i FARKLI TAHILLAR İLE ÜRETİLMİŞ BOZALARDAN İZOLE EDİLEN POTANSİYEL PSİKOBİYOTİK MİKROORGANİZMALARIN KARAKTERİZASYONU Gamze DÜVEN ii T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FARKLI TAHILLAR İLE ÜRETİLMİŞ BOZALARDAN İZOLE EDİLEN POTANSİYEL PSİKOBİYOTİK MİKROORGANİZMALARIN KARAKTERİZASYONU Gamze DÜVEN 0000-0001-7418-5384 Prof. Dr. Sine ÖZMEN TOĞAY (Danışman) Doç. Dr. Aycan YİĞİT ÇINAR (2.Danışman) DOKTORA TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI BURSA – 2024 Her Hakkı Saklıdır iii TEZ ONAYI Gamze DÜVEN tarafından hazırlanan “FARKLI TAHILLAR İLE ÜRETİLMİŞ BOZALARDAN İZOLE EDİLEN POTANSİYEL PSİKOBİYOTİK MİKROORGANİZMALARIN KARAKTERİZASYONU” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı’nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Prof. Dr. Sine ÖZMEN TOĞAY Başkan : Prof. Dr. Sine ÖZMEN TOĞAY 0000-0002-8851-1803 Bursa Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı İmza Üye : Prof. Dr. Yasemin ŞAHAN 0000-0003-3457-251X Bursa Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı İmza Üye : Prof. Dr. Canan Ece TAMER 0000-0003-0441-1707 Bursa Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı İmza Üye : Doç. Dr. Dilek DÜLGER ALTINER 0000-0002-7043-2883 Kocaeli Üniversitesi, Turizm Fakültesi, Gastronomi ve Mutfak Sanatları Anabilim Dalı İmza Üye : Dr. Öğr. Üyesi Ufuk BAĞCI 000-000-000-000 0000-0002-1511-2465 Trakya Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı İmza Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Ali KARA Enstitü Müdürü 06/09/2024 iv B.U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; − tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, − görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, − başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, − atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, − kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, − ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 06/09/2024 Gamze DÜVEN v TEZ YAYINLANMA FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezin/raporun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kâğıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma izni Bursa Uludağ Üniversitesi’ne aittir. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet hakları ile tezin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları tarafımıza ait olacaktır. Tezde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanılması zorunlu metinlerin yazılı izin alınarak kullandığını ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederiz. Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” kapsamında, yönerge tarafından belirtilen kısıtlamalar olmadığı takdirde tezin YÖK Ulusal Tez Merkezi / B.U.Ü. Kütüphanesi Açık Erişim Sistemi ve üye olunan diğer veri tabanlarının (Proquest veri tabanı gibi) erişimine açılması uygundur. Prof. Dr. Sine ÖZMEN TOĞAY 06/09/2024 Gamze DÜVEN 06/09/2024 İmza Bu bölüme kişinin kendi el yazısı ile okudum anladım yazmalı ve imzalanmalıdır. İmza Bu bölüme kişinin kendi el yazısı ile okudum anladım yazmalı ve imzalanmalıdır. vi BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ LİSANSÜSTÜ TEZ TANITIMI ÖĞRENCİ VE DANIŞMAN FORMU FR 3.4.6_27 BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ DOKTORA EĞİTİMİ BOYUNCA BİLİMSEL ÇALIŞMALARI VE FAALİYETLERİ* 1. Makale- Chemical composition and biological activities of Cypriot propolis, 2022 (SCI-Expanded) 2. Makale- Ultrasonication-assisted kefir production and its effect on fermentation time and EPS production. 2021(SCI-Expanded) 3. Makale- Determination of hygienic status of refrigerators surface. 2021(Hakemli Dergi) 4. Makale- A portable microfluidic platform for rapid determination of microbial load and somatic cell count in milk. 2019 (SCI-Expanded) 5. Makale-Çip-Üstü-Laboratuvar (ÇÜL) Teknolojisinin Gıda Mikrobiyolojisindeki Uygulamaları.2018 (Hakemli Dergi) 6. Tam Metin Sözlü Bildiri- İnsan ve Gıda Mikrobiyotasında Psikobiyotikler. Mikrobiyom Terapileri Kongresi, İstanbul, Türkiye, 19-21Mayıs 2023. 7. Tam Metin Sözlü Bildiri- Geleneksel Fonksiyonel Bir İçecek: Boza. Geleneksel Gıdalar Sempozyumu, Bursa, Türkiye. 2022. 8. Tam Metin Sözlü Bildiri- Psikobiyotik Mikroorganizmaları İçeren Gıdaların Sağlık Üzerine Olası Etkileri. 12. Gıda Mühendisliği Öğrenci Kongresi, 21-22 Mart 2022. 9. Tam Metin Sözlü Bildiri- Gıda Üretiminde Kullanılan Laktik Asit Bakterilerinde Antibiyotik Direnci. Türkiye 13. Gıda Kongresi, 21-23 Ekim 2020. 10. Sözlü Bildiri- Use of Different Raw Materials in Production of Tarhana and Evaluation of Their Sensory Properties. IFIS 2024. 16-18 Mayıs 2024. 11. Sözlü Bildiri- Effect of Social Media Literacy on Food Safety and Sustainability. IFIS 2024. 16-18 Mayıs 2024. 12. BUU BAP Destekli UIP Projesi- Farklı Ekşi Maya Starterleri ile Karakılçık ve Mor Patates Unlarından Üretilen Tarhanaların Fonksiyonel Karakterizasyonu, 2023 – 2025. 13. TÜBİTAK AB COST Projesi- Farklı Ham Maddeler Kullanılarak Üretilen Bozalarda GABA (Gamma Amino Bütirik Asit) Üreticisi Potansiyel Psikobiyotik Suşların Araştırılması, 2024 – 2026. 14. AB Erasmus+ KA2 Projesi- Establishment of Centre of Vocational Excellence (CoVE) for Dairy Sector, 2022- 2026. 15. YÖK ADEP Destekli BUU BAP Projesi- Farklı Hammaddeler Kullanılarak Üretilen Tarhanaların ve Mikrobiyotasındaki Laktik Asit Bakteri İzolatlarının Gıda Endüstrisi ve İnsan Sağlığı Açısından Fonksiyonel Özelliklerinin Araştırılması, 2022–2025. 16. BUU BAP Destekli Proje- Bursa bölgesinden toplanan ekşi hamurlardan izole edilen mikroorganizmaların fonksiyonel karakterizasyonu, 2022 – 2023. 17. EU BAP Destekli Proje- Türkiye'den 41 Propolis Örneği Üzerinde Ayrıntılı Kimyasal İçerik Belirleme ve Biyolojik Aktivite Çalışmaları, 2020 – 2022. *Makaleler, Bilimsel toplantılarda sunulan bildiriler, patentler, projeler, eğitimler vb. faaliyetler sıralanmalıdır. DANIŞMAN Adı SOYADI : Sine ÖZMEN TOĞAY ÜNVANI : Prof. Dr. FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ABD E-POSTA : sinetogay@uludag.edu.tr YÖKSİS ARAŞTIRMACI ID : 49062 ORCID :0000-0002-8851-1803 TÜBİTAK ID : TBTK-0004-7048 WOS RESEARCHER ID : FQF-3683-2022 SCOPUS AUTHOR ID : 36468917400 Google Scholar ID : GrM3pacAAAAJ ÖĞRENCİ Adı SOYADI : Gamze DÜVEN ÜNVANI : Öğr. Gör. FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ABD E-POSTA : gamzeduvenn@gmail.com PROGRAMI: DOKTORA ORCID : 0000-0001-7418-5384 TÜBİTAK ID : TBTK-0031-3302 WOS RESEARCHER ID : AEZ-4340-2022 SCOPUS AUTHOR ID : 57209322710 Google Scholar ID : Yl0n53cAAAAJ BİRLEŞMİŞ MİLLETLER SÜRDÜRÜLEBİLİR KALKINMA HEDEFLERİ vii Anahtar Kelimeler Mental Health Gut Microbiota Gamma-Amino Butryric Acid Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler Anahtar Kelimeler viii ÖZET Doktora Tezi FARKLI TAHILLAR İLE ÜRETİLMİŞ BOZALARDAN İZOLE EDİLEN POTANSİYEL PSİKOBİYOTİK MİKROORGANİZMALARIN KARAKTERİZASYONU Gamze DÜVEN Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Sine ÖZMEN TOĞAY İkinci Danışman: Doç. Dr. Aycan YİĞİT ÇINAR (Bursa Teknik Üniversitesi) Bu doktora tez çalışmasında; chia ve kinoanın boza üretiminde kullanılabilme potansiyeli araştırılmış, farklı ham maddelerin (kinoa, chia, darı, mısır) kullanılmasıyla üretilen bozalardan potansiyel psikobiyotik laktik asit bakterisi (LAB) ve mayaların izole ve karakterize edilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla üretilen boza örneklerinin duyusal, mikrobiyolojik (toplam aerobik mezofilik canlı bakteri, toplam maya, fekal koliform bakteri ve LAB sayısı), fiziksel ve kimyasal özellikleri (pH, titrasyon asitliği, kuru madde miktarı, su aktivitesi, gluten içeriği, ekzopolisakkarit [EPS] miktarı, Briks, renk özellikleri, viskozitesi, gamma amino bütirik asit [GABA] içeriği) belirlenmiştir. Tez kapsamında üretilen bozaların GABA miktarının geleneksel bozada 26,34±0,99 ppm, chialıda 31,41±1,83 ppm, kinoalıda 32,20±1,95 ppm ve chia ve kinoalıda ise 31,04±0,56 ppm olduğu bulunmuştur. Ayrıca, boza örneklerinden toplam 309 adet izolat elde edilmiş, bunların 234 tanesi Gram pozitif ve katalaz negatif bulunarak gliserol stoğa alınmıştır. Bunlardan 137 tanesinin GABA üreticisi olduğu belirlenmiştir. Bu izolatların probiyotik özellikleri (antimikrobiyal aktivite, antibiyotik direnci, in vitro sindirim modelindeki davranışı, düşük pH ve safra tuzuna karşı direnci) de değerlendirilmiştir. Bu amaçla, izolatların çeşitli test bakterilerine karşı antimikrobiyal aktiviteleri incelenmiş ve 17 tanesinin aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Bu izolatlardan 4 tanesinin çeşitli antibiyotiklere karşı istenilen antibiyotik duyarlılıklarına sahip olduğu tespit edilmiş ve 2 tanesinin in vitro sindirim sistemi modelinde canlı kaldığı ve düşük pH ve %0,3 safra tuzuna karşı direnç gösterdiği belirlenmiştir. Chialı (24C-9MR kodlu izolat) ve kinoalı (24Ki-3MR kodlu izolat) boza örneklerinden izole edilen bu iki izolatın 16S rRNA dizi analizi tanımlanması sonucu ikisinin de Pediococcus acidilactici türüne ait olduğu ve pH indikatör methodu (PIM) yönteminden elde edilen süpernatantlarının GABA içeriklerinin sırasıyla 119,01±12,86 ppm ve 206,69±10,03 ppm miktarında olduğu bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Boza, GABA, psikobiyotik, kinoa, chia 2024, xix + 143 sayfa. ix ABSTRACT PhD Thesis CHARACTERIZATION OF POTENTIAL PSYCHOBIOTIC MICROORGANISMS ISOLATED FROM BOZA PRODUCED BY DIFFERENT CEREALS Gamze DÜVEN Bursa Uludag University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof Dr Sine ÖZMEN TOĞAY Second Supervisor: Assoc. Prof Dr Aycan YİĞİT ÇINAR (Bursa Technical University) In this doctoral thesis, the potential of using chia and quinoa in boza production was investigated and the aim of the study is isolation and characterization of potential psychobiotic LAB and yeasts from boza obtained with different raw materials (quinoa, chia, millet, corn). For this purpose, sensory, microbiological (total aerobic mesophilic bacteria, total yeast, fecal coliform bacteria and LAB count), physical and chemical properties (pH and titratable acidity, water activity dry matter, gluten, EPS and GABA content, Brix, colour, viscosity) of boza samples. The GABA amount of bozas were found 26.34±0.99 ppm in traditional boza, 31.41±1.83 ppm in chia boza, 32.20±1.95 ppm in quinoa boza and 31.04±0.56 ppm in chia and quinoa boza. In addition, 309 isolates were obtained, 234 of which were found to be Gram positive and catalase negative, 137 of the isolates obtained were GABA producers. The probiotic properties of these isolates (antimicrobial activity, antibiotic resistance, survival in in vitro digestion model, low pH and bile salt tolerance) were also evaluated. For this purpose, 17 isolates showed the antimicrobial activities against various test bacteria. It was determined that 4 of these isolates had the desired antibiotic resistance against various antibiotics and 2 of them survived in the in vitro digestive system model and showed resistance to low pH and 0.3% bile salt. These two isolates isolated from boza samples with chia (24C-9MR) and quinoa (24Ki-3MR) were found to be Pediococcus acidilactici via 16S rRNA identification and the GABA contents of their supernatants obtained from the PIM method were determined to be 119.01±12.86 ppm and 206.69±10.03 ppm, respectively. Key words: Boza, GABA, psychobiotic, quinoa, chia 2024, xix + 143 pages. x TEŞEKKÜR Doktora çalışmamın her aşamasında yakın ilgi ve değerli yardımlarını gördüğüm, bilgi ve tecrübelerini benden esirgemeyen değerli danışman hocalarım Sayın Prof. Dr. Sine Özmen Toğay’a ve Doç. Dr. Aycan Yiğit Çınar’a en içten dileklerimle teşekkürlerimi sunarım. Doktora çalışmalarım ve analizlerim boyunca desteğini, bilgi ve tecrübelerini benden esirgemeyen ve daima yol gösteren