AZOT SĠNYAL ĠLETĠM YOLAĞININ EST3 GENĠNDE PROGRAMLI ÇERÇEVE KAYMASI ORANINA ETKĠLERĠNĠN ĠNCELENMESĠ Mahmoud ARAFAT T.C ULUDAĞ ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ AZOT SĠNYAL ĠLETĠM YOLAĞININ EST3 GENĠNDE PROGRAMLI ÇERÇEVE KAYMASI ORANINA ETKĠLERĠNĠN ĠNCELENMESĠ Mahmoud ARAFAT Prof. Dr. Sezai TÜRKEL (DanıĢman) YÜKSEK LĠSANS TEZĠ MOLEKÜLER BĠYOLOJĠ VE GENETĠK ANABĠLĠM DALI BURSA-2016 Her Hakkı Saklıdır Bilimsel Etik Bildirim Sayfası U. Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalıĢmasında;  tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi,  görsel, iĢitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu,  baĢkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu,  atıfta bulunduğum eserlerin kaynak olarak gösterdiğimi,  kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı,  ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya baĢka bir üniversitede baĢka bir tez çalıĢması olarak sunmadığımı, beyan ederim. 20 / 09 / 2016 Mahmoud ARAFAT ÖZET Yüksek Lisans Tezi AZOT SĠNYAL ĠLETĠM YOLAĞININ EST3 GENĠNDE PROGRAMLI ÇERÇEVE KAYMASI ORANINA ETKĠLERĠNĠN ĠNCELENMESĠ Mahmoud ARAFAT Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı DanıĢman: Prof. Dr. Sezai TÜRKEL Telomerler ökaryotlarda kromozom uçlarında bulunan özel yapılardır. Telomerlerin replikasyonu DNA polimeraz tarafından değil özel bir enzim kompleksi olan telomeraz tarafından yapılır. Telomerlerin tam olarak replike olması ökaryotlarda genom stabilitesi için önemlidir. Telomeraz enziminin düzenleyici alt birimlerinden birisi de EST3‟dür. EST3 geni ifadesi translasyonun devamı sırasında programlı ribozomal frameshift (PRF) ile kontrol edilmektedir. Telomer uzunluklarının çeĢitli stres faktörleri ve üreme ortamı koĢullarına göre değiĢtiği bilinmektedir. Bu araĢtırmada S. cerevisiae‟da üreme özelliklerine önemli etkisi olan azot sinyal iletim yolu ve bazı stres koĢullarının telomeraz alt birimi olan EST3 gen ifadesinde PRF oranına etkileri incelendi. EST‟de PRF oranının durağan fazdaki hücrelerde yaklaĢık %50 daha az olduğu bulundu. Pseudohifsel üreme aĢamasının ise EST3 PRF oranında 4 kat azalmaya yol açtığı bulundu. Normal ortamda %14.78 olan PRF oranının pseudohifsel üremede %4.39‟a düĢtüğü tayin edildi. Farklı azot kaynaklarında üremenin de PRF oranına azot kaynağına bağlı olarak düĢük seviyede etki ettiği bulundu. Amonyum gibi tercih edilen azot kaynağında %14.78 olan PRF oranının üre ortamında %11.82‟e düĢtüğü tayin edildi. Etanol stresi uygulanan maya hücrelerinde PRF oranının %10.78‟e azaldığı tayin edildi. Kafein‟in ise PRF oranını önemli ölçüde azalttığı ve bu oranın %8.9‟a indiği bulundu. Karbon kaynağı olarak etanol verilen hücrelerde ise PRF oranının yaklaĢık %1‟e kadar azaldığı tayin edildi. Elde edilen sonuçlar EST3‟de PRF oranının üreme koĢullarına göre kontrol edilebildiğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: S. cerevisiae, Programlı çerçeve kayması, Azot sinyal yolağı, Telomeraz, Translasyonel control, EST3. 2016, VIII + 41 sayfa i ABSTRACT M.Sc. Thesis INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF NITROGEN SIGNALING PATHWAY ON THE PROGRAMMED RIBOSOMAL FRAMESHIFT RATE IN EST3 GENE Mahmoud ARAFAT Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Molecular Biology and Genetics Supervisor: Prof. Dr. Sezai TÜRKEL Telomeres are the special structures located on the ends of the chromosomes. Replication of telomeres is carried out by speciel enzyme, telomerase complex, not by DNA polymerase. Complete and the full length replication of telomere ends are the crucial factors for genome stability in eukaryotes. EST3 is one of the regulatory subunits of telomerase enzyme. The expression of EST3 is regulated by the programmed ribosomal frameshift (PRF) during translation elongation stage. It is known that telomere lenghts are regulated by stress factors and the growth conditions. In this research, the effect of nitrogen sources, stress factors and the growth conditions on the PRF rate was investigated. It was found that the PRF rate decreases 50% in the stationary stage. Moreover, PRF rate decreased at least 4-fold in in the pseudohypeal growth conditions. While the PRF rate is 14.78% in normal conditions, it decreased