrultuda keçiboynuzu ununun fenolik bileşik içeriği ve antioksidan özellikleri belirlenerek fizikokimyasal özellikleri değerlendirilmiş ve enkapsülasyonun keçiboynuzunun fizikokimyasal özellikleri üzerine etkisi incelenmiştir. Elde edilen probiyotik bakteri kapsüllerinin depolama ve in vitro gastrointestinal sindirimde canlılıkları incelenerek serbest probiyotik bakterilere göre üstünlükleri ortaya koyulmuştur. 3 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Probiyotikler Probiyotik terimi Yunanca kökenlidir ve “yaşam için” anlamına gelir. Probiyotikler, Dünya Sağlık Örgütü (WHO), Gıda ve Tarım Örgütü (FAO) ve Uluslararası Probiyotik ve Prebiyotik Bilimsel Derneği (ISAPP) tarafından, “yeterli miktarda alındığında, konakçının sağlığı üzerinde olumlu etkiler yaratan canlı mikroorganizmalar” olarak tanımlanmaktadır (Markowiak ve Slizewska, 2017; Bilginer ve Çetin, 2019). Probiyotik bir mikroorganizmanın tanımlanması için gerekli kriterler, Laktik Asit Bakteri Endüstriyel Platformu (LABIP) tarafından belirlenmiştir (Uymaz, 2010). Probiyotik potansiyeli taşıyan mikroorganizmalar; • Patojenik özellik taşımamalıdır. • Bağırsak epitel hücrelerine bağlanabilme yeteneğine sahip olmalıdır. • Mide asidi ve safra tuzlarına karşı dayanıklılık göstererek gastrointestinal sistemde varlığını sürdürebilmelidir. • Antimikrobiyal bileşikler üreterek zararlı mikroorganizmaların gelişimini engelleyebilmelidir. • Bağışıklık sistemini uyarıcı etkiler gösterebilmelidir. • Kolesterol azaltımı, laktaz aktivitesini artırma veya vitamin üretimi gibi faydalı metabolik işlevler gerçekleştirebilmelidir. • Üretim ve depolama gibi teknolojik süreçlerde dayanıklılığını koruyabilmelidir. Probiyotikler, alerjik hastalıklar, kanser, hiperkolesterolemi, laktoz intoleransı, inflamatuar bağırsak hastalıkları, ishal ve huzursuz bağırsak sendromu gibi çeşitli sağlık sorunlarının önlenmesi ve tedavisinde önemli bir rol oynamaktadır. Artan farkındalık ve bilimsel kanıtlar, tüketicilerin probiyotik içeren ürünlere olan ilgisini artırmıştır. Yoğurt, süt tozu, fermente tatlılar, peynir, dondurma, tahıllar ve meyve suları gibi birçok gıda probiyotiklerle zenginleştirilmekte ve probiyotik bakterilerle üretilen preparatların kullanımı giderek artış göstermektedir (Uymaz, 2010; Grom ve diğerleri, 2020). Genellikle probiyotik ürünlerde bakteri canlılığının 106-107 kob/mL-g düzeyinde olması, 4 günlük tüketimle ise 106-109 kob/g probiyotik alınması önerilmektedir. Bu canlılık, hem insan vücudu için yararlı etkide olabilmeleri hem de eklendikleri gıdaların üretim ve depolama süreçlerinde hayatta kalmaları için önemli kabul edilmektedir. (Gismondo ve diğerleri, 1999; Bilginer ve Çetin, 2019). Bifidobacterium ve Lactobacillus türleri sağlık üzerinde çeşitli etkilerle önemli bir rol oynayan ve yaygın olarak kullanılan probiyotik mikroorganizmalardır (Uymaz, 2010; Latif ve diğerleri, 2023). 2.2. Laktik asit bakterileri (LAB) LAB, gram-pozitif, spor üretmeyen, oksijenli solunum yapmayan ancak oksijene toleranslı bakterilerdir ve fermentasyon sırasında karbohidratları kullanarak laktik asidi ana fermentasyon ürünü olarak üretirler (Capurso, 2019; Zheng ve diğerleri, 2020). Tarım, gıda ve klinik sektörlerde önemli bir yere sahip olan bu bakteriler, özellikle gıda fermentasyonunda yaygın olarak kullanılmakta ve fermentasyon süreçleri sayesinde ürünlerin duyusal özelliklerini ve kalitesini artırmaktadır. Sadece fermente gıda üretiminde değil, aynı zamanda sağlık alanında sundukları faydalarla dikkat çeken bazı LAB’ler, probiyotik olarak sınıflandırılmaktadır (Ayivi ve diğerleri, 2020; Zheng ve diğerleri, 2020). Orla-Jensen (1919), laktik asit bakterilerinin sınıflandırılmasına yönelik temel bir monograf yayımlamış ve bu sistem; glikoz fermentasyonu, hücre morfolojisi, şeker kullanım kapasitesi ve optimum gelişme sıcaklığı gibi faktörlere dayanarak Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Streptococcus olmak üzere dört cinsi tanımlamıştır. LAB, şekerleri fermente ederek asit üretim özelliklerine ve belirli sıcaklıklarda gelişme kapasitelerine göre farklı cinslere/türlere göre sınıflandırılmıştır. Ayrıca karbohidratları fermente etme yeteneklerine göre homofermentatif (örneğin, Lactococcus ve Streptococcus türleri, bir glikozdan iki molekül laktat üretir) veya heterofermentatif (örneğin, Leuconostoc, Wiessella ve bazı Lactobacillus türleri, laktat, etanol ve karbondioksit üretir) olarak ayrılabilmektedir. Geleneksel sınıflandırma, fizyolojik ve biyokimyasal özelliklere dayanırken, günümüzde moleküler karakterizasyon daha önemli bir sınıflandırma aracı olmuştur. Moleküler yöntemler arasında rastgele amplifiye edilmiş polimorfik DNA, 16S rRNA gen sekanslaması, 5 polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı parmak izi analizi ve çoklu PCR yöntemleri yer almaktadır (Ayivi ve diğerleri, 2020). Lactobacillus cinsi, çeşitliliği nedeniyle 25 cins olarak yeniden sınıflandırılmıştır (Zheng ve diğerleri, 2020): Lactobacillus, Paralactobacillus, Lacticaseibacillus, Loigolactobacilus, Lactiplantibacillus, Limosilactobacillus, Lentilactobacillus, Lapidilactobacillus, Ligilactobacillus, Liquorilactobacillus, Levilactobacillus, Latilactobacillus, Secundilactobacillus, Schleiferilactobacillus, Paucilactobacillus, Acetilactobacillus, Apilactobacillus, Amylolactobacillus, Agrilactobacillus, Holzapfelia, Fructilactobacillus, Furfurilactobacillus, Dellaglioa, Companilactobacillus ve Bombilactobacillus. 2.2.1. Lacticaseibacillus rhamnosus Lacticaseibacillus rhamnosus (LR), gram-pozitif, spor oluşturmayan ve oksijensiz ortamlarda L(+) laktik asit ve etanol üretebilen fakültatif heterofermentatif bir probiyotik bakteridir. LR, doğal olarak insan bağırsak florasında bulunur ve düşük pH seviyelerine karşı dayanıklıdır. LR takviyesi, akut ishal, antibiyotik kaynaklı ishal, fonksiyonel gastrointestinal rahatsızlıklar, solunum yolu enfeksiyonları ve atopik hastalıklar gibi çeşitli sağlık sorunlarına karşı faydalı etkiler göstermektedir (Collins ve diğerleri, 1989; Goldin ve diğerleri, 1992; Capurso, 2019; Leser ve Baker, 2024). 2.2.2. Lacticaseibacillus paracasei Lacticaseibacillus paracasei (LPC) güçlü probiyotik aktiviteye sahip bir mikroorganizma olduğu birçok çalışma ile kanıtlanmıştır. Gram-pozitif, spor oluşturmayan ve fakültatif heterofermentatif olan bu probiyotik bakteri oksijensiz ortamlarda L(+) laktik asit ve etanol üretebilme özellikleriyle bilinmektedir. LPC bağırsak mikrobiyotasına özgüdür ve düşük pH seviyelerine karşı dayanıklıdır. LPC’nin faydalı etkileri çeşitli sindirim bozuklukları, enfeksiyon hastalıkları, obezite ve depresyon hastalarında yapılan klinik çalışmalarla desteklenmiştir (Collins ve diğerleri, 1989; Leboš Pavunc ve diğerleri, 2023). 