GIDA VE YAĞMUR SUYU ÖRNEKLERİNDE MANGAN İLE BAKIR TÜRLENDİRMESİ/FRAKSİYONLAMASI VE HPLC-ICP-MS TEKNİĞİ Ümran SEVEN ERDEMİR T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN-EDEBİYAT FAKÜLTESİ KİMYA BÖLÜMÜ GIDA VE YAĞMUR SUYU ÖRNEKLERİNDE MANGAN İLE BAKIR TÜRLENDİRMESİ/FRAKSİYONLAMASI VE HPLC-ICP-MS TEKNİĞİ Ümran SEVEN ERDEMİR Prof. Dr. Şeref GÜÇER (Danışman) DOKTORA TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI BURSA–2013 Her Hakkı Saklıdır TEZ ONAYI ÜMRAN SEVEN ERDEMİR tarafından hazırlanan “Gıda ve Yağmur Suyu Örneklerinde Mangan ile Bakır Türlendirmesi/Fraksiyonlaması ve HPLC-ICP-MS Tekniği” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı’nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman : Prof. Dr. Şeref GÜÇER Başkan : Prof. Dr. Şeref GÜÇER İmza Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Gürcan GÜLERYÜZ İmza Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Haluk TÜRKDEMİR İmza Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Cevdet DEMİR İmza Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Mehmet YAMAN İmza Fırat Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Ali Osman DEMİR Enstitü Müdürü ....../ ...... / 2013 U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; - tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, - görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, - başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, - atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, - kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, - ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 03/07/2013 İmza Ümran SEVEN ERDEMİR ÖZET Doktora Tezi GIDA VE YAĞMUR SUYU ÖRNEKLERİNDE MANGAN İLE BAKIR TÜRLENDİRMESİ/FRAKSİYONLAMASI VE HPLC-ICP-MS TEKNİĞİ Ümran SEVEN ERDEMİR Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Şeref GÜÇER Çalışmamızda gıda ve çevre örneklerinde eser element türlendirmesi/fraksiyonlamasına yönelik örnek hazırlama teknikleri ve farklı analiz yöntemlerinin kullanılması üzerinde durulmuştur. Bu amaçla, biyolojik açıdan önemli olan mangan ve bakır elementleri seçilerek, bu elementlerin fazla bulunduğu iç fındık, ıspanak, buğday unu gibi gıda örnekleri ile yağmur suyu örneklerinde türlendirme/fraksiyonlama çalışmalarının yapılabilme olanakları araştırılmıştır. Fraksiyonlama çalışmalarında, dağılımdaki mangan ve bakır elementlerinin düşük düzeyde bulunmaları halinde duyar bir teknik olan indüktif eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi kullanılmıştır. Dağılımların güvenirliği açısından elementlerin bulunabileceği toplam düzeyler için validasyon çalışmaları yapılmıştır. Bu amaca ulaşmak için reaktif karışımları ile yaş yakma işlemleri ve kemometrik yöntemler kullanılarak optimum şartlar saptanmıştır. Seçilen matriksler içerisindeki mangan ve bakır elementlerinin dağılımlarının incelenmesi için fraksiyonlama şeması tasarlanmış ve farklı çözgenler ile ekstraksiyonlar gerçekleştirilerek organik yapılara bağlı mangan ve bakır türlerinin tayini yapılmıştır. Ayrıca in-vitro biyoyararlılık ve aktif karbon adsorpsiyonu gibi farklı tekniklerin kullanımının beslenme açısından değeri yorumlanmıştır. Çevre örneklerinden yağmur suyunda mangan ve bakırın havadan taşınım özelliklerinin incelenmesine imkan verecek olan örnek bir türlendirme/fraksiyonlama şeması da incelenmiştir. Fraksiyonlama basamaklarından bazılarında daha detaylı bilgi alabilme ve şemayı türlendirmeye döndürebilme olasılığının belirlenmesi açısından HPLC-ICP-MS ikili tekniğinden alınan sonuçlar irdelenmiştir. Anahtar Kelimeler: Mangan, bakır, fındık, ıspanak, buğday unu, yağmur suyu, fraksiyonlama, türlendirme, biyoyararlılık, HPLC-ICP-MS 2013, xiv + 172 sayfa. i ABSTRACT PhD Thesis MANGANESE AND COPPER SPECIATION/FRACTIONATION ANALYSIS IN FOOD AND RAINWATER SAMPLES AND HPLC-ICP-MS TECHNIQUE Ümran SEVEN ERDEMİR Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Şeref GÜÇER In our study, sample preparation and different analysis techniques were taken into account for trace element speciation/fractionation in food and environmental samples. For this purposes application possibilities of speciation/fractionation studies were investigated in terms of manganese and copper elements. These elements were selected for their biological importance. The principal food sources for manganese and copper elements, namely hazelnut, spinach, wheat flour and rainwater samples were preferred for investigations. In fractionation studies, due to the low concentration of the distribution of these elements in samples, inductively coupled plasma-mass spectrometry analysis technique was found as a proper chose because of its high sensitive capabilities. Validation studies were performed in order to ensure that the distributions will be varied in the total elemental limit. For this reason wet digestions with nitric acid, hydrogen peroxide, sulphuric acid mixtures depending on sample matrix were optimized using chemometric methods. In order to investigate the distributions of manganese and copper in selected matrices, different organic extraction steps were introduced for fractionation schemes. Bounded and free forms of manganese and copper were then outlined. Also different techniques such as in-vitro bioavailability procedures and activated carbon adsorption were applied for nutritional interpretations. Additionally, speciation/fractionation scheme was proposed for understanding the mobilities of manganese and copper in air using rain water as an example of environmental samples. Detailed fractionation information and the possibility to speciation analysis were also assessed using HPLC-ICP-MS coupled technique. Key words: Manganese, copper, hazelnut, spinach, wheat flour, rainwater, fractionation, speciation, bioavailability, HPLC-ICP-MS 2013, xiv + 172 pages. ii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsüne sunulan bu doktora tezi Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü’nde Prof. Dr. Şeref GÜÇER danışmanlığında gerçekleştirilmiştir. Yüksek lisans ve doktora danışmanım, hayatımın bundan sonraki kısmında da öğrencisi olmaktan hep gurur duyacağım, en başta bilimsel olgunluğun nasıl olması gerektiği konusunda bana örnek olan bilim babam, örnek bilim insanı hocam Prof. Dr. Şeref GÜÇER’e; yetişmemdeki, bilimsel vizyon kazanmamdaki katkılarından ve harcadığı mesaiden dolayı sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bu bağlamda hocamızı bize kazandıran, onu yetiştiren saygıdeğer hocalarını da saygıyla anmak isterim. Ayrıca görünmez destekçimiz, hocamızın saygıdeğer eşi Sema GÜÇER’e de teşekkürlerimi sunar, 2013 Mayıs ayı itibari ile emekli olan hocama, eşi ve ailesi ile birlikte sağlıklı ve huzurlu bir emeklilik hayatı dilerim. Çalışmamızı F–2008/25 numaralı proje ile destekleyen Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyon Başkanlığına; bize bu çalışmayı yapma fırsatı sağladıkları için, Tez izleme komitemde yer almaları benim için çok büyük şans olan sayın hocalarım Doç. Dr. M. Haluk TÜRKDEMİR ve Prof. Dr. Gürcan GÜLERYÜZ’e çok değerli katkılarından dolayı, Doktora çalışmalarımı tamamlayıncaya kadar Kimya Bölümünde bölüm başkanlığı görevini yürüten hocamız Prof. Dr. Necati BEŞİRLİ’ ye; yüksek lisans ve doktora boyunca çalışmamıza olanak veren tüm katkıları ve iyi bir önder olduğu için, Deneysel çalışmalarımın bir kısmını hizmet alımı şeklinde gerçekleştirdiğim Tübitak Bursa Test ve Analiz Laboratuvarı’nda başta Sibel TAŞKESEN olmak üzere tüm çalışanlarına benden yardımlarını esirgemedikleri için, Beni yetiştiren, bu günlere getiren anneme; üzerimdeki tüm emekleri için, benim yanında olamadığım zamanlarda minik oğlumla ilgilenerek çalışmalarıma katkı sağladığı için, En büyük destekçim, her zaman yanımda benimle olan-bazen de arkamdan hep beni iteleyen güç olan, benimle birlikte sıkıntı çeken ve bir gün dahi desteğini esirgemeyen, eşim, can yoldaşım Mustafa ERDEMİR’e; zorlu doktora sürecinde hep yanımda olduğu, hayatımı kolaylaştırdığı ve son olarak da tezimdeki çoğu şeklin daha iyi görünmesi adına mesai harcayıp yeniden çizmeye yardım ettiği için, Ve şu an dokuz aylık olan canım oğlum Mert Mustafa’ma; en büyük motivasyon kaynağım olduğu için, doğmadan önce ve doğduktan sonra en yoğun tez çalışmalarım döneminde adeta benimle çalıştığı ve hayatının ilk aylarında annesini bu tez çalışması ile paylaşarak en büyük özveriyi gösterdiği için, bu tezi de kendisine ithaf ederek, Teşekkür ederim. Ümran SEVEN ERDEMİR 03/07/2013 iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET i ABSTRACT ii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ iv SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ ix ŞEKİLLER DİZİNİ x ÇİZELGELER DİZİNİ xii 1. GİRİŞ 1 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 3 2.1. Türlendirme ve Fraksiyonlama Çalışmalarının Önemi 3 2.2. Türlendirme/Fraksiyonlamanın Tanımı ve Analitik Kimyadaki Yeri 4 2.3. Türlendirmede İkili Teknikler 7 2.3.1. HPLC-ICP-MS kesiksiz bağlantısı ve “Chromera” yazılımı 12 2.4. Kesiksiz (On-Line) Tekniklerin Avantajları ve Sınırlılıkları 14 2.5. Türlendirme/ Fraksiyonlama ve Biyoyararlılık İlişkisi 15 2.6. Gıdalarda Metal analizleri 17 2.6.1. Metal analizleri için kullanılan örnek hazırlama ve analiz yöntemleri 19 2.6.2. Katı örneklerin çözünürleştirilmesi ve açık sistem örnek hazırlama 22 2.6.3. Mikrodalga yöntemleri 23 2.6.4. Ultrasonik banyoya dayalı ekstraksiyon teknikleri 24 2.6.5. Katı faz ekstraksiyonu 25 2.6.6. Gıdalarda atomik spektroskopi ile türlendirme analizleri 26 2.7. ICP-MS 27 2.7.1. ICP-MS analizlerinde girişimler ve türlendirme analizleri 31 2.8. HPLC 34 2.9. Tez kapsamında Seçilen Matriksler 36 2.9.1. Ispanak (Spinacia oleracea L.) 36 2.9.2. Buğday (Triticum aestivum L.) unu 37 2.9.3. Fındık (Corylus avellana L.) 38 2.9.4. Yağmur suyu 41 2.10. Tez kapsamında Seçilen Metaller 43 2.10.1. Mangan 43 2.10.1.1. Gıda bileşenlerinin mangan emilimine etkisi 47 2.10.1.2. Metal türlendirme analizleri ve mangan 47 2.10.2. Bakır 51 3. MATERYAL ve YÖNTEM 53 3.1. Materyal 53 3.1.1. Çalışmada kullanılan analitik cihazlar ve parçaları 53 3.1.1.1. İndüktif eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi 53 3.1.1.2. Yüksek basınç sıvı kromatografisi 53 3.1.1.3. HPLC-ICP-MS arayüzü için çevirici valf 53 3.1.1.4. Alevli atomik absorpsiyon spektrometresi 54 3.1.1.5. Gaz kromatografisi 54 3.1.2. Çalışmada kullanılan temel laboratuar cihazları 54 3.1.2.1. Su banyosu 54 iv 3.1.2.2. pH-Metre 54 3.1.2.3. Ultrasonik karıştırıcı 54 3.1.2.4. Etüv 55 3.1.2.5. Terazi 55 3.1.2.6. Santrifüj aleti 55 3.1.2.7. Soxhlet ekstraksiyon sistemi 55 3.1.2.8. Vorteks cihazı 55 3.1.2.9. Kül fırını 55 3.1.2.10 Kjeldahl aparatı 56 3.1.2.11. Otomatik destilasyon ünitesi 56 3.1.2.12. Diyet lif/ham selüloz tayin cihazı 56 3.1.2.13. Döner vakumlu buharlaştırıcı 56 3.1.2.14. Mikrodalga parçalama sistemi 56 3.1.2.15. Liyofilizatör (dondurarak kurutma cihazı) 56 3.1.2.16. Saf su cihazı 57 3.1.2.17. Katı faz ekstraksiyon sistemi 57 3.1.2.18.Süzme düzeneği 57 3.1.2.19. Manyetik karıştırıcılı ısıtıcı 57 3.1.3. Çalışmada kullanılan kimyasallar, sarf malzemeler, numuneler ve 57 çözeltiler 3.1.3.1. Analitik saflıktaki kimyasallar ve sarf malzemeler 57 3.1.3.2. Sertifikalı referans malzemeler 60 3.1.3.3. Diğer sarf malzemeler 61 3.1.3.4. Numuneler 62 3.1.3.5. Deneysel işlemlerde kullanılacak çözeltilerin hazırlanması 62 3.1.3.5.1. ICP-MS çalışmaları ve örnek hazırlamada kullanılmak üzere 62 yaklaşık 0,1 N, 1 N ve 2 N nitrik asit çözeltilerinin hazırlanması 3.1.3.5.2. Biyoyararlılık çalışmaları için gerekli çözeltilerin hazırlanması 63 3.1.3.5.2.1. Yaklaşık 0,1 N HCl çözeltisinin hazırlanması 63 3.1.3.5.2.2. Yaklaşık 0,1 N NaHCO3 çözeltisinin hazırlanması 63 3.1.3.5.2.3. Pepsin çözeltisinin hazırlanması 63 3.1.3.5.2.4. Pakreatin çözeltisinin hazırlanması 63 3.1.3.5.3. Örneklerdeki temel bileşenlerin analizleri için gerekli çözeltilerin 63 hazırlanması 3.1.3.5.3.1. Ham selüloz tayini için gerekli sülfürik asit ve sodyum 63 hidroksit çözeltilerinin hazırlanması 3.1.3.5.3.2. Protein tayini için gerekli çözeltilerin hazırlanması 64 3.1.3.5.3.3. Şeker tayini için gerekli çözeltilerin hazırlanması 64 3.1.3.5.3.4. Diyet lif tayini için gerekli çözeltilerin hazırlanması 64 3.1.3.5.4. Yağ asidi metil esterleri oluşturmak için metanolik potasyum 65 hidroksit çözeltisinin hazırlanması 3.1.3.5.5. Katı faz ekstraksiyonu için gerekli çözeltilerin hazırlanması 65 3.1.3.5.5.1. Metanolde % 0,1 (v/v) formik asit çözeltisinin hazırlanması 65 3.1.3.5.5.2. Suda % 2 (v/v) formik asit çözeltisinin hazırlanması 65 3.1.3.5.5.3. Suda % 0,5 (v/v) amonyak çözeltisinin hazırlanması 65 3.2. Yöntem 66 3.2.1. Örneklerin analize hazırlanması 66 3.2.1.1. Ispanak örneklerinin liyofilizasyon işlemine tabi tutulması 66 v 3.2.1.2. Örneklerinin mikrodalga parçalama yöntemi ile AAS analizine 66 hazırlanması 3.2.1.3. Örneklerinin ICP-MS analizine hazırlanması 67 3.2.2. ICP-MS için kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması 68 3.2.3. Fraksiyonlama çalışmaları için örneklerin hazırlanması 68 3.2.4. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki temel bileşenlerin belirlenmesi 68 3.2.4.1. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki nem içeriğinin belirlenmesi 68 3.2.4.2. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki ham selüloz içeriğinin 69 belirlenmesi 3.2.4.3. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki kül içeriğinin belirlenmesi 70 3.2.4.4. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki protein içeriğinin belirlenmesi 71 3.2.4.5. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki yağ içeriğinin belirlenmesi 72 3.2.4.5.1. Kloroform:metanol karışımı ile fındık örneklerinin yağ 73 içeriklerinin belirlenmesi 3.2.4.5.2. Fındık örneklerinin yağ asitleri bileşimin belirlenmesi 73 3.2.4.6. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki şeker içeriğinin Luff-Schoorl 74 yöntemi ile belirlenmesi 3.2.4.7. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki diyet lif içeriğinin 76 belirlenmesi 3.2.5. Yağ asitleri metil esterlerinin GC ile analizi 77 3.2.6. AAS ile metal analizleri 78 3.2.7. ICP-MS ile metal analizleri 79 3.2.7.1. AAS ile karşılaştırma analizleri 79 3.2.7.2. Açık sistem yaş yakma ile toplam metal analizleri 80 3.2.7.2.1. Açık sistem yaş yakma işleminin optimizasyonu 81 3.2.7.2.2. Optimum koşullarda Mn, Cu analizleri; SRM analizi ve yüzde 85 geri kazanım çalışmaları 3.2.7.3. Seyreltik nitrik asit ve ultrasonik ekstraksiyonun etkinliğinin 85 araştırılması 3.2.7.4. Matrikslerin yağsız kısmının eldesi ve metal analizi 85 3.2.7.5. Ispanak, un ve fındık örneklerinde çözgen ekstraksiyonuna dayalı 85 fraksiyonlama çalışmaları 3.2.7.6. “in-vitro” mide ve bağırsak sindirim simülasyon işlemleri ile 87 biyoyararlılık çalışmaları 3.2.7.7. Biyoyararlılık değerlendirmeleri için n-oktanol ekstraksiyonu 87 çalışmaları 3.2.7.8. Aktif karbon ile adsorpsiyon çalışmaları 88 3.2.7.9. AAS ve ICP-MS’de metot validasyon parametrelerinin 88 belirlenmesi 3.2.7.10. Katı faz ekstraksiyon çalışmaları 88 3.2.7.11. Yağmur suyunda mangan ve bakır türlendirme analizleri 89 3.2.7.12. HPLC-ICP-MS ikili tekniğine yönelik çalışmalar 89 3.2.7.12.1. HPLC-ICP-MS ikili tekniğine yönelik püskürtme haznesi 90 karşılaştırılması 3.2.7.12.2. HPLC-ICP-MS ikili tekniğine yönelik uygun sisleştiricinin 90 belirlenmesi 3.2.7.12.3. HPLC-ICP-MS ikili tekniğine yönelik peltier soğutmalı siklonik 91 püskürtme haznesi etkinliğinin belirlenmesi vi 3.2.7.12.4. HPLC-ICP-MS ikili tekniği ile türlendirme/fraksiyonlama 91 çalışmaları 4. BULGULAR 92 4.1. Ispanak, Un ve Fındık Örneklerindeki Temel Bileşenler 92 4.2. Fındık Örneklerindeki Yağ Asitlerinin Karakterizasyonu 93 4.3. Fındıkta Yağ İçeriğinin Standart Metot ve Kloroform:Metanol 95 Ekstraksiyonu ile Karşılaştırılması 4.4. AAS ile Metal Analizleri 95 4.4.1. AAS ile bazı metot validasyon parametrelerinin belirlenmesi 95 4.4.2. AAS’de standart çözeltiler ile elde edilen kalibrasyon eğrileri 96 4.4.3. AAS ile yüzde geri kazanım çalışmaları 97 4.4.3.1. Kalibrasyon eğrileri 97 4.4.3.2. Yüzde geri kazanım çalışmaları 99 4.4.4. AAS’ de sertifikalı referans malzeme ile yapılan çalışma sonuçları 99 4.4.5. AAS ile metal analizleri 100 4.5. ICP-MS ile Metal Analizleri 100 4.5.1. AAS ile analiz edilen örneklerin ICP-MS ile karşılaştırılması 100 4.5.2. Mikrodalga parçalama ile açık sistem yaş yakmanın karşılaştırılması 101 4.5.3. Merkezi kompozit dizayn yöntemi ile optimizasyon çalışmaları 102 4.5.3.1. Optimum koşullarda ICP-MS ile metal düzeylerinin belirlenmesi 105 4.5.4. Serifikalı referans malzemelerin açık sistem yaş yakmalı örnek 106 hazırlama sonrası ICP-MS ile analizleri 4.5.5. 0,1 N nitrik asit ile ultrasonik banyoda doğrudan parçalama yöntemi 106 ile toplam metal analizleri 4.5.6. Matrikslerin kuru kısımlarında (yağı alınan örneklerde) metal 107 analizleri 4.5.7. Fraksiyonlama Sonuçları 108 4.5.7.1. Ispanak örnekleri için fraksiyonlama çalışmaları 108 4.4.7.2. Un örnekleri için fraksiyonlama çalışmaları 109 4.4.7.3. Fındık örnekleri için fraksiyonlama çalışmaları 111 4.5.8. Biyoyararlılık çalışmaları 111 4.5.8.1. Ispanak için biyoyararlılık çalışmaları 112 4.5.8.2. Un için biyoyararlılık çalışmaları 116 4.5.8.3. Fındık için biyoyararlılık çalışmaları 122 4.5.9. ICP-MS ile metot duyarlılık parametrelerinin belirlenmesi 126 4.5.10. Katı faz ekstraksiyonu sonuçları 128 4.5.11. Çevre örneklerinden yağmur suyunda mangan ve bakır 129 türlendirme/fraksiyonlama analizleri 4.6. HPLC-ICP-MS İkili Tekniğine Dayanan Türlendirme Çalışmaları 130 Sonuçları 4.6.1. Kalitatif analiz sonuçları 130 4.6.1.1. Standart çözeltiler ile yapılan çalışmalar 130 4.6.2. Matrikslerden elde edilen kalitatif analiz sonuçları 134 4.6.2.1. Yağmur suyunda kalitatif analiz sonuçları 134 4.6.2.2. Ispanak örneği için kalitatif analiz sonuçları 135 4.6.2.3. Un örneği için kalitatif analiz sonuçları 135 4.6.2.4. Fındık örneği için kalitatif analiz sonuçları 136 4.6.2.5. Metanol içeren mobil fazın ayırmaya etkisi 137 vii 4.6.3. Matrikslerden elde edilen kantitatif analiz sonuçları 139 5. TARTIŞMA ve SONUÇ 141 KAYNAKLAR 156 EKLER 169 ÖZGEÇMİŞ 172 viii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama tR Alıkonma zamanı dk dakika ºC Derece, Santigrat g Gram v/v Hacim/hacim K Kelvin cinsinden sıcaklık kg Kilogram m/z Kütle/yük m/v Kütle/hacim L Litre μ Mikro -1 µg L Mikrogram/Litre -1 mg L Miligram/Litre -1 mL dk Mililitre/dakika ppb Milyarda bir kısım ppm Milyonda bir kısım s Saniye ± Standart sapma ~ Yaklaşık % Yüzde d Yoğunluk Kısaltmalar Açıklama AAS Atomik absorpsiyon spektrometri/Alevli atomik absorpsiyon spektrometresi AES Atomik emisyon spektrometresi CE Kapiler elektroforez ICP- DRC-MS Dinamik reaksiyon hücreli indüktif eşleşmiş plazma- kütle spektrometresi ETAAS Elektrotermal atomik absorpsiyon spektrometresi GC Gaz kromatografisi GFAAS Grafit fırınlı atomik absorpsiyon spektrometresi HPLC Yüksek basınç sıvı kromatografisi ICP İndüktif eşleşmiş plazma ICP-MS İndüktif eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi LC Sıvı kromatografisi LOD Belirleme limiti LOQ Nicel tayin limiti SEC Boyut eleme kromatografisi SRM Sertifikalı referans malzeme HPLC-ICP-MS Yüksek basınç sıvı kromatografisi-indüktif eşleşmiş plazma- kütle spektrometresi ix ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.2.1 Türlendirme analizlerinin önemli olduğu uygulama alanları 4 Şekil 2.2.2 Kimyasal analiz alanı ile ilişkili türlendirme analizi çeşitleri 6 Şekil 2.2.3 Fraksiyonlamanın başlıca uygulanma nedenleri 7 Şekil 2.3.1 HPLC’de ayırma mekanizmaları ve türlendirme 10 analizlerindeki bazı tipik uygulamaları Şekil 2.3.2 HPLC-ICP-MS veya LC-ICP-MS ikili teknikleri ile ilgili 11 yayın sayılarının yıllara bağlı değişimi Şekil 2.3.3 Türlendirme analizlerinde kullanılan teknikler ve bu 11 teknikler arası ilişkiler Şekil 2.3.4 HPLC-ICP-MS ikili tekniğinin şekilsel gösterimi 12 Şekil 2.3.5 Türlendirme analizlerine çeşitli analitik tekniklerin katkısı 12 ve bu teknikler arası ilişkiler Şekil 2.3.1.1 HPLC-ICP-MS ikili tekniğinde cihazlar arasındaki çevirici 14 valfin şematik gösterimi Şekil 2.5.1 İnsan ve gıda zincirinde metal hareketliliği 16 Şekil 2.5.2 Biyoyararlılık ile ilgili terimlerin şematik gösterimi 17 Şekil 2.6.5.1 Katı faz ekstraksiyonunun şematik gösterimi 26 Şekil 2.6.6.1 2003-04-27 ve 2013-04-27 tarihleri arasında mangan veya 27 bakır türlendirmesi ve fraksiyonlaması ile ilgili yayın sayıları Şekil 2.7.1 ICP-MS cihazının temel bileşenleri 27 Şekil 2.7.2 Element analizi için analitik spektroskopik teknik seçimi 29 Şekil 2.7.3 Atomik spektroskopik yöntemlerdeki belirleme limitlerinin 30 ICP-MS ile karşılaştırılması Şekil 2.7.4 Elementel analiz için atomik spektroskopik teknik 30 seçiminde önemli parametreler Şekil 2.7.5 ICP-MS ile tayin edilebilen elementler ve belirleme 31 limitleri Şekil 2.8.1 HPLC cihazının temel bileşenleri 35 Şekil 2.10.1.1.1. Mulder diyagramı 47 Şekil 3.2.7.5.1 Fraksiyonlama analiz şeması 86 Şekil 4.4.2.1 AAS’de Cu için standart çözeltiler ile elde edilen 96 kalibrasyon eğrisi grafiği Şekil 4.4.2.2 AAS’de Mn için standart çözeltiler ile elde edilen 97 kalibrasyon eğrisi grafiği Şekil 4.4.3.1.1 AAS’de yüzde geri kazanım çalışmalarında Cu için standart 98 çözeltiler ile elde edilen kalibrasyon eğrisi grafiği Şekil 4.4.3.1.2 AAS’de yüzde geri kazanım çalışmalarında Mn için 98 standart çözeltiler ile elde edilen kalibrasyon eğrisi grafiği Şekil 4.6.1.1.1 Mn (II) ve Cu (II) çözeltileri karışımı için HPLC-ICP-MS 131 ile eş-zamanlı elde edilen kromatogram Şekil 4.6.1.1.2 Mn (III) çözeltisi için HPLC-ICP-MS ile elde edilen 132 kromatogram Şekil 4.6.1.1.3 Mn (IV) çözeltisi için HPLC-ICP-MS ile elde edilen 133 kromatogram x Şekil. 4.6.2.1.1. A: 1. yağmur suyu; B: 2. yağmur suyu ve C: 3. yağmur 134 suyu için HPLC-ICP-MS ile elde edilen kromatogramlar Şekil 4.6.2.2.1 İkinci ıspanak örneği için HPLC-ICP-MS ile elde edilen 135 kromatogram Şekil 4.6.2.3.1 İkinci un örneği için HPLC-ICP-MS ile elde edilen 136 kromatogram Şekil 4.6.2.4.1 Üçüncü fındık örneği için HPLC-ICP-MS ile elde edilen 137 kromatogram Şekil 4.6.2.5.1 HPLC-ICP-MS sisteminde %1-5 arasında metanol 138 kullanıldığında üçüncü fındık örneği için elde edilen kromatogramlar Şekil 5.1 Ispanak, un ve fındık matrikslerinde kuru bazdaki makro 146 bileşenler EKLER Şekil 1 HPLC-ICP-MS cihazı 169 Şekil 2 Scott tip püskürme haznesi ve ryton karşı akış sisleştirici 169 Şekil 3 Siklonik (Cyclonic) püskürtme haznesi 170 Şekil 4 ICP-MS için organik çözgen iletim aparatı 170 Şekil 5 Düşük akış sisleştirici 171 Şekil 6 Meinhard sisleştirici 171 Şekil 7 Rheodyne çevirici valf 171 xi ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.2.1 Temel türlendirme analiz çeşitlerinin kısa 5 karakteristikleri Çizelge 2.6.3.1 Derişik asitler ve kral suyunun atmosferik basınç ve 24 5 7×10 Pa basınçta kaynama noktaları Çizelge 2.7.1.1. ICP-MS’te karşılaşılan yaygın poliatomik girişimlere 32 örnekler Çizelge 2.9.3.1 Fındık çeşitlerinin elementel içeriği-1 40 Çizelge 2.9.3.2 Fındık çeşitlerinin elementel içeriği-2 41 Çizelge 2.10.1.1 Mangan ve bazı bileşiklerinin kimyasal özellikleri 46 Çizelge 3.2.4.6.1 Luff Scroll yöntemi için harcanan tiyosülfat hacmine 75 karşı mg olarak invert şeker değeri Çizelge 3.2.5.1 GC çalışma şartları 78 Çizelge 3.2.6.1 Mikrodalga programı 78 Çizelge 3.2.6.2 AAS çalışma şartları 79 Çizelge 3.2.6.3 Sertifikalı referans malzemeler ve Mn, Cu 79 elementlerinin sertifika değerleri Çizelge 3.2.7.1.1 ICP-MS çalışma şartları 80 Çizelge 3.2.7.2.1.1 Ispanak matriksi için merkezi kompozit dizayn 82 Çizelge 3.2.7.2.1.1.(a) Kodlanmış faktörler ve seviyeleri 82 Çizelge 3.2.7.2.1.1.(b) Ispanak matriksi için deneysel dizayn matriksi 82 Çizelge 3.2.7.2.1.2 Un matriksi için merkezi kompozit dizayn 83 Çizelge 3.2.7.2.1.2.(a) Kodlanmış faktörler ve seviyeleri 83 Çizelge 3.2.7.2.1.2.(b) Un matriksi için deneysel dizayn matriksi 83 Çizelge 3.2.7.2.1.3 Fındık matriksi için merkezi kompozit dizayn 84 Çizelge 3.2.7.2.1.3.(a) Kodlanmış faktörler ve seviyeleri 84 Çizelge 3.2.7.2.1.3.(b) Fındık matriksi için deneysel dizayn matriksi 84 Çizelge 3.2.7.12.1 HPLC-ICP-MS cihazı çalışma şartları 90 Çizelge 4.1.1 Ispanak örneklerinin makro bileşenleri ve bunların 92 düzeyleri Çizelge 4.1.2 Un örneklerinin makro bileşenleri ve bunların düzeyleri 92 Çizelge 4.1.3 Fındık örneklerinin makro bileşenleri ve bunların 93 düzeyleri Çizelge 4.2.1 1 numaralı fındık örneğinin metil esterlerine dayalı yağ 93 asidi bileşimi Çizelge 4.2.2 2 numaralı fındık örneğinin metil esterlerine dayalı yağ 94 asidi bileşimi Çizelge 4.2.3 3 numaralı fındık örneğinin metil esterlerine dayalı yağ 94 asidi bileşimi Çizelge 4.3.1 Fındıkta, iki farklı metot ile bulunan yağ yüzdelerinin 95 karşılaştırılması Çizelge 4.4.1.1 AAS analizleri için bazı metot validasyon parametreleri 95 ve değerleri Çizelge 4.4.2.1 AAS’de Cu analizinde standart çözeltiler ile elde edilen 96 absorbans değerleri xii Çizelge 4.4.2.2 AAS’de Mn analizinde standart çözeltiler ile elde 96 edilen absorbans değerleri Çizelge 4.4.3.1.1 AAS’de Cu analizinde geri kazanım çalışmaları için 97 standart çözeltiler ile elde edilen absorbans değerleri Çizelge 4.4.3.1.2 AAS’de Mn analizinde geri kazanım çalışmaları için 98 standart çözeltiler ile elde edilen absorbans değerleri Çizelge 4.4.3.2.1 AAS ile analizlerde matriksler için yüzde geri kazanım 99 sonuçları Çizelge 4.4.4.1 AAS ile doğruluk çalışmaları kapsamında analiz edilen 99 SRM’ lerde belirlenen Mn ve Cu düzeyleri Çizelge 4.4.5.1 Matrikslerde AAS analizleri sonucu bulunan element 100 düzeyleri Çizelge 4.5.1.1 Matrikslerde mikrodalga parçalama sonrası ICP-MS ile 101 belirlenen metal düzeyleri, örneklere eklenen Mn ve Cu için bulunan yüzde geri kazanım değerleri Çizelge 4.5.2.1 Açık sistem yaş yakmalı örnek hazırlama sonrası ICP- 101 MS ile mangan ve bakır analizi sonuçları Çizelge 4.5.3.1 Ispanak matriksi için 2^3+star merkezi kompozit 103 dizayn (N=16) Çizelge 4.5.3.2 Un matriksi için 2^3+star merkezi kompozit dizayn 104 (N=16) Çizelge 4.5.3.3 Fındık matriksi için 2^3+star merkezi kompozit dizayn 105 (N=16) Çizelge 4.5.3.4 Matrisler için optimum açık sistem yaş yakma koşulları 105 Çizelge 4.5.3.1.1 Optimum koşullarda açık sistem yaş yakma ile 106 belirlenen metal düzeyleri Çizelge 4.5.4.1 Açık sistem yaş yakma sonrası ICP-MS ile SRM 106 analizleri Çizelge 4.5.5.1 Nitrik asite geçen metal miktarları 107 Çizelge 4.5.6.1 Ispanak, un ve fındık matriksleri için yağı 107 uzaklaştırılan örneklerdeki metal düzeyleri Çizelge 4.5.7.1.1 Üç farklı ıspanak örneğinden organik çözgenlere geçen 108 mangan düzeyleri Çizelge 4.5.7.1.2 Üç farklı ıspanak örneğinden organik çözgenlere geçen 109 bakır düzeyleri Çizelge 4.5.7.2.1 Üç farklı un örneğinden organik çözgenlere geçen 109 mangan düzeyleri Çizelge 4.5.7.2.2 Üç farklı un örneğinden organik çözgenlere geçen bakır 110 65 ( Cu) düzeyleri Çizelge 4.5.7.2.3 Üç farklı un örneğinden organik çözgenlere geçen bakır 110 63 ( Cu) düzeyleri Çizelge 4.5.7.3.1 Üç farklı fındık örneğinden organik çözgenlere geçen 111 mangan düzeyleri Çizelge 4.5.7.3.2 Üç farklı fındık örneğinden organik çözgenlere geçen 111 63 bakır ( Cu) düzeyleri Çizelge 4.5.8.1.1 Ispanak örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile 112 ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe edilebilen fraksiyonlarındaki mangan düzeyleri xiii Çizelge 4.5.8.1.2 Ispanak örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile 113 ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe edilebilen fraksiyonlarındaki bakır düzeyleri Çizelge 4.5.8.1.3 Ispanaktaki manganın biyoyararlılığı 114 Çizelge 4.5.8.1.4 Ispanaktaki bakırın biyoyararlılığı 115 Çizelge 4.5.8.2.1 Un örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile 116 ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe edilebilen fraksiyonlarındaki mangan düzeyleri Çizelge 4.5.8.2.2 Un örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile 117 ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe 65 edilebilen fraksiyonlarındaki bakır ( Cu) düzeyleri Çizelge 4.5.8.2.3 Un örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile 118 ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe 63 edilebilen fraksiyonlarındaki bakır ( Cu) düzeyleri Çizelge 4.5.8.2.4 Undaki manganın biyoyararlılığı 119 65 Çizelge 4.5.8.2.5 Undaki bakırın ( Cu) biyoyararlılığı 120 63 Çizelge 4.5.8.2.6 Undaki bakırın ( Cu) biyoyararlılığı 121 Çizelge 4.5.8.3.1 Fındık örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile 122 ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe edilebilen fraksiyonlarındaki mangan düzeyleri Çizelge 4.5.8.3.2 Fındık örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile 123 ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe edilebilen fraksiyonlarındaki bakır düzeyleri Çizelge 4.5.8.3.3 Fındıktaki manganın biyoyararlılığı 124 Çizelge 4.5.8.3.4 Fındıktaki bakırın biyoyararlılığı 125 Çizelge 4.5.9.1 Mn için ıspanak matriksinde bazı metot validasyon 126 parametreleri ve değerleri Çizelge 4.4.9.2 Cu için ıspanak matriksinde bazı metot validasyon 126 parametreleri ve değerleri Çizelge 4.5.9.3 Mn için sertifikalı referans malzeme kullanılarak 127 yapılan doğruluk çalışmaları Çizelge 4.4.9.4 Cu için sertifikalı referans malzeme kullanılarak 127 yapılan doğruluk çalışmaları Çizelge 4.5.9.5 Mn ve Cu için un ve fındık matriksinde ilave metot 127 validasyon parametreleri Çizelge 4.5.10.1 Katı faz ekstraksiyon sonuçları 128 Çizelge 4.5.10.2 Katı faz ekstraksiyonu için yüzde geri kazanım 129 sonuçları Çizelge 4.5.11.1 Yağmur suyunda mangan ve bakır 129 türlendirme/fraksiyonlama sonuçları Çizelge 4.6.3.1 HPLC-ICP-MS ile elde edilen kalibrasyon eğrileri 139 Çizelge 4.6.3.2 HLPC-ICP-MS çalışmalarında Mn ve Cu türleri için 139 belirleme ve nicel tayin limitleri Çizelge 4.6.3.3 HLPC-ICP-MS çalışmalarında matrikslerde Mn ve Cu 140 için belirlenen türlerin miktarları xiv 1. GİRİŞ Bir elementin fizikokimyasal formunun belirlenmesi, yani türlendirme çalışmaları neden önem teşkil etmektedir? Toplam element tayini; elementin taşınım, toksisite, biyoyararlılık etkilerini belirtmede yeterli görülebilir mi? Türlendirmede hangi atomik spektroskopik teknikler ön plana çıkmaktadır? Metallerin hem lüzumlu olmaları hem de toksik özellik göstermeleri nedeni ile tayinlerinde özel analitik şemaların geliştirilmesi güncel konular arasındadır. Günümüzde biyoyararlılık ve toksisitenin, metallerin belirli fizikokimyasal formları ile yakından ilgili olduğu bilinmektedir. Ele alınan bir matriks içinde elementler çeşitli formda ve yapıda bulunabilmektedir (Broekart ve ark. 1990). Bu nedenle etkilerinin tam olarak belirlenmesinde toplam element düzeyleri yerine türlendirme ve fraksiyonlama çalışmaları önemlidir. Tez kapsamında incelenecek olan mangan (Mn) ve bakır (Cu) elementleri; hem lüzumlu hem toksik özellik göstermeleri, organizmada birbirlerinin etkilerini değiştirebilmeleri açısından çeşitli gıda örneklerinde (ıspanak, iç fındık, buğday unu) ve çevre örneği olarak da yağmur suyunda türlendirme ve fraksiyonlama çalışmaları açısından incelenmiştir. Bu kapsamda, farklı örnek hazırlama teknikleri ve analiz yöntemlerinin kullanılması üzerinde durulmuştur. İlgili elementlerin çok düşük düzeylerde bulunmaları halinde indüktif eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi (ICP-MS) tekniği ile ölçümleri gerçekleştirilmiştir. Asit karışımları ile yaş yakma işlemleri sonucu organik kısmın parçalanması ve toplam element tayini ile validasyonu yapılmıştır. Elementlerin bağlı bulundukları yapıların aydınlatılmasına yönelik olarak farklı çözgenler ile ekstraksiyona veya aktif karbon adsorpsiyonuna dayalı fraksiyonlama çalışmaları yapılmıştır. Organizmadaki yararlılıklarının belirlenmesi açısından in-vitro biyoyararlılık çalışmaları; yine tez kapsamında uygulanmıştır. Tüm bu çalışmalar Mn ve Cu elementlerinin taşınım özelliklerinin, bağlı bulundukları yapıların aydınlatılmasında ve buna bağlı olarak da toksisite ve biyoyararlılık çalışmalarının değerlendirilmesinde 1 yararlı olacaktır. Buna ilaveten; yüksek basınç sıvı kromatografisi-indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (HPLC-ICP-MS) kesiksiz ikili tekniğinin kullanılması da çalışmamızın çıktılarını oluşturacaktır. 2 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI Çoğu gıda ve çevre örneklerinde eser elementlerin türlendirme ve fraksiyonlama çalışmalarında metotların duyarlılıklarının sınırlı olması sebebi ile fazla veri üretilememiş; farklı matrikslerde, fraksiyonlama çalışmaları toplam element düzeyinde değerlendirilmiştir. Günümüzde hızlı ve örnek yapısını değiştirmeyen ikili tekniklerin kullanımına ihtiyaç duyulmaktadır. Aşağıda bu bağlamda literatürden derlenen bilgiler özetlenmektedir. 2.1. Türlendirme ve Fraksiyonlama Çalışmalarının Önemi Metabolik işlevlerde gerekli olan eser element analizleri halk sağlığı çalışmaları açısından önemlidir; fakat ilgili elementlerin toplam konsantrasyonları değişik formları hakkında bilgi vermez (Tokalioğlu ve ark. 2000, Tuzen ve Soylak 2007). Elementin toksisitesi, biyoyararlılığı ve taşınım özellikleri kimyasal formuna bağlıdır (Rosen ve Hieftje 2004, Gomez-Ariza ve ark. 2006). Ayrıca metal veya metaloidler biyomakromoleküllerin bir parçası olarak da bulunabilir ki bu da farklı etki ve davranışları açısından önemlidir. Bu nedenle biyolojik örnekler veya gıda örneklerindeki eser element türlendirmesi ile elde edilen bilgi metal ve yarı-metallerin biyokimyasını anlamada günümüzde önemli görülmektedir (Gomez-Ariza ve ark. 2006). Gıdalar açısından örnek verilirse, toplam element içeriğinin absorpsiyon ve kullanım hakkında çok az bilgi verdiği kabul görmüştür (Crews 1998). Zira gıdadaki mineralin besin değeri sadece element içeriğine değil; biyoyararlılığına veya biyoalınabilirliğine de bağlıdır (Ruzik 2012). Eser elementler ve organik bileşikler kimyasal olarak hemen etkileşir ve bu nedenle elementler; protein, enzim veya hormon gibi bir makromolekül parçası olarak ortaya çıkarak bu bağlı form ya da oksidasyon basamağına göre biyokimyasal etkilerini gösterirler (Michalke 2006). Elementlerin kimyasal formları toksisite ve biyoyararlılık açısından önemli olduğundan geçmişte potansiyel yarar-zarar belirlemede toplam element tayinleri kullanılırken; günümüzde pek çok araştırmacı tarafından bunun tek başına yetersiz olduğu ve yaşayan organizmalara etkilerinin tam olarak anlaşılmasında, türlerin tespit ve kantitatif tayinlerinin gerekli olduğu kabul görmüştür (Rosen ve Hieftje 2004). 