değerli hocalarım Prof. Dr. Yasemin ŞAHAN’a, Dr. Öğr. Üyesi Ufuk Bağcı’ya, Dr. Öğr. Üyesi Mustafa Ay’a ve her zaman desteğini hissettiğim yüksek lisans danışmanı hocam Prof. Dr. Duygu Kışla’ya, fikirleri ve yol gösterici yorumlarıyla doktora tez çalışmamda büyük katkısı olan, çok erken kaybettiğimiz eski jüri üyesi hocam Prof. Dr. Nurcan Değirmencioğlu’na ve bugünlere gelmeme vesile olan tüm hocalarıma teşekkürlerimi bir borç bilirim. Bu doktora tez çalışması, 124O180 numaralı “Farklı Ham Maddeler Kullanılarak Üretilen Bozalarda GABA (Gamma Amino Bütirik Asit) Üreticisi Potansiyel Psikobiyotik Suşların Araştırılması” konulu proje kapsamında TÜBİTAK 2515 AB COST Projeleri Destek Programıyla desteklenmiştir. Bu tez çalışmasının gerçekleştirilmesinde gerekli maddi desteği sağladığı için TÜBİTAK’a, desteğin kazanılmasındaki manevi destekleri için Bursa Uludağ Üniversitesi Rektörlüğü’ne ve Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölüm Başkanlığı’na teşekkür ederim. Tez çalışmam için verdikleri değerli maddi ve manevi desteklerden dolayı Ömür Boza Fabrika Müdürü Atakan Kuşku ve Samet Kuşku’ya, boza üretimi süresince gösterdiği özveri, bilgi ve tecrübeleri ve değerli dostluğu için Üretim Müdürü Burçin Bulurman’a ve değerli yardımları için Gıda Teknisyeni Ebru Çelik’e ve Ömür Boza (Bozacılar Gıda Tekstil Tic. Ltd. Şti., Bursa) ailesinin her bir üyesine çok teşekkür ederim. Doktora eğitimim süresince bilgi, tecrübe ve dostluklarıyla yanımda olan dostlarım Ege Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü’nden “Friend’s” üyelerine, Dr. Ilgın Kımız Geboloğlu’na, Dr. Pelin Metiner’e ve Dr.Remzi Cholakov’a, Meral Tekin Atay, Fethi Atay ve Çardak-Yenifoça ekibine ve hayatımdaki yeri her zaman bambaşka olacak olan, eğitimim boyunca bana gösterdiği sevgisi, özverisi ve fedakarlıkları ile sevgili Kenan Solak’a ve değerli ailesine çok teşekkür ederim. Hayatımın ve tezimin her aşamasında maddi ve manevi olarak verdiği destek ve hoşgörüyü hissettiğim, tez çalışmalarım boyunca benimle laboratuvara gelen, büyük fedakarlıklar gösteren ve bu günlerimi borçlu olduğum değerli annem Neveda Neslihan Düven’e, bugünlere gelmemde uzaklardaki manevi gücüm 9 yaşında kaybettiğim babam Mehmet Yıldırım Düven’e ve ailemin her bir üyesine, bir kadın olarak bu günlere gelmeme vesile olan Ulu Önderimiz Gazi Mustafa Kemal Atatürk’e minnet ve vefalarımı sunarım. Gamze DÜVEN 06/09/2024 xi İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.............................................................................................................................. viii ABSTRACT ..................................................................................................................... ix TEŞEKKÜR ...................................................................................................................... x SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ .................................................................... xiii 1. GİRİŞ ........................................................................................................... 1 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI ...................... 4 2.1. Akdarı (Panicum miliaceum L.) ............................................................................ 4 2.2. Mısır (Zea mays L.) ............................................................................................... 5 2.3. Chia (Salvia hispanica L.)..................................................................................... 6 2.4. Kinoa (Chenopodium quinoa Wild) ...................................................................... 8 2.5. Boza..................................................................................................................... 10 2.6. Psikobiyotik Mikroorganizmalar ........................................................................ 15 2.7. Gamma Amino Bütirik Asit (GABA) ................................................................. 19 3. MATERYAL ve YÖNTEM ...................................................................... 28 3.1. Farklı Ham Maddeler ile Boza Üretimi .............................................................. 28 3.2. Duyusal Analizler................................................................................................ 31 3.3. Mikrobiyolojik Analizler .................................................................................... 32 3.3.1. Toplam aerobik mezofilik canlı bakteri sayımı ...................................... 33 3.3.2. Toplam maya sayımı ............................................................................... 33 3.3.3. Toplam fekal koliform bakteri sayımı..................................................... 33 3.3.4. Laktik asit bakterisi sayımı ..................................................................... 33 3.4. Fiziksel ve Kimyasal Analizler ........................................................................... 34 3.4.1. pH ölçümü ve titrasyon asitliği tayini ..................................................... 34 3.4.2. Kuru madde, su aktivitesi, gluten, EPS tayinleri ve Briks ölçümü ......... 35 3.4.3. Renk tayini ve viskozite ölçümü ............................................................. 36 3.4.4. Farklı ham maddeler ile üretilen boza örneklerinin HPLC ile GABA miktarının belirlenmesi ............................................................................................ 36 3.5. Boza Örneklerinden LAB ve Maya İzolasyonu .................................................. 37 3.6. Boza Örneklerinden İzole Edilen LAB ve Mayaların PIM Yöntemi ile GABA Üretim Potansiyellerinin Belirlenmesi ............................................................................ 39 3.7. Boza Örneklerinden İzole Edilen GABA Üreticisi İzolatların Probiyotik Özelliklerinin Belirlenmesi ............................................................................................. 40 3.7.1. İzolatların antimikrobiyal aktivitesinin belirlenmesi .............................. 40 3.7.2. İzolatların antibiyotik dirençlerinin belirlenmesi .................................... 42 3.7.3. İzolatların in vitro sindirim modelindeki davranışının belirlenmesi ....... 42 3.7.4. İzolatların safra tuzu ve düşük pH direncinin belirlenmesi .................... 43 3.8. Boza Örneklerinden İzole Edilen GABA Üreticisi ve Probiyotik Potansiyeli Olan İzolatların Tanımlanması ........................................................................................ 44 3.9. İstatistiksel Analizler ........................................................................................... 45 4. BULGULAR ve TARTIŞMA ................................................................... 46 4.1. Duyusal Analiz Sonuçları ................................................................................... 46 xii 4.2. Mikrobiyolojik Analiz Sonuçları ........................................................................ 51 4.2.1. Toplam aerobik mezofilik canlı bakteri sayımı ...................................... 51 4.2.2. Toplam maya sayımı ............................................................................... 53 4.2.3. Toplam fekal koliform bakteri sayısı ...................................................... 56 4.2.4. Laktik asit bakterisi sayımı ..................................................................... 58 4.3. Fiziksel ve Kimyasal Analiz Sonuçları ............................................................... 65 4.3.1. pH ve Titrasyon asitliği sonuçları ........................................................... 65 4.3.2. Kuru madde, su aktivitesi, gluten, EPS tayini ve Briks ölçümü sonuçları… ............................................................................................................... 69 4.3.3. Renk tayini ve viskozite ölçümü sonuçları ............................................. 74 4.3.4. Farklı ham maddeler ile üretilen boza örneklerinin GABA miktarları ... 78 4.4. Boza Örneklerinden LAB ve Maya İzolasyonu .................................................. 80 4.5. Boza Örneklerinden İzole Edilen LAB ve Mayaların PIM Yöntemi ile GABA Üretim Potansiyellerinin Belirlenmesi ............................................................................ 87 4.6. Boza örneklerinden İzole Edilen GABA Üreticisi İzolatların Probiyotik Özelliklerinin Belirlenmesi ............................................................................................. 89 4.6.1. İzolatların antimikrobiyal aktiviteleri ..................................................... 89 4.6.2. İzolatların antibiyotik dirençleri .............................................................. 99 4.6.3. İzolatların in vitro sindirim modelindeki davranışları .......................... 104 4.6.4. İzolatların safra tuzu ve düşük pH direncinin belirlenmesi .................. 106 4.7. Boza Örneklerinden İzole Edilen GABA Üreticisi ve Probiyotik Potansiyeli Olan İzolatların Tanımlanması ...................................................................................... 109 5. SONUÇ .................................................................................................... 113 KAYNAKLAR ............................................................................................................. 115 ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................. 142 xiii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama a/h Ağırlık/hacim a* Kırmızı-yeşil ekseni aw Su aktivitesi bp Baz çifti b* Sarı-mavi ekseni C Chia katkılı boza CKi Chia ve kinoa katkılı boza cm Santimetre CO2 Karbondioksit cP Centipoise (1kg/ms) C-3 Karbon-3 d g/mL cinsinden örneğin yoğunluğu dH2O Distile su dk Dakika dNTP Deoksiribonükleotid F 0,1N NaOH çözeltisinin faktörü (1,048) g Gram g G kuvveti HCl Hidroklorik asit H2O2 Hidrojen peroksit h/h Hacim/hacim H2N Amin I Nötr K Geleneksel boza/kontrol örneği kg Kilogram Ki Kinoa katkılı boza %KM Yüzde kuru madde kob Koloni oluşturan birim L Litre Log Logaritma 10 tabanında L* Aydınlık ekseni M Molar m Mililitre cinsinden tüketilen örnek miktarı mA Miliamper mg Miligram MgCl2 Magnezyum klorür mL Mililitre mm Milimetre mM Milimolar mmol Milimol N Normalite NaCl Sodyum klorür NaOH Sodyum hidroksit xiv Simgeler Açıklama nm Nanometre nmol Nanomol O Oksijen OH Hidroksil O/R Oksidasyon redüksüyon potansiyeli P Olasılık, probability ppm Parts per million (milyonda bir) pH Hidrojen iyonu konsantrasyonunun negatif logaritması R Dirençli rpm Revolutions per minute S Duyarlı sa Saat V Volt oC Santigrat α Alfa ΔE Delta E, renk farkı ɷ Omega ʋ Mililitre cinsinden tüketilen 0,1 N NaOH miktarı µg Mikrogram µL Mikrolitre µm Mikrometre % Yüzde xv Kısaltmalar Açıklama AD Antibiyotik direnci ANOVA Varyans analizi ATCC American Type Culture Collection B Bağırsak sindirimi sonrası BHI Brain Heart Infusion Broth BLAST Basic Local Alignment Search Tool BUÜ Bursa Uludağ Üniversitesi BTÜ Bursa Teknik Üniversitesi C-30 Kloramfenikol CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CN-10 Gentamisin CRISPR-Cas Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats sistemi DAD Diode array dedektör DNA Deoksiribonükleik asit DRBCA Dichloran Rose-Bengal Chloramphenicol Agar E-10 Eritromisin EFSA Avrupa Gıda Güvenliği Kurumu ELISA enzyme linked immunosorbent assay EPS Ekzopolisakkarit FDA Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi FLD Floresans dedektör GABA Gamma amino bütirik asit GAD Glutamat dekarboksilaz GRAS Generally recognized as safe HPA Hipotalamik hipofiz adrenal HPLC Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi I Intermediate, orta derecede duyarlı/dirençli IS Internal standart KAA Kanamisin Esculin Azide Agar KM