BAZI PROBİYOTİK BAK TERİLERİN İĞDE (Elaeagnus angustifolia L.) ÜZERİNE ENKAPSÜLASYONUNUN ANALİT İK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMA SI Büşra KARKAR T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI PROBİYOTİK BAKTERİLERİN İĞDE (Elaeagnus angustifolia L.) ÜZERİNE ENKAPSÜLASYONUNUN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Büşra KARKAR 0000-0001-6547-5558 Prof. Dr. Saliha ŞAHİN (Danışman) DOKTORA TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI BURSA – 2023 Her Hakkı Saklıdır TEZ ONAYI Büşra KARKAR tarafından hazırlanan “BAZI PROBİYOTİK BAKTERİLERİN İĞDE (Elaeagnus angustifolia L.) ÜZERİNE ENKAPSÜLASYONUNUN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı’nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Başkan : Prof. Dr. Saliha ŞAHİN İmza 0000-0003-2887-5688 Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ ERSAN İmza 0000-0001-9588-6200 Bursa Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Hüseyin ALTUNDAĞ İmza 0000-0002-3675-4133 Sakarya Üniversitesi, Fen Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Önder AYBASTIER İmza 0000-0002-0380-1992 Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Dr. Öğr. Üyesi Burçak KAYA ÖZSEL İmza 0000-0003-2190-3834 Bursa Teknik Üniversitesi, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Hüseyin Aksel EREN Enstitü Müdürü 23/01/2023 i B.U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; − tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, − görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, − başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, − atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, − kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, − ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 23/01/2023 Büşra KARKAR ii TEZ YAYINLANMA FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezin/raporun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kâğıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma izni Bursa Uludağ Üniversitesi’ne aittir. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet hakları ile tezin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları tarafımıza ait olacaktır. Tezde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanılması zorunlu metinlerin yazılı izin alınarak kullandığını ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederiz. Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” kapsamında, yönerge tarafından belirtilen kısıtlamalar olmadığı takdirde tezin YÖK Ulusal Tez Merkezi / B.U.Ü. Kütüphanesi Açık Erişim Sistemi ve üye olunan diğer veri tabanlarının (Proquest veri tabanı gibi) erişimine açılması uygundur. Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Büşra KARKAR 23/01/2023 23/01/2023 iii ÖZET Doktora Tezi BAZI PROBİYOTİK BAKTERİLERİN İĞDE (Elaeagnus angustifolia L.) ÜZERİNE ENKAPSÜLASYONUNUN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Büşra KARKAR Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Probiyotik bakteriler insan sağlığı üzerine olumlu etki gösteren ve gıdalarda starter kültür olarak kullanılan canlı mikroorganizmalardır. Bakterilerin gıdalara uygulanabilmeleri ve istenilen etkiyi gösterebilmeleri için gıda işleme operasyonunun tüm aşamalarında, depolama sürecinde ve gastrointestinal sistemde canlı kalmaları gerekmektedir. Bu nedenle L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterileri fenolik bileşenlerce zengin ve prebiyotik özelliğe sahip olan iğde unu ile emülsiyon yöntemi kullanılarak enkapsüle edilmiştir. Nevşehir ilinin üç farklı lokasyonunda yetişen iğde (Elaeagnus angustifolia L.) bitkisinin un, kabuk, çekirdek, çiçek ve yaprak kısımlarının sekiz farklı çözücü ve asidik hidroliz ekstraktlarının toplam fenolik, karotenoid, flavonoid içeriği, antioksidan kapasitesi ve fenolik bileşik profilleri değerlendirilmiş ve iğde unu L. casei ve L. acidophilus bakterilerinin enkapsülasyonu için kaplama materyali olarak seçilmiştir. Seçilen iğde ununun toplam yağ, şeker, protein, nişasta, karbohidrat, diyet lif, nem, kül, kuru madde ve titre edilebilir asitlik içerikleri belirlenmiştir. Daha sonra L.casei ve L. acidophilus bakterilerinin iğde unu kullanılarak maksimum verim ile enkapsüle edilebilmeleri için gerekli optimum koşullar merkezi kompozit dizayn-yanıt yüzey metodolojisi ile kemometrik olarak belirlenmiştir. Optimizasyon sonucunda enkapsülasyon verimi L. casei-iğde unu ve L. acidophilus-iğde unu kapsülleri için sırasıyla %93,66±2,58 ve %74,97±1,34 olarak bulunmuştur. Elde edilen kapsüllerin yapısal karakterizasyonu için gerçekleştirilen SEM analizi ile L. casei-iğde unu ve L. acidophilus-iğde unu kapsüllerinin boyutları sırasıyla 104,8±26,3 µm ve 95,7±12,1 µm olarak belirlenmiş ve FTIR analizi enkapsülasyon işleminin iğde ununun yapısında değişiklik meydana gelmeden gerçekleştiğini göstermiştir. Depolama esnasında bakterilerin canlılık kaybı değerlendirildiğinde, mikrokapsüllerdeki bakterilerin canlılık kaybının serbest bakterilere kıyasla çok daha az olduğu belirlenmiştir. Gastrointestinal koşullarda ise serbest bakterilerin bağırsak ortamına ulaşmadan önce canlılıklarını yitirdikleri, ancak kapsüllenmiş bakterilerin canlılıklarını korudukları gözlenmiştir. (Bu tez YÖK 100/2000 kapsamında “Yenilikçi Gıda İşleme Teknolojileri ve Gıda Biyoteknolojisi” öncelikli alanında yapılmıştır.) Anahtar Kelimeler: L. acidophilus, L. casei, Elaeagnus angustifolia L., enkapsülasyon, fenolik bileşik 2023, xv + 163 sayfa. iv ABSTRACT PhD Thesis INVESTIGATION OF ENCAPSULATION OF SOME PROBIOTIC BACTERIA ONTO OLEASTER (Elaeagnus angustifolia L.) BY ANALYTICAL METHODS Büşra KARKAR Bursa Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Probiotic bacteria are living microorganisms that have a positive effect on human health and are used as starter cultures in foods. For the use of bacteria to be applied to foods and to show the desired effect, they must remain alive in all stages of food processing, storage, and the gastrointestinal system. For this reason, L. casei and L. acidophilus probiotic bacteria were encapsulated by using the emulsion method with oleaster flour, which is rich in phenolic compounds and has prebiotic properties. The total phenolic, carotenoid, flavonoid content, antioxidant capacity, and phenolic compound profiles of eight different solvent and acidic hydrolyzed extracts of flour, bark, seed, flower, and leaf parts of the oleaster (Elaeagnus angustifolia L.) plant grown in three different locations in Nevşehir province were evaluated and oleaster flour was selected as the coating material of L. casei and L. acidophilus bacteria. The total fat, sugar, protein, starch, carbohydrate, dietary fiber, moisture, ash, dry matter, and titratable acidity contents of the selected oleaster flour were determined. Then, the optimum conditions required for the encapsulation of L. casei and L. acidophilus bacteria with maximum efficiency by using oleaster flour were determined chemometrically by central composite design-response surface methodology. As a result of the optimization, the encapsulation efficiency was found to be 93.66±2.58% and 74.97±1.34% for L. casei-oleaster flour and L. acidophilus-oleaster flour capsules, respectively. SEM analysis performed for structural characterization of the obtained capsules showed that the size of L. casei-oleaster flour and L. acidophillus-oleaster flour capsules were 104.8±26.3 µm and 95.7±12.1 µm, respectively, and FTIR analysis showed that the encapsulation process occurred without any change in the structure of the oleaster flour. When the loss of viability of bacteria during storage was evaluated, it was determined that the loss of viability of bacteria in microcapsules was much less compared to free bacteria. In gastrointestinal conditions, it was observed that free bacteria lost their viability before reaching the intestinal environment, but encapsulated bacteria maintained their viability. (This thesis was carried out in the priority area of "Innovative Food Processing Technologies and Food Biotechnology" within the scope of 100/2000 Programme by the Council of Higher Education.) Key words: L. acidophillus, L. casei, Elaeagnus angustifolia L., encapsulation, phenolic compound 2023, xv + 163 pages. v TEŞEKKÜR Bana inanan, güvenen ve elindeki tüm imkanlarını benimle paylaşarak yolumu açan, o yolda benimle beraber yürüyen ve üzerimden elini bir an bile çekmeyen, danışmanlığının yanı sıra anneliğini benden eksik etmeyen, hayatımın önemli bir noktasında yer alan ve daima orada olacak olan, üzerimdeki hakkını asla ödeyemeyeceğim danışman hocam Prof. Dr. Saliha ŞAHİN’e teşekkür ederim. Birlikte çalışmaktan onur duyduğum, bilgi ve tecrübelerini benden esirgemeyen, her sorunda imdadıma yetişen değerli hocam Doç. Dr. Önder AYBASTIER’e destekleri için çok teşekkür ederim. Tezimin oluşumunda ve ilerlemesinde hiç bilmediğim bir yolda bana kapısını açan ve bu yola bilimsel anlamda beni hazırlayan, her türlü desteğini gördüğüm değerli hocam Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ ERSAN’a ve tez çalışmalarım süresince bilgi, öneri ve desteklerini esirgemeyen, tezimin gelişmesine katkı sağlayan değerli hocam Prof. Dr. Hüseyin ALTUNDAĞ’a teşekkür ederim. Tezimin ilerlemesi adına fazlasıyla ihtiyaç duyduğum cihazı oldukça uzun bir süre kullanmama olanak sağlayan, bana olan inancından onur duyduğum saygıdeğer hocam Doç. Dr. Mesut ERTAN GÜNEŞ’e teşekkür ederim. Enerjisi, düşünceleri ve sözleriyle modumu yükselten, bilimsel anlamda ufkumu açan, kahve içmekten ve sohbet etmekten keyif aldığım canım hocam Doç. Dr. Aslı GÖÇENOĞLU SARIKAYA’ya desteklerinden dolayı teşekkür ederim. Tez çalışmam boyunca yardımlarına ihtiyaç duyduğum, arada bir atıştığım ama birlikte çalışmaktan çok keyif aldığım, yolları uzun ve açık, kalpleri güzel çalışma arkadaşlarım İlkyaz PATIR’a, Gizem BAYAÇLI’ya, Serenay EYÜBOĞLU’na ve Elif TÜLEK’e emekleri için teşekkür ederim. Bu zorlu süreçte tüm kahrımı, nazımı, gelgitlerimi, duygusal patlamalarımı çeken, olmazları oldurmama yardım eden, hayatımın en değerli varlıkları olan kardeşlerim Ebru KARKAR’a, Derya KARKAR’a ve biz kızları olarak ayaklarımızın üzerinde durabilelim, diye kendi hayatından fedakarlık eden canımdan öte annem Semiha YILDIZ’a teşekkür ederim. Tez çalışmamı FGA-2021/416 numaralı proje kapsamında destekleyen Bursa Uludağ Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri birimine teşekkür ederim. Bursa Uludağ Üniversitesi YÖK 100/2000 “Yenilikçi gıda işleme teknolojileri ve gıda biyoteknolojisi” öncelikli alanlar doktora burs programı tarafından desteklenen tez çalışmamdan dolayı Yükseköğretim Kurulu’na teşekkür ederim. Doktora sürecim boyunca TÜBİTAK 2211-A Genel Yurt İçi Doktora Burs Programı ile desteklerinden dolayı TÜBİTAK’a teşekkür ederim. Büşra KARKAR 23/01/2023 vi İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET .................................................................................................................. iv ABSTRACT ................................................................................................................ v TEŞEKKÜR ................................................................................................................ vi SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ................................................................. ix ŞEKİLLER DİZİNİ ..................................................................................................... xii ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................... xiv 1. GİRİŞ ............................................................................................................... 1 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI ................................. 4 2.1. Fonksiyonel Gıdalar ............................................................................................. 4 2.2. Prebiyotikler ......................................................................................................... 5 2.3. Probiyotik Bakteriler ............................................................................................ 6 2.3.1. Lactobacillus spp. ............................................................................................. 8 2.3.2. Lactobacillus acidophilus ................................................................................. 9 2.3.3. Lactobacillus casei ............................................................................................ 9 2.4. Sinbiyotik Gıdalar ................................................................................................ 10 2.5. Probiyotik Ürünler ............................................................................................... 10 2.6. Probiyotik Bakterilerin Gıdalara Uygulanabilirliği ............................................. 11 2.7. Enkapsülasyon ..................................................................................................... 12 2.7.1. Enkapsülasyon çeşitleri ..................................................................................... 13 2.7.2. Enkapsülasyon teknikleri .................................................................................. 13 2.7.3. Enkapsülasyonun gıda endüstrisinde kullanım amaçları .................................. 18 2.8. Probiyotik Bakterilerin Enkapsülasyonu.............................................................. 18 2.9. İğde (Elaeagnus angustifolia L.).......................................................................... 19 2.10. İğdenin Gıdalarda Kullanımı ............................................................................. 20 3. MATERYAL ve YÖNTEM .................................................................................... 22 3.1. Materyal ............................................................................................................... 22 3.1.1. Tez kapsamında kullanılan cihazlar .................................................................. 22 3.1.2. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar ............................................................ 25 3.1.3. Tez kapsamında kullanılan sarf malzemeler ..................................................... 28 3.1.4. Tez kapsamında kullanılan çözeltiler ................................................................ 28 3.2. Yöntem ................................................................................................................. 33 3.2.1. İğde örneklerinin toplanması............................................................................. 33 3.2.2. İğde örneklerinin ekstraksiyon işlemleri ........................................................... 33 3.2.3. Toplam fenolik madde analizi ........................................................................... 36 3.2.4. Toplam flavonoid analizi .................................................................................. 36 3.2.5. Toplam karotenoid analizi ................................................................................ 36 3.2.6. ABTS yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ................................................ 37 3.2.7. CHROMAC yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ...................................... 37 3.2.8. DPPH yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ................................................ 38 3.2.9. FRAP yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ................................................ 39 3.2.10. İğde ekstraktlarında bulunan fenolik bileşiklerin analizi ................................ 39 3.2.11. İğde (Elaeagnus angustifolia L.) ununun fizikokimyasal özelliklerinin belirlenmesi ............................................................................................................... 40 3.2.12. İğde (Elaeagnus angustifolia L.) ununun sterilizasyonu ................................ 41 3.2.13. Probiyotik bakterinin geliştirilmesi ve aktive edilmesi ................................... 41 3.2.14. Probiyotik bakterinin iğde unu üzerine enkapsüle edilmesi ........................... 43 vii 3.2.15. Mikrobiyolojik analizler ................................................................................ 48 3.2.16. Serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin depolama süresince canlılıkları .............................................................................................................. 51 3.2.17. Serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerinin in-vitro gastrointestinal ortamdaki canlılıkları ........................................................................ 51 3.2.18. Mikrokapsüllerin yüzey analizleri ve boyutlarının belirlenmesi ................... 58 4. BULGULAR ve TARTIŞMA ................................................................................ 59 4.1. Spektroskopik Bulgular ....................................................................................... 59 4.1.1. Toplam fenolik madde içeriği .......................................................................... 59 4.1.2. CHROMAC yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ..................................... 61 4.1.3. ABTS yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ............................................... 61 4.1.4. FRAP yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ............................................... 62 4.1.5. DPPH yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ............................................... 63 4.1.6. Toplam flavonoid içeriği .................................................................................. 64 4.1.7. Toplam karotenoid içeriği ................................................................................ 66 4.2. Kromatografik Bulgular ...................................................................................... 78 4.3. İğde Ununun Fizikokimyasal Özellikleri ............................................................ 115 4.4. İğde Ununun Sterilizasyonu ................................................................................ 116 4.5. Probiyotik Bakterinin İğde Unu Üzerine Enkapsüle Edilmesi ve Optimum Koşulların Belirlenmesi ............................................................................................. 118 4.6. Serbest ve Enkapsüle Edilen Probiyotik Bakterilerin Depolama Süresince Canlılıkları ................................................................................................................. 126 4.7. Serbest ve Enkapsüle Edilen Probiyotik Bakterilerin İn-vitro Gastrointestinal Ortamdaki Canlılıkları ............................................................................................... 130 4.8. İğde Unu ve İğde Unu-Probiyotik Bakteri Kapsüllerinin FTIR Analizleri ........ 136 4.9. Kapsüllerin Yüzey Morfolojisi ve Boyutlarının Belirlenmesi ............................ 139 5. SONUÇ .............................................................................................................. 149 KAYNAKLAR .......................................................................................................... 151 ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................... 161 viii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama % Yüzde ℃ Santigrat derece < Küçüktür A Absorbans b0 Sabit terim bi Doğrusal etkileşim sabiti bii Parabolik etkileşim sabiti bij Parametre etkileşim sabiti cm Santimetre d Işık yolu dk Dakika F Seyrelme faktörü g Gram IC50 Yarı maksimum inhibisyon derişimi k Faktör sayısı kg Kilogram kob Koloni oluşturan birim L Litre log Logaritma M Molarite mg Miligram mL Mililitre mm Milimetre mM Milimolar N Normalite nm Nanometre ppm Milyonda bir kısım R2 Korelasyon katsayısı v/v Hacim/hacim w/v Kütle/hacim xi Bağımsız değişken xj Bağımsız değişken y Yanıt α Alfa β Beta ε Molar sönüm katsayısı µg Mikrogram µL Mikrolitre µm Mikrometre µmol Mikromol ix Kısaltmalar Açıklama 2-HCA 2-hidroksisinamik asit A Aseton ABTS 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) AH Asidik hidroliz ANOVA Varyans analizi B Bütanol BC Beta-karoten C Derişim CAF Kafeik asit CAT Kateşin CE Kateşin eşdeğeri CHL Klorojenik asit CHROMAC Krom indirgeyici antioksidan kapasite tayini DF Serbestlik derecesi DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil E Etanol EA Etil asetat ECAT Epikateşin ECATG Epikateşin gallat EGCAT Epigallokateşin EGCATG Epigallokateşin gallat ELA Ellagik asit FAO Gıda ve Tarım Örgütü FER Ferulik asit FRAP Demir (III) iyonu indirgeyici antioksidan gücü FTIR Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi FTS Fizyolojik tuzlu su GA Gallik asit GAE Gallik asit eşdeğeri H Hekzan HPLC-DAD Yüksek performanslı sıvı kromatografisi-diod serili dedektör IQU İzokuersitrin KA Kuru ağırlık KAM Kamferol KAMG Kamferol-3-glikozit LAE Enkapsüle L. acidophillus LAS Serbest L. acidophillus LCE Enkapsüle L. casei LCS Serbest L. casei LOD Tespit Sınırı LOQ Tayin Sınırı LU Luteolin M Metanol MRS Man Ragosa MS Ortalamaların karesi MYR Mirisetin x Kısaltmalar Açıklama PCA p-kumarik asit PE Petrol eteri PHBA p-hidroksibenzoik asit PRCA Protokatekuik asit QE Kuersetin eşdeğeri QU Kuersetin RES Resveratrol ROS Rosmarinik asit RU Rutin SE Çözücü ekstraksiyonu SEM Taramalı elektron mikroskobu SGF Simüle mide sıvısı SIF Simüle bağırsak sıvısı SS Karelerin toplamı TA Taze ağırlık TCC Toplam karotenoid içeriği te Tespit edilemedi TE Troloks eşdeğeri TFC Toplam flavonoid TK Toplam karbohidrat TN Toplam nişasta TP Toplam protein TPC Toplam fenolik madde TPTZ 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazin TS Toplam şeker TY Toplam yağ USA Amerika Birleşik Devletleri UV-GB Ultraviyole/Görünür bölge VAN Vanilik asit W Su WHO Dünya Sağlık Örgütü xi ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Enkapsülasyon işlemi.......................................................................... 12 Şekil 2.2. Emülsiyon yöntemi ............................................................................. 17 Şekil 2.3. İğde (Elaeagnus angustifolia L.) ........................................................ 19 Şekil 3.1. İğde örneklerinin çözücü ekstraksiyonunun şematik gösterimi .......... 34 Şekil 3.2. İğde örneklerinin asidik hidroliz ekstraksiyonunun şematik gösterimi ............................................................................................. 35 Şekil 3.3. L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin geliştirilmesi ..... 42 Şekil 3.4. Probiyotik bakteri kültürlerinin aktive edilmesi ................................. 43 Şekil 3.5. İğde unu üzerine probiyotik bakterilerin enkapsülasyonu .................. 44 Şekil 3.6. Serbest probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analiz şeması ............ 49 Şekil 3.7. Enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analiz şeması ................................................................................................ 50 Şekil 3.8a. Enkapsüle probiyotik bakterilerin SGF ortamında canlılıklarının incelenmesi ......................................................................................... 52 Şekil 3.8b. Serbest probiyotik bakterilerin SGF ortamında canlılıklarının incelenmesi ......................................................................................... 53 Şekil 3.9a. Enkapsüle probiyotik bakterilerin SIF ortamında canlılıklarının incelenmesi ......................................................................................... 54 Şekil 3.9b. Serbest probiyotik bakterilerin SIF ortamında canlılıklarının incelenmesi ......................................................................................... 55 Şekil 3.10a. Enkapsüle probiyotik bakterilerin SGF-SIF ortamında canlılıklarının incelenmesi.................................................................. 56 Şekil 3.10b. Serbest probiyotik bakterilerin SGF-SIF ortamında canlılıklarının incelenmesi ......................................................................................... 57 Şekil 4.1. İğde unu metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı ...................................................................................... 84 Şekil 4.2. İğde kabuğu metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı ...................................................................................... 90 Şekil 4.3. İğde çekirdeği metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı ...................................................................................... 96 Şekil 4.4. İğde çiçeği metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı ...................................................................................... 102 Şekil 4.5. İğde yaprağı metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı ..................................................................................... 108 Şekil 4.6. İğde unu üzerine L.casei probiyotik bakterisinin enkapsülasyon verimi için üç boyutlu yüzey analizi grafikleri .................................. 119 Şekil 4.7. İğde unu üzerine L.acidophilus probiyotik bakterisinin enkapsülasyon verimi için üç boyutlu yüzey analizi grafikleri ........ 121 Şekil 4.8. Depolama süresi boyunca serbest ve enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin canlılık kayıpları ............................................................. 128 Şekil 4.9. Serbest ve iğde unu ile enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin SGF ortamındaki canlılıkları .............................................................. 132 Şekil 4.10. Serbest ve iğde unu ile enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin SIF ortamındaki canlılıkları ............................................................... 133 Şekil 4.11. Serbest ve iğde unu ile enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin ardışık olarak SGF-SIF ortamındaki canlılıkları ................................ 134 xii Şekil 4.12. İğde unu örneklerinin FT-IR spektrumları ......................................... 138 Şekil 4.13. L. casei-iğde unu kapsül boyutları ..................................................... 139 Şekil 4.14. L. acidophilus-iğde unu kapsül boyutları........................................... 140 Şekil 4.15a. Sterilize edilmiş iğde ununun 2000X büyütme SEM görüntüsü ........ 141 Şekil 4.15b. Sterilize edilmiş iğde ununun 3000X büyütme SEM görüntüsü ....... 142 Şekil 4.15c. Sterilize edilmiş iğde ununun 5000X büyütme SEM görüntüsü ........ 142 Şekil 4.16a. Bakterisiz enkapsüle edilen iğde ununun 2000X büyütme SEM görüntüsü ............................................................................................ 143 Şekil 4.16b. Bakterisiz enkapsüle edilen iğde ununun 3000X büyütme SEM görüntüsü ............................................................................................ 144 Şekil 4.16c. Bakterisiz enkapsüle edilen iğde ununun 5000X büyütme SEM görüntüsü ............................................................................................ 144 Şekil 4.17a. L. casei-iğde unu kapsüllerinin 2000X büyütme SEM görüntüsü ..... 145 Şekil 4.17b. L. casei-iğde unu kapsüllerinin 3000X büyütme SEM görüntüsü ..... 146 Şekil 4.17c. L. casei-iğde unu kapsüllerinin 5000X büyütme SEM görüntüsü ..... 146 Şekil 4.18a. L. acidophilus-iğde unu kapsüllerinin 2000X büyütme SEM görüntüsü ............................................................................................ 147 Şekil 4.18b. L. acidophilus-iğde unu kapsüllerinin 3000X büyütme SEM görüntüsü ............................................................................................ 148 Şekil 4.18c. L. acidophilus-iğde unu kapsüllerinin 5000X büyütme SEM görüntüsü ............................................................................................ 148 xiii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 3.1. Tez kapsamında kullanılan cihazlar ve amaçları ................................. 22 Çizelge 3.1. Tez kapsamında kullanılan cihazlar ve amaçları (devam) ................... 23 Çizelge 3.1. Tez kapsamında kullanılan cihazlar ve amaçları (devam) ................... 24 Çizelge 3.2. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar ............................................... 25 Çizelge 3.2. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar (devam) ................................ 26 Çizelge 3.2. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar (devam) ................................ 27 Çizelge 3.3. Çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler ............................................. 28 Çizelge 3.4. HPLC-DAD gradient hareketli faz programı ..................................... 400 Çizelge 3.5. Merkezi kompozit dizayn için faktörler ve kodlanmış seviye değerleri ............................................................................................. 455 Çizelge 3.6. Merkezi kompozit dizayn tablosu ........................................................ 47 Çizelge 4.1. İğde unu ekstraktlarının spektroskopik bulguları .............................. 688 Çizelge 4.1. İğde unu ekstraktlarının spektroskopik bulguları (devam) .................. 69 Çizelge 4.2. İğde kabuğu ekstraktlarının spektroskopik bulguları ......................... 700 Çizelge 4.2. İğde kabuğu ekstraktlarının spektroskopik bulguları (devamı) ......... 711 Çizelge 4.3. İğde çekirdeği ekstraktlarının spektroskopik bulguları...................... 722 Çizelge 4.3. İğde çekirdeği ekstraktlarının spektroskopik bulguları(devam) ........ 733 Çizelge 4.4. İğde çiçeği ekstraktlarının spektroskopik bulguları ........................... 744 Çizelge 4.4. İğde çiçeği ekstraktlarının spektroskopik bulguları (devam)............. 755 Çizelge 4.5. İğde yaprağı ekstraktlarının spektroskopik bulguları ........................ 766 Çizelge 4.5. İğde yaprağı ekstraktlarının spektroskopik bulguları (devam) .......... 777 Çizelge 4.6. Standart fenolik bileşiklerin validasyon parametreleri ........................ 79 Çizelge 4.6. Standart fenolik bileşiklerin validasyon parametreleri (devam) ........ 800 Çizelge 4.7. Standart fenolik bileşiklerin geri kazanım çalışmaları ....................... 811 Çizelge 4.7. Standart fenolik bileşiklerin geri kazanım çalışmaları (devam) ........ 822 Çizelge 4.8. İğde unu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) ......... 855 Çizelge 4.8. İğde unu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) .............................................................................................. 866 Çizelge 4.8. İğde unu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) .............................................................................................. 877 Çizelge 4.8. İğde unu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) .............................................................................................. 888 Çizelge 4.9. İğde kabuğu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) ..... 91 Çizelge 4.9. İğde kabuğu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) .............................................................................................. 922 Çizelge 4.9. İğde kabuğu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) .............................................................................................. 933 Çizelge 4.9. İğde kabuğu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) .............................................................................................. 944 Çizelge 4.10. İğde çekirdeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) 977 Çizelge 4.10. İğde çekirdeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) .............................................................................................. 988 Çizelge 4.10. İğde çekirdeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ................................................................................................ 99 Çizelge 4.10. İğde çekirdeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ................................................................................................ 100 xiv Çizelge 4.11. İğde çiçeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek)....... 103 Çizelge 4.11. İğde çiçeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ............................................................................................... 104 Çizelge 4.11. İğde çiçeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ............................................................................................... 105 Çizelge 4.11. İğde çiçeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ............................................................................................... 106 Çizelge 4.12. İğde yaprağı ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) .. 1099 Çizelge 4.12. İğde yaprağı ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ............................................................................................... 110 Çizelge 4.12. İğde yaprağı ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ............................................................................................... 111 Çizelge 4.12. İğde yaprağı ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ............................................................................................... 112 Çizelge 4.13. İğde ununun fizikokimyasal özellikleri .............................................. 115 Çizelge 4.14. İğde ununun sterilizasyon öncesi ve sonrası fizikokimyasal özellikleri ............................................................................................ 116 Çizelge 4.15. İğde ununun sterilizasyonunun istatistiksel analizi............................. 117 Çizelge 4.16. L. casei ve L. acidophilus için ikinci dereceden polinom denklemleri ......................................................................................... 118 Çizelge 4.17. Yanıt değerleri için ANOVA analizi sonuçları ................................... 123 Çizelge 4.18. L. casei ve L. acidophilus için enkapsülasyon veriminin (%) tahmini ve deneysel değerlere sahip merkezi kompozit dizayn tasarımı ........ 124 Çizelge 4.19. Optimum çalışma koşulları ile tahmini ve deneysel değerler ............. 125 Çizelge 4.20. Depolama süresi boyunca serbest ve enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin canlılıkları (log kob /g-mL) ........................... 126 Çizelge 4.21. Depolama süresi boyunca serbest ve enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin canlılık kayıpları (%) ..................................... 127 Çizelge 4.22. İn-vitro gastrointestinal analiz sonrası serbest ve enkapsüle L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin canlılıkları ...................... 