6 Probiyotiklerin klinik etkilerindeki farklılıklar, probiyotikler ile konakçı arasındaki etkileşimlerin tam olarak anlaşılmamasından kaynaklanmaktadır. Probiyotiklerin sağlık üzerindeki koruyucu etkilerini daha iyi anlayabilmek için, probiyotik-konakçı etkileşimlerinin moleküler düzeyde incelenmesi ve probiyotiklerin mikrobiyota üzerinden konakçı fizyolojisiyle nasıl etkileştiğinin araştırılması gerekmektedir (Leser ve Baker, 2024). Lacticaseibacillus cinsine ait L. rhamnosus ve L. paracasei probiyotik bakterilerinin özellikleri Çizelge 2.1’de verilmektedir (Collins ve diğerleri, 1989; Zheng ve diğerleri, 2020). Çizelge 2.1. L. rhamnosus ve L. paracasei probiyotik bakterilerinin özellikleri Özellik Lacticaseibacillus rhamnosus Lacticaseibacillus paracasei Alan Bacteria Bacteria Şube Bacillota Bacillota Sınıf Bacilli Bacilli Takım Lactobacillales Lactobacillales Familya Lactobacillaceae Lactobacillaceae Cins Lacticaseibacillus Lacticaseibacillus Tür L. rhamnosus L. paracasei Hücre Şekli Çubuk şeklinde, genellikle kare uçlarla, tek başına veya zincirler halinde bulunur. Çubuk şeklinde, genellikle kare uçlarla, tek başına veya zincirler halinde bulunur. Gelişim sıcaklığı 5-45°C 10-40°C (bazı suşlar 5-45°C) Habitat Süt ürünleri, fermente et, balık, sebzeler, tahıllar, atık su, insanlar (ağız, vajina, bağırsak), omurgasızlar, klinik kaynaklar İnsan ağız boşluğu, fermente tahıllar, sebzeler, etler, süt ürünleri, omurgasızlar 7 2.3. Enkapsülasyon Enkapsülasyon; katı, sıvı veya gaz haldeki gıda bileşenleri, enzim, hücre ve diğer mikroorganizmaların uzun süreli korunması, stabilizasyonu ve kontrollü salımı için protein, karbohidrat veya lipit esaslı bir kaplama materyaliyle kaplanması ya da kaplama materyalinin içine hapsedilmesi prensibine dayalı bir yöntemdir (Şekil 2.1) (Gökmen ve diğerleri, 2012; Serna-Cock ve Vallejo-Castillo, 2013; Chawda ve diğerleri, 2017; Roshanzamir ve diğerleri, 2017). Kaplanan materyal çekirdek, yük, aktif bileşen, dolgu veya iç faz materyali gibi farklı adlarla ifade edilebilir. Kaplama işlemini yapan materyal ise duvar, taşıyıcı, zar, kabuk veya kaplama materyali olarak adlandırılabilir (Huq ve diğerleri, 2013). Şekil 2.1. Enkapsülasyon işlemi Enkapsülasyon sürecinde, mikrokapsüller (1 µm ile birkaç yüz mikrometre arasındaki çaplarda), submikron kapsüller (yüzlerce nanometreden 1 µm’ye kadar olan çaplarda) ve nanokapsüller (1 nm ile birkaç yüz nanometre arasındaki çaplarda) mikroenkapsülasyon ve nanoenkapsülasyon yöntemleriyle elde edilir (Shishir ve diğerleri, 2018). Enkapsülasyon, gıda ve ilaç endüstrilerinde geniş bir kullanım alanına sahip en yaygın yöntemdir (Shishir ve diğerleri, 2018; Saifullah ve diğerleri, 2019). Gıda ürünlerinde genel olarak katı ve sıvı yağlar, polifenoller, vitaminler, aroma bileşenleri, mineraller, oleoresinler, enzimler ve probiyotik bakteriler enkapsüle edilmektedir (Gökbulut ve Öztürk, 2018). Enkapsülasyonun gıda endüstrisindeki kullanım amaçları aşağıda yer almaktadır (Desai ve Jin Park, 2005; Koç ve diğerleri, 2010). 8 • Çekirdek materyalinin nem, sıcaklık, oksijen ve ışık gibi çevresel faktörlerin olumsuz etkilerinden koruyarak fiziksel yapısının stabil kalmasının sağlanması. • Çekirdek materyalin diğer bileşenlerle reaksiyona girmesinin engellenmesi. • Çekirdek materyalin küçük miktarlarda homojen bir şekilde karıştırılabilir hale getirilmesi. • Buharlaşmaya bağlı kayıpların önlenmesi. • İşleme ve taşımada daha kolay kullanım imkanı sunması. • Aktif bileşenlerin istenilen noktada ve zamanda kontrollü bir şekilde salınması. • İstenmeyen tat ve kokuların gizlenmesi. Enkapsülasyonda genellikle kaplama materyali olarak (Koç ve diğerleri, 2010; Serna- Cock ve Vallejo-Castillo, 2013), • Agar, sodyum aljinat, karragenan, gam arabik, kitosan, pektin, nişasta, selüloz, sakkaroz, maltodekstrin ve mısır şurubu gibi karbohidratlar, • Vaks, parafin, monogliserit, digliserit, stearik asit, tristearin ve yağlar gibi lipitler, • Gluten, kazein, kazeinat, albümin, jelatin, nohut ve peynir altı suyu gibi proteinler kullanılmaktadır. Kaplama materyalinin bileşimi, kapsülün işlevsel özelliklerini doğrudan etkiler. İdeal bir kaplama materyalinin sahip olması gereken tüm özellikleri tek bir materyalde bir araya getirmek genellikle zordur. Bu nedenle, farklı materyallerin bir arada kullanılması, daha verimli ve etkili sonuçlar elde etmek için yaygın bir yaklaşımdır. Enkapsülasyonda ideal bir kaplama materyalinin sahip olması gereken özellikler aşağıda belirtilmiştir (Koç ve diğerleri, 2010; Serna-Cock ve Vallejo-Castillo, 2013; Geniş ve Tuncer, 2019). • Yüksek konsantrasyonlarda reolojik özellikleri iyi olmalıdır. • Emülsiyon ve dispersiyon özellikleri iyi olmalıdır. • Çekirdek materyalini etkili bir şekilde kaplamalı ve hem kaplama hem de depolama sürecinde çekirdek materyalinin özelliklerini korumalıdır. 9 • Kullanılacak çözücüde kolayca çözünebilecek bir yapıya sahip olmalıdır. • Uygun maliyetli olmalıdır. Enkapsülasyon işleminde kapsül oluşturmak için ekstrüzyon, emülsiyon, sprey kurutma, sprey soğutma, dondurarak kurutma, lipozom, akışkan yatak kaplama, koaservasyon, inklüzyon kompleksi oluşturma, santrifüj ekstrüzyonu, döner süspansiyon ayırma, çarpışmalı aerosol teknolojisi ve rennet ile jelleştirilmiş protein gibi çeşitli yöntemler kullanılmaktadır (Gibbs ve diğerleri, 1999; Martín ve diğerleri, 2015; Kavitake ve diğerleri, 2018). Bu yöntemler, farklı uygulama alanlarına uygun kapsüller oluşturmak için kaplama materyallerinin etkin bir şekilde kullanılmasını sağlamaktadır. Probiyotikleri içeren kapsüllerin oluşumunda temel olarak sprey kurutma, dondurarak kurutma, ekstrüzyon ve emülsiyon yöntemi kullanılmaktadır (Chávarri ve diğerleri, 2012; Uran ve diğerleri, 2017; Latif ve diğerleri, 2023). 2.3.1. Sprey kurutma yöntemi İlk kez 1930’larda bir aromanın enkapsülasyonu için kullanılan sprey kurutma, gıda bileşenleri üretiminde yaygın olarak kullanılan, büyük ölçekli sanayi uygulamalarına uygun ve ekonomik bir yöntemdir. Sprey kurutma, aktif bileşenin kaplama materyalinde çözünerek emülsiyon veya süspansiyon oluşturduğu bir enkapsülasyon yöntemidir. Çözücüler genellikle jelatin, modifiye nişasta veya bitkisel gam gibi hidrokolloidlerdir (Chávarri ve diğerleri, 2012). Sprey kurutma işleminde, sıvı karışım atomize edilerek küçük damlacıklara ayrılır. Biyoaktif bileşikler içeren bu damlacıklar, sıcak hava ile kurutularak kapsüller oluşturulur. Bu süreç, kapsüllerin oksijen ve diğer zararlı etmenlere karşı bir bariyer oluşturmasını sağlar, bu da biyoaktif bileşiklerin stabilitesinin korunmasına yardımcı olur. Ancak, sprey kurutma işleminde uygulanan yüksek sıcaklıklar, uçucu bileşiklerin veya ısıya duyarlı bileşenlerin bozulmasına neden olabilir. Özellikle, probiyotiklerin enkapsülasyonu sırasında yüksek kurutma sıcaklıkları, bakterilerin canlılık oranını olumsuz yönde etkileyebilir ve bu da uzun vadeli depolama sırasında stabilitenin bozulmasına yol açabilir. Bu nedenle sprey kurutma işlemi, kurutma sıcaklığı, süresi ve 10 kullanılan kaplama materyali gibi parametrelerin optimizasyonunu gerektirir (Shishir ve diğerleri, 2018). 2.3.2. Dondurarak kurutma yöntemi Dondurarak kurutma veya liyofilizasyon yöntemi, neredeyse tüm ısıya duyarlı materyallerin, suda çözünebilen esansların, doğal aromaların ve ilaçların enkapsülasyonu için kullanılan basit bir yöntemdir. Dondurarak kurutma ile enkapsülasyon, çekirdek materyallerin matris çözeltilerinde homojenize edilmesi ve ardından birlikte liyofilize edilmesiyle gerçekleştirilir. Bu süreç donma, birincil kurutma (süblimasyon) ve ikincil kurutma (desorpsiyon) olmak üzere üç aşamalı bir işlemden oluşur. Suyun buza dönüştürülmesinin ardından düşük sıcaklık ve basınçta süblimasyon yoluyla buz uzaklaştırılır. Sonrasında, donmamış su, desorpsiyon yoluyla istenilen nem seviyesine ulaşana kadar giderilir. Giderim, örneğin cam geçiş sıcaklığı gibi faktörlere bağlı olarak birkaç saatten birkaç güne kadar sürebilir. Bu yöntem, uzun süren kurutma süresi ve yüksek maliyeti ile pahalı bir teknoloji olmasının yanı sıra, genellikle belirsiz kapsül formlarının oluşmasına neden olur (Fang ve Bhandari, 2010; Shishir ve diğerleri, 2018). Probiyotiklerin enkapsülasyonu için tercih edilen yöntemlerden biri olan dondurarak kurutma, genellikle yalnızca ürünün depolama aşamasında stabilite sağlar. Tüketim sırasında ise stabilite sağlanamaz veya sınırlı düzeyde sağlanır. Bu nedenle, bu yöntem genellikle enkapsülasyon sürecinin ikinci adımı olarak kullanılır. Dondurarak kurutma, emülsifikasyon veya jel mikrokürelere hapsolma gibi yöntemlerle enkapsüle edilmiş probiyotikleri kurutmak için kullanılan etkili bir yöntemdir. Bu şekilde, gastrointestinal sistemdeki stabiliteyi artırmak ve probiyotik tüketiminin faydalı etkisini optimize etmek mümkündür (Chávarri ve diğerleri, 2012). 