3 2.2. Türlendirme/Fraksiyonlamanın Tanımı ve Analitik Kimyadaki Yeri Türlendirmeye ilişkin temel kavramlar ve tanımlar aşağıda özetlenmiştir (Templeton ve ark. 2000): Türlendirme analizleri; örnekteki bir veya daha fazla kimyasal türün tespit veya kantitatif ölçümlerine ilişkin analitik işlemlerdir. Kimyasal tür; elementin, izotopik bileşim elektronik/oksidasyon durumu, ve/veya kompleks ya da moleküler yapısı ile tanımlanan özel formudur. Element türlendirmesi, türlendirme; ilgili elementin bir sistemde tanımlanan kimyasal türler arasındaki dağılımını ifade eder. Türlendirme analizleri; kimyasal bileşiklerin biyojeokimyasal çevriminde, seçilen elementlerin toksisite ve ekotoksisitelerinin belirlenmesinde, gıda örneklerinin kalite kontrolünde, tıbbi ve farmakolojik ürünlerin kontrolünde, teknolojik süreç kontrolünde, sanayi kuruluşlarının çevreye etkilerinin araştırılmasında, meslek hastalıkları boyutunda maruz kalmaların değerlendirilmesinde ve klinik analizlerde kritik öneme sahiptir (Kot ve Namiesnik 2000). Türlendirmenin hitap ettiği temel alanlar aşağıda şematik olarak verilmiştir (Rosen ve Hieftje 2004). Şekil 2.2.1. Türlendirme analizlerinin önemli olduğu uygulama alanları (Rosen ve Hieftje 2004’den değiştirilerek alınmıştır) Temel türlendirme analizleri dört şekilde uygulanabilmekte olup; bu alanlar Çizelge 2.2.1’de verilmiştir. Kimyasal analiz ile ilişkili kısım ise ayrıntılı olarak Çizelge 2.2.2’ de görülmektedir (Kot ve Namiesnik 2000). 4 Çizelge 2.2.1. Temel türlendirme analiz çeşitlerinin kısa karakteristikleri (Kot ve Namiesnik 2000’ den özetlenerek alınmıştır) Türlendirme Açıklamalar Örnekler Analizi Çeşidi Tarama Türlerin, kirlilik boyutunda (toprak Eser element analizleri Türlendirmesi su veya hava) özellikle çevresel (çözünmüş veya askıda örneklerde fiziksel veya kimyasal kalan fraksiyon) ve bunların olarak belirlenmesidir. farklı formlarının ardışık ekstraksiyon sonrası toprak veya çökellerde belirlenmesi, çökellerde, deniz suyunda tributil kalay tayini, dokuda metil cıva belirlenmesi Grup Belirli oksidasyon basamağında ve Elementel, inorganik veya Türlendirmesi belirli bileşik yapısındaki organik cıva bileşiklerinin elementin bağlı bulunduğu yapının tayini belirlenmesi şeklindedir. Dağılma Genellikle biyolojik örneklerin Serumda eser element, Türlendirmesi analizi ile ilişkilidir. bitkide ağır metal tayini Bireysel En zor türlendirme çalışmaları bu Kimyasal türlerin Türlendirme gruba girer. Fraksiyonlama ve moleküler, kompleks, ayırma teknikleri önemlidir. elektronik veya nükleer Kromatografi ve ikili teknikler ön yapılarının belirlenmesi plana çıkmaktadır. 5 Şekil 2.2.2. Kimyasal analiz alanı ile ilişkili türlendirme analizi çeşitleri (Kot ve Namiesnik 2000) Bazı durumlarda kimyasal türlerin belirtilmesinde türlendirme kelimesinin kullanımındaki sınırlılık söz konusudur veya çok fazla sayıda tür bulunmakta olup; bunların matriksteki toplam derişimi verecek şekilde tek tek belirlenmesi çok zordur (Templeton ve ark. 2000). Örneğin; metaller farklı ve kompleks gıda bileşenlerine bağlı olabilir, biyoligandlar ile kompleksleşmiş halde bulunabilir (Pohl 2007, Pohl ve Prusisz 2007). İlgili türlerin analitik prosedür veya ölçüm metodundan kaynaklanan kararsızlığı, pH değişimleri veya kompleksleşme gibi etkiler ile ölçüm metodunun duyarlılığındaki sınırlılık türlerin belirlenmesinde zorluğa neden olabilir. Belirlenmek istenilen tür kararlı olsa da inert olabilir. Bu durumda fraksiyonlama pratik bir uygulama olarak karşımıza çıkmaktadır. Fraksiyonlama; belirli bir örnekteki analit veya analit grubunun fiziksel (örneğin boyut veya çözünürlük) veya kimyasal (örneğin bağlanma ve reaktiflik) özelliklerine göre sınıflandırılması işlemidir (Templeton ve ark. 2000). Yukarıdaki veriler ışığında fraksiyonlama çalışmalarının pratik uygulamaya dönüşmesinin temel nedenleri tarafımızdan aşağıdaki şekile dönüştürülmüştür (Şekil 2.2.3). 6 Şekil 2.2.3. Fraksiyonlamanın başlıca uygulanma nedenleri 2.3. Türlendirmede İkili Teknikler Türlendirmenin başarısı iki faktöre bağlıdır: seçicilik (sadece belirli bir türün belirlenmesi) ve duyarlılık (ölçüm metodunun analit seviyesini yakalayabilmesi). Bu iki faktörün sağlanması ile ilgili büyük bir yenilik; kromatografi veya elektroforez tekniğinin kesiksiz olarak element seçici bir dedektöre (atomik absorpsiyon, emisyon, floresans veya kütle spektrometri, indüktif eşleşmiş plazma veya mikrodalga indüklenmiş plazma gibi) bağlanmasıdır (Kot ve Namiesnik 2000). Analitik kimyacılar, son otuz yıllık süreçte toplam element derişiminin; taşınım, biyoyararlılık ve bunun sonucunda elementin ekolojik sistem veya biyolojik organizmalar üzerindeki etkileri ile ilgili istenen bilgiye ulaşmada yetersiz kaldığını anlamışlardır. Element türlendirme analizleri belirli bir örnekteki farklı elementlerin türlendirmesine imkan verirken gerçek etkileşimlerini de yansıtmalıdır. Bu, kolay ulaşılır bir durum değildir. Bu nedenle ayırma ve ölçüm yöntemleri kadar; örnek alma, saklama ve hazırlama ile ilgili yeni yaklaşımlar da ortaya çıkmıştır. Son zamanlarda tek başına türlendirmede gösterdikleri sorunlara karşı ayırma ve tespit yöntemlerinin birleştirildiği ve iyileştirildiği metotlar gündeme gelmektedir. Bu tekniklerin birleştirilmesinde ve kalite kontrol stratejilerinde yeni metodolojik gelişmeler de gerekli görülmektedir (Michalke 2003). Kompleks örnekler, bir ayırma tekniğinden yararlanmaksızın analiz edilemezken; ayırma metotları için yaygın olarak kullanılan pek 7 çok dedektör de elemente özgü bilgi vermemektedir. Bu nedenle farklı ikili teknikler geliştirilmiştir (Rosen ve Hieftje 2004). Bu tekniklerde türler mümkün olduğunca seçici olarak ayrılır ve sonrasında yine seçici olarak ölçülür (Michalke 2003). İkili tekniklerin gelişim periyodu incelenecek olursa; 1970’lerin sonunda ilk kez Van Loon ve Suzuki tarafından gaz kromatografisi (GC) ve sıvı kromatografisi (LC)’ nin elemente özgü dedektörler ile birlikte kullanılmasının öncülük ettiği çalışmalar, kromatografik ayırım ve duyarlı element seçici dedektörlerin birleştirilmesi ile türlendirmeye bir kapı açmıştır (Montes-Bayon ve ark. 2003, Rosen ve Hieftje 2004). Başlangıçta atomik absorpsiyon (AA), atomik floresans (AF) ve atomik emisyon (AE) teknikleri ile kombinasyonlar, yerini son yıllarda, kütle spektrometresinin kullanımına bırakmıştır. Özellikle HPLC-ICP-MS türlendirme çalışmalarında rutin olarak kullanılır hale gelmiştir. Ayrıca; ayırma tekniği olarak türevlendirme yapılmadığında sadece uçucu bileşiklere yönelik olan GC, ya da yüksek hızda ayırma etkinliği ve düşük örnek hacimlerine yönelik olarak avantaj sunan kapiler elektroforez (CE) de HPLC’ye alternatif olarak kullanılabilmektedir. ICP-MS, HPLC veya CE ile birleştirilerek element seçici belirlemelerde yaygın olarak kullanılırken; moleküler seçici belirlemelerde de elektrosprey iyonlaştırma-kütle spektrometresinden (ESI-MS) yararlanılmaktadır (Rosen ve Hieftje 2004). LC, ikili tekniklerden indüktif eşleşmiş plazma (ICP) torç sistemine belki de en kolay adapte edilebilenidir. Genellikle LC-ICP-MS’deki temel problemler mobil (hareketli) faz ile ilgilidir. LC hareketli fazındaki tuz ve organik çözgen içeriği minimum düzeyde tutulmalıdır. Belirleme limiti (veya nitel belirleme limiti, LOD) yeterince düşük olmayabilir ve LOD’yi artırmak için uygun sisleştiriciler kullanılmalıdır. LC’ den farklı olarak GC bağlantısı için tamamen ısıtılmış bir arayüz ve gaz örneğin iletimi açısından da uygun aparatlar gerekirken; arayüzde karbon birikiminin önlenmesi için de taşıyıcı bir gaza ihtiyaç olabilir. CE’ de bağlantı GC veya LC ye göre daha zor olup düşük ölü hacimli arayüz gerekir; zira burada örnek akış hızı dakikada 0,5 µL’ den genellikle az olmaktadır. Ticari arayüzeyler olsa da kurum içi tarzında geliştirilenler daha çok kullanılmıştır. CE’ye dayanan ikili teknikte mutlak LOD düşüktür. Metal veya 8 metaloidler tespit edilemezken metaloprotein gibi makromoleküler ölçümler hedeflenmektedir (Dressler ve ark. 2011). LC-ICP-MS ikili tekniğinin analiz boyutunda tarihçesi alevli atomik absorpsiyon spektrometresi (AAS), elektrotermal atomik absorpsiyon spektrometresi (ETAAS) ve indüktif eşleşmiş plazma-atomik emisyon spektrometresi (ICP-AES)’ e uzanmaktadır; fakat ne HPLC-AAS; ne de HPLC-ICP-optik emisyon spektrometresi (OES), biyolojik ve çevresel örnekler açısından kıyaslandığında ICP-MS kadar gündeme gelmemiştir (Montes-Bayon ve ark. 2003). ICP-MS dışında atomik absorpsiyon spektroskopisi veya ICP-AES gibi optik spektrometrik teknikler kullanılabilir olsa da AA, eş zamanlı çoklu element tayinine imkan vermezken; ICP-AES’ in duyarlılığı da ICP-MS’e ulaşamamaktadır. ICP-MS, düşük belirleme limitleri, makro ve eser bileşenlerin aynı seyreltme ile belirlenmesine imkan verecek geniş dinamik aralığı ve çoklu element tayin imkanı ile önemli bir ölçüm tekniği haline gelmiştir. (Rosen ve Hieftje 2004). Zira ICP- MS 1980’ lerin ortalarında devreye girdiğinde, analitik veri karakteristikleri açısından performansının çok daha iyi olduğu görülmüştür. HPLC-ICP-MS’ e yönelik ilk çalışmalar 1986’larda Houk ve ark. tarafından yayınlanmıştır. Günümüzde HPLC dolgu maddelerindeki çeşitlilikle de ters faz, boyut eleme, iyon değişimi ve kiral çalışmalar yapılabilmektedir (Montes-Bayon ve ark. 2003). HPLC’nin ayırma mekanizmaları çeşitliliği ile çok sayıda önemli çevresel ve biyolojik örneklere uygulanabilmesi ayrıca; duyarlılığı yüksek ve sağlam (çevre şartlarından az etkilenen) ticari ICP-MS cihazlarının bulunabilmesi ile HPLC-ICP-MS tekniği, ikili teknikler arasında en iyi kombinasyonlardan biri haline gelmiştir (Montes-Bayon ve ark. 2003). HPLC için ayırma mekanizmaları ve türlendirme analizlerinde bazı uygulamaları Şekil 2.3.1’ de görülmektedir. 9 Boyut Anyon Eleme Ters-faz değişimi Polisakkaritler Fitoşelatinler Polipeptit izoformları Metaloenzimler… vb. Polipeptit alt-izoformları Organoselenyum, organoarsenik Organoselenyum, organoarsenik Redoks basamakları… vb. Metaloporfirinler… vb. Katyon İyon çifti değişimi HPLC-ICP-MS Şekil 2.3.1. HPLC’de ayırma mekanizmaları ve türlendirme analizlerindeki bazı tipik uygulamaları (Szpunar 2000’ den değiştirilerek alınmıştır) HPLC-ICP-MS ikili tekniğinde mangan açısından ve HPLC kısmında karşımıza yaygın olarak boyut eleme kromatografisi (SEC) çıkmaktadır (Quintana ve ark. 2005, Quintana ve ark. 2006, Michalke ve ark. 2007, Arias-Borrego ve ark 2008, Michalke ve ark. 2013, Rybak ve Ruzik 2013). İkili tekniklerde SEC, proteince zengin matrikslerde metaloprotein veya düşük molekül kütleli metal şelatları gibi sınırlı kararlılıktaki türlerin ayrılması için uygun görülmektedir. Diğer sıvı kromatografi tekniklerine göre ayırmada daha az etkili olsa da uygulama kolaylığı, hareketli faz bileşimine uygunluk ve element türlerinin molekül kütlelerinin tahminine imkan vermesi nedeni ile avantajlı görülmektedir. SEC ile, biyolojik sıvılar ve gıda matriksleri gibi örneklerde özellikle element türlerinin fraksiyonlama çalışmalarında önemli bilgiler elde edilebilmektedir (Koplik ve ark. 2002). Türlendirmede HPLC veya LC’ nin ICP-MS ile birlikte kullanımına dayalı çalışmaların sayısal olarak yıllara göre değişim grafiği tarafımızdan çizilerek Şekil 2.3.2’de verilmiştir. 10 Şekil 2.3.2. HPLC-ICP-MS veya LC-ICP-MS ikili teknikleri ile ilgili yayın sayılarının yıllara bağlı değişimi Element seçici ölçüm yöntemlerinin doğrudan ayırma metotlarına bağlanması sonucu ikili teknik halinde kullanımı; kesikli sistemlere göre daha kolay ve hızlı olarak sonuca götürmektedir (Michalke 2003). Şekil 2.3.3’ de türlendirme çalışmalarında yaygın olarak kullanılan ikili teknikler, bunlar arası ilişkiler ile arayüz şematik olarak özetlenmiştir (Michalke 2003, Anonim 2012). Şekil 2.3.3. Türlendirme analizlerinde kullanılan teknikler ve bu teknikler arası ilişkiler (Anonim 2012a (solda) ve Michalke 2003’den (sağda) değiştirilerek alınmıştır. Şekil 2.3.4’ de HPLC’nin ICP-MS ile birleştirilmesine ilişkin şekilsel gösterim (Maher ve ark. 2012) verilmiştir. 11 HPLC kolonu Alet kontrolü ve veri değerlendirme ICP-MS sistemi HPLC sitemi sistemi Şekil 2.3.4. HPLC-ICP-MS ikili tekniğinin şekilsel gösterimi (Maher ve ark. 2012) Çevre, sağlık-beslenme ve biyoorganik kimya alanları ile ayrı ayrı ilişkilendirilen türlendirme çalışmalarında farklı ikili tekniklerin sağladığı faydalar Şekil 2.3.5’de özetlenmiştir (Rosen ve Hieftje 2004). Şekil 2.3.5. Türlendirme analizlerine çeşitli analitik tekniklerin katkısı ve bu teknikler arası ilişkiler (Rosen ve Hieftje 2004’den değiştirilerek alınmıştır) 2.3.1. HPLC-ICP-MS kesiksiz bağlantısı ve “Chromera” yazılımı HPLC veya LC-ICP-MS ikili tekniği; literatürde yaygın olarak bulunmaktadır. Bu -1 bağlantı nispeten kolaydır; zira kolondan çıkan mL dk büyüklüğündeki akış hızları, ICP-MS geleneksel sisleştiricilerinin optimum koşullarda çalışması için gerekli sıvı alımına uygundur (Alvarez-Llamas ve ark. 2005). Bu amaçla; HPLC kolon çıkışından 12 dar bir politetrafloretilen veya benzer malzemeli inert bir materyal ile ICP-MS sisleştiricisine fiziksel olarak bağlanabilir (Larsen 1998). Buradaki sınırlılık organik çözgen kullanımı ve gradiyent elüsyondur (Larsen 1998, Alvarez-Llamas ve ark. 2005). Özellikle terz fazda görülen yüksek organik içerik; plazma kararsızlığı ve torçun enjektör kanalında, sampler ve skimmer konilerinde karbon birikmesine yol açabilir. Aynı zamanda yüksek tuz içeriği de sisleştirici ve konilerde tuz birikmesine ve duyarlılık kaybına yol açabilir. Bu nedenle ayırım için gerekli hareketli faz kesiksiz bağlantıda ICP-MS dedektörüne uygun olmayabilir (Alvarez-Llamas ve ark. 2005). Ayrıca; organik çözgen, püskürtme haznesi (sprey odası)’ nin duvarlarına yapışabilir. İzokritik elüsyonda mobil faz bileşiminin örneğin her yerinde aynı olması avantaj olarak görülmektedir (Larsen 1998). Kullandığımız “Chromera” yazılımı, türlendirme çalışmalarına özgüdür. HPLC ve ICP- MS arasındaki kesiksiz bağlantıyı sağlamakta ve iki cihaz da bu yazılım üzerinden çalıştırılabilmektedir. Ayrıca yazılım, ICP-MS ve HPLC arasındaki çevirici valfi de kontrol eder. Bu valf sayesinde ICP-MS analize hazırlanırken HPLC kolonu da şatlandırılabilmekedir. Yani, doğrudan ICP-MS ya da doğrudan HPLC’den atığa geçme pozisyonları mevcuttur. Bununla birlikte analiz sonunda kolon temizlenirken; ICP-MS de ayrıca kapatmaya hazır hale getirilebilmektedir. Çevirici valfe ait şematik görünüm tarafımızdan çizilerek Şekil 2.3.1.1’ de verilmiştir. Valfin iki konumu vardır. Bir konumunda HPLC’den atığa; iki konumunda ise HPLC’den ICP-MS’e iletim söz konusudur. Kullanılan yazılım ile ICP-MS ve HPLC şartları ayarlanabilir. Her iki cihaz da bu yazılımdan çalıştırılıp kontrol edilebilir, çalışılacak izotoplar seçilebilir ve bunlara ait türler belirtilebilir, analiz öncesi temel çizgi incelenebilir ve sonrasında analiz gerçekleştirilebilir. 13 Şekil 2.3.1.1. HPLC-ICP-MS ikili tekniğinde cihazlar arasındaki çevirici valfin şematik gösterimi 2.4. Kesiksiz (On-Line) Tekniklerin Avantajları ve Sınırlılıkları Bir ayırma sisteminin doğrudan element seçici dedektöre bağlandığı kesiksiz birleşik tekniklerin avantajları şöyle özetlenebilir (Michalke 2002): Bu teknikler daha az zaman alıcıdır, kesikli sistemlere göre daha hızlı sonuç verir. Böylece daha az emek ve masraf gerektirir, otomasyona elverişlidir. Fraksiyonların toplanmasına ve saklanmasına gerek yoktur; böylece saklanma sırasındaki türlerin kararsızlığı veya kaybı, kirlilik problemleri, saklama kaplarına örnek adsorpsiyonu gibi tipik problemler egellenmiş olur. Sonuç olarak daha az kirlilik ve kayıp muhtemeldir. Bakteriyel oksidasyon ve parçalanma azalır. Genellikle, tekrar elde edilebilirliği yüksek sonuçlar elde edilir. Bununla birlikte bazı sınırlılıklar da söz konusudur: Kesikli modda toplanan fraksiyonlar ile kalite kontrol daha kolay uygulanır. Girişimlerden uzak optimum ayırma ve belirleme ile yeterli sinyal/gürültü oranı arasında uyum sağlanmalıdır. Genellikle ayırma veya belirleme bu nedenle optimize edilmez. Tampon derişimi, tuz yükü, organik matriks düzenleyici yüzdesi veya düşük akış hızları ile ilgili ayırma ve ölçüm ihtiyaçlarına cevap verecek uygun arayüz gereklidir. Hareketli fazın tuz yükü iyonizasyon değişimlerine yol açarken; organik düzenleyiciler de plazma kararsızlığı, karbon birikimi ve iyonizasyon karakteristikleri ile ilgili problemlere neden olabilmektedir. ICP-MS transfer arayüzünde pik genişlemesi ve akış hızları ile ilgili problemler ile de karşılaşılmaktadır. Bu nedenle kromatografik ayırımı sağlamak/korumak için arayüzün ölü hacmi yüksek olmamalıdır (Michalke 2002). 14 Montes-Bayon ve ark. (2003) tarafından yapılan bir araştırmada HPLC-ICP-MS ikili tekniğine dair avantaj ve dezavantajlar belirtilmiştir. Bu ikili teknikte hareketli faz bileşimi ve akış hızı oldukça önemlidir. Organometalik türlerin tayininde önemli olan sıvı kromatografı teknikleri; ters-faz (RP), ters faz iyon çifti (RP-IP), boyut eleme (SEC), iyon değişimi (IEC) ve kiral kromatografi (CC) olarak önerilmektedir. RP, dolgu maddesi kararlılığı ve basitliği nedeniyle avantajlı görülürken; pek çok organik düzenleyicilerin ICP-MS için uygun olmayışı problem teşkil etmektedir. Normalde sadece çok düşük yüzdelerdeki metanol ve etanol uygun görülürken; son zamanlarda kullanılan mikrosisleştiriciler ile asetonitril gibi organik düzenleyiciler verilebilmekte ve böylece bu sınırlılık aşılmaya çalışılmaktadır. RP-IP’ nin avantajı çok yönlülüğüdür. Örneğin; tek bir kromatografik analizde kısa sürede ve iyi tekrar elde edilebilirlik ile yüklü ve yüksüz türlerin ayırımına imkan vermektedir. Sınırlılığı ise kullanılan bazı iyon çifti oluşturucu reaktifler için silika temelli kolonlarda degradasyon problemleri olabilmesidir. SEC’in (veya jel geçirgenlik kromatografide) temel dezavantajı ise kullanılan çözgenlerden kaynaklanan yüksek tuz içerikleridir. IEC, gradiyent çalışmalar söz konusu olduğunda kompleks ayırmalar için uygun görülse de zaman alıcı olmakla birlikte (bir analiz bititğinde kolonun yeni molil faz ile şartlanması gerekmektedir); ayrıca mobil faz bileşimdeki değişimler zemin sinyali ve duyarlılıkta değişimine neden olabilmektedir. Kiral çalışmalar farmakoloji endüstisinde optik izomer ve enantiyomerlerin ayırımına imkan verse de literatürde çok az uygulama bulmuştur. 2.5. Türlendirme/ Fraksiyonlama ve Biyoyararlılık İlişkisi Gıdalarda sağlık açısından risk değerlendirmesinde genellikle metalin toplam miktarı temel alınır; fakat bu miktarlar biyoyarar fraksiyonu her zaman yansıtmayabilir (Moreda-Pineiro ve ark. 2012). Böylece toplam element içeriği, biyoyararlılığı; yani sindirim sırasında absorbe edilip metabolik aktif türlere çevrimi hakkında bilgi vermez (Cabanero ve ark. 2004). Çevrim ile ilgili şematik gösterim Şekil 2.5.1’de verilmiştir (Bernhard ve ark. 1986). 15 Şekil 2.5.1. İnsan ve gıda zincirinde metal hareketliliği (Bernhard ve ark. 1986’ dan değiştirilerek alınmıştır) Toksikolojik açıdan bakıldığında ise toplam metal derişimi değil; biyolojik ligandlar ile etkileşime girebilecek formlar önemlidir. Bu alandaki in-vivo çalışmalar pahalıdır, daha az yaygındır, uygulanması ve bazı parametrelerin deney sırasında ölçümü zordur; ayrıca etik olarak tartışma konusudur. in-vitro çalışmalar ise basit, hızlı, ucuz ve kesin yöntemler olup canlı sistemler üzerinde yapılan denemelere alternatif sunar. Bu metotlar mide veya bağırsak şartlarının simülasyonuna dayanır (sıcaklık, pH, enzim, kimyasal bileşim ve karıştırma gibi) ve çözünür sindirim ürünleri elde edilir (Cabanero ve ark. 2004, Moreda-Pineiro ve ark. 2012). Biyoyararlılık; gıdalar, gıda bileşenleri ve gastrointestinal şartlara bağlı olarak değişir; ayrıca sindirim, absorpsiyon, taşınım, kullanım ve atılma gibi süreçlere bağlıdır (Dominguez-Gonzalez ve ark. 2010) Biyoyararlılığı belirten bir yol, mide ve bağırsaklarda parçalanma veya absorpsiyon sırasında ne kadar metal serbest kaldığının (gastrointestinal olarak gıdadan çözünmüş faza geçen metal miktarının) belirlenmesidir (Moreda-Pineiro ve ark. 2012). Bilimsel literatürde yaygın olarak kullanılan biyoyararlılık kavramı ile ilgili disiplinler arası farklılıkları önlemek için bazı tanımlamalar getirilmiştir. Buna göre; biyoyararlılık (veya mutlak biyoyararlılık) yeme, solunum veya deri yoluyla alınan ve sistematik döngüye giren ya da basitçe bağırsaktan absorbe edilen fraksiyonu tanımlarken; biyoerişilebilirlik ise in-vitro yaklaşımlarda başvurulan bir terim olup gastrointestinal alannda çözünmüş ve absorpsiyona elverişli bileşik fraksiyonudur. Her ikisi de in-vitro ve in-vivo olarak çalışılabilir (Rostami ve Juhasz 2011, Moreda-Pineiro ve ark. 2012). 16 Biyoyararlılık-biyoerişilebilirlik terimlerinin toprak veya çökel kirleticilerinden organizmaya uzanan süreçte şekilsel gösterimi Şekil 2.5.2’de belirtilmiştir (Naudi ve ark. 2008). Şekil 2.5.2. Biyoyararlılık ile ilgili terimlerin şematik gösterimi (Naudi ve ark. 2008’ den özetlenerek alınmıştır) Enzimatik in-vitro yaklaşımlarda, enzim etkisi ile meydana gelen parçalanma-çözünme işlemleri in-vivo şartlarına benzetilir. Hidrolaz ve proteaz (pepsin ve pankreatin) yardımı ile gıdaya uygulanan ardışık in-vitro işlemlerden sonra elementlerin çözünür miktarları ölçülür ve bu miktar biyoerişilebilirliğin bir ölçüsüdür. Bu işlemlerde de validasyon önemlidir. Ayrıca in-vitro metotlar IUPAC tanımlamasına göre türlendirme metotları değildir; zira burada aslında herhangi bir tür tespit ve tayin edilmemektedir (Khouzam ve ark. 2012). 2.6. Gıdalarda Metal Analizleri Metabolik işlevlerdeki rolleri ve dolayısı ile insan sağlığına etkileri bakımından çevre ve biyolojik örneklerdeki metal tayinleri önem arz etmektedir (Grotti ve ark. 2006). Sağlık için gerekli vitamin ve mineral kaynağı olan gıdalar, geniş bir derişim aralığında lüzumlu veya toksik özellikteki metalleri içerebilmektedir (Demirel ve ark. 2008). Bu 17 açıdan kolay, hızlı ve doğru örnek hazırlama işlemleri; eser elemet tayininin duyarlı, hızlı ve rutin analize elverişli olması açısından önem arz etmektedir (Grotti ve ark. 2006). Metabolik açıdan önemli elementlerden sadece birkaçı doğal olarak ve sabit düzeyde bulunurken; diğerleri farklı şekillerde ve farklı miktarlarda bulunmaktadır. Bunlardan oksijen, karbon, hidrojen ve azot en bol bulunan yani makro elementler olup vücut ağırlığının % 93’ ünü oluştururken; kalsiyum, fosfor, kükürt, silisyum, stronsiyum gibi yapısal mikro elementler ve sodyum, potasyum, magnezyum, klorür gibi elektrolit görevli elementler toplam hücresel ağırlığın küçük bir miktarını (% 5) oluştururlar. Demir, bakır, çinko, mangan, kobalt, nikel, molibden, selenyum, iyodür, florür, kalay ve vanadyum gibi hücre içeriğinin % 1 ini oluşturan ve yaşam için gerekli elementler de bulunmaktadır. Arsenik, kadmiyum, krom, cıva ve kurşun gibi elementler çevresel kirlilik kaynaklı iken; antimon, bizmut, lityum, altın, platin gibi bir kısım element de sadece özel işlemler için vücuda alınmaktadır. Alüminyum, bor, baryum bromür gibi bazı elementlerin biyolojik aktiviteleri de araştırma konusudur (Burguera ve Burguera 2009). Günümüzde kullanılan çoğu analitik ölçüm; analiz öncesi, gıda matriksinin parçalanmasına dayalıdır. Bu amaçla da kuru kül etme, yaş yakma veya mikrodalga parçalama basamaklarına gerek duyulmaktadır. Bu basamaklarda tek başına bir çözgen kullanılabildiği gibi; HNO3–H2O2, HNO3–HCl, HNO3–H2SO4 gibi reaktif karışımları da kullanılabilmektedir (Demirel ve ark. 2008). Türlendirme çalışmaları açısından bakıldığında da gıda matriksinde en önemli sorun örnek hazırlama basamağındadır. Gıdalar da biyolojik matriksler gibi karmaşık yapıda olup; doğrudan analizleri zordur. Gıdanın katı, sıvı yapıda olması veya yağ içeriği önemlidir. Türlendirme için örnek hazırlama ve analiz sırasında kompleks türlerin kararlılığı önemlidir; fakat metilasyon, hidrolizasyon veya mikroorganizma etkileri ile oksidasyon basamakları değişebilir. Örneğin mikroorganizmalar, bazı kompleks bağları koparabilir; bu da materyal profilini değiştirir. Biyometilasyon da uçucu formlar oluşturabilir ve örnek hazırlama sırasında kayıplara neden olabilir. Seyreltme kararsız 18 formun oksidasyonuna neden olabileceği gibi; dondurma işlemi de protein denatürasyonuna yol açabilir. Katı örneklerde ekstraksiyon, çözme, çözünürleştirme veya katı sıvı ekstraksiyonu örnek hazırlama yöntemleri olarak kullanılabilir. Bitkisel kaynaklı gıdalarda en kullanışlı yöntem su veya tampon çözelti ile yapılan çözgen ekstraksiyonu ve sonrasında da santrifüjleme işlemidir. Sıvı örnekler de yağlı ve yağsız olarak sınıflandırılabilirken burada da sıvı sıvı ekstraksiyon, katı faz ekstraksiyon veya bulutlanma noktası ekstraksiyonu uygulanabilir (Ruzik 2012). 2.6.1. Metal analizleri için kullanılan örnek hazırlama ve analiz yöntemleri Çoğu organik ve inorganik matrikslerde aletli analiz öncesi kısmi veya tam çözünürleştirme ile örnek hazırlama gereklidir (de Oliveira 2003); zira AAS, grafit fırınlı atomik absorpsiyon spektrometresi (GFAAS), ICP-OES veya ICP-MS’ te örnekler sıvı formda ölçülür. Yaş ve kuru kül etme yöntemleri uzun ve yavaştır. Bu nedenle mikrodalga ile mineralizasyon daha çok kabul görmüştür (Tuzen 2002). Örnek hazırlama tüm analiz süresinin % 61–80’ ini oluştururken toplam analiz hatasının yaklaşık % 30’unun da nedenidir (de Oliveira 2003, Buszewski ve Szultka 2012) Gıdalarda metal tayininde örnek hazırlama için; kuru kül etme, yaş yakma, mikrodalga parçalama, ultrasonik ekstraksiyon, bulamaç oluşturma, doğrudan katı örnekleme gibi teknikler kullanılabilmektedir (Korn ve ark. 2008). Seyreltme, çöktürme, filtrasyon, santrifüjleme gibi ön basamaklar ile en iyi ayırma; ayrıca belirleme yöntemleri kullanılsa da genellikle analiti matriksten ayırmak ve zenginleştirmek için ekstraksiyon gerekir. Bu bağlamda en yaygın kullanılan örnek hazırlama yöntemi sıvı sıvı ekstraksiyon (LLE) iken alternatif olarak katı faz ekstraksiyonundan da yararlanılabilmektedir (Buszewski ve Szultka 2012). Sıvı sıvı ekstraksiyon zaman alıcı ve fazla miktarda toksik organik çözgen kullanımı açısından oldukça zararlıdır. Özellikle kromatografik analizlerde daha hızlı, basit, ucuz ve çevre ile dost tekniklerin kullanımı önemlidir. Bu kapsamda yeni yaklaşımlar ise LLE’ ye alternatif olarak ultrasonik ekstraksiyon (UAE), mikrodalga yardımlı ekstraksiyon (MAE), katı faz ekstraksiyon (SPE) ve mikroekstraksiyon tekniklerinin kullanılmasıdır (Cobzac ve Gocan 2011). 19 Yaş parçalama yöntemlerinde yükseltgen asitler kullanılarak organik yapı parçalanır ya da inorganik matriksten metal ekstrakte edilir. Genellikle derişik nitrik asit ve ısı uygulanır. Asidin gücü, oksitleyici veya kompleksleştirici etkisi, kaynama noktası, oluşan tuzların çözünürlüğü, kullanım güvenirliği ve saflığı önemlidir. Yaş yöntemlerde termal, ultrasonik veya radyasyon enerjisi (infrared, ultraviyole ve mikrodalga) kullanılabilir (de Oliveira 2003). Örnek hazırlamada kullanılan asit tipi ölçümlerde de önemlidir. Yaygın olarak bilinen atomik spektroskopik tekniklerde nitrik asit en çok tercih edilen reaktiftir. Örnek ve standartlarda aynı derişimde olmak kaydıyla % 10 (v/v) nitrik asit derişimi ve bazen de daha yükseğine kadar nitrik asit içeriği bile analitik bir probleme yol açmaz. Mineralizasyonda çoğunlukla kullanılan hidrojen peroksitin de analitik bir probleme yol açması nadiren görülür. Nitrik asit aromatik ve alifatik organik materyal ile reaksiyona girer. Oksidasyon, esterifikasyon, nitrasyon reaksiyonlarına yol açarak basit karboksilik asitler oluşturur. Bu asit yaklaşık 120 ºC’ de kaynar. Bu, hem ortamdan uzaklaşmasını kolaylaştıran hem de aynı zamanda etkinliğini kısıtlayan bir durumdur. Etkin oksidasyon için nitrik asit ile sülfürik asit (daha zor parçalanan materyal için), perklorik asit (nitrik asit uzaklaştırıldıktan sonra oksidasyonun devamı için) veya hidrojen peroksit kullanılabilir (Hoenig 2001). Yaş örneklemenin uygulanabilirliği gıda tipine de bağlıdır. Karbonhidratlar nitrik asit ile 180 ºC’ de kolaylıkla mineralize olurken; yağ, protein ve amino asitler nitrik asidin oksidasyon gücünün az olması nedeni ile tam parçalanmazlar. Bu durumda sülfürik asit ve perklorik asit kullanılabilir. Nitrik asit bazen % 10 (v/v) derişimden fazlasında ve örnek-kalibrasyon çözeltilerinin derişiminde benzerlik olması kaydı ile analitik bir probleme yol açmadan kullanılabilirken; hidroklorik asit ICP-OES için problem yaratmasa da GFAAS’ de analit klorürleri oluşabilmesi nedeni ile kullanımı sakıncalıdır. Sisleştiriciye dayanan ICP-OES, AAS veya ICP-MS’te ise sülfürik asit problem oluşturmaktadır (Korn ve ark. 2008). Yine ICP-MS’ te izobarik girişimleri en aza indirgemek için hidroklorik asit kullanımından kaçınılmaktadır (Hoenig ve Kersabiec 1996). 20 Örnek hazırlama sonrası analiz boyutunda öncelikle seçicilik olmalı ve belirleme limiti (dedektör duyarlılığı ve gürültü seviyesi) örnekteki düzeye uygun olmalıdır. İkili tekniklerde tür seçiciliğini sağlayan kısım kromatografi ya da elektroforez; element seçiciliğini sağlayan kısım ise atomik spektrometrik tekniktir. Tür seçici teknikler Mössbauer spektroskopi, X-ışınları fotoelektron spektroskopi veya elektron spin rezonans spektroskopi ya da elektrokimyasal teknikler, ultraeser seviyeler için gerçek örneklerde yetersiz kalmakta ve böylece yaş örnek hazırlama tekniklerini takiben ikili teknikler önem arz etmektedir. İkili tekniklerde türlendirme analizleri için de etkin örnek hazırlama işlemleri gerekir. Kromatografiden önce analitler matriksten ayrılmalı, ön deriştirilmeli, veya çoğunlukla türevlendirilmelidir (GC için). Bazı klinik örnekler (serum, idrar gibi) ya da endüstriyel örnekler sadece seyrelme ile doğrudan analizlenebilir. Gaz ve sıvı örnekler genellikle 0,45 mikrometrelik filtreden süzülür; çözünen ve partiküle faz olarak ayrılır. Katı örneklerde analit, örnek matriksinden ayrılmalıdır. Çözünürleştirme gibi teknikler de belli matriksler için yeterli olabilmektedir (Lobinski 1998). Türlendirme çalışmaları açısından ekstraksiyon tekniği, örnekte herhangi bir kirlilik ya da kayıp olmadan ve orijinal formu değişmeden analiti matriksten ayırmaya imkan vermelidir. Ekstraskiyon tekniği ve ekstraksiyon çözgeni seçilirken analitin kimyasal özellikleri, kimyasal formları, matriks ve analiz tekniği göz önüne alınmalıdır (Ruzik 2012). Türlendirme çalışmalarında kompleks örneklerdeki elementlerin biyoerişilebilirliği duyar analitik tekniklere olan gereksinimi artırır. GFAAS, ICP-OES, ICP-MS gibi teknikler bu anlamda önemli iken; doğrudan gerçek örneklere uygulamaları matriks etkileri nedeni ile sınırlıdır. Bu durumda GC ve HPLC ayırma tekniklerinin ICP-MS gibi dedektör işlevi gören cihazlar ile birlikte kullanılması da türlendirme çalışmalarında önemlidir (Burguera ve Burguera 2009). Günümüzde HPLC veya CE gibi ayırma tekniklerinin atomik spektrometrik teknikler (ETAAS veya GFAAS, ICP-OES veya ICP-MS) ile birlikte kullanıldığı birleşik teknikler görülmektedir. (Ruzik 2012). 21 2.6.2. Katı örneklerin çözünürleştirilmesi ve açık sistem örnek hazırlama Doğrudan katı örneklemeye müsaade eden lazer spektroskopik teknikler gibi (Sneddon ve ark. 2006) farklı analiz teknikleri bulunsa da (Hoenig ve Kersabiec 1996, Hoenig 2001, de Oliveira 2003) katı örnekler analiz gereksinimlerini karşılayamayacak kadar heterojendir (Srogi 2008). İyileştirilmiş kesinlik ve doğruluk katı matriksten ziyade çözülmüş, homojen örneklerde sağlanır (Sneddon ve ark. 2006) ve çözünürleştirme ile toplam analit geri kazanımı da artar (Hoenig ve Kersabiec 1996). Ayrıca metal tayinlerinde kullanılan çoğu ticari cihaz da optimum şartlarda, çözelti formu ile çalışmayı gerekli kılmaktadır. Bu nedenle atomik spektrometrik metotlarda (alev veya grafit fırınlı AAS, ICP-AES (çoğunlukla indüktif eşleşmiş plazma optik emisyon spektrometresi olarak da adlandırılır) ya da ICP-MS) genellikle katı örneklerin parçalanması veya çözünürleştirmesi gerekir. Böylece atomik spektroskopide örnek hazırlama hala önemli bir kısım olarak görülmektedir (Sneddon ve ark. 2006). Amaca yönelik olarak kullanılacak klasik metotlar arasında yaş veya kuru çözünürleştirme (kuru kül etme) metotları bulunmaktadır. Yaş yakma veya asit ile parçalama yöntemlerinde mineral asitler ile hidrojen peroksit gibi oksitleyiciler kullanılır. Ayrıca kullanılacak tekniğe göre asit seçimi de önemlidir (Sneddon ve ark. 2006). Örnek hazırlamada uzun yıllardır kullanılagelen açık sistemler, gıda gibi nispeten daha kolay matriksler için elverişli olup; bir-yirmi dört saat gibi sürelerde tam olarak parçalanabilen örnekler için uygun değildir. Ayrıca zahmetli, zaman alıcı olabilir ve uçucu analitlerin buharlaşarak kaybı ile sonuçlanabilir. Kapalı sistemler yüksek basınç sağlar; bu da yüksek kaynama sıcaklıklarına ve sonuç olarak da çoğu örneğin tam çözünürleşmesine imkan verir. Kapalı sistemlerin en yaygın kullanılan şekli, mikrodalga parçalama metotlarıdır (Sneddon ve ark. 2006). Klasik açık sistemlerde (atmosferik basınçta parçalama) çözünürleştirme işlemleri için genellikle cam veya PTFE (politetrafloretilen, teflon) bir kapta ve ısıtıcı üzerinde çalışılır. Bu amaç ile kurutulmuş veya yaş örnek mineralizasyonda kullanılacak kap 22 içine tartılarak, üzerine de reaktifler ilave edilir. Karışım kaynayıncaya dek ısıtılır. Isıtma süresi de örneğin tam parçalanmasına ve çözünmesine kadar devam eder. Soğutma sonrası çözelti bir balon jojeye aktarılarak hacim çizgisine tamamlanır. Çözünmeyen partiküler yapı kalıyor ise süzme veya santrifüjleme ile ortamdan ayrılır. Eğer bileşimi konusunda şüphe var ise ayrılarak farklı bir analitik işlem ile ayrıca çözülüp yine ayrı olarak analiz edilebilir (Hoenig 2001). 2.6.3. Mikrodalga yöntemleri Mikrodalga metotlarında elektromanyetik radyasyon ile parçalama gerçekleşir. Mikrodalgaların polar molekül ile etkileşmesi ile başlayan süreç sonunda; moleküllerdeki dönme hareketleri ve moleküller arası çarpışma ısı üretir. Mikrodalga parçalama hızı kullanılan asite de bağlıdır. Metot, açık sistem örnek hazırlamaya göre daha güvenlidir. Ayrıca programlanabilir ve pek çok örneğe de uygulanabilir (Sneddon ve ark. 2006) Mikrodalga parçalama yöntemlerinde genellikle HNO3, HNO3 + HCl, HNO3 + HCl + HF, HNO3 + H2O2, HNO3 + HF, HF + HCl, HNO3 + HClO4, ve kral suyu (aqua regia) gibi asit karışımları kullanılır (Srogi 2008). Mikrodalga tekniklerde mikrodalga radyasyonun örnek ile etkileşimi iyonik migrasyon ve dipol rotasyona neden olur. Bu da karışımın hızlı ısıtmayı takiben parçalanmasına yol açar. Yöntemin avantajı kısa süre gerektirmesi, örneğin ve reaktiflerin doğrudan ısıtılması (kaplar dolaylı olarak ısınmış çözelti ile ısınır), kirliliklerin en az düzeyde olması ve uçucu elementlerin kaybedilmemesi ya da kör örnek sinyalini düşürecek düzeyde az reaktif kullanımıdır. Bu teknikte sıcaklık ve güç programlaması yapılabilir. 5 Kullanılan bazı asitlerin atmosferik basınçta ve 7×10 Pa basınçta kapalı kaplarda kaynama noktaları ve atmosferik basınçları Çizelge 2.6.3.1’de verilmektedir. Biyolojik veya gıda örneklerinde nitrik asit ile hidrojen peroksit; viskoz yağlarda, polivinil klorür çipler, polipropilen, poliamid, polyester ve bazı gıdalarda (ıspanak, fıstık türevi vb.) sülfürük asit-hidrojen peroksit; inorganik materyal alaşımı, toprak ve çökellerde ise nitrik asit- hidroklorik asit gibi asit karışımları kullanılabilmektedir (de Oliveira 2003). 