131 xv 1. GİRİŞ Günümüzde insanlar, gıda ürünlerini sadece temel ihtiyaçlarını gidermek için değil aynı zamanda sağlık açısından önemine de bakarak tercih etmektedirler. Son zamanlarda, tüketicilerin daha sağlıklı yaşam tarzına sahip olma istekleri doğrultusunda fonksiyonel gıdaya olan talep dünya çapında hızla artmaktadır. Fonksiyonel gıdalar, “vücudun temel besin maddelerine olan ihtiyacını karşılamanın ötesinde, insan fizyolojisine ve metabolik fonksiyonlarına ek faydalar sağlayan, böylelikle hastalıklardan korunmada ve daha sağlıklı bir yaşama ulaşmada etkinlik gösteren gıda ya da gıda bileşenleri” olarak tanımlanmaktadır (Aboulfazli ve ark., 2015, 2016; Sengsaengthong ve Oonsivilai, 2019). Dünya genelinde fonksiyonel gıdalarda en fazla kullanılan bileşenlerden olan probiyotikler, prebiyotikler, sinbiyotikler, diyet lifleri, Omega-3 yağ asitleri ve fenolik bileşikler, gıdalara eklenerek yeni ürünler geliştirilmesini sağlamaktadır (del Castillo ve ark., 2018; Jaddu ve Katam, 2018). Probiyotik bakteriler Gıda ve Tarım Örgütü (FAO) ile Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından “yeterli miktarda alındığında konakçı sağlığı üzerine olumlu etkiler gösteren canlı mikroorganizmalar” olarak tanımlanır. Lactobacillus ve Bifidobacterium türleri bağırsak mikrobiyotasında doğal olarak bulunmalarından dolayı en fazla kullanılan probiyotik bakteri kültürleridir (Açu ve ark., 2017; Homayouni ve ark., 2008; Niamah ve ark., 2018; Sengsaengthong ve Oonsivilai, 2019). Prebiyotikler ise “konağın bağırsak mikrobiyotasındaki mikroorganizmaların seçici olarak kullandığı, sağlık üzerinde faydalı etkileri bulunan substratlar” olarak tanımlanmaktadır (Gibson ve ark., 2017). Prebiyotiklerin ana hedefi, probiyotik bakterilerin gelişimini özellikle potansiyel patojenik bakteri grupları varlığında dahi seçici olarak uyarmaktır. Günümüzde ilaç kullanımına karşı geliştirilen ön yargılar, kapsül ve tablet formundaki probiyotik ürünlerin kullanımını sınırlamaktadır. Bu nedenle dünya genelinde probiyotik mikroorganizmaları içeren fermente süt ürünlerine olan talep hızla artmaktadır. Probiyotik özellik gösteren mikroorganizmalar tablet olarak ya da süt, yoğurt gibi gıda ürünü olarak tüketildiklerinde beklenen olumlu etkiyi gösterebilmeleri için gıda işleme ve depolama sürecinde, vücuda alındıktan sonra da gastrointestinal sistemde hayatta kalabilmelidirler (Chaikham ve Rattanasena, 2017; Cruz ve ark., 2009; Homayouni ve ark., 2008; Niamah ve ark., 2018; Sengsaengthong ve Oonsivilai, 2019). 1 Probiyotiklerin canlılığını geliştirmek için uygun suş seçimi, prebiyotik ve şeker ilavesi, pH ayarlaması, sıvı kültürlerin kullanımı ve probiyotik kültürün enkapsülasyonu gibi çok sayıda proses bulunmaktadır (Akalın ve ark., 2018; Champagne ve ark., 2015). Enkapsülasyon işlemi biyoaktif bileşenlerin diğer koruyucu malzemelerle (kaplama materyali) veya bunların karışımları ile kaplandığı bir işlemdir (Niamah ve ark., 2018). Enkapsülasyon işlemi, düşük pH değeri, safra tuzları, oksijen varlığı gibi olumsuz çevre koşullarında dahi probiyotik bakterilerin canlılığının korunmasını sağlamaktadır (Kataria ve ark., 2018). İğde (Elaeagnus angustifolia L.) Elaeagnaceae familyasına ait yaygın olarak oleaster, Rus zeytini, yabani zeytin veya gümüş meyvesi olarak bilinen, tıbbi özelliklerinden dolayı bitkisel ilaç olarak kullanılan bir bitkidir. İğde meyvesi iyi bir esansiyel yağ asidi, vitamin ve mineral kaynağı olmasının yanında karotenoid, flavonoid ve biyoaktif bileşenlerce zengin içeriğe ve prebiyotik özelliğe sahiptir (Ishaq ve ark., 2015; Khan ve ark., 2016; Okmen ve Turkcan, 2014; Sabir ve ark., 2007; Saleh ve ark., 2018) İğde ununun spesifik tadı, yapısı, lif, mineral ve fenolik bileşik içeriği nedeniyle gıda ürünlerinde kullanılabilecek doğal bir ürün olduğu, aynı zamanda içerdiği Omega-7 olarak bilinen palmitoleik yağ asidi nedeniyle iyi kolestrolü arttırırken, kötü kolestrolü ve trigliseridi düşürebileceği, dolayısıyla insülin direncini azaltmayı destekleyebileceği düşünülmektedir. Son yıllarda dengeli beslenme ve sağlıklı yaşam ile doğal ürünlere yönelimin popüleritesi tüketicilerin fonksiyonel gıdalara olan ilgilerini arttırarak talep profillerinde büyük değişikliklere neden olmuştur. Bu nedenle üretici firmalar fonksiyonel gıda yelpazelerini genişletmeyi hedef haline getirmektedir. Çünkü artan nüfus, küresel ısınma ve iklim değişiklikleri gibi çevresel koşullara bağlı olarak artan hastalıkların ve ölüm oranlarının kökeninde hastalıkların ortaya çıkışının önlenmesi daha önemli hale gelmiştir. Bunun için de tüketiciler fonksiyonel gıda ürünlerine yönelmektedir. Bu bağlamda dünyada tüketim açısından önemli hale gelen probiyotik fonksiyonel ürünler tez çalışma konusu olarak seçilmiştir. Fonksiyonel ürünlerin endüstriyel alanda kullanılabilirliğinin teşvik edilmesi için gıda alanında kullanılabilecek fonksiyonel ürünlerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu 2 amaç doğrultusunda probiyotik bakterilerin iğde unu ile enkapsülasyonu için optimum koşullar belirlenerek probiyotik bakterilerin canlılıkları araştırılmış, elde edilen kapsüller karakterize edilerek depolama süresince ve in-vitro gastrointestinal ortamda probiyotik bakterilerin canlılıkları incelenmiştir. 3 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Fonksiyonel Gıdalar Vücudun temel besin ihtiyaçlarını karşılamanın ötesinde insan fizyolojisi üzerine olumlu etkiler gösterdiğinden dolayı hastalıklardan koruyarak daha sağlıklı bir yaşam sürmeyi sağlayan gıda ya da gıda bileşenleri fonksiyonel gıdalar olarak tanımlanmaktadır (Aboulfazli ve ark., 2015, 2016; Sengsaengthong ve Oonsivilai, 2019). Fonksiyonel gıdalar hap, kapsül, besin takviyesi gibi formlarda bulunmazlar. Hiçbir işlem görmemiş meyve, sebze, tahıl, içecek gibi doğal bir besin ya da fonksiyonel bir besin maddesi ile zenginleştirilmiş ya da geliştirilmiş gıdalar olarak bulunmaktadırlar. Bir fonksiyonel gıda maddesi (Coşkun, 2005); ∗ Bireyin beslenmesine katkı sağlayarak daha sağlıklı bir yaşam sürmeye yardımcı olmalıdır. ∗ Günlük olarak alınması gereken uygun miktarlar belirlenmiş olmalıdır. ∗ Gıda olarak tüketiminin güvenilir olduğu kanıtlanmış olmalıdır. ∗ İçeriğinin fizikokimyasal, nicel ve nitel özellikleri belirlenmiş olmalıdır. ∗ İşlenerek fonksiyonelleştirildiğinde besleyici özelliği azalmamalıdır. ∗ Günlük hayatta sıklıkla kullanılan bir gıda olmalıdır. ∗ Tedavi amacıyla kullanılan bir madde olmamalıdır. Yapılan çalışmalar fonksiyonel gıdaların obezite, diyabet, kanser, osteoporoz, kalp-damar hastalıkları, hipertansiyon gibi hastalıklara sahip bireylerde olumlu etkilere yol açtığını göstermiştir (Coşkun, 2005). Gıdalara eklenerek fonksiyonel özellikte yeni ürünlerin geliştirilmesinde kullanılan bileşenler arasında; 4 ∗ Probiyotikler ∗ Mineraller ∗ Prebiyotikler ∗ Vitaminler ∗ Sinbiyotikler ∗ Sülfür içeren maddeler ∗ Fenolik bileşikler ∗ Fitokimyasallar ∗ Antioksidan maddeler ∗ Oligosakkaritler ∗ Besinsel lifler ∗ Çoklu doymamış yağ asitleri sayılmaktadır (del Castillo ve ark., 2018; Jaddu ve Katam, 2018). 2.2. Prebiyotikler Sağlık üzerinde olumlu etkileri bulunan, bağırsak mikrobiyotasında bulunan mikroorganizmalar tarafından seçici olarak kullanılan substratlar prebiyotikler olarak tanımlanmaktadır (Gibson ve ark., 2017). Soğan, sarımsak, hindiba gibi sebzeler, ejderha, kriko gibi meyveler, tahıllar ve baklagiller gibi birçok gıda doğal prebiyotik kaynakları arasında yer almaktadır. Prebiyotiklerin temel hedefi patojenik bakteri varlığında dahi bağırsak mikrobiyotasının temel üyeleri olan Lactobacillus ve Bifidobacterium ssp. gibi probiyotik bakterileri tarafından fermente edilerek onların gelişimini seçici olarak uyarmaktır. Prebiyotiklerin bağırsakta fermente edilmesi sonucunda laktik asit ve kısa zincirli yağ asitleri (asetik, propiyonik ve bütirik asit) ile karbondioksit, metan ve hidrojen gibi gazlar oluşmaktadır. Oluşan kısa zincirli yağ asitleri; ∗ Bağırsak pH’sini düşürmektedir. ∗ Patojen bakterilerin gelişmesini önlemektedir. ∗ Kolon epitel hücreleri için gerekli enerjiyi sağlamaktadır. ∗ Minerallerin (Na, Ca ve Mg gibi) emilimini artırmaktadır. ∗ Bağırsak epitel hücrelerini korumaktadır. ∗ Enfeksiyonel bağırsak hastalıkları riskini azaltmaktadır. ∗ İmmün sistemin düzenlenmesine destek olmaktadır. ∗ Antitümorenejik etki göstermektedir. 5 Araştırmalara göre prebiyotikler kanser, böbrek yetmezliği, diyabet, metabolik stres ve travma gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Ayrıca yapılan çalışmalar ile prebiyotik substratların vücuttaki toksik, mutajenik ve genotoksik bileşenlerin miktarını düşürdüğü, glisemik kontrolü geliştirdiği, kanser riskini azalttığı, B vitaminlerinin sentezlenmesini sağladığı, dışkılama miktarını arttırdığı ve bağışıklık sistemini güçlendirdiği kanıtlanmıştır (Davani-Davari ve ark., 2019; Markowiak ve Ślizewska, 2017). 2.3. Probiyotik Bakteriler “Yaşam için” anlamına gelen probiyotik kelimesi Yunanca “pro‟ ve “biota‟ kelimelerinin bileşiminden gelmektedir. Probiyotik bakteriler Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ile Gıda ve Tarım Örgütü (FAO) tarafından “yeterli miktarda alındığında konakçı sağlığı üzerine olumlu etkiler gösteren canlı mikroorganizmalar” olarak tanımlanmaktadır. Lactobacillus ve Bifidobacterium türleri normal bağırsak mikrobiyotasının üyeleri olmalarından dolayı en fazla kullanılan probiyotik bakterilerdir (Açu ve ark., 2017; Homayouni ve ark., 2008; Niamah ve ark., 2018; Sengsaengthong ve Oonsivilai, 2019; Suyabatmaz ve ark., 2023). Lactobacillus ve Bifidobacterium türleri dışında; E. coli ve Bacillus türleri, küflerden Aspergillus niger ve mayalardan Saccharomyces boulardii en çok kullanılan probiyotik mikroorganizmalar arasında sayılmaktadır (Açu ve ark., 2017; Homayouni ve ark., 2008; Niamah ve ark., 2018; Sengsaengthong ve Oonsivilai, 2019). Probiyotik bakterilerin insan sağlığına olumlu etkileri üzerine yapılan bilimsel araştırmalarda serum kolesterolünü düşürdüğü, Helicobacter pylori bakterisinin elimine ettiği, bağışıklık sistemini stimüle ettiği ve bağırsak mikrobiyotasını patojenlere karşı koruduğu ispatlanmıştır. Aynı zamanda aşağıda maddeler halinde verilen birçok hastalığı önleyici ya da tedavi edici özellikleri olduğu yapılan çalışmalarda bildirilmiştir (George Kerry ve ark., 2018; Maldonado Galdeano ve ark., 2019; Suyabatmaz ve ark., 2023; Wan ve ark., 2019). 6 ∗ Gastrointestinal enfeksiyonlar ∗ Hiperkolesterolemi ∗ İnflamatuar bağırsak hastalığı ∗ Osteoporoz ∗ Laktoz metabolizması ∗ İdrar yolu iltihabı ∗ Obezite ∗ Bebek ishalleri ∗ Tip 2 diyabet ∗ Yağlı karaciğer hastalığı ∗ Antimutajenik ∗ İnsülin direnci sendromu ∗ Antidiyaretik özellikler ∗ Alerjik rahatsızlıklar ∗ Antimikrobiyal aktivite Probiyotik bakteriler kapsül formunda takviye edici gıda ya da süt ürünleri gibi gıda maddesi olarak tüketildiklerinde insan sağlığında beklenen olumlu etkiyi gösterebilmeleri bazı faktörlere bağlıdır. Bu faktörler aşağıda maddeler halinde yer almaktadır (Boza- Mendez ve ark., 2012; Santiago-López ve ark., 2015). ∗ Bakteri türü, ∗ Günlük alınması gereken bakteri sayısı (107-1010 kob/g-mL), ∗ Günlük tüketilme sıklığı, ∗ Bakterinin tüketilme zamanı (yemek öncesi, sonrası ya da yemekle birlikte), ∗ Bakterinin tüketilme süresi, ∗ Bakterinin tüketilme şekli (kapsül ya da gıda maddesi), ∗ Bakterinin gastrointestinal sistemde canlılığını devam ettirebilme kabiliyeti Uluslararası Sütçülük Federasyonu, probiyotik gıda ürünlerinde bakteri sayısının tüketim anında en az 106-107 kob/g (log 6-7 kob/g) olmasını tavsiye etmektedir (Aboulfazli ve ark., 2015; Akalın ve ark., 2018; Akin ve ark., 2007; Akın ve Dasnik, 2015; Chaikham ve Rattanasena, 2017; Homayouni ve ark., 2008; Kataria ve ark., 2018; Low ve ark., 2015; Sengsaengthong ve Oonsivilai, 2019). Bakterilerin canlılığını etkileyen faktörler arasında aşağıdaki parametreler sayılabilir (Homayouni ve ark., 2008; Kataria ve ark., 2018). 7 ∗ Probiyotik bakterilerin canlılığı ∗ Probiyotik bakterilerin doz seviyesi ∗ Sıcaklık ∗ Süt ürünlerinin matriksi ∗ Oksijen varlığı ∗ Redoks potansiyeli ∗ pH değeri ∗ Ozmotik etkiler ∗ Şeker konsantrasyonu ∗ Mekanik kesme 2.3.1. Lactobacillus spp. Lactobacillus, Lactobacillaceae familyasına ait laktik asit bakterileri grubundan, gram- pozitif, fakültatif anaerobik veya mikroaerofilik, çubuk şeklinde, spor oluşturmayan bir bakterileri cinsidir. Lactobacillus türlerinin gelişebildikleri optimum sıcaklık 30-40°C arasındadır. Ayrıca fermantasyon ürünü olarak laktik asit ürettikleri için ortam pH’sini 3,5’e kadar düşürdüklerinden asidik ortama dayanıklıdırlar. Üretilen laktik asidin fermente ürünleri koruyucu etki göstermesinden dolayı, bu türler yıllardır gıda endüstrisinde kullanılmaktadır. Lactobacillus türleri, insan ve hayvan mikrobiyotasının sindirim sistemi ve kadın genital sistemi gibi çeşitli vücut bölgelerinde bulunmaktadır. Bu mikroorganizmalar laktoz intoleransının hafifletilmesi, diyare ve vajinal enfeksiyonların tedavi edilmesi, bağışıklık sisteminin kuvvetlendirilmesi, egzama gibi cilt bozukluklarının tedavisi, kanserin önlenmesi ve kolesterol seviyesinin düşürülmesi gibi özelliklere sahiptir (Naidu ve ark., 1999; Soomro ve ark., 2002). Lactobacillus cinsine ait probiyotik kültürler arasında L. acidophilus, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. brevis, L. lactis ve L. reuteri türleri gelmektedir. 8 2.3.2. Lactobacillus acidophilus Alem : Bacteria Şube : Firmicutes Sınıf : Bacilli Takım : Lactobacillales Familya : Lactobacillaceae Cins : Lactobacillus Tür : L. acidophilus L. acidophilus, ilk kez 1900’de Dr. Ernst Moro tarafından bebek dışkısından izole edildiğinden beri diğer tüm laktobasillerden daha kapsamlı bir şekilde incelenmiştir (Selle ve ark., 2014). Karbohidratları parçalayarak laktik aside dönüştüren, gram pozitif, anaerobik ya da fakültatif anaerobik, hareketsiz, sporsuz, görünümleri polimorf yapılı bakterilerdir. Gelişebildikleri sıcaklık değerleri 35-40°C arasında iken optimum pH aralığı 5,5-6,0’dır. İnsan ağız, bağırsak ve vajinasında doğal olarak bulunur. Diş çürümelerini, endokardit ve menenjit enfeksiyonunu tetikleyen etken olarak da bilinirler. Kolesterolü düşürmeye yardımcı olur, diyareye karşı korur ve diyareyi azaltır, vajinal enfeksiyonlara karşı korur ve oluşmasını önler, kilo vermeye yardımcı olur, gribe ve alerjiye karşı korur, egzama belirtilerini azaltır ve kanserin önlenmesine yardımcı olur. 2.3.3. Lactobacillus casei Alem : Bacteria Şube : Firmicutes Sınıf : Bacilli Takım : Lactobacillales Familya : Lactobacillaceae Cins : Lactobacillus Tür : L. casei 9 Lactobacillus casei Hansen ve Lessel tarafından ilk olarak 1971’de yeni bir tür olarak önerilmiş ancak 1996’da kabul edilmiştir. Laktozu ve diğer şekerleri laktik aside dönüştürdüklerinden dolayı ‘Lacto’, sütü peynire dönüştürdüğü için ‘caseification’ yani ‘peynirleştirme’ anlamına gelen ‘casei’ ismi verilmiştir. Gram pozitif, fakültatif heterofermentatif, fakültatif anaerobik, çubuk şeklinde, hareketsiz ve spor oluşturmayan bir bakteridir. L. casei bakterileri 15°C’de gelişim gösterirken 45°C’de gelişemez ve optimum pH’leri 5,5 tir. L. casei taze sebzelerde, bitkisel fermente ürünlerde, çiğ ve fermente süt ürünlerinde, anne sütünde, insanların ve diğer sıcakkanlıların sindirim sisteminde yaygın olarak bulunur. L. casei türleri yüksek miktarda laktik asit üretir, gıdaların lezzet gelişimini güçlendirir, antimikrobiyel ve antidiyaretik özellik gösterir (Ghalehjooghi ve ark., 2023; Hill ve ark., 2018; Li ve ark.,2023). 2.4. Sinbiyotik Gıdalar Bağırsakta faydalı bir mikrobiyal popülasyon sağlamak için aralarında sinerjik bir etki bulunan probiyotik bakteri ve prebiyotik substratları içeren gıdalar sinbiyotik gıda olarak tanımlanmaktadır. Sinbiyotik gıdalar seçici olarak fizyolojik bağırsak mikrobiyotasının gelişimini ve aktivitesini arttırarak konakçı sağlığı üzerinde olumlu etkiler oluşturmaktadır. Bir sinbiyotik ürün oluşturulurken uygun bir probiyotik bakteri ve prebiyotik substrat seçilerek bir araya getirilmelidir (Markowiak ve Ślizewska, 2017; Miremadi ve ark., 2016). Prebiyotikler, özel olarak kalın bağırsak florası üzerine etki ederken, probiyotikler ince bağırsak üzerinde daha çok etkilidirler. Dolayısıyla oluşan sinbiyotik ürün hem ince bağırsak hem de kalın bağırsakta etkili ajanlar içermektedir. 2.5. Probiyotik Ürünler Konakçı sağlığı üzerinde olumlu etkileri olan mikroorganizmalar, çeşitli enzim, vitamin ve aroma bileşenleri ile takviye edilerek direkt kapsül ya da tablet haline getirilmiş diyet destekleyicisi ürünler probiyotik ürünler olarak tanımlanmaktadır. İlaç kullanımına karşı 10 oluşan ön yargılar, ilaç formunda hazırlanmış diyet destekleyici kapsül ve tabletlerin kullanımını sınırladığından dünya genelinde probiyotik mikroorganizmaları içeren gıda ürünlerine olan talep hızla artmaktadır. Piyasada fermente süt, kefir, yoğurt, ekşitilmiş krema, dondurma ve dondurulmuş tatlı gibi probiyotik bakteri içeren çeşitli süt ürünleri bulunmaktadır. Fermente süt ürünlerinde doğal olarak bulunan fonksiyonel özellikler, probiyotik etkili mikroorganizmaların kullanımıyla daha da artmaktadır (Reid, 2016; Rezaul ve ark., 2017; Yilmaz-Ersan ve Kurdal, 2014). Probiyotik bakterilerin süt ürünü içerisinde canlı hücre sayısını koruması büyük önem taşımaktadır. Ne yazık ki, gıdaların üretimi ve depolanması sırasında birçok faktör probiyotik bakterilerin canlılığında kayıplara yol açmaktadır (Champagne ve ark., 2015). Bu nedenle, fermente ürünlerde probiyotik bakterilerin canlılıklarının arttırılması ve sürekliliğinin sağlanmasına yönelik çeşitli stratejiler (bitki özleri, fenolik bileşikler ve antioksidan maddeler kullanmak) son zamanlardaki çalışmaların odak noktasını oluşturmaktadır (Noori ve ark., 2017). 2.6. Probiyotik Bakterilerin Gıdalara Uygulanabilirliği Probiyotik bakterilerin gıdalarda uygulanabilir olması ve istenilen etkiye sahip olması için gıda işleme operasyonunun tüm aşamalarında, depolama sürecinde ve gastrointestinal sistemde hayatta kalabilmeli ve bağırsak mikrobiyotasıyla rekabet edebilme kabiliyetine sahip olmalıdır (Chaikham ve Rattanasena, 2017; Cruz ve ark., 2009; Homayouni ve ark., 2008; Niamah ve ark., 2018; Sengsaengthong ve Oonsivilai, 2019). Probiyotiklerin canlılığını geliştirmek için uygun suş seçimi, prebiyotik ve şeker ikamelerinin ilavesi, yağ içeriğinin ayarlanması, gliserol eklenmesi, inokülasyon oranı, pH ayarlaması, sıvı kültürlerin kullanımı, donma parametreleri ve probiyotik kültürün enkapsülasyonu gibi çok sayıda proses önerilmiştir (Akalin ve Erişir, 2008; Champagne ve ark., 2015). 11 2.7. Enkapsülasyon Enkapsülasyon; katı, sıvı veya gaz haldeki gıda bileşenlerinin, enzim, hücre ve mikroorganizmaların, protein veya karbohidrat esaslı bir duvar materyaliyle kaplanması sonucunda nanometreden milimetreye kadar geniş aralıkta partiküllerin oluşturulması işlemidir. Kapsüller çevresinde homojen bir duvarın yer aldığı basitçe küre şeklinde olan partiküllerdir. Kapsül içerisinde yer alan madde; çekirdek, iç faz, öz madde veya dolgu, dış kısımda yer alan duvar ise; kabuk, kaplama materyali, duvar materyali veya membran olarak isimlendirilmektedir (Şekil 2.1). Şekil 2.1. Enkapsülasyon işlemi Vitamin ve mineraller, aroma ve lezzet verici maddeler, bitkisel maddeler ve biyoaktifler (keratin, probiyotik bakteriler), enzimler, mayalar gibi gıda bileşenleri dolgu materyali olarak kullanılarak enkapsüle edilebilir (Beldarrain-Iznaga ve ark., 2021; Farahmand ve ark., 2022; Nasiri ve ark., 2021). Kaplama materyali olarak ise; ∗ Proteinler (jelatin, kasein, zein, soy ve albümin) ∗ Polisakkaritler/Hidrokarbonlar (nişasta, aljin/aljinat, agar/agaroz, pektin/polipektat, karragenan ve gamlar) ∗ Yağ ve yağ asitleri (mono-di-tri gliserit, laurik, kaprik, palmitik, stearik asit) ∗ Hidrofilik ve lipofilik vakslar (PEG (polietilen glikol), karnauba vaks) ∗ Selülozik türevler (metil-etil selüloz, karboksimetil selüloz) ∗ Şeker türevleri 12 kullanılmaktadır. Enkapsülasyon işleminin gerçekleştirilebilmesi için kullanılan kaplama materyalinin belli özelliklere sahip olması gerekmektedir. ∗ Yüksek derişimlerde reolojik özellikleri iyi olmalıdır. ∗ Kapsülleme işlemi esnasında kolay işlenebilmelidir. ∗ Emülsiyon ve dispersiyon özelliği olmalıdır. ∗ Dolgu materyali ile reaksiyona girmemelidir. ∗ Dolgu materyalini enkapsülasyon işlemi ve depolama esnasında korumalıdır. ∗ İstenilen çözücüde çözünebilmelidir. ∗ Ucuz olmalıdır. Belirtilen özellikleri tek bir kaplama materyalinin sağlaması çok zor olduğundan farklı kaplama materyallerinin bir arada kullanılması önerilmektedir. 2.7.1. Enkapsülasyon çeşitleri Nano ve mikro boyut, enkapsülasyon işleminde en işlevsel ve arzu edilen kapsül boyutlarıdır. Kapsül boyutu 1 ile 1000 nm aralığında olan kapsüller nanokapsül ve 1 ile 1000 μm aralığında olan kapsüller mikrokapsül olarak sınıflandırılsalar da nanoenkapsülleme, kapsül boyutu 1 nm ile birkaç yüz nanometre çapını mikroenkapsülleme ise 1 μm ile birkaç yüz mikrometre çapını kapsar. Ayrıca, nano ve mikroenkapsülleme aralığı arasındaki parçacık boyutuna mikron altı parçacıklar, mikroenkapsülleme aralığının üzerindeki parçacık boyutuna ise makro parçacıklar denir. Mikroenkapsülasyon, gıda ve ilaç endüstrilerinde en sık ve yaygın olarak kullanılan yöntemdir (Saifullah ve ark., 2019). 2.7.2. Enkapsülasyon teknikleri Farklı amaç ve kullanım için çeşitli mikroenkapsülasyon yöntemleri bulunmaktadır. Yöntem seçimi, kapsül oluşumunda kullanılacak olan materyalin ve membranın özellikleri dikkate alınarak yapılmalıdır. 13 Püskürterek kurutma yöntemi Püskürterek (sprey) kurutma yöntemi, su miktarının azaltılması ile ürünlerin mikrobiyolojik stabilitelerinin sağlanması, kimyasal veya mikrobiyolojik bozulmaların önlenmesi, depolama ve taşıma maliyetlerinin azaltılması ve ürünlerin spesifik özelliklerinin korunması amacıyla gıda endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Yöntemde, çözeltiye basınç uygulandıktan sonra bir “sis” oluşturması için çözelti kurutma bölmesine atomize edilir. Kurutma bölmesine üflenen sıcak gaz (hava ya da azot) çözücünün buharlaşmasını sağlar. Kapsüller daha sonra geri kazanım için bir siklon ayırıcıya taşınır (Özcan ve Altun, 2013). ∗ En sık kullanılan kaplama materyalleri dekstrin, modifiye nişasta, jelatin gibi hidrokolloidlerdir. ∗ Diğer yöntemler ile kıyaslandığında maliyetinin düşük ve erişilebilir olması yöntemi avantajlı kılmaktadır. ∗ Tekrarlanabilir olması yöntemi endüstriyel uygulamalar için uygun hale getirmektedir. ∗ Yöntemin en büyük dezavantajı uygulama alanının dar olmasıdır. ∗ Ayrıca bakteri enkapsülasyonu düşünüldüğünde, yöntemin gerekliliklerinden olan yüksek sıcaklık uygulaması bakterilerin canlılık oranının azalmasına neden olabilmektedir. Bu dezavantajın ortadan kaldırması kurutma öncesinde ortama eklenen koruyucular ile sağlanabilmektedir. Sprey dondurma yöntemi Sprey dondurma yönteminde, vakslar, yağ asitleri, monomerler, suda çözünen ve çözünmeyen polimerler kaplama materyali olarak kullanılır. Sprey dondurarak kurutma ile elde edilen kapsüller, püskürterek-kurutulmuş kapsüllerden daha büyük yüzey alanına sahip olurlar. Bu yöntem için yüksek enerji kullanımı ve uzun işleme süresinden dolayı sprey kurutmadan 30-50 kat daha fazla maliyet gerektirmesi bir dezavantaj oluşturmaktadır. Dondurarak kurutma yönteminin avantajları ise aroma kaybının çok 14 düşük olması ve çözünen maddelerin gıda içerisindeki hareketi dolayısıyla kayıpların minimum olmasıdır (Özcan ve Altun, 2013). Ekstrüzyon yöntemi Ekstrüzyon yöntemi daha çok, düşük sıcaklıkta uygulanan enkapsülasyon yöntemi olarak bilinir. Bu yöntem daha çok uçucu ve ısı stabilitesi düşük olan aroma maddelerinin enkapsülasyonunda kullanılmaktadır (Kailasapathy, 2002). Bu yöntemin en önemli avantajı, oksidasyona eğilimli lezzet bileşenlerine normalden daha uzun bir raf ömrü sağlamasıdır. Prensibi ise, atmosfer gazlarının camsı haldeki karbohidrat matriksleri içine doğru yavaşça difüze olması ve böylelikle oksijene karşı bir bariyer oluşturulmasıdır (Gouin, 2004). Bu yöntem; ∗ Aljinat ve karragenan gibi hidrokolloidlerin kaplama materyali olarak kullanıldığı bir tekniktir, ∗ Temeli çekirdek materyalini içeren çözeltinin yüksek basınçla küçük açıklıklardan geçirilmesidir, ∗ Maliyeti düşük, uygulaması kolay ve verimi yüksektir, ∗ Tehlikeli çözücüler gerektirmez, aerobik ve anaerobik koşullar altında uygulanabilmektedir. Mikrokapsül oluşumunun yavaş olması, büyük ölçekli olarak kullanımını kısıtlar, bu da yöntemin en büyük dezavantajıdır (Özcan ve Altun, 2013). Koaservasyon (faz ayırımı) yöntemi Bu yöntemde suda çözünen polimerler kaplama materyali olarak kullanılır. Yöntem, kaplama materyaline ait sıvı fazın polimer çözeltisinden ayrılmasını ve bu sıvı fazın asılı çekirdek partikülleri etrafında üniform bir tabaka halinde tutulmasını temel almaktadır. Çekirdek ve kaplama materyalinin yüzey enerjileri, sıcaklık, pH ve bileşimleri gibi bazı sistem özellikleri değiştirilerek kümelenmeleri sağlanmaktadır. İşlem sonunda elde edilen 15 mikrokapsüller, filtrasyon ve santrifügasyon gibi ayırma teknikleri kullanılarak ortamdan ayrılır ve tek tek kurutulur (Özcan ve Altun, 2013). Lipozom dağıtma yöntemi Fosfolipitlerin hidrofilik başları ve hidrofobik zincirleri sulu ortamda kendiliğinden yönlenerek lipozom adı verilen küresel kabarcıkları meydana getirir. (Teschke ve De Souza, 2002). Lipozomlar, lipit çift tabakanın oluşturduğu hidrofobik bölge ve merkezinde bulunan suyun oluşturduğu hidrofilik bölge nedeniyle hem suda çözünen hem yağda çözünen hem de amfililik bileşiklerin kapsüllenmesinde kullanılmaktadır. Yöntemin en büyük avantajları arasında enkapsüle edilmiş bileşenin salınımının ve depolama zamanının kontrol edilebilir olmasıdır. Lipozom içerisine enkapsüle edilen biyoaktif bileşenler gastrointestinal sistem koşullarından korunarak bağırsaklardan yüksek oranda emilebildikleri için biyoerişilebilirlik ve biyoyararlanım oranları etkili şekilde arttırılabilmektedir (Jafari ve ark., 2016). Lipozomlar ile biyoyararlanım oranının arttırılması, biyoaktif bileşenlerin vücuda faydalı biyolojik özelliklerinden ve besinsel özelliklerinden daha fazla fayda sağlamaya olanak vermektedir (Kailasapathy, 2002; Kim ve ark., 2008). Emülsiyon yöntemi Emülsiyon yöntemi aljinat, pektin ve karragenan gibi polimer çözeltisi (süreksiz faz) ile soya, mısır, ayçiçeği ve kanola yağı gibi sıvı yağların (sürekli faz) karıştırılmasıyla probiyotik bakterinin su/yağ ya da yağ/su sisteminde tutulması için geliştirilen bir yöntemdir (Özcan ve Altun, 2013). Yağ içinde su (ya da su içinde yağ) emülsiyonu oluşturulduktan sonra suda çözünür polimerin, yağ fazı içinde kapsülleri oluşturması için çözünmez olması gerekmektedir (Burgain ve ark., 2011). Emülsiyon sonrası ortama CaCl2 eklenmesi ile oluşan kapsüller sertleştirilir (Şekil 2.2). Emülsiyon yöntemi ile enkapsülasyon işleminin uygulanması kolaydır ve bakteri canlılık oranı yüksektir. Oluşturulan kapsüllerin boyutları küçüktür ve kapsüllerin boyutları homojenizasyon ve karıştırma hızı ile kontrol edilebilmektedir. Kapsüllere ek koruma sağlamak için kapsüller 16 ikinci bir polimer çözeltisi içine daldırılarak çift kaplama yapılabilmektedir (Chen ve Chen, 2007; de Vos ve ark., 2010; Kasipathy Kailasapathy, 2009). Şekil 2.2. Emülsiyon yöntemi Probiyotik bakterilerin emülsiyon ve ekstrüzyon yöntemi kullanılarak enkapsüle edilmesi ile elde edilen mikrokapsüllerdeki bakterilerin canlılıkları ve ürüne kattıkları duyusal özellikleri arasında kayda değer bir fark olmadığı pek çok araştırmacı tarafından bildirilmiştir (Papagianni ve Anastasiadou, 2009). Emülsiyon ve ekstrüzyon tekniklerinin başarıyla uygulanmasındaki en etkili faktör homojenizasyondur. Bakteri canlılığı ve kapsül boyutu kullanılan homojenizerin özelliğine göre çeşitlilik göstermektedir. Emülsiyon yöntemi ile daha küçük boyutlarda kapsüller elde edilebildiği için, bu yöntem çok aşamalı uygulamalara daha uygundur (Capela ve ark., 2007; Ding ve Shah, 2009; Heidebach ve ark., 2009; Park ve Chang, 2000). 17 2.7.3. Enkapsülasyonun gıda endüstrisinde kullanım amaçları Gıda endüstrisinde enkapsülasyon işleminin başlıca kullanılma amaçları aşağıda maddeler halinde verilmiştir. ∗ Kaplanacak materyali dış etkenlere (nem, sıcaklık, hava ve ışık gibi) karşı korumak, ∗ Kaplanacak materyalin buharlaşarak kaybolmasını önlenmek, ∗ Kaplanacak materyalin fiziksel özelliklerini daha iyi korumak, ∗ Kaplanacak materyalin taşınmasını kolaylaştırmak, ∗ Kaplanacak materyalin doğru bölgede ve doğru zamanda salınmasını sağlamak, ∗ Kaplanacak materyalin tat ve kokusunu maskelemek, ∗ Kaplanacak materyalin başka bileşenlerle reaksiyona girmesini önlemek. 2.8. Probiyotik Bakterilerin Enkapsülasyonu Yanprapasiri ve ark. (2018) L. casei probiyotik bakterisini, konjak glukomannanı kaplama materyali olarak kullanarak sprey kurutma yöntemi ile enkapsüle etmiş ve dondurmaya uygulamışlardır. Enkapsülasyon verimi %95,4 olarak bulunan L. casei- konjak glukomannan kapsülleri, dondurma içerisine katılarak dondurma -18°C’de 28 gün boyunca depolanmıştır. Depolama süreci sonunda dondurmadaki bakteri canlılığı %98 olarak bulunmuştur. Mu ve ark. (2018), L. acidophilus’un bir konjak glukomannan hidrojeli kullanılarak kapsüllenmesiyle %62,5’luk enkapsülasyon verimi ile mikrokapsüller üretmişlerdir. Çalışmada konjak oligosakkarit hem L. acidophilus’un prebiyotiği hem de antifriz ajanı olarak uygulanmıştır. Depolama ve mide sıvısı üzerinde yaptıkları stabilite çalışmalarının sonuçları, mikroenkapsülasyonun L. acidophilus’un asit direncini iyileştirdiğini ve kapsüllenmiş probiyotiklerin hayatta kalma oranını arttırdığını göstermiştir. Mokarram ve ark. (2009), yaptıkları çalışmada emülsiyonlaştırma yöntemi ile aljinat kaplama materyalini kullanarak tek ve çift tabakalı olarak L. acidophilus ve L. rhamnosus 18 probiyoik bakterilerinin kapsüllerini oluşturmuşlardır. Oluşturulan kapsüllerin mide- bağırsak sıvısından geçişi sırasında bakteri canlılıkları karşılaştırılmış ve bakterilerin en iyi çift kaplamalı kapsüllerde korunduğu görülmüştür. Yapılan başka bir çalışmada Lactobacillus rhamnosus probiyotik bakterisi püskürterek kurutma yöntemi kullanılarak, sodyum aljinat üzerine enkapsüle edilmiştir. Daha sonra kapsüllenmemiş ve kapsüllenmiş formda, prebiyotik (β-glukan) ilaveli ve prebiyotik ilavesiz olarak yağı azaltılmış krem peynire eklenen probiyotik bakterilerin, 5 hafta boyunca 4°C’de depolamanın ardından canlılıkları incelenmiştir. Kapsüllenmiş probiyotik bakterilerin canlılıklarının kapsüllenmemişlere kıyasla daha yüksek olduğu, aynı zamanda prebiyotik katkılarının depolama sırasında canlı bakteri sayısının korunmasına yardımcı olduğu görülmüştür (Ningtyas ve ark., 2019). 2.9. İğde (Elaeagnus angustifolia L.) İğde (Elaeagnus angustifolia L.) Elaeagnaceae familyasına ait yaygın olarak oleaster, Rus zeytini, yabani zeytin veya gümüş meyvesi olarak bilinen, tıbbi özelliklerinden dolayı bitkisel ilaç olarak kullanılan bir bitkidir (Khadivi ve ark., 2020) (Şekil 2.3). Erişim Tarihi: 04.12.2022 Erişim Tarihi: 04.12.2022 Erişim Tarihi: 04.12.2022 (https://powo.science.kew.org/ https://www.yurtgazetesi.com.tr https://jiovi.com/products/russi taxon/urn:lsid:ipni.org:names: /yasam/igde-tozu-nedir-igde- an_olive_seeds 323646-1) tozu-ne-ise-yarar-igde-tozunun- faydalari-nelerdir-h213933.html Şe kil 2.3. İğde (Elaeagnus angustifolia L.) 19 İğde iyi bir esansiyel yağ asidi (özellikle palmitoleik, palmitik ve linoleik yağ asitleri), vitamin (özellikle A, C ve E) ve mineral kaynağı olan, aynı zamanda karotenoid, flavonoid ve diğer biyoaktif bileşenlerce (sitosterol, kardiyak glikozit, terpen, alkoloid, polisakkarit, triterpenoid, kumarin, aminoasit, saponin, fitoen, tanen vb.) zengin olan bir meyvedir (Ishaq ve ark., 2015; Khan ve ark., 2016; Mortazavi-Derazkola ve ark., 2021; Okmen ve Turkcan, 2014; Sabir ve ark., 2007; Saleh ve ark., 2018). İğdenin zengin biyoaktif bileşen içeriği sebebiyle çeşitli kısımları (çiçek, meyve, yaprak, kabuk, un, yağ ve sakız vb.) ile yapılan çalışmalarda; antioksidan, antiinflamatuar, antimutajenik, antitusif, antitümör, antiartritik, antimikrobiyal ve hepatoprotektif gibi terapötik etkileri keşfedilmiştir (Huojiaaihemaiti ve ark., 2022; Incilay, 2014; Ishaq ve ark., 2015; Khan ve ark., 2016; Liao ve ark., 2012; Mortazavi-Derazkola ve ark., 2021; Saleh ve ark., 2018; Sun ve ark., 2021). İğdenin kısımlarından olan un; spesifik tadı, yapısı, içerdiği lif, mineral ve fenolik bileşikler nedeniyle gıda ürünlerinde kullanılabilecek doğal bir üründür. Yapılan bir çalışmada iğdenin protein içeriği %3,74- 4,51, nişasta içeriği %36,86-43,18 ve diyet lif içeriği %20,67-23,55 aralığında bulunmuştur. Aynı zamanda bor, bakır, demir, mangan, çinko ve eser miktarda kobalt, krom, molibden ve selenyum içerdiği, palmitik, palmitoleik, stearik, oleik, linoleik, araşidonik, behenik ve lignoserik yağ asitlerini de içerdiği belirtilmiştir (Sahan ve ark., 2015). Omega 7 olarak bilinen palmitoleik yağ asidi iyi kolesterolü arttırırken, kötü kolesterolü ve trigliseriti düşürür, insülin direncini azaltmayı destekler. Bu nedenle iğdenin insülin direncini azaltmaya destek olacak bir gıda ürünü olduğu düşünülmektedir. 2.10. İğdenin Gıdalarda Kullanımı İğde ununun katkı malzemesi olarak kullanıldığı bir çalışmada farklı miktarlarda (%1, %2 ve %3) iğde unu ve iğde kabuğu eklenerek hazırlanan dondurmanın fiziksel ve kimyasal özellikleri araştırılmıştır (Çakmakçi ve ark., 2015). Kontrol grubuna göre protein ve yağ içeriğindeki azalma, kuru madde miktarında ise artma gözlenmiş, bu da iğde ihtiva eden dondurmanın besin değerinin arttığını göstermektedir. İğde unu ve kabuğu eklenmesinin dondurmanın fiziksel, kimyasal, duyusal ve antioksidan 20 özelliklerini önemli ölçüde etkilediği görülmüştür. Sonuç olarak, iğde ununun besin değeri ve lezzeti göz önüne alındığında, dondurmanın besin değerlerini ve antioksidan kapasitesini arttırmak, daha az şeker kullanımı ile insülin direncini düşürmek ve fizikokimyasal özelliklerini iyileştirmek için dondurma üretiminde uygun bir doğal katkı maddesi kaynağı olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. 21 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Tez kapsamında kullanılan cihazlar Yapılan çalışmalarda kullanılan cihazlar, cihazların özellikleri (Marka/Model) ve kullanım amaçları Çizelge 3.1’de verilmiştir. Çizelge 3.1. Tez kapsamında kullanılan cihazlar ve amaçları Cihaz Adı Marka/Model Kullanım Amacı Analitik terazi Mettler Toledo, İğde örneklerinin, iğde unu-probiyotik MS105DU bakteri kapsüllerinin ve çalışmalarda (± 0,00001 g) kullanılan kimyasalların tartımında kullanılmıştır. Çoklu manyetik MS-MP8, Çalışmalarda kullanılan çözeltilerin karıştırıcı Wisd hazırlanmasında kullanılmıştır. Evaporatör Bibby Scientific, İğde ekstraktalarının hazırlanmasında RE 100 kullanılmıştır. Su Banyosu Bibby Scientific, RE100B FTIR (Fourier Pelkin Elmer, İğde unu ve iğde unu-probiyotik Dönüşümlü Kızılötesi Spectrum 100 bakteri kapsüllerinin yapı analizlerinde Spektroskopisi) kullanılmıştır. Isıtıcılı manyetik Are, Çalışmalarda kullanılan çözeltilerin karıştırıcı Velp hazırlanmasında kullanılmıştır. İnkübatör Nüve Probiyotik bakterileri kültürlerinin S500 geliştirilmesi ve aktivasyonunda, Memmert mikrobiyolojik analizlerde INB 400 kullanılmıştır. 22 Çizelge 3.1. Tez kapsamında kullanılan cihazlar ve amaçları (devam) Cihaz Adı Marka/Model Kullanım Amacı Liyofilizatör Labconco, İğde unu-probiyotik bakteri FreeZone kapsüllerinin liyofilizasyonu için 2,5 Plus kullanılmıştır. Yüksek Performanslı Agilent İğde örneklerinin un, kabuk, çekirdek, Sıvı Kromatografisi- Technologies, yaprak ve çiçek kısımlarının fenolik Diod Serili Dedektör 1200 Series madde içeriğinin kalitatif ve kantitatif (HPLC-DAD) tayininde kullanılmıştır. Otoklav Nüve, Probiyotik bakteri enkapsülasyonu, SteamArt, mikrobiyolojik analizler ve OT 40L gastrointestinal analizlerde kullanılan tüm çözelti ve cam malzemelerin ve kaplama materyali olan iğde ununun sterilizasyonunda kullanılmıştır. pH metre Hanna, Çalışmalarda kullanılan tampon HI 221 çözeltilerin, gastro-intestinal ortamların hazırlanmasında ve iğde örneklerinin asidik hidroliz ekstraksiyonlarında kullanılmıştır. Saf Su Cihazı Elga Purelab, Çalışmalarda kullanılan saf ve ultra saf Option Q DV25 suyun temininde kullanılmıştır. Santrifüj Hermle, İğde ekstraktlarının spektroskopik ve Z 206 A kromatografik analizleri öncesinde ve iğde unu-probiyotik bakteri enkapsülasyonu aşamalarında kullanılmıştır. 