Kimchi LAB Laktik asit bakterisi LDL Düşük yoğunluklu lipoprotein L-Glu L-glutamik asit LT Lahana turşusu M17A M17 agar M17B M17 broth MEB Malt Extract Broth MHI Muller Hilton Agar MO Mide sindirimi öncesi MRSA De Man Rogosa Sharpe Agar MRSB De Man Rogosa Sharpe Broth MS Mide sindirimi sonrası MSG Monosodyum glutamat MSS Merkezi sinir sistemi NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth xvi Kısaltmalar Açıklama NCBI National Center of Biotechnology Information OPA O-fitalaldehid P Pelet PCA Plate Count Agar PIM pH indikatör methodu PLP Piridoksal-5’-fosfataz PW Peptonlu su PZR Polimeraz zincir reaksiyonu R Resistance, dirençli RAPD-PZR Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA polimeraz zincir reaksiyonu rRNA Ribozomal ribonükleik asit S Sensitive, duyarlı SK Sauerkraut S-10 Streptomisin TAE Tris, asetik asit, etilendiamintetraasetik asit TAMB Toplam aerobik mezofilik canlı bakteri TCA Trikloroasetik asit TE Tespit edilemedi TE-30 Tetrasiklin TFKB Toplam fekal koliform bakteri TM Toplam maya TS Türk Standartları UV Ultraviyole VA-30 Vankomisin VRBA Violet Red Bile Agar YGCA Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar 2-MCE 2-merkaptoetanol xvii ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Maya kullanarak (back sloping) fermantasyon ile boza üretimi akış şeması 11 Şekil 2.2. GABA'nın moleküler yapısı 20 Şekil 2.3. GABA üretim mekanizması 21 Şekil 3.1. Boza üretiminde kullanılan ham maddeler 28 Şekil 3.2. Boza üretim aşamaları 30 Şekil 3.3. Boza üretim akış şeması 30 Şekil 3.4. Duyusal analiz formu örneği 32 Şekil 4.1. Boza örneklerinin 36. saat duyusal analiz sonucunun örümcek ağı grafiğinde gösterimi 47 Şekil 4.2. Farklı ham maddeler kullanılarak üretilen boza örnekleri 48 Şekil 4.3. Boza örneklerinin soğuk depolama (+4°C) 6.gün duyusal analiz sonuçlarının örümcek ağı grafiğinde gösterimi 50 Şekil 4.4. Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4°C) boyunca TAMB sayısı değişimi 52 Şekil 4.5. Boza örnekleri fermantasyon ve soğuk depolama (+4°C) boyunca TM sayısındaki değişim 55 Şekil 4.6. Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4°C) boyunca Lactobacillus spp. sayısındaki (MRSA) değişim 59 Şekil 4.7. Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4°C) boyunca Lactococcus spp. sayısındaki (M17A) değişim 61 Şekil 4.8. Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4°C) boyunca Enterococcus spp. sayısındaki (KAA) değişim 64 Şekil 4.9 Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4°C) boyunca pH değişimi 66 Şekil 4.10 Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4°C) boyunca titrasyon asitliğindeki değişim 67 Şekil 4.11 Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4°C) boyunca viskozite değerlerindeki değişim 76 Şekil 4.12 GABA standardı (5ppm) HPLC sonucu ve kinoa katkılı boza örneği GABA analizi HPLC kromatogramı 79 Şekil 4.13 Boza örneklerinden izole edilen LAB ve mayaların ışık mikroskobu görüntüleri 85 Şekil 4.14 Boza örneklerinden izole edilen LAB ve mayaların PIM ile GABA üretim potansiyellerinin belirlenmesi 87 Şekil 4.15 LAB ve maya izolatlarından bazılarının agar damlatma yöntemine göre antimikrobiyal aktivite tayini görüntüleri 96 Şekil 4.16 Boza örneklerinden izole edilen bazı LAB izolatlarının agar difüzyon yöntemi ile antimikrobiyal aktivite tayini görüntüsü 98 Şekil 4.17 Boza örneklerinden izole edilen bazı LAB izolatlarının antibiyotik direnç analizi görüntüsü 101 Şekil 4.18 Boza örneklerinden izole edilen probiyotik özelliğe sahip ve GABA üreticisi izolatlara ait PZR jel elektroforezi görüntüsü 109 Şekil 4.19 İzolatlara ait filogenetik ağaç dendogramı 111 xviii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Boza fermantasyonunda rol alan bazı bakteri türleri 12 Çizelge 2.2. Boza fermantasyonunda rol alan bazı maya türleri 13 Çizelge 2.3. Psikobiyotik bakterilerin üretmiş oldukları metabolitler ve sağlık etkileri 17 Çizelge 2.4. Fermente gıdalar ve içerdiği mikroorganizmaların potansiyel psikobiyotik etkisi ile ilgili çalışmalar 18 Çizelge 2.5. Gıdalardan izole edilen LAB'nin GABA üretim potansiyeli 22 Çizelge 2.6. Gıdalardan izole edilen mayaların GABA üretim potansiyeli 24 Çizelge 3.1. Boza örneklerinin ham madde oranları 29 Çizelge 3.2. Boza örneklerinden elde edilen toplam izolat sayıları, geliştirildikleri sıvı ve katı besiyerleri ve inkübasyon koşulları. 38 Çizelge 3.3. Antibiyotik direnç analizinde kullanılan antibiyotikler ve konsantrasyonları 42 Çizelge 4.1. Boza örneklerinin 36. saat duyusal analiz sonuçları 46 Çizelge 4.2. Boza örneklerinin soğuk depolama (+4°C) 6.gün duyusal analiz sonuçları 49 Çizelge 4.3. Boza örneklerinin toplam aerobik mezofilik canlı bakteri sayım sonuçları 51 Çizelge 4.4. Boza örneklerinin toplam maya sayım sonuçları 54 Çizelge 4.5. Boza örneklerinin toplam fekal koliform bakteri sayım sonuçları 57 Çizelge 4.6. TS 9778’e göre bozanın mikrobiyolojik özellikleri 57 Çizelge 4.7. Boza örneklerinin Lactobacillus spp. sayımı sonuçları 58 Çizelge 4.8. Boza örneklerinin Lactococcus spp. sayımı sonuçları 60 Çizelge 4.9. Boza örneklerinin Enterococcus spp. sayımı sonuçları 62 Çizelge 4.10. Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4oC) sırasındaki pH değişimi 65 Çizelge 4.11. Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4oC) 66 sırasındaki titrasyon asitliğindeki değişim Çizelge 4.12. Boza örneklerinin kuru madde, su aktivitesi,EPS analizi sonuçları 69 Çizelge 4.13. Boza örneklerinin fermantasyon ve soğuk depolama (+4oC) boyunca Briks değerlerindeki değişim 72 Çizelge 4.14. Boza örneklerinin renk tayini sonuçları 74 Çizelge 4.15. Boza örneklerinin viskozite ölçümü sonuçları 75 Çizelge 4.16. Boza örneklerinin HPLC ile GABA miktarı tayini sonuçları 78 Çizelge 4.17. Farklı boza örneklerinden izole edilerek stoğa alınan LAB ve maya izolat sayıları 80 Çizelge 4.18. Gliserol stoğa alınan LAB ve maya izolatlarının izole edildikleri besiyerleri ve inkübasyon koşulları 81 xix Sayfa Çizelge 4.19. Geleneksel boza (K) örneğinden izole edilen LAB izolatlarının Gram boyama ve katalaz testi sonuçları ile mikroskobik morfolojileri 82 Çizelge 4.20. Chialı boza (C) örneğinden izole edilen LAB izolatlarının Gram boyama ve katalaz testi sonuçları ile mikroskobik morfolojileri 83 Çizelge 4.21. Kinoalı boza (Ki) örneğinden izole edilen LAB izolatlarının Gram boyama ve katalaz testi sonuçları ile mikroskobik morfolojileri 83 Çizelge 4.22. Chia ve kinoalı boza (CKi) örneğinden izole edilen LAB izolatlarının Gram boyama ve katalaz testi sonuçları ile mikroskobik morfolojileri 84 Çizelge 4.23. Farklı boza örneklerinden izole edilen maya izolatlarının kodları 86 Çizelge 4.24. Farklı boza örneklerinden elde edilen GABA üretim potansiyeli pozitif bulunan LAB ve maya izolat sayıları 88 Çizelge 4.25. Geleneksel boza (K) örneğinden izole edilen GABA üreticisi LAB izolatlarının agar damlatma testi yöntemine göre antimikrobiyal aktivite sonuçları 90 Çizelge 4.25. Geleneksel boza (K) örneğinden izole edilen GABA üreticisi LAB izolatlarının agar damlatma testi yöntemine göre antimikrobiyal aktivite sonuçları (devamı) 91 Çizelge 4.26. Chialı boza (C) örneğinden izole edilen GABA üreticisi LAB izolatlarının agar damlatma testi yöntemine göre antimikrobiyal aktivite sonuçları 92 Çizelge 4.27. Kinoalı boza (Ki) örneğinden izole edilen GABA üreticisi LAB izolatlarının agar damlatma testi yöntemine göre antimikrobiyal aktivite sonuçları 93 Çizelge 4.28. Chia ve kinoalı boza (CKi) örneğinden izole edilen GABA üreticisi LAB izolatlarının agar damlatma testi yöntemine göre antimikrobiyal aktivite sonuçları 94 Çizelge 4.29. Boza örneklerinden izole edilen GABA üreticisi maya izolatlarının agar damlatma yöntemine göre antimikrobiyal aktivite sonuçları 95 Çizelge 4.30. Boza örneklerinden izole edilen GABA üreticisi LAB izolatlarının agar difüzyon yöntemine göre antimikrobiyal aktivite sonuçları 97 Çizelge 4.31. Boza örneklerinden izole edilen GABA üreticisi LAB izolatlarının antibiyotik direnç analizi sonuçları 100 Çizelge 4.32. Boza örneklerinden izole edilen GABA üreticisi LAB izolatlarının in vitro sindirim modelindeki davranışı 105 Çizelge 4.33. Boza örneklerinden izole edilen GABA üreticisi LAB izolatlarının düşük pH ve %0,3 safra tuzu konsantrasyonuna dirençleri 107 Çizelge 4.34. Boza örneklerinden izole edilen GABA üreticisi ve probiyotik olduğu belirlenen LAB izolatlarının NCBI BLAST sonucu ve GABA üretim miktarları 110 1 1. GİRİŞ İnsanların yaşam tarzları ve beslenme alışkanlıkları tüm dünyada gün geçtikçe değişmekte, fonksiyonel beslenme ve sağlıklı yaşam konuları önem kazanmaktadır (Oleskin ve Shenderov, 2019; Oroojzadeh vd., 2022). Özellikle büyük kentlerde yaşam ve çalışma koşullarının zorlayıcı olması, hayatın hızlı akışı ve ekonomik zorluklar insanlarda ağır strese neden olabilmektedir. Bu durum bireylerde ani duygu durum değişimlerine, kuvvetli yalnızlık hissine, depresyona ve anksiyeteye sebep olmakta ve bireylerin diğer birçok fiziksel ve ruhsal sağlığı olumsuz etkileyebilecek durumlarla karşılaşma oranını yükseltmektedir (Giri ve Sharma, 2022; Wall vd., 2014). Tüm bu olumsuz etmenlerin (stres, zorlayıcı çalışma ve yaşam koşulları vb.) insan bağırsak mikrobiyotasını olumsuz etkilediği ve bunun bir sonucu olarak da bireylerdeki nöropsikiyatrik ve davranışsal bozuklukların arttığı yapılan çalışmalarla gösterilmektedir (Pepoyan vd., 2021; Sarkar vd., 2016; Tette vd., 2022). Probiyotik mikroorganizmaların insanlarda bağırsak mikrobiyotasının yenilenmesi ve güçlendirilmesi üzerine pozitif etkileri bulunmaktadır. Bu etkileri sayesinde bireylerde oluşan psikiyatrik ve davranışsal bozukluklar üzerine önleyici ve düzeltici etkilerinin de olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmektedir (Del Toro-Barbosa vd., 2020; Giri ve Sharma, 2022; Otaru vd., 2021). Nöropsikiyatrik bozukluklar üzerine çeşitli olumlu etkisi bulunan probiyotiklere psikobiyotik mikroorganizmalar adı verilmiştir (Del Toro- Barbosa vd., 2020). Psikobiyotik mikroorganizmaların kan-beyin bariyerinden geçebilen metabolitler ürettiği ve vücutta çeşitli değişimlere (nöral, hormonal ve immünolojik gibi) sebep olduğu ifade edilmektedir (Çetinbaş vd., 2017). Probiyotik mikroorganizmaları içeren fermente gıdaların aynı zamanda psikobiyotik mikroorganizmaları da içerebileceği düşünülmektedir (Del Toro-Barbosa vd., 2020; Dinan vd., 2013). Ülkemizde özellikle kış aylarında sıklıkla tüketilen geleneksel fermente tahıl ürünümüz olan bozanın da probiyotik mikroorganizmalarca zengin olduğu yapılan çalışmalar ile ortaya konulmuştur (Doğan ve Özpınar, 2017; Hancıoǧlu ve Karapınar, 1997; Kabak ve Dobson, 2011; Osimani vd., 2015; Petrova ve Petrov, 2017; S. D.Todorov vd., 2008; 2 Ucak vd., 2022). Boza; farklı tahılların (buğday, darı, çavdar, arpa, mısır, yulaf, pirinç gibi) kırmalarından veya unlarından, biri veya birkaçına suda pişirilmesi ve şeker ilave edilmesi sonrasında tekniğine göre laktik asit ve alkol fermantasyonlarına tabi tutulması ile hazırlanan, tatlı veya ekşimsi bir tada sahip, kendine özgü (mayamsı, asidik-alkollü) bir kokusu olan, koyu sarı renkte, koyu kıvamlı bir içecektir (Arici ve Daglioglu, 2002; Yeǧin ve Üren, 2008). Boza, mikrobiyotası LAB’leri ve mayalardan oluşan kompleks bir mikrobiyotadır (Anlı ve Şanlıbaba, 2019; S. D. Todorov vd., 2008). Bazı LAB’leri, bulundukları ortamdaki substrata bağlı olarak GABA üretme yeteneğine sahiptir. Psikobiyotik mikroorganizmaların da ürettiği bir nörotransmitter madde olan GABA, protein yapıda olmayan bir biyoaktif bileşendir ve insan vücudunda merkezi sinir sisteminde (MSS) sinir iletiminin uyarımı ve inhibisyonundan sorumludur (Yalçınkaya vd., 2019). Boza, farklı tahıllardan (buğday, darı, mısır, arpa, yulaf, pirinç, bulgur) çeşitli oranlarda katılarak üretilebilen bir fermente üründür (Arici ve Daglioglu, 2002). Bu tez çalışması kapsamında boza üretiminde kullanılacak olan tahıllardaki glutamik asit miktarına bağlı olarak fermantasyonu gerçekleştiren GABA üreticisi LAB’lerinin bozada çeşitli konsantrasyonlarda GABA üretme potansiyeli olabileceği düşünülmüştür. Chia ve kinoa, son yıllarda ülkemizde tüketimi artan, glutensiz, prebiyotik özellikli tahıl benzeri tohumlardır (Bueno vd., 2010; Demir ve Kılınç, 2016). Her iki ham maddenin prebiyotik özellikleri ve içerdikleri besinsel ögeleri (Özbek ve Şahin Yeşilçubuk, 2018), geleneksel boza üretiminde alternatif tahıl kaynağı olarak kullanılabileceğini; glutamik asit içeriklerinin yüksek olması (Chauhan vd., 1992; Yurt ve Gezer, 2018) ise boza üretiminde fermantasyon sonucu GABA üretim potansiyelinin de yüksek olabileceğini düşündürmüştür. Bu nedenle chia ve kinoa boza üretiminde kullanıldığında bozanın probiyotik özelliklerinin yanı sıra potansiyel psikobiyotik özelliğe de sahip olabileceği öngörülmüştür. Bu doktora tez çalışmasında; chia ve kinoanın boza üretiminde kullanılabilme potansiyeli araştırılmış, farklı tahıl ürünleri (kinoa, chia, darı, mısır) ile elde edilen bozalardan potansiyel psikobiyotik LAB ve mayaların izole edilmesi hedeflenmiştir. 