23 5 Çizelge 2.6.3.1. Derişik asitler ve kral suyunun atmosferik basınç ve 7×10 Pa basınçta kaynama noktaları (de Oliveira 2003’ ten özetlenerek alınmıştır) 5 Asit Derişim Atmosferik 7×10 Pa %, m/v Basınçta Basınçta Kaynama noktası Kaynama noktası HCl 37 110 140 HF 49 108 175 HNO3 70 120 190 HCl:HNO3 (3:1 v/v) (kral suyu) - 112 146 H2SO4 98,3 338 - H3PO4 85 150 - HClO4 72,4 203 - 2.6.4. Ultrasonik banyoya dayalı ekstraksiyon teknikleri Yaygın yaş yakma yöntemlerine alternatif yeşil analitik örnek hazırlama teknikleri olarak; bulamaç oluşturma, ultrasonik banyo veya ultrasonik prob ya da mikrodalgaya dayalı ekstraksiyon teknikleri ve enzimatik hidroliz teknikleri kullanılabilmektedir. Bunlardan ultrasonik banyoda yapılan ekstraksiyon, sıcaklık kontrollü veya sıcaklık kontrollü olmayan bir tank içinde gerçekleştirilir. Genellikle tankın altındaki ultrasonik dönüştürücü, ultrasonik enerjiyi sıvıya (genellikle ultra saf suya) transfer eder. Örnek hücresinin yatay veya dikey konumda olması da önemlidir; zira her noktadaki ultrasonik enerji aynı olmamaktadır. Bu durum reaksiyon hücresinin içi için de geçerlidir. Ayrıca, ultrasonik frekans ve güç yukarıda değinilen ve farklı ticari ultrasonik banyolardaki dönüştürücülere de bağlı olduğundan deneysel şartların karşılaştırılmasını zorlaştırır. Metal kirliliğini azaltan yapıda olan ultrasonik problar kullanıldığında yukarıda değinilen sorunlar ortadan kaldırılabilir. Prob, doğrudan reaksiyon hücresine daldırıldığından ultrasonik enerji de sadece reaksiyon ortamı tarafından absorbe edilir. Bu da etkinliği artırır. Ultrasonik banyoda metal geri kazanımını artırmak için sıcaklık da kullanılabilmektedir. Bu teknikte katı bir matriksten metal geri kazanımı eser element ve örneğin doğasına bağlıdır. Ayrıca analit ve matriks bileşenleri arası bağlar ve kullanılan asit çözeltisine bağlı olup sıcaklık da gerekli olabilmektedir (Moreda- Pineiro ve ark 2009). 24 2.6.5. Katı faz ekstraksiyonu Çevre, jeolojik veya biyolojik örneklerde yüksek miktarda olan ve girişim etkisi yaratan matriks bileşenleri yanında düşük derişimde bulun eser elementlerin analizi için çoğu kez matriksten ayırma ve zenginleştirme işlemleri gereklidir. Ayırma ve önderiştirme için de katı faz ekstraksiyon, sıvı sıvı ekstraksiyon, bulutlanma noktası ekstraksiyonu, sıvı membran, elektroanalitik teknikler, iyon değimi, mikrodalga ekstraksiyonu ya da birlikte çöktürme gibi yaklaşımların kullanılabileceği belirtilmiştir (Srogi 2008). Bunlar arasında katı faz ekstraksiyonu örneklerdeki analitin matriksten ayrılması veya önderiştirilmesinde basitliği yanında; düşük miktarda organik çözgen kullanımını ve yüksek zenginleştirme faktörlerine ulaşılmasını sağladığından en yaygın kullanılan örnek hazırlama tekniklerinden biridir (Zhang ve ark. 2011, Ramos 2012). Ticari olarak mevcut pek çok dolgu maddesinin varlığı da farklı kimyasal yapı ve polaritedeki analitler için bu örnek hazırlama tekniğini uygun hale getirir (Ramos 2012) . Bununla birlikte; analitik duyarlığı, seçiciliği ve kesinliği artıracak nitelikte yeni katı faz ekstraksiyon materyali arayışları ve geliştirilmesi de süregelmiştir (Zhang ve ark. 2011). Katı faz ekstraksiyonunda genellikle sıvı örnek hareketsiz durgun fazdan geçirilir. Sonrasında uygun bir çözgen ile ekstrakte edilir. Analit durgun faz (dolgu maddesi) ve sıvı hareketli faz arasında dağılır. Bileşenin durgun faza afinitesi örnek matriksinden daha büyük olmalıdır. Yöntem genellikle kolonun şartlandırılması, örnek yüklenmesi, yıkama ve örnek geri alınması olmak üzere dört basamaktan oluşur. Yıkama basamağı istenmeyen bileşiklerin uzaklaştırılması için gereklidir (Buszewski ve Szultka 2012). Katı faz ekstraksiyonuna ilişkin bu temel basamaklar tarafımızdan Şekil 2.6.5.1’ e dönüştürülmüştür. 25 a b c d e Şekil 2.6.5.1. Katı faz ekstraksiyonunun şematik gösterimi* *a: şartlandırma, b, c: örnek yükleme, d: yıkama, e: elüsyon 2.6.6. Gıdalarda atomik spektroskopi ile türlendirme analizleri Gıdalarda çeşitli miktarlarda ve tipik olarak altmıştan fazla element bulunabilir. Bu elementler genellikle iki gruba ayrılırlar: Temel tuz bileşenleri (K, Na, Ca, Mg, Cl, S, P ve C) ve eser elementler. Eser elementler genellikle 50 ppm’den azdır. Bunlar da besin değeri özelliği olanlar (Fe, Cu, I, Co, Mn, Zn, Cr, Ni, Si, F, Mo ve Se), besin değeri özelliği olmayan fakat toksik de olmayanlar (Al, B ve Sn) ya da besleyici olmayıp toksik olanlar (Hg, Pb, As, Cd ve Sb) olarak sınıflandırılabilirler. İlgili minerali içeren gıda maddesinin besin değeri özelliği sadece element içeriğine değil aynı zamanda ilgili elementin biyoyararlılığına da bağlıdır. Eser element türlendirmesi de biyolojik aktivitenin anlaşılmasında son derece önemlidir. Fakat lüzumlu/besleyici özellikteki elementler için türlendirme çalışmaları daha azdır (Ruzik 2012). Şekil 2.6.6.1’ de mangan ve bakır için 2003–2013 yılları arasındaki yayın sayıları tarafımızdan çizilerek gösterilmiştir. Gıdalar söz konusu olduğunda bu sayılara ulaşılamamaktadır. 26 45 40 35 30 mangan fraksiyonlama 25 mangan türlendirme 20 bakır fraksiyonlama 15 bakır türlendirme 10 5 0 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Şekil 2.6.6.1. 2003–04–27 ve 2013–04–27 tarihleri arasında mangan veya bakır türlendirmesi ve fraksiyonlaması ile ilgili yayın sayıları* * Web of Science verilerine göre elde edilmiştir. Anahtar kelimeler: (başlıkta) manganese speciation/fractionation veya copper fractionation/ speciation 2.7. ICP-MS ICP-MS, farklı örnek matrikslerinde eser ve ultra eser seviyede ve aynı anda pek çok ağır metalin hızlı tayinini sağlayan en duyarlı analitik tekniklerden biridir. (Rao ve Talluri 2007). 1983’ lerde ticari olarak piyasaya sürülen ICP-MS cihazı; örnek enjeksiyon kısmı, ICP kısmı, arayüz, kütle ayırma ve belirleme kısmı olmak üzere beş temel parçadan olşumaktadır ve bunlar da Şekil 2.7.1’ de görülmektedir (Ha ve ark. 2011) RF g güüç çk akyanyağnıa ğı Sprey odası (püskürtme Plazma torç Lensler Kütle analizörü İyon dedektörü haznesi) Argo Veri analizi n Sisleştiri Plazm Turbomoleküler pompa ci a Turbomoleküler pompa Örnek Mekanik pompa M(H2O)X + 2 MX2 MX M M Şekil 2.7.1. ICP-MS cihazının temel bileşenleri (Ha ve ark. 2011) 27 Örnek enjeksiyon kısmı sisleştirici ve püskürtme haznesinden oluşurken; bu kesim lazer ablasyon (LA), LC veya CE’ ye bağlanabilir. Enjektör sistemi sıvı örnekler için tasarlanmıştır. Bu nedenle örnekler oldukça saf asitler kullanılarak çözünürleştirilmelidir. Yüzey analizlerine olanak veren LA ile katı olarak analiz de mümkündür. Argan gazı ve radyofrekans (RF) güç ile plazma oluşturulur ve plazma sıcaklığı 6000-10000 K’e ulaşır. Burada örnek +1 yüklü iyonlarına çevrilir. Pozitif yüklü iyon oluşma mekanizması basitçe yukarıdaki şekilde (bkz. Şekil 2.7.1) -6 verilmiştir. Pozitif yüklü iyon akışı ICP (1,000 mbar) ve MS (10 mbar) kısımlarını bağlayan arayüze yönelir. Bu yönelmede sampler ve skimmer konileri ile iyon optikleri önemlidir. İyon optikler de iyonik olmayan türlerin, foton ve nötral türlerin dedektöre ulaşmasını engeller. Vakum düşük düzeyde tutulur. Soğutma ICP sıcaklığından koruma + amaçlıdır. Pozitif iyonlar Ar ve O ile bazı girişimlerin oluşmasına da yol açabilir. ICP- OES ile kıyaslandığında girişim yapan moleküllerin ayrılması önemlidir. Bunun için dinamik reaksiyon veya çarpışma hücreleri ile analiz ediecek elementler girişimlerden ayrılır. Dedektörde, çok düşük (yaklaşık ppq (katrilyonda bir kısım) seviyesinde) ve nispeten çok yüksek (yaklaşık ppm (milyonda bir kısım seviyesinde)) derişimler arası tayin gerçekleştirmek için sinyal artırıcılar gereklidir. Bu amaçla ticari olarak farklı elektron çoğaltıcılar (dinod gibi) ve faraday kabı kullanılabilmektedir (Ha ve ark. 2011). Yaygın ICP-MS analizlerinde sıvı fazdaki örnekler, peristaltik pompa ile sürekli ve dakikada belirli mL’ lik hacim değerinde akış hızları ile sisleştiriciye iletilirler. Burada -1 yaklaşık 1 mL dk argon gazı ile ince sis haline dönüştürülen örnekler (% 1-2 lik kısmı) daha büyük damlacıklardan bu haznede (sprey odası, püskürtme haznesi) ayrılarak atılır ve kalan kısım, sprey odasının çıkış tüpünden geçip enjektör vasıtası ile torç kısmına iletilir. Yatay olarak konumlandırılmış torç kısmında argon gazı radyofrekans güç ile plazma halinde çok yüksek sıcaklıklara ulaşır (yaklaşık 10000 K) (Thomas 2004). Bu sıcaklıklarda numunede atomlaşma sonucu pozitif yüklü iyonlar meydana gelir; aynı zamanda bu sıcaklıklarda kimyasal girişimler azalır (Anonim 2004a). Bu iyonlar mekanik pompa ile 1–2 torr’luk vakum altında tutulan arayüzden geçer (vakum aynı zamanda birçok Ar atomunu da ortamdan uzaklaştırır). Arayüz sampler ve skimmer konileri olarak adlandırılan ve 0,6–1,2 mm delikli iki metal koniden oluşur. Bu parçalar pozitif yüklü iyonların süzülerek iyon optiklere geçimini sağlar. Buradan kütle filtresi 28 olarak görev yapan iyon ayırıcı kuadropole iletilir. İyonlar “kütle/yük” oranlarına göre ayrılarak iyon dedektörünün aktif yüzeyine (dinod olarak bilinir) çarparlar ve elektron yayarak ölçülebilir bir elektronik sinyal oluştururlar (Thomas 2004). Gıda, çevre, jeolojik, yarı iletken, biyomedikal ve nükleer alandaki çalışmalarda uygulama alanı bulan ICP-MS (Thomas 2004), düşük belirleme limitleri, eş zamanlı çoklu element analizlerine imkan vermesi, geniş dinamik aralığa sahip olması, izotopik oranların ölçümüne olanak vermesi gibi nedenler ile çeşitli matrikslerde ve pek çok element analizinde oldukça önemli bir tekniktir (Nardi ve ark. 2009). Ayrıca türlendirme analizlerinde seçici ve duyarlı bir dedektör olarak ikili tekniklerde de yer almaktadır (Batista ve ark. 2011). Diğer elementel tayin imkanı veren teknikler ile karşılaştırılması aşağıda belirtilen şekillerde görülmektedir. Şekil 2.7.2-Şekil 2.7.4’te ICP-MS’in diğer atomik spektroskopik teknikler ile farklı açılardan kıyaslanması ve Şekil 2.7.5’te ise ICP-MS ile tayin edilebilen elementler ve bu elementlerin belirlenme limitleri gösterilmiştir (Anonim 2004a). Şekil 2.7.2. Element analizi için analitik spektroskopik teknik seçimi (Anonim 2004a)* * = PerkinElmer’in izni ile alınmıştır. (“©2004-2013 PerkinElmer, Inc. All rights reserved.”) 29 Şekil 2.7.3. Atomik spektroskopik yöntemlerdeki belirleme limitlerinin ICP-MS ile karşılaştırılması (Anonim 2004a)* * = PerkinElmer’in izni ile alınmıştır. (“©2004-2013 PerkinElmer, Inc. All rights reserved.”) Şekil 2.7.4. Elementel analiz için atomik spektroskopik teknik seçiminde önemli parametreler (Anonim 2004a)* * = PerkinElmer’in izni ile alınmıştır. (“©2004-2013 PerkinElmer, Inc. All rights reserved.”) 30 Şekil 2.7.5. ICP-MS ile tayin edilebilen elementler ve belirleme limitleri (Anonim 2004a)* * = PerkinElmer’in izni ile alınmıştır. (“©2004-2013 PerkinElmer, Inc. All rights reserved.”) 2.7.1. ICP-MS analizlerinde girişimler ve türlendirme analizleri ICP-MS eser ve ultra eser element analizlerinde pek çok element için yüksek duyarlılığı nedeni ile oldukça güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte girişimlerden uzak değildir; özellikle spektroskopik girişimlere ve matriks etkilerine dayalı girişimlere açıktır. Spektroskopik girişimler yüksek çözünürlüklü (HR) ICP-MS ve çarpışma/reaksiyon hücreleri kullanılarak en aza indirilebilir. Yine de bu teknikler pahalıdır ve örnekler doğrudan analiz edildiğinde matriks etkilerine açıktır. Bu nedenle matriks bileşenlerinden analiti ayıracak ve önderiştirecek örnek hazırlama metotlarına ihtiyaç vardır (Zhang ve ark. 2011). ICP-MS’ in temel sınırlılıklarından biri atomik veya poliatomik türlerden kaynaklanan ve analit ile aynı “kütle/yük, m/z” oranına sahip poliatomik girişimlerin varlığıdır 31 (D’llio ve ark. 2006). ICP-MS’te görülen yaygın girişimlere örnekler Çizelge 2.7.1.1’ de verilmiştir. Çizelge 2.7.1.1. ICP-MS’te karşılaşılan yaygın poliatomik girişimlere örnekler (Anonim 2004b) Girişim yapan Belirlenen Girişim yapan Belirlenen poliatomik tür Analit poliatomik tür Analit 12 15 12 14 1 27 40 12 52 C N, C N H Al Ar C Cr 38 1 39 38 16 1 55 Ar H K Ar O H Mn 40 40 40 16 56 Ar Ca Ar O Fe 35 16 51 40 16 1 57 Cl O V Ar O H Fe 35 16 1 52 40 35 75 Cl O H Cr Ar Cl As 36 16 52 80 Ar O Cr ArAr Se * = PerkinElmer’in izni ile alınmıştır. (“©2004-2013 PerkinElmer, Inc. All rights reserved.”) İzobarik, çift yüklü veya poliatomik girişimler, spektral girişimlere örnek olarak verilebilir. Spektral olmayan girişimler iç standart kullanılarak ya da matrikse benzetilen kalibrasyon çalışmaları ile giderilebilirken; örnek matriksi ile argon plazma, hava ve su arası reaksiyonlar poliatomik girişimlere yol açabilir. Matriks girişimi, yüksek organik içerikten kaynaklanır. Kullanılan argon gazı, argon temelli bazı 40 12 poliatomik iyonları oluşturarak poliatomik, girişimlere neden olabilir. Örneğin Ar C, 40 16 40 35 40 40 52 56 75 80 Ar O, Ar Cl, and Ar Ar gibi türler Cr, Fe, As, and Se ile örtüşerek girişime neden olabilir. Bu nedenle kuadropol ICP-MS sistemi ile bu elementler için düşük belirleme limitlerine ulaşılamaz. Geliştirilen teknolojiler ile poliatomik girişimler giderilmeye çalışılmıştır (Pick ve ark. 2010). Girişim varlığında, izobarik iyondan etkilenmeyen alternatif izotop seçimi (düşük duyarlılık ve arsenik, kobalt gibi tek izotoplu elementler bu stratejinin uygulanabilirliği sınırlandırır) veya matematiksel düzeltme eşitliklerinin kullanımı (bu yöntem basitliğine rağmen örnekte yüksek girişim etkisi yapan türler varsa ya da plazmada oluşuyorlarsa etkili değildir) önemli yaklaşımlardır (Amais ve ark. 2011). Poliatomik girişimleri azaltmak için diğer teknolojik yaklaşımlar arasında soğuk plazma kullanımı, dinamik reaksiyon hücreli 32 (DRC) ICP-MS (ICP-DRC-MS), çarpışma reaksiyon arayüzü ve sektör alanlı ICP-MS bulunmaktadır (Pick ve ark. 2010). Örnek hazırlama basamağı açısından gıda gibi matriskler, yüksek karbon içeriğinin azaltılması için uygun metotlar ile parçalanmalıdır (Nardi ve ark. 2009). Tez kapsamında incelenen elementler açısından irdelenirse; Mn tek izotoplu olup gürültü ve zemin çizgisi sinyali arttığından kompleks matrikslerde analizi zor olabilmektedir; zira pikler kısmen de olsa girişim etkisi gösteren sinyallerin altında kalabilir. DRC tekniği kullanıldığında “sinyal/gürültü” oranında iyileşme ve daha büyük duyarlılık görülmektedir. Sonuç olarak zemin çizgisi sinyali düşmekte ve pikler yükselmektedir. Bu iyileşmeler girişimlerin azalması ile açıklanabilir (Quintana ve ark. 55 2005). Mn için temel potansiyel girişimlerden bazıları özetle şöyle belirtilmiştir: 40 14 1 + 39 16 + 37 18 + 40 15 + 38 17 + 36 18 1 + 38 16 1 + 37 17 1 + Ar N H , K O , Cl O , Ar N , Ar O , Ar O H , Ar O H , Cl O H 23 32 + 14 41 ve Na S (Quintana ve ark. 2005, D’llio ve ark. 2006). Buna ilave olarak; N + K, 1 54 15 40 15 40 12 43 1 54 H + Cr, N + Ar, N + Ca, C + Ca ve H + Fe birleşimleri mangan elementinin izotop kütlesi ile aynı kütledeki potansiyel poliatomik interferensler olarak verilebilir. Dinamik reaksiyon veya çarpışma hücre teknolojileri, bu tip poliatomik girişimlerin duyarlılık kaybı olmadan giderilmesi alternatifini sağlar (Richardson ve ark. 2012). ICP-MS’de klinik örnekler, deniz suyu, toprak ve bitki örneği gibi yüksek oranda alkali metal içeren örneklerin analizinde “kütle/yük” oranı 63 ve 65 olan argon temelli poliatomik girişimler önemlidir (Chrastny ve Komarek 2009). Böylece bakır izotopları 40 23 + 40 25 + Ar Na ve Ar Mg varlığından etkilenir. Yüksek oranda alkali metal içeren 63 + 65 + örneklerde bağıl bollukları sırası ile % 69,17 ve % 30,83 olan Cu ve Cu 40 23 + 44 18 + 40 25 + 48 16 + izotoplarının tayini; Ar Na , Ca OH , Ar Mg ve Ca OH poliatomik iyonlarının oluşumundan etkilenebilir. Bu izotoplar için genellikle matematiksel düzeltme eşitlikleri yoktur. Girişimlerin giderilmesi için farklı yaklaşımlar önem + + 2+ kazanır. Örneğin; Na , Mg ve Ca , Mg(OH)2 gibi bir formda çöktürülmek sureti ile uzaklaştırılabilir, iyon değiştirici reçineler kullanılabilir ya da yüksek çözünürlüklü manyetik sektör ICP-MS gibi aletsel uygulamalara başvurulabilir (Fialho ve ark. 2011). 33 Elementin toksisite ve biyoyayarlılığı kimyasal formuna bağlı olduğundan türlendirme çalışmaları özellikle toksik elementlerde risk değerlendirilmesi açısından önemlidir. ICP-MS’te tam iyonlaşma nedeni ile analit ile ilgili moleküler bilgi edinilemez yani bu teknik ile türden bağımsız bilgi edinilebilir. İlgili element için sadece bir elementel tür nicel tayin amacı ile kullanılabilir. Bilinmeyen türler varlığında ya da ilgili türlerin standartları mevcut olmadığında bu durum yararlı olarak görülebilir; zira türlerin ayrılması için LC, GC veya CE kullanıldığında farklı türler için pik genişlikleri farklı olacağından belirleme limitleri de farklılık gösterebilecektir (Dressler ve ark. 2011). Çoğu türlendirme çalışmalarında kromatografik bir teknik (LC, GC, CE gibi) ile ICP- MS birleştirilerek farklı element türlerinin tayini için kullanılmaktadır. Yine de tür bilgileri ilgili türlerin standartları ile karşılaştırmak sureti ile elde edilir (Dressler ve ark. 2011). 2.8. HPLC HPLC ilk kez 1969’larda ortaya çıktıktan sonra hızla gelişen bir teknik olarak karşımıza çıkmaktadır. LC ayırmasının temelinde aynı şartlarda, bir karışımdaki bileşenlerin çevresinden farklı etkileşimleri yer almaktadır. Böylece karışımdaki bileşenlerin miktar ve saflık tayinleri yapılabilir. Diğer teknikler ile birleştirildiğinde ise karışımdaki bileşenlerin tespit edilmesini sağlar. Karışım çok kompleks yapıda ve bileşenlerin spektroskopik yöntemler gibi yöntemler ile doğrudan belirlenmesi mümkün değilse, analizlenecek bileşenler izomerler gibi çok benzer yapıda ise, yüksek saflıkta materyal hazırlanması ya da belirli bir bileşenin ölçümü söz konusu ise bir ayırma gereklidir ve HPLC bu anlamda kompleks karışımlara yönelik daha büyük kesinlik ve yüksek ayırma gücü ile basit sıvı kromatografik yöntemlere göre daha hızlı ve iyidir. Örneğin analizi öncesi gerekli parametrelerin belirlenmesi uzun zaman alabilir. Deneyim ve literatür bilgisi de bu aşamada önemlidir (Bidlingmeyer 1992). HPLC bütün analitik teknikler arasında satışı ile en yaygın olanıdır. Yöntemin bu kadar yaygın olmasının sebepleri, duyarlılığı, doğru kantitatif tayinlere kolaylıkla uygulanabilir olması, uçucu olmayan türlerin veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen 34 türlerin ayrılmasına uygun olması ve hepsinden de önemlisi sanayinin, birçok bilim dalının ve halkın birinci dereceden ilgilendiği maddelere geniş bir şekilde uygulanabilirliğidir. Bu gibi maddelere örnek olarak amino asitler, proteinler, nükleik asitler, hidrokarbonlar, karbonhidratlar, ilaçlar, terpenoidler, pestisitler, antibiyotikler, steroidler, metal-organik türler ve çeşitli inorganik bileşikler sayılabilir (Skoog ve ark. 1998a). Bir HPLC cihazının temel bileşenleri tarafımızca çizilerek Şekil 2.8.1’ de belirtilmiştir. Kolon fırını Şekil 2.8.1. HPLC cihazının temel bileşenleri HPLC tekniğinde örnek uygun bir çözücüde çözülür. Kolon girişine iletilir (enjekte edilir). Sonrasında örnek, içinde çözülebilen ve sürekli geçişi olan hareketli faz ile kolonda taşınır. Ayrılma işlemi, durgun faz olarak da adlandırılan ve partiküler yapı içeren kolonda gerçekleşir. Hareketli fazlar bileşenlerin matriksteki doğası gereği kompleks olmalı ve bileşimindeki değişiklikler ile ayırma sağlanabilmelidir (Bidlingmeyer 1992). HPLC kolonunun verimliliği tanecik boyutu azaldığında çarpıcı bir şekilde artmaktadır. Modern sıvı kromatografi sistemlerinde genel olarak kullanılan ve tanecik boyutu 2 ile 10 µm arasında olan dolgu maddeleri ile uygun sıvı akış hızları elde edebilmek için yüzlerce atmosferlik pompa basınçlarına gerek vardır. Bu yüksek basınçların bir sonucu olarak HPLC için gerekli donanım, diğer tip kromatografi sistemleri dikkate alındığında daha ince işçilik gerektirir ve daha pahalıdır. Modern bir HPLC cihazı, bir veya daha 35 fazla her biri 200-1000 mL çözücü içeren camdan veya çelikten yapılmış hazne içermektedir. Bu hazneler çoğu zaman kolonda ve dedektör sisteminde gaz oluşturarak bozucu etkilere sahip olan çözünmüş gazların (genellikle oksijen ve azot) giderilmesi için bir cihazla donatılmıştır. Gaz gidericilerin bir HPLC sisteminin ana parçası olması gerekli değildir. Çözücüyü hazneye koymadan önce uygulanacak uygun bir yöntem ile de gaz giderimi gerçekleştirilebilir (Skoog ve ark. 1998a). Sabit bileşimdeki tek bir çözücü kullanılarak yapılan ayırma izokritik elüsyon, polariteleri birbirinden farklı iki veya üç çözücü sistemi kullanılarak yapılan ayırma ise gradiyent elüsyon olarak adlandırılır. Modern HPLC cihazları çözücülerin hacimsel oranlarını doğrusal veya üstel olarak değiştirebilecek şekilde iki veya daha fazla hazneden aldığı çözücüleri bir karıştırma odasında sürekli olarak değişen hızlarda bir araya getiren sistemler ile donatılmıştır (Skoog ve ark. 1998a). 2.9. Tez kapsamında Seçilen Matriksler 2.9.1. Ispanak (Spinacia oleracea L.) Diyetin önemli bir parçasını oluşturan sebzeler, karbonhidrat, protein, vitamin, mineral, lif içerirler ve bunlar da sağlık için gereklidir. Aynı zamanda yenilebilen veya yenilmeyen kesimlerinde genellikle kirli topraktan kaynaklanabilecek olan kadmiyum (Cd), bakır (Cu), krom (Cr), nikel (Ni), kurşun (Pb) ve çinko (Zn) gibi ağır metalleri de biriktirebilirler. Bunlardan bazıları; örneğin Cd, Cr, Pb, sağlık açısından zararlı iken; bazıları da; örneğin Zn, Ni, Cu, normal biyolojik fonksiyonlar için düşük derişimlerde lüzumlu olup; aşırısında sağlığı olumsuz yönde etkilemektedir (Hu ve ark. 2013). Ispanak (Spinacia oleracea L.) gibi yeşil yapraklı sebzeler bitkisel gıdaların önemli bir grubunu oluştururlar (Lisiewska ve ark. 2011). Ispanak yüksek mineral bileşenleri, vitaminler, karotenoidler, organik asitler, alkali mineral bileşenler (Lisiewska ve ark. 2011) ve antioksidanlar (Lisiewska ve ark. 2011, Khanam ve ark. 2012) içerir. Çiğ veya pişmiş (Klein ve ark. 1981), donmuş ya da taze yaprakları kaynatılmış olarak (Lomnitski ve ark. 2003) ya da bebek ıspanak olarak (Huang ve Chen 2011) tüketimi 36 yapılabilmekte; ayrıca kimyasal bileşimi de ekilme-yetiştirme şartları ve gıda olarak kullanılan kısım gibi faktörlere bağlı olarak değişmektedir. Yapraklarının tazeliğine (yaşı) de bu açıdan önemli olabilecektir (Lisiewska ve ark. 2011). Ispanağın besleyici değeri açısından bakıldığında, çiğ ıspanakta yüz gram yenilebilen kesimde mineral içeriği açısından potasyum, kalsiyum, magnezyum-sodyum (standart sapmalar dahilinde yaklaşık aynı düzeyde), fosfor fazla miktarda bulunurken (49-558 mg); bunları demir (2,71 mg), selenyum (1,0 mg), mangan (0,897 mg), çinko (0,53 mg) ve bakır (0,130 mg) izlemektedir. Ayrıca; A ve K vitamini ile folat içeriği açısından da zengin olup, C vitamini de (28,1 mg) yüksektir (Tang 2009). Ispanak çok önemli antioksidan özelliği gösteren sebzelerden biri olmakla birlikte (Lomnitski ve ark. 2003); artan Cu (II) miktarının antioksidan içeriğine etkisine dair çalışmalar literatürde görülmektedir (Caldwell 2002). Ayrıca ıspanak eser mineralleri açısından değerlendirildiğinde, iyi bir mangan kaynağı olduğu söylenebilir (Tang 2009). Literatürde yer alan bazı çalışmaların sadece ıspanağın genel bileşiklerinin analizine yönelik olduğu belirlenmiştir ya da farklı yeşil yapraklı sebzelerdeki mangan belirlenmesi-türlendirmesi (Yaman 1997, Ozdemir ve Gucer, 1998, Vinas ve ark. 1993, Dugo ve ark. 2005) veya antioksidan içeriklerinin belirlenmesi üzerine yoğunlaşılmıştır (Bergman ve ark. 2001, Kahanam ve ark. 2012). Yine literatürde ıspanakta artan bakıra tolerans etkisi (Tukendorf 1989), genel olarak eser ve makro bileşenlerinin analizi ya da içeriklerinin belirlenmesi (Tang 2009, Hokura ve ark. 2000, Durukan ve ark. 2011) veya amino asit profillerinin belirlenmesine (Lisiewska ve ark. 2011) ilişkin çalışmalar görülmekle birlikte tez kapsamında değerlendirilecek olan mangan ve bakır fraksiyonlaması veya biyoyararlılığına ilişkin çalışmalar bulunamamıştır. 2.9.2. Buğday (Triticum aestivum L.) unu Tahıllar diyetteki temel gıda bileşenlerinden biridir ve çok iyi birer karbonhidrat, protein, belirli vitamin ve mineral kaynaklarıdırlar (Koplik ve ark. 2006). Tahıl unları, pek çok ülkede temel yiyecek maddelerinden biridir (Gonzalez ve ark. 1999). Bunlar arasında buğday da tüm dünyada en fazla tüketilen tahıl çeşididir (Arajuo ve ark. 2007) . 37 Buğday unu, ekmek, pasta, sos vb. yapımında sıklıkla kullanıldığından eser element içeriğinin analizi hem beslenme hem de toksikolojik açıdan önem arz etmektedir (Gonzalez ve ark. 1999). Buğday ununun başlıca bileşenleri nişasta, su, protein, nişasta olmayan polisakkaritler ve lipidlerdir (Goesaert ve ark. 2005) Beyaz un, buğday çekirdeğinin endosperminin öğütülmesi ile elde edilir. Buğdayda endosperm % 12 protein içerir. Protein iki sınıfa ayrılır. Bunlardan ilki, gluten olmayan proteinlerdir; bunlar albumin ve globulinden ibarettir. Albümin suda çözünürken; globulin suda çözünmez, seyreltik tuz çözeltilerinde çözünür. İkinci sınıf ise toplam buğday proteininin büyük kısmını oluşturan gluten proteinleri olup; bunlar da suda çözünmez. Gluten proteinleri gliadin ve gluteninlere ayrılır. Buğdayda en fazla bulunan bileşen nişasta, % 63–72 civarındadır ve endospermde bulunur. Nişasta; glikoz polimerleri, amiloz ve amilopektinden oluşur. Öğütme sırasında %5–8 nişasta granülleri fiziksel olarak zarar görür. Nişasta olmayan polisakkaritler de yapısı gereği suda çözünür veya çözünmez fraksiyonlara ayrılabilir. Polar veya polar olmayan türdeki yağ içeriği ise % 2 civarındadır (van der Borght ve ark. 2005). 2.9.3. Fındık (Corylus avellana L.) Fındık büyük ölçüde Karadeniz bölgesi-Türkiye, İtalya, ispanya, Portekiz ve Fransa’ da; ayrıca Amerika Birleşik Devletlerinin bazı bölgelerinde üretilmektedir (Alasalvar ve ark. 2009). Bazı başka ülkelerde de üretimi görülmektedir (Avustralya, Yeni Zelanda, Çin, Azerbaycan gibi). Türkiye toplam üretimin ~% 74’ ü ile ilk sırada yer alırken; bunu ~% 16 ile İtalya, ~% 4 ile Amerika Birleşik Devletleri ve ~% 3 ile İspanya izlemektedir. Diğer ülkeler de toplam üretime ~%3’ lük katkı göstermektedir ( Seyhan ve ark. 2007, Alasalvar ve ark. 2009). Türkiye’de yaklaşık on sekiz fındık türü bulunmakta olup; bunlar arasında Tombul, birinci kalitede ve başlıca Giresun ili kaynaklı olarak sınıflandırılmıştır (Alasalvar ve ark. 2009). Kara Fındık da yine yüksek kalitede tür olarak nitelendirilmiştir (Dundar ve Altundag 2004). 38 Fındık ekonomik değeri yanında gıda ürünlerinde katkı olarak da kullanılmakta; beslenme ve sağlık açısından da önemli rolü bulunmaktadır (Açkurt ve ark. 1999) Yağ asitleri profilleri, protein, karbonhidrat, vitamin, mineral, diyet lif, fitosterol, tokol, skualen, antioksidan, fenolik ve fitokimyasal içeriği ile beslenme ve sağlık açısından önemlidir (Seyhan ve ark. 2007). Çalışmalarda fındığın yağ ve mineral içeriğinin tür, coğrafi kaynak, hasat zamanı, mevsim ve üretim tekniğinden etkilendiği belirtilmiştir. Literatürde Türkiye’ de yetiştirilen fındık çeşitlerinin vitamin ve mineral içeriğine yönelik çalışmalar da mevcuttur (Açkurt ve ark. 1999). Fındık, yüksek düzeyde yağ içeriğine sahiptir. Tekli ve çoklu doymamış yağ asitleri ile kan serum lipid profili ile ilgili sağlık açısından yararlılığı bulunmaktadır (Delgado ve ark. 2010). Yüksek yağ içeriği aynı zamanda bozulmaya-acılaşmaya da yatkınlık nedenidir (Açkurt ve ark. 1999). Doymamış yağ asitleri ve α-tokoferol gibi antioksidanlar yanında; demir, mangan, bakır gibi mineral içeriği de yine acılaşma ile ilişkilidir (Açkurt ve ark. 1999, Özdemir ve ark. 2001). Doymamış yağca zengin aynı zamanda protein, fiber, mikro elementler, bitki sterolleri ve fitokimyasalları içeren fındık ve benzeri gıdalar yüksek kalori içeriğine rağmen yüksek tüketimleri ile oldukça popüler görülmektedir; ayrıca yine, yağ asidi profilleri nedeniyle koroner kalp hastalıklarına karşı koruyucu olduğu da belirtilmiştir (Wuilloud ve ark. 2004). Fındıktan antioksidan madde ekstraksiyonunda etanol, metanol veya aseton kullanıldığı belirtilmiştir (Contini ve ark. 2008, Delgado ve ark. 2010). Ayrıca sadece gıda maddesi olarak değil; aynı zamanda kozmetik ve farmasotik alanlarında ürün geliştirmeye yönelik önemli özelliklerinin olabileceği de vurgulanmıştır (Delgado ve ark. 2010). Fındık ve benzerleri açısından toplam element içeriğine yönelik çalışmaların az ve türlendirme çalışmaları açısından da selenyumun dışında çalışmanın geliştirilmediği (Wuilloud ve ark. 2004) belirtilmiştir. Fındığın kimyasal bileşimi kompleks olduğundan (içeriğindeki lipid % 50–70, protein % 10–20 ve karbonhidratlar % 10–20 ) eser element analizi zordur ve analiz öncesi uygun örnek hazırlama basamağı geliştirilmelidir. Farklı yaş yakma işlemleri ve ölçüm sistemleri toplam element 39 analizlerinde kullanılmış olmakla birlikte; bu çalışmalarda sonuçların düşük doğruluk ve tekrar elde edilebilirliklerinin temel nedeninin örneğin tam parçalanmamasından kaynaklandığı görülmüştür (Wuilloud ve ark. 2004). Fındığın elementel bileşimi; coğrafi kaynak, hasat yılı, iklim toprak bileşimi, sulama, gübre kullanımı, yetiştirme metodu gibi nedenlerle değişmekte olup Türkiye’de yetiştirilen yaklaşık on sekiz çeşit fındıktan beşinin (tombul, yassı badem, sivri, karafındık, ham) AAS ile tespit edilen içerikleri Çizelge 2.9.3.1’de özetlenmiştir (Alasavar ve ark. (2009). Yine literatürde Açkurt ve ark. (1999) tarafından farklı illerden elde edilen fındıklarda belirlenen elementel içerikler de Çizelge 2.9.3.2’de görülmektedir. Çizelge 2.9.3.1. Fındık çeşitlerinin elementel içeriği-1 (Alasalvar ve ark. 2009)* Krom, Molibden ve Selenyum için µg/100g; diğerleri için mg/100 g Mineral Tombul Yassı Sivri Karafındık Ham Badem Kalsiyum 264 ± 9,9 161 ± 2,2 176 ± 4,1 202 ± 1,7 238 ± 5,7 Krom 10,8 ± 0,35 13,1 ± 0,61 9,93 ± 0,51 10,8 ± 0,80 17,5 ± 1,15 Bakır 1,59 ± 0,08 1,23 ± 0,05 1,36 ± 0,04 1,77 ± 0,01 0,94 ± 0,03 Demir 3,73 ± 0,08 4,28 ± 0,14 3,66 ± 0,08 3,67 ± 0,08 4,42 ± 0,14 Magnezyum 152 ± 2,2 140 ± 1,0 43,3 ± 0,6 149 ± 0,3 34,9 ± 2,5 Mangan 2,17 ± 0,02 5,98 ± 0,04 9,66 ± 0,01 2,17 ± 0,02 19,0 ± 0,16 Molibden 3,13 ± 0,32 3,77 ± 0,25 2,11 ± 0,11 3,27 ± 0,32 2,20 ± 0,10 Fosfor 314 ± 8,9 288 ± 4,2 256 ± 4,5 268 ± 1,4 260 ± 8,2 Potasyum 678 ± 6,5 857 ± 1,7 661 ± 2,0 676 ± 1,2 519 ± 0,2 Selenyum 8,11 ± 0,11 6,72 ± 0,07 7,43 ± 0,15 8,03 ± 0,06 5,52 ± 0,06 Sodyum 1,97 ± 0,01 1,24 ± 0,02 2,65 ± 0,01 1,70 ± 0,01 1,31 ± 0,01 Çinko 2,45 ± 0,02 1,86 ± 0,03 1,84 ± 0,04 2,45 ± 0,02 2,07 ± 0,02 * = Türler, Giresun kaynaklı olup; örnekler hasat zamanı başında (Eylül 2007’ de) alınmıştır. 40 Çizelge 2.9.3.2. Fındık çeşitlerinin elementel içeriği-2 (mg/100 g) (Açkurt ve ark. 1999). Bölge Çeşit Demir Çinko Bakır Magnzeyum Akçakoca Karafındık 2,30 ± 0,09 2,44 ± 0,04 0,10 ± 0,02 142,64 ± 3,96 Çakıldak 2,05 ± 0,18 2,18 ± 0,08 0,86 ± 0,03 142,24 ± 4,39 Mincane 2,60 ± 0,02 1,82 ± 0,04 0,90 ± 0,01 118,09 ± 9,36 Foşa 2,23 ± 0,23 1,85 ± 0,22 0,62 ± 0,12 140,89 ± 5,54 Ordu Çakıldak 2,15 ± 0,05 2,09 ± 0,06 0,74 ± 0,04 154,42 ± 12,00 Palaz 2,54 ± 0,12 2,11 ± 0,02 0,77 ± 0,03 177,22 ± 15,42 Trabzon Sivri 2,41 ± 0,07 2,06 ± 0,12 0,80 ± 0,03 140,82 ± 0,34 Mincane 2,05 ± 0,05 1,81 ± 0,08 0,83 ± 0,18 140,42 ± 5,40 Giresun Sivri 2,40 ± 0,13 1,63 ± 0,03 0,16 ± 0,01 143,33 ± 2,33 Tombul 2,56 ± 0,08 1,77 ± 0,02 0,32 ± 0,01 137,51 ± 1,76 Kalınkara 2,24 ± 0,12 1,71 ± 0,07 0,17 ± 0,01 141,96 ± 3,44 Ortalama 2,32 ± 0,21 1,95 ± 0,25 0,65 ± 0,29 143,59 ± 14,86 Bölge Çeşit Mangan Kalsiyum Potasyum Sodyum Akçakoca Karafındık 1,99 ± 0,02 82,28 ± 1,17 686,24 ± 9,5 0,86 ± 0,04 Çakıldak 2,92 ± 1,43 92,46 ± 3,30 735,26 ± 11,74 0,80 ± 0,04 Mincane 15,85 ± 0,60 82,76 ± 5,52 624,27 ± 57,96 0,84 ± 0,01 Foşa 11,22 ± 0,05 85,88 ± 7,58 611,77 ± 19,05 0,81 ± 0,05 Ordu Çakıldak 1,77 ± 0,04 80,63 ± 2,81 894,72 ± 72,63 0,63 ± 0,02 Palaz 5,90 ± 0,40 82,58 ± 1,37 602,07 ± 10,44 0,66 ± 0,03 Trabzon Sivri 4,92 ± 0,33 89,53 ± 1,71 532,58 ± 4,63 0,62 ± 0,02 Mincane 3,34 ± 0,28 79,06 ± 1,00 553,23 ± 22,67 0,62 ± 0,01 Giresun Sivri 7,72 ± 0,24 80,86 ± 4,46 636,66 ± 8,45 0,61 ± 0,01 Tombul 8,45 ± 0,02 78,83 ± 2,50 526,72 ± 11,55 0,62 ± 0,01 Kalınkara 4,61 ± 0,28 83,76 ± 3,03 609,05 ± 14,04 0,61 ± 0,02 Ortalama 6,09 ± 4,17 83,51 ± 5,14 637,14 ± 105,33 0,70 ± 0,10 2.9.4. Yağmur suyu Atmosferik taşınım ve birikim süreçleri eser elementlerin küresel çevriminde önemlidir (Baez ve ark. 2007). Eser elementler doğal veya antropojenik kaynaklıdırlar. Doğal kaynaklar arasında taş (akıntılardan dolayı), toprak, volkanlar göl ve nehir çökelleri, bitki örtüsü, orman yangınları gibi etmenler yer alırken; endüstriyel faaliyetlerden 41 dolayı oluşanlar ise antropojenik kaynaklıdırlar (Srogi 2008). Antropojenik kaynaklar atmosferik birikintilerdeki eser element derişimlerini büyük ölçüde artırır; bunu izleyen süreçte de eser elementler, yağmur-kar suları ve kuru serpintiler ile çökelirler. Bu nedenle atmosferik çökeltilerde çevresel ve sağlık etkileri nedeni ile eser metal düzeylerinin belirlenmesi çalışmaları son yıllarda artış göstermiştir. Yaş birikintilerdeki eser elementlerin % 80’den fazlası yağmur sularında çözünerek alınmaya uygun formda, bitkiye ulaşmaktadır (Baez ve ark. 2007). Volkanik faaliyetler brom (Br), selenyum (Se) ve antimon (Sb) gibi çeşitli eser elementler için önemli bir kaynaktır. Çinko (Zn) da bu anlamda tek kaynağı volkanik faaliyetler olmamakla birlikte örnek olarak verilebilir; bunun dışında gübre üretimi, bitki örtüsü gibi pek çok farklı kaynaktan da gelebilmektedir. Bazı kimyasallar; örneğin fungisitler, pestisitler ve herbisitler bakır, çinko, mangan, demir ve arsenik içerirken; kadmiyum ve kurşun gibi bazı eser elementler de gübrede safsızlık olarak toprağa ulaşır. Böylece atmosferdeki eser elementleri belirli bir kaynağa dayandırmak çok zordur. Çevresel izleme amacı ile toplanan örnekler matriks kompleksliği ve derişim düzeyi ile ilgili olarak analitik zorluklarına göre farklı kategoriye ayrılırlar ve yağmur suları su kategorisindeki (içme, yüzey, yeraltı, yağmur suları ve atık sular) matrikslerden biridir (Srogi 2008). Atmosfer, eser elementlerin biojeokimyasal çevriminde önemli bir çevre bileşenidir. Pek çok nedenden dolayı atmosferik eser elementler önem arz etmektedir. Küçük miktarlarda eser elementler besleyici özelliği veya toksik kirletici olduğu için ekolojik olarak önemlidir. Besleyici olanlar magnezyum, mangan, bakır ve çinko iken; bunlardan bazıları da yüksek derişimde toksik olabilmektedir. Endüstiride yaygın olarak kullanılan ve toksik olan grupta ise civa, kadmiyum, arsenik ve kurşun gibi elementler yer alır (Srogi 2008). Kurşun, kadmiyum ve civa gibi bazı eser elementler biyosferde birikerek canlı sistemler için toksik olabilmektedir (Baez ve ark. 2007). Mangan, biyolojik veya antropojenik kaynaklı olarak atmosferik sularda en çok bulunan eser elementlerden biridir. Yağmur sularında bu element Mn (II) ve Mn (IV) formunda olabilir. Termodinamik hesaplamalar, pH 4–6 arasında çözünmüş mangan için baskın 42 olarak Mn (II) formunu önermektedir. Mn (III) atmosferik şartlarda kararsız olup; Mn (IV)’e yükselgenebilir ya da Mn (II)’ye indirgenebilir. Kinetik model, yağmurda genellikle Mn (II) oksidasyon basamağının baskın olduğunu; çok az düzeyde ve gün ışığının olduğu saatlerde Mn (III)’ ün de bulunabileceğini önermektedir (Willey ve ark. 2009). Atmosferde oluşan türler ile ilgili çok az bilgi mevcut olup; kısmen hesaplamalara dayalıdır. Mangan atmosfere sadece partiküler formda ulaşır. Antropojenik partiküller atmosfere % 35 oranında Mn emisyonununun nedenidir. Mangan, S (IV)’ ün oksijen ile yükseltgenmesini de katalizler ki bu durum asit yağmuru oluşum mekanizmalarında önemlidir. Kinetik ve mekanik araştırmalara ve model hesaplamalara göre mangan, Fe (III) iyonları ile birlikte bulutlu havalarda S (IV) yükseltgenmesinin önemli bir kısmı ile ilgilidir; gece hidrojen peroksit derişimi az olduğunda bu yükseltgenmenin % 29’a kadar olan kısmı ile ilişkilendirilebilir (Deutsch ve ark. 1997). Literatürde, asitlendirilmiş ve filtre edilmemiş yağmur suyunda toplam manganın ölçüldüğü; türlendirme-dağılım çalışmaları açısından da çözünmüş, partiküle ve kolloidal Mn ölçümünün yapıldığı, fotokimyasal deneylerden yararlanıldığı (Willey ve ark. 2009); yine fotometrik ölçümler ve ayrıca iyon kromatografisinden yararlanıldığı (Deutsch ve ark. 1997 ) görülmektedir. Analizde kullanılan yaygın teknikler ise atomik spektroskopik tekniklerdir (Deutsch ve ark. 1997, Baez ve ark. 2007, Srogi 2008) 2.10. Tez kapsamında Seçilen Metaller 2.10.1. Mangan Mangan lüzumlu eser element olarak fotosentezde ve solunumda önemlidir ve pek çok enzimin aktivatörüdür. Ayrıca; bitki sistemlerinde protein, açil lipidler ve karbonhidratların sentezinde önemlidir. Hücresel düzeyde aşırısı vakuollerde, hücre duvarında ve kloroplast tilakoidinde depolanır (Boojar ve Goodarzi 2008). 