2.3.3. Ekstrüzyon yöntemi Ekstrüzyon, hidrokolloidlerle kapsüller üretmek için en eski ve en yaygın kullanılan enkapsülasyon yöntemlerinden biridir. Bu yöntemde, öncelikle bir hidrokolloid çözeltisi hazırlanır ve içerisine çekirdek materyali eklenir. Daha sonra bu süspansiyon, bir şırınga 11 iğnesi aracılığıyla damlacıklar halinde çok değerlikli bir katyon içeren çözeltiye bırakılır. Damlacıkların boyut ve şekli, kullanılan şırınga iğnesi çapına ve çözeltinin üzerine damlatılma mesafesine bağlı olarak değişir (Krasaekoopt ve diğerleri, 2003). Ekstrüzyon yöntemi basit yapısı, düşük maliyeti ve hücre canlılığını yüksek oranda koruma özellikleriyle tercih edilen bir yöntemdir. Bu yöntem, zararlı çözücüler kullanılmaksızın hem aerobik hem de anaerobik koşullarda gerçekleştirilebilir ve genellikle aljinat gibi biyouyumlu kaplama materyalleriyle uygulanır. Bununla birlikte, ekstrüzyonun büyük ölçekli üretimdeki en önemli sınırlaması, kapsüllerin yavaş oluşumu nedeniyle verimli bir şekilde uygulanamamasıdır (Choińska-Pulit ve diğerleri, 2015). 2.3.4. Emülsiyon yöntemi Emülsiyon yöntemi, hidrofobik, hidrofilik ve ısıya duyarlı bileşiklerin kapsüllenmesi için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntemde, bir yağ fazı ve bir su fazı olmak üzere birbiri içerisinde karışmayan en az iki sıvı bir emülsiyon oluşturur; bir sıvı, diğer sıvı içinde küçük damlacıklar halinde dağılır. Çekirdek fazı hidrofilik olduğunda su/yağ emülsiyonu, çekirdek fazı hidrofobik olduğunda ise, yağ/su emülsiyonu olarak adlandırılır. Bu emülsiyonlar için genellikle kanola, ayçiçeği veya mısır yağı gibi bitkisel yağlar tercih edilir. Ayrıca, temel yöntemin bir modifikasyonu olan su/yağ/su ya da yağ/su/yağ gibi çift emülsiyon yöntemleri de bulunmaktadır. Emülsiyonun stabil kalması için emülgatörlerin kullanılması gerekmektedir. Emülsiyon, çapraz bağlayıcı madde eklenmesiyle kırılır ve kapsüller sertleşir. Elde edilen kapsüller ardından çöktürme yoluyla toplanır (Kailasapathy, 2002; Chávarri ve diğerleri, 2012; Choińska-Pulit ve diğerleri, 2015; Eghbal ve diğerleri, 2022) (Şekil 2.2). 12 Şekil 2.2. Emülsiyon yönteminin şematik gösterimi Probiyotik bakterilerin enkapsülasyonu için literatürde yaygın olarak kullanılan emülsiyon yöntemi ile elde edilen kapsüller geniş bir boyut dağılımı göstermektedir. Karıştırma ve homojenizasyon işlemleriyle uygun boyut dağılımı elde etmeye yönelik çeşitli çalışmalar yapılmaktadır. Emülsiyonun iç faz partikül boyutunun küçülmesi, oluşan kapsüllerin boyutunun da küçülmesine neden olmaktadır. Emülsiyon yönteminde hücrelerin canlılık oranı yüksek tutulabilir; ancak, şiddetli karıştırma, hücrelerin kapsüllere düzensiz bir şekilde ilave edilmesi ve bitkisel yağın sterilize edilememesi hücre canlılığını olumsuz etkilemektedir. Emülsiyon yönteminde, kaplama materyali olarak karragenan, keçiboynuzu gamı, selüloz asetat ftalat, aljinat, kitosan ve jelatin gibi çeşitli maddeler kullanılmaktadır. Bu materyaller, emülsiyonun stabilitesini ve kapsüllerin özelliklerini belirlemede önemli rol oynamaktadır (Chávarri ve diğerleri, 2012; Gbassi ve Vandamme, 2012; Gökmen ve diğerleri, 2012; Choińska-Pulit ve diğerleri, 2015). Kapsüllerin karakterizasyonu; kimyasal, fiziksel, fizikokimyasal ve organoleptik yöntemlerle gerçekleştirilebilmektedir. İleri düzey fiziksel ve fizikokimyasal yöntemler, kapsüllerin yapısını doğrudan gözlemlemeye veya yapısal özelliklerine ilişkin veri sağlamaya olanak tanımaktadır. Her bir yöntemin avantajları ve sınırlamaları bulunmakta olup, bu yöntemler özellikle farmasötik ve biyolojik araştırmalarda yaygın olarak 13 kullanılmaktadır (Shahidi ve Han, 1993; Gökmen ve diğerleri, 2012). Bu amaçla kullanılan yöntemler arasında, • Elektron mikroskobu, • Taramalı elektron mikroskobu, • Elektron spin rezonansı spektroskopisi, • Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi, • Ultrasonik absorpsiyon, • Floresans söndürme ve • Radyoaktif izleyiciler yer almaktadır. 2.4. Probiyotik bakteri enkapsülasyonu Probiyotik bakteriler, oksijen, yüksek sıcaklık, düşük pH, sindirim enzimleri ve safra tuzları gibi streslere karşı hassasiyetleri nedeniyle işleme, depolama ve gastrointestinal geçiş sırasında canlılıklarını yitirebilmektedir. Probiyotik bakterilerin gıda endüstrisinde kullanımını sınırlayan bu zorlukları aşmak ve probiyotiklerin canlılığını korumak için çeşitli enkapsülasyon yöntemleri geliştirilmiştir (Luo ve diğerleri, 2022). Çizelge 2.2’de probiyotik bakteri enkapsülasyonuna ait bazı yöntemler sunulmaktadır (Serna-Cock ve Vallejo-Castillo, 2013). Çizelge 2.3’te ise probiyotik bakteri enkapsülasyonlarına ait bazı çalışmalar verilmektedir. 14 Çizelge 2.2. Probiyotik bakteri enkapsülasyon yöntemleri Yöntem Mekanizma Maliyet Uygulama kolaylığı Partikül tipi Partikül boyutu (µm) Sprey kurutma Dehidrasyon Düşük Evet Yaklaşık küresel 3-100 Dondurarak kurutma Süblimasyon ve desorpsiyon Yüksek Hayır Düzensiz - Ekstrüzyon Retikülasyon Düşük Evet Küresel 1600-5000 Emülsiyon Emülsifikasyon Düşük Evet Küresel 25-2000 1 5 Çizelge 2.3. Probiyotik bakteri enkapsülasyonuna ait çalışmalar Probiyotik bakteri Kaplama materyali Yöntem Kaynak Bifidobacterium bifidum Lactobacillus gasseri Aljinat-kitosan Ekstrüzyon Chávarri (2010) Bifidobacterium Bb-12 Peynir altı suyu proteini Sprey kurutma de Castro-Cislaghi vd. (2012) Lactobacillus reuteri DPC16 Aljinat-yağsız süt tozu Ekstrüzyon Zhao vd. (2012) Lactobacillus reuteri DSM 17938 Aljinat, kitosan Sprey kurutma Malmo vd. (2013) Lactobacillus casei/paracasei CTC1677 Lactobacillus casei/paracasei CTC1678 Lactobacillus rhamnosus CTC1679 Glikoz, laktoz, trehaloz, yağsız süt Dondurarak kurutma Jofré vd. (2015) Lactiplantibacillus plantarum NRRL B-4496 Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 Jelatin Emülsiyon da Silva vd. (2023) Lactiplantibacillus plantarum V2 Kitosan-inülin Ekstrüzyon Rojas-Espina vd. (2024) Lacticaseibacillus casei DSM 20011 Lactobacillus acidophilus DSM 20079 İğde unu Emülsiyon Karkar vd. (2024b) 16 Zhao vd. (2012) yaptıkları çalışmada L. reuteri DPC16 hücrelerini aljinat-yağsız süt tozu ile enkapsüle ederek 2 sa simüle edilmiş mide ve 5 sa simüle edilmiş bağırsak sisteminden geçişi sırasında canlılıklarını koruma yeteneğini incelemiştir. Serbest bakteriler (109 kob/mL), simüle mide sıvısında 90 dk inkübe edildikten sonra tespit edilmemiştir. Buna karşın, kapsüllenmiş hücre canlılığında (5×108 kob/g) 2 sa sonra, 1 log biriminden daha az bir kayıp yaşanmış ve simüle mide sıvısı içinde canlı hücreler tespit edilmemiştir. Simüle bağırsak sıvısına maruz kalan kapsüllenmiş hücrelerin canlılığı biraz azalmış ve sızıntı sonucu hücreler simüle bağırsak sıvısı içinde tespit edilmiştir. Başlangıçta 3-4 mm çapında olan kapsüller, simüle mide sıvısında küçülmüş ancak yapısal bütünlüğünü korumuştur. Bağırsak sıvısında ise kapsüller şişmiş, ardından gözle görülebilir bir dağılma meydana gelmiş ve bu durum, canlı hücrelerin kontrollü bir şekilde serbest kalmasına neden olmuştur. Bir diğer çalışmada (Malmo ve diğerleri, 2013) probiyotik hücrelerin ısı ve sindirim koşullarına karşı direncini arttırarak probiyotik çikolatalı sufle elde edilmesi hedeflenmiştir. L. reuteri DSM 17938, aljinat matrisi içine sprey kurutma yöntemiyle enkapsüle edilip, ardından kitosan ile kaplanmıştır. Sonuçlar, aljinat kapsüllerinin, in vitro deneylerde aside tolerans ve ısıya karşı direnç sağlamadığını, ancak çikolatalı sufle pişirme sonrası L. reuteri popülasyonunun %7’sinin hayatta kalmasını sağladığını göstermiştir. Aljinat ve kitosan kaplı kapsüller, in vitro deneylerde asit toleransını artırarak simüle mide koşullarında 3 sa boyunca hücre popülasyonu sabit kalmış ve ısıya karşı daha iyi direnç sağlamıştır. Ayrıca, çikolatalı suflenin pişirilmesi sonrasında L. reuteri popülasyonunun %10’u hayatta kalmıştır ve bakteri popülasyonun probiyotik bir ürün olarak kabul edilemeyecek kadar düşük olduğu bildirilmiştir. Jofré vd. (2015) glikoz, laktoz ve trehaloz gibi şekerlerin tek başına veya yağsız süt ile kombinasyon halinde kullanımının, dondurarak kurutulmuş üç potansiyel probiyotik suşun depolama sırasında (4C ve 22C’de 39 hafta) canlılıkları üzerindeki koruyucu etkisini değerlendirmiştir. L. casei/L. paracasei suşları için yağsız süt, trehaloz-yağsız süt ve laktoz-yağsız süt kombinasyonları, L. rhamnosus için ise yağsız süt, laktoz ve laktoz- yağsız süt kombinasyonu en etkili koruyucu maddeler olarak belirlenmiştir. Trehalozun yüksek maliyeti nedeniyle, endüstriyel uygulamalarda laktoz veya yağsız süt (tek başına 17 ya da kombinasyon halinde) kullanılması önerilmiştir. Glikoz dışındaki şekerlerin oda sıcaklığında kısa süreli depolama sırasında probiyotik bakterilerin canlılığını uzatmak için kullanılabileceği bildirilmiştir. Başka bir çalışmada (da Silva ve diğerleri, 2023) jelatin kullanılarak yağ/su emülsifikasyonu ile L. acidophilus ve L. plantarum probiyotikleri enkapsüle edilmiştir. Sonuçlar, L. acidophilus ve L. plantarum kapsüllerinin sırasıyla 26,08±1,74 µm ve 21,56±4,17 µm çaplara ve %89,6±4,2 ve %81,1±9,4 kapsülleme verimliliklerine sahip olduğunu göstermiştir. Enkapsülasyon işleminin 5C ve 25C’de 120 günlük depolama süresince L. acidophilus ve L. plantarum’un canlılığını korumak ve sürdürmek için olumlu özellikler gösterdiği belirtilmiştir. 