3 Ayrıca, tez kapsamında üretilen bozaların GABA içerikleri belirlenmiş ve bozalardan elde edilen izolatların GABA üretim potansiyelleri tespit edilmiş ve GABA üreticisi olduğu belirlenen suşların probiyotik özellikleri de değerlendirilmiştir. 4 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Akdarı (Panicum miliaceum L.) Darılar, buğdaygiller ailesinden tek yıllık, birçok çeşidi olan küçük tohumlu bitkiler olup, genel olarak darı olarak adlandırılmaktadır. Darılar ilk kültüre alınan bitkiler arasında olup, binlerce yıldır yetiştirilmektedir. Darı çeşitleri tane büyüklüğüne göre minör ve majör olarak ikiye ayrılmakta, Akdarı minör darılar sınıfında bulunmaktadır. Akdarının (Proso millet, Panicum miliaceum L), orijini tam olarak bilinmemekle birlikte ilk kültüre alınan tahıllardan (muhtemelen buğdaydan önce) biri olduğu belirtilmektedir (Murshed, 2018). Asya ve Avrupa’da birçok ülkede doğrudan insan gıdası olarak tüketildiği için ekonomik önemi büyüktür. Akdarı, gıda endüstrisinde çeşitli ürünlerin üretiminde kullanılmaktadır. Bira, boza, un, ekmek, makarna, gevrek ve atıştırmalık ürünler gibi gıda ürünlerinin üretiminde kullanıldığı gibi kuş yemi olarak da kullanımı bulunmaktadır (Gültekin, 2021; Murshed, 2018). Hayvan yemi olarak kullanımı da yaygındır, çünkü besleyici bir tahıl olduğu için hayvanların sağlıklı büyümesi ve gelişmesi için önemli olmaktadır (Awika, 2011). Akdarı unu, glutensiz ürünlerin üretiminde buğday ununa alternatif olarak kullanılmaktadır (Taylor ve Duodu, 2015). Akdarı nişastası, gıda üretiminde koyulaştırıcı, stabilizatör ve jelleştirici olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, fonksiyonel gıdaların ve besin takviyelerinin üretiminde de önemli bir bileşendir (Awika, 2011). Akdarı taneleri diyet lifi, nişasta, mineral ve vitamince zengin bir kaynaktır. Akdarı, özellikle B vitaminleri (B1, B2, B3, B6 ve folat) açısından zengindir ve önemli miktarda demir, magnezyum, fosfor ve çinko içermektedir (Taylor ve Duodu, 2015). Akdarı içerdiği biyoaktif bileşenler ile düşük yoğunluklu lipoproteinin (LDL) kandaki miktarını azaltmakta ve karaciğerin vücuttaki faaliyetlerini pozitif yönde etkilemektedir (Gültekin, 2021). Ayrıca akdarı boza üretiminde kullanılan en kaliteli ham madde olarak bilinmektedir (Anlı ve Şanlıbaba, 2019). 5 Akdarı tanelerinin protein içeriği, diğer tahıllara kıyasla yüksektir ve esansiyel amino asitler bakımından dengelidir. Özellikle lisin gibi amino asitlerin varlığı, bu tahılı beslenme açısından değerli kılmaktadır (Saleh vd., 2013). Yapılan bir çalışmada darı tanelerinde en yüksek oranda bulunan amino asidin glutamik asit olduğu ve 100 g’da yaklaşık 2,13 g glutamik asit içerdiği tespit edilmiştir (Wiedemair vd., 2020). Ayrıca, darı taneleri glutensiz yapısı sayesinde çölyak hastaları ve gluten intoleransı olan bireyler için uygun bir alternatif olmaktadır (Saleh vd., 2013). Akdarının sağlık üzerindeki olumlu etkileri çeşitli araştırmalarla desteklenmiştir. Yüksek lif içeriği sayesinde sindirim sistemine faydalı olduğu bilinmekte, bağırsak hareketlerini düzenlemekte ve kabızlığı önlemektedir. Ayrıca, düşük glisemik indeksi ile kan şekeri seviyelerinin kontrolünde yardımcı olabilmektedir. Bu da diyabet hastası bireylere önemli bir avantaj sağlamaktadır (Knudsen, 2014). 2.2. Mısır (Zea mays L.) Mısır, buğdaygiller familyasından, orijini Amerika kıtası olan, dünyada ve ülkemizde en fazla tarımı yapılan tahıllardan birisidir. Amerika’da yapılan arkeolojik çalışmalarda 8000-10000 yıl öncesinde mısırın varlığı belirlenmiştir (Ulus ve Koca, 2023). Mısır, Zea mays everta (patlak mısır), Zea mays saccharata sturt (şeker mısır), Zea mays indendata (at dişi mısır), Zea mays indurata (sert mısır), Zea mays ceratina (mumsu mısır), Zea mays amylaceae (unlu mısır) ve Zea mays tunicata (kavuzlu mısır) olmak üzere yedi alt türden oluşan bir tahıl türüdür (A. Öztürk vd., 2019; Ulus ve Koca, 2023). Ülkemiz ekonomisi üzerinde de etkisi yüksek olan mısır bitkisi hem gıda hem de yem olarak kullanılabilmektedir. Bunun yanı sıra gıda sektöründe birçok ürünün (un, yağ, nişasta, tatlandırıcılar, etil alkol gibi) ham maddesi olarak karşımıza çıkmaktadır (Çağlar vd., 2017). Sıcak iklimlerde yetişen bir bitki olarak bilinen mısır, dünya nüfusunun artmasıyla birlikte çok yönlü kullanımı sebebiyle birçok ülkede en önemli tane tahıl ürünü haline gelmiştir (Keskin vd., 2018). Mısır, özellikle az gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde 6 insan tüketimi için çeltik ve buğdaydan sonra en fazla kullanılan ürünlerin başındadır (Ulus ve Koca, 2023). Mısır, enerji kaynağı olarak yüksek karbonhidrat içeriği ile bilinmektedir. Mısırdaki nişasta, sindirim sisteminde glikoza dönüşerek enerji sağlamakta, aynı zamanda önemli miktarda diyet lifi, protein, vitamin ve mineral içermektedir. Mısır tanelerinin, özellikle B grubu vitaminler (B1, B3, B5, B6 ve folat) ve E vitamini açısından zengin olduğu bilinmektedir. Ayrıca, potasyum, magnezyum ve fosfor gibi mineralleri de içermektedir (A. Öztürk vd., 2019). Mısırda antioksidan özellikleri olan fenolik bileşikler ve karotenoidler bulunmaktadır. Özellikle sarı mısır, lutein ve zeaksantin gibi karotenoidler bakımından zengindir. Bu bileşikler, göz sağlığını korumakta ve yaşa bağlı makula dejenerasyonunu önleyebilmektedir (Sommerburg vd., 1998). Tok tutması ve mide asidini absorbe etmesi, zengin lif içeriği (15,1 g diyet lifi/100g mısır) ve tercih edilen duyusal özelliklere sahip olması sayesinde sevilen bir gıda olarak bilinmektedir (J. W. Anderson vd., 2009; A. Öztürk vd., 2019). Mısır taneleri aminoasitler bakımından fakirdir ancak aminoasitlerden en fazla glutamik asiti (0,918-1,391 g/100g) içermektedir (Çağlar vd., 2017). Farklı tahılların GABA içeriklerinin incelendiği bir çalışmada bozanın ham maddelerinden biri olan mısırın GABA içeriği 199 nmol/g kuru ağırlık olarak bulunmuştur (Quílez ve Diana, 2017). 2.3. Chia (Salvia hispanica L.) Son yıllarda sağlıklı beslenme trendlerinin artmasıyla birlikte chia tohumu, süper gıda olarak adlandırılan besinler arasında yerini almıştır (Ullah vd., 2016). Nane familyasının (Lamiaceae) bir üyesi olan chia, beyaz, gri veya çoğunlukla siyah renkli, oval, yaklaşık 1 mm çapında tohumları olan, otsu, tek yıllık bir bitkidir (Erdoğdu ve Geçgel, 2019; Ixtaina vd., 2011). Chia tohumunun en iyi yetiştiği bölgeler tropikal iklimin hakim olduğu bölgelerdir. Özellikle Meksika ve Arjantin’de üretilen chia tohumu Güney Amerika’nın haricinde ayrıca Avustralya, Bolivya, Ekvador, Paraguay, Kolombiya ve Nikaragua gibi birçok ülkede de üretilebilmektedir (Bresson vd., 2009; Erdoğdu ve Geçgel, 2019; Timilsena vd., 2017). 7 Avrupa Komisyonu’nun talebi üzerine yeni bir gıda bileşeni olarak chianın halk sağlığı üzerine etkilerinin tartışıldığı ve çok sayıda bilim insanının katıldığı bir panelde “chia tohumlarının, ağır metal içeriğinin güvenli seviyelerde bulunduğu, gıda güvenliği için maksimum metal seviyelerini aşmadığı ve gıda güvenliğini ve halk sağlığını tehdit etmeyecek yeni bir gıda bileşeni olduğu” rapor edilmiştir (Bresson vd., 2009). Chia tohumunun alerjik olmadığı, herhangi bir toksik etki göstermediği ve gıdalara katılarak yenilebilir olduğu yapılan bilimsel çalışmalarla kanıtlanmıştır. Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), chia tohumunun gıda katkı maddesi kategorisinde olmadığını, insan tüketimine sunulabilecek bir gıda olduğunu kabul ettiğini belirtmiştir (Cassiday, 2017). Chia tohumu, besleyici özellikleri ile de oldukça dikkat çekmektedir. Yapılan çalışmalarda 100 g chia tohumunda yaklaşık olarak 486 kalori, 16,5 g protein, 42,1 g karbonhidrat (bu miktarın 34,4 g lif) ve 30,7 g yağ bulunduğu tespit edilmiştir (Ixtaina vd., 2011; Orona-Tamayo vd., 2017). Ayrıca, chia tohumu ɷ-3 yağ asitleri, antioksidanlar, vitaminler (B vitamini kompleksi) ve mineraller (kalsiyum, demir, magnezyum, fosfor ve çinko) açısından da zengindir (Coorey vd., 2014). Gluten içermemesi chia tohumunun önemli bir özelliği olmaktadır. Bu özelliğiyle de çölyak ve gluten alerjisi olan bireylerin tüketebileceği alternatif gıda kaynağı olmakta, ayrıca vegan veya vejeteryan tipte beslenen bireyler için de alternatif bir bitkisel kaynak olarak kullanılmaktadır (Bueno vd., 2010). Chia tohumu, %15 ile %23 arasında protein içermektedir. Buna karşılık yulaf ortalama %15,3, amarant %14,8, mısır ve buğday %14, arpa %9,2 ve pirinç %8,5 protein içermektedir. Dolayısıyla chia tohumunun protein içeriği söz konusu tahıllarının protein içeriğine göre daha yüksektir (Bresson vd., 2009). Chia tohumunun protein yapısı 9’u esansiyel aminoasit olmak üzere, 18 çeşit aminoasitten oluşmaktadır (Özbek ve Şahin Yeşilçubuk, 2018). Chia tohumu proteini yaklaşık %52 oranında globülin, %17,3 albümin, %14,5 gliadin ve %12,7 prolamin içermektedir (Demyanenko vd., 2019; Orona-Tamayo vd., 2017; Yurt ve Gezer, 2018). Chia tohumunda yüksek oranda bulunan proteinlerden biri olan globülin; amino asitlerden aspartik asit, glutamik asit, treonin ve histidini içermektedir. Glutamik asit, MSS’yi uyarmakta, bağışıklık fonksiyonlarını güçlendirmekte, sporcularda dayanıklılığı artırmaktadır ve bu özellikleri 8 ile metabolizma faaliyetleri için önemli bir amino asit olarak bilinmektedir (Woraharn vd., 2015). Chia tohumu unu, 7,0 g glutamik asit, 4,7 g aspartik asit, 4,2g arjinin ve 2,7 g metionin ve sistin amino asitlerini içermektedir. Arjinin, kalp-damar hastalıklarına karşı koruyucu etki gösterirken, aspartik asit ise sinir sisteminin işlevinin düzenlenmesine katkıda bulunmaktadır (Karolewicz vd., 2001; Meldrum, 2000). Chia tohumu, ekmek, kek, kurabiye gibi fırın ürünlerine eklenerek besin değerlerini artırmak için kullanılmaktadır. Ayrıca, gluten içermemesi nedeniyle çölyak ve gluten intoleransı olan bireyler için ideal bir ham madde olmaktadır (Borneo vd., 2010; Cassiday, 2017; Coorey vd., 2014). Chia tohumu, enerji içecekleri ve smoothie'ler gibi içeceklerde sıklıkla kullanılmaktadır. Su ile karıştırıldığında jel benzeri bir yapı oluşturmakta ve içeceklere farklı bir doku katmaktadır (Muñoz vd., 2013). Chia tohumu, granola barlar, enerji topları ve krakerler gibi sağlıklı atıştırmalıkların üretiminde de kullanılmaktadır. Yüksek besin değeri, bu ürünleri daha cazip hale getirmektedir (Sandoval-Oliveros ve Paredes-López, 2013). Chia tohumu, ayrıca yoğurt ve puding gibi süt ürünlerinde de kullanılmaktadır. Özellikle vegan yoğurt ve puding üretiminde bitkisel bir alternatif olarak tercih edilmektedir (Coorey vd., 2014). Chia tohumu, doğal bir koyulaştırıcı ve jelleştirici olarak da kullanılabilmektedir. Chia tohumunun su ile temas ettiğinde jelleşme özelliği olduğundan çeşitli gıdalarda yapısal iyileştirici olarak görev yapmaktadır (Muñoz vd., 2013). Chia tohumu, içerdiği yüksek ɷ-3 yağ asitleri sayesinde kalp sağlığını desteklemekte (Taga vd., 1984), yüksek lif içeriğiyle sindirim sistemini düzenlemekte, özellikle kabızlık gibi sorunlara karşı etkili olmakta (Reyes-Caudillo vd., 2008), yüksek lif ve protein içeriği sayesinde uzun süre tok kalmaya yardımcı olmaktadır (Chiang vd., 2021). Chia tohumu, karbonhidratların sindirilme hızını yavaşlatarak kan şekerinin daha dengeli bir şekilde yükselmesini sağlamaktadır. Bu, özellikle diyabet hastaları için önemli olmaktadır (Vuksan vd., 2010). 