43 Protein, karbonhidrat ve yağ metabolizması, sağlıklı sinir ve bağışıklık sistemleri, kan şekeri düzenlenmesi için gerekli olan Mn kofaktör olarak etki göstererek metabolik işlemlerde gerekli birçok enzimi aktive eder. (Michalke ve Schramel 2004, Dugo ve ark. 2005, Citak ve ark. 2010, Ruzik 2012). Piruvat karboksilaz, süperoksit dismutaz, glikozil transferaz ve arginaz bu enzimlere örnek olarak verilebilir (Gomez-Ariza ve ark. 2006). Mangan, B1 ve E vitamininden yararlanılması ile ilgili olduğu gibi normal kemik gelişiminde de gereklidir. Ayrıca Mn, diyette uygun düzeyde alındığında lüzumlu bir elementtir. Bu bağlamda günlük 2–3 mg mangan gereklidir. Tipik olarak günlük alımı 5,4–12,4 mg arasındadır. Bu nedenle miktarı yeterli olup takviye gerektirmez. Ancak bu lüzumlu element kolaylıkla absorbe edilmez (Ruzik 2012). Mangan bitkilerde de azot metabolizmasının düzenlenmesi ve fotosentezde önemli rol oynar (Dugo ve ark. 2005). Bitkisel kökenli gıdalarda; özellikle buğday ve pirinçte manganın derişimi çok fazla olmakla birlikte; ayrıca çay, soya fasülyesi, yumurta ve fındık gibi gıdalarda da fazla miktarda bulunur. Toksik ve toksik olmayan derişim aralıkları arasındaki sınır çok düşüktür bu nedenle de kesinliği ve doğruluğu yüksek analitik teknikler ile belirlenmesi gerekli görülmektedir (Ruzik 2012). Matriks açısından literatürde en fazla mangan analizi yapılan gıda örnekleri; yeşil sebze, kabuklu yemiş, tahıl ve çay olarak görülmektedir. Mangan, beyinde plazmaya oranla yüz kattan daha fazla derişir. Bu nedenle de seçici bağlanma ve aktif taşınım mekanizmalarının anlaşılması önemlidir. Hücresel mangan türlendirmesi de kan-beyin bariyerinde taşınımın anlaşılması açısından önem arz etmektedir. MnCl2 > KMnO4 > MnSO4 sırasında mangan bileşiklerinin kanserojenliği azalmaktadır. Fakat bu etkiyi göstermesi için de yüksek dozlarda alınımı gerekmektedir. Bu nedenle günümüzde manganın deriştiği beyin ortamının oldukça önemli olduğu belirtilmiştir (Pearson ve Greenway 2005). Mangan eksikliği sinir sistemini etkiler, epilepsi benzeri rahatsızlıklara neden olabilir. Epileptik hastalarda kan mangan derişimi normale göre düşük bulunmuştur (Dugo ve ark. 2005) Genellikle yetişkin organizmasında toksik olmamakla birlikte; nispeten 44 yüksek dozda veya kronik olarak aşırı doza maruz kalma durumunda manganizm olarak adlandırılan ve belirtileri Parkinson hastalığına benzeyen nörolojik bozukluğa neden olabilmektedir. Bu nörolojik rahatsızlık; titreme, hareket bozukluğu, kas sertliği, durumu ile kendini gösterir, uzun maruz kalma durumu ise bilişsel eksiklik, sanrı, uyku hali ve depresyona yol açabilir (Pearson ve Greenway 2005). Mangan, glikospingolipid biyosentezinde metal iyon aktivatör olarak önemlidir (Burczak ve ark. 1984); ayrıca yine literatürde glikolipid sentez aşamalarında magnezyum yerine etkinliği araştırılmış iki değerlikli katyonlardan biridir (Awai ve ark. 2006). Glikolipidler literatürde anti-kanser bileşikleri olarak, ıspanak ise monogalaktosil diaçilgliserol (MGDG), digalaktosil diaçilgliserol (DGDG) ve sülfokuinovosil diaçilgliserol (SQDG) isimli üç glikolipid türü için iyi bir kaynak olarak önerilmiştir (Maeda ve ark. 2008). Kimya endüstrisinde oksidasyon reaksiyonlarında, cam, seramik boya ve pigmentlerin renklendirilmesinde, toprak ve gıda takviyesi olarak veya tıbbi alanda ilaç olarak farklı bileşikleri ile uygulama alanı bulan ve endüstride sıklıkla kullanılan metallerden biri olan mangan, biyolojik sistemlerde önemli rolü olan lüzumlu elementlerden biridir. Mangan, yüksek dozda DNA işleyişini etkileyerek mutasyonlara neden olabilen bir elementtir. Sağlıklı bağışıklık sistemi için gereklidir. Serbest radikalleri düşürerek antioksidan etki gösteren Mn-süperoksit dismutaz yapısında yer alır ve hücre koruyucu” olarak da etki gösterir (Pearson ve Greenway 2005). -3 Genel bir çevre şartında atmosferik derişimleri 0,1 -10 µg m arasında değişirken solunum ile alınması toksisitenin temel nedenidir. Manganın yaklaşık yarısı kemiklerde -1 depolanırken; fazlası karaciğerden atılır. İnsan karaciğeri ortalama 1,5 mg kg mangan içerir. Manganın fazlası karaciğerden diğer organlara; özellikle de beyine iletilebilmektedir. Sağlıklı bir insanda serumda ve idrarda mangan düzeyleri sırası ile -1 0,5 ve 1 µg L dir. Sağlıklı diyette yeterli düzeyde alındığından mangan eksikliği görülmemektedir (Pearson ve Greenway 2005). Mangan türleri açısından değerlendirecek olursak; taş toprak su ve gıdalarda doğal olarak bulunan manganın -3 ile +7 arasındaki onbir oksidasyon basamağı olduğu belirtilmiş olup; bunlar arasında en 45 kararlı olanları +2 (MnCl2) +4 (örneğin MnO2) ve +7 (KMnO4) olarak verilmiştir. Çoğu tuzları suda çözünürken; fosfat ve karbonatları ile oksitlerinin çözünürlüğü düşüktür. Mangan, atmosferde toz benzeri küçük partiküllerin yapısında yer alabilir (Howe ve ark. 2004). Bir başka kaynakta ise 0 ile +7 arasında tüm oksidasyon basamaklarının bulunabileceği; fakat +2, +4 ve +7’ nin en önemlileri olduğu ve iki değerlikli mangan tuzlarının en kararlıları olduğu, doğada da baskın olarak Mn(IV) (MnO2) bulunduğu belirtilmiştir. Organizmada sadece iki değerlikli mangan absorbe edilebilirken, mangan açısından temel gıda kaynakları ise yeşil sebzeler, fındık ve türevleri, tahıllar ve çay olarak belirtilmiştir (Pearson ve Greenway 2005). Manganın bazı temel bileşiklerine ait özellikler Çizelge 2.10.1.1’de ayrıntılı olarak verilmiştir (Howe ve ark. 2004). Çizelge 2.10.1.1. Mangan ve bazı bileşiklerinin kimyasal özellikleri (Howe ve ark. 2004’ten değiştirilerek alınmıştır) Kimyasal Mn MnCl2 MnSO4 Mn3O4 MnO2 KMnO4 Formül CAS No. 7439-96-5 7773-01-5 7785-87-7 1317-35-7 1313-13-9 7722-64-7 Molekül 54,94 125,85 151,00 228,81 86,94 158,04 Kütlesi (g/mol) Renk gri-beyaz pembe Soluk siyah siyah mor pembe Fiziksel katı katı katı katı katı katı Özellik Erime Noktası 1244 °C 650 °C 700 °C 1564 °C 535 °C <240 °C (parçalanır) Kaynama 1962 °C 1190 °C 850 °C’de - - - Noktası parçalanır Çözünürlük seyreltik su su HCl HCl su mineral (723 (520 Suda Suda (64 g/litre asitler g/litre, 25 g/litre, 5 çözünmez çözünmez 20 °C), °C); alkol °C); alkol aseton ve sülfürik asit 46 2.10.1.1. Gıda bileşenlerinin mangan emilimine etkisi Bitkide topraktan element alımına ilişkin olan Mulder diyagramının gıda bileşenlerinin mangan emilimine etkisinde de açıklayıcı etkisi öngörülebilir. Şekil 2.10.1.1.1’ de Mulder’in bitki beslenmesi açısından, eser element bağımlılık şeması verilmiştir (Demir 1986). Bu şemaya göre örneğin Mn dört element ile ilişkili olup; bunlar K, Ca, Fe ve Cu olarak görülmektedir ve K hariç diğerlerinin varlığında mangan emiliminin azalacağı öngörülebilir. Tez kapsamında inelenecek ikinci element olan bakır (Cu) ise üç element ile ilişklili olup bunlar Mn, P ve Fe’dir ve bunların varlığında Cu emiliminin azalacağı öngörülebilir. Arttırıcı Azaltıcı Şekil 2.10.1.1.1. Mulder diyagramı (Demir 1986) 2.10.1.2. Metal türlendirme analizleri ve mangan Alüminyum, antimon, arsenik, krom, iyot, kadmiyum, kurşun, fosfor, cıva, platin, selenyum ve aktinit serilerine ilişkin türlendirme çalışmaları literatürde yaygın olarak yer almakla birlikte (Kot ve Namiesnik 2000); mangan ile ilgili bazı çalışmalara aşağıda değinilmiştir: Alasalvar ve ark. (2009), AAS ile çeşitli fındık türleri üzerinde AAS ile toplam mangan tayini yapmışlardır. Belirlenen Mn miktarları türe göre değişmekle birlikte; 2,17±0,02 ile 19,0±0,16 (“mg/100g”) arasında bulunmuştur. 47 Dolan ve Capar (2002), mikrodalga parçalamalı örnek hazırlama işlemi ve ICP-AES ile mangan da dahil pek çok element için toplam miktar tayini yapmışlardır. Abollino ve ark. (1998), sütte katı faz ekstraksiyonu, GFAAS ve ICP-AES ile Cu ve Mn türlendirmesi ilgili çalışmalar yapmış; kolonlarda tutunmasına göre bu elementlerin katyonik, anyonik formları, kolonda tutulmayan (nötral veya apolar) tür, proteine bağlı (kazein ile çöken) mangan şeklinde incelemeler yapmışlardır. Ozdemir ve Gucer (1998) tarafından çay yapraklarında mangan fraksiyonlaması için ekstraktlarda anyon-katyon değiştiriciler ve birlikte çöktürmeye dayalı işlemlerden yararlanılmıştır. Ayrıca yaş yakmayı takiben toplam metal tayini yapılırken; dietil eter, etil asetat, kloroform gibi çözgen ekstraksiyonları ile organik bağlı metal fraksiyonları da elde edilmiştir. Bu fraksiyonlardaki elementel tayinlerde ise AAS kullanılmıştır. Mangan türlendirmesinde yukarıda da bahsedilen elemente özgü tayinler yapılabildiği gibi, kromatografik ayırmanın element seçici tespit yöntemleri ile birleştiği ikili tekniklere dayalı moleküler belirleme imkanlarının da var olduğu görülmektedir (Michalke 2003, Pearson ve Greenway 2005). Arias-Borrego ve ark. (2008) tarafından yapılan bir çalışmada çam fıstığında biyomoleküllere bağlı manganın LC-ICP-MS ve ESI-MS ile tespit ve tayini yapılmıştır. Boyut eleme ve güçlü anyon değişim kolonları kullanılarak fraksiyonlar ICP-MS ’e gönderilmiş ve mangan içeren biyomoleküler fraksiyonlar analiz edilmiştir. Kullanılan matrikslerde kaynağına bağlı olarak 26–559 µg/g’ a kadar değişen miktarlarda Mn belirlenmiştir. Bunun dışında farklı gıdalarda mangan içeriklerine dair literatürden örnekler verilmişken; en fazla oranda mangan bulunan gıdalara örnek olarak badem ve yer fıstığı verilmiştir. SEC-ICP-MS çalışmasında 7–10kDa, 2126–7000 Da, 1352–2126 Da arasında biyomoleküle bağlı üç mangan piki gözlenmiştir. Bunlar da mangan (II) klorür, ayrıca mangan sitrat kompleksi ve proteine bağlı mangan ile ilişkilendirilmiş; bazı doğrulama çalışmalarında elektrosprey iyonizasyon/kütle spektrometresi (ESI/MS) kullanılmıştır. 48 Wuilloud ve ark. (2004) kabuklu gıdalarda mangan da dahil birkaç elementin türlendirmesine dayanan çalışmalarında, moleküler büyüklük dağılımına dayalı SEC- ICP-MS’ten yararlanmışlardır. Fraksiyonlama için sodyum hidroksit (NaOH) ve hidroklorik asit (HCl)’den yararlanılmıştır. NaOH ile hem düşük hem de yüksek molekül kütleli elementel bileşikler ekstrakte edilebilirken; HCl ile düşük molekül kütleli olanlar ekstrakte edilebilmiştir. Çalışmada da görüleceği gibi farklı fındık türevi –1 gıdalarda 9 ile 4780 μg g aralığında mangan düzeyi olabilmektedir. Mangan bu anlamda fazlaca farklılık gösteren bir metaldir. Benzer bir çalışmada Naozuka ve Oliveira (2007) tarafından fındık da dahil olmak üzere bazı kabuklu gıdalarda protein fraksiyonlarındaki element dağılımı katı-sıvı ekstraksiyonu ve ETAAS ile belirlenmiştir. Bakır (Cu (II)), demir (Fe (II)), mangan (Mn (II)), molibden (Mo (II)), ve çinko (Zn (II)) gibi geçiş metalleri ile, selenyum (Se (IV))’ ün gıda matriksindeki kompleks yapılarla koordinasyon etkileşimleri yüksektir. Bu nedenle de çoğunlukla metalloprotein yapıları ile ilişkili görülmüştür. Lipid, albümin, globülin gibi moleküler yapıları ekstrakte etmek için metanol: kloroform (1:2, -1 -1 v/v), su, 0,5 mol L sodyum klorür (NaCl) çözeltisi, % 70 etanol ve 0,5 mol L NaOH çözeltilerinden yararlanılmıştır. Quintana ve ark. (2005), manganın merkezi sinir sistemine etkileri nedeni ile kan-beyin bariyeri düzeyinde incelemelerini gerçekleştirmek amacı ile vücutta mangan depolama yeri olan karaciğer matriksini ele almışlardır. Kuvvetli anyon değişimine dayalı ayırmaların mangan türlerinin kararlılığına negatif olarak etki ettiği; bu anlamda CE- ICP-MS’in daha yararlı olduğu belirtilmiştir. Bu teknikte ise sadece bazı türler tespit edilebilmekte; bir kısmı da belirlenememektedir. Çalışmada toplam element tayini ICP- AES ile yapılırken; dinamik reaksiyon hücreli (DRC) ICP-MS de ikili teknikte kullanılmıştır. Çalışmada ayrıca DRC sisteminin etkisi DRC kullanılmayan matriks çalışmaları ile de gösterilmeye çalışılmıştır. Seçilen matriksteki (hayvan karaciğeri) -1 toplam mangan düzeyi 1,8 ± 0,08 mg kg olarak belirlenirken; manganın karaciğerde % 90’dan fazlasının yüksek moleküler yapılar ile, yaklaşık % 7’ sinin de düşük moleküler yapılar ile ilişkili olduğu belirtilmiştir. 49 Quintana ve ark. (2006) tarafından yapılan benzer bir çalışmada farklı olarak CE-ICP- MS çalışmasına ilaveten SEC-ICP-MS çalışması da yapılmıştır. Önce boyut karakterizasyonu yapılmış ve toplanan fraksiyonların tayinine yönelik olarak CE-ICP- MS kullanılmıştır. Belirlenen Mn türleri baskın olarak Mn-enzim bileşikleridir. Tipik Mn taşıyıcısı Mn-albumin iken; Mn-transferrin, SEC ayrımı sırasında parçalanmaktadır. Bu da ilgili türün kararlı yapıda olmamasından kaynaklanmaktadır. Bu çalışmada toplam metal tayini ICP-OES ile yapılırken; kullanılan DRC sisteminin “sinyal/gürültü” oranına etkisi ile girişim giderimindeki rolü belirtilmektedir. Michalke (2004) tarafından yapılan çalışmada mangan türlendirmesinde CE-ICP-MS kombinasyonu ele alınmıştır. Çalışmada biyolojik fonksiyonu olan, karaciğerde biriken ve aşırısının baskın olarak beyine taşındığı belirtilen Mn türleri karaciğer ekstraktlarında incelenmiştir; Tekniğin kullanımındaki amaç, türlerin hızlı ve değişime uğramadan tayinlerini sağlamaktır. Herhangi bir durgun faz ile etkileşimin olmadığı ve böylece de tür kararlılığına katkıda bulunan CE, bu anlamda oldukça önemli bir teknik olarak ele alınmıştır. Manganın albumin veya transferin ile oluşturduğu kararsız kompleksler kuvvetli anyon değiştirici (SAX) ayrımı sırasında kolayca parçalandıkları için CE kombinasyonu önemli görülmekledir. İnorganik mangan, Mn-arginaz, Mn-transferrin, Mn-sitrat olabileceği belirtilen türler ilgili standartların elektrofreogramları ile karşılaştırılarak tespit edilmiştir. Gomez-Ariza ve ark. (2007) tarafından Mn, Ni, Zn ve Cu elementlerine ilişkin molekül dağılım desenlerinden yararlanılarak yüksek protein içerikli ve önemli bir gıda katkı maddesi olan çam fıstığı matriksinde incelemeler yapılmıştır. Bu amaçla boyut eleme kromatografisinin (SEC), kesiksiz olarak ultraviyole spektrometresi (UV) ve ICP-MS ile birleştirilmesinden yararlanılmıştır. Dou ve ark. (2009) tarafından yapılan çalışmada yapraklardaki toplam manganın yaklaşık % 55–75 inin çözünür fraksiyonda olduğu, % 18’ inin de hücre duvarında, çok az miktarda Mn’ın ise hücresel organeller ve hücre membran fraksiyonunda olduğu belirtilmiştir. 50 Çevre örneklerinde taşınım ve biyoyararlılık kimyasal forma bağlıdır (Krasnodebska- Ostrega ve ark. 2009) Elementler toprak, çökeller ve atıklarda kompleks, değişebilir anyon, organik bağlı, oksitleri-karbonatları veya fosfatları şeklinde çökebilen yapıda ya da kristal yapısında farklı fizikokimyasal formlarda bulunabileceğinden çevre örneklerinden metalurjik atıklarda Krasnodebska-Ostrega ve ark. (2009) tarafından ardışık ekstraksiyon yöntemleri ile Mn dahil pek çok element için değerlendirilmeler yapılmıştır. 2.10.2. Bakır Bakır biyolojik sistemler ve yaşayan organizmalarda en az otuz önemli enzim için kofaktör olarak görev yapan lüzumlu bir eser elementtir; aynı zamanda hayvan, bitki ve mikroorganizmalarda bulunan önemli bir biyoelementtir. Çoğu biyolojik sistemlere, derişim düzeyine bağlı olarak hem yararlı hem de toksik etki gösterebilmektedir. En -1 fazla tolere edilebilir günlük alınımı vücut ağırlığı bazında 0,5 mg kg dır. Biyosistemlerde iki karakteristik formda bulunur; bunlar Cu (I) ve Cu (II) oksidasyon basamakları olup yükseltgenme-indirgenme işlemlerinde yer alırlar. Dikkate değer bir fonksiyonu da demir metabolizmasındaki etkisidir (Abbasi ve ark. 2010). Bakır ayrıca karbonhidrat ve lipid metabolizmalarında da önemlidir (Xiang ve ark. 2010). Mevsim, toprak kalitesi, coğrafya, su kaynağı ve gübre kullanımı gibi faktörler gıdadaki nihai bakır içeriklerini etkilemektedir. Gıda, içme suyu ve bakır içeren takviyeler bakırın temel kaynaklarıdır. Metalin solunum yolu ile veya deri üzerinden alımı ihmal edilebilir. Gıdalardaki doğal bakır içerikleri değiştiğinden diyetteki bakır içeriği de büyük ölçüde değişir. (de Romana ve ark. 2011). Sınırları ile ilgili başka kaynaklara göre; yetişkin insanlarda günlük bakır alımı 0,6 ile 1,6 mg arasında değişmektedir (Tapiero ve ark. 2003). Genellikle 1,5–2 mg bakır alımı −1 zaruri olup en azından 40 ng mL düzeyi pek çok yaşayan organizmada normal metabolik faaliyetler için gereklidir. Avrupa komisyonunca içme sularında bakır için 2 −1 µg mL limit önerilmiştir. Farklı standartlarda bu değer biraz daha az olabilmektedir −1 −1 (1,3 µg mL Amerika Birleşik Devletleri; 1,0 µg mL Kanada gibi) (Xiang ve ark. 2010). Günlük tavsiye edilen alımı 1 mg iken 1–3 mg arası güvenli seviye olarak kabul edilir (Ruzik 2012). Bu nedenlerle gıda örneklerindeki düşük bakır düzeylerinin dahi 51 kontrol edilmesi artan bir öneme sahiptir. Bu amaca yönelik olarak da oldukça hassas, basit, hızlı ve ucuz metotlar gereklidir (Xiang ve ark. 2010). Bakır için birincil kaynaklar tohumlar, tahıllar, fındık, fasulye, kabuklu deniz ürünleri ve karaciğerdir. İnsanlarda normal sınırlarda alımda % 55–75’i gıdalardan absorbe edilmektedir (Ruzik 2012). Bakır lüzumlu olmakla birlikte; bu elementin yüksek miktarları zararlı da olabilmektedir. Bitkide çok düşük düzeylerde gerekli olmakla birlikte; yüksek düzeylerde toksik etki gösterebilir. Yüksek düzeylerde, bitkide, hücre membranına bağlanabilir ve hücre duvarındaki taşınım sürecini engelleyebilir (Durukan ve ark. 2011). Böylece fitokimyasal işlemleri olumsuz etkileyebildiği belirtilmiştir. Bakır pek çok endüstride önemli bir elementtir; diğer taraftan yüksek düzeyde bakır alımı kusma, bulantı, ishal, karaciğer veya böbrek hasarı ve hatta ölüme bile neden olabilmektedir (Durukan ve ark. 2011). Çeşitli örneklerdeki bakır seviyeleri de düşük olduğundan, gıda ve biyolojik örneklerdeki bakır düzeylerinin belirlenmesinde hassas ve seçici teknikler gereklidir. (Abbasi ve ark. 2010). Eser element analzinde kullanılacak tekniğin duyarlılığı yüksek olmalıdır. Girişimlerden uzak ve en az düzeyde reakif kullanımı ile basit bir örnek hazırlama basamağı içermeli, hızlı element tayinine de imkan vermelidir (Silvestre ve ark. 2000). ICP-MS yüksek duyarlılığı ile bir ön deriştirme basamağına gerek kalmadan tayine imkan verir. Böylece bu basamak ile ilgili problemler de giderilmiş olur (Ciceri ve ark. 2008). 52 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Çalışmada kullanılan analitik cihazlar ve parçaları 3.1.1.1. İndüktif eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi ICP-MS analizlerinde PerkinElmer marka ELAN 9000 model ve yazılım programı sürümü 3,4 olan ICP-MS (PerkinElmer SCIEX) kullanılmıştır. Cihazda PerkinElmer marka S10 model otomatik örnek verici ile türlendirme çalışmalarına imkan veren Chromera yazılımı kullanılmıştır. Chromera yazılımın sürümü, 1.2.254.0’dır. ICP-MS cihazına; scott, siklonik (cyclonic), ryton karşı akış, düşük akış ve meinhard tipi sisleştiri sistemleri ve parçaları takılabilmektedir. Cihaza ayrıca; 2ºC ve -5ºC’ de çalışabilen PC3 model (Elemental Scientific) peltier soğutmalı siklonik sisleştirici odası aparatı da takılabilmektedir. Kullanılan cihaz, Ek-1’de gösterilmiştir. 3.1.1.2. Yüksek basınç sıvı kromatografisi Çalışmada, PerkinElmer marka Series 200 model yüksek basınç sıvı kromatografi cihazı kullanılmıştır. Cihaz; Series 200 kolon fırını, Series 200 pompa, Series 225 otomatik örnek verici ve Series 200 EP foto diyod serili dedektörden oluşmaktadır. Ayrıca cihaza; 150 mm uzunluğunda, 4,6 mm iç çap ve 5 µm film kalınlığına sahip PerkinElmer marka Brownlee Analytical DB Aq C18 kolonu bağlanmıştır. Kullanılan cihaz Ek-1’de gösterilmiştir. 3.1.1.3. HPLC-ICP-MS arayüzü için çevirici valf İkili teknikte, Rheodyne marka, altı kanallı ve iki pozisyonlu (PerkinElmer N8122251) çevirici valf kullanılarak HPLC-ICP-MS analizleri yapılmıştır. 53 1 3.1.1.4. Alevli atomik absorpsiyon spektrometresi Mangan ve bakır analizlerinde karşılaştırma tekniği olarak Varian marka, AA240FS model atomik absorpsiyon spektrometresi kullanılmıştır. 1 3.1.1.5. Gaz kromatografisi Fındık örneklerinin yağ asitleri bileşimi analizlerinde Shimadzu marka, GC-17 A model, alev iyonlaşma dedektörüne sahip gaz kromatografisi kullanılmıştır. Cihaza; 30 m uzunluğunda, 0,25 mm iç çap ve 0,25 µm film kalınlığına sahip DB-WAX analitik kolonu bağlanarak kullanılmıştır. 3.1.2. Çalışmada kullanılan temel laboratuar cihazları 3.1.2.1. Su banyosu Biyoyararlılık çalışmalarında, Clifton marka NE1-22 model su banyosu kullanılmış olup; su banyosu sıcaklığı 37 ºC’ye ayarlanmıştır. 3.1.2.2. pH-Metre Fraksiyonlama ve biyoyararlılık çalışmalarında, IQ Scientific Instruments marka Minilab IQ125 model pH-metre kullanılmıştır. 3.1.2.3. Ultrasonik karıştırıcı Örnek hazırlama basamaklarında, ELMA marka LC-30H model ultrasonik karıştırıcı kullanılmıştır. Bu karıştırıcı için ultrasonik frekans 35 kHz ve güç 240 W değerindedir. 1 İlgili analitik cihazlar ile ilgili deneysel işlemler; Tübitak Bursa Test ve Analiz Laboratuvarı’nda hizmet alımı kapsamında, uygulamalı olarak gerçekleştirilmiştir. 54 3.1.2.4. Etüv 1 Örnek hazırlama basamaklarında, Termo Scientific marka Heraeus model etüv ve Nüve marka EN 500 model etüv kullanılmıştır. 3.1.2.5. Terazi Deneysel işlemler sırasında, ± 0,0001 g duyarlıklı Gec Avery marka analitik terazi ile ± 1 0,001 g duyarlıklı Sartorius BP310S kullanılmıştır. 3.1.2.6. Santrifüj aleti Fraksiyonlama ve biyoyararlılık çalışmalarında, MSE MISTRAC marka 2000 model santrifüj cihazı kullanılmıştır. Cihaz, deneysel ayırmalar sırasında 4000 “devir/dakika” hızda çalıştırılmıştır. 1 3.1.2.7. Soxhlet ekstraksiyon sistemi Örneklerdeki yağ içeriklerinin ekstraksiyonunda altı hazneli Gerhardt soxhlet ekstraksiyon sisteminden yararlanılmıştır. 1 3.1.2.8. Vorteks cihazı Fındık örneklerinin yağ asitleri metil esterlerinin hazırlanmasında, VELP Scientifica marka ZX Classic model vorteks karıştırıcı kullanılmıştır. 1 3.1.2.9. Kül fırını Makro bileşen analizlerinde, Nabertherm marka L3-12/S27 model kül fırını kullanılmıştır. 1 İlgili analitik cihazlar ile ilgili deneysel işlemler; Tübitak Bursa Test ve Analiz Laboratuvarı’nda hizmet alımı kapsamında, uygulamalı olarak gerçekleştirilmiştir. 55 1 3.1.2.10 Kjeldahl aparatı Toplam azot ve protein analizlerinde, Foss marka Tecator 2006 model Kjeldahl ilkesine dayanan aparat kullanılmıştır. 1 3.1.2.11. Otomatik destilasyon ünitesi Toplam azot ve protein analizlerinde, Foss marka Kjeltec 2200 model otomatik destilasyon ünitesi kullanılmıştır. 1 3.1.2.12. Diyet lif/ham selüloz tayin cihazı Diyet lif ve ham selüloz tayinlerinde Velp Scientifica marka Fiwe model ekstraktör kullanılmıştır. 1 3.1.2.13. Döner vakumlu buharlaştırıcı Örneklerden organik çözgen uzaklaştırılması amacı ile Buchi marka R-3000 model, döner vakumlu buharlaştırıcı kullanılmıştır. 1 3.1.2.14. Mikrodalga parçalama sistemi Örneklerin çözünürleştirilerek homojenleştirilmesi amacı ile Milestone marka MLS 1200 mega model mikrodalga parçalama sisteminden yararlanılmıştır. 1 3.1.2.15. Liyofilizatör (dondurarak kurutma cihazı) Ispanak örnekleri ile ıspanak ve un sertifikalı referans malzemelerinin (SRM) kurutulmasında Labconco FreeZone 1 liyofilizasyon cihazı kullanılmıştır. 1 İlgili analitik cihazlar ile ilgili deneysel işlemler; Tübitak Bursa Test ve Analiz Laboratuvarı’nda hizmet alımı kapsamında, uygulamalı olarak gerçekleştirilmiştir. 56 3.1.2.16. Saf su cihazı Çalışmalarda kullanılan çözeltilerin hazırlanmasında Human firmasının Zeneer Power I model ve Scholar UV tip ultra saf su düzeneği (Human Corporation) kullanılmıştır. Su kalitesi ise 18,3 MΩ.cm’ dir. 3.1.2.17. Katı faz ekstraksiyon sistemi Katı faz ekstraksiyon çalışmaları için Agilent marka aynı anda on iki ekstraksiyon yapılabilen vakum manifoldu kullanılmıştır. Sisteme KNF marka ve N 022 AN.18 model vakum pompası bağlanmıştır. 3.1.2.18. Süzme düzeneği Süzme işlemleri için Sartorius marka 16307 model, cam ve vakumda süzme sağlayan aparat kullanılmıştır. Sisteme KNF marka ve N 022 AN.18 model vakum pompası bağlanarak kullanılmıştır. 3.1.2.19. Manyetik karıştırıcılı ısıtıcı Örnek hazırlama işlemleri sırasında, Chiltern Scientific marka HS31 model manyetik karıştırıcılı ısıtıcı kullanılmıştır. 3.1.3. Çalışmada kullanılan kimyasallar, sarf malzemeler, numuneler ve çözeltiler 3.1.3.1. Analitik saflıktaki kimyasallar ve sarf malzemeler -11000 µg mL Mn (II) stok çözeltisi, % 3 (v/v) HNO3 içinde, sertifika konsantrasyonu: -1 1,006 ± 5 µg/mL ve sertifika yoğunluğu 1,020 g mL (20 ± 1°C’de) (Inorganic Ventures) 57 -11000 µg mL Cu (II) stok çözeltisi, % 3 (v/v) HNO3 içinde, sertifika konsantrasyonu: -1 999 ± 5 µg/mL ve sertifika yoğunluğu 1,016 g mL (20 ± 1°C’de) (Inorganic Ventures) -11000 µg mL İndiyum (In) (II) stok çözeltisi, , % 2 (v/v) HNO3 içinde, sertifika -1 konsantrasyonu: 999 ± 5 µg/mL ve sertifika yoğunluğu 1,010 g mL (20 ± 1°C’de) (Inorganic Ventures) ICP-MS multi-element kalibrasyon standart çözeltisi VI, Merck 110580, 30 element 1 içerikli, % 5 (v/v) HNO3 içinde, Certipur® (Merck) 1PerkinElmer N8125032 “ELAN 6100/Dual detector” çözeltisi (PerkinElmer SCIEX) PerkinElmer N8125030 “ELAN 6100/Setup/Stab/Masscal” çözeltisi (PerkinElmer 1 SCIEX) PerkinElmer N8125031 “ELAN 6100/Detection Limit” çözeltisi (PerkinElmer 1 SCIEX) 1PerkinElmer N8125040 “Smart Tune” çözeltisi (PerkinElmer SCIEX) Amonyak, Merck 105432, (NH3, % 25, proanalysi) (Merck) Aseton, Merck 100020, (CH3COCH3, LC saflıkta, LiChrosolv) (Merck) Dietil Eter, Merck 100921, ((C2H5)2O, EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur (Merck) ®Etanol, Sigma-Aldrich 34870, (CH3CH2OH, CHROMASOLV , HPLC saflıkta (Sigma-Aldrich) Hidrojen peroksit, Merk 107209, (%30, EMSURE® ISO) (Merck) Hidrojen peroksit, suprapur, Merk 107298, (H2O2, %30, 1L=1,11 kg) (Merck) Hidroklorik asit, suprapur, Merck 100318, (HCl, %30, 1L=1,15 kg) (Merck) izobütil metil keton, Merck 820820, (C6H12O, EMPLURA®) (Merck) Kloroform, Merck 102444, (CHCl3, LC saflıkta, LiChrosolv) (Merck) Metanol, Merck 106007, (CH3OH, LC saflıkta, LiChrosolv) (Merck) Metanol, Merck 106035, (LC-MS saflıkta, LiChrosolv) (Merck) n-hekzan, Merck 104391, (CH3(CH2)4CH3, LC saflıkta, LiChrosolv) (Merck) Nitrik asit, suprapur, Merk 100441, (HNO3, % 65, 1L=1,39 kg) (Merck) 1 İlgili çözeltiler, ICP-MS cihazının analize hazırlanması için kullanılmıştır. 58 1-oktanol (n-oktanol), Merck 100991, (C8H18O, EMPLURA) (Merck) -3Sülfürik Asit, Merck 100731, (H2SO4, 95–97%, d=1,84 g cm (20 °C), EMSURE® ISO) (Merck) Aktif Karbon (toz form, AOX Batch, PPTRE0049 ( Euroglass, UK) Mangan (IV) oksit, Merck 805958 (MnO2) (Merck) Mangan (III) asetat dihidrat, Aldrich 215880, (C6H9MnO6·2H2O, % 97) (Sigma- Aldrich) Sodyum hidrojen karbonat, Carlo Erba 478537 (NaHCO3) (Carlo Erba RPE) Pepsin, Sigma P7000 (Sigma-Aldrich) Pankretain, Sigma P1750 (Sigma-Aldrich) Safra Tuzları, Sigma B8631 (Sigma-Aldrich) Yüksek saflıkta Argon gazı (%99,999 saflıkta), (Orsez (Bursa-Türkiye)) Saf Oksijen gazı (Habaş-Türkiye) Azot gazı, %99,995 saflıkta, (Orsez (Bursa-Türkiye)) -1 11000 mg L Mn (II) stok çözeltisi, Merck 119789, HNO3 içinde Mn(NO3)2 (Merck) -1 11000 mg L Cu (II) stok çözeltisi, Merck 119786, HNO3 içinde Cu(NO3)2, (Merck) 1Asetik asit, Sigma 27225 (CH3CO2H, %98,5-100,5 (Sigma-Aldrich) 1Aseton, Merck 100014, LC saflıkta, LiChrosolv (Merck) 1Borik asit, J.T. Baker – 0501 (H3BO3) (J.T.Baker) 1Carez I çözeltisi, 102050, Bursa teknik Kimya test kitleri ve ayarlı çözeltileri, Bursa 1Carez II çözeltisi, 102060, Bursa teknik Kimya test kitleri ve ayarlı çözeltileri, Bursa 1Dietil eter, Sigma 31700 (Sigma-Aldrich) Di-sodyum hidrojen fosfat, Merck 106586 (Na2HPO4, susuz, EMSURE® ACS,Reag. 1 Ph Eur) (Merck) 1Etanol, Merck, 100983, (EMSURE® ACS, ISO, Reag. Ph Eur (Merck) F.A.M.E. karışım C4-C24 standardı, Supelco 18919-1AMP (Supelco, Sigma- 1 Aldrich) 1Fenolftalein, Carlo Erba 451154 (Carlo Erba Reagents) 1 İlgili kimyasallar; Tübitak Bursa Test ve Analiz Laboratuvarı’nda hizmet alımı kapsamında uygulamalı olarak gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda, kurumun deposundan alınarak kullanılmıştır. 59 1Hidrojen peroksit çözeltisi, Sigma-Aldrich 18304, % 34,5-36,5 (Sigma-Aldrich) -3Hidroklorik asit, Merck 100317 (dumanlı, %37, d=1,19 g cm (20 °C), EMSURE® 1 ACS,ISO,Reag. Ph Eur) (Merck) 1İzooktan, Labscan C21C11X, 2,2,4-trimetil pentan, HPLC saflıkta (Labscan) 1Kjeldahl tableti, Foss 15270003 Kjeltabs S-3.5 (Foss) Kuvartz kum, Merck 107536 (Kuvartz ince granüllü, yıkanmış ve kalsine edilmiş) 1 (Merck) 1Luff çözeltisi, 111030, Bursa teknik Kimya test kitleri ve ayarlı çözeltileri, Bursa 1Metanol, Sigma 34885 (Sigma-Aldrich) 1Nişasta, Merck 101252 (Merck) 1Nitrik Asit, Sigma-Aldrich 07006, % 64-66 (Sigma-Aldrich) 12-oktanol, Merck 820925 (CH3(CH2)5CH(OH)CH3, sentez saflıkta) (Merck) 1Potasyum hidroksit, Merck 105033 (KOH, EMSURE®) (Merck) 1Potasyum iyodür, Merck 105043 (KI, EMSURE® ISO,Reag. Ph Eur) (Merck) 1 Potasyum iyodür, Sigma 03124 (%99,0–100,5) (Sigma-Aldrich) Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat, Merck 106349 (NaH2PO4.H2O, EMPROVE®) 1 (Merck) 1Sodyum hidrojen sülfat monohidrat, Merck 106350 (NaHSO4.H2O) (Merck) 1Sodyum hidroksit, Sigma 06203 (NaOH, %98-100,5) (Sigma-Aldrich) -1 1Sodyum tiyosülfat çözeltisi, Merck 109950 0,1 mol L (0,1 N) Titrisol® (Merck) -3 1Sülfürik asit, Merck 100731 (% 95-97, d=1,84 g cm , EMSURE® ISO) (Merck) 1Toplam Diyet Lif Analiz Kiti, TDF100A (Sigma-Aldrich) 3.1.3.2. Sertifikalı Referans Malzemeler NIST 1570a ıspanak yaprakları (NIST (National Institute of Standards and Technology) NIST 1567a buğday unu (NIST) 1 İlgili kimyasallar; Tübitak Bursa Test ve Analiz Laboratuvarı’nda hizmet alımı kapsamında uygulamalı olarak gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda, kurumun deposundan alınarak kullanılmıştır. 60 1LGC7162 çilek yaprakları (LGC Standards) 1NCS ZC73014 çay (National Analysis Center for Iron and Steel) 1IAEA-359 lahana (International Atomic Energy Agency) 3.1.3.3. Diğer sarf malzemeler 2 ml hacminde ve 9 mm genişlikte screw cap şeffaf vial (PerkinElmer N9306201) 9 mm genişlikte PTFE tek yarıklı ve silikon septumlu şeffaf vial kapağı (PerkinElmer N9306203) 20 ml hacminde, vida kapaklı şeffaf vial (Supelco, Sigma Aldrich) 40 mL hacminde, vida kapaklı şeffaf vial (Supelco, Sigma Aldrich) Double Rings 103 (12,5 cm) marka ve model mavi bant süzgeç kağıdı Millipore 0,45 µm şırınga tipi tek kullanımlık hidrofilik PVDF filtre(Millex-HV, Millipore) AIM marka 0,22 µm ve 25 mm şırınga tipi tek kullanımlık hidrofilik PVDF filtre 0,22 µm PVDF, Hidrofilik, 100 mm, Durapore membran filtre (Millipore) 0,45 µm PVDF, Hidrofobik, 90 mm, Durapore membran filtre (Millipore) 0,5–10 µL hacim aralığında çalışılabilen Eppendorf mikropipet ve pipet uçları 10–100 µL hacim aralığında çalışılabilen Eppendorf mikropipet ve pipet uçları 100–1000 µL hacim aralığında çalışılabilen Eppendorf mikropipet ve pipet uçları 500–5000 µL hacim aralığında çalışılabilen Eppendorf mikropipet ve pipet uçları 15 mL hacminde vida kapaklı polipropilen santrifüj tüpü (falkon tüp) (steril ve steril olmayan) 50 mL hacminde vida kapaklı polipropilen santrifüj tüpü (falkon tüp) (steril ve steril olmayan) Kapaklı, 100 mL hacimli polipropilen saklama kapları Porselen havan ve tokmağı Kalaycı pamuğu, kaynama taşı, kaba süzgeç kağıdı 1 İlgili Sertifikalı Referans Malzemeler; Tübitak Bursa Test ve Analiz Laboratuvarı’nda hizmet alımı kapsamında uygulamalı olarak gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda, kurumun deposundan temin edilerek kullanılmıştır. 61 Gooch krozeleri Agilent marka SampliQ SCX kartuş tipi kuvvetli katyon değiştirici kolonlar (sülfonik asit-modifiye divinil benzen yapılı 30 mg polimerik dolgu maddeli ve 3 mL kartuş hacimlidir) 3.1.3.4. Numuneler Biri Karadeniz bölgesinden (Giresun) temin edilmiş, diğeri yine Karadeniz bölgesi kaynaklı olup paketlenmiş, satışa sunulan ve sonuncusu da iç pazardan ve pazarı yansıtması için değişik yerlerden elde edilerek eşit kütlede karıştırılan üç farklı iç fındık örneği ayrı ayrı ve homojen olarak öğütülmüştür. Ispanak için kış mevsiminde birer hafta ara ile pazardan (Bursa) elde edilen ıspanak örneklerinin yaprakları alınarak dondurarak kurutma işleminden sonra kullanılmıştır. Buğday unu örnekleri için marketten (Bursa) elde edilen, etiketinde İç Anadolu kaynaklı olduğu belirtilen ve paketlenmiş üç farklı numune ayrı ayrı homojenize edilerek deney numuneleri olarak kullanılmıştır. Yağmur suyu örnekleri olarak Bursa’da Şubat-Mart 2013 tarih aralığında farklı zamanlarda aynı bölgeden toplanan yağmur suları kullanılmıştır. 3.1.3.5. Deneysel işlemlerde kullanılacak çözeltilerin hazırlanması 3.1.3.5.1. ICP-MS çalışmaları ve örnek hazırlamada kullanılmak üzere yaklaşık 0,1 N, 1 N ve 2 N nitrik asit çözeltilerinin hazırlanması Yaklaşık 0,1 N nitrik asit çözeltisi, 1 mL (1,39 g) nitrik asit (suprapur) alınarak balon jojede 100 mL’ye ultra saf su ile tamamlanarak hazırlanmıştır. (çözelti derişimi 0,1434 N’ dir). 10 mL nitrik asit balon jojede 100 mL’ye tamamlanarak da yaklaşık 1 N nitrik asit çözeltisi hazırlanmıştır. Aynı şekilde 20 mL nitrik asit, 100 mL’ ye tamamlanarak 2 N nitrik asit çözeltisi hazırlanmıştır. 62 3.1.3.5.2. Biyoyararlılık çalışmaları için gerekli çözeltilerin hazırlanması 3.1.3.5.2.1. Yaklaşık 0,1 N HCl çözeltisinin hazırlanması Suprapur HCl çözeltisinden 1058 µL alınarak balon jojede 100 mL’ye ultra saf su ile seyreltilerek hazırlanmıştır. 3.1.3.5.2.2. Yaklaşık 0,1 N NaHCO3 çözeltisinin hazırlanması NaHCO3 katısından 0,4573 gram alınarak bir miktar suda çözüldükten sonra balon jojede 50 mL’ye ultra saf su ile seyreltilerek hazırlanmıştır (0,1089 N NaHCO3 çözeltisi hazırlanmıştır) 3.1.3.5.2.3. Pepsin çözeltisinin hazırlanması 0,4069 g pepsin, 10 mL 0,1 M HCl çözeltisinde çözünerek pepsin enzim çözeltisi hazırlanmıştır. 3.1.3.5.2.4. Pakreatin çözeltisinin hazırlanması 0,4584 g safra tuzu ve 0,0751 g pankreatin, 37,5 mL yaklaşık 0,1 N NaHCO3 çözeltisinde çözülerek pankreatin/safra tuzları enzim çözeltisi hazırlanmıştır. 