23 Çizelge 3.1. Tez kapsamında kullanılan cihazlar ve amaçları (devam) Cihaz Adı Marka/Model Kullanım Amacı SEM (Taramalı Carl ZEISS, İğde unu-probiyotik bakteri Elektron Mikroskobu) EVO 40 kapsüllerinin morfolojik analizlerinde ve kapsüllerin boyutlarının belirlenmesinde kullanılmıştır. Sıcaklık programlı Mikrotest, İğde unu–probiyotik bakteri çalkalayıcı MCI 55 D enkapsülasyonunda ve gastrointestinal analizlerde kullanılmıştır. Ultrasonik Banyo ISOLAB, İğde örneklerinin ekstraksiyon 621.06.003 aşamalarında ve iğde unu-probiyotik bakteri enkapsülasyonu işlemlerinde kullanılmıştır. UV-GB Varian, İğde örneklerinin un, kabuk, çekirdek, Spektrofotometresi Cary 50 Conc yaprak ve çiçek kısımlarının toplam fenolik madde, toplam karotenoid, toplam flavonoid ve antioksidan kapasite değerlerinin belirlenmesinde kullanılmıştır. Vorteks Karıştırıcı Wisd, İğde ekstraktlarının spektroskopik VM-10 analizlerinde, serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analizlerinde ve fenolik bileşik standartlarının hazırlanmasında kullanılmıştır. 24 3.1.2. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar Çalışmalarda kullanılan kimyasallar Çizelge 3.2.’de verilmiştir. Çizelge 3.2. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar Kimyasal Adı Marka Katalog Numarası 1,5-difenilkarbazit Sigma-Aldrich 259225 2-hidroksisinamik asit Merck 800233 ABTS Sigma-Aldrich A1888 Alüminyum klorür Merck 101084 Asetik asit Merck 100063 Aseton Sigma-Aldrich 32201 Asetonitril ISOLAB 901037 Bakır (II) sülfat pentahidrat Sigma-Aldrich 209198 Bütanol Merck 101990 Demir (III) klorür Merck 803945 di-potasyum hidrojen fosfat Merck 105101 DPPH Sigma-Aldrich D9132 Ellagik asit Sigma-Aldrich E2250 Epigallokateşin Extrasynthese 0979 S Epigallokateşin gallat Extrasynthese 0981 S Epikateşin Extrasynthese 0977 S Epikateşin gallat Extrasynthese 0978 S Etanol Merck 100983 Etil asetat Merck 100868 Ferulik asit Sigma-Aldrich W518301 Folin-Ciocalteau reaktifi Sigma-Aldrich F9252 Formik asit Merck 100264 Fosforik asit Merck 100563 25 Çizelge 3.2. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar (devam) Kimyasal Adı Marka Katalog Numarası Galangin Extrasynthese 1114 S Gallik asit Sigma-Aldrich 27645 Hekzan Merck 104391 Hidroklorik asit Merck 100314 Isokuersitrin Sigma-Aldrich 17793 Kafeik asit Sigma-Aldrich C0625 Kalsiyum klorür Merck 1133055B Kamferol Sigma-Aldrich K0133 Kamferol-3-glikozit Cayman 25060 Kateşin Extrasynthese 0976 S Klorojenik asit Sigma-Aldrich C3878 Kuersetin Sigma-Aldrich Q4951 Lactobacillus acidophilus DSMZ DSM 20079 Lactobacillus casei DSMZ DSM 20011 Lesitin Tito E322 Luteolin Hwi Analytik GmbH 491-70-3 Metanol Merck 106007 Mirisetin Sigma-Aldrich 70050 MRS agar Biokar BK089HA MRS broth Biokar BK070HA Pankreatin Sigma-Aldrich P3292 Pepsin Sigma-Aldrich 77160 Peptonlu su Merck 107228 Petrol eteri Merck 101769 p-hidroksibenzoik asit Sigma-Aldrich 240141 p-kumarik asit Sigma-Aldrich C9008 Potasyum dihidrojen fosfat ISOLAB 960066 Potasyum dikromat Sigma-Aldrich 207802 26 Çizelge 3.2. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar (devam) Kimyasal Adı Marka Katalog Numarası Potasyum klorür Sigma-Aldrich 746436 Potasyum peroksidisülfat Merck 105091 Protokatekuik asit Sigma-Aldrich 08992 Resveratrol Sigma-Aldrich R5010 Rosmarinik asit Sigma-Aldrich 536954 Rutin Sigma-Aldrich R5143 Safra tuzu Edukim F0499 Sodyum asetat trihidrat Sigma-Aldrich S8625 Sodyum dihidrojen fosfat Merck 141677 Sodyum hidroksit Sigma-Aldrich 795429 Sodyum karbonat Sigma-Aldrich 791768 Sodyum klorür TEKKİM 170540 Sodyum nitrit Merck 106544 Sodyum potasyum tartarat tetrahidrat Sigma-Aldrich 217255 TPTZ Sigma-Aldrich T1253 Troloks Sigma-Aldrich 238813 Vanilik asit Merck 841025 27 3.1.3. Tez kapsamında kullanılan sarf malzemeler Çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler ve özellikleri Çizelge 3.3 ’te verilmiştir. Çizelge 3.3. Çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler Malzeme Adı Marka Katalog Numarası Özellikleri AnaeroGen Thermo Scientific AN0025A 2,5 L Otomatik pipet Eppendorf Z683809 10 – 100 µL Otomatik pipet Eppendorf Z683825 100 – 1000 µL Otomatik pipet Eppendorf Z683833 500 – 5000 µL 3.1.4. Tez kapsamında kullanılan çözeltiler Toplam fenolik madde analizinde kullanılan çözeltilerin hazırlanması ∗ Lowry A çözeltisi: 4 g NaOH (1 M) ve 2 g Na2CO3 (%2; w/v) saf su ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. ∗ Lowry B çözeltisi: 1 g NaKC4H4O6 (%1; w/v) ve 0,5 g CuSO4 (%0,5; w/v) saf su ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. ∗ Lowry C çözeltisi: Lowry A ve Lowry B çözeltileri 50:1 (v/v) oranında karıştırılarak hazırlanmıştır. ∗ Folin-Ciocalteu çözeltisi: Stok Folin-Ciocalteu reaktifi (2N) saf su ile 1:3 oranında seyreltilerek hazırlanmıştır. ∗ Gallik asit çözeltisi (1000 mg/L): 0,1 g gallik asit metanol ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol çözücüsü kullanılarak yapılmıştır. 28 Toplam flovanoid analizinde kullanılan çözeltilerin hazırlanması ∗ NaNO2 çözeltisi (%5; w/v): 5 g NaNO2 saf su ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. ∗ AlCl3 çözeltisi (%10; w/v): 10 g AlCl3 saf su ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. ∗ NaOH çözeltisi (1 M): 4 g NaOH saf su ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. ∗ Kateşin çözeltisi (1000 mg/L): 0,1 g kateşin metanol ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol çözücüsü kullanılarak yapılmıştır. ABTS yöntemi ile antioksidan kapasite analizinde kullanılan çözeltilerin hazırlanması ∗ Stok ABTS çözeltisi: 0,092 g ABTS (2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) reaktifi (7 mM) ve 0,01655 g K2S2O8 (2,45 mM) su ile çözülerek 25 mL hacme tamamlanmış ve 24 saat boyunca karanlık ortamda bekletilmiştir. ∗ ABTS radikal çözeltisi (ABTS*): 24 saat sonra stok ABTS çözeltisi su ile 10 kat seyreltilerek analizde kullanılan ABTS* çözeltisi hazırlanmıştır. ∗ Troloks çözeltisi (1000 mg/L): 0,1 g troloks metanol ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol çözücüsü kullanılarak yapılmıştır. CHROMAC yöntemi ile antioksidan kapasite analizinde kullanılan çözeltilerin hazırlanması ∗ HCl çözeltisi (10 N): 12,06 N’lik derişik HCl (%37; 1,19 g/mL) çözeltisinden 41,46 mL alınarak saf su ile 50 mL’lik 10 N HCl çözeltisi hazırlanmıştır. ∗ HCl çözeltisi (0,2 N): Hazırlanan 10 N HCl çözeltisinden 2 mL alınıp saf su ile 100 mL hacme tamamlanmıştır. ∗ KCl çözeltisi (0,2 N): 0,3725 g KCl toplam hacim 25 mL olacak şekilde saf su ile çözülerek hazırlanmıştır. 29 ∗ pH 1,2 tamponu: 25 mL 0,2 N KCl ve 42,5 mL 0,2 N HCl toplam hacim 100 mL olacak şekilde saf su ile hazırlanmıştır. Hazırlanan tampon çözeltinin pH’si 0,2 N HCl ile 1,2’ye ayarlanmıştır. ∗ pH 2,8 fosfat tamponu: 6,24 g NaH2PO4.2H2O bir miktar saf su ile çözülerek 0,68 mL %85’lik H3PO4 (1,685 g/cm3) ile asitlendirildi ve toplam hacim 1 L olacak şekilde saf su ile hazırlanmıştır. Hazırlanan tampon çözeltinin pH’si 0,2 N HCl ile 2,8’e ayarlanmıştır. ∗ K2Cr2O7 çözeltisi (50 mg/L): 5 mg K2Cr2O7 toplam hacim100 mL olacak şekilde pH 2,8 fosfat tamponu ile çözülerek hazırlanmıştır. ∗ 1,5-difenilkarbazit çözeltisi (4,1x10-3 M): 0,01 g 1,5-difenilkarbazit 7 mL aseton ve 3 mL pH 2,8 fosfat tamponu içerisinde çözülmüştür. ∗ 1,5-difenilkarbazit çözeltisi (3,4x10-4 M): Hazırlanan 4,1x10-3 M’lık 1,5- difenilkarbazit çözeltisinden 8,3 mL alınarak toplam hacim 100 mL olacak şekilde pH 2,8 tamponu ile analizde kullanılacak olan 1,5-difenilkarbazit çözeltisi hazırlanmıştır. ∗ Troloks çözeltisi (1000 mg/L): 0,1 g troloks metanol ile çözülüp hacmi 100 mL’ye tamamlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol çözücüsü kullanılarak yapılmıştır. DPPH yöntemi ile antioksidan kapasite analizinde kullanılan çözeltilerin hazırlanması ∗ DPPH reaktif çözeltisi (1 mM): 39,44 mg DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) metanol içerisinde çözülerek 100 mL’ye tamamlanmıştır. ∗ Troloks çözeltisi (1000 mg/L): 0,1 g troloks metanol ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol çözücüsü kullanılarak yapılmıştır. 30 FRAP yöntemi ile antioksidan kapasite analizinde kullanılan çözeltilerin hazırlanması ∗ CH3COONa çözeltisi (0,1 N): 1,36 g CH3COONa.3H2O saf su ile çözülerek 100 mL hacme tamamlanmıştır. ∗ CH3COOH çözeltisi (0,1N): Derişik CH3COOH (%95; 1,05 g/cm3) çözeltisinden 0,6 mL alınarak saf su ile toplam hacim 100 mL olacak şekilde çözülerek hazırlanmıştır. ∗ pH 3,6 asetat tampon çözeltisi: 92,5 mL 0,1 N CH3COOH ve 7,5 mL 0,1 N CH3COONa çözeltileri karıştırılarak hazırlanmıştır. Hazırlanan tampon çözeltinin pH’si 0,1 N HCl çözeltisi kullanılarak 3,6’ya ayarlanmıştır. ∗ HCl çözeltisi (10 N): 12,06 N’lik derişik HCl (%37; 1,19 g/mL) çözeltisinden 82,92 mL alınarak saf su ile 100 mL’ye tamamlanmıştır. ∗ HCl çözeltisi (40 mM): 10 N HCl çözeltisinde 2 mL alınarak toplam hacim 500 mL olacak şekilde saf su ile seyreltilmiştir. ∗ TPTZ çözeltisi (10 mM): Toplam hacim 100 mL olacak şekilde, 0,3 g 2,4,6-tris(2- piridil)-s-triazin (TPTZ) 40 mM HCl içinde çözülerek hazırlanmıştır. ∗ FeCl3 çözeltisi (20 mM): 0,3 g FeCl3 toplam hacim 100 mL olacak şekilde saf su ile çözülmüştür. ∗ FRAP çözeltisi: pH 3,6 asetat tamponu, FeCl3 ve TPTZ çözeltilerinin 10:1:1 oranında karıştırılmıştır. ∗ Troloks çözeltisi (1000 mg/L): 0,1 g troloks metanol ile çözülüp 100 mL hacme tamamlanmıştır. Gerekli seyreltmeler metanol çözücüsü kullanılarak yapılmıştır. 31 Kromatografik analizler için kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması İğde örneklerinin fenolik bileşik içeriğinin kantitatif analizi için standart fenolik bileşiklerden 1 mg tartılıp toplam hacim 10 mL olacak şekilde metanolde çözülerek 100 mg/L’lik stok çözeltileri hazırlanmıştır. Fenolik standartların stok çözeltileri kullanılarak 1-20 mg/L derişim aralığında metanol ile seyreltmeler yapılarak kalibrasyon çözeltileri hazırlanmıştır. Gastro-intestinal analizler için simüle mide sıvısı (SGF) ve simüle bağırsak sıvısı (SIF) ortamlarının hazırlanması SGF ortamı; 1 g NaCl ve 1,6 g pepsin sterilize edilmiş saf su içerisinde çözülerek toplam hacim 500 mL’ye tamamlanmıştır. 0,2 N HCl yardımıyla pH 2,0 ± 0,2 ayarlanarak tek kullanımlık steril filtreden geçirilmiştir. SIF ortamı; 3,4 g KH2PO4 ve 38,5 mL 0,2 N NaOH sterilize edilmiş saf su içerisinde çözülmüştür. Hazırlanan çözeltiye 0,625 g pankreatin ve 1,5 g safra tuzu eklenerek çözelti hacmi 500 mL’ye tamamlanmıştır. Ortam pH’si 0,2 N NaOH ve 0,2 N HCl ile 7,0 ± 0,2’ye ayarlanarak tek kullanımlık steril filtreden geçirilmiştir. 32 3.2. Yöntem 3.2.1. İğde örneklerinin toplanması Türkiye’nin Nevşehir ilinin 3 lokasyonundan (1: 38°36'32''/34°74'32'', 2: 38°38'61''/34°73'99'', 3: 38°38'58''/34°74'00'') iğde (meyve, yaprak ve çiçek) örnekleri toplanmıştır. Toplanan örnekler laboratuvar koşullarında kurutulmuştur. İğde meyvesinin kabuğu, unsu kısmı ve çekirdeği ayrılarak kurutma işlemine devam edilmiştir. Daha sonra iğdenin tüm kısımları öğütücü yardımıyla küçük parçalara ayrılarak homojenize edilmiştir. Analizlerde kullanılana kadar -24°C’de muhafaza edilmiştir. 3.2.2. İğde örneklerinin ekstraksiyon işlemleri Spektroskopik ve kromatografik analizler için homojenize edilen iğde örneklerinin su, metanol, etanol, bütanol, etil asetat, aseton, hekzan ve petrol eteri olmak üzere 8 farklı çözücü kullanılarak ultrasonik destekli ekstraksiyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyon işlemleri çözücü ekstraksiyonu (Şekil 3.1) ve asidik hidroliz ekstraksiyonu (Şekil 3.2) olarak iki farklı şekilde gerçekleştirilmiştir. 33 X g örnek Y mL çözücü 45°C’de 60 dk Su, metanol, etanol Kalıntı 5 mL Ultrasonik destekli Ekstraktlar dışındaki ekstraktlar metanol ile ekstraksiyon yapıldı. süzüldü. evaporatörde uçuruldu. çözüldü. Şekil 3.1. İğde örneklerinin çözücü ekstraksiyonunun şematik gösterimi (X/Y değerleri: un için 2 g/20 mL, kabuk için 2 g/20 mL, çekirdek için 1 g/20 mL, çiçek için 0,1 g/10 mL, yaprak için 1 g/20 mL) 34 X g örnek Y mL çözücü 45°C’de 60 dk Ultrasonik destekli 0,02 N HCl ile 45°C’de 60 dk Ekstraktlar Ultrasonik destekli süzüldü. ekstraksiyon yapıldı. pH 2’ye ayarlandı. ekstraksiyon yapıldı. Kalıntı 5 mL Su, metanol, etanol metanol ile dışındaki ekstraktlar çözüldü. evaporatörde uçuruldu. Şekil 3.2. İğde örneklerinin asidik hidroliz ekstraksiyonunun şematik gösterimi (X/Y değerleri: un için 1 g/10 mL, kabuk için 1 g/10 mL, çekirdek için 1 g/10 mL, çiçek için 0,1 g/10 mL, yaprak için 0,5 g/10 mL) 35 3.2.3. Toplam fenolik madde analizi İğde ekstraklarının toplam fenolik madde analizi Folin-Ciocalteu yöntemi ile yapılmıştır (Karkar ve ark., 2021; Singleton ve ark., 1999). Toplam fenolik madde tayini çalışmalarında standart madde olarak gallik asit çözeltisi kullanılarak 0,1-60,0 ppm aralığında kalibrasyon grafiği çizilmiş en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Analiz tüplerine x mL örnek/standart, (2-x) mL saf su, 2,5 mL Lowry C çözeltisi ve 0,25 mL seyreltilmiş Folin-Ciocalteu reaktifi eklenerek karıştırılmıştır. Örnekler 30 dk karanlıkta bekletildikten sonra UV-GB spektrofotometresinde 750 nm’de absorbansları ölçülmüştür. Daha sonra doğru denklemi kullanılarak iğde örneklerinin toplam fenolik madde içeriği mg gallik asit eşdeğeri (GAE)/ g örnek olarak belirlenmiştir. 3.2.4. Toplam flavonoid analizi İğde ekstraklarının toplam flavonoid analizi (Low ve ark., 2015) çalışmalarında %80 metanol ile hazırlanmış kateşin çözeltisi standart olarak kullanılarak 0,3-50,0 ppm aralığında kalibrasyon grafiği çizilmiş, en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Analiz tüplerine 0,5 mL örnek/standart, 1,5 mL etanol, 0,1 mL %10’luk alüminyum klorür çözeltisi, 0,1 mL 1 M’lık sodyum asetat çözeltisi ve 2,8 mL saf su eklenerek tüpler karıştırılmıştır. Analiz tüpleri 30 dk boyunca karanlık ortamda bekletilerek UV-BB spektrofotometresinde 415 nm’de absorbansları ölçülmüştür. Daha sonra doğru denklemi kullanılarak iğde örneklerinin toplam flavonoid içeriği mg kateşin eşdeğeri (CE) /g örnek olarak belirlenmiştir. 3.2.5. Toplam karotenoid analizi İğde ekstratlarının toplam karotenoid içeriği için örneklerin UV-GB spektrofotometresi ile 450 nm’de absorbansları ölçülerek ve Eşitlik 3.1 yardımıyla molar derişimleri belirlenmiş ve sonuçlar mg β-karoten eşdeğeri (QE) /kg örnek olarak verilmiştir (Biehler ve ark., 2010; Nasir ve ark., 2017). 36 A C (M) = 450 ×F (3.1) ε x d C: derişim, A450: 450 nm’deki absorbans, F: seyrelme faktörü, d: ışık yolu (cm), ε: molar sönüm katsayısı (metanol için: 136400 L cm-1 mol-1, etanol için: 135800 L cm-1 mol-1) 3.2.6. ABTS yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ABTS yöntemi ile antioksidan kapasite tayini (Karkar ve ark., 2021; Re ve ark., 1999) çalışmalarında standart madde olarak troloks kullanılarak 0,5-5,0 ppm aralığında kalibrasyon grafiği çizilmiş, en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Analiz tüplerine x mL örnek/standart, (4-x) mL etanol ve 1 mL ABTS* reaktif çözeltisi eklenerek karıştırılmış, 6 dk sonra UV-GB spektrofotometresi ile 734 nm’de absorbansları ölçülmüştür (Aörnek). Örnek/standart içermeyen analiz tüplerine 4 mL etanol ve 1 mL ABTS* reaktif çözeltisi eklenerek aynı şekilde 6 dk sonra 734 nm’de absorbansları ölçülmüştür (Akör). Ölçümler sonucunda örnek/standartlar için % inhibisyon değerleri Eşitlik 3.2’ye göre hesaplanmıştır. Daha sonra doğru denklemi kullanılarak iğde örneklerinin antioksidan kapasite değerleri mg troloks eşdeğeri (TE) /g örnek olarak belirlenmiştir. Akör - A% İnhibisyon = örnek x100 (3.2) Akör 3.2.7. CHROMAC yöntemi ile antioksidan kapasite analizi CHROMAC yöntemi ile antioksidan kapasite tayini (Karkar ve ark., 2021) çalışmalarında standart madde olarak troloks kullanılarak 10,0-60,0 ppm aralığında kalibrasyon grafiği çizilmiş, en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Analiz tüplerine x mL (<0,50 mL) örnek/standart, 0,50-x mL saf su, 3,5 mL pH 2,8 fosfat tamponu, 0,50 mL potasyum dikromat çözeltisi eklenerek tüpler karıştırılmıştır. 1 dk bekletildikten sonra analiz tüplerine 0,50 mL 1,5-difenilkarbazit çözeltisi eklenerek karıştırılmış ve 50 dk karanlıkta bekletilmiştir. Süre sonunda UV-GB spektrofotometresi ile 540 nm’de 37 absorbans ölçümleri gerçekleştirilmiştir (Ageriye kalan). Kör numune analizi için analiz tüplerine 0,5 mL saf su, 3,5 mL pH 1,2 tamponu ve 0,50 mL potasyum dikromat çözeltisi eklenerek karıştırılmıştır. 1 dk bekletildikten sonra 0,50 mL 1,5-difenilkarbazit çözeltisi eklenerek karıştırılmış 50 dk karanlık ortamda bekletilmiş ve aynı şekilde 540 nm’de absorbans ölçümleri alınmıştır (Akör). Örnek/standartların absorbans değerleri (Aörnek) Eşitlik 3.3’e göre hesaplanmıştır. Aörnek = Akör – Ageriye kalan (3.3) Daha sonra doğru denklemi kullanılarak iğde örneklerinin antioksidan kapasite değerleri mg troloks eşdeğeri (TE) /g örnek olarak belirlenmiştir. Akör: Antioksidan içermeyen, tüm reaktif maddenin ve aşırı Cr+6’nın bulunduğu çözeltide, Cr+6 ve 1,5-difenilkarbazit bileşiğinin oluşturduğu yükseltgenme-indirgenme tepkimesi sonucu oluşan Cr+3-difenilkarbazon şelatının absorbans değeri, Ageriye kalan: Fenolik madde ile reaksiyon sonucu geriye kalan Cr+6 ve 1,5-difenilkarbazit oluşturduğu Cr+3- difenilkarbazon şelatının absorbans değeridir. 3.2.8. DPPH yöntemi ile antioksidan kapasite analizi DPPH antioksidan kapasite tayini (Şahin ve ark., 2012) çalışmalarında standart madde olarak troloks ile 0,3-5,0 ppm aralığında kalibrasyon grafiği çizilmiş, en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Analiz tüplerine x mL örnek/standart, (3- 0,18-x) mL metanol ve 0,18 mL 1 mM DPPH çözeltisi eklenerek karıştırılmıştır. Analiz tüpleri 30 dk boyunca karanlık ortamda bekletilerek UV-GB spektrofotometresi ile 515 nm’de absorbansları ölçülmüştür (Aörnek). Aynı şekilde örnek/standart içermeyen analiz tüplerine (3-0,18) mL metanol ve 0,18 mL 1 mM DPPH çözeltisi eklenerek 30 dk karanlıkta bekletilen analiz örneklerinin 515 nm’de absorbans ölçümleri alınmıştır (Akör). Ölçümlerden sonra örnek/standartların % inhibisyon değerleri Eşitlik 3.4’e göre hesaplanmıştır. 38 A - A % İnhibisyon = kör örnek x100 (3.4) Akör Daha sonra belirlenen doğru denklemi kullanılarak iğde örneklerinin antioksidan kapasite değerleri mg troloks eşdeğeri (TE) /g örnek olarak belirlenmiştir. 3.2.9. FRAP yöntemi ile antioksidan kapasite analizi Fe3+-TPTZ (ferriktripiridiltriazin) kompleksinin asidik ortamda antioksidanların varlığıyla Fe2+’ye indirgenmesine dayanan FRAP yöntemiyle antioksidan kapasite tayininde standart olarak troloks kullanılarak 0,1-15,0 ppm aralığında kalibrasyon grafiği çizilmiş, en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır (Benzie ve Strain, 1996; Karkar ve ark., 2021). Analiz tüplerine x mL (<0,25 mL) örnek/standart ve (3-x) mL FRAP reaktifi eklenerek 30 dk boyunca karanlık ortamda bekletildikten sonra örnek/standartların UV-GB spektrofotometresi ile 593 nm’de absorbansları alınmıştır. Daha sonra belirlenen doğru denklemi kullanılarak iğde örneklerinin antioksidan kapasite değerleri mg troloks eşdeğeri (TE) /g örnek olarak belirlenmiştir. 3.2.10. İğde ekstraktlarında bulunan fenolik bileşiklerin analizi İğde ekstraktlarında (un, kabuk, çekirdek, çiçek ve yaprak) bulunan fenolik maddelerin kantitatif tayinleri için yüksek performanslı sıvı kromatografisi-fotodiod serili dedektör cihazı (HPLC-DAD) kullanılmıştır. HPLC-DAD ile fenolik madde analizi için C18 (XBridge, 3,5 µm, 4,6 x 250 mm) kolonu ile enjeksiyon hacmi 10 µL, akış hızı ise 0,5 mL /dk olacak şekilde çalışılmıştır. Analiz sırasında %1’lik sulu formik asit ve asetonitrilden oluşan gradient hareketli faz programı uygulanmıştır (Çizelge 3.4) (Şahin ve ark., 2012). 39 Çizelge 3.4. HPLC-DAD gradient hareketli faz programı Süre Hareketli faz bileşimi (dk) %1’lik Formik asit Asetonitril 0 %90 %10 10 %87 %13 20 %58,5 %41,5 25 %30 %70 35 %90 %10 36 %90 %10 Fenolik bileşik standartları ve iğde ekstraktları Çizelge 3.4’te belirtilen çözücü programı kullanılarak HPLC-DAD cihazı ile analiz edilmiştir. Elde edilen kromatogramlar incelenerek iğde ekstraktlarının fenolik bileşik profili kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmiştir. 3.2.11. İğde (Elaeagnus angustifolia L.) ununun fizikokimyasal özelliklerinin belirlenmesi İğde (Elaeagnus angustifolia L.) ununun toplam yağ (AOAC 920.39 2005), toplam şeker (AOAC 968.28.1969/2000), toplam protein (AOAC 991.20 2005), toplam nişasta (GMMAM 1988), toplam karbohidrat (Cemeroğlu, B., Acar 1986), toplam diyet lif (AOAC 991.43 1994), nem (TS EN ISO 712 2012), kül (TS EN ISO 2171 2010), kuru madde ve titre edilebilir asitlik (TS 4500) içerikleri belirlenmiştir. 40 3.2.12. İğde (Elaeagnus angustifolia L.) ununun sterilizasyonu Enkapsülasyon işleminde kaplama materyali olarak kullanılacak olan iğde unu kullanılmadan önce sterilize edilmiştir. Bunun için iğde unu 121°C’de 1, 2, 3, 4 ve 5 dk boyunca sterilize edilerek her bir örneğin toplam fenolik madde, toplam yağ, toplam şeker, toplam protein, toplam nişasta ve toplam karbohidrat içerikleri belirlenmiştir. Sonuçlar istatistik olarak ANOVA ile değerlendirilerek iğde ununun optimum sterilizasyon süresi belirlenmiştir. 3.2.13. Probiyotik bakterinin geliştirilmesi ve aktive edilmesi Tez kapsamında probiyotik bakteri olarak Lactobacillus casei (DSM 20011) ve Lactobacillus acidophilus (DSM 20079) suşları seçilmiştir. Her iki bakterinin aktivasyonları için De Man Rogosa ve Sharpe (MRS) sıvı besiyeri kullanılmıştır. Tüm çalışmalarda MRS Broth sıvı besiyeri 121°C’de 15 dk sterilize edilerek kullanılmıştır. Şekil 3.3’te şematize edilen L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin aktive edilerek geliştirilmesi işlemleri mikrobiyolojik kabin içerisinde gerçekleştirilmiştir. 41 24 saat 1 mL Bakteri kültürü Vorteksle 37°C’de 24 saat 5 mL MRS Vorteksle 5 mL karıştırılarak anaerobik inkübasyona bırakılmıştır. Broth sıvı karıştırılarak MRS Broth çözülmüştür. besiyeri çözülmüştür. 1 mL 37°C’de 24 saat Geliştirilen bakteri anaerobik inkübasyona kültürleri 37°C’de 24 saat Vorteksle 20 mL bırakılmıştır. -24 °C’de depolanmıştır. anaerobik inkübasyona karıştırılarak bırakılmıştır. çözülmüştür. MRS Broth Şekil 3.3. L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin geliştirilmesi 24 saat 42 3.2.14. Probiyotik bakterinin iğde unu üzerine enkapsüle edilmesi Probiyotik bakterilerin iğde unu üzerine enkapsüle edilmesi emülsifikasyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Enkapsülasyon işleminde Şekil 3.3’te belirtildiği şekilde hazırlanan stok kültürler Şekil 3.4’te belirtilen şekilde enkapsülasyondan 24 saat önce aktive edilerek kullanılmıştır. Probiyotik bakterilerin yararlı etki gösterebilmeleri, insan vücuduna daha fazla sayıda alınması ve eklendikleri gıdaların üretimi ve depolama süresi boyunca canlı kalabilmeleri için bakteri yoğunluğunun 106-107 kob/mL veya daha fazla olması gereklidir (Gismondo ve ark., 1999). Bu nedenle aktive edilen probiyotik bakteri 25 mL (106-108 kob/mL) olacak şekilde ortama eklenmiştir. 1 mL Stok 25 mL Vorteksle 37°C’de 24 saat bakteri MRS Broth karıştırılarak anaerobik inkübasyona kültürü çözülmüştür. bırakılmıştır. Şekil 3.4. Probiyotik bakteri kültürlerinin aktive edilmesi Enkapsülasyon işleminde iğde unu 121°C’de, belirlenen optimum sürede iğde unu dışında kalan tüm malzeme ve çözeltiler 121°C’de 15 dk boyunca sterilize edilerek kullanılmıştır. İğde unu üzerine probiyotik bakterilerin enkapsülasyon prosedürü Şekil 3.5’te verilmiştir. 43 25 mL probiyotik bakteri Belirlenen optimum süre 2,5 mL lesitin (%2) boyunca optimum sıcaklıkta eklenmiştir. 100 rpm’de karıştırılmıştır. Örnekler dondurularak Örnekler 3000 rpm’de Çökelti (kapsüller) 10 mL Örnekler 3000 rpm’de 25°C’de 20 dk ultrasonik liyofilize edildi. 15 dk santrifüjlendi. CaCl2 (%0,7) içerisinde 15 dk santrifüjlendi. banyoda bekletilmiştir. 30 dk bekletildi. Şekil 3.5. İğde unu üzerine probiyotik bakterilerin enkapsülasyonu 44 Probiyotik bakterilerin iğde unu üzerine maksimum enkapsülasyon verimi için kemometrik yöntemlerden merkezi kompozit dizayn kullanılarak optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Karıştırma sıcaklığı (°C), karıştırma süresi (dk) ve iğde unu miktarı (%) önemli faktörler olarak seçilmiştir. Merkezi kompozit dizayn için kullanılan faktörler ve kodlanmış seviye değerleri Çizelge 3.5’te verilmektedir. Merkezi kompozit dizaynda faktörler ve 5 seviye aralığı belirlendikten sonra deney sayısı (N) hesaplanmıştır (Eşitlik 3.5). N = 2k + 2k + 1 + x0 (3.5) k, faktör sayısı ve x0, tekrarlanan deney sayısını ifade eder. Çalışmada beş seviyeli üç faktörlü merkezi kompozit dizayn uygulanmıştır. Formüldeki 2k full faktöriyel veya fraksiyonlu faktöriyel dizayndaki deney sayılarını, 2k star dizayn deney sayısını ve 1 ise orta seviyedeki deney sayısını gösterir. 2k’daki seviyeler (±1), 2k’dakiler (±α), 1’deki ise (0) dır. Optimizasyon çalışmaları için 20 deney (N=23+2.3+1+5=20) yapılmıştır. α değeri dairesel ve ortagonal dizayna göre farklı seviyeler almaktadır. Dairesel dizaynda α Eşitlik 3.6’ya göre hesaplanarak 1,68 olarak bulunmuştur. 4 α = ± �2k (3.6) Çizelge 3.5. Merkezi kompozit dizayn için faktörler ve kodlanmış seviye değerleri Kodlanmış seviyeler Faktörler -1,68 -1 0 1 1,68 Karıştırma sıcaklığı (oC) (x1) 22 25 30 35 38 Karıştırma süresi (dk) (x2) 69,6 90 120 150 170,4 İğde unu miktarı (%) (x3) 0,32 1,0 2,0 3,0 3,68 45 Kodlanmış seviye değerleri ile hazırlanan merkezi kompozit dizayn tablosunda her bir faktörün parabolik etkileri incelenebilmektedir (Çizelge 3.6). Çizelge 3.6’da verilen son altı deney orta seviyede tekrarlanan deneylerdir ve tekrarlanan deneylerin hatasının bulunmasını sağlar. Yapılan 20 deney için enkapsülasyon verimi hesaplanıp yanıt değerleri için Design Expert 7.0.0 (Stat-Ease inc. USA) programı kullanılarak ANOVA analizi gerçekleştirilmiştir. ANOVA analizi ile Eşitlik 3.7’deki ikinci dereceden denklem ile tahmini değerler ve üç faktör için optimum değerler hesaplanmıştır. 3 3 2 3 y = b 20+� bixi +� biixi +�� bijxixj (3.7) i=1 i=1 i=1 j=i+1 y, yanıt; b0, sabit terim; bi, doğrusal etkileşim sabiti; bii, parabolik etkileşim sabiti; bij, parametre etkileşim sabiti, xi ve xj bağımsız değişkenleri temsil etmektedir. 46 Çizelge 3.6. Merkezi kompozit dizayn tablosu Faktörler x1 x2 x3 Deney Karıştırma Karıştırma İğde unu sıcaklığı süresi miktarı (oC) (dk) (%) 1 25,00 90,0 0,50 2 35,00 90,0 0,50 3 25,00 150,0 0,50 4 35,00 150,0 0,50 5 25,00 90,0 1,50 6 35,00 90,0 1,50 7 25,00 150,0 1,50 8 35,00 150,0 1,50 9 22,00 120,0 1,00 10 38,00 120,0 1,00 11 30,00 69,6 1,00 12 30,00 170,4 1,00 13 30,00 120,0 0,16 14 30,00 120,0 1,84 15 30,00 120,0 1,00 16 30,00 120,0 1,00 17 30,00 120,0 1,00 18 30,00 120,0 1,00 19 30,00 120,0 1,00 20 30,00 120,0 1,00 47 3.2.15. Mikrobiyolojik analizler Serbest ve enkapsüle L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin mikrobiyolojik analizleri dökme plaka yöntemine göre gerçekleştirilmiştir. Kapsüllerin açılması için kapsüller 0,1 M fosfat tamponu (K2HPO4/KH2PO4; pH 7,0 ± 0,2) içerisinde 30 dk boyunca 5 dakikada bir vortekslenmiştir. Fizyolojik tuzlu su (FTS) (NaCl, %0,85; w/v) ile serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin 10-1-10-8 arası seri dilüsyonları hazırlanarak steril petri kaplarına mikrobiyolojik ekimleri gerçekleştirilmiştir. Besiyeri olarak MRS-Agar sıvı besiyeri kullanılmıştır. Şekil 3.6 ve Şekil 3.7’de verilen analiz şemalarına göre mikrobiyolojik analizleri gerçekleştirilen örneklerin kapsüllenmiş probiyotik bakteri gramı veya serbest probiyotik bakteri mililitresi başına koloni oluşturan birimleri (kob) belirlenmiştir (log kob /g-mL) (Tharmaraj ve Shah, 2003). L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin iğde unu üzerine enkapsüle edilmesi için Çizelge 3.6’da belirlenen çalışma koşulları ile her iki bakteri için 20 farklı koşulda enkapsülasyon işlemi uygulanmış ve Şekil 3.7’de belirtilen analiz şemasına göre enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin canlılıkları belirlenmiştir. Serbest ve enkapsüle edilen L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin mL ve g başına düşen canlı koloni sayıları kullanılarak Eşitlik 3.8’e göre enkapsülasyon verimleri hesaplanmıştır. Elde edilen enkapsülasyon verimleri kullanılarak Design Expert 7.0.0 (Stat-Ease inc. USA) programı ile ANOVA analizi gerçekleştirilmiş ve her iki bakterinin enkapsülasyonu için optimum koşullar belirlenmiştir. % Verim = Enkapsüle edilen probiyotik bakteri sayısı ( log kob/g) x 100 3.8 Serbest probiyotik bakteri sayısı ( log kob/mL) 48 10 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL Petri kaplarına besiyeri eklenerek karıştırılmıştır. 90 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL Aktive edilmiş FTS FTS FTS FTS FTS FTS FTS FTS probiyotik bakteri Besiyeri donduktan sonra petriler AnaeroGen paketler ile anaerojenik 72 saat sonra bakteri 37°C’de 72 saat anaerobik kavanozlara sayımları yapılmıştır. inkübasyona bırakılmıştır. yerleştirilmiştir. Şekil 3.6. Serbest probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analiz şeması 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 49 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 30 dk 5 dk aralıklarla vorteks ile 1 g enkapsüle 9 mL karıştırılmıştır. 90 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL 9 mL edilen pH 7 fosfat FTS FTS FTS FTS FTS FTS FTS FTS probiyotik tamponu bakteri 72 saat sonra 37°C’de 72 saat Petriler AnaeroGen paketler Petri kaplarına bakteri sayımları anaerobik inkübasyona ile anaerojenik kavanozlara besiyeri eklenerek yapılmıştır. bırakılmıştır. yerleştirilmiştir. karıştırılmıştır. Şekil 3.7. Enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analiz şeması 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 50 3.2.16. Serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin depolama süresince canlılıkları MRS Broth içerisinde aktive edilen serbest probiyotik bakteriler ve iğde unu ile enkapsüle edilen probiyotik bakteriler -24°C’de 1 ay boyunca depolanmıştır. Depolamanın 0, 7, 14, 21 ve 28. günleri serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analizleri gerçekleştirilmiştir. Serbest probiyotik bakteri için canlı hücre popülasyonu log kob/mL, enkapsüle edilen probiyotik bakteriler için canlı hücre popülasyonu log kob/g olarak belirlenmiştir. Depolama sürecinin bakteri canlılığına etkisi Eşitlik 3.9 yardımıyla belirlenmiştir. Canlılık kaybı (%)= başlangıç hücre popülasyonu-depolama sonrası hücre popülasyonu x 100 (3.9) başlangıç hücre popülasyonu 3.2.17. Serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerinin in-vitro gastrointestinal ortamdaki canlılıkları Serbest ve enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin simüle mide ve bağırsak ortamlarındaki canlıkları literatürdeki yöntemler modifiye edilerek incelenmiştir (Tipigil, 2015). Probiyotik bakterilerin simüle mide ortamındaki canlılıklarının incelenmesi Şekil 3.8a ve Şekil 3.8b, bağırsak ortamındaki canlılıklarının incelenmesi Şekil 3.9a ve Şekil 3.9b, ardışık olarak mide ve bağırsak ortamındaki canlılıkların incelenmesi Şekil 3.10a ve Şekil 3.10b’de verilen analiz şemalarına göre gerçekleştirilmiştir. 51 Peptonlu su ile mikrobiyolojik ekimleri gerçekleştirildi. 1 g 37°C’de Örnekler Kalıntı üzerine 30 dk boyunca 5 dk enkapsüle bakteri 30-60-90-120 dk 3000 rpm’de 15 dk 9 mL pH 7 tamponu aralıklarla vorteks ile 9 mL SGF boyunca 100 rpm’de santrifüjlendi. eklendi. karıştırıldı. karıştırıldı. Şekil 3.8a. Enkapsüle probiyotik bakterilerin SGF ortamında canlılıklarının incelenmesi 52 Peptonlu su ile mikrobiyolojik ekimleri gerçekleştirildi. 1 mL serbest bakteri 37°C’de 9 mL SGF 30-60-90-120 dk boyunca 100 rpm’de karıştırıldı. Şekil 3.8b. Serbest probiyotik bakterilerin SGF ortamında canlılıklarının incelenmesi 53 Peptonlu su ile mikrobiyolojik ekimleri gerçekleştirildi. 1 g 37°C’de Örnekler Kalıntı üzerine 30 dk boyunca 5 dk enkapsüle bakteri 30-60-90-120 dk 3000 rpm’de 15 dk 9 mL pH 7 tamponu aralıklarla vorteks ile 9 mL SIF boyunca 100 rpm’de santrifüjlendi. eklendi. karıştırıldı. karıştırıldı. Şekil 3.9a. Enkapsüle probiyotik bakterilerin SIF ortamında canlılıklarının incelenmesi 54 Peptonlu su ile mikrobiyolojik ekimleri gerçekleştirildi. 1 mL serbest bakteri 37°C’de 9 mL SIF 30-60-90-120 dk boyunca 100 rpm’de karıştırıldı. Şekil 3.9b. Serbest probiyotik bakterilerin SIF ortamında canlılıklarının incelenmesi 55 1 g 37°C’de 90 dk 0,02 N NaOH 10 mL 37°C’de 90-120 dk Örnekler enkapsüle bakteri 100 rpm’de İle pH 7’ye SIF 100 rpm’de 3000 rpm’de 15 dk 9 mL SGF karıştırıldı. ayarlandı. karıştırıldı. santrifüjlendi. Peptonlu su ile mikrobiyolojik ekimleri gerçekleştirildi. 30 dk boyunca 5 dk Kalıntı üzerine aralıklarla vorteks ile 9 mL pH 7 karıştırıldı. tamponu eklendi. Şekil 3.10a. Enkapsüle probiyotik bakterilerin SGF-SIF ortamında canlılıklarının incelenmesi 56 Peptonlu su ile mikrobiyolojik ekimleri gerçekleştirildi. 1 mL 37°C’de 90 dk 0,02 N NaOH 10 mL 37°C’de 90-120 dk serbest bakteri 100 rpm’de İle pH 7’ye SIF 100 rpm’de 9 mL SGF karıştırıldı. ayarlandı. karıştırıldı. Şekil 3.10b. Serbest probiyotik bakterilerin SGF-SIF ortamında canlılıklarının incelenmesi 57 3.2.18. Mikrokapsüllerin yüzey analizleri ve boyutlarının belirlenmesi 121°C’de 1 dk sterilize edilen iğde unu, L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakteri kullanılmadan ve kullanılarak enkapsülasyon işleminin uygulandığı örneklerin SEM ve boyut analizleri Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Mikroskobi Laboratuvarı’nda hizmet alımı şeklinde, FT-IR analizleri ise Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü’nde hizmet alımı şeklinde gerçekleştirilmiştir. 58 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. Spektroskopik Bulgular İğde örneklerinin un, kabuk, çekirdek, yaprak ve çiçek kısımlarının su, metanol, etanol, bütanol, etil asetat, aseton, hekzan ve petrol eteri çözücüleri ile ultrasonik destekli ekstraksiyon ile çözücü ekstraktları ve asidik hidroliz ekstraktları hazırlanmıştır. Hazırlanan ekstraktların toplam fenolik madde, toplam flavonoid, toplam karotenoid içeriği ve ABTS, CHROMAC, DPPH ve FRAP yöntemleri ile antioksidan özellikleri belirlenmiştir. Elde edilen veriler MİNİTAB 17.0 (Minitab Inc., Stage College, PA) istatistik programı kullanılarak tek yönlü ANOVA (çözücü ve asidik hidroliz ekstraktlarının her bir yöntem için ayrı ayrı olarak, p < 0,05) ile istatiksel olarak analiz edilmiştir. 