T. C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SU ÜRÜNLERİ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI GÖKKUŞAĞI ALABALIKLARINDA GÖRÜLEN MOTİL AEROMONAS (Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae), Yersinia ruckeri ve Lactococcus garvieae BAKTERİLERİNİN ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIKLARI VE DUYARLILIKTA ROL OYNAYAN GENLERİN TESPİTİ MUHAMMED DUMAN DOKTORA TEZİ BURSA 2017 MUHAMMED DUMAN SU ÜRÜNLERİ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ 2017 T. C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SU ÜRÜNLERİ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI GÖKKUŞAĞI ALABALIKLARINDA GÖRÜLEN MOTİL AEROMONAS (Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae), Yersinia ruckeri ve Lactococcus garvieae BAKTERİLERİNİN ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIKLARI VE DUYARLILIKTA ROL OYNAYAN GENLERİN TESPİTİ MUHAMMED DUMAN (DOKTORA TEZİ) DANIŞMAN Prof. Dr. Soner ALTUN ÜSİP (V) 2013/1; TAGEM 14 AR-GE/26; KUAP(V) 2014-07 BURSA 2017 İçindekiler Dış Kapak İç Kapak ETİK BEYANI KABUL ONAYI TEZ KONTROL ve BEYAN FORMU İçindekiler ............................................................................................................................. IV ÖZET .................................................................................................................................... VI ABSTRACT ........................................................................................................................ VII 1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1 2. GENEL BİLGİLER..................................................................................................... 3 2.1 Akuakültür Üretimi ........................................................................................................ 3 2.2 Akuakültürde Sorun Olan Önemli Bakteriyel Hastalıklar ............................................. 4 2.2.1 Hareketli Aeromonas Septisemi .................................................................................. 12 2.3 Yersinia ruckeri ........................................................................................................... 20 2.3.1 Tarihçe ......................................................................................................................... 20 2.3.2 Etiyoloji ....................................................................................................................... 21 2.3.3 Epidemiyoloji .............................................................................................................. 22 2.3.4 Teşhis ........................................................................................................................... 24 2.3.5 Antimikrobiyal Direnç ................................................................................................. 25 2.4 Lactococcus garvieae .................................................................................................. 25 2.4.1 Tarihçe ......................................................................................................................... 25 2.4.2 Etiyoloji ....................................................................................................................... 26 2.4.3 Epidemiyoloji .............................................................................................................. 26 2.4.4 Teşhis ........................................................................................................................... 27 2.4.5 Antimikrobiyal Direnç ................................................................................................. 28 3. GEREÇ VE YÖNTEM.............................................................................................. 29 3.1 Bakteri İzolatları .......................................................................................................... 29 3.2 Fenotipik İdentifikasyon .............................................................................................. 36 3.3 Moleküler İdentifikasyon ............................................................................................. 37 3.3.1 DNA Ekstraksiyonu ..................................................................................................... 37 3.3.2 PCR ile İdentifikasyon ................................................................................................. 37 3.4 Moleküler Karakterizasyon ......................................................................................... 39 3.4.1 Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD-PCR) ................................................. 39 3.5 Duyarlılık Konsantrasyonlarının Belirlenmesi (MİK) ................................................. 41 3.6 Direnç Genleri ............................................................................................................. 41 4. BULGULAR ............................................................................................................... 43 4.1 Bakteri İzolatları .......................................................................................................... 43 4.2 Hareketli Aeromonas İzolatlarının Fenotipik Özellikleri ............................................ 45 4.3 Y. ruckeri İzolatlarının Fenotipik Özellikleri ............................................................... 48 4.4 L. garvieae İzolatlarının Fenotipik Özellikleri ............................................................ 51 4.5 Hareketli Aeromonas İzolatlarının Moleküler İdentifikasyonu ................................... 54 4.6 Hareketli Aeromonas Türlerinin Moleküler Karakterizasyonu ................................... 56 4.7 Y. ruckeri İzolatlarının Moleküler Karakterizasyonu .................................................. 58 4.8 L. garvieae İzolatlarının Moleküler Karakterizasyonu ................................................ 61 4.9 Hareketli Aeromonas İzolatlarının Antimikrobiyal Duyarlılıkları (MIK) ................... 62 4.10 Y. ruckeri İzolatlarının Antimikrobiyal Duyarlılıkları (MIK) ..................................... 63 4.11 L. garvieae İzolatlarının Antimikrobiyal Duyarlılıkları (MIK) ................................... 63 IV 4.12 Hareketli Aeromonas İzolatlarında Tespit Edilen Direnç Genleri ............................... 66 4.13 Y. ruckeri İzolatlarında Genotipik Direnç .................................................................... 68 4.14 L. garvieae İzolatlarında Genotipik Direnç ................................................................. 70 5. TARTIŞMA ve SONUÇ ............................................................................................ 73 6. KAYNAKLAR ........................................................................................................... 89 7. SİMGELER ve KISALTMALAR .......................................................................... 114 TEŞEKKÜR ....................................................................................................................... 115 ÖZGEÇMİŞ........................................................................................................................ 116 V ÖZET Bu araştırmada, farklı kökenlere sahip Motil Aeromonas spp. (Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae), Yersinia ruckeri ve Lactococcus garvieae izolatlarının moleküler karakterizasyonu, antimikrobiyal duyarlılıkları ve antimikrobiyal direnç gelişiminde rol oynayan genlerin tespiti yapılmıştır. Çalışmada hareketli Aeromonas, Y. ruckeri ve L. garvieae izolatlarının biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde klasik mikrobiyolojik testler (gram boyama, hareketlilik, oksidaz, katalaz, O/F vb.) ve hızlı teşhis kitleri (API 20NE, API 32 STREPT ve API 32E) kullanılmıştır. Hareketli Aeromonas türlerinin identifikasyonu gyrB bölgesinin dizi analizi ile Y. ruckeri ve L. garvieae izolatlarının identifikasyonu ise sırasıyla YER8-YER10, pLG primerleri kullanılarak PCR analizi ile gerçekleştirilmiştir. Y. ruckeri ve L. garvieae izolatlarının genotiplendirilmesi RAPD-PCR, hareketli Aeromonas izolatlarının genetik yakınlıkları ise gyrB bölgesinin dizi analizi ile (Bionumerics 7.0 yazılımı kullanılarak) yapılmıştır. Ayrıca çalışmada kullanılan tüm izolatların sulfanomid, tetrasiklin, florfenikol ile sulfamethoksazol-trimetoprim antimikrobiyallerinde minimum inhibitör konsantrasyonları (MİK) ve bu antimikrobiyallere karşı geliştirdikleri direnç genleri (PCR ve dizi analiziyle) tespit edilmiştir. Araştırmada 6 adedi ülkemizde ilk bildirim olmak üzere toplam 13 motil Aeromonas türü, 18 farklı Y. ruckeri ve 5 farklı L. garvieae genotipi belirlenmiştir. Hareketli Aeromonas türlerinin yaygın olarak sulfanomid ve florfenikole; Y. ruckeri izolatlarının sulfanomid ve tetrasiklin’e; L. garvieae izolatlarının ise sulfonamid ve florfenikol’e direnç geliştirmiş olduğu görülmüştür. Ayrıca Aeromonas türlerinde sulI, tetA, tetE, flor; Y. ruckeri izolatlarında sulI; L. garvieae izolatlarında ise ermA ve tetS genlerinin yaygın olduğu tespit edilmiştir. Anahtar sözcükler: Hareketli Aeromonas septisemi, Yersinia ruckeri, Lactococcus garvieae, Antimikrobiyal direnç VI ABSTRACT “Determination of Antimicrobial senstivity and antimicrobial resistance genes of Motile Aeromonads (Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae), Yersinia ruckeri and Lactococcus garvieae in rainbow trout” Determination of molecular characteristics, antimicrobial susceptibility and resistance genes in motile Aeromonas spp. (Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae), Yersinia ruckeri and Lactococcus garvieae isolates that isolated from different origin were performed in this study. The classical biochemical tests (gram stain, motility, oxidase, catalase, O/F etc.) and rapid test kits (API 20NE, API 32 STREPT ve API 32E) were used for determination of biochemical characteristics of motile Aeromonas spp., Yersinia ruckeri and Lactococcus garvieae isolates in our study. Identification of motile Aeromonas isolates were performed with sequence analayses of gyrB gene region, Y. ruckeri and L. garvieae isolates were identified with YER8-YER10, pLG primer pairs, respectively. Yersinia ruckeri and Lactococcus garvieae isolates were genotyped using RAPD-PCR method, and also motile Aeromonas isolates were genogrouped based on sequence of gyrB gene region (using Bionumerics 7.0 software). Beside, all isolates were investigated for susceptibility of sulfonamide, tetracycline, florfenicole and sulfamethoxazole-trimetoprime using minimum inhibitor concentration (MIC) test and antimicrobial resistance genes related to these compounds were detected using PCR and sequence analyses. There are 13 different motile Aeromonas species that were six of them firstly reported in our country, 18 Y. ruckeri and 5 different L. garvieae genotype were identified in this study. Motile Aeromonas species are commonly found in sulfanomide and florfenicole; Y. ruckeri isolates to sulfanomide and tetracycline; L. garvieae isolates were found resistance to sulphonamide and florfenicole. In addition, sulI, tetA, tetE, floR in Aeromonas species; sulI in Y. ruckeri isolates; ermA and tetS genes in L. garvieae isolates, were commonly detected resistance genes. Keywords: Motile Aeromonas septicemia, Yersinia ruckeri, Lactococcus garvieae, Antimicrobial resistance VII 1. GİRİŞ Türkiye’de yapılan akuakültür üretimi 1986 yılında 3075 ton/yıl iken, 2010 yılında bu üretim 167.141 ton/yıl’a ulaşmıştır. 2013 yılında toplam su ürünleri üretiminin (avcılık ve yetiştiricilik) 607.515 ton/yıl olduğu, bu üretimin %38,4’ünün akuakültür üretiminden yapıldığı bildirilmiştir. Yetiştiricilik yoluyla yapılan üretimin ise %52,7’sinin iç sulardan elde edildiği görülmüştür. Akuakültür üretimi en fazla Ege bölgesi’nde yapılmakta olup (%55) sırasıyla Doğu Anadolu (%12), Akdeniz bölgesi (%10), Karadeniz bölgesi (%9), İç Anadolu bölgesi (%8), Güneydoğu Anadolu bölgesi (%4) ve Marmara bölgesi (%2) izlemektedir. Gökkuşağı alabalığı üretimi su kaynaklarının daha verimli kullanılması, gelişen teknoloji, Avrupa ülkelerine ihraç edilen bir ürün olması ve Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığının desteklemeleri ile son on yılda %130’dan fazla bir artış göstermiştir. Türkiye’de gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliğinin farklı su sıcaklıkları, akarsu tipleri (baraj, kaynak suyu, dere suyu gibi) ve yetiştiricilik şartlarında yapıldığı görülmektedir. Özellikle su sıcaklığındaki ani değişim ve stres faktörlerinin arttığı durumlarda fırsatçı patojen olan Aeromonas spp. enfeksiyonları ortaya çıkmaktadır. Aeromonas spp. bazı durumlarda primer etken olsa da genellikle sekonder enfeksiyon olarak rapor edilmektedir. Alabalık işletmelerinde su sıcaklığının arttığı ilkbahar aylarında (12-15ºC) stres faktörlerinin de etkisiyle Yersinia ruckeri ve özellikle yaz aylarında su sıcaklığının 15ºC ve üzerine çıktığı durumlarda ise Lactococcus garvieae enfeksiyonlarının yüksek mortalite oranlarına sebep olduğu görülmektedir. Gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliği sektöründe yaygın görülen bakteriyel hastalıkların tedavi edilmesinde genellikle işletmelerde farklı antimikrobiyaller kullanmaktadır. Ülkemizde ruhsatlı 7 antimikrobiyal etken madde olmasına rağmen birçok hastalık salgınında ruhsatlı olmayan antimikrobiyal bileşikler kullanılmaktadır. Gökkuşağı alabalığı işletmelerinde gelişmiş bir laboratuvar bulunmamakta ve hastalıklarla karşılaşıldığında genellikle antibiyogram testleri yapılmadan antimikrobiyal maddeler kullanılmaktadır. 1 Bu çalışmada; hareketli Aeromonas spp., Yersinia ruckeri ve Lactococcus garvieae’nin genotiplendirilmesi ve antimikrobiyal direnç gelişiminde rol oynayan genlerin varlığı ve yaygınlığının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmada; akuakültür sektöründe ortaya çıkan hastalıkların hızlı ve doğru teşhisinin yapılması, genetik özelliklerinin ve bölgeler arası yayılımlarının belirlenmiş olması bundan sonraki çalışmalarda bakteriyel hastalıklara karşı kontrol programlarının oluşturulmasında faydalı olacaktır. Ayrıca bu çalışma sonuçları ülkemizde sıklıkla kullanılan antimikrobiyallere (sulfanomid, tetrasiklin, florfenikol) karşı gelişen direncin yaygın olduğunu göstermiş ve bu durum su ürünleri yetiştiricilerinin antimikrobiyal kullanımı hakkında bilgilendirilmesi gerekliliğini ortaya koymuştur. 2 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Akuakültür Üretimi Gelecekte insan tüketiminde hayvansal protein kaynaklarının azalacak olması ve yeni protein kaynaklarının aranması, Dünya üzerinde akuakültür üretiminin hızlı büyümesini sağlayan en önemli etkendir. Geçtiğimiz 30 yıl boyunca avcılıkla yapılan balıkçılık üretimi 69 milyon ton’dan 93 milyon tona ulaşmış ve aynı süre boyunca akuakültür üretimi tüm dünyada 5 milyon tondan 63 milyon tona ulaşmıştır (Fao, 2012). Günümüzde balık eti, hayvansal protein kaynağının %16.6’sını oluştururken insan tüketimi için gerekli olan toplam protein ihtiyacının da %6.5’ini karşılamaktadır (Fao, 2012). Balık eti doymuş yağlar, karbonhidratlar ve kolesterol açısından düşük besin içeriğine sahipken çeşitli vitaminler, minareller ve çoklu doymamış yağ asitleri gibi önemli besin maddelerini içermekle birlikte yüksek oranlarda kaliteli bir protein kaynağıdır (Fao, 2012). Böylelikle az miktarlarda tüketim olsa bile yetersiz beslenmeye sahip toplumlar için balık ürünleri güvenli ve besleyici gıda olma özelliğini taşımaktadır. Gelişmekte olan ülkelerde birçok balık çiftliği küçük aile işletmesi tarzında kurulmuştur. Gıda ve Tarım Topluluğu (FAO) 55 milyon insanın balık ihtiyacını avcılık yoluyla sağladığını bildirmiştir (Fao, 2012). Son yirmi yılda global akuakültür üretimi hızlı bir gelişim göstermiş ve büyükbaş yetiştiriciliğinin önüne geçmiştir (Jennings ve ark., 2016). Akuakültür üretiminin hızla artmasına rağmen ülkesel balıkçılık politikaları ve denizlerde bulunan balık popülasyonlarının her yıl değişmesiyle birlikte avcılık yoluyla üretim süreklilik sağlamamaktadır. FAO tarafından rapor edilen global avcılık ile balık üretim verileri 2000 yılından beri 90 milyon ton civarlarında dalgalanmakta iken, akuakültür üretimi 64 milyon ton artış göstermiştir (Fao, 2014). Başta A.B.D. olmak üzere çok sayıda Avrupa ülkesi ve Türkiye’de akuakültür sistemlerinde üretimin artmasında; teknolojinin gelişmesi, otomasyon ve sektörde iş imkânılarının artmasının önemli katkısı olmuştur (Jennings ve ark., 2016). Türkiye gibi gelişmekte olan ülkelerin ortak sorunu olan üretim, gelir ve istihdam düşüklüğü gibi makro düzeydeki aksaklıklar, beslenme ve tüketim alışkanlıklarının değişimini zorunlu kılmakta, tüketici talebinin de nispeten pahalı olan hayvansal ürünler yerine bitkisel ürünlere doğru yönelmesine yol açmaktadır. Nitekim 3 Türkiye’de günlük kişi başı tüketilen toplam protein miktarı 104 g olup bunun %30’unu hayvansal kaynaklı proteinler oluştururken %70’ini bitkisel kaynaklılar oluşturmaktadır (Fao, 2015). Bu durum gelişmiş ülkelerde hayvansal protein lehinedir. Türkiye’de yeterli/dengeli beslenme adına eksik olan ve artırılması gereken hayvansal protein tüketimidir (Sarıözkan ve Akçay, 2014). Çünkü ülkeler arasında gelişmişlik karşılaştırılması yapılırken kullanılan kriterlerden birisi de hayvansal protein tüketim düzeyidir. Dünya’da 2013 yılında 92,6 milyon ton (%56,9) avcılık ve 70,2 milyon ton (%43,1) yetiştiricilik yoluyla olmak üzere toplam 162,8 milyon ton su ürünleri üretimi gerçekleştirilmiştir (Tüik, 2015). Su ürünleri yetiştiriciliği yıllık ortalama %8 (%1- %13 arasında) büyümektedir. Türkiye’de akuakültür yetiştiriciliğinin %56’sını gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss), % 29’unu levrek (Dicentrarchus labrax) ve %15’ini çipura (Sparus aurata) oluşturmaktadır (Akova, 2015). Akuakültür üretimi ülkemizde en yaygın Ege bölgesi olmak üzere (%55), Doğu Anadolu (%12), Akdeniz bölgesi (%10), Karadeniz bölgesi (%9), İç Anadolu bölgesi (%8), Güneydoğu Anadolu bölgesi (%4) ve Marmara bölgesi (%2)’nde yapılmaktadır (Akova, 2015). Son 10 yılda yetiştiricilikteki toplam üretim miktarı %99 artış göstererek neredeyse 2 katına çıkmıştır. En yüksek üretim artışı alabalıkta (%130) daha sonra çipura (%100) ve levrekte (%52) gerçekleşmiştir. Ancak, avcılık yoluyla gerçekleşen üretimde yıllık ortalama % 2,3 azalma olduğu görülmektedir (Sarıözkan, 2016). Türkiye mevcut üretimi ile Dünya’da 30’lu sıralarda iken Avrupa’da 6. sıradadır. Türkiye İstatistik kurumunun 2013 verilerine göre Türkiye’de 607,515 ton balıkçılık ürünü hasat edilmiştir (Tuik, 2014). Türkiye’de 479.708,3 ton balık tüketimi mevcutken, 87.896,2 tonu işlenmiş (balık unu ve balık yağı) ve 6.378,1 tonu ise atık olarak değerlendirilmiştir (Akova, 2015). 2.2 Akuakültürde Sorun Olan Önemli Bakteriyel Hastalıklar Akuakültürün hızla gelişmesi ve artan balık üretimiyle birlikte hastalıklardan kaynaklanan yıllık ekonomik kayıplar da artmış ve bu gün dünya çapında balık hastalıklarından kaynaklanan ekonomik kayıplar milyar dolarlara ulaşmıştır (Subasinghe ve ark., 2001). Akuakültür endüstrisini etkileyen en önemli hastalıklar bakteri, mantar, virüs ve parazitlerden kaynaklanmaktadır (Khoo, 2000; Ramaiah, 2006; Brooker ve ark., 2007; Guo ve Woo, 2009; Jacobs ve ark., 2009; Birkbeck ve 4 ark., 2011; Frans ve ark., 2011; Wang, 2011; Gomez-Casado ve ark., 2011; Ransangan ve ark., 2011; Oidtmann ve Stentiford, 2011; Vega-Heredia ve ark., 2012). Bakteriyel etkenlerin canlı dışında da uzun süre canlı kalabilmeleri akuatik çevre açısından büyük bir risk oluşturmaktadır (Klesius ve Pridgeon, 2011). Akuatik hayvanlarda mortalite oluşturan en önemli bakteriler; Gram negatif özellikte olan Aeromonas, Edwardsiella, Flavobacterium, Francisella, Photobacterium, Piscirickettsia, Pseudomonas, Tenacibaculum, Vibrio ve Yersinia türleri ile Gram Pozitif karakter gösteren Lactococcus, Renibacterium ve Streptococcus türleridir. (Klesius ve Pridgeon, 2011). Deniz balıklarında olduğu gibi tilapia, kedi balığı, sazan, alabalık, somon, çipura, levrek, mersin balığı ve yılan balığı vs. tatlı su balıkları da bakteriyel hastalıklardan etkilenmektedir. Örneğin Çin’de 1990-1992 yılları arasında A. hydrophila, Y. ruckeri ve Vibrio. fluvialis patojenlerinden kaynaklanan yıllık ekonomik kayıp 120 milyon dolar olarak hesaplanırken 2009 yılında akuakültür üretimi ancak 105,3 milyon dolar olarak hesaplanmıştır (Wei, 2002; Subasinghe, 2005). Motil Aeromonas septisemi (MAS) genellikle balıklarda fırsatçı patojen olarak düşünülse de A. hydrophila başta olmak üzere çeşitli Aeromonas türlerinin de enfeksiyon oluşturduğu, mortalite ve salgınlarda primer etken olduğu belirlenmiştir (Faisal ve ark., 1989; Fang ve ark., 2004; Nielsen ve ark., 2001; Pathiratne ve ark., 1994; Yambot, 1998; Xia ve ark., 2004). Amerika’nın Kuzey Alabama eyaletinde 2009 ve 2010 yıllarında çıkan A. hydrophila salgınlarında ekonomik kaybın 3 milyon dolar olduğu tahmin edilmektedir (Pridgeon ve Klesius, 2011a). Bu salgınlardan izole edilen A. hydrophila izolatlarıyla yapılan virülens çalışmalarında etkenin kanal kedi balıklarında oldukça virülent olduğu ve LD50 değerlerinin 2x10 2 CFU/balık’dan daha düşük olduğu tespit edilmiştir (Pridgeon ve Klesius, 2011a). A. hydrophila başta olmak üzere A. caviae, A. sobria ve A. media gibi hareketli Aeromonas türleri yüksek genetik heterogenezis gösterdikleri için; bu hastalıklara karşı koruyucu aşı ve probiyotik gibi profilaktif uygulamalar da hastalığın kontrolü açısından zorluk oluşturmaktadır (Poobalane ve ark., 2010). Ülkemizde gökkuşağı alabalığı üretimi (O. mykiss, Walbaum) 2014 yılında 113 bin tona ulaşmıştır (BSGM 2016). Ülkemizde artan üretim ile birlikte alabalık yetiştiriciliğinde görülen bakteriyel hastalıklardan L. garvieae, Y. ruckeri ve hareketli Aeromonas septisemi etkenleri yaygın oalrak izole edilmiştir (Çağırgan ve Yüreklitürk, 1991; Diler ve ark., 2002; Altun ve ark., 2013a; Altun ve ark., 2013b). 5 Ülkemizde A. hydrophila ilk olarak Eskişehirdeki bir gökkuşağı alabalığı işletmesinden izole edilmiştir (Baran ve ark., 1980). Daha sonra etken Türkiye’nin farklı bölgelerindeki çipura, levrek, yılan balığı, sazan, mersin balığı, istavrit gibi farklı balık türlerinden de rapor edilmiştir (Tel ve ark., 2007; Ozturk ve ark., 2007; Aksoy, 2009; Durmaz ve Turk, 2009; Korun ve Toprak, 2010; Timur ve ark., 2010; Boran ve ark., 2013). Hareketli Aeromonas septisemi etkenlerinden olan A. sobria ülkemizde ilk olarak Karadenizde yetiştiriciliği yapılan Atlantik salmon (Salmo salar), gökkuşağı alabalığı, çipura ve levrekten izole edilmiştir (Karataş, 1996; Korun ve Toprak, 2010; Avsever ve ark., 2012). İlk olarak Keban Barajı’ndan izole edilen A. caviae (Muz ve ark., 1995) sonraki yıllarda gökkuşağı alabalığı, Atlantik salmon ve bazı akvaryum balıklarından da rapor edilmiştir (Candan ve ark., 1995; Timur ve ark., 2003; Korun ve Toprak, 2010). Akaylı ve ark., (2011); Akdeniz Bölgesi’nde gökkuşağı alabalıklarında karşılaşılan mortalitelerde A. schubertii etkenini izole etmiştir. Ülkemizdeki gökkuşağı alabalıklarında hareketli Aeromonas spp. Enfeksiyonları, genellikle Y. ruckeri ve L. garvieae enfeksiyonları ile birlikte rapor edilmektedir. Y. ruckeri ilk olarak Akdeniz Bölgesinde yetiştirilen gökkuşağı alabalıklarında görülen hastalık salgınından izole edilmiştir (Timur ve Timur, 1991). Enfeksiyon daha sonra Malatya, Elazığ, Bursa ve Yalova’dan da izole edilmiş ve mortalitelere neden olduğu bildirilmiştir (Savas ve Ture, 2007; Ozer ve ark., 2008; Altun ve ark., 2010; Seker ve ark., 2012). Altınok ve ark., (2016) farklı coğrafik kökenli Y. ruckeri izolatları üzerinde yaptıkları çalışmada suşların biyokimyasal olarak heterojenite gösterdiğini, dış membran proteinlerinin incelenmesi sonucunda ise 4 farklı gruba ayrıldığını ve Türkiye izolatlarının kendi aralarında % 86,03 benzerlik gösterdiğini tespit etmişlerdir. Altun ve ark., (2013a) Y. ruckeri’nin fenotipik ve biyokimyasal farklılıkları üzerine yaptıkları çalışmada izolatlar arasında çok farklı biyokimyasal özellikler görüldüğünü, genotiplendirme çalışmalarında ise 17 adet Y. ruckeri’nin 5 farklı genotipe ayrıldığını tespit etmişlerdir. Şeker ve ark., (2012) Elazığ ve Malatya bölgesindeki alabalık işletmelerinde yaptıkları çalışmalarda işletmelerin %52,9’unun Y. ruckeri ile enfekte ya da taşıyıcısı olduğunu tespit etmişlerdir. Aynı çalışmada yetişkin balıklarda genç balıklara oranla Y. ruckeri görülme oranının daha yaygın olduğu tespit edilmiştir. 6 L. garvieae akuakültürde konak seçiciliği az olan patojenlerden biri olup zoonoz özellik göstermektedir. Bu etkenin insanlarda üriner, dolaşım, deri ve solunum sistemi enfeksiyonlarından, endokardiditis ve karaciğer apsesine sahip olan immunsupresif hastalardan izole edildiği rapor edilmiştir (Elliot ve ark., 1991; Fefer ve ark., 1998; James ve ark., 2000; Mofredj ve ark., 2000; Fihman ve ark., 2006). Ayrıca yaygın olarak tüketilen inek ve keçi peyniri gibi önemli gıdalar ve sebzelerden de izole edilmiştir (Foschino ve ark., 2006; Kawanishi ve ark., 2007; Fernandez ve ark., 2010). İlk olarak mastitisli ineklerden izole edilen L. garvieae sonraki yıllarda tatlı su ve deniz balıklarının yanı sıra kedi, köpek, kurbağalardan da izole edilmiştir (Fihman ve ark., 2006; Kubota ve ark., 2010; Mendoza ve ark., 2012; Russo ve ark., 2012). Avrupa’da L. garvieae’nin balıklarda ilk salgından sonra birçok farklı ülke ve balık türünde izole edildiği bildirilmiştir. İlk izolasyonu takiben sonraki yıllarda hastalık geniş bir coğrafik dağılım göstererek İtalya, Avusturalya, Güney Afrika, Tayvan ve Türkiye’de de birçok balık işletmesinden rapor edilmiştir (Ghittino ve Prearo, 1992; Carson ve ark., 1993; Diler ve ark., 2002). L. garvieae kaynaklı ekonomik kayıplar gökkuşağı alabalığı çifltliklerinde total üretimin % 50-80’ine ulaşabilmektedir (Itami ve ark., 1996). Ülkemizde yaz aylarının sıcak geçtiği Ege Bölgesi başta olmak üzere Türkiye’nin birçok bölgesinde yaygın olan L. garvieae enfeksiyonu ilk olarak Diler ve ark., (2002) tarafından rapor edilmiştir. Enfeksiyonun ilk bildiriminden sonraki yıllarda Doğu Karadeniz Bölgesi de dahil olmak üzere birçok bölgede görülmesi etkenin hızlı yayılım gösterdiğini ortaya koymuştur (Kubilay ve ark., 2005; Savaş ve Ture, 2007; Ozer ve ark., 2008; Timur ve ark., 2011; Altun ve ark., 2013b). Dünyada ve ülkemizde akuakültürdeki hızlı büyüme beraberinde hastalık salgınlarının da artış göstermiştir. Akuakültürde karşılaşılan bakteriyel orijinli salgınlara karşı mücadelede birçok ülkede halen daha yoğun miktarda antimikrobiyal kullanıldığı bildirilmektedir. Örneğin Norveç’te bir yılda üretilen her bir ton balık için 0.8g, İngiltere’de 11.7g, Kanada’da 175g ve Şili’de 1400g antimikrobiyal kullanıldığı rapor edilmiştir (Burridge Les ve ark., 2005; SalmonChile, 2008; Gomez C, 2009; Millanao ve ark., 2011;). Balıkların stok yoğunluklarının fazla olması, karasal sulardaki balık çiftliklerinin artması, işletmelerde hijyen ve sanitasyonun yetersiz 7 olması ve ülke içerisinde balık hareketlerinin iyi kontrol edilmemesi enfeksiyonların hızla yayılmasına neden olmaktadır (Naylor ve ark., 2000; Naylor ve Burke, 2005). Akuakültürde hijyen ve sanitasyon uygulamalarındaki yetersizlikler antimikrobiyal kullanımını da arttırmıştır (Grave ve ark., 1996; Cabello, 2006; Sorum, 2006). Antimikrobiyallerin yoğun kullanımının önemli olumsuz etkilerinden birisi de antibiyotiklerin su kaynakları ile çevreye, insanlara ve karasal ekosisteme yayılmasıdır (Haya ve ark., 2000; Boxall ve ark., 2004; Naylor ve Burke, 2005). Karasal evcil hayvanlarda olduğu gibi akuakültürde de antimikrobiyallerin yaygın kullanımı, balık ve çevresel patojenlere karşı antimikrobiyal direnç gelişimine neden olmaktadır (Angulo ve Griffin, 2000; Rhodes ve ark., 2000a; Rhodes ve ark., 2000b; Witte, 2000; Miranda ve Zemelman, 2002a; Miranda ve Zemelman, 2002b; Petersen ve ark.,2002; Angulo ve ark., 2004; Alcaide ve ark.,2005). Balık patojenlerinde antimikrobiyal direncin ortaya çıkması akuakültürde profilaktik amaçla kullanılan antimikrobiyallerin etkisinin azalmasına, antimikrobiyal direnç geliştirmiş olan patojenlerin ve direnç genlerinin karasal hayvanlara, insanlara geçişine neden olmaktadır (L’Abee-Lund ve Sorum, 2001; Sorum, 2006). Profilaktik amaçla kullanılan bazı antimikrobiyaller balıklarda immun sistemin baskılanmasına neden olmakta ve buna bağlı olarak enfeksiyonların oluşumuna yol açmaktadır (Barton ve Iwama, 1991; Naylor ve Burke, 2005; Cabello, 2006). Antimikrobiyaller balıklara genellikle oral, banyo ve enjeksiyon yöntemiyle verilmektedir (Markestad ve Grave, 1997; Sorum, 2006). Antimikrobiyallerin kontamine balık yemleri (tüketilmeyen), balık dışkıları ile sedimentte birikmesi ilaç kalıntılarının farklı bölgelere yayılımına yol açmaktadır. Böylece çevreye ulaşan bu antimikrobiyal kalıntılar başta kabuklu canlılar olmak üzere yabani balıklara da ulaşabilmektedir (Hektoen ve ark., 1995; Kerry ve ark., 1996; Coyne ve ark., 1997; Holten ve ark., 1999; Guardabassi ve ark., 2000a; Sorum ve L’Abée-Lund, 2002; Boxall ve ark., 2004). Akuakültürde hastalıkların tedavisinde öncelikle ruhsatlı antimikrobiyaller kullanılmalı ancak antibiyogram sonuçlarına göre bu ilaçların etkisiz olduğu durumlarda Veteriner Hekimler tarafından etiket dışı antimikrobiyaller reçete edilmelidir. Bu amaçla Amerika’da Gıda ve İlaç Uygulama topluluğu tarafından akuakültürde kullanılmak üzere oksitetrasiklin, florfenikol ve 8 sulfadimetoksin/ormetoprim kombinasyonu ruhsatlandırılmıştır (Cabello ve ark., 2013; Van Boeckel ve ark., 2015). Ülkemizde de kültür balıkçılığı için florfenikol, oksitetrasiklin, enrofloksasin, sulfamethoksazol-trimetoprim ve amoksisillin ruhsatlandırılmıştır. Antimikrobiyaller genellikle balıkların yemlerine karıştırılarak kullanılmaktadır. Oral kullanımda antimikrobiyallerin tamamı balık tarafından alınamamakta böylece ilaçların bir kısmı ortama (akarsu, deniz ya da göl) geçmektedir (Burridge ve ark., 2010). Antimikrobiyal direncin yayılımından önemli olan faktörler ve antimikrobiyallerin kontaminasyon yolu şekil 1’de verilmiştir. Antimikrobiyallerin bilinçsiz kullanımının önüne geçilebilmesi için yalnızca Veteriner Hekim kontolünde ilaç kullanımına müsaade verilmelidir. Miranda ve Zemelman (2002b) bir salmon işletmesinde yürüttükleri çalışmada; havuzların çıkış suyundan alınan örneklerden izole edilen bakterilerin %8-69’unun oksitetrasikline dirençli olduklarını tespit etmişlerdir. Aynı araştırmada ilginç olarak havuzların giriş suyundan izole edilen bakterilerin ise %0-16’sının oksitetrasikline dirençli olduğu bildirilmiştir. Akinbowale ve ark., (2007) oksitetrasiklin direncinin (tetR) yayılımında balıkların yaşadıkları ortamın (tank yüzeyi, kuluçkahane suyunun) ve ortama bağlı olarak şekillenen floranın (deri, barsağın) rol oynadıklarını saptamıştır. Antimikrobiyal ajanlar genellikle bir bakteri popülasyonunda etkenlerin hedef protein bölgelerini bozarak bakterilerin üremesini durdurarak (bakteriostatik) ya da bakterileri öldürerek (bakterisidal) etki eder. Bakterilerin hücre duvarı yapısının değişmesi, hücre duvarı geçirgenliğinin azalması ya da hücre duvarında bulunan dışa atım pompasının aktivasyonu, bakteri kromozomlarında noktasal mutasyon, DNA ve proteinlerin yapısını bozarak hücre duvarı sentezinin bozulması, enzimatik inaktivasyon gibi etkilerle antimikrobiyallere karşı direnç gelişir. Beta-laktam ya da glikopeptitler gibi bazı antimikrobiyaller bakterilerin hücre duvarı sentezini inhibe ederek bakteriyostatik etki gösterirler. Makrolid, aminoglikozid, tetrasiklin ve kloramfenikoller gibi bazı antimikrobiyal ajanlar ise bakterilerin protein sentezini durdurarak gelişmelerini önler ve böylelikle bakteriyostatik etki gösterirler (Carpenter ve Chambers, 2004; Romero ve ark., 2012). Transformasyonda bakteriler direnç genlerini dış ortamdan alırlarlarken transdüksiyonda bakteriler direnç genlerini viral bir DNA’dan (bakteriyofaj) alırlar. Konjugasyonda ise bakteriler direnç genleri ya da plazmidleri hücreler arası direkt 9 bağlantı ile alırlar. Bu aynı tür bakteriler arasında olabileceği gibi farklı tür bakteriler arasında da olabilmektedir. Bakteriler arasında direnç genlerinin taşınmasında genellikle transpozonlar ve plazmidler rol oynar. Transpozonlar hareketli genetik elementlerdir ve plazmidler aracılı ile taşınırlar. Bakteriler arasında taşınan bu hareketli genetik elementler mikroorganizmların antimikrobiyallerin etkinliğini azaltacak enzimler salgılamasına (beta laktamaz gibi), hücre duvarlarında bulunan dışa atım pompasının aktivasyonuna, hücre duvarlarında bulunan antimikrobiyal bağlanma reseptörlerinin engellenmesine ya da antimikrobiyallerin hücre içine alınmasına etki ederek mikroorganizmaların antimikrobiyallere karşı direnç kazanmalarına neden olur (Kumarasamy ve ark., 2010). Ayrıca ribozomlar (RNA ya da proteinler) mutasyon, fiziksel ya da kimyasal değişikliklere uğrayarak antimikrobiyal etkilerinden korunurlar. Böylelikle duyarlı bir bakteri dirençli hale gelmiş olur. Bakteriler arasında antimikrobiyal direncin yayılımı başlıca horizontal gen transferi (HGT) ile oluşmaktadır. Bakteriler arasında horizontal gen transferi konjugasyon, transdüksiyon ve doğal transformasyon olarak 3 farklı yol ile olmaktadır. Konjugasyon plazmid üzerinde hareketli genetik elementlerin alıcı hücreye transferi ile (integronlar, transpozonlar, gene kasetleri gibi) gerçekleşmektedir. Transdüksiyon ile gen transferinde direnç genleri plazmidler aracılığı ile alıcı hücrelere aktarılırlar. Doğal transformasyonda ise bakterilerin çevrede bulunan serbest direnç genlerini hücre içine alarak bu genlerin bakteri DNA’larına entegrasyonu sonucu direnç kazanması ile oluşmaktadır (Lorenz ve Wackernagel, 1994). Doğal transformasyon ile direnç kazanımda bakteriler yan yana gelerek kendi aralarında gen aktarımı ile olabilirken bakterilerin yaşadığı ortamda bulunan direnç genlerinin hücre içerisine alınması ile de gerçekleşebilmektedir (Thomas ve Nielsen, 2005). 