3.1.3.5.3. Örneklerdeki temel bileşenlerin analizleri için gerekli çözeltilerin hazırlanması 3.1.3.5.3.1. Ham selüloz tayini için gerekli sülfürik asit ve sodyum hidroksit çözeltilerinin hazırlanması Yaklaşık % 1,25 (m/v) sülfürik asit ve sodyum hidroksit çözeltilerinin hazırlanması için; 12,5 g NaOH bir miktar suda çözüldükten sonra balon jojde 1 L’ye -1 tamamlanmıştır. Sülfürik asitten ise yoğunluk değeri olan 1,84 g mL kullanılarak 63 hesaplama yapıldığında % 1,25 (m/v) için derişik asitten yaklaşık 6,79 mL sülfürik asit (derişik asit yaklaşık % 100’lük kabul edildiğinde) alınarak balon jojede 1 L’ye tamamlanarak hacimde kütlece yüzdesi 1,25 olan çözeltiler hazırlanmıştır. 3.1.3.5.3.2. Protein tayini için gerekli çözeltilerin hazırlanması % 4’lük borik asit için 4 g borik asit bir miktar suda çözüldükten sonra saf su ile balon jojede 100 mL’ye tamamlanmıştır. 0,02 N HCl ise derişik HCl’ den (% 37’lik d=1,19 g -3 cm ) 1,68 mL alınarak balon jojede 1000 mL’ye saf su ile tamamlanarak hazırlanmıştır. 3.1.3.5.3.3. Şeker tayini için gerekli çözeltilerin hazırlanması % 20’lik (m/v) potasyum iyodür (KI) veya potasyum hidroksit (KOH) çözeltileri için 20 g KI (veya KOH) saf suda çözülerek son hacmi 100 mL’ye tamamlanmıştır. Nişasta çözeltisi de aynı şekilde 1 g nişasta alınarak son hacmi 100 mL olacak şekilde hazırlanmıştır. %1’lik fenolftalein indikatör çözeltisi için benzer yaklaşım ile 1 gram fenolftalein alınıp çözülerek etil alkolde ve balon jojede 100 mL’ye tamamlanmıştır. Yaklaşık % 25 sülfürik asit (m/v) için; 25 gram sülfürik asitin hacim olarak karşılığı -1 yoğunluk değerinden (1,84 g mL ) belirlenmiş; derişik asitten 13,59 mL alınarak (derişik asit yaklaşık %100’lük kabul edildiğinde) balon jojede 100 mL’ye tamamlanıp hacimde kütlece yüzdesi yaklaşık % 25 olan çözelti hazırlanmıştır. 3.1.3.5.3.4. Diyet lif tayini için gerekli çözeltilerin hazırlanması Çözeltiler AOAC 985.29 standardına göre hazırlanmıştır. Yaklaşık % 78 etanol çözeltisi için 207 mL su 1 L balon jojeye konur ve % 95 lik etil alkol ile 1 L’ye seyreltilir. 1 hacim su 4 hacim etil alkol ile karıştırıldığında da yaklaşık aynı yüzdede çözelti hazırlanmış olur. Standartta önerilen fosfat tamponu (0,08M yaklaşık pH=6; 1,400 g susuz disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) ve (veya 1,753g dihidratı) 9,68 g sodyum dihidrojen fosfat mono hidrat (NaH2PO4.H2O) (veya 10,94 g dihidratı) 700 mL suda çözülür, 1 L’ye tamamlanır ve yaklaşık pH değeri ayarlanır. Yaklaşık 0,275M NaOH çözeltisi için 11 g NaOH ACS (Amerikan Chemical Society) katısı yaklaşık 700 mL saf 64 suda çözülerek 1 L’ ye tamamlanır. 0,325 M HCl çözeltisi ise 1 M HCl çözeltisinden 1 325 mL alınıp 1 L’ye tamamlanarak hazırlanır (AOAC 985.29) . 1M HCl çözeltisi -3 hazırlamak için de % 37’lik d=1,19 g cm olan hidroklorik asitten 82,99 mL alınarak balon jojede saf su ile 1000 mL’ ye tamamlanır. 3.1.3.5.4. Yağ asidi metil esterleri oluşturmak için metanolik potasyum hidroksit çözeltisinin hazırlanması İlgili çözelti 100 mL metanol ve 13,1 g KOH kullanılarak hazırlanmıştır. 3.1.3.5.5. Katı faz ekstraksiyonu için gerekli çözeltilerin hazırlanması 3.1.3.5.5.1. Metanolde % 0,1 (v/v) formik asit çözeltisinin hazırlanması 100 µL formik asit alınarak metanol ile 100 mL’ye tamamlanmıştır. Çözelti, katı faz kartuş kolonların şartlandırılması için kullanılmıştır. 3.1.3.5.5.2. Suda % 2 (v/v) formik asit çözeltisinin hazırlanması 2 mL formik asit alınarak ultra saf su ile 100 mL’ye tamamlanmıştır. Çözelti, katı faz kartuş kolonların şartlandırılması için kullanılmıştır. 3.1.3.5.5.3. Suda % 0,5 (v/v) amonyak çözeltisinin hazırlanması 2 mL amonyak ultra saf su ile 100 mL’ye tamamlanarak katı faz kartuş kolondan elüsyon için kullanılan çözelti hazırlanmıştır. Elüsyon için literatürde önerilen çözelti (Anonim 2010) ICP-MS şartlarına göre uyarlanarak kullanılmıştır. 1 AOAC 985.29: Total Dietary Fibre in Foods Enzymatic-Gravimetric Method’ unu göre hazırlanmıştır. 65 3.2. Yöntem 3.2.1. Örneklerin analize hazırlanması 3.2.1.1. Ispanak örneklerinin liyofilizasyon işlemine tabi tutulması Ispanak yaprakları köklerden ve saplardan ayıklanarak makro kirliliklerin uzaklaştırılması için önce çeşme suyu ile daha sonra da ultra saf su ile birkaç kez yıkanmıştır. Yapraklar el yardımı ile küçük parçalara ayrılmış; en az 24 saat süre ile kapaklı cam viallerde −20 °C’de derin dondurucuda tutulmuştur ve daha sonra −45 °C ve 0,057 mBar şartlarında liyofilizasyon işlemine tabi tutulmuştur. Kurutulan örnekler porselen havanda öğütülerek homojenize edilmiş ve kapaklı polipropilen kaplarda muhafaza edilmiştir. Buğday unu örnekleri homojenize edilmiş; iç fındık örnekleri ise önce porselen havanda öğütülerek belirli tanecik boyutuna getirildikten sonra homojenize edilmiş ve her iki örnek de ıspanak örnekleri gibi kapaklı polipropilen kaplarda muhafaza edilmiştir. 3.2.1.2. Örneklerinin mikrodalga parçalama yöntemi ile AAS analizine hazırlanması Numunelerin mikrodalga parçalama ve sonrasında AAS ile analizi DS/EN 14084 1 standardı temel alınarak ve bazı değişiklikler yapılarak gerçekleştirilmiştir. Bu amaç ile homojenize edilmiş örneklerden 0,5’er g alınmış; 6 mL HNO3 ve 1 mL H2O2 kullanılarak parçalanmıştır. Parçalanan örnekler oda sıcaklığına soğutulduktan sonra polipropilen santrifüj tüplerine alınarak 25 mL hacim değerine seyreltilmişlerdir. Sertifikalı referans malzemeler, standart katmalı örnekler veya çözgen kör örmekleri de aynı şekilde hazırlanmıştır. Standart katma işlemi matrikslere parçalama işlemi öncesi -1 0,1 mg L Mn ve Cu standardı eklenerek gerçekleştirilmiştir. 1 “DS/EN 14084: Foodstuffs - Determination of trace elements - Determination of lead, cadmium, zinc, copper and iron by atomic absorption spectrometry (AAS) after microwave digestion” (TS EN 14084: Gıdalar - Eser elementlerin tayini - Mikrodalga ile parçalama işleminden sonra kurşun, kadmiyum, çinko, bakır ve demirin atomik absorpsiyon spektrometri (AAS) ile tayini) 66 Uygun standart çözeltiler ile kalibrasyon eğrisi çizildikten sonra örnekteki metal derişiminin belirlenmesi için aşağıdaki eşitlikten yararlanılmıştır. w=[(a-b)/m].v (3.2.1.2) -1 w: örnekteki mg kg olarak metal miktarı -1 a: mg L olarak örnekteki metal derişimi -1 b: mg L olarak çözgen kör örneğindeki metal derişimi v: örnek hacmi, mL m: örnek miktarı, g Belirleme ve tayin limiti belirlenirken de standart sapmalar temel alınmıştır. DS/EN 1 14084, bu amaç ile EN 13804 standardına yönlendirmektedir . 3.2.1.3. Örneklerinin ICP-MS analizine hazırlanması ICP-MS analizinde kullanılacak tüm deneysel malzemeler %10 (v/v) nitrik asit çözeltisinde tutulmuş, sonra ultra saf su ile birkaç kez yıkanıp etüvde kurutulmuştur. Mangan ve bakır standart çözeltileri, stok çözeltilerden günlük olarak seyreltilerek hazırlanmış ve kalibrasyon çözeltileri elde edilmiştir. İndiyum iç standart çözeltisi tüm -1 örnekler ve standartlara son derişim 10 µg L olacak şekilde eklenmiştir. Kalibrasyon -1 eğrileri 0,5 ve 40 µg L arasında sekiz noktalı olacak şekilde hazırlanmıştır. Standartlar da dahil tüm çözeltiler 0,45 µm PVDF filtrelerden süzülmüş ve analiz edilinceye kadar +4 ºC’de buzdolabında saklanmıştır. Mikrodalga parçalama işlemine tabi tutulan örnekler uygun seyreltme işlemleri yapıldıktan sonra ICP-MS cihazı ile de analiz edilmiştir. Tüm örnekler, standart malzemeler veya kör örnekler en az üç tekrarlı olarak çalışılmış ve analiz edilmiştir. 1 “EN 13804: Foodstuff - Determination of trace elements - Performance criteria, general considerations and sample prepatration” (TS EN 13804: Gıdalar - Eser elementlerin tayini - Performans ölçütleri, genel hususlar ve numune hazırlama) 67 3.2.2. ICP-MS için kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması –1 1000 mg kg stok mangan, bakır ve indiyum çözeltileri kullanılarak kalibrasyon -1 eğrileri oluşturulmuştur. Stok çözeltiden 1 mg kg ara stok çözeltisi hazırlanmış ve bu –1 ara stok çözeltileri de seyreltilerek 0,5–1,0–3–5–10–20–40–80 µg kg mangan ve bakır çözeltileri hazırlanmıştır. İndiyum ise gerekli olan tüm hallerde ve tüm çözeltilere 10 µg –1 kg olacak şekilde iç standart olarak eklenmiştir. 3.2.3. Fraksiyonlama çalışmaları için örneklerin hazırlanması Ispanak örneklerinden yaklaşık 0,01 gram; un örneklerinden yaklaşık 0,5 gram ve fındık örneklerinden 0,1–0,5 gram alınarak farklı çözgenler ile ekstraksiyon işlemlerine tabi tutulmuştur. Tüm örnekler en az üç tekrarlı olarak çalışılmıştır. 3.2.4. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki temel bileşenlerin belirlenmesi 3.2.4.1. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki nem içeriğinin belirlenmesi 1 Örneklerdeki nem içeriği ISO 771:1977, TS 3075 ve EN ISO 712 standartları temel alınarak ve bu standartlardan aşağıda özetlendiği şekilde uyarlanarak belirlenmiştir. Yöntemde örnekler sabit kütleye ulaşılıncaya dek, 105 ± 2 ºC’de etüvde kurutulmuştur. Bu amaç ile homojen hale getirilmiş ıspanak için yaklaşık 5 g, fındık için yaklaşık 10 g ve un için yaklaşık 5 g örnekler alınarak etüvde en az iki saat tutulmuştur. Fındık örnekleri için bu süre altı saat olarak uygulanmıştır. Desikatörde soğutulan örnekler tartılarak tekrar etüvde tutulmuş; sabit tartıma gelince bu tartım değerleri alınarak hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılmıştır. Örnekler üçer tekrarlı olarak çalışılarak her biri için hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılmış ve ortalama belirlenmiştir. U=Nem yüzdesi=((m1-m2)/(m1-mo))×100 (3.2.4.1) 1 “ISO 771:1977: Oilseed residues; Determination of moisture and volatile matter content” (TS ISO 771: Yağlı tohum kalıntıları - Rutubet ve uçucu madde içeriği tayini); TS 3075: İç fındık; “EN ISO 712: Cereals and cereal products - Determination of moisture content -Reference method” (TS EN ISO 712: Tahıl ve tahıl ürünleri-Rutubet muhtevası tayini- Referans yöntem) 68 U=örnekteki nem (veya uçucu madde) yüzdesi m0= Kapların kütlesi, (g) m1=Kap+numune kütlesi, kurutmadan önce (g) m2=Kap+numune kütlesi, kurutmadan sonra (g) 3.2.4.2. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki ham selüloz içeriğinin belirlenmesi 1 Örneklerdeki ham selüloz içeriği ISO 5498:1981 standardı temel alınarak ve bu standarttan aşağıda özetlendiği şekilde uyarlanarak belirlenmiştir. Yöntem, homojen hale getirilen ve gerekirse ön kurutma yapılan ve yağı uzaklaştırılan örneklerin standart derişimde önce sülfürik asit sonra da sodyum hidroksit kaynatılması, kurutulması ve kalıntının kütlesinin belirlenmesine dayanır. Bu amaç ile homojen hale getirilmiş ıspanak, un ve fındık örneklerinden yaklaşık birer gram alınarak uygun cam krozeye yerleştirilmiş ve krozeler tartılmıştır. Yaklaşık 1 g kadar kuvartz kum da krozelere alınmıştır. Krozeler sıcak ekstraktöre (Fibertec cihazına) yerleştirilerek 150 mL % 1,25’lik (m/v) sülfürik asit çözeltisi ilave edilmişir. Köpürmeyi önlemek için 2–4 damla arası 2-oktanol eklenmiş ve sülfürik asit ile kaynama başladıktan sonra 30 dakika süre ile sıcak ekstraksiyon uygulanmıştır. Örnekler 3×30 mL sıcak su ile yıkanmış ve kalıntıya 150 mL % 1,25’lik (m/v) sodyum hidroksit çözeltisi ilave edilerek ilk basamakta sülfürik asit için yapılan işlemler tekrarlanmıştır. Aynı şekilde yıkama işlemleri de bittikten sonra; krozeler, 130 ± 2 ºC’ye ısıtılmış etüvde en az üç saat tutulmuş, desikatörde oda sıcaklığına soğutulup sabit tartıma getirildikten sonra 525 ± 25 ºC’de en az üç saatlik kül etme işlemi uygulanmıştır. Örnekler üçer tekrarlı olarak çalışılmış ve her biri için hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılarak ortalama alınmıştır. % Ham selüloz= (m1-m2) ×(100/mo) (3.2.4.2) 1 “ISO 5498:1981: “Agricultural food products-Determination of crude fibre content-General method” 69 m0= test edilen numune kütlesi (g) m1 = Etüvde 130 ºC’de sabit tartıma getirilen cam kroze + kuvartz kum + numune kütlesi (g) m2 = 525ºC’de kül fırınından çıktıktan sonra sabit tartıma getirilen cam kroze + kuvartz kum + kalıntı kütlesi (g) Fındık örneklerinde yaklaşık beşer gram numune alınarak dietil eter ile soxhlet ekstraksiyonu sonrası yağı uzaklaştırılmıştır (bkz. Bölüm 3.2.4.5). Kalan posa miktarı (yağsız kısım), alınan numune miktarına bölünerek düzeltme faktörü elde edilmiş ve yukarıdaki formüle göre (bkz. 3.2.4.2) bulunan ortalama ham selüloz miktarı, bu düzeltme faktörüne bölünerek de düzeltilmiş ham selüloz miktarı elde edilmiştir. 3.2.4.3. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki kül içeriğinin belirlenmesi 1 Örneklerdeki kül içeriği ISO 5984:2002 ve EN ISO 2171, TS 921:1971 standartları temel alınarak ve aşağıda özetlendiği şekilde matrikslere uyarlanarak belirlenmiştir. Yöntem örneklerin kül fırınında yakılması ve kalıntının kütlesinin belirlenmesine dayanır. Bu amaç ile homojen hale getirilmiş ıspanak ve un yaklaşık 5 g, fındık için yaklaşık 3 g örnekler alınarak 550 ºC’de en az altı saat tutulmuş; kalıntı beyaz ya da beyaza yakın renk alıncaya dek işlem sürdürülmüştür. Daha sonra örnekler desikatörde soğutularak tartılmıştır. Örnekler üçer tekrarlı olarak çalışılmış ve ortalama alınmıştır. Hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılmıştır: W=Kül yüzdesi=[(m2-m0)/(m1-m0)] × 100 (3.2.4.3) m0= Boş kabın kütlesi (dara) (g) m1= numune kütlesi + kabın kütlesi (g) m2=küllendirme işlemi sonrası numune kütlesi + kabın kütlesi (g) 1 “ISO 5984:2002: Animal feeding stuffs-Determination of crude ash” (TS ISO 5984: Hayvan yemleri- Ham kül tayini); TS EN ISO 2171 Tahıllar, baklagiller ve yan ürünleri- Yakılarak kül veriminin tayini; TS 921: 1971: Yağlı tohum küspelerinde toplam kül tayini 70 3.2.4.4. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki protein içeriğinin belirlenmesi 1 Örneklerdeki protein içeriği ISO 1871:1975 standardı temel alınarak ve matrikslere uyarlanarak belirlenmiştir. Yöntem özetle; organik yapının sülfürik asit ile parçalanması, destilasyonu ve serbest amonyağın titre edilmesine dayanır. Bu amaç ile homojen hale getirilmiş ıspanak örneklerinden yaklaşık 2 g, un ve fındık örneklerinden ise yaklaşık 0,3’ er gram 250 mL’lik kjeldahl tüplerine alınarak 15 mL derişik sülfürik asit ve ikişer tane katalizör (kjeldahl tableti Cu/3,5)eklenmiştir. Örnekler; 100, 200 ve 300 °C’de onar dakika ve son olarak da 420 °C’de 1 saat süre ile yakma ünitesinde yakılmıştır. Örneklerin rengi yeşilimsi sarı olunca yakma işlemine son verilerek oda sıcaklığına soğutulmuş ve soğuyan örnekler Foss Kjeltec 2200 damıtma ünitesine yerleştirilerek buhar fazı % 4’lük borik asit içerisine toplanmıştır. Toplama kabındaki borik asit, 0,02 N HCl ile yeşilden gri-mor renge dek titrasyon yapılmıştır. Sonuçlar azot cinsinden hesaplanmakta olup; protein ifadesi için faktör kullanımı gerekliliği de standartta belirtilmiştir. Örnekler üçer tekrarlı olarak çalışılarak ortlama alınmıştır. Azot yüzdesi için aşağıdaki formüle göre hesaplama yapılmıştır: % Azot=((M-blank)×N×14,007×100)/(m×1000) (3.2.4.4) M = Titrasyonda, numune için HCL sarfiyatı (mL) Blank = Titrasyonda, çözgen kör örneği (şahit) için HCl sarfiyatı (mL) N= Titrasyonda kullanılan HCl çözeltisinin derişimi (0,02 N) m= numune kütlesi (g) 14,007=Azotun atom kütlesi (g/mol) Azot için bulunan değer 6,25 faktörü ile çarpıldığında örnekteki protein yüzdesi 2 belirlenmiş olur. AOAC 985.29 metodunda da proteindeki azot yüzdesi bilinmiyor ise protein miktarının belirlenmesi için 6,25 faktörünün kullanılması önerilmektedir. 1 ISO 1871:1975: Agricultural food products -General directions for the determination of nitrogen by the Kjeldahl method 2 AOAC 985.29: Total Dietary Fibre in Foods Enzymatic-Gravimetric Method 71 3.2.4.5. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki yağ içeriğinin belirlenmesi 1 Örneklerdeki yağ içeriği TS 765:1971 temel alınarak belirlenmiştir. Dietil eter ile ekstraksiyon sonucu yağın eldesi prensibine dayanan bu metot, un ve ıspanak örneklerine de uyarlanarak kullanılmıştır. Bu amaç ile homojenize edilmiş örneklerden ıspanak için 10 g, fındık için 3 g ve un için 5 g örnekler alınarak ekstraksiyon kartuşuna aktarılmıştır. Kartuşun ağız kısmı pamuk tıkaç (kalaycı pamuğu) ile kapatılarak daha önce etüvde kurutularak sabit tartıma getirilen ve içine yeterli miktarda dietil eter ve ayrıca kaynama taşı konulan ekstraksiyon balonu ile birlikte altı saat süre ile soxhlet sisteminde ekstraksiyona tabi tutulmuştur. İlgili işlem için sifon sayısı “1 sifon/2dk” şeklindedir. Ekstraksiyon sonunda ortamdaki dietil eter 60 °C’de döner vakumlu buharlaştırıcıda uzaklaştırılmış ve ekstraksiyon balonu etüvde 105 °C’de 4–5 saat kurutularak sabit tartıma getirilip tartılmıştır. Örnekler üçer tekrarlı olarak çalışılmış ve her biri için hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılarak ortalama belirlenmiştir. % Dietil eter ekstraktı = [(m1-((m1+m0)-m2))/m1] x 100 (3.2.4.5) m1 = Numunenin kütlesi (g) m2 = Ekstraksiyon balonunun en son basamakta (105 °C sonrası) tartılan kütlesi, (dara+numune kütlesi) (g) m0= Ekstraksiyon balonunun kütlesi (dara) (g) m1 bulunurken Sabit tartıma getirilmiş balonun kütlesi + kalıntı kütlesi (g)- Sabit tartıma getirilmiş balonun kütlesi (g) eşitliği kullanılmıştır. 1 TS 765: Yağlı tohum küspelerinde dietil eter ile ekstrakte edilebilen yağın tayini 72 3.2.4.5.1. Kloroform:metanol karışımı ile fındık örneklerinin yağ içeriklerinin belirlenmesi Fındık örneklerinden ikişer gram alınarak 3×15 mL 2:1 (v/v) kloroform:metanol karışımı ile otuzar dakika ultrasonik ekstraksiyon uygulanarak örneklerden yağ uzaklaştırılmıştır. Her defasında santrifügat atılarak örneklere 15 mL çözgen eklemesi yapılmıştır. Elde edilen son örnek mavi bant süzgeç kağıdından süzülerek açık havada bir gün süre ile kurutulmuş, kalıntı tartılmış ve kütle azalmasından yağ yüzdesi belirlenmiştir. İşlem beş tekrarlı deneme şeklinde gerçekleştirilmiştir. 3.2.4.5.2. Fındık örneklerinin yağ asitleri bileşimin belirlenmesi Fındık örneklerinde yağ içeriğinin belirlenmesinden sonra (bkz. bölüm 3.2.4.5) elde 1 edilen kalıntıdaki yağ asitleri TS 4664 EN ISO 5508 standardı temel alınıp gerekli şekilde uyarlanarak gaz kromatografisi ile analiz edilmiştir. Yağ asitleri metil 2 esterlerinin hazırlanmasında ise TS 4504 EN ISO 5509 standardından yararlanılarak metanollü potasyum hidroksit çözeltisi ile transesterleşme işlemi uygulanmıştır. Fındık örnekleri altı saat süre ile dietil eter ile soxhlet ekstraksiyonuna tabi tutulduktan sonra oluşan yağ örneklerinden 0,1 g örnek alınıp, 4 mL izooktan eklenerek vortekslendikten sonra 0,8 mL metanollü KOH çözelisi ilave edilip deney tüpü kapatılarak 30 s süre ile hızlıca çalkalanmıştır. Daha sonra yaklaşık 1 g sodyum hidrojen sülfat monohidrat çözeltiye ilave edilerek yine şiddetli bir şekilde çalkalanmış ve metil esterleri içeren izooktanlı üst faz başka bir viale alınmıştır. Yağ asidi metil esterlerinin gaz kromatografisi ile analizinde Supelco F.A.M.E. karışım C4-C24 standardı cihaza enjekte edilerek yağ asitleri metil esterleri % olarak doğrulanmıştır. 1 TS 4504 EN ISO 5509: Hayvansal ve bitkisel katı ve sıvı yağlar- Yağ asitleri metil esterlerinin hazırlanması; 2 TS 4664 EN ISO 5508: Hayvansal ve bitkisel katı ve sıvı yağlar-Yağ asitleri metil esterlerinin gaz kromatografisiyle analizi 73 Bu işlemden kalitatif analizde yararlanılırken; kantitatif analiz için standarda göre örneğin kromatogramı üzerinde numuneyi meydana getiren bileşenlerin tümünün görüldüğü varsayılarak pikler altında kalan toplam alan bileşenlerin %100’ üne karşılık gelecek şekilde göz önüne alınmış ve hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılmıştır: Metil Esteri Kütlece Yüzdesi=(İlgili metil esteri pik alanı/toplam pik alanı)× 100 (3.2.4.5.2) 3.2.4.6. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki şeker içeriğinin Luff-Schoorl yöntemi ile belirlenmesi 1 Örneklerdeki şeker içeriği Türk Gıda Kodeksi Tebliğ No: 2002/26’ya göre Luff Schoorl yöntemi temel alınarak ve matrikslere gerekli uyarlamalar yapılarak belirlenmiştir (Anonim 2002a). Yöntemin prensibi, örnekteki indirgen şekerin, belirli koşullarda kaynama noktasına kadar Cu (II) çözeltisi ile ısıtılması, Cu (II) iyonlarının bir kısmının Cu (I) iyonlarına indirgemesi ve çözeltide kalan Cu (II) iyonlarının iyodimetrik olarak tayini esasına dayanır (Anonim 2002b) Ispanak, fındık ve un örneklerinden yaklaşık 5 g alınarak üzerlerine bir miktar saf su ilave edilmiş, 5 mL Carez I ve 5 mL Carez II çözeltilerinden eklenerek iyice karıştırılıp 200 mL’ye saf su ile tamamlanmıştır. Çökmenin gerçekleşmesi için 10–15 dk bekletilen örnekler kaba süzgeç kağıdından süzülmüştür. Süzüntüden 25 mL alınarak üzerine 50 mL su eklenmiştir. Su banyosuna konulan örneklere, sıcaklık 67–70 °C’ ye ulaştığında 5 mL derişik hidroklorik asit eklenerek 5 dk daha bekletilmiştir. Soğutulan çözeltiye bir damla fenolftalein indikatörü eklenerek % 30’luk KOH çözeltisi ile hafif pembe renk gözlenene kadar nötralize edilmiştir. Örneklere birkaç damla asetik asit eklenerek pembe renk giderilip 100 mL’ye tamamlanmıştır. Örnekten 25 mL alınıp üzerine 25 mL Luff çözeltisi ve birkaç tane kaynama taşı konularak geri soğutucuya bağlanmıştır. 1 Türk Gıda Kodeksi İnsan Tüketimine Sunulan Şekerlerin Analiz Yöntemleri Tebliği (Tebliğ No: 2002/ 26) temel alınmıştır. Örnek hazırlama ve hesaplama basamakları Tübitak Bursa Test ve Analiz LAboratuvarı’nda hizmet alımı kapsamında uygulandığı şekli ile belirtilmiştir. 74 Örnekler 10 dakika kaynatılarak hızlı bir şekilde su altında soğutulup üzerlerine 10 mL % 20 lik potasyum iyodür çözeltisi eklenmiştir. Örneklere çok yavaş bir şekilde 25 mL % 25’lik H2SO4 ve sonra 2 mL nişasta indikatör çözeltisi eklenip; 0,1 N tiyosülfat çözeltisi ile renk maviden krem rengine dönünceye kadar titre edilmiştir. Harcanan tiyosülfat çözeltisi hacmi kaydedilip aynı işlemler örnek çözeltisi yerine 25 mL su alınarak geri soğutucu basamağından itibaren kör örneğe de (şahit) uygulanmış ve harcanan tiyosülfat çözeltisi kaydedilmiştir (Anonim 2012b) Her numune için iki paralet test ve her test için de iki paralel titrasyon yapılmıştır. Toplam dört titrasyon sonucunun ortalaması alınmıştır. Seyrelmelerdeki hacim değerleri göz önüne alınarak (200→25→100→25 mL değerleri) titre edilen numune faktörü belirlenmiştir. Bunun için hesaplama aşağıdaki gibi yapılmıştır: Titre edilen numune faktörü = [25×numune kütlesi (g)/200] × [25 (geri soğutucudan alınan örnek)/100] (3.2.4.6.1) Şahit ve numune sarfiyatları arasındaki farka göre Çizelge 3.2.4.6.1’ deki tablodan mg olarak invert şeker miktarı belirlenmiştir. Çizelge 3.2.4.6.1. Luff Scroll yöntemi için harcanan tiyosülfat hacmine karşı mg olarak invert şeker değeri (Anonim 2012b) 0,1 N Sodyum tiyosülfat çözeltisinin mL sayısı b V* 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 miligram invert şeker 0 0,00 0,24 0,48 0,72 0,96 1,20 1,44 1,68 1,92 2,16 a 1 2,40 2,64 2,88 3,12 3,36 3,60 3,84 4,08 4,32 4,56 2 4,80 5,04 5,28 5,52 5,76 6,00 6,24 6,48 6,72 6,96 3 7,20 7,45 7,70 7,95 8,20 8,45 8,70 8,95 9,20 9,45 4 9,70 9,95 10,20 10,45 10,70 10,95 11,20 11,45 11,70 11,95 5 12,20 12,45 12,70 12,95 13,20 13,45 13,70 13,95 14,20 14,45 6 14,70 14,95 15,20 15,45 15,70 15,95 16,20 16,45 16,70 16,95 7 17,20 17,46 17,72 17,98 18,24 18,50 18,76 19,02 19,28 19,54 8 19,80 20,06 20,32 20,58 20,84 21,10 21,36 21,62 21,88 22,14 9 22,40 22,66 22,92 23,18 23,44 23,70 23,96 24,22 24,48 24,74 10 25,00 25,26 25,52 25,78 26,04 26,30 26,56 26,82 27,08 27,34 11 27,60 27,87 28,14 28,41 28,68 28,95 29,22 29,49 29,76 30,03 12 30,30 30,57 30,84 31,11 31,38 31,65 31,92 32,19 32,46 32,73 75 Çizelge 3.2.4.6.1. Luff-Schoorl yöntemi için harcanan tiyosülfat hacmine karşı mg 1 olarak invert şeker değeri (devam) 0,1 N Sodyum tiyosülfat çözeltisinin mL sayısı V 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 miligram invert şeker 13 33,00 33,27 33,54 33,81 34,08 34,35 34,62 34,89 35,16 35,43 14 35,70 35,98 36,26 36,54 36,82 37,10 37,38 37,66 37,94 38,22 15 38,50 38,78 39,06 39,34 39,62 39,90 40,18 40,46 40,74 41,02 16 41,30 41,59 41,88 42,17 42,46 42,75 43,04 43,33 43,62 43,91 17 44,20 44,49 44,78 45,07 45,36 45,65 45,94 46,23 46,52 46,81 18 47,10 47,39 47,68 47,97 48,26 48,55 48,84 49,13 49,42 49,71 19 50,00 50,30 50,60 50,90 51,20 51,50 51,80 52,10 52,40 52,70 20 53,00 53,30 53,60 53,90 54,20 54,50 54,80 55,10 55,40 55,70 21 56,00 56,31 56,62 56,93 57,24 57,55 57,86 58,17 58,48 58,79 V*= Harcanan 0,1 N tiyosülfat çözeltisinin hacmi mL a,b a b = Tablo okumasına örnek: 1 mL + 0,1 mL=toplam 1,1 mL için mg invert şeker değeri 2,64’ tür. Şeker miktarı için hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılmıştır: 1 Toplam şeker (g/100 g) = [(100×tablodan okunan değer )/ titre edilen numune faktörü]/1000 (3.2.4.6.2) 3.2.4.7. Ispanak, un ve fındık örneklerindeki diyet lif içeriğinin belirlenmesi 2 Örneklerdeki diyet lif AOAC 985.29 standardı temel alınarak ve matrikslere uyarlanarak belirlenmiştir. Kullanılacak krozeler 525ºC de bir saat ısıtılıp; soğutulmuş ve içlerine 0,5 g kuvartz kum eklenip 130 ºC’de sabit tartıma getirilmiştir. Soğutularak desikatörde bekletilmiş ve numuneler tartılmıştır (w1= (kuvartz + kroze) kütlesi). (Numune % 10’ dan fazla yağ içeriyor ise yağı uzaklaştırılıp kütle kaybı not edilmelidir. Buradan elde edilecek düzeltme düzeltme faktörü önemlidir. Fındık örnekleri için uygulanmıştır). 1 Tablodan okunan değerin belirlenişi, bkz. Çizelge 3.2.4.6.1 açıklamalarında bulunmaktadır. 2 “AOAC 985.29: Total Dietary Fibre in Foods Enzymatic-Gravimetric Method” 76 Dört paralel test yapılmıştır. İkisi protein; ikisi kül tayini için kullanılmıştır. Yaklaşık 1 g homojenize edilmiş ve öğütülmüş numune tartılarak erlene alınmıştır. Önce 50 mL fosfat tamponu eklenerek pH değeri 6,0±0,2 değerine ayarlanmıştır. Daha sonra 0,1 mL α-amilaz eklenmiştir. Karıştırılarak üzeri alüminyum folyo ile kapatılan örnekler kaynayan sıcak su banyosuna (100 ºC) yerleştirilip 5 dk aralıklarla karıştırılmıştır. Erlenlerin iç sıcaklığı 95 ºC’ye gelince yarım saat tutulup oda sıcaklığına soğutulmuş ve pH 7,5 ± 0,2’ye 10 mL 0,275 M NaOH çözeltisi ile ayarlanmıştır. Örneklere fosfat -1 tamponunda, kullanmadan hemen önce hazırlanmış 50 mg mL derişimde hazırlanmış proteaz çözeltisinden 0,1 mL eklenip alüminyum folyo ile üzeri tekrar kapatılarak 60 ºC su banyosunda iç sıcaklık 60 ºC olunca yarım saat daha tutulmuştur. Oda sıcaklığına soğutulan örneklerin pH değeri 4–4,6’ya, 10 mL 0,325 M HCl ile ayarlanmıştır. Örneklere 0,1 mL amiloglukozidaz eklenip alüminyum folyo ile üzerleri kapatılarak 60 ºC su banyosunda bir saat tutulmuştur. 200 mL ve 60 ºC’de ön ısıtılmış % 95’lik etanol çözeltisi eklenerek bir gece oda sıcaklığında çökmenin tamamlanması için bekletilmiştir. Uygun Gooch krozelerinden 3 kez 20 mL % 78 etanol, 2 kez 10 mL % 95 etanol ve 2 kez 10 mL aseton ile yıkanmıştır. 105 ºC’ de etüvde bir gece kurutulup desikatörde soğutularak kalıntı + kuvartz kum + kroze kütlesi (w2) yaklaşık 0,1 mg değerinde sabit tartıma getirilip belirlenmiştir. İki örnekte Kjeldahl protein analizi yapılmıştır (bkz. Bölüm 3.2.4.4). Protein miktarını belirlemek için azot içeriği 6,25 faktörü ile çarpılmıştır. İki örnek ise 525 ºC’de 5 saat tutulmuş ve desikatörde soğutularak sabit tartımı tartımı alınıp kül miktarı belirlenmiştir (bkz. Bölüm 3.2.4.3) (kalıntı + kuvartz + kroze kütlesi = w3). Özetle 130, 105 ve 525 ºC sonrası kroze+numune kütleleri sırası ile w1, w2 ve w3 olarak kaydedilerek hesaplama aşağıdaki formüle göre yapılmıştır: % toplam diyet lif (TDF) = [((w2 - w1) - (w3 - w1))-ortalama protein kütlesi] / numune kütlesi]×100 (3.2.4.7) 3.2.5. Yağ asitleri metil esterlerinin GC ile analizi Fındık örneklerinin yağ asitleri bileşimini belirlemek için yararlanılan GC şartları Çizelge 3.2.5.1’ de verilmiştir. 77 Çizelge 3.2.5.1. GC çalışma şartları Deneysel parametreler Değer Kolon sıcaklığı 210 ºC, izotermal -1 Akış hızı 1 mL dk Split oranı 1/20 FID sıcaklığı 250 ºC Enjektör sıcaklığı 250 ºC Enjeksiyon hacmi 1 µL En düşük tayin sınırı % 0,1 Kullanılan gazlar Hidrojen jeneratörü tarafından üretilen hidrojen gazı ile Yüksek saflıkta helyum gazı ve yüksek saflıkta kuru hava (Linde Gaz A.Ş’den temin edilmiştir.) 3.2.6. AAS ile metal analizleri Mikrodalga ile parçalanan örneklerin Mn ve Cu içerikleri AAS ile analiz edilmiştir. Mikrodalga parçalama programı ve AAS şartları sırası ile Çizelge 3.2.6.1 ve Çizelge 3.2.6.2’de verilmiştir. AAS analizinde ayrıca, Çizelge 3.2.6.3’de gösterilen sertifikalı referans malzemelerden (SRM) de yararlanılmıştır. SRM sertifika değerleri ilgili çizelgede görüldüğü gibidir. Örneklere uygulanan parçalama işlemleri SRM’lere de uygulanarak mangan ve bakır içerikleri sertifikada verilen değerler ile karşılaştırılmıştır. -1 Örneklere ayrıca; 0,1 mg L olacak şekilde Mn ve Cu standardı da eklenerek yüzde geri kazanım değerleri incelenmiştr. Çizelge 3.2.6.1. Mikrodalga programı Zaman Basınç (Bar) (dk) 2 250 2 0 6 250 5 400 5 600 78 Çizelge 3.2.6.2. AAS çalışma şartları Slit Dalgaboyu Alev Gaz ve Akım aralığı Lamba (nm) yüksekliği akış hızı (mm) -1 2,0 L dk Mn 10 mA 279,5 nm 0,2 BGC-D2* 7 mm hava-asetilen -1 1,8 L dk Cu 6 mA 324,8 nm 0,5 BGC-D2 7 mm hava-asetilen *BGC-D2=zemin düzeltme-döteryum Çizelge 3.2.6.3. Sertifikalı referans malzemeler ve Mn, Cu elementlerinin sertifika değerleri -1 -1Bakır (mg kg ) Mangan (mg kg ) Lahana 5,67 ± 0,25 31,9 ± 1,2 IAEA-359, Cabbage (%95 güven aralığı) (%95 güven aralığı) Çilek Yaprağı 10 (homojen değil) 171 ± 10 (LGC 7162), Strawberry Leaves Çay 18,6 ± 0,7 500 ± 20 NCS ZC73014, Tea Ispanak Yaprağı 12,2 ± 0,6 75,9 ± 1,9 NIST 1570a, Spinach leaves Buğday Unu 2,1 ± 0,2 9,4 ± 0,9 NIST 1567a, Wheat Flour 3.2.7. ICP-MS ile metal analizleri 3.2.7.1. AAS ile karşılaştırma analizleri AAS için mikrodalga sisteminde hazırlanan ve analiz edilen örnekler kalibrasyon eğrisine uygun seyreltilerek ICP-MS cihazı ile de analiz edilmiştir. ICP-MS şartları Çizelge 3.2.7.1.1’de belirtildiği gibidir. 79 Çizelge 3.2.7.1.1. ICP-MS çalışma şartları Deneysel parametreler Değer RF güç 1000 W -1 Plazma argon akış hızı 17,0 L dk -1 Sisleştirici gaz akış hızı 0,85 L dk -1 Yardımcı gaz akış hızı 1,2 L dk Sisleştirici Ryton karşı akış Sprey odası (püskürtme haznesi) Scott Sampler ve skimmer koniler Ni, iç çap: 1,1 mm Ni, iç çap: 0,9 mm -1 Örnek alma hızı 1,5 mL dk Okuma/tekrar 1 Tekrar sayısı 3 Görüntüleme zamanı, ms 50 Tarama modu Peak hopping Dedektör modu Dual 55 63 Ölçülen izotoplar Mn (% 100,0000), Cu (% 69,2), 65 Cu (% 30,8) 3.2.7.2. Açık sistem yaş yakma ile toplam metal analizleri Açık sistem yaş yakmanın etkinliğini araştırmak için öncelikle mikrodalga parçalama işleminde kullanılan çözgen miktarları temel alınarak yaş yakma işlemi yapılmıştır. 0,5’er gram tartılan örnekler 6 mL nitrik asit ve 1 mL hidrojen peroksit ile 100 mL hacimli, ağzı saat camı ile kapatılmış cam beherlerde ve ısıtıcı üzerinde parçalama işlemine tabi tutulmuştur. Parçalan örnekler soğutulmuş ve polipropilen santrifüj tüpünde 50 mL’ ye saf su ile tamamlanmıştır. PVDF filtreden süzülen örnekler seyreltilerek ICP-MS ile analiz edilmiştir. Örneklere uygulanan işlemler aynı şekilde SRM’lere de uygulanmış; ayrıca standart katma analizleri de yapılmıştır. 80 3.2.7.2.1. Açık sistem yaş yakma işleminin optimizasyonu Açık sistem yaş yakma işleminin optimizasyonu için merkezi kompozit dizayndan (CCD) yararlanılmıştır (Brereton 2007). Her bir matriks ile ön denemeler yapılarak ıspanak ve un için kütle, nitrik asit hacmi ve peroksit hacminin etkili parametreler olduğuna karar verilmiştir. Fındık matriksi yağlı olduğu için yağ bileşenlerinin tam parçalamasına yönelik olarak sülfürik asitten yararlanılmış ve ilgili parametreler fındık miktarı, nitrik asit hacmi ve sülfürik asit hacmi olarak seçilmiştir. Peroksit miktarı ön çalışmalar sonrası 2,0 mL değerinde sabit tutulmuştur. Parçalamada etkili faktörlerin optimizasyonu için ikinci dereceden üç faktörlü CCD kullanılmıştır. Deney sayısı k N=2 +2k+1 (k=faktör sayısı) formülüne göre hesaplanmıştır (Brereton 2007, Erdemir ve ark. 2013). Ispanak ve un örnekleri için optimizasyon çalışmalarında mangan ve -1 bakır elementlerine ilişkin okunan sinyaller temel alınmıştır. Fındık örnekleri için µg L olarak belirlenen metal düzeyleri temel alınarak optimizasyon gerçekleştirilmiştir. Tüm hesaplamalar Microsoft Office Excel 2003 programı ile gerçekleştirilmiştir. 2 2 2 y = b1x1 + b2x2 + b3x3 + b11x1 + b22x2 + b33x3 + b12x1x2 + b13x1x3 +b23x2x3 (3.2.7.2.1) İkinci dereceden polinom denkleminin x1, x2 ve x3’ e göre türevleri alınıp sıfıra eşitlendiğinde belirtilen değişkenlerin teorik değerleri bulunmuş; gerçek değerlerin belirlenmesi için ayrı ayrı x1=(x1(gerçek)-0 değeri(orta değer))/(0 değeri ile ±1 arasındaki fark), x2=( x2(gerçek)-0 değeri)/(0 değeri ile ±1 arasındaki fark) ve x3=( x3(gerçek)-0 değeri)/(0 değeri ile ±1 arasındaki fark) denklemlerinden yararlanılmıştır (Erdemir ve ark. 2013). Çizelge 3.2.7.2.1.1, Çizelge 3.2.7.2.1.2 ve Çizelge 3.2.7.2.1.3’de her üç matriks için de kodlanmış faktörler ve seviyeleri ile gerçek değerlerin yer aldığı deneysel dizayn matriksleri gösterilmiştir. On altıncı deneme, on beşinci denemenin tekrarı niteliğindedir. 81 Çizelge 3.2.7.2.1.1. Ispanak matriksi için merkezi kompozit dizayn* * (a-kodlanmış değerler ve b-gerçek değerler) Çizelge 3.2.7.2.1.1.(a) Kodlanmış faktörler ve seviyeleri -1,68 -1 0 +1 +1,68 x ( HNO (mL)) 2,5 3 4 5 5,5 1 3 x ( H O (mL)) 0,3 0,5 1 1,5 1,7 2 2 2 x (Kütle (g)) 0,3 0,5 0,75 1 1,2 3 Çizelge 3.2.7.2.1.1.(b) Ispanak matriksi için deneysel dizayn matriksi Deney Kodlanmış Değerler Gerçek Değerler x1 x2 x3 x1 x2 x3 1 +1 +1 +1 5 1,5 1 2 +1 +1 -1 5 1,5 0,5 3 +1 -1 +1 5 0,5 1 4 +1 -1 -1 5 0,5 0,5 5 -1 +1 +1 3 1,5 1 6 -1 +1 -1 3 1,5 0,5 7 -1 -1 +1 3 0,5 1 8 -1 -1 -1 3 0,5 0,5 9 +1,68 0 0 5,5 1 0,75 10 -1,68 0 0 2,5 1 0,75 11 0 +1,68 0 4 1,7 0,75 12 0 -1,68 0 4 0,3 0,75 13 0 0 +1,68 4 1 1,2 14 0 0 -1,68 4 1 0,3 15 0 0 0 4 1 0,75 16 0 0 0 4 1 0,75 82 Çizelge 3.2.7.2.1.2. Un matriksi için merkezi kompozit dizayn (a-kodlanmış değerler ve b-gerçek değerler) Çizelge 3.2.7.2.1.2.(a) Kodlanmış faktörler ve seviyeleri -1,68 -1 0 +1 +1,68 x ( HNO (mL)) 2,5 3 4 5 5,5 1 3 x ( H O (mL)) 0,3 0,5 1 1,5 1,7 2 2 2 x (Kütle (g)) 0,28 0,3 0,4 0,5 0,52 3 Çizelge 3.2.7.2.1.2. (b) Un matriksi için deneysel dizayn matriksi Deney Kodlanmış Değerler Gerçek Değerler x1 x2 x3 x1 x2 x3 1 +1 +1 +1 5 1,5 0,5 2 +1 +1 -1 5 1,5 0,3 3 +1 -1 +1 5 0,5 0,5 4 +1 -1 -1 5 0,5 0,3 5 -1 +1 +1 3 1,5 0,5 6 -1 +1 -1 3 1,5 0,3 7 -1 -1 +1 3 0,5 0,5 8 -1 -1 -1 3 0,5 0,3 9 +1,68 0 0 5,5 1 0,4 10 -1,68 0 0 2,5 1 0,4 11 0 +1,68 0 4 1,7 0,4 12 0 -1,68 0 4 0,3 0,4 13 0 0 +1,68 4 1 0,52 14 0 0 -1,68 4 1 0,28 15 0 0 0 4 1 0,4 16 0 0 0 4 1 0,4 83 Çizelge 3.2.7.2.1.3. Fındık matriksi için merkezi kompozit dizayn (a-kodlanmış değerler ve b-gerçek değerler) Çizelge 3.2.7.2.1.3.(a) Kodlanmış faktörler ve seviyeleri -1,68 -1 0 +1 +1,68 x ( HNO (mL)) 5,5 6,0 7,0 8,0 8,5 1 3 x ( H SO (mL)) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 2 2 4 x (Kütle (g)) 0,1 0,15 0,12 0,25 0,30 3 Çizelge 3.2.7.2.1.3. (b) Fındık matriksi için deneysel dizayn matriksi Deney Kodlanmış Değerler Gerçek Değerler x1 x2 x3 x1 x2 x3 1 +1 +1 +1 8 2,5 0,25 2 +1 +1 -1 8 2,5 0,15 3 +1 -1 +1 8 1,5 0,25 4 +1 -1 -1 8 1,5 0,15 5 -1 +1 +1 6 2,5 0,25 6 -1 +1 -1 6 2,5 0,15 7 -1 -1 +1 6 1,5 0,25 8 -1 -1 -1 6 1,5 0,15 9 +1,68 0 0 8,5 2 0,12 10 -1,68 0 0 5,5 2 0,12 11 0 +1,68 0 7 3 0,12 12 0 -1,68 0 7 1 0,12 13 0 0 +1,68 7 2 0,3 14 0 0 -1,68 7 2 0,1 15 0 0 0 7 2 0,12 16 0 0 0 7 2 0,12 84 3.2.7.2.2. Optimum koşullarda Mn, Cu analizleri; SRM analizi ve yüzde geri kazanım çalışmaları Merkezi kompozit dizayna göre elde edilen optimum parçalama koşullarında örnek ve standart referans malzemeler analize hazırlanmış; ayrıca yüzde geri kazanım çalışmaları yapılmıştır. 