2.5. Prebiyotikler Prebiyotikler, “konağın bağırsak mikrobiyotasındaki mikroorganizmaların seçici olarak kullandığı ve sağlık üzerinde olumlu etkileri bulunan substratlar” olarak tanımlanmaktadır. Sindirilmeksizin kalın bağırsağa ulaşıp probiyotik bakterilerin gelişimini ve aktivitesini teşvik ederek konağın sağlığını desteklerler (Bilginer ve Çetin, 2019). Kuşkonmaz, sarımsak, bal, şeker pancarı, yer elması, muz, hindiba, bezelye, soğan, arpa, buğday, çavdar, domates, soya fasulyesi, insan ve inek sütü gibi çeşitli besin ürünleri doğal prebiyotikler olarak çeşitli çalışmalar sonucu belirlenmiştir ve son zamanlarda deniz yosunları ve mikroalglerde de prebiyotik özellikler tespit edilmiştir. Laktüloz, laktitol, ksilitol ve mannitol içeren polioller; frukto-oligosakkaritler, galakto- oligosakkaritler, izomalto-oligosakkarit, ksilo-oligosakkarit, inülin gibi oligosakkaritler ve polidekstroz, dekstrin, β-glukanlar, pektin ve lignin ile temsil edilen lifler gibi prebiyotikler hem besleyici hem de gıdalarda fonksiyonel özellik geliştirici olarak kullanılırken, sağlık üzerindeki olumlu etkilerinden dolayı geniş çapta araştırılan bileşenlerdir. Karbohidratlar en çok bildirilen prebiyotikler olmasına rağmen, literatürde mineraller, polifenoller ve yağ asitleri gibi karbohidrat olmayan bileşenlerin prebiyotik potansiyeline dair umut verici sonuçlar içeren çalışmalar bulmak mümkündür (Davani- Davari ve diğerleri, 2019; Ferreira ve diğerleri, 2023). 18 Bir bileşiğin prebiyotik olarak kabul edilmesi için aşağıdaki kriterleri karşılaması gerekmektedir (Singarayar ve diğerleri, 2024). • Tamamen sindirilmeden veya emilmeden alt gastrointestinal sisteme ulaşabilmelidir. • Asit ve enzimatik emilime direnç göstermelidir. • Yerel mikroflora tarafından sindirilmelidir. • Patojenler yerine yararlı mikroorganizmaların gelişmesini iyileştirmelidir. • Bakterilerin metabolizmasını değiştirerek bağırsakta faydalı maddelerin üretimini sağlamalıdır. • Sağlık üzerindeki etkileri kanıtlanmış olmalıdır. 2.5.1. Fenolik bileşikler Bitkilerin ikincil metabolitleri olarak bilinen fenolik bileşikler, serbest radikal hasarına karşı koruyucu etkileri, antioksidan özellikleri ve metal şelatlayıcı olarak işlev görmeleriyle tanınmaktadır. Bir veya daha fazla hidroksil grubu içeren aromatik bir halkadan oluşan fenolik bileşikler içerdikleri fenol halkalarına ve bu halkalar arasındaki bağlanmadaki yapısal farklılıklara göre genellikle birkaç sınıfa ayrılırlar. Fenolik bileşikler esas olarak (Stavrou ve diğerleri, 2018); • Flavonoidler, • Fenolik asitler, • Tanenler (hidrolize edilebilir ve kondanse), • Stilbenler ve • Lignanlar olarak sınıflandırılmaktadır. Sebze, meyve ve diğer bitkilerin kalitesini belirleyen fenolik bileşikler, bağırsak mikrobiyotası üzerinde prebiyotik etkiler göstererek mikrobiyota bileşimine ve sağlığına katkıda bulunmaktadır. Bu özellikleri sayesinde vücut sağlığı üzerinde önemli etkilere sahip olmaktadır (Öztürk ve Yılmaz, 2024). Fenolik bileşiklerin antimikrobiyal, antiviral, antialerjik, antiinflamatuar, antidiyabetik, antipatojenik ve antitrombotik özelliklerinin 19 yanı sıra diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, osteoporoz, kanser ve nörodejeneratif hastalıklar üzerinde koruyucu etkileri olduğu yapılan araştırmalar ile ortaya koyulmaktadır (Kolaç ve diğerleri, 2017; Stavrou ve diğerleri, 2018). 2.5.2. Diyet lifleri Diyet lifleri, meyve, sebze, baklagil ve tahıllarda bulunan, ince bağırsakta sindirilmeye direnç gösteren ve kalın bağırsakta kısmi veya tam olarak fermente olabilen bileşenlerdir. Suda çözünürlük özelliklerine göre çözünür ve çözünür olmayan lifler olmak üzere iki ana grupta sınıflandırılmaktadır (Salçın ve Ercoşkun, 2021). • Çözünür lifler (pektin, β-glukan, galaktomannan, inülin gibi) suyu emip çözelti oluştururken, kolesterolü düşürmeye ve glukoz emilimini azaltmaya yardımcı olur. • Çözünür olmayan lifler (lignin, selüloz, hemiselüloz gibi) ise suyu tutarak bağırsak hareketlerini düzenler. Çözünür liflerin, çözünür olmayan liflerden daha az yaygın olduğu düşünülse de prebiyotik özellik göstererek bağırsak sağlığını destekleyebileceği bilinmektedir (Yangilar, 2013). 2.6. Sinbiyotikler Yaşam koşulları ve beslenme alışkanlıklarındaki değişiklikler, doğal floradaki bozulmalarla ilişkilendirilmektedir. Bu durum obezite, inflamatuar hastalıklar ve bazı kanser türlerinin yaygınlaşmasına yol açarak probiyotik ve prebiyotiklere olan talebi artırmıştır (Bakır, 2012). İnsan bağırsak sistemi, mikroorganizmaların oluşturduğu karmaşık bir ekosistemle doludur. Prebiyotikler, konakçının bağırsak ekosisteminde bulunan mikroorganizmaları seçici olarak uyarır. Sinerjik olarak etkili olan probiyotiklerin ve prebiyotiklerin birleşimini tanımlamak için “sinbiyotik” terimi kullanılmaktadır. Sinbiyotikler hem ürün stabilitesini artırır hem de probiyotiklerin canlılığını artırarak bağırsak sağlığını geliştirir. Bu işlevlerin desteklenmesi için 20 sinbiyotiklerin diyette yer alması gerekmektedir. Bu maddeler, çiğ sebze, meyve, fermente gıdalar veya süt ürünleri gibi doğal kaynaklarla alınabileceği gibi farmasötik ürünler ve fonksiyonel gıdalar aracılığıyla da temin edilebilir. Özellikle yoğurt gibi süt ürünlerinde sinbiyotikler, ürünün depolama süresi boyunca stabilitesini koruması açısından önemlidir (Pandey ve diğerleri, 2015; Markowiak ve Śliżewska, 2017; Köse ve diğerleri, 2019). 2.7. Keçiboynuzu (Ceratonia siliqua L.) Keçiboynuzu (Ceratonia siliqua L.), Leguminoseae (Fabaceae) familyasının bir üyesi olup, Akdeniz ve Ege havzasının çoğu ülkesinde antik çağlardan beri yetiştirilen bir bitkidir (Petkova ve diğerleri, 2017; Pazır ve Alper, 2018). Keçiboynuzu ağacı, zemin seviyesine kadar uzayan dalları ile 6-12 m’lik ve bazen 20 m’yi aşan bir yüksekliğe ulaşır (Kumazawa ve diğerleri, 2002) (Şekil 2.3). Keçiboynuzu ağacı, İspanya, Portekiz, Fas, Yunanistan, İtalya, Türkiye, Lübnan, Cezayir, Tunus, Mısır ve Kıbrıs’ta yetiştirilmektedir. Keçiboynuzunun yıllık küresel üretiminin 100.000 tonun üzerinde olduğu tahmin edilmektedir (Hssaini ve diğerleri, 2024). Şekil 2.3. Keçiboynuzu (Ceratonia siliqua L.) ağacı (Mayordomo-Maya ve Hermosilla- Pla, 2024) Keçiboynuzu meyvesi kahverengi renklidir ve boyu bazı koşullarda 25 cm’ye kadar ulaşabilir (Kumazawa ve diğerleri, 2002). Meyve, %90 yenilebilir kısım (posa) ve %10 tohumdan oluşur (Pazır ve Alper, 2018). Keçiboynuzu unu keçiboynuzu meyvesinin kabuk ve tohumundan elde edilir (Şekil 2.4). Tohumlar esas olarak galaktomannanlardan 21 oluşur (Petkova ve diğerleri, 2017). Ticari olarak satın alınan keçiboynuzu ununun besin değeri incelenmiş ve sonuçlar Çizelge 2.4’te özetlenmiştir. Şekil 2.4. Keçiboynuzu meyvesi ve temel bileşenleri (Zhu ve diğerleri, 2019) Çizelge 2.4. Keçiboynuzu ununun besinsel özellikleri (Petkova ve diğerleri, 2017) Özellik Değer Nem (%) 7,56±0,16 Kül (%) 2,25±0,02 Karbohidrat (%) 85,50±0,02 Toplam çözünür karbohidrat (%) 57,44±3,30 İndirgen şeker (%) 8,60±1,72 Glikoz (%) 3,25±0,42 Fruktoz (%) 4,16±0,21 Sükroz (%) 34,13±1,45 Enerji (kcal/100 g) 370,37 Keçiboynuzunun toplam fenolik madde miktarı 100 g’da 45 ile 5376 mg gallik asit eşdeğerine kadar değişmektedir. Keçiboynuzunda bulunan başlıca fenolik bileşikler gallik asit, (+)-kateşin, (-)-epikateşin, (-)-epikateşingallat, (-)-epigallokateşin, (-)- epigallokateşingallat, mirisetin, kuersetin, tanen bileşikleri ve bunların türevleridir (Kumazawa ve diğerleri, 2002; Stavrou ve diğerleri, 2018). Keçiboynuzunda en fazla bulunan fenolik bileşik olan gallik asit (Şekil 2.5), özellikle yağların oksidasyonunu yavaşlatmada çok etkili olan bir antioksidandır (Pazır ve Alper, 2016; Pazır ve Alper, 2018). 