10 Şekil 1. Antimikrobiyal ajanların balık çiftliğindeki yayılımının şematik görünümü Seyfried ve ark., (2010) ise; daha önce tetrasiklin tedavi geçmişi olmayan bir balık işletmesinden izole edilen bakterilerde tetR tespit etmişlerdir. Bununla birlikte akuatik ortamdan horizontal gen transferi aracılığı ile insan ve diğer karasal hayvan patojenlerine direnç genlerinin aktarılabildiği rapor edilmiştir (Rhodes ve ark., 2000a; Rhodes ve ark., 2000b; L’Abee- Lund ve Sorum, 2001; Sorum, 2006). Akuatik ve karasal hayvanlar arasında gen aktarımları olabildiği gibi balıkların tatlı sulardan okyanuslara taşınması ile de gen aktarımı olabilmektedir (Naylor ve Burke, 2005; Cabello, 2006). Ayrıca bu alanda yapılan epidemiyolojik ve moleküler çalışmalar Aeromonas gibi fırsatçı patojenlerin antimikrobiyal direnç genlerini insanlardan izole edilen Escherichia coli gibi patojenlere aktarılabildiğini ortaya koymuştur (Rhodes ve ark., 2000a; Rhodes ve ark., 2000b; L’Abee-Lund ve Sorum, 2001; Sorum ve L’Abée- Lund, 2002; Sorum, 2006). Bu kapsamda yapılan çalışmalarda da tetrasiklin direncini içeren plazmidlerin A. salmonicida aracılığıyla farklı ülkelerde insanlardan izole edilen A. hydrophila, A. caviae ve E. coli gibi patojenlere aktarıldığı rapor edilmiştir (Rhodes ve ark., 2000a). Ayrıca epidemiyolojik ve moleküler çalışmalar, A. salmonicida da trimetoprim, sulfanomid ve streptomisin direncinden sorumlu 11 plasmidin (sınıf 1 integron) E. coli ve Salmonella’ya transfer potansiyelinin yüksek olduğunu göstermiştir (Sorum ve L’Abee-Lund, 2002; Sorum, 2006). Sulfonamid direncinin (sulI) A. salmonicida’nın yanı sıra bitikilerden izole edilen Erwinia, insanlardan izole edilen V. cholerae ve E. coli gibi patojenlerde de tespit edildiği bildirilmiştir (L’Abee-Lund ve Sorum, 2001; Sorum, 2006). Florfenikol direncinden sorumlu floR geni ilk olarak balık patojeni olan V. damsela’dan izole edilmiştir (Bolton ve ark., 1999). Balıklarda ilk olarak V. anguillarum’da tespit edilen tetrasiklin direnç geninin (sınıf G) Salmonella aracılığı ile taşındığı bildirilmiştir. Antimikrobiyal direnç üzerine yapılan çalışmalar; insanlar, karasal ve akuatik hayvanlar arasında antimikrobiyal direnç genlerinin aktarıldığını göstermiştir (Kim ve Aoki, 1993; Briggs ve Fratamico, 1999; Angulo ve Griffin, 2000). 2.2.1 Hareketli Aeromonas Septisemi 2.2.1.1 Tarihçe Aeromonas ilk olarak 1954 yılında insan patojeni olarak (kan, akciğer, karaciğer, dalak, idrar, serebrospinal sıvı ve immun sistemi baskılanmış bir kadının kas dokusundan) izole edilmiştir (Caselitz, 1996). Sonraki yıllarda insanlarda Aeromonas enfeksiyonları gastroenteritis vakalarında da rapor edilmiştir. Aeromonas genusu; 22-25°C’de üreyebilen, çoğunlukla soğukkanlı canlıları (sürüngen ve balıklar) enfekte eden psikrofilik hareketsiz türler ve 35-37°C’de üreyen hareketli mezofilik türler olarak iki gruba ayrılmaktadır (Holt, 1994). Hareketli mezofilik Aeromonas türleri genellikle insanlarda da hastalık yapan türleri kapsamaktadır. Aeromonadaceae’nin en geniş tanımlaması son 15 yılda yapılmıştır. Keza 2000’li yıllardan sonra A. diversa, A. fluvialis, A. taiwanensis ve A. sanarelli gibi yeni türlerde tespit edilmiştir (Alperi 2010a; Alperi 2010b; Janda ve Abbott, 2010; Minana-Galbis ve ark., 2010). Aeromonas genusunun kronolojik gelişimi tablo 1’de verilmiştir. Tablo 1. Aeromonas genusunun önemli tarihsel gelişim dönemleri 12 Tarih Önemli gelişmeler Yorum Kaynak 1891 Genus ilişkili kurbağaların bakteriyel İsolata ilişkin bir kültür yok; Ewing ve ark., 1961 hastalığı (“kızıl bacak”) Aeromonas’dan şüpheleniliyor Stanier ve ark., 1943 A. hydrophila olarak belirlenen türün Polar flagella ile kok’lardan ayrılması sınıflandırılması ve taksonomisi 1943 Caselitz ve ark., 1951 Bu genusun insan enfeksiyonları ile ilk Aeromonas otopsi örneklerikden izole bağlantısı (akut metastatik myositis) edilmiştir 1996. Karaciğer hastalıkları ilişkili von Graevenitz ve 1968 Çeşitli insan enfeksiyonlarında Aeromonas septisemilerden 28 olgu rapor edilmiştir genusunun tanımlandığı ilk kapsamlı rapor ark., 1968. (Laennec sirozu) Popoff ve ark., 1981 Genus içerisinde farklı mezofilik türlerin 55 suş üzerinde DNA ilişkili çalışmalar tespit edilmesi yapılmıştır 1981 Colwell ve ark., 1986 Aeromonas filogenetik olarak 5S ve 16S rRNA gen sekansına dayalı yeni Vibriolardan ayrılması aile oluşturulmuştur (Aeromonadaceae) 1986 Genusa ait türlerin tipik suşunun Seshadri ve ark., 2006 A. hydrophila ATCC 7966’nın tüm genom belirlenmesi; hareketli parçalarda akıcılığın sekansı (4,7 Mb) olmayışı; çevresel metabolik içeriğe göre 2006 ipuçları 1970’lerden sonraki çalışmalarda Paris Pastör Enstitüsü, Atlanta Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (CDC), Washington Walter Reed Araştırma Enstitüsü gibi araştırma kurumları DNA bazlı çalışmalarla mezofilik Aeromonas grubu tekrar sınıflandırmıştır (Janda ve Abbott, 2010). Fakat DNA hibridizasyon çalışmaları ile mezofilik gruba ait olan (A. hydrophila, A. sobria ve A. caviae) türlerinin genetik farklılıkları tanımlanamadığından hibridizasyon grubu (HGs) oluşturulmuştur. Biyokmiyasal özellikleri yönüyle de farklılık tespit edilemeyen bu türler için tam olarak bir isimlendirme yapılamadığından bahsedilen HGs grubu referans suşlar ile temsil edilmiştir. Hibridizasyon grupları belirlenen türler ya rakamlarla gruplandırılmış (A. hydrophila HG1) ya da gruplandırılamayan referans suşlar Aeromonas spp. olarak isimlendirilmiştir. Pastör Enstitüsü ve CDC yaptıkları incelemelerde oluşturulan hibridizasyon gruplarını 12 HGs grubuna ayırmıştır. Daha sonraki çalışmalarda bazı Aeromonas türlerinin ayrımında biyokimyasal özellikler kullanılmış ve buna göre A. trota (Voges-Proskauer (VP) negatif, ampisillin duyarlı), A. jandaei (sukroz negatif) gibi yeni isimlendirmeler yapılmıştır (Carnahan, 1993). Yakın zamanda yapılan genetik çalışmalarda yedi Aeromonas kompleks türüden 13 yalnızca 3’ü (A. molluscorum, A. aquariorum ve A. tecta) ayrıntılı analizleri yapılarak identifiye edilebilmiştir (Piotrowska ve Popowska, 2014). Su hayvanlarında görülen patojen Aeromonas türleri içerisinde yaygın olarak A. bestiarum, A. hydrophila subsp. dhakensis, A. sobria biovar sobria ve A. veronii biovar sobria ‘yer almaktadır (Orozova ve ark., 2009). Martinez ve ark., (2009) tarafından A. hydrophila subsp. dhakensis olarak tanımlanan tür A. aquariorum olarak tekrar isimlendirilmiştir (Martinez-Murcia ve ark., 2009). Su hayvanlarından izole edilen ve patogenezisleri tam olarak bilinmeyen Aeromonas türleri akuakültürde enfeksiyon vakalarından sıklıkla rapor edilmektedir. Örneğin Beaz-Figueras ve ark., (2010) önemli bir patoloji göstermeyen balıklardan A. bestiarum, A. hydrophila, A. media, A. piscicola, A. salmonicida ve A. sobria izole etmiştir. Fakat A. piscicola hasta balıklarda izole edilen yeni bir tür olmuştur (Yanez ve ark., 2003; Austin ve Austin,, 2016; Beaz-Hidalgo ve ark., 2009). Aeromonas türlerinin kendi aralarında ve diğer genuslar arasındaki genetik ilişkilerin filogenetik olarak belirlenmesinde çok sayıda gen bölgesi araştırılmıştır. Aeromonas türlerinin ayrımında yaygın kullanılan genler arasında yaklaşık uzunlukları 1.000 ila 1.500bp arasında değişen 16S rRNA, gyrB (DNA giraz B-alt ünitesi), rpoD (Ơ70 factor), rpoB, β-alt ünite (DNA bağlı RNA polimeraz) ve dnaJ (ısı şoklu protein 40) genleri yer almaktadır (Yanez ve ark., 2003; Soler ve ark., 2004; Thompson ve ark., 2004; Morandi ve ark., 2005; Kupfer ve ark., 2006; Saavedra ve ark., 2006; Nhung ve ark., 2007; Adekambi ve ark., 2008; Minana-Galbis ve ark., 2009). Yapılan çok sayıdaki araştırmada 16S rRNA gen sekans sonuçlarının korunmuş gen bölgelerinden daha az ayrım gücüne sahip olduğu bildirilmiştir. Korunmuş gen bölgeleriyle (gyrB, rpoD ve dnaJ) yapılan sekans analizlerinde benzerlik oranları %89; %92 gibi belirlenirken, 16S rRNA gen bölgesinden yapılan sekans analizlerinde benzerlik %98.7 olduğu belirtilmiştir (Nhung ve ark., 2007). Yanez ve ark., (2003) A. trota ve A. caviae’nin ayrımında gyrB gen bölgesinin 57 ila 69 baz çiftlik farklık gösterdiği ancak 16S rRNA gen bölgesi kullanıldığında ise tek bir nükleotid farklılıkla birbirinden ayrıldığını belirlemişlerdir (Yanez ve ark., 2003). 2000’li yıllardan sonra Aeromonas türlerinin belirlenmesine yönelik çok sayıda çalışma yapılmasına rağmen A. encheleia HG11, A. veronii ve A. ichthiosmia/A. allosaccharophila/A. culicicola türlerin taksonomileri halen tam olarak açıklığa 14 kavuşturulamamıştır (Janda ve Abbott, 2010). Aeromonas genusunda yer alan A. schubertii türünün bu genus içerisinde en uzak benzerliğe sahip olduğu belirlenmiştir (Nhung ve ark., 2007; Yanez ve ark., 2003). Aeromonas türleri 2000’li yıllar sonrası; A. hydrophila [2 alt türe ayrılmış (hydrophila ve ranae)], A. bestiarum, A. salmonicida [5 alt türe ayrılmış (A. salmonicida, masoucida, smithia, achromogenes ve pectinolytica)], A. caviae, A. media, A. eucrenophila, A. sobria, A. veronii, A. encheleia, A. jandaei, A. schubertii, A. trota, A. allosaccharophila ve A. popoffii olarak 14 tür Aeromonadaceae ailesine dahil edilmiştir (Martin-Carnahan ve Joseph, 2005). 2012 yılında ise; A. ichthiosmia ve A. culicicola ile A. veronii; A. enteropelogenes ile A. trota gibi türlerin daha önce isimlendirilen Aeromonas türleri ile sinonim olduğu bildirilmiştir. Böylece Aeromonas genusuna 11 yeni tür daha eklenerek (A. simiae, A. molluscorum, A. bivalvium, A. tecta, A. aquariorum, A. piscicola, A. fluvialis, Aeromonas taiwanensis, A. sanarellii, A. diversa ve A. rivuli) toplam 25 tür Aeromonadaceae ailesine dahil edilmiştir (Figueras ve ark., 2011a; Hidalgo ve Figueras, 2012). 2.2.1.2 Hareketli Aeromonas Etiyoloji Aeromonas türleri gram negatif, 1-3,5 mm boyutlarında, oksidaz ve katalaz pozitif, fakültatif anaerobik, fermentatif özellikte olup genellikle kültür ortamlarında (TSA, BHIA, KA gibi) kolay üremektedirler (Janda ve Motyl, 1985). Bu türlerin büyük çoğunluğu kanlı agarda (at-koyun kanı) hemoliz oluşturur, triptofan ve indol üretir. Optimum gelişme sıcaklıkları 28°C olmasına rağmen genellikle 1-42°C arasında gelişebilmekte (Hanninen ve ark., 1995; Mateos ve ark., 1993) ve yüksek asidik ortamlara (pH 3,5) adapte olabilmektedirler (Karem ve ark., 1994). Doğal olarak 2, 4-diamino-6, 7-diisopropylpteridine (O/129) vibriostatik ajanına duyarlıdırlar. Vibrio ve Plesiomonas gibi yakın özelliklere sahip cinslerden %6 NaCl’da üreme ve tiyosülfat sitrat safra tuzu (TCBS) agarda üreme göstermemeleriyle ayrılmaktadır. Aeromonas genusu genel olarak maltoz, D-galaktoz ve trehalozu fermente edebilirken, ksiloz, sorboz, eritrol, adonitol, dulsitol ya da H2S’ü fermente edememektedir. Hareketli Aeromonas’ların karakteristik özellikleri olarak üreaz, pektinaz, ornitin dekarboksilaz, triptofan ve fenilalanin deaminaz üretmemeleri belirtilebilir (Holt, 1994; Janda ve Abbott, 2010). 15 Tipik A. salmonicida suşları psikrofilik, hareketsiz ve kahverengi pigment üretme özelliklerine sahiptirler. Atipik A. salmonicida grubu kendi içerisinde heterojen özellik (fenotipik karakter) göstermektedir. Atipik A. salmonicida türleri genel olarak, salmonid olmayan balıklardan izole edilmekte, mezofilik (37ºC gelişme) gelişme, hareketli-hareketsiz ve kahverengi pigment üretmeyen özellik göstermektedir (Figueras, 2005; Martínez-Murcia ve ark., 2005; Noga, 2010). Tipik ve atipik A. salmonicida türlerinin birbirlerinden ve diğer Aeromonas türlerinden biyokimyasal özellikleriyle ayrımlarının yapılamadığı bildirilmektedir (Martínez-Murcia ve ark., 2005; Beaz-Hidalgo ve ark., 2008; Figueras ve ark., 2011b). 2.2.1.3 Epidemiyoloji Aeromonas türleri; yüzey suları, balık çiftlikleri, dereler, atık sular, işlenmiş ve işlenmemiş içme suları, nehirler, göller, denizler ve arıtma sularından rapor edilmiştir (Simidu ve ark., 1971; Freij, 1984; Ormen ve Ostensvik, 2001; Carvalho ve ark., 2012). Plankton ve deniz suyu florasının rezervuar olabileceği, insanlarda Aeromonas enfeksiyonlarının balık kaynaklı kontaminasyon ile oluşabileceği bildirilmiştir (Rahman ve ark., 2007). Aeromonas’ların farklı su kaynaklarındaki prevalanslarının; kirlilik, coğrafik bölge ve yerleşim birimlerine göre değişiklik gösterdiği belirlenmiştir (Huys ve ark., 1995; Kuhn ve ark., 1997a; Kuhn ve ark., 1997b; Sechi ve ark., 2002; Pablos ve ark., 2011). Hem A. veronii bv. sobria hem de A. caviae atık sularındaki sediment ve su arıtma tesislerinin çıkış su florasının dominant bakterileri olduğu bildirilmiştir (Ashbolt ve ark., 1995; Rahman ve ark., 2007). Sağlıklı insanlarda Aeromonas’ların insidensi %1-3,5 iken; ishalli insanların dışkılarında %10,8 olduğu rapor edilmiştir (Goodwin ve ark., 1983; Edberg ve ark., 2007; Rahman ve ark., 2007; Suarez ve ark., 2008). Aeromonas türleri balıklar, diğer akuatik hayvanlar ve bitkilerin normal mikrobiyal florasında yer alırken; tatlı su balıklarında predominant karakter göstermektedir (Simidu ve ark., 1971; Trust ve Sparrow, 1974). Akuakültürde patojen Aeromonas türleri önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır (Austin ve Austin,, 1987; Nash ve ark., 2006; Pridgeon ve ark., 2011c). Balıklarda yaygın olarak hastalık vakalarından izole edilen Aeromonas türleri A. salmonicida, A. hydrophila ve A. veronii iken; son zamanlarda A. bestiarum, A. piscicola ve A. tecta türleri de 16 bildirilmiştir (Beaz-Hidalgo ve ark., 2009). Tipik A. salmonicida başta salmonid balıklar olmak üzere gökkuşağı alabalıklarında da furunkulozise neden olmaktadır (Beaz-Hidalgo ve ark., 2009). A. hydrophila ve A. veronii gibi mezofilik türler, sazan, tilapia, mersin balığı, levrek (Dicentrarchus labrax), kedi balığı (catfish, Siluriformes) ve salmonlarda hareketli Aeromonas septisemi (MAS) enfeksiyonuna neden olmaktadır (Joseph ve Carnahan, 1994). 2.2.1.4 Teşhis Aeromonas türlerinin klasik yöntemlerle identifikasyonu genellikle karbonhidrat fermentasyonları ve gaz üretimleri dikkate alınarak yapılmaktadır (Kluyver ve van Neil, 1936; Schubert, 1968). Ancak klasik yöntemlerle tür teşhislerinin yapılamadığı birçok araştırmacı tarafından bildirilmiştir (Martinez- Murcia ve ark., 2000; Figueras, 2005; Wahli ve ark., 2005). Ayrıca identifikasyon amacıyla kullanılan biyokimyasal testler, çevresel faktörlere (sıcaklık) bağlı olarak farklı sonuçlar verebilmektedir (Knochel, 1989). Aeromonas türlerinin klasik identifikasyonunda yüksek ayrım gücü olan biyokimyasal testlere dayanan Aerokey II (Carnahan ve ark., 1991; Joseph ve Carnahan, 1994), A. salmonicida’nın tür ve cins düzeyinde ayrımı için hazırlanan AeroMat-1/AsalMat-1 gibi teşhis anahtarları hazırlanmıştır (Higgins ve ark., 2007). Ancak Aerokey II; türler arası inkübasyon süresi farklılıkları ve maliyetli olması nedeniyle yaygın kullanım bulamamıştır (Janda ve Abbott, 1998). Öte yandan Aeromonas türlerinin hızlı teşhisi için Vitek, API, MicroScan, Walk/Away, BBL Crystal Enteric/Non-fermenter, Biolog ve Phoenix 100 ID/AST gibi ticari kitler geliştirilmiş olmasına rağmen bunlar gıda güvenliği açısından yaygın kullanım bulmuştur (Hanninen, 1994; Park ve ark., 2003; Soler ve ark., 2003; Huddleston ve ark., 2006; O’Hara, 2006). Zira belirtilen kitlerin psikrofil Aeromonas’ların teşhisinde hatalı sonuçlar verdiği bilinmektedir (Abbott ve ark., 1998; Janda ve Abbott, 2010). Aeromonas genusu içerisinde yer alan türler arasında yüksek genetik benzerlik göstermesi nedeniyle moleküler (PCR, RT-PCR, dizi analizi) yöntemlerle ayrımlarında güçlükler olduğu bildirilmektedir. Bu nedenle birçok hareketli Aeromonas türü; A. hydrophila ve/veya A. caviae kompleks olarak 17 isimlendirilmektedir (Janda ve Abott, 2010). A. hydrophila kompleks; içerisinde A. hydrophila sensu stricto, A. bestiarum ve A. salmonicida yer almaktadır. A. bestiarum’un ise A. hydrophila’dan ayrımında büyük güçlük yaşanmaktadır (Janda ve Abott, 2010). Bakteriyel hastalıkların moleküler teşhisine yönelik araştırmalar incelendiğinde sıklıkla 16S rRNA (SSU) dizi analizinin kullanıldığı görülmektedir (Janda ve Abbott, 2007). Ancak son zamanlarda bazı türlerin bir ya da iki baz farklılık göstermesi 16S rRNA’nın identifikasyonda kullanımını sınırlandırmaktadır (Alperi ve ark., 2008). Örneğin A. caviae ve A. trota’nın 16S rRNA dizi analizinde yalnızca 3 ya da daha az sayıda nükleotid farklılığına sahip olduğu belirtilmiştir (Martinez-Murcia ve ark., 2005). Zira Alperi ve ark., (2008); 999 Aeromonas izolatının kullanıldığı çalışmada bu izolatların %8.1’inin 16S rRNA dizi analizi ile ayrımlarının yapılamadığını bildirmiştir. Yapılan bu çalışmalar 16S rRNA ile identifikasyonun Aeromonas türleri için kullanışlı bir metot olmadığını göstermiştir. Son zamanlarda etkenlerin identifikasyonunda korunmuş gen bölgeleri (housekeeping genes) incelenmiş ve Aeromonas türlerinin ayrımında gyrB ve rpoD gibi gen bölgelerinin kullanışlı olduğu belirtilmektedir (Martinez-Murcia ve ark., 2005; Chang ve ark., 2005; Alperi ve ark., 2008). 2.2.1.5 Antimikrobiyal Duyarlılık ve Direnç Antimikrobiyallerin beşeri, veteriner ve tarım alanlarında bilinçsizce kullanımı çevrede antimikrobiyal kontaminasyona yol açmaktadır (Goni-Urriza ve ark., 2000a; Goni-Urriza ve ark., 2000b; Kummerer, 2003). Şehirsel atık suların akarsu ve denizlere karışması antimikrobiyal kirlilik yönüyle doğal kaynakları da tehdit etmektedir (Goni-Urriza ve ark., 2000a; Goni-Urriza ve ark., 2000b). Akuakültürde florokinolonlar, florfenikol, oksitetrasiklin, amoksasillin ve sulfonamidler grubu antimikrobiyallerin yaygın kullanıldığı bildirilmektedir (Graslund ve ark., 2003; Holmstrom ve ark., 2003; Cabello, 2006; Soonthornchaikul ve Garelick, 2009). Akuakültürde bakteriyel etkenlere karşı yaygın kullanılan antimikrobiyalerde direnç gelişimi olduğu birçok araştırmacı tarafından rapor edilmiştir (Petersen ve ark., 2002; Sorum, 2008; Szczepanowski ve ark., 2009; Cheng ve ark., 2012; Moura ve ark., 2012). Goni-Urriza ve ark., (2000a,b) Avrupa’da iki nehirden izole ettiği 138 hareketli Aeromonas izolatının nalidiksik aside %59, tetrasiklin’e %14, 18 sulfamethoksazol/trimetoprim’e %7, ve kloramfenikol’e %2 dirençli olduğunu bildirmiştir. Aynı araştırmacılar 16 farklı bölgeden almış oldukları şehirsel atık su örneklerinden 118 Aeromonas sp. izolatı tespit etmişler ve bu izolatların %75’inin antimikrobiyal direnç geliştirmiş olduklarını belirlemişlerdir. Ayrıca belirtilen araştırmada atık su ünitelerinin su giriş noktalarına oranla çıkış noktalarından izole edilen Aeromonas sp.’lerin %50 daha fazla antimikrobiyal dirençli oldukları saptanmıştır (Goni-Urriza ve ark., 2000a). Farklı bir araştırmada ise; şehir atık suyu deşarj edilen Coco, Ceara ve Brezilya nehirlerinden toplanan su örneklerinin %77’sinde Aeromonas (A. caviae, A. veronii bv. sobria, A. veronii bv. veronii, A. trota, A. media, A. sobria, ve A. hydrophila) türleri tespit edilmiş ve bu türlerin %60’ının 8 antimikrobiyale karşı dirençli oldukları görülmüştür (Evangelista-Barreto ve ark., 2010). Fransada balık işletmelerinde Aeromonas sp. enfeksiyonlarının tedavisi sonrası alınan sediment örneklerinde düşük seviyede florfenikol (%0,3) direnci rapor edilmiştir (Gordon ve ark., 2007). Akuakültürde yapılan antimikrobiyal çalışmalar Aeromonas türlerinin diğer akuatik bakteri türlerine oranla daha yaygın antimikrobial direnç genleri taşıdığını göstermiştir. Akuakültürde su, sediment ve hasta balıklardan izole edilen Aeromonas spp. izolatlarının tetA-E, tetH, tetG ve tetM genlerini taşıdığı bildirilmiştir (Schmidt ve ark., 2001b; Nawaz ve ark., 2006; Akinbowale ve ark., 2007; Jacobs ve Chenia, 2007; Verner-Jeffreys ve ark., 2009). Yapılan çalışmalarda tetA ve tetE genlerini tetrasiklin direncinin kodlanmasında predominant olduğu görülmüştür (Han ve ark., 2012; Nawaz ve ark., 2006). Son yıllardaki araştırmalar; yetiştiricilik sistemlerinden izole edilen Aeromonas türlerinde florfenikol (floR), trimetoprim (dfrA1 ya da dfrA7) ve sulfonamid (sulI, sulII) genlerinin tespit edildiğini bildirmektedir (Schmidt ve ark., 2001a; Jacobs ve Chenia, 2007; McIntosh ve ark., 2008; Verner-Jeffreys ve ark., 2009; Verner-Jeffreys ve ark., 2009; Ishida ve ark., 2010; Ndi ve Barton, 2011). Ülkemizde yapılan çalışmalarda ise tetA, tetB, sulI ve sulII genlerinin tespit edildiği bildirilmiştir (Boran ve ark., 2013; Çapkın ve ark., 2015). Aeromonas türlerinde tespit edilen direnç genlerinin dağılımları Tablo 2’de verilmiştir. Tablo 2. Farklı çevrelerden izole edilen antimikrobiyal direnç geni taşıyan Aeromonaslar Direnç Direnç Biyolojik kaynak Çevresel kaynak* Literatür geni fenotipi 19 A. salmonicida, Akuakültür McIntosh ve ark., 2008; Ndi ve Barton 2011; sulI Sulfanomidler A. veronii, (Sediment, Balık) Verner-Jeffreys ve ark., 2009 A. caviae A. salmonicida, Akuakültür, Gordon ve ark., 2008; McIntosh ve ark., sulII Sulfanomidler A. bestiarum Akarsu, Sediment 2008 Akuakültür A. salmonicida, Gordon ve ark., 2008; McIntosh ve ark., floR Kloramfenikol (Balık), Akarsu, A. hydrophila, 2008; Verner-Jeffreys ve ark., 2009 Sediment Akinbowale ve ark., 2007; Carvalho ve ark., Su arıtma tesisi, 2012; Girlich ve ark., 2010; Girlich ve ark., İçme suyu, 2011; Han ve ark., 2012; Ishida ve ark., A. hydrophila, tetA Tetrasiklin Akuakültür 2010; Jacobs ve Chenia 2007; Kim ve ark., A. allosaccharophila (Balık), Sediment, 2011; McIntosh ve ark., 2008; Nawaz ve Akarsu ark., 2006; Schmidt ve ark., 2001a; Verner- Jeffreys ve ark., 2009 tetB Tetrasiklin A. hydrophila, Akuakültür Jacobs ve Chenia 2007; Nawaz ve ark., 2006 Carvalho ve ark., 2012; Han ve ark., 2012c; İçme suyu, Ishida ve ark., 2010; Jacobs ve Chenia 2007; tetC Tetrasiklin A. hydrophila, Akuakültür, Nawaz ve ark., 2006; Ndi ve Barton 2011; Sediment, Balık Verner-Jeffreys ve ark., 2009; Akinbowale ve ark., 2007; Carvalho ve ark., İçme suyu, Aeromonas sp., 2012; Han ve ark., 2012c; Jacobs ve Chenia tetD Tetrasiklin Akuakültür, A. hydrophila, 2007; Nawaz ve ark., 2006; Schmidt ve ark., Sediment, Balık 2001b; Verner-Jeffreys ve ark., 2009 Akinbowale ve ark., 2007; Carvalho ve ark., Su arıtma tesisi, 2012; Han ve ark., 2012c; Ishida ve ark., A. eucrenophila, İçme suyu, tetE Tetrasiklin 2010; Jacobs ve Chenia 2007; Kim ve ark., A. hydrophila Akuakültür, 2011; Nawaz ve ark., 2006; Schmidt ve ark., Sediment, Balık 2001b; Verner-Jeffreys ve ark., 2009 Akuakültür tetG Tetrasiklin A. caviae Verner-Jeffreys ve ark., 2009 (Balık) A. hydrophila, tetH Tetrasiklin Akuakültür Jacobs ve Chenia 2007 A. encheleia A. hydrophila, Akuakültür tetM Tetrasiklin Akinbowale ve ark., 2007 A. sobria (Balık) tetY Tetrasiklin A. bestiarum Doğal su Gordon ve ark., 2008 2.3 Yersinia ruckeri 2.3.1 Tarihçe Yersinia ruckeri ilk kez 1950’li yılların başında ABD’nin Idoha Eyaleti’nin Hagerman vadisindeki gökkuşağı alabalıklarından (Rucker ve Ross) izole edilmiş ve hastalığa Kızıl Ağız (Redmouth) veya Kızıl Boğaz (Redthrout) adı verilmiştir (Rucker, 1966; Ross ve ark.,1966). Etkenin Enterobacteriaceace familyası üyesi olan Serratia, Yersinia, Hafnia, Salmonella, Klebsiella türlerine benzer olduğu belirlenmiş, daha sonra yapılan DNA hibridizasyon çalışmaları ile Y. ruckeri’nin Yersinia cinsi ile yakın benzerlik gösterdiği ortaya konularak etkene ilk izole eden “Rucker”in ismi verilmiştir 20 (Ewing ve ark., 1978). Y. ruckeri’nin neden olduğu hastalık uluslararası terminolojide Enterik Kızıl Ağız Hastalığı olarak yaygın kullanım bulmuştur (Busch, 1982). Y. ruckeri daha sonra salmon ve alabalık yetiştiriciliği yapılan Alaska, Arizona, Kalifornia, Ohio, Tenneesse ve Washington olmak üzere Amerika’nın farklı bölgelerinden izole edilmiş ve hastalığın ortaya çıktığı bölgelerde büyük ekonomik kayıplara neden olmuştur (Dear, 1988). Ancak hastalık hakkında gerekli kontrol önlemlerinin alınamaması üzerine hastalık Amerika’dan dünyanın diğer bölgelerine yayılmıştır (Valtonen ve ark., 1992). Günümüzde ise İngiltere, Almanya, Fransa, Norveç, İtalya Portekiz, Çekoslovakya, Finlandiya, İskoçya, Güney Afrika, Avustralya ve Türkiye dahil olmak üzere dünyanın birçok bölgesinde izole edildiği bildirilmiştir (Llewellyn, 1980; Roberts, 1983; Fuhrmann, 1983; Frerichs ve Collins, 1984; Giorgetti ve ark., 1985; Rintamaki ve ark., 1986; Bragg ve Henton, 1986; Sparboe ve ark.,1986; Vuillaume ve ark., 1987; Dear, 1988; Vladik ve Prouza, 1990; Cagirgan ve Yüreklitürk, 1991; Sousa ve ark., 1994; Altun ve ark., 2013a). 2.3.2 Etiyoloji Y. ruckeri gram-negatif, 1.0 ve 2-3µm uzunluğunda basil olup genellikle 7 ya da 8 tane peritrik flagellaya sahip (%80’i hareketli) bir bakteridir. Bazı suşlarda flagella olsa bile flagellar fonksiyonel olmadığı için hareketsiz olabilmekte ve genellikle 35°C’de hareketsizdirler (O’Leary, 1977). Y. ruckeri, katalaz, ß-galaktosidaz, lizin ve ornitin dekarboksilaz üretebilirken, H2S, indol, oksidaz, fenilalanin deaminaz ya da fosfataz üretemez ve genellikle nitratı indirgerler. Genellikle jelatin, sodyum sitrat, Tween 20, 40, 60 ve 80’i indirgerken eskülin, kitin, DNA, elastin, pektin, tributrin, ya da üreyi indirgeyemez ve %0-3 tuzlulukta gelişebilirler. Fruktoz, glukoz, maltoz, mannitol ve trehalozdan asit üretebilirken inositol, laktoz, raffinoz, salisin, sorbitol ya da sukrozdan asit üretemezler (Ewing ve ark., 1978; Austin ve Austin,, 2016). Bununla birlikte serovar II sorbitol fermente edemez ve bu yönüyle serovar I’den ayrılabilir. Genellikle lipopolisakkarit (LP) ya da tüm hücre serolojik reaksiyonlarına dayanan serotiplendirmeler yapılmıştır. Temelde, 5 büyük serotip tanımlanmıştır. Bu serotiplerden tip I (Hagerman) çok virülent, tip II (O’Leary) az virulenttir. Diğer serotipler olan III (Avustralya), IV ve V’in ise avirülent olduğu belirlenmiştir (Austin 21 ve Austin,, 2016). Ancak Tinsley ve ark., (2011) yüksek virülens gücüne sahip olan yeni bir klonal grup tanımlamışlardır. Serotip 1; O1a ve O1b olarak iki gruba, serotip O2 ise O2a, O2b ve O2c olarak üç gruba ayrılmıştır. Ayrıca Serotip O3, serotip O4 ve serotip O7 tanımlanmıştır (Romalde ve ark., 1993; Tobback ve ark., 2007). Y. ruckeri’nin hareket ve lipaz aktivitesine göre iki biyotipi (biyotip I-II) bildirilmiştir (Davies, 1990; Evenhuis ve ark., 2009). Hareket ve lipaz aktivitesi pozitif olan biyotip I genellikle salgınlardan izole edilen O1a (Hagerman suşu) ve O2b (O’Leary suşu) serotiplerini içermektedir ve serotip O1a kültürü yapılan gökkuşağı alabalıklarının dominant suşudur (O'Leary, ve ark., 1979; Stevenson ve Airdrie,1984; Austin ve Austin,, 2016). Y. ruckeri yaklaşık 3.7Mb genom uzunluğuna ve %47 G+C oranına sahiptir (Navas ve ark., 2014). DNA sekans analizlerinde Yersinia türlerinin yakın ilişkili oldukları ve bu genusda yer alan diğer türler ile benzer gen dizilerini taşıdığı tespit edilmiştir (Chen ve ark., 2010). Genetik yapı ve moleküler çeşitlilik açısından çoklu bölge gen sekansı (Multilocus sequence typing MLST), yağ asidi metil ester profili, pulsed field jel elektroforezi (PFGE), ribotiplendirme vs. PCR yöntemleri kullanılmıştır. Uygulanan farklı moleküler yöntemlerle Y. ruckeri serotip O1a’nın genetik olarak yüksek homojenite gösterdiği tespit edilmiştir (Schill ve ark., 1984; Huang ve ark., 2013). Bastardo ve ark., (2012) Y. ruckeri suşlarının coğrafik yayılımı ve biyoçeşitliliğini çoklu gen sekansı ile (MLST) araştırmış, popülasyon yapısı içerisinde iki büyük klonal kompleks (CC1 ve CC2) tanımlamıştır (Bastardo ve ark., 2012). Y. ruckeri’nin genotiplendirmesinde 16S rRNA sekans analizi, ERIC-PCR ve (GTG)5-PCR yöntemleri kullanılmıştır (Arias ve ark., 2007; Tinsley ve ark., 2011). 2.3.3 Epidemiyoloji Gökkuşağı alabalıklarında Yersiniozis genellikle 10g’a kadar ağırlıkdaki balıklarda şiddetli enfeksiyonlara neden olmakta 50g ve daha büyük balıklarda ise kronik formda seyretmektedir. Enfeksiyonun şiddeti 15-18°C su sıcaklıklarında en yüksek düzeye ulaşırken ve 10°C’nin altındaki su sıcaklıklarında ise düşmektedir. Aşırı yağlı ya da aşırı zayıf balıkların salgınlara daha duyarlı oldukları belirtilmektedir (Rucker, 1966). Asemptomatik taşıyıcıların bulunduğu popülasyonlarda Yersiniozis salgınları dönemsel olarak ortaya çıkabilmektedir (Busch, 1982). Hunter ve ark., 22 (1988) yaptıkları çalışmalarda stres etkisinde kalmayan taşıyıcı balıkların Y. ruckeri’yi bulaştırmadığını bildirmiştir. Taşıyıcı balıklarda hastalığın yayılmasında su sıcaklığı gibi stres faktörlerinin rol oynadığı rapor edilmiştir. Bununla birlikte balıkların ellenmesi, düşük su kalitesi (yüksek amonyak, düşük O2) ve yoğun stok gibi faktörlerin hastalığın ortaya çıkışıyla ilişkili olduğu bildirilmiştir (Bullock ve Snieszko, 1975). Y. ruckeri’nin balıklarda inkübasyon süresi yaklaşık 5-19 gündür ve inkübasyon periyodu sonrasında mortaliteler görülmektedir (Rucker, 1966; Busch, 1982). Gökkuşağı alabalığı popülasyonlarında mortaliteler kümülatif olarak %30-35 olmakta, küçük boydaki duyarlı balıklarda ise mortalite %70’e ulaşabilmektedir. (Klontz ve Huddleston, 1976). Bazı araştırmacılar Y. ruckeri’nin akuatik ortama kolay adapte olduğu, balık dışında uzun süre canlılığını koruduğunu ve etkenin çamurda 2 ay boyunca canlı kalabildiğini bildirilmiştir (Thorsen ve ark., 1992; Austin ve Austin,, 2016). Doğal enfekte ve hastalığı atlatmış balıklarda enfeksiyondan 2 ay sonra yapılan incelemelerde balıkların kalın bağırsaklarında Y. ruckeri’yi taşıdığı bildirilmiştir (Rodgers, 1992; Tobback ve ark., 2007). Flagellar proteinin aşırı salgılanması durumunda bakterinin karakteristik özelliği olan yapışkanlığı artmakta ve biyofilm oluşturabilme kabiliyeti kazanabilmektedir. Bu durum Y. ruckeri’nin sedimentte ve dışkıda uzun süreler canlı kalabilmektedir (Coquet ve ark., 2002). Etkenin bulaşmasında anaç-yumurta ilişkisi henüz tam olarak belirlenememiş olsa da Y. ruckeri’nin dezenfekte edilmeyen döllenmemiş yumurtalardan izole edildiğine dair kayıtlar bulunmaktadır. Chinook salmon (O. tshawytscha), döllenmemiş yumurta ve seminal sıvılarında bu etkene ait DNA’ların tespit edilmesi Y. ruckeri’nin vertikal bulaşma gösterebileceğine dair şüpheleri güçlendirmektedir (Glenn ve ark., 2014). Etken başta gökkuşağı alabalığı (O. mykiss) olmak üzere Coho salmon (O. kisutch), Sockeye salmon (O. nerka), Atlantik salmon (Salmo salar), Kahverengi alabalık (S. trutta), Cut-throat (S. clarki), Brook trout (Salvelinus fontinalis), dağ alası (S. alphinus) gibi salmon grubu balıklar ile kanal kedi balığı (Ictalurus punctatus), Japon balığı (Carassius auratus), sazan balıkları (Cyprinus carpio, Aristichyts nobilis), yılan balıkları (Anguilla Anguilla), Mersin balığı (Acipenser baeri Brvet) ve deniz levreğinden (D. labrax) izole edilmiştir (Rucker, 1966; Mcardle ve Martin, 1985; Vuillaume ve ark., 1987; Valtonen ve ark., 1992; Hietala ve ark., 1995; Petrie ve ark., 23 1996; Austin ve Cross, 1998; Berc ve ark., 1999; Danley ve ark., 1999; Altun ve ark., 2013a). Ayrıca su samuru, kerkenes, hindi, martı ve fare gibi farklı hayvan türlerinin de Y. ruckeri’nin taşıyıcısı olduğu bildirilmiştir (Rintamaki ve ark., 1986; Willumsen, 1989). Yapılan çalışmalarda; Y. ruckeri’nin %1-9 tuzlu sularda dahi gökkuşağı alabalıklarında enfeksiyon oluşturabildiği, polivinilklorid, beton, ağaç, fiberglas gibi yüzey materyallerine tutunma özelliği gösterdiği rapor edilmiştir (Altınok ve ark., 2001; Coquet ve ark., 2002). 2.3.4 Teşhis Etkenin primer izolasyonu özellikle dalak, kalp, böbrek ve bağırsağın son kısmından TSA, KA ve BHIA gibi genel besi yerlerine ekim yapılarak 22°C’de 48 saat inkübasyon sonrasında krem renkli yuvarlak, düzgün kenarlı kolonilerin görülmesiyle yapılabilmektedir (Austin ve Austin,, 2016). Mikroskopta gram negatif, hafif kıvrık, genellikle hareketli, oksidaz, üre kullanımı negatif, glukoz fermentasyonu, katalaz pozitif özellikte olan Y. ruckeri şüpheli izolatların Waltman- Shotts besi yerinde yeşil renkli koloniler ve hidroliz zonu oluşturması ile ön teşhisi yapılabilmektedir (Austin ve Austin,, 2016). Y. ruckeri’nin teşhisinde klasik mikrobiyolojik yöntemlerin yanı sıra yaygın olarak hızlı teşhis kitleri de (API 20E ve API 32 E) geliştirilmiştir. Y. ruckeri’nin hızlı teşhis kitlerinde pozitif olan izolatları yaygın olarak apiweb’te “1104100”, “5104100”, “5107100”, “5307100” ve “5105500” profili vermektedir (Santos ve ark., 1993; Bastardo ve ark., 2011). Ancak “51051010” nolu profile sahip Y. ruckeri izolatı Hafnia alvei’den ayırt edilememekte ve Hafnia alvei olarak yanlış identifiye edilebilmektedir (Santos ve ark., 1993; Danley ve ark., 1999). Ancak H. alvei ksiloz fermentasyonu ve 30°C’de hareket etme özellikleri ile Y. ruckeri’den ayrılabilmektedir (Buller, 2004). Y. ruckeri’nin moleküler teşhisinde PCR yöntemleri başarılı bir şekilde kullanılmış hatta bu yöntemle gökkuşağı alabalıklarında deneysel enfeksiyondan 1 saat sonra bile kan örneklerinden etken teşhis edilebilmiştir (Argenton ve ark., 1996 ; Gibello ve ark., 1999; Altınok ve ark., 2001; Taylor ve Winton, 2002). Y. ruckeri’nin moleküler karakterizasyonunda Enterobakteriyel repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), 16S rRNA gen sekansı ve Multilocus Sequence Analysis (MLSA) yöntemleri kullanılmış ve ERIC-PCR, 16S- 24 rRNA gen sekansı ve MLSA’nın taksonomik çalışmalarda güvenilir ve etkili yöntemler olduğu bildirilmiştir (Souza ve ark., 2010). 