4.1.1. Toplam fenolik madde içeriği İğde örneklerinin farklı çözücü ortamlarında ve farklı ekstraksiyon koşullarında yapılan toplam fenolik madde içerikleri arasında farklılıklar gözlemlenmiştir. İğde ununun çözücü ekstraksiyonlarında toplam fenolik madde içeriği 0,13 ± 0,01 - 24,57 ± 0,92 mg GAE /g örnek arasında değişirken asidik hidroliz ekstraktlarının sonuçları 18,01 ± 0,80 - 34,89 ± 0,14 mg GAE /g örnek arasında değişmektedir (Çizelge 4.1). İğde kabuğunun çözücü ekstraktlarının toplam fenolik madde içerikleri 0,37 ± 0,06 - 16,99 ± 0,98 mg GAE /g örnek arasındayken asidik hidroliz ekstraktlarının toplam fenolik madde içeriği 13,78 ± 0,46 - 36,16 ± 0,46 mg GAE /g örnek arasında değişmektedir (Çizelge 4.2). Çizelge 4.3’te gösterilen sonuçlara göre iğde çekirdeğinin çözücü ekstraktlarının toplam fenolik madde içeriği 1,12 ± 0,01 - 44,93 ± 1,34 mg GAE /g örnek, asidik hidroliz sonucu toplam fenolik madde içeriği 22,82 ± 0,50 - 158,73 ± 1,27 mg GAE /g örnektir. İğde çiçeği ve yaprağının çözücü ekstraktlarının toplam fenolik madde içeriği sırasıyla 2,36 ± 0,03 - 44,55 ± 1,34 mg GAE /g örnek ve 0,95 ± 0,04 - 34,12 ± 1,57 mg GAE /g örnek arasında değişirken asidik hidroliz sonrası değerler 36,79 ± 1,46 - 205,26 ± 3,61 mg GAE /g örnek ve 8,86 ± 0,32 - 77,49 ± 0,35 mg GAE /g örnek arasında değişmektedir 59 (Çizelgeler 4.4 ve 4.5). İğde örneklerinin çözücü ekstraktlarının toplam fenolik madde içerikleri, çözücü polaritesi arttıkça artmaktadır. En yüksek toplam fenolik madde içeriği su ekstraktlarında gözlenmiştir. Ayrıca asidik hidroliz sonrası belirlenen toplam fenolik madde içeriği çözücü ekstraktlarında belirlenen toplam fenolik madde içeriğinden yüksektir. Literatür incelendiğinde yapılan bir çalışmada Elaeagnus angustifolia L. bitkisinin yaprak, çiçek, meyve ve meyve kabuğunun metanol ekstraktlarının toplam fenolik madde içerikleri sırasıyla ortalama 1,07 µg GAE /g KA, 1,66 µg GAE /g KA, 2,96 µg GAE /g KA ve 1,85 µg GAE /g KA) olarak bulunmuştur (Incilay, 2014). Diğer bir çalışmada Elaeagnus umbellate meyvesinin su, metanol, aseton ve hekzan ekstraktlarındaki toplam fenolik madde içerikleri sırasıyla 20,0 ± 2,1, 18,6 ± 1,5, 18,2 ± 1,3 ve 16,3 ± 0,8 mg GAE /g iğde olarak belirlenmiş ve artan çözücü polaritesi ile toplam fenolik madde içeriklerinin arttığı görülmüştür (Ishaq ve ark., 2015). Ozen ve ark. (2017), yaptıkları çalışmada Elaeagnus umbellate Thunb.’un meyve ve yaprak kısımlarının farklı çözücü ortamlarında artan derişimlerde (50-500 µg /mL) ekstraktlarını hazırlayarak toplam fenolik madde içeriklerini belirlemişlerdir. Elde edilen sonuçlara göre, meyvenin su ve metanol ekstraktları ile yaprağın metanol, etanol ve aseton ekstraktlarının toplam fenolik madde içerikleri oldukça yüksek bulunmuştur. Elaeagnus kologa yaprağının petrol eteri, kloroform, metanol ve su ekstraktlarının toplam fenolik madde içerikleri sırasıyla 23,11 ± 0,31, 9,42 ± 0,43, 18,99 ± 0,24 ve 20,04 ± 0,09 mg katekol /g olarak belirlenmiştir (Merculieff ve ark. 2014). Elaeagnus latifolia Linn’in %70 metanol ile hazırlanan ekstraktının toplam fenolik madde içeriği 7,04 ± 0,27 mg GAE /100 g ekstrakt olarak bulunmuştur (Panja ve ark. 2014). Başka bir çalışmada, farklı genotiplerden toplanan Elaeagnus angustifolia L. meyvesinin kabuk ve unsu kısmının ekstraktlarındaki (%85 metanol) toplam fenolik madde içerikleri belirlenmiştir (Hassanzadeh ve Hassanpour, 2018). Elde edilen sonuçlara göre Elaeagnus angustifolia L. kabuğunun ve unsu kısmının toplam fenolik madde içeriği sırasıyla 262,36 ile 1179,04 mg GAE /100 g TA ve 250,55 ile 820,88 mg GAE /100 g TA aralığında bulunmuştur. Elaeagnus umbellate Thunb. Meyvesinin toplam fenolik madde içeriği 168,9 ve 258,1 mg GAE /100 g TA aralığında bulunmuş (Wang ve Fordham, 2007). Saboonchian ve ark. (2014), yaptıkları çalışma ile 60 Elaeagnus angustifolia L. ‘nın yaprak ve çiçeğinin metanol ekstraktlarının toplam fenolik madde içeriğini etanol ekstraktından daha yüksek bulmuşlar ve aynı zamanda yaprağın çiçekten çok daha yüksek fenolik madde içeriğine sahip olduğunu belirlemişlerdir. Eleagnus oldhamii Maxim. yaprağının metanol ekstraktının toplam fenolik madde içeriği 106,09 ± 3,83 µg kateşin /mg örnek olarak bulunmuştur (Liao ve ark., 2012). 4.1.2. CHROMAC yöntemi ile antioksidan kapasite analizi CHROMAC yöntemine göre belirlenen antioksidan kapasite sonuçları iğde unu çözücü ekstraktlarında 29,72 ± 1,86 ve 62,32 ± 1,20 mg TE /g örnek arasında, asidik hidroliz ekstraktlarında ise 64,83 ± 3,42 ve 122,07 ± 1,67 mg TE /g örnek aralığında belirlenmiştir (Çizelge 4.1). İğde kabuğu sonuçları ise çözücü ekstraktları için 35,00 ± 1,20 ve 57,90 ± 0,02 mg TE /g örnek, asidik hidroliz ekstraktları için 49,37 ± 3,56 ve 108,02 ± 2,32 mg TE /g örnek arasında değişiklik göstermektedir (Çizelge 4.2). İğde çekirdeğinin çözücü ekstraktlarının antioksidan kapasite sonuçları 24,70 ± 0,62 ve 100,11 ± 1,91 mg TE /g örnek aralığında bulunurken asidik hidroliz sonrası 93,02 ± 3,59 ve 336,94 ± 7,32 mg TE /g örnek aralığında bulunmuştur (Çizelge 4.3). İğde çiçeğinin Çizelge 4.4’te verilen antioksidan kapasite değerlerine göre çözücü ekstraktlarının 245,93 ± 4,88 ve 859,08 ± 9,35 mg TE /g örnek aralığında, asidik hidroliz ekstraktlarının ise 454,83 ± 23,69 ve 699,48 ± 14,33 mg TE /g örnek aralığında olduğu görülmektedir. İğde yaprağının antioksidan kapasite değerleri ise sırasıyla çözücü ekstraktları ve asidik hidroliz ekstraktlarının 74,84 ± 0,17 ile 196,96 ± 1,03 mg TE /g örnek ve 122,59 ± 2,40 ile 232,16 ± 0,19 mg TE /g örnek aralığında değişmektedir (Çizelge 4.5). 4.1.3. ABTS yöntemi ile antioksidan kapasite analizi ABTS yöntemi antioksidan kapasite değerleri iğde unu çözücü ekstraktlarının 0,89 ± 0,01 ile 30,99 ± 0,05 mg TE /g örnek, asidik hidroliz ekstraktlarının 3,04 ± 0,06 ile 22,43 ± 0,50 mg TE /g örnek aralığında (Çizelge 4.1); iğde kabuğu çözücü ekstraktlarının 1,60 ± 0,05 ile 23,30 ± 0,14 mg TE /g örnek, asidik hidroliz ekstraktlarının 4,76 ± 0,11 ile 19,85 ± 0,52 mg TE /g örnek aralığında (Çizelge 4.2); iğde çekirdeği çözücü ekstraktlarının 61 2,34 ± 0,03 ile 51,20 ± 0,26 mg TE /g örnek, asidik hidroliz ekstraktlarının 15,05 ± 0,35 ile 129,26 ± 0,10 mg TE /g örnek aralığında (Çizelge 4.3); iğde çiçeği çözücü ekstraktlarının 13,67 ± 0,11 ile 49,68 ± 0,51 mg TE /g örnek, asidik hidroliz ekstraktlarının 37,98 ± 0,48 ile 200,30 ± 2,43 mg TE /g örnek aralığında (Çizelge 4.4); iğde yaprağı çözücü ekstraktlarının ise 1,55 ± 0,06 ile 43,15 ± 0,57 mg TE /g örnek ve asidik hidroliz ekstraktlarının 7,66 ± 0,08 ile 119,73 ± 0,06 mg TE /g örnek aralığında (Çizelge 4.5) değişiklik gösterdiği tespit edilmiştir. İncilay (2014) yaptığı çalışmada iğde (Elaeagnus angustifolia L.) yaprağı, çiçeği, meyve ve meyve kabuğunun metanol ekstraktlarının antioksidan kapasite değerlerini sırasıyla 0,385 ± 0,027 ile 1,955 ± 0,000 µg TE /g, 0,623 ± 0,000 ile 1,689 ± 0,029 µg TE /g, 0,031±0,003 ile 4,642 ± 0,133 µg TE /g ve 0,434 ± 0,027 ile 1,651 ± 0,027 µg TE /g aralığında bulmuştur. Başka bir çalışmada Elaeagnus latifolia Linn. örneğinin antioksidan kapasite değeri 0,070 ± 0,003 µg TE/ mL ekstrakt olarak ölçülmüştür (Panja ve ark., 2014). Nazir ve ark. (2018) ise çalışmasında Elaeagnus umbellate Thunb. örneğinin metanol, hekzan, kloroform, etil asetat, bütanol ve sulu ekstraktlarının IC50 değerlerini sırasıyla 760 - 135 - 57 - 70 - 120 ve 1175 µg troloks /mL ekstrakt olarak bulmuştur. Diğer bir çalışmada, Elaeagnus umbellate Thunb. meyvesinin farklı genotiplerindeki ortalama antioksidan kapasite değerleri 20,3 ile 29,9 µmol TE /g örnek aralığında bulunmuştur (Wang ve Fordham, 2007). 4.1.4. FRAP yöntemi ile antioksidan kapasite analizi FRAP yöntemine göre iğde unu, iğde kabuğu, iğde çekirdeği, iğde çiçeği ve iğde yaprağını antioksidan kapasite değerleri sırasıyla çözücü ekstraktları için 0,43 ± 0,01 ile 15,10 ± 0,05 mg TE /g iğde unu, asidik hidroliz ekstraktları için 2,68 ± 0,09 ile 46,66 ± 1,85 mg TE /g iğde unu (Çizelge 4.1); çözücü ekstraktları için 0,45 ± 0,01 ile 2,12 ± 0,10 mg TE /g iğde kabuğu, asidik hidroliz ekstraktları için 1,85 ± 0,05 ile 16,77 ± 0,68 mg TE /g iğde kabuğu (Çizelge 4.2); çözücü ekstraktları için 1,32 ± 0,04 ile 47,99 ± 1,21 mg TE /g iğde çekirdeği, asidik hidroliz ekstraktları için 7,64 ± 0,38 ile 336,12 ± 0,83 mg TE /g iğde çekirdeği (Çizelge 4.3); çözücü ekstraktları için 4,93 ± 0,10 ile 20,62 ± 1,19 mg 62 TE /g iğde çiçeği, asidik hidroliz ekstraktları için 20,70 ± 1,22 ile 146,40 ± 1,17 mg TE /g iğde çiçeği (Çizelge 4.4) ve çözücü ekstraktları için 1,08 ± 0,01 ile 21,68 ± 0,66 mg TE /g iğde yaprağı, asidik hidroliz ekstraktları için 5,82 ± 0,28 ile 98,45 ± 1,19 mg TE /g iğde yaprağı (Çizelge 4.5) aralığında bulunmuştur. Farklı genotiplere sahip Elaeagnus angustifolia L. meyvesinin kabuk ve unsu kısmının antioksidan kapasiteleri incelenmiş, iğde kabuğunun antioksidan kapasitesinin 57,00- 131,33 mg Fe2+ /100 g TA aralığında olduğu, unsu kısmının da en yüksek antioksidan kapasite değerinin 164,67 mg Fe2+ /100 g TA iken en düşük antioksidan kapasite değerinin ise 86,00 mg Fe2+ /100 g TA olduğu görülmüştür (Hassanzadeh ve Hassanpour, 2018). Faklı genotiplere sahip Elaeagnus angustifolia L. meyvesinin kabuk ve unsu kısmıyla yapılan başka bir çalışmada kabuktaki antioksidan kapasite 0,246 mM Fe2+ /mg örnek, unsu kısımdaki antioksidan kapasite 548 mM Fe2+ /mg örnek olarak bulunmuştur (Faramarz ve ark., 2015). 4.1.5. DPPH yöntemi ile antioksidan kapasite analizi DPPH yöntemi antioksidan kapasite değerleri (IC50) çözücü ekstraktları ve asidik hidroliz ekstraktları olarak sırasıyla; 11.60 ± 0.01 ile 24.08 ± 0.23 mg TE /g iğde unu ve 22.66 ± 0.01 ile 39.71 ± 0.60 mg TE /g iğde unu (Çizelge 4.1), 14.48 ± 0.08 ile 22.27 ± 0.99 mg TE /g iğde kabuğu ve 23.50 ± 0.04 ile 34.42 ± 0.90 mg TE /g iğde kabuğu (Çizelge 4.2), 23.72 ± 0.01 ile 38.28 ± 0.30 mg TE /g iğde çekirdeği ve 47.29 ± 0.08 ile 67.55 ± 1.00 mg TE /g iğde çekirdeği (Çizelge 4.3), 148.70 ± 6.73 ile 898.99 ± 16.36 mg TE /g iğde çiçeği ve 238.97 ± 0.03 ile 620.75 ± 6.86 mg TE /g iğde çiçeği (Çizelge 4.4), 24.00 ± 0.01 ile 364.96 ± 13.06 mg TE /g iğde yaprağı ve 47.54 ± 0.01 ile 78.10 ± 2.65 mg TE /g iğde yaprağı (Çizelge 4.5) aralığında bulunmuştur. Elaeagnus angustifolia L. ‘nın meyve, kabuk, çiçek ve yaprak ekstraktlarının incelendiği bir çalışmada, en yüksek antioksidan kapasite meyve ekstraktında (1,109 ile 4,450 µg TE /g KA arasında) ve en düşük antioksidan kapasite yaprak ekstraktında (0,713 ile 1,620 µg TE /g KA arasında) görülmüştür. Ayrıca çiçek ekstraktının antioksidan kapasitesi 0,541 63 ile 2,425 µg TE /g KA arasında değişirken, meyve kabuğu ekstraktının antioksidan kapasitesi 0,756 ile 2,063 µg TE /g KA arasında değişmektedir (Incilay 2014). Elaeagnus umbellate Thunb. türünün farklı çözücü (metanol, hekzan, kloroform, etil asetat, bütanol, su) ekstraktlarının antioksidan kapasite (IC50) değerleri 40 ve 1300 µg TE /mL ekstrakt aralığında bulunmuş. Çözücü polaritesi arttıkça antioksidan kapasite değerlerinin arttığı gözlenmiştir (Nazir ve ark., 2018). Hassanzadeh ve Hassanpour (2018) Elaeagnus angustifolia L. türünün kabuk ve unsu kısmın ortalama antioksidan kapasitesini sırasıyla %74,71 ve %53,76 olarak bulmuştur. Faramarz ve ark. (2015), Elaeagnus angustifolia L. türünün farklı genotiplerinde kabuk, un ve çekirdek ekstraktlarındaki ortalama antioksidan kapasitesinin (IC50) sırasıyla 86,95 mg Troloks /mL, 91,79 mg Troloks /mL ve 32,68 mg Troloks /mL olduğunu ortaya koyulmuştur. 4.1.6. Toplam flavonoid içeriği İğde ununun toplam flavonoid içeriği, çözücü ekstraktları için 0,40 ile 6,45 mg kateşin /g örnek, asidik hidroliz ekstraktları için 0,63 ile 6,63 mg kateşin /g örnek arasında bulunmuştur (Çizelge 4.1). En yüksek flavonoid içeriği, çözücü ekstraksiyonunun su ekstraktlarında ve asidik hidrolizin su ve etanol ekstraktlarında görülürken, en düşük flavonoid içeriği çözücü ekstraksiyonunun metanol ekstraktlarında ve asidik hidrolizin bütanol ve aseton ekstraktlarında tespit edildi. İğde kabuğunun flavonoid içeriği, çözücü ekstraktları için 0,16 ile 0,70 mg kateşin /g örnek ve asidik hidroliz ekstraktları için 0,12 ile 5,13 mg kateşin /g örnek aralığında bulunmuştur (Çizelge 4.2). En yüksek flavonoid içeriği çözücü ekstraktlarında bütanol, asidik hidroliz ekstraktlarında ise etanol ekstraktlarında bulunurken, her ikisi için de en az flavonoid içeriği su ekstraktlarında görülmüştür. İğde çekirdeğinin toplam flavonoid içeriği, çözücü ekstraktları için 1,57 ile 14,82 mg kateşin /g örnek ve asidik hidroliz ekstraktları için 2,01 ile 42,30 mg kateşin /g örnek arasında değişmektedir (Çizelge 4.3). En yüksek flavonoid içeriği çözücü ekstraktlarından metanol, asidik hidroliz ekstraktlarında ise bütanolde gözlenirken, en düşük flavonoid içerikleri her ikisi için de su ekstraktlarında tespit edilmiştir. İğde çiçeğinin toplam flavonoid içeriği, çözücü ekstraktları için 1,47 ile 13,17 mg kateşin /g örnek ve asidik hidroliz ekstraktları için 2,13 ile 21,79 mg kateşin /g örnek olarak 64 belirlenmiştir (Çizelge 4.4). Çözücü ekstraktlarından bütanol ve asidik hidroliz ekstraktlarından su ekstraktı en düşük flavonoid içeriği gösterirken, en yüksek flavonoid içeriği çözücü ekstraktlarından hekzan ve petrol eterinde, asidik hidroliz ekstraktlarından aseton ve hekzanda belirlendi. İğde yaprağının toplam flavonoid içeriği, çözücü ekstraktları için 0,33 ile 2,61 mg kateşin /g örnek ve asidik hidroliz ekstraktları için 0,26 ile 5,56 mg kateşin /g örnek arasında değişmektedir (Çizelge 4.5). Her ikisi için de en düşük flavonoid içeriği su ekstraktlarında, en yüksek flavonoid içeriği ise hekzan ekstraktlarında belirlenmiştir. Ishaq ve ark. (2015), Elaeagnus umbellata türünün farklı çözücü ekstraktlarının toplam flavonoid içeriğinin 1,5 ± 0,15 ile 3,8 ± 0,3 mg kuersetin /g örnek arasında değiştiğini bildirmiştir. En yüksek flavonoid içeriği su, metanol ve hekzan ekstraktlarında görülürken, aseton ekstraktlarının toplam flavonoid içeriği düşük bulunmuştur. Merculieff ve ark. (2014), Elaeagnus kologa yaprağının farklı çözücü ekstraktlarının toplam flavonoid içeriğinin 5,20 ± 0,06 ile 21,19 ± 0,45 mg rutin /g örnek arasında değiştiğini belirlemiştir. Sonuçlar, toplam flavonoid içeriğinin petrol eteri ekstraktında en yüksek, su ve metanol ekstraktlarında orta ve kloroform ekstraktında düşük olduğunu göstermektedir. Başka bir çalışmada, Elaeagnus latifolia Linn. meyvesinin %70 metanol ekstraktındaki toplam flavonoid içeriğinin 5,44 ± 0,16 mg kuersetin /100 g ekstrakt olduğu bildirilmiştir (Panja ve ark., 2014). Hassanzadeh ve Hassanpour (2018) sonuçlarına göre Elaeagnus angustifolia L. meyvesinin kabuğunda en yüksek toplam flavonoid içeriği 489,58 mg kateşin /100 g TA bulunurken ve en düşük toplam flavonoid içeriği 23,50 mg kateşin /100 g TA olarak bulunmuştur. Elaeagnus angustifolia L. meyvesinin toplam flavonoid içeriğinin ise 17,00 ile 318,75 ve mg kateşin /100 g TA arasında olduğu bildirilmiştir. Elaeagnus angustifolia L. meyvesi ile yapılan bir diğer çalışmada toplam flavonoid içeriği 1,35 mg kateşin /g örnek olarak bulunmuştur (Abizov ve ark. 2008). Faramarz ve ark. (2015) ise, Elaeagnus angustifolia L. kabuğunun ve meyvesinin toplam flavonoid içeriğinin sırasıyla 121,55 ve 148,52 mg kateşin /100 g TA olduğunu bildirmiştir. 65 4.1.7. Toplam karotenoid içeriği İğde ununun toplam karotenoid içeriği çözücü ekstraktları için 0,24 ile 6,62 mg β-karoten /g örnek ve asidik hidroliz ekstraktları için 1,82 ile 10,71 mg β-karoten /g örnek arasında belirlenmiştir (Çizelge 4.1). İğde kabuğunun çözücü ekstraktlarının toplam karotenoid içeriği 0,29 ile 7,80 mg β-karoten /g örnek aralığında bulunurken, iğde kabuğunun asidik hidroliz ekstraktlarının toplam karotenoid içeriği 2,33 ile 34,74 mg β-karoten /g örnek aralığında değiştiği bulunmuştur (Çizelge 4.2). İğde çekirdeğinin toplam karotenoid içeriği çözücü ekstraktları için 1,25 ile 10,69 mg β-karoten /g örnek ve asidik hidroliz ekstraktları için 3,16 ile 46,82 mg β-karoten /g örnek aralığında bulunmuştur (Çizelge 4.3). İğde yaprağının toplam karotenoid içeriği çözücü ekstraktları için 0,22 ile 77,57 mg β-karoten /g örnek arasında değişirken, asidik hidroliz ekstraktları için 14,12 ile 164,81 mg β-karoten /g örnek arasında bulunmuştur (Çizelge 4.4). İğde çiçeğinin çözücü ekstraktlarının toplam karotenoid içeriğinin 1,12 ile 7,80 mg β-karoten /g örnek arasında ve asidik hidroliz ekstraktlarının toplam karotenoid içeriği 25,88 ile 193,60 mg β-karoten /g örnek arasında değiştiği belirlenmiştir (Çizelge 4.5). Carradori ve ark. (2020), Elaeagnus angustifolia meyvelerinin ve yapraklarının toplam karotenoid içeriklerini sırasıyla 3,2 ± 0,6 ve 18,3 ± 2,5 µg β-karoten /g örnek olarak bulmuştur. 66 Genel olarak iğde örneklerinin antioksidan kapasitesinin belirlenmesinde 4 farklı analiz yöntemi kullanılmıştır. Kullanılan her bir analiz yöntemi farklı çalışma mekanizmasına sahip olduğu ve her yöntemin etki ettiği fenolik bileşikler farklı polaritede olduğu için örneklerin antioksidan kapasite değerleri de farklı bulunmuştur. Antioksidan kapasite verileri istatistiki olarak incelendiğinde farklı çözücü ekstraktlarının verilerinin çoğunlukla farklı gruplarda yer aldığı belirlenmiştir. Fenolik bileşiklerin analizinde ayrılmak istenen gruplara bağlı olarak pek çok farklı yöntem uygulanmaktadır. Bitkilerden fenolik bileşiklerin ekstraksiyonu matriks etkisine, bitkinin kimyasal doğasına, saklanma koşullarına, saklanma süresine ve ekstraksiyon yönteminin işleyişine bağlıdır. Fenolik bileşiklerin çözünürlüğü kullanılan çözücünün polaritesine bağlıdır. Bu nedenle tüm bitki bileşenleri için tek bir prosedürün uygulanması çok zordur. Uygun bir ekstraksiyon sistemi ile birlikte kullanıldığında çözelti sistemleri bitki hücre duvarını parçalar, böylece ekstrakte edilebilir bileşenlerin ortaya çıkması kolaylaşır (Akyüz, 2011; Atak ve Uslu, 2018). Bitkilerden elde edilen fenolik ekstraktlar çözücü sistemde çözünebilen farklı polaritedeki fenolik bileşiklerin bir karışımıdır. Pek çok fenolik bileşik doğal olarak glikozitleri veya esterleri şeklinde bulunduklarından numune hazırlama kısmında bazik, asidik veya enzimatik hidroliz işlemi serbest fenoliklerin izole edilebilmesi için gereklidir. Asidik ve bazik katalizler sayesinde çeşitli şeker grupları ile glikozidik bağ kuran flavonoidlerin aglikonlarına dönüşmeleri sağlanabilmektedir. Ayrıca kararsız yapıdaki dimerik polifenoller ve glikozidik fenolik asitlerin de aglikonlarına dönüşmeleri mümkündür. Böylece analizleri güç olan karmaşık yapıdaki polifenoller basit yapılarına dönüştürülerek kolaylıkla tanımlanabilmektedir (Akyüz, 2011). 67 Çizelge 4.1. İğde unu ekstraktlarının spektroskopik bulguları Çözücü Örnek TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 12,33 ± 21,21 ± 2,50 ± 5,03 ± 7,64 ± 15,04 ± 38,63 ± 69,88 ± 13,55 ± 28,77 ± 2,65 ± 1,91 ± 3,07 ± 1,82 ± 0,13n 0,49h,ı 0,08o 0,24j,k 0,29g 0,01d 0,31s,t 1,46o 0,09w 0,15e,f 0,77ı 0,01j 0,03t 0,01x W 2 20,1 ± 28,59 ± 12,03 ± 16,92 ± 25,03 ± 13,03 ± 51,57 ± 90,64 ± 11,60 ± 24,65 ± 6,45 ± 5,06 ± 6,61 ± 6,21 ± 0,97ı,j 1,89c 0,08f 0,06d 0,16b 0,12e 0,66q 4,81l 0,01x 0,01ı,j 0,03g 0,09f 0,05j 0,01k 3 24,57 ± 31,54 ± 15,10 ± 22,68 ± 30,99 ± 22,43 ± 62,32 ± 100,89 ± 11,87 ± 23,86 ± 4,47 ± 6,48 ± 6,62 ± 5,47 ± 0,92e 0,67b 0,05e 0,01c 0,05a 0,50c 1,20p 4,78g,h,ı,j 0,01x 0,01k,l 1,61g 0,05a,b 0,02j 0,03m 1 8,22 ± 15,67 ± 1,37 ± 3,63 ± 5,31 ± 5,71 ± 45,38 ± 75,43 ± 16,49 ± 28,91 ± 0,40 ± 0,77 ± 5,57 ± 1,56 ± 0,07o 0,40m 0,09p 0,14l,m,n 0,14j 0,13h 2,06r 1,57n 0,14u,v 0,20e 0,09u 0,02n,o,p,q,r,s 0,15l,m 0,02y M 2 8,45 ± 21,97 ± 1,36 ± 9,91 ± 2,86 ± 5,47 ± 45,52 ± 64,83 ± 15,90 ± 24,59 ± 0,47 ± 2,78 ± 3,02 ± 4,56 ± 0,22o 0,14g,h 0,02p 0,02g 0,31q 0,10h,ı,j 3,15r 3,42p 0,11v 0,03ı,j,k 0,05t,u 0,07ı 0,17t 0,01o,p 3 8,16 ± 26,71 ± 1,15 ± 23,17 ± 3,42 ± 4,75 ± 45,90 ± 94,00 ± 16,35 ± 23,17 ± 0,50 ± 5,83 ± 2,83 ± 2,79 ± 0,62o 0,24d 0,09p,q 0,61c 0,10p 0,21k,l 2,24r 0,89k,l 0,11u,v 0,01l,m 0,04s,t,u 0,21d,e 0,02u 0,02u 1 2,89 ± 19,24 ± 0,73 ± 14,41 ± 2,09 ± 4,58 ± 34,63 ± 67,00 ± 22,27 ± 25,23 ± 0,55 ± 2,76 ± 2,59 ± 11,08 ± 0,18p,q 0,60j,k 0,01p,q 0,26e 0,24r,s 0,20l,m,n 0,24s,t,u,v,w 0,99o,p 0,31n 0,06ı 0,01p,q,r,s,t,u 0,11ı 0,06v 0,01a E 2 3,09 ± 34,50 ± 0,72 ± 32,61 ± 1,91 ± 3,04 ± 35,99 ± 107,02 ± 19,37 ± 22,66 ± 0,48 ± 5,54 ± 2,32 ± 10,93 ± 0,07p,q 0,83a 0,03p,q 1,79b 0,02s,t 0,06q 0,71s,t,u,v 0,61c,d,e 0,33p 0,01m,n 0,03s,t,u 0,31e 0,01w 0,01b 3 3,49 ± 34,89 ± 0,72 ± 46,66 ± 1,67 ± 3,45 ± 39,17 ± 122,07 ± 15,78 ± 24,26 ± 0,59 ± 6,63 ± 2,28 ± 10,08 ± 0,18p 0,14a 0,02p,q 1,85a 0,06t,u,v 0,02p 1,26s 1,67a 0,26v 0,01j,k 0,05p,q,r,s,t,u 0,22a 0,06w 0,02d 1 2,89 ± 21,67 ± 0,86 ± 3,77 ± 1,65 ± 3,92 ± 31,92 ± 96,34 ± 18,59 ± 32,75 ± 1,08 ± 1,08 ± 5,69 ± 10,71 ± 0,03p,q 0,10g,h 0,04p,q 0,11l,m 0,02t,u,v 0,04o 1,38v,w,x 2,24j,k 0,22q 0,16d 0,02l,m 0,02l,m 0,03l 0,09c B 2 2,19 ± 23,70 ± 0,89 ± 2,68 ± 1,74 ± 5,29 ± 37,08 ± 101,51 ± 16,90 ± 32,51 ± 1,47 ± 0,81 ± 5,47 ± 7,73 ± 0,23q 1,20e,f 0,04p,q 0,09o 0,03t,u,v 0,06j 2,49s,t,u 3,10f,g,h,ı 0,17t,u 0,86d 0,03k 0,05m,n,o,p,q 0,09m 0,08g 3 2,78 ± 21,60 ± 0,92 ± 3,11 ± 1,73 ± 4,84 ± 38,43 ± 112,24 ± 18,35 ± 32,76 ± 1,18 ± 0,83 ± 5,48 ± 6,89 ± 0,01p,q 0,32g,h 0,02p,q 0,13m,n,o 0,03t,u,v 0,11k,l 0,47s,t 5,90b 0,39q,r 0,27d 0,05k,l 0,04m,n,o,p 0,07m 0,28ı *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), W: su, M: metanol, E: etanol, B: bütanol, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS- CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 68 Çizelge 4.1. İğde unu ekstraktlarının spektroskopik bulguları (devam) Çözücü Örnek TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 1,05 ± 21,65 ± 0,58 ± 3,89 ± 1,79 ± 5,40 ± 33,92 ± 101,56 ± 16,13 ± 26,69 ± 0,73 ± 0,63 ± 4,37 ± 7,16 ± 0,33r 0,37g,h 0,01p,q 0,26l,m 0,03t,u 0,19ı,j 0,70t,u,v,w,x 3,79f,g,h,ı 0,18v 0,12h 0,04o,p,q,r,s,t 0,01p,q,r,s,t,u 0,09q 0,08h A 2 0,66 ± 26,58 ± 0,56 ± 5,95 ± 2,28 ± 8,82 ± 32,64 ± 105,92 ± 18,48 ± 28,34 ± 0,50 ± 1,08 ± 2,48 ± 8,76 ± 0,02r 0,68d 0,02q 0,18ı 0,03r 0,09f 0,65u,v,w,x 2,25c,d,e,f 0,18q 0,06e,f,g 0,03r,s,t,u 0,05l,m 0,02v 0,07e 3 0,79 ± 28,96 ± 0,76 ± 8,24 ± 1,73 ± 7,46 ± 35,06 ± 77,53 ± 18,47 ± 26,06 ± 0,65 ± 3,28 ± 4,62 ± 5,58 ± 0,05r 0,09c 0,04p,q 0,06h 0,08t,u,v 0,08g 0,36s,t,u,v 1,50m,n 0,49q 0,08h 0,06p,q,r,s,t,u 0,16h 0,06o 0,28l,m 1 0,16 ± 18,01 ± 0,48 ± 5,95 ± 1,27 ± 4,33 ± 29,88 ± 80,75 ± 16,98 ± 27,68 ± 0,61 ± 2,57 ± 3,42 ± 3,88 ± 0,04r 0,80l 0,01q 0,15ı 0,07w,x 0,07n 0,51w,x 3,56m 0,04t,u 0,28g 0,05p,q,r,s,t,u 0,10ı 0,04s 0,06r H 2 0,41 ± 20,93 ± 0,43 ± 4,39 ± 1,81 ± 5,26 ± 31,52 ± 97,48 ± 18,28 ± 34,74 ± 0,51 ± 2,79 ± 4,86 ± 4,43 ± 0,01r 0,89h,ı 0,01q 0,07k,l 0,01s,t,u 0,25j 0,33v,w,x 3,02ı,j,k 0,32q,r 0,10c 0,06q,r,s,t,u 0,07ı 0,06n 0,18p,q 3 0,42 ± 18,34 ± 0,47 ± 2,87 ± 1,67 ± 4,83 ± 32,57 ± 99,53 ± 20,68 ± 32,93 ± 0,45 ± 2,11 ± 4,99 ± 4,39 ± 0,01r 0,79k,l 0,01q 0,08n,o 0,04t,u,v 0,08k,l 0,69u,v,w,x 3,64h,ı,j 0,86o 0,06d 0,01t,u 0,20j 0,04n 0,23q 1 0,54 ± 24,12 ± 0,71 ± 2,88 ± 1,49 ± 4,87 ± 31,53 ± 108,18 ± 17,40 ± 37,28 ± 0,74 ± 1,04 ± 1,72 ± 8,02 ± 0,02r 1,06e 0,03p,q 0,11n,o 0,06v,w 0,24k,l 0,86v,w,x 1,93b,c,d 0,53s,t 1,56b 0,02o,p,q,r,s,t 0,02l,m,n 0,04x 0,03f EA 2 0,59 ± 21,17 ± 0,58 ± 2,85 ± 1,53 ± 4,36 ± 29,72 ± 104,99 ± 17,72 ± 39,71 ± 0,80 ± 0,83 ± 0,76 ± 5,46 ± 0,01r 1,01h,ı 0,03p,q 0,04n,o 0,01u,v,w 0,03m,n 1,86x 4,07d,e,f,g 0,14r,s 0,60a 0,01m,n,o,p,q,r 0,02m,n,o,p 0,05z 0,32m 3 0,63 ± 21,42 ± 0,58 ± 5,43 ± 1,25 ± 4,92 ± 32,45 ± 110,09 ± 21,00 ± 28,10 ± 0,62 ± 1,02 ± 0,85 ± 6,95 ± 0,01r 0,50h 0,01p,q 0,25ı,j 0,01w,x 0,10k 1,53u,v,w,x 4,26b,c 0,10o 0,08f,g 0,04p,q,r,s,t,u 0,01l,m,n,o 0,01z 0,11ı 1 0,13 ± 22,66 ± 0,77 ± 2,88 ± 1,24 ± 4,62 ± 36,99 ± 103,07 ± 20,35 ± 35,14 ± 0,56 ± 6,32 ± 0,44 ± 5,47 ± 0,01r 0,21f,g 0,06p,q 0,10n,o 0,04w,x 0,02l,m 0,82s,t,u 2,26e,f,g,h 0,54o,p 0,11c 0,04p,q,r,s,t,u 0,09b,c 0,03aa 0,02m PE 2 0,14 ± 21,83 ± 0,45 ± 5,22 ± 1,16 ± 4,60 ± 35,28 ± 119,92 ± 22,08 ± 28,25 ± 0,40 ± 6,05 ± 0,24 ± 5,51 ± 0,01r 0,14g,h 0,01q 0,02ı,j 0,07x,y 0,19l,m,n 0,27s,t,u,v 0,49a 0,43n 0,06e,f,g 0,02u 0,07c,d 0,02ab 0,16m 3 0,14 ± 18,85 ± 0,51 ± 3,29 ± 0,89 ± 5,61 ± 38,67 ± 100,36 ± 24,08 ± 33,18 ± 0,44 ± 1,88 ± 0,58 ± 4,85 ± 0,01r 0,58k,l 0,09q 0,03m,n,o 0,01y 0,14h,ı 0,49s,t 3,90g,h,I,j 0,23j,k 0,13d 0,02t,u 0,32j 0,01aa 0,35n *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), A: aseton, H: hekzan, EA: etil asetat, PE: petrol eteri, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS-CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 69 Çizelge 4.2. İğde kabuğu ekstraktlarının spektroskopik bulguları Çözücü Örnek TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 12,85 ± 14,25 ± 1,91 ± 1,85 ± 3,49 ± 4,80 ± 46,60 ± 72,02 ± 17,07 ± 34,42 ± 0,30 ± 0,12 ± 7,80 ± 5,43 ± 0,40q 0,62o,p 0,03m,n,o,p 0,05n,o,p,q 0,10s 0,04q,r 1,76r,s 4,28k 0,15v,w,x 0,90a 0,01x 0,01y 0,03g 0,03l W 2 16,22 ± 18,41 ± 2,12 ± 4,09 ± 7,03 ± 7,29 ± 36,74 ± 65,18 ± 15,43 ± 34,24 ± 0,32 ± 0,54 ± 3,71 ± 2,33 ± 0,19n 0,74k,l 0,10m,n 0,20g 0,14l 0,04k,l 0,88w,x 3,45l 0,03y,z 0,91a 0,01w,x 0,01q,r,s,t 0,02q 0,02s 3 16,99 ± 17,72 ± 1,71 ± 3,38 ± 9,51 ± 6,46 ± 47,38 ± 69,91 ± 17,43 ± 29,19 ± 0,16 ± 0,36 ± 2,06 ± 3,77 ± 0,98m,n 0,12l,m 0,05o,p,q 0,05h,ı 0,03h 0,16m 0,61r,s 1,12k 0,17t,u,v,w 0,09h 0,01y 0,01v,w,x 0,04t 0,07q 1 8,41 ± 14,89 ± 1,48 ± 3,15 ± 2,56 ± 5,05 ± 42,28 ± 81,49 ± 15,77 ± 31,63 ± 0,51 ± 0,48 ± 1,77 ± 3,18 ± 0,06t 0,10o 0,07q 0,22ı,j,k 0,10u 0,06q 0,28t,u 0,78ı 0,08y 0,07e 0,01r,s,t 0,01t,u,v 0,03u,v 0,02r M 2 9,26 ± 18,82 ± 1,56 ± 5,09 ± 4,55 ± 5,82 ± 37,29 ± 54,78 ± 14,76 ± 24,86 ± 0,52 ± 1,54 ± 1,65 ± 4,58 ± 0,05s 0,49k 0,04p,q 0,21f 0,20r 0,11o 0,76w,x 0,54o,p 0,03z,aa 0,03k 0,02q,r,s,t 0,01ı 0,01v,w 0,01o 3 10,45 ± 21,27 ± 2,04 ± 6,46 ± 14,17 ± 6,23 ± 45,43 ± 82,74 ± 14,48 ± 25,99 ± 0,70 ± 1,87 ± 1,90 ± 6,06 ± 0,32r 0,18j 0,01m,n,o 0,44e 0,30f 0,06m,n 2,70s,t 3,56ı 0,08aa 0,04ı 0,02n,o,p 0,05h 0,01t,u 0,01j 1 3,22 ± 13,78 ± 0,73 ± 2,95 ± 7,43 ± 4,76 ± 42,62 ± 71,24 ± 18,02 ± 31,88 ± 0,35 ± 0,54 ± 1,11 ± 4,82 ± 0,10u 0,46p 0,02r,s,t 0,14j,k,l 0,21j,k 0,11q,r 2,01t,u 1,73k 0,12r,s,t 0,03d,e 0,01v,w,x 0,01q,r,s,t 0,02y 0,40n E 2 2,99 ± 26,50 ± 0,80 ± 15,11 ± 23,30 ± 16,94 ± 51,59 ± 49,37 ± 18,18 ± 23,50 ± 0,33 ± 4,81 ± 0,85 ± 5,82 ± 0,12u,v 0,15g 0,06r,s,t 0,24b 0,14a 0,45d 1,34p,q 3,51q,r 0,02q,r,s 0,04l 0,02w,x 0,17b 0,01z,aa 0,03k 3 2,77 ± 26,30 ± 0,66 ± 16,77 ± 22,91 ± 19,85 ± 57,90 ± 56,83 ± 18,61 ± 25,04 ± 0,37 ± 5,13 ± 0,88 ± 4,73 ± 0,01u,v,w 0,77g 0,01r,s,t 0,68a 0,02b 0,52c 0,02m,n,o 2,51n,o 0,34p,q,r 0,03j,k 0,01u,v,w,x 0,14a 0,04z 0,01n,o 1 2,20 ± 29,34 ± 0,73 ± 4,28 ± 1,60 ± 9,47 ± 36,00 ± 105,67 ± 19,44 ± 31,89 ± 0,65 ± 0,97 ± 1,60 ± 25,92 ± 0,03v,w,x,y 0,30e 0,04r,s,t 0,31g 0,01w 0,15h 1,25x 2,07b,c 0,42o 0,05d,e 0,02o,p,q 0,06k 0,06v,w 0,08c B 2 2,15 ± 30,31 ± 0,66 ± 5,11 ± 1,76 ± 7,03 ± 42,64 ± 108,02 ± 18,69 ± 31,62 ± 0,61 ± 1,36 ± 1,11 ± 32,09 ± 0,01w,x,y 0,90d 0,06r,s,t 0,33f 0,06v,w 0,21l 0,88t,u 2,32b 0,14p,q,r 0,01e 0,03p,q,r,s 0,02j 0,08y 0,14b 3 2,32 ± 29,53 ± 0,86 ± 5,04 ± 4,88 ± 6,17 ± 37,85 ± 100,03 ± 18,26 ± 31,60 ± 0,65 ± 1,24 ± 1,12 ± 34,74 ± 0,07v,w,x 0,40d,e 0,05r,s 0,08f 0,07q 0,32m,n 1,48w,x 0,69d,e,f 0,49q,r,s 0,38e 0,03o,p,q,r 0,03j 0,02y 0,06a *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), W: su, M: metanol, E: etanol, B: bütanol, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS- CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 70 Çizelge 4.2. İğde kabuğu ekstraktlarının spektroskopik bulguları (devamı) Çözücü Örnek TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 1,89 ± 24,60 ± 0,78 ± 4,21 ± 3,47 ± 7,48 ± 36,51 ± 97,64 ± 16,60 ± 29,07 ± 0,53 ± 0,92 ± 0,56 ± 16,25 ± 0,04x,y,z 0,96h 0,02r,s,t 0,33g 0,04s 0,21j,k 1,09w,x 2,60f,g 0,01x 0,28h 0,02q,r,s,t 0,02k,l 0,16ab,ac 0,06d A 2 1,79 ± 36,15 ± 0,98 ± 11,84 ± 2,60 ± 15,21 ± 36,19 ± 58,50 ± 16,77 ± 24,91 ± 0,47 ± 4,31 ± 1,47 ± 10,42 ± 0,03x,y,z,aa 0,93a 0,04r 0,43c 0,05u 0,13e 0,17x 0,28m,n 0,27w,x 0,09k 0,02t,u,v 0,26c 0,07w,x 0,36e 3 1,49 ± 36,16 ± 0,71 ± 9,86 ± 1,88 ± 10,76 ± 36,21 ± 59,11 ± 17,80 ± 25,67 ± 0,49 ± 3,87 ± 0,92 ± 9,43 ± 0,09y,z,aa,ab 0,49a 0,03r,s,t 0,08d 0,08v,w 0,07g 1,43x 0,88m,n 0,34s,t,u 0,02ı,j 0,02s,t,u,v 0,03d 0,05y,z 0,23f 1 0,40 ± 18,12 ± 0,45 ± 2,25 ± 1,95 ± 5,79 ± 35,00 ± 94,57 ± 18,70 ± 32,38 ± 0,32 ± 3,55 ± 1,50 ± 5,16 ± 0,01ac 0,47k,l 0,03t 0,06m 0,03v 0,20o,p 1,20x 1,69g,h 0,22p,q 0,30c,d 0,02w,x 0,22e 0,16w,x 0,24m H 2 0,37 ± 22,28 ± 0,64 ± 2,87 ± 3,09 ± 6,02 ± 40,16 ± 107,70 ± 22,27 ± 33,13 ± 0,43 ± 2,16 ± 0,31 ± 4,15 ± 0,06ac 0,32ı 0,01r,s,t 0,01k,l 0,12t 0,08n,o 2,54u,v,w 2,63b 0,99m 0,35b 0,02t,u,v,w,x 0,08g 0,02ad,ae 0,42p 3 0,37 ± 28,28 ± 0,64 ± 3,65 ± 1,60 ± 6,19 ± 41,81 ± 99,41 ± 20,81 ± 32,32 ± 0,50 ± 2,34 ± 0,52 ± 3,56 ± q 0,05ac 0,26f 0,05r,s,t 0,08h 0,05w 0,19m,n 0,77t,u,v 2,51e,f 0,71n 0,08c,d 0,01s,t,u 0,09f 0,02ac,ad 0,10 1 1,14 ± 29,57 ± 0,65 ± 4,11 ± 1,72 ± 7,00 ± 37,06 ± 103,32 ± 16,88 ± 31,22 ± 0,50 ± 0,82 ± 0,72 ± 6,85 ± 0,07z,aa,ab,ac 0,33d,e 0,04r,s,t 0,37g 0,06v,w 0,15l 2,76w,x 1,38c,d 0,45w,x 0,30e 0,03s,t 0,02l,m,n 0,02z,aa,ab,ac 0,08h EA 2 0,96 ± 32,28 ± 0,62 ± 4,39 ± 1,71 ± 7,62 ± 38,37 ± 92,39 ± 18,07 ± 30,27 ± 0,62 ± 0,82 ± 0,65 ± 5,72 ± 0,01aa,ab,ac 0,61b 0,04r,s,t 0,34g 0,11v,w 0,13ı,j 1,97v,w,x 0,03h 0,22q,r,s,t 0,27f 0,01p,q,r,s 0,02l,m,n 0,01aa,ab,ac 0,22k 3 0,76 ± 31,18 ± 0,64 ± 4,22 ± 1,79 ± 7,94 ± 37,64 ± 102,82 ± 17,70 ± 29,96 ± 0,55 ± 0,75 ± 0,29 ± 9,34 ± 0,06ab,ac 0,58c 0,02r,s,t 0,12g 0,06v,w 0,05ı 0,29w,x 0,44c,d,e 0,13s,t,u,v 0,08f,g 0,01q,r,s,t 0,03m,n,o 0,01ae 0,02f 1 0,53 ± 21,96 ± 0,45 ± 2,68 ± 1,76 ± 7,00 ± 76,04 ± 94,86 ± 18,10 ± 32,82 ± 0,44 ± 1,25 ± 1,50 ± 7,05 ± 0,04ac 0,40ı,j 0,01t 0,10l 0,04v,w 0,12l 0,74j 0,84g,h 0,15q,r,s,t 0,45b,c 0,01t,u,v,w 0,11j 0,17w,x 0,70h PE 2 0,40 ± 26,38 ± 0,55 ± 3,20 ± 1,64 ± 6,30 ± 61,20 ± 100,70 ± 18,99 ± 29,48 ± 0,88 ± 0,69 ± 0,76 ± 6,48 ± 0,02ac 0,53g 0,01s,t 0,29ı,j,k 0,03v,w 0,27m,n 1,57m 3,00d,e,f 0,30o,p 0,17g,h 0,03k,l,m 0,04n,o,p 0,02z,aa,ab 0,23ı 3 0,46 ± 26,86 ± 0,50 ± 3,31 ± 1,73 ± 5,47 ± 73,08 ± 117,86 ± 17,19 ± 31,72 ± 0,69 ± 1,62 ± 1,36 ± 5,77 ± 0,01ac 0,31g 0,04s,t 0,04h,ı,j 0,07v,w 0,04p 0,29j,k 1,63a 0,03u,v,w,x 0,34d,e 0,02n,o,p 0,09ı 0,15x 0,17k *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), A: aseton, H: hekzan, EA: etil asetat, PE: petrol eteri, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS-CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 71 Çizelge 4.3. İğde çekirdeği ekstraktlarının spektroskopik bulguları Çözücü Örnek TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 21,52 ± 22,82 ± 10,90 ± 7,64 ± 16,61 ± 15,05 ± 77,14 ± 125,01 ± 25,81 ± 67,55 ± 1,57 ± 2,01 ± 10,65 ± 5,69 ± 0,21r,s 0,50r 0,42xy 0,38z 0,15y 0,35z 0,47q,r 3,03j 0,02s 1,00a 0,03ad 0,09ad 0,55q 0,32v W 2 26,71 ± 36,88 ± 12,39 ± 10,68 ± 19,97 ± 32,05 ± 77,49 ± 111,95 ± 25,15 ± 53,55 ± 3,14 ± 2,05 ± 6,89 ± 3,16 ± 0,46p,q 0,75n 0,60w 0,18y 0,05w 0,33q 0,78p,q,r 0,18k 0,03t 0,33b 0,02ac 0,04ad 0,04u 0,03z 3 28,24 ± 36,70 ± 14,18 ± 15,36 ± 25,85 ± 31,19 ± 82,84 ± 127,22 ± 24,98 ± 53,91 ± 4,72 ± 3,66 ± 8,82 ± 8,50 ± 1,03p,q 0,92n 0,17v 0,23u,v 0,20s 0,81r 0,81o,p 3,86j 0,04t,u 0,08b 0,12aa,ab 0,16ac 1,21r 0,43s 1 32,97 ± 51,24 ± 26,34 ± 36,29 ± 36,27 ± 45,78 ± 73,78 ± 164,80 ± 23,90 ± 51,09 ± 12,07 ± 8,40 ± 8,34 ± 12,13 ± 0,42o 0,89l 1,01r 0,39p 0,09o 0,96m 2,30r,s 3,04h 0,02v,w 0,02c,d 0,33p,q 0,01t,u 0,07s,t 0,01o M 2 35,01 ± 71,53 ± 47,99 ± 51,44 ± 38,39 ± 56,66 ± 98,41 ± 185,51 ± 24,27 ± 49,98 ± 11,93 ± 14,18 ± 8,07 ± 11,22 ± 0,56n,o 0,32h 1,21l,m 1,31k 0,25n 0,50ı 3,88l,m 2,89f 0,02v,w 0,02e 0,17p,q 0,25m 0,01t 0,01p 3 44,93 ± 69,13 ± 40,77 ± 54,08 ± 51,20 ± 56,30 ± 100,11 ± 187,93 ± 24,08 ± 49,37 ± 14,82 ± 14,48 ± 10,69 ± 14,59 ± 1,34m 1,60h,ı 0,47o 1,71j 0,26k 0,13ı 1,91l 2,74f 0,01v,w 0,01f 0,11k,l,m 0,19l,m 0,01q 0,01m 1 16,73 ± 60,60 ± 12,23 ± 47,16 ± 18,43 ± 54,82 ± 33,62 ± 163,15 ± 24,91 ± 48,38 ± 9,22 ± 10,31 ± 3,07 ± 15,47 ± 0,46t 3,36k 0,90w,x 0,98m 0,12x 0,28j 1,52z 1,88h 0,02t,u 0,03g,h 0,11s,t 0,05r 0,06z,aa 0,01l E 2 19,79 ± 69,50 ± 14,76 ± 56,25 ± 21,98 ± 70,29 ± 45,58 ± 178,80 ± 23,72 ± 49,42 ± 9,54 ± 16,04 ± 4,16 ± 13,75 ± 0,90s 0,17h,ı 1,03u,v 0,98ı 0,32v 0,29g 0,69y 1,57g 0,01w 0,06e,f 0,59r,s 0,78ı,j 0,01y 0,02n 3 23,30 ± 58,83 ± 19,00 ± 51,99 ± 25,00 ± 58,76 ± 66,68 ± 168,39 ± 24,03 ± 48,61 ± 9,40 ± 14,61 ± 4,67 ± 21,41 ± 0,13r 1,77k 0,26t 0,20k 0,01t 0,92h 0,56t 5,68h 0,01v,w 0,31g 0,43s 0,53l,m 0,01x 0,01g 1 3,23 ± 68,17 ± 1,95 ± 45,03 ± 4,25 ± 50,30 ± 57,84 ± 110,22 ± 30,65 ± 48,37 ± 6,40 ± 15,60 ± 2,54 ± 16,52 ± 0,07u,v,w 0,91ı 0,13aa 0,37n 0,14ab,ac 0,43l 0,85v 0,54k 0,32q,r 0,01g,h 0,30v,w 0,54j,k 0,01ab 0,16j B 2 3,86 ± 131,55 ± 2,67 ± 155,05 ± 5,49 ± 125,98 ± 60,01 ± 246,45 ± 30,17 ± 47,74 ± 6,76 ± 42,30 ± 2,19 ± 19,96 ± 0,07u,v 2,88c 0,20aa 0,91f 0,28aa 0,42c 1,59u,v 1,12d 0,10r 0,01ı,j 0,01v 0,68a 0,06ac 0,03ı 3 4,14 ± 125,51 ± 2,68 ± 161,11 ± 4,81 ± 127,08 ± 66,97 ± 251,15 ± 30,77 ± 47,29 ± 6,15 ± 36,74 ± 2,79 ± 33,46 ± 0,15u 0,04d 0,15aa 0,25e 0,09aa,ab 0,32b 1,22t 3,93d 0,19p,q 0,08j 0,32v,w,x 0,97b 0,21aa,ab 0,05c *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), W: su, M: metanol, E: etanol, B: bütanol, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS- CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 72 Çizelge 4.3. İğde çekirdeği ekstraktlarının spektroskopik bulguları(devam) Çözücü Örnek TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 26,20 ± 131,57 ± 22,86 ± 313,66 ± 31,06 ± 128,87 ± 24,70 ± 311,30 ± 24,24 ± 47,64 ± 13,23 ± 12,35 ± 6,86 ± 23,86 ± 0,20q 1,74c 0,80s 0,06b 0,35r 0,01a 0,62aa 2,97c 0,01v,w 0,01ı,j 0,82n 0,55o,p 0,02u 0,02d A 2 21,21 ± 138,87 ± 16,17 ± 336,12 ± 23,38 ± 129,26 ± 66,62 ± 324,48 ± 24,46 ± 47,81 ± 7,69 ± 15,16 ± 5,09 ± 20,83 ± 0,83r,s 0,82b 1,08u 0,83a 0,13u 0,10a 0,96t 0,56b 0,04u,v 0,01h,ı,j 0,14u 0,40k,l 0,35w 0,01h 3 34,96 ± 158,73 ± 33,31 ± 271,01 ± 33,13 ± 129,09 ± 82,54 ± 336,94 ± 23,87 ± 47,69 ± 11,30 ± 11,66 ± 8,51 ± 23,41 ± 1,27n,o 1,27a 1,26q 0,62c 0,26p 0,01a 2,29o,p,q 7,32a 0,01v,w 0,01ı,j 0,12q 0,02p,q 0,01s 0,04e 1 1,20 ± 47,35 ± 1,50 ± 26,32 ± 3,74 ± 30,78 ± 51,55 ± 93,02 ± 31,66 ± 50,65 ± 5,05 ± 18,45 ± 1,51 ± 40,16 ± 0,03w 1,46m 0,08aa 0,98r 0,13ac,ad 0,24r 1,17w,x 3,59m,n 0,69o 0,33d 0,32y,z,aa 0,57g 0,16ad 0,02b H 2 1,59 ± 78,14 ± 1,48 ± 48,90 ± 4,17 ± 51,41 ± 70,08 ± 153,25 ± 33,25 ± 48,53 ± 3,98 ± 17,28 ± 1,25 ± 11,03 ± 0,07u,v,w 3,06g 0,05aa 0,42l 0,04ab,ac 0,22k 1,12s,t 1,27ı 0,81n 0,23g 0,13ac,ac 0,76h 0,30ad 0,06p 3 1,94 ± 60,32 ± 1,53 ± 44,54 ± 3,28 ± 54,12 ± 45,41 ± 124,00 ± 35,58 ± 49,89 ± 5,50 ± 19,61 ± 1,36 ± 23,33 ± 0,01u,v,w 1,28k 0,06aa 1,60n 0,11ad,ae 0,25j 0,06y 5,62j 0,62l 0,14e,f 0,03x,y,z,aa 0,28f 0,04ad 0,02e 1 1,57 ± 81,68 ± 1,50 ± 73,28 ± 4,65 ± 75,65 ± 54,61 ± 200,52 ± 31,26 ± 49,48 ± 5,08 ± 26,36 ± 2,75 ± 22,14 ± 0,21v,w 2,00f 0,07aa 0,38h 0,09ab 0,85f 1,04v,w 8,66e 0,60o,p 0,09e,f 0,04y,z,aa 1,23d 0,10ab 0,03f EA 2 2,24 ± 114,78 ± 1,80 ± 215,14 ± 3,77 ± 118,08 ± 59,60 ± 249,10 ± 33,59 ± 47,25 ± 5,85 ± 31,97 ± 2,06 ± 19,81 ± 0,34u,v,w 1,99e 0,06aa 1,48d 0,16ac,ad 0,86e 1,38u,v 1,04d 0,46n 0,03j 0,62w,x,y 0,17c 0,15ac 0,03ı 3 1,95 ± 112,42 ± 1,95 ± 129,15 ± 3,29 ± 123,26 ± 48,11 ± 245,65 ± 34,23 ± 47,93 ± 5,64 ± 21,91 ± 4,96 ± 20,62 ± 0,11u,v,w 3,06e 0,01aa 0,47g 0,05ad,ae 0,41d 0,72x,y 5,27d 0,13m 0,02h,ı 0,23w,x,y,z 0,43e 0,02w 0,02h 1 1,35 ± 29,09 ± 1,66 ± 15,71 ± 2,80 ± 20,01 ± 38,53 ± 94,05 ± 36,16 ± 51,46 5,07 ± 14,44 ± 2,07 ± 39,96 ± 0,01v,w 1,00p 0,12aa 0,45u 0,05ae,af 0,05w 1,37z 0,12m 0,33l ±0,20c 0,33y,z,aa 0,25l,m 0,02ac 0,03b PE 2 1,14 ± 64,99 ± 1,32 ± 46,79 ± 2,76 ± 56,28 ± 87,67 ± 126,57 ± 38,28 ± 48,37 ± 5,02 ± 16,78 ± 1,37 ± 16,16 ± 0,08w 0,80j 0,04aa 1,01m 0,07ae,af 0,50ı 0,03n,o 2,10j 0,30k 0,17g,h 0,20y,z,aa 0,08h,ı 0,01ad 0,01k 3 1,12 ± 44,93 ± 1,49 ± 40,27 ± 2,34 ± 36,24 ± 64,51 ± 102,07 ± 31,25 ± 50,95 ± 4,91 ± 13,17 ± 1,25 ± 46,82 ± 0,01w 1,89m 0,04aa 0,86o 0,03af 0,51o 0,83t,u 1,32l 0,32o,p 0,29c,d 0,05z,aa 0,57n,o 0,11ad 0,04a *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), A: aseton, H: hekzan, EA: etil asetat, PE: petrol eteri, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS-CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 73 Çizelge 4.4. İğde çiçeği ekstraktlarının spektroskopik bulguları Çözücü Örnek TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 36,96 ± 36,79 ± 13,59 ± 22,32 ± 34,15 ± 47,69 ± 255,24 ± 598,72 ± 148,70 ± 375,82 ± 2,66 ± 3,73 ± 82,83 ± 40,38 ± 1,94p 1,46p 0,94o 0,90n 0,47r 2,24n,o 1,72v 2,04e,f 6,73z 8,33e 0,04l,m,n,o,p 0,22j,k,l,m,n 0,81j 1,31r W 2 31,22 ± 37,34 ± 11,76 ± 20,70 ± 28,45 ± 45,73 ± 265,38 ± 618,34 ± 165,54 ± 620,75 ± 1,96 ± 3,43 ± 45,57 ± 132,74 ± 0,95q 1,39p 0,72o,p 1,22n 0,30s 0,75o 5,14n 1,87d,e 6,06y,z 6,86b 0,06n,o,p 0,41k,l,m,n,o 0,01p,q 12,78c 3 44,55 ± 38,00 ± 20,62 ± 21,87 ± 49,68 ± 56,02 ± 245,93 ± 603,98 ± 151,73 ± 439,79 ± 2,98 ± 2,13 ± 113,61 ± 68,61 ± 1,34n,o 1,30p 1,19n 0,27n 0,51n 1,10m 4,88v 1,83e,f 0,50z 3,69c 0,13k,l,m,n,o,p 0,14m,n,o,p 1,82f 14,37l 1 27,81 ± 74,35 ± 10,66 ± 53,61 ± 27,74 ± 65,88 ± 397,27 ± 571,77 ± 172,17 ± 300,52 ± 3,88 ± 3,91 ± 56,25 ± 25,88 ± 1,39r 0,86j 0,27p,q 1,76ı 0,38s,t 0,66l 16,17o,p 3,39g,h 0,82x,y 2,39h,ı,j 0,24j,k,l,m 0,30j,k,l,m 0,13n 0,09u M 2 17,99 ± 59,70 ± 9,05 ± 46,91 ± 34,20 ± 85,10 ± 406,84 ± 544,75 ± 184,88 ± 298,30 ± 3,30 ± 5,50 ± 36,53 ± 32,20 ± 0,33s 0,81l 0,02q,r,s 0,35j 0,50r 0,29h 13,19o 29,34ı,j 1,45w,x 2,88h,ı,j,k 0,22k,l,m,n,o,p 0,06ı,j 0,19s 0,08t 3 26,30 ± 66,46 ± 9,73 ± 47,58 ± 25,45 ± 57,14 ± 389,26 ± 559,40 ± 185,46 ± 301,13 ± 3,97 ± 3,38 ± 57,20 ± 27,17 ± 0,71r 2,03k 0,61p,q,r 0,01j 0,74t,u 0,98m 7,59o,p,q 16,92h,ı 1,17w,x 2,48h,ı,j 0,23j,k,l,m 0,15k,l,m,n,o,p 0,06n 0,01u 1 9,54 ± 79,68 ± 6,59 ± 61,65 ± 19,49 ± 86,53 ± 377,84 ± 531,00 ± 241,10 ± 280,87 ± 2,51 ± 4,53 ± 36,44 ± 41,73 ± 0,30t,u 0,65h,ı 0,02s,t,u,v 1,77g 0,63w,x 0,04h 5,88p,q,r,s 12,24j 0,78r,s 1,04k,l 0,10m,n,o,p 0,09j,k,l 0,61s 0,08r E 2 5,99 ± 78,37 ± 5,42 ± 55,42 ± 17,38 ± 113,22 ± 355,65 ± 523,86 ± 161,17 ± 275,80 ± 2,29 ± 6,56 ± 18,79 ± 42,20 ± 0,05v,w,x 1,31ı 0,26u,v 0,03h,ı 0,21x,y,z,aa 0,79d 22,98s,t 13,28j,k 4,97y,z 2,51l,m,n,o 0,11m,n,o,p 0,02h,ı 0,53v 0,10q,r 3 9,70 ± 82,19 ± 8,31 ± 55,63 ± 19,39 ± 84,33 ± 327,76 ± 582,64 ± 216,99 ± 295,12 ± 3,23 ± 4,70 ± 42,26 ± 39,04 ± 0,39t,u 1,75h 0,68q,r,s,t 2,49h,ı 0,34w,x,y 1,65h 13,05u 5,32f,g,h 8,75t,u 0,93ı,j,k 0,11k,l,m,n,o,p 0,09ı,j,k 0,53q,r 0,29r,s 1 3,43 ± 96,22 ± 5,41 ± 62,15 ± 13,67 ± 73,38 ± 436,94 ± 469,63 ± 186,96 ± 271,31 ± 1,49 ± 8,20 ± 74,65 ± 107,61 ± 0,13w,x,y 1,74f 0,05u,v 2,29g 0,11ab 1,46k 6,85n 8,90m 11,61v,w,x 2,33l,m,n,o 0,01p 0,61g,h 0,79k 0,26g B 2 4,22 ± 110,25 ± 5,68 ± 79,44 ± 17,51 ± 103,21 ± 442,91 ± 501,85 ± 198,40 ± 260,56 ± 1,47 ± 12,25 ± 51,52 ± 123,31 ± 0,08v,w,x,y 3,19e 0,08t,u,v 2,36d 0,72x,y,z,aa 4,69e 5,90n 27,86k,l 3,50v,w 1,73m,n,o,p,q 0,03p 1,01e,f 0,16o 1,11d,e 3 4,70 ± 137,54 ± 5,81 ± 87,82 ± 17,32 ± 100,09 ± 371,32 ± 467,90 ± 260,41 ± 248,56 ± 2,18 ± 14,63 ± 66,92 ± 110,10 ± 0,04v,w,x,y 3,08c 0,01t,u,v 1,48c 0,70x,y,z,aa 1,52f 0,42q,r,s 13,63m 48,81m,n,o,p,q 0,10q,r 0,08m,n,o,p 1,06c 0,19l 0,10f,g *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), W: su, M: metanol, E: etanol, B: bütanol, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS- CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 74 Çizelge 4.4. İğde çiçeği ekstraktlarının spektroskopik bulguları (devam) Çözücü Örnek TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 7,26 ± 187,75 ± 7,71 ± 129,91 ± 16,58 ± 177,82 ± 432,13 ± 591,56 ± 277,59 ± 253,06 ± 2,19 ± 14,34 ± 38,96 ± 120,00 ± 0,15u,v 3,42b 0,59r,s,t,u 3,30b 0,89z,aa 4,35b 1,22n 25,07f,g 11,31l,m 0,60p,q,r 0,10m,n,o,p 3,54c,d 1,79r,s 0,08e A 2 6,53 ± 204,39 ± 5,90 ± 146,40 ± 21,15 ± 200,30 ± 433,99 ± 583,86 ± 313,75 ± 238,97 ± 2,14 ± 21,79 ± 36,46 ± 193,60 ± 0,06u,v,w 4,75a 0,31t,u,v 1,17a 0,09v,w 2,43a 3,55n 7,77f,g,h 4,97g,h 0,03r,s 0,03m,n,o,p 1,64a 0,47s 0,20a 3 4,38 ± 205,26 ± 5,50 ± 131,06 ± 16,82 ± 164,35 ± 386,98 ± 546,09 ± 287,27 ± 252,24 ± 1,92 ± 13,55 ± 16,26 ± 172,45 ± 0,28v,w,x,y 3,61a 0,41u,v 4,00b 0,03y,z,aa 0,04c 2,30o,p,q 0,01ı,j 5,49j,k,l 0,58q,r 0,13n,o,p 0,55c,d,e 1,13v 0,52b 1 11,05 ± 60,62 ± 6,23 ± 39,72 ± 15,70 ± 56,07 ± 358,66 ± 588,48 ± 248,89 ± 311,03 ± 8,79 ± 12,02 ± 7,37 ± 62,80 ± 0,56t 2,58l 0,52t,u,v 1,09k 0,03aa,ab 0,92m 14,92s,t 20,99f,g 3,67q,r 2,35g,h,ı 0,70g 0,45e,f 0,08x 0,10m H 2 7,12 ± 55,18 ± 5,48 ± 36,04 ± 21,06 ± 48,13 ± 345,00 ± 599,86 ± 203,66 ± 327,99 ± 11,13 ± 19,63 ± 3,03 ± 76,40 ± 0,03u,v 2,53m 0,46u,v 0,24l 0,73v,w 0,93n,o 6,08t,u 1,44e,f 3,64u,v 3,89g 0,60f 1,60b 0,26y 1,08k 3 7,11 ± 65,24 ± 6,06 ± 40,53 ± 18,12 ± 76,11 ± 390,83 ± 563,60 ± 355,48 ± 374,10 ± 12,51 ± 21,57 ± 11,50 ± 76,47 ± 0,20u,v 0,98k 0,24t,u,v 1,12k 0,46x,y,z,aa 1,93j 2,50o,p,q 11,07h,ı 2,91f 8,25e 0,32d,e,f 3,21a 0,26w 0,23k 1 2,36 ± 121,87 ± 5,28 ± 74,32 ± 17,23 ± 84,58 ± 434,47 ± 477,27 ± 319,57 ± 258,88 ± 1,58 ± 12,76 ± 17,31 ± 92,01 ± 0,03y 1,87d 0,18u,v 1,80e 0,30x,y,z,aa 0,07h 3,71n 3,25l,m 5,21g 1,75o,p,q 0,04o,p 1,53c,d,e,f 0,11v 0,17ı EA 2 2,88 ± 92,31 ± 4,93 ± 57,74 ± 18,45 ± 80,87 ± 361,32 ± 454,83 ± 898,99 ± 259,40 ± 2,19 ± 18,40 ± 16,18 ± 126,61 ± 0,08x,y 2,96g 0,10v 1,76h 0,80x,y,z 1,94ı 5,47r,s,t 23,69m,n 16,36a 0,85n,o,p,q 0,06m,n,o,p 2,02b 0,35v 0,28d 3 3,09 ± 113,01 ± 5,04 ± 71,53 ± 19,41 ± 90,37 ± 383,47 ± 498,40 ± 225,46 ± 273,40 ± 2,71 ± 12,12 ± 46,80 ± 97,29 ± 0,07x,y 2,57e 0,02v 2,06f 0,37w,x 0,97g 7,25o,p,q,r 2,80l 1,79s,t 0,47l,m,n,o 0,07l,m,n,o,p 1,03e,f 1,79p 0,16h 1 4,29 ± 42,79 ± 5,48 ± 27,02 ± 23,50 ± 37,98 ± 859,08 ± 699,48 ± 158,78 ± 401,07 ± 12,01 ± 11,75 ± 2,27 ± 39,79 ± 0,10v,w,x,y 0,87o 0,06u,v 1,23m 0,07u,v 0,48q 9,35a 14,33c 0,72y,z 4,29d 0,18e,f 0,87e,f 0,09y 0,14r,s PE 2 7,28 ± 44,53 ± 5,50 ± 26,78 ± 16,11 ± 42,27 ± 835,40 ± 680,59 ± 199,59 ± 270,41 ± 13,17 ± 8,62 ± 1,95 ± 46,91 ± 0,36u,v 1,49n,o 0,13u,v 1,76m 0,27z,aa,ab 0,45p 1,82a 2,61c 3,89u,v,w 2,80l,m,n,o,p 0,24c,d,e 0,23g 0,26y 0,12p 3 5,85 ± 47,07 ± 6,41 ± 34,21 ± 17,11 ± 45,89 ± 745,83 ± 635,44 ± 276,40 ± 320,91 ± 8,67 ± 13,57 ± 1,12 ± 54,05 ± 0,43v,w,x 0,83n 0,21s,t,u,v 2,30l 0,60x,y,z,aa 0,33o 11,34b 25,28d 6,49l,m,n 8,07g 0,26g 1,59c,d,e 0,10y 0,35n,o *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), A: aseton, H: hekzan, EA: etil asetat, PE: petrol eteri, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS-CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 75 Çizelge 4.5. İğde yaprağı ekstraktlarının spektroskopik bulguları TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 32,18 ± 34,69 ± 14,67 ± 17,53 ± 37,92 ± 37,66 ± 95,45 ± 159,06 ± 24,74 ± 54,30 ± 0,64 ± 0,29 ± 62,24 ± 117,31 ± 0,42j,k 0,72ı 0,06o,p 0,40m 0,26l 0,23l 2,15s,t,u 3,26ı,j 0,03t 0,11l,m,n 0,01s,t,u 0,01x,y 0,39m 0,18c W 2 22,28 ± 27,95 ± 15,77 ± 12,56 ± 19,25 ± 16,56 ± 80,67 ± 157,18 ± 24,11 ± 68,56 ± 0,42 ± 0,32 ± 58,76 ± 66,64 ± 0,28m 0,91l 0,14n,o,p 0,03q 0,16r 0,02s 0,97v 6,64j 0,16t 1,05ı,j 0,01v,w,x 0,01w,x,y 0,14n 0,56j 3 34,12 ± 31,05 ± 21,68 ± 16,69 ± 43,15 ± 41,59 ± 103,70 ± 195,85 ± 24,00 ± 53,22 ± 0,58 ± 0,26 ± 77,57 ± 151,51 ± 1,57ı,j 1,07k 0,66k 0,55m,n 0,57j 0,18k 2,89p,q 1,18h 0,01t 0,30l,m,n 0,01t,u,v 0,01y 0,19g 0,70b 1 13,13 ± 58,36 ± 4,34 ± 80,93 ± 9,20 ± 84,12 ± 89,54 ± 195,79 ± 36,00 ± 47,54 ± 0,99 ± 0,71 ± 69,43 ± 32,87 ± 0,59n,o 2,34b 0,17t,u 1,85x 0,03d 0,11c 3,57u 5,31c 0,63r,s 0,01n,o,p 0,03o,p 0,06ı 0,79c 0,14aa M 2 8,92 ± 35,71 ± 3,32 ± 25,59 ± 5,07 ± 25,03 ± 107,60 ± 158,13 ± 38,48 ± 53,03 ± 0,79 ± 1,00 ± 44,15 ± 33,96 ± 0,35q 1,61h,ı 0,18u,v 0,80aa 0,07f 0,25p 1,72o,p 1,44j 0,16q,r,s 0,37l,m,n 0,04q,r,s 0,04w 0,18l 0,53z 3 12,49 ± 59,20 ± 4,23 ± 71,04 ± 6,96 ± 75,48 ± 94,98 ± 205,65 ± 35,33 ± 48,21 ± 0,99 ± 0,72 ± 56,74 ± 24,92 ± 0,70n,o,p 1,76b 0,05u 2,31z 0,13e 0,08d 4,23s,t,u 2,13b 1,21s 0,01n,o,p 0,01o,p 0,03p 0,30h 0,44ad 1 5,02 ± 50,03 ± 2,41 ± 55,52 ± 3,82 ± 69,57 ± 108,95 ± 168,16 ± 52,95 ± 47,98 ± 0,59 ± 1,07 ± 63,19 ± 52,94 ± 0,18r 1,06d 0,12v,w 0,17ad 0,11h 0,28f 3,09o,p 2,67g,h 3,88l,m,n 0,01n,o,p 0,01t,u,v 0,08k,l 0,20d 0,84r E 2 4,34 ± 33,80 ± 2,25 ± 25,86 ± 4,35 ± 27,40 ± 108,96 ± 147,67 ± 82,18 ± 52,94 ± 0,62 ± 1,28 ± 49,96 ± 164,81 ± 0,03r,s,t 0,51ı,j 0,04v,w 1,03ab,ac 0,17g 0,15o 6,57o,p 4,77k 1,62g 0,47l,m,n 0,01t,u 0,02s 0,34j 0,64a 3 4,67 ± 53,23 ± 2,20 ± 57,23 ± 4,83 ± 73,36 ± 111,26 ± 188,58 ± 43,38 ± 48,61 ± 0,88 ± 0,94 ± 70,48 ± 47,11 ± 0,16r,s 1,50c 0,03v,w 2,32aa,ab 0,30f 0,12e 3,53o 3,71d,e 1,01p,q,r 0,07n,o,p 0,02p,q,r 0,01h 0,27b 0,44u 1 2,43 ± 55,05 ± 1,50 ± 43,41 ± 3,69 ± 56,00 ± 100,20 ± 173,13 ± 140,80 ± 49,24 ± 0,33 ± 1,70 ± 58,96 ± 62,85 ± 0,01t,u,v,w 2,80c 0,02w 1,79g 0,01ad,ae 0,32g 1,20q,r,s 3,20g 3,29c 0,07n,o,p 0,01w,x,y 0,03m 0,13n 0,14l,m B 2 3,60 ± 37,52 ± 1,64 ± 19,97 ± 3,98 ± 20,74 ± 102,79 ± 165,72 ± 45,06 ± 57,89 ± 0,34 ± 2,63 ± 40,81 ± 47,99 ± 0,27r,s,t,u,v 1,22g,h 0,02w 1,51l 0,14ac,ad 0,40q 1,84p,q,r 7,14h 3,82o,p,q 1,25k,l,m 0,01w,x,y 0,18g,h 0,13y 0,62t 3 2,70 ± 49,90 ± 1,71 ± 42,37 ± 3,30 ± 51,06 ± 99,17 ± 165,11 ± 59,13 ± 49,84 ± 0,59 ± 3,20 ± 31,11 ± 41,94 ± 0,03s,t,u,v,w 1,95d 0,04w 1,30g 0,08ae,af 0,14h 3,27q,r,s 0,94h,ı 2,30k,l,m 0,03n,o,p 0,04t,u 0,09e 0,40ab 0,92x *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), W: su, M: metanol, E: etanol, B: bütanol, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS- CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 76 Çizelge 4.5. İğde yaprağı ekstraktlarının spektroskopik bulguları (devam) TPC FRAP ABTS CHROMAC DPPH TFC TCC Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 4,06 ± 77,49 ± 2,16 ± 93,07 ± 4,86 ± 113,54 ± 92,15 ± 232,16 ± 94,39 ± 47,61 ± 0,48 ± 2,54 ± 57,84 ± 86,63 ± 0,04r,s,t,u 0,35a 0,13v,w 0,59b 0,08aa 0,08b 3,73t,u 0,19a 7,97f 0,01n,o,p 0,02u,v,w 0,05h,ı,j 0,32o 0,52f A 2 3,90 ± 47,47 ± 2,50 ± 30,04 ± 4,99 ± 35,91 ± 96,51 ± 181,59 ± 97,13 ± 52,62 ± 0,54 ± 4,52 ± 44,88 ± 104,74 ± 0,16r,s,t,u,v 1,57e 0,12v,w 1,35ı 0,13aa 0,02m 2,06r,s,t 0,25f 7,96f 0,10m,n,o 0,01u,v 0,32c 0,39v 0,87d 3 4,11 ± 76,99 ± 2,09 ± 98,45 ± 3,71 ± 119,73 ± 91,06 ± 233,95 ± 130,54 ± 47,77 ± 0,59 ± 2,75 ± 54,61 ± 93,22 ± 0,12r,s,t,u 1,39a 0,07v,w 1,19a 0,07ad,ae 0,06a 4,17t,u 1,18a 9,29d 0,01n,o,p 0,02t,u,v 0,06g 0,13q 0,62e 1 1,22 ± 14,28 ± 1,12 ± 14,40 ± 2,63 ± 14,81 ± 95,81 ± 122,59 ± 172,43 ± 55,11 ± 2,52 ± 3,01 ± 5,37 ± 25,97 ± 0,04w 0,80n 0,03w 0,10p 0,08ag 0,48t 2,09s,t,u 2,40n 7,65b 1,03l,m,n 0,07h,ı,j 0,03f 0,40al 0,77ac H 2 1,08 ± 14,10 ± 1,15 ± 10,10 ± 3,18 ± 8,88 ± 105,36 ± 165,67 ± 49,08 ± 57,51 ± 2,61 ± 5,06 ± 6,15 ± 14,12 ± 0,03w 0,51n 0,01w 0,30r 0,07af 0,34x 0,83o,p,q 4,20h 0,86n,o,p 0,78l,m 0,17g,h,ı 0,08b 0,52ak 0,58aı 3 1,56 ± 13,19 ± 1,08 ± 10,18 ± 3,15 ± 14,09 ± 99,12 ± 131,85 ± 94,48 ± 60,39 ± 2,29 ± 5,56 ± 44,98 ± 18,45 ± 0,17w 0,23n,o 0,01w 0,52r 0,28af 0,22u 3,24q,r,s 4,77m 7,31f 1,45k,l 0,11k,l 0,03a 0,39v 2,00af 1 2,79 ± 40,61 ± 1,50 ± 29,02 ± 2,30 ± 30,43 ± 89,78 ± 123,56 ± 69,67 ± 51,98 ± 0,36 ± 2,33 ± 30,58 ± 58,77 ± 0,23s,t,u,v,w 0,18f 0,02w 0,68ı 0,06ag 0,77n 2,27u 2,26n 6,78h,ı,j 0,21m,n,o 0,02w,x,y 0,17k 0,46ab 0,72n EA 2 2,22 ± 37,99 ± 1,56 ± 16,01 ± 3,15 ± 14,78 ± 74,84 ± 149,64 ± 115,42 ± 65,48 ± 0,58 ± 2,33 ± 20,47 ± 63,68 ± 0,04u,v,w 1,91g 0,01w 0,44m,n,o 0,03af 0,07t 0,17v 5,96k 5,31e 2,23j,k 0,01t,u,v 0,09k 0,17ae 0,68k 3 1,89 ± 53,93 ± 1,81 ± 39,82 ± 3,74 ± 46,73 ± 80,15 ± 145,11 ± 77,21 ± 49,68 ± 0,70 ± 1,36 ± 17,13 ± 62,98 ± 0,15v,w 1,99c 0,11v,w 0,56h 0,15ad,ae 0,31ı 2,87v 1,50k,l 1,03g,h 0,11n,o,p 0,02s,t 0,01n 0,24ag 0,60k,l 1 1,20 ± 11,83 ± 1,11 ± 9,08 ± 1,74 ± 12,07 ± 193,34 ± 140,19 ± 364,96 ± 65,15 ± 2,43 ± 1,75 ± 8,36 ± 16,73 ± 0,06w 0,28o,p 0,01w 0,77r 0,19ah 0,28v 1,88c,d 2,43l 13,06a 1,80j,k 0,10j,k 0,04m 0,56aj 0,53ag PE 2 1,16 ± 10,81 ± 1,26 ± 5,82 ± 2,40 ± 7,66 ± 196,96 ± 168,27 ± 142,39 ± 75,14 ± 2,45 ± 2,12 ± 15,09 ± 14,65 ± 0,06w 0,36p,q 0,07w 0,28s,t 0,05ag 0,08y 1,03c 2,49g,h 6,36c 1,30g,h,ı 0,03ı,j,k 0,01l 0,34ah 0,59ah,aı 3 0,95 ± 8,86 ± 1,09 ± 7,24 ± 1,55 ± 10,61 ± 185,82 ± 130,45 ± 92,64 ± 78,10 ± 1,63 ± 3,40 ± 0,22 ± 16,87 ± 0,04w 0,32q 0,03w 0,17s 0,06ah 0,52w 0,09e,f 1,75m 1,18f 2,65g 0,12m 0,21d 0,05am 0,87ag *ortalama ± standart sapma (2 tekrar), A: aseton, H: hekzan, EA: etil asetat, PE: petrol eteri, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, TPC: mg GAE/g örnek, FRAP-ABTS-CHROMAC: mg TE/g örnek, DPPH: IC50 (mg TE/g örnek), TFC: mg QE/g örnek, TCC: mg BC/g örnek a-z: Küçük harfler bir yöntemdeki farklı ekstraktları arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p < 0,05). 77 4.2. Kromatografik Bulgular Fenolik bileşik standartlarının 1-20 ppm aralığında çözeltileri hazırlandıktan sonra HPLC-DAD ile kromatografik analizleri gerçekleştirilmiştir. Derişim-pik alanı grafikleri çizilerek, en küçük kareler yöntemi kullanılarak doğru denklemleri hesaplanmış ve her bir standart fenolik bileşiğin validasyon parametreleri (Çizelge 4.6) ve iki ekstraksiyon yöntemi için de geri kazanımları (Çizelge 4.7) belirlenmiştir. Aynı zamanda iğde ekstraktları HPLC-DAD ile analiz edilerek örnekler içerisinde bulunan fenolik bileşenler tespit edilmiştir. Kromatogramlardan belirlenen pik alanları standartların doğru denklemlerinde yerine konularak iğde ekstraktlarında bulunan fenolik maddeler mg /kg örnek cinsinden hesaplanmıştır. Analiz verileri MİNİTAB 17.0 (Minitab Inc., Stage College, PA) istatistik programı kullanılarak tek yönlü ANOVA (çözücü ve asidik hidroliz ekstraktlarının her bir fenolik bileşik için ayrı ayrı olarak, p < 0,05) ile istatistiki olarak analiz edilmiştir. 78 Çizelge 4.6. Standart fenolik bileşiklerin validasyon parametreleri Fenolik Dalga Alıkonma Çalışma Kalibrasyon Eşitliği Regresyon LOD LOQ Bileşikler Boyu zamanı Aralığı katsayısı (mg/L) (mg/L) (nm) (dk) (mg/L) (R2) CAT 280 17,163 1-20 y = 7,8378x + 1,4209 0,9989 0,0499 0,1664 ECAT 280 21,147 1-20 y = 17,2960x - 0,5017 0,9973 0,1187 0,3955 ECATG 280 24,060 1-20 y = 30,5643x + 6,1300 0,9900 0,0843 0,2809 EGCAT 280 13,571 1-20 y = 5,9032x - 19,7339 0,9962 0,2114 0,7046 EGCATG 280 20,837 1-20 y = 15,5587x + 0,0902 0,9988 0,1694 0,5647 2-HCA 280 28,989 1-20 y = 135,9691x - 112,6913 0,9971 0,0859 0,2862 CHL 320 16,934 1-20 y = 47,2881x - 3,3150 0,9939 0,0767 0,2558 CAF 320 21,071 1-20 y = 111,0825x - 8,8965 0,9982 0,0969 0,3230 PCA 320 24,160 1-20 y = 130,7578x + 11,8809 0,9997 0,0475 0,1584 FER 320 24,887 1-20 y = 107,5075x - 2,3255 0,9988 0,0344 0,1146 ROS 320 26,031 1-20 y = 50,4342x - 21,8842 0,9982 0,0614 0,2048 RES 320 27,698 1-20 y = 135,3697x - 24,0625 0,9992 0,0240 0,0800 LOD: Tespit Sınırı, LOQ: Tayin Sınırı, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, 2-HCA: 2- hidroksisinamik asit, CHL: klorojenik asit, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit, ROS: rosmarinik asit, RES: resveratrol. 79 Çizelge 4.6. Standart fenolik bileşiklerin validasyon parametreleri (devam) Fenolik Dalga Alıkonma Çalışma Kalibrasyon Eşitliği Regresyon LOD LOQ Bileşikler Boyu zamanı Aralığı katsayısı (mg/L) (mg/L) (nm) (dk) (mg/L) (R2) PRCA 260 12,104 1-20 y = 65,8074x + 5,7423 0,9997 0,1087 0,3623 VAN 260 20,659 1-20 y = 74,4184x + 5,6058 0,9988 0,0029 0,0095 PHBA 260 21,855 1-20 y = 139,0133x - 97,2374 0,9970 0,0340 0,1132 GA 280 7,840 1-20 y = 46,8968x + 10,7916 0,9986 0,0207 0,0691 ELA 360 23,320 1-20 y = 43,5766x - 15,7168 0,9993 0,0558 0,1860 QU 360 28,480 1-20 y = 78,2328x - 32,5901 0,9987 0,0481 0,1603 MYR 360 25,957 1-20 y = 64,3772x - 54,6879 0,9991 0,0879 0,2931 LU 360 28,013 1-20 y = 63,2430x - 1,2038 0,9997 0,0145 0,0482 KAM 360 29,679 1-20 y = 78,3573x - 16,9318 0,9983 0,0224 0,0747 KAMG 360 24,253 1-20 y = 57,6594x + 3,9351 0,9998 0,0087 0,0290 IQU 360 25,115 1-20 y = 45,4920x - 31,9872 0,9970 0,0110 0,0368 RU 360 22,818 1-20 y = 37,5017x - 4,9297 0,9976 0,0296 0,0987 LOD: Tespit Sınırı, LOQ: Tayin Sınırı, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, PHBA: p-hidroksibenzoik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, QU: kuersetin, MYR: mirisetin, LU: luteolin, KAM: kamferol, KAMG: kamferol-3-glikozit, IQU: izokuersitrin, RU: rutin. 80 80 Çizelge 4.7. Standart fenolik bileşiklerin geri kazanım çalışmaları Geri Kazanım (%) Fenolik Su Metanol Etanol Aseton Etil asetat Bütanol Petrol eteri Hekzan Bileşikler Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH CAT 87 101 49 96 68 92 45 7 55 40 46 20 35 62 37 2 ECAT 65 91 46 89 30 23 41 21 44 23 42 11 47 81 28 28 ECATG 90 98 70 95 33 44 39 11 32 39 35 53 38 24 34 19 EGCAT 79 117 89 119 99 102 84 70 92 83 93 79 80 73 109 64 EGCATG 79 74 62 89 55 102 76 24 56 31 95 17 62 11 63 52 2-HCA 106 109 104 107 106 108 103 98 100 98 98 100 99 94 97 99 CHL 110 109 62 92 38 104 46 36 57 47 44 43 44 37 39 45 CAF 82 83 75 86 75 80 68 46 78 41 72 57 69 57 68 54 PCA 80 76 68 80 73 73 68 31 69 57 68 58 67 48 67 45 FER 84 84 81 85 80 81 69 33 80 56 73 61 69 53 68 47 ROS 85 87 84 88 83 84 69 39 71 42 75 53 71 53 70 51 RES 85 86 80 89 86 86 79 37 77 28 79 31 79 28 78 35 SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, 2-HCA: 2- hidroksisinamik asit, CHL: klorojenik asit, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit, ROS: rosmarinik asit, RES: resveratrol 81 Çizelge 4.7. Standart fenolik bileşiklerin geri kazanım çalışmaları (devam) Geri Kazanım (%) Fenolik Su Metanol Etanol Aseton Etil asetat Bütanol Petrol eteri Hekzan Bileşikler Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı Ekstraktı SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH PRCA 86 87 72 91 59 86 66 64 71 63 66 67 62 65 66 67 VAN 112 113 104 117 105 112 99 87 104 84 97 90 96 93 95 91 PHBA 88 85 87 88 86 87 86 86 84 87 85 85 83 86 82 85 GA 105 96 64 105 8 51 57 54 56 24 52 48 51 51 47 53 ELA 78 83 81 85 79 84 63 47 77 71 79 71 62 29 59 46 QU 59 93 94 95 96 94 89 56 94 40 90 42 90 44 90 42 MYR 76 100 120 116 127 105 111 76 128 73 84 71 121 71 112 72 LU 98 99 108 109 104 108 105 83 98 16 101 97 93 92 93 95 KAM 88 92 100 99 97 98 99 70 94 23 94 64 88 63 87 82 KAMG 57 58 60 59 55 59 58 41 55 40 54 51 52 51 50 49 IQU 111 115 122 126 118 115 115 82 112 68 119 106 108 98 121 102 RU 85 87 80 91 86 87 81 53 82 37 80 71 76 68 80 66 SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, PHBA: p-hidroksibenzoik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, QU: kuersetin, MYR: mirisetin, LU: luteolin, KAM: kamferol, KAMG: kampferol-3-glikozit, IQU: izokuersitrin, RU: rutin. 82 İğde ununun (3 nolu örnek) metanol çözücüsü ile gerçekleştirilen asidik hidroliz ekstraktının 280 nm’de alınan kromatogramı Şekil 4.1’de verilmiştir. Tespit edilen fenolik maddelerin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyları 260, 280, 320 ve 360 nm’dir. 280 nm’de alınan kromatogramda pikler tam olarak ayrılmamış görülse de diğer dalga boylarında alınan kromatogramlarda pikler tam olarak ayrılmıştır. İğde ununun tüm ekstraktlarının fenolik bileşik profili Çizelge 4.8'de verilmiştir. İğde unu çözücü ortamları ve ekstraksiyon uygulamaları arasında büyük farklılıklar gözlenmiştir. İğde unu ekstraktlarında toplam 15 fenolik bileşik (kateşin, epikateşin, epikateşin gallat, epigallokateşin, kafeik asit, p-kumarik asit, ferulik asit, rosmarinik asit, resveratrol, protokatekuik asit, vanilik asit, p-hidroksibenzoik asit, gallik asit, kamferol glikozit ve rutin) tespit edilmiştir. Ana bileşenlerin kateşin ve kateşin türevleri (epikateşin, epikateşin gallat, epigallokateşin) olduğu görülmüştür. Su ve metanollü asidik hidroliz ekstraktlarındaki kateşin miktarı çözücü ekstraktlarına göre azalırken, diğer çözücü ekstraktlarında artmıştır. Aynı zamanda etil asetat, petrol eteri ve hekzan çözücü ekstraktlarında kateşin tespit edilmezken, asidik hidroliz ekstraktlarında tespit edilmiştir. Epikateşin metanol, etanol, petrol eteri ve hekzan çözücü ekstraktlarında görülmezken asidik hidroliz ekstraktlarında tespit edilmiştir. Genel olarak örneklerdeki epikateşin miktarının asidik hidroliz ile arttığı gözlenmiştir. Tüm çözücü ekstraktlarında epikateşin gallat tespit edilirken, asidik hidroliz yapıldığında sadece metanol ve etanol ekstraktlarında tespit edilmiştir. Örneklerdeki epikateşin gallat miktarı asidik hidroliz ile azalmıştır. Epigallokateşin sadece metanol ekstraktı ve 3 numaralı örneğin etanol ekstraktında tespit edilmiş, ancak asidik hidroliz uygulaması ile epigallokateşin miktarı artmış ve tüm asidik hidroliz ekstraktlarında tespit edilmiştir. Su, etanol ve aseton çözücülerinde asidik hidroliz sonrası gallik asit oluşumu ve miktarında artış gözlenmiştir. 83 350 300 250 200 3 150 100 5 8 50 7 1 2 4 6 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Zaman (dk) Şekil 4.1. İğde unu metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı (280 nm) (1: protokatekuik asit, 2: epigallokateşin, 3: kateşin, 4: epikateşin gallat, 5: epikateşin, 6: rutin, 6: p-kumarik asit, 7: epikateşin gallat, 8: ferulik asit) mAU 84 Çizelge 4.8. İğde unu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) CAT ECAT ECATG EGCAT CAF PCA FER Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 5970,11 5441,64 ±32,38v ±1,76x te te 1095,10 738,42 5,85 9,19 5,19 2,99 8,41 ±1,06e te te ±1,21p ±0,01g ±0,16b ±0,05b ±0,20g,h te ±0,54f W 2 9445,34 7128,57 198,91 210,90 1288,60 772,66 4,31 7,50 3,49 1,21 7,08 ±57,34l ±12,03s ±3,17h ±0,45g ±22,69d te te ±31,30p ±0,09j ±0,01f ±0,03e ±0,01r te ±0,03h 3 10068,96 8224,29 386,11 348,05 883,25 te te 676,37 te 7,73 1,92 1,37 6,20 ±40,52k ±37,72p ±2,38d ±3,30e ±61,01h ±5,59q ±0,03e ±0,01l ±0,01o,p,q te ±0,05j,k 1 8963,95 5584,42 te 147,86 930,94 te 1048,80 1026,40 5,17 8,82 4,68 2,88 te 8,96 ±150,67m ±16,92w ±1,97j ±10,11g ±4,46l ±10,59l ±0,04ı ±0,07c ±0,18c ±0,03h,ı ±0,10e M 2 13024,51 8379,49 te 153,99 1009,84 354,19 1784,93 1288,19 2,80 1,53 8,98 ±16,06j ±15,21o ±13,61j ±6,99f ±5,23t ±5,35a ±15,50g te te ±0,02ı ±0,03m,n te ±0,03e 3 13023,72 8077,15 172,19 1033,46 366,91 1555,59 1307,52 2,94 2,82 10,68 ±50,50j ±36,16q te ±2,03ı ±2,41f ±0,96s,t ±0,52b ±16,30g te te ±0,01g,h ±0,15ı te ±0,22d 1 2834,54 5997,22 te te 2201,00 779,70 te 1086,43 te 9,69 2,57 4,35 10,78 ±1,93ab ±33,42v ±0,94a ±0,82ı ±5,12j,k ±0,08a ±0,06j ±0,06d te ±0,11d E 2 3375,15 8779,78 te 813,11 2091,96 961,61 ±14,16aa ±2,17n ±3,98c ±13,99c ±6,98g te 1554,32 te 7,84 1,31 2,59 10,83 ±15,56b ±0,03e ±0,07p,q,r ±0,04j te ±0,17d 3 3748,25 8912,83 te 1091,87 2153,19 869,96 614,17 1435,24 8,63 1,32 3,01 11,28 ±61,60z ±20,63m ±0,72a ±54,90b ±2,60h ±5,87r ±4,47e te ±0,05d ±0,21o,p,q,r ±0,03g te ±0,28c 1 197,59 42148,32 20,98 390,34 1101,93 5,21 0,64 5,86 13,47 ±0,83ae ±5,83f ±0,17o te ±2,23r,s te te ±5,02ı,j te ±0,03ı ±0,01t ±0,03a te ±0,03a A 2 191,00 62864,83 te te 372,96 1508,45 0,25 3,41 13,27 ±0,65ae ±92,79d ±1,32s,t te te ±4,41c te te ±0,01v ±0,03e te ±0,01a 3 236,24 59455,18 29,98 382,48 ±2,29ae ±94,09e ±0,57n te ±2,36s,t te te 1293,46 ±42,83g te te 0,35 3,18 12,59 ±0,01v ±0,02f te ±0,02b *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit. a–ad: Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 85 Çizelge 4.8. İğde unu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) CAT ECAT ECATG EGCAT CAF PCA FER Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te 6894,34 10,58 248,30 454,23 te te 1348,05 te 5,46 1,64 1,95 5,81 ±20,13t ±0,24p ±1,99f ±0,02p ±37,16f ±0,05h ±0,03m ±0,01l te ±0,02l EA 2 te 80,79 te te 448,79 te te 1029,40 0,60 1,40 7,56 ±18,33q ±3,43p,q ±12,00l te te ±0,01t,u ±0,01o,p te ±0,03g 3 te 7525,71 8,51 te 509,96 te te 1501,42 te te 0,61 1,37 6,48 ±11,30r ±0,05p ±16,69l,m,n ±11,53c,d ±0,01t,u ±0,01o,p,q te ±0,01ı,j 1 940,80 14532,79 te 958,82 470,14 te te 693,19 te te 1,30 3,36 1,25 6,42 ±41,35ac,ad ±71,78ı ±10,09b ±2,69o,p ±1,81q ±0,01p,q,r ±0,02e ±0,02q ±0,01ı,j,k B 2 871,68 19095,32 69,75 545,68 ±12,45ad ±43,89h ±0,26m te ±5,07j,k te te 910,48 te te 0,49 1,26 4,80 ±4,90m ±0,01u ±0,02q,r te ±0,06p 3 1002,22 20724,20 138,24 475,86 868,02 0,65 1,44 5,30 ±32,79ac ±13,33g ±0,77k te ±0,05n,o,p te te ±4,68n te te ±0,02t ±0,04n,o te ±0,01o 1 te 4354,61 te 88,60 418,52 te te 1053,95 3,98 2,61 6,61 ±3,34y ±0,74l ±1,09q,r ±32,68k,l te ±0,04k te ±0,01j te ±0,01ı PE 2 te 5563,39 te te 501,77 ±1,56w ±2,63m,n,o te te 1467,08 1,20 6,17 ±34,67d,e te te te ±0,01r te ±0,01k 3 te 6777,40 te te 520,02 te te 1029,64 te te te 1,41 5,73 ±0,36u ±6,96k,l,m ±3,90l ±0,02n,o,p te ±0,01l,m 1 te 83769,19 198,08 545,05 814,65 3,81 2,10 5,42 ±63,36c te ±3,89h ±6,00j,k te te ±8,89o te ±0,01l te ±0,04k te ±0,01n,o H 2 te 12784,19 te 77,45 561,43 ±197,96a ±1,06m ±7,34j te te 1218,79 1,03 5,67 ±9,01h te te te ±0,02s te ±0,01l,m,n 3 te 123136,23 ±46,92b te te 541,07 1121,21 0,96 5,49 ±9,69j,k,l te te ±5,79ı te te te ±0,02s te ±0,01m,n,o *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit. a–ad: Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 86 Çizelge 4.8. İğde unu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ROS RES PRCA VAN PHBA GA KAMG RU Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te te 3,68 te 24,69 21,59 5,52 te te te 14,18 22,17 26,25 23,65 ±0,01l ±0,21a ±2,69b ±0,07c ±0,17l ±0,62k te te ±0,21c ±0,04e W 2 te te 3,77 te 11,38 10,83 te te te te te 27,70 ±0,06k,l ±0,05g ±0,20g,h,ı ±0,22j te te 14,32 17,50 ±0,23o ±0,17j 3 8,33 te 3,77 te 12,64 10,16 38,83 15,00 16,63 ±0,02d ±0,02k,l ±0,07f ±0,14h,ı te te te te te ±0,15h te te ±0,21n ±0,29k 1 10,74 te 4,15 te 24,42 24,85 26,86 24,58 ±0,23a ±0,04j ±1,57a ±0,29a te te te te te te te te ±0,52b ±0,08d M 2 8,84 te 3,80 te 13,87 12,61 te te te te te te te te 16,31 19,72 ±0,11c ±0,04k,l ±0,12e ±0,18f ±0,09l ±0,08h 3 9,10 te 3,86 10,51 11,18 15,93 17,57 ±0,18b ±0,04k te ±0,37g,h,ı ±0,07g,h te te te te te te te te ±0,13m ±0,12j 1 7,99 3,28 6,69 17,66 24,60 1,00 314,26 14,15 27,19 ±0,13e te ±0,01m ±0,04a ±0,05d ±0,40a ±0,07d,e te te te te ±1,94c te te ±0,27o ±0,21a E 2 7,86 te 3,26 6,18 8,52 12,93 0,56 te te te te 376,10 te te 8,76 20,86 ±0,08e ±0,02m ±0,03c ±0,19j ±0,05e,f ±0,03f,g ±1,64a ±0,08v ±0,04g 3 7,26 te 3,21 6,55 1,84 10,09 0,74 317,89 9,07 18,35 ±0,03f ±0,02m ±0,01b ±0,05n ±0,08ı ±0,03f te te te te ±0,53b te te ±0,06u,v ±0,09ı 1 2,31 te te 4,57 2,10 18,83 0,41 te te te te 79,17 te te 1,69 22,68 ±0,02j ±0,05h ±0,01n ±0,19c ±0,01g,h,ı ±0,05e ±0,01aa ±0,21f A 2 te te te te 1,64 10,87 0,19 47,46 72,68 1,13 16,71 ±0,03n ±0,02g,h,ı ±0,01ı te te te ±0,21g ±0,32f te te ±0,01ab ±0,16k 3 te te te 4,29 1,63 8,12 0,26 32,68 96,69 1,32 13,63 ±0,03ı ±0,04n ±0,14j,k ±0,02h,ı te te te ±0,50ı ±0,74d te te ±0,02ab ±0,07p *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, ROS: rosmarinik asit, RES: resveratrol, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, PHBA: p-hidroksibenzoik asit, GA: gallik asit, KAMG: kampferol-3-glikozit, RU: rutin. a–ad: Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 87 Çizelge 4.8. İğde unu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ROS RES PRCA VAN PHBA GA KAMG RU Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 3,02 te 1,12 5,55 6,84 18,70 1,15 3,09 ±0,01h ±0,01n ±0,12e ±0,09l ±0,32c ±0,02d te ±0,01a te te te te te te te EA 2 2,25 te 0,93 5,34 1,88 7,90 0,46 te 2,34 te te te te 0,80 te 18,41 ±0,02j,k ±0,01o ±0,20g ±0,05n ±0,02j,k ±0,01g,h ±0,01c ±0,13b ±0,10ı 3 2,39 te 0,97 5,27 1,11 7,12 0,43 2,67 16,92 ±0,02j ±0,01o ±0,05g ±0,01n ±0,11k,l ±0,01g,h,ı te ±0,02b te te te te te te ±0,27k 1 2,61 te 1,01 te 5,10 18,44 1,09 7,30 1,39 3,64 16,69 ±0,03ı ±0,01n,o ±0,10m ±0,04c,d ±0,03d ±0,09b te te te te te ±0,04a ±0,04y ±0,04k B 2 2,09 5,76 0,90 te 1,46 8,38 8,82 0,84 1,76 10,78 ±0,02k ±0,03g ±0,01o ±0,01n ±0,01j te ±0,44a te te te te te ±0,01b ±0,01z,aa ±0,05r 3 2,25 te 0,94 te 1,43 7,63 0,76 7,04 ±0,03j,k ±0,01o ±0,03n ±0,02j,k,l ±0,02e,f ±0,08b te te te te te te 2,03 10,36 ±0,03z ±0,01s 1 te te te 5,72 17,82 12,72 ±0,07d te ±0,03c,d te te te te te te te te te ±0,10q PE 2 te te te 5,37 te 10,00 ±0,09f,g ±0,11ı te te te te te te te te te 9,18 ±0,05u 3 te te te 5,48 ±0,11e,f te 7,98 ±0,30j,k te te te te te te te te te 9,19 ±0,03u 1 te te te 4,08 12,87 9,67 ±0,04j te ±0,41e,f te te te te te te te te te ±0,10t H 2 te te te 4,04 te 7,32 ±0,06j ±0,24k,l te te te te te te te te te 7,98 ±0,04w 3 te te te te te 5,26 ±0,02m te te te te te te te te te 7,04 ±0,01x *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, ROS: rosmarinik asit, RES: resveratrol, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, PHBA: p-hidroksibenzoik asit, GA: gallik asit, KAMG: kampferol-3-glikozit, RU: rutin. a–ad: Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 88 İğde kabuğunun (3 nolu örnek) metanol çözücüsü ile gerçekleştirilen asidik hidroliz ekstraktının 280 nm’de alınan kromatogramı Şekil 4.2’de verilmiştir. Tespit edilen fenolik maddelerin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyları 260, 280, 320 ve 360 nm’dir. 280 nm’de alınan kromatogramda pikler tam olarak ayrılmamış görülse de diğer dalga boylarında alınan kromatogramlarda pikler tam olarak ayrılmıştır. İğde kabuğu ekstraktlarında ana bileşik olarak belirlenen kateşin, epikateşin gallat ve epigallokateşin (asidik ortamda) dışında epikateşin, epigallokateşin gallat, kafeik asit, p-kumarik asit, ferulik asit, rosmarinik asit, resveratrol, protokatekuik asit, vanilik asit, gallik asit, ellagik asit, mirisetin, kamferol, kamferol glikozit, izokuersitrin ve rutin olmak üzere toplam 19 tane fenolik bileşik tespit edilmiştir (Çizelge 4.9). Su ve metanol çözücüleri dışında, kateşin miktarı çözücü polaritesi azaldıkça azalmış ve asidik hidroliz ile kateşin miktarlarında artış gözlenmiştir. Epikateşin gallat çözücü ekstraktlarında yüksek miktarlarda bulunurken, asidik hidroliz sonrası metanol ve etanol ekstraktları dışında tespit edilememiş ve bu iki çözücü ortamında miktarları düşük bulunmuştur. Çözücü ekstraktlarında epikateşin, epigallokateşin gallat ve epigallokateşin gözlenmezken, asidik hidroliz ile miktarlarının arttığı tespit edilmiştir. Aynı zamanda etanol ve aseton ekstraktlarının asidik hidrolizlerinden sonra gallik asit gözlenmiştir. 89 500 450 400 350 300 250 3 200 150 100 5 4 6 9 50 7 8 10 11 1 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Zaman (dk) Şekil 4.2. İğde kabuğu metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı (280 nm) (1: protokatekuik asit, 2: epigallokateşin, 3: kateşin, 4: epigallokateşin gallat, 5: kafeik asit, 6: epikateşin, 7: rutin, 8: p-kumarik asit, 9: kamferol glikozit, 10: rosmarinik asit, 11: resveratrol) mAU 90 Çizelge 4.9. İğde kabuğu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) CAT ECAT ECATG EGCAT EGCATG CAF PCA FER ROS Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 5632,92 4996,63 te te 1118,72 te te 649,64 te te 11,31 9,40 te 12,45 te te te 15,72 ±1,14w ±87,33y ±3,47g ±4,61p ±0,05g ±0,65ı,j ±0,46c ±0,06f,g W 2 9666,71 9239,22 1447,43 873,87 ±28,25q ±12,48s te te ±47,74e te te ±18,11l te te 4,79 8,82 7,23 6,09 te te 13,01 15,49 ±0,03n,o ±0,31k,l ±0,01k ±0,27l,m ±0,18ı ±0,53g 3 10153,80 8912,81 te te 1433,72 te te 915,69 te te 5,21 9,72 7,74 8,15 te te 13,53 17,86 ±17,57o ±97,39t ±29,19e ±5,28k ±0,06n ±0,09ı ±0,03j ±0,50ı,j ±0,29ı ±0,79e 1 9839,82 5293,21 te 337,31 1651,89 924,69 970,40 13,84 10,74 11,49 16,34 ±51,65p ±71,45x ±2,14e ±5,54d te ±9,75k ±8,80j te te te ±0,18e ±0,06e ±0,20d te te te ±0,66f M 2 15253,32 9341,95 te 168,73 1661,80 418,18 1693,50 1567,80 te te te 12,09 8,73 10,88 15,76 ±18,96k ±36,84r ±0,60ı ±0,60d ±21,04q ±14,67d ±17,59f ±0,24f ±0,11g,h ±0,37e te te te ±1,04f,g 3 16220,05 9793,88 te 158,73 2015,50 455,47 1695,71 1723,17 304,11 6,94 10,72 9,25 8,41 15,21 ±49,25ı ±34,32p ±0,36j ±16,75c ±3,29p ±73,92d ±0,78d te ±2,07e ±0,03m ±0,38h ±0,09f ±0,04h,ı te te te ±083g 1 3588,54 5256,55 te te 3283,96 1038,65 te 1071,63 te te te 9,15 3,91 9,36 8,04 ±35,90z,aa ±19,03x ±48,55b ±4,68h ±13,16ı ±0,33j,k ±0,19p ±0,90f te te ±0,05m te E 2 3666,30 9840,57 te te 3359,80 1064,78 te 2097,95 te 213,65 te te 2,82 11,35 te te 8,62 16,42 ±14,90z ±42,03p ±22,98a ±7,42h ±5,52a ±0,58f ±0,01q,r ±0,10d ±0,01l,m ±0,19f 3 3085,44 10269,87 te 1039,40 3342,34 1302,52 te 1761,56 te 324,17 15,01 2,68 12,69 ±19,60ab ±43,52n ±6,49a ±0,34a ±11,73f ±1,17c ±3,99d te ±0,22d ±0,03r ±0,21c te te 8,34 29,96 ±0,07l,m ±1,36a 1 562,93 41635,83 637,60 1363,99 360,08 1,96 20,44 2,89 25,29 ±2,35ae ±102,82f te te ±3,24m te te ±18,26g te ±1,37c te te ±0,16s,t ±0,53a te te ±0,01o ±0,07b A 2 721,53 69316,97 634,33 1572,98 551,33 ±2,42ad ±58,18d te te ±0,65m te te ±8,06f te ±0,63b te te 1,43 te te 19,70 3,26 ±0,01u,v ±0,51a ±0,01o te 3 837,04 68648,62 te te 640,77 te te 1545,09 te 564,90 ±5,83ac ±98,16e ±9,21m ±11,97f ±3,33a te te 1,05 14,99 18,24 2,88 23,92 ±0,06v ±0,33b te ±0,22b ±0,10o ±0,23c *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit, ROS: rosmarinik asit, a–z: Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 91 Çizelge 4.9. İğde kabuğu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) CAT ECAT ECATG EGCAT EGCATG CAF PCA FER ROS Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te 8933,76 te 218,76 765,47 te te te te te te 23,50 2,84 8,92 7,33 3,31 19,38 ±4,23t ±0,37g ±8,53j ±0,05a ±0,02q,r ±0,05f,g te ±0,09f ±0,08o ±0,30d EA 2 te 11838,37 te 144,13 803,58 te te 1615,39 ±4,35m ±0,61k ±2,79ı ±1,94e te te te 17,92 1,60 6,19 10,65 3,36 17,64 ±0,06c ±0,01t,u ±0,04l te ±0,11c ±0,01o ±0,10e 3 te 12541,33 154,44 591,32 ±18,89l te ±0,69j ±0,19n te te 1818,80 te te te 21,24 1,33 6,94 9,74 3,15 14,34 ±13,30b ±0,10b ±0,02u,v ±0,06k te ±0,05d ±0,05o ±0,18h 1 621,11 16036,94 1024,63 722,09 750,60 2,10 8,56 6,55 2,61 13,58 ±8,22ad,ae ±135,29j te ±7,34b ±3,07k te te ±2,69n te te te te ±0,01s ±0,02g,h,ı te ±0,02g ±0,01o ±0,28h,ı B 2 906,36 23984,58 te 673,42 707,98 1075,97 1,34 4,45 2,88 10,60 ±9,76ac ±58,08g ±3,44c ±3,42k,l te te ±1,13ı te te te te ±0,01u,v ±0,02o te te ±0,03o ±0,01k 3 843,26 23530,70 te te 675,79 te te 1081,07 te te te 8,61 1,31 5,38 2,89 11,41 ±25,76ac ±61,57h ±7,23l ±2,12ı ±0,15l ±0,02u,v ±0,13n te te ±0,03o ±0,18j te 1 te 3553,31 te 290,88 595,32 ±5,65aa ±0,59f ±0,47n te te 586,35 ±2,52q te te te 5,07 5,89 3,55 8,22 ±0,03n ±0,02l,m te ±0,09j te ±0,14m PE 2 te 6083,79 te 43,40 532,54 815,84 ±11,03v ±0,38m ±0,07o te te ±0,72m te te te 3,82 te 3,77 5,96 7,85 ±0,03q ±0,09p te ±0,03h te ±0,08m,n 3 te 6265,62 te 55,89 506,96 te te 829,12 3,22 te 3,22 5,18 7,93 ±4,51u ±0,46l ±0,10o ±1,88m te te te ±0,03r ±0,04q te ±0,10ı te ±0,01m,n 1 te 73840,04 te 464,91 578,26 ±67,86c ±1,00d ±6,99n te te 712,26 4,35 te 3,79 3,26 7,22 ±3,49o te te te ±0,05p ±0,03p te ±0,06j te ±0,11n H 2 te 161670,71 te 172,01 582,31 te te 1280,95 te te te 3,86 te 4,57 ±54,13b ±1,31ı ±2,60n ±2,62h ±0,04q ±0,07o te 9,56 9,07 ±0,09d te ±0,03l 3 te 174482,19 te ±59,73a te 191,96 597,64 ±0,95h ±0,19n te te te te te te 4,49 5,68 8,96 10,14 ±0,05o,p ±0,02m,n te ±0,04e te ±0,12k *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit, ROS: rosmarinik asit. a–z: Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 92 Çizelge 4.9. İğde kabuğu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) Çözücü Örnek RES PRCA VAN GA ELA MYR KAM KAMG IQU RU SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te 6,54 30,35 23,88 ±0,19f,g ±0,31d ±0,12g te te te te te te te te te te te te te te 103,11 117,37 ±0,48r ±3,94p W 2 te 7,12 14,81 11,88 te te te te te 11,73 ±0,05b,c ±0,27k ±0,22n ±0,04b te te te te 15,76 32,05 109,13 135,74 ±0,58n ±1,49j te te ±2,78q ±2,50n 3 te 7,03 14,54 9,59 11,02 23,18 25,91 110,97 117,24 ±0,13c,d ±0,11k ±0,17p te te te te te ±0,12c te te te te ±2,61m ±0,21l te te ±2,14q ±2,93p 1 te 6,85 31,66 27,99 ±0,01e ±0,20b ±0,16e te te te te te 23,27 7,77 te te 6,10 17,12 61,59 159,54 183,96 ±0,23a ±0,03c ±0,01e ±0,19n ±0,53f te te ±1,15m ±1,15ı M 2 te 6,58 16,26 11,72 ±0,24f ±0,10j ±0,15n te te te te te te te te 3,77 5,27 27,65 75,71 6,98 177,63 177,38 ±0,25ı ±0,02g ±3,20l ±0,49b ±0,55d te ±2,53j ±2,29j 3 te 6,91 16,10 10,97 ±0,02d,e ±0,22j ±0,25o te te te te te te te te 4,21 te 29,67 70,19 7,22 te 188,19 182,85 ±0,04h ±0,01k ±0,60d ±0,03d ±2,16h ±0,56ı 1 te 7,13 6,56 31,03 2,30 ±0,08b,c ±0,23r ±0,35c ±0,33a te te 289,81 ±0,53c te te te te 3,59 6,46 4,11 57,55 ±0,06j,k ±0,04d ±0,20q ±0,62g te te 35,32 168,20 ±0,55x ±5,45l E 2 3,67 7,22 4,97 17,14 te te te 565,25 te te te te 3,52 5,76 4,27 82,83 te te 24,79 192,19 ±0,01q ±0,02b ±0,05s,t ±0,21ı ±3,01a ±0,06k,l ±0,05f ±0,07q ±1,88a ±0,41y ±2,78g 3 3,53 7,66 4,04 12,24 379,07 ±0,06q ±0,27a ±0,16u ±0,10m te te te ±4,85b te te te te 3,28 6,04 3,61 81,22 20,00 214,52 ±0,04m ±0,04e ±0,02q ±0,50a te te ±0,06z ±3,30d 1 0,95 6,64 3,95 34,06 1,37 81,82 10,56 1,14 3,45 0,49 77,62 11,16 5,74 202,41 ±0,01r ±0,01f ±0,06u ±0,23a ±0,03c,d te te ±0,11f te te te ±0,05a ±0,01p,q ±0,21k,l,m ±0,02r ±2,78b te ±0,12c ±0,09aa,ab ±0,61e A 2 1,05 5,77 2,11 9,60 1,35 115,90 7,96 0,92 3,77 0,99 72,43 14,89 6,99 197,40 ±0,01r ±0,11j,k ±0,02w ±0,11p ±0,15c,d,e te te ±0,29e te te te ±0,04b ±0,01r,s ±0,04ı,j ±0,06r ±0,71c te ±0,07a ±0,12aa ±0,49f 3 0,99 5,87 2,20 11,81 0,83 128,85 7,42 0,81 3,33 0,51 67,24 12,08 4,24 172,36 ±0,01r ±0,09j ±0,02w ±0,11n ±0,01g te te ±0,06d te te te ±0,02d ±0,01s ±0,04l,m ±0,01r ±1,09e te ±0,05b ±0,13aa,ab ±2,22k *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, RES: resveratrol, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, MYR: mirisetin, KAM: kamferol, KAMG: kamferol-3-glikozit, IQU: izokuersitrin, RU: rutin. a–z: Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 93 Çizelge 4.9. İğde kabuğu ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) RES PRCA VAN GA ELA MYR KAM KAMG IQU RU Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 0,96 6,41 5,30 26,04 1,75 ±0,03b te te te te te te te 1,40 ±0,03o 20,21 0,81 60,07 te te 4,05 268,28 ±0,02r ±0,02g,h ±0,04s ±0,19f ±0,16a ±0,01r ±0,74f ±0,06aa,ab ±0,33b EA 2 1,05 5,49 1,96 10,78 1,13 ±0,01r ±0,04m ±0,03w,x ±0,22o ±0,02d,e,f te te te te te te te 1,01 ±0,01q,r 9,64 ±0,04 b 0,61 56,44 2,48 251,51 ±0,01r ±0,26g te te ±0,05ab ±0,30c 3 1,06 5,29 1,67 8,06 1,10 0,95 c 0,54 57,48 2,44 294,30 ±0,01r ±0,04n ±0,06x ±0,06q ±0,01e,f te te te te te te te ±0,01r,s 7,77 ±0,23 ±0,02r ±0,19g te te ±0,01ab ±1,11a 1 0,97 6,15 3,61 26,04 ±0,01r ±0,02ı ±0,01v ±0,30f 1,46 ±0,06 c te te te te te te te 1,21 ı 0,66 42,44 4,30 6,84 131,00 ±0,03o,p 3,85 ±0,13 ±0,01r ±0,82h te ±0,09e ±0,03aa ±0,73o B 2 1,04 5,53 1,24 6,89 0,99 te te te te te te te 1,03 ±0,01r ±0,01l,m ±0,04y ±0,11r ±0,03f,g ±0,01p,q,r 2,66 ±0,03 n 0,83 27,73 3,88 5,96 88,26 ±0,01r ±0,06l te ±0,01e ±0,01aa ±0,30s 3 1,03 5,69 1,01 6,68 0,90 0,97 3,29 0,91 34,26 4,02 6,03 102,55 ±0,01r ±0,03k,l ±0,02y ±0,07r ±0,05f,g te te te te te te te ±0,01q,r,s ±0,11m ±0,03r ±1,09ı te ±0,01e ±0,18aa ±1,55r 1 te 5,88 te 18,88 ±0,03j ±0,12h te te te te te te te te te te te 8,03 48,36 ±0,11p te te te ±0,19v PE 2 te 6,34 te 4,99 te te te te te te te te te te te 10,44 te te te 49,53 ±0,07h ±0,19s,t ±0,07o ±0,27v 3 te 6,26 ±0,04h,ı te 4,69 ±0,10t te te te te te te te te te 2,84 ±0,03n te 6,95 ±0,10p te te te 47,86 ±0,15v 1 te 4,48 13,98 ±0,02p te ±0,17l te te te te te te te te te te te 8,50 41,32 ±0,15o,p te te te ±0,72w H 2 te 4,99 7,89 ±0,05o te ±0,11q te te te te te te te te te te te 10,40 ±0,06o te te te 57,19 ±0,27u 3 te 5,15 ±0,06n,o te 8,04 te te te te te te te te te te te 15,85 te te te 74,53 ±0,06q ±0,21n ±0,46t *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, RES: resveratrol, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, MYR: mirisetin, KAM: kamferol, KAMG: kamferol-3-glikozit, IQU: izokuersitrin, RU: rutin. a–z: Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 94 İğde çekirdeğinin (3 nolu örnek) metanol çözücüsü ile gerçekleştirilen asidik hidroliz ekstraktının 280 nm’de alınan kromatogramı Şekil 4.3’te verilmiştir. Tespit edilen fenolik maddelerin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyları 260, 280, 320 ve 360 nm’dir. 280 nm’de alınan kromatogramda pikler tam olarak ayrılmamış görülse de diğer dalga boylarında alınan kromatogramlarda pikler tam olarak ayrılmıştır. İğde çekirdeğinde farklı ekstraksiyon koşulları altında yirmi fenolik bileşik: kateşin, epikateşin, epikateşin gallat, epigallokateşin, epigallokateşin gallat, kafeik asit, klorojenik asit, ferulik asit, rosmarinik asit, p-kumarik asit, protokatekuik asit, gallik asit, ellagik asit, vanilik asit, resveratrol, kuersetin, mirisetin, kamferol, izokuersitrin ve rutin tespit edilmiştir (Çizelge 4.10). Genel olarak kateşin ve türevlerinin (epikateşin, epigallokateşin ve epigallokateşin gallat) miktarının çözücü polaritesi azaldıkça azaldığı görülmüştür. Ayrıca su ve metanol çözücüleri dışında asidik hidroliz ile miktarlarının arttığı görülmüştür. Çözücü ekstraktlarında gallik asit tespit edilemezken, etanol hariç tüm çözücü ekstraktlarında asidik hidroliz ile gallik asit oluştuğu tespit edilmiştir. 