3.2.7.3. Seyreltik nitrik asit ve ultrasonik ekstraksiyonun etkinliğinin araştırılması Nitrik asit çözeltisi ile doğrudan parçalanmada ultrasonik ekstraksiyonun etkinliği araştırılmıştır. Bu amaçla örneklerden kapaklı viallere belirli miktarlarda (ıspanak örnekleri için yaklaşık 0,01 g, un örnekleri için yaklaşık 0,5 g ve fındık örnekleri için yaklaşık 0,1’er g) alınmıştır. Daha sonra 15’er mL yaklaşık 0,1 N nitrik asit çözeltisinde, ıspanak örnekleri için birer saat; un ve fındık örnekleri için 1,5 saat süre ultrasonik banyoda ekstraksiyon uygulanmıştır. Örnekler süzülmüş ve kalibrasyon eğrisine uygun düzeyde seyreltilerek analiz edilmiştir. 3.2.7.4. Matrikslerin yağsız kısmının eldesi ve metal analizi Yağ yüzdesinin belirlenmesinde matrikslerden dietil eter ile yağın uzaklaştırılmasından sonra geriye kalan kısımlar alınarak kuru kısım olarak değerlendirilmiştir. Bu kısımlarda, optimum koşullarda belirlenen şartlarda veya mikrodalga şartlarında parçalama işlemi yapılmış; böylece kuru kısıma ve yağlı kısıma geçen metal miktarları incelenmiştir. 3.2.7.5. Ispanak, un ve fındık örneklerinde çözgen ekstraksiyonuna dayalı fraksiyonlama çalışmaları Ispanak, un ve fındık örneklerine her biri 15 mL olan su, aseton, kloroform, dietil eter, etanol, n-hekzan, metanol, kloroform/metanol (2:1, v/v veya 1:2 v/v) veya 0,1 N nitrik asit ile ayrı ayrı ve ultrasonik banyoda ekstraksiyon işlemi uygulanmıştır. Ekstraksiyonlar 22 veya 40 mL kapaklı cam viallerde gerçekleştirilmiştir. İlgili 85 ekstraksiyon süresi ıspanak örnekleri için 1 saat; un ve fındık örnekleri için 1,5 saat uygulanmıştır. Ekstraktlar mavi bant süzgeç kağıdından süzülmüş ve kuruluğa dek uçurulmuştur. Çözgenlerin kuruluğa dek uçurulmasında genellikle azot gazı kullanılmıştır. Kalıntılar ıspanak için 15’er mL, un için 7,5’ar mL ve fındık için 10’ar mL yaklaşık 0,1 N nitrik asit çözeltisinde çözülerek 0,45 veya 0,22 µm şırınga tipi PVDF filtrelerden süzülmüş ve ICP-MS ile analiz edilmiştir. Çözgen kör örnekleri de aynı şekillerde hazırlanmıştır. Bir çözgen için tüm işlemler en az üç veya dört kez (un örnekleri için) tekrarlanmıştır. Ekstraksiyona yönelik analitik şema Şekil 3.2.7.5.1’de görülmektedir. Şekil 3.2.7.5.1. Fraksiyonlama analiz şeması* *Literatür kaynaklarına örnekler: Aktif karbon adsorpsiyonu (biyoyararlılık çalışmaları; Kowalewska ve ark. 2005) Aseton ekstraksiyonu (glikolipid ekstraksiyonu veya protein çöktürme; Rouser ve ark. 1967, Karadjova ve ark. 2002) Etanol ekstraksiyonu (polisakkarit çöktürme; Karadjova ve ark. 2002) Hekzan ekstraksiyonu (serbest lipid; Eller ve King 1996) Kloroform:metanol (2:1, v/v) ekstraksiyonu (toplam lipid; Folch ve ark. 1957, Ferraz ve ark. 2004) Kloroform, eter ekstraksiyonu (nötral lipid; Ferraz ve ark. 2004) Metanol ekstraksiyonu (polar lipid; Akoh ve Min 2002) n-oktanol ekstraksiyonu (biyoyararlılık çalışmaları; Yaşar ve Güçer 2004, Shun-xing ve ark. 2005) Pepsin ve/veya pankreatin ekstraksiyonu (biyoyararlılık çalışmaları; Liu ve ark. 2004) 86 3.2.7.6. “in-vitro” mide ve bağırsak sindirim simülasyon işlemleri ile biyoyararlılık çalışmaları Biyoyararlılık çalışmaları için gerekli çözeltilerin hazırlanması (bkz. sayfa 63) ve in- vitro biyoyararlılık çalışmaları Liu ve ark. 2004’den uyarlanarak yapılmıştır. Mide enzimleri ile parçalama işleminin simülasyonu ıspanak için 0,01 g liyofilize örneklere 1 mL pepsin çözeltisinin eklenmesi ile başlatılmıştır. 15 mL ultra saf su eklenen örneklerin pH değeri 0,1 N HCl ile 1,9 değerine ayarlanmıştır. Örnekler daha sonra 37 ºC su banyosunda 1 saat süre ile inkübe edilmiştir. Bağırsak enzimleri ile parçalama işleminin simülasyonu için safra tuzlarından ve pankreatin enziminden yararlanılmıştır. 0,01 g liyofilize örneklere 2,5 mL pankreatin/safra tuzları çözeltisi eklenmiş ve 15 mL ultra saf su eklenen örneklerin pH değeri 0,1 N HCl veya 0,1 N NaHCO3 ile 6,9 değerine ayarlanmıştır. Örnekler 37 ºC su banyosunda 2 saat süre ile inkübe edilmiştir. Enzim içeren çözeltiler santrifüjlenerek, santrifügatları 0,45µm PVDF tipi şırınga filtreden süzülmüştür. Ardışık mide ve bağırsak sindirim işleminin simülasyonu için önce pepsin ile parçalama işlemi yukarıda belirtildiği gibi uygulanmış, 3 mL pepsin ekstraktına 4,5 mL ultra saf su eklenerek pH ayarlanmasından sonra 2,5 mL pankreatin/safra tuzları çözeltisi eklenmiştir. Örnekler 37 ºC su banyosunda 2 saat süre ile inkübe edilmiş ve santrifügatlar 0,45µm PVDF tipi şırınga filtreden süzülmüştür. Tüm işlemler için de en az üç tekrarlı çözgen kör örnekleri hazırlanmıştır. 3.2.7.7. Biyoyararlılık değerlendirmeleri için n-oktanol ekstraksiyonu çalışmaları n-oktanol ekstraksiyonu Yaşar ve Güçer 2004’den uyarlanarak çalışılmıştır. Örnek miktarları in-vitro biyoyararlılık çalışmasında belirtildiği gibi alınarak 15 mL n-oktanol ile ultrasonik banyoda bir saat süre ile ekstraksiyon uygulanmıştır. Örneklere üç kez 5’er mL yaklaşık 0,1 N nitrik asit eklenerek geri sıvı-sıvı ekstraksiyon işlemi uygulanmıştır. Ekstraksiyon işleminin etkinliğini değerlendirmek için ise iki seviyede standart katmalı örnekler hazırlanarak yüzde geri kazanım değerleri belirlenmiştir. 87 3.2.7.8. Aktif karbon ile adsorpsiyon çalışmaları Kowalewska ve ark. (2005) tarafından önerilen metot, matriksler için gerekli değişiklikler yapılarak kullanılmıştır. Yaklaşık 0,01 g liyofilize örneklere 50 mL ultra saf su, 2,5 mL metil izobutil keton ve 0,5 g toz aktif karbon eklenmiştir. Örneklere, ultrasonik banyoda bir saat süre ile ekstraksiyon işlemi uygulanmıştır. Örnekler mavi bant süzgeç kağıdından süzülmüş ve 60 ºC’de kurutulduktan sonra 10 mL yaklaşık 1 N nitrik asit çözeltisi ile metal fraksiyonları geri alınmıştır. Örnekler on kat seyreltilerek ICP-MS ile analiz edilmiştir. 3.2.7.9. AAS ve ICP-MS’de metot validasyon parametrelerinin belirlenmesi Enstrümantal belirleme ve nicel tayin limitleri, çözgen körü (blank) değerine yakın ve çözgen körü sinyalinden belirli güven seviyesinde (k=3, % 99,86 güven aralığı) farklandırılabilen en küçük derişime dayalı olarak belirlenmiştir (Corley 2003). İlgili derişim biriminin standart sapmasının üç ve on katı alınarak ayrıca örnek kütlesi ve seyreltme faktörü de kullanılarak metot belirleme ve nicel tayin limitleri hesaplanmıştır. ICP-MS için gün içi ve günler arası tekrarlanabilirlik değerleri ilgili standardın tekrarlanabilir ve tekrar elde edilebilir sinyalinin standart sapmasına göre belirlenirken; metodun doğruluğu da sertifikalı referans malzemeler ile incelenmiştir. 3.2.7.10. Katı faz ekstraksiyon çalışmaları Her üç örnek matriksi için aşağıda anlatılan işlemler uygulanmıştır: Yaklaşık 0,01’er gram ıspanak; 0,5’er gram un ve yağı dietil eter ile uzaklaştırılmış 0,05’er gram fındık örneklerinden alınarak 15 mL ultra saf su ile 1,5 saat ultrasonik banyoda ekstraksiyon işlemi uygulanmıştır. Örnekler, 0,22 µm PVDF filtreden süzülerek katı faz ekstraksiyonuna hazır hale getirilmiştir (aynı örneklerden 10 kat seyreltilip ICP-MS ile Mn ve Cu düzeyleri de tayin edilmiştir; ayrıca bir miktar örnek de viale alınarak HPLC- ICP-MS ile analizi gerçekleştirilmiştir). Katı faz kartuş kolonlar önce 3 mL, metanolde % 0,1 formik asit ile; sonra 3 mL, suda % 2 formik asit ile şartlandırılmış ve katı faz ekstraksiyonu için hazırlanan örneklerden üçer mL, kartuş kolonlara yüklenerek 88 kolonların kuruması sağlanmıştır. Son basamakta örnekler 4 mL, suda % 2 amonyak çözeltisi ile kolondan geri alınmıştır. Hazırlanan örneklere 10 mL ultra saf su eklenerek seyreltilip; ICP-MS ile analizi gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyonun etkinliğinin araştırılması için şartlandırma işlemi sonrası oluşan formik asit atıkları atıldıktan sonra 4 mL örnek yüklenmesi sırasında atığa geçen süzüntüden doğrudan seyreltme sonrası metal tayini yapılmış; ayrıca kolonlara uygun derişimde ve örnekler gibi suda hazırlanmış Mn ve Cu stok çözeltileri de yüklenerek kolonda ne kadar tutulabildiğine bakılmıştır. 3.2.7.11. Yağmur suyunda mangan ve bakır türlendirme analizleri 4 mL yağmur suyu örneği alınarak 2 mL derişik nitrik asit ve 1 mL hidrojen peroksit ile açık sistem yaş yakma işlemine tabi tutulmuştur. Örnekler polipropilen santrifüj tüplerinde 25 mL’ye ultra saf su ile tamamlanarak analize hazırlanmıştır. Bu şekilde hazırlanan örneklerdeki element düzeyleri ile 0,22 µm membran filtreden doğrudan süzülmüş örneklerdeki element düzeyleri arasındaki fark partiküle mangan ve bakır olarak değerlendirilmiştir. Bu değerlendirmede doğrudan analiz edilen yağmur suları da kullanılarak bulunan sonuçlar karşılaştırılmıştır. İkinci basamakta 0,45 ve 0,22 µm membran filtrelerden süzülen örneklerden elde edilen metal düzeyleri arasındaki fark ise kolloidal mangan ve bakır olarak belirlenmiştir. Kullanılan en küçük gözenekli 0,22 µm membran filtreden süzülen örneklerdeki metal düzeyleri de çözünmüş mangan ve bakır olarak tanımlanmıştır (Willey ve ark 2009). Tüm işlemler üç tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. 3.2.7.12. HPLC-ICP-MS ikili tekniğine yönelik çalışmalar HPLC cihazına dedektör olarak ICP-MS cihazı bağlanarak HPLC-ICP-MS ikili tekniğinde çalışmalar yapılmıştır. İkili teknik için çalışma şartları Çizelge 3.2.7.12.1’de verilmiştir. 89 Çizelge 3.2.7.12.1. HPLC-ICP-MS cihazı çalışma şartları HPLC ŞARTLARI HPLC Perkin Elmer Series 200 Yazılımı Total chrom nav.6.3.2 Otomatik örnek verici Perkin Elmer Series 225 Kolon PerkinElmer Brownlee Analytical DB Aq. C-18 5μm, 150 × 4,6 mm Enjeksiyon hacmi 30 μL Kolon sıcaklığı 26 °C Hareketli faz 1. haraketli faz olarak su/metanol (100:0, v/v) ile başlayan su/metanol (95:5, v/v) ye ulaşan ve su/metanol (100:0, v/v) ile biten gradiyent sistem kullanılmıştır. 2. hareketli faz olarak %100 ultra saf su kullanılmıştır. Analiz süresi 10 dk Kromatografik veri Chromera (sürüm, 1.2.254.0 (2005)) sistemi 3.2.7.12.1. HPLC-ICP-MS ikili tekniğine yönelik püskürtme haznesi karşılaştırılması Scott tipi ve siklonik püskürtme hazneleri (sprey odaları) aynı örnek analizi ve mangan (II) çözeltisinden elde edilen sinyal şiddeti değerine göre karşılaştırılmıştır. İlgili aparatlar Ek-1’de gösterilmiştir. 3.2.7.12.2. HPLC-ICP-MS ikili tekniğine yönelik uygun sisleştiricinin belirlenmesi Cihazda; ryton karşı akış, düşük akış ve meinhard sisleştiriciler kullanılabilmekte olup bunlar Ek-1’de görülmektedir. Sisleştiricilerin etkinlikleri aynı örnek analizi ile ve mangan (II) çözeltisinden elde edilen sinyalin şiddet değerine göre karşılaştırılmıştır. 90 3.2.7.12.3. HPLC-ICP-MS ikili tekniğine yönelik peltier soğutmalı siklonik püskürtme haznesi etkinliğinin belirlenmesi PC3 model peltier soğutmalı püskürtme haznesinin etkinliği, metanol fraksiyonlarından doğrudan analizler yapılmak sureti ile değerlendirilmiştir. 3.2.7.12.4. HPLC-ICP-MS ikili tekniği ile türlendirme/fraksiyonlama çalışmaları -1 Belirli konsatrasyon aralığında (136–595) µg L Mn ve on kat fazla derişimde Cu ile ultra saf suda hazırlanan mangan ve bakır karışım standartları analiz edilerek standartlara ait alıkonma zamanları (tR) belirlenmiştir. Tek bir derişim için tekrarlı analizler sonucu mobil faz olarak su seçilmiş ve bu seçim, matriks çalışmalarında da tekrar değerlendirilmiştir. Ispanak, un ve fındık örneklerinin su ekstraktları bkz. Bölüm 3.2.3 ve Bölüm 3.2.7.5’de anlatıldığı gibi hazırlanarak 0,22 µm PVDF tipi şırınga filtreden süzülmüş ve HPLC sistemine enjekte edilerek ICP-MS dedektöründe analiz edilmiştir. Yağmur suyu için ise 0,22 µm membran filtereden süzülen örnekler doğrudan viallere alınmıştır. Örnekler iki farklı mobil fazda, iyon çifti eklenerek- eklenmeden analiz edilerek mobil faz olarak su kullanımına karar verilmiştir. Ayrıca örnekler bazında fazla farklılık getirmemesi nedeni ile özellikle kantitatif çalışmalar her matriksten birer örneğin tekrarlı analizlerine uygulanmıştır (2 numaralı ıspanak, 2 numaralı un, 3 numaralı fındık ve tüm yağmur suları analiz edilmiştir). 91 4. BULGULAR 4.1. Ispanak, Un ve Fındık Örneklerindeki Temel Bileşenler Ispanak, un ve fındık örneklerindeki temel bileşenler ve miktarları sırası ile Çizelge 4.1.1, Çizelge 4.1.2 ve Çizelge 4.1.3’de verilmiştir. Çizelge 4.1.1. Ispanak örneklerinin makro bileşenleri ve bunların düzeyleri Ispanak Nem Diyet Lif Ham Selüloz Protein Örneği (%) (%) (%) (%) 1 87,7 ± 0,2 3,13 ± 1,05 1,88 ± 0,08 2,29 ± 0,06 2 90,1 ± 0,3 3,30 ± 0,75 1,98 ± 0,03 2,45 ± 0,15 3 91,0 ± 0,3 2,96 ± 0,28 2,07 ± 0,02 3,30 ± 0,15 Ispanak Yağ Şeker Kül Örneği (%) (%) (%) 1 0,12 ± 0,01 0,49 ± 0,08 2,31 ± 0,09 2 - - 1,37 ± 0,10 3 - - 1,89 ± 0,13 Çizelge 4.1.2. Un örneklerinin makro bileşenleri ve bunların düzeyleri Un Nem Diyet Lif Ham Selüloz Protein Örneği (%) (%) (%) (%) 1 11,9 ± 0,1 3,39 ± 0,70 0,43 ± 0,06 11,4 ± 0,1 2 11,40 ± 0,02 3,94 ± 0,64 0,43 ± 0,06 9,77 ± 0,14 3 13,8 ± 0,1 2,28 ± 0,71 0,46 ± 0,02 10,1 ± 0,1 Un Yağ Şeker Kül Örneği (%) (%) (%) 1 0,82 ± 0,10 1,66 ± 0,19 0,53 ± 0,03 2 1,04 ± 0,11 - 0,51 ± 0,01 3 1,07 ± 0,07 - 0,55 ± 0,01 92 Çizelge 4.1.3. Fındık örneklerinin makro bileşenleri ve bunların düzeyleri Fındık Nem Diyet Lif Ham Selüloz Protein Örneği (%) (%) (%) (%) 1 2,03 ± 0,01 11,90 ± 0,41 5,45 ± 0,24 18,2 ± 0,8 2 1,65 ± 0,02 10,48 ± 0,45 5,97 ± 0,42 18,3 ± 0,2 3 1,89 ± 0,03 10,29 ± 1,05 5,95 ± 0,40 17,0 ± 0,2 Fındık Yağ Şeker Kül Örneği (%) (%) (%) 1 64,6 ± 0,7 2,22 ± 0,24 2,20 ± 0,18 2 61,2 ± 0,7 - 2,13 ± 0,17 3 64,7 ± 0,6 2,33 ± 0,07 4.2. Fındık Örneklerindeki Yağ Asitlerinin Karakterizasyonu Fındık örneklerinin yağ asiti içeriklerine yönelik sonuçlar; Çizelge 4.2.1, Çizelge 4.2.2 ve Çizelge 4.2.3’te verilmiştir. a Çizelge 4.2.1. 1 numaralı fındık örneğinin metil esterlerine dayalı yağ asidi bileşimi b b Yağ asidi Ortalama Standart Limit Değer Limit Değer (metil esteri) (%) Sapma (en az) (en çok) Miristik (C14:0) <0,1 Palmitik (C16:0) 5,02 0,04 3,06 10 Palmitoleik (C16:1) 0,13 0,01 Eser 1,92 Stearik (C18:0) 2,52 0,01 Eser 3,2 c Oleik (C18:1) 84,2 0,1 71,00 91,00 Linoleik (C18:2) 7,95 0,05 2,87 21,42 Linolenik (C18:3) <0,1 Araşidik (C20) 0,11 0,01 Ekosenoik (C20:1) <0,1 Behenik (C22:0) <0,1 Erusik (C22:1) <0,1 TOPLAM 100,00 a : Enjeksiyon sayısı = 4 b : TS 6581 “yemeklik rafine fındık yağı standardı”na göre verilmiştir. c : Numunede en fazla bulunan yağ asidi 93 a Çizelge 4.2.2. 2 numaralı fındık örneğinin metil esterlerine dayalı yağ asidi bileşimi b b Yağ asidi Ortalama Standart Limit Değer Limit Değer (metil esteri) (%) Sapma (en az) (en çok) Miristik (C14:0) <0,1 Palmitik (C16:0) 5,03 0,02 3,06 10 Palmitoleik (C16:1) 0,13 0,01 Eser 1,92 Stearik (C18:0) 2,45 0,01 Eser 3,2 c Oleik (C18:1) 83,9 0,1 71 91 Linoleik (C18:2) 8,29 0,03 2,87 21,42 Linolenik (C18:3) <0,1 Araşidik (C20) 0,11 0,01 Ekosenoik (C20:1) <0,1 Behenik (C22:0) <0,1 Erusik (C22:1) <0,1 TOPLAM 100,00 a : Enjeksiyon sayısı = 4 b : TS 6581 “yemeklik rafine fındık yağı standardı”na göre verilmiştir. c : Numunede en fazla bulunan yağ asidi a Çizelge 4.2.3. 3 numaralı fındık örneğinin metil esterlerine dayalı yağ asidi bileşimi b b Yağ asidi Ortalama Standart Limit Değer Limit Değer (metil esteri) (%) Sapma (en az) (en çok) Miristik (C14:0) <0,1 Palmitik (C16:0) 5,04 0,01 3,06 10 Palmitoleik (C16:1) 0,14 0,01 eser 1,92 Stearik (C18:0) 2,20 0,01 eser 3,2 c Oleik (C18:1) 84,1 0,1 71 91 Linoleik (C18:2) 8,34 0,01 2,87 21,42 Linolenik (C18:3) 0,11 0,01 Araşidik (C20) 0,10 0,01 Ekosenoik (C20:1) <0,1 Behenik (C22:0) <0,1 Erusik (C22:1) <0,1 TOPLAM 100,00 a : Enjeksiyon sayısı = 4 b : TS 6581 “yemeklik rafine fındık yağı standardı”na göre verilmiştir. c : Numunede en fazla bulunan yağ asidi 94 4.3. Fındıkta Yağ İçeriğinin Standart Metot ve Kloroform:Metanol Ekstraksiyonu ile Karşılaştırılması Fındıkta, literatürde belirtilen (Gomez-Ariza ve ark. 2006, Gomez-Ariza ve ark. 2007) kloroform:metanol (2:1, v/v) ekstraksiyonu ile bulunan sonuç ve standart metot (TS 765/1971’ den yararlanılan soxhlet ekstraksiyonu metodu, bkz. Çizelge 4.1.1., Çizelge 4.1.2 ve Çizelge 4.1.3) ile bulunan sonuç birinci fındık örneği açısından kıyaslandığında; Çizelge 4.3.1’deki sonuçlara ulaşılmıştır. Çizelge 4.3.1. Fındıkta, iki farklı metot ile bulunan yağ yüzdelerinin karşılaştırılması Yağ Yağ Fındık (%) (%) (Soxhlet ekstraksiyonu) (Kloroform:metanol ekstraksiyonu) 1 numaralı örnek 64,6 ± 0,7 61,8 ± 5,6 4.4. AAS ile Metal Analizleri 4.4.1. AAS ile bazı metot validasyon parametrelerinin belirlenmesi AAS metot validasyon parametreleri olarak kullanılan faktörler ve değerleri bundan sonraki kısımda özetlenmektedir. Çizelge 4.4.1.1’de metot belirleme ve nicel tayin limitleri görülmektedir. Çizelge 4.4.1.1. AAS analizleri için bazı metot validasyon parametreleri ve değerleri Parametre Cu Mn a -1 LOD kör (çözgen)(mg L ) 0,01 0,01 b -1 LOQ kör (mg L ) 0,04 0,03 c -1 MLOD (mg kg ) 0,64 0,44 d -1 MLOQ (mg kg ) 2,13 1,48 a : Belirleme limiti b : Nicel tayin limiti c : Metot belirleme limiti d : Metot nicel tayin limiti 95 4.4.2. AAS’ de standart çözeltiler ile elde edilen kalibrasyon eğrileri Cu ve Mn için standart çözeltiler kullanılarak elde edilen kalibrasyon eğrisi grafikleri ve okunan absorbanslar Çizelge 4.4.2.1, Şekil 4.4.2.1; Çizelge 4.4.2.2 ve Şekil 4.4.2.2’de verilmiştir. Çizelge 4.4.2.1. AAS’de Cu analizinde standart çözeltiler ile elde edilen absorbans değerleri -1 Derişim (mg L ) Absorbans 0 0,001 0,1 0,007 0,2 0,016 0,5 0,042 1 0,085 1,5 0,128 2 0,170 0,18 0,16 0,14 y = 0,0853x - 0,0004 0,12 R2 = 0,9999 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 -0,02 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Derişim (mg L-1) Şekil 4.4.2.1. AAS’de Cu için standart çözeltiler ile elde edilen kalibrasyon eğrisi grafiği Çizelge 4.4.2.2. AAS’de Mn analizinde standart çözeltiler ile elde edilen absorbans değerleri -1 Derişim (mg L ) Absorbans 0 0,003 0,1 0,010 0,5 0,051 1 0,094 1,5 0,148 2 0,193 96 Absorbans 0,2500 0,2000 y = 0,096x + 0,0016 2 R = 0,999 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 -1 Derişim (mg L ) Şekil 4.4.2.2. AAS’de Mn için standart çözeltiler ile elde edilen kalibrasyon eğrisi grafiği 4.4.3. AAS ile yüzde geri kazanım çalışmaları 4.4.3.1. Kalibrasyon eğrileri Yüzde geri kazanım çalışmalarında yeni standart çözeltilere karşı belirlenen absorbanslar ve kalibrasyon eğrisi grafikleri Çizelge 4.4.3.1.1, Şekil 4.4.3.1.1, Çizelge 4.4.3.1.2 ve Şekil 4.4.3.1.2’de görülmektedir. Çizelge 4.4.3.1.1. AAS’de Cu analizinde geri kazanım çalışmaları için standart çözeltiler ile elde edilen absorbans değerleri -1 Derişim (mg L ) Absorbans 0,2 0,034 0,5 0,061 1 0,123 1,5 0,179 2 0,240 0,2 0,034 97 Absorbans 0,3000 0,2500 y = 0,1153x + 0,0076 2 R = 0,9987 0,2000 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 -1 Derişim (mg L ) Şekil 4.4.3.1.1. AAS’de yüzde geri kazanım çalışmalarında Cu için standart çözeltiler ile elde edilen kalibrasyon eğrisi grafiği Çizelge 4.4.3.1.2. AAS’de Mn analizinde geri kazanım çalışmaları için standart çözeltiler ile elde edilen absorbans değerleri Derişim (ppm) Absorbans 0,1 0,020 0,2 0,038 0,5 0,092 1,0 0,182 1,5 0,261 2 0,346 0,4000 y = 0,1712x + 0,0055 0,3500 2 R = 0,9995 0,3000 0,2500 0,2000 0,1500 0,1000 0,0500 0,0000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 -1 Derişim (mg L ) Şekil 4.4.3.1.2. AAS’de yüzde geri kazanım çalışmalarında Mn için standart çözeltiler ile elde edilen kalibrasyon eğrisi grafiği 98 Absorbans Absorbans 4.4.3.2. Yüzde geri kazanım çalışmaları -1 -1 Matrikslere mikrodalga parçalama işlemi öncesi 0,1 mg L (5 mg kg ) Mn ve Cu standartları katıldığında AAS analizi sonucu belirlenen yüzde geri kazanım değerleri Çizelge 4.4.3.2.1’de verilmiştir. Çizelge 4.4.3.2.1. AAS ile analizlerde matriksler için yüzde geri kazanım sonuçları Örnekler % Geri kazanım, Mn % Geri kazanım, Cu 1 numaralı Ispanak 96,63 92,81 2 numaralı Ispanak 82,70 100,00 3 numaralı Ispanak 100,00 117,50 1 numaralı Un 98,40 102,90 2 numaralı Un 103,20 93,40 3 numaralı Un 93,20 101,30 1 numaralı Fındık 100,00 104,20 2 numaralı Fındık 94,70 89,70 3 numaralı Fındık 102,40 100,0 4.4.4. AAS’ de sertifikalı referans malzeme ile yapılan çalışma sonuçları Metotta doğruluk çalışmaları kapsamında analiz edilen beş farklı SRM için elde edilen sonuçlar ve sertifika değerleri standart sapmaları ile birlikte Çizelge 4.4.4.1’de verilmiştir. Çizelge 4.4.4.1. AAS ile doğruluk çalışmaları kapsamında analiz edilen SRM’ lerde belirlenen Mn ve Cu düzeyleri SRM Ölçülen Ölçülen Mangan Bakır Mangan Bakır (Sertifika Değeri) (Sertifika Değeri) -1 -1 -1 -1 (mg kg ) (mg kg ) (mg kg ) (mg kg ) Ispanak 66,7 ± 1,7 12,2 ± 0,3 75,9 ± 1,9 12,2 ± 0,6 Yaprağı Buğday 8,8 ± 0,2 2,1 ± 0,1 9,4 ± 0,9 2,1 ± 0,2 Unu Çay 508,0 ± 0,1 18,6 ± 0,1 500 ± 20 18,6 ± 0,7 Çilek 185,20 ± 0,11 - 171,0 ± 10,0 Homojen değil Lahana - 5,65 ± 0,04 31,9 ± 1,2 5,67 ± 0,25 99 4.4.5. AAS ile metal analizleri Mikrodalga parçalama yöntemi ile analize hazırlanan ıspanak, un ve fındık örneklerinde belirlenen mangan ve bakır düzeyleri Çizelge 4.4.5.1’de verilmiştir. Çizelge 4.4.5.1. Matrikslerde AAS analizleri sonucu bulunan element düzeyleri Numunedeki Numunedeki Standart Standart Mangan Bakır -1 sapma -1 sapma (mg kg ) (mg kg ) 1 numaralı Ispanak 36,3 0,3 11,7 0,3 2 numaralı Ispanak 43,3 0,9 14,2 0,6 3 numaralı Ispanak 50,4 0,1 16,3 0,6 1 numaralı Un 7,5 0,2 2,0 0,1 2 numaralı Un 7,7 0,1 2,6 0,3 3 numaralı Un 11,1 0,9 2,6 0,6 1 numaralı Fındık 74,6 1,0 14,2 0,8 2 numaralı Fındık 85,8 2,8 21,3 1,3 3 numaralı Fındık 65,5 10,9 18,3 0,5 4.5. ICP-MS ile Metal Analizleri 4.5.1. AAS ile analiz edilen örneklerin ICP-MS ile karşılaştırılması AAS ile analiz edilen ve mikrodalga parçalama ile hazırlanan örnekler kalibrasyon eğrilerine uygun düzeyde seyreltilerek ICP-MS ile analiz edildiğinde mangan ve bakır düzeylerine ilişkin bulunan sonuçlar Çizelge 4.5.1.1’de verilmiştir. Ayrıca verim tayini -1 için; ıspanak, un ve fındık örneklerine 0,1 mg L olacak şekilde Mn ve Cu eklenmiştir. ICP-MS ile bulunan değerlerden hesaplanan yüzde geri kazanım değerleri de yine Çizelge 4.5.1.1’de görülmektedir. 100 Çizelge 4.5.1.1. Matrikslerde mikrodalga parçalama sonrası ICP-MS ile belirlenen metal düzeyleri, örneklere eklenen Mn ve Cu için bulunan yüzde geri kazanım değerleri % Geri % Geri Mangan Standart Bakır Standart -1 -1 kazanım, kazanım, (mg kg ) sapma (mg kg ) sapma Mn Cu 1 numaralı 37,9 0,8 10,8 0,2 96,5 92,7 ıspanak 2 numaralı 44,5 1,0 9,4 0,3 99,5 96,2 ıspanak 3 numaralı 53,2 1,4 9,7 0,2 98,2 96,5 ıspanak 1 numaralı un 7,7 0,1 2,0 0,1 103,8 103,3 2 numaralı un 5,1 0,1 1,8 0,1 103,9 99,4 3 numaralı un 8,4 0,4 2,2 0,1 87,4 98,7 1 numaralı fındık 79,9 1,3 13,7 0,5 100,3 103,7 2 numaralı fındık 95,5 1,9 16 1,6 96,5 96,7 3 numaralı fındık 76,7 9,3 14,2 0,6 95,3 97,8 4.5.2. Mikrodalga parçalama ile açık sistem yaş yakmanın karşılaştırılması Matriksler için açık sistem yaş yakma ve mikrodalga parçalamalı örnek hazırlama yöntemlerinin etkinliklerinin mangan ve bakır elementel düzeyleri açısından karşılaştırılması kapsamında açık sistem yaş yakma sonrası ICP-MS ile belirlenen Mn ve Cu düzeyleri Çizelge 4.5.2.1’de verilmiştir. Mikrodalga parçalamalı örnek hazırlama sonrası AAS ile belirlenen element düzeyleri bkz. Çizelge 4.4.5.1 ve AAS’de çalışılan aynı örnekler için ICP-MS ile belirlenen element düzeyleri ise bkz. Çizelge 4.5.1.1’ de verilmiştir. Çizelge 4.5.2.1. Açık sistem yaş yakmalı örnek hazırlama sonrası ICP-MS ile mangan ve bakır analizi sonuçları Mangan Standart Bakır Standart Örnekler -1 -1 (mg kg ) sapma (mg kg ) sapma 1 numaralı Ispanak 31,0 1,1 9,9 0,6 2 numaralı Ispanak 42,1 0,8 10,6 1,3 3 numaralı Ispanak 52,6 4,2 12,5 3,3 1 numaralı Un 8,7 1,6 2,9 1,0 101 Çizelge 4.5.2.1. Açık sistem yaş yakmalı örnek hazırlama sonrası ICP-MS ile mangan ve bakır analizi sonuçları (devam) Mangan Standart Bakır Standart Örnekler -1 -1 (mg kg ) sapma (mg kg ) sapma 2 numaralı Un 6,3 0,5 2,2 0,3 3 numaralı Un 8,8 1,0 2,11 0,1 1 numaralı Fındık 84,2 11,6 12,4 0,1 2 numaralı Fındık 88,0 1,2 14,1 0,1 3 numaralı Fındık 74,6 6,1 13,5 2,1 4.5.3. Merkezi kompozit dizayn yöntemi ile optimizasyon çalışmaları Merkezi kompozit dizayn (CCD) ile optimizasyona ilişkin kodlanmış değerler, gerçek değerler, ICP-MS cihazında ilgili metaller için elde edilen sinyaller veya metal düzeyleri ve polinom denklemler için hesaplanan katsayılar Çizelge 4.5.3.1, Çizelge 4.5.3.2 ve Çizelge 4.5.3.3’de verilmiştir. Katsayıların önemli olup olmadığı; Microsoft Office Excel ile optimum şartların belirlenmesinden sonraki matematiksel işlemlere dayandırılmıştır. Ispanak ve un örnekleri için optimizasyon çalışmalarında temel alınan -1 mangan ve bakır elementlerine ilişkin okunan sinyaller ile fındık örnekleri için µg L olarak belirlenen metal düzeyleri de ilgili çizelgelerde gösterilmiştir. 102 Çizelge 4.5.3.1. Ispanak matriksi için 2^3+star merkezi kompozit dizayn (N=16) Deney Kodlanmış Değerler Gerçek Değerler Cevap (sinyal) 5 5 6 ×10 ×10 ×10 63 65 55 x1 x2 x3 x1 x2 x3 Cu Cu Mn 1 +1 +1 +1 5 1,5 1 2,97 1,38 1,76 2 +1 +1 -1 5 1,5 0,5 1,83 0,86 1,40 3 +1 -1 +1 5 0,5 1 2,76 1,30 1,54 4 +1 -1 -1 5 0,5 0,5 1,66 0,77 1,34 5 -1 +1 +1 3 1,5 1 3,11 1,46 1,52 6 -1 +1 -1 3 1,5 0,5 1,86 0,87 1,33 7 -1 -1 +1 3 0,5 1 2,99 1,41 1,62 8 -1 -1 -1 3 0,5 0,5 1,74 0,82 1,25 9 +1,68 0 0 5,5 1 0,75 1,10 0,52 0,81 10 -1,68 0 0 2,5 1 0,75 2,35 1,11 1,62 11 0 +1,68 0 4 1,7 0,75 2,78 1,31 1,88 12 0 -1,68 0 4 0,3 0,75 3,08 1,44 1,55 13 0 0 +1,68 4 1 1,2 0,02 0,01 0,02 14 0 0 -1,68 4 1 0,3 1,43 0,67 0,99 15 0 0 0 4 1 0,75 3,02 1,42 1,67 16 0 0 0 4 1 0,75 2,85 1,33 1,54 Faktör Katsayı x1 -77963,903 x2 59098,467 x3 -37521,308 2 x1 480929,612 2 x2 659590,974 2 x3 229643,132 x1 x2 37895,181 x1 x3 - 1630,409 x2x3 - 2246,174 103 Çizelge 4.5.3.2. Un matriksi için 2^3+star merkezi kompozit dizayn (N=16) Deney Kodlanmış Değerler Gerçek Değerler Cevap (sinyal) 5 5 6 ×10 ×10 ×10 63 65 55 x1 x2 x3 x1 x2 x3 Cu Cu Mn 1 +1 +1 +1 5 1,5 0,5 0,51 0,24 5,25 2 +1 +1 -1 5 1,5 0,3 0,32 0,15 2,90 3 +1 -1 +1 5 0,5 0,5 0,54 0,26 4,53 4 +1 -1 -1 5 0,5 0,3 0,28 0,13 2,19 5 -1 +1 +1 3 1,5 0,5 0,50 0,24 3,76 6 -1 +1 -1 3 1,5 0,3 0,20 0,10 1,51 7 -1 -1 +1 3 0,5 0,5 0,50 0,24 4,06 8 -1 -1 -1 3 0,5 0,3 0,31 0,15 2,26 9 +1,68 0 0 5,5 1 0,4 0,43 0,20 3,66 10 -1,68 0 0 2,5 1 0,4 0,41 0,19 3,27 11 0 +1,68 0 4 1,7 0,4 0,45 0,22 3,47 12 0 -1,68 0 4 0,3 0,4 0,44 0,21 3,23 13 0 0 +1,68 4 1 0,52 0,59 0,28 4,77 14 0 0 -1,68 4 1 0,28 0,33 0,16 2,52 15 0 0 0 4 1 0,4 0,47 0,23 3,73 16 0 0 0 4 1 0,4 0,48 0,23 3,83 Faktör Katsayı x1 288614,1663 x2 56313,67738 x3 918654,1884 2 x1 1147674,401 2 x2 1106790,35 2 x3 1211868,453 x1 x2 308210,2852 x1 x3 57624,57768 x2x3 79722,82257 104 Çizelge 4.5.3.3. Fındık matriksi için 2^3+star merkezi kompozit dizayn (N=16) Deney Kodlanmış Değerler Gerçek Cevap Faktör Katsayı Değerler (metalmiktarı) (µg/L) 55x1 x2 x3 x1 x2 x3 Mn 1 +1 +1 +1 8 2,5 0,25 69,45 x1 -4,061 2 +1 +1 -1 8 2,5 0,15 43,06 x2 4,666 3 +1 -1 +1 8 1,5 0,25 69,90 x3 10,034 2 4 +1 -1 -1 8 1,5 0,15 63,61 x1 19,666 2 5 -1 +1 +1 6 2,5 0,25 39,84 x2 19,026 2 6 -1 +1 -1 6 2,5 0,15 43,23 x3 17,728 7 -1 -1 +1 6 1,5 0,25 68,99 x1 x2 0,396 8 -1 -1 -1 6 1,5 0,15 38,25 x1 x3 0,665 9 +1,68 0 0 8,5 2 0,12 58,08 x2x3 -1,753 10 -1,68 0 0 5,5 2 0,12 58,25 11 0 +1,68 0 7 3 0,12 50,85 12 0 -1,68 0 7 1 0,12 61,88 13 0 0 +1,68 7 2 0,3 75,58 14 0 0 -1,68 7 2 0,1 29,81 15 0 0 0 7 2 0,12 40,45 16 0 0 0 7 2 0,12 56,11 Ispanak, un ve fındık örnekleri için Çizelge 4.5.3.1, Çizelge 4.5.3.2. ve Çizelge 4.5.3.3’te verilen deneysel dizayn yöntemlerine göre belirlenen optimum koşullar Çizelge 4.5.3.4’de verilmiştir. Çizelge 4.5.3.4. Matrisler için optimum açık sistem yaş yakma koşulları Matriks HNO3 H2O2 H2SO4 Kütle (mL) (mL) (mL) (g) Un 3,89 1,00 - 0,3625 Ispanak 4,08 0,97 - 0,7705 (yaş örnek) Fındık 6,90 2 (sabit) 2,06 0,1862 4.5.3.1. Optimum koşullarda ICP-MS ile metal düzeylerinin belirlenmesi Merkezi kompozit dizayn yöntemi ile belirlenen optimum koşullardaki metal düzeyleri Çizelge 4.5.3.1.1’de verilmiştir. 105 Çizelge 4.5.3.1.1. Optimum koşullarda açık sistem yaş yakma ile belirlenen metal düzeyleri Mangan Bakır Örnekler -1 Standart Sapma -1 Standart Sapma (mg kg ) (mg kg ) 1 numaralı Ispanak 33,0 2,0 13,5 1,6 2 numaralı Ispanak 43,6 3,8 15,5 3,8 3 numaralı Ispanak 52,2 4,9 7,2 0,4 1 numaralı Un 7,5 0,9 1,9 0,3 2 numaralı Un 4,5 0,2 1,5 0,2 3 numaralı Un 8,0 0,6 2,0 0,1 1 numaralı Fındık 60,4 3,5 11,7 5,0 2 numaralı Fındık 67,0 3,8 10,8 1,3 3 numaralı Fındık 50,1 3,5 8,1 0,4 4.5.4. Serifikalı referans malzemelerin açık sistem yaş yakmalı örnek hazırlama sonrası ICP-MS ile analizleri AAS ile karşılaştırma amacı ile mikrodalga şartlarında (6 mL HNO3 ve 1 mL H2O2 ile) açık sistem örnek hazırlama yapıldığında SRM için elde edilen sonuçlar Çizelge 4.5.4.1’de verilmiştir. Çizelge 4.5.4.1. Açık sistem yaş yakma sonrası ICP-MS ile SRM analizleri SRM Mangan Bakır -1 Standart Sapma -1 Standart Sapma (mg kg ) (mg kg ) Ispanak Yaprağı 76,9 2,1 12,1 1,2 Buğday Unu 12,2 3,4 3,01 0,5 Çay 507 22,5 21,6 0,6 Çilek 166,3 3,5 - - Lahana 32,6 2,0 6,6 0,3 4.5.5. 0,1 N nitrik asit ile ultrasonik banyoda doğrudan parçalama yöntemi ile toplam metal analizleri Fraksiyonlama çalışmalarında kalıntıdan yüzde metal geri kazanımını belirtecek olan; ayrıca matrikslerin doğrudan parçalanabilme özelliklerini de yansıtacak olan yaklaşık 0,1 N nitrik asit ile ultrasonik banyoda ekstraksiyona ilişkin sonuçlar Çizelge 4.5.5.1’de verilmiştir. 106 Çizelge 4.5.5.1. Nitrik asite geçen metal miktarları Mangan Standart Bakır Standart -1 -1 (mg kg ) sapma (mg kg ) sapma 1 numaralı ıspanak 30,6 1,3 10,6 0,1 2 numaralı ıspanak 41,1 2,0 10,2 0,4 3 numaralı ıspanak 47,5 2,0 9,2 0,3 1 numaralı un 1,4 0,4 2,0 0,7 2 numaralı un 1,8 0,5 1,4 0,4 3 numaralı un 6,2 2,4 3,3 1,6 1 numaralı fındık 44,9 0,9 14,5 0,3 2 numaralı fındık 44,4 3,3 11,5 4,9 3 numaralı fındık 44,7 2,3 7,6 2,2 4.5.6. Matrikslerin kuru kısımlarında (yağı alınan örneklerde) metal analizleri TS 765:1971 temel alınarak uygulanan dietil eter ile soxhlet ekstraksiyonu sonucu yağı uzaklaştırılan örneklerin kuru kısımlarındaki metal düzeyini belirlemek amacı ile örnekler mikrodalga parçalama şartlarında fakat açık sistem yaş yakma ile parçalanarak analize hazırlanmıştır. Örnekler ICP-MS ile analiz edildiğinde Çizelge 4.5.6.1’deki sonuçlara ulaşılmıştır. Çizelge 4.5.6.1. Ispanak, un ve fındık matriksleri için yağı uzaklaştırılan örneklerdeki metal düzeyleri Mangan Standart Bakır Standart -1 -1 (mg kg ) sapma (mg kg ) sapma 1 numaralı ıspanak * 13,7 2,5 5,2 1,0 1 numaralı un 4,6 0,3 1,9 0,2 2 numaralı un 6,5 1,0 1,5 0,1 3 numaralı un 9,2 2,3 2,4 0,2 1 numaralı fındık 49,0 4,8 13,7 4,2 2 numaralı fındık 43,0 8,9 10,0 0,9 3 numaralı fındık 65,6 10,2 13,6 1,0 * Yağ içeriği düşük olduğundan sadece bir numaralı ıspanakta bu işlem uygulanmıştır. 107 4.5.7. Fraksiyonlama Sonuçları Fraksiyonlama sonrası farklı çözgenlere geçen metal miktarları her üç matriks için de çalışılmıştır. Organik çözgeni uçurulan ve yaklaşık 0,1 N nitrik asitte çözülen kalıntılar ICP-MS ile mangan ve bakır düzeyleri açısından analiz edilmiştir. Ispanak matriksi için mangan ve bakır düzeyleri Çizelge 4.5.7.1.1 ve Çizelge 4.5.7.1.2’de verilmiştir. Un için ilgili sonuçlar Çizelge 4.5.7.2.1, Çizelge 4.5.7.2.2 ve Çizelge 4.5.7.2.3’de ve fındık matriksi için de sonuçlar Çizelge 4.5.7.3.1 ve Çizelge 4.5.7.3.2’de görülmektedir. Tüm 63 matriks analizlerinde aksi belirtilmedikçe bakır için Cu izotopu ölçülmüştür. 4.5.7.1. Ispanak örnekleri için fraksiyonlama çalışmaları Çizelge 4.5.7.1.1. Üç farklı ıspanak örneğinden organik çözgenlere geçen mangan düzeyleri* Ispanak Su Kloroform Kloroform: Dietil eter Etanol metanol (2:1 (v/v)) 1 24,25 ± 0,61 1,04 ± 0,28 2,52 ± 0,10 0,84 ± 0,16 6,79 ± 2,51 2 30,10 ± 2,43 1,31 ± 0,46 1,38 ± 0,24 0,64 ± 0,14 5,97 ± 3,29 3 33,02 ± 1,81 1,31 ± 0,65 1,73 ± 0,10 0,77 ± 0,18 7,72 ± 2,73 Ispanak Aseton Aseton ile Etanol ile n-hekzan Metanol çöken çöken kalıntı kalıntı 1 0,87 ± 0,02 32,13 ± 8,12 36,99 ± 6,68 1,38 ± 0,28 6,89 ± 0,23 2 2,34 ± 0,87 30,08 ± 5,04 38,35 ± 9,34 1,11 ± 0,41 4,18 ± 0,79 3 1,47 ± 0,28 28,11 ± 1,88 27,08 ± 2,75 1,23 ± 0,28 4,40 ± 0,50 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve kuru kütle üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir. 108 Çizelge 4.5.7.1.2. Üç farklı ıspanak örneğinden organik çözgenlere geçen bakır düzeyleri* Ispanak Su Kloroform Kloroform: Dietil eter Etanol metanol (2:1 (v/v)) 1 6,40 ± 0,32 0,37 ± 0,10 3,51 ± 0,87 0,46 ± 0,20 2,98 ± 0,65 2 5,21 ± 0,52 0,34 ± 0,05 3,17 ± 0,55 0,61 ± 0,16 1,91 ± 0,68 3 6,52 ± 0,64 0,24 ± 0,07 3,88 ± 0,65 0,60 ± 0,20 2,46 ± 0,50 Ispanak Aseton Aseton ile Etanol ile n-hekzan Metanol çöken çöken kalıntı kalıntı 1 0,92 ± 0,33 4,76 ± 1,41 5,06 ± 1,21 0,51 ± 0,10 6,86 ± 0,44 2 1,06 ± 0,50 6,21 ± 1,12 6,85 ± 0,64 0,63 ± 0,20 6,25 ± 0,79 3 1,95 ± 0,24 7,30 ± 0,52 6,93 ± 0,43 0,45 ± 0,02 6,48 ± 0,48 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve kuru kütle üzerinden mg kg olarak sonuç 63 verilmiştir; Cu izotopu kullanılmıştır. 4.5.7.2. Un örnekleri için fraksiyonlama çalışmaları Çizelge 4.5.7.2.1. Üç farklı un örneğinden organik çözgenlere geçen mangan düzeyleri* Un Su Kloroform: Kloroform: Dietil eter metanol metanol (2:1 (v/v)) (1:2 (v/v)) 1 4,42 ± 0,72 0,094 ± 0,009 0,122 ± 0,018 0,04 ± 0,01 2 2,86 ± 0,40 0,083 ± 0,009 0,076 ± 0,044 0,05 ± 0,01 3 5,04 ± 0,32 0,088 ± 0,024 0,126 ± 0,046 0,07 ± 0,02 Un Aseton n-hekzan Metanol 1 0,005 ± 0,001 0,044 ± 0,002 0,195 ± 0,038 2 0,008 ± 0,003 0,042 ± 0,005 0,115 ± 0,016 3 0,009 ± 0,004 0,076 ± 0,005 0,129 ± 0,002 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve yaş kütle üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir. 109 65 Çizelge 4.5.7.2.2. Üç farklı un örneğinden organik çözgenlere geçen bakır ( Cu) düzeyleri* Un Su Kloroform: Kloroform: Dietil eter metanol metanol (2:1 (v/v)) (1:2 (v/v)) 1 0,29 ± 0,07 0,024 ± 0,013 0,232 ± 0,056 0,017 ± 0,005 2 0,40 ± 0,02 0,039 ± 0,021 0,100 ± 0,016 0,003 ± 0,001 3 0,32 ± 0,06 0,026 ± 0,010 0,110 ± 0,038 0,003 ± 0,002 Un Aseton n-hekzan Metanol 1 0,006 ± 0,001 0,006 ± 0,002 0,370 ± 0,093 2 0,040 ± 0,012 0,010 ± 0,002 0,262 ± 0,065 3 0,009 ± 0,005 0,008 ± 0,003 0,283 ± 0,050 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve yaş kütle üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir. 63 Çizelge 4.5.7.2.3. Üç farklı un örneğinden organik çözgenlere geçen bakır ( Cu) düzeyleri* Un Su Kloroform: Kloroform: Dietil eter metanol metanol (2:1 (v/v)) (1:2 (v/v)) 1 0,29 ±0,08 0,026 ± 0,014 0,230 ± 0,057 0, 017 ± 0,004 2 0,44 ±0,02 0,040 ± 0,020 0,100 ± 0,017 0, 004 ± 0,001 3 0,31 ±0,06 0,025 ± 0,009 0,110 ± 0,036 0, 004 ± 0,002 Un Aseton n-hekzan Metanol 1 0,006 ±0,001 0,006 ± 0,002 0,366 ± 0,094 2 0,040 ±0,012 0,009 ± 0,002 0,260 ± 0,065 3 0,010 ± 0,004 0,007 ± 0,002 0,275 ± 0,049 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve yaş kütle üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir. Seyreltme işlemi sonrası ICP-MS analizinde girişim etkisi olup olmadığını görmek için unda her iki bakır izotopuna ait sonuçlar verilmiştir. 