2.4. Kinoa (Chenopodium quinoa Wild) Kinoa (Chenopodium quinoa Wild) tek yıllık, çift çenekli ve C3 (karbon–3) bitkiler grubuna dahil edilen bir tane bitkisidir (Demir ve Kılınç, 2016; Jacobsen, 2003). 9 Arjantin, Bolivya, Ekvator, Kolombiya, Peru ve Şili’nin de içinde yer aldığı Güney Amerika And Bölgesi’nde 7000 yıldan uzun süreden beri kinoa yetiştiriciliğinin yapıldığı bilinmektedir (Chauhan vd., 1992; Demir ve Kılınç, 2016; Ruales ve Nair, 1992). Kinoa, protein içeriğinin yüksek olması ve esansiyel amino asitlerce zengin olması ile dikkat çekmektedir. Kinoanın protein içeriği diğer bazı tahıllardan yüksektir ve iyi kaliteli proteine sahip bir üründür (Repo-Carrasco-Valencia ve Serna, 2011; Valencia- Chamorro, 2003). Kinoanın 100 gramında yaklaşık 368 kalori, 14 g protein, 6 g yağ ve 64 g karbonhidrat bulunmaktadır (Rojas vd., 2011). Ayrıca, kinoa iyi bir lif kaynağı olup, demir, magnezyum, çinko ve B vitaminleri gibi önemli mikro besinleri içermektedir. Kinoa, glutensiz olması ile çölyak ve gluten hassasiyeti olan bireyler tarafından güvenle tüketilebilmektedir (Vega-Gálvez vd., 2010). Kinoa, esansiyel olmayan bir amino asit olan glutamik asit açısından da oldukça zengindir. Glutamik asit, MSS için önemli bir nörotransmitter olan glutamatın bir öncüsüdür ve beyin fonksiyonları için kritik öneme sahip olduğu bilinmektedir (Alvarez-Jubete vd., 2009). Kinoanın 100 gramında yaklaşık 1,2 g glutamik asit bulunmaktadır (Chauhan vd., 1992). Yapılan birçok araştırma kinoa ununun prebiyotik özellikte olduğunu bildirmiştir (Casarotti vd., 2014; Codină vd., 2016; Lorusso vd., 2018). Kinoa, gıda sektöründe yaygın olarak kullanılmakta, un haline getirilip, makarna, ekmek ve çeşitli atıştırmalık ürünlerin yapımında kullanılmakta (Bhargava vd., 2006) ya da diğer tahılların (buğday, çavdar gibi) unları ile karıştırılıp çeşitli ürünlerin üretiminde kullanılabilmektedir. Kinoa taneleri ve ürünleri, gluten içermemesi nedeniyle pseudo- cereal (tahıl benzeri) olarak adlandırılmakta ve gluten tüketemeyen bireylerin diyetlerinde güvenle kullanılabilen bir alternatif olmaktadır (Alvarez-Jubete vd., 2009). Ayrıca, kinoa sütü, bitkisel süt alternatifleri arasında popüler olmakta ve laktoz intoleransı olan bireyler için uygun bir seçenek olarak ortaya çıkmaktadır (Tang vd., 2015). Kinoa, salatalar, çorbalar ve garnitürlerde de sıkça kullanılmaktadır (Vega- Gálvez vd., 2010). 10 Kinoanın sağlık üzerinde birçok olumlu etkisi bulunmaktadır. İçerdiği yüksek miktarda protein ve lif, kilo kontrolüne yardımcı olmakta ve tokluk hissini artırmaktadır (Tang vd., 2015). Ayrıca, düşük glisemik indeksi sayesinde kan şekerini düzenlemeye yardımcı olabilmektedir (Bhargava vd., 2006). Kinoa, antioksidan özelliklere sahip fenolik bileşikler içermektedir ve bu bileşikler vücutta oksidatif stresi azaltarak kronik hastalıklara karşı koruyucu etki göstermektedir (Hirose vd., 2010). Ayrıca, kinoa tüketiminin kalp sağlığını desteklediği ve inflamasyonu azalttığı da bildirilmiştir (Watson ve Zibadi, 2013). 2.5. Boza Boza, geçmişi 8000-9000 yıl öncelerine uzanan, geleneksel fermente bir içecektir. Birçok kaynakta boza en eski bira veya biranın atası olarak kabul edilmektedir. Boza üretiminde hem laktik asit hem de alkol fermantasyonunun aynı anda gerçekleşiyor olması ve bira ile kıyaslandığında alkol oranının düşük olması (maksimum %2) bozanın biradan farklı olmasını sağlamaktadır (Levent ve Algan Cavuldak, 2017; Sağlam vd., 2018). Boza, ilk olarak Orta Asya’da üretilmiş, göç ile Anadolu topraklarına ve daha sonra da komşu ülkelere yayılarak buralarda da üretilmeye başlamıştır (Erkmen, 2011). Boza, Türkiye dışında, Balkanlar’da (Arnavutluk, Bosna-Hersek, Bulgaristan, Makedonya, Karadağ, Sırbistan, Romanya), Arap ülkeleri, İran, Kafkaslar, Kazakistan, Kırım, Kırgızistan, Kosova, Mısır, Macaristan, Türkistan ve birçok Afrika kabilelerinde, Volga çevresi’nde üretilip tüketilen fermente, koyu kıvamlı, ferahlık veren bir tahıl içeceğidir (Anlı ve Şanlıbaba, 2019; Altay vd., 2013; R. Cholakov vd., 2014; Yeǧin ve Üren, 2008). Türk Standartları Enstitüsü Boza Standardı’na (TS 9778) göre; “yabancı maddelerinden temizlenmiş darı, pirinç, buğday, mısır ve benzeri hububatın kırma veya unlarından biri veya birkaçına içme suyu katılarak pişirilmesi ve beyaz şeker ilave edilerek tekniğine uygun olarak alkol ve laktik asit fermantasyonlarına tabi tutulması ile hazırlanan bir ürün” olarak tanımlanmaktadır. Darı, buğday, çavdar, arpa, yulaf, mısır, pirinç gibi tahıllar bozanın başlıca ham maddesini oluşturmaktadır (Hancıoǧlu ve Karapınar, 11 1997). Boza üretiminde üretildiği bölgeye göre kullanılan ham maddelerin (ekmek, bulgur gibi) de değişiklik gösterdiği bilinmektedir. Ülkemizde en çok darı ve mısır kullanılarak boza üretimi gerçekleştirilmektedir (Anlı ve Şanlıbaba, 2019). HAM MADDE (ÖN HAZIRLIK) • Temizleme • Kırma/öğütme ▼ PİŞİRME • 1-2 saat • Ham maddenin 5 katı su ile (a/h) ▼ SOĞUTMA VE SÜZME ▼ HAM BOZA ▼ ŞEKER İLAVESİ • %15-20 toz şeker ▼ MAYA İLAVESİ • %2-5 oranında • Fermente boza, yoğurt veya ekşi hamur ilavesi ▼ FERMANTASYON • 25-30oC’de 24-36 saat ▼ SOĞUTMA • 15oC’nin altına ▼ AMBALAJLAMA VE DEPOLAMA Şekil 2.1. Maya kullanarak (back-slopping) fermantasyon ile boza üretim akış şeması (Yeǧin ve Üren, 2008; Erkmen, 2011; Anlı ve Şanlıbaba, 2019). Boza, ülkemizde özellikle kış aylarında tarçın ilave edilerek, tercihe göre leblebi ile beraber tüketilebilen koyu kıvamlı, tatlı veya hafif ekşi, koyu sarı renkli, kendine özgü (alkollü/mayalı) bir kokusu olan, fermente bir gıdadır (Arici ve Daglioglu, 2002). Boza üretiminde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Boza üretimi Şekil 2.1’de gösterildiği gibi maya kullanarak (back-slopping) fermantasyon ile yapılacak ise ilk aşamada ham madde temizlenip, öğütüldükten sonra pişirme, soğutma, süzme işlemi yapılmaktadır. Bu işlemlerden sonra elde edilen ham bozaya %15-20 oranında şeker ilave edilmektedir. Bir sonraki aşamada şekerli ham bozaya % 2-5 oranında maya (ekşi hamur, yoğurt veya eski boza) eklenmekte ve ham boza 25-30oC’de 24-36 saat süreyle fermantasyona bırakılmaktadır. Fermantasyon tamamlandıktan sonra boza hızlı bir şekilde 15oC’nin 12 altındaki sıcaklıklara soğutulmakta ve ambalajlanıp depolanmaktadır (Yeğin ve Üren, 2008; Erkmen, 2011; Anlı ve Şanlıbaba, 2019). Boza üretimi doğal fermantasyonla da gerçekleştirilebilmektedir. Doğal fermantasyonla boza üretiminde ham boza eldesine kadar olan aşamalar (ham madde temizleme, öğütme, pişirme, soğutma, süzme) maya kullanarak yapılan fermantasyondaki üretim ile aynı olmaktadır. Bu yöntemde süzme aşamasından sonra ham boza, 25-30oC’de 24-36 saat boyunca, açık kazanda, herhangi bir kültür ilavesi olmadan fermantasyona bırakılmaktadır. Fermantasyon tamamlandıktan sonra bozaya %15-20 oranında şeker ilavesi yapılmakta ve gerekirse viskozite değerlerine göre kıvamını ayarlamak için su ilavesi yapılmaktadır. Sonrasında boza hızlıca 15oC’nin altına soğutulmakta ve ambalajlanıp depolanmaktadır (Akpinar-Bayizit vd., 2010; R. Cholakov vd., 2016, 2017). Çizelge 2.1. Boza fermantasyonunda rol alan bazı bakteriler (Hancıoǧlu ve Karapınar, 1997; Kabak ve Dobson, 2011; Osimani vd., 2015; Petrova ve Petrov, 2017) BAKTERİLER Lacticaseibacillus paracasei Pseudomonas pentosaceus Lactobacillus pentosus Leuconostoc lactis Lactiplantibacillus plantarum Leu.mesenteroides Levilactobacillus brevis Leu.oenos Lacticaseibacillus rhamnosus Leu.mesenteroides subsp. dextranicum Limosilactobacillus fermentum Leu. raffinolactis Lactobacillus acidophilus Weissella confusa Lactobacillus coprophilus W. paramesenteroides Lactobacillus cornyformis Lc. lactis subsp. lactis Lactobacillus sanfranciscensis Enterococcus faecium Bozada fermantasyonda rol oynayan birçok farklı mikroorganizma bulunmaktadır (Çizelge 2.1 ve Çizelge 2.2). Başlıca homofermantatif LAB, heterofermantatif LAB ve mayalar fermantasyondan sorumludur. Bozada fermantasyonda rol alan bakterilerin ve mayaların sayı ve cinsi, kullanılan ham maddenin çeşidine ve hangi oranda kullanıldığına göre de oldukça değişkenlik göstermektedir (Altay vd., 2013; R. Cholakov vd., 2014; S. D. Todorov vd., 2008). Bozada mayaların rol aldığı alkol fermantasyonu ve LAB’leri tarafından gerçekleştirilen laktik asit fermantasyonu olmak 13 üzere iki çeşit fermantasyon eş zamanlı gerçekleşmektedir. Alkol fermantasyonu ile boza, fermantasyonla oluşan CO2’in etkisiyle kabarmakta ve hacmi artmaktadır. Ayrıca alkol fermantasyonu sonucu oluşan diğer metabolitler ise bozanın koku ve tat özellikleri üzerine etkili olmaktadır. Laktik asit fermantasyonu ise bozanın asidik karakterinin kazanmasını sağlayan ve lezzeti üzerinde başlıca etkili olan bir diğer fermantasyondur (Erkmen, 2011; Anlı ve Şanlıbaba, 2019). Fermantasyon aşaması boza üretimindeki en kritik aşamalardan birisidir. Fermantasyon aşamasında kontrolsüz koşullarda üretilen bozaların duyusal özellikleri hızla kötüye gitmekte, alkol tadı baskınlaşmakta, raf ömrü boyunca kıvam sorunları (pütürlülük, fazla akışkanlık, lapa görüntü vb.) meydana gelmektedir (Heperkan vd., 2014; Levent ve Algan Cavuldak, 2017; Osimani vd., 2015). Çizelge 2.2. Boza fermantasyonunda rol alan bazı mayalar (Hancıoǧlu ve Karapınar, 1997; Kabak ve Dobson, 2011; Osimani vd., 2015; Petrova ve Petrov, 2017) MAYALAR Candida spp. Rhodotorula spp. C. diversa R. araucariae C. inconspicua R. mucilaginosa C. pararugosa Saccharomyces spp. C. glabrata S. uvarum C. quercitrusa S. cerevisiae C. silvae S. boulardii C. tropicalis Pichia spp. P. fermentas P. guilliermondii P. norvegensis TS 9778 Boza standardına göre, “bozanın toplam kuru madde oranı en az %20, kül miktarı en çok %0,2, sakaroz cinsinden toplam şeker miktarı en az %10, alkol oranı ise hacimce %2’yi geçmemelidir”. Standartta asitlik değerine göre boza, “tatlı boza” ve “ekşi boza” olmak üzere iki temel sınıfta tanımlanmaktadır. Tatlı ve ekşi bozada laktik asit cinsinden toplam asitlik değeri sırasıyla %0,2-0,5 ve %0,5-1,0 olarak belirtilmektedir (Anlı ve Şanlıbaba, 2019). Boza; sindirimi kolay, vitamin ve mineral içeriği yüksek (Kabak ve Dobson, 2011) kullanıldığı tahılın çeşidine bağlı olarak glutensiz olarak da üretilebilme potansiyeline 14 sahip ve glutene karşı hassasiyeti olan bireyler tarafından da rahatlıkla tüketilebilecek (Göncü vd., 2023) fermente bir ürünüdür. Fermente süt ürünleri ile kıyaslandığında nispeten düşük esansiyel amino asit ve yağ içeren (Kabak ve Dobson, 2011), ayrıca bitki temelli bir ürün olduğu için vegan veya vejeteryan bireyler arasında da popülerliğini koruyan bir üründür. Yapılan çalışmalar bozanın esansiyel yağ asitleri açısından zengin olduğunu, mikrobiyotası sayesinde kolon sağlığını iyileştirdiğini (Petrova ve Petrov, 2017), kan basıncını dengelediğini (Kancabaş ve Karakaya, 2013), emziren kadınlarda süt verimini artırdığını (Petrova ve Petrov, 2017), mide sıvısının üretimini artırarak