22 Şekil 2.5. Gallik asidin kimyasal yapısı (Delfanian ve diğerleri, 2021) Şeker, diyet lif, mineraller ve fenolik bileşikler gibi yüksek miktarda ve çeşitte besin maddelerine sahip olan keçiboynuzu meyvesinin kimyasal bileşimi çeşide, kökene ve hasat zamanına bağlı olarak değişmektedir. Keçiboynuzu fonksiyonel özelliklere sahip fitokimyasal bileşenleri, aroma özellikleri ve beslenme faydaları nedeniyle gıda, tekstil, kozmetik ve ilaç endüstrileri için önemli bir potansiyele sahiptir (Kumazawa ve diğerleri, 2002; Petkova ve diğerleri, 2017; Pazır ve Alper, 2018; Brassesco ve diğerleri, 2021). Keçiboynuzu tohumları, toz (un), şurup, keçiboynuzu gamı ve D-pinitol gibi bazı ticari ürünlerin üretiminde kullanılmaktadır. Keçiboynuzu tohumları mikroorganizmalar için gelişme ortamı olarak, emülsiyonların ve dispersiyonların stabilizatörü olarak, gıda endüstrisinde kıvamlaştırıcı olarak ve farmasötik endüstrisinde ilaç taşıyıcı olarak kullanılmaktadır (Kumazawa ve diğerleri, 2002; Petkova ve diğerleri, 2017; Pazır ve Alper, 2018). Keçiboynuzu şurubunun müshil ve idrar söktürücü gibi ilaçlarda kullanıldığı bilinmektedir. Keçiboynuzu posası, hayvan yemi, farmasötik ürünler ve etanol üretimi gibi birçok alanda geniş bir uygulama alanı bulmuştur. Keçiboynuzu kabukları, sitrik asit, antiemetik ürünler (bulantı önleyici) ve pastacılık ürünlerinin üretiminde kullanılmaktadır. Ayrıca keçiboynuzu kabuklarının antioksidan katkı maddesi olarak kullanılabileceği bildirilmiştir (Ahmed ve diğerleri, 2009). Keçiboynuzu unu, yüksek şeker içeriği nedeniyle doğal bir tatlandırıcı olarak değerlendirilebilir ve benzer tat ve görünümünden dolayı kakao tozunun yerine kullanılabilmektedir (Fadel ve diğerleri, 2006; El Batal ve diğerleri 2016). Keçiboynuzu 23 ununun kimyasal bileşimi, yüksek miktarda çözünmeyen diyet lif içerdiğini göstermektedir. Bu nedenle gıda ürünlerini diyet lif ile zenginleştirmek için keçiboynuzu unu kullanılabilir (Durazzo ve diğerleri, 2014; Petkova ve diğerleri, 2017). Diyet lif açısından zengin beslenmenin, kolesterol düzeyini düşürdüğü ve kolon sağlığı üzerinde olumlu etkiler sağladığı bilinmektedir (Pazır ve Alper, 2016; Pazır ve Alper, 2018). İnsan metabolizmasında D-pinitol, insülin gibi davranarak kandaki glikoz seviyesini düşürmeye ve dengelemeye yardımcı olur. Araştırmalar, keçiboynuzu galaktomannanlarının, fermente süt ürünlerinde probiyotiklerin hayatta kalmasını desteklediğini ve gastrointestinal koşullar altında etkinliklerini arttırdığını göstermektedir. Ayrıca, araştırmalar keçiboynuzu posası ununun yoğurda eklenmesinin probiyotiklerin hayatta kalmasını iyileştirdiğini ve antioksidan aktiviteyi arttırdığını göstermiştir. Bu nedenle keçiboynuzunun prebiyotik potansiyele sahip olduğu bildirilmiştir (Arab ve diğerleri, 2022; Ziar ve diğerleri, 2022). 24 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Keçiboynuzu unu (KBU) Keçiboynuzu unu (KBU), Türkiye’nin Antalya ilinin Alanya ilçesinde bulunan doğal gıda ürünleri üreticisinden ticari olarak satın alınmıştır. Analizlerde kullanılmak üzere 25C’de muhafaza edilmiştir. 3.1.2. Çalışmada kullanılan cihazlar Çalışmada kullanılan cihazlar, cihazların özellikleri (Marka/Model) ve kullanım amaçları Çizelge 3.1’de verilmiştir. Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları Cihaz Adı Marka/Model Kullanım Amacı Analitik Terazi Mettler Toledo, MS105DU (± 0,00001 g) KBU, KBU-probiyotik bakteri kapsülleri ve kimyasalların tartımında kullanılmıştır. Çoklu Manyetik Karıştırıcı Wisd, MS-MP8 Analizlerde gerekli olan çözeltilerin hazırlanmasında kullanılmıştır. FTIR (Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi) Perkin Elmer, Spectrum 100 KBU, sterilize edilmiş KBU ve KBU- probiyotik bakteri kapsülleri ve pektinin yapı analizlerinde kullanılmıştır. HPLC-DAD (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi-Diod Serili Dedektör) Agilent Technologies, 1200 Series KBU ekstraktlarının fenolik bileşik içeriğinin kalitatif ve kantitatif tayininde kullanılmıştır. 25 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları (devam) Cihaz Adı Marka/Model Kullanım Amacı Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı Are, Velp Analizlerde gerekli olan çözeltilerin hazırlanmasında kullanılmıştır. İnkübatör Nüve S500, Memmert INB 400 Probiyotik bakteri kültürlerinin aktive edilmesi, geliştirilmesi ve mikrobiyolojik analizleri için kullanılmıştır. Liyofilizatör Labconco, FreeZone 2,5 Plus KBU-probiyotik bakteri kapsüllerinin liyofilizasyonu için kullanılmıştır. Otoklav Nüve, SteamArt, OT 40L Probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonu ve mikrobiyolojik analizlerinde gerekli olan tüm çözelti ve materyallerin sterilizasyonunda kullanılmıştır. pH metre Hanna, HI 221 Tampon çözeltilerin ve in vitro gastrointestinal sindirim ortamlarının hazırlanmasında ve KBU’nun asidik hidroliz içeren çözücü ekstraksiyonunda kullanılmıştır. Saf Su Cihazı Elga Purelab, Option Q DV25 Analizlerde gerekli olan saf su ve ultra saf su temini için kullanılmıştır. Santrifüj Hermle, Z 206 A KBU ekstraktlarının spektroskopik ve kromatografik analizleri öncesi örnek hazırlama ve probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonu aşamalarında kullanılmıştır. 26 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları (devam) Cihaz Adı Marka/Model Kullanım Amacı SEM (Taramalı Elektron Mikroskobu) Carl ZEISS, EVO 40 KBU, sterilize edilmiş KBU ve KBU- probiyotik bakteri kapsüllerinin morfolojik analizlerinde kullanılmıştır. Sıcaklık Programlı Çalkalayıcı Mikrotest, MCI 55 D Probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonunda ve in vitro gastrointestinal sindirim analizlerinde kullanılmıştır. Ultrasonik Destekli Su Banyosu ISOLAB, 621.06.003 KBU’nun ekstraksiyonunda ve probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonunda kullanılmıştır. UV-GB Spektrofotometresi Varian, Cary 50 Conc KBU ekstraktlarının toplam fenolik madde, toplam flavonoid, kondanse tanen ve antioksidan aktivite değerlerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. Vorteks Karıştırıcı Wisd, VM-10 KBU ekstraktlarının spektroskopik ve kromatografik analizlerinde, probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonunda ve mikrobiyolojik analizlerinde kullanılmıştır. 27 3.1.3. Çalışmada kullanılan kimyasallar Çalışmada kullanılan kimyasallar Çizelge 3.2’de verilmiştir. Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan kimyasallar Kimyasal Adı Marka Katalog Numarası 1-bütanol Sigma-Aldrich 101990 ABTS Sigma-Aldrich A1888 Apigenin Sigma-Aldrich A3145 Alüminyum klorür hekzahidrat Merck 101084 Amonyum demir (II) sülfat hekzahidrat J.T. Baker 0118 Asetonitril ISOLAB 901037 Bakır (II) sülfat pentahidrat Sigma-Aldrich 209198 Baryum klorür Bostonchem BBM802863 di-potasyum hidrojen fosfat Merck 105104 Epigallokateşin gallat Extrasynthese 0981 S Epikateşin gallat Extrasynthese 0978 S Etanol Merck 100983 Folin-Ciocalteu reaktifi Sigma-Aldrich F9252 Formik asit Merck 100264 Gallik asit Sigma-Aldrich 27645 Hidroklorik asit Merck 100314 Hiperozid HWI HWI00286-1 Kateşin Extrasynthese 0976S Kuersetin Sigma-Aldrich Q4951 Kuersitrin HWI HWI00330 Lacticaseibacillus rhamnosus Chr. Hansen 3671822 Lacticaseibacillus paracasei Chr. Hansen 3671291 Metanol Merck 106007 MRS agar Biokar BK089HA 28 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan kimyasallar (devam) Kimyasal Adı Marka Katalog Numarası MRS broth Biokar BK070HA Neohesperidin BLD pharm BD31760 Pankreatin Sigma-Aldrich P3292 Pektin Sigma-Aldrich P9135 Pepsin Sigma-Aldrich 77160 Peptonlu su Merck 107228 Potasyum di-hidrojen fosfat ISOLAB 960066 Potasyum peroksidisülfat Merck 105091 Safra tuzu Edukim F0499 Siringik asit Sigma-Aldrich 63627 Sodyum asetat trihidrat Merck 106265 Sodyum hidroksit Sigma-Aldrich 795429 Sodyum karbonat Sigma-Aldrich 791768 Sodyum klorür ISOLAB 969036 Sodyum potasyum tartarat tetrahidrat Sigma-Aldrich 217255 trans-sinnamik asit Sigma-Aldrich 970130 Troloks Sigma-Aldrich 238813 3.1.4. Çalışmada kullanılan sarf malzemeler Çalışmada kullanılan sarf malzemeler ve özellikleri Çizelge 3.3 ’te verilmiştir. Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan sarf malzemeler Malzeme Adı Marka Katalog Numarası Özellikleri AnaeroGen Thermo Scientific AN0025A 2,5 L Otomatik pipet Eppendorf Z683809 10–100 µL Otomatik pipet Eppendorf Z683825 100–1000 µL Otomatik pipet Eppendorf Z683833 500–5000 µL 29 3.1.5. Çalışmada kullanılan çözeltiler Çalışmada yer alan analizlerde kullanılan çözeltiler ve hazırlanışları Çizelge 3.4’te verilmiştir. Çizelge 3.4. Analizlerde kullanılan çözeltiler ve hazırlanışları Toplam fenolik madde analizi Folin çözeltisi : 2N Folin-Ciocalteu reaktifi 3 kat saf su ile seyreltilmiştir. Lowry A çözeltisi : 1 M NaOH ve %2 (w/v) Na2CO3 içeren çözelti saf su ile hazırlanmıştır. Lowry B çözeltisi : %1 (w/v) NaKC4H4O6.4H2O ve %0,5 (w/v) CuSO4.5H2O içeren çözelti saf su ile hazırlanmıştır. Lowry C çözeltisi : 50:1 (v/v) oranında Lowry A ve Lowry B karıştırılarak hazırlanmıştır. Gallik asit çözeltisi : Ana stok olarak 1000 ppm gallik asit çözeltisi metanol kullanılarak hazırlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol kullanılarak gerçekleştirilmiştir. ABTS yöntemi ile antioksidan aktivite analizi ABTS radikal çözeltisi : 7 mM ABTS ve 2,45 mM K2S2O8 içeren çözelti saf su ile hazırlanmış ve 24 sa karanlıkta bekletilmiştir. Analizlerde 10 kat saf su ile seyreltilerek kullanılmıştır. Troloks çözeltisi : Ana stok olarak 1000 ppm troloks çözeltisi metanol kullanılarak hazırlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Alüminyum klorür yöntemi ile toplam flavonoid analizi AlCl3 çözeltisi : %10 (w/v) AlCl3 içeren çözelti AlCl3.6H2O kullanılarak saf su ile hazırlanmıştır. NaC2H3O2 çözeltisi : 1 M NaC2H3O2 çözeltisi NaC2H3O2.3H2O kullanılarak saf su ile hazırlanmıştır. Kuersetin çözeltisi : Ana stok olarak 1000 ppm kuersetin çözeltisi metanol kullanılarak hazırlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 30 Çizelge 3.4. Analizlerde kullanılan çözeltiler ve hazırlanışları (devam) Bütanol-HCl yöntemi ile kondanse tanen analizi HCl çözeltisi : 12,06 M (%36, 1,18 g/mL) HCl kullanılarak saf su ile 2 M olacak şekilde seyreltilerek hazırlanmıştır. FeNH4(SO4)2 çözeltisi : %2 (w/v) FeNH4(SO4)2.6H2O içeren çözelti 2 M HCl ile hazırlanmıştır. 1-bütanol-HCl çözeltisi : 95:5 (v/v) oranında 1-bütanol ve derişik HCl karıştırılarak hazırlanmıştır. Kateşin çözeltisi : Ana stok olarak 1000 ppm kateşin çözeltisi metanol kullanılarak hazırlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kromatografik analizler için kalibrasyon çözeltileri Standart fenolik bileşiklerin metanol çözücüsü kullanılarak 100 ppm ana stok çözeltileri hazırlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol kullanılarak gerçekleştirilmiştir. In vitro gastrointestinal sindirim analizi SGF ortamı : 1 g NaCl ve 1,6 g pepsin sterilize edilmiş saf su içerisinde çözülerek toplam hacim 500 mL olacak şekilde hazırlanmıştır. Ortam pH’si, 0,2 N HCl kullanılarak 2,0±0,2’ye ayarlanmıştır. Hazırlanan SGF ortamı tek kullanımlık steril PVDF filtreden (0,45 µm) geçirilmiştir. SIF ortamı : 3,4 g KH2PO4, 38,5 mL 0,2 N NaOH çözeltisi, 0,625 g pankreatin ve 1,5 g safra tuzu sterilize edilmiş saf su içerisinde çözülerek toplam hacim 500 mL olacak şekilde hazırlanmıştır. Ortam pH’si, 0,2 N NaOH ve 0,2 N HCl kullanılarak 7,0±0,2’ye ayarlanmıştır. Hazırlanan SIF ortamı tek kullanımlık steril PVDF filtreden (0,45 µm) geçirilmiştir. 31 3.2. Yöntem 3.2.1. KBU ekstraksiyonu Spektroskopik ve kromatografik analizler için KBU’nun çözücü olarak metanol-su (80:20, v/v) karışımları kullanılarak ultrasonik destekli ekstraksiyonları gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyon işlemleri literatüre göre modifiye edilerek Şekil 3.1 ve Şekil 3.2’de verilen analiz şemalarına göre çözücü ekstraksiyonu ve asidik hidroliz içeren çözücü ekstraksiyonu olarak iki farklı şekilde gerçekleştirilmiştir (Şahin ve diğerleri, 2011; Karkar ve diğerleri, 2021). Ekstraktlar, analiz edilinceye kadar +4C’de muhafaza edilmiştir. 3 2 Şekil 3.1. KBU’nun çözücü ekstraksiyonunun şematik gösterimi Şekil 3.2. KBU’nun asidik hidroliz içeren çözücü ekstraksiyonunun şematik gösterimi 33 3.2.2. KBU ekstraktlarının spektroskopik analizleri Toplam fenolik madde analizi KBU ekstraktlarının toplam fenolik madde analizi Folin-Ciocalteu yöntemi kullanılarak yapılmıştır (Singleton ve diğerleri, 1999; Sarıburun ve diğerleri, 2010; Şahin ve diğerleri, 2015). Analiz tüplerindeki x mL KBU ekstraktı/standart üzerine 2-x mL saf su, 2,5 mL Lowry C çözeltisi ve 1/3 oranında seyreltilen 0,25 mL Folin-Ciocalteu reaktifi eklenip karıştırılarak karanlık ortamda 30 dk bekletilmiştir. Süre sonunda KBU ekstraktı/standart absorbansı UV-GB spektrofotometresi ile 750 nm’de ölçülmüştür. 1-60 ppm aralığında hazırlanan gallik asit çözeltilerinin absorbans değerleri kullanılarak kalibrasyon grafiği çizilmiş ve en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Hesaplanan doğru denklemi yardımıyla KBU ekstraktlarının toplam fenolik madde içeriği mg gallik asit eşdeğeri (GAE)/g KBU olarak belirlenmiştir. ABTS yöntemi ile antioksidan aktivite analizi KBU ekstraktlarının antioksidan aktivite analizi ABTS (2,2- azinobis(3- etilbenzotiyazolin-6-sülfonik asit) yöntemi ile belirlenmiştir (Re ve diğerleri, 1999; Şahin ve diğerleri, 2015). x mL KBU ekstraktı/standart, 4-x mL etanol ve 1 mL ABTS radikal çözeltisi (ABTS*) analiz tüpüne eklenmiştir. Absorbans değeri, UV-GB spektrofotometresi ile 6 dk sonra 734 nm’de kaydedilmiştir (Aörnek). KBU ekstraktı/standart içermeyen analiz tüplerine 4 mL etanol ve 1 mL ABTS radikal çözeltisi (ABTS*) eklenerek 6 dk sonra 734 nm’de absorbansı ölçülmüştür (Akör). Ölçümler sonucunda KBU ekstraktı/standart için % inhibisyon değerleri Eşitlik 3.1’de gösterildiği gibi hesaplanmıştır. 0,3-10 ppm aralığında hazırlanan troloks çözeltilerinin absorbans değerleri kullanılarak kalibrasyon grafiği çizilmiş ve en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Hesaplanan doğru denklemi yardımıyla KBU ekstraktlarının antioksidan aktivite değeri mg troloks eşdeğeri (TE)/g KBU olarak belirlenmiştir. % İnhibisyon = Akör-Aörnek Akör × 100 (3.1) 34 Alüminyum klorür yöntemi ile toplam flavonoid analizi KBU ekstraktlarının toplam flavonoid madde içeriği, alüminyum klorür kolorimetrik yöntemine göre belirlenmiştir (Chang ve diğerleri, 2002; Formagio ve diğerleri, 2014). Analiz tüplerine sırasıyla x mL KBU ekstraktı/standart, 3,3-x mL saf su, 1,5 mL %95’lik etanol, 0,1 mL %10’luk AlCl3 çözeltisi ve 0,1 mL 1 M NaC2H3O2 çözeltisi eklenerek karıştırılmıştır. Analiz tüpleri 30 dk karanlıkta bekletilerek 415 nm’de UV-GB spektrofotometresi ile absorbans ölçümü alınmıştır (Aörnek). KBU ekstraktı/standart içermeyen analiz tüplerine 3,3 mL saf su, 1,5 mL %95’lik etanol, 0,1 mL %10’luk AlCl3 çözeltisi ve 0,1 mL 1 M NaC2H3O2 çözeltisi eklenerek karıştırılmıştır. 30 dk süre sonunda 415 nm’de absorbansı ölçülmüştür (Akör). KBU ekstrakt/standart için absorbans değeri Eşitlik 3.2’de gösterildiği gibi hesaplanmıştır. 