110 4.5.7.3. Fındık örnekleri için fraksiyonlama çalışmaları Çizelge 4.5.7.3.1. Üç farklı fındık örneğinden organik çözgenlere geçen mangan düzeyleri* Fındık Su 2N HNO3 Dietil eter n-hekzan Metanol 1 10,89 ± 2,62 51,03 ± 0,86 0,78 ± 0,15 0,36 ± 0,03 0,15 ± 0,05 2 13,38 ± 0,02 45,13 ± 2,35 0,79 ± 0,24 0,67± 0,02 0,23 ± 0,01 3 7,33 ± 0,32 47,39 ± 2,65 0,67 ± 0,05 0,40 ± 0,02 0,42 ± 0,04 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve yaş kütle üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir. 63 Çizelge 4.5.7.3.2. Üç farklı fındık örneğinden organik çözgenlere geçen bakır ( Cu) düzeyleri* Fındık Su 2N HNO3 Dietil eter n-hekzan Metanol 1 6,64 ± 1,19 7,80 ± 0,50 0,07 ± 0,03 0,10 ± 0,05 0,51 ± 0,05 2 11,19 ± 1,06 9,78 ± 0,90 0,04 ± 0,02 0,08 ± 0,02 0,26 ± 0, 05 3 6,64 ± 0,09 9,53 ± 0,79 0,04 ± 0,03 0,05 ± 0,03 0,32 ± 0,06 −1 *Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve kuru kütle üzerinden mg kg olarak sonuç 63 65 verilmiştir. Seyreltme işlemi sonrası ICP-MS analizinde Cu ve Cu düzeyleri yaklaşık aynı bulunduğundan sadece bir izotopa ait sonuçlar verilmiştir. 4.5.8. Biyoyararlılık çalışmaları Biyoyararlılık çalışmaları farklı yöntemlere dayanılarak yapılmış ve sonuçlar birbirleri ile kıyaslanmıştır. Ispanak örneklerinin pepsin ve pankreatin enzimleri ile ayrı ayrı veya ardışık (mide ve bunu takiben bağırsakta) parçalanmaları sonucu serbest kalan, n- oktanol ile ekstrakte edilebilen veya aktif karbon üzerine adsorbe edilebilen element miktarları mangan ve bakır için ayrı ayrı Çizelge 4.5.8.1.1 ve 4.5.8.1.2’de görülmektedir. İlgili matriks için hem mangan hem de bakır düzeyinde biyoyararlılık değerlendirilmesi ise Çizelge 4.5.8.1.3 ve Çizelge 4.5.8.1.4’de verilmiştir. Un örnekleri için benzer şekilde elde edilen sonuçlar Çizelge 4.5.8.2,1, Çizelge 4.5.8.2.2, Çizelge 4.5.8.2.3, Çizelge 4.5.8.2.4, Çizelge 4.5.8.2.5 ve Çizelge 4.5.8.2.6’da verilmiştir. Fındık 111 örnekleri için elde edilen sonuçlara dayanan tablolar ise Çizelge 4.5.8.3.1, Çizelge 4.5.8.3.2, Çizelge 4.5.8.3.3 ve Çizelge 4.5.8.3.4’de gösterilmiştir. Tüm matriks 63 analizlerinde aksi belirtilmedikçe bakır için Cu izotopu ölçülmüş; pankreatin enzimine 65 dayalı ve ardışık biyoyararlılık çalışmaları için Cu izotopu değerlendirilmiştir. 4.5.8.1. Ispanak için biyoyararlılık çalışmaları Çizelge 4.5.8.1.1. Ispanak örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe edilebilen fraksiyonlarındaki mangan düzeyleri* Ispanak Pepsin Su Pankreatin −1 −1 −1 mg kg % mg kg % mg kg % 1 23,86 ± 2,41 66,23 24,25 ± 0,61 63,98 10,65 ± 0,80 28,10 2 28,75 ± 0,46 64,61 30,10 ± 2,43 67,64 17,26 ± 2,17 38,80 3 33,85 ± 0,20 63,63 33,02 ± 1,81 62,07 28,11 ± 1,37 52,84 Pepsin+Pankreatin (Gastrointestinal) n-oktanol Aktif karbon Ispanak −1 −1 −1 mg kg % mg kg % mg kg % 1 11,25 ± 2,13 29,68 3,53 ± 0,27 9,31 10,58 ± 2,01 27,92 2 14,16 ± 0,32 31,82 5,16 ± 1,36 11,59 17,34 ± 0,89 38,97 3 14,82 ± 1,11 27,85 9,84 ± 0,33 18,50 21,57 ± 2,10 40,54 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve kuru kütle üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir. 112 Çizelge 4.5.8.1.2. Ispanak örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe edilebilen fraksiyonlarındaki bakır düzeyleri* Ispanak Pepsin Su Pankreatin −1 −1 −1 mg kg % mg kg % mg kg % 1 8,92 ± 0,30 82,6 6,40 ± 0,32 59,3 7,66 ± 0,37 70,9 2 7,51 ± 0,17 79,9 5,21 ± 0,52 55,4 7,42 ± 0,10 78,9 3 7,93 ± 0,24 81,7 6,52 ± 0,64 67,2 6,60 ± 0,25 68,0 Pepsin+Pankreatin (Gastrointestinal) n-oktanol Aktif karbon Ispanak −1 −1 −1 mg kg % mg kg % mg kg % 1 5,35 ± 0,30 49,5 1,75 ± 0,14 16,2 7,59 ± 0,44 70,3 2 5,39 ± 0,39 57,3 2,52 ± 0,34 26,8 5,99 ± 0,72 63,7 3 5,19 ± 0,23 53,5 2,13 ± 0,31 33,2 7,68 ± 0,60 79,2 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve kuru kütle üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir. 113 Çizelge 4.5.8.1.3. Ispanaktaki manganın biyoyararlılığı* a Ispanak Biyoyararlılık n-oktanol ile Pankreatin ile n-oktanol ile (%) ekstrakte ekstrakte ekstrakte edilebilen edilebilen edilebilen b miktar mangan miktarı mangan miktarı −1 c (%) (mg kg ) (Düzeltilmiş) −1 (mg kg ) 1 46,39 14,56 10,65 ± 0,80 10,71 ± 0,81 2 47,04 17,14 17,26 ± 2,17 11,48 ± 3,02 3 44,88 29,80 28,11 ± 1,37 28,12 ± 0,94 Aktif karbona Suda adsorbe çözünen Toplam miktar −1 edilebilen mangan miktarı (mg kg ) d −1 Ispanak mangan miktarı (mg kg ) (%) 1 43,63 24,25 ± 0,61 37,9 ± 0,8 2 57,61 30,10 ± 2,43 44,5 ± 1,0 3 65,32 33,02 ± 1,81 53,2 ± 1,4 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve kuru kütle üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir a : in-vitro pepsin+pankreatin ile (gastrointestinal olarak) sindirilebilen element içeriğinin suya geçen element düzeyine oranı ile elde edilmiştir. b : n-oktanol ile ekstrakte edilebilen element düzeyinin suya geçen element düzeyine oranı ile elde edilmiştir. c b : ×düzeltme faktörü ile elde edilmiştir. d : Aktif karbon tarafından adsorbe edilen element düzeyinin suya geçen element düzeyine oranı ile elde edilmiştir. 114 Çizelge 4.5.8.1.4. Ispanaktaki bakırın biyoyararlılığı* a Ispanak Biyoyararlılık n-oktanol ile Pepsin+pankreatin ile (%) ekstrakte ekstrakte edilebilen edilebilen b miktar bakır miktarı −1 (%) (mg kg ) 1 83,6 16,2 5,35 ± 0,30 2 103,4 26,8 5,39 ± 0,39 3 79,6 33,2 5,19 ± 0,23 n-oktanol ile Aktif karbona Toplam miktar −1 Ispanak ekstrakte edilebilen adsorbe (mg kg ) bakır miktarı edilebilen c d (Düzeltilmiş) bakır miktarı −1 (mg kg ) (%) 1 5,35 ± 0,43 70,3 10,8 ± 0,2 2 4,96 ± 0,67 63,7 9,4 ± 0,3 3 5,66 ± 0,82 79,2 9,7 ± 0,2 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve kuru kütle −1 üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir a : in-vitro pepsin+pankreatin ile (gastrointestinal olarak) sindirilebilen element içeriğinin suya geçen element düzeyine oranı ile elde edilmiştir. b : n-oktanol ile ekstrakte edilebilen element düzeyinin suya geçen element düzeyine oranı ile elde edilmiştir. c b : ×düzeltme faktörü ile elde edilmiştir. d : Aktif karbon tarafından adsorbe edilen element düzeyinin suya geçen element düzeyine oranı ile elde edilmiştir. 115 4.5.8.2. Un için biyoyararlılık çalışmaları Çizelge 4.5.8.2.1. Un örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile ekstrakte edilebilen veya aktif karbona adsorbe edilebilen fraksiyonlarındaki mangan düzeyleri* Un Pepsin Su Pankreatin −1 −1 −1 mg kg % mg kg % mg kg % 1 7,60 ± 0,30 98,7 4,42 ± 0,72 57,4 2,75 ± 0,26 35,7 2 4,87 ± 0,22 95,5 2,86 ± 0,40 56,1 2,21 ± 0,60 43,3 3 5,13 ± 0,82 61,1 5,04 ± 0,32 60,0 2,45 ± 0,84 29,2 Pepsin+Pankreatin (Gastrointestinal) n-oktanol Aktif karbon Un −1 −1 −1 mg kg % mg kg % mg kg % 1 6,19 ± 0,36 80,4 0,34 ± 0,06 4,4 1,61 ± 0,42 20,9 2 4,42 ± 0,15 86,7 0,18 ± 0,06 3,5 0,77 ± 0,30 15,1 3 3,96 ± 0,19 47,1 0,42 ± 0,08 5,0 1,29 ± 0,14 15,3 −1 * Ortalama ± standart sapma, (N=3) ve yaş kütle üzerinden mg kg olarak sonuç verilmiştir. 116 Çizelge 4.5.8.2.2. Un örneklerinin enzim çözeltileri, su, n-oktanol ile ekstrakte 65 edilebilen veya aktif karbona adsorbe edilebilen fraksiyonlarındaki bakır ( Cu) a düzeyleri Un Pepsin Su Pankreatin −1 −1 −1 mg kg % mg kg % mg kg % 1,47 ± 0,61 66,8 0,29 ± 0,07 13,2 2,07 ± 0,28 94,1 1 2 1,72 ± 0,20 95,5 0,40 ± 0,02 22,2 1,70 ± 0,90 94,4 3 1,34 ± 0,42 61,0 0,32 ± 0,06 14,5 2,18 ± 0,69 99,1 Pepsin+Pankreatin (Gastrointestinal) n-oktanol Aktif karbon Un −1 −1 −1 mg kg % mg kg % mg kg b 1 1,62 ± 0,29 73,6 0,08 ± 0,03 3,6 % 95) triaçilgliserolden oluştuğu için gıdalardan lipid ekstraksiyonunda polar olmayan çözgenler daha etkindir. Yine de polaritesi düşük olan çözgenler ile istenmeyen yapılar da lipid ile ekstrakte edilebilir. Yaygın olarak kullanılan Folch metoduna göre lipidler kloroform ve metanol ile 142 ekstrakte edilebilmektedir (Folch ve ark. 1957, Rouser ve ark. 1967; Leray ve Pelletier 1987; Eller ve King 1996, Akoh ve Min 2002, Ferraz ve ark. 2004, Maeda ve ark. 2005; Bonfils ve ark. 2007, Akoh ve Min. 2008). Ispanaktaki % 0,12 lik yağ içeriği, eter ile ekstrakte edilebilen ham yağı belirtir ve bu -1 yapıya bağlı olan mangan ise 0,6–0,8 mg kg arasındadır. Çalışmamızda n-hekzan serbest lipit ve trigliseritler için kullanılmış ve eter ile karşılaştırılmıştır. n-hekzan aromatik yapıları da ekstrakte edebileceğinden miktarı daha fazla bulunmuştur. Toplam yağ da Folch metoduna göre kloroform:metanol (2:1, v/v) ekstraksiyonu ile belirlenmiştir (Folch ve ark. 1957; Akoh ve Min 2002; Ferraz ve ark. 2004; Emek ve -1 ark. 2011). Bağlı veya serbest lipidlere bağlı mangan düzeyleri 1,4–2,5 mg kg ve 1,1- -1 1,4 mg kg arasındadır. Fraksiyonlama çalışmalarında kloroform da nötral veya kovalent bağlı bileşenler; özellikle nötral lipidler için kullanılmıştır (Ozdemir ve Gucer, 1998; Ferraz ve ark. 2004, Yaşar ve Güçer 2004). Kloroforma geçen yapıların mangan -1 içeriği 1,0–1,3 mg kg arasında belirlenmiştir. Toplam lipidlere, nötral lipidlere veya -1 -1 serbest lipidlere bağlı Cu düzeyleri ise sırası ile 3,17–3,88 mg kg , 0,46–0,61 mg kg -1 ve 0,45–0,63 mg kg arasında belirlenmiştir. Ayrıca glikolipid içeren yapılar da aseton ile ekstrakte edilmiştir. Metanol polifenol de dahil olmak üzere pek çok polar bileşeni matriskten alabilecektir. Çalışmada metanol ve etanol de etkinlik açısından birbirleri ile kıyaslanmış ve etkinlikleri hemen hemen aynı bulunmuştur; fakat standart sapması daha küçük ve kesinliği daha iyi olan metanol ekstraktı temel alınmıştır. Literatürde etanol ve aseton sırası ile gıda matriksinden karbonhidrat ve protein çöktürmelerinde önerilmiştir (Karadjova ve ark. 2002). Bizim elde ettiğimiz sonuçlardan ise ikisinin de glikoprotein yapıları ile ilgili olabileceği gözlemine ulaşılmıştır. Sadece, etanol ile çöken yapıdaki element miktarı daha fazla olarak belirlenmiştir ki bu da ıspanağın daha yüksek glikolipid veya karbonhidrat içeriği ile ilgili olabilir. Sonuçlar yorumlandığında, manganın büyük bir kısmı (% 51–97) glikoproteine bağlı olup kalan % 3-7’si lipidlere bağlıdır. Cu için glikoproteine bağlı düzey ise % 44–75 arasındadır. Üçüncü ıspanakta muhtemelen yapısal bir özellikten dolayı % 49 civarında toplam mangan kaybı olmaktadır. Su ekstraktları da bunu doğrulayıcı niteliktedir. 143 Kullanılan organik çözgenler yeterince seçici davranmazlar bu nedenle de tek tek çözgenler ile yapılabilecek validasyon çalışmaları fraksiyonlardaki türler kesin olarak aydınlatılmadığı sürece anlamlı değildir. Gıdalardaki toplam metal düzeyleri biyoyararlılıkları ile ilişkili değildir. Biyoyararlılığı tespit etmede mide veya bağırsak şartlarında ne kadar metal ayrıldığının belirlenmesi önemlidir. Ispanak tilakoid membranı lipid ve protein içerdiğinden in-vitro gastrointestinal sindirim çalışmaları yapılmıştır (Emek ve ark. 2011; Moreda-Pineiro ve ark. 2012). Diğer matrikslere de makro bileşen analizinden görüldüğü üzere; farklı düzeyde lipid ve protein içerikleri nedeni ile uygulanmıştır. Protein sindirimi midede başlamaktadır. Zayıf bağlı proteinlerin çoğu burada parçalanmakta (Emek ve ark. 2011); parçalanan proteinler de bağırsağa iletilmektedir. Safra tuzları yağlı parçalar üzerine adsorbe olarak protein, emulsifier gibi diğer materyalleri lipid yüzeyinden uzaklaştıran bir bio-yüzey aktif madde olarak davranır; yağda çözünebilen besinlerin çözünme ve bağırsak mukozasına taşınımını kolaylaştırır (Maldonado-Valderrama ve ark. 2011). Böylece safra tuzları emulsifier etki göstererek (Chun ve ark. 2012) yağların pankreatin ile sindirimine yardımcı olmaktadır (Alava ve ark. 2013). Pepsin ve pankretaine ilaveten n-oktanol de bağırsaktan geçen miktarı karakterize eden bir çözgendir ve bu amaçla da uygulanarak bağırsaktan geçen mangan kompleksleri, pankreatin ile parçalanan kısım ile karşılaştırılmıştır (Shun-xing ve ark. 2004, Feng-Ying ve ark. 2007). Aktif karbon da suda veya organik çözgende çözülebilen bağlı mangan-bakır türlerinin adsorplanabilme özelliklerini araştırmak için uygulanmıştır. Suya geçen miktar pepsine geçen miktara yakın bulunmuştur. Bu nedenle suya geçen miktar toplam mangan olarak ele alınarak biyoyaralık hesaplamalarında kullanılmıştır. Toplam metal miktarı (suda çözünen kısım ya da toplam element içeriği temel alınmıştır.) ile pepsin (ya da pepsin+ pankreatin) tarafından parçalanan miktarlar arasındaki fark ya da pepsin ve pankretain tarafından parçalanan miktarlar arasındaki fark, sırası ile kalıntıdaki manganı-bakırı ya da yüklü ve/veya serbest Mn (II) ya da Cu (II)’yi karakterize edecektir. Bu miktar biyoyararlı olmayan kısımdır. Deneysel 144 sonuçlarda ıspanak üzerinde kanıtlandığı üzere, uygun bir faktörle çarpılmadığı sürece n-oktanol ekstraksiyonu, in-vitro yöntemlere alternatif olamamaktadır. Bu faktörü belirlemek için iki seviyeli standart katma çalışmaları yapılmıştır. Belirlenen yüzde geri kazanımlar Mn için % 32,5, % 45,2 ve % 35,3 iken Cu için % 32,7, % 50,8 ve % 37,6 olup bu oranlar komplekleşme olasılığını gösterecektir. Benzer faktör, n-oktanol fraksiyonundan elde edilen sonucun Mn için pankretainden elde edilen sonuca; Cu için de pepsin+pankreatinden elde edilen sonuca bölünmesi ile de çıkarılmaktadır. Bu düzeltme faktörleri göz önüne alınarak biyoyararlılık karşılaştırılması da yapılmıştır. Aktif karbon da pankreatin sıvısı ile benzer sonuçlar vermektedir. Aktif karbon, adsorbe olan kompleks yapıları ya da aromatik yapıları karakterize etmekte olup; biyoyararlılık çalışmalarında alternatif olarak kullanılabilir. Fakat bakır için aktif karbon alternatif bir yöntem olarak kullanılamamaktadır; bu da ilgili metallerin kompleksleşme özellikleri arasındaki farka dayandırılabilir. Ispanak için ayrıntılı olarak yapılan yorumlamalar diğer matriks-metal analizleri için de benzer şekilde açıklanabilir, benzer yorumlamalar yapılabilir. İlgili sayısal değerler un için bkz. Çizelge 4.5.7.2.1-Çizelge 4.5.7.2.3 63 65 arasında görülmektedir. Un için hem Cu hem de Cu analizi yapılmış olup; fraksiyonlama çalışmaları açısından aralarında bir fark görülmemiştir. Temel bileşenlerdeki farklılıklar nedeni ile ıspanak ve unun fraksiyonlama analizlerinde sonuçlar bazında farklılık beklenmelidir. Fındık için ilgili sayısal değerler de bkz. Çizelge 4.5.7.3.1 ve Çizelge 4.5.7.3.2’ de görülmektedir. Ispanak, un ve fındık örneklerinin makro bileşenleri bkz. Çizelge 4.1.1, Çizelge 4.1.2 ve Çizelge 4.1.3’ten alınarak kuru bazda ve her matriksin birinci örneği için yüzdesel içerikleri de sayısal olarak görülecek bir şekile dönüştürülmüştür (Şekil 5.1). Matriksin makro bileşenleri kendine özgüdür. Bu durum, bitki/hücre yapıları ve gıda olarak kullanılan kısımlarının yapılarına bağımlı olarak kimyasal yapıtaşlarının farklılığından ileri gelmektedir (Marschner 1989, Prasad 2004). İlk basamakta yapılacak basit bir yaklaşım ile mangan ve bakır türleri organik yapıya bağlı olmaları durumunda bu makro bileşenlerden birinin yapısında olabilecektir. Bunlar dışında eser olarak bulunabilecek yapıların varlığı da göz ardı edilmemelidir. Belirli bir makro bileşen açısından değerlendirildiğinde, örneğin yağ içeriği incelendiğinde, bu içeriğin azalma sırasının fındık, un, ıspanak şeklinde olduğu görülmektedir. Buna göre mangan ve bakır 145 elementlerinin yağlı organik yapıya bağlı olma olasılığında fındık matriksinde bu oranın potansiyel olarak en fazla olması beklenebilir. Fındık örneklerinin metil esterlerine dayalı yağ asidi kompozisyonu çalışması örneklerde başlıca oleik, linoleik, palmitik ve stearik asit olduğunu belirtmektedir. Bu bileşenlere ait değerlerin “yemeklik rafine fındık yağı standardı (TS 6581)” nın belirttiği limit değerlere uygun olduğu görülmüştür. Literatüre göre lipid kompozisyonu membrandan metal taşınımını etkileyen önemli bir değişken olabilmektedir (Marschner 1989). Standarda dayalı soxhlet ve kloroform:metanol ekstraksiyonu ile fındıktan yağ uzaklaştırılması metotları uyumlu olup; kloroform metanol ekstraksiyonunda standart sapma yüksektir. Ispanaktaki yağ ve şeker içerikleri sadece ilk ıspanak için incelenmiş ve yeterince küçük olduğu belirlenmiştir. 1 numaralı ıspanak örneğinin makro bileşenleri kül; 2,31 diyet lif; 3,13 diyet lif ham selüloz protein şeker ; 0,49 yağ yağ; 0,12 şeker kül protein; 2,29 ham selüloz; 1,88 1 numaralı un örneğinin makro bileşenleri kül; 0,53 şeker ; 1,66 diyet lif; 3,39 yağ; 0,82 diyet lif ham selüloz; 0,43 ham selüloz protein yağ şeker kül protein; 11,4 Şekil 5.1. Ispanak, un ve fındık matrikslerinde kuru bazdaki makro bileşenler 146 1 numaralı fındık örneğinin makro bileşenleri kül; 2,2 şeker ; 2,22 diyet lif; 11,9 ham selüloz; 5,45 diyet lif ham selüloz protein protein; 18,2 yağ şeker yağ; 64,6 kül Şekil 5.1. Ispanak, un ve fındık matrikslerinde kuru bazdaki makro bileşenler (devam) Örneklerdeki metal içeriklerinin belirlenmesi için mikrodalga yöntemi ile standart olarak uygulanan örnek hazırlama işlemleri sonrası AAS ile mangan ve bakır analizleri yapılmıştır. Metodun validasyonuna ait parametreler kalibrasyon eğrileri, belirleme ve nicel tayin limitleri, yüzde geri kazanım ve standart referans malzemeler kullanılarak incelenmiştir. Standart referans malzeme varlığında validasyon çalışmaları açısından yüzde geri kazanım çalışmaları yapılmasına gerek olmasa da hem fındık için standart referans malzeme olmadığından hem de geri kazanım çalışmaları ilgili metallerin diğer matriks bilenleri ile etkileşimini göstereceğinden önem arz edecektir. Örneğin; matrikslerde Mn ve Cu için % 100’ den düşük veya bazı hallerde de büyük yüzde geri kazanım görülmesi (ICP-MS sonuçları için bkz. Çizelge 4.5.1.1 ve AAS sonuçları için bkz. Çizelge 4.4.5.1) muhtemel girişim etkileri ile açıklanabilir. Ispanak sertifikalı referans malzemesinde de düşük doğruluk görülmesi (66,7± 1,7 değeri, bkz. Çizelge 4.4.4.1) örnek hazırlamada tam parçalanmama veya partiküle türlerin oluşmasına (örneğin kalsiyum fosfat gibi suda çözünmeyen türler) dayandırılabilir. Standart sapmanın küçük olması ikinci olasılığı azaltmaktadır. Bu etkinin her üç ıspanak matriksinde de aynı olmaması ise matriksin yapısındaki değişikliklere veya örneğin analiz için parçalanması işleminin yeterli olmamasına bağlanabilir. Sonuç olarak validasyon çalışmaları kalibrasyon metodunun seçimi açısından da önem arz eder ve bu anlamdaki hataların giderilmesinde önemlidir. Sulu standartlar ile çalışmak matriks etkisinin yok olduğunun kabullenilmesi veya gerçekten bu etkinin 147 gözlenmesi ile gerçekleştirilebilecekken; matriks etkisi varlığında standart katma metodu ile çalışmak daha doğru olacaktır. Yine bu metotta da bileşenin hangi kimyasal formda olduğu da önem arz eder. Hangi kalibrasyon metodunun kullanılacağı her iki kalibrasyon yönteminin eğim değerlerinden çıkarılabilmektedir. Eğer doğru değeri bilinen standartlar varsa bunlardan elde edilen sonuçlar ile ölçü metodunun sonuçları karşılaştırılarak sistematik hata varsa belirlenebilir (Skoog ve ark. 1998b). ICP-MS ve AAS sonuçlarına t-testi uygulanmıştır (Hadjiioannou ve ark. 1988). Elde edilen veriler şu şekildedir: Ispanak matriksi için t deneysel = 3,164 < t kuramsal = 4,303; un matriksi için t deneysel = 1,227 < t kuramsal = 4,303; fındık matriksi için t deneysel = 1,356 < t kuramsal = 4,303 olup; % 95 güven seviyesinde iki metot birbiri ile istatistiksel açıdan uyumludur; bununla birlikte iki fındık örneği için ancak % 99 güven seviyesinde uyum gözlenmiştir. Benzer şekilde Cu için de birer örnekle test uygulandığında uyumlu sonuçlar gözlenmiştir. Mikrodalga parçalamada kullanılan reaktif miktarları açık sisteme uyarlandığında ve iki yöntem karşılaştırıldığında üç matriks için de %95 güven seviyesinde Mn açısından uyumlu sonuçlar bulunmuştur. Mikrodalga parçalama-ICP- MS analizi sonrası bulunan Mn değerleri, optimum şartlar-ICP-MS analizi sonucu bulunan Mn değerleri ile % 95 güven aralığında uyumludur. Sadece iki fındık örneğinde % 95 güven aralığına uyumsuzluk belirlenmiştir (% 99 seviyesinde ancak uyum gözlenebilmiştir). Bakır örnekleri için optimum koşullar sadece bir fındık örneği için % 95 güven seviyesinde uyumlu değildir. Referans standart malzemelerin sertifika değeri ile bulunan değerlerin kıyaslanmasında da % 95 güven seviyesinde her iki element için de çoğunlukla uyumlu olduğu belirlenmiştir. Tez çalışmamızda ilave bir validasyon parametresi olarak metal analizleri AAS ile de karşılaştırıldığı gibi; ayrıca mikrodalga parçalamaya alternatif olarak yaklaşık 0,1 N nitrik asitte doğrudan parçalanma ya da açık sistem yaş yakma işlemleri de incelenmiş ve karşılaştırılmıştır. bkz. Çizelge 4.5.5.1 ve Çizelge 4.5.3.1.1 karşılaştırıldığında optimum koşullarda, ıspanak örnekleri için % 91–94 arası, un örnekleri için % 20–78 aralığında fındık örnekleri için ise % 66–89 aralığında metalin serbest kaldığı ve yaklaşık 0,1 N nitrik asitte çözündüğü belirlenmiştir. İkinci olarak mikrodalga parçalama işlemini takiben ICP-MS analizi temel alınarak nitrik asite geçen miktarlar belirlenirse bu oran ıspanak için % 80–92, un örnekleri için % 18–74 ve fındık örnekleri için % 46–58 olup; daha 148 düşük düzeyde serbest kalma yüzdesi gözlenmiştir. Bu durumda optimum şartların başarı ile uygulanabileceği ve açık sistemde ultrasonik banyoda gerçekleştirilen ekstraksiyonun da etkili olduğu görülmektedir. Bkz. Çizelge 4.5.6.1’ de matrikslerde yağın uzaklaştırılmasından sonra kuru kısımda kalan metal miktarları incelendiğinde ve bkz. Çizelge 4.5.3.1.1’deki optimum değerler ile kıyaslandığında; toplam mangan ve bakır içeriğinin ıspanak için % 40’ a yakın oranda kuru kısımda kaldığı, diğer matriksler için ise daha büyük oranda (%50’ den büyük) kuru kısımda kaldığı belirlenmiştir. Bakır için bu oranın ıspanak matriksinde yine yaklaşık olarak %40 civarında olduğu; diğer matrikslerde yaklaşık %100 olduğu belirlenmiştir. Bu oran da yağlı kısıma geçişin pratikçe olmadığını göstermiştir. Bu durumda kuru kısımda kalabilecek fraksiyonlar düşünüldüğünde ilgili elementlerin protein yapılarına bağlı olduğu öngörülebilir. Unda suya geçiş ıspanağa göre yaklaşık dörtte bir oranındadır. Bununla birlikte yağ temel bileşeni açısından sekiz kat daha fazla olmasına rağmen ıspanakta kloroform:metanol ekstraktına geçen metal miktarı undan onlarca kat daha fazladır. Bu durum temel bileşen sonucununun daha önce de belirttiğimiz gibi ilk basamak olarak sadece belirli öngörüler yapmada geçerli olabileceğini, her zaman doğrusal bir korelasyon olmayabileceğini göstermektedir. Dolayısı ile örneğin yağ miktarı az ise bu yapılara bağlı metal miktarı da azdır sonucuna ulaşılamayacaktır. Bununla birlikte unda beş kat fazla protein olması asetona geçen miktarının azlığı ile uyumludur. Daha önce de belirtidiği gibi aseton protein çöktürülmesi amacı ile kullanılabilmektedir. Bu durumda yapının aseton ile çökmüş olma ihtimali fazladır. Yine bu durum da daha önce belirtilen kuru kısım analizlerini doğrulamaktadır. Zira orada da un matriksi için ilgili elementlerin yaklaşık tamamının kuru kısımda kaldığı belirtilmiştir. Unda kloroform metanol (2:1, v/v) ve (1:2, v/v) analizleri sonucu arada fark bulunamamıştır. Bu durum daha önce de belirtildiği gibi literatür kaynakları ile uyumludur. Ispanakta bu çözgene geçen metal miktarının fazla olması sonucu, glikolipid fraksiyonlarına bağlı olma olasılığının fazla olduğu öngörülebilir. Ispanakta % 40 dışında kalan kısımın yağa geçtiği de daha önceki kuru kısım analizlerinde belirtilmiştir. Sonuç, bunu da doğrulayıcı niteliktedir. Ispanakta klorofil yapısından dolayı kloroforma geçen metal 149 düzeyleri fazla olabilir. Bu da manganın fotosentezdeki rolünü göstermesi açısından önemli olabilir. Bakır analizlerinden elde edilen sonuçlar da fraksiyonlara geçen düzeyler açısından mangana benzemektedir. Ancak suda çözünen formlar ıspanak-un karşılaştırması yapıldığında; hem su hem aseton açısından ilgili fraksiyona geçen bakır düzeyleri en az 20 kat fazla olup bu durumda bakırın da proteinlerle ilişkili olduğu sonucuna ulaşılabilir. Örneğin un matriksi için asetona geçen mangan ve bakır düzeyleri irdelendiğinde; belirli bir elementin daha çok protein ile ilişkili olduğu sonucuna ulaşılamamaktadır. Fındıkta yağ miktarı yaklaşık % 60 düzeyinde ve bu düzeyden de fazla olmasına rağmen dietil etere geçen mangan ve bakır miktarının az olması bu matrikste de Mn ve Cu elementlerinin büyük oranda proteine bağlılığı ile ilişkilendirilebilir. Nitrik asit derişimi yaklaşık 2 N’ e artırıldığında mangan ve bakırın serbest kalma oranı açısından 0,1 N nitrik asite göre belirgin bir değişiklik görülmemiştir. Bu da fraksiyonlama çalışmalarında kalıntının çözülmesinde 0,1 N nitrik asit derişiminin yeterli olacağını ve serbest kalan metal miktarının nitrik asit derişimi arttığında değişmeyeceğini göstermektedir. Fındıktaki mangan içeriği ıspanağın yaklaşık iki katı olmasına rağmen biyoyararlılık açısından ıspanak ve fındık, mangan kapsamında aynı düzeydedir. Bakırın biyoyararlılığı ise ıspanakta en fazla; fındıkta ise en az düzeydedir. Aktik karbon ekstraksiyonu çöken veya aromatik yapıda olan türler ile ilişkili olup, Mn açısından her üç matriks de hemen hemen aynı özellik gösterirken; Cu açısından aktik karbon adsorpsiyonu un ve fındık için uygun değilken; ıspanak için % 70 düzeyleri ile oldukça uygundur. n-oktanol çalışmaları her üç matriks için de biyoyararlılığı belirtmede yetersiz kalmaktadır. n-oktanolde ekstraksiyon veriminin pH’ a bağlı olması ve oktanolün yüksüz türleri alabilmesi sebebi ile sınırlılık görülmektedir. Ayrıca matriks etkileşiminin olduğu yapılan çalışmalar ile yüzde geri kazanım anlamında doğrulanmıştır. Yine de unda ve ıspanakta Cu için n-oktanol sonuçları Mn’ a göre daha iyi olup bu da bakırın yüksüz ve bağlı olduğunu gösteren diğer bir delildir. Biyoyararlılık çalışmalarından elde edilen sonuçlar ise; mide ve bağırsak şartlarının simülasyonu derecesinde belirlenebilmiştir. Suya geçen düzeyler biyoyararlılık açısından ilişkilendirildiğinde; matriksler açısından suya geçiş az olup elementin biyoyararlılığı fazla da olabilmektedir. Buradan metalin suda çözünmesinin gerekli; fakat tek başına biyoyararlılık ile ilişkilendirmede yeterli olmadığı sonucuna ulaşılabilir. ICP-MS çalışmalarının doğruluğunu gösteren validasyon çalışmaları da bkz. Çizelge 150 4.5.9.1 ve Çizelge 4.5.9.5 arasında verilmiştir. Katyon değiştirici kartuş kolonlar ile kesikli olarak matriks ayırma amaçlı olarak yapılan analizler sonucu matrikslerden katyonik formda Mn’ ın çok düşük düzeyde elüe edilebildiği belirlenebilmiştir. Atığa geçen element fraksiyonu ICP-MS ile değerlendirilse de bu oran çok fazla artmamış olup; ıspanak matriksi için %3–6 arasında, un matriksi için %1–1,5 arasında ve fındık matriksi için de %2–21 arasında değişmektedir. Ispanak için atığa geçen miktar da değerlendirildiğinde yüzde geri kazanımda ancak % 8 e kadar artış olabilmektedir. Bu durumda, matriksin zayıf baz özelliği gösterip kolondan elüe edilebilecek katyonik formları dışındaki yapısının daha fazla olduğu ve bu nedenle de kolonda tutulduğu değerlendirmesine ulaşılmıştır. Üretici firmanın şartlandırma-elüsyon için önerdiği çözgenler (Anonim 2010) elüsyon bazında ICP-MS’e uyarlanmaya çalışılmıştır. Buradaki değişiklik elüsyonda metanolik amonyum hidroksit kullanımı yerine suda ve yüzdesi daha az olan amonyaklı elüsyon çözgeni kullanılmasıdır. Bu durum, ICP-MS’ te azot yüzdesi artırılmayarak girişimlerin de bunun doğal sonucu olarak artırılmamasına göre ayarlanmıştır. Deneysel sonuçlar açısından ikinci bir olasılık da bu elüsyonun yetersiz olabileceğidir. Birinci fındık örneğinde katı faz ekstraksiyonunda yüzde geri kazanımın yüksek olmasına; matrikste muhtemel mikroorganizma faaliyetlerinin elementel yapının bağlı olduğu makromoleküler yapıyı parçalaması şeklinde öngörü getirilebilir. Zira bu fındık örneği matriksinde ekstraksiyon öncesi gözle görülür düzeyde küf oluşumu saptanmıştır. HPLC-ICP-MS sonuçlarına bakılacak olursa ilk yapılan işlem bu çalışmalar için kullanılan aparatların optimizasyonu; yani uygun püskürtme haznesi ve sisleştirici belirlenmesi olmuştur. Sisleştirici, sisleştirici gaz akış hızı ve püskürtme haznesi parçaları standart olarak verilmiştir (bkz. Çizelge 3.2.7.1.1). Ancak bu kısımlar sulu veya seyreltik nitrik asitli ortamda çalışmaya uygundur ve doğrudan organik çözgen ile çalışılmak isteniyorsa bu parçaların değiştirilmesi gerekmektedir. Sadece bu değişim de yeterli olmamaktadır; aynı zamanda organik çözgen iletim kiti de kullanılmalıdır. Bu kit, belirli sıcaklık koşullarında organik çözgenin ikincil bir gaz yardımı ile (oksijen) doğrudan sisteme verilmesi ve organik içeriğin bu ikincil gaz ile parçalanmasının artırılmasını sağlar. Bu kit, içinde, standart olarak siklonik püskürtme haznesi de barındırmakta; üzerine meinhard ya da düşük akış sisleştiriciler sonradan 151 takılabilmektedir. Literatürde ortama inert veya reaktif gazın verildiği çarpışma veya reaksiyon modlarında ICP-MS cihazları mevcuttur. Sistemimize ise ESI peltier soğutmalı siklonik püskürtme haznesi aksesuarı takılarak organik çözgenler ile doğrudan çalışma imkanı incelenmiştir. ICP-MS plazma kararlılığı metanol ile sağlanmakta olup; diğer çözgenlerde bu kararlılığın olmadığı görülmüştür. Diğer çözgenler ile yapılan denemelerde tüm örnek ve standartlara eklenen iç standart okumaları tutarsızdır veya plazma kararlı yanmamakta ya da sık sık sönmektedir. Bu nedenle sadece metanollü örneklerde sonuç alınabildiği görülmüştür. Türlendirme çalışmalarında siklonik püskürtme haznesi kullanımı daha çok tercih edilebilir. Çünkü ilgili aparatın yüksek taşınım hızı, etkin yıkama gibi avantajlar sunduğu bilinmektedir. Organik çözgen çalışmalarında standart ryton karşı akış yerine düşük akış veya meinhard sisleştirici de kullanılabilir. Düşük belirleme limitlerine ulaşmak açısından meinhard sisleştirici daha uygun görülmüştür. (İlgili parametre Mn(II) sinyal okuma -1 değeridir. HPLC-ICP-MS tekniğinde 1 mg L Mn (II) çözeltisi için ICP-MS’de düşük akış sisleştiricide ve ilk çalışmalarda şiddet değeri 900 000 iken meinhard sisleştiricide bu değer 1 900 000 olarak belirlenmiştir. Denemelerde siklonik püskürtme haznesi aparatı sabit tutulmuştur. -1 Ispanak, un, fındık ve yağmur suyu matrikslerinde Mn için µg L düzeyinde, bakır için -1 mg L düzeyinde standartlar, scott-ryton karşı akış kombinasyonu ile yüksek sinyal şiddetinde görülebilmiş olup bu birleşim örnek analizlerinde kullanım kolaylığı açısından sonraki tüm çalışmalarda kullanılmıştır. Türlendirme çalışmalarında meinhard sisleştirici ve siklonik püskürtme haznesi kullanımı tercih edilse de meinhard sisleştiricinin yapısı itibari ile tıkanmalar her ihtimalde daha fazla olabilecek ve daha uzun süreli sistem yıkamalarını gerektirebilecektir. Çalışmalarımızda da görüldüğü üzere meinhard nebulizer tıkanmalara daha açık olduğundan duyarlılığı Mn için yeterli gelen scott aparatının kullanılmasına karar verilmiştir. Organik çözgen ile yapılan çalışmalar ise sinyal kararlılığı ve tekrarlanabilir sonuçlar açısından daha zor olup organik çözgen iletim aparatının yine de metanol ile çalışılmaya uygun olduğu ve bu fraksiyonlarda doğrudan metal analizleri de yapılabilmesine imkan sağlayacağı belirlenmiştir. 152 HPLC-ICP-MS analizleri ile yüklü ve bağlı Mn/Cu türleri ile serbest ve yüklü Mn/Cu türlerinin belirlenmesine yönelik çalışmalar yapılmıştır. Kolondan hızlıca çıkabilecek bileşenler serbest Mn/Cu veya yüklü ve bağlı Mn/Cu bileşenleri olabilecektir. Standart çözeltiler ile alan ve yüksekliğe göre kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur. Gerek kesiksiz analizde ICP-MS tarafında belirlenebilirlik açısından numunenin derişik verilme zorunluluğu; gerekse teknikler arası bağlantıdan kaynaklanan gecikmelere dayandırılabilecek olan pik genişlikleri nedeni ile alana göre değil yüksekliğe göre olan kalibrasyon eğrileri grafikleri değerlendirilmiş ve matrikslerde ıspanak için % 51,8, un için % 60,6 ve fındık için % 6,6 oranında serbest veya moleküler yapıda ayrıca yüklü mangan belirlenirken; fındıkta buna ilaveten % 5,2 oranında bağlı fakat yüklü mangan türü de öngörülmüştür. Cu sonuçlarında tekrarlanabilirlik sağlanamamış olup; genellikle nicel tayin limitinden düşük olmakla birlikte; bazen toplam metal miktarından çok daha yüksek sonuçlar da gözlenebilmiştir. Kalibrasyon eğrisi çalışmalarında optimizasyon yapıldığı ve düşük belirleme limitleri elde edildiğinde; en iyi ihtimal ile ıspanak, un ve fındık matriksleri için sırası ile % 10,47, % 4,46 ve % 0,34 serbest veya moleküler 63 yapıda ayrıca yüklü Cu düzeyleri belirlenmiş olup; bunlar da ilgili elementin daha çok bağlı formda olduğunu göstermektedir. Ancak bakır analizlerinde tekrar elde edilebilirlik sağlanamadığından matrikslerdeki bakırın HPLC-ICP-MS tekniği ile analizinde en çok tekrar elde edilebilirlik düzeyine ve bu şartlardaki kalibrasyon eğrilerine dayanılarak nicel tayin limitinden daha düşük düzeyde bakır olduğu şeklinde değerlendirilmeye varılmıştır. Sistemde yüklü ve serbest türler belirlenebileceğinden, numunedeki toplam metal derişimi kesiksiz sistem analizinde önemli olduğundan ve bakır için fraksiyonlama çalışmalarından da büyük ölçüde bağlı formlar öngörüldüğünden bu beklenen bir sonuç olabilecektir. Bakırın hem çok düşük hem de matriks içeriğinden de büyük belirlenmesinin; örneğin alkali metal girişimi gibi girişim etkileri nedeni ile ya da kolon ile etkileşen bağlı bakır türlerinin fazlalığından olabileceği öngörülebilir. Bu durumda analizler arası daha etkin yıkama ve kolondan desorpsiyonu sağlayacak metodolojik yaklaşımlar uygulanmalıdır. Yağmur sularında da bakır için yukarıda anlatılan durumun aynısı söz konusudur. Yağmur suyunda mangan düzeyleri ise belirleme limitinin altındadır. Toplam element düzeyine göre de bu beklenen bir sonuçtur. Yine de fraksiyonlama çalışmalarındaki kolloidal, çözünmüş, partiküle mangan gibi tanımlamalar bağlı yapıların önerilebilmesine ışık tutacaktır. 153 Bakır için tekrar elde edilebilirliğin olmaması, aynı matriks ve aynı örnek için dahi hem toplam düzeyden daha az hem de daha çok serbest/yüklü bakır düzeyinin gözlenebilmesi nedeni ile bu element için ön deriştirme basamağı da uygulanmamıştır. Katı faz ekstraksiyonu ise uygun düzeyde sonuçlar vermediğinden özellikle yağmur suyu örnekleri için Mn açısından deriştirme söz konusu olamamıştır. Mangan için ıspanak, un ve fındık matrikslerinden elde edilen HPLC-ICP-MS sonuçları, seçiciliği sınırlı olsa da aseton ile çöktürülen fraksiyonlarda glikoproteinlere bağlı olabileceği belirlenmiş mangan düzeyleri ile uyumlu olup standart sapmalar dahilinde yaklaşık bütünü (toplam element düzeyini) karakterize etmektedir. Yukarıda açıklanan pik genişlemesine neden olabilecek üçüncü olasılık girişimler olabilecektir. Literatürde arsenik çalışmalarında bu yönde açıklamalar da görülmüştür (Akter ve ark. 2005). Yine literatürde sütte yapılan çalışmalarda Chelex 100 ve AG-1 X-8 dolgu maddeleri ile çalışıldığında bakırın katyonik formda veya bağlı olduğu, enzim ve protein yapılarında olduğu; ayrıca protein yapılarında daha çok bulunduğu belirtilmiştir. Katyonik tür dışında nötral veya anyonik türler de olabilmektedir (Abollino ve ark. 1998). Kısaca; matriks etkisi fazla olsa da bağlı yapıların aydınlatılmasına yönelik çalışmalarda literatür ile uyumlu öngörüler de ortaya konmaya çalışılmıştır. Sonuç olarak; fraksiyonlama çalışmalarının, çalışılan örneklerin yapılarının ve bu yapılardaki taşınım olaylarının anlaşılmasında kilit basamak olacağı; ayrıca biyoyararlılık çalışmalarının değerlendirilmesinde de yararlı olabileceği görülmüştür. Bununla birlikte fraksiyonlama basamaklarının seçimi de matriks bileşenlerinin dağılımları ile ilişkili olacaktır. Türlendirme çalışmalarına geçilebilmesi için de bu dağılımlar önem gösterecektir. Türlendirme çalışmalarında metale bağlı yapıların genel anlamda kararlılıkları ve inert olup olmamaları önemlidir. HPLC-ICP-MS tekniğinin kullanılabilirliği açısından bakıldığında mobil faz yapısının getirdiği sınırlayıcı etkiler yanında; örnekte bulunan bileşenlerin tayinlerinde seyrelme problemleri nedeni ile zorluklar yaşanabilmektedir. Bu açıdan bakıldığında, sisleştirme düzeneklerinde ve taşınım yolunda optimizasyonlar yapılarak özellikle duyarlılık açısından bir takım iyileştirmeler gerçekleştirilse de plazma şartlarına eklenen mobil fazın girişim 154 etkilerinden ve plazma şartlarının değişiminden kurtulmak için yine ilave iyileştirmeler gerekmektedir. Ayrıca seçilen mangan ve bakır elementleri türlendirme çalışmalarından, bitkilerdeki stres çalışmalarının aydınlatılması ile uygun ligandların saptanması sonucu geliştirilecek metotlar ile de daha başarılı sonuçlar alınabileceği söylenebilir. 