sindirimi kolaylaştırdığını (Arici ve Daglioglu, 2002; Petrova ve Petrov, 2017), hiperglisemi, oksidatif stres ve inflamasyon üzerinde pozitif etkilerinin olduğunu (Levent ve Algan Cavuldak, 2017) göstermiştir. Bozanın içerdiği potansiyel probiyotik bakterilerin aynı zamanda psikobiyotik özeliklerinin de olabileceği düşünülmektedir. Türkiye’de ticari olarak üretilen 23 boza örneği ile yapılan bir çalışmada örneklerin mikrobiyotası metagenomik analiz ile incelenmiştir. Boza örneklerinin baskın olarak Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc ve Streptococcus cinslerine ait bakteri türlerini içerdiği bildirilmiştir. Boza örneklerinde ayrıca E. faecium bulunduğu ifade edilmiştir. Test edilen 23 boza örneğinin asitliğinin %0,14-0,51, pH’ının 3,00-4,07, protein miktarının 0,35-1,23 mg/100 mg, toplam şeker miktarının 9,64-19,21 mg/100 mg boza, toplam kül miktarının 0,05-0,18 mg/100 mg kuru örnek, toplam kuru madde miktarının 13,79-28,04 mg/100 mg arasında değiştiği belirtilmiştir (Ucak vd., 2022). Bir diğer çalışmada, Bulgar bozasından izole edilen bakteriyosin üreticisi Enterococcus faecium ST10Bz suşunun DNA’sının PZR analiz sonuçlarında bakterinin genetik yapısında tutunma genleri olan map, mub ve ef-tu’nun ve GABA üretimi ile ilişkili olan gen gad’ın varlığına dair pozitif bulguların elde edildiği bildirilmiştir (Valledor vd., 2020) Yapılan çalışmalardan da anlaşılacağı gibi bozada bulunan mikroorganizmaların (Çizelge 2.1 ve Çizelge 2.2) birçoğu (Lb. plantarum, Lb. paracasei, Lc. lactis, Leu. mesenteroides, Weisella spp., Lb. brevis, P. pentosaceus, E. faecium) farklı fermente gıdalardan da izole edilmiş ve GABA üretme potansiyeli göstermişlerdir (Diez- Gutiérrez vd., 2022; Quílez ve Diana, 2017; Sakkaa vd., 2022; Wall vd., 2014). Bu 15 çalışmalar bozanın mikrobiyotasında potansiyel GABA üreticisi mikroorganizmaların olabileceğine işaret etmektedir. Bozanın üretiminde kullanılan hammaddelerin içerdiği glutamik asit miktarı da mikroorganizmalarca üretilecek olan GABA’nın miktarını etkileyecek bir diğer faktördür (Quílez ve Diana, 2017; Siragusa vd., 2007; Woraharn vd., 2016). Çünkü GABA üretimi, L-glutamik asitin bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalarda bulunabilen bir enzim olan glutamat dekarboksilaz (GAD) enzimi tarafından dekarboksilasyonu ile gerçekleşmektedir. O nedenle GABA üreticisi suşların yanı sıra, boza üretiminde L-glutamik asit içeriği yüksek ham maddelerin seçilmesinin son üründe GABA üretim miktarının artırılması açısından önemli olacağı düşünülmüştür. Kinoa ve chia tohumları yüksek protein ve aminoasit kaynağı olarak bilinmektedir. Kinoanın 100 gramında yaklaşık 1,2 g glutamik asit bulunmakta (Chauhan vd., 1992), chia tohumu unu ise 7,0 g/100 g protein glutamik asit içermektedir (Sandoval-Oliveros ve Paredes-López, 2013). Farklı tahılların GABA içeriklerinin incelendiği bir başka çalışmada da bozanın ham maddelerinden biri olan mısırın GABA içeriği 199 nmol/g kuru ağırlık olarak bulunmuştur (Quílez ve Diana, 2017). 2.6. Psikobiyotik Mikroorganizmalar Günümüzdeki hızlı yaşam ve çalışma koşulları insanların gün içinde ağır strese maruz kalmasına ve ruh sağlığının bozulmasına neden olmaktadır. Bunun bir sonucu olarak insanlarda duygu durum bozukluğu, depresyon, anksiyete vb. ruhsal problemler daha fazla görülmektedir (Oleskin ve Shenderov, 2019). Dünya Sağlık Örgütü’nün (2018) raporuna göre dünya üzerinde 300 milyondan fazla insan depresyon yaşamaktadır ve bunların birçoğu ayrıca anksiyeteye de maruz kalmaktadır. Bu durum insanların hayat kalitesini düşürmekte ve başka sağlık sorunlarına da sebebiyet vermektedir (Palepu ve Dandekar, 2022). Son yıllarda yapılan çalışmalar bağırsak sağlığı ile akıl sağlığı arasında bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. İnsan bağırsak mikrobiyotası ile MSS arasındaki ilişki “bağırsak-beyin ekseni’’ olarak tanımlanmıştır (Wall vd., 2014). Bilimsel çalışmalar bağırsak mikrobiyotamızın genel sağlığımız için önemini göstermekte ve hatta bağırsak mikrobiyotası “ikinci beyin” olarak adlandırılmaktadır. Bağırsak mikrobiyotasının insan 16 vücudunda ikinci beyin olarak adlandırılmasının bir diğer sebebi de mikrobiyotanın akıl sağlığı üzerine olan potansiyel etkilerinden kaynaklanmaktadır (Sarkar vd., 2016; Wall vd., 2014). Araştırmacılar, insanların akıl sağlığı ve MSS üzerine etkileri olan bu mikroorganizmaları “psikobiyotik” olarak adlandırmıştır (S. Anderson, 2019; Barros vd., 2020; Giri ve Sharma, 2022; Mörkl vd., 2020; Özer vd., 2019). Daha kapsamlı olarak tanımlandığında psikobiyotik mikroorganizmalar; belirli miktarda tüketildiklerinde konak organizmanın bağırsak mikrobiyotası ile etkileşime girerek sinir sistemine pozitif etkileri olan probiyotik mikroorganizmalardır (Casertano vd., 2022; Cheng vd., 2019; Del Toro-Barbosa vd., 2020; Otaru vd., 2021; Thakur ve Tariq, 2019). Psikobiyotik mikroorganizmaların, vücutta kan-beyin bariyerinden geçebilen metabolitler (Çizelge 2.3) ürettiği ve bu sayede insan vücudunda sinir sisteminde, hormonlar ve bağışıklık üzerinde olumlu değişimlere sebep olduğu ifade edilmektedir (Çetinbaş vd., 2017; Needham vd., 2022). Bundan dolayı bağırsak-beyin ekseninde herhangi bir anormallik olması durumunda hem sindirim sistemi hem de MSS’yle ilgili rahatsızlıklar görülebileceği bildirilmiştir. Yapılan çalışmalara göre psikobiyotikler vücutta etkilerini üç farklı şekilde gösterebilmektedir (Beck vd., 2019; Del Toro- Barbosa vd., 2020) : • Bağışıklı sistemini doğrudan etkilemek, • Sistemik inflamasyonu azaltmak ve hipotalamik-hipofiz-adrenal (HPA) ekseni boyunca stres tepkisini etkilemek, • Çeşitli biyoaktif maddeler üretmek (biyoaktif peptidler ve proteinler, nörotransmitter maddeler ve kısa zincirli yağ asitleri gibi). Bir mikroorganizmanın psikobiyotik potansiyeli belirlemek için kesinleşmiş bir yöntem bulunmamaktadır. Ancak literatürde çoğunlukla uygulanan ve sonuç alınan iki farklı yaklaşım bulunmaktadır. Bunlardan ilki olan pre-klinik yaklaşımda, in vitro veya in vivo çalışmalar bulunmaktadır. In vitro çalışmalarda mikroorganizmanın üretmiş olduğu psikobiyotik özelliğe neden olan metabolitlerin (biyoaktif peptidler, nörotransmitter maddeler, GABA veya kısa zincirli yağ asitleri gibi) düzeyi belirlenmekte ya da hayvan hücre kültürleri kullanılarak çeşitli hormonların (serotonin, dopamin vb.) üretimine etkisi incelenmektedir. In vivo çalışmalarda, hayvan modelleri (fare/sıçan) kullanılarak 17 davranış testleri uygulanmakta ve mikroorganizmanın neden olduğu biyolojik değişimlerin (hormonal, immünolojik, nöronal) tespiti yapılmaktadır (S. Anderson, 2019; Del Toro-Barbosa vd., 2020; Luang-In vd., 2020). İkincisinde (klinik yaklaşım) insan deneyleri (davranışsal testler), biyolojik işaretçilerin kandaki düzeylerinin tespiti veya görüntüleme teknikleri kullanımıyla mikroorganizmanın psikobiyotik potansiyeli değerlendirilmektedir. Çizelge 2.3. Psikobiyotik bakterilerin üretmiş oldukları metabolitler ve sağlık etkileri (Oleskin ve Shenderov, 2019; Oroojzadeh vd., 2022; R. Sharma vd., 2021; Tette vd., 2022; Wall vd., 2014; Yalçınkaya vd., 2019) Mikroorganizma Üretilen metabolit Sağlık üzerine etkisi Lactobacillus, Bifidobacterium, Levilactobacillus brevis, Lacticaseibacillus rhamnosus, Bifidobacterium longum, Lactococcus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus GABA Anksiyete ve depresyonda azalma, hayatı olumsuz yönde etkileyen faktörleri azaltma (psikolojik problemler, bağışıklık problemleri uykusuzluk gibi) Escherichia, Streptococcus, Enterococcus Lactobacillus, Lactococcus, Saccharomyces cerevisiae Serotonin Canlılık ve zindelik hissi, ruhsal durumun düzenlenmesi, mutluluk Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, S. cerevisiae Dopamin Kan basıncının yükselmesi, kalp atışlarının hızlanması, Parkinson hastalığının tedavisi veya semptomlarının hafifletilmesi, nörohormon üretiminin teşvik edilmesi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus Histamin Lokal bağışıklık yanıtı oluşturulması, bağırsaktaki fizyolojik fonksiyonlar üzerine etki Bacillus subtilis Norepinefrin Odaklanma, çevreye cevap verme, dikkat gibi zihinsel yeteneklerin düzenlenmesi Lacticaseibacillus casei, Levilactobacillus brevis Glutamik asit ve Taurin Glutamik asit, koku, tat ve açlık ile ilişkili olurken; taurin, beyinde iletişim mekanizmasını düzenlemektedir. Lactobacillus Asetilkolin Öğrenme ve hafızayı güçlendirme, Alzheimer ve Parkinson hastalıklarında olumlu etki Psikobiyotik mikroorganizmalar; otizim gibi hastalıklarda davranışların olumlu yönde etkilenmesi ve hastalık semptomlarının azalması, psikolojik durumun iyileşmesi, depresyon ve anksiyetede hafifleme, hafıza, öğrenme, kavrama gibi zihinsel yeteneklerde artış, Alzheimer/Parkinson gibi sinirsel hastalıkların önlenmesi ve 18 semptomlarının hafifletilmesi ve tedavisi gibi vücutta psikiyatrik ve sinirsel olumlu etkiler yaratmaktadır (Oleskin ve Shenderov, 2019). Psikobiyotikler, β-glukorinidaz enzimi sentezlemekte ve östrojen hormonunu aktif olmayan formdan aktif forma dönüştürerek hormonun seviyesini ayarlayabilmektedir. Ayrıca psikobiyotik mikroorganizmalar, tiroit hormonuna da benzer bir mekanizma ile etki etmektedir. Psikobiyotik mikroorganizmalar fermente gıdaların üretiminde fermantasyon aşamasında çeşitli biyoaktif metabolitler ürettiği gibi, tüketicinin bağırsağına kolonize olarak da bu metabolitleri (Çizelge 2.3) üretebilmekte veya metabolitlerin üretimini artırıcı etki gösterebilmektedir (Bermúdez-Humarán vd., 2019; Hemarajata ve Versalovic, 2013; Zagórska vd., 2020). Çizelge 2.4. Fermente gıdalar ve içerdiği mikroorganizmaların potansiyel psikobiyotik etkisi ile ilgili çalışmalar (Del Toro-Barbosa vd., 2020; Dinan vd., 2013; Sarkar vd., 2016) Gıda Suş Model Doz Psikobiyotik Etkisi Referans Kefir Acetobacter sp., A. aceti, Lb. delbrueckii, Limosilactobacillus fermentum, Lb. fructivorans, Enterococcus faecium, Leuconostoc sp., Lb. kefiranofaciens, Candida famata, C. krusei Klinik 2 mL/kg/gün 90 gün boyunca Hafızada gelişme, görsel-mekansal/ soyutlama yetenekler ve yönetici/dil işlevleri Ton vd., 2020 Pastörize edilmemiş süt ve süt ürünü Lactobacillus Klinik 12 haftanın öncesi ve sonrasında serbest tüketim Yetişkinlerde stres ve anksiyete skorunu azaltma Butler vd., 2020 Fermente Süt Lacticaseibacillus casei Shirota Klinik 100 mL fermente süt 8 hafta boyunca günde 1 kez Stresli durumlara maruz kaldığında sağlıklı deneklerde artan dışkı serotonin seviyeleri ve azalmış fiziksel semptomlar Kato- Kataoka vd., 2016 B. animalis subsp. lactis I- 2494, S. thermophilus I-1630, Lb. bulgaricus I-1632 ve I- 1519, ve Lc. lactis subsp. lactis I-1631 125 mL fermente süt 4 hafta boyunca günde 2 kez Sağlıklı kadınlarda duygu ve duyunun merkezi işleyişini kontrol eden beyin bölgelerinin aktivitesini etkilenmesi Tillisch vd., 2013 Lb. acidophilus, Lb. casei, B. bifidum ve Lb. fermentum 200 mL/gün 12 hafta boyunca Alzheimer hastalarında (60-95 yaş) olumlu bir bilişsel işlev Akbari vd., 2016 Lacticaseibacillus casei Shirota YIT 9029 Klinik ve in vivo fare deneyi 8 hafta boyunca günde 1 kez 100 mL fermente süt Stresli deneklerin fiziksel semptomlarının azalması Takada vd., 2016 Fermente pirinç kepeği S. cerevisiae IFO 2346 In vivo fare deneyi 1 g/kg/gün fermente pirinç kepeği sıcak su ekstraktı Sıçanlarda ve farelerde gösterilen anti-stres ve yorgunluk önleyici etkiler Kim, vd. 2002 Fermente gıdaların birçoğu potansiyel probiyotik bakteriler açısından oldukça zengindir. Fermente gıdalardaki probiyotik potansiyelli mikroorganizmalar, bağırsak 19 bariyerini koruma, patojen gelişimini engelleme, besinlerden yararlanmayı artırma (Rocks vd., 2021) gibi önemli sağlık etkilerinin yanı sıra gıdada gelişme gösterirken nörotransmitter maddeler üreterek veya doğrudan bağırsak ve beyin arasındaki sinir yollarının aktivasyonuyla nörotrofik kimyasalları modüle ederek ve analjezik etki göstererek beyin sağlığı üzerine de etki etmektedir (Del Toro-Barbosa vd., 2020). Yapılan çalışmalarda fermente gıdaların psikobiyotik etkileri çoğunlukla klinik olarak anket yöntemleri ile insanlar üzerinde veya hayvan modellerinde davranış çalışmaları kullanılarak incelenmiştir (Çizelge 2.4). Ancak, çalışmalarda fermente gıdaların veya içerisindeki mikroorganizmaların pre-klinik olarak in vitro ve in vivo fizyolojik etkileri (hayvan modellerinde vücuttaki nörotransmitter miktarına ve bağırsaktaki nörotransmitter salınımına etkisi vb.), fermente gıdalardaki nörotransmitterlerin varlığı ve miktarı incelenmediğinden fermente gıdaların ve içerdikleri mikroorganizmaların psikobiyotik etkileri tam anlaşılamamıştır (Dinan vd., 2013; Sarkar vd., 2016). 