2.3.5 Antimikrobiyal Direnç Gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliğinde karşılaşılan Yersiniozis salgınlarının tedavisinde genellikle Sulfamethoksazol+trimetoprim, florfenikol, kloramfenikol, flumequin, oksalinik asit, oksitetrasiklin, potansiyel sulfanomidler ve tiamulin kullanıldığı bildirilmektedir (Austin ve Austin,, 2016). Y. ruckeri’nin farklı serotip ve biyotipleriyle yapılan çalışmalarda sulfatriad ve sephalothin’e dirençli, tetrasiklin ve kotrimoksazol’e duyarlı olduğu rapor edilmiştir (Tinsley, 2010). Balta ve ark., (2010) yaptıkları çalışmada 116 Y. ruckeri izolatının 7 farklı antimikrobiyale [oksitetrasiklin (35,3%), ampisillin (29%), oksalinik asit (11,1%), streptomisinn (10,2%), sulfamethoksazol (9,4%), trimetoprim-sulfamethoksazol (9,4%) ve florfenikol (4,2%)] karşı direnç geliştirmiş olduğu tespit etmiştir. Aynı çalışmada oksitetrasiklin dirençli izolatların büyük çoğunluğunun (44 izolatın 24’ü) tetA ve tetB direnç genlerini taşıdığı bildirilmiştir (Balta ve ark., 2010). 2015 yılında tetrasiklin ve sulfanomid direncini incelemek amacıyla yapılan farklı bir çalışmada ise Y. ruckeri izolatlarının yalnızca tetD ve sulI genleri taşıdığı tespit edilmiştir (Çapkın ve ark., 2015). 2.4 Lactococcus garvieae 2.4.1 Tarihçe Laktokokkozis; su sıcaklığının 16ºC ve üzerine çıktığı yaz aylarında tatlı sularda kültürü yapılan gökkuşağı alabalıkları başta olmak üzere hem tatlı su hem de deniz balıklarını etkileyen yüksek mortaliteyle seyreden bir hastalıktır (Ferrario, 2012). L. garvieae Avusturalya, Güney Afrika, Japonya, Tayvan, Amerika, İngiltere, Türkiye ve Akdeniz ülkeleri de dahil olmak üzere 5 farklı kıtadan rapor edilmiştir (Vendrell ve ark., 2006). L. garvieae ilk olarak İngiltere’de bir mastit vakasından (sığır) izole edilmiş ve Streptococcus garvieae olarak isimlendirilmiştir (Collins ve ark., 1983). Japonya’da sarıkuyruk (Seriola quinqueradiata) balıklarında görülen salgınlarından izole edilen bakteri 1991 yılında Enterococcus seriolicida olarak isimlendirilmiştir (Kusuda ve ark., 1991). Etken üzerine daha sonra yapılan 25 biyokimyasal ve moleküler çalışmalarda E. seriolicida ile L. garvieae’nin sinonim olduğu bildirilmiştir (Palacios ve ark., 1993; Domenech ve ark., 1993; Eldar ve ark., 1996). 2.4.2 Etiyoloji L. garvieae; fakültatif anaerobik, hareketsiz, sporsuz, oksidaz, katalaz, H2S ve indol negatif özellikte gram pozitif kok olup tek veya iki-üçlü zincirler oluşturabilmektedirler. Çevresel ve fizyolojik toleransı yüksek olan L. garvieae 4- 45°C sıcaklık, %0-6,5 tuzluluk, %0,40 safra tuzu, pH 4-9,6 ve %0,1 metilen mavisinde üreme özelliği gösterebilmektedir. Kanlı agarda α hemoliz oluşturduğu bilinen etkenin, β-hemoliz oluşturduğu da bildirilmiştir (Teixeira LM ve ark., 1996; Vendrell ve ark., 2006). Etken triptik soy agar (TSA), %5 koyun kanı ilave edilmiş kanlı agar, beyin kalp infüzyon agar (BHIA) ve safra-eskülin agar (BEA)’da üreyebilirken McConkey agarda üreyememektedir (Austin ve Austin,, 2016). Karbonhidrat fermentasyonu yönüyle incelendiğinde ise bakterinin; eskulin, sellobiyoz, D-fruktoz, galaktoz, D-glukoz, maltoz, manntiol, D-mannoz, salisin, sorbitol ve trehaloz pozitif olduğu, adonitol, D-arabinoz, gliserol, glikojen, inositol, laktoz, melezitoz, melibiyoz, raffinoz, L-ramnoz, nişasta, sukroz ya da D-ksiloz negatif özellik gösterdiği bildirilmiştir (Austin ve Austin,, 2016; Aguado-Urda ve ark., 2011) L. garvieae’nin fenotipik özelliklerine göre biyotiplendirilmesinde tagatoz, riboz ve sukroz kullanımına göre 3 biyotip tanımlanmıştır (Ravelo ve ark., 2001). L. garvieae’nin moleküler karakterizasyonunda rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA (RAPD-PCR), Sau-PCR, çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizmi (AFLP), kesilmiş parça polimorfizmi (RFLP), ribotiplendirme, pulsed-field jel elektroforezi (PFGE) ve rRNA gen analizi (ARDRA) gibi moleküler tekniklerin başarıyla kulanıldığı bildirilmiştir (Ravelo ve ark., 2003; Eyngor ve ark., 2004; Kawanishi ve ark., 2005; Michel ve ark., 2007; Foschino ve ark., 2008). 2.4.3 Epidemiyoloji L. garvieae etkeni başta gökkuşağı alabalığı olmak üzere sarıkuyruk (S. dumerili), tilapi (Oreochromis sp.), japon yılan balığı (Anguilla japonica), dil balığı (Paralichthys olivaceous), kefal (Mugil cephalus), kedi balığı, çırçır balığı (Coris aygula), kayabalığı (Sebastes schlegeli), sarıağız balığı (Seriola lalvei) ve tatlı su 26 karidesi (Macrobrachium rosenbergii) gibi çok sayıda akuatik organizmadan izole edilmiştir (Kusuda ve ark., 1991; Prieta ve ark., 1993; Lee ve ark., 2001; Chen ve ark., 2001; Chen ve ark., 2002; Ravelo ve ark., 2003; Colorni ve ark., 2003; Kang ve ark., 2004; Kawanishi ve ark., 2005). Sazan balıkları (Cyprinus carpio) bu hastalığa karşı doğal direnç göstermektedir (Eldar ve ark., 1995). L. garvieae’nin patojenitesi üzerine yapılan bir deneysel çalışmalarda 100g’a göre 50g’lık alabalıklarda hastalığın daha şiddetli seyrettiği ve yüksek mortaliteye neden olduğu rapor edilmiştir. Ancak gökkuşağı alabalıklarında Laktokokkozis ile ilgili yapılan çalışmalarda hastalık etkeninin tüm boylarda (5 g-1 kg) etkili olduğu ve yüksek mortaliteye neden olduğu bildirilmiştir (Chang ve ark., 2002; Pereira ve ark., 2004). L. garvieae’nin kapsüllü suşlarının (serotip KG-) kapsülsüzlerden (serotip KG+) daha virulent olduğu ve şiddetli patojeniteye sebep olduğu kaydedilmiştir (Alim ve ark., 1996; Ravelo ve ark., 2001; Kang ve ark., 2004). Laktokokkozis salgınlarına genellikle yaz aylarında su sıcaklıklarının yükseldiği dönemlerde (>16°C) sıklıkla rastlanılmaktadır. Gökkuşağı alabalığı işletmelerinde su sıcaklığının 14-15°C üzerine çıkması durumunda hastalığın inkübasyon süresi hızlanır ve mortalitede artış gözlenir (Ghittino ve ark., 1998; Pereira ve ark., 2004). Gökkuşağı alabalıklarında deneysel enfeksiyon yapılan bir çalışmada; 18°C su sıcaklığındaki balıklarda %85 mortalite olduğu fakat 14°C su sıcaklığındaki balıklarda ise etken izole edilebilirken (inokülasyondan sonra ilk 25 gün) mortalite gözlenmediği bildirilmiştir (Royo, 1999). L. garvieae’nin yayılımında sediment, işletme suyu, su ve balık yakalama ekipmanlarının da rolü olduğu bildirilmiştir (Kitao ve ark., 1979; Kusuda ve ark., 1991). 2.4.4 Teşhis Laktokokkozis’in teşhisi genellikle karakteristik semptomlar ve klinik bulguların görülmesiyle de yapılabilir. Hasta balıkların böbrek, beyin, karaciğer, dalak, göz, barsak ya da kan örneklerinden TSA, BHIA, KA gibi genel besi yerlerine ekim yapılarak 22-24°C’de 24-48 saat inkübasyon sonrası dağınık kenarlı beyaz-krem renkli koloniler görülmesi ile izolasyon yapılabilir (Kusuda ve ark., 1991; Ghittino ve ark., 1998; Austin ve Austin,, 1999). L. garvieae’nin teşhisinde klasik mikrobiyolojik 27 yöntemlerin (gram boyama, hareket, oksidaz, katalaz, O/F vb.) yanı sıra hızlı teşhis kitleri de (API 32STREPT) geliştirilmiştir (Ravelo ve ark., 2001). L. garvieae’nin moleküler teşhisinde pLG ve ITS primerlerinin başarılı sonuçlar verdiği bildirilmiştir (Elliot ve ark., 1991; Zlotkin ve ark., 1998; Dang ve ark., 2012). 2.4.5 Antimikrobiyal Direnç Laktokokkozisin tedavisinde eritromisin, oksitetrasiklin, amoksasillin ve doksisiklin yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Munday, 1994). Fakat akuakültürde bilinçsiz antimikrobiyal kullanımına bağlı olarak direnç gelişimi rapor edilmiştir (Katao, 1982). Bununla birlikte bazı antimikrobiyal ajanların invitro çalışmalarda L. garvieae’ye karşı etkili sonuçlar vermesine rağmen sahada başarılı sonuçlar alınamadığı bildirilmektedir (Bercovier ve ark., 1997). Yapılan bir araştırmada coğrafik orijinleri farklı olan L. garvieae izolatlarının enrofloksasin ve nitrofurantoin’e duyarlı, oksalinik asit ve sulfamethoksazol-trimetoprim kombinasyonlarına ise direnç geliştirmiş oldukları bildirilmiştir (Ravelo ve ark., 2001). Sarıkuyruk balıklarından izole edilen L. garvieae üzerine yapılan diğer bir araştırmada ise; izolatların %44’ünün eritromisin, linkomisin ve oksitetrasikline direnç geliştirmiş oldukları ve bu izolatların ermB ve tetS genlerini taşıdıkları tespit edilmiştir (Kawanishi ve ark., 2005). Ülkemizde bu konuda yapılan araştırmalarda L. garvieae izolatlarının eritromisin, ofloksasin, ampisillin ve kloramfenikol’e duyarlı, penisilin ve klindamisin’e ise dirençli olduğu bildirilmiştir (Ture ve Boran, 2015). Bugüne kadar yapılan araştırmalarda L. garvieae izolatlarının tetA, tetE, tetB, tetD, tetL, tetK, tetG, tet34, tetS, tetC, tetM, tetO ve ermB direnç genlerinin tespit edildiğine dair bildirimler bulunmaktadır (Raissy ve Shahrani, 2015; Raissy ve Moumeni, 2016). 28 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1 Bakteri İzolatları Bu tez çalışmasında Su Ürünleri Hastalıkları Anabilim Dalı Laboratuvarı kültür koleksiyonunda yer alan Y. ruckeri, L. garvieae ve Hareketli Aeromonas suşları kullanılmıştır. Çalışmada kulanılan izolatların kökenleri ve izolasyon yılları Tablo 3’de verilmiştir. Bakteriyel izolatların bölgesel dağılımı ise Şekil 2’de verilmiştir. 29 Şekil 2. Tez çalışmasında kullanılan bakteriyel izolatların izole edildiği gökkuşağı alabalığı işletmeleri (mavi halka). ᴏTürkiye haritasında gösterilen yeşil noktalar ülkemizdeki projeli gökkuşağı alabalığı işletmelerinin dağılığımını göstermektedir. (Balcı Akova S. B. 2015) 30 Tablo 3. Tez çalışmasında kullanılan Aeromonas spp., Y. ruckeri ve L. garvieae izolatları Örnek Balık Türü İzolasyon İzolasyon Örnek Balık Türü İzolasyon İzolasyon Örnek Balık Türü İzolasyon İzolasyon Bölge Bölge Bölge No ve Ağırlığı Yılı Ayı No ve Ağırlığı Yılı Ayı No ve Ağırlığı Yılı Ayı A 131 RT -60g 2013 Temmuz İç Anadolu Y 32 RT -150g 2013 Mart Marmara L 69 RT -150g 2013 Mart Ege A 41 RT 2013 Temmuz İç Anadolu Y 202 RT -5g 2013 Ağustos Ege L 6 RT -0,5g 2013 Mart Ege A 105 RT -60 2013 Temmuz İç Anadolu Y 75 RT 2013 Ağustos Ege L 7 RT -0,5g 2013 Mart Ege A 106 RT -250 2013 Temmuz İç Anadolu Y 122 RT -15g 2013 Eylül İç Anadolu L 8 RT -0,5g 2013 Mart Ege A 109 RT -60 2013 Temmuz İç Anadolu Y 121 RT -250g 2013 Eylül İç Anadolu L 68 RT -150g 2013 Mart Ege A 113 RT -250g 2013 Temmuz İç Anadolu Y 89 RT -10g 2013 Eylül İç Anadolu L 70 RT -0,5g 2013 Mart Ege A 115 RT -100g 2013 Temmuz İç Anadolu Y 13 RT -10g 2013 Kasım İç Anadolu L 71 RT -130g 2013 Mart Ege A 118 RT -100g 2013 Temmuz İç Anadolu Y 14 RT -15g 2013 Kasım İç Anadolu L 67 RT -250g 2013 Mart İç Anadolu A 119 RT -150g 2013 Temmuz İç Anadolu Y 10 RT -3000g 2013 Kasım İç Anadolu L 87 RT -150g 2013 Nisan Ege A 120 RT -250g 2013 Temmuz İç Anadolu Y 7 RT -3000g 2013 Kasım İç Anadolu L 88 RT -150g 2013 Nisan Ege A 124 RT -150g 2013 Temmuz İç Anadolu Y 201 RT -40g 2013 Aralık İç Anadolu L 72 RT -150g 2013 Mayıs Ege A 210 RT 2013 İç Anadolu Y 200 RT -180g 2014 Ocak İç Anadolu L 73 RT -150g 2013 Mayıs Ege A 30 RT -0,3g 2013 Ağustos İç Anadolu Y 199 RT -30g 2014 Ocak İç Anadolu L 77 RT -150g 2013 Mayıs Ege A 174 RT -250g 2013 Ağustos İç Anadolu Y 173 RT -8g 2014 Şubat Ege L 83 RT -65g 2013 Temmuz İç Anadolu A 28 RT -150g 2013 Ağustos İç Anadolu Y 175 RT -8g 2014 Şubat Ege L 86 RT -250g 2013 Temmuz İç Anadolu A 25 RT -7,5g 2013 Ağustos İç Anadolu Y 183 RT -10g 2014 Şubat İç Anadolu L 81 RT -250g 2013 Temmuz İç Anadolu A 26 RT -7,5g 2013 Ağustos İç Anadolu Y 186 RT -150g 2014 Şubat İç Anadolu L 78 RT -250g 2013 Temmuz İç Anadolu A 171 RT 2013 Ağustos Ege Y 190 RT -40g 2014 Şubat İç Anadolu L 79 RT -200g 2013 Temmuz İç Anadolu A 153 RT -6g 2013 Ağustos Ege Y 193 RT -10g 2014 Şubat İç Anadolu L 80 RT -3000g 2013 Temmuz İç Anadolu A 39 RT -230g 2013 Ağustos İç Anadolu Y 174 RT -3000g 2014 Şubat İç Anadolu L 20 RT 2013 Ağustos Ege A 42 RT -10g 2013 Ağustos İç Anadolu Y 176 RT -3000g 2014 Şubat İç Anadolu L 21 RT -30g 2013 Ağustos Ege A 80 RT -10g 2013 Ağustos İç Anadolu Y 167 RT -8g 2014 Mart Ege L 22 RT -300g 2013 Ağustos Ege A 86 RT -15g 2013 Ağustos İç Anadolu Y 171 RT -8g 2014 Mart Ege L 25 RT -300g 2013 Ağustos Ege A 37 RT -80g 2013 Eylül İç Anadolu Y 165 RT -220g 2014 Mart Ege L 124 RT -5g 2013 Ağustos Ege A 36 RT -80g 2013 Eylül İç Anadolu Y 169 RT -20g 2014 Mart Ege L 24 RT -8g 2013 Ağustos Ege A 82 RT -15g 2013 Eylül İç Anadolu Y 146 RT -0,3g 2014 Nisan İç Anadolu L 26 RT -3g 2013 Ağustos Ege A 61 RT -250g 2013 Eylül İç Anadolu Y 147 RT -0,3g 2014 Nisan İç Anadolu L 74 RT 2013 Ağustos Ege A 155 RT 2013 Eylül Ege Y 127 RT -8g 2014 Nisan Ege L 75 RT 2013 Ağustos Ege A 156 RT -250g 2013 Eylül Ege Y 130 RT -5g 2014 Nisan Ege L 76 RT 2013 Ağustos Ege A 32 RT -200g 2013 Eylül İç Anadolu Y 132 RT -60g 2014 Nisan Ege L 27 RT -250g 2013 Eylül Ege A 74 RT -15g 2013 Eylül İç Anadolu Y 139 RT -8g 2014 Nisan Ege L 29 RT -0,5g 2013 Eylül Ege A 87 RT -15g 2013 Eylül İç Anadolu Y 131 SU 2014 Nisan Ege L 32 RT -0,5g 2013 Eylül Ege 31 A 33 RT -80g 2013 Ekim İç Anadolu Y 133 RT -200g 2014 Nisan Ege L 33 RT -2g 2013 Eylül Ege A 40 RT -80g 2013 Kasım İç Anadolu Y 152 RT -120g 2014 Nisan İç Anadolu L 34 RT -2g 2013 Eylül Ege A 8 RT -8g 2013 Kasım İç Anadolu Y 156 RT -300g 2014 Nisan İç Anadolu L 36 RT -250g 2013 Eylül Ege A 5 RT -3000g 2013 Kasım İç Anadolu Y 161 RT -200g 2014 Nisan İç Anadolu L 37 RT -250g 2013 Eylül Ege A 7 RT -8g 2013 Kasım İç Anadolu Y 119 RT -10g 2014 Mayıs Ege L 38 RT -250g 2013 Eylül Ege A 9 RT -8g 2013 Kasım İç Anadolu Y 110 RT -150g 2014 Mayıs Ege L 39 RT -250g 2013 Eylül Ege A 31 RT -3000g 2013 Aralık İç Anadolu Y 120 RT -200g 2014 Mayıs Ege L 40 RT -250g 2013 Eylül Ege A 170 RT -12g 2014 Ocak Ege Y 111 RT -200g 2014 Mayıs İç Anadolu L 41 RT -250g 2013 Eylül Ege A 1 RT -0,5g 2014 Ocak Ege Y 118 RT -200g 2014 Mayıs İç Anadolu L 42 RT -250g 2013 Eylül Ege A 108 RT -30g 2014 Mayıs Ege Y 86 RT -2g 2014 Haziran Ege L 43 RT -250g 2013 Eylül Ege A 89 CAA -8g 2014 Haziran Marmara Y 91 RT -2g 2014 Haziran Ege L 44 RT -250g 2013 Eylül Ege A 77 CAA -8g 2014 Haziran Marmara Y 51 RT -200g 2014 Temmuz İç Anadolu L 45 RT -150g 2013 Eylül Ege A 123 Su -bentik 2014 Haziran İç Anadolu Y 66 RT -200g 2014 Temmuz İç Anadolu L 46 RT -150g 2013 Eylül Ege A 76 CAA -8g 2014 Haziran Marmara Y 2 RT -8g 2014 Temmuz Ege L 47 RT -150g 2013 Eylül Ege A 91 CAA -8g 2014 Haziran Marmara Y 25 RT -12g 2014 Temmuz Ege L 48 RT -150g 2013 Eylül Ege A 84 RT -0,5g 2014 Temmuz Ege Y 3 RT -15g 2014 Temmuz Ege L 49 RT -150g 2013 Eylül Ege A 59 RT -0,3g 2014 Temmuz Ege Y 68 RT -0,3g 2014 Temmuz Ege L 50 RT -150g 2013 Eylül Ege A 88 RT -10g 2014 Ağustos Ege Y 53 RT -100g 2014 Temmuz İç Anadolu L 51 RT -150g 2013 Eylül Ege A 79 RT -10g 2014 Eylül Ege Y 64 RT -100g 2014 Temmuz İç Anadolu L 52 RT -100g 2013 Eylül Ege A 65 RT -15g 2014 Eylül İç Anadolu Y 71 RT -15g 2014 Ağustos Ege L 28 RT 2013 Eylül Ege A 78 RT -10g 2014 Ekim Marmara Y 79 RT -15g 2014 Ağustos Ege L 30 RT 2013 Eylül Ege A 90 RT -15g 2014 Ekim Ege Y 61 RT -0,2g 2014 Ağustos Ege L 35 RT 2013 Eylül Ege A 67 RT -8g 2014 Kasım İç Anadolu Y 56 RT -10g 2014 Eylül Ege L 31 RT 2013 Eylül Ege A 97 RT -8g 2015 Ocak Marmara Y 57 RT -20g 2014 Eylül Ege L 17 RT 2013 Eylül Ege A 100 RT -120g 2015 Ocak Marmara Y 60 RT -150g 2014 Ekim Marmara L 18 RT 2013 Eylül Ege A 99 RT -10g 2015 Ocak Marmara Y 78 RT -5g 2014 Ekim Ege L 11 RT -15g 2013 Aralık Ege A 98 RT -8g 2015 Ocak Marmara Y 81 RT -14g 2014 Ekim Ege L 116 RT -30g 2013 Aralık Ege A 162 RT -0,5g 2015 Ocak Marmara Y 114 RT -250g 2014 Ekim Ege L 130 RT -15g 2013 Aralık Ege A 2 RT -40g 2015 Ocak Akdeniz Y 58 RT -8g 2014 Kasım Akdeniz L 19 RT -200g 2014 Mart Ege A 3 RT -40g 2015 Ocak Akdeniz Y 73 RT -20g 2014 Kasım Akdeniz L 1 RT -200g 2014 Nisan Ege A 101 RT -1g 2015 Ocak Ege Y 77 RT -8g 2014 Kasım Akdeniz L 4 RT -40g 2014 Nisan Ege A 102 RT -2g 2015 Ocak Ege Y 106 RT -3g 2014 Kasım Ege L 118 RT -200g 2014 Nisan Ege A 16 RT -8g 2015 Ocak Marmara Y 107 RT -5g 2014 Kasım Ege L 128 RT -40g 2014 Nisan Ege A 17 RT -10g 2015 Ocak Marmara Y 11 RT -2g 2014 Kasım Ege L 5 RT -200g 2014 Nisan Ege A 160 RT -0,1g 2015 Şubat Ege Y 9 RT -0,1g 2014 Kasım Ege L 125 RT -200g 2014 Nisan Ege A 161 RT -10g 2015 Şubat Ege Y 40 RT -250g 2014 Aralık Doğu L 2 RT -200g 2014 Nisan Ege Anadolu 32 A 146 RT -0,1g 2015 Şubat İç Anadolu Y 43 RT -250g 2014 Aralık Doğu L 3 RT -200g 2014 Nisan Ege A 165 RT -250g 2015 Mart Ege Y 44 RT -10g 2014 Aralık İçA Anandaodloul u L 16 RT -200g 2014 Nisan Ege A 164 RT -2g 2015 Mart Ege Y 45 RT -10g 2014 Aralık İç Anadolu L 115 RT -200g 2014 Nisan Ege A 147 RT -0,5g 2015 Mart İç Anadolu Y 29 RT -1g 2014 Aralık Ege L 63 RT -200g 2014 Mayıs Ege A 173 RT -0,4g 2015 Nisan Ege Y 37 RT -50g 2014 Aralık Ege L 66 RT -300g 2014 Mayıs Ege A 172 RT -200g 2015 Nisan Marmara Y 42 RT -40g 2014 Aralık İç Anadolu L 65 RT -60g 2014 Mayıs Ege A 148 RT -6g 2015 Nisan Ege Y 47 RT -150g 2014 Aralık İç Anadolu L 62 RT -200g 2014 Mayıs Ege A 159 RT -0,2g 2015 Nisan Ege Y 38 RT -1g 2015 Ocak Ege L 64 RT -200g 2014 Mayıs Ege A 189 RT -3g 2015 Nisan Ege Y 39 RT -7g 2015 Ocak Ege L 53 RT -8g 2014 Haziran Ege A 182 RT -100g 2015 Nisan İç Anadolu Y 36 RT -150g 2015 Ocak Ege L 59 RT -150g 2014 Haziran Ege A 151 RT -0,5g 2015 Nisan İç Anadolu Y 255 RT -250g 2015 Şubat Akdeniz L 55 RT -200g 2014 Haziran Ege A 178 RT -8g 2015 Mayıs Karadeniz Y 256 RT -250g 2015 Şubat Akdeniz L 56 RT -100g 2014 Haziran Ege A 181 RT -8g 2015 Mayıs Karadeniz Y 6 RT -300g 2015 Şubat İç Anadolu L 54 RT -8g 2014 Haziran Ege A 209 RT -40g 2015 Mayıs Karadeniz Y 212 RT -250g 2015 Mart Ege L 57 RT -250g 2014 Haziran Ege A 179 RT -8g 2015 Mayıs Karadeniz Y 213 RT -250g 2015 Mart Ege L 58 RT -250g 2014 Haziran Ege A 180 STL -200g 2015 Mayıs Karadeniz Y 217 RT -30g 2015 Mart İç Anadolu L 60 RT -200g 2014 Haziran Ege A 150 RT -150g 2015 Mayıs Marmara Y 214 RT -200g 2015 Nisan Marmara L 82 RT -200g 2014 Haziran Ege A 184 RT -25g 2015 Mayıs Ege Y 215 RT -250g 2015 Nisan Marmara L 84 RT -200g 2014 Haziran Ege A 70 K 2015 Haziran Marmara Y 224 RT -6g 2015 Nisan Ege L 85 RT -200g 2014 Haziran Ege A 175 RT -350g 2015 Haziran Ege Y 206 RT -3g 2015 Nisan Ege L 90 RT -12g 2014 Temmuz Ege A 176 RT -2g 2015 Haziran Ege Y 229 RT -3g 2015 Nisan Ege L 94 RT -12g 2014 Temmuz Ege A 177 RT -4g 2015 Haziran Ege Y 207 RT -250g 2015 Nisan Ege L 89 RT -300g 2014 Temmuz Ege A 185 RT -200g 2015 Haziran İç Anadolu Y 228 RT -250g 2015 Mayıs Karadeniz L 91 RT -150g 2014 Temmuz Ege A 186 RT -0,6g 2015 Haziran İç Anadolu Y 216 RT -12g 2015 Mayıs Ege L 92 RT -200g 2014 Temmuz Ege A 187 RT -0,6g 2015 Haziran İç Anadolu Y 232 RT -12g 2015 Mayıs Ege L 93 RT -200g 2014 Temmuz Ege A 204 RT -250g 2015 Ağustos Ege Y 231 RT -10g 2015 Mayıs Ege L 97 RT -10g 2014 Ağustos Ege A 205 RT -250g 2015 Ağustos Ege Y 259 RT -2000g 2015 Haziran Marmara L 99 RT -200g 2014 Ağustos Ege A 190 RT 2016 Karadeniz Y 260 RT -2000g 2015 Haziran Marmara L 96 RT -100g 2014 Ağustos Ege A 192 RT 2016 Karadeniz Y 257 RT -200g 2015 Haziran Ege L 98 RT -7g 2014 Eylül Ege A 193 RT 2016 Karadeniz Y 258 RT -200g 2015 Haziran Ege L 100 RT -250g 2014 Eylül Ege A 194 RT 2016 Ege Y 210 RT -250g 2015 Haziran Ege L 103 RT -250g 2014 Eylül Ege A 195 RT 2016 Karadeniz Y 225 RT -250g 2015 Haziran Ege L 101 RT -60g 2014 Eylül Ege A 196 RT 2016 Karadeniz Y 227 RT -8g 2015 Haziran Ege L 102 RT -250g 2014 Eylül Ege A 212 Z 2016 Nisan Marmara Y 211 RT -5g 2015 Haziran Ege L 104 RT -60g 2014 Ekim Ege A 213 Z 2016 Nisan Marmara Y 223 RT -30g 2015 Haziran Ege L 105 RT -40g 2014 Ekim Ege A 214 RT -40g 2016 Mayıs Marmara Y 226 RT -5g 2015 Haziran Ege L 108 RT -14g 2014 Ekim Ege 33 ATCC A. Y 209 RT -250g 2015 Haziran İç Anadolu L 107 RT -250g 2014 Ekim Ege 7966 Süt hydrophila ATCC 1976 A. caviae Y 94 R 827 Rize Karadeniz L 106 RT -30g 2014 Ekim Ege 23214 Akarsu ATCC 1976 A. sobria Y 96 R 871 Rize Karadeniz L 110 RT -300g 2014 Ekim Ege 43979 Balık FNR A. sobria Y 233 RT Ege L 111 RT -30g 2014 Ekim Ege 2478 FNR A. bestiarum Y 234 RT Ege L 109 RT -300g 2014 Ekim Ege 5488 Y 235 RT Ege L 12 RT -250g 2014 Aralık Ege Y 236 RT İç Anadolu L 13 RT -200g 2014 Aralık Ege Y 238 RT Marmara L 122 RT -200g 2014 Aralık Ege Y 239 RT İç Anadolu L 131 RT -250g 2014 Aralık Ege Y 240 RT Danimarka L 123 RT -200g 2014 Aralık Ege Y 242 RT 185E0g6e2 1- L 14 RT -200g 2014 Aralık Ege 1116b Y 243 RT Marmara L 15 RT -400g 2014 Aralık Ege Y 244 RT İç Anadolu L 132 RT -400g 2014 Aralık Ege Y 245 RT Ege L 140 RT -250g 2014 Aralık Doğu Y 246 RT İç Anadolu L 9 RT -200g 2015 Ocak AnEagdeo lu Y 247 RT Marmara L 135 RT -200g 2015 Ocak Ege Y 249 RT Ege L 10 RT -150g 2015 Ocak Ege Y 250 RT Karadeniz L 114 RT -150g 2015 Ocak Ege Y 251 RT Karadeniz L 129 RT -250g 2015 Şubat Akdeniz Y 252 RT Ege L 119 RT -100g 2015 Şubat Ege Y 254 RT Ege L 133 RT -200g 2015 Şubat Ege R 825 Y 92 Karadeniz L 112 RT -250g 2015 Mart Ege Artvin R 874 Y 93 Karadeniz L 120 RT -250g 2015 Mart Ege Trabzon Y 237 RT Marmara L 126 RT -250g 2015 Mart Ege Y 241 RT Ege L 127 RT -250g 2015 Mart Ege Y 248 RT Ege L 117 RT -12g 2015 Mayıs Ege Y 253 RT Ege L 121 RT -200g 2015 Mayıs Ege Y 95 Karadeniz L 113 RT -350g 2015 Mayıs Ege Y 261 RT -250g 2016 Mart Akdeniz L 134 RT -25g 2015 Mayıs Ege Y 262 RT -250g 2016 Mart Akdeniz L 136 RT -250g 2015 Mayıs Doğu Anadolu 34 Y 263 RT -250g 2016 Mart Akdeniz L 137 RT -250g 2015 Mayıs Doğu Y 264 RT -250g 2016 Mart Akdeniz L 138 RT -250g 2015 Mayıs ADnaodğoul u Y 265 RT -250g 2016 Mart Akdeniz L 139 RT -250g 2015 Mayıs ADnaodğoul u NCTC ATCC Anadolu RT 1978 A.B.D. Sarıkuyruk 1974 Japonya 12266 49156 NCTC Çinok ATCC 1978 A.B.D. Sarıkuyruk 49157 1974 Japonya 12267 salmon NCTC ATCC RT 1978 A.B.D. Sığır 1984 Amerika 12268 43921 NCTC RT 1978 A.B.D. 12269 NCTC Yılan balığı 1978 A.B.D. 12270 RT: Gökkuşağı Alabalığı (Onchorhychus mykiss); ATCC: American type culture collection; NCTC: National type culture collection, STL: Salmo trutta labrax; CAA: Akvaryum balığı (Gold fish-Carassius auratus auratus; Z: Zebra balığı-Danio reriro) ve K: Kanguru (Macropus) 35 3.2 Fenotipik İdentifikasyon Bakteriyel izolatlar saflaştırıldıktan sonra konvansiyonel yöntemler ve API hızlı teşhis kitleri kullanılarak fenotipik özellikleri belirlenmiştir (API 32E, API 32STREP ve API 20NE; BioMerieux, France). Bakterilerin konvansiyonel yöntemlerle identifikasyonu, Gram boyama, oksidaz, katalaz, O/F(Oksidasyon-Fermantasyon), hareketlilik, Kanlı agarda (KA) hemoliz oluşturma, MacConkey agarda (MCA) üreme, Shotts-Waltman Agar’da (SWA) üreme ve O/129 (Vibriostat) testleri kullanılarak yapılmıştır (Austin ve Austin,, 1999; Austin ve Austin, 2016). Hareketli Aeromonasların API 20NE ile identifikasyonunda; Hareketli Aeromonas izolatlarının biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde API 20NE (biomerieux, Fransa) hızlı teşhis kiti kullanılmıştır. Test kitinin hazırlanması uygulama yönergesine uygun olarak yapılmıştır. Hareketli Aeromonas’ların inkübasyon sıcaklığı uygulama yönergesinden farklı olarak 26°C’de 24-48 saat uygulanmıştır (Abu‐Elala ve ark., 2015; Awan ve ark., 2005; Park ve ark., 2003; Popoff, 1984; Verner-Jeffreys ve ark., 2009). Hareketli Aeromonas izolatlarına yapılan API 20NE test sonuçları api veri tabanında okutularak sonuç kaydedilmiştir. Y. ruckeri’nin API 32E ile identifikasyonu; Y. ruckeri izolatlarının biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde API 32E (biomerieux, Fransa) hızlı teşhis kiti kullanılmıştır. Test kitinin hazırlanması uygulama yönergesine uygun olarak yapılmıştır. Y. ruckeri izolatlarının inkübasyon sıcaklığı uygulama yönergesinden farklı olarak 30°C’de 5-7 saat uygulanmıştır (Abdel-Latif ve ark., 2014; Frerichs, 1993; Romalde and Toranzo, 1991; Verner-Jeffreys ve ark., 2009). Y. ruckeri izolatlarına yapılan API 32E test sonuçları api veri tabanında okutularak sonuç kaydedilmiştir. L. garvieae izolatlarının API 32STREP ile identifikasyonunda; L. garvieae izolatlarının biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde API 32STREP (biomerieux, Fransa) hızlı teşhis kiti kullanılmıştır. Test kitinin hazırlanması uygulama yönergesine uygun olarak yapılmıştır. L. garvieae izolatlarının inkübasyon sıcaklığı uygulama yönergesinden farklı olarak 30°C’de 5-7 saat uygulanmıştır (Ravelo ve ark., 2001; Altun ve ark., 2004; Evans ve ark., 2006; 36 Aguado-Urda ve ark., 2014; Chen ve ark., 2001). L. garvieae izolatlarına yapılan API 32STREP test sonuçları api veri tabanında okutularak sonuç kaydedilmiştir. 3.3 Moleküler İdentifikasyon 3.3.1 DNA Ekstraksiyonu Suşların DNA ekstraksiyonları için spin kolon ile filtrasyon sistemine dayanan ekstraksiyon kiti kullanılmıştır (Şekil 3, QIAamp DNA mini kit, 51306). Üretici firmanın protokolüne uygun olarak uygulanan protokolde Hareketli Aeromonas’lar, Y. ruckeri ve L. garvieae için; 24 saatlik bakteri kültüründen DNA ekstraksiyonları yapılmıştır (Dauphin ve ark., 2010; Greenspoon ve ark., 1998; Starke ve ark., 2014). Ekstrakte edilen DNA konsantrasyonları 260 nm, saflıkları ise 260/280 nm dalga boylarında spektrofotometre (Multiscan Go, Thermo) ile ölçülmüştür. Şekil 3. DNA ekstraksiyonunda kullanılan spin kolon filtreler 3.3.2 PCR ile İdentifikasyon Hareketli Aeromonas’ların PCR yöntemleriyle kesin identifikasyonu yapılamadığından hizmet alımı yapılarak sekans analiziyle identifikasyonları yapılmıştır. Hareketli Aeromonas izolatlarında sekans analizi gyrB korunmuş gen bölgesi çoğaltılarak yapılmıştır. gyrB gen bölgesinin çoğaltılmasında kullanılan primer seti Tablo 2’de verilmiştir (Abu‐Elala ve ark., 2015; Alperi ve ark., 2012; Aravena-Roman ve ark., 2011; Soler ve ark., 2004; Yanez ve ark., 2003; Zhou ve ark., 2013). Hareketli Aeromonas izolatlarının PCR amplifikasyonunda; DEPC-treated water, 1xPCR Buffer, 1,5 mM MgCl2, her bir dNTP’den 0.2 mM, 1.0 U Taq 37 polymerase, 1 µM her bir primer ve 5 µl template DNA içeren 25 µl PCR master mix’i oluşturulmuştur (Qiagen, 201205). Oluşturulan karışım 94°C‘de 5 dk ön denatürasyonu takiben 94°C‘de 1 dk denatürasyon, 62°C‘de 30sn primer bağlanma, 72°C‘de 45sn uzama olmak üzere 30 siklus ve 72°C‘de 1 dk final uzama koşullarında amplifikasyon işlemine tabi tutulmuştur (Tablo 2). PCR ile amplifikasyon sonucunda 1100 bp’lik amplifikasyon ürününün görülmesi pozitif sonuç olarak değerlendirilerek amplikonlar sekans analizine gönderilmiştir (Alperi ve ark., 2012; Aravena-Roman ve ark., 2011; Soler ve ark., 2004; Yanez ve ark., 2003; Zhou ve ark., 2013). Tüm amplifikasyon ürünleri sekans analizi için Makrogen Avrupa (Amsterdam, Hollanda) firmasına gönderilmiştir. Sekans analizinde Sanger sekans analizi tekniğine uygun olarak çift yönlü (double strand) DNA dizi analizi yaptırılmış ve elde edilen sekans dizileri GenBank veritabanı ile karşılaştırılmıştır. Y. ruckeri’nin PCR ile identifikasyonu tablo 2’de dizileri verilen YER8 ve YER10 primerleriyle Gibello ve ark., (1999) tarafından belirtilen yönteme göre yapılmıştır. PCR amplifikasyonunda; DEPC-treated water, 1xPCR Buffer, 3.0 mM of MgCl2, her bir dNTP’den 0.2 mM, 1.0 U Taq polymerase, 1µM her bir primer ve 5 µl template DNA içeren 25 µl PCR master mix’i oluşturulmuştur (Qiagen, 201205). Oluşturulan karışım 94°C‘de 2 dk ön denatürasyonu takiben 94°C‘de 1 dk denatürasyon, 62°C‘de 1 dk primer bağlanma, 72°C‘de 1 dk uzama olmak üzere 25 siklus ve 72°C‘de 5 dk final uzama koşullarında amplifikasyon işlemine tabi tutulmuştur (Şekil 4-5; Tablo 2). PCR ile amplifikasyon sonucunda 575 bp’lik amplifikasyon ürününün görülmesi pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Altinok ve ark., 2001; Gibello ve ark., 1999). L. garvieae’nın PCR ile identifikasyonunda tablo 2’de dizileri verilen pLG–1 ve pLG–2 oligonukleotid primer seti kullanılmıştır (Dang ve ark., 2012; Fadaeifard ve ark., 2014). PCR amplifikasyonunda DEPC-treated water, 1xPCR Buffer, 1,5 mM of MgCl2, her bir dNTP’den 0.2 mM, 1.0 U Taq polymerase, 1 µM her bir primer ve 5 µl template DNA içeren 25 µl PCR master mix’i oluşturulmuştur (Şekil 3, 4, Qiagen, 201205). Oluşturulan karışım 94°C‘de 3 dk ön denatürasyonu takiben 94°C‘de 1 dk denatürasyon, 55°C‘de 1 dk primer bağlanma, 72°C‘de 1,5 dk uzama olmak üzere 35 siklus ve 72°C‘de 10 dk final uzama koşullarında amplifikasyon işlemine tabi tutulmuştur (Tablo 4). PCR ile amplifikasyon sonucunda 1100 bp’lik amplifikasyon 38 ürününün görülmesi pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir (Dang ve ark., 2012; Sharifiyazdi ve ark., 2010; Romalde and Toranzo, 2002; Zlotkin ve ark., 1998). Tablo 4. Hareketli Aeromonas, Y. ruckeri ve L. garvieae identifikasyonunda kullanılan primer dizileri ve PCR koşulları Hedef Primer ismi Primer dizisi Amplikon Pcr koşulları Kaynak Bölge büyüklüğü 92 °C 5dk Gibello ve 92 °C 1dk ark, 1999 16S- Yer8 (F) 5’-GCGAGGAGGAAGGGTTAAGTG–3’ 575bp 57 °C 1dk X25 rDNA Yer10 (R) 5’-GAAGGCACCAAGGCATCTCTG–3’ 72 °C 1dk 72 °C 5dk 94 °C 3dk Zlotkin ve 94 °C 1dk ark., 1998 16S- pLG-1 (F) 5’-CATAACAATGAGAATCGC–3’ 1.100bp 55 °C 1dk X30 rDNA pLG-2 (R) 5’-GCACCCTCGCGGGTTG–3’ 72 °C 1.5dk 72 °C 10dk 94 °C 5dk Yanez ve ark., gyrB3F (F) 94 °C 1dk 2003; Soler, 5’-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT–3’ gyrB 1.100bp 62 °C 30sn X30 2004; Abu‐gyrB14R 5’-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC–3’ 72 °C 45sn Elala ve ark., (R) 72 °C 1dk 2015 Şekil 4. PCR çalışmalarında kullanılan Thermal Cycler Şekil 5. DNA konsantrasyon ve MİK dilüsyonlarının (Biorad T100) ölçülmesinde kullanılan MultiScan Go(Thermo) 3.4 Moleküler Karakterizasyon 3.4.1 Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD-PCR) İzolatların moleküler karakterizasyonunun yapılması ve genetik yakınlığın belirlenmesi amacıyla amacıyla rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA-polimeraz zincir 39 reaksiyonu (RAPD-PCR) metodu kullanılmıştır. Bu metotda Y. ruckeri izolatları için “Enterobacterial repetitive intergenic consensus” (ERIC) dizgilerine özgü ERIC-2 primeri (Amann, 2007; Huang ve ark., 2013), L. garvieae izolatları için ise ayrım gücü yüksek olan M13 primeri kullanılmış ve primer dizileri Tablo 5’de verilmiştir (Fernandez ve ark., 2010; Ferrario ve ark., 2012; Foschino ve ark., 2008; Rossetti & Giraffa 2005). RAPD-PCR analizi için; DEPC-treated water, 1XPCR Buffer 2,5μl, 2,5 mM MgCl2, 200 μM her bir dNTP, 2.5U Taq DNA polimeraz, 25 pmol primer (Qiagen, 201205 kit) ve 5 μl template DNA içeren 25 µl’lik master karışımı hazırlanmıştır. Master mix final hacim 25 μl olacak şekilde bakteri DNA’ları eklenerek tablo 3’de verilen PCR koşulları uygulanmıştır. Amplifikasyon ürünleri etidium bromid (2 g/ml) içeren %1,5’luk agaroz jel ile 100 V 100 dk elektroforeze tabi tutulmuş, UV transilluminatör ile görüntülenmiştir. Oluşan RAPD bantları UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages) ile Bioedit yazılımı (Applied Maths, Belgium) ve MEGA 7 programlarıyla analiz edilerek dendogramları oluşturulmuştur. RAPD analizinin güvenilirliğinin belirlenmesi amacıyla referans suşlarının RAPD analizi 3 kez tekrarlanmıştır (Fernandez ve ark., 2010; Ferrario ve ark., 2012; Foschino ve ark., 2008; Rossetti & Giraffa, 2005). Hareketli Aeromonas’ların moleküler karakterizasyonu ve genetik yakınlıklarının belirlenmesinde gyrB gen bölgesinin sekans analiziyle elde edilen DNA dizileri MEGA 7 programında UPGMA metoduyla (1000 bootstrap) belirlenmiş ve filogenetik ağaç oluşturulmuştur. (Alperi ve ark., 2012; Aravena-Roman ve ark., 2011; Fontes ve ark., 2012; Soler ve ark., 2004; Yanez ve ark., 2003; Zhou ve ark., 2013). Tablo 5 Y. ruckeri ve L. garvieae’nin moleküler karakterizasyonunda kullanılan primer dizileri Hedef Primer Primer dizisi Pcr koşulları Kaynak Bölge ismi 94°C 7dk Gibello 94°C 1dk ve 16S- 41°C 1dk X35 ark,1999 ERIC-2 5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG–3’ rDNA 72°C 5dk 72°C 15dk 40 94°C 2dk Rossetti 94°C 1dk ve 16S- 42°C 40sn X40 Giraffa, M13 5-GAGGGTGGCGGTTCT-3′ rDNA 72°C 2dk 2005 72°C 10dk 3.5 Duyarlılık Konsantrasyonlarının Belirlenmesi (MİK) Tez çalışmasında kullanılan Hareketli Aeromonas, Y. ruckeri, L. garvieae izolatlarının florfenikol (FFC; Sigma, F1427), tetrasiklin (TET; Sigma, 31741), sulfamethoksazol (SUL; Sigma, S7507), sulfamethoksazol-trimetoprim (19:1) ve eritromisin (ERM; SigmaE5389) antimikrobiyallerine karşı üremelerini inhibe eden Minimal inhibitör konsantrasyonları (MİK) broth mikrodilüsyon yöntemiyle belirlenmiştir (CLSI, 2014a; CLSI, 2014b; Gao ve ark., 2012; Goni-Urriza ve ark., 2000b; Huddleston ve ark., 2006; Kahlmeter ve ark., 2006; Miller and Reimschuessel 2006; Wang ve ark., 2014). Antimikrobiyaller 0.008, 0.016, 0.032, 0.064, 0.128, 0.256, 0.512, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 ve 256 mg/L dilüsyonlarında hazırlanmış ve mikro plakalara 50’şer µl dağıtılmıştır. Bakteri süspansiyonunu hazırlamak için Tryptic-Soy Broth’ da 22°C’de 16-24 saat inkübe edilen bakteriler, Mueller-Hinton Broth’da 0.5 McFarland dansitesiye göre süspanse edilmiştir. Hazırlanan bakteri süspansiyonundan 50 µl antimikrobiyal içeren mikroplakalara dağıtılmış ve mikroplakalar 22°C’de 16-24 saat inkübe edilmiştir. Bakteri süspansiyonu ve antimikrobiyal içeren mikropalakalar mikroplaka okuyucu sistemde 595nm dalga boyunda (Multiskan Go, Thermo) ölçülmüştür. Bakteri üremesini inhibe eden en düşük konsantrasyon, MİK olarak belirlenmiş ve CLSI 2014 referans değerleriyle karşılaştırılmıştır (CLSI 2014a; CLSI 2014b). 