95 90 80 70 60 50 40 6 4 30 5 1 7 20 3 8 10 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Zaman (dk) Şekil 4.3. İğde çekirdeği metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı (280 nm) (1: gallik asit, 2: protokatekuik asit, 3: epigallokateşin, 4: kateşin, 5: epigallokateşin gallat, 6: epikateşin, 7: p-kumarik asit, 8: ferulik asit) mAU 96 Çizelge 4.10. İğde çekirdeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) CAT ECAT ECATG EGCAT EGCATG CHL CAF PCA FER Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 2586,22 1095,89 390,42 132,03 te te 3642,52 502,92 545,27 te te te te 7,06 0,37 te 2,45 1,43 ±8,87r ±1,40z ±1,91r ±0,45w ±10,01c ±1,61s ±2,17o ±0,01a ±0,03q,r ±0,06n ±0,03u,v W 2 2972,26 3457,77 602,92 588,79 te te 3809,24 1874,01 786,20 1126,89 ±16,90q ±9,14o ±2,03m ±4,78m,n ±3,64b ±4,36h ±6,97l ±0,59g te te te te 5,96 9,11 5,52 10,53 ±0,15b ±0,18a ±0,13f ±0,05a 3 3256,33 2185,71 778,64 337,71 te te 4560,64 1216,33 963,04 828,55 8,98 0,43 6,45 4,15 ±10,90p ±0,18t ±4,69k ±1,27s,t ±2,42a ±2,83n ±4,45ı ±0,36j te te te te ±0,20a ±0,06n,o,p,q ±0,17e ±0,03ı 1 4231,63 1345,80 1292,07 315,57 te te 1381,28 702,04 1174,51 286,92 ±17,75l ±3,98x ±2,31ı ±1,04t ±5,80l ±2,63p ±51,79f ±1,85r te te te te 5,75 0,52 6,61 1,63 ±0,05c ±0,08n,o,p ±0,02d ±0,02r M 2 4993,97 1851,82 1376,43 508,52 1737,70 1081,36 1484,76 1011,03 4,24 5,53 1,58 ±6,66j ±2,63u ±0,54h ±1,03p te te ±5,93ı ±54,60o ±2,79e ±0,31h te te te te ±0,02f te ±0,01f ±0,03r,s,t 3 5482,23 1769,78 2088,55 682,31 te te 2366,92 1082,86 2049,46 650,84 te te te te te 0,40 9,32 1,60 ±17,35ı ±1,11u ±7,06f ±1,02l ±13,72d ±2,18o ±7,46c ±1,41m ±0,01p,q ±0,10b ±0,02r,s 1 774,09 1422,18 753,63 1553,67 te te te 1307,14 368,06 540,40 ±1,30ab ±3,61w,x ±4,86k ±1,05g ±4,10m ±1,14q ±0,95o te te te te 1,29 0,55 3,35 1,85 ±0,04l ±0,01n ±0,02k ±0,03q E 2 1027,19 1010,89 959,79 2389,44 573,14 2230,00 649,46 829,35 0,54 1,91 3,85 ±14,12z,aa ±1,76z,aa ±11,73j ±46,44e te te ±3,24r ±9,84f ±4,72m ±3,99j te te te te ±0,01n,o te ±0,02p,q ±0,02j 3 1224,12 1461,72 1371,50 2377,65 707,39 1861,23 809,05 600,58 1,35 ±3,64y ±0,76w ±11,30h ±2,09e te te ±0,72p ±3,85h ±1,79j,k ±4,28n te te te te te te te ±0,06v 1 255,99 26623,66 331,08 2689,22 212,22 1327,93 80,37 ±0,90ae ±110,96e ±0,45s,t ±21,63d te te ±0,43w ±14,02m ±0,18u te te 11,49 0,82 1,50 ±0,04b te te ±0,04m te ±0,01t,u te A 2 284,59 36780,71 238,18 3605,43 224,36 2274,69 120,08 4558,19 0,27 0,71 ±1,49ae ±56,35b ±0,25u ±5,36a te te ±0,35w ±10,79e ±0,44t ±10,64a te te te te ±0,01r,s te ±0,01x te 3 378,66 25994,22 435,56 3327,61 te te 368,99 1619,37 208,95 ±7,35ad ±109,80f ±0,60q ±50,32b ±1,27u ±31,28k ±0,18s te te te te te 0,86 te 1,14 4,76 ±0,01m ±0,03w ±0,07g *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, CHL: klorojenik asit, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit. a–z Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 97 Çizelge 4.10. İğde çekirdeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) CAT ECAT ECATG EGCAT EGCATG CHL CAF PCA FER Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te 2319,99 te 357,00 te te te ±13,59s ±0,70s te te te te te te te 0,13 4,75 0,29 3,38 ±0,01t ±0,07e ±0,01aa ±0,02k EA 2 te 4633,23 te 572,50 ±3,91k ±8,65n,o te te te 1720,63 te 957,10 0,15 3,40 0,35 ±0,07ı ±0,35ı te te te te ±0,01s,t ±0,03h ±0,01aa te 3 te 3551,16 te 585,48 te te te 1226,99 te 793,24 0,42 5,28 0,63 6,44 ±16,64n ±6,41m,n ±22,98n ±2,86k,l te te te te ±0,01o,p,q ±0,03d ±0,01x,y ±0,03e 1 127,13 3981,51 te 546,25 te te te 448,65 408,10 3,69 0,37 2,61 0,46 2,59 ±0,75af ±7,52m ±1,22o ±7,01t te ±1,44p te te te ±0,01b ±0,01q,r ±0,01j ±0,01z ±0,02m B 2 119,42 9671,12 26,85 2727,38 te 74,89 te 1983,76 te 2224,76 te te te te 0,42 te 0,57 7,16 ±0,10af ±31,97g ±0,19y ±23,86c ±1,32a ±8,02g ±11,94b ±0,02o,p,q ±0,01y ±0,01c 3 99,72 8106,74 19,73 2712,71 69,10 1661,92 1915,12 0,23 0,46 6,52 ±0,19af ±16,81h ±0,05y ±5,15c,d te ±0,39b te ±6,38j te ±2,52d te te te te ±0,01s,t te ±0,01z ±0,06d,e 1 te 590,44 ±6,07ac te 84,62 ±1,08x te te te te te te te te te te te 3,61 ±0,01g te 2,16 ±0,01o PE 2 te 1623,67 83,22 ±0,70v te ±0,02x te te te te te te te te te te te 1,20 ±0,02l te 1,97 ±0,02p 3 te 939,05 te 151,86 ±4,29aa ±1,51w te te te te te te te te te te te te te te 1 te 29087,33 ±5,53d te 200,29 252,87 87,13 17,23 1,30 1,53 ±1,37v te te te ±6,83v te ±1,47u te ±0,41a te te te ±0,02l te ±0,01s,t H 2 te 45294,19 te 208,97 te te te 660,44 te 139,38 ±27,06a ±8,81v ±7,32q ±0,46t te te te te te 1,61 3,14 ±0,01k te ±0,01l 3 te 35499,92 te 356,97 489,73 137,68 2,86 4,26 ±223,00c ±0,36s te te te ±1,12s te ±1,83t te te te te te ±0,02ı te ±0,01h *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, CHL: klorojenik asit, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit. a–z Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 98 Çizelge 4.10. İğde çekirdeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ROS RES PRCA VAN GA ELA QU MYR KAM IQU RU Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te te te te 63,79 14,90 9,92 92,44 12,22 ±0,20b ±0,12r te ±0,02a te ±0,19o ±0,17h te te te te te te te te te te te W 2 te te te te 32,48 44,53 te te te 338,41 te 11,33 ±0,05ı ±0,46e ±0,43d ±0,01ı te te te te te te te te te te 3 te te te te 27,41 14,22 199,74 ±0,07j ±0,20s te te te ±0,09h te te te te te te te te te te te te 1 te te te te 67,54 14,98 69,65 ±1,17a ±0,02r te te te ±0,14p te te te te te te te te te te te te M 2 te te 7,79 ±0,06b te 50,63 17,06 136,32 15,21 ±0,24c ±0,17p te te te ±0,06k ±0,08e te te te te te te te te te te te 3 te te 7,92 te 45,61 8,19 te te te 122,96 17,76 ±0,05a ±0,74d ±0,05u ±0,34m ±0,28c te te te te te te te te te te te 1 te te te te te 16,36 ±0,10q te te te te te te te te te te te te te te te te E 2 te te te te te 22,63 ±0,35m,n te te te te te te te te te te te te te te te te 3 te te te te te 6,92 ±0,07v te te te te te te te te te te te te te te te te 1 te 12,76 te te 8,24 32,28 ±0,04c ±0,12u ±0,34ı te te te 186,16 29,36 7,22 2,35 ±0,55ı te ±0,05a te te te ±0,04f te ±0,01f te te te te A 2 te 28,69 5,63 38,31 334,37 5,06 7,48 2,32 9,79 ±0,09a te te ±0,04w ±0,35g te te te ±2,13e te te te ±0,03a te ±0,01e te ±0,01g te ±0,06a te te 3 te te te te 7,22 23,20 te te te 224,34 4,33 28,00 6,99 7,54 ±0,14v ±0,07m ±3,68g ±0,05l ±0,05b te te te ±0,05g te te te ±0,02b te te *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, ROS: rosmarinik asit, RES: resveratrol, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, QU: kuersetin, MYR: mirisetin, KAM: kamferol, IQU: izokuersitrin, RU: rutin. a–z Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 99 Çizelge 4.10. İğde çekirdeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) ROS RES PRCA VAN GA ELA QU MYR KAM IQU RU Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te te te te 1,73 26,57 te te te te te 5,44 te te te 7,65 ±0,01y ±0,20k ±0,01k ±0,04d te te te te te te EA 2 te te te te 3,53 41,78 ±0,05x ±0,05f te te te 629,00 te 15,46 te te te 7,98 te 6,71 ±3,81a ±0,02d ±0,02b ±0,01a te te te te 3 te te te te 1,55 15,02 te te te 446,16 te 8,03 7,22 ±0,04y ±0,11r ±0,94b ±0,01j te te te ±0,02f te te te te te te 1 te 7,69 te te 3,88 22,07 te te te 94,94 ±0,04e ±0,02x ±0,13n ±0,07o te 4,39 ±0,01l te te te te te 2,31 ±0,01g te te te 3,02 ±0,01b B 2 te 13,38 ±0,09b te te 5,93 36,80 1,19 ±0,01w ±0,16h ±0,02c te te 346,37 14,78 ±0,78c te ±0,02f te te te 8,09 ±0,02a te 2,59 5,12 ±0,01b te ±0,01c te te 3 te 12,46 te te 2,09 19,71 282,40 13,71 7,87 2,56 7,54 ±0,10d ±0,14y ±0,43o te te te ±1,07f te ±0,01g te te te ±0,02c te ±0,01c te te te ±0,01a 1 te te te te te 8,94 2,55 2,49 ±0,05t te ±0,01b te te te te te te te te te ±0,01e te te te te PE 2 te te te te te 22,45 130,57 ±0,55n te te te ±0,16l te te te te te te te te te te te te 3 te te te te te te te te te te te te te te te 7,02 te 2,53 ±0,04g ±0,02d te te te te 1 te te te te te 14,68 ±0,52r,s te te te 58,52 ±0,01q te te te te te te te te te te te te H 2 te te te te te 24,15 149,55 ±0,07l te te te ±0,30j te te te te te te te te te te te te 3 te te te te te 14,98 111,65 ±0,74r te te te ±1,46n te te te te te te te te te te te te *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, ROS: rosmarinik asit, RES: resveratrol, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, QU: kuersetin, MYR: mirisetin, KAM: kamferol, IQU: izokuersitrin, RU: rutin. a–z Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 100 İğde çiçeğinin (3 nolu örnek) metanol çözücüsü ile gerçekleştirilen asidik hidroliz ekstraktının 280 nm’de alınan kromatogramı Şekil 4.4’te verilmiştir. Tespit edilen fenolik maddelerin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyları 260, 280, 320 ve 360 nm’dir. 280 nm’de alınan kromatogramda pikler tam olarak ayrılmamış görülse de diğer dalga boylarında alınan kromatogramlarda pikler tam olarak ayrılmıştır. İğde çiçeği ekstraktlarında 16 tane fenolik bileşik (kateşin, epikateşin, epigallokateşin gallat, 2- hidroksisinamik asit, resveratrol, ferulik asit, p-kumarik asit, protokatekuik asit, kafeik asit, gallik asit, ellagik asit, vanilik asit, mirisetin, kamferol, kamferol glikozit ve izokuersitrin) tespit edilmiştir (Çizelge 4.11). Kateşin iğde çiçeği ekstraktlarında en yüksek miktarda bulunan fenolik bileşik olarak belirlenmiştir. Kateşin çözücü ekstraksiyonu ile sadece su, metanol ve etanol ekstraktlarında bulunurken, asidik hidroliz sonrası petrol eteri ve hekzan dışındaki çözücü ekstraktlarında yüksek miktarlarda tespit edilmiştir. Asidik hidroliz sonrası bazı çözücü ekstraktlarında epikateşin ve epigallokateşin gallat görülmüştür. Benzer şekilde gallik asit, aseton hariç çözücü ekstraktlarında gözlenmezken asidik hidrolizden sonra çoğu çözücü ekstraktlarında tespit edilmiştir. 101 250 9 200 150 100 10 50 1 6 2 3 4 5 7 8 11 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Zaman (dk) Şekil 4.4. İğde çiçeği metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı (280 nm) (1: kateşin, 2: 2-hidroksisinamik asit, 3: ellagik asit, 4: p-kumarik asit, 5: kamferol glikozit, 6: ferulik asit, 7: izokuersitrin, 8: mirisetin, 9: 2-hidroksisinamik asit, 10: resveratrol, 11: kamferol) mAU 102 Çizelge 4.11. İğde çiçeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) CAT ECAT EGCATG 2-HCA CAF PCA FER RES Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 4988,95 4839,67 ±17,45r ±4,97r,s te 1085,14 te te te te te 105,02 457,91 39,18 309,41 87,50 83,27 ±3,40ı ±0,42d ±0,40a ±1,44r ±1,19a ±0,29g ±0,05h te W 2 1746,07 2505,96 te 850,93 te te te te te te 101,41 17,29 56,41 55,18 43,90 ±18,92v,w ±7,08u,v ±0,91k ±0,72g ±3,50u ±0,83ı ±5,15k ±0,48k,l te 3 2213,64 6820,12 te 992,54 te te te te te te 349,07 39,84 158,63 40,00 63,38 ±10,50u ±8,66q ±14,22j ±0,47b ±0,41r ±1,54b ±0,46m ±0,35ı te 1 6280,59 32093,69 ±53,44m ±80,91e te te te te 1931,86 1778,06 61,74 95,93 53,24 71,88 96,77 74,79 131,31 147,06 ±0,15d ±1,05e ±0,85g ±0,14e ±1,15m ±0,13n ±0,90e ±3,79h ±0,61d ±0,35e M 2 1544,79 18253,66 ±1,78t ±1,81k te te te te 815,46 981,12 32,85 37,34 31,75 39,65 53,91 63,64 ±3,75n ±0,09l ±0,06j te ±0,37p,q ±0,13s ±0,13l ±0,74k ±0,62h te 3 2139,91 21722,10 ±4,84s ±140,80j te te te te 1775,86 1962,02 46,08 90,99 38,11 107,49 73,74 63,72 228,31 ±1,95f ±1,03c ±0,22h ±0,14f ±0,34p ±0,26j te ±1,19h ±0,14h ±3,39c 1 1237,16 37219,13 te 10617,55 te te 274,50 1995,37 te 137,32 17,09 81,71 17,09 126,19 54,18 136,00 ±28,57w,x ±139,71d ±62,50d ±0,10r ±1,96b ±1,22a ±0,10t ±1,01l ±0,70p ±0,32d ±0,45j ±2,36f E 2 424,91 25095,24 9274,19 ±2,37y ±28,32ı te ±62,50e te te 204,38 1056,87 110,75 11,59 39,12 63,85 32,50 ±0,23s ±1,11k te ±0,45c ±0,28v ±0,14r te ±0,79j ±0,05n,o te 3 1019,52 29067,02 13227,77 399,22 2023,31 121,53 13,50 81,52 67,98 109,19 138,63 ±32,93x ±68,45g te ±7,19a te te ±0,33q ±5,73a te ±0,47b ±0,05u,v ±0,30l te ±1,47ı ±0,43g ±0,72f 1 te 168285,03 te 12070,67 te 11529,04 te 1470,30 te te 8,58 244,53 12,64 27,55 ±788,55b ±57,91b ±125,76a ±0,24h ±0,37w ±0,61c ±0,45p,q te ±0,05o,p te A 2 te 180760,65 te 7719,60 7539,64 796,28 6,29 123,05 133,66 ±57,34a ±27,14f te ±65,24b te ±1,16n te te ±0,30x ±4,16h te ±2,18c te te 3 te 97739,27 te 10992,49 te 7389,56 te 1530,41 te te 7,22 191,29 9,53 24,94 ±895,90c ±58,48c ±165,29b ±0,66g ±0,32w,x ±6,41d ±0,17r te ±0,31p te *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, 2-HCA: 2-hidroksisinamik asit, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit, RES: resveratrol. a–y Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 103 Çizelge 4.11. İğde çiçeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) CAT ECAT EGCATG 2-HCA CAF PCA FER RES Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te 8426,85 te te te te te 1161,23 te te te 119,82 te 123,78 te 452,40 ±150,17o ±0,08j ±0,31ı ±1,27d ±10,09a EA 2 te 7831,20 te te te te te 529,89 te te te 84,29 ±76,69p ±0,38p ±0,05l te 76,48 ±0,11h te te 3 te 9104,71 te te te te te 889,11 81,42 97,05 86,86 ±27,66n ±51,78m te ±1,43g te ±1,08k te ±2,57g te te 1 te 17365,89 te 7304,41 te te te 882,19 te te te 99,68 26,94 32,26 ±56,93l ±6,86g ±0,15m ±2,76k te ±1,01o ±0,15m,n te B 2 te 31234,05 te 6776,42 ±136,24f ±38,10h te te te 594,78 ±0,57o te te te 29,55 te 27,41 ±0,75s ±1,95o te 71,81 ±0,80ı 3 te 28050,12 1215,94 45,77 147,38 99,87 32,62 284,27 ±252,57h te te te te te ±1,69ı te ±1,70ı te ±0,48f te ±0,20f ±0,05m,n ±0,71b 1 te te te te te te te te te te te 52,55 te 37,28 te 62,15 ±0,22q ±0,43m ±1,03j PE 2 te te te te te te te te te te te 53,57 16,76 49,41 ±0,26p,q te ±0,17q,r te ±0,61l 3 te te te te te te te te te te te 64,18 ±0,11o te 26,01 55,39 ±0,42o te ±0,73k 1 te te te te te te te te te 36,14 ±0,88k te 151,25 43,88 ±0,17e te te te ±0,07m H 2 te te te te te te te te te te te 123,21 25,73 ±0,16h te ±0,19o te 38,92 ±0,20n,o 3 te te te te te te te te te te te 125,41 te 31,06 te 42,13 ±0,01g,h ±0,27n ±0,63m,n *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, 2-HCA: 2-hidroksisinamik asit, CAF: kafeik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit, RES: resveratrol. a–y Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 104 Çizelge 4.11. İğde çiçeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) PRCA VAN GA ELA MYR KAM KAMG IQU Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 194,02 178,85 101,38 947,96 325,72 235,65 147,83 ±2,93b te ±1,85d ±2,49f te ±0,58f te ±0,73f te ±1,88a te ±3,12f te te te te W 2 119,27 te 82,23 49,80 te 704,55 251,23 ±3,06c ±1,20h ±0,83j ±0,62h te ±0,39ı te te te 135,79 ±0,20g te te te te 3 300,32 te 339,52 237,98 582,34 181,96 ±6,46a ±6,45a ±0,16c te ±6,42j te ±4,23l te te te te te te te te 1 te te te te te te te te te te te 69,94 209,17 301,02 201,72 ±0,54k ±1,31g ±7,28h te ±3,13k M 2 te te te te te te 66,48 243,98 57,48 78,81 129,00 204,23 97,39 171,29 ±0,32o ±1,86j te te ±0,80l,m ±0,70j,k ±4,48k ±3,97l ±0,77o ±0,95l 3 te te te te te te 72,00 263,71 164,75 48,18 80,48 206,13 369,62 138,94 256,52 ±2,92n ±3,34h te ±1,64c ±0,89m,n,o ±0,70j ±4,83g ±1,59f ±0,42m ±2,60e 1 te te te te te te te 256,15 ±7,54ı te te 41,15 76,72 23,22 299,58 230,06 ±0,43n,o,p ±0,36j,k ±0,94o ±2,03h te ±3,15h E 2 te te te te te te te 322,69 te te 48,67 98,45 24,60 236,95 206,44 ±3,72f ±0,47l,m,n ±1,77ı ±0,54o ±5,61j te ±0,01j 3 te te te te te te te 357,41 te 192,32 48,55 102,24 49,61 387,37 311,63 ±1,93e ±3,97b ±0,41l,m,n ±0,73ı ±0,90n ±3,32e te ±0,27c 1 te te te te 384,09 892,77 te 640,86 30,29 161,30 642,75 278,65 ±0,88ı ±8,50g ±1,38c te te ±0,09q,r ±12,96e te ±5,75c te ±2,28d A 2 te te te te 820,46 398,49 731,01 35,41 119,82 424,39 244,27 ±0,01d ±1,59k te ±0,33a te te ±0,25p,q,r ±0,37h te ±4,08d te ±2,17f 3 te te te te 331,95 932,68 657,97 27,41 381,23 878,80 383,91 ±0,13j ±15,23f te ±3,43b te te ±0,23r ±7,10c te ±0,29a te ±0,57a *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, MYR: mirisetin, KAM: kamferol, KAMG: kamferol-3-glikozit, IQU: izokuersitrin. a–y Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 105 Çizelge 4.11. İğde çiçeği ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) PRCA VAN GA ELA MYR KAM KAMG IQU Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te te te 285,52 1172,86 ±0,96b te ±13,18e te 404,02 te 100,60 1398,83 737,67 346,59 ±1,30d ±0,01d te ±21,42a te ±11,40b te ±0,96b EA 2 te te te 79,63 te 1626,79 te 254,75 te 87,27 te 347,23 te 287,27 223,44 ±0,16g ±15,49c ±1,64ı ±0,51e ±1,86d ±2,46ı te ±0,43ı 3 te te te 170,89 te 894,50 te 315,86 te 101,36 te 1353,16 353,69 314,23 ±0,22e ±13,57g ±3,87g ±0,08d ±4,05b te ±2,10g te ±1,69c 1 te te te te te 2055,57 te 228,37 te 70,29 te 167,51 te 211,68 117,11 ±31,18a ±1,19k ±0,15f ±0,40e ±0,23k,l te ±0,28m B 2 te te te te te te te 250,54 te te te 125,19 te 168,34 106,71 ±7,43ı ±1,07h ±2,20m te ±3,48n 3 te te te te te 1921,65 te 409,26 ±3,96b ±1,94d te 101,39 ±2,54d te 349,56 ±4,96d te 302,90 239,02 ±2,29h te ±2,75g 1 te te te 24,53 ±0,56m te te te 114,18 ±3,70m te te te 39,46 te te ±0,14o,p,q te te PE 2 te te te 35,03 49,09 ±0,28l te te te te te te te ±0,20m,n,o te te te te 3 te te te 34,45 te te te 186,96 te te ±2,48l ±0,56l te 52,39 56,25 ±0,49l,m te te te ±0,38r 1 te te te 66,09 92,57 101,48 70,65 ±2,30ı te te te ±1,01n te te te ±0,78ı te te te ±1,44p H 2 te te te 18,14 65,05 ±0,29n te te te ±0,66p te te te 76,95 te 12,37 63,53 ±1,27j,k ±0,35p te ±0,21q 3 te te te 42,13 te te te 94,44 te te te 59,11 te te te 58,85 ±0,89k ±1,03n ±2,47l ±0,29r *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, MYR: mirisetin, KAM: kamferol, KAMG: kamferol-3-glikozit, IQU: izokuersitrin. a–y Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 106 İğde yaprağının (3 nolu örnek) metanol çözücüsü ile gerçekleştirilen asidik hidroliz ekstraktının 280 nm’de alınan kromatogramı Şekil 4.5’te verilmiştir. Tespit edilen fenolik maddelerin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyları 260, 280, 320 ve 360 nm’dir. 280 nm’de alınan kromatogramda pikler tam olarak ayrılmamış görülse de diğer dalga boylarında alınan kromatogramlarda pikler tam olarak ayrılmıştır. İğde yaprağı ekstraktlarında ise kateşin, epikateşin, epikateşin gallat, epigallokateşin, epigallokateşin gallat, 2-hidroksisinamik asit, resveratrol, ferulik asit, protokatekuik asit, p-kumarik asit, gallik asit, ellagik asit, vanilik asit, kuersetin, mirisetin, luteolin, kamferol, kamferol glikozit ve izokuersitrin olmak üzere 19 tane fenolik bileşik tespit edilmiştir (Çizelge 4.12). İğde yaprağı ekstraktlarında ana bileşen olarak kateşin, epikateşin ve epigallokateşin gallat belirlenmiştir. Asidik hidroliz sonrası kateşin ve epikateşin miktarları su ekstraktında azalırken, diğer çözücü ekstraktlarında artmıştır. Bazı çözücü ekstraktlarında epikateşin gallat, epigallokateşin ve epigallokateşin gallat gözlenirken asidik hidroliz sonrası tespit edilememiştir. 107 800 2 700 1 5 600 500 400 300 200 6 100 3 4 7 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Zaman (dk) Şekil 4.5. İğde yaprağı metanol çözücüsü ile asidik hidroliz ekstraktının kromatogramı (280 nm) (1: kateşin, 2: epikateşin, 3: kamferol glikozit, 4: isokuersitrin, 5: 2-hidroksisinamik asit, 6: kuersetin, 7: kamferol) mAU 108 Çizelge 4.12. İğde yaprağı ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) CAT ECAT ECATG EGCAT EGCATG 2-HCA PCA FER RES Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 36443,94 2607,88 5760,42 3292,62 te te 4336,57 te 7128,61 te te te 438,59 222,27 221,05 135,08 98,55 ±5,33g ±37,69t,u ±5,33ı ±69,29l,m ±181,37a ±81,38a ±5,12b ±2,45f ±3,40e ±2,13f ±0,28a te W 2 8508,06 4942,10 3317,74 ±22,39q ±24,27s te ±15,34l te te te te 5694,73 te te te 397,68 268,34 260,44 294,70 ±26,32c ±4,95c ±1,87e ±1,86b ±1,83a te te 3 29772,78 2490,41 6979,60 2675,43 461,97 279,18 256,19 225,39 77,18 ±1,02j ±4,24t,u ±144,13h ±31,17o te te te te te te te te ±3,83a ±0,45d ±4,93c ±3,31d ±1,00b te 1 6853,91 86392,58 3465,69 ±71,82r ±131,38c te ±61,44k,l te te te te te te te 1885,96 ±9,04a te te te te te te M 2 6540,08 20197,26 3100,77 1018,34 ±60,27r ±46,12m te ±27,02n te te te te te te te ±1,08f te te te te te te 3 5333,56 84634,63 te 3629,17 ±22,94s ±301,29d ±66,40k te te te te te te te 1634,52 ±0,51b te te te te te te 1 1042,56 46915,86 32833,96 5088,96 223,96 1559,77 22,13 34,39 ±84,09v,w ±111,70f te ±206,83b te te te te ±109,44d te ±1,58p ±6,35c ±0,88g te ±0,73g te te te E 2 1104,34 16109,41 te 11613,29 te te te te 6081,81 te 84,02 1011,50 18,84 ±66,87v ±119,46n ±129,35e ±61,64b ±1,10r ±5,74g ±0,13g te te te te te 3 611,98 50055,06 te 41246,46 te te te te 2267,47 te 151,42 1455,14 18,79 27,43 ±2,83w,x ±349,08e ±231,33a ±21,82e ±0,23q ±1,32d ±0,09g te ±0,24h te te te 1 213,58 254271,45 47,64 11918,79 337,00 32,85 1251,55 4,06 9,24 ±0,77x,y ±926,96a ±0,62q ±114,62d te te te te ±19,89f te ±0,16s ±0,61e ±0,05h te ±0,02ı,j te te te A 2 320,59 31744,81 39,74 te te te te te 321,25 te 18,31 673,20 2,63 10,02 ±5,82x,y ±127,75h ±2,11q ±0,27f ±0,31u ±4,46j ±0,01h te ±0,04ı te te te 3 150,74 246637,13 37,03 12278,12 ±0,49y ±446,40b ±0,74q ±24,32c te te te te 320,01 ±0,41f te 28,73 1002,64 3,52 7,32 ±0,05s,t ±4,58h ±0,01h te ±0,01ı,j,k te te te *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, 2-HCA: 2-hidroksisinamik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit, RES: resveratrol. a–y Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 109 Çizelge 4.12. İğde yaprağı ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) CAT ECAT ECATG EGCAT EGCATG 2-HCA PCA FER RES Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te 2296,19 35,38 te 379,33 te 41,70 24,68 657,24 1,74 7,73 ±2,68u ±0,14q ±23,41a,b ±0,44b te te te ±0,02t ±0,20k ±0,03h te ±0,23ı,j,k te te te EA 2 te 2796,38 28,35 3108,95 345,48 te 30,58 te te te 10,35 525,31 0,72 5,18 ±11,59t ±1,51q ±6,20m,n ±16,73c ±0,30b ±0,13v ±0,39m ±0,03h te ±0,12k te te te 3 te 15074,67 te 4524,92 342,66 te 39,59 13,05 627,64 0,36 4,30 ±94,95o ±118,55j ±0,94c ±1,45b te te te ±0,16u,v ±1,31l ±0,03h te ±0,08k te te te 1 75,75 31234,41 te 11929,70 te te te te 249,08 te 16,16 819,83 te te 5,96 ±2,06y ±62,34ı ±67,38d ±12,19f ±0,13u ±0,57ı ±0,11j,k te te te B 2 112,42 9275,74 9734,38 ±1,56y ±16,76p te ±2,15g te te te te 266,80 ±0,33f te 13,03 423,61 6,63 ±0,52u,v ±2,14o te te ±0,08ı,j,k te te te 3 42,82 27056,94 te 10161,27 te te te te 256,07 te 16,64 508,77 4,67 ±0,01y ±145,49k ±41,27f ±0,98f ±0,05u ±1,14n te te ±0,01k te te te 1 te te te te 392,55 0,34 ±0,39a te te te te te te te ±0,02h te te te 1,73 ±0,01c te PE 2 te te te te 360,91 ±3,20b,c te te te te te te te 0,27 ±0,04h te te te te te 3 te te te te 371,45 0,38 1,61 ±1,71a,b,c te te te te te te te ±0,02h te te te ±0,01c te 1 te te te te te te te te te te te te te te te te te te H 2 te 23744,62 422,24 ±421,49l te ±1,75p te te te te te te te te te te te te te te 3 te te t e te te te te te te te te te te te te te te te *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, CAT: kateşin, ECAT: epikateşin, ECATG: epikateşin gallat, EGCAT: epigallokateşin, EGCATG: epigallokateşin gallat, 2-HCA: 2-hidroksisinamik asit, PCA: p-kumarik asit, FER: ferulik asit, RES: resveratrol. a–y Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 110 Çizelge 4.12. İğde yaprağı ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) PRCA VAN GA ELA QU MYR LU KAM KAMG IQU Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te 113,44 te 614,33 638,11 1126,74 108,42 796,33 293,76 ±0,25c ±0,97a ±15,30c ±3,39b te te te te te ±0,22b te te te te ±2,23c te te ±0,49l W 2 te 425,10 te te 217,70 318,16 ±0,98a ±18,83e ±1,24d te te te te te te te te te te te 731,22 ±3,28e te te 3 te 133,64 378,40 664,77 2601,29 758,06 ±1,57b te ±2,93b ±0,85c ±16,57a ±5,87a te te te te 118,16 te te te te te 343,86 te 324,04 ±0,65a ±1,86n ±0,16j 1 0,13 te te te te te 97,90 te te te te te te te 32,39 55,11 363,11 807,13 115,94 641,91 ±0,03e ±3,49b ±0,56l ±0,14f ±0,33m ±2,27b ±0,15p ±10,19a M 2 1,33 te te te te te te te te 186,40 16,42 31,08 239,01 810,88 54,44 368,10 ±0,12d,e ±1,60b te te te te ±0,39n ±0,07l ±0,90q ±9,98b ±0,30r ±4,17ı 3 2,49 ±0,09d te te te te te te te te 69,76 ±0,57d te te te te 33,47 36,70 408,07 768,46 107,96 566,77 ±0,23k,l ±0,22j,k ±1,11k ±2,39d ±0,08q ±1,27b 1 te te te te te te te te te te te te te te 32,84 42,17 617,74 465,82 ±0,11l ±0,80ı te ±6,25ı te ±5,86f E 2 te te te te te te te te te te te te te te 21,24 45,82 te 828,74 433,92 ±2,17m ±0,04h ±4,58a te ±0,59g 3 te te te te te te te te te te te te te te 32,83 50,37 te 685,31 te 496,20 ±6,61l ±0,55g ±4,17f ±0,11e 1 te te te te te te te te te te te te te te 5,38 39,95 te 653,21 507,99 ±0,05p ±0,03ı,j ±0,03h te ±3,51d A 2 te te te te te te te te te te te te te te te 30,87 te 667,99 te 305,00 ±0,28l ±5,79g ±1,36k 3 te te te te te te te te te te te te te te 5,76 79,63 689,96 547,38 ±0,03p ±0,49e te ±0,06f te ±5,86c *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, W: su, M: metanol, E: etanol, A: aseton, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, QU: kuersetin, MYR: mirisetin, LU: luteolin, KAM: kamferol, KAMG: kamferol-3-glikozit, IQU: izokuersitrin. a–y Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 111 Çizelge 4.12. İğde yaprağı ekstraktlarının fenolik bileşik içeriği (mg /kg örnek) (devam) PRCA VAN GA ELA QU MYR LU KAM KAMG IQU Çözücü Örnek SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH SE AH 1 te te te te te te 3,49 te te 169,92 ±0,01e ±1,57c te te te te te 465,08 519,47 289,56 ±1,44b te ±2,06j te ±1,16l EA 2 te te te te te te te te te 200,52 ±0,96a te te te te te 213,72 te 345,50 224,11 ±1,79c ±0,48n te ±1,29n 3 te te te te te te te te te te te te te te te 545,00 325,32 378,68 ±2,29a te ±4,95o te ±1,88h 1 te te te te te te te te te te te te te te te 57,54 388,88 320,88 ±1,53f te ±4,23l te ±2,72j B 2 te te te te te te 3,99 te te te te te te 69,07 te 31,35 6,04 324,64 183,57 ±0,04e ±0,01a ±0,57l ±0,08t ±1,75o te ±3,03o 3 te te te te te te te te te te te te te te 3,14 149,38 267,86 272,03 ±0,32p ±2,15d te ±0,87p te ±0,28m 1 te te te te te te te 46,09 ±0,17d te 28,53 ±0,08e te 14,73 24,08 3,92 12,68 ±0,06c te te te ±0,09m te ±0,02t te ±0,02t PE 2 te te te te te te te 52,63 29,90 ±0,17c te ±0,12e te te te te te 11,95 15,10 12,75 ±0,04o te ±0,07s te ±0,03t 3 te te te te te te te 48,44 ±0,23c,d te 28,66 14,78 ±0,12e te ±0,09c te te te 16,61 ±0,10n te te te 20,85 ±0,08s 1 te te te te te te te te te te te te te te te te te 10,64 te 15,65 ±0,05s,t ±0,08s,t H 2 te te te te te te te te te te te te te te te te te 41,82 ±0,10r te 20,45 ±0,08s 3 te te te te te te te te te te te te te te te te te 7,94 16,45 ±0,08t te ±0,08s,t *Ortalama (çift tekrar) ± Standart sapma, te: tespit edilemedi, EA: etil asetat, B: bütanol, PE: petrol eteri, H: hekzan, SE: çözücü ekstraksiyonu, AH: asidik hidroliz, PRCA: protokatekuik asit, VAN: vanilik asit, GA: gallik asit, ELA: ellagik asit, QU: kuersetin, MYR: mirisetin, LU: luteolin, KAM: kamferol, KAMG: kamferol-3-glikozit, IQU: izokuersitrin. a–y Farklı ekstraksiyon ortamlarında iğde örneklerindeki fenolik bileşen ortalamalarında önemli farklılıklar olduğunu gösterir (p < 0,05). 112 Epigallokateşin gallat ve epikateşin gallat epimerizasyonu sonucunda bozunma ürünü olarak gallik asit, epigallokateşin ve epikateşin miktarlarında artışlar oluşmaktadır. Aynı şekilde epikateşin gallat ve epikateşin epimerizasyonu sonucunda epikateşin gallat ve epikateşin miktarları azalırken, kateşin gallat ve kateşin miktarları artmaktadır. Ekstraksiyon sırasında ısıl işlem uygulandığında epigallokateşin gallat ve epikateşin gallat parçalanmakta ve gallik aside dönüşerek gallik asit miktarını arttırmaktadır. Ayrıca epigallokateşin gallat konsantrasyonu arttıkça, düşük pH’deki stabilitesi artar ve bozulması azalır. Epigallokateşin epimerizasyonda baskın olduğu için ısıl işlem sırasında miktarı artıyor gibi görünse de uzun süre ısıl işleme maruz kaldığında azalmaya başlar. Kateşinin oksidasyon hızı artan pH ile doğrudan arttığı için, kateşin genel olarak asidik ortamda kararlıdır (Li ve ark., 2012, 2013; Roginsky ve Alegria, 2005). Literatürdeki araştırmalara bakıldığında; Zhu ve ark. (2018) yaptığı çalışmada E. pungens yaprak ekstraktında kuersetin, kamferol ve isorhamnetin tespit edilmiştir. Ishaq ve ark. (2015) yaptığı çalışmada iğde (E. umbellata) meyvesinin sıcak sulu ekstraktında gallik asit (0,286 ± 0,010 µg /g), vanilik asit (0,781 ± 0,04 µg /g), sinapik asit (1,24 ± 0,1 µg /g), kumarik asit (3,00 ± 0,07 µg /g), ferulik asit (0,81 ± 0,06 µg /g) ve kafeik asit (3,19 ± 0,2 µg /g) tespit edilmiştir. İğde (E. umbellata) meyvesi ve yaprağı ile farklı çözücü ortamlarında yapılan bir çalışmada; iğde meyvesi etil asetat ekstraktında fumarik asit (2600,36 mg /kg), 4-hidroksibenzoik asit (10,00 mg /kg), rutin (0,32 mg /kg) ve morin (5,79 mg /kg); iğde meyvesi etanol ekstraktında fumarik asit (273,90 mg /kg) ve 4- hidroksibenzoik asit (3,35 mg /kg); iğde meyvesi aseton ekstraktında fumarik asit (425,56 mg /kg), gentisik asit (6,25 mg /kg), 4-hidroksibenzoik asit (3,66 mg /kg) ve morin (9,72 mg /kg); iğde meyvesi metanol ekstraktı fumarik asit (1203,01 mg /kg) ve 4- hidroksibenzoik asit (9,68 mg /kg); iğde meyvesi su ekstraktı fumarik asit (1770,71 mg /kg) ve 4-hidroksibenzoik asit (10,30 mg /kg); iğde yaprağı etil asetat ekstraktı fumarik asit (7,82 mg /kg), genistik asit (6,95 mg /kg), 4-hidroksibenzoik asit (10,00 mg /kg), siringik asit (17,52 mg /kg), rutin (116,00 mg /kg), ellagik asit (1,16 mg /kg), kuersetin- 3-β-D-glikozit (1,59 mg /kg), naringin (4,35 mg /kg), neohesperidin (110,64 mg /kg), hesperidin (175,09 mg /kg), morin (10,61 mg /kg) ve sinamik asit (8,60 mg /kg); iğde yaprağı aseton ekstraktı fumarik ekstraktı (1359,82 mg /kg), 4-hidroksibenzoik asit (18,34 mg /kg), vanilik asit (18,13 mg /kg), rutin (236,43 mg /kg), kuersetin-3-β-D- 113 glikozit (1,12 mg /kg), naringin (7,02 mg /kg), diosmin (74,35 mg /kg), neohesperidin (223,87 mg /kg), hesperidin (356,11 mg /kg) ve morin (25,15 mg /kg); iğde yaprağı etanol ekstraktı fumarik ekstraktı (2113,06 mg /kg), genistik asit (12,31 mg /kg), 4- hidroksibenzoik asit (12,07 mg /kg), vanilik asit (13,76 mg /kg), siringik asit (30,74 mg /kg), rutin (326,55 mg /kg), ellagik asit (146,54 mg /kg), kuersetin-3-β-D-glikozit (14,80 mg /kg), naringin (12,84 mg /kg), neohesperidin (312,22 mg /kg) ve hesperidin (498,05 mg /kg); iğde yaprağı metanol ekstraktı fumarik ekstraktı (4767,98 mg /kg), genistik asit (15,17 mg /kg), 4-hidroksibenzoik asit (14,44 mg /kg), protokatekuik asit (34,76 mg /kg), siringik asit (38,01 mg /kg), rutin (412,32 mg /kg), ellagik asit (225,89 mg /kg), kuersetin- 3-β-D-glikozit (13,08 mg /kg), naringin (15,34 mg /kg), neohesperidin (388,43 mg /kg) ve hesperidin (623,78 mg /kg); iğde yaprağı su ekstraktı fumarik ekstraktı (131,67 mg /kg), genistik asit (10,52 mg /kg), kateşin (13,79 mg /kg), 4-hidroksibenzoik asit (9,82 mg /kg), protokatekuik asit (22,97 mg /kg), vanilik asit (10,92 mg /kg), siringik asit (25,27 mg /kg), rutin (160,43 mg /kg), ellagik asit (71,34 mg /kg), kuersetin-3-β-D-glikozit (0,75 mg /kg), naringin (5,21 mg /kg), diosmin (44,36 mg /kg), neohesperidin (152,17 mg /kg), hesperidin (241,93 mg /kg) ve morin (14,88 mg /kg) tespit edilmiştir (Ozen ve ark., 2017). Nazir ve ark. (2018) tarafından yapılan bir çalışmada ise, HPLC-UV ile iğde (E. umbellata Thunb.) meyvesi metanol ekstraktında malik asit, gallik asit, askorbik asit, klorojenik asit, epigallokateşin gallat, kuersetin, morin, ellagik asit, kateşin hidrat, rutin, pirogalol ve mandelik asit; kloroform ekstraktında klorojenik asit, epigallokateşin gallat, kuersetin, morin, ellagik asit, kateşin hidrat, rutin ve pirogalol; etil asetat ekstraktında gallik asit, kuersetin, rutin, pirogalol ve mandelik asit fenolik bileşikleri tespit edilmiştir. 