0,5-10 ppm aralığında hazırlanan kuersetin çözeltilerinin absorbans değerleri kullanılarak kalibrasyon grafiği çizilmiş ve en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Hesaplanan doğru denklemi yardımıyla KBU ekstraktlarının toplam flavonoid madde içeriği kuersetin eşdeğeri (QE)/g KBU olarak belirlenmiştir. Absorbans = Aörnek - Akör (3.2) Bütanol-HCl yöntemi ile kondanse tanen analizi KBU ekstraktlarının kondense tanen analizi, bütanol-HCl yöntemi ile yapılmıştır (Giner- Chavez ve diğerleri, 1997). 6 mL 1-bütanol/HC1 (95:5, v/v) ve 0,2 mL %2’lik FeNH4(SO4)2 çözeltisi analiz tüpündeki 0,1 mL KBU ekstraktı/standart içerisine eklenmiştir. 30 s karıştırıldıktan sonra 95C’deki su banyosunda 50 dk bekletilmiştir. Beklemeden sonra örnekler oda sıcaklığına soğutularak UV-GB spektrofotometresi ile 550 nm’de absorbans ölçümü yapılmıştır. 50-100 ppm aralığında hazırlanan kateşin çözeltilerinin absorbans değerleriyle kalibrasyon grafiği çizilmiş ve en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Hesaplanan doğru denklemi yardımıyla KBU ekstraktlarının kondanse tanen içeriği mg kateşin eşdeğeri (CE)/g KBU olarak belirlenmiştir. 35 3.2.3. KBU ekstraktlarının kromatografik analizi KBU ekstraktlarının fenolik bileşik içeriklerinin kalitatif ve kantitatif analizi için HPLC- DAD cihazı kullanılmıştır. Bu cihaz, otomatik örnekleyici, degazer, ikili pompa sistemi ve fotodiyot serili dedektör içermektedir. Analizlerde C18 (XBridge®, 3,5 µm, 4,6 x 250 mm) kolon kullanılmış, enjeksiyon hacmi 10 µL, akış hızı ise 0,5 mL/dk olarak ayarlanmıştır. %1’lik sulu formik asit ve asetonitrilden oluşan bir gradient hareketli faz programıyla ekstraktların analizi gerçekleştirilmiştir (Çizelge 3.5). Çizelge 3.5. HPLC-DAD gradient hareketli faz programı Süre (dk) Hareketli faz bileşimi %1’lik Formik asit (%) Asetonitril (%) 0 90 10 10 87 13 20 58,5 41,5 25 30 70 35 90 10 36 90 10 Standart fenolik bileşikler analiz edilerek alıkonma zamanları belirlenmiş ve 2-10 mg/L derişim aralığında kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur. Analiz edilen KBU ekstraktlarının kromatogramları incelenerek fenolik bileşik içeriği kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmiştir (Şahin ve diğerleri, 2011; Karkar ve diğerleri, 2024a). 3.2.4. KBU sterilizasyonu Enkapsülasyon işleminden önce kaplama materyali olarak kullanılacak olan KBU sterilize edilmiştir. Sterilizasyon süresi literatürde yapılan çalışmada belirlenen optimum süre olan 1 dk seçilmiş ve 121°C’de sterilizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir (Karkar ve diğerleri, 2024b). 36 3.2.5. Probiyotik bakterilerin geliştirilmesi ve aktive edilmesi Probiyotik bakteri olarak laktik asit bakterilerinden Lacticaseibacillus rhamnosus (LGG) ve Lacticaseibacillus paracasei (L. CASEI 431) (Chr. Hansen A/S, Hørsholm, Danimarka) seçilmiştir. Tüm mikrobiyolojik çalışmalar biyolojik güvenlik kabini içerisinde gerçekleştirilmiştir. De Man Rogosa ve Sharpe (MRS) Broth, MRS Agar, kullanılan tüm malzeme ve çözeltiler 121°C’de 15 dk boyunca sterilize edilmiştir. Şekil 3.3’te verilen analiz şemasına göre bakteriler, MRS Broth sıvı besiyerinde 3 kez inkübasyona bırakılarak aktive edilmiş ve geliştirilmiştir (24 sa, 37C). Süre sonunda geliştirilen bakteri kültürleri -24C’de depolanmıştır. 3 7 Şekil 3.3. Probiyotik bakterilerin geliştirilmesi ve aktive edilmesi 38 3.2.6. Probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonu L. rhamnosus (LR) ve L. paracasei (LPC) probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsüle edilmesi emülsiyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Probiyotik bakteriler enkapsülasyon işleminden 24 sa önce, stok bakteri kültürlerinden 1 mL alınarak 25 mL MRS Broth içerisinde 37°C’de aktive edilmiştir. Aktive edilen probiyotik bakteri kültürleri en az 106-107 kob/mL canlılığa sahip olacak şekilde (Gismondo ve diğerleri, 1999) (25 mL hacimde) KBU (sterilize edilmiş) üzerine eklenmiştir (Şekil 3.4). 50 mL NaCl çözeltisi (%0,5, w/v) ilave edildikten sonra sıcaklık programlı çalkalayıcıda (100 rpm) karıştırılmıştır. Daha sonra 2,5 mL pektin çözeltisi (%1, w/v) eklenerek ultrasonik banyoda (25C, 20 dk) bekletilmiştir. Süre sonunda santrifüjleme (3000 rpm, 15 dk) işlemi ile süpernatant ayrılarak kapsüller 10 mL BaCl2 çözeltisi (%0,5, w/v) içinde 30 dk karıştırılmıştır. İkinci kez santrifüjleme (3000 rpm, 15 dk) sonrası süpernatant dekante edilerek kapsüller liyofilize edilmiştir (-86C, 0,1 mbar). 3 9 Şekil 3.4. Probiyotik bakterilerin KBU ile enkapsülasyonu 40 3.2.7. Probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analizi Serbest ve enkapsüle edilen LR ve LPC probiyotik bakterilerinin mikrobiyolojik analizi için dökme plaka yöntemi kullanılmıştır (Chandramouli ve diğerleri, 2004). Kapsüllerdeki probiyotik bakteri canlılıklarının belirlenmesi için kapsüllerin açılarak bakterilerin serbest hale getirilmesi gerekmektedir. Bunun için pH 7,0±0,2 fosfat tamponu (0,1 M K2HPO4/KH2PO4) hazırlanarak sterilize edilmiştir. Kapsüller tampon içerisinde 30 dk boyunca bekletilerek 5 dk aralıklarla vorteks yardımıyla karıştırılmıştır. Serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin fizyolojik tuzlu su (%0,85’lik NaCl çözeltisi, w/v) ile 10-1-10-8 arası seri seyreltmeleri hazırlanmıştır. Her seri seyreltmeden 1 mL alınarak steril petri kaplarına mikrobiyolojik ekim gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.5). Ekim sonrası petri kaplarına her birine yaklaşık 13 mL olacak şekilde MRS-Agar sıvı besiyeri eklenip karıştırılmıştır. Besiyerinin donmasının ardından petriler, AnaeroGen paketleriyle birlikte anaerobik kaplara ters bir şekilde yerleştirilmiştir. Kaplar 37°C’de 72 sa boyunca anaerobik koşullarda inkübasyona bırakılmıştır. Süre sonunda bakteri sayımları gerçekleştirilmiştir. Enkapsüle edilen probiyotik bakteri canlılığı gram başına koloni oluşturan birim (log kob/g) ve serbest probiyotik bakteri canlılığı mililitre başına koloni oluşturan birim (log kob/mL) olarak belirlenmiştir (Tharmaraj ve Shah, 2003; Karkar ve diğerleri, 2024b). 4 1 Şekil 3.5. Probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analizi 42 3.2.8. Enkapsülasyon koşullarının optimizasyonu LR ve LPC probiyotik bakterilerin KBU ile yüksek verimle enkapsüle edilmesi için enkapsülasyon koşulları optimize edilmiştir. Optimizasyon için kemometrik yöntemlerden Box-Behnken Dizayn (BBD) kullanılmıştır. Buna göre karıştırma sıcaklığı (°C), karıştırma zamanı (dk) ve KBU miktarı (g) önemli faktörler olarak seçilmiştir. BBD için kullanılan faktörler ve kodlanmış seviye değerleri Çizelge 3.6’te verilmiştir. Çizelge 3.6. BBD için faktörler ve kodlanmış seviye değerleri Faktörler Kodlanmış seviye değerleri -1 0 1 (x1) Karıştırma sıcaklığı (°C) 25 30 35 (x2) Karıştırma zamanı (dk) 15 45 75 (x3) KBU miktarı (g) 1 2 3 BBD’de üç seviyeli, üç faktörlü ve merkez noktasında 5 tekrar içeren dizayn için deney sayısı (N) hesaplanmıştır (Eşitlik 3.3). N = 2k(k-1) + C𝑘 (3.3) k, faktör sayısını ve Ck, merkez noktaları ifade eder. Bu üç bağımsız faktörü optimize etmek için Çizelge 3.7’de verilen merkez noktasında beş tekrar içeren 17 deney (N=2.3(3-1)+5=17) ile BBD ile birleştirilmiş yanıt yüzey yöntemi (RSM-BBD) uygulanmıştır. Her iki probiyotik bakteri için yapılan 17 deney için enkapsülasyon verimi (Eşitlik 3.4) hesaplanmıştır. Yanıt değerleri için Design Expert 7.0.0 (Stat-Ease Inc. USA) programı kullanılarak ANOVA analizi yapılmıştır. % Verim = Enkapsüle edilen probiyotik bakteri sayısı ( log kob/g) Serbest probiyotik bakteri sayısı ( log kob/mL) × 100 (3.4) 43 Çizelge 3.7. BBD çizelgesi Deney Faktörler x1 x2 x3 Karıştırma sıcaklığı (°C) Karıştırma zamanı (dk) KBU miktarı (g) 1 25 15 2 2 35 15 2 3 25 75 2 4 35 75 2 5 25 45 1 6 35 45 1 7 25 45 3 8 35 45 3 9 30 15 1 10 30 75 1 11 30 15 3 12 30 75 3 13 30 45 2 14 30 45 2 15 30 45 2 16 30 45 2 17 30 45 2 Deneysel verilerde ANOVA analizi gerçekleştirilerek ikinci dereceden denklem ile tahmini değerler hesaplanmıştır (Eşitlik 3.5). 