2.7. Gamma Amino Bütirik Asit (GABA) GABA, protein yapısına katılmayan dört karbonlu bir aminoasit ve biyoaktif bir bileşendir (Chua vd., 2018; Tsai vd., 2006; Valenzuela vd., 2019; Yalçınkaya vd., 2019). GABA esas olarak beynin korteks bölgesinde inhibitör bir nörotransmitter olarak bilinmektedir ve nöronal uyarılabilirliği düzenlemek için çalışmaktadır (Boonstra vd., 2015; Chua vd., 2018). Bu amino asit sadece fizyolojik sistemimizde değil aynı zamanda bitkilerde, hayvanlarda ve mikroorganizmalarda da yaygın olarak bulunmaktadır (Şekil 2.2). Bitkilerde ve mikroorganizmalarda Krebs döngüsündeki rolü ile bilinirken, hayvanlarda ise sinir sinyali nörotransmitteri olarak bilinmektedir. Sağlık, medikal malzemeler, ilaç ve beslenme alanlarında ve özellikle son zamanlarda naylon ve diğer bileşiklerin üretimindeki geniş uygulamaları bu basit aminoasidi oldukça önemli hale getirmiştir (Jain ve Ghodke, 2021). 20 Şekil 2.2. GABA’nın moleküler yapısı GABA üretimi (Şekil 2.3), bakterilerin yanı sıra bitki ve hayvanların da sahip olabildiği bir enzim olan glutamat dekarboksilaz (GAD) tarafından L-glutamik asitin dekarboksilasyonunu içeren bir mekanizmadır (Kurohara vd., 2001; Siragusa vd., 2007; Yalçınkaya vd., 2019). Bu mekanizmada GABA, L-glutamatın geri dönüşümsüz α- dekarboksilasyonu ve bir sitoplazmik proton tüketimi ile piridoksal-5'-fosfata (PLP, B6 vitamini) bağımlı enzim olan GAD yardımıyla sentezlenir. PLP hücrede, GAD’ın ko- faktörü olarak görev yapmaktadır ve apo-GAD’ı halo-GAD’a çevirerek aktif hale getirmektedir (Chua vd., 2018). Monosodyum glutamat (MSG) veya L-glutamik asitten GABA üretimi bakterilerde genellikle spesifik bir glutamat/gama-amino butirat antiporteri (hücre zarında vitamin/enzim gibi maddeleri taşıyan membran proteini) aracılığıyla eş zamanlı olarak gerçekleşmektedir. Bu enzimler bakterilerde gadB ve gadC genleri tarafından kodlanmaktadır (Yunes vd., 2016). Mikroorganizmalarda GABA üretiminde en önemli faktörlerden biri ortamın pH’ıdır. GAD enzimi nötral pH’larda sitoplazmada inaktif halde bulunurken, asidik ortamlarda membrana taşınmakta ve aktif hale geçmektedir (Xiao ve Shah, 2021). Bunun yanı sıra ortamda bulunan karbon ve azot kaynağının çeşidi ve miktarı, GAD enzimi aktivitesi de GABA üretimi için hayati öneme sahip parametreler olmaktadır (Chua vd., 2018; Xiao ve Shah, 2021). 21 Şekil 2.3. GABA üretim mekanizması (Chua vd., 2018; Jain ve Ghodke, 2021; Yalçınkaya vd., 2019) GABA, fermantasyon sırasında gıdalarda mikroorganizmalar tarafından üretilebildiği gibi bağırsak mikrobiyotasında bulunan bakteriler tarafında insan vücudunda da sentezlenebilmektedir (Mousavi vd., 2022). Yapılan birçok çalışmada LAB’lerinin ve mayaların GAD enzimini ürettiği tespit edilmiştir (Dahiya ve Nigam, 2022; Sahab vd, 2020). Tüketildiklerinde mental sağlığa olumlu etkileri bulunan ve probiyotik olarak sınıflandırılan psikobiyotik mikroorganizmaların, bağırsak-beyin ekseninde etkili olan GABA gibi nöroaktif bileşenleri üretebildikleri ifade edilmiştir (Dinan vd., 2013; R. Sharma vd., 2021; Tette vd., 2022). GABA ile ilgili yapılan çalışmalar incelendiğinde GABA'nın farklı organizmalarda çok sayıda fizyolojik fonksiyona sahip olduğu bildirilmiştir (Monteagudo-Mera vd., 2023). Memelilerin MSS’deki ana nörotransmitter maddelerdendir ve sinir iletiminin uyarımı ve inhibisyonunu kontrolden sorumludur (S. M. Han ve Lee, 2017; Tette vd., 2022). Memelilerde beyindeki GABA sentezi esas olarak GAD67 enzimi tarafından gerçekleştirilmektedir. Yapılan bazı çalışmalarda gıdalar ile alınan GABA'nın kan beyin bariyerini geçme yeteneğinden yoksun olduğu bildirilmiştir. Gıdanın içerisinde vücuda alınan GABA, kan beyin bariyerini geçemese de farklı hayvan çalışmaları ve insan denemeleri gıdaların tüketimi ile vücuda alınan GABA’nın sağlığa çok sayıda olumlu 22 faydasının olduğunu göstermektedir. Bu yararlardan bazıları; stresi ve yan etkilerini azaltma, tansiyonu dengeleme, kardiyovasküler riski azaltma, antidiyabetik, antidepresan ve sakinleştirici etki olarak sayılabilmektedir (Boonstra vd., 2015; Chua vd., 2018). Yapılan çalışmalarda GABA’nın sağlık üzerine etkileri ve genellikle fermente gıdalardan izole edilen ve çoğu GRAS (generally recognized as safe) olarak kabul edilen LAB’lerinin GABA üretimi üzerinde durulmuştur (Kanklai vd., 2021; Perpetuini vd., 2020; P. Sharma vd., 2022; Tsai vd., 2006). Mayaların GABA üretimi ile ilgili çalışmalar LAB’lerine kıyasla oldukça sınırlıdır ve bozadan izole edilen mayaların psikobiyotik potansiyeli ve GABA üretim yeteneklerini inceleyen çalışmalara literatürde rastlanmamıştır (Çizelge 2.5 ve Çizelge 2.6). Çizelge 2.5. Gıdalardan izole edilen LAB’lerinin GABA üretim potansiyeli Gıda Ülke Mikroorganizma GABA üretme yeteneği Referans Kimchi İspanya L. plantarum K16 1000 mg/L (12 g/L of maya ekstratı, 500mM MSG içeren MRS broth, 34oC’de 96 saat fermantasyon) Diez-Gutiérrez vd., 2022 Çikolata Türkiye L. rhamnosus NRRL B-442 59000 mg/L Ozer vd., 2022a Karides Mısır Enterococcus faecium SH9 0,97 g/L (%1 MSG ilave edilmiş MRSB’de) Sakkaa vd., 2022 Fermente dut suyu Tayland Levilactobacillus brevis F064A 3,31 mg/mL (%2 MSG’li dut suyunda, 37oC’de 48 saat fermantasyon ile) Kanklai vd., 2021 Lahana turşusu Tayland Enterobacter xiangfangensis 4,6 µg/mL (20 mg/mL MSG’den) Luang-In vd., 2021 Kefir Tayland Bacillus spp. PS15 5,57 µg/mL (20 mg/mL MSG’den) Fermente süt Çin Str.thermophilus 8,3 mg/L M. Han vd., 2020 Paork kampus Kamboçya Lb. plantarum 20,34 mM Ly vd., 2019 Pico peyniri İrlanda L.plantarum L2A21R1 937 mg/L (30mg/mL MSG ilave edilmiş MRS broth’ta) Ribeiro vd., 2018 Yoghurt- amazake Japonya Str. thermophilus Hp 1096 µM (ilave MSG yapılmamış) Ohmori vd., 2018 Kung-som Tayland L. futsaii CS3 10,130 mg/kg (starter kültür 8 log kob/g, 0,5% MSG ilave edilmiş) Sanchart vd., 2017 Ekşi hamur Türkiye Lb. plantarum SC-9 Lb. plantarum ED-1 Lb. graminis 4,92 mM 15,47 mM 3,90 mM Demirbaş vd., 2017 Kimchi Kore L. brevis HYE1 14,64 mM GABA, (%1 [a/h] MSG içeren MRS besiyerinde 48 saatte) Lim vd., 2017 Yoghurt İrlanda Str.thermophilus APC151 2 mg/ mL GABA üretimi (14% [a/h] yağsız süt içeren süt, 2,25 mg/mL MSG ilave edilmiş 42oC 48 saat Linares vd., 2016 23 Çizelge 2.5. Gıdalardan izole edilen LAB’lerinin GABA üretim potansiyeli (devamı) Gıda Ülke Mikroorganizma GABA üretme yeteneği Referans Nostrano İtalya Str. thermophilus, L. paracasei 80,0 mg/kg (Str. thermophilus) Franciosi vd., 2015 Siyah soya fasülyesi sütü Tayvan Lb. brevis FPA 3709 2,45 mg/mL GABA (37oC, 48 saat, 1% MSG, 1% kahverengi şeker ve 0,1% pepton ilave edilmiş) Ko vd., 2013 Nham Tayland L.namurensis, P.pentasaceus HN8 4051 mg/kg (%0,5 MSG ilave edilmiş) Ratanaburee vd., 2013 Kimchi (20 farklı örnekte) Kore 55 adet L. plantarum, 6 adet L. brevis, 4 adet Leu. mesenteroides, 1 adet Leu. lactis ve 2 adet Weissella viridescens 68 izolat da GABA üretme yeteneğine sahip M. J. Kim ve Kim, 2012 Ekşi hamur İtalya L.plantarum C48 504 mg/kg (0,1 mM pridoksal 5 fosfat ilave edilmiş un, starter 5x107 kob/g, 30oC’de 24 saat) Coda vd., 2010 Ahududu suyu Kore L.brevis GABA100 27,6 mg/mL (%2 MSG ilave edilmiş, pH=3,5 ahududu suyunda) J. Y. Kim vd., 2009 Geleneksel turşu Japonya L. senmaizukei GABA üretim yeteneğine sahip Hiraga vd., 2008 Peynir Kore L.buncheri OPM-1 91,72 mg/L (%1 MSG’li MRS Broth’da 30oC’de 48saat) Park ve Oh, 2007 Tempe Japonya Rhizopus microsporus var. oligosporus IFO 1,740 mg/100g kuru maddede (Aerobik koşullarda 30oC’de 20–22 saat ve anaerobik koşullarda 30oC’de 20 saat) Aoki vd., 2003 Mayalar; alkol üretimi, organik asitlerin üretimi, fermente gıdalarda tekstür, aroma ve tadın geliştirilmesi, besleyici özelliklerin artırılması, anti-besinsel faktörlerin ve toksinlerin azaltılması gibi önemli rolleri ile gıdaların fermantasyonunda önemli bir konumda bulunmaktadır. Ayrıca mayaların biyoaktif maddeler (GABA, folik asit, karotenoidler, antimikrobiyal peptidler gibi) ürettiği bilinmekte (S. Han vd., 2016; S. M. Han ve Lee, 2017; L. Zhang vd., 2022) ve mayalar fonksiyonel gıda endüstrisinde vazgeçilmez bir rol üstlenmektedir (S. Li vd., 2021; Perpetuini vd., 2020). Mayalar da LAB’leri gibi glutamat dekarboksilazın katalizlediği dekarboksilasyon reaksiyonu ile GABA üretmektedir (S. M. Han ve Lee, 2017; Perpetuini vd., 2020). Ayrıca uçucu aroma bileşenleri üreterek gıdaların aromasında değişikliklere neden olabilmektedirler. GABA ilk olarak asit uygulanmış maya ekstraktından izole edilmiş, daha sonra işlenmemiş maya ekstraktında kuru ağırlığına göre %1-2 oranında serbest halde de mevcut olduğu tespit edilmiştir (Dhakal vd., 2012). Kırmızı maya Rhodotorula glutinis ile ilgili yapılan bir çalışmada mayanın amino asit kompozisyonu araştırılırken de GABA tespit edilmiştir. Neurospora crassa sporunun erken çimlenme döneminde oldukça önemli bir miktarda ortamda GABA tespit edilmiştir. Farklı maya türlerinin de 24 GABA ürettiği bilinmektedir (Dhakal vd., 2012; S. Li vd., 2021). Yapılan bir çalışmada Çin’in geleneksel bir fermente süt ürününden izole edilen Kluyveromyces marxianus B13 ile peynir üretilmiş ve 489 mg/kg GABA üretildiği tespit edilmiştir (S. Li vd., 2021). Fermente elma suyunda S. cerevisiae SC125’in 898,35 mg/L (Sun vd., 2022), Pao cai (Çin Turşusu)’nda S. cerevisiae’in 1,03 g/L (Q. Zhang vd., 2020), fermente fırın ürünlerinde S. cerevisiae Hansen’in 20 mg/mL ve şarapta S. cerevisiae Klosterneuburg’un 26 mg/mL (Hudec vd., 2015) düzeylerinde GABA ürettiği tespit edilmiştir. Ayrıca çeşitli fermente süt ürünlerinden izole edilen Kluyveromyces marxianus’un 50 farklı suşu analiz edilmiş ve suşların GABA üretim potansiyeli 2,33 mg/L ile 7,78 mg/L arasında bulunmuştur (Perpetuini vd., 2020). Bu çalışmalardan da görüldüğü gibi mayalar da GABA üretiminde fermente gıdalarda en az LAB’leri kadar önemli bir rol üstlenmektedir. Tez kapsamında bozada LAB’lerinden sonra ortamda hakim olan bir diğer mikroorganizma grubu olan mayaların da GABA üretim yetenekleri incelenmiştir. Çizelge 2.6. Gıdalardan izole edilen mayaların GABA üretim potansiyeli Gıda Ülke Mikroorganizma GABA üretme yeteneği Referans Peynir Çin Kluyveromyces marxianus B13-5 489 mg/kg Y. Li vd., 2022 Fermente Elma suyu Çin S. cerevisiae SC125 898,35 mg/L Sun vd., 2022 Tempe Tayvan Rhizopus oryzae MHU001 Rhizopus oryzae MHU002 Rhizopus oryzae BCRC 31837 7,552 g/kg 9,712 g/kg 4,122 g/kg Chen vd., 2021 Çeşitli süt ürünleri - Kluyveromyces marxianus (50 farklı suş) Suşların GABA üretim potansiyeli 2,33 mg/L ile 7,78 mg/L Perpetuini vd., 2020 Pao cai (Çin Turşusu) Çin S. cerevisiae 1,03 g/L Q. Zhang vd., 2020 Dut birası (mullberry beer) Çin S. cerevisiae SC125 2,42 g/L, (30oC, 72 saat, 5 g/L glutamate ilave edilmiş) Fırın ürünleri Slovakya S. cerevisiae Hansen 20 mg/mL Hudec vd., 2015 Şarap S. cerevisiae Klosterneuburg 26 mg/mL GABA’nın; nörotransmisyon, hipotansiyonu uyarma, diüretik ve sakinleştirici etkilerinin olduğu (H. Li ve Cao, 2010), rahatlama ve uyku düzeni üzerinde olumlu etkilerinin bulunduğu (Sanacora ve Blumberg H, 2007; Yamatsu vd., 2015), bağışıklık sistemi ile ilgili hücrelerin uyarılmasında etkili olduğu bildirilmiştir (Siragusa vd., 25 2007). Siragusa vd. (2007) yaptıkları çalışmada 22 farklı İtalyan peynirinin GABA konsantrasyonlarını incelemişler ve peynirlerin GABA konsantrasyonlarının 0,26-39 mg/kg arasında değiştiğini tespit etmişlerdir. Ayrıca bu peynirlerden 440 adet LAB izole etmişler ve GABA üretme potansiyellerini incelemişlerdir. Bu izolatlardan 61 tanesinin GABA üretme aktivitesi gösterdiği tespit edilmiştir. Yapılan bir diğer çalışmada Kore’nin kimchi, kırmızı biber salçası, soya fasülyesi ezmesi, tuzlu karides, salatalık turşusu gibi geleneksel fermente gıdalarından 100 adet LAB izole edilmiş ve izolatlar GABA üretme potansiyeli ve GAD geni taşıması bakımından değerlendirilmiştir. Çalışma sonucunda kimchiden izole edilen Lactobacillus brevis HYE1’in %1 (a/h) MSG içeren MRS besiyerinde 48 saat sonunda en çok GABA üreten (14,64 mM) mikroorganizma olduğu bildirilmiştir (Lim vd., 2017). Yapılan başka bir çalışmada ise, İtalya’da Alp Dağları’na özgü geleneksel bir peynir olan ve çiğ inek sütünden yapılan Nostrano peynirinden LAB izole edilmiştir. İzolatların GABA üretme yetenekleri araştırılmıştır. Toplam 1059 LAB izolatı, rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA polimeraz zincir reaksiyonu (RAPD-PZR) kullanılarak taranmış ve 583 gruba ayrılmıştır. 