114 4.3. İğde Ununun Fizikokimyasal Özellikleri İğde ununun toplam yağ, toplam şeker, toplam protein, toplam nişasta, toplam karbohidrat, toplam diyet lif, kuru madde, nem, kül ve titre edilebilir asitlik içerikleri Çizelge 4.13’te verilmiştir. Çizelge 4.13. İğde ununun fizikokimyasal özellikleri Fizikokimyasal Özellik (%) Toplam yağ 11,67 ± 0,31 Toplam protein 5,98 ± 0,38 Toplam nişasta 10,70 ± 0,10 Toplam şeker 47,06 ± 3,38 Toplam karbohidrat 57,76 ± 3,38 Kuru madde 71,35 ± 0,63 Nem 28,65 ± 0,63 Kül 2,59 ± 0,02 Asitlik 1,30 ± 0,01 Diyet Lif 19,65 ± 0,35 Cansev ve ark. (2011) yaptığı çalışmada Elaeagnus angustifolia meyvesinin protein içeriği %4,64 ± 0,88; toplam çözünebilir şeker içeriği %70,61 ± 3,76; yağ içeriği %0,47 ± 0,10; nem içeriği %26,52 ± 0,16; kül içeriği %1,24 ± 0,09; ham lif içeriği %4,07 ± 0,19 ve toplam titre edilebilir asitlik değeri %1,84 ± 0,68 olarak bulunmuştur. 115 4.4. İğde Ununun Sterilizasyonu İğde ununun sterilizasyon öncesi ve 121°C’de belirli sürelerde (1, 2, 3, 4 ve 5 dk) sterilizasyonu sonrası belirlenen toplam fenolik madde, toplam yağ, toplam şeker, toplam protein, toplam nişasta ve toplam karbohidrat içerikleri Çizelge 4.14’te verilmiştir. Elde edilen veriler MİNİTAB 17.0 (Minitab Inc., Stage College, PA) istatistik programı kullanılarak tek yönlü ANOVA (sterilizasyon süreleri her bir fizikokimyasal özellik için için ayrı ayrı olarak, p < 0,05) ile istatiksel olarak analiz edilmiştir. Çizelge 4.14. İğde ununun sterilizasyon öncesi ve sonrası fizikokimyasal özellikleri Zaman TY TP TN TS TK TPC (dk) (%) (%) (%) (%) (%) (mg GAE/g) 0 11,67±0,31f 5,98±0,38d 10,70±0,10c 47,06±3,38b 57,76±3,38d 18,83±1,09c 1 12,31±0,74c 5,95±0,38d 3,90±0,19f 42,80±3,07f 46,70±3,08f 18,18±0,83c 2 12,39±0,88b 6,20±0,40c 10,12±0,70d 51,87±3,73a 61,99±3,80b 20,28±0,41b 3 14,29±0,10a 6,25±0,40c 6,54±0,01e 46,64±3,35c 53,18±3,35e 21,11±0,51a,b 4 11,71±0,89e 6,67±0,43a 16,08±0,47b 44,54±3,20e 60,62±3,23c 20,47±0,50b 5 11,82±0,31d 6,54±0,42b 18,70±2,09a 46,02±3,31d 64,73±3,91a 22,11±0,46a TY: toplam yağ, TP: toplam protein, TN: toplam nişasta, TS: toplam şeker, TK: toplam karbohidrat, TPC: toplam fenolik madde 116 İğde ununun farklı sterilizasyon süreleri sonucunda elde edilen veriler ile sterilize edilmeyen iğde unu (0. dk) verileri ANOVA kullanılarak istatistiksel olarak incelenmiş ve belirlenen p-değerleri Çizelge 4.15’te verilmiştir. Çizelge 4.15. İğde ununun sterilizasyonunun istatistiksel analizi p-değeri 0 - 1 dk 0,76 0 - 2 dk 0,89 0 - 3 dk 0,96 0 - 4 dk 0,92 0 - 5 dk 0,82 Sterilize edilmeyen iğde unu ile 1 dk sterilize edilmiş iğde ununun fizikokimyasal özellikleri arasında % 24 benzerlik olduğu ve sterilizasyon süresi arttıkça benzerlik oranında azalmalar olduğu görülmüştür. Bu nedenle enkapsülasyon işleminde kullanılacak olan iğde ununun 121°C’de optimum sterilizasyon süresi 1 dk olarak belirlenmiştir. 117 4.5. Probiyotik Bakterinin İğde Unu Üzerine Enkapsüle Edilmesi ve Optimum Koşulların Belirlenmesi L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin iğde unu üzerine enkapsüle edilmesi için optimum koşulları belirlerken Çizelge 3.6’da verilen deneysel parametreler Şekil 3.5’te belirtilen analiz şemasına göre gerçekleştirilmiştir. Elde edilen mikrokapsüllerin bakteri sayımları gerçekleştirilerek enkapsülasyon verimleri (%) hesaplanmış ve elde edilen verilerin Design Expert 7.0.0 (Stat-Ease inc. USA) programı kullanılarak ANOVA analizleri gerçekleştirilmiştir. ANOVA analizi sonrası L. casei ve L. acidophilus için Çizelge 4.16’te verilen ikinci dereceden polinom denklemleri hesaplanmıştır. Çizelge 4.16. L. casei ve L. acidophilus için ikinci dereceden polinom denklemleri Bakteri Türü İkinci dereceden polinom denklemi L. casei y=82,62+2,79x1-0,074x2-1,13x3-0,59x1x2-0,83x1x3+1,98x 21 +2,06x 22 L. acidophilus y=62,60-1,73x1-0,68x2-0,81x3+1,04x 2 2 21x2+2,55x2x3+1,64x1 +1,04x2 +2,90x3 x1; ekstraksiyon sıcaklığı, x2; ekstraksiyon zamanı, x3; iğde unu miktarı İğde unu üzerine probiyotik bakterilerin enkapsülasyonunda etkili faktörlerin (ekstraksiyon sıcaklığı (°C), ekstraksiyon zamanı (dk) ve iğde unu miktarı (%)) ANOVA analizine göre enkapsülasyon verimi üzerindeki etkisini gösteren yüzey analiz grafikleri Şekil 4.6’da (L. casei) ve Şekil 4.7’de (L. acidophilus) verilmiştir. 118 Şekil 4.6. İğde unu üzerine L.casei probiyotik bakterisinin enkapsülasyon verimi için üç boyutlu yüzey analizi grafikleri A) ekstraksiyon zamanı ve ekstraksiyon sıcaklığının enkapsülasyon verimine etkisi, B) iğde unu miktarı ve ekstraksiyon sıcaklığının enkapsülasyon verimine etkisi 119 İğde unu üzerine L.casei probiyotik bakterisinin enkapsülasyon verimi için ekstraksiyon süresi sabitken ekstraksiyon sıcaklığı arttıkça enkapsülasyon verimi artış göstermektedir. Aynı şekilde ekstraksiyon sıcaklığı sabitken ekstraksiyon zamanı arttıkça belirli bir süreye kadar enkapsülasyon verimi azalma gösterirken belirli bir süreden sonra artış göstermektedir. Ekstraksiyon sıcaklığı 38°C ve ekstraksiyon zamanı 69 dk iken enkapsülasyon verimi %100 iken ekstraksiyon zamanı 170 dk’ya çıkartıldığında verim %95’e düşmüştür. 22°C’de 170 dk enkapsülasyon işlemi gerçekleştirildiğinde enkapsülasyon verimi %90 civarında tespit edilmiştir (Şekil 4.1a). İğde unu miktarı ile ekstraksiyon sıcaklığı etkisi incelendiğinde iğde unu miktarı sabitken ekstraksiyon sıcaklığı arttıkça enkapsülasyon veriminin arttığı, ekstraksiyon sıcaklığı sabitken iğde unu miktarı arttıkça enkapsülasyon veriminde ciddi bir değişim olmadığı görülmüştür. İğde unu miktarı %0,32 iken yüksek sıcaklıkta (38°C) enkapsülasyon işlemi gerçekleştirildiğinde verim %97’lere ulaşmıştır (Şekil 4.1b). 120 Şekil 4.7. İğde unu üzerine L.acidophilus probiyotik bakterisinin enkapsülasyon verimi için üç boyutlu yüzey analizi grafikleri A) ekstraksiyon zamanı ve ekstraksiyon sıcaklığının enkapsülasyon verimine etkisi, B) iğde unu miktarı ve ekstraksiyon zamanının enkapsülasyon verimine etkisi 121 İğde unu üzerine L.acidophilus probiyotik bakterisinin enkapsülasyon verimi için ekstraksiyon süresi sabitken ekstraksiyon sıcaklığı arttıkça enkapsülasyon verimi belirli bir sıcaklığa kadar azalmış (34°C) sıcaklık artmaya devam ettikçe enkapsülasyon verimi artış göstermeye başlamıştır. Enkapsülasyon işlemi 22°C’de ve 69 dk boyunca gerçekleştirildiğinde enkapsülasyon verimi maksimum seviyeye (%77) ulaşmıştır (Şekil 4.2a). İğde unu miktarı ile ekstraksiyon zamanının etkisi incelendiğinde iğde unu miktarı sabitken ekstraksiyon süresi arttıkça enkapsülasyon verimi azalmıştır. Ekstraksiyon süresi sabit tutulduğunda ise iğde unu miktarı %0,32’den %2 civarına gelene kadar enkapsülasyon verimi azalmış iğde unu miktarı daha fazla arttırıldığın enkapsülasyon verimi artmıştır. İğde unu miktarı minimum miktarda ekstraksiyon süreside en yüksek değerde iken ve iğde unu miktarı en yüksek miktarda ekstraksiyon süresi minimumda iken enkapsülasyon verimi en yüksek değerde bulunmuştur (Şekil 4.2b). Probiyotik bakterilerin enkapsülasyon veriminin yanıt değerleri için ANOVA analiz sonuçları Çizelge 4.17’de verilmiştir. Enkapsülasyon sonucu bulunan deneysel değerler (% Verim) ile ANOVA analizi sonucu bulunan tahmini değerler (% Verim) Çizelge 4.18’de verilmiştir. 122 Çizelge 4.17. Yanıt değerleri için ANOVA analizi sonuçları Yöntem L. casei (R2 = 0,9888) L. acidophilus (R2 = 0,9511) DF SS MS F değeri P değeri DF SS MS F değeri p değeri Model 9 240,81 26,76 97,88 <0,0001 9 271,69 30,19 21,62 <0,0001 Lack of fit 5 2,28 0,46 5,02 0,0505 5 9,59 1,92 2,19 0,2049 Pure error 5 0,45 0,091 5 4,38 0,88 DF: Serbestlik derecesi, SS: Karelerin toplamı, MS: Ortalamaların karesi 123 Çizelge 4.18. L. casei ve L. acidophilus için enkapsülasyon veriminin (%) tahmini ve deneysel değerlere sahip merkezi kompozit dizayn tasarımı Deney Enkapsülasyon Verimi (%) Numarası Faktörler L. casei L. acidophilus x1 x2 x3 Deneysel Tahmini Deneysel Tahmini 1 -1 -1 -1 83,40 83,79 70,90 69,52 2 1 -1 -1 92,50 92,19 64,45 64,73 3 -1 1 -1 85,42 85,39 70,74 71,18 4 1 1 -1 91,40 91,45 71,68 70,55 5 -1 -1 1 83,40 83,76 73,52 73,74 6 1 -1 1 88,42 88,86 68,80 67,45 7 -1 1 1 83,48 84,21 66,40 65,20 8 1 1 1 86,93 86,96 62,62 63,08 9 -1,18 0 0 84,50 83,84 69,45 70,15 10 1,18 0 0 93,14 93,22 63,75 64,34 11 0 -1,18 0 89,20 88,88 65,79 66,67 12 0 1,18 0 88,89 88,63 63,98 64,39 13 0 0 -1,18 85,00 85,14 71,56 72,18 14 0 0 1,18 82,07 81,34 68,77 69,44 15 0 0 0 83,08 82,92 62,26 62,60 16 0 0 0 83,16 82,92 61,27 62,60 17 0 0 0 82,39 82,92 64,00 62,60 18 0 0 0 83,17 82,92 62,23 62,60 19 0 0 0 82,82 82,92 63,16 62,60 20 0 0 0 82,78 82,92 62,90 62,60 124 Design Expert 7.0.0 (Stat-Ease inc. USA) programı kullanılarak gerçekleştirilen ANOVA analizleri sonucu ekstraksiyon sıcaklığı, ekstraksiyon zamanı ve iğde unu miktarı için belirlenen optimum koşullar ile bu optimum koşullarda belirlenen tahmini ve deneysel değerler Çizelge 4.19’da verilmiştir. Çizelge 4.19. Optimum çalışma koşulları ile tahmini ve deneysel değerler Optimum çalışma koşulları Maksimum enkapsülasyon verimi (%) Ekstraksiyon Ekstraksiyon İğde unu Tahmini Deneysel sıcaklığı zamanı miktarı (oC) (dk) (%) L. casei 36,5 142,47 0,60 93,84 93,66 ± 2,58 L. acidophilus 36,5 145,41 0,68 74,00 74,97 ± 1,34 Fermantasyon sonucu temel ürün olarak laktik asit oluşturan L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterileri iğde unu ile hazırlanan L. casei ve L. acidophilus kapsüllerinin özellikle süt ürünü gibi gıda ürünlerinde katkı maddesi olarak kullanılıp ürün özelliklerinin geliştirilebileceği düşünülmektedir. Bu hipotezi doğrulamak için L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterileri optimum enkapsülasyon koşullarında probiyotik bakterilerin enkapsülasyonunda sıklıkla kullanılan yağsız süt tozu ile enkapsüle edilmiştir. Süt tozu ile yapılan enkapsülasyon işleminde yağ içeriği %0,2, protein içeriği %33,0 ve laktoz içeriği %54,1 olan yağsız süt tozu kullanılmıştır. L. casei-yağsız süt tozu kapsüllerinin enkapsülasyon verimi %86,43 ± 1,66 olarak bulunmuş ve L. casei-iğde unu kapsüllerinin enkapsülasyon veriminden (%93,66 ± 2,58) düşük olduğu görülmüştür. L. acidophilus-yağsız süt tozu kapsüllerinin enkapsülasyon verimi ise %76,54 ± 2,15 olarak bulunmuş ve L. acidophilus-iğde unu kapsüllerinin enkapsülasyon veriminden (%74,97 ± 1,34) yaklaşık %1,5 yüksek olduğu görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlar iğde ununun probiyotik bakteri enkapsülasyonunda sıklıkla kullanılan yağsız süt tozu gibi kaplama materyallerine alternatif olarak kullanılabileceğini ve daha yüksek verimde kapsüllerin (yüksek canlılık) oluşturulacağını göstermiştir. 125 4.6. Serbest ve Enkapsüle Edilen Probiyotik Bakterilerin Depolama Süresince Canlılıkları MRS Broth içerisinde aktive edilen serbest probiyotik bakteriler ve iğde unu ile enkapsüle edilen probiyotik bakteriler -24°C’de 1 ay boyunca depolanmıştır. Depolamanın 0, 7, 14, 21 ve 28. günleri serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin mikrobiyolojik analizleri gerçekleştirilerek canlı bakteri sayısı log kob/mL ve log kob/g olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.20). Depolamanın başlangıcındaki canlı koloni sayısına karşılık haftalık olarak belirlenen canlı koloni sayısındaki kayıplar Çizelge 4.21’de verilerek Şekil 4.8’te grafiksel olarak gösterilmiştir. Çizelge 4.20. Depolama süresi boyunca serbest ve enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin canlılıkları (log kob /g-mL) Probiyotik bakteri canlılığı (log kob /g-mL) 0. Gün 7. Gün 14. Gün 21. Gün 28. Gün LCE 9,49 ± 0,42 9,04 ± 0,29 8,75 ± 0,25 8,41 ± 0,53 7,90 ± 0,09 LCS 11,01 ± 0,10 9,16 ± 0,04 9,05 ± 0,01 9,02 ± 0,04 8,89 ± 0,06 LAE 7,71 ± 0,15 7,29 ± 0,05 6,94 ± 0,01 6,63 ± 0,22 6,01 ± 0,17 LAS 9,44 ± 0,40 7,39 ± 0,18 7,35 ± 0,05 7,22 ± 0,01 7,18 ± 0,12 LCE: enkapsüle L. casei, LCS: serbest L. casei, LAE: enkapsüle L. acidophillus, LAS: serbest L. acidophillus 126 Çizelge 4.21. Depolama süresi boyunca serbest ve enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin canlılık kayıpları (%) Canlılık kaybı (%) 7. Gün 14. Gün 21. Gün 28. Gün LCE 4,74 ± 0,89 7,80 ± 1,04 11,49 ± 1,19 16,75 ± 0,15 LCS 16,84 ± 0,40 17,82 ±0,03 18,05 ± 0,37 19,29 ± 0,56 LAE 5,43 ± 0,61 9,99 ± 0,18 13,92 ± 0,01 21,66 ± 0,92 LAS 21,87 ± 0,24 22,17 ± 0,55 23,47 ± 0,11 23,99 ± 0,22 LCE: enkapsüle L. casei, LCS: serbest L. casei, LAE: enkapsüle L. acidophillus, LAS: serbest L. acidophillus 127 25 20 15 10 5 0 7. gün 14. gün 21. gün 28. gün LCE LCS LAE LAS Şekil 4.8. Depolama süresi boyunca serbest ve enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin canlılık kayıpları (LCE: enkapsüle L. casei, LCS: serbest L. casei, LAE: enkapsüle L. acidophillus, LAS: serbest L. acidophilus) Serbest ve enkapsüle edilen L. casei probiyotik bakterilerinin depolama süresince canlı koloni sayısında azalma görülmüştür. Serbest L. casei probiyotik bakterilerinde başlangıca göre 28 günün sonunda 2,12 log birimi canlılık kaybı gözlenirken, enkapsüle edilen L. casei probiyotik bakterilerinde 1,59 log birimi kadar canlılık kaybı görülmüştür. Depolamanın 7 ve 28. gün sonundaki canlılık kayıpları serbest L. casei probiyotik bakterileri ve enkapsüle edilen L. casei probiyotik bakterileri için sırasıyla; %4,74 ve %16,75 ile %16,84 ve %19,29 olarak tespit edilmiştir. 7. gün sonunda serbest L. casei probiyotik bakteri canlılığındaki kayıp enkapsüle edilen L. casei probiyotik bakterilerinin canlılığındaki kayıptan 3,5 kat daha fazladır. Aynı zamanda serbest L. casei probiyotik bakterilerinin 7 gün depolanmasının ardından meydana gelen canlılık kaybı enkapsüle edilen L. casei probiyotik bakterilerinin 28 gün depolamanın sonundaki canlılık kaybı kadardır. 128 Canlılık kaybı (%) Aynı şekilde serbest ve enkapsüle edilen L. acidophilus probiyotik bakterilerinin depolama süresince canlı koloni sayısında da azalma görülmüştür. Serbest L. acidophilus probiyotik bakterilerinde başlangıca göre 28 günlük depolama sonunda 2,26 log birimi canlılık kaybı gözlenirken, enkapsüle edilen L. acidophilus probiyotik bakterilerinde bu kayıp 1,70 log birimi olarak tespit edilmiştir. Serbest L. acidophilus probiyotik bakterileri ile enkapsüle edilen L. acidophilus probiyotik bakterilerinin 7 gün sonundaki canlılık kayıpları karşılaştırıldığında, serbest L. acidophilus probiyotik bakterilerinde (%21,87) enkapsüle edilen L. acidophilus probiyotik bakterilerinden (%5,43) 4 kat daha fazla kayıp oluştuğu görülmüştür. Ayrıca serbest L. acidophilus probiyotik bakterilerinde 7 gün sonunda oluşan canlılık kaybı enkapsüle probiyotik L. acidophilus bakterilerinin 28 gün sonundaki canlılık kaybı (%21,66) kadardır. İğde unu ile enkapsüle edilen probiyotik bakteriler depolama esnasında çevre koşullarına direkt olarak maruz kalmadığı için serbest probiyotik bakterilere göre daha yüksek dayanıklılık göstermişlerdir. İğde ununun probiyotik bakterileri sararak ortama karşı bariyer görevi görmesinin yanında prebiyotik özelliğe sahip olduğu için bakteriler tarafından besin kaynağı olarak kullanılmış ve serbest probiyotik bakterilere oranla enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin canlılıkları daha iyi korumuştur. Yapılan bir çalışmada emülsiyon yöntemi ile kaplama materyali olarak farklı derişimlerde aljinat kullanılarak L. acidophilus KPb4b bakterileri enkapsüle edilmiş ve +5°C’de dört hafta boyunca depolanmıştır. Aljinat derişiminin artmasıyla depolama süresince daha fazla bakterinin canlı kaldığı görülmüştür (İşleyen, 2018). Başka bir çalışmada emülsiyon yöntemi ile L. casei Shirota probiyotik bakterisi aljinat, nişasta, jelatin ve kitosan kaplama materyallerinin farklı oranlarda kullanılması ile enkapsüle edilmiştir. Kapsüller 4°C ve 24°C’de sekiz hafta boyunca depolanmış ve canlılıkları incelenmiştir. Serbest bakteriler 24°C’de depolamanın 4. haftasında canlılıklarını tamamen kaybetmiştir. Emülsiyon yöntemi ile elde edilen kapsüllerdeki bakterilerin canlılık kaybı ise %16,97-31,48 arasında bulunmuştur (Gül, 2015). 129 4.7. Serbest ve Enkapsüle Edilen Probiyotik Bakterilerin İn-vitro Gastrointestinal Ortamdaki Canlılıkları Literatür incelendiğinde in-vitro gastrointestinal analizlerde simüle mide ortamında sindirim süresi ve ortamın pH’si araştırmacılar arasında farklılıklar göstermektedir. Simüle mide ortamındaki sindirim, bazı çalışmalarda 90 dk kabul edilirken bazı çalışmalarda 120 dk olarak kabul edilmektedir. Mide sıvısının ortalama pH aralığının da 1,5 ile 2,5 arasında değiştiği görülmüştür. Serbest ve enkapsüle edilmiş L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerin simüle mide ortamındaki salım çalışmaları pH 2,0 ± 0,2 ortamında ve 30 dk’lık periyotlarla 120 dk boyunca gerçekleştirilmiştir. Simüle bağırsak ortamlarındaki canlıkları ise aynı şekilde 30 dk’lık periyotlarla 120 dk boyunca pH 7,0 ± 0,2 ortamında incelenmiştir. Çalışmalar simüle mide ve bağırsak ortamında ayrı ayrı ve ardışık olarak (90 dk SGF ortamı ardından 120 dk SIF ortamı ve 120 dk SGF ortamı ardından 120 dk SIF ortamı) gerçekleştirilmiştir. Serbest ve enkapsüle L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterileri için in-vitro gastrointestinal salım analizi sonrası tespit edilen canlı hücre sayısı (log kob/mL-g) ve canlılık (%) değerleri Çizelge 4.22’de verilmiştir. 130 Çizelge 4.22. İn-vitro gastrointestinal analiz sonrası serbest ve enkapsüle L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin canlılıkları Ortam Zaman Canlı bakteri sayısı (log kob /mL-g) Canlılık (%) (dk) LCE LCS LAE LAS LCE LCS LAE LAS Başlangıç 9,60±0,02 7,21±0,04 8,27±0,01 8,01±0,01 0 9,02±0,13 7,03±0,02 7,88±0,09 7,75±0,27 93,92±1,38 97,49±0,29 95,23±1,06 96,70±3,38 30 7,00±0,02 3,93±0,04 6,21±0,02 te 72,95±0,18 54,49±0,50 75,06±0,26 te SGF 60 5,56±0,04 te 3,54±0,09 te 57,87±0,45 te 42,80±1,07 te 90 5,17±0,04 te 3,39±0,12 te 53,86±0,44 te 40,98±1,51 te 120 5,06±0,17 te 3,00±0,01 te 52,74±1,76 te 36,28±0,01 te 0 9,59±0,17 7,25±0,01 8,04±0,03 7,98±0,03 99,86±1,78 100,00±0,12 97,19±0,39 99,68±0,35 30 8,81±0,18 7,20±0,03 7,83±0,01 7,85±0,02 91,73±1,84 99,84±0,37 94,65±0,09 98,05±0,30 SIF 60 8,63±0,51 7,10±0,05 7,69±0,23 7,66±0,09 89,90±5,30 98,51±0,69 92,98±2,81 95,63±1,13 90 8,38±0,63 6,91±0,01 7,18±0,16 7,20±0,07 87,25±6,55 95,81±0,15 86,87±1,89 89,94±0,82 120 8,14±0,85 6,80±0,02 6,92±0,38 6,79±0,24 84,84±8,88 94,28±0,27 83,62±4,59 84,72±2,98 SGF 90+120 5,22±0,76 te 3,73±0,11 te 54,40±7,87 te 45,05±1,29 te + SIF 120+120 3,80±0,14 te 3,00±0,01 te 39,59±1,50 te 36,28±0,01 te te: tespit edilemedi, LCE: enkapsüle L. casei, LCS: serbest L. casei, LAE: enkapsüle L. acidophilus, LAS: serbest L. acidophilus 131 Serbest ve iğde unu ile enkapsüle edilen L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerin simüle mide ortamındaki canlılıkları (%) Şekil 4.9’da verilmiştir. Serbest haldeki L. acidophilus probiyotik bakterileri SGF ortamında 30 dakika sonunda canlılığını tamamen kaybederken iğde unu ile enkapsüle edilen L. acidophilus probiyotik bakterileri SGF ortamında 120 dakika sonunda %36,28 oranında hayatta kalmıştır. Aynı şekilde serbest haldeki L. casei probiyotik bakterileri SGF ortamında 60 dakikanın sonunda canlılığını tamamen kaybederken enkapsüle edilen L. casei probiyotik bakterileri SGF ortamında 120 dakika sonunda %52,74 oranında hayatta kalmıştır. Mide ortamına maruz kalan serbest bakteriler mide sindiriminde hayatta kalmayı başaramamıştır, dolayısıyla probiyotiklerin asıl ulaşması gereken bağırsak ortamına ulaşmaları mümkün olmayacaktır. 100 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120 Zaman (dk) LCE LCS LAE LAS Şekil 4.9. Serbest ve iğde unu ile enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin SGF ortamındaki canlılıkları (LCE: enkapsüle L. casei, LCS: serbest L. casei, LAE: enkapsüle L. acidophilus, LAS: serbest L. acidophilus) 132 SGF ortamındaki canlılık (%) Serbest ve iğde unu ile enkapsüle edilen L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerin simüle bağırsak ortamındaki canlılıkları (%) Şekil 4.10’da verilmiştir. Serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin canlılıkları SIF ortamında 120 dakika boyunca az da olsa azalma göstermiştir. Ancak genel olarak SIF ortamındaki canlılıkları %84’ün üzerinde bulunmuştur. L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin canlılıklarının SIF ortamında korunduğu görülmüştür. Bu nedenle SGF ortamında bakterilerin canlı kalması önemlidir. 100 80 60 40 20 0 0 30 60 90 120 Zaman (dk) LCE LCS LAE LAS Şekil 4.10. Serbest ve iğde unu ile enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin SIF ortamındaki canlılıkları (LCE: enkapsüle L. casei, LCS: serbest L. casei, LAE: enkapsüle L. acidophillus, LAS: serbest L. acidophilus) 133 SIF ortamındaki canlılık (%) Serbest ve iğde unu ile enkapsüle edilen L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerin ardışık olarak simüle SGF ve SIF ortamındaki canlılıkları (%) Şekil 4.11’de verilmiştir. Simüle SGF ortamına (90 ve 120 dk) maruz bırakılmanın hemen ardından SIF ortamına (120 dk) alınan serbest ve enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin canlılıkları başlangıçtaki probiyotik bakteri canlılıkları ile karşılaştırılmıştır. Ardışık olarak simüle SGF ve SIF ortamındaki sindirim sonrasında serbest L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterileri canlılıklarını tamamen kaybetmiştir. Enkapsüle edilen L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin 90 dk SGF - 120 dk SIF sindirimi sonrası canlılıkları sırasıyla %54,40 ve %45,05 olarak bulunurken, 120 dk SGF - 120 dk SIF sindirimi sonrası canlılıkları sırasıyla %39,59 ve %36,28 olarak bulunmuştur. 100 80 60 40 20 0 90 120 Zaman (dk) LCE LCS LAE LAS Şekil 4.11. Serbest ve iğde unu ile enkapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin ardışık olarak SGF-SIF ortamındaki canlılıkları (LCE: enkapsüle L. casei, LCS: serbest L. casei, LAE: enkapsüle L. acidophillus, LAS: serbest L. acidophilus) 134 SGF-SIF ortamındaki canlılık (%) Yapılan bir çalışmada L. plantarum probiyotik bakterileri ekstrüzyon ve elektrosprey yöntemleri kullanılarak kaplama materyali olarak aljinat ile kaplanmış ve elde edilen mikrokapsüllerin SGF-SIF ortamlarındaki canlılıkları incelenmiştir. Kontrol örneğinin başlangıçtaki canlı bakteri sayısı 7,5 ± 0,20 log kob /mL bulunurken, SGF-SIF ortamından sonra 3,3 log birimi kadar canlılık kaybı meydana gelmiştir. Ekstrüzyon yöntemi ile elde edilen mikrokapsüllerin başlangıçtaki canlı bakteri sayısı 7,42 ± 1,21 log kob /mL iken, SGF-SIF ortamlarına maruz bırakıldıktan sonra canlılıkta 0,52 log birimi kadar düşüş gözlenmiştir. Elektrosprey yöntemi ile elde edilen mikrokapsüllerin başlangıçtaki canlı hücre sayısı 7,16 ± 1,05 log kob /mL iken SGF-SIF ortamlarına maruz bırakıldıktan sonra 1,11 log birimi kadar canlılık kaybı meydana gelmiştir. Sonuçlar ekstrüzyon ve elektrosprey yöntemleri ile enkapsüle edilen L. plantarum probiyotik bakterilerinin serbest probiyotik bakterilere göre SGF-SIF ortamına karşı çok daha fazla dirençli olduğunu göstermiştir (Tipigil, 2015). Başka bir çalışmada ise kaplama materyali olarak aljinat üzerine ekstrüzyon ve emülsiyon yöntemi ile enkapsüle edilen L. casei Shirota probiyotik bakterileri 90 dk simüle mide ortamında ardından da 90 dk bağırsak ortamında bekletilmiş ve canlılık kayıpları belirlenmiştir. Ekstrüzyon ve emülsiyon yöntemi ile elde edilen kapsüllerin mide ortamında canlılık kayıpları sırasıyla 2,08-2,83 log kob /g ve 2,62- 3,21 log kob /g birimi arasında bulunurken, serbest haldeki L. casei Shirota probiyotik bakterileri canlılıklarını tamamen kaybetmiştir. Ardından bağırsak ortamına alınan kapsüllerin canlılık oranlarında büyük bir değişiklik görülmemiştir (Gül, 2015). Benzer şekilde serbest ve enkapsüle B. adolescentis bakterileri ile yapılan gastrointestinal çalışmada mide ortamının ilk 60 dakikasında canlılık kaybının görüldüğü ancak bağırsak ortamında canlılık düzeyinin değişmediği görülmüştür (Annan ve ark., 2008). Lactobacillus’un üç faklı türü ile yapılan bir çalışmada simüle mide ortamında serbest halde bulunan bakterilerin 90. dakikada canlılıklarını kaybettiği tespit edilmiştir (Gbassi ve ark., 2009). 135 4.8. İğde Unu ve İğde Unu-Probiyotik Bakteri Kapsüllerinin FTIR Analizleri 121oC 1 dk boyunca sterilize edilmiş iğde unu, bakteri içermeden enkapsülasyon prosedürünün uygulandığı iğde unu ve optimum koşullarda L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterilerinin enkapsüle edildiği iğde unu örneklerinin liyofilizasyon sonrası FT-IR analiz sonuçları Şekil 4.12’de verilmiştir. 3600-3000 cm-1 dalga sayısı aralığındaki absorpsiyon bandı hidrojen bağı varlığından kaynaklanan O-H gruplarının gerilme titreşimlerini temsil etmektedir. Enkapsülasyon işlemiyle hidrojen bağı yoğunluğunun azaldığı görülmektedir. 3000-2800 cm-1 aralığındaki bantlar moleküler ve aromatik C-H varlığını temsil etmektedir (Coates, 2000; El Mouftari ve ark., 2021; Hirri ve ark., 2015). 2946-2881 cm-1 aralığındaki bantlar C-H (CH2) asimetrik gerilme titreşimlerini, 2881- 2782 cm-1 aralığındaki bantlar C-H (CH2) simetrik gerilme titreşimlerini, 1486-1446 cm- 1 aralığındaki bantlar C-H (CH2) bükülme (makaslama) titreşimlerini, 1382-1371 cm-1 aralığındaki bantlar C-H (CH2) bükülme (simetrik) titreşimlerini temsil etmektedir. 1290- 1072 cm-1 aralığındaki bantlar C-O (alkol) gerilme titreşimlerinin varlığını göstermektedir. 1795-1677 cm-1 aralığındaki bantlar C-O (ester) gerilme titreşimlerini temsil eder bu da trigliserit veya trigliseritlerin fonksiyonel grup karbonil esterinin varlığını belirtmektedir (Coates, 2000; El Mouftari ve ark., 2021; Guillén ve Cabo, 1997; Rohman ve Man, 2010). 1200-1000 cm-1 aralığındaki bantlar monosakkaritlerdeki pironoz halkasındaki gerilme titreşimlerinden kaynaklanmaktadır (C=O, C-O-C, C-OH). 1000-800 cm-1 aralığındaki bantlar ise glikozit bağların varlığını göstermektedir (Vaziri ve ark., 2018). Ayrıca 1500-500 cm-1 aralığındaki spektral bölge, hidrokarbonların C-H esneme ve gerilme titreşimlerini ve aromatik C=C-C titreşimlerini temsil etmektedir (Coates, 2000; El Mouftari ve ark., 2021). Genel olarak spektrumlar incelendiğinde enkapsülasyon öncesi ve sonrası iğde unu yapısında büyük bir farklılık görülmemiştir. Bu bize enkapsülasyon sonrası iğde ununun yapısında bir bozulma meydana gelmediğini göstermektedir. Enkapsülasyon işlemi esnasında kaplama materyalinin değişikliğe uğramaması probiyotik bakterilerin optimum şekilde kaplanması ve canlılıklarının korunması için oldukça önemlidir. Ca2+ ile gerçekleşen çapraz bağlanma sonucunda karboksil grubunda bir artış olduğu 136 düşünülmektedir. Karboksil grubunda yer alan C–O bağının titreşimleri b, c, ve d spektrumlarında sırasıyla 1734, 1733 ve 1734 cm-1 dalga sayısında görülmüştür. Ayrıca 1550 cm-1 dalga sayısında gözlenen küçük absorpsiyon değişimlerinin amino gruplarıyla gerçekleşen elektrostatik etkileşimlerden kaynaklanabileceği düşünülmektedir. FTIR spektrumunda gözlenen küçük değişimlerin iğde unu içerisine probiyotik bakterilerin enkapsülasyonu esnasında gerçekleşen hidrojen ve Van der Waals bağlarına dayandığını göstermektedir. 137 d 2854 1734 2921 1608 1236 c 1230 1733 2922 2853 1626 1232 b 1033 1734 2921 2854 1611 1241 a 1031 1721 2848 2930 1620 1241 1230 Dalga sayısı (cm -1) Şekil 4.12. İğde unu örneklerinin FT-IR spektrumları (a: sterilize edilmiş iğde unu, b: bakterisiz enkapsülasyon işlemi uygulanmış iğde unu, c: L. casei - iğde unu çifti, d: L. acidophilus - iğde unu çifti) 138 % Geçirgenlik 4.9. Kapsüllerin Yüzey Morfolojisi ve Boyutlarının Belirlenmesi L. casei-iğde unu ve L. acidophilus-iğde unu kapsüllerinin küreselliği liyofilizasyon sonrası bozularak düzensiz ve daha az küresel yapıya sahip, oldukça pürüzlü bir yüzeye dönüşmüştür. L. casei-iğde unu kapsüllerinin boyutları ortalama 104,8 ± 26,3 µm (Şekil 4.13) bulunurken L. acidophilus-iğde unu kapsülleri ortalama 95,7 ± 12,1 µm (Şekil 4.14) boyutlarında tespit edilmiştir. Mikrokapsül boyutlarındaki farklılıkların homojenizasyon aşamasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Şekil 4.13. L. casei-iğde unu kapsül boyutları 139 Şekil 4.14. L. acidophilus-iğde unu kapsül boyutları 140 121 oC 1 dk boyunca sterilize edilmiş iğde unu örneğinin 2000 X (Şekil 4.15a), 3000 X (Şekil 4.15b) ve 5000 X (Şekil 4.15c) büyütme ile SEM görüntüleri alınmıştır. Sterilize edilen iğde unu yüzeyinin oldukça pürüzsüz olduğu görülmektedir. Şekil 4.15a. Sterilize edilmiş iğde ununun 2000X büyütme SEM görüntüsü 141 Şekil 4.15b. Sterilize edilmiş iğde ununun 3000X büyütme SEM görüntüsü Şekil 4.15c. Sterilize edilmiş iğde ununun 5000X büyütme SEM görüntüsü 142 Bakteri içermeden enkapsülasyon prosedürünün uygulandığı iğde unu örneğinin 2000 X (Şekil 4.16a), 3000 X (Şekil 4.16b) ve 5000 X (Şekil 4.16c) büyütme ile SEM görüntüleri alınmıştır. Yüzey incelendiğinde karboksilat ve Ca2+ iyonları arasında gerçekleşen çapraz bağlar nedeniyle iğde unu yüzeyinde ıslak kürelerin oluştuğu görülmüştür (Liu ve ark., 2004; Vaziri ve ark., 2018). Şekil 4.16a. Bakterisiz enkapsüle edilen iğde ununun 2000X büyütme SEM görüntüsü 143 Şekil 4.16b. Bakterisiz enkapsüle edilen iğde ununun 3000X büyütme SEM görüntüsü Şekil 4.16c. Bakterisiz enkapsüle edilen iğde ununun 5000X büyütme SEM görüntüsü 144 Optimum koşullarda L. casei probiyotik bakterilerinin enkapsüle edildiği iğde unu örneklerinin liyofilize edildikten sonra 2000 X (Şekil 4.17a), 3000 X (Şekil 4.17b) ve 5000 X (Şekil 4.17c) büyütme ile SEM görüntüleri alınmıştır. Oluşturulan L. casei-iğde unu kapsüllerinde probiyotik bakterilerin kümeler oluşturarak büyük oranda iğde unu içerisine çubuk şeklinde gömüldüğü, çok az bir kısmın yüzeye tutunduğu ve yüzeylerin pürüzlü bir hal aldığı görülmüştür. Şekil 4.17a. L. casei-iğde unu kapsüllerinin 2000X büyütme SEM görüntüsü 145 Şekil 4.17b. L. casei-iğde unu kapsüllerinin 3000X büyütme SEM görüntüsü Şekil 4.17c. L. casei-iğde unu kapsüllerinin 5000X büyütme SEM görüntüsü 146 Optimum koşullarda L. acidophilus probiyotik bakterilerinin enkapsüle edildiği iğde unu örneklerinin liyofilize edildikten sonra 2000 X (Şekil 4.18a), 3000 X (Şekil 4.18b) ve 5000 X (Şekil 4.18c) büyütme ile SEM görüntüleri alınmıştır. Oluşturulan L. acidophilus -iğde unu kapsüllerinde probiyotik bakterilerin kümeler oluşturarak iğde unu içerisine çubuk şeklinde gömüldüğü ve yüzeylerin pürüzlü bir hal aldığı görülmüştür. Probiyotik bakteriler yüzeyde neredeyse hiç görülmediği için bakterilerin tamamen kapsüllerin içerisine enkapsüle edildiği sonucuna varılmıştır. Şekil 4.18a. L. acidophilus-iğde unu kapsüllerinin 2000X büyütme SEM görüntüsü 147 Şekil 4.18b. L. acidophilus-iğde unu kapsüllerinin 3000X büyütme SEM görüntüsü Şekil 4.18c. L. acidophilus-iğde unu kapsüllerinin 5000X büyütme SEM görüntüsü 148 5. SONUÇ Yapılan çalışmada tıbbi özelliklerinden dolayı bitkisel ilaç olarak da kullanılan iğde (Elaeagnus angustifolia L.) meyvesi seçilmiştir. Farklı lokasyonlardan toplanan iğde örneklerinin un, kabuk, çekirdek, yaprak ve çiçek kısımlarının sekiz farklı çözücü kullanılarak ultrasonik destekli ekstraksiyon ile çözücü ekstraktları ve asidik hidroliz ekstraktları hazırlanmıştır. Hazırlanan ekstraktların toplam fenolik madde, toplam flavonoid, toplam karotenoid miktarları ve antioksidan kapasite değerleri belirlenmiştir. İğde kısımlarının farklı çözücü ortamlarındaki fenolik bileşik profilleri HPLC-DAD ile kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmiştir. Geniş fenolik bileşen içeriği nedeniyle antioksidan, antienflamatuar, antimutajenik, antitüssif, antitümör, antiartritik, antimikrobiyal ve hepatoprotektif gibi tedavi edici özelliklere sahip olduğu bilinmektedir. Genel olarak iğdenin fenolik bileşik içeriği ve antioksidan özellikleri bitkinin yetiştiği coğrafi bölgeye, bitkinin kısımlarına ve ekstraksiyon koşullarına göre farklılık göstermektedir. Fenolik bileşen içeriği belirlenen iğdenin çeşitli bölümlerinin dejeneratif hastalıklara karşı kullanılabilecek doğal bir kaynak olabileceği düşünülmektedir. Çalışmanın ikinci kısmında iğde ununun toplam yağ, toplam şeker, toplam protein, toplam nişasta, toplam karbohidrat, toplam diyet lif, kuru madde, nem, kül ve titre edilebilir asitlik içerikleri belirlenmiştir. İğde ununun sahip olduğu bu içeriklerin yanında spesifik kokusu ve tadı aynı zamanda potansiyel olarak prebiyotik özelliğe sahip olması probiyotik bakterilerin enkapsülasyon işlemi için kaplama materyali olarak kullanılabileceğini göstermektedir. L. casei ve L. acidophilus probiyotik bakterileri fonksiyonel bir gıda ürünü olan iğde unu üzerine emülsiyon tekniği kullanılarak kapsüllenmiştir. Probiyotik bakterilerin iğde unu üzerine maksimum enkapsülasyon verimi ile enkapsüle edilebilmesi için karıştırma sıcaklığı (°C), karıştırma süresi (dk) ve iğde unu miktarı (%) önemli faktörler olarak seçilerek kemometrik yöntemlerden merkezi kompozit dizayn kullanılarak optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. İğde unu ile oluşturulan L. casei mikrokapsüllerinin kapsülleme etkinliği %93,66 ± 2,58, L. acidophilus mikrokapsüllerinin kapsülleme etkinliği ise %74,97 ± 1,34 olarak bulunmuştur. Optimum koşullarda enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin depolama 149 süresince canlılık kaybı incelenmiştir. İğde unu ile enkapsüle edilen probiyotik bakteriler depolama esnasında çevre koşullarına direkt olarak maruz kalmadığı için serbest probiyotik bakterilere göre daha yüksek dayanıklılık gösterdiği tespit edilmiştir. Elde edilen kapsüllerin simüle gastrointestinal ortamdaki canlılıkları ayrı ayrı ve ardışık olarak incelenmiştir. Canlı bakteri sayısı 7,21 ± 0,04 log kob /mL olan serbest L. casei probiyotik bakterilerinin mide ortamındaki canlılığını 60 dakika sonra kaybettiği ve bağırsak ortamına ulaşamadığı görülmüştür. Canlı bakteri sayısı 9,60 ± 0,02 log kob /g olan kapsüllenmiş L. casei probiyotik bakterilerinin mide ortamından hemen sonra bağırsak ortamında sindirime maruz bırakıldığında bakteri canlılığını %39,59 ± 1,50 oranında koruduğu görülmüştür. Aynı şekilde serbest L. acidophilus (8,01 ± 0,01 log kob /mL) probiyotik bakterileri mide ortamında 30 dakika sonra canlılığını kaybettiği için bağırsak ortamına ulaşamamıştır. Ancak kapsüllenmiş L. acidophilus (8,27 ± 0,01 log kob /g) probiyotik bakterileri mide ortamında sindirildikten hemen sonra bağırsak ortamında sindirime maruz bırakılmış ve bakteri canlılığı %36,28 ± 0,01 olarak bulunmuştur. Elde edilen sonuçlar, iğde ununun probiyotik bakterileri sararak ortama karşı bariyer görevi görmesiyle serbest probiyotik bakterilere oranla enkapsüle edilen probiyotik bakterilerin depolama koşullarında ve simüle gastrointestinal ortamlardan geçiş sırasında probiyotik bakterilerin canlılığını ve hayatta kalmasını önemli ölçüde artırdığını göstermiştir. Hazırlanan kapsüllerin FTIR spektrumları ve SEM görüntüleri ile yapı ve yüzey analizleri gerçekleştirilerek boyutları belirlenmiştir. L. casei-iğde unu kapsüllerinin boyutları ortalama 104,8 ± 26,3 µm bulunurken L. acidophilus-iğde unu kapsülleri ortalama 95,7 ± 12,1 µm boyutlarında olduğu tespit edilmiştir. Yapılan çalışmada probiyotik bakterilerin emülsiyon yöntemi ile fenolik bileşik içeriği yüksek ve potansiyel prebiyotik özellikteki iğde unu ile kaplanması sonucu fonksiyonel bir gıda ürünü oluşturmak için gıda katkı maddesi olarak kullanılabilecek mikrokapsüller elde edilmiştir. Hazırlanan mikrokapsüller ile tüketicilere fonksiyonel süt ve süt ürünleri pazarında istedikleri damak tadına sahip yeni ürünler geliştirilerek bu ürünlerin endüstriyel anlamda kullanımının arttırılması ile ülke ekonomisine katkı sağlanabileceği düşünülmektedir. 