𝑦 = 𝑏0 + ∑ 𝑏𝑖𝑥𝑖 + 3 𝑖=1 ∑ 𝑏𝑖𝑖𝑥𝑖 2 + 3 𝑖=1 ∑ ∑ 𝑏𝑖𝑗𝑥𝑖𝑥𝑗 3 𝑗=𝑖+1 2 𝑖=1 (3.5) y, yanıt; b0, sabit terim; bi, doğrusal etkileşim sabiti; bii, parabolik etkileşim sabiti; bij, parametre etkileşim sabiti, xi ve xj bağımsız faktörleri temsil etmektedir. 44 Her faktör için optimum değerler belirlenmiştir ve belirlenen optimum koşullarda 3 tekrarlı olarak enkapsülasyon işlemi gerçekleştirilerek enkapsülasyon verimi hesaplanmıştır. Deneysel olarak belirlenen enkapsülasyon verimi model tarafından belirlenen tahmini verim değerleri ile karşılaştırılmıştır. RSM yöntemi kullanılarak faktörlerin ikili etkileşimlerinin enkapsülasyon etkinliği üzerindeki etkileri yanıt yüzey grafikleriyle değerlendirilmiştir. Bu tez çalışmasının ilerleyen tüm aşamalarında optimum koşullar altında elde edilen kapsüller kullanılmıştır. 3.2.9. KBU ve KBU-probiyotik bakteri kapsüllerinin fizikokimyasal analizleri KBU ve KBU-probiyotik bakteri kapsüllerinin toplam şeker (AOAC 968.28 ve TS 1466’dan modifiye edilmiş), toplam yağ (TS EN ISO 659), toplam protein (AOAC 990.03), toplam diyet lif (AOAC 991.43), kuru madde ve nem (TS 1129 İSO 1026), ve titre edilebilir asitlik (TS 1125 ISO 750) analizleri hizmet alımı şeklinde gerçekleştirilmiştir. KBU’nun kül analizi (TS EN ISO 2171) Bursa Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Zootekni Bölümü, Yemler ve Hayvan Besleme Laboratuvarı’nda gerçekleştirilmiştir. 3.2.10. KBU ve KBU-probiyotik bakteri kapsüllerinin karakterizasyonu KBU, sterilize edilmiş (121°C, 1 dk) KBU, KBU-probiyotik bakteri kapsüllerinin morfolojik analizleri Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Mikroskopi Laboratuvarı’nda hizmet alımı şeklinde gerçekleştirilmiştir. Pektin, KBU, sterilize edilmiş KBU, KBU-LR ve KBU-LPC kapsüllerinin yapısal karakterizasyonu için FTIR analizleri ise Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü’nde hizmet alımı şeklinde gerçekleştirilmiştir. 3.2.11. Probiyotik bakterilerin in vitro gastrointestinal sindirimdeki canlılıkları Serbest ve enkapsüle edilen LR ve LPC probiyotik bakterilerinin SGF ve SIF ortamlarındaki canlılıklarının incelenmesi, literatürdeki yöntemler modifiye edilerek gerçekleştirilmiştir (Tipigil, 2015; Karkar ve diğerleri, 2024b). SGF ve SIF ortamları 45 analize başlamadan önce 37°C’de 1 sa boyunca karıştırılmıştır. Analiz sonunda mikrobiyolojik ekim için seyreltme çözeltisi olarak peptonlu su kullanılmıştır. Probiyotik bakterilerin SGF ortamındaki canlılıkları, Şekil 3.6’da SIF ortamındaki canlılıkları ise Şekil 3.7’de gösterilen analiz şemalarına göre incelenmiştir. Ayrıca, ardışık olarak SGF ve SIF ortamındaki canlılıkların değerlendirilmesi ise Şekil 3.8’deki analiz şeması doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. In vitro gastrointestinal sindirimin serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakteri canlılığı üzerindeki etkisi, Eşitlik 3.6 kullanılarak belirlenmiştir. Canlılık (%) = sindirim sonrası probiyotik bakteri sayısı başlangıç probiyotik bakteri sayısı × 100 (3.6) Şekil 3.6. SGF ortamında sindirimin analiz şeması 46 Şekil 3.7. SIF ortamında sindirimin analiz şeması 4 7 Şekil 3.8. Ardışık olarak SGF ve SIF ortamında sindirimin analiz şeması 48 3.2.12. Probiyotik bakterilerin depolama koşullarındaki canlılıkları MRS Broth sıvı besiyeri içerisinde aktive edilen serbest LR ve LPC probiyotik bakterilerinin ve enkapsüle edilen LR ve LPC probiyotik bakterileri +24C, +4C ve -24C olmak üzere 3 farklı sıcaklık koşulunda 28 gün boyunca depolanmıştır. Probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analizleri depolamanın 0., 7., 14., 21. ve 28. günlerinde gerçekleştirilmiştir. Depolama sürecinin serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakteri canlılığı üzerindeki etkisi, Eşitlik 3.7 kullanılarak belirlenmiştir. Canlılık (%) = depolama sonrası probiyotik bakteri sayısı başlangıç probiyotik bakteri sayısı ×100 (3.7) 49 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. Spektroskopik Bulgular KBU’nun metanol-su kullanılarak elde edilen çözücü ve asidik hidroliz içeren çözücü ekstraktları için Folin-Ciocalteu yöntemi ile toplam fenolik madde, ABTS yöntemi ile antioksidan aktivite, alüminyum klorür yöntemi ile toplam flavonoid ve bütanol-HCl yöntemi ile kondanse tanen analizleri gerçekleştirilmiştir. Analiz sonuçlarının mg/g KBU cinsinden hesaplanabilmesi için, her bir yönteme ait standart eşdeğeri kullanılarak kalibrasyon grafikleri oluşturulmuş ve en küçük kareler yöntemiyle Çizelge 4.1’de verilen doğru denklemleri elde edilmiştir. Çizelge 4.1. Spektroskopik yöntemler için kalibrasyon verileri Yöntem Konsantrasyon aralığı (mg/L) Doğru Denklemi Korelasyon katsayısı (R2) Toplam fenolik madde 1-60 y = 0,0314x - 0,0015 0,9978 Antioksidan aktivite 0,3-10 y = 8,8122x - 2,2937 0,9981 Toplam flavonoid 0,5-10 y = 0,1053x - 0,0061 0,9996 Kondense tanen 50-100 y = 0,0033x - 0,0714 0,9942 KBU’nun çözücü ve asidik hidroliz içeren çözücü ekstraktlarının spektroskopik analizleri sonucunda elde edilen veriler Çizelge 4.2’de verilmiştir. Elde edilen veriler (mg/g KBU) MİNİTAB 17.0 (Minitab Inc., State College, PA) istatistik programı kullanılarak tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. Ekstraktların her bir yöntem için ayrı olarak p<0,01 düzeyinde karşılaştırmaları gerçekleştirilmiştir. KBU’nun toplam fenolik madde içeriği çözücü ekstraktında 33,99±0,11 mg GAE/g KBU iken asidik hidroliz içeren çözücü ekstraktında 44,70±0,89 mg GAE/g KBU olarak belirlenmiştir. KBU’nun antioksidan aktivite değeri çözücü ekstraktında 34,14±0,95 mg TE/g KBU olarak bulunurken asidik hidroliz içeren çözücü ekstraktında 43,84±1,12 mg 50 TE/g KBU olarak bulunmuştur. KBU’nun toplam flavonoid içeriği çözücü ekstraktında 0,60±0,04 mg QE/g KBU, asidik hidroliz içeren çözücü ekstraktında 0,73±0,01 mg QE/g KBU olarak tespit edilmiştir. KBU’nun kondanse tanen içeriği ise çözücü ekstraktında 37,07±1,90 mg CE/g KBU olarak elde edilirken asidik hidroliz içeren çözücü ekstraktında 55,05±2,00 mg CE/g KBU olarak belirlenmiştir. Sonuçlar incelendiğinde KBU’nun toplam fenolik madde, antioksidan aktivite, toplam flavonoid ve kondanse tanen içeriklerinin asidik hidroliz ile artış gösterdiği tespit edilmiştir. Çizelge 4.2. KBU ekstraktlarının spektroskopik analiz sonuçları Ekstrakt türü Toplam fenolik maddeγ Antioksidan aktiviteφ Toplam flavonoidψ Kondanse tanen Ç 33,99±0,11b,B 34,14±0,95b,B 0,60±0,04c,A 37,07±1,90a,B Ç-AH 44,70±0,89b,A 43,84±1,12b,A 0,73±0,01c,A 55,05±2,00a,A *ortalama±standart sapma (iki tekrar) γmg GAE/g KBU, φmg TE/g KBU, ψmg QE/g KBU, mg CE/g KBU Ç: çözücü, Ç-AH: çözücü-asidik hidroliz, GAE: gallik asit eşdeğeri, TE: troloks eşdeğeri, QE: kuersetin eşdeğeri, CE: kateşin eşdeğeri a-c: Küçük harfler her bir ekstrakt türündeki farklı yöntemler arasında istatistiksel olarak anlamlı farklı grupları göstermektedir (p<0,01). A-B: Büyük harfler her bir yöntemdeki farklı ekstrakt türleri arasında istatistiksel olarak anlamlı farklı grupları göstermektedir (p<0,01). Goulas ve Georgiou (2020) tarafından yapılan bir çalışmada keçiboynuzundan fenolik antioksidanların ekstraksiyonu için farklı çözücülerin kullanıldığı ultrasonik destekli ekstraksiyon yöntemi uygulanmıştır. Tylliria türü için metanol:su:asit (80:19:1, v/v/v) çözücü sisteminde toplam fenolik madde miktarı 288,4±19,4 mg GAE/100 g örnek, toplam flavonoid miktarı 70,5±1,8 mg CE/100 g örnek olarak bulunurken, Koumbota türü için toplam fenolik madde miktarı 343,2±33,7 mg GAE/100 g örnek, toplam flavonoid miktarı 38,8±3,0 mg CE/100 g örnek olarak bulunmuştur. Metanol:su (80:20, v/v) çözücü sisteminde ise Tylliria türü için toplam fenolik madde miktarı 342,2±9,4 mg GAE/100 g örnek, toplam flavonoid miktarı 49,3±1,4 mg CE/100 g örnek olarak tespit edilirken, Koumbota türü için toplam fenolik madde miktarı 228,4±25,8 GAE/100 g örnek, toplam flavonoid m