155 KAYNAKLAR Abbasi, S., Khani, H., Tabaraki, R. 2010. Determination of ultra trace levels of copper in food samples by a highly sensitive adsorptive stripping voltammetric method. Food Chemistry,123: 507–512. Abollino, O., Aceto, M., Bruzzoniti, M.C., Mentasti, E., Sarzanini, C. 1998. Speciation of copper and manganese in milk by solid-phase extraetion/inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry. Analytica Chimica Acta, 375: 299–306. Açkurt, F., Özdemir, M., Biringen, G., Löker, M. 1999. Effects of geographical origin and variety on vitamin and mineral composition of hazelnut (Corylus avellana L.) varieties cultivated in Turkey. Food Chemistry, 65: 309–313. Akter, K.F., Chen, Z., Smith, L., Davey, D., Naidu, R. 2005. Speciation of arsenic in ground water samples: A comparative study of CE-UV, HG-AAS and LC-ICP-MS. Talanta, 68: 406–415. Akoh, C.C., Min, D.B. 2002. Food Lipids, Chemistry, Nutrition, and Biotechnology, Second Edition. Marcel Dekker, USA, 1005 pp. Akoh, C.C., Min, D.B. 2008. Food Lipids, Chemistry, Nutrition, and Biotechnology, Third Edition. CRC Press, USA, 928 pp. Alasalvar, C., Amaral, J.S., Satır, G., Shahidi, F. 2009. Lipid characteristics and essential minerals of native Turkish hazelnut varieties (Corylus avellana L.). Food Chemistry, 113: 919–925. Alava, P., Du Laing G., Odhiambo, M., Verliefde, A., Tack, F., Van De Wiele, T.R. 2013. Arsenic bioaccessibility upon gastrointestinal digestion is highly determined by its speciation and lipid-bile salt interactions. Journal of Environmental Science and Health, Part A, 48: 656–665. Alvarez-Llamas, G., Fernândez de la Campa, M.R., Sanz-Medel, A. 2005. ICP-MS for specific detection in capillary electrophoresis. Trends in Analytical Chemistry, 24 (1): 28–36. Amais, R.S., Donati, G.L., Nóbrega, J.A. 2011. Application of the interference standard method for the determination of sulfur, manganese and iron in foods by inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 706: 223–228. Anonim 2002a. Yem maddeleri ve karma yemlerin bileşiminin kontrol edilmesinde kullanılan analiz metotları. http://www.tarim.gov.tr/GKGM_Belgeler/Gıda ve Yem Hizmetleri/Konular/yem_hizmetleri/analiz_metotlari.doc-(Erişim tarihi: 01.06.2013) Anonim 2002b. Türk Gıda Kodeksi, İnsan Tüketimine Sunulan Şekerlerin Analiz Yöntemleri Tebliği. http://www.istanbulsaglik.gov.tr/w/mev/mev_tebl/tebl_temel_ saglik/insan_tuketimine_sunulan.pdf-(Erişim tarihi:12.04.2013). 156 Anonim 2004a. Guide to inorganic Analysis (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, USA), 2004, USA. Anonim 2004b. The 30-Minute Guide to ICP-MS (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, USA), 2004, USA. Anonim 2010. Agilent SampliQ Products for Sample Preparation (Agilent Technologies, Inc., USA). http://www.chem.agilent.com/Library/brochures/5989- 9334EN.pdf-(Erişim tarihi: 03.06.2013) Anonim, 2012a. Tools for elemental speciation analysis, (© 2003 - 2010 by European Virtual Institute for Speciation Analysis ( EVISA ), last time updated: December 13, 2012) http://www.speciation.net/Public/Document/2003/09/11/503.html-(Erişim tarihi: 05.06.2013), Anonim 2012b. Gıdalarda şeker analizi. 2012. http://gidatayinleri.files.wordpress.com /2012/02/gidalarda-seker-analizi.pdf-(Erişim tarihi:12.04.2013) Arias-Borrego, A., Garcia-Barrera, T., Gomez-Ariza, JL. 2008. Speciation of manganese binding to biomolecules in pine nuts (Pinus pinea) by two-dimensional liquid chromatography coupled to ultraviolet and inductively coupled plasma mass spectrometry detectors followed by identification by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications In Mass Spectrometry, 22: 3053–3060. Araujo, R.G.O., Dias, F.D.S., Macedo, S.M., dos Santos, W. N.L., Ferreira, S.L.C. 2007. Method development for the determination of manganese in wheat flour by slurry sampling flame atomic absorption spectrometry. Food Chemistry, 101: 397–400. Araujo, G.S., Matos, L.J.B.L., Fernandes, J.O., Cartaxo, S.J.M., Gonçalves, L.R.B., Fernandes, F.A.N., Farias, W.R.L. 2013. Extraction of lipids from microalgae by ultrasound application: Prospection of the optimal extraction method. Ultrasonics Sonochemistry, 20: 95–98. Awai, K., Kakimoto, T., Awai, C., Kaneko, T., Nakamura, Y., Takamiya, K., Wada, H., Ohta, H. 2006. Comparative genomic analysis revealed a gene for monoglucosyldiacylglycerol synthase, an enzyme for photosynthetic membrane lipid synthesis in Cyanobacteria. Plant Physiology, 141: 1120–1127. Baez, A., Belmont, R., García, R., Padilla, H., Torres, M.C. 2007. Chemical composition of rainwater collected at a southwest site of Mexico City, Mexico. Atmospheric Research, 86: 61–75. Batista, B.L., Rodrigues, J.L., de Souza, S.S., Souza, V.C.O., Barbosa Jr., F. 2011. Mercury speciation in seafood samples by LC–ICP-MS with a rapid ultrasound-assisted extraction procedure: Application to the determination of mercury in Brazilian seafood samples. Food Chemistry, 126: 2000–2004. 157 Bergman, M., Varshavsky, L., Gottlieb, H.E., Grossman, S. 2001. The antioxidant activity of aqueous spinach extract: chemical identification of active fractions. Phytochemistry, 58: 143–152. Bernhard, M., Brinckman, F.E., Sadler, P.J. 1986. Importance and Determination of Chemical Species in Biological Systems: The importance of chemical “speciation” in environmental processes, Dahlem Konferenzen-Workshop Reports, Ed.: Bernhard, S., Springer-Verlag, Germany, p.18. Bhandari S.A., Amarasiriwardena, D. 2000. Closed-vessel microwave acid digestion of commercial maple syrup for the determination of lead and seven other trace elements by inductively coupled plasma-mass spectrometry. Microchemical Journal, 64: 73–84. Bidlingmeyer, B.A. 1992. Practical HPLC Methodology and Applications. John Wiley & Sons, Inc. New York, USA, 452 pp. Bonfils, F., Ehabe, E. E., Aymard, C., Vaysse, L., Sainte-Beuve, J. 2007. Enhanced solvent extraction of polar lipids associated with rubber particles from Hevea brasiliensis. Phytochem. Anal., 18, 103–108. Boojar, M.M.A, Goodarzi, F. 2008. Comparative evaluation of oxidative stress status and manganese availability in plants growing on manganese mine. Ecotoxicology and Environmental Safety, 71: 692–699. Brereton, R.G. 2007. Applied Chemometrics for Scientists. John Wiley & Sons Inc, USA, 396 pp. Broekaert, J.A.C., Gücer, S., Adams, F. 1990. Metal Speciation in the Environment. Springer-Verlag, Berlin, 645 pp. Burczak, J. D., Soltysiak, R.M., Sweeley, C.C. 1984. Regulation of membrane-bound enzymes of glycosphingolipid biosynthesis. Journal of Lipid Research, 25: 1541–1547. Burguera, J.L., Burguera, M. 2009. Recent on-line processing procedures for biological samples for determination of trace elements by atomic spectrometric methods. Spectrochimica Acta Part B, 64: 451–458. Buszewski, B., Szultka, M. 2012. Past, present, and future of solid phase extraction: A review. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 42: 198–213. Cabanero, A.I., Madrid, Y., Camara, C. 2004. Selenium and mercury bioaccessibility in fish samples: an in vitro digestion method. Analytica Chimica Acta, 526: 51–61. Caldwell, C.R. 2002. Effect of elevated copper on phenolic compounds of spinach leaf tissues. Journal of Plant Nutrition, 25(6): 1225–1237. 158 Chun, I.K., Lee, K.M., Lee, K.E., Gwak, H.S. 2012. Effects of bile salts on gastrointestinal absorption of Pravastatin. Journal of Pharmaceutical Sciences, 101 (7): 2281–2287. Ciceri, E., Recchia, S., Dossi, C., Yang, L., Sturgeon, R.E. 2008. Validation of an isotope dilution, ICP-MS method based on internal mass bias correction for the determination of trace concentrations of Hg in sediment cores. Talanta, 74: 642–647. Citak, D., Tuzen, M., Soylak, M. 2010. Speciation of Mn(II), Mn(VII) and total manganese in water and food samples by coprecipitation–atomic absorption spectrometry combination. Journal of Hazardous Materials, 173: 773–777. Cobzac, S. C., Gocan, S. 2011. Sample preparation for high performance liquid chromatography: recent progress. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 34: 1157–1267 Contini, M., Baccelloni, S., Massantini, R., Anelli, G. 2008. Extraction of natural antioxidants from hazelnut (Corylus avellana L.) shell and skin wastes by long maceration at room temperature. Food Chemistry, 110: 659–669. Corley, J. 2003. Best Practices in Establishing Detection and Quantification Limits for Pesticide Residues in Foods: Handbook of Residue Analytical Methods for Agrochemicals, Volume 1, Ed.: Lee, P.W., Aizawa, H., Barefoot, A.C., Murphy, J.J., John Wiley & Sons Ltd., UK, pp 59-75. Crews, H.M. 1998. Speciation of trace elements in foods, with special reference to cadmium and selenium: is it necessary?. Spectrochimica Acta Part B, 53: 213–219. Chrastny, V., Komarek, M. 2009. Copper determination using ICP-MS with hexapole collision cell. Chemical Papers, 63 (5): 512–519. Delgado, T., Malheiro, R., Pereira, J.A., Ramalhosa, E. 2010. Hazelnut (Corylus avellana L.) kernels as a source of antioxidants and their potential in relation to other nuts. Industrial Crops and Products, 32: 621–626. Demir, M. 1986. Toprak örneklerinde bazı eser elementlerin (Bi, Cd, Co, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Zn) atomik absorpsiyon spektrofotometresi ile tayinlerinde halka tekniğinin yeri. Doktora Tezi, İnönü Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Malatya. Demirel, S., Tuzen, M., Saracoglu, S., Soylak, M. 2008. Evaluation of various digestion procedures for trace element contents of some food materials. Journal of Hazardous Materials, 152: 1020–1026. de Oliveira E. 2003. Sample preparation for atomic spectroscopy: Evolution and Future Trends. J. Braz. Chem. Soc., 14 (2): 174-182. 159 de Romana, D.L., Olivares, M., Uauy, R., Araya, M. 2011. Risks and benefits of copper in light of new insights of copper homeostasis. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 25: 3–13. Deutsch, F., Hoffmann, P., Ortner, H.M. 1997. Analytical characterization of manganese in rainwater and snow samples. Fresenius J Anal Chem, 357: 105–111. D’Ilio, S., Violante, N., Caimi, S., Di Gregorio, M., Petrucci, F., Senofonte, O. 2006. Determination of trace elements in serum by dynamic reaction cell inductively coupled plasma mass spectrometry Developing of a method with a desolvating system nebulizer. Analytica Chimica Acta, 573–574: 432–438. Dolan, S.P., Capar, S.G. 2002. Multi-element analysis of food by microwave digestion and inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry. Journal of Food Composition and Analysis, 15: 593–615. Dominguez-Gonzalez, R., Romaris-Hortas, V., Garcia-Sartal, C., Moreda- Pineiro, A., Barciela-Alonso, M.D.J. Bermejo-Barrera, P. 2010. Evaluation of an in vitro method to estimate trace elements bioavailability in edible seaweeds. Talanta, 82: 1668–1673. Dou, C., Fu, X., Chen, X., Shi, J., Chen, Y. 2009. Accumulation and interaction of calcium and manganese in Phytolacca americana. Plant Science, 177: 601–606. Dressler, V.L., Antes, F.G., Moreira, C.M., Pozebon, D., Duarte, F.A. 2011. As, Hg, I, Sb, Se and Sn speciation in body fluids and biological tissues using hyphenated-ICP- MS techniques: A review. International Journal of Mass Spectrometry, 307: 149–162. Dugo, G., Pera, L.L., Turco, V.L., Palmieri, R.M., Saitta, M. 2005. Effect of boiling and peeling on manganese content of some vegetables determined by derivative anodic stripping chronopotentiometry (dASCP). Food Chemistry, 93: 703–711. Dundar, M.S., Altundag, H. 2004. Selenium content of Turkish hazelnut varieties: Kara Fındık, Tombul and Delisava. Journal of Food Composition and Analysis, 17: 707–712. Durukan, İ., Şahin, Ç.A., Şatıroğlu, N., Bektaş, S. 2011. Determination of iron and copper in food samples by flow injection cloud point extraction flame atomic absorption spectrometry. Microchemical Journal, 99: 159–163. Eller, F.J., King, J.W. 1996. Determination of fat content in foods by analytical SFE. Seminars in Food Analysis, 1: 145–162. Emek, S. C., Åkerlund, H. E., Clausén, M., Ohlsson, L., Weström, B., Erlanson- Albertsson, C., Albertsson, P. A. 2011. Pigments protect the light harvesting proteins of chloroplast thylakoid membranes against digestion by gastrointestinal proteases. Food Hydrocolloids, 25: 1618–1626. 160 Erdemir, U.S., Izgi, B., Gucer, S. 2013. An alternative method for screening of Sudan dyes in red paprika paste by gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Methods, 5 (7): 1790–1798. Fen-Ying, Z., Shun-Xing, L., Lu-Xiu, L. 2007. Assessment of bioavailability and risk of iron in phytomedicines Aconitum carmichaeli and Paeonia lactiflora. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 21: 77–83. Ferraz, T.P.L., Fiuza, M.C., dos Santos, M.L.A., Pontes de Carvalho, L., Soares, N.M. 2004. Comparison of six methods for the extraction of lipids from serum in terms of effectiveness and protein preservation. J.Biochem. Biophys. Methods, 58: 187–193. Fialho, L.L., Pereira, C.D., Nóbrega, J.A. 2011. Combination of cool plasma and collision-reaction interface for correction of polyatomic interferences on copper signals in inductively coupled plasma quadrupole mass spectrometry. Spectrochimica Acta Part B, 66: 389–393. Folch, J. , Lees, M., Sloane Stanley, G.H. 1957. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem, 226 (1): 497–509. Goesaert, H., Brijs, K., Veraverbeke, W.S., Courtin, C.M., Gebruers, K., Delcour, J.A. 2005. Wheat flour constituents: how they impact bread quality, and how to impact their functionality. Trends in Food Science & Technology, 16: 12–30. Gomez-Ariza, J.L., Arias-Borrego, A., Garcia-Barrera, T. 2006. Multielemental fractionation in pine nuts (Pinus pinea) from different geographic origins by size- exclusion chromatography with UV and inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Journal of Chromatography A, 1121: 191–199. Gomez-Ariza, J.L., Arias-Borrego, A., Garcia-Barrera, T. 2007. Combined use of total metal content and size fractionation of metal biomolecules to determine the provenance of pine nuts (Pinus pinea). Anal Bioanal Chem, 388: 1295–1302. Gonzalez, M., Gallego, M., Valcarcel, M. 1999. Determination of nickel, chromium and cobalt in wheat flour using slurry sampling electrothermal atomic absorption spectrometry. Talanta, 48: 1051–1060. Grotti, M., Lagomarsino, C., Magi, E. 2006. Simultaneous determination of Arsenic, Selenium And Mercury in foodstuffs by chemical vapour generation inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. Annali di Chimica, 96: 751–764. Ha, Y., Tsay, O.G., Churchill, D.G. 2011. A tutorial and mini-review of the ICP-MS technique for determinations of transition metal ion and main group element concentration in the neurodegenerative and brain sciences. Monatsh Chem,142: 385– 398. Hadjiioannou, T.P., Christian, G.D., Efstathiou, C.E., Nikolelis, D.P. 1988. Mathematical calculations and statistical treatment of analytical data: Problem 161 Solving in Analytical Chemistry, Ed.: Hadjiioannou, T.P., Christian, G.D., Efstathiou, C.E., Nikolelis, D.P., Pergamon Press, UK, pp:1-33. Hoenig, M., de Kersabiec, A-M. 1996. Sample preparation steps for analysis by atomic spectroscopy methods: present status. Spectrochimica Acta Part B, 51: 1297– 1307. Hoenig, M. 2001. Preparation steps in environmental trace element analysis—facts and traps. Talanta, 54: 1021–1038. Hokura, A., Oguri, S., Matsuura, H., Haraguchi, H. 2000. Multielement determination of major-to-ultratrace elements in vegetable samples by ICP-MS and ICP-AES after acid digestion. Bunseki Kagaku, 49(6): 387–396., http://ci.nii.ac.jp/naid/110002905869/-(Erişim tarihi: 04.06.2013) Howe, P.D., Malcolm, H.M., Dobson, S. 2004. Manganese and Its Compounds: Environmental Aspects, Concise International Chemical Assessment Document Series , 63, WHO Regional Office for the Western Pacific, World Health Organization Geneva, 2004, pp. 66. http://www.who.int/ipcs/publications/cicad/cicad63_rev_1.pdf- (Erişim tarihi: 12.04.2013) Hu, J., Wu, F., Wu, S., Cao, Z., Lin, X.,Wong, M.H. 2013. Bioaccessibility, dietary exposure and human risk assessment of heavy metals from market vegetables in Hong Kong revealed with an in vitro gastrointestinal model. Chemosphere, 91: 455–461. Huang, Y., Chen, H. 2011. Effect of organic acids, hydrogen peroxide and mild heat on inactivation of Escherichia coli O157:H7 on baby spinach. Food Control, 22: 1178– 1183. Karadjova, I., Izgi, B., Gucer, S. 2002. Fractionation and speciation of Cu, Zn, and Fe in wine samples by atomic absorption spectrometry. Spectrochimica Acta Part B, 57: 581–590. Khanam, U.K.S., Oba, S., Yanase, E., Murakami, Y. 2012. Phenolic acids, flavonoids and total antioxidant capacity of selected leafy vegetables. Journal of Functional Foods, 4: 979–987. Khouzam, R.B., Szpunar, J., Holeman, M., Lobinski, R. 2012. Trace element speciation in food: State of the art of analytical techniques and methods. Pure Appl. Chem., 84 (2): 169–179. Klein, B.P., Kuo, C.H.Y., Boyd, G. 1981. Folacin and ascorbic acid retention in fresh raw, microwave, and conventionally cooked spinach. Journal of Food Science, 46 (2): 640–641. Koplik, R., Borkova, M., Mestek, O., Kominkova, J., Suchanek, M. 2002. Application of size-exclusion chromatography–inductively coupled plasma mass spectrometry for fractionation of element species in seeds of legumes. Journal of Chromatography B, 775: 179–187. 162 Koplik, R., Borkova, M., Bicanova, B., Polak, J., Mestek, O., Kominkova, J. 2006. Speciation analysis of elements in cereal flours by liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry. Food Chemistry, 99: 158–167. Korn, M.G.A., Morte, E.S.B., dos Santos, D.C.M.B., Castro, J.T., Barbosa, J.T.P., Teixeira, A.P., Fernandes, A.P., Welz, B., dos Santos, W.P.C., dos Santos, E.B.G.N., Korn, M. 2008. Sample preparation for the determination of metals in food samples using spectroanalytical methods—A review. Applied Spectroscopy Reviews, 43: 67–92. Kot, A., Namiesnik, J. 2000. The role of speciation in analytical chemistry. Trends in Analytical Chemistry, 19: 69–79. Kowalewska, Z., Izgi, B., Saracoglu, S., Gucer, S. 2005. Application of liquid-liquid extraction and adsorption on activated carbon to the determination of different forms of metals present in edible oils. Chem. Anal. (Warsaw), 50 (6) 1007–1019. Krasnodebska-Ostrega, B., Pałdyna, J., Kowalska, J., Jedynak, L., Golimowski, J. 2009. Fractionation study in bioleached metallurgy wastes using six-step sequential extraction. Journal of Hazardous Materials, 167: 128–135. Larsen, E. H. 1998. Method optimization and quality assurance in speciation analysis using high performance liquid chromatography with detection by inductively coupled plasma mass spectrometry. Spectrochimica Acta Part B, 53: 253–265. Leray, C., Pelletier, X. 1987. Thin-layer chromatography of human platelet phospholipids with fatty acid analysis. Journal of Chromatography B, 420: 411–416. Lisiewska, Z., Kmiecik, W., Gebczynski, P., Sobczynska, L. 2011. Amino acid profile of raw and as-eaten products of spinach (Spinacia oleracea L.). Food Chemistry, 126: 460–465. Liu, C-S., Glahn, R.P., Liu, R.H. 2004. Assessment of carotenoid bioavailability of whole foods using a Caco-2 cell culture model coupled with an in vitro digestion. J. Agric. Food Chem., 52: 4330-4337. Lobinski, R. 1998. Speciation targets, analytical solutions and markets. Spectrochimica Acta Part B, 53: 177–185. Lomnitski, L., Bergman, M., Nyska, A., Ben-Shaul, V., Grossman, S. 2003. Composition, efficacy, and safety of spinach extracts. Nutrition and Cancer, 46 (2): 222–231. Maeda, N., Hada, T., Murakami-Nakai, C., Kuriyama, I., Ichikawa, H., Fukumori, Y., Hiratsuka, J., Yoshida, H., Sakaguchi, K., Mizushina, Y. 2005. Effects of DNA polymerase inhibitory and antitumor activities of lipase-hydrolyzed glycolipid fractions from spinach. Journal of Nutritional Biochemistry, 16: 121–128. 163 Maeda, N., Kokai, Y., Ohtani, S., Sahara, H., Kumamoto-Yonezawa, Y., Kuriyama, I., Hada, T., Sato, N., Yoshida, H., Mizushina, Y. 2008. Anti-tumor effect of orally administered spinach glycolipid fraction on implanted cancer cells, Colon-26, in Mice. Lipids, 43, 741–748. Maher, W., Krikowa, F., Ellwood, M., Foster, S., Jagtap, R., Raber, G. 2012. Overview of hyphenated techniques using an ICP-MS detector with an emphasis on extraction techniques for measurement of metalloids by HPLC–ICPMS. Microchemical Journal, 105: 15–31. Maldonado-Valderrama, J., Wilde, P., Macierzanka, A., Mackie, A. 2011. The role of bile salts in digestion. Advances in Colloid and Interface Science, 165: 36–46. Mandigo, R.W., Munson, A.W., Henrickson, R.L., Whiteman, J.V. 1967. Some sources of variation associated with ether extraction. J Anim Sci, 26(2): 302-306. Marschner, H. 1989. Mineral Nutrition of Higher Plants. Academic Press, San Diego, USA. 674 pp. Michalke, B. 2002. The coupling of LC to ICP-MS in element speciation: I. General aspects. Trends in analytical chemistry, 21 (2): 142–153. Michalke, B. 2003. Element speciation definitions, analytical methodology, and some examples. Ecotoxicology and Environmental Safety, 56: 122–139. Michalke, B. 2004. Manganese speciation using capillary electrophoresis–ICP-mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1050: 69–76. Michalke, B., Schramel, P. 2004. Manganese speciation in human milk using size exclusion chromatography combined with strong anion Exchange chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry detection. Journal of Analytical Atomic spectrometry, 19 (1): 121 – 128. Michalke, B. 2006. Trace element speciation in human milk. Pure Appl. Chem., 78 (1): 79–90. Michalke, B., Berthele, A., Mistriotis, P., Ochsenkühn-Petropoulou, M., Halbach, S. 2007. Manganese speciation in human cerebrospinal fluid using CZE coupled to inductively coupled plasma MS. Electrophoresis, 28: 1380–1386. Michalke, B., Lucio, M., Berthele, A., Kanawati, B. 2013. Manganese speciation in paired serum and CSF samples using SEC-DRC-ICP-MS and CE-ICP-DRC-MS. Anal Bioanal Chem, 405: 2301–2309. Millaleo, R., Reyes-Díaz, M., Ivanov, A.G., Mora, M.L., Alberdi, M. 2010. Manganese as essential and toxic element for plants: transport, accumulation and resistance mechanisms. J. Soil Sci. Plant Nutr., 10 (4): 476–494. 164 Montes-Bayon, M., DeNicola, K., Caruso, J.A. 2003. Liquid chromatography- inductively coupled plasma mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1000: 457–476. Moreda-Pineiro, J., Moreda-Pineiro, A., Romaris-Hortas, V., Dominguez- Gonzalez, R., Alonso-Rodriguez, E., Lopez-Mahia, P., Muniategui-Lorenzo, S., Prada-Rodriguez, D., Bermejo-Barrera, P. 2012. Trace metals in marine foodstuff: Bioavailability estimation and effect of major food constituents. Food Chemistry, 134: 339–345. Moreda-Pineiro, A., Barciela-Alonso, M.D., Dominguez-Gonzalez, R., Pena- Vazquez, E., Herbello-Hermelo, P., Bermejo-Barrera, P. 2009. Alternative Solid Sample Pretreatment Methods in Green Analytical Atomic Spectrometry. Spectroscopy Letters, 42: 394–417. Nardi, E.P., Evangelista, F.S., Tormen, L., SaintPierre, T.D., Curtius, A.J., de Souza, S.S., Barbosa Jr, F. 2009. The use of inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) for the determination of toxic and essential elements in different types of food samples. Food Chemistry, 112: 727–732. Naozuka, J., Oliveira, P.V. 2007. Cu, Fe, Mn and Zn Distribution in Protein Fractions of Brazil-Nut, Cupuassu Seed and Coconut Pulp by Solid-Liquid Extraction and Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry. J. Braz. Chem. Soc., 18(8): 1547– 1553. Naudi, R., Semple, K.T., Megharaj, M., Juhasz, A.L., Bolan, N.S., Gupta, S.K., Clothier, B.E., Schulin, R. 2008. Bioavailability: definition, assessment and implications for risk assessment: Developments in Soil Science, volume 32, Ed.: Naidu, R., Elsevier B.V., Netherlands, pp: 39–51. Ozdemir, Y., Gucer, S. 1998. Speciation of manganese in tea leaves and tea infusions. Food Chemistry, 61 (3): 313–317. Özdemir, M., Açkurt, F., Kaplan, M., Yıldız, M., Löker, M., Gürcan, T., Biringen, G., Okay, A., Seyhan, F.G. 2001. Evaluation of new Turkish hybrid hazelnut (Corylus avellana L.) varieties: fatty acid composition, α-tocopherol content, mineral composition and stability. Food Chemistry, 73: 411–415. Pearson G.F., Greenvay, G.M. 2005. Recent developments in manganese speciation. Trends in Analytical Chemistry, 24(9): 803–809. Pick, D., Leiterer, M., Einax, J.W. 2010. Reduction of polyatomic interferences in biological material using dynamic reaction cell ICP-MS. Microchemical Journal, 95: 315–319. Prasad, M.N.V. 2004. Heavy Metal Stress in Plants: From Biomolecules to Ecosystems. Springer-Verlag, Berlin. 462 pp. 165 Pohl, P. 2007. Manganese and zinc operational fractionation in beer by means of tandem ion exchange column assemblage and flame atomic absorption spectrometry. Microchim Acta, 159: 325–332. Pohl, P., Prusisz, B. 2007. Fractionation analysis of manganese and zinc in tea infusions by two-column solid phase extraction and flame atomic absorption spectrometry. Food Chemistry, 102: 1415–1424. Quintana, M., Klouda, A.D., Ochsenkuhn-Petropoulou, M., Michalke, B. 2005. Size characterization of manganese species from liver extracts using size exclusion chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 554: 130–135. Quintana, M., Klouda, A.D., Gondikas, A., Ochsenkühn-Petropoulou, M., Michalke, B. 2006. Analysis of size characterized manganese species from liver extracts using capillary zone electrophoresis coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry (CZE-ICP-MS). Analytica Chimica Acta, 573-574: 172–180. Ramos, L. 2012. Critical overview of selected contemporary sample preparation techniques. Journal of Chromatography A, 1221: 84– 98. Rao, R.N., Talluri, M.V.N.K. 2007. An overview of recent applications of inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) in determination of inorganic impurities in drugs and pharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43: 1–13. Richardson, C., Roberts, E., Nelms, S., Roberts, N.B. 2012. Optimisation of whole blood and plasma manganese assay by ICP-MS without use of a collision cell. Clin Chem Lab Med, 50 (2): 317–323. Rosen, A.L., Hieftje, G.M. 2004. Inductively coupled plasma mass spectrometry and electrospray mass spectrometry for speciation analysis: applications and instrumentation. Spectrochimica Acta Part B, 59: 135–146. Rostami I., Juhasz, A.L. 2011. Assessment of persistent organic pollutant (POP) bioavailability and bioaccessibility for human health exposure assessment: A critical review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 41: 623–656. Rouser, G., Kritchevsky, G., Simon, G., Nelson, G.J. 1967. Quantitative analysis of brain and spinach leaf lipids employing silicic acid column chromatography and acetone for elution of glycolipids. Lipids, 2: 37–40. Ruzik, L. 2012. Speciation of challenging elements in food by atomic spectrometry. Talanta, 93: 18– 31. Rybak, J. Ruzik, L. 2013. Application of chromatography and mass spectrometry to the characterization of cobalt, copper, manganese and molybdenum in Morinda Citrifolia. Journal of Chromatography A, 1281: 19–25. 166 Seyhan, F., Ozay, G., Saklar, S., Ertas, E., Satır, G., Alasalvar, C. 2007. Chemical changes of three native Turkish hazelnut varieties (Corylus avellana L.) during fruit development. Food Chemistry, 105: 590–596. Shun-xing, L., Feng-ying, Z., Xian-li, L., Wen-lian, C. 2005. Speciation analysis and the assessment of bioavailability of manganese in phytomedicines by extraction with octanol and determination by flame atomic absorption spectrometry. Phytochemical Analysis, 16: 405–410. Silvestre, M.D., Lagarda, M.J., Fare, R., Martinez-Costa, C., Brines, J. 2000. Copper, iron and zinc determinations in human milk using FAAS with microwave digestion. Food Chemistry, 68: 95–99. Skoog, D.A., Holler, F.J., Nieman, T.A. 1998a. Yüksek-Performanslı Sıvı Kromatografi: Enstrümantal Analiz İlkeleri, Editörler: Kılıç, E., Köseoğlu, F., Yılmaz, H., Bilim Yayıncılık, s.725-766. Skoog, D.A., Holler, F.J., Nieman, T.A. 1998b. Enstrümantal Analiz İlkeleri. Bilim Yayıncılık, Ankara, 849 s. Sneddon, J., Hardaway, C., Bobbadi, K.K., Reddy, A.K. 2006. Sample preparation of solid samples for metal determination by atomic spectroscopy—An overview and selected recent applications. Applied Spectroscopy Reviews, 41: 1–14. Srivastava, S., Dubey, R.S. 2011. Manganese-excess induces oxidative stress, lowers the pool of antioxidants and elevates activities of key antioxidative enzymes in rice seedlings. Plant Growth Regul, 64: 1–16. Srogi, K. 2008. Developments in the determination of trace elements by atomic spectroscopic techniques. Analytical Letters, 41: 677–724. Szpunar, J. 2000. Trace element speciation analysis of biomaterials by high- performance liquid chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection. Trends in Analytical Chemistry, 19: 127–137. Szpunar, J., Lobinski, R. 2003. Hyphenated Techniques in Speciation Analysis, The Royal Society of Chemistry, UK, 220 pp. Tang, G. 2009. Spinach and carrots: vitamin A and health: Bioactive Foods in Promoting Health: Fruits and Vegetables, Ed.; Watson, R., Preedy, V., London, UK: Elsevier, pp: 381–392. Tapiero, H., Townsend, D.M., Tew, K.D. 2003. Trace elements in human physiology and pathology. Copper, Biomedicine & Pharmacotherapy, 57: 386–398. Templeton, D. M., Ariese, F., Cornelis, R., Danielsson, L-G., Muntau, H., Leeuwen, H. P. V., Lobinski, R. 2000. Guidelines for terms related to chemical speciation and fractionation of elements. Definitions, structural aspects, and methodological approaches. Pure Appl. Chem., 72 (8): 1453–1470. 167 Thomas, R. 2004. Practical Guide to ICP-MS. Marcel Dekker Inc. New York, USA, 324 pp. Tokalioglu, S., Kartal, S., Elci, L. 2000. Determination of heavy metals and their speciation in lake sediments by flame atomic absorption spectrometry after a four-stage sequential extraction procedure. Analytica Chimica Acta, 413: 33–40. Tukendorf, A. 1989. Characteristics of copper-binding proteins in chloroplasts of spinach tolerant to excess copper. Journal of Plant Physiology, 135(3): 280–284. Tüzen M. 2002. A comparison of sample preparation procedures for the determination of heavy metals in Lichen samples by GFAAS. Analytical Letters, 35(10): 1667–1676. Tuzen, M., Soylak M. 2007. Evaluation of trace element contents in canned foods marketed from Turkey. Food Chemistry, 102: 1089–1095. Van der Borght, A., Goesaert, H., Veraverbeke, W.S., . Delcour, J.A. 2005. Fractionation of wheat and wheat flour into starch and gluten: overview of the main processes and the factors involved. Journal of Cereal Science, 41: 221–237. Vinas, P., Campillo, N., Lopez Garcia, I., Hernandez Cordoba M. 1993. Flow- injection flame atomic absorption spectrometry for slurry atomization. Determination of calcium, magensium, iron, zinc and manganese in vegetables. Analytica Chimica Acta, 283 (1): 393–400. Willey, J. D., Inscore, M.T., Kieber, R.J., Skrabal, S.A. 2009. Manganese in coastal rainwater: speciation, photochemistry and deposition to seawater. J Atmos Chem, 62: 31–43. Wuilloud, R.G., Kannamkumarath, S.S., Caruso, J.A. 2004. Speciation of nickel, copper, zinc, and manganese in different edible nuts: a comparative study of molecular size distribution by SEC–UV–ICP–MS. Anal Bioanal Chem, 379: 495–503. Xiang, G., Zhang, Y., Jiang, X., He, L., Fan, L., Zhao, W. 2010. Determination of trace copper in food samples by flame atomic absorption spectrometry after solid phase extraction on modified soybean hull. Journal of Hazardous Materials, 179: 521–525. Yaman, M. 1997. Determination of manganese in vegetables by atomic absorption spectrometry with enrichment using activated carbon. Chemia Analityczna, 42: 79–86. Yaşar, S.B., Güçer, Ş. 2004. Fractionation analysis of magnesium in olive products by atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta, 505: 43–49. Zhang, N., Peng, H., Wang, S., Hu, B. 2011. Fast and selective magnetic solid phase extraction of trace Cd, Mn and Pb in environmental and biological samples and their determination by ICP-MS. Microchim. Acta, 175:121–128. 168 EKLER EK-1 HPLC-ICP-MS çalışmalarında kullanılan cihazlar ve cihaz parçaları Şekil 1. HPLC-ICP-MS cihazı (ICP-MS solda, ve HPLC sağda) Scott püskürtme haznesi Ryton karşı akış sisleştirici Şekil 2. Scott tip püskürtme haznesi (çift yarıklı, sağda) ve ryton karşı akış sisleştirici (solda) 169 Şekil 3. Siklonik (Cyclonic) püskürtme haznesi Şekil 4. ICP-MS için organik çözgen iletim aparatı 170 Şekil 5. Düşük akış sisleştirici(PFA-ST µFlow) Şekil 6. Meinhard sisleştirici Şekil 7. Rheodyne çevirici valf 171 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Ümran SEVEN ERDEMİR Doğum Yeri ve Tarihi : Kelkit/Gümüşhane-01.01.1982 Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Yabancı Dil Ağırlıklı Aliağa Lisesi, Aliağa/İZMİR ,1999 Lisans : Uludağ Üniversitesi-Fen-Edebiyet Fakültesi Kimya Bölümü, 2003 Yüksek Lisans : Uludağ Üniversitesi-Fen Bilimleri Enstitüsü, 2006 Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Yıl : Bölümü (2005- günümüze) İletişim (e-posta) : useven@uludag.edu.tr Yayınları : Seven Erdemir, U., Izgi, B., Gucer, S. 2013. An alternative method for screening of Sudan dyes in red paprika paste by gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Methods, 5 (7) 1790–1798. Arslan, H., Guleryuz, G., Akpinar, A., Kirmizi, S., Seven Erdemir, U., Gucer, S. 2013. Responses of ruderal Verbascum olympicum Boiss. (Scrophulariaceae) growing under cadmium (Cd) stres. Clean - Soil, Air, Water, DOI: 10.1002/clen.201300219. (yayına kabul edildi.) 172