583 gruptan 97’sinde GABA üreten suşlar tespit edilmiştir ve suşların GABA üretimleri yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile incelenmiştir. İzole edilen türler çoğunlukla L. paracasei, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (Str. thermophilus) ve Leuconostoc mesenteroides olarak tespit edilmiştir. En çok GABA üreten türün L. paracasei olduğu belirlenirken, L. lactis, L. plantarum, L. rhamnosus, Pediococcus pentosaceus ve Str. thermophilus suşlarının da GABA üretme yeteneği saptanmıştır. Str. thermophilus’un bir suşu 80,0 mg/kg ile en yüksek GABA üreten suş olduğu ifade edilmiştir. Çalışma sonucunda çiğ sütten elde edilen peynirler, faydalı mikrobiyal çeşitlilik ve sağlığı destekleyici yeni LAB suşlarının kaynağı olarak tanımlanmıştır. Proteolitik aktivite ile kazeinden bol miktarda glutamat açığa çıktğı ve glutamatın da mikroorganizmaların sahip olduğu enzimler sayesinde GABA’ya dönüştürüldüğü bildirilmiştir (Franciosi vd., 2015). Japonya’da yapılan bir çalışmada da geleneksel turşulardan izole edilen bir suş L. senmaizukei olarak tanımlanmış ve GABA ürettiği belirlenmiştir (Hiraga vd., 2008). M. J. Kim ve Kim, (2012)’in yaptığı başka bir çalışmada ise 20 kimchi örneğinden 230 adet LAB izole edilmiş ve izolatların GABA sentezleme yetenekleri araştırılmıştır. Çalışmada, 55 adet L. plantarum, 6 adet L. brevis, 4 adet Leu. mesenteroides, 1 adet Leu. lactis ve 2 adet Weissella viridescens olmak 26 üzere toplam 68 izolatın GABA sentezlediği belirlenmiştir. Perpetuini vd. (2020) çeşitli süt ürünlerinden 50 adet farklı Kluyveromyces marxianus suşu izole etmişler ve suşların GABA üretim potansiyelini incelemişlerdir. Tüm suşların az miktarda (2,33 mg/L ile 7,78 mg/L arasında değişmekte) GABA ürettiği tespit edilmiştir. Türkiye’de yapılan bir çalışmada lahana turşusu (LT), sauerkraut (SK) ve kimchi (KM) gibi lahana-bazlı fermente ürünlerin doğal mikrobiyotasından 72 adet LAB izole edilmiş ve izolatların GABA üretme yeteneği ve GAD enzim aktivitesi test edilmiştir. SK örneklerinden 6 adet ve KM örneklerinden 5 adet LAB suşu elde edilmiştir. Bu suşların tanımlanması sonucunda, izolatların Lactococcus ve Leuconostoc cinsindeki bakteri türlerine ait olduğu belirlenmiştir. GABA üretme yeteneğine sahip bu izolatların, starter kültür olarak kontrollü fermantasyon koşullarında SK ve KM üretimleri gerçekleştirilmiştir. SK örnekleri arasında en yüksek GABA üretimi Lc. lactis ssp. lactis 1 SK1-C29 suşunun inokule edildiği SK örneğinde (15184,0 mg GABA/kg); KM örneklerinde ise en yüksek miktar Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 1 KM1-C102 suşunun inoküle edildiği KM örneğinde (1442,0 mg GABA/kg) örneğinde belirlenmiştir (Özer vd., 2019). Demirbaş vd., (2017), ekşi hamurdan LAB suşları izole ederek GABA üretim miktarlarını incelemişlerdir. Yaptıkları çalışmanın sonucunda Lb. plantarum SC-9 ve ED-1 suşlarında sırasıyla 4,92 mM ve 15,47 mM GABA üretildiğini tespit ederken, Lb. graminis suşunda 3,90 mM GABA üretildiğini tespit etmişlerdir. Yapılan bir başka çalışmada ise, ekşi hamurdan izole edilen LAB’lerinin probiyotik özellikleri ve GABA üretme yeteneği belirlenmiştir. Ekşi hamur kaynaklı Lb. plantarum WPS-12 suşunun 0,072 mg/mL GABA ürettiği tespit edilirken, Lc. garvieae WPS-3’te 0,069 mg/mL ve Lb. paracasei WPS11’de 0,066 mg/mL ve Lb. graminis WPS-1 suşunda 0,048 mg/mL düzeyinde GABA ölçülmüştür. Yüksek glutamat dekarboksilaz aktivitesine sahip mikroorganizmalar ile özellikle glutamik asit (L-Glu) bakımından zengin gıdaların fermantasyonu sonucunda GABA içeriğinin arttığı yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Aoki vd., 2003; Coda vd., 2010; Demirbaş vd., 2017; Franciosi vd., 2015; M. Han vd., 2020; Hiraga vd., 2008; Hudec vd., 2015; M. J. Kim ve Kim, 2012; Ko vd., 2013; Y. Li vd., 2022; Lim vd., 2017; Linares vd., 2016; Nagaoka, 2005; Ohmori vd., 2018; Ozer vd., 2022a; Özer vd., 2019; Perpetuini vd., 2020; Sahab vd., 2020; Sanchart vd., 2017; Sun vd., 2022; Q. Zhang vd., 27 2020). Mikroorganizma faaliyeti sonucu GABA üretimi, ortamın pH’sına (Bhanwar vd., 2013), glutamik asit veya glutamik asit tuzlarının varlığına ve dışarıdan eklenen karbon ve azot kaynaklarına bağlı olarak değişiklik gösterdiği rapor edilmiştir (Diana, Rafecas, vd., 2014; Sahab vd., 2020; Yogeswara vd., 2021). Bu doktora tez çalışmasında; chia ve kinoanın boza üretiminde kullanılabilme potansiyeli araştırılmış, farklı tahıl ürünleri (kinoa, chia, darı, mısır) ile elde edilen bozalardan potansiyel GABA üreticisi LAB ve mayaların izole edilmesi hedeflenmiştir. Ayrıca, tez kapsamında üretilen bozaların GABA içerikleri belirlenmiş ve GABA üreticisi olduğu belirlenen suşların probiyotik özellikleri de incelenmiştir. 28 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Farklı Ham Maddeler ile Boza Üretimi Tez çalışması kapsamında analize alınan tüm boza örnekleri Ömür Boza (Bozacılar Gıda Tekstil Tic. Ltd. Şti., Bursa) firması tesislerinde üretilmiştir. Boza üretimi için ham madde olarak Şekil 3.1’de gösterilen mısır (Zea mays), darı (Panicum miliaceum), chia (Salvia hispanica) ve kinoa (Chenopodium quinoa) üretilen bozayı tatlandırmak için şeker ve kıvam ayarlaması için su kullanılmıştır. Ham maddeler, Ömür Boza (Bozacılar Gıda Tekstil Tic. Ltd. Şti., Bursa) firması tarafından temin edilmiştir. Şekil 3.1. Boza üretiminde kullanılan ham maddeler (soldan sağa kinoa, chia, mısır ve darı) Boza üretiminde kullanılacak olan ham maddelerin seçiminde glutamik asit içeriği ve son ürünün duyusal özellikleri göz önünde bulundurulmuştur. Boza üretiminde kullanılan ham maddelerin oranları ön çalışmalar ile belirlenmiştir. Buna göre; kontrol örneği (K) olarak mısır ve darıdan (9:1 oranında) hazırlanan geleneksel boza kullanılmıştır. Chia içeren boza örneğinde (C) mısır, darı ve chia sırasıyla 8:1:1 oranında, kinoa içeren boza örneğinde (Ki) mısır, darı ve kinoa sırasıyla 7,5:1:1,5 oranında hem kinoa hem de chia içeren boza örneğinde ise (CKi) mısır, darı, chia ve kinoa sırasıyla 8:1:0,5:0,5 oranında karıştırılmıştır (Çizelge 3.1). 29 Çizelge 3.1. Boza örneklerinin ham madde oranları Boza Kısaltma Mısır Darı Chia Kinoa Geleneksel Boza (Kontrol Örneği) K 9 1 - - Chia Katkılı Boza C 8 1 1 - Kinoa Katkılı Boza Ki 7,5 1 - 1,5 Chia ve Kinoa Katkılı Boza CKi 8 1 0,5 0,5 Boza üretimi Şekil 3.2 ve Şekil 3.3’te gösterilen üretim basamakları takip edilerek yapılmıştır. Öncelikle ham maddeler yabancı maddelerden temizlenmiştir. Sonrasında mısır ve darı taneleri değirmende öğütülerek kırılmıştır. Chia ve kinoa taneleri küçük olduğu için herhangi bir öğütme işlemi uygulanmamıştır. Kırılmış tahıllar, chia ve/veya kinoa yapılacak boza örneğine uygun oranlarda karıştırılmış ve ham madde karışımının 5 katı (a/h) kadar kaynayan suya aktarılmıştır. Ham maddeler yaklaşık 2 saat boyunca arada karıştırma uygulanarak pişirilmiştir. Yumuşayan ham maddeler süzme ve posa ayırma işlemi için filtreye gönderilmiştir. Filtrede posa ve ham boza birbirinden ayrılmıştır. Ham boza fermantasyon sıcaklığına kadar soğutulmuş ve fermantasyon tankına alınmıştır. Boza üretiminde doğal (spontan) fermantasyon gerçekleştirilmiştir ve herhangi bir ticari starter kültür ilavesi yapılmamış, eski boza ilave edilmemiştir. Ham boza açık kazanda, 25oC’de, 36 saat fermantasyon odasında fermente edilmiş; fermantasyon, örneklerin pH’ı 3-4 aralığında ölçüldüğünde tamamlanmıştır. Fermantasyonu tamamlanan bozaya şeker (en az %15) ve gerekliyse su ilavesi (bozanın kıvamına göre) yapılmıştır. Daha sonra elde edilen bozalar 1L’lik pet şişelere otomatik dolum makinasıyla doldurulmuştur (Akpinar-Bayizit vd., 2010; R. Cholakov vd., 2016). 30 Şekil 3.2. Boza Üretim Aşamaları (A) Ham madde, (B) Tahıl karışımının kaynayan suya ilave edilmesi, (C) Pişirme, (D) Süzme ve posa ayırma, (E)Ham Boza, (F) Ham bozanın karıştırılarak soğutulması, (G) Açık Kazanda Fermantasyon, (H) Şişelere dolum Üretilen boza örneklerinden fermantasyon başlangıcında (0. saat) örnek alınmış ve fermantasyon tamamlandığında ağzı kapalı şişelerde hazırlanan bozalar soğuk koşullarda (+4oC’de) hızlıca Bursa Uludağ Üniversitesi (BUÜ) Gıda Mühendisliği Laboratuvarı’na getirilmiştir. Şekil 3.3. Boza üretim akış şeması (Akpinar-Bayizit vd., 2010; R. Cholakov vd., 2016) Tahıl tanelerinin öğütülmesi Kırılmış tahılların karıştırılması Su ile kırılmış tahıl karışımının pişirilmesi Süzme ve posa ayırma Ham Boza Soğutma Açık Kazanda Fermantasyon Su ve Şeker İlavesi Şişelere Dolum 31 Boza örneklerinde duyusal analizler fermantasyon sonunda (36. saat) ve soğuk depolamanın (+4oC) 6. gününde gerçekleştirilmiştir. Mikrobiyolojik analizler (toplam aerobik mezofilik canlı bakteri sayısı, laktik asit bakterisi sayısı, maya sayısı, fekal koliform bakteri sayısı), fiziksel ve kimyasal analizler (pH, titrasyon asitliği, Briks, viskozite) ise boza örneklerine fermantasyon başlangıcında (0. saat), fermantasyon sonunda (36. saat) ve soğukta depolama boyunca ise (6. gün, 12. gün, 18. gün, 24. gün) uygulanmıştır. Fiziksel ve kimyasal analizlerden su aktivitesi tayini, gluten miktarı tayini, EPS analizi, kuru madde tayini, renk analizi ve HPLC ile GABA miktarı tayini tüm boza örneklerine yalnızca fermantasyon sonunda (36. saat) yapılmıştır. Her bir farklı boza örneğinden en az 3 şahit numune -18oC’de tez çalışması boyunca muhafaza edilmiştir. 3.2. Duyusal Analizler Duyusal analizler, BUÜ Gıda Mühendisliği Bölümü’nde gerçekleştirilmiştir. Boza örneklerinin duyusal özellikleri tüketici beğeni testi yöntemine göre, 9 puanlı hedonik skala kullanılarak, 20 eğitimsiz panelist tarafından gerçekleştirilmiştir. Duyusal analiz formu örneği Şekil 3.4.’de verilmiştir. Boza örnekleri; panelistler tarafından, standart olarak ışıklandırılmış ortamda, koku, renk, kıvam, lezzet, ağızda bıraktığı his, tatlılık ve genel kabul edilebilirlik özellikleri üzerinden bireysel olarak, fermantasyon sonunda ve soğuk depolamanın (+4oC) 6. gününde analiz edilmiştir. Panelistlerden duyusal değerlendirme kapsamında bozalarda algıladıkları farklı bir özellik varsa belirtmeleri de istenmiştir. (Altuğ Onoğur ve Elmacı, 2019). 32 Şekil 3.4. Duyusal analiz formu örneği (Berktaş, 2011) 3.3. Mikro