150 KAYNAKLAR Abizov, E. A., Tolkachev, O. N., Mal’Tsev, S. D. ve Abizova, E. V. (2008). Composition of biologically active substances isolated from the fruits of Russian olive (Elaeagnus angustifolia) introduced in the European part of Russia. Pharmaceutical Chemistry Journal, 42(12), 696–698. https://doi.org/10.1007/s11094-009-0203-5 Aboulfazli, F., Baba, A. S. ve Misran, M. (2015). Effects of fermentation by Bifidobacterium bifidum on the rheology and physical properties of ice cream mixes made with cow and vegetable milks. International Journal of Food Science and Technology, 50(4), 942–949. https://doi.org/10.1111/ijfs.12723 Aboulfazli, F., Shori, A. B. ve Baba, A. S. (2016). Effects of the replacement of cow milk with vegetable milk on probiotics and nutritional profile of fermented ice cream. LWT - Food Science and Technology, 70, 261–270. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2016.02.056 Açu, M., Kinik, Ö. ve Yerlikaya, O. (2017). Functional properties of probiotic ice cream produced from goat’s milk. Carpathian Journal of Food Science and Technology, 9(4), 86–100. Akalin, A. S. ve Erişir, D. (2008). Effects of inulin and oligofructose on the rheological characteristics and probiotic culture survival in low-fat probiotic ice cream. Journal of Food Science, 73(4), M184-M188. https://doi.org/10.1111/j.1750- 3841.2008.00728.x Akalın, A. S., Kesenkas, H., Dinkci, N., Unal, G., Ozer, E. ve Kınık, O. (2018). Enrichment of probiotic ice cream with different dietary fibers: Structural characteristics and culture viability. Journal of Dairy Science, 101(1), 37–46. https://doi.org/10.3168/jds.2017-13468 Akin, M. B., Akin, M. S. ve Kirmaci, Z. (2007). Effects of inulin and sugar levels on the viability of yogurt and probiotic bacteria and the physical and sensory characteristics in probiotic ice-cream. Food Chemistry, 104(1), 93–99. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2006.11.030 Akın, M. B. ve Dasnik, F. (2015). Utjecaj različitih koncentracija askorbinske kiseline i glukoza oksidaze na preživljavanje probiotičkih bakterija i na fizikalna i senzorska svojstva u simbiotičkom sladoledu. Mljekarstvo: časopis za unaprjeđenje proizvodnje i prerade mlijeka, 65(2), 121–129. https://doi.org/10.15567/mljekarstvo.2015.0206 Akyüz, E. (2011). Digitalis ferruginea ssp. schischkinii ve bazı endemik digitalis türlerinin ekstraktlarında mevcut kardiyak glikozitleri ve fenolik bileşiklerin kromatografik yöntemlerle belirlenmesi (Doctoral dissertation, Karadeniz Teknik Üniversitesi/Fen Bilimleri Enstitüsü). Annan, N. T., Borza, A. D. ve Hansen, L. T. (2008). Encapsulation in alginate-coated gelatin microspheres improves survival of the probiotic Bifidobacterium adolescentis 15703T during exposure to simulated gastro-intestinal conditions. Food Research International, 41(2), 184–193. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2007.11.001 AOAC 920.39 (2005). Fat (crude) or ether extract in animal feed. Official methods of analysis of AOAC International. 151 AOAC 968.28.1969 (2000). Total sugars in molasses as invert sugar. Official methods of analysis of AOAC International. AOAC 991.20 (2005). Nitrogen (Total) in milk, Kjeldahl Methods. Official methods of analysis of AOAC International. AOAC 991.43 (1994). Total, Soluble, and Insoluble Dietary Fibre in Foods. Official methods of analysis of AOAC International. Atak, E. ve Uslu, M. E. (2018). Fenolik Bileşikler, Ekstraksiyon Metotları ve Analiz Yöntemleri. MCBÜ Soma Meslek Yüksekokulu Teknik Bilimler Dergisi, 3(27), 39– 48. Retrieved from https://dergipark.org.tr/tr/pub/somatbd/issue/40237/480250 Beldarrain-Iznaga, T., Villalobos-Carvajal, R., Sevillano-Armesto, E., & Leiva-Vega, J. (2021). Functional properties of Lactobacillus casei C24 improved by microencapsulation using multilayer double emulsion. Food Research International, 141, 110136. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2021.110136 Benzie, I. F. F. ve Strain, J. J. (1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay. Analytical Biochemistry, 239(1), 70–76. https://doi.org/10.1006/abio.1996.0292 Biehler, E., Mayer, F., Hoffmann, L., Krause, E. ve Bohn, T. (2010). Comparison of 3 spectrophotometric methods for carotenoid determination in frequently consumed fruits and vegetables. Journal of Food Science, 75(1), 55–61. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2009.01417.x Boza-Mendez, E., Lopez-Calvo, R. ve Cortes-Munoz, M. (2012). Innovative Dairy Products Development Using Probiotics: Challenges and Limitations. In. Tech, Costarica, 10, 213-236. https://doi.org/10.5772/50104 Burgain, J., Gaiani, C., Linder, M. ve Scher, J. (2011). Encapsulation of probiotic living cells: From laboratory scale to industrial applications. Journal of Food Engineering, 104(4), 467–483. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2010.12.031 Çakmakçi, S., Topdaş, E. F., Kalin, P., Han, H., Şekerci, P., P. Köse, L. ve Gülçin, I. (2015). Antioxidant capacity and functionality of oleaster (Elaeagnus angustifolia L.) flour and crust in a new kind of fruity ice cream. International Journal of Food Science and Technology, 50(2), 472–481. https://doi.org/10.1111/ijfs.12637 Cansev, A., Sahan, Y., Celik, G., Taskesen, S. ve Ozbey, H. (2011). Chemical Properties and Antioxidant Capacity of Elaeagnus angustifolia L. Fruits. Asian Journal of Chemistry, 23(6), 2661–2665. Capela, P., Hay, T. K. C. ve Shah, N. P. (2007). Effect of homogenisation on bead size and survival of encapsulated probiotic bacteria. Food Research International, 40(10), 1261–1269. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2007.08.006 Carradori, S., Cairone, F., Garzoli, S., Fabrizi, G., Iazzetti, A., Giusti, A. M., Menghini, L., Uysal, S., Ak, G., Zengin, G. ve Cesa, S. (2020). Phytocomplex Characterization and Biological. Molecules, 25, 1–19. https://doi.org/doi:10.3390/molecules25092021 Cemeroğlu, B. ve Acar, J. (1986). Meyve ve Sebze İşleme Teknolojisi. Ankara. Chaikham, P. ve Rattanasena, P. (2017). Combined effects of low-fat ice cream supplemented with probiotics on colon microfloral communities and their metabolites during fermentation in a human gut reactor. Food Bioscience, 17, 35– 41. https://doi.org/10.1016/j.fbio.2016.12.005 Champagne, C. P., Raymond, Y., Guertin, N. ve Bélanger, G. (2015). Effects of storage 152 conditions, microencapsulation and inclusion in chocolate particles on the stability of probiotic bacteria in ice cream. International Dairy Journal, 47, 109–117. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2015.03.003 Chen, M. J. ve Chen, K. N. (2007). Applications of Probiotic Encapsulation in Dairy Products. Encapsulation and Controlled Release Technologies in Food Systems, 83– 112. https://doi.org/10.1002/9780470277881.ch4 Coates, J. (2000). Interpretation of Infrared Spectra, a Practical Approach, in Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. A. (Ed.), Wiley, Chichester, UK, (s. 10815-10837). Coşkun, T. (2005). Fonksiyonel besinlerin sağlığımız üzerine etkileri. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 48, 69–84. Cruz, A. G., Antunes, A. E. C., Sousa, A. L. O. P., Faria, J. A. F. ve Saad, S. M. I. (2009). Ice-cream as a probiotic food carrier. Food Research International, 42(9), 1233– 1239. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2009.03.020 Davani-Davari, D., Negahdaripour, M., Karimzadeh, I., Seifan, M., Mohkam, M., Masoumi, S. J., Berenjian, A. ve Ghasemi, Y. (2019). Prebiotics: Definition, types, sources, mechanisms, and clinical applications. Foods, 8(3), 1–27. https://doi.org/10.3390/foods8030092 de Vos, P., Faas, M. M., Spasojevic, M. ve Sikkema, J. (2010). Encapsulation for preservation of functionality and targeted delivery of bioactive food components. International Dairy Journal, 20(4), 292–302. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2009.11.008 del Castillo, M. D., Iriondo-DeHond, A. ve Martirosyan, D. M. (2018). Are Functional Foods Essential for Sustainable Health?. Annals of Nutrition & Food Science, 2(1), 1015. Retrieved from www.health.harvard.edu. Ding, W. K. ve Shah, N. P. (2009). Effect of homogenization techniques on reducing the size of microcapsules and the survival of probiotic bacteria therein. Journal of Food Science, 74(6), 231–236. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2009.01195.x El Mouftari, M., Mahjoubi, F. Z., Kzaiber, F., Terouzi, W., Ali, G. A. M., Souhassou, S. ve Oussama, A. (2021). Study of oleaster oil’s falsification by ATR-FTIR and chemometrics tools. Egyptian Journal of Chemistry, 64(6), 2747–2755. https://doi.org/10.21608/ejchem.2021.53644.3107 Farahmand, A., Ghorani, B., Emadzadeh, B., Sarabi-Jamab, M., Emadzadeh, M., Modiri, A., & Tucker, N. (2022). Millifluidic-assisted ionic gelation technique for encapsulation of probiotics in double-layered polysaccharide structure. Food Research International, 160, 111699. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2022.111699 Faramarz, S., Dehghan, G. ve Jahanban-Esfahlan, A. (2015). Antioxidants in different parts of oleaster as a function of genotype. BioImpacts, 5(2), 79–85. https://doi.org/10.15171/bi.2015.09 Gbassi, G. K., Vandamme, T., Ennahar, S. ve Marchioni, E. (2009). Microencapsulation of Lactobacillus plantarum spp in an alginate matrix coated with whey proteins. International Journal of Food Microbiology, 129(1), 103–105. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2008.11.012 George Kerry, R., Patra, J. K., Gouda, S., Park, Y., Shin, H. S. ve Das, G. (2018). Benefaction of probiotics for human health: A review. Journal of Food and Drug Analysis, 26(3), 927–939. https://doi.org/10.1016/j.jfda.2018.01.002 153 Ghalehjooghi, H. D., Tajik, H., & Shahbazi, Y. (2023). Development and characterization of active packaging nanofiber mats based on gelatin sodium alginate containing probiotic microorganisms to improve the shelf-life and safety quality of silver carp fillets. International Journal of Food Microbiology, 384, 109984. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2022.109984 Gibson, G. R., Hutkins, R., Sanders, M. E., Prescott, S. L., Reimer, R. A., Salminen, S. J., Scott, K., Stanton, C., Swanson, K. S., Cani, P. D., Verbeke, K. ve Reid, G. (2017). Expert consensus document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology, 14(8), 491–502. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.75 Gismondo, M. R., Drago, L. ve Lombardi, A. (1999). Review of probiotics available to modify gastrointestinal flora. International Journal of Antimicrobial Agents, 12(4), 287–292. https://doi.org/10.1016/S0924-8579(99)00050-3 GMMAM (Gıda Maddeleri Muayene ve analiz Metodları). (1988). Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü. (s. 418). Gouin, S. (2004). Microencapsulation: Industrial appraisal of existing technologies and trends. Trends in Food Science and Technology, 15(7–8), 330–347. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2003.10.005 Guillén, M. D. ve Cabo, N. (1997). Characterization of edible oils and lard by fourier transform infrared spectroscopy. Relationships between composition and frequency of concrete bands in the fingerprint region. JAOCS, Journal of the American Oil Chemists’ Society, 74(10), 1281–1286. https://doi.org/10.1007/s11746-997-0058-4 Gül, O. (2015). Lactobacillus casei Shirota’nın çeşitli yöntemlerle mikroenkapsülasyonu. [Doktora tezi]. Ondokuz Mayıs Üniversitesi Hassanzadeh, Z. ve Hassanpour, H. (2018). Evaluation of physicochemical characteristics and antioxidant properties of Elaeagnus angustifolia L. Scientia Horticulturae, 238, 83–90. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2018.04.041 Heidebach, T., Först, P. ve Kulozik, U. (2009). Microencapsulation of probiotic cells by means of rennet-gelation of milk proteins. Food Hydrocolloids, 23(7), 1670–1677. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2009.01.006 Hill, D., Sugrue, I., Tobin, C., Hill, C., Stanton, C. ve Ross, R. P. (2018). The Lactobacillus casei group: History and health related applications. Frontiers in Microbiology, 9, 1–12. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02107 Hirri, A., Gammouh, M., Gorfti, A., Kzaiber, F., Bassbasi, M., Souhassou, S., Balouki, A. ve Oussama, A. (2015). The use of Fourier transform mid infrared (FT-MIR) spectroscopy for detection and estimation of extra virgin olive oil adulteration with old olive oil. Sky Journal of Food Science, 4(5), 60–66. Retrieved from http://www.skyjournals.org/SJFS Homayouni, A., Azizi, A., Ehsani, M. R., Yarmand, M. S. ve Razavi, S. H. (2008). Effect of microencapsulation and resistant starch on the probiotic survival and sensory properties of synbiotic ice cream. Food Chemistry, 111(1), 50–55. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.03.036 Huojiaaihemaiti, H., Fang, L. C., Ning, H. X., Mutaillifu, P., Abudukelimu, N., Nuerxiati, R., ... & Yili, A. (2022). Polysaccharides from Fruit of Elaeagnus angustifolia and Their Antioxidant Activity. Chemistry of Natural Compounds, 58(6), 991-994. 154 https://doi.org/10.1007/s10600-022-03851-2 Incilay, G. (2014). Volatile Composition, Antimicrobial and Antioxidant Properties of Different Parts from Elaeagnus angustifolia L. Journal of Essential Oil-Bearing Plants, 17(6), 1187–1202. https://doi.org/10.1080/0972060X.2014.929044 Ishaq, S., Rathore, H. A., Sabir, S. M. ve Maroof, M. S. (2015). Antioxidant properties of Elaeagnus umbellata berry solvent extracts against lipid peroxidation in mice brain and liver tissues. Food Science and Biotechnology, 24(2), 673–679. https://doi.org/10.1007/s10068-015-0088-x İşleyen, M. F. (2018). Lactobacillus acidophilus KPb4b suşunun farklı yöntemlerle mikroenkapsülasyonu ve bu yöntemlerin bakteri canlılığı üzerine etkilerinin yanıt yüzey yöntemi ile belirlenmesi. [Doktora tezi]. Bolu Abant İzzet Baysal Üniversitesi. Jaddu, S. ve Katam, S. (2018). Hub of health: Nutraceuticals and functional foods. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 7(2), 1327–1331. Jafari, Y., Sabahi, H. ve Rahaie, M. (2016). Stability and loading properties of curcumin encapsulated in Chlorella vulgaris. Food Chemistry, 211, 700–706. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.05.115 Kailasapathy, K. (2002). Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications. Current Issues in Intestinal Microbiology, 3(2), 39-48. Kailasapathy, K. (2009). Encapsulation technologies for functional foods and nutraceutical product development. CABI Reviews, 4(033), 1-19. Karkar, B., Şahin, S. ve Güneş, M. E. (2021). Evaluation of antioxidant properties and determination of phenolic and carotenoid profiles of chestnut bee pollen collected from Turkey. Journal of Apicultural Research, 60(5), 765–774. https://doi.org/10.1080/00218839.2020.1844462 Kataria, A., Achi, S. C. ve Halami, P. M. (2018). Effect of Encapsulation on Viability of Bifidobacterium longum CFR815j and Physiochemical Properties of Ice Cream. Indian Journal of Microbiology, 58(2), 248–251. https://doi.org/10.1007/s12088- 018-0720-6 Khadivi, A., Mirheidari, F., Moradi, Y., & Paryan, S. (2020). Phenotypic variability of oleaster (Elaeagnus angustifolia L.) as revealed by morphological characteristics. Industrial crops and products, 149, 112322. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.112322 Khan, S. U., Khan, A. U., Shah, A. U. H. A., Shah, S. M., Hussain, S., Ayaz, M. ve Ayaz, S. (2016). Heavy metals content, phytochemical composition, antimicrobial and insecticidal evaluation of Elaeagnus angustifolia. Toxicology and Industrial Health, 32(1), 154–161. https://doi.org/10.1177/0748233713498459 Kim, S. J., Cho, S. Y., Kim, S. H., Song, O. J., Shin, I. S., Cha, D. S. ve Park, H. J. (2008.) Effect of microencapsulation on viability and other characteristics in Lactobacillus acidophilus ATCC 43121. LWT, 41(3), 493–500. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2007.03.025 Li, N., Taylor, L. S., Ferruzzi, M. G. ve Mauer, L. J. (2012). Kinetic study of catechin stability: Effects of ph, concentration, and temperature. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(51), 12531–12539. https://doi.org/10.1021/jf304116s Li, N., Taylor, L. S., Ferruzzi, M. G. ve Mauer, L. J. (2013). Color and chemical stability of tea polyphenol (-)-epigallocatechin-3-gallate in solution and solid states. Food Research International, 53(2), 909–921. 155 https://doi.org/10.1016/j.foodres.2012.11.019 Li, Q., Lin, H., Li, J., Liu, L., Huang, J., Cao, Y., ... & Zhou, M. (2023). Improving probiotic (Lactobacillus casei) viability by encapsulation in alginate-based microgels: Impact of polymeric and colloidal fillers. Food Hydrocolloids, 134, 108028. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2022.108028 Liao, C. R., Chang, Y. S., Peng, W. H., Lai, S. C. ve Ho, Y. L. (2012). Analgesic and anti-inflammatory activities of the methanol extract of Elaeagnus oldhamii Maxim. in mice. American Journal of Chinese Medicine, 40(3), 581–597. https://doi.org/10.1142/S0192415X12500449 Liu, X., Xue, W., Liu, Q., Yu, W., Fu, Y., Xiong, X., Ma, X. ve Yuan, Q. (2004). Swelling behaviour of alginate-chitosan microcapsules prepared by external gelation or internal gelation technology. Carbohydrate Polymers, 56(4), 459–464. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2004.03.011 Low, R. H. P., Baba, A. S. ve Aboulfazli, F. (2015). Effects of different levels of refined cane sugar and unrefined coconut palm sugar on the survivability of lactobacillus acidophilus in probiotic ice cream and its sensory and antioxidant properties. Food Science and Technology Research, 21(6), 857–862. https://doi.org/10.3136/fstr.21.857 Maldonado Galdeano, C., Cazorla, S. I., Lemme Dumit, J. M., Vélez, E. ve Perdigón, G. (2019). Beneficial effects of probiotic consumption on the immune system. Annals of Nutrition and Metabolism, 74(2), 115–124. https://doi.org/10.1159/000496426 Markowiak, P. ve Ślizewska, K. (2017). Effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on human health. Nutrients, 9(9). https://doi.org/10.3390/nu9091021 Merculieff, Z., Ramnath, S., Sankoli, S. M., Venkataramegowda, S., Murthy, G. S. ve Ceballos, R. M. (2014). Phytochemical, antioxidant and antibacterial potential of Elaeagnus kologa (Schlecht.) leaf. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 7(S1), S599–S602. https://doi.org/10.1016/S1995-7645(14)60295-9 Miremadi, F., Sherkat, F. ve Stojanovska, L. (2016). Hypocholesterolaemic effect and anti-hypertensive properties of probiotics and prebiotics: A review. Journal of Functional Foods, 25, 497–510. https://doi.org/10.1016/j.jff.2016.06.016 Mokarram, R. R., Mortazavi, S. A., Najafi, M. B. H. ve Shahidi, F. (2009). The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice. Food Research International, 42(8), 1040– 1045. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2009.04.023 Mortazavi-Derazkola, S., Yousefinia, A., Naghizadeh, A., Lashkari, S., & Hosseinzadeh, M. (2021). Green synthesis and characterization of silver nanoparticles using Elaeagnus angustifolia bark extract and study of Its antibacterial effect. Journal of Polymers and the Environment, 29(11), 3539-3547. https://doi.org/10.1007/s10924- 021-02122-5 Mu, R. J., Yuan, Y., Wang, L., Ni, Y., Li, M., Chen, H. ve Pang, J. (2018). Microencapsulation of Lactobacillus acidophilus with konjac glucomannan hydrogel. Food Hydrocolloids, 76, 42–48. https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2017.07.009 Naidu, A. S., Bidlack, W. R. ve Clemens, R. A. (1999). Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB). Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 39(1), 13–126. https://doi.org/10.1080/10408699991279187 156 Nasir, N., Şahin, S., Çakmak, Z. E. ve Çakmak, T. (2017). Optimization of ultrasonic- assisted extraction via multiresponse surface for high antioxidant recovery from Chlorella vulgaris (Chlorophyta ). Phycologia, 56(5), 561-569. https://doi.org/10.2216/16132.1 Nasiri, H., Golestan, L., Shahidi, S. A., & Darjani, P. (2021). Encapsulation of Lactobacillus casei in sodium alginate microcapsules: improvement of the bacterial viability under simulated gastrointestinal conditions using wild sage seed mucilage. Journal of Food Measurement and Characterization, 15(5), 4726-4734. https://doi.org/10.1007/s11694-021-01022-5 Nazir, N., Zahoor, M., Nisar, M., Khan, I., Karim, N., Abdel-Halim, H. ve Ali, A. (2018). Phytochemical analysis and antidiabetic potential of Elaeagnus umbellata (Thunb.) in streptozotocin-induced diabetic rats: Pharmacological and computational approach. BMC Complementary and Alternative Medicine, 18(1), 1–16. https://doi.org/10.1186/s12906-018-2381-8 Niamah, A. K., Al-Manhel, A. J. ve Al-Sahlany, S. T. G. (2018). Effect microencapsulation of Saccharomyces boulardii on viability of yeast in vitro and ice cream. Carpathian Journal of Food Science and Technology, 10(3), 100–107. Ningtyas, D. W., Bhandari, B., Bansal, N. ve Prakash, S. (2019). The viability of probiotic Lactobacillus rhamnosus (non-encapsulated and encapsulated) in functional reduced-fat cream cheese and its textural properties during storage. Food Control, 100, 8–16. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.12.048 Noori, N., Khaji, L. ve Gandomi, H. (2017). Effects of Camellia sinensis on survival of encapsulated Lactobacillus casei and Bifi dobacterium lactis in ice-cream. Bioscience Biotechnology Research Communications, 10(1), 72–77. https://doi.org/10.21786/bbrc/10.1/11 Okmen, G. ve Turkcan, O. (2014). A study on antimicrobial, antioxidant and antimutagenic activities of Elaeagnus angustifolia L. leaves. African Journal of Traditional, Complementary, and Alternative Medicines, 11(1), 116–120. https://doi.org/10.4314/ajtcam.v11i1.17 Özcan, T. ve Altun, B. (2013). Süt Ürünlerinde Probiyotik Bakterilerin Mikroenkapsülasyonu I: Enkapsülasyon Teknikleri. Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 27(2), 93–104. https://doi.org/10.20479/uuzfd.28653 Ozen, T., Yenigun, S., Altun, M. ve Demirtas, I. (2017). Phytochemical Constituents, ChEs and Urease Inhibitions, Antiproliferative and Antioxidant Properties of Elaeagnus umbellata Thunb. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 20(6), https://doi.org/10.2174/1386207320666170127161837 Panja, S., Chaudhuri, D., Baban Ghate, N., Le Minh, H. ve Mandal, N. (2014). In vitro assessment of phytochemicals, antioxidant and DNA protective potential of wild edible fruit of Elaeagnus latifolia Linn. Fruits, 69(4), 303–314. https://doi.org/10.1051/fruits/2014019 Papagianni, M. ve Anastasiadou, S. (2009). Encapsulation of Pediococcus acidilactici cells in corn and olive oil microcapsules emulsified by peptides and stabilized with xanthan in oil-in-water emulsions: Studies on cell viability under gastro-intestinal simulating conditions. Enzyme and Microbial Technology, 45(6–7), 514–522. https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2009.06.007 157 Park, J. K. ve Chang, H. N. (2000). Microencapsulation of microbial cells. Biotechnology Advances, 18(4), 303–319. https://doi.org/10.1016/S0734-9750(00)00040-9 Qayyum, R., Qamar, H. M. U. D., Salma, U., Khan, S., Khan, T. ve Shah, A. J. (2019). Insight into the cardiovascular activities of elaeagnus umbellata. Farmacia, 67(1), 133–139. https://doi.org/10.31925/farmacia.2019.1.18 Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M. ve Rice-Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, 26(9–10), 1231–1237. https://doi.org/10.1016/S0891-5849(98)00315-3 Reid, G. (2016). Probiotics: Definition, scope and mechanisms of action. Best Practice and Research: Clinical Gastroenterology, 30(1), 17–25. https://doi.org/10.1016/j.bpg.2015.12.001 Rezaul, M., Rakib, H., Kabir, A. ve Amanullah, S. M. (2017). Starter Cultures Used in the Production of Probiotic Dairy Products and Their Potential Applications: A Review. Chemical and Biomolecular Engineering, 2(2), 83–89. https://doi.org/10.11648/j.cbe.20170202.12 Roginsky, V. ve Alegria, A. E. (2005). Oxidation of tea extracts and tea catechins by molecular oxygen. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(11), 4529–4535. https://doi.org/10.1021/jf040382i Rohman, A. ve Man, Y. B. C. (2010). Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy for analysis of extra virgin olive oil adulterated with palm oil. Food Research International, 43(3), 886–892. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2009.12.006 Sabir, M. S., Ahmad, D. S., Hussain, I. M. ve Tahir, K. M. (2007). Antibacterial activity of Elaeagnus umbellata (Thunb.) a medicinal plant from Pakistan. Saudi Medical Journal, 28(2), 259–263. Saboonchian, F., Jamei, R. ve Hosseini Sarghein, S. (2014). Phenolic and flavonoid content of Elaeagnus angustifolia L. (leaf and flower). Avicenna journal of phytomedicine, 4(4), 231–238. https://doi.org/10.22038/ajp.2014.1975 Sahan, Y., Gocmen, D., Cansev, A., Celik, G., Aydin, E., Dundar, A. N., Dulger, D., Kaplan, H. B., Kilci, A. ve Gucer, S. (2015). Chemical and techno-functional properties of flours from peeled and unpeeled oleaster (Elaeagnus angustifolia L.). Journal of Applied Botany and Food Quality, 88, 34–41. https://doi.org/10.5073/JABFQ.2015.088.007 Şahin, S., Işik, E., Aybastier, Ö. ve Demir, C. (2012). Orthogonal signal correction-based prediction of total antioxidant activity using partial least squares regression from chromatograms. Journal of Chemometrics, 26(7), 390–399. https://doi.org/10.1002/cem.2450 Saifullah, M., Shishir, M. R. I., Ferdowsi, R., Tanver Rahman, M. R. ve Van Vuong, Q. (2019). Micro and nano encapsulation, retention and controlled release of flavor and aroma compounds: A critical review. Trends in Food Science and Technology, 86, 230–251. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2019.02.030 Saleh, A. I., Mohamed, I., Mohamed, A. A., Abdelkader, M., Yalcin, H. C., Aboulkassim, T., Batist, G., Yasmeen, A. ve Moustafa, A. E. Al (2018). Elaeagnus angustifolia Plant Extract Inhibits Angiogenesis and Downgrades Cell Invasion of Human Oral Cancer Cells via Erk1/Erk2 Inactivation. Nutrition and Cancer, 70(2), 297–305. https://doi.org/10.1080/01635581.2018.1412472 158 Santiago-López, L., Hernández-Mendoza, A., Garcia, H. S., Mata-Haro, V., Vallejo- Cordoba, B. ve González-Córdova, A. F. (2015). The effects of consuming probiotic-fermented milk on the immune system: A review of scientific evidence. International Journal of Dairy Technology, 68(2), 153–165. https://doi.org/10.1111/1471-0307.12202 Selle, K. M., Klaenhammer, T. R. ve Russell, W. M. (2014). Lactobacillus: Lactobacillus acidophilus (Vol. 2), Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-384730-0.00179- 8 Sengsaengthong, S. ve Oonsivilai, R. (2019). Effect of microencapsulation of Lactobacillus sp. 21C2-10 isolated from cassava pulp on physicochemical, sensorial and microbiological characteristics of ice cream. International Food Research Journal, 26(2), 585–594. Singleton, V. L., Orthofer, R. ve Lamuela-Raventos, R. M. (1999). Analysis of Total Phenols and Other Oxidation Substrates and Antioxidants by Means of Folin- Ciocalteu Reagent. Methods In Enzymology, 299, 152–178. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2016.11.004 Soomro, A. H., Masud, T. ve Anwaar, K. (2002). Role of Lactic Acid Bacteria (LAB) in Food Preservation and Human Health – A Review. Pakistan Journal of Nutrition, 1(1), 20–24. https://doi.org/10.3923/pjn.2002.20.24 Sun, Y., Liu, J., Tang, S., & Zhou, X. (2021). Analysis of gallic acid and ellagic acid in leaves of Elaeagnus angustifolia L. from different habitats and times in Xinjiang by HPLC with cluster analysis. Acta Chromatographica, 33(2), 195-201. https://doi.org/10.1556/1326.2020.00684 Suyabatmaz, Ş., Karaoğlu, Ş. A., Bozdeveci, A., & Akpınar, R. (2023). Honeybee- associated lactic acid bacteria and their probiotic potential for human use. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 39(1), 2. https://doi.org/10.1007/s11274-022-03427-w Teschke, O. ve De Souza, E. F. (2002). Liposome structure imaging by atomic force microscopy: Verification of improved liposome stability during adsorption of multiple aggregated vesicles. Langmuir, 18(17), 6513–6520. https://doi.org/10.1021/la025689v Tharmaraj, N. ve Shah, N. P. (2003). Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and propionibacteria. Journal of Dairy Science, 86(7), 2288–2296. https://doi.org/10.3168/jds.S0022- 0302(03)73821-1 Tipigil, E. (2015). İki farklı yöntem kullanılarak probiyotik bakteri mikroenkapsülasyonu ve ayranda depolama periyodu boyunca hücre stabilitesi üzerine etkilerinin karşılaştırılması. [Yüksek lisans tezi]. Ege Üniversitesi. TS 4500 Buğday ununda ham sellüloz miktarı tayini (gravimetrik metot), asidite tayini (titri-metrik metot). Türk Standartları Enstitüsü. TS EN ISO 2171 (2010). Tahıllar, baklagiller ve yan ürünleri- yakılarak kül muhtevasının tayini. Türk Standartları Enstitüsü. TS EN ISO 712 (2012). Tahıl ve tahıl ürünleri- rutubet muhtevası tayini. Türk Standartları Enstitüsü. Vaziri, A. S., Alemzadeh, I., Vossoughi, M. ve Khorasani, A. C. (2018). Co- 159 microencapsulation of Lactobacillus plantarum and DHA fatty acid in alginate- pectin-gelatin biocomposites. Carbohydrate Polymers, 199, 266–275. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2018.07.002 Wan, M. L. Y., Forsythe, S. J. ve El-Nezami, H. (2019). Probiotics interaction with foodborne pathogens: a potential alternative to antibiotics and future challenges. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 59(20), 3320–3333. https://doi.org/10.1080/10408398.2018.1490885 Wang, S. Y. ve Fordham, I. M. 2007. Differences in chemical composition and antioxidant capacity among different genotypes of autumn olive (Elaeagnus umbellate Thunb.). Food Technology and Biotechnology, 45(4), 402–409. Yanprapasiri, K., Lohsrithong, C., Setthachaimongkol, S., Mekkerdchoo, O. ve Borompichaichartkul, C. (2018). Probiotic encapsulation by spray drying using konjac glucomannan hydrolysate as wall material and its application in ice cream. Italian Journal of Food Science, 30(5), 36–40. Yilmaz-Ersan, L. ve Kurdal, E. (2014). The Production of Set-Type-Bio-Yoghurt with Commercial Probiotic Culture. International Journal of Chemical Engineering and Applications, 5(5), 402–408. https://doi.org/10.7763/ijcea.2014.v5.418 Zhu, J. X., Wen, L., Zhong, W. J., Xiong, L., Liang, J. ve Wang, H. L. (2018). Quercetin, Kaempferol and Isorhamnetin in Elaeagnus pungens Thunb. Leaf: Pharmacological Activities and Quantitative Determination Studies. Chemistry and Biodiversity, 15(8), 1–9. https://doi.org/10.1002/cbdv.201800129 160 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı Büşra KARKAR Doğum Yeri ve Tarihi OSMANGAZİ – 27/09/1992 Yabancı Dili İngilizce Eğitim Durumu Lise Hasan Coşkun Lisesi, 2006-2010 Lisans Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü, 2010-2015 (GANO: 3.13/4.00) Yüksek Lisans Uludağ Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Bölümü, 2015-2018 (GANO: 4.00/4.00) Burslar YÖK 100/2000 ‘Yenilikçi Gıda İşleme Teknolojileri ve Gıda Biyoteknolojisi’ Öncelikli Alan Bursu TÜBİTAK 2211/A Genel Yurtiçi Doktora Bursu Yayınlar Karkar, B., Şahin, S., Güneş, M.E. 2018. Antioxidative Effect of Turkısh Chestnut Bee Pollen on DNA Oxidation System and Its Phenolic Compounds. The Journal of Food, 43 (1): 34-42. Şahin, S., Karkar, B. 2019. The antioxidant properties of the chestnut bee pollen extract and its preventive action against oxidatively induced damage in DNA bases. Journal of Food Biochemistry, 43:e12888, doi.org/10.1111/jfbc.12888 Karkar, B., Şahin, S., Güneş, M.E. 2021. Evaluation of antioxidant properties and determination of phenolic and carotenoid profiles of chestnut bee pollen collected from Turkey. Journal of Apicultural Research, 60 (5): 765-774, doi:10.1080/00218839.2020.1844462. Şahin, S., Aybastıer, Ö., Dawbaa, S., Karkar, B., Çakmak, T. 2020. Study of the Ability of Lutein and Neoxanthin as Standards and in the Extract of Chlamydomonas reinhardtii to Prevent Oxidatively Induced DNA Base Damage Using Ultrasensitive GC-MS/MS Analysis. Chromatographia, 83: 919-926, doi.org/10.1007/s10337- 020-03918-8 161 Karkar, B., Şahin S. 2022. Determination of phenolic compounds profiles and antioxidant properties of oleaster (Elaeagnus angustifolia L.) grown in Turkey. European Food Research and Technology, 248: 219-241, doi.org/10.1007/s00217-021-03875-y. Erken, İ., Şahin, S., Karkar, B., Akça, B., Özakın, C. 2022. Chitosan based edible film incorporating different Prunella L. extracts, characterization and their antioxidant properties. Journal of Food Processing and Preservation, 00:e16658, doi.org/10.1111/jfpp.16658 Projeler Kestane Ballarının Serbest Radikalleri Süpürme Özelliklerinin Araştırılması. Uludağ Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projesi, No: HDP(F)-2016/66 (Araştırmacı), 2017-2018. Probiyotik bakterinin iğde unu ile enkapsülasyonu ve gıda alanında kullanılabilirliğinin araştırılması, Bursa Uludağ Üniversitesi, Genel Araştırma Projesi (GAP), No: FGA- 2021-416 (Araştırmacı), devam ediyor. Kongreler Karkar, B., Eren, P., Şahin, S. Kişniş (Coriandrum sativum) ile Hazırlanan Gıda Ürünlerinin Antioksidan Özelliklerinin Belirlenmesi. 5. Ulusal Kimya Öğrenci Kongresi, 17-19.05.2014, İstanbul. (Poster Sunumu) Karkar, B., Şahin, S., Demir, C. Zeytin yaprağından Hazırlanan Ekstraktların CHROMAC Yöntemiyle Antioksidan Kapasite İçeriklerinin Belirlenmesi. 6. Ulusal Kimya Öğrenci Kongresi, 17-19.05.2015, İzmir. (Poster Sunumu) Karkar, B., Dorken, E.A., Şahin, S., Güneş, M.E. Determination of Phenolic Compounds in Chestnut Pollen and Its Antioxidant Effect on DNA Oxidation System. 1. International Congress on Medicinal and Aromatic Plants, 10-12.05.2017, Konya. (Poster Sunumu) Karkar, B., Şahin S. İğde (Elaeagnus angustifolia L.) Ununun Toplam Fenolik Madde ve Antioksidan Özelliğinin Belirlenmesi. 33. Ulusal Kimya Kongresi, 7- 9.10.2021, Tekirdağ. (Sözlü Sunum) 162 Karkar, B., Şahin, S. Udihindi ekstraktı ile hazırlanan kitosan temelli yenilebilir antioksidan filmlerin eldesi. 10. Ulusal Analitik Kimya Kongresi, 7-11.09.2022, Muğla. (Sözlü Sunum) Bayaçlı, G., Karkar, B., Şahin, S. Determination of Phenolic Compounds in Avocado (Persea americana) and Their Antioxidant Effect on DNA Oxidation System. 4th Eurasia Biochemical Approaches & Technologies (EBAT), 03-06.10.2022, Antalya (Poster Sunum) Karkar, B., Şahin S. The Improvement of Viability of Lactobacillus casei by Freeze-drying Method. 4th Eurasia Biochemical Approaches & Technologies (EBAT), 03- 06.10.2022, Antalya (Sözlü Sunum) Patentler "Probiyotik Bakterinin İğde Ununa Enkapsülasyonu", Türk Patent ve Marka Kurumu (Başvuru No: 2021/018259) Eğitim ve Seminerler ISO 9001:2008 Kalite Yönetim Sistemi İç Denetçi Eğitimi. YÖNMER, 13.12.2014 TS EN ISO 14001:2005 Çevre Yönetim Sistemi. Kimyagerler Derneği, 21.03.2015 XV. Ulusal Spektroskopi Kongresi, Spektroskopi Çalıştayı, 16.05.2017, Yalova Analiz Hayatın Her Anında/ Günlük Yaşam ve İleri Analitik Teknikler Semineri, ANT TEKNİK, 17.04.2018, Bursa Kimyasal Ölçümlerde Kalite. EURACHEM Türkiye, 03.05.2019 163