3.6 Direnç Genleri Antimikrobiyal direncin genotipik olarak belirlenmesinde floR, ermA, ermB, tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG, tetM, tetS, sulI, sulII ve sulIII direnç genleri incelenmiştir. İncelenecek direnç gen bölgelerinin PCR amplifikasyonu için Tablo 6’deki primer dizileri ve PCR koşulları kullanılmıştır. PCR amplifikasyonu için DEPC-treated water, 1xPCR Buffer, 1,5 mM of MgCl2, her bir dNTP’den 0.2 mM, 1.0 U Taq polymerase, 1µM her bir primer ve 5 µl template DNA içeren 25 µl PCR master mix’i oluşturulmuştur (Qiagen, 201205). PCR ile amplifikasyon sonucunda herbir 41 direnç geni için tablo 4’de belirtilen spesifik bantların görüntülenmesi pozitif sonuç olarak değerlendirilmiş ve her bir direnç geni sekans analizi ile doğrulanmıştır. Tablo 6. Hedef direnç gen bölgelerine ait primer dizileri ve pcr protokolleri Primer Amplikon Primer dizisi Pcr koşulları Kaynak ismi büyüklüğü 94°C 4dk F. 5’-TATCTCCCTGTCGTTCCAG-3’ 94°C 30sn flo(R) 399bp 55°C 30sn X30 Van ve ark., 2008 R. 5’-AGAACTCGCCGATCAATG-3’ 72°C 1dk 72°C 7dk 94°C 4dk F. 5’-GATACCGTTTACGAAATTGG-3’ 94°C 30sn Chen ve ark., erm(B) 364bp R. 5’-GAATCGAGACTTGAGTGTGC-3’ 58°C 30sn X30 2007 72°C 1dk 72°C 7dk 94°C 4dk F. 5’-GAAATYGGRTCAGGAAAAGG-3’ 94°C 30sn Chen ve ark., erm(A) 332bp R. 5’-AAYAGYAAACCYAAAGCTC-3’ 55°C 30sn X30 2007 72°C 1dk 72°C 7dk 94°C 5dk F. 5’-GCTACATCCTGCTTGCCTTC-3’ 94°C 1dk tet(A) 210bp R. 5’-CATAGATCGCCGTGAAGAGG-3’ 55°C 1dk X30 Ng ve ark., 2001 72°C 1,5dk 72°C 10dk 95°C 3dk Schmidt ve ark., F. 5’-CTCAGTATTCCAAGCCTTTG-3’ 95°C 30sn 2001b; tet(B) 416bp R. 5’-CTAAGCACTTGTCTCCTGTT-3’ 59°C 30sn X25 Guardabassi ve 72°C 3dk ark., 2000b 72°C 5dk 94°C 4dk F. 5’-AACAATGCGCTCATCGT-3’ 94°C 1dk French ve tet(C) 1138bp R. 5’-GGAGGCAGACAAGGTAT-3’ 62°C 2dk X35 Schwarz, 2000 72°C 3dk 72°C 7dk 94°C 4dk F. 5’-ACACTGCTGGACGCGAT-3’ 94°C 1dk French ve tet(D) 1121 R. 5’- CTGATCAGCAGACAGAT-3’ 62°C 2dk X35 Schwarz, 2000 72°C 3dk 72°C 7dk 95°C 4dk F. 5’-GTGATGATGGCACTGGTCAT-3’ 95°C 30sn Schmidt ve ark., tet(E) 1180 R 5’-CTCTGCTGTACATCGCTCTT-3’ 62°C 30sn X25 2001b; 72°C 45sn 72°C 7dk 94°C 4dk F. 5’-GCTCGGTGGTATCTCTGCTC-3’ 94°C 1dk French ve tet(G) 468bp R. 5’-AGCAACAGAATCGGGAACAC-3’ 62°C 2dk X35 Schwarz, 2000 72°C 3dk 72°C 7dk 95 °C 5dk F. 5’-GTTAAATAGTGTTCTTGGAG-3’ 95°C 45sn Nawaz ve ark., tet(M) 657bp R. 5’-CTAAGATATGGCTCTAACAA-3’ 55°C 45sn X30 2011 72°C 1dk 72°C 7dk 94°C 4dk Charpentier ve F. 5’-ATCAAGATATTAAGGAC-3’ 94°C 30sn ark., 1993; Nawaz tet(S) 573bp R. 5’ -TTCTCTATGTGGTAATC-3’ 55°C 30sn X30 ve ark., 2011; 72°C 1dk Rizotti ve ark., 72°C 7dk 2009 42 94°C 4dk F. 5’-CGGCGTGGGCTACCTGAACG-3’ 94°C 30sn Na Wang ve ark., sul(1) 433bp R 5’-GCCGATCGCGTGAAGTTCCG-3’ 60°C 30sn X30 2014 72°C 1dk 72 °C 7dk 94 °C 4dk F. 5’-GCGCTCAAGGCAGATGGCATT-3’ 94°C 30sn Na Wang ve ark., sul(2) 293bp R 5’-GCGTTTGATACCGGCACCCGT-3’ 55°C 30sn X30 2014 72°C 1dk 72°C 7dk 94°C 4dk F. 5’-TCAAAGCAAAATGATATGAGC-3’ 94°C 30sn Na Wang ve ark., sul(3) 787bp R 5’-TTTCAAGGCATCTGATAAAGAC-3’ 55°C 30sn X30 2014 72°C 1dk 72°C 7dk 4. BULGULAR 4.1 Bakteri İzolatları Bu tez çalışmasında Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Su Ürünleri Hastalıkları Anabilim Dalı Laboratuvarı kültür koleksiyonunda yer alan 103 adet Hareketli Aeromonas, 142 adet Y. ruckeri ve 140 adet L. garvieae izolatı kullanılmıştır. Bu izolatların kökenleri ve bölgesel dağılımları Şekil 6-8’de verilmiştir. 43 Şekil 6. Aeromonas türlerinin bölgesel dağılımı (n= örnek sayısı) Şekil 7. Y. ruckeri izolatlarının bölgesel dağılımı (n= örnek sayısı) Şekil 8. L. garvieae izolatlarının bölgesel dağılımı (n= örnek sayısı) 44 4.2 Hareketli Aeromonas İzolatlarının Fenotipik Özellikleri Tez çalışmasında; gökkuşağı alabalığı, alabalık işletme suyu, balık havuzları bentiği, doğal alabalık (Salmo trutta labrax), Gold fish (Carassius auratus auratus); Zebra balığı (Danio reriro) ve Kanguru’dan (Macropus) izole edilmiş olan 103 hareketli Aeromonas izolatı kullanılmıştır (Tablo 3). Hareketli Aeromonas izolatlarının, her birinin dizi analizi ile tür tespitleri yapılmış, tür tespiti yapılan her bir Aeromonas türünü eşit oranda temsil eden 35 izolatın fenotipik özellikleri belirlenmiştir. Hareketli Aeromonas türlerinin fenotipik özelliklerine ait sonuçlar Tablo 7’de verilmiştir. Hareketli Aeromonas türleri arasında Üre (URE), N-asetil-glukosamin (NAG), Potasyum Glukonat (GNT), Malik asit (MLT) ve Oksidaz (OX) aktivitelerinin homojen özellik gösterdiği görülürken, API 20NE profilinde yer alan diğer biyokimyasal testlerin ise türler arasında oldukça heterojen olduğu belirlenmiştir (Şekil 9). Bu sonuçlara göre hareketli Aeromonas türlerinin biyokimyasal özelliklerinin türler arasında hatta türlerin kendi içlerinde heterojen özellik gösterdiği söylenebilir. 45 Tablo 7. Hareketli Aeromonas türlerinin Fenotipik ( API 20NE profilleri ve morfolojik, biyokimyasal ) özellikleri ATCC A146 A74 A185 A84 A78 A186 A37 A119 A40 A151 A59 A187 A175 A180 A179 A181 A177 A176 A209 A172 43979 AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS AS ASA ASA ASA ASA ASA ASA ASA ASA Gram boyama — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — Hareket + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Katalaz + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ O/129 R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R API 20NE NO3 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + TRP + + + + + + + + + + — + + + + + + — — — + GLU + + + + + + + + — + + + — + + + + + + + + ADH + + + — + — — + + + + + — + — — + — — + + URE — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — — ESC — — — — + + + — — — — + + + + + + — — + — GEL + + + + + + + + + + + + + + + + + — — + + PNG + + + + + + + + + + + + — + + + + + + + + GLU + + + + + + + + + + + + — + + + + + + + + ARA — — + — — + + — + + + + — — — — + — — + + MNE + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + MAN + + + + + + + + — + + + + + + + + + + + + NAG + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + MAL + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + GNT + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + CAP + + + — — — + — + + + + — — — + + — — + — ADI — — — — — — — — — — — — — — — — — + — — — MLT + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + CIT + + — + + + — — — — — — — — — — — + + — + PAC — — — — — — — — — — — — — — — — — + — — — OX + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + AS: A. sobria, ASA: A. salmonicida NO3: Potasyum nitrat; TRP: L-triptofan; GLU: D-Glukoz; ADH: L-arjinin; ESC: Eskulin; GEL: Jelatin; PNG: 4-nitrofenil-βDgalaktopiranosid; GLU: D-Glukoz; ARA: L- Arabinoz; MNE: D- Mannoz; NAG: N-asetil-glukosamin; MAL: D- Maltoz; GNT: Potasyum Glukonat; CAP: Kaprik asit; ADI: Adipik asit; MLT: Malik asit; CIT: Trisodyum sitrat; PAC: Fenilasetik asit 46 Tablo 7’nin devamı ATCC A204 A102 A9 A91 A170 A79 A88 A97 A70 A98 A39 A1 A196 A77 A76 7966 AB AB AB AH AH AH AH AM AM AV SP. AAL AE AE AHH.D AHA Gram boyama — — — — — — — — — — — — — — — — Hareket + + + + + + + + + + + + + + + + Katalaz + + + + + + + + + + + + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ O/129 R R R R R R R R R R R R R R R R API 20NE NO3 + — + + + + + + + + + + + + + + TRP + + + + + — — + + — + — — + + + GLU + — + + + + + + — + + + + + + + ADH + — + + + — — — — — + + — + + + URE — — — — — — — — — — — — — — — — ESC + — + + + — — + — — + + — + + + GEL + — + + + + + + + — + — — + + + PNG + + + + + + + + — + + + + + + + GLU + + + + + + + + + + + + + + + + ARA + — + + + — — + + — + + — — — + MNE + + + + + + + + + + + + + + + — MAN + + + + + + + + + + + + + + + + NAG + + + + + + + + + + + + + + + + MAL + + + + + + + + — + + + + + + + GNT + + + + + + + + + + + + + + + + CAP + — + + + — — + + — + — — + + + ADI — — — — — — — — + — — — — — — — MLT + + + + + + + + + + + + + + + + CIT — + + + + — — — + + — + + — — — PAC — — — — — — — — + — — + — — — — OX + + + + + + + + + + + + + + + + AB: A. bestiarum, AH: A. hydrophila, AM: A. media, AV: A. veronii, SP. Aeromonas sp., AAL: A. allosaccharophila, AE: A. eucrenophila, AHH.D: A. hydrophila subps. dhakensis, AHA: A. hydrophila subsp. anaerogenes 47 Şekil 9. Aeromonas izolatlarının API 20 NE hızlı teşhis kiti ile biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi 4.3 Y. ruckeri İzolatlarının Fenotipik Özellikleri Tez çalışmasında toplamda 142 adet Y. ruckeri izolatı kullanılmıştır. Gram negatif, Hareketli, Oksidaz negatif, O/F Fermentatif, MacConkey’de üreme pozitif özellik gösteren izolatların identifikasyonu PCR analizi ile yapılmıştır. İdentifikasyonları yapılan Y. ruckeri izolatlarından her bir RAPD grubunu temsil edecek sayıda izolat seçilerek biyokimyasal özellikleri API RAPD ID 32E hızlı teşhis kitleri ile belirlenmiştir (Tablo 8, Şekil 10). Biyokimyasal özellikleri belirlenen ve ülkemizden izole edilmiş olan Y. ruckeri izolatlarından 6’sının biyokimyasal özelliklerinin homojen olduğu, 5 izolatın ise yalnızca sorbitol testi yönüyle farklılık gösterdiği belirlenmiştir. 48 Tablo 8. Y. ruckeri izolatlarının konvansiyonel mikrobiyolojik testler ve API RAPID 32E hızlı teşhis kiti ile belirlenen biyokimyasal özellikleri Gram — — — — — — — — — — — — — — — — Boyama Hareket + + + + + + + + + + + + + + + + Oksidaz — — — — — — — — — — — — — — — — Katalaz + + + + + + + + + + + + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Mac Conkey + + + + + + + + + + + + + + + + üreme Api Rapid 32E URE — — — — — — — — — — — — — + + — LDC + + + + + + + + + + + + + + + + ODC + + + + + + + + + + + + + + + + ESC — — — — — — — — — — — — — — — — FER + + + + + + + + + + + + + + + + ARA — — — — — — — — — — — — — — — — ADO — — — — — — — — — — — — — — — — RHA — — — — — — — — — — — — — — — — MAN + + + + + + + + + + + + + + + + SOR — — — — — — + + + + + + + + — — CEL — — — — — — — — — — — — — — — — MEL — — — — — — — — — — — — — — — — IND — — — — — — — — — — — — — — — — MNT — — — — — — — — — — — — — — — — PPA — — — — — — — — — — — — — — — — SAC — — — — — — — — — — — — — — — — 5KG — — — — — — — — — — — — — — — — PLE — — — — — — — — — — — — — — — — GAT + + + + + + + + + + + + + + + + COL — — — — — — — — — — — + + + + + CMT + + + + + + + + + + + + + + + + TTR — — — — — — — — — — — — — — — — ONAG — — — — — — — — — — — — — — — — PNPG + + + + + + + + + + + + — — — + GRT + + + + + + + + + + + + + + + + MNE + + + + + + + + + + + + + + + + MAL + + + + + + + + + + + + + + + + αGAL — — — — — — — — — — — — — — — — IDP + + + + + + + + + + + + + + + + RAF — — — — — — — — — — — — — — — — TRE + + + + + + + + + + + + + + + + * — — — — — — — — — — — — — — — — LDC: L-lysin, ODC: L-ornithin, ESC: Eskülin ferrik sitrat, FER: D-glukoz, ARA: L-arabinoz, ADO: Adonitol, RHA: L-rhamnoz, MAN: D-mannitol, SOR: D-sorbitol, CEL: D-sellobiyoz, MEL: D-melibiyoz, GRT: Sdoyum glukuronat, MNE: D-mannoz, MAL: D-maltoz, TRE: D-trehaloz, IND: L-triptofan, MNT: Sodyum malonat, PPA: 4-nitrofenilalanin, SAC: D-sakkaroz (sukroz), 5KG: Potasyum 5-ketoglukonat, PLE: Palatinoz, GAT: Galakturonik asit, COL: Kolistin, CMT: Koumarate, TTR: Potasyum tetrahionat, ONAG: 2-nitrofenil-N-asetil-βD-glukosaminid, PNPG: 4-nitrofenil- βD- galaktopiranosidaz, αGAL: 4-nitrofeil-αD-galaktopiranosid, IDP: 5-bromo-4-kloro-3-indolil-disodyum fosfat, RAF: D- raffinoz, *: Kontaminasyon kontrol 49 Y58 Y106 Y107 Y147 Y2 Y39 NCTC 12268 NCTC 12270 Y237 Y248 Y253 NCTC 12266 NCTC 12267 NCTC 12269 Y56 Y36 Tablo 8’in devamı Gram — — — — — — — — — — — — — — — — — — — boyama Hareket + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Oksidaz — — — — — — — — — — — — — — — — — — — Katalaz + + + + + + + + + + + + + + + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ Mac Conkey + + + + + + + + + + + + + + + + + + + üreme Api Rapid ID 32E URE — — — — — — — — — — + + — — + — — — — LDC + + + + + — — — — + — — — + + + + + + ODC + + + + + — — — — + + + + + + + + + + ESC — — — — + + — — — — + — — — — — — — + FER + + + + + + + + + + — — — — + + + + + ARA — — — — — — — — — — — — + + + + — + + ADO — — — — — — — + + — — + — — — — — — — RHA — — — — — — — — — — — — — — + + — + + MAN + + + + + + + + + — — + + + + + + + + SOR — — — + — — — + + — — — — — — — — + + CEL — — — — — + — + + — — — — — — — + + + MEL — — — — — — — — — — — — — — — — — + + IND — — — — — + — — — + + — — — — — — + + MNT — — — — — — — — — — — — + + + + — — + PPA — — — — — — — — — — + — — — — — — — — SAC — — — — — + — — — — — — — — — — + — + 5KG — — — — — — — — — — — — — — — — — + + PLE — — — — — — — — — — — — — — — — — — + GAT + + + + + — + — — + — — — + — — — + + COL — — — — — — — + + + + — — + + + + + + CMT + + + + + + + + + + + — — + — — — + — TTR — — — — — — — — — — + — — — — — — — — ONAG — — — + — — — — — — — — — — — — — — — PNPG — — + + + + — — — — — — — + + + + + + GRT + + — + + — + — — + + — — + — — — + + MNE + + + + + + + + + + + + + + + + + + + MAL + + + + + + + + + + — — — + + + + + + α GAL — — — — — — — — — — — — — — — — — — — IDP + + + + + + + + + + + + + + + + + + + RAF — — — — — — — — — — — — — — — — — + + TRE + + + + + + + + + — — + — + + + + + + * — — — — — — — — — — — — — — — — — — — 50 Y262 Y263 Y14 Y241 Y226 Y44 Y73 Y121 Y75 Y89 Y199 Y95 Y11 Y255 Y7 Y10 Y79 Y92 Y93 Şekil 10. Y. ruckeri izolatlarıın API 32E hızlı teşhis kiti ile biyokimyasal özelliklerin belirlenmesi 4.4 L. garvieae İzolatlarının Fenotipik Özellikleri Tez çalışmasında toplamda 140 adet L. garvieae izolatı kullanılmıştır. Gram pozitif, hareketsiz, oksidaz negatif, O/F fermentatif, MaC Conkey’ Agar’da üreme negatif özellik gösteren izolatların identifikasyonu PCR analizi ile yapılmıştır. İdentifiye edilen L. garvieae izolatlarından her bir RAPD grubunu temsil eden izolatların API RAPID ID 32STREPT hızlı teşhis kitleri ile biyokimyasal özellikleri belirlenmiş ve sonuçlar Tablo 9’da verilmiştir. L56, L114, L70, L51, L5, L89, L107, L109, L123, L133 ve ATCC 49156 numaralı izolatlar biyokimyasal karakterleri yönüyle homojen özellik göstermiştir (Tablo 9, Şekil 11). 51 Tablo 9. L. garvieae izolatlarının konvansiyonel Mikrobiyolojik testler ve API RAPID ID 32STREPT hızlı teşhis kiti ile belirlenen biyokimyasal özellikleri Gram + + + + + + + + + + + + + + + + + boyama Hareket — — — — — — — — — — — — — — — — — Oksidaz — — — — — — — — — — — — — — — — — Katalaz — — — — — — — — — — — — — — — — — O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ APİ 32 STREPT ADH + + + + + + + + + + + + + + + + + βGLU + + + + + + + + + + + + + + + + + βGAR — — — — — — — — — — — — — — — — — βGUR — — — — — — — — — — — — — — — — — αGAL — — — — — — — — — — — — — — — — — PAL — — — — — — — — — — — — — — — — — RIB — + — + + + + + + + + + + + + + — MAN + + + + + + + + + + + + + + + + + SOR — — — — — — — — — — — — — — — — — LAC — — — — — — — — — — — — — — — — — TRE + + — + + + + + + + + + + + + + + RAF — — — — — — — — — — — — — — — — — VP + + + + + + + + + + + + + + + + + APPA + + + + + + + + + + + + + + + + + βGAL — — — — — — — — — — — — — — — — — PyrA + + + + + + + + + + + + + + + + + β NAG — — — — — — — — — — — — — — — — — GTA — — — — — — — — — — — — — — — — — HIP — — — — — — — — — — — — — — + + + GLYG — — — — — — — — — — — — — — — — — PUL — — — — — — — — — — — — — — — — — MAL + + + + + + + + + + + + + + + + + MEL — — — — — — — — — — — — — — — — — MLZ — — — — — — — — — — — — — — — — — SAC — — — — — — — — — — — — — + + + + LARA — — — — — — — — — — — — — — — — — DARL — — — — — — — — — — — — — — — — — MBDG + + + + + + + + + + + + + + + + + TAG — + — + + + + + + + + + + + + + + β MAN — — — — — — — — — — — — — — — — — CDEX — — + — — — — — — — — — — — — — — URE — — — — — — — — — — — — — — — — — O/F: Oksidasyon/Fermentasyon; ADH: arjinin dihidrolaz, βGLU: β-glukosidaz; βGAR: β-galaktosidaz; βGUR; β-glukuronidaz αGAL: α-galaktosidaz; PAL: alkalin fosfataz, RIB: D-riboz; MAN: Mannitol; SOR: Sorbitol; LAC: Laktoz; TRE: Trehaloz; RAF: Raffinoz; VP: Voges proskauer; APPA: alanyl-fenilalanil-prolin arilamidaz, βGAL: β-galaktosidaz; PYRA: pirrolidonil arilamidaz, ß-NAG: N-asetil-β- glukosaminidaz, GTA: glisil-triptofan-arilamidaz, HIP: hippurat hidroliz, GLYG: Glikojen; PUL: Pullulan; MAL: Maltoz; MEL: Melibioz; MLZ: Melezitoz; SAC: Sakkaroz; LARA: L-arabinoz; DARL: D-arabitol; MBDG: methil-β-D-glukopiranosid asidifikasyon; TAG: Tagatoz; β MAN: β-mannosidaz; CDEX: Siklodekstrin; URE: Ureaz Tablo 9’un devamı 52 ATCC 43921 ATCC 49156 ATCC 49157 L56 L114 L70 L51 L5 L89 L107 L109 L123 L133 L131 L64 L97 L31 Gram + + + + + + + + + + + + + + + + boyama Hareket — — — — — — — — — — — — — — — — Oksidaz — — — — — — — — — — — — — — — — Katalaz — — — — — — — — — — — — — — — — O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ APİ 32 STREPT ADH + + + + + + + + + + + + + + — + βGLU + + + + + + + + + + + + + + + + βGAR — — — — — — — — — — — — — — — — βGUR — — — — — — — — — — — — — — — — αGAL — — — — — — — — — — — — — + — — PAL — — — — — — — — — — — — — — — — RIB — — — — + + + + + + + + — + + — MAN + + + + + + + + + + + + + + + + SOR — — — — — — — — — — — — — — + — LAC — — — — — — — — — — — — — + + — TRE + + + + + + + + + + + + + + + + RAF — — — — — — — — — — — — — + + — VP + + + + + + + + + + + + + + + + APPA + + + + + + + + + + + + + + + + βGAL — — — — — — — — — — + + — — — — PyrA + + + + + — — + + + + + + — — + β NAG — — — — — — + + + + + + + — — — GTA — — — — — — — — — — — — — — — — HIP + + + + + + + + + — — + — — + + GLYG — — — — — — — — — — — — — — — — PUL — — — — — — — — — — — — — — + — MAL + + + + + + + + + + + + + + + — MEL — — — — — — — — — — — — — + + — MLZ — — — — — — — — — — — — — — + — SAC + + + + + + + + + — + + + + + + LARA — — — — — — — — — — — — — — + — DARL — — — — — — — — — — — — — — + — MBDG + + + + + + + + + + + + + + + + TAG + + + + + + + + + + + + + + + + β MAN — — — — — — — — — — — — — + — — CDEX — — — — + — — — + + + + + + + — URE — — — — — — — — — — — — — — — — 53 L116 L127 L136 L137 L114 L115 L132 L111 L129 L90 L14 L104 L138 L81 L140 L108 Şekil 11. L. garvieae izolatlarının API 32 STREPT hızlı teşhis kiti biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi 4.5 Hareketli Aeromonas İzolatlarının Moleküler İdentifikasyonu Hareketli Aeromonas’lara spesifik olan 16S r-RNA gen bölgesinin PCR ile çoğaltılmasıyla 1.500bp’da bant veren izolatlar Aeromonas spp. olarak identifiye edilmiştir (Şekil 12). Tür tespiti için sekans analizi yapılacak izolatlara, gyrB korunmuş gen bölgesiyle PCR yapılmış ve 1.100bp’da pozitif sonuç veren izolatlar sekansa gönderilmiştir (Şekil 13). Sekans analizi sonucunda; 98 Aeromonas sp. izolatından 33’ü A. sobria, 18’i A. salmonicida, 12’si A. media, 11’i Aeromonas sp., yedi ’si A. bestiarum, dört ‘ü A. allosaccharophila, dört ‘ü A. veronii, üç ‘ü A. hydrophila, iki ’si A. eucrenophila ve birer izolat da A. hydrophila subsp. hydrophila, A. hydrophila subsp. anaerogenes, A. dhakensis, A. hydrophila subsp. dhakensis olarak identifiye edilmiştir. Tür tespiti yapılan hareketli Aeromonas izolatların genetik benzerlik oranları http://blast.ncbi.nlm.nih.gov veri tabanıyla karşılaştırılarak Tablo 10’da verilmiştir. 54 Şekil 12. Aeromonas spp. 16S r-DNA PCR sonuçları 1500bp. Şekil 13. Aeromonas spp. gyrB PCR sonuçları 1: Negatif kontrol, 2: pozitif kontrol, 3-11: pozitif Aeromonas 1100bp. 1-10: pozitif izolatlar, M: Marker 100, 200, izolatları, M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000bp. 2500, 3000bp. Tablo 10. gyrB gen bölgesinin sekans analizi ile identifiye edilen Aeromonas’lar İdentifiye edilen Tür İzolat numaraları, Benzerlik Oranı (%)* izolat sayısı A30a; A184a; A131b; A41b; A105b; A119b; A26b; A80b; A86b; A37b; A82b; A61b; A32b; A74b; A87b; A33b; A40b; b A. sobria 33 A31 ; A59 b; A65b; A78b; A162b; A3b; A161b; A146b; A165b; A164b; A159b; A186b; A190b; A214b; A40b; A151c; A84c A189a; A28b; A25b; A174b; A5b; A171b; A170b; A172b; A173b; A123b; A178bA. salmonicida ; A181 b; A179b; A209b; A180b; 18 A175b; A176b; A177b A194a; A120b; A118b; A156b; A153b; A88b; A99b; A17b; A. media 12 A193b; A195b; A97c; A100c A109a; A210a; A115b; A42b; A7b; A98b; A16b; A147b; Aeromonas sp. 11 A192b;A148c; A67c A. bestiarum 7 A9a; A90a; A101b; A102b; A150b; A8 b; A205b A. allosaccharophila 4 A155a; A182b; A36b; A39b A. veronii 4 A70a; A212b; A213b; A106b A. hydrophila 3 A89a; A91a; A79a A. eucrenophila 2 A1b; A196 b A. hydrophila subsp. hydrophila 1 A124b A. hydrophila subsp. anaerogenes 1 A76b A. dhakensis 1 A77b A. hydrophila subsp. dhakensis 1 A108b a: %100 benzerlik; b: %99 benzerlik; c: %98 benzerlik *Benzerlik oranları, gyrB sekans sonuçlarının Nükleotid Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov, GeneBank) ile karşılaştırılması ile belirlenmiştir. 55 4.6 Hareketli Aeromonas Türlerinin Moleküler Karakterizasyonu Tür teşhisleri yapılan izolatların sekans verileri BioNumerics 7.0 yazılımında (Applied Maths, Belgium) analiz edilmiş, genetik yakınlıklarının belirlenmesinde Matematiksel ortalama ile ağırlıksız çiftlerin gruplandırılması (UPGMA) istatistik metodu kullanılmış ve filogenetik ağaç Şekil 14’de verilmiştir. Çalışmada kullanılan 98 hareketli Aeromonas izolatının dizi analizi sonucu filogenetik olarak 7 farklı genogrupta toplandığı, A. allosacharophila ve A. hydrophila subsp. anaerogenes olarak tespit edilen birer izolatın ise bu gruplarda yer almadığı saptanmıştır. Tez çalışmasında identifiye edilen tüm A. sobria izolatlarının A grubunda toplandığı ve bu gruptaki izolatların en az %91,2 benzerliğe sahip oldukları bulunmuştur. B grubunu oluşturan Aeromonas izolatlarının A. hydrophila ATCC 7966 ve A. caviae ATCC 23214 referans suşları ile aynı grupta olduğu ve bu izolatların en az %91,3 benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. A. hydrophila, A. hydrophila subps. hydrophila, A. hydrophila subsp. dhakensis, A. media, A. dhakensis, A. allosacharophila ve A. veronii türlerinin de B grubu içerisinde yer aldığı belirlenmiştir. Bu çalışmada tespit edilen iki A. veronii izolatından biri C grubunda yer alırken, diğer A. veronii izolatı ile % 87.6 benzerlik gösterdiği görülmüştür. A. allosacharophila olarak tespit edilen A36 numaralı izolatın, B genogrubunda bulunan diğer A. allosacharophila izolatlarına %87,6 oranında benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. A. salmonicida A. bestiarum, A. eucrenophila ve Aeromonas sp. türleri aynı genogrupta (D) yer almış olup bu türler kendi aralarında en az %91,4 benzerlik göstermişlerdir. A. eucrenophila ve 8 numaralı A. bestiarum izolatı E genogrubunda yer almış olup en az %89,2 benzerlik göstermiştir. A. bestiarum izolatları D ve E genogrubunda yer almış olup bu türlerin kendi aralarındaki benzerlikleri %86,5 olarak belirlenmiştir. 76 nolu A. hydrophila subsp. anaerogenes izolatı çalışmada kullanılan hareketli Aeromonas türlerinden farklı bir genogrupta yer almış ve bu gruplara benzerliğinin %84.8 olduğu görülmüştür. 212 ve 213 numaralı A. veronii izolatları kendi aralarında %99 benzerlik gösterirken, diğer A. veronii izolatları (106, 115 ve 36 numaralı) ile en düşük %95 benzerlik gösterdiği belirlenmiştir. 184 ve 214 numaralı A. sobria izolatları A grubunda bulunan A. sobria izolatları ile %98 benzer bulunmuştur. 205 numaralı A. bestiarum izolatı D grubunda yer alan A. bestiarum izolatları ile en az % 95 benzerliğe sahip olduğu görülmüştür. 210 nolu Aeromonas sp. izolatı ise A grubunda yer alan Aeromonas sp. izolatları ile en az % 98 benzerliğe sahip bulunmuştur. Bu izolatların ilk sekans sonuçlarında bazı 56 hatalı okumalar olduğu için daha sonrasında tekrar edilmiş fakat ilk sekans analizlerinde yapılan filogenetik ağaca dahil edilememiştir. Şekil 14. Hareketli Aeromonas izolatlarının genetik yakınlıkları (Bionumeric 7, Applied Maths, Belçika) 57 Şekil 14’ün devamı 4.7 Y. ruckeri İzolatlarının Moleküler Karakterizasyonu Konvansiyonel Mikrobiyolojik testlerde Y. ruckeri şüpheli izolatlar spesifik YER8-YER10 primerleri ile 575bp’da pozitif sonuç vermiş ve sonuçlar Şekil 15’de gösterilmiştir. RAPD-PCR analizi ile 18 farklı Y. ruckeri genotipi tespit edilerek sonuçlar Şekil 16-18’de verilmiştir. Toplam 142 Y. ruckeri izolatından 117 (%82,3) izolatın aynı genetik profile sahip olduğu ve bu izolatların NCTC12266 referans suş (serotip O1) ile benzer genogrupta yer aldığı belirlenmiştir. Y. ruckeri izolatlarının moleküler karakterizasyonunda en yaygın görülen RAPD-PCR profili Şekil 16’de verilmiştir. 142 izolattan 4 (%2,8)’ü NCTC 12270 numaralı referans suş (serotip O7) ile benzer genogrupta yer alırken, diğer suşların NCTC 12267, NCTC 12268 ve NCTC12269 referans suşlara benzer profil vermedikleri saptanmıştır (Şekil 18). Ege, İç Anadolu, Doğu Anadolu, Akdeniz ve Marmara bölgelerine ait izolatların benzer profil verdikleri, Karadeniz bölgesine ait izolatların 142 izolattan farklı genetik profilde olduğu belirlenmiştir. 2009 yılında Ege bölgesine ait bir, 2010 yılı Ege bölgesine ait iki ve Marmara bölgesine ait bir izolatın NCTC12270 numaralı Y. ruckeri izolatına benzer RAPD profili gösterdikleri tespit edilmiştir. RAPD profili benzerlik gösteren bu beş izolatın ikisi İç Anadolu, üçü ise Ege bölgesinden izole edilmiştir. 58 Şekil 15. Y. ruckeri YER8-YER10 primerleri ile PCR sonuçları 575bp. 1-7, 10: pozitif Y. ruckeri izolatları, 8-9: negatif kontrol, M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500bp, m: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600bp. Şekil 16. Y. ruckeri RAPD-PCR parmak izi analiziyle tespit edilen en yaygın genetik profil (NCTC 12266 ile aynı profil), 1-36: En yaygın profili veren izolatlar, M: marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.500bp 59 Şekil 17. ERIC2 primerleri ile Y. ruckeri RAPD-PCR parmak izi analizi (m: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000bp; A: NCTC 12266; B: NCTC: 12267; C: NCTC: 12268; D: NCTC 12269; E: NCTC 12270; 249, 250, 251, 252, 255, 256, 257, 258, 259, 260, A en yaygın profil) Şekil 18. Y. ruckeri izolatlarının RAPD-PCR parmak izi analizi, NCTC referans suşlar: 12266, 12267, 12268, 12269, 12270, Y258, Y259, Y260, Y248, Y253, Y7, Y11, Y9, Y68, Y75, Y93, Y95, Y121, Y131, Y89, Y133, Y199, Y202: Y. ruckeri izolatları; M: marker: 100, 200, 300, 400, 500, 700, 1.000, 1.600, 2.000, 5.000, 8.000, 10.000bp 60 4.8 L. garvieae İzolatlarının Moleküler Karakterizasyonu Tez çalışmasında kullanılan L. garvieae izolatları pLG-F ve pLG-R primerleri kullanılarak PCR’da doğrulanmış ve sonuçlar Şekil 19’de verilmiştir. Ülkemizin 4 farklı bölgesinden izole edilen 99 L. garvieae izolatının RAPD-PCR profilleri Şekil 19-21’de verilmiştir. Referans suşlarla birlikte tüm izolatların 8 farklı genogruba ayrıldığı, ülkemiz izolatlarının ise kendi aralarında 5 farklı genetik profil gösterdiği belirlenmiştir. 137 L. garvieae izolatından 99’unun (%72,2) A genogrubunda, 32’sinin (%23,3) B genogrubunda, 3’ünün (%2,1) C genogrubunda ve birer izolatın da D ve E genogruplarında yer aldığı belirlenmiştir. Türkiye’den izole edilen izolatlar ile referans suşlar arasında yüksek bir genetik yakınlık (<%90) tespit edilememiştir. ATCC 49156 ve 49157 suşları kendi aralarından %82 benzer bulunurken L81 (D genogrup) ve L1 (A genogrup) izolatları %86 benzer L31 (E genogrup) ve ATCC 43921 suşları %72, L68 (C genogrup) ve L5 (B genogrup) izolatları da %77 benzer bulunmuştur. Tüm izolatların RAPD profillerinin en az %61 benzerlikte olduğu görülmüştür. Şekil 19. L. garvieae pLG-F, plg-R primerleri ile PCR sonuçları 1100bp. 1-11: pozitif izolatlar, M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000bp. Şekil 20. L. garvieae izolatlarında en yaygın görülen RAPD-PCR profilleri. 11, 17, 18, 19, 116, 130, 118, 128, 63, 66 ve 82 bu profile örnek izolatlar (M: Marker: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000bp) 61 Şekil 21. L. garvieae izolatlarının RAPD-PCR patternleri (49157, 49156, 43921: ATCC suşları; 81, 1, 5, 31, 68: L. garvieae izolatları) 4.9 Hareketli Aeromonas İzolatlarının Antimikrobiyal Duyarlılıkları (MIK) Aeromonas izolatlarının antimikrobiyal duyarlılık konsantrasyonları Tablo 11’de verilmiştir. Duyarlılık çalışmasında 25 izolatın (%24.2) FFC’e, 29 izolatın (%28.1) TET’e ve 95 izolatın (%92.2) ise SUL’e dirençli olduğu tespit edilmiştir. FFC’un 0,128 ile 256 mg/ml, SUL’un 0,064 ile 256 mg/ml ve TET’in 0,016 ile 256 mg/ml inhibitör konsantrasyonu aralığında olduğu görülmüştür (Şekil 22). A. sobria 11, A. media 6, A. salmonicida 3 Aeromonas sp., A. bestiarum, A. veronii ve A. hydrophila subsp. hydrophila birer izolatın FFC’e karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir. Hareketli Aeromonas izolatlarının SUL’e dirençli olduğu belirlenirken yalnızca A. sobria (86, nolu) ve A. media (153, 156, 88 nolu) duyarlı bulunmuştur. A. sobria 9, A. media 4, A. salmonicida 5, Aeromonas sp. 3, A. hydrophila 2, A. veronii 2, A. hydrophila subsp. hydrophila, A. hydrophila subsp. anaerogenes ve A. dhakensis’in birer izolatının TET’e karşı direnç geliştirmiş olduğu belirlenmiştir. Ayrıca ATCC 7966, ATCC 23214 ve ATCC 43979 numaralı referans suşlarının da TET dirençli olduğu görülmüştür. Hareketli Aeromonas izolatların FFC ve SUL’e karşı direnç düzeylerinin 2015 yılında ciddi düzeyde arttığı, 2013, 2014 ve 2015 yıllarında ise en yaygın SUL’e karşı direnç geliştirmiş olduğu görülmüş ve sonuçlar Şekil 23’de verilmiştir. 62 4.10 Y. ruckeri İzolatlarının Antimikrobiyal Duyarlılıkları (MIK) Y. ruckeri izolatlarının antimikrobiyal duyarlılık konsantrasyonları Tablo 12’de verilmiştir. Çalışmada kullanılan Y. ruckeri izolatlarının tamamının SUL’e, 21’inin FFC’e, 19’unun TET’e ve 18’inin SXT’ye karşı dirençli oldukları tespit edilmiştir (Tablo 12). FFC’un 0,256 ile 256 mg/ml, SUL’un 256 mg/ml üzeri, TET’in 0,512 ile 64 µg/ml ve SXT’nin 2 ile 256 µg/ml inhibitör konsantrasyonu aralığında olduğu görülmüştür. Y. ruckeri izolatlarının 2013, 2014 ve 2015 yıllarında yaygın olarak SUL’e karşı direnç geliştirmiş olduğu, 2015 yılında ise FFC, TET ve SUL bileşiklerine karşı en düşük düzeyde gelişiminin olduğu belirlenmiş ve sonuçlar Şekil 23’de verilmiştir. 4.11 L. garvieae İzolatlarının Antimikrobiyal Duyarlılıkları (MIK) L. garvieae izolatlarının antimikrobiyal duyarlılık konsantrasyonları Tablo 13’de verilmiştir. Çalışmada kullanılan 137 izolatın; 25’i FFC’e, 3’ü TET’e, 128’i SUL’e ve ikisi ERM’e direnç geliştirmiş olduğu belirlenmiştir. FFC’un 0,008 ile 32 mg/ml, SUL’un 0,008 ile 256 µg/ml, TET’in 0,032 ile 32 µg/ml ve ERM’nin 0,008 ile 1 inhibitör µg/ml konsantrasyonu aralığında olduğu görülmüştür. L. garvieae izolatlarının 2013, 2014 ve 2015 yıllarında yaygın olarak SUL’e karşı direnç geliştirmiş olduğu, 2015 yılında ise FFC, TET ve SUL bileşiklerine karşı dirençte önemli düzeyde azalma olduğu belirlenmiş ve sonuçlar Şekil 23’de verilmiştir. Şekil 22. Hareketli Aeromonas, Y. ruckeri ve L. garvieae etkenlerine broth dilüsyon yöntemiyle yapılan MIK testi. A, C, E, G yukardan aşağıya: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2mg/L dilüsyon; B, D, F, H yukardan aşağıya: 1, 0.512, 0.256, 0.128, 0.064, 0.032, 0.016, 0.008mg/L dilüsyon. 63 40 Hareketli Aeromonas 35 30 25 FFC 20 TET 15 SUL 10 5 0 2013 2014 2015 70 Y. ruckeri 60 50 FFC 40 TET 30 SUL 20 SXT 10 0 2013 2014 2015 60 L. garvieae 50 40 FFC 30 TET SUL 20 ERM 10 0 2013 2014 2015 Şekil 23. Hareketli Aeromonas, Y. ruckeri ve L. garvieae izolatlarının yıllara göre fenotipik antimikrobiyal direnç dağılımları 64 Tablo 11. Hareketli Aeromonas suşlarının FFC, TET ve SUL duyarlılıkları Antimikrobiyal İzolat MIK konsantrasyonları (mg/L) MİK duyarlılık konsantrasyonu11 sayısı (n) 0,008 0,016 0,032 0,064 0,128 0,256 0,512 1 2 4 8 16 32 64 128 256 Dirençli suş sayısı (%) Florfenikol (FFC) 103 2 2 4 12 38 15 5 3 4 9 4 3 2 S<8>R 24,2 Tetrasiklin (TET) 103 1 2 4 5 22 10 9 8 12 6 7 8 4 3 1 S<8>R 28,1 Sulfamethoksazol 103 1 2 2 1 1 1 95 S<128>R 92,2 (SUL) Tablo 12. Y. ruckeri suşlarının FFC, TET, SUL ve SXT duyarlılıkları Antimikrobiyal İzolat MIK konsantrasyonları (mg/L) MİK duyarlılık konsantrasyonu11 sayısı (n) 0,008 0,016 0,032 0,064 0,128 0,256 0,512 1 2 4 8 16 32 64 128 256 Dirençli suş sayısı (%) Florfenikol (FFC) 142 3 1 5 33 79 8 5 2 3 1 2 S<8>R 14,7 Tetrasiklin (TET) 142 1 2 5 24 61 22 8 7 1 7 4 S<8>R 19,0 Sulfamethoksazol 142 142 S<128>R 100 (SUL) Sulfamethoksazol- 142 22 102 7 3 1 1 6 S<8>R 12,6 Trimetoprim (SXT) Tablo 13. L. garvieae suşlarının FFC, TET ve SUL duyarlılıkları Antimikrobiyal İzolat MIK konsantrasyonları (mg/L) MİK duyarlılık konsantrasyonu11 sayısı (n) 0,008 0,016 0,032 0,064 0,128 0,256 0,512 1 2 4 8 16 32 64 128 256 Dirençli suş sayısı (%) Florfenikol (FFC) 140 6 2 11 32 27 37 13 9 3 S<8>R 17,8 Tetrasiklin (TET) 140 1 1 10 29 46 38 6 1 2 1 5 S<8>R 2,1 Sulfamethoksazol 140 3 2 3 1 131 S<128>R 94,2 (SUL) Eritromisin (ERM) 140 13 2 7 48 33 27 8 2 S<1>R 1,4 65 4.12 Hareketli Aeromonas İzolatlarında Tespit Edilen Direnç Genleri Fenotipik olarak SUL’e dirençli olduğu tespit edilen 95 Hareketli Aeromonas izolatında sulIII direnç geni tespit edilmemiştir. Fenotipik direnç tespit edilen hareketli Aeromonas izolatlarının 22’si sulI, 18’inin ise sulII direnç geni taşıdığı belirlenmiştir. Hareketli Aeromonas izolatlarının 26’sı (ATCC 7966, ATCC 23214 ve ATCC 43979 dahil) fenotipik olarak TET dirençli iken, 24’ü tetA, biri tetC, ikisi tetD ve 20’sinin de tetE direnç geni taşıdığı belirlenmiştir. 25 izolatın FFC’e karşı dirençli olmasına rağmen bu izolatlardan 14 tanesinin floR direnç geni taşıdığı tespit edilmiştir (Tablo 14, Şekil 25-34). Referans suşlarda (ATCC ve FNR) herhangi bir direnç geni tespit edilememiştir. Hareketli Aeromonas izolatlarında en yaygın “sulI-sulII” genleri birlikte tespit edilmiştir. “sulI-sulII-tetA”, “sulI-floR”, “floR-tetA” ve “sulII-tetE” direnç genlerinin yaygın olarak bulunduğu görülmüş ve dağılımları Şekil 24’de verilmiştir. Tablo 14. Aeromonas izolatlarında tespit edilen direnç genleri ve MİK değerleri* Filogenetik DNA FFC (8) SUL (128) TET (8) grup AS 131 16 - 256< - - - 4 - - - - - AS 41 32 - 256< - - - 0,512 - - - - - AS 105 16 - 256< - - - 0,512 - - - - - AV 106 0,51 - 256< - - - 1 + - - - - SP. 109 1 - 256< - + - 1 - - - - - AM 118 2 - 256< - - - 64 - - - - - AS 119 0,03 - 256< - - - 0,256 - - - - + AM 120 64 - 256< - - - 16 - - - - - AHH 124 0,03 - 256< + + - 0,256 - - - - - AS 26 32 + 256< + - - 4 - - - - - ASA 174 2 + 256< - - - 1 + - - - + ASA 28 0,51 - 256< - - - 16 - - - - + ASA 171 1 + 256< - - - 2 + - - - - AM 153 256 - 0,128 - - - 0,128 - - - - - AS 80 0,26 - 256< - - - 8 - - - - + AS 86 1 - 16 - - - 2 - - - - + AS 82 1 - 256< + - - 0,512 - - - - - AS 61 1 - 256< + + - 1 - - - - + AM 156 1 - 2 - - - 0,128 + - - - - AS 74 1 - 256< - - - 0,256 + - - - - AS 33 0,51 - 256< + - - 8 - - - - + AS 40 1 - 256< - - - 32 - - - - - SP. 7 0,13 - 256< - - - 4 - - - - + AS 31 0,51 - 256< + - - 1 - - - - - ASA 170 2 + 256< - - - 0,256 + - - - - AH 89 2 - 256< - - - 32 - - - - - AHH.D 77 1 - 256< - - - 16 + - - - - ASA 123 1 - 256< - - - 0,512 - - - - + AHH.A 76 8 - 256< - - - 128 + - - - - 66 floR sulI sulII sulIII tetA tetB tetC tetD tetE AH 91 0,51 - 256< - - - 256< - - - + - AS 84 32 + 256< - - - 1 - - - - - AM 88 256 - 0,06 + + - 0,128 + - - - - AH 79 32 - 256< - - - 2 - - - - + AS 65 32 + 256< - - - 1 + - - - - AS 78 64 - 256< + - - 1 - - - - - AB 90 1 - 256< - - - 256 - - - - + SP. 67 0,51 - 256< + - - 4 - - - - - AM 97 64 + 256< - + - 4 + - - - + AM 100 128 - 256< - + - 4 + - - - - AM 99 2 + 256< - - - 0,512 + - - - - SP. 98 2 - 256< - + - 16 - - - - + AS 162 4 - 256< - - - 0,512 + - - - - AB 102 1 - 256< + - - 0,128 - - - - - SP. 16 1 - 256< - - - 16 - - - - + AM 17 128 - 256< - - - 8 - - - - - AS 161 1 - 256< + - - 0,256 - - - - - AS 165 32 - 256< - - - 8 - - - - - AS 164 4 - 256< + - - 0,256 - - - - - SP. 147 8 + 256< - - - 0,256 - - - - - ASA 173 4 + 256< + + - 8 + - - - + ASA 172 16 - 256< + + - 0,256 + - - - - SP. 148 2 - 256< - - - 8 - - - - + AS 159 32 - 256< - - - 128 - - - - - ASA 189 64 + 256< - - - 0,256 + - + + - AS 151 32 + 256< - - - 64 - - - - + ASA 178 2 - 256< + - - 0,256 + - - - - ASA 181 2 - 256< + + - 64 - - - - - ASA 209 2 - 256< - - - 32 - - - - - ASA 179 32 - 256< + + - 64 + - - - - ASA 180 1 - 256< + + - 2 + - - - - AB 150 8 - 256< - - - 2 - - - - - AV 70 16 - 256< + - - 0,256 + - - - - ASA 175 1 + 256< + + - 4 + - - - - ASA 176 2 + 256< + + - 2 + - - - - ASA 177 2 - 256< + + - 1 + - - - - AS 190 1 - 256< - - - 128 - - - - - AM 194 1 - 128 - + - 4 - - - - - AE 196 1 - 256< - - - 0,256 - - - - + AV 212 0,51 - 256< - + - 32 - - - - + AV 213 1 - 256< - + - 32 - - - - + AS 214 128 256< 32 AV: A. veronii, SP. Aeromonas sp., AS: A. sobria, AHH: A. hydrophila subps. hydrophila, ASA: A. salmonicida, AM: A. media, AHH.D: A. hydrophila subps. dhakensis, AHH.A: A. hydrophila subsp. anaerogenes, AH: A. hydrophila, AB: A. bestiarum, AV: A. veronii, AE: A. eucrenophila *Yalnızca dirençli izolatların sonuçları verilmiştir 67 3% 3% sulI-sulII (11 izolat) 3% sulI-floR (4 izolat) sulI-tetA (2 izolat) 13% 29% sulI-tetE (1 izolat) sulII-tetA (2 izolat) sulII-tetE (3 izolat) 3% floR-tetE (1 izolat) 3% floR-tetA (4 izolat) sulI-sulII-tetE (1 izolat) 10% floR-tetA-tetE (1 izolat) 10% sulI-sulII-tetA (5 izolat) 3% floR-sulII-tetA-tetE (1 izolat) 5% floR-sulI-sulII-tetA (1 izolat) 2% 8% 5% floR-sulI-sulII-tetA-tetE (1 izolat) Şekil 24. Hareketli Aeromonas izolatlarında çoklu antimikrobiyal direnç geni taşıyan izolatların dağılımı 4.13 Y. ruckeri İzolatlarında Genotipik Direnç Tez çalışmasında incelenen 142 Y. ruckeri izolatında sulIII, tetA, tetB, tetC, tetD, tetM ve tetS direnç genleri tespit edilememiştir. Direnç geni taşıdığı belirlenen Y. ruckeri izolatlarından üçünün sulI, sekizinin sulII, ikisinin tetE ve birinin de floR geni taşıdığı görülmüştür (Tablo 15, Şekil 25-34). Fenotipik olarak TET’e dirençli olduğu tespit edilen 19 Y. ruckeri izolatının birinde tetE direnç geni belirlenmiştir. Fenotipik olarak TET’e duyarlı olan bir izolatın ise tetE direnç geni taşıdığı görülmüştür (Tablo 15, Şekil 25-34). Fenotipik olarak FFC’e dirençli 21 izolatın birinin floR geni taşıdığı belirlenmiştir (Şekil 26). Referans suşlarda (NCTC) herhangi bir direnç geni tespit edilmemiştir. 68 Tablo 15. Y. ruckeri izolatlarında tespit edilen direnç genleri ve MİK değerleri* Filogenetik SXT DNA FFC SUL TET grup 19/1 B 241 4 - 256< - - - 1 - - - - - - - 8 B 248 32 - 256< - - - 2 - - - - - - - 4 M 121 4 - 256< + - - 0,512 - - - - - - + 4 G 89 4 - 256< + - - 0,512 - - - - - - - 4 A 13 64 - 256< - - - 4 - - - - - - - 2 A 14 128 - 256< - - - 1 - - - - - - - 4 D 10 16 - 256< - - - 0,512 - - - - - - - 16 D 7 16 - 256< - - - 4 - - - - - - - 32 A 200 2 - 256< - - - 32 - - - - - - - 4 J 199 8 - 256< - - - 1 - - - - - - - 16 A 183 2 - 256< - - - 32 - - - - - - - 4 A 132 2 - 256< - - - 32 - - - - - - - 4 L 131 0,51 - 256< - - - 8 - - - - - - + 8 A 120 42 - 256< - - - 32 - - - - - - - 4 A 91 8 - 256< - - - 1 - - - - + - - 4 A 66 4 - 256< - - - 64 - - - - - - - 4 O 68 16 - 256< - - - 4 - - - - - - - 8 A 71 4 - 256< - - - 8 - - - - - - - 4 A 78 4 - 256< - - - 32 - - - - - - - 4 A 106 4 - 256< - - - 1 - - - - + - - 4 A 107 4 - 256< - + - 1 - - - - - - - 4 C 11 256 + 256< - - - 2 - - - - + - - 256 E 9 2<56 - 256< - - - 64 - - - - + + - 256 A 40 <4 - 256< - - - 1 - - - - - - - 256 A 43 4 - 256< - - - 0,512 - - - - - - - 256 A 255 8 - 256< - - - 4 - - - - - - - 4 A 256 8 - 256< - - - 32 - - - - - - - 4 A 212 2 - 256< - - - 2 - - - - - - - 8 A 217 2 - 256< - + - 8 - - - - - - - 4 A 206 2 - 256< - - - 64 - - - - - - - 4 A 232 4 - 256< - - - 64 - - - - - - - 4 A 231 4 - 256< - - - 1 - - - - - - - 8 A 260 8 - 256< - - - 1 - - - - - - - 4 A 257 8 - 256< - - - 2 - - - - - - - 4 A 258 8 - 256< - - - 2 - - - - - - - 4 A 210 0,25 - 256< - + - 1 - - - - - - - 4 A 225 64 - 256< - - - 32 - - - - - - - 4 A 211 0,25 - 256< - + - 1 - - - - - - - 4 A 96 68 - 256< - - - 1 - - - - - - - 4 A 233 4 - 256< - - - 16 - - - - - - - 256 A 234 4 - 256< - - - 8 - - - - - - - 2 A 236 1 - 256< - - - 8 - - - - - - - 4 A 239 4 - 256< - - - 8 - - - - - - - 2 A 244 16 - 256< - - - 1 - - - - - - - 4 A 247 32 - 256< - - - 2 - - - - - - - 2 A 252 4 - 256< - - - 8 - - - - - - - 4 H 92 64 - 256< - - - 2 - - - - - - - 128 I 93 16 - 256< - - - 1 - - - - - - - 16 N 95 64 - 256< + - - 1 - - - - - - - 256 A 261 1 - 256< - + - 0,128 - - - - - - - 2 A 262 4 - 256< - + - 0,256 - - - - - - - 4 A 263 4 - 256< - + - 0,128 - - - - - - - 2 A 265 1 - 256< - + - 0,512 - - - - - - - 2 NCTC 12266 4 - 256< - - - 1 - - - - - - - 4 NCTC 12267 2 - 256< - - - 0,256 - - - - - - - 4 NCTC 12268 4 - 256< - - - 0,256 - - - - - - - 8 NCTC 12269 4 - 256< - - - 0,064 - - - - - - - 4 NCTC 12270 4 - 256< - - - 0,256 - - - - - - - 8 *Yalnızca dirençli izolatların sonuçları verilmiştir, A, C, G, L, M, N: bakterilerin ait oldukları grupları ifade etmektedir. 69 floR sulI sulII sulIII tetS tetM tetA tetB tetC tetD tetE 4.14 L. garvieae İzolatlarında Genotipik Direnç Çalışmamızda incelenen L. garvieae izolatlarında sulI, sulII, sulIII, tetA ve floR direnç genleri tespit edilmemişken, izolatların dokuzunda ermA, dördünde ermB, yedisinde tetM, dördünde tetS direnç geni belirlenmiştir (Tablo 16). Fenotipik olarak iki L. garvieae izolatı ERM’e dirençli iken bu izolatlardan ikisinin ermB geni taşıdığı belirlenmiştir. Ayrıca fenotipik olarak ERM’e duyarlı izolatların ermB ve ermA taşıdığı tespit edilmiştir (Şekil 25-34). Fenotipik olarak TET’e dirençli 15 L. garvieae izolatından ikisinin tetM ve tetS, diğer ikisinin ise hem tetM hem de tetS direnç genlerini birlikte taşıdığı belirlenmiştir. Fenotipik olarak TET’e duyarlı bir izolatın tetM ve tetS direnç genlerini birlikte taşıdığı, iki izolatın tetM ve bir izolatın ise tetS direnç geni taşıdığı belirlenmiştir (Tablo 16, Şekil 25-34). Bir L. garvieae izolatının tetM ve tetS, üç izolatın tetM ve tetS, genlerini birlikte (çoklu antimikrobiyal direnç) taşıdığı tespit edilmiştir (Tablo 16). Ayrıca L. garvieae referans suşlarında direnç geni tespit edilememiştir. Tablo 16. L. garvieae izolatlarında tespit edilen direnç genleri ve MİK değerleri* DNA FFC TET ERM SUL kodu L69 1 - - - - - - 256< L6 1 - - - - 0,08< - + 256< L7 0,008 - - - - 0,08< - + 256< L8 1 - 1 - - 0,016 - + 256< L68 2 - 1 + + 0,128 - - 256< L70 4 - 64 + - 0,128 - - 256< L71 2 - 64 + + 0,128 - - 256< L87 2 - 0,512 - + 0,064 - - 256< L88 1 - - - - - - - 256< L72 2 - - - - - - - 256< L73 1 - - - - - - - 256< L77 2 - 64 - - 0,064 - - 256< L78 4 - 0,256 + - 0,256 - - 256< L79 1 - 0,512 + - 0,256 - - 256< L20 0,512 - 2 - - 0,512 - - 64 L21 2 - 16 - - 0,032 - - 256< L25 2 - 0,512 - - 0,032 - + 256< L26 1 - 0,128 - - 0,064 - + 256< L27 0,512 - 0,512 - - 0,256 - + 256< L29 2 - 0,512 - - 0,064 - + 256< L34 0,512 - 64 + + 0,256 - - 256< L28 1 - 0,512 - - 0,256 - + 256< L5 0,008 - - - - 0,08< - + 0,128 L99 2 - 1 - - 1 + - 256< L100 2 - 0,256 - - 1 + - 256< L101 4 - 0,256 - - 0,064 + - 256< L104 2 - 0,512 - - 0,064 + - 256< L123 32 - - - - - - - 256< L119 4 - 2 + - 0,256 - - 256< *Yalnızca dirençli izolatların sonuçları verilmiştir, Turuncu, yeşil ve mavi renkler bakterilerin genetik olarak gruplarını ifade etmektedir. 70 floR tetM tetS ermB ermA Şekil 25. ermA geni pozitif örnekler, 332bp (1, 2, 5, 6, 7, 8); Şekil 26. floR geni pozitif Aeromonas ve Y. ruckeri M: Marker 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, örnekleri, 399bp (1); M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600bp 600bp Şekil 27. ermB geni pozitif örnekler, 364bp (1, 2, 4, 5); M: Şekil 28. tetA geni pozitif örnekler, 210bp (1-3); M: Marker 50, Marker 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500bp 600bp 71 Şekil 30. tetD geni pozitif örnek (1) 1121bp ve negatif örnekler Şekil 29. tetB geni pozitif örnek 416bp (2), tetE geni pozitif (2, 3). M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, örnekler 1.180bp (3, 10, 13); M: Marker 100, 200, 300, 400, 1.000, 1.500bp 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500bp Şekil 32. tetS geni pozitif örnekler, 573bp (1, 2, 4); M: Şekil 31. tetC geni pozitif örnekler (1, 3, 5) 1138bp. M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1500bp 1.500bp 72 Şekil 33. tetM geni pozitif örnekler, 657bp (1, 2); M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500bp Şekil 34. SulI geni pozitif örnekler, 433bp (1-5); SulII geni pozitif örnekler, 293bp (3, 4, 5); SulI ve SulII genleri pozitif örnekler (6, 7, 8); M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600bp 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Hareketli Aeromonas; 73 Aeromonas genusuna ait türler, akuatik ortamda (su, sediment) bulunmakta, tatlısu, deniz balıkları ve diğer soğukkanlı hayvanlarında hastalık oluşturmaktadır. Ayrıca insanlarda septisemi, yara enfeksiyonu, gastroenteritis, aspirasyon pnömonisi olgularına ve çok sayıda gıda zehirlemesine neden olduğu rapor edilmiştir (Altwegg ve ark., 1991; Hänninen ve ark., 1997; Ghenghesh ve ark., 2005). Akuakültürde yetiştiriciliği yapılan balıkların yanı sıra deve, sığır, koyun, keçi, tavuk, kuş, kedi ve köpek gibi birçok hayvana ait hastalık vakalarından, şehirsel atık ve içme sularından da Aeromanas türleri izole edilmiştir (D'Aloia ve ark., 1996; Ghenghesh ve ark., 1999; Mansour ve ark., 2014). Hem tatlısu hem de deniz balıklarında hareketli Aeromonas septisemi (MAS) yaygın görülmektedir (Yogananth ve ark., 2009; Viji ve ark., 2011). Aeromonas türlerinin virulensinde, Lipaz (Lip), Serine proteaz (Ser), Aerolizin (Aer), Cytotoxic enterotoxin (ACT) ve sıcaklık-duyarlı protease Epr (CAI) enzimlerinin sorumlu olduğu bildirilmiştir (Li ve ark., 2011; Yi ve ark., 2013). Gökkuşağı alabalıklarında hareketli Aeromonas enfeksiyonlarına sıklıkla rastlanılmasına rağmen (Abott ve ark., 2003, Duman ve ark., 2017) klasik mikrobiyolojik testlerin tür ayrımında yetersiz kaldığı, atipik özellik gösteren Aeromonas türlerinin biyokimyasal özelliklerinin farklılık gösterdiği bu durumun da Aeromonas türlerinin teşhisini zorlaştırdığı bildirilmektedir (Janda, 2011). Aeramonas genusunda yer alan bazı türlerin biyokimyasal özelliklerinin birbirilerine yüksek oranda benzerlikler göstermeleri, biyokimyasal test sonuçlarının belirlenmesinin uzun zaman alması araştırmacıları API, VITEK, BIONOR gibi hızlı teşhis kitlerin kullanımına yöneltmiştir. Hızlı teşhis kitleri Aeromonas türlerinin teşhisinde çok güvenilir sonuç vermese de benzer özellik gösteren türlerin belirlenmesine olanak sağlamaktadır (Altwegg ve ark., 1990; Duman ve ark., 2017). Tez çalışmasında Aeromonas spp. teşhisi konulmuş 140 izolat ayrıntılı mikrobiyolojik ve moleküler identifikasyona tabi tutulmuştur. Çalışmada kullanılan 140 izolatın büyük bir çoğunluğu biyokimyasal testlerde benzer özellik göstermiş, ancak bu izolatlardan bazılarının DNA dizi analizinde Aeromanas’tan farklı bir türe mensup olduğu belirlenmiştir. Mezofilik Aeromonas türlerinin hareketli; tipik A. salmonicida’nın ise psikrofilik ve hareketsiz olduğu bilinirken, Abott ve ark., (2003) mezofilik türler içerisinde hareketsiz suşların ve A. salmonicida suşları arasında ise hareketli suşların 74 olduğunu bildirmişlerdir. Tez çalışmamızın konusunu hareketli Aeromonas türlerinin oluşturması nedeniyle hareketsiz türler çalışılmamıştır. Ancak, çalışmamızda da Abott ve ark., (2003) ’nın bildirdiği şekilde bazı A. salmonicida suşlarının hareketli olduğu belirlenmiştir. Hareketli Aeromonas türlerinin biyokimyasal özellikleri ayrıntılı olarak çalışılmış olsa da son zamanlarda yapılan çalışmalarda atipik suşların belirlenmesi, tür içinde genetik modifikasyonların görülmesi ve yeni türlerin tespit edilmesi biyokimyasal testlere dayanılarak yapılan identifikasyonların güvenilir olmadığını ortaya koymuştur (Lamy ve ark., 2010). Carnahan ve ark., (1991) Aeromonas’ların ayrıntılı biyokimyasal özelliklerini belirleyerek tür içi ayrımda kullanılabilecek biyokimyasal özellikleri (Aerokey II) bildirmiş olsalar da, Abott ve ark., (2003) yaptıkları çalışmada; birçok Aeromonas türünün en karakteristik özellikleri açısından bile farklılıklar gösterebileceğini rapor etmişlerdir. Tez çalışmasında; son yıllarda yapılan çalışmalara uyumlu olarak Aeromonas’ların aynı tür içinde dahi farklı biyokimyasal özellikler gösterebilecekleri hatta aynı türe ait referans suşlardan (ATCC) farklı biyokimyasal karaktere sahip oldukları belirlenmiştir. Biyokimyasal özelliklere dayanılarak tür tayininin yapılamaması sonucunda 16S rRNA’ya dayalı PCR yöntemleri geliştirilmiştir. 16S rRNA’nın dizi analizi Aeromonas türlerinin identifikasyonu ve tür içi filogenetik ilişkilerin belirlenmesinde son yirmi yılda yaygın olarak kullanılmıştır (Martínez-Murcia ve ark., 1997; Martínez- Murcia ve ark., 2007). Bu genus içerisinde V2, V3 ve V6 gibi 16S rRNA üzerinde yer alan bazı spesifik bölgelerin incelenmesiyle ayrıntılı tür teşhislerinin yapılabildiği bildirilse de sürekli gelişen moleküler teknikler 16S rRNA PCR analizlerinin kullanımını azaltmıştır. Bunun üzerine son yıllarda protein bölgelerini kodlayan ve mutasyonların az olduğu korunmuş gen bölgelerinin (gyrB, rpoD gibi) kullanıldığı çalışmalar ön plana çıkmıştır (Saavedra ve ark., 2006; Martínez-Murcia ve ark., 2008a; Martínez-Murcia ve ark., 2008b; Yi ve ark., 2013). Hem klasik testlerle hem de 16S rRNA PCR ile tür teşhisi yapılmış Aeromonas’ların korunmuş gen bölgeleri ile yapılan analizler sonucunda teşhis edilen türlerden farklı türler olduğunun belirlenmesi, korunmuş gen bölgelerinin güvenilirliğini arttırmıştır. Çalışmamızda 16S rRNA PCR ile Aeromonas spp. olduğu belirlenen bazı izolatların korunmuş gen bölgesi (gyrB)’nin dizi analizi sonucunda Aeromonas genusuna ait olmadığı (Citrobacter sp., Pseudomonas sp., Enterobacter sp.) 75 belirlenmiştir. Ayrıca gyrB’nin dizi analizi ile 13 farklı Aeromonas türü belirlenmiş olup, bunlar içerisinde en yaygın türlerin A. sobria, A. salmonicida ve A. media olduğu görülmüştür. Yaptığımız literatür taramasına göre A. allosacharophila, A. eucrenophila, A. hydrophila subsp. hydrophila, A. hydrophila subsp. anaerogenes, A. dhakensis ve A. hydrophila subsp. dhakensis türleri ülkemizde gökkuşağı alabalıklarında ilk defa tespit edilmiştir. Soler ve ark., (2004), Aravena-Roman ve ark., (2011) Aeromonas türlerinin gyrB bölgesinin dizi analizini yaptıkları çalışmalarında; farklı Aeromonas türlerinin yakın ilişkili veya aynı genogrupta yer alabileceklerini rapor etmişlerdir. Aeromonas türlerinin filogenetik analizlerinin yapıldığı ve yukarıda bildirilen araştırmalara benzer olarak; tez çalışmasında da Aeromonas’ların farklı türlerinin aynı genetik grup içerisinde yer aldığı belirlenmiştir. Bu sonuçlara göre çalışmamızda; A genogrubunda: A. sobria, A. salmonicida, Aeromonas sp.; B genogrubunda: A. hydrophila, A. hydrophila subsp. hydrophila, A. hydrophila subsp. dhakensis, A. dhakensis, A. media, Aeromonas sp., A. caviae, A. allosacharophila, A. veronii; C genogrubunda: A. veronii ve Aeromonas sp.; D genogrubunda: A. salmonicida, A. bestiarum, Aeromonas sp.; E genogrubunda: A. eucrenophila ve A. bestiarum’un yer aldığı görülmektedir. Akuakültürde fırsatçı patojen olan hareketli Aeromonas etkenlerinin antimikrobiyal direnç genlerinin taşınmasında ve yayılmasında rol oynadığı bildirilmiştir (Zhang ve ark., 2009). Cantas ve ark., (2013); Aeromonas türlerinde antimikrobiyal direncin yaygın olmasının en önemli nedenlerinden birinin de tarım ve akuakültürde antimikrobiyal bileşiklerin yaygın kullanımının olduğunu rapor etmişlerdir. Farklı bir araştırmada ise; antimikrobiyal direnç genlerinin çevre kirliliği ve su kaynakları yoluyla farklı bakteri türleri arasında yayıldığı bildirilmiştir (Lupo ve ark., 2012). Özellikle son yıllarda akuakültürde antimikrobiyallerin yaygın kullanımına bağlı olarak oluşan sağlık sorunları AB ülkelerinde yasal düzenlemelerin yürürlüğe girmesine neden olmuş ve buna bağlı olarak birçok AB ülkesinde antimikrobiyallerin kullanımı sınırlandırılmıştır (Avrupa komisyonu No 1831/2003). AB ülkelerinde olduğu gibi ülkemizde de antimikrobiyal kullanımına sınırlamalar getiren 76 düzenlemeler yapılmıştır. Ancak küresel boyutta balıklar için ruhsatlı olmayan antimikrobiyallerde direnç gelişiminin görülmesi, akuakültürde ruhsatlı olmayan antimikrobiyallerin yaygın kullanıldığına dair görüşleri haklı kılmıştır (Tennstedt ve ark., 2003; Szczepanowski ve ark., 2009; Cheng ve ark., 2012; Moura ve ark., 2012). Atık su ve akuakültürden izole edilen Aeromonas izolatlarının ampisilin, sulfonomid, trimetoprim/sulfamethoksazol, rifampin, nalidiksik asit, kloramfenikol, florfenikol ve doksisiklin gibi çok sayıda antimikrobiyale direnç geliştirmiş olduğu belirlenmiştir (Figueira ve ark., 2011; Deng ve ark., 2012; Usui ve ark., 2016). Bu tez çalışmasında Aeromonas türlerinin fenotipik ve genotipik olarak FFC, TET ve SUL antimikrobiyallerine karşı direnç geliştirdiği ve bu türlerin %24,2’inin FFC’e, %28,1’inin TET’e ve %92,2’sinin ise SUL’e dirençli olduğu tespit edilmiştir. Bu sonuçlar literatürde Aeromonas spp. izolatlarında FFC, TET ve SUL antimikrobiyalleri üzerinde yukarıda bildirilen direnç çalışmalarındaki sonuçları desteklemiştir. Atık sulardan izole edilen Aeromonas türlerinde özellikle kinolon, aminoglikozid, β-laktam ve tetrasiklin başta olmak üzere çok sayıda antimikrobiyale karşı direnç geni tespit edilmiştir (Zhang ve ark., 2009). Figueira ve ark., (2011) atık sulardan izole edilen Aeromonas türlerinin kinolon direncinden sorumlu gyrA ve parC genlerinde mutasyon olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca aynı araştırmada A. media ve A. caviae türlerinin büyük çoğunluğunun nalidiksik asite karşı direnç geliştirdiği belirtilmiştir. Miyahara ve ark., ise kinolon direncinden sorumlu qnrS ve accA-cr genlerinin de özellikle A. media türlerinde bulunduğunu rapor etmişlerdir (Miyahara ve ark., 2011). A. veronii’nin tetA, A. salmonicida’nın ise tetE taşıdığı tespit edilirken, tetC direnç geni tespit edilememiştir (Chopra ve Roberts, 2001; Szczepanowski ve ark., 2009; Kim ve ark., 2011; Han ve ark., 2012c; Igbinosa ve Okoh, 2012). Atık sularda Aeromonas türlerini konu alan antimikrobiyal çalışmalar incelendiğinde akuatik çevreye oranla daha az direnç geni tespit edildiği görülmektedir. Akuakültürde yapılan çalışmalarda ise çok sayıda antimikrobiyale (florokinolonlar, florfenikol, oksitetrasiklin, amoksasillin ve sulfanomidler) karşı direnç geni tespit edildiği görülmektedir (Holmström ve ark., 2003; Cabello, 2006; Primavera, 2006; Soonthornchaikul ve Garelick 2009; Petersen ve ark., 2002; Sorum, 2008; Shah ve ark., 2012). 77 Norveç’te Atlantik salmon yetiştiriciliği yapan bir işletmede oksitetrasiklin tedavisi sonrasında mikrobiota incelendiğinde yalnızca Aeromonas türlerinin canlı kalabildiği belirtilmiştir (Navarrete ve ark., 2008). İnsan, karasal hayvan, çevre ve atık sulardan izole edilen Aeromonas türlerinde yaygın olarak kinolon, aminoglikozid, β- laktam antimikrobiyallerine karşı direnç genlerinin varlığı bildirilmişken, akuakültürden izole edilen Aeromonas türlerinde ise yaygın olarak tetrasiklin (tet) genleri rapor edilmiştir. Kültür balığı yetiştiriciliği yapılan balık, su ve sediment örneklerinden izole edilen Aeromonas türlerinde bu güne kadar tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetH, tetG ve tetM direnç genleri bildirilmiştir (Schmidt ve ark., 2001b; Nawaz ve ark., 2006; Akinbowale ve ark., 2007; Jacobs ve Chenia 2007; Verner-Jeffreys ve ark., 2009). Tespit edilen TET genlerinden tetA’nın plasmid ve transpozon ile, tetC ve tetE’nin plasmid, integron ve transpozon ile, tetB ve tetD ’nin ise yalnızca plasmid ile aktarıldığı ve TET direnç genlerinin akuakültürde yayılma potansiyelinin yüksek olduğu rapor edilmiştir (Akinbowale ve ark., 2007). Tez çalışmasında literatürde bildirilen çalışmalara benzer olarak; hareketli Aeromonas izolatlarının %25,2’si fenotipik olarak TET dirençli iken, %23,3’ü tetA, %19,4’ü tetE, %1,9’u tetD, sadece bir izolatın ise tetC direnç geni taşıdığı ve tespit edilen tetA ve tetE direnç genlerinin yaygın olduğu belirlenmiştir. Ndi ve Barton (2011) yaptıkları çalışmada; gökkuşağı alabalıklarından izole edilen Aeromonas spp. izolatlarında TET direncinin predominant olduğunu, TET direnci taşıyan izolatların iki ya da üç farklı gen taşımasına rağmen MIC değerlerinde TET duyarlı sonuçlar verebileceklerini belirtmişlerdir. Bildirilen bu sonuçlara benzer olarak tez çalışmasında da direnç geni taşıyan birçok Aeromonas spp. izolatın fenotipik olarak TET’e duyarlı olduğu belirlenmiştir. Tez çalışmamızda A. sobria’nın antimikrobiyallere karşı en yaygın direnç geliştiren tür olduğu ve bunu sırasıyla A. media, A. salmonicida ve A. hydrophila’nın izlediği saptanmıştır. Ayrıca 2013 ve 2014 yılı Aeromonas izolatlarının genellikle SUL’e karşı dirençli olduğu; 2015 yılı izolatlarının ise SUL ile birlikte FFC’e karşı yüksek düzeyde direnç geliştirdiği belirlenmiştir (bk. şekil 23). Kültür balıklarında hastalık oluşturan Aeromonas türlerinde kloramfenikol (catB) ve FFC (floR) direnç genlerine yönelik çok sayıda rapor bulunurken, A. 78 salmonicida izolatlarında çoklu antimikrobiyal gen kasetinde yalnızca floR geni bildirilmiştir (Schmidt ve ark., 2001; McIntosh ve ark., 2008; Verner-Jeffreys ve ark., 2009; Ishida ve ark., 2010). Bu çalışmada Aeromonas türlerinin %24,2’sinin FFC’e karşı fenotipik dirençli olduğu ancak bu izolatlardan %56’sının floR direnç geni taşıdığı tespit edilmiştir. Akuakültürde Aeromonas türlerinin tedavisinde sulfonamid grubu antimikrobiyallerin yaygın kullanılmadığı bildirilmesine rağmen sulI ve sulII direnç genlerinin yaygın olduğu rapor edilmiştir (McIntosh ve ark., 2008; Ndi ve Barton 2011). Schmidt ve ark., (2001) A. hydrophila türlerinde sulI direnç geninin daha yaygın olduğunu; sulII direnç geninin sulI’e göre daha az sıklıkta bulunduğunu bildirmiştir. Bununla birlikte aynı araştırmacılar sulII geninin genellikle floR, tetA/R ve strA/B genleriyle birlikte plazmit’le taşındıklarını belirtmişlerdir. Bazı araştırmalarda da sulI ve sulII geninin yaygın olduğu ancak sulIII geninin nadir görüldüğü bildirilmiştir (Kim ve ark., 2011; Han ve ark., 2012; Shah ve ark., 2012; Capkin ve ark., 2015). Aeromonas türlerinde sul genleri üzerine daha önce yapılan araştırmalara benzer olarak bu çalışmada da sulI, sulII yaygın olduğu belirlenmişken sulIII geni tespit edilememiştir. Ülkemizde bu konuda yapılan farklı çalışmalarda; A. hydrophila izolatlarının tetA, tetB, tetC, sulI ve sulII direnç genlerini taşıdığı bildirilmişken diğer Aeromonas türlerinde FFC, TET ve SUL direncine yönelik bir kayda rastlanılamamıştır (Boran ve ark., 2013; Capkin ve ark., 2015). Bu tez çalışmasında hareketli Aeromonas’larda tetD ve tetE genlerinin tespit edilmesi bu konuda ülkemizde yapılan daha önceki çalışmalardan farklılık göstermiştir. Ayrıca çalışmamızda ülkemizde ilk olarak Aeromonas türlerinde “sulI-sulII”, “sulI-sulII-tetA”, “sulI-floR”, “floR-tetA” ve “sulII-tetE” genleri bir arada tespit edilmiştir. Bu sonuçlar alabalık işletmelerinden izole edilen Aeromonas türlerinin çoklu direnç taşıma potansiyeli gösterdiğini ortaya koymuştur. Y. ruckeri; Yersiniozisin enfekte ya da taşıyıcı balıklar ile direkt kontak yoluyla kolayca bulaşabildiği ve enfeksiyonu atlatan balıkların 2 ay süreyle etkeni dışkı ile etrafa yayabildiği bildirilmiştir (Shaowu ve ark., 2013). Y. ruckeri, balıklar dışında misk 79 faresi (Ondatra zibethicus), kerkenez (Falco spp.), martı (Laridae), kaplumbağa (Cheloniidae) ve insanlardan da izole edilmiştir (Farmer ve ark., 1985; Willumsen 1989; Shaowu ve ark., 2013). Çalışmamızda gökkuşağı alabalıklarının yanı sıra su örneğinden de izole edilen Y. ruckeri izolatı incelenmiştir. Busch ve Lingg (1975) yaptıkları prevalans çalışmasında gökkuşağı alabalıklarının kalın bağırsağında (%25’inin) Y. ruckeri’nin varlığını tespit etmişlerdir. Stres durumunda ise taşıyıcı balıkların kalın bağırsaklarında bulunan etkenlerin çevreye yüksek oranda yayıldığı belirlenmiştir (Busch ve Lingg, 1975). Özellikle gökkuşağı alabalık üretimi yüksek olan İtalya, İspanya, Şili ve Yunanistan’da olduğu gibi ülkemizde de Y. ruckeri’nin yılın hemen her mevsimi izole edildiği görülmektedir (Kumar ve ark., 2015; Duman ve ark., 2017). Hasta gökkuşağı alabalığı örneklerinden Y. ruckeri’nin izolasyonu TSA, BHIA, KA ve NA gibi genel besi yerlerinde hem aerobik hem de anaerobik şartlarda kolaylıkla yapılabilmektedir (Austin ve Austin,, 2016). Etkenin biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde özellikle 22-25°C inkübe edilmesi gerektiği, 30°C’de etkenin hareket yeteneğini kaybettiği ve farklı sıcaklıklarda biyokimyasal özelliklerinde değişiklik görülebileceği belirtilmiştir (Rintamaki ve ark., 1986). Etken biyokimyasal testlerle teşhis edilebilmesine rağmen klasik testlerin sonuçlarının zaman alması nedeniyle Y. ruckeri’nin teşhisinde hızlı teşhis kitleri kullanılmıştır. Özellikle API 20E gibi hızlı teşhis kitleri kullanılarak etkenin kolayca teşhis edildiği birçok araştırmacı tarafından bildirilmiştir (Onuk ve ark., 2011; Tinsley ve ark., 2011; Altun ve ark., 2013a; Austin ve Austin, 2016). Biyokimyasal testlerin karakterizasyon çalışmalarında; Y. ruckeri suşlarının API 20E hızlı teşhis kitinde jelatin, Tween hidrolizi ve VP reaksiyonu gibi bazı testlerde farklılık gösterse de izolatların büyük oranda homojen karakter gösterdikleri bildirilmiştir (Onuk ve ark., 2011; Bastardo ve ark., 2012; Altun ve ark., 2013a; Austin ve Austin, 2016). Yapılan çalışmalara benzer olarak bu çalışmada gerek biyokimyasal gerekse hızlı teşhis kitleri ile Y. ruckeri’nin teşhisinin yapılabildiği ve izolatların biyokimyasal özelliklerinin büyük oranda homojen bir karakter gösterdiği belirlenmiştir. Biyokimyasal yöntemlerle ve hızlı teşhis kitleriyle kolay identifiye edilebilen Y. ruckeri aynı zamanda doku, kan, dışkı ve su örneklerinden de moleküler yöntemlerle (16S rRNA, YER8-YER10 PCR gibi) teşhis edilebilmektedir (Gibello ve 80 ark., 1999; Altinok ve ark., 2001; Chen ve ark., 2010). Gibello ve ark., (1999) YER8- YER10 primerlerini kullanarak dokuda düşük miktarlarda dahi bulunan Y. ruckeri’nin teşhisini yapabilmiş ve bu şekilde PCR analizi ile asemptomatik taşıyıcı balıkların belirlenebildiğini bildirmişlerdir. Tez çalışmamızda; ülkemizin 6 farklı bölgesinden izole edilmiş olan 137 Y. ruckeri izolatının PCR analiziyle identifikasyonu yapılmıştır. Ayrıca çalışmada kullanılan Y. ruckeri izolatlarını temsilen seçilen suşların DNA dizi analizi ile konfirmasyonu yapılmıştır. Son yapılan çalışmalarda Y. ruckeri’nin genetik karakterizasyonunda ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive İntergenic Consensus) yöntemi kullanılmış ve başarılı sonuçlar elde edildiği bildirilmiştir (Altinok ve ark., 2001; Kumar ve ark., 2015). Huang ve ark., (2013) 5 farklı genotiplendirme yönteminin kullanılabilirliğini karşılaştırdıkları çalışmada; ERIC-PCR yönteminin Y. ruckeri’nin genetik farklılıklarının belirlenmesinde en yüksek ayrım gücüne sahip yöntem olduğunu belirtmişlerdir. Bastardo ve ark., (2012) bazı Y. ruckeri genogruplarının farklı bölge ve farklı balık türlerinde yaygın karakterde olduğunu rapor etmişlerdir. Onuk ve ark., (2011) 97 Y. ruckeri izolatıyla yaptıkları çalışmada izolatlardan %36,1’inin benzer genetik profil gösterdiğini; Altun ve ark., (2013a) ise ülkemizden izole edilen 17 Y. ruckeri suşundan %29,4’ünün yaygın genogrubu oluşturduğunu bildirmişlerdir. Huang ve ark., (2013) ise 83 izolattan %92,7’sinin benzer genetik profil gösterdiğini rapor etmişlerdir. Çalışmamızda 142 Y. ruckeri izolatının moleküler karakterizasyonu ERIC-PCR primerleri kullanılarak RAPD yöntemiyle yapılmıştır. Yapılan bu çalışmada RAPD-PCR’da 18 farklı genotip tespit edilmiştir. Yapılan araştırmalara benzer olarak çalışmamızda gruplandırılan Y. ruckeri izolatlarının %82,3’ünün NCTC 12266 (serotip O1) ile benzer genetik profil gösterdiği belirlenmiştir. Çalışmada kullanılan 4 izolatın Serotip O2 (NCTC 12267) ile %100 benzerlik, diğer serotiplerle (O5, O6 ve O7) ise en az %90 benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Ülkemizde Y. ruckeri’nin RAPD-PCR ile genotiplendirmesi konusunda daha önce yapılan çalışmalarda, Onuk ve ark., (2011) Y. ruckeri izolatlarının 6, Altun ve ark., (2013a) ise 5 farklı genotipe ayrıldığını bildirmişlerdir. Tez çalışmasında 6 farklı bölgeyi temsil eden 142 Y. ruckeri izolatın 18 farklı genotipe ayrıldığının belirlenmesi ülkemizde daha önce bildirilen çalışmalardan farklılık göstermiştir. Bu farklılığın; ülkemizin geniş bir coğrafik konumunun olması ve farklı coğrafik 81 bölgelerde alabalık işletmelerinin yaygın olarak bulunmasından kaynaklandığı düşünülmüştür (Altun ve ark. 2013). Bu çalışmada, izolatların genetik yakınlıkları ve bölgesel dağılımları değerlendirildiğinde; Y. ruckeri’nin genellikle 14°C ve üzerindeki su sıcaklıklarında daha yaygın görüldüğü, genetik benzerliklerine göre ise izolatların genellikle Fethiye bölgesinden diğer bölgelere yayılım göstermiş olabileceği ve Karadeniz izolatlarının ise diğer bölge izolatlarından farklı genetik profil gösterdikleri belirlenmiştir. Akuakültürde yüksek üretim kapasitesine sahip olan gelişmiş ülkelerde olduğu gibi ülkemizde de Yersiniozis’e karşı aşılama yapılmasına rağmen Yersiniozis vakalarında yüksek oranda ölüm görüldüğü bildirilmiştir (Bastardo ve ark., 2011; Altun ve ark., 2013a). Bu durum kültür balıkçılığında, Yersiniozis başta olmak üzere çok sayıda bakteriyel hastalığın tedavisinde antimikrobiyal kullanımına neden olmaktadır. Yapılan çalışmalarda Y. ruckeri izolatlarının antimikrobiyallere karşı farklı düzeylerde duyarlılık gösterdikleri bildirilmiştir (Altun ve ark., 2013a; Türe ve ark., 2016; Huang ve ark., 2013; Orozova ve ark., 2014; Balta ve ark., 2010). Bu çalışmada Y. ruckeri izolatlarının SXT, FFC ve TET’e yaklaşık %80’inin duyarlı olduğu tespit edilirken, SUL’e karşı %100’ünün direnç geliştirmiş olduğu belirlenmiştir. Bu sonuçlar Y. ruckeri’nin antimikrobiyal duyarlılığı konusunda daha önce yapılan araştırmalara benzerlik göstermiştir. Ayrıca çalışmamızda Y. ruckeri izolatlarının SXT’e (%12,6) ve FFC’e (%14,7) oranlarında direnç geliştirmiş olduğu görülmüştür. Bu sonuçlar Yersiniozis’e karşı SXT ve FFC’in halen etkili bir şekilde kullanılabileceğini göstermiştir. Bulgaristan, Şili ve Almanya’da, farklı araştırmacıların gökkuşağı alabalıklarından izole edilen Y. ruckeri izolatlarıyla yaptıkları antimikrobiyal direnç çalışmalarında FFC ve TET’e karşı orta ve yüksek düzeyde direnç gelişmiş olduğunu; sulfanomid-trimethoprim kombinasyonlarına ise duyarlılığın yüksek olduğunu bildirmişlerdir (Miranda ve Zemelman 2002a,b; Huang ve ark., 2013; Orozova ve ark., 2014). Y. ruckeri’nin antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesi konusunda çalışmalar olmasına rağmen bu etkenin antimikrobiyal direnç genlerinin belirlenmesine yönelik çalışmalar oldukça sınırlıdır (Balta ve ark., 2010; Huang ve ark., 2013; Türe ve ark., 2015). Balta ve ark., Y. ruckeri izolatlarında tetA ve tetB genlerini tespit ettiklerini bildirirken (Balta ve ark., 2010), son zamanlarda yapılan 82 çalışmalarda sulII geninin varlığı da belirlenmiştir (Huang ve ark., 2013; Türe ve ark., 2016). Y. ruckeri izolatlarında direnç genlerinin varlığı konusunda bildirilen araştırmalara benzer olarak bu tez çalışmasında da sulII geninin varlığı belirlenmiş ancak tetA, tetB, tetM, tetS ve sulIII direnç genleri tespit edilememiştir. Bu farklılığın araştırmalarda incelenen izolatların farklı kökenlere sahip olmalarından kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmada Y. ruckeri izolatlarında belirlenen sulII geninin yalnızca serotip O1’e benzer profile sahip predominant genogrupta bulunduğu; tetC (Y91 ve Y106) geni istisna olmak üzere floR, sulI, tetD ve tetE genlerinin ise diğer genogruplarda yer aldığı tespit edilmiştir. Ayrıca FFC’e fenotipik olarak dirençli izolatlardan (%14,7) yalnızca birinin “floR” geni taşıdığı, SUL’e fenotipik olarak dirençli izolatlardan (%100) 11’inin “sul” direnç geni taşıdığı, TET’e fenotipik olarak dirençli izolatlardan (%13,3) ise 3’ünün “tet” direnç geni taşıdığı belirlenmiştir. Buna ilaveten fenotipik olarak TET’e duyarlı olduğu belirlenen Y. ruckeri izolatlarının %57’sinin tetC ve tetE genlerini taşıdığı saptanmıştır. Bu durum fenotipik olarak duyarlı olmasına rağmen bazı izolatların direnç geni taşıyabileceğini göstermiştir. Bu tez çalışmasında tespit edilen floR, sulI, tetC, tetD ve tetE genleri Y. ruckeri için literatürde ilk bildirimdir (Duman ve ark., 2017). L. garvieae; İlkbahar ve yaz aylarında gökkuşağı alabalığı işletmelerinde su sıcaklıklarının 16ºC ve üzerine çıktığı dönemlerde Laktokokkozis yaygın olarak görülmektedir (Altun ve ark., 2013b). İşletmeler arasında kontrolsüz balık nakilleri, su kaynaklarının ortak kullanımı ve alet-ekipmanın yetersiz dezenfeksiyonu Laktokokkozis hastalığının yayılmasında önemli faktörlerdir. L. garvieae’nin gökkuşağı alabalıklarının yanı sıra birçok tatlı su ve deniz balıklarında da enfeksiyon oluşturduğu bildirilmiştir (Carson ve ark., 1993). Gökkuşağı alabalığı işletmelerinde su sıcaklığının 16ºC ve üzeri olması durumunda ortaya çıkan Laktokokkozis ’in karakteristik belirtileri balıklarda renkte kararma ve bilateral egzoftalmustur (Austin ve Austin, 2016). Gram pozitif hareketsiz bir kok olan L. garvieae’nin; TSA, BHIA ve KA’da kolayca üreyebilme, %5 koyun kanı ilave edilmiş agarda α-hemoliz oluşturma, oksidaz, katalaz negatif, O/F fermentatif, 45 ºC üreyebilme gibi özellikler göstermesiyle laboratuvarda kolayca teşhisi yapılabilmektedir (Austin ve Austin, 2016). Ravelo ve ark., (2001); farklı ortam ve hayvanlardan izole edilen L. garvieae izolatlarının biyokimyasal testlerde 83 genellikle homojen bir özellik gösterdiğini; ß-galaktosidaz ve N-asetil-ß- glukosaminidaz enzimlerinin kullanımında farklılıklar görülebildiğini; Cheng ve Chen, (1998) ise yaptıkları çalışmada İspanya’dan ve Kedi balıklarından izole edilen L. garvieae izolatlarının hippurat hidrolizinde pozitif sonuç verdiğini bildirmişlerdir. Etkenin biyokimyasal testlerde homojen sonuçlar vermesi, L. garvieae’nin hızlı teşhis kitleri ile de teşhis edilebilmesine olanak sağlamaktadır. API Rapid ID 32 Strept (Biomerieux, Fransa) hızlı teşhis kitleri ile L. garvieae 5-6 saatte %99,9 güvenilirlikte teşhis edilebilmektedir (Vela ve ark., 1999; Ravelo ve ark., 2001). Vela ve ark., (2000) alabalık, insan, sığır ve su bufalosundan L. garvieae izole etmiş ve bu etkenlerin sukroz, tagatoz, mannitol, siklodekstrinden asit üretme, proglutamik asit arilamidaz ve N- asetil-ß-glukosaminidaz enzimlerinin üretimine göre 13 farklı biyotip gösterdiklerini bildirmişlerdir. Daha önceki çalışmalarda karbonhidrat testlerinde negatif sonuçlar bildirilmesine rağmen, Ravelo ve ark., (2001) 23 balık izolatının karbonhidrat testlerinde pozitif sonuç verebileceğini belirlemiş ve önceki çalışmalarda elde edilen farklı sonuçların hızlı teşhis kitleri ile yapılan teşhislerde uygulama sırasında bazı maniplasyon hatalarından kaynaklanabileceğini belirtmişlerdir (Ravelo ve ark., 2001). Altun ve ark., (2013b) çalışmalarında Türkiye’den izole edilen L. garvieae izolatlarının genellikle biyokimyasal testlerde homojen özellik gösterdiğini ve hızlı teşhis kitleriyle yapılan identifikasyonların da güvenilir sonuçlar verdiğini bildirmişlerdir. Bu tez çalışmasında daha önce yapılan birçok araştırma sonucuna benzer olarak riboz ve sakkaroz gibi bazı karbonhidrat ve enzim üretimlerinde (hippurat, N-asetil-ß-glukosaminidaz) farklılıklar görülse de L. garvieae izolatlarının genellikle biyokimyasal testlerde homojen özellik gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca, L. garvieae izoaltlarının biyokimyasal test sonuçlarında bazı farklılıklar görülmesine rağmen tüm izolatlar API RAPID 32Strept hızlı teşhis kitinde %99,9 L. garvieae identik bulunmuştur. Tez çalışmasında da; Ravelo ve ark., (2001)’nın bildirdiği gibi API Rapid ID 32Strept hızlı teşhis kitinin oldukça başarılı sonuçlar verdiği görülmüştür. Birçok araştırmacı tarafından L. garvieae’nin moleküler olarak da kolaylıkla identifiye edilebildiği bildirilmiştir (Zlotkin ve ark., 1998; Dang ve ark., 2012). L. garvieae’nin PCR ile teşhisinde Zlotkin ve ark., (1998), Dang ve ark (2012) iki farklı gen bölgesinin güvenilir sonuçlar verdiğini, özellikle ITS gen bölgesini hedef alan 84 primerlerle yapılan teşhisin çok yakın genetik yapıya sahip olan diğer streptokokların ayrımında da başarılı sonuçlar verdiğini rapor etmişlerdir. Dang ve ark., (2012) yaptığı çalışmada bazı Enterococcus türlerinin PCR analizinde pLG primerleri kullanıldığında pozitif sonuç verdiğini ve bu primerlerin L. garvieae identifikasyonunda güvenilirliğinin az olduğunu belirtmiştir. Aynı araştırmada, pLG primerleri ve 16S- 23S gen bölgesini karşılaştıran araştırmacılar ITS gen bölgesini amplifiye eden primerlerinin L. garvieae haricinde diğer Streptococcus türlerinde pozitif sonuç vermediğini göstermişlerdir. Tez çalışmamızda 137 L. garvieae ve 3 referans suşun identifikasyonunda hem pLG hem de ITS gen bölgesini hedef alan primerler kullanılmış olup tüm izolatlar yapılan çalışmalara benzer olarak her iki primer çiftiyle de identifiye edilmiştir. Ülke genelinde balık hastalıklarına karşı koruma ve kontrol stratejisinin geliştirilebilmesi için farklı coğrafik bölgelerde ortaya çıkan salgınların genotipik ve serotipik ilişkilerinin belirlenmesi gerekmektedir. L. garvieae’nin epidemiyolojisini araştırmak amacıyla RAPD-PCR (Ravelo ve ark., 2003) ve ribotiplendirme (Eldar ve ark., 1996) gibi teknikler yaygın kullanılmıştır. Balıklarda görülen Lactococcosis enfeksiyonlarının incelendiği birçok araştırma olmasına rağmen ülkemizin 6 farklı bölgesine ait L. garvieae izolatlarının aynı anda incelendiği ayrıntılı çalışmalar sınırlıdır. Ferrario ve ark., (2012) L. garvieae izolatlarının 3 farklı RAPD-PCR primer kullanarak genotipik ilişkilerini inceledikleri araştırmalarında, BoxA1R ve (GTG)5 primerleri ile 20 farklı genetik profil, M13 primeri ile 23 farklı profil elde ettiklerini belirtmişlerdir. Foschino ve ark., (2008) RAPD-PCR, Sau-PCR ve AFLP tekniklerini kullanarak yaptıkları genotiplendirme çalışmalarında; L. garvieae izolatlarının genetik ilişkilerinin belirlenmesinde kullanılan 3 tekniğin de benzer sonuç verdiğini bildirmişlerdir. RAPD-PCR tekniğinin tekrarlanabilirliği üzerine bazı kuşkular olsa da bu çalışmada farklı zamanlarda yapılan RAPD-PCR analizlerinde benzer sonuçlar elde edilmiştir. Ayrıca tez çalışmasında ülkemizin 4 farklı bölgesini temsil eden L. garvieae izolatlarının 5 farklı genotipe ayrıldığı belirlenmiştir. RAPD-PCR analizinin güvenirliğinin belirlenmesi amacıyla yapılan DNA dizi analizlerinde de çalışmada kullanılan L. garvieae izolatlarının 5 genotipe ayrıldığı görülmüştür. Ülkemizdeki L. garvieae izolatlarından %72,2’si benzer profil gösterirken geri kalan izolatlardan % 85 23,3’ü de kendi aralarında benzerlik göstermiştir. Ayrıca çalışmada kullanılan L. garvieae referans suşlarından ATCC 49156 ve 49157’nin kendi aralarında %82 benzerlik gösterdiği ve L31 nolu Ege izolatının ise ATCC 43921 ile %72 benzer profile sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu durumda ülkemizden izole edilen L. garvieae izolatlarının %70,7’sini oluşturan Ege izolatlarının A genogrubunu, %22,8’ini oluşturan Ege, İç Anadolu ve Doğu Anadolu izolatlarının ise B genogrubunu oluşturduğu tespit edilmiştir. Ege bölgesinden 2013 yılı Mart-Mayıs ayları arasında izole edilen C genogrubuna ait izolatlar (3 izolat) Mayıs-2013 tarihinden sonra herhangi bir bölgede tespit edilememiştir. Bu grupta yer alan L. garvieae izolatlarının üçünün de Ege bölgesindeki bir işletmeden izole edilmiş olması söz konusu dönemde bu işletmeye kültür koleksiyonumuzda yer almayan bir bölgeden enfekte balık girişi olması ile açıklanabilir. Ayrıca 2013-2015 yılları arasında izole edilen L. garvieae izolatlarının Ege bölgesi izolatlarıyla aynı genogrupta yer alması Altun ve ark., (2013b) belirttiği gibi etkenin Ege bölgesinden yayıldığı fikrini desteklemiştir. Su sıcaklığının 16ºC ve üzerinde olduğu alabalık işletmelerinde L. garvieae’nin yaygın olduğu çok sayıda araştırmacı tarafından bildirilmiştir (Nawaz ve ark., 2011; Altun ve ark., 2013b; Türe ve Alp, 2016). Laktokokkozisden korunma için enjeksiyon aşılar kullanılmasına rağmen dört aydan daha uzun sureli bir koruma elde edilemediği bildirilmektedir (Vendrell ve ark., 2006). Bu şartlarda alabalık üreticileri Laktokokkozisle mücadelede sıklıkla antimikrobiyal kullanımına yönelmektedir. Tez çalışmasında incelenen L. garvieae izolatlarında antimikrobiyal duyarlılığın farklılık gösterdiği, son yıllarda farklı ülkelerden bildirilen çalışmalarda ise antimikrobiyal direncin yaygınlaştığı belirlenmiştir (Schmidt ve ark., 2000; Huang ve ark., 2013; Onuk ve ark., 2011; Nawaz ve ark., 2011; Altun ve ark., 2013b; Chapman, 2013; Türe ve Alp, 2016). Yapılan araştırmalarda L. garvieae izolatlarının enrofloksasin ve nitrofurantoin’e duyarlı, oksalinik asit ve sulfamethoksazol-trimetoprim kombinasyonuna ise dirençli olduğu bildirilmiştir (Ravelo ve ark., 2001). Laktokokkozis’in tedavisinde yaygın kullanıldığı bilinen eritromisin, kloramfenikol, oksitetrasiklin ve ampisillin antimikrobiyallerinde duyarlılığın ise farklılık gösterdiği rapor edilmiştir (Ravelo ve ark., 2001). Son zamanlarda yapılan araştırmalarda L. garvieae’de antimikrobiyal direnç gelişimine yönelik raporlara sıklıkla 86 rastlanılmaktadır (Raissy ve Ansari, 2011; Soltani ve ark., 2008; Raissy ve ark., 2015). Gerek ülkemizde gerekse farklı ülkelerde yapılan araştırmalarda L. garvieae izolatlarının eritromisin, ofloksasin, ampisilin, kloramfenikol’e duyarlı, penisilin ve klindamisin’e ise fenotipik olarak dirençli olduğu bildirilmiştir (Diler ve ark., 2002; Soltani ve ark., 2008; Raissy ve Ansari 2011; Altun ve ark., 2013b; Raissy ve ark., 2015). Bu tez çalışmasında L. garvieae izolatlarının %1,4’inin ERM’e, % 17,8’inin FFC’e, % 10,7’inin TET’e ve % 94,4’ünün SUL’e dirençli olduğu belirlenmiştir. L. garvieae’nin antimikrobiyal duyarlılığının belirlenmesi üzerine son yıllarda yapılan çalışmalara paralel olarak bu çalışmada da L. garvieae izolatlarının ERM ve TET’e karşı yüksek oranda duyarlı oldukları görülmüştür. Akuatik ortamda dirençli bakterilerin su ile çevreye ve nihai olarak insanlara yayılma potansiyeli karasal ekosisteme göre daha yüksektir (Carvalho ve ark., 2012). Bu durum, akuatik ortama yönelik antimikrobiyal direnç çalışmalarının önemini artırmıştır. Son yıllarda gökkuşağı alabalıklarından izole edilen L. garvieae izolatları ile yapılan çalışmalar incelendiğinde tetS, integraz, ermB, gyrA ve parC genlerinin tespit edildiği görülmüştür (Hirono ve Aoki, 2001; Maki ve ark., 2008; Morandi ve ark., 2015). Tez çalışmasında L. garvieae izolatlarında ermA, ermB, tetM ve tetS genleri tespit edilmiştir. Bu sonuçlar incelenen antimikrobiyaller dikkate alındığında önceki çalışmaları desteklemiştir. Ülkemizde gökkuşağı alabalıklarından izole edilen L. garvieae izolatlarında 2015 yılında yapılan bir araştırmada; izolatların %63,3’ünde ereA geni tespit edildiği, ereB geninin belirlenemediği ve tetB geninin yaygın olduğu bildirilmiştir (Türe ve ark., 2015). Aynı konuda komşumuz olan İran’da 2015 yılında yapılan bir araştırmada ise tetA geninin yaygın olduğu bildirilmiştir (Raissy ve ark., 2015). Tez çalışmasında yukarda bildirilen çalışmalardan farklı olarak L. garvieae izolatlarında tetM ve tetS genlerinin yaygın olduğu ve tetB, tetE ve tetA genlerinin bulunmadığı belirlenmiştir. Ayrıca diğer çalışmalardan farklı olarak fenotipik olarak TET direnci göstermeyen 4 izolatın tetM ve tetS direnç genlerinden birini taşıdığı görülmüştür. Japonya’da 2005 yılında yapılan bir çalışmada; sarı kuyruk balıklarından izole edilen ERM ve oksitetrasiklin’e dirençli olduğu tespit edilen L. garvieae izolatlarının ermB ve tetS genlerini taşıdığı bildirilmiştir (Kawanishi ve ark., 2005). Yapılan araştırmalardan farklı olarak; bu çalışmada L. garvieae izolatlarının yalnızca 87 4’ünün ERM’e direnç göstermiş olduğu ve bu dirençli izolatlardan yalnızca 2’sinin ermB geni taşıdığı belirlenmiştir. Ayrıca ERM direnç geni tespit edilen izolatların Ege bölgesine ait olduğu dikkat çekmiştir. Altun ve ark., (2013a) yaptıkları çalışmada L. garvieae izolatlarının büyük çoğunluğunun (%50’den fazla) FFC’e dirençli olduğunu; Maki ve ark., (2008) L. garvieae izolatlarının FFC’e duyarlılığının farklılık gösterdiğini ve bu izolatların floR geni taşımadığını, Türe ve ark., (2015) ise L. garvieae izolatlarının fenotipik olarak FFC’e duyarlı olmasına rağmen izolatların %48,2’sinde (ATCC 49156 dahil) floR geninin bulunduğunu rapor etmişlerdir. Bu çalışmada L. garvieae izolatlarının %17,8’inin fenotipik olarak FFC’e dirençli olmasına rağmen floR geni taşımadığı belirlenmiştir. Bu sonuçlar, Altun ve ark., (2013b) ile Maki ve ark., (2008)’nın bildirdiği sonuçlarla benzerlik göstermiş ancak Türe ve ark., (2015)’nın çalışmalarında floR geni tespit etmeleri yönüyle çalışmamızdan farklılık göstermiştir. Bu farklılığın Türe ve ark.,’nın çalışmalarındaki izolatların Karadeniz bölgesinden izole edilmiş olması, çalışmamızda ise Karadeniz bölgesini temsil eden L. garvieae izolatının bulunmamasından kaynaklanabileceği düşünülmüştür. Laktokokkozis’in tedavisinde SUL bileşiklerinin yaygın kullanılmadığı bilinmektedir (Raissy ve ark 2015; Türe ve ark., 2015). L. garvieae’de SUL dirençliliği konusunda yapılan sınırlı sayıdaki çalışmada; Raissy ve ark., (2015) izolatların %53’ünün, Türe ve ark., (2015) ise %86,6’sının SUL bileşiklerine dirençli olduğunu bildirmişlerdir. Tez çalışmasında fenotipik SUL dirençliliği konusunda elde ettiğimiz sonuçlar bu konudaki diğer araştırmalarla benzerlik göstermiştir. Laktokokkozis tedavisinde yaygın kullanılmayan SUL bileşiklerine karşı yaygın direnç gelişiminin tespit edilmiş olması SUL grubu antimikrobiyalllerin akuakültürde yaygın olarak kullanıldığını ve akuatik patojenlerde de fenotipik direnç gelişimine neden olabileceği düşünülmüştür. Sonuç olarak;  Hareketli Aeromonas septisemi etkenlerinin teşhisinde biyokimyasal testler ve 16S rRNA dizi analizinin başarılı sonuç vermediği,  Aeromonas izolatlarının moleküler tekniklerle teşhisinde korunmuş gen bölgelerinin kullanılması gerektiği,  Ülkemizde 13 farklı hareketli Aeromonas türünün tespit edildiği, 88  Ülkemizin 6 farklı coğrafi bölgesini temsil eden Y. ruckeri izolatlarının 18 farklı genotipe, L. garvieae izolatlarının ise 5 farklı genotipe ayrıldığı,  Çalışmada kullanılan izolatlarının antimikrobiyal duyarlılıklarının oldukça farklı olduğu ve fenotipik olarak duyarlı bulunan izolatların da direnç gen/genlerini bulundurabileceği belirlenmiştir.  A. allosacharophila, A. eucrenophila, A. hydrophila subsp. hydrophila, A. hydrophila subsp. anaerogenes, A. dhakensis ve A. hydrophila subsp. dhakensis türleri ülkemizde gökkuşağı alabalıklarında ilk defa tespit edilmiştir.  Tespit edilen floR, sulI, tetC, tetD ve tetE genleri Y. ruckeri için literatürde ilk bildirimdir. Bu çalışma sonuçlarına göre; 1. Ülkemizden farklı fenotipik özelliklere sahip olan 13 hareketli Aeromonas türü, 18 Y. ruckeri genotipi ve 5 L. garvieae genotipinin tespit edilmesi, bu etkenlerin neden olduğu hastalıklara karşı uygulanması gereken koruma-kontrol programlarında genotip farklılıklarının dikkate alınması, 2. Fenotipik ve genotipik antimikrobiyal dirençlilik açısından her bir izolatın farklı özelliklere sahip olması, bu etkenlere bağlı hastalık vakalarında mutlaka antibiyogram test sonuçları değerlendirilerek tedavi protokollerinin hazırlanması, 3. Gökkuşağı alabalığı işletmelerinde bakteriyel etkenlerin ve antimikrobiyal direnç genlerinin karasal ekosisteme ve insanlara yayılmasının önlenmesi için işletmelerde biyogüvenlik sistemlerinin kurulması, çalıştırılması ve işletmelerden belirli periyotlarda mikrobiyolojik örneklemelerin yapılması gerekmektedir. 6. KAYNAKLAR Abbott SL, Cheung WK, Janda JM (2003) The genus Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reactions, and phenotypic identification schemes. Journal of clinical microbiology, 41(6), pp.2348-2357. Abbott SL, Seli LS, Catino JrM, et al (1998) "Misidentification of unusual Aeromonas species as members of the genus Vibrio: a continuing problem." Journal of Clinical Microbiology 36(4): 1103-1104. Abdel-Latif, HM, Khalil RH, Saad TT, El-Bably RY (2014) Identification and molecular characterization of Yersinia ruckeri isolated from mass mortalities of cultured Nile tilapia at Kafr El-sheikh governorate. Global Journal of Fisheries and Aquaculture Researches 1(2), 01-17. 89 Abu‐Elala N, Abdelsalam M, Marouf S, Setta A (2015) Comparative analysis of virulence genes, antibiotic resistance and gyrB‐based phylogeny of motile Aeromonas species isolates from Nile tilapia and domestic fowl. Letters in applied microbiology 61(5), 429-436. Adekambi T, Shinnick TM, Raoult D, Drancourt M, (2008) Complete rpoB gene sequencing as a suitable supplement to DNA–DNA hybridization for bacterial species and genus delineation. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 58(8), pp.1807-1814. Aguado-Urda M, Rodriguez-Bertos A, Ana I, Blanco MM, Acosta F, Cid R, Gibello A (2014) Experimental Lactococcus garvieae infection in zebrafish and first evidence of its ability to invade non-phagocytic cells. Veterinary microbiology 171(1), 248-254. Akaylı T, Çanak O and Başaran B (2011) Gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) görülen Aeromonas schubertii enfeksiyonu üzerine bir çalışma. Biyoloji Bilimleri Araştırma Dergisi, 4(1): 99- 106 Akinbowale OL, Peng H, Barton MD (2007) Diversity of tetracycline resistance genes in bacteria from aquaculture sources in Australia.“. In: Journal of applied microbiology. 103 (5), pp. 2016-25. Akova SB (2015). Aquaculture And Its Distribution In Turkey. Population (billions), 6(6.5), pp.7-1. Aksoy S (2009) Bir gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) üretim tesisinde (Elazig) görülen motil Aeromonas septisemi. In: Ulusal Su Ürünleri Sempozyumu, Rize. Alcaide E, Blasco MD, Esteve C (2005) Occurrence of drug-resistant bacteria in two European eel farms. Appl Environ Microbiol 71: 3348–3350. Alim SR, Kawai K, Kusuda R (1996) Comparative pathogenicity study on antigenically variant strains of Enterococcus seriolicida. J Fish Dis 19:39–46. Alperi A, Figueras MJ, Inza I, Martinez-Murcia AJ (2008) Analysis of 16S rRNA gene mutations in a subset of Aeromonas strains and their impact in species delineation. Int. Microbiol. 11:185–194. Alperi A, Martinez-Murcia AJ, Ko WC, Monera A, Saavedra MJ, Figueras MJ (2010b) Aeromonas taiwanensis sp. nov. and Aeromonas sanarellii sp. nov., clinical species from Taiwan. Int J Syst Evol Microbiol 60(Pt 9):2048e55. Alperi A, Martinez-Murcia AJ, Monera A, Saavedra MJ, Figueras MJ (2010a) Aeromonas fluvialis sp. nov., isolated from a Spanish river. Int J Syst Evol Microbiol 60(Pt 1):72e7. Altinok I, Capkin E, Boran H (2016) Comparison of molecular and biochemical heterogeneity of Yersinia ruckeri strains isolated from Turkey and the USA. Aquaculture, 450, 80-88. Altinok I, Grizzle JM, Liu Z (2001) Detection of Yersinia ruckeri in rainbow trout blood by use of the polymerase chain reaction. Dis Aquat Org 44:29–34 Altun S, Buyukekiz A, Onuk EE, Duman M and Ciftci A (2013b) Phenotypic, genotypic characterisation and antimicrobial susceptibility determination of Lactococcus garvieae strains. Kafkas Universitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 19 (3): 375-381. doi: 10.9775/kvfd.2012.7754 Altun S, Diler O, Adiloglu AK (2004) Genotyping of Lactococcus garvieae strains from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by 16S rDNA sequencing. Bulletın- European Assocıatıon Of Fısh Pathologısts 24(2), 119-125. 90 Altun S, Kubilay A and Diler O (2010) Yersinia ruckeri suslarının fenotipik ve serolojik özelliklerinin incelenmesi. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 16(1): 223-229 Altun S, Onuk EE, Ciftci A, Duman M, Büyükekı̇z AG (2013a) Determination of Phenotypic, Serotypic and Genetic Diversity and Antibiotyping of Yersinia ruckeri Isolated from Rainbow Trout. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 19(2), pp.225-232. Altwegg M, Martinetti Lucchini G, Lüthy-Hottenstein J, Rohrbach M (1991) Aeromonas-associated gastroenteritis after consumption of contaminated shrimp. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 10(1), pp.44-45. Altwegg M, Steigerwalt AG, Altwegg-Bissig R, Luthy-Hottenstein J, Brenner DJ (1990) Biochemical identification of Aeromonas genospecies isolated from humans. J. Clin. Microbiol. 28:258–264. Amann S (2007) Untersuchung zur Klassifizierung, identifizierung und differenzierung von Yersinia Arten (Doctoral dissertation, uniwien). Angulo FJ and Griffin PM (2000) Changes in antimicrobial resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Emerg Infect Dis 6: 436–438 Angulo FJ, Nargund VN, Chiller TC (2004) Evidence of an association between use of anti-microbial agents in food animals and anti-microbial resistance among bacteria isolated from humans and the human health consequences of such resistance. J Vet Med 51: 374–379. Aravena-Roman M, Harnett GB, Riley TV, Inglis TJ, Chang BJ (2011) Aeromonas aquariorum is widely distributed in clinical and environmental specimens and can be misidentified as Aeromonas hydrophila. Journal of clinical microbiology, 49(8), 3006- 3008, 2011. Argenton F, De Mas S, Malocco C, Dalla Valle L, Giorgetti G, Colombo L (1996) Use of random DNA amplification to generate specific molecular probes for hybridization tests and PCR-based diagnosis of Yersinia ruckeri. Diseases of Aquatic Organisms, 24(2), pp.121-127. Arias CR, Olivares-Fuster O, Hayden K, Shoemaker CA, Grizzle JM, Klesius PH (2007) First report of Yersinia ruckeri biotype 2 in the U.S.A. J Aquat Anim Health 19:35–40 Ashbolt NJ, Ball A, Dorsch M ve ark (1995) "The identification of human health significance of environmental aeromonads." Water Science Technology 31(5-6): 263- 269. Austin B and Cross N (1998) Infection of pronephros cell cultures derived from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) with bacterial fish pathogens: a comparison with whole fish infectivity studies. Methods in cell science, 19(4), pp.317- 324. Austin B, and Austin DA (2016) Bacterial fish pathogens. 6. th edition. Springer International Publishing, Switzerland, pp: 21-82; 161-321; 323-396; 643-721. Avsever ML, Onuk EE, Turk N, Tunaligil S, Eskiizmirliler S, Incoglu S and Yabanli M (2012) Pasteurellosis cases in sea bass and sea bream cultured in the Aegean region and other bacteria isolated from these cases. Bornova Veteriner Kontrol ve Arastırma Enstitüsü Dergisi, 34(48): 9-16. Awan MB, Ahmed MM, Bari A, Saad AM (2005) Biochemical characterization of the Aeromonas species isolated from food and environment. Pak J Physiol 1(1-2). 91 Balta F, Svealli C, Kayis S, Ozgumus OB (2010) Molecular analysis of antimicrobial resistance in Yersinia ruckeri strains isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) grown in commercial fish farms in Turkey. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 30(6), 211-219. Baran I, Timur M, Aydın N, İstanbulluoğlu E and Aydintuğ MK (1980) Çifteler- Sakaryabaşı balık üretim ve araştırma istasyonunda, alabalıklarda (Salmo gairdneri) görülen bakteriyel hemorajik septisemi hastalığı üzerine incelemeler. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 27(1): 467-473 Barton BA and Iwama GK (1991) Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids. Annu Rev Fish Dis 1:3-26 Bastardo A, Bohle H, Ravelo C, Toranzo AE, Romalde JL (2011) Serological and molecular heterogeneity among Yersinia ruckeri strains isolated from farmed Atlantic salmon Salmo salar in Chile. Dis Aquat Organ 93:207–214 Bastardo A, Ravelo C, Romalde JL (2012) Multilocus sequence typing reveals high genetic diversity and epidemic population structure for the fish pathogen Yersinia ruckeri. Environ Microbiol 14:1888–1897 Beaz-Hidalgo R, Alperi A, Figueras MJ ve ark (2009). "Aeromonas piscicola sp. nov., isolated from diseased fish." Systematic ve Applied Microbiology 32: 471-479. Beaz-Hidalgo R; Magi GE; Balboa S; Barja JL, Romalde JL (2008) Development of a PCR protocol for the detection of Aeromonas salmonicida in fish by amplification of the fstA (ferric siderophore receptor) gene. Veterinary Microbiology 128, pp. 386-394. Berc A, Mata E, Kozariae Z, Petrinec-kozariae Z (1999) Yersinia ruckeri septicemia in experimentally infected carp (Cyprinus carpio L.) fingerlings. Acta Veterinaria Hungarica (47): 161-172. Bercovier H, Ghittino C, Eldar A (1997) Immunization with bacterial antigens: infection with streptococci and related organisms. Dev Biol Stand 90:153–60. Birkbeck TH, Feist SW, Verner-Jeffreys DW (2011) Francisella infections in fish and shellfish. Journal of Fish Diseases 34:173–87. Bolton LF, Kelley LC, Lee MD, Fedorka-Cray PJ, Maurer JJ (1999) Detection of multidrug-resistant Salmonella enterica serotype Typhimurium DT104 based on a gene which confers cross-resistance to florfenicol and chloramphenicol. J Clin Microbiol 37: 1348–1351. Boran H, Terzi E, Altinok I, Capkin E and Bascinar N (2013) Bacterial diseases of cultured mediterranean Horse mackerel (Trachurus mediterraneus) in sea cages. Aquaculture, 396: 8-13. Boxall AB, Fogg LA, Blackwell PA, Kay P, Pemberton EJ and Croxford A (2004) Veterinary medicines in the environment. Rev Environ Contam Toxicol 180: 1–91. Bragg RR, Henton MM (1986) Isolation of Yersinia ruckeri from rainbow trout in South Africa. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 6(1), pp.5-6. Briggs CE and Fratamico PM (1999) Molecular characterization of an antibiotic resistance gene cluster of Salmonella Typhimurium DT104. Antimicrob Agents Chemother 43: 846–849. Brooker AJ, Shinn AP, Bron JE (2007) A review of the biology of the parasitic copepod Lernaeocera branchialis (L., 1767) (Copepoda: Pennellidae). Advances in Parasitology 65:297–341. Buller NB (2004) Bacteria from fish and other aquatic animals: a practical identification manual. CABI Publishing, Wallingford 92 Bullock GL and Snieszko SF (1975) Hagerman redmouth, a disease of salmonids caused by a member of the Enterobacteriaceae (No. 42, pp. 0-5). US Fish and Wildlife Service. Burridge Les et al (2010) Chemical use in salmon aquaculture: A review of current practices and possible environmental effects“. In: Aquaculture. Elsevier B.V. 306 (1- 4), pp. 7-23. Busch RA (1982) Enteric redmouth disease (Yersinia ruckeri). in: Anderson DP, Dorson M, Dubourget P (ed.) Antigens of Fish Pathogens. Development and Production of Vaccines and Serodiagnostics. Lyon: Symposium International de Taloires. Busch RA, Lingg AJ (1975) Establishment of an asymptomatic carrier state infection of enteric redmouth disease in rainbow trout (Salmo gairdneri). J Fish Res Board Can 32:2429–2432 Cabello FC (2006) Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment. Environmental microbiology, 8(7), pp.1137-1144. Cabello, F.C., Godfrey, H.P., Tomova, A., Ivanova, L., Dölz, H., Millanao, A. and Buschmann, A.H., 2013. Antimicrobial use in aquaculture re‐examined: its relevance to antimicrobial resistance and to animal and human health. Environmental microbiology, 15(7), pp.1917-1942. Candan A, Kucuker MA and Karatas S (1995) Motile aeromonad septicaemia in Salmo salar cultured in the Black Sea in Turkey. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 15(6): 195-196. Cantas L, Shah SQ, Cavaco LM, Manaia CM, Walsh F, Popowska M, Garelick H, Bürgmann H, and Sørum H (2013) A brief multi-disciplinary review on antimicrobial resistance in medicine and its linkage to the global environmental microbiota. Frontiers in Microbiology, 4. Vancouver Capkin, E., Terzi, E., & Altinok, I. (2015). Occurrence of antibiotic resistance genes in culturable bacteria isolated from Turkish trout farms ve their local aquatic environment. Diseases of aquatic organisms, 114(2), 127-137. Carnahan AM (1993) Aeromonas taxonomy: a sea of change. Med. Microbiol. Lett. 2:206–211. Carpenter CF and Chambers HF (2004) Daptomycin: another novel agent for treating infections due to drug-resistant gram-positive pathogens. Clinical infectious diseases, 38(7), pp.994-1000. Carnahan AM, Behram S, Joseph SW (1991) Aerokey II: a flexible key for identifying clinical Aeromonas species. Journal of Clinical Microbiology, 29(12), pp.2843-2849. Carson J, Gudkovs N, Austin B (1993) Characteristics of an Enterococcus-like bacterium from Australia and South Africa, pathogenic for rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). J. Fish Dis., 6: 381-388. Carvalho MJ, Martínez-Murcia A, Esteves AC, Correia A, Saavedra MJ (2012) Phylogenetic diversity, antibiotic resistance and virulence traits of Aeromonas spp. fromuntreated waters for human consumption. Int J Food Microbiol 159:230–239. Caselitz FH (1996) How the Aeromonas story started in medical microbiology. Med Microbiol Lett 5:46e54. Chang BJ, Janda JM (2005) Chapter 59. Aeromonas, p. 1524–1540. In S. P. Borriello, P. R. Murray, and G. Funke (ed.), Topley & Wilson’s microbiology & microbial infections, 10th ed., vol. 2. Hodder Arnold, London,United Kingdom. 93 Chang PH, Lin CW, Lee YC (2002) Lactococcus garvieae infection of cultured rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, in Taiwan and associated biophysical characteristics and histopathology. Bull Eur Ass Fish Pathol 22:319–27. Chapman AL (2013) The Incidence of Antibiotic Resistance in Mesophilic Aeromonas Isolated from the Buffalo River and from a Non-Urban Site Upstream. Charpentier E, Gerbaud G, Courvalin P (1993) Characterization of a new class of tetracycline-resistance gene tet (S) in Listeria monocytogenes BM4210. Gene 131(1), 27-34. Chen J, Yu Z, Michel FC, Wittum T, Morrison M (2007) Development and application of real-time PCR assays for quantification of erm genes conferring resistance to macrolides-lincosamides-streptogramin B in livestock manure and manure management systems. Applied and Environmental Microbiology 73(14), 4407-4416. Chen PE, Cook C, Stewart AC, Nagarajan N, Sommer DD, Pop M, Thomason B, Thomason MP, Lentz S, Nolan N, Sozhamannan S, Sulakvelidze A, Mateczun A, Du L, Zwick ME, Read TD (2010) Genomic characterization of the Yersinia genus. Genome Biol 11:R1 Chen SC, Liaw LL, Su HY, Ko SC, Wu CY, Chaung HC, et al (2002) Lactococcus garvieae, a cause of disease in grey mullet, Mugil cephalus L., in Taiwan. J Fish Dis 25:727–32. Chen SC, Lin YD, Liaw LL, Wang PC (2001) Lactococcus garvieae infection in the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii confirmed by polymerase chain reaction and 16S rDNA sequencing. Dis Aquat Org 45:45–52. Cheng AC, Turnidge J, Collignon P, Looke D, Barton M, Gottlieb T (2012) Control of fluoroquinolone resistance through successful regulation, Australia. Emerg Infect Dis 18:1453–1460. Cheng W, Chen JC (1998) Isolation and characterization of an Enterococcus-like bacterium causing muscle necrosis and mortality in Macrobrachium rosenbergii in Taiwan. Dis Aquat Org;34:93–101. Chopra I, Roberts M (2001) Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and molecular biology reviews, 65(2), pp.232-260. CLSI (2014a). Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated from Aquatic Animals, Approved Guideline VET04-A2. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. CLSI (2014b) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacteria Isolated from Aquatic Animals; Second Informational Supplement. CLSI document VET03/04-S2. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. Collins MD, Farrow JA, Phillips BA, Kandler O (1983) Streptococcus garvieae sp. nov. and Streptococcus plantarum sp. nov. Journal of General Microbiology 129, 3427–3431. Colorni A, Ravelo C, Romalde JL, Toranzo AE, Diamant A (2003) Lactococcus garvieae in wild Red Sea wrasse Coris aygula (Labridae). Dis Aquat Org 56:275–8. Colwell RR, MacDonell MT, De Ley J (1986) Proposal to recognize the family Aeromonadaceae fam. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 36:473–477. Coquet L, Cosette P, Junter GA, Beucher E, Saiter JM, Jouenne T (2002) Adhesion of Yersinia ruckeri to fish farm materials: influence of cell and material surface properties. Colloids Surf B: Biointerfaces 26:373–378 94 Coyne R, Hiney M, Smith P (1997) Transient presence of oxytetracycline in blue mussels (Mytilus edulis) following its therapeutic use at a marine Atlantic salmon farm. Aquaculture 149: 175–181. Çagirgan H and Yüreklitürk O (1991) First isolation of Yersinia ruckeri from rainbow trout farm in Turkey. In. In The Fifth Conference of Eafp, Disease of Fish and Shellfish pp. 24-29. D'Aloia MA, Bailey TA, Samour JH, Naldo J, Howlett JC (1996) Bacterial flora of captive houbara (Chlamydotis undulata), kori (Ardeotis kori) and rufous‐crested (Eupodotis ruficrista) bustards. Avian Pathology, 25(3), pp.459-468. Dang HT, Park HK, Myung SC, Kim W (2012) Development of a novel PCR assay based on the 16S–23S rRNA internal transcribed spacer region for the detection of Lactococcus garvieae. Journal of fish diseases 35(7), pp.481-487. Danley ML, Goodwin AE, Killian HS (1999) Epizootics in farm-raised channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque), caused by the enteric redmouth bacterium Yersinia ruckeri. Journal of Fish Diseases, (22): 451- 456. Dauphin LA, Stephens KW, Eufinger SC, Bowen MD (2010) Comparison of five commercial DNA extraction kits for the recovery of Yersinia pestis DNA from bacterial suspensions and spiked environmental samples. Journal of applied microbiology, 108(1), 163-172. Davies RL (1990) O-serotyping of Yersinia ruckeri with special emphasis on European isolates. Veterinary Microbiology 22, 299–307. Dear G (1988) Yersinia ruckeri isolated from Atlantic salmon in Scotland. Bull. Euro. Ass. Fish Pathol. 8, 18–20. Diler O, Altun S, Adiloglu A, Kubik A and Isikli BT (2002) First occurrence of streptococcosis affecting farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Turkey. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 22 (1): 21 Domenech A, Prieta J, Fernandez-Garayzaabal J, Collins MD, Jones D, Domınguez L (1993) Phenotypic and phylogenetic evidence for a close relationship between Lactococcus garvieae and Enterococcus seriolicida. Microbiologia (SEM) 9:63–68. Duman M, Altun S, Cengiz M, Saticioglu IB, Buyukekiz AG, Sahinturk P (2017). Genotyping and antimicrobial resistance genes of Yersinia ruckeri isolates from rainbow trout farms. Disease of Aquatic Organism. DOI: https://doi.org/10.3354/dao03132. Duman M, Saticioglu IB, Buyukekiz AG, Balta F, Altun S (2017). Molecular Characterization and Antimicrobial Resistance Profile of Atypical Citrobacter gillenii and Citrobacter sp. isolated from diseased rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Global Antimicrobial Resistance. In press. Durmaz Y ve Türk N (2009) Alabalık işletmelerinden motil aeromonasların izolasyonu ve antibiyotiklere duyarlılıklarının saptanması. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 15 (3): 357-361 Edberg SC, Browne FA ve Allen M (2007) "Issues for microbial regulation: Aeromonas as a model." Critical Reviews in Microbiology 33: 89-100. Eldar A, Bejerano Y, Livoff A, Horovitcz A, Bercovier H (1995) Experimental streptococcal meningoencephalitis in cultured fish. Vet Microbiol 43:33–40. Eldar AC, Ghittino C, Asanta L, Bvozzettz E, Goria M (1996) Enterococcus seriolicida is a junior synonym of Lactococcus garvieae, a causative agent of septicemia and meningoencephalitis in fish. Curr Microbiol 32:85–88 95 Elliot JA, Collins MD, Pigott NE, Facklam RR (1991) Differentiation of Lactococcus lactis and Lactococcus garvieae from humans by comparison of whole-cell protein patterns. J Clin Microbiol 20:2731–4. Evangelista-Barreto NS, Carvalho FCTD, Vieira RHS, dos Reis CMF, Macrae A, Rodrigues DDP (2010). Characterization of Aeromonas species isolated from an estuarine environment. Brazilian Journal of Microbiology, 41(2), 452-460. Evans JJ, Pasnik DJ, Klesius PH, Al-Ablani S (2006) First report of Streptococcus agalactiae and Lactococcus garvieae from a wild bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Journal of wildlife diseases, 42(3), 561-569. Evenhuis JP, LaPatra SE, Verner-Jeffreys DW, Dalsgaard I, Welch TJ (2009) Identification of flagellar motility genes in Yersinia ruckeri by transposon mutagenesis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 6630–6633. Ewing WH, Hugh R, Johnson JG (1961) Studies on the Aeromonas group. U.S. Department of Health and Human Services, Atlanta, GA. Ewing WH, Ross AJ, Brenner DJ, Fanning GR (1978) Yersinia ruckeri sp. nov., the red mouth (RM) bacterium. International Journal of Systemic Bacteriology, (28): 37- 44. Eyngor M, Zlotkin A, Ghittino C, Prearo M, Douet DG, Chilmonczyk S, et al (2004) Clonality and diversity of the fish pathogen Lactococcus garvieae in Mediterranean countries. Appl Environ Microbiol 70:5132–7. Fadaeifard F, Momtaz H, Rahimi E, Mirzakhani A (2014) Detection of Streptococcus iniae and Lactococcus garvieae by multiplex polymerase chain reaction (PCR) in some rainbow trout farms of Iran. African Journal of Biotechnology 11(2), 260-263 Faisal M, Popp W, Refai M (1989) Aeromonas hydrophila-related septicemia in the Nile tilapia Oreochromis niloticus. Berliner und Mu¨nchener Tiera¨rztliche Wochenschrift 102:87–93. Fang HM, Ge R, Sin YM (2004) Cloning, characterisation and expression of Aeromonas hydrophila major adhesin. Fish and Shellfish Immunology 16:645–58. Fao (2014) The state of the world fisheries and aquaculture 2014. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Fisheries and Aquaculture Department, Rome. 223p Fao F (2012). Yearbook 2010: Fishery and Aquaculture Statistics. Food and Agriculture Organisation of the United Nations Rome, 78. Fao. (2015) Food and Agricultural Organisation. Statistics. http://www.fao.org Farmer JJ 3rd, Davis BR, Hickman-Brenner FW, McWhorter A, Huntley-Carter GP, Asbury MA, Riddle C, Wathen-Grady HG, Elias C, Fanning GR (1985) Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J Clin Microbiol 21:46–76 Fefer JJ, Ratzan KR, Sharp SE, Saiz E (1998) Lactococcus garvieae endocarditis: report of a case and review of the literature. Diagn Microbiol Infect Dis 32:127–30. Fernandez E, Alegrıa A, Delgado S, Mayo B (2010) Phenotypic, genetic and technological characterization of Lactococcus garvieae strains isolated from a raw milk cheese. Int Dairy J 20: 142–148. Ferrario C (2012) Lactococcus garvieae and Morganella morganii: two bacterial models to study quality and safety of fish products. Scientific field AGR/16. PhD programme in Food Science. Technology and Biotechnology, Universita degli studi di Milano. 96 Ferrario C, Ricci G, Borgo F, Rollando A, Fortina MG (2012) Genetic investigation within Lactococcus garvieae revealed two genomic lineages. FEMS microbiology letters 332(2), 153-161. Figueira V, Vaz-Moreira I, Silva M, and Manaia CM (2011) Diversity and antibiotic resistance of Aeromonas spp. in drinking and waste water treatment plants. Water research, 45(17), pp.5599-5611. Figueras MJ (2005) Clinical relevance of Aeromonas. Reviews in Medical Microbiology 16, pp. 145-153. Figueras MJ, Beaz-Hidalgo R, Collado L, Martínez-Murcia AJ (2011a). Recommendations for a new bacterial species description based on analysis of the unrelated genera Aeromonas and Arcobacter. Bull Bergey’s Int Soc Microb Syst 2, 1– 16. Figueras MJ; Beaz-Hidalgo R; Collado L, Martínez-Murcia AJ (2011b) Point of view on the recomendations for new bacterial species description ve their impact on the genus Aeromonas and Arcobacter. The Bulletin of Bergey´s International Society for Microbial Systematics 2, part 1, pp. 1-16. Fihman V, Raskine L, Barron Z, Kiffel C, Riahi J, Berc-ot B, et al (2006) Lactococcus garvieae endocarditis: identification by 16S rRNA and sodA sequence analysis. J Infect 52:e3–6. Foschino R, Nucera D, Volponi G, Picozzi C, Ortoffi M, Bottero MT (2008) Comparison of Lactococcus garvieae strains isolated in northern Italy from dairy products and fishes through molecular typing. Journal of applied microbiology 105(3), pp.652-662. Foschino R, Picozzi C, Borghi M, Cerliani MC, Cresci E (2006) Investigation on the microflora of Caprino Lombardo cheese from raw goat milk. Ital J Food Sci 18: 33– 49. Frans I, Michiels CW, Bossier P, Willems KA, Lievens B, Rediers H (2011) Vibrio anguillarum as a fish pathogen: virulence factors, diagnosis and prevention. Journal of Fish Diseases 34:643–61. Frech G and Schwarz S (2000) Molecular analysis of tetracycline resistance in Salmonella enterica subsp. enterica serovars Typhimurium, Enteritidis, Dublin, Choleraesuis, Hadar and Saintpaul: construction and application of specific gene probes. Journal of applied microbiology 89(4), 633-641. Freij BJ (1984) "Aeromonas: biology of the organism ve diseases in children." Pediatric Infectious Disease 3(2): 164-174. Frerichs GN (1993) Isolation and identification of fish bacterial pathogens. In: Bacterial Diseases of Fish (ed. by V. Inglis, R.J. Roberts & N.R. Bromage), Blackwell Scientific Publications, Oxford.pp. 270–272. Frerichs GN and Collins RO (1984) Enteric redmouth disease in Scotland. Veterinary Record 115(2), pp.45-46. Fuhrmann H, Bohm KH, Schlotfeldt HJ (1983) An outbreak of enteric redmouth disease in West Germany. Journal of Fish Diseases 6, 309-311. Gao P, Mao D, Luo Y, Wang L, Xu B, Xu L (2012) Occurrence of sulfonamide and tetracycline-resistant bacteria and resistance genes in aquaculture environment. Water Research 46(7), 2355-2364. Ghenghesh KS, Abeid SS, Jaber MM, Ben-Taher SA (1999) Isolation and haemolytic activity of Aeromonas species from domestic dogs and cats. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 22(3), pp.175-179. 97 Ghenghesh KS, Ahmed SF, El-Khalek RA, Al-Gendy A, Klena J (2008) Aeromonas- associated infections in developing countries. The Journal of Infection in Developing Countries, 2(02), pp.081-098. Ghittino C, Muzquiz JL (1998) La estreptococosis de la trucha arco iris en Espana. Reunion de Piscicultores. Zaragoza. Rev Aquatic 2. Ghittino P and Prearo M (1992) Report of Streptococcosis in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Italy: preliminary note. Boll. Soc. Ital. Pathol. Ittica 8: 4-9. Gibello A, Blanco MM, Moreno MA, Cutuli MT, Domenech A, Dominguez L, Fernandez-Garayzabal JF (1999) Development of a PCR assay for detection of Yersinia ruckeri in tissues of inoculated and naturally infected trout. Applied and Environmental Microbiology 65, 346-350. Giorgetti G, Ceschia G, Bovo G (1985) First isolation of Yersinia ruckeri in farmed rainbow trout in Italy, pp 161-166 In: Ellis, A. E (eds.). Fish and Shellfish Pathology. Academic Press, London. Girlich D, Poirel L, Nordmann P (2010) PER-6, an extended-spectrum beta-lactamase from Aeromonas allosaccharophila. Antimicrob Agents Chemother 54:1619–1622. doi:10.1128/AAC.01585-09 Girlich D, Poirel L, Nordmann P (2011) Diversity of clavulanic acidinhibited extended-spectrum β-lactamases in Aeromonas spp. from the Seine River, Paris, France. Antimicrob Agents Chemother 55: 1256–1261. doi:10.1128/AAC.00921-10 Glenn RA, Taylor PW, Pelton EH, Gutenberger SK, Ahrens MA, Marchant LM, Hanson KC (2014) Genetic evidence of vertical transmission and cycling of Yersinia ruckeri in hatchery-origin fall chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha. J Fish Wildl Manage 5:197 Gomez C (2009) Estudio cualitativo y cuantitativo de las tetraciclinas y fenicoles importadas y autorizadas para uso y disposición en medicina y en veterinaria en Chile, en el período 2002-2005. Consideraciones sobre su impacto para la salud pública y el medio ambiente. [Qualitative and Quantitative Study of Tetracyclines and Phenicols Imported and Authorized for Veterinary and Medical Use in Chile, 2000-2007. Considerations of Its Impact on Public Health and the Environment]. Valdivia, Chile: Tesis de Grado, Escuela de Química y Farmacia, Universidad Austral de Chile. [WWW document]. URL http://cybertesis.uach.cl/ tesis/uach/2009/fcg633e/doc/fcg633e.pdf. Gomez-Casado E, Estepa A, Coll JM (2011) A comparative review on European- farmed finfish RNA viruses and their vaccines. Vaccine 29:2657–71. Goni-Urriza M, Capdepuy M, Arpin C, Raymond N, Caumette P, Quentin C (2000a) Impact of an Urban Effluent on Antibiotic Resistance of Riverine Enterobacteriaceae and Aeromonas spp. Applied and environmental Microbiology, 66(1), pp.125-132. Goni-Urriza M, Pineau L, Capdepuy M, Roques C, Caumette P, Quentin C (2000b) Antimicrobial resistance of mesophilic Aeromonas spp. isolated from two European rivers. Journal of Antimicrobial Chemotherapy,46(2), pp.297-301. Goodwin CS, Harper WES, Stewart JK ve ark (1983) "Enterotoxigenic Aeromonas hydrophila ve diarrhea in adults " Medical Journal of Australia 1: 25-26. Gordon L, Giraud E, Ganière JP, Armand F, Bouju‐Albert A, De La Cotte N, Mangion C, Le Bris H (2007) Antimicrobial resistance survey in a river receiving effluents from freshwater fish farms. Journal of applied microbiology 102(4), pp.1167-1176. 98 Graslund S, Holmstrom K, Wahlstrom A (2003) A field survey of chemicals and biological products used in shrimp farming. Marine Pollution Bulletin, 46(1), pp.81- 90. Grave K, Markestad A, Bangen M (1996) Comparison in prescribing patterns of antibacterial drugs in salmonid farming in Norway during the periods 1980– 1988 and 1989–1994. J Vet Pharmacol Therap 19: 184– 191. Greenspoon SA, Scarpetta MA, Drayton ML, Turek SA (1998) QIAamp Spin Columns as a Method of DNA Isolation for Forensic Casework. Journal of forensic sciences 43, 1024-1030. Guardabassi L, Dalsgaard A, Raffatellu M, Olsen JE (2000a) Increase in the prevalence of oxolinic acid resistant Acinetobacter spp. observed in a stream receiving the effluent from a freshwater trout farm following the treatment with oxolinic acid- medicated feed. Aquaculture 188: 205–218. Guardabassi L, Dijkshoorn L, Collard JM, Olsen JE, Dalsgaard A (2000b) Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. Journal of Medical Microbiology 49(10), 929-936. Guo FC and Woo PT (2009) Selected parasitosis in cultured and wild fish. Veterinary Parasitology 163(3, Special Issue):207–16. Han JE, Kim JH, Choresca CH Jr, Shin SP, Jun JW, Chai JY, Park SC (2012) First description of ColE-type plasmid in Aeromonas spp. carrying quinolone resistance (qnrS2) gene. Lett ApplMicrobiol 55: 290–294. Hanninen ML (1994) "Phenotypic characteristics of the three hybridization groups of Aeromonas hydrophila complex isolated from different sources." Journal of Applied Bacteriology 76: 455-462. Hänninen ML, Oivanen P, Hirvelä-Koski V (1997) Aeromonas species in fish, fish- eggs, shrimp and freshwater. International Journal of Food Microbiology, 34(1), pp.17-26. Hanninen ML, Salmi S.and Siitonen A (1995) "Maximum growth temperature ranges of Aeromonas spp. isolated from clinical ve environmental sources." Microbial Ecology 29: 259-267. Haya K, Burridge LE and Chang BD (2001) Environment impact of chemical wastes produced by the salmon aquaculture industry. Ices J Mar Sci 58: 492–496. Hektoen H, Berge JA, Hormazabal V, Yndestad M (1995) Persistence of antibacterial agents in marine sediments. Aquaculture 133: 175–184. Hidalgo RB and Figueras MJ (2012) Molecular detection and characterization of furunculosis and other Aeromonas fish infections. INTECH Open Access Publisher. Hietala J, Valtonen ET, Aaltonen T (1995) Experimental infection of brown trout, Salmo trutta L., using a Finnish Yersinia ruckeri isolate. Aquaculture 136(1), pp.11- 20. Higgins M, Carson J, Gudkovs N (2007) "Development of an improved identification matrix for Aeromonas salmonicida." World Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians. 13th International Symposium, Melbourne, Australia. Concurrent Session 2.2. Hirono I, Aoki T (2001) Characterization of structure and genes of R Plasmid from fish-pathogenic Lactococcus garvieae. Proc Jpn Soc Antimicrob Anim 23, 22–24 (in Japanese). Holmström K, Gräslund S, Wahlström A, Poungshompoo S, Bengtsson BE, Kautsky N (2003) Antibiotic use in shrimp farming and implications for environmental impacts 99 and human health. International journal of food science & technology, 38(3), pp.255- 266. Holt GJ (1994) Aeromonas. In: Bergey’s Manual of determinative Bacteriology. 9th ed. p. 190e1. Holten Lützhøft HC, Halling-Sørensen B, Jørgensen SE (1999) Algal toxicity of antibacterial agents applied in Danish fish farming. Arch Environ Contam Toxicol 36: 1– 6. Huang Y (2013) Epidemiological Study on Yersinia ruckeri Isolates from Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) in North West Germany., University of Veterinary Medicine Hannover Institute of Parasitology Fish Disease Research Unit., Hannover, Germany, pHD thesis Huang Y, Runge M, Michael GB, Schwarz S, Jung A, Steinhagen D (2013) Biochemical and molecular heterogeneity among isolates of Yersinia ruckeri from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) in North West Germany. BMC Vet Res 9:215 Huddleston JR, Zak JC, Jeter RM (2006) "Antimicrobial susceptibilities of Aeromonas spp. isolated from environmental sources." Applied and Environmental Microbiology 72(11): 7036-7042. Hunter PR and Gaston MA (1988) Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity. J Clin Microbiol 26:2465–2466 Huys G, Kersters I, Vancanneyt M ve ark (1995) "Diversity of Aeromonas sp. in Flemish drinking water production plants as determined by gas-liquid chromatographic analysis of cellular fatty acid methyl esters (FAMEs)." Journal of Applied Bacteriology 78: 445-455. Igbinosa IH, Okoh AI (2012) Antibiotic susceptibility profile of Aeromonas species isolated from wastewater treatment plant. The Scientific World Journal, 2012. Ishida Y, Ahmed AM, Mahfouz NB, Kimura T, El-Khodery SA, Moawad AA, Shimamoto T (2010) Molecular analysis of antimicrobial resistance in gram-negative bacteria isolated from fish farms in Egypt. J Vet Med Sci 72:727–734 Itami T, Kondo M, Suganuma A, Abe T, Nakagawa A, Suzuki N, et al (1996) Enhancement of resistance aganinst Enterococcus seriolicida infection in yellowtail, Seriola quinqueradiata by oral administration of peptidoglycan derived from Bifidobacterium thermophilum. J Fish Dis 19:185–7. Jacobs JM, Stine CB, Baya AM, Kent ML (2009) A review of mycobacteriosis in marine fish. Journal of Fish Diseases 32:119–30. Jacobs L and Chenia HY (2007) Characterization of Integrons and Tetracycline Resistance Determinants in Aeromonas Species Isolated from South African Aquaculture Systems. International Journal of Food Microbiology, 114, 295–306 James PR, Hardman S, Patterson D (2000) Osteomyelitis and possible endocarditis secondary to Lactococcus garvieae: a first case report. Postgrad Med J 76:301–3. Janda JM (2001) Aeromonas and Plesiomonas, p. 1237–1270. In M. Sussman (ed.), Molecular medical microbiology, Academic Press, London, England. Janda JM and Abbott SL (1998) "Evolving concepts regarding the genus Aeromonas: an expanding panorama of species, disease presentations, and unanswered questions." Clinical Infectious Diseases 27: 332-344. 100 Janda JM and Abbott SL (2007) 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J. Clin. Microbiol. 45:2761– 2764. Janda JM and Abbott SL (2010) The genus Aeromonas: taxonomy, pathogenicity, and infection. Clin Microbiol Rev 23(1):35e73. Janda JM ve Motyl MR (1985) "Cephalothin susceptibility as a potential marker for the Aeromonas sobria group." Journal of Clinical Microbiology 22(5): 854-855. Jennings S, Stentiford GD, Leocadio AM, Jeffery KR, Metcalfe JD, Katsiadaki I, Auchterlonie NA, Mangi SC, Pinnegar JK, Ellis T and Peeler EJ (2016) Aquatic food security: insights into challenges and solutions from an analysis of interactions between fisheries, aquaculture, food safety, human health, fish and human welfare, economy and environment. Fish and Fisheries. Joseph SW and Carnahan A (1994) The isolation, identification, and systematics of the motile Aeromonas species. Annual Review of Fish Diseases, 4, pp.315-343. Kahlmeter G, Brown DFJ, Goldstein FW, Macgowan AP, Mouton JW, Odenholt I, Stetsiouk O (2006) European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) technical notes on antimicrobial susceptibility testing. Clinical Microbiology and Infection 12(6), 501-503. Kang S, Shin G, Shin Y, Palaksha KJ, Kim Y, Yang H, et al (2004) Experimental evaluation of pathogenicity of Lactococcus garvieae in black rockfish (Sebastes schlegeli). J Vet Sci 5(4):387–90. Karataş S (1996) Salmo salar larda bağırsak florasından Aeromonas cinsi bakterilerin izolasyonu MSc Thesis İstanbul: İstanbul University Karem KL, Foster JW, Bej AK (1994) "Adaptive acid tolerance response (ATR) in Aeromonas hydrophila. " Microbiology 140: 1731-1736. Katao H (1982) Erithromycin: the application to streptococcal infections in yellowtails. Fish Pathol 17:77–82. Kawanishi A, Kojima A, Ishihara K, Esaki H, Kijima M, Takahashi T, et al (2005) Drug resistance and pulsed-field gel electrophoresis patterns of Lactococcus garvieae isolates from cultured Seriola (yellowtail, amberjack and kingfish) in Japan. Lett Appl Microbiol 40:322–8. Kawanishi M, Yoshida T, Kijima M, Yagyu K, Nakai T, Okada S, Endo A, Murakami M, Suzuki S, Morita H (2007) Characterization of Lactococcus garvieae isolated from radish and broccoli sprout that exhibited a KG phenotype, lack of virulence and absence of a capsule. Lett Appl Microbiol 44: 481–487. Kerry J, Coyne R, Gilroy D, Hiney M, Smith P (1996) Spatial distribution of oxytetracycline and elevated frequencies of oxytetracycline resistance in sediments beneath a marine salmon farm following oxytetracycline therapy. Aquaculture 145: 31–39. Kim EH and Aoki T (1993) Drug resistance and broad geographical distribution of identical R plasmids of Pasteurella piscicida isolated from cultured yellowtail in Japan. Microbiol Immunol 37: 103–109. Kim JH, Hwang SY, Son JS, Han JE, Jun JW, Shin SP, Choresca C Jr, Choi YJ, Park YH, Park SC (2011) Molecular characterization of tetracycline- and quinolone- resistant Aeromonas salmonicida isolated in Korea. J Vet Sci 12:41–48 Kitao T, Aoki T, Iwata K (1979) Epidemiological study on streptococcosis of cultured yellowtail. Distribution of Streptococcus spp. In sea water and muds around yellowtails farms. Bull Jpn Soc Sci Fish 45:567–72. 101 Klesius PH and Pridgeon JW (2011) Live attenuated bacterial vaccines in aquaculture. In: Proceedings of the 9th International Symposium on Tilapia in Aquaculture p. 18– 26. Klontz GW and Huddleston TR (1976) Control of Enteric Redmouth Disease. A Twelve Month Activity Report on Contract 10690004 DEMO-1014. Moscow, Idaho. Enteric Redmouth Disease 475. Kluyver AJ, van Niel CB (1936) Prospects for a natural system of classification of bacteria. Zentralblatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene, 94, pp.369-403. Knochel S (1989) Effect of temperature on hemolysin production in Aeromonas spp. isolated from warm and cold environments. International journal of food microbiology, 9(3), pp.225-235. Korun J and Toprak HB (2010) Kültürü yapılan gökkuşağı alabalıkları (Oncorhynchus mykiss)’nin bağırsağından izole edilen hareketli Aeromonas suşlarının antibiyotik hassasiyetleri üzerine NACl’un etkisi. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 16(2): 193-198 Kubilay A, Altun S, Ulukoy G and Diler O (2005) Lactococcus garvieae suşlarının antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesi. Eğirdir Su Ürünleri Fakültesi Dergisi, 1(1): 39-48 Kubota H, Tsuji H, Matsuda K, Kurakawa T, Asahara T, Nomoto K (2010) Detection of human intestinal catalase-negative, Gram-positive cocci by rRNA-targeted reverse transcription-PCR. Applied and environmental microbiology, 76(16), pp.5440-5451. Kuhn I, Albert MJ, Ansaruzzaman M ve ark (1997a) "Characterisation of Aeromonas spp. isolated from humans with diarrhoea, from healthy controls ve from surface water in Bangladesh." Journal of Clinical Microbiology 35(2): 369-373. Kuhn I, Allestam G, Huys G ve ark (1997b) "Diversity, persistence ve virulence of Aeromonas strains isolated from drinking water distribution systems in Sweden." Applied ve Environmental Microbiology 63(7): 2708-2715. Kumar G, Menanteau-Ledouble S, Saleh M, and El-Matbouli M (2015) Yersinia ruckeri, the causative agent of enteric redmouth disease in fish. Veterinary research, 46(1), p.103. Kumarasamy KK, Toleman MA, Walsh TR, Bagaria J, Butt F, Balakrishnan R, Chaudhary U, Doumith M, Giske CG, Irfan S, Krishnan P (2010) Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study. The Lancet infectious diseases, 10(9), pp.597- 602. Kummerer K (2003) Significance of antibiotics in the environment. J Antimicrob Chemother 52: 5–7. Kupfer M, Kuhnert P, Korczak BM, Peduzzi R, Demarta A (2006) Genetic relationships of Aeromonas strains inferred from 16S rRNA, gyrB and rpoB gene sequences. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56:2743–2751. Kusuda K, Kawai K, Salati F, Banner CR, Fryer JL (1991) Enterococcus seriolicida sp. nov., a fish pathogen. Int. J. Syst. Bacteriol 41: 406-409. L’Abee-Lund TM, Sorum H (2001) Class 1 integrons mediate antibiotic resistance in the fish pathogen Aeromonas salmonicida worldwide. Microb Drug Resist 7: 263–272 Lamy B, Laurent F, Verdier I, Decousser JW, Lecaillon E, Marchandin H, Roger F, Tigaud S, de Montclos H, Kodjo A, colBVH Study Group (2010) Accuracy of 6 102 commercial systems for identifying clinical Aeromonas isolates. Diagnostic microbiology and infectious disease, 67(1), pp.9-14 Lee DC, Lee JI, Park CI, Park SI (2001) The study on the causal agent of streptococcosis (Lactococcus garvieae), isolated from cultured marine fish. J Fish Pathol 14:71–80. Li J, Ni XD, Liu YJ, Lu CP (2011) Detection of three virulence genes alt, ahp and aerA in Aeromonas hydrophila and their relationship with actual virulence to zebrafish. Journal of applied microbiology, 110(3), pp.823-830. Llewellyn L (1980) A bacterium with similarities to the redmouth bacterium and Serratia liquefaciens (Grimes and Hennerty) causing mortalities in hatchery-reared salmonids in Australia. Journal of Fish Diseases 3, 29 - 39. Lorenz MG and Wackernagel W (1994) Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev 58:563–602. Lupo A, Coyne S, and Berendonk TU (2012) Origin and evolution of antibiotic resistance: the common mechanisms of emergence and spread in water bodies. Analyzing possible intersections in the resistome among human, animal and environment matrices, p.116. Maki T, Hirono I, Kondo H, Aoki T (2008) Drug resistance mechanism of the fish‐ pathogenic bacterium Lactococcus garvieae. Journal of fish diseases, 31(6), pp.461- 468. Mansour AM, Zaki HM, Hassan NA, El-Nashar NA (2014) Phenotyping, virulence characteristics of Aeromonas species and the effects of essential plant oils as antimicrobial agents against pathogenic isolates from different sources. American Journal of Infectious Diseases, 10(1), p.21. Markestad A and Grave K (1997) Reduction of antibacterial drug use in Norwegian fish farming due to vaccination. Fish Vaccinol 90: 365–369. Martin-Carnahan A and Joseph SW (2005) Genus I. Aeromonas. Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2nd ed. pp. 556e78. Martinez JL, Fajardo A, Garmendia L, Hernandez A, Linares JF, Martínez-Solano L, Sánchez MB (2009) A global view of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev 33:44–65. Martínez-Murcia A, Monera A, Alperi A, Figueras MJ, Saavedra MJ (2008a) Phylogenetic evidence suggests that strains of Aeromonas hydrophila subsp. dhakensis Martínez-Murcia AJ, Borrell N, Figueras MJ (2000) Typing of clinical and environmental Aeromonas veronii strains based on the 16S–23S rDNA spacers. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 28(3), pp.225-232. Martínez-Murcia AJ, Figueras MJ, Saavedra MJ, Stackebrandt E (2007) The recently proposed species Aeromonas sharmana sp. nov., isolate GPTSA-6T, is not a member of the genus Aeromonas. Int Microbiol 10:61-64 Martínez-Murcia AJ, Saavedra MJ, Mota VR, Maier T, Stackebrandt E, Cousin S (2008b) Aeromonas aquariorum sp. nov., isolated from aquaria of ornamental fish. Int J Syst Evol Microbiol 58:1169-1175 Martínez-Murcia AJ, Soler L, Saavedra MJ, Chacon MR, Guarro J, Stackebrandt E, Figueras MJ (2005) Phenotypic, genotypic, and phylogenetic discrepancies to differentiate Aeromonas salmonicida from Aeromonas bestiarum. Int. Microbiol. 8:259–269. Mateos D, Anguita J, Naharro G, et al (1993) "Influence of growth temperature on the production of extracellular virulence factors ve pathogenicity of environmental ve 103 human strains of Aeromonas hydrophila." Journal of Applied Bacteriology 74: 111- 118. McArdle JF and Dooley Martin C (1985) Isolation of Yersinia ruckeri type I (Hagerman strain) from goldfish Carassius auratus (L). Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 5, 10-11. McIntosh D, Cunningham M, Ji B, Fekete FA, Parry EM, Clark SE, Zalinger ZB, Gilg IC, Danner GR, Johnson KA, Beattie M, Ritchie R (2008) Transferable, multiple antibiotic and mercury resistance in Atlantic Canadian isolates of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida is associated with carriage of an IncA/C plasmid similar to the Salmonella enterica plasmid pSN254. J Antimicrob Chemother 61:1221–1228. Mendoza GM, Pasteris SE, Ale CE, Otero MC, Bühler MI, Nader-Macías MEF (2012) Cultivable microbiota of Lithobates catesbeianus and advances in the selection of lactic acid bacteria as biological control agents in raniculture. Research in veterinary science, 93(3), pp.1160-1167. Michel C, Pelletier C, Boussaha M, Douet DG, Lautraite A, Tailliez P (2007) Diversity of lactic acid bacteria associated with fish and the fish farm environment, established by amplified rRNA gene restriction analysis. Applied and environmental microbiology 73(9), pp.2947-2955. Millanao AB, Barrientos HM, Gomez CC, Tomova A, Buschmann A, Dölz H, Cabello FC (2011) Uso inadecuado y excesivo de antibióticos: salud pública y salmonicultura en Chile. [Injudicious and excessive use of antibiotics: public health and salmon aquaculture in Chile]. Rev Med Chil 139: 107–118. Miller RA and Reimschuessel R (2006) Epidemiologic cutoff values for antimicrobial agents against Aeromonas salmonicida isolates determined by frequency distributions of minimal inhibitory concentration and diameter of zone of inhibition data. American journal of veterinary research 67(11), 1837-1843. Minana-Galbis D, Farfan M, Gaspar Loren J, Carmen Fuste M (2010) Proposal to assign Aeromonas diversa sp. nov. as a novel species designation for Aeromonas group 501. Syst Appl Microbiol 33(1):15e9. Minana-Galbis D, Farfan M, Loren JG, Fuste MC, (2002) Biochemical identification and numerical taxonomy of Aeromonas spp. isolated from environmental and clinical samples in Spain. J. Appl. Microbiol. 93:420–430. Miranda CD and Zemelman R (2002a) Bacterial resistance to oxytetracycline in Chilean salmon farming. Aquaculture 212: 31–47. Miranda CD, Zemelman R (2002b) Antimicrobial multiresistance in bacteria isolated from freshwater Chilean salmon farms. Sci Total Environ 293: 207–218. Miyahara E, Nishie M, Takumi S et al. (2011) Environmental mutagens may be implicated in the emergence of drug-resistant microorganisms. FEMS Microbiol Lett 317(2):109–116 Mofredj A, Baraka D, Cadranel JF, LeMaitre P, Kloeti G, Dumont JL (2000) Lactococcus garvieae septicemia with liver abscess in an immunosuppressed patient. Am J Med 109:513–4. Morandi A, Zhaxybayeva O, Gogarten JP, Graf J (2005) Evolutionary and diagnostic implications of intragenomic heterogeneity in the 16S rRNA gene in Aeromonas strains. J. Bacteriol. 187:6561–6564. 104 Morandi S, Silvetti T, Miranda Lopez JM and Brasca M (2015) Antimicrobial activity, antibiotic resistance and the safety of lactic acid bacteria in raw milk valtellina casera cheese. Journal of Food Safety, 35(2), pp.193-205. Moura A, Oliveira C, Henriques I, Smalla K, Correia A (2012) Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol Lett 330:157–164. Munday BL (1994) Fish. In: Coopert SB, editor. Antimicrobial Prescribing Guidelines for Veterinarians: a Post Graduate Foundation Publication. University of Sydney, Australia, In association with the National Health and Medical Research Council p. 305–25. Muz A, Sarıeyüpoğlu M, Ertaş HB and Simsek A (1995) Keban baraj golünden yakalanan bazı balıkların serobik ve mikroaerofilik bakteriler yönünden incelenmesi. Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Dergisi, 9 (2): 212-219 Nash JHE, Findlay WA, Luebbert CC ve ark (2006) "Comparative genomics profiling of clinical isolates of Aeromonas salmonicida using DNA microarrays." BioMed Central Genomics 7(43): 1-15. Navarrete P, Mardones P, Opazo R, Espejo R, Romero J (2008) Oxytetracycline treatment reduces bacterial diversity of intestinal microbiota of Atlantic salmon. Journal of Aquatic Animal Health, 20(3), pp.177-183. Navas E, Bohle H, Henríquez P, Grothusen H, Bustamante F, Bustos P, Mancilla M (2014) Draft genome sequence of the fish pathogen Yersinia ruckeri strain 37551, serotype O1b, isolated from diseased, vaccinated Atlantic salmon (Salmo salar) in Chile. Genome Announc 2:e00858–14 Nawaz M, Sung K, Khan SA, Khan AA, Steele R (2006) Biochemical and molecular characterization of tetracycline-resistant Aeromonas veronii isolates from catfish. Applied and environmental Microbiology, 72(10), 6461-6466. Nawaz M, Wang J, Zhou A, Ma C, Wu X, Moore JE, Xu J (2011) Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented food products. Current microbiology 62(3), 1081-1089. Naylor R and Burke M (2005) Aquaculture and ocean resources: raising tigers of the sea. Annual Review of Environment and Resources 30:185–218. Naylor RL, Goldburg RJ, Primavera JH, Kautsky N, Beveridge MCM, Clay J, et al (2000) Effect of aquaculture on world fish supplies. Nature 405: 1017– 1024. Ndi OL and Barton MD (2011) Incidence of class 1 integron and other antibiotic resistance determinants in Aeromonas spp. from rainbow trout farms in Australia. Journal of fish diseases, 34(8), pp.589-599. Ng LK, Martin I, Alfa M, Mulvey M (2001) Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes. Molecular and cellular probes 15(4), 209-215. Nhung PH, Hata H, Ohkusu K, Noda M, Shah MM, Goto K, Ezaki T (2007) Use of the novel phylogenetic marker dnaJ and DNA-DNA hybridization to clarify interrelationships within the genus Aeromonas. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57:1232– 1237. Nielsen ME, Høi L, Schmidt AS, Qian D, Shimada T, Shen JY, et al (2001) Is Aeromonas hydrophila the dominant motile Aeromonas species that causes disease outbreaks in aquaculture production in the Zhejiang Province of China? Diseases of Aquatic Organisms 46:23–9. Noga EJ (2010) Fish Diseases (2nd edition) Willey-Blackwell, ISBN 978-0-8138- 0697-6, Singapore. 105 O’Leary PJ (1977) Enteric redmouth bacterium of salmonids: a biochemical and serological comparison of selected isolates. MSc Thesis, Oregon State University, Corvallis, OR. O'Hara C (2006) "Evaluation of the Phoenix 100 ID/AST system and NID panel for identification of Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, and commonly isolated nonenteric Gram-negative bacilli." Journal of Clinical Microbiology 44(3): 928-933. Oidtmann B and Stentiford GD (2011) White spot syndrome virus (WSSV) concentrations in crustacean tissues – a review of data relevant to assess the risk associated with commodity trade. Transboundary and Emerging Diseases 58:469–82. Onuk EE, Ciftci A, Findik A, Ciftci G, Altun S, Balta F, Ozer S, Coban AY (2011) Phenotypic and molecular characterization of Yersinia ruckeri isolates from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum, 1792) in Turkey. Berl Munch Tierarztl Wochenschr 124: 320−328. Ormen Ø and Oestensvik Ø (2001) "The occurrence of aerolysin-positive Aeromonas spp. ve their cytotoxicity in Norwegian water sources." Journal of Applied Microbiology 90: 797-802. Orozova P, Barker M, Austin DA, Austin B (2009). Identification and pathogenicity to rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), of some aeromonads. J. Fish Dis 32: 865-871. Orozova P, Sirakov I, Chikova V, Popova R, Al-Harbi AH, Crumlish M, Austin B (2014) Recovery of Hafnia alvei from diseased brown trout, Salmo trutta L., and healthy noble crayfish, Astacus astacus (L.), in Bulgaria. J Fish Dis., 37:891-898. Ozer S, Bulduklu PS and Dönmez E (2008) Mersin ilinde yetiştiriciliği yapılan gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) streptokokkozis varlığı. Journal of Fisheries Sciences 2(3): 272-283. Ozturk D, Adanır R and Turutoğlu H (2007) Bir sazan (Cyprinus carpio) işletmesinde Aeromonas hydrophila izolasyonu ve antibiyotik duyarlılığı. Ulusal Su Ürünleri Sempozyumu, at Mugla Pablos M, Huys G, Cnockaert M ve ark (2011) "Identification ve epidemiological relationships of Aeromonas isolates from patients with diarrhoea, drinking water ve foods." International Journal of Food Microbiology 147: 203-210. Palacios MA, Zamora MJ, Velazqez J, Zamora E, Duran A (1993) Streptococcus in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Spain. Boll Sci Ital Pathol 13:11–14 Park TS, Oh SH, Lee EY, et al (2003) "Misidentification of Aeromonas veronii biovar sobria as Vibrio alginolyticus by the Vitek system." Letters in Applied Microbiology 37: 349-353. Pathiratne A, Widanapathirana GS, Chandrakanthi WHS (1994) Association of Aeromonas hydrophila with epizootic ulcerative syndrome (EUS) of freshwater fish in Sri Lanka. Journal of Applied Ichthyology 10:204–8. Pereira F, Ravelo C, Toranzo AE, Romalde JL (2004) Lactococcus garvieae, an emerging pathogen for the Portuguese trout culture. Bull Eur Ass Fish Pathol 24:274– 9. Petersen A, Andersen JS, Kaewmak T, Somsiri T, Dalsgaard A (2002) Impact of integrated fish farming on antimicrobial resistance in a pond environment. Appl Environ Microbiol 68: 6036–6042. Petrie J, Bruno DW, Hastings TS (1996) Isolation of Yersinia ruckeri from wild, Atlantic salmon, Salmo salar L., in Scotland. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathologists, 16(3):83. 106 Piotrowska M, Popowska M (2014) The prevalence of antibiotic resistance genes among Aeromonas species in aquatic environments. Annals of microbiology, 64(3), pp.921-934. Poobalane S, Thompson KD, Ardo L, Verjan N, Han HJ, Jeney G, et al (2010) Production and efficacy of an Aeromonas hydrophila recombinant S-layer protein vaccine for fish. Vaccine 28:3540–7. Popoff M (1984) Aeromonas, p. 545-548. In N. R. Krieg and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 1. The Williams & Wilkins Co., Baltimore. Popoff MY, Coynault C, Kiredjian M, Lemelin M (1981) Polynucleotide sequence relatedness among motile Aeromonas species. Curr. Microbiol. 5:109–114. Pridgeon JW and Klesius PH (2011a) Molecular identification and virulence of three Aeromonas hydrophila isolates cultured from infected channel catfish during a disease outbreak in West Alabama in 2009. Diseases of Aquatic Organisms 94:249–53. Pridgeon JW, Klesius PH, Mu X ve ark (2011b) "Identification of unique DNA sequences present in highly virulent 2009 Alabama isolates of Aeromonas hydrophila." Veterinary Microbiology 152: 117-125. Prieta J, Domenech AM, Fernandez-Garaizabal JF, Collins MD, Rodrıgues UM, Jones D, et al (1993) Lactococcosis de la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). Med Vet 10:367–73. Primavera J (2006) Overcoming the impacts of aquaculture on the coastal zone. Ocean & Coastal Management, 49(9), pp.531-545. Rahman M, Huys G, Rahman M ve ark (2007) "Persistence, transmission, ve virulence characteristics of Aeromonas strains in a duckweed aquaculture-based hospital sewage water recycling plant in Bangladesh." Applied ve Environmental Microbiology 73(5): 1444-1451. Raissy M and Moumeni M (2016) Detection of antibiotic resistance genes in some Lactococcus garvieae strains isolated from infected rainbow trout. Iranian Journal of Fisheries Sciences, 15(1), 221-229. Raissy M and Shahrani M (2015) Detection of Tetracycline Resistance Genes in Lactococcus garvieae Strains Isolated from Rainbow Trout. World Academy of Science, Engineering ve Technology, International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food ve Biotechnological Engineering, 9(2), 126-129. Raissy M, Ansari M (2011) Antibiotic susceptibility of Lactococcus garvieae isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Iran fish farms. African Journal of Biotechnology, 10(8), pp.1473-1476. Ramaiah N (2006) A review on fungal diseases of algae, marine fishes, shrimps and corals. Indian Journal of Marine Sciences 35:380–7. Ransangan J, Manin BO, Abdullah A, Roli Z, Sharudin EF (2011) Betanodavirus infection in golden pompano, Trachinotus blochii, fingerlings cultured in deep-sea cage culture facility in Langkawi, Malaysia. Aquaculture 315:327–34. Ravelo C, Magarinos B, Lopez-Romalde S, Toranzo AE, Romalde JL (2003) Molecular fingerprintings of fish-pathogenic Lactococcus garvieae strains by random amplified polymorphic DNA analysis. J Clin Microbiol 41:751–6. Ravelo C, Magarinos B, Romalde JL, Toranzo AE (2001) Convencional versus miniaturizad systems for the phenotypic characterization of Lactococcus garvieae strains. Bull Eur Ass Fish Pathol 21:136–44. Rhodes G, Huys G, Swings J, McGann P, Hiney M, Smith P, Pickup RW (2000a) Distribution of oxytetracycline resistance plasmids between aeromonads in hospital 107 and aquaculture environments: implication of Tn1721 in dissemination of the tetracycline resistance determinant Tet A. Appl Environ Microbiol 66: 3883– 3890. Rhodes LD, Grayson TH, Alexander SM, Strom MS (2000b) Description and characterization of IS994, a putative IS3 family insertion sequence from the salmon pathogen, Renibacterium salmoninarum. Gene 244: 97– 107. Rintamaki P, Valtonen ET, Frerichs GN (1986) Occurrence of Yersinia ruckeri infection in farmed whitefish, Coregonus peled Gmelin and Coregonus muksun Pallas, and Atlantic salmon, Salmo salar L., in northern Finland. Journal of Fish Diseases, 9(2), pp.137-140. Rizzotti L, La Gioia F, Dellaglio F, Torriani S (2009) Molecular diversity and transferability of the tetracycline resistance gene tet(M), carried on Tn916-1545 family transposons, in enterococci from a total food chain. Antonie Van Leeuwenhoek 96:43– 52. Roberts MS (1983) A report of an epizootic in hatchery-reared rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, at an English trout farm, caused by Yersinia ruckeri. Journal of Fish Diseases, (6): 551-552. Rodgers CJ (1992) Development of a selective-differential medium for the isolation of Yersinia ruckeri and its application in epidemiological studies. J Fish Dis 15:243– 254 Romalde JL and Toranzo AE (1991) Evaluation of the API 20E system for the routine diagnosis of the enteric redmouth disease. Bull Eur Assoc Fish Pathol 11(4), 147-149. Romalde JL and Toranzo AE (2002) Molecular approaches for the study and diagnosis of salmonid streptococcosis. In: Cunningham C, editor. Molecular diagnosis of salmonid diseases. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers p. 211– 33. Romalde JL, Margarinos B, Barja JL, Toranzo AE (1993) Antigenic and molecular characterization of Yersinia ruckeri. Proposal for a new intraspecies classification. Systematic and Applied Microbiology 16, 411–419. Romero J, Feijoó CG, Navarrete P 2012. Antibiotics in aquaculture-use, abuse and alternatives. INTECH Open Access Publisher. Ross AJ, Rucker RR, Ewing WH (1966) Description of a bacterium associated with redmouth disease of rainbow trout (Salmo gairdneri). Canadian Journal of Microbiology 12, 763–770. Rossetti L and Giraffa G (2005) Rapid identification of dairy lactic acid bacteria by M13-generated, RAPD-PCR fingerprint databases. Journal of Microbiological Methods 63(2), 135-144. Royo FM (1999) Estudio de la estreptococosis de la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss); factores implicados en su virulencia y patogenicidad. Aplicaciones para su control. B.Sc. thesis, University of Zaragoza, Spain Rucker R (1966) Redmouth disease of rainbow trout (Salmo gairdneri). Bulletin de L Office International des Epizooties 65, 825–830. Russo G, Iannetta M, D’Abramo A, Mascellino MT, Pantosti A, Erario L, Tebano G, Oliva A, D'Agostino C, Trinchieri V, Vullo V (2012) Lactococcus garvieae endocarditis in a patient with colonic diverticulosis: first case report in Italy and review of the literature. New Microbiol 35(4), pp.495-501. Saavedra MJ, Figueras MJ, Martinez-Murcia AJ (2006) Updated phylogeny of the genus Aeromonas. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56:2481–2487. 108 SalmonChile 2008 Producción mundial de salmon y trucha cultivado. http://www. salmonchile.cl/files/T4-Mundial%201997-2007.pdf. Santos Y, Romalde JL, Bandín I, Magariños B, Núñez S, Barja JL, Toranzo AE (1993) Usefulness of the API-20E system for the identification of bacterial fish pathogens. Aquaculture 116, 111-120. Sarıözkan S (2016) "Türkiye’de Balıkçılık Sektörü ve Ekonomisi." Turkish Journal of Aquatic Sciences. 31(1): 15-22. Sarıözkan S, Akçay A (2014) Protein tüketimleri bakımından Türkiye ve Avrupa Birliği ülkelerinin kümeleme analizi ile karşılaştırılması, 1.Ulusal Hayvancılık Ekonomisi Kongresi, 17-20 Ekim, Antalya, Türkiye, s.179-188. Savaş H and Türe M (2007) Bölgemizde doğal ve kültürü yapılan balıklarda görülen hastalıklar. SUMAE Yunus Araştırma Bülteni 7: 10-13. Schill WB, Phelps SR, Pyle SW (1984) Multilocus electrophoretic assessment of the genetic structure and diversity of Yersinia ruckeri. Appl Environ Microbiol 48:975– 979 Schmidt AS, Bruun MS, Dalsgaard I, Larsen JL (2001b) Incidence, distribution, and spread of tetracycline resistance determinants and integron-associated antibiotic resistance genes among motile aeromonads from a fish farming environment. Appl Environ Microbiol 67: 5675– 5682. Schmidt AS, Bruun MS, Dalsgaard I, Pedersen K, Larsen JL (2000) Occurrence of antimicrobial resistance in fish-pathogenic and environmental bacteria associated with four Danish rainbow trout farms. Appl Environ Microbiol 66:4908–4915. doi:10.1128/AEM.66.11.4908-4915.2000. Schmidt AS, Bruun MS, Larsen JL, Dalsgaard I (2001a) Characterization of class 1 integrons associated with R-plasmids in clinical Aeromonas salmonicida isolates from various geographical areas. J Antimicrob Chemother 47: 735–743. Schubert RHW (1968). The taxonomy and nomenclature of the genus Aeromonas Kluyver and van Niel 1936. 111. Suggestions on the definition of the genus Aeromonas Kluyver and van Niel 1936. Internutionul Journal of Systematic Bacteriology 18, I -7. Sechi LA, Deriu A, Falchi MP ve ark (2002) "Distribution of virulence genes in Aeromonas spp. isolated from Sardinian waters ve from patients with diarrhoea." Journal of Applied Microbiology 92: 221-227. Seker E, Karahan M, Ispir U, Cetinkaya B, Saglam N and Sarieyyupoglu M (2012) Investigation of Yersinia ruckeri infection in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss walbaum 1792) farms by polymerase chain reaction (PCR) and bacteriological culture. Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi, 18 (6): 913- 916 Seshadri RS, Joseph W, Chopra AK, Sha J, Shaw J, Graf J, Haft D, Wu M, Ren Q, Rosovitz MJ, Madupu R, Tallon L, Kim M, Jin S, Vuong H, Stine OC, Ali A, Horneman AJ, Heidelberg JF (2006) Genome sequence of Aeromonas hydrophila ATCC 7966T: jack of all trades. J. Bacteriol 188:8272–8282. Seyfried Erin E, et al (2010) Occurrence of tetracycline resistance genes in aquaculture facilities with varying use of oxytetracycline.“. In: Microbial ecology. 59 (4), pp. 799- 807. Shah SQA, Karatas S, Nilsen H, Steinum TM, Colquhoun DJ, Sørum H (2012) Characterization and expression of the gyrA gene from quinolone resistant Yersinia ruckeri strains isolated from Atlantic salmon (Salmo salar L.) in Norway. Aquaculture 350–353:37–41 109 Shaowu L, Di W, Hongbai L, Tongyan L (2013) Isolation of Yersinia ruckeri strain H01 from farm-raised amur sturgeon Acipenser schrencki in China. J Aquat Anim Health 25:9–14 Sharifiyazdi H, Akhlaghi M, Tabatabaei M. and Mostafavi Zadeh SM (2010) Isolation and Characterization of Lactococcus garvieae from Diseased Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) Cultured in Iran. Iranian Journal of Veterinary Research 11, 342-350. Simidu U, Ashino K ve Kaneko E (1971) "Bacterial flora of phyto-ve zoo-plankton in the inshore water of Japan." Canadian Journal of Microbiology 17: 1157-1160. Soler L, Marco F, Vila J, et al (2003) “Evaluation of two miniaturized systems, MicroScan W/A and BBL Crystal E/NF, for the identification of clinical isolates of Aeromonas spp.” Journal of Clinical Microbiology 41: 1511-1519. Soler L, Yanez MA, Chacon MR, Aguilera-Arreola MG, Catalan V, Figureras MJ, Martínez-Murcia AJ (2004) Phylogenetic analysis of the genus Aeromonas based on two housekeeping genes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54:1511–1519. Soltani M, Nikbakht G, Ebrahimzadeh Moussavi HA, Ahmadzadeh N (2008) Epizootic outbreak of lactococcosis caused by Lactococcus garvieae in farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Iran. Bull. of the Europ. Ass. of Fish Patho., 28(5), pp.95-106. Soonthornchaikul N and Garelick H (2009) Antimicrobial resistance of Campylobacter species isolated from edible bivalve molluscs purchased from Bangkok markets, Thailand. Foodborne pathogens and disease, 6(8), pp.947-951. Sorum H (2006) Antimicrobial drug resistance in fish pathogens. In Antimicrobial Resistance in Bacteria of Animal Origin. Aarestrup, F.M. (ed.). Washington, DC, USA: American Society for Microbiology Press, pp. 213–238 (Chapter 13). Sorum H (2008) Antibiotic resistance associated with veterinary drug use in fish farms. In: Lie Ø (ed) Improving Farmed Fish Quality and Safety. WoodHead Publishing Limited, Cambridge, pp 157–182 Sorum H and L’Abée-Lund TM (2002) Antibiotic resistance in food-related bacteria – a result of interfering with the global web of bacterial genetics. Int J Food Microbiol 78: 43–56. Sousa JA, Nunez S, Eiras JC, Toranzo AE (1994) Yersinia ruckeri in Portugal: characterization of the first isolates from fish and environment. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists (United Kingdom). Souza RA, Pitondo-Silva A, Falcao DP, Falcao JP (2010) Evaluation of four molecular typing methodologies as tools for determining taxonomy relations and for identifying species among Yersinia isolates. J Microbiol Methods 82, 141–150. doi:10.1016/ j.mimet.2010.05.005 Sparboe O, Koren C, Hastein T, Poppe T, Stenwig H (1986) The first isolation of Yersinia ruckeri from farmed Norwegian salmon. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 6, 41-42. Stanier RY (1943) A note on the taxonomy of Proteus hydrophilus. J. Bacteriol. 46:213–214. Starke IC, Vahjen W, Pieper R, Zentek J (2014) The influence of DNA extraction procedure and primer set on the bacterial community analysis by pyrosequencing of barcoded 16S rRNA gene amplicons. Molecular biology international. Stevenson RMW and Airdrie DW (1984) Serological variation among Yersinia ruckeri strains. Journal of Fish Diseases 7, 247–254. 110 Suarez GJC, Sierra JSha ve ark (2008) "Molecular characterization of a functional type VI secretion system from a clinical isolate of Aeromonas hydrophila." Microbial Pathogens 44: 344-361. Subasinghe RP (2005) Epidemiological approach to aquatic animal health management: opportunities and challenges for developing countries to increase aquatic production through aquaculture. Preventive Veterinary Medicine 67:117–24. Subasinghe RP, Bondad-Reantaso MG, McGladdery SE (2001) Aquaculture development, health and wealth. In: Subasinghe RP, Bueno P, Phillips MJ, Hough C, McGladdery SE, Arthur JR, editors. Aquaculture in the Third Millennium. Technical Proceedings of the Conference on Aquaculture in the Third Millennium Bangkok: NACA and FAO. p. 167–91. Szczepanowski R, Linke B, Krahn I, Gartemann KH, Gutzkow T, Eichler W, Puhler A, Schulter A (2009) Detection of 140 clinically relevant antibiotic- resistance genes in the plasmid metagenome of wastewater treatment plant bacteria showing reduced susceptibility to selected antibiotics. Microbiology 155:2306–2319 Taylor PW and Winton JR (2002) Optimization of nested polymerase chain reaction assays for identification of Aeromonas salmonicida, Yersinia ruckeri, and Flavobacterium psychrophilum. Journal of Aquatic Animal Health, 14(3), pp.216-224. Teixeira LM, Merquior VLC, Vianni MDCE, Carvalho MDGS, Fracalanzza SE, Steigerwalt AG, Facklam RR (1996) Phenotypic and genotypic characterization of atypical Lactococcus garvieae strains isolated from water buffalos with subclinical mastitis and confirmation of L. garvieae as a senior subjective synonym of Enterococcus seriolicida. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 46(3), 664-668. Tel OY, Irgare G, Karahan M and Keskin O (2007) Şanlıurfa Balıklıgöl balıklarından Aeromonas hydrophila izolasyonu ve antibiyotik duyarlılıklarının saptanması. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi, 18 (1): 1-4 Tennstedt T, Szczepanowski R, Braun S, Pühler A, Schlüter A (2003) Occurrence of integron-associated resistance gene cassettes located on antibiotic resistance plasmids isolated from a wastewater treatment plant. FEMS Microbiol Ecol 45:239–252 Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997). The clustal_x windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 25, 4876–4882. Thorsen BK, Enger Ø, Norland S, Hoff KA (1992) Long-term starvation survival of Yersinia ruckeri at different salinities studied by microscopical and flow cytometric methods. Applied and environmental microbiology 58(5), pp.1624-1628. Timur G (1991) A historical study of a Carp pox (viral epithelioma) disease in Turkey. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 11 (5): 171 Timur G, Akayli T, Korun J and Yardimci RE (2010) A study on bacterial haemorrhagic septicemia in farmed young Russian sturgeon in Turkey (Acipencer gueldenstaedtii). Istanbul Universitesi, Su Urunleri Dergisi, 25 (1): 19-27 Timur G, Korun J and Güvener RP (2003) Lepistes (Poecilia reticulata) üretim ünitesindeki anaç ve yavru balıklarda ağır mortalite ile seyreden aeromonad septisemisi üzerine bir çalışma. Istanbul University Journal of Fisheries and Aquatic Science, 15: 1-11 Timur G, Yardimci RE, Urku C and Canak O (2011) Marmara Bölgesi kültür gökkuşağı alabalıklarında lactococcosisin bakteriyolojik ve histopatolojik metotlarla teşhisi. İstanbul Üniversitesi, Su Ürünleri Dergisi, 26 (1): 63-81 111 Tinsley J (2010) Studies on the pathogenicity of Yersinia ruckeri biotype 2 to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) (Doctoral dissertation, Heriot-Watt University). Tinsley JW, Lyndon AR, Austin B (2011) Antigenic and cross‐protection studies of biotype 1 and biotype 2 isolates of Yersinia ruckeri in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of applied microbiology 111(1), pp.8-16. Tobback E, Decostere A, Hermans K, Haesebrouck F, Chiers K (2007) Yersinia ruckeri infections in salmonid fish. J Fish Dis 30:257–268 Trust TJ and Sparrow RAH (1974) "The bacterial flora in the alimentary tract of freshwater salmonid fishes." Canadian Journal of Microbiology 20: 1219-1228. Ture M ve Boran H (2015) Phenotypic and genotypic antimicrobial resistance of Lactococcus sp. strains isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 59(1), pp.37-42. Tüik (2014) Türkiye İstatistik Yıllığı 2013 (Statistical Yearbook of Turkey), ISBN 978-975-19-6016-0 Tüik (2015) Türkiye İstatistik Kurumu. Konularına Göre İstatistikler, Tarım. http://www.tuik.gov.tr/PreTablo.do?alt_id =1001 Türe M, and Alp H (2016) Identification of bacterial pathogens and determination of their antibacterial resistance profiles in some cultured fish in Turkey. Journal of Veterinary Research, 60(2), pp.141-146. Thomas CM and Nielsen KM (2005) Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria. Nature reviews microbiology, 3(9), pp.711-721. Usui M, Tagaki C, Fukuda A, Okubo T, Boonla C, Suzuki S, Seki K, Takada H, and Tamura Y (2016) Use of Aeromonas spp. as general indicators of antimicrobial susceptibility among bacteria in aquatic environments in Thailand. Frontiers in microbiology, 7. Valtonen ET, Rintamäki P, Koskivaara M (1992) Occurrence and pathogenicity of Yersinia ruckeri at fish farms in northern and central Finland. Journal of Fish Diseases, 15(2), pp.163-171. Van Boeckel, T.P., Brower, C., Gilbert, M., Grenfell, B.T., Levin, S.A., Robinson, T.P., Teillant, A. and Laxminarayan, R., 2015. Global trends in antimicrobial use in food animals. Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(18), pp.5649- 5654. Van TTH, Chin J, Chapman T, Tran LT, Coloe PJ (2008) Safety of raw meat and shellfish in Vietnam: an analysis of Escherichia coli isolations for antibiotic resistance and virulence genes. International journal of food microbiology 124(3), 217-223. Vega-Heredia S, Mendoza-Cano F, Sanchez-Paz A (2012) The infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus: a brief review of what we do and do not know. Transboundary and Emerging Diseases 59:95–105. Vela AI, Vázquez J, Gibello A, Blanco MM, Moreno MA, Liébana P, Albendea C, Alcalá B, Mendez A, Domínguez L, and Fernández-Garayzábal JF (2000) Phenotypic and Genetic Characterization of Lactococcus garvieae Isolated in Spain from Lactococcosis Outbreaks and Comparison with Isolates of Other Countries and Sources. Journal of Clinical Microbiology, 38(10), pp.3791-3795. Vela I, Liebana P, Albendea C, Gibello A, Blanco M, Moreno M, Cutúli M, García JA, Doméneche A, Domínguez L, and Vázquez J (1999) September. Caracterización fenotípica y molecular de Lactococcus garvieae. In Proceedings of the XIII 112 Congreso Nacional de Microbiologia de la Sociedad Española de Microbiologia. Granada, Spain (Vol. 47). Vendrell D, Balcazar JL, Ruiz-Zarzuela I, De Blas I, Girones O, Muzquiz JL (2006) Lactococcus garvieae in fish: a review. Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases 29, 177–198. Verner-Jeffreys DW, Welch TJ, Schwarz T, Pond MJ, Woodward MJ, Haig SJ, Rimmer GS, Roberts E, Morrison V, Baker-Austin C (2009) High prevalence of multidrug-tolerant bacteria and associated antimicrobial resistance genes isolated from ornamental fish and their carriage water. PLoS One. doi:10.1371/journal.pone.0008388 Viji VT, Babu MM, Velmurugan S, Kumaran T, Anand SB, Gunasekaran P, Citarasu T (2012) Virulence Factors and Molecular cloning of Outer Membrane Protein (OMP) gene from virulent Aeromonas hyrophila isolated from infected gold fish Carassius auratus. Bangladesh Journal of Microbiology, 28(2), pp.70-75. Vladík P, Prouza A (1990) [Detection of Yersinia ruckeri in rainbow trout in Czechoslovakia]. Veterinarni medicina, 35(7), pp.437-442. von Graevenitz A, Mensch AH. (1968) The genus Aeromonas in human bacteriology: report of 30 cases and review of the literature. N. Engl. J. Med. 278:245–249. Vuillaume A, Brun R, Chene P, Sochon E, Lesel R (1987) First isolation of Yersinia ruckeri from sturgeon, Acipenser baeri Brandt, in south west of France. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 7, 18-19. Wahli T, Burr SE, Pugovkin D, Mueller O, Frey J (2005) Aeromonas sobria, a causative agent of disease in farmed perch, Perca fluviatilis L. Journal of fish diseases, 28(3), pp.141-150. Wang N, Yang X, Jiao S, Zhang J, Ye B, Gao S (2014) Sulfonamide-resistant bacteria and their resistance genes in soils fertilized with manures from Jiangsu Province, Southeastern China. PloS one 9(11), e112626. Wang W (2011) Bacterial diseases of crabs: a review. Journal of Invertebrate Pathology 106:18–26. Wei Q (2002) Socia l and economic impacts of aquatic animal health problems in aquaculture in China. FAO Fisheries Technical Paper 406:55–61. Willumsen B (1989) Birds and wild fish as potential vectors of Yersinia ruckeri. Journal of Fish Diseases 12, 275 - 277. Witte W (2000) Selective pressure by antibiotic use in livestock. Int J Antimicrob Agents 16: S19–S24. Xia C, Ma Z, Rahman H, Wu Z (2004) PCR Cloning and identification of the b- hemolysin gene of Aeromonas hydrophila from freshwater fishes in China. Aquaculture 229:45–53. Yambot AV (1998) Isolation of Aeromonas hydrophila from Oreochromis niloticus during fish disease outbreaks in the Philippines. Asian Fisheries Science 10:347–54. Yanez MA, Catalan V, Apraiz D, Figueras MJ, Martinez-Murcia AJ (2003) Phylogenetic analysis of members of the genus Aeromonas based on gyrB gene sequences. Int J Syst Evol Microbiol 53, 875–883. Yi SW, You MJ, Cho HS, Lee CS, Kwon JK, Shin GW (2013) Molecular characterization of Aeromonas species isolated from farmed eels (Anguilla japonica). Veterinary microbiology, 164(1), pp.195-200. 113 Yogananth N, Bhakyaraj R, Chanthuru A, Anbalagan T, Nila KM (2009) Detection of virulence gene in Aeromonas hydrophila isolated from fish samples using PCR technique. Global J Biotech Biochem, 4, pp.51-53. Zhang XX, Zhang T, and Fang HH (2009) Antibiotic resistance genes in water environment. Applied microbiology and biotechnology, 82(3), pp.397-414. Zhou QL, Wang YJ, Xie J, Ge XP, Xi BW, Liu B (2013) Distribution and virulence gene comparison of Aeromonas strains isolated from diseased fish and water environment. Polish Journal of Microbiology 62(3), 299-302. Zlotkin A, Eldar A, Ghittino C, Bercovier H (1998) Identification of Lactococcus garvieae by PCR. J Clin Microbiol 36:983–5. 7. SİMGELER ve KISALTMALAR %: Yüzde µl: Mikro litre µm: Mikro molar ATCC: Amerika tip kültür koleksiyonu ATCC: Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu BHIA: Beyin kalp infüzyon agar bp: Baz çifti bp: Baz çifti CFU: Bir ünitede sayılan koloni DEPC: dietil polikarbonat su dk: dakika ERIC: Tekrar eden enterobacterial genler arası ilişki ERM: Eritromisin FFC: Florfenikol HG: Hibridizasyon grubu KA: %5 koyun kanı ilave edilmiş kanlı agar LD: Öldürücü doz MAS: Hareketli Aeromonas Septisemi MHB: müller hinton broth MİK: en düşük inhibitör konsantrasyon NaCl: Sodyum klorür NCTC: İngiltere tip kültür kolleksiyonu nm: nanometre dalga boyu PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu pmol: pikomol RAPD-PCR: Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA polimeraz zincir reaksiyonu RT-PCR: Reverse transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu sn: saniye SUL: Sulfamethoksazol TET: Tetrasiklin TSA: Tryptic soy agar UPGMA: eşit olmayan çift grup metodu ve aritmetik ortalaması 114 TEŞEKKÜR Doktora tez çalışmamın her anında tecrübeleriyle yön veren, bilimsel ve akademik olarak gelişmemde önemli katkılar sağlayan danışmanım Prof. Dr. Soner ALTUN’a teşekkürlerimi sunuyorum. Tez çalışmalarıma önemli bilimsel katkılar sağlayan ve karşılaştığım sorunlarda bana yol gösteren Tez izleme komitesi hocalarıma teşekkür ederim. Çalışmalarımın büyük kısmında bana yardımcı olan çalışma arkadaşlarım Ayşe Gül BÜYÜKEKİZ ve İzzet B. SATICOĞLU’na, fakültemizdeki öğrenci arkadaşlarıma ve çalışmalarımda katkısı olan tüm dostlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. Doktora çalışmalarım süresince yapılan proje çalışmalarında kapılarını sonuna kadar açan, çalışmalarımızda her türlü kolaylığı sağlayan ve tecrübelerini aktaran işletmelerin yönetim ve tüm çalışanlarına şükranlarımı sunuyorum. Tez çalışmalarımın projelerle maddi olarak desteklenmesine olanak sağlayan Uludağ Üniversitesi ve Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine, Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığına çok teşekkür ederim. Hayatım boyunca beni destekleyen, her anımda yanımda olan, eksikliklerini ve dualarını bir an bile esirgemeyen Aileme, zorlu doktora sürecimde bana büyük sabır gösteren, gerektiğinde benimle laboratuvarda çalışan Eşime minnetimi ve şükranlarımı sunarım. Doktora süresince ve sonrasında yaptığım tüm çalışmaların insanların yararlanabileceği, bilime katkı sağlayan ve kamu menfaatine çalışmalar ve sonuçlar olması dileğiyle. 115 ÖZGEÇMİŞ 1988 Ankara doğumlu Muhammed DUMAN ilk, orta ve lise eğitimini Ankara’da tamamlamış ve 2005 yılında Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesini kazanmıştır. Bir yıl hazırlık eğitiminden sonra 2006-2011 yıllarında Veteriner Fakültesinde lisans eğitimini tamamlamıştır. Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesinden 2011 yılında mezun olduktan sonra yine aynı yıl içerisinde Veteriner- Su Ürünleri Hastalıkları Anabilim dalında doktora eğitimine başlamıştır. Doktora eğitimi süresince Üniversite-Sektör iş birliği projesi ile Türkiye’nin farklı bölgelerinde bulunan gökkuşağı alabalığı işletmelerinde aylık örnekleme çalışmalarına katılmıştır. Doktora tez çalışmaları devam ederken Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı tarafından desteklenen (TAGEM) projede yardımcı araştırmacı olarak görev almış, bu kapsamda da Türkiye’nin 6 bölgesinde yer alan ve Üniversite-Sektör iş birliği projesi kapsamı dışındaki alabalık işletmlerinde iki yıl boyunca örnekleme çalışmalarına katılmıştır. Bu projeler kapsamında bakteriyolojik muayene, işletme hijeni, balık sağlığı ve antimikrobiyal duyarlılık konularında incelemelere yardımcı olmuştur. Doktora süresince araştırma makaleleri ve ulusal/uluslararası toplantılarda bildiriler yayınlamıştır. Halen daha Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Su Ürünleri Hastalıkları Anabilim Dalında Araştırma Görevlisi olarak görevine devam etmektedir. Projelerde Yaptığı Görevler: 1. Gökkuşağı Alabalık İşletmelerinde Sağlıklı Alabalık Yumurtası ve Yavru Balık Üretimi Üzerine Bir Araştırma, Üniversite-Sektör işbirliği projesi, Araştırmacı, , 23/09/2013 - 15/07/2016 (ULUSAL-TAMAMLANDI) 2. Ülkemizde Gökkuşağı alabalığı İşletmelerinde Sıklıkla Karşılaşılan Motil Aeromonas (Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae), Yersinia ruckeri ve Lactococcus garvieae etkenlerinde antimikrobiyal direnç, Sülfonamidler Tetrasiklin Florfenikol ve Eritromisin ve IPN, VHS, IHN virüslerinin varlığının incelenmesi, TAGEM/14/AR-GE/26 (Tarımsal Araştırmalar ve Politikalar Genel Müdürlüğü), Araştırmacı, , 21/07/2014 (Devam Ediyor) (ULUSAL) 3. Gökkuşağı alabalıklarında görülen Motil Aeromonas (Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae), Yersinia ruckeri ve Lactococcus garvieae bakterilerinin antimikrobiyal duyarlılıkları ve duyarlılıkta rol oynayan genlerin tespiti, KUAP(V)-2014/7 (Bilimsel Araştırma Projeleri-Uludağ Üniversitesi), Araştırmacı, , 24/04/2014 (Devam Ediyor) (ULUSAL) 4. Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792) kuluçkahanelerinde hastalık oluşturan Flavobacterium türlerinin genotipik karakterizasyonu ve antimikrobiyal direnç gelişiminde rol oynayan genlerin varlığı-yaygınlığının belirlenmesi, TÜBİTAK, Proje no: 116O626, 2016- (devam ediyor) Araştırma makaleleri 116 Uluslararası hakemli dergilerde yayımlanan makaleler: 1. Duman, M., A. G. Buyukekiz, I. B. Saticioglu, S. Altun, 2017. Molecular characterization and antimicrobial resistance profile of fecal contaminant and spoiled bacteria that emerged in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) farms. In progress. 2. Duman, M., A. G. Buyukekiz, I. B. Saticioglu, M. Cengiz, P. Sahinturk. S. Altun, 2017. Epidemiology, Genotypic Diversity, and Antimicrobial Resistance of Lactococcus garvieae in Farmed Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Iranian Journal of Fisheries Science. In press. 3. Duman, M., I. B. Saticioglu, A. G. Buyukekiz, F. Balta, S. Altun, 2017. Molecular Characterization and Antimicrobial Resistance Profile of Atypical Citrobacter gillenii and Citrobacter sp. isolated from diseased rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Global Antimicrobial Resistance. S2213-7165(17)30101-7. DOI: 10.1016/j.jgar.2017.05.014 4. Duman, M., S. Altun, M. Cengiz, I. B. Saticioglu, A. G. Buyukekiz, P. Sahinturk. 2017. Genotyping and antimicrobial resistance genes of Yersinia ruckeri isolates from rainbow trout farms. Diseases of Aquatic Organisms, DOI https://doi.org/10.3354/dao03132. 5. Büyükekiz A. G., Altun S., Furuseth Hansen E., Burçin Satıcıoğlu İ. B., Duman M., Markussen T., Rimstad E., 2017. Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) serotype Sp is prevalent in Turkish rainbow trout farms. Journal of Fish Diseases DOI: 10.1111/jfd.12675. 6. Ustuner, B., Alcay, S., Toker, M.B., Nur, Z., Gokce, E., Sonat, F.A., Gul, Z., Duman, M., Ceniz, C., Uslu, A. and Sagirkaya, H., 2016. Effect of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) seminal plasma on the post-thaw quality of ram semen cryopreserved in a soybean lecithin-based or egg yolk-based extender. Animal reproduction science, 164, pp.97-104. 7. Altun S., Duman M., Büyükekiz A. G., Özyiğit M. Ö., Karataş S., Turgay E., 2013. First isolation of Citrobacter braakii from Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) The Israeli Journal of Aquaculture. 915-924 44. 8. Altun, S., Büyükekiz, A.G., Duman, M., Özyiğit, M.Ö., Karataş, S. and Turgay, E., 2014. Isolation of Shewanella putrefaciens from Goldfish (Carassius auratus auratus). The Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh. 1- 8 66. 9. Altun, S., Onuk, E.E., Ciftci, A., Büyükekiz, A.G. and Duman, M., 2013. Phenotypic, genotypic characterisation and antimicrobial susceptibility determination of Lactococcus garvieae strains. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 19, pp.375-381. 10. Altun, S., Onuk, E.E., Ciftci, A., Duman, M. and Büyükekiz, A.G., 2013. Determination of Phenotypic, Serotypic and Genetic Diversity and Antibiotyping of Yersinia ruckeri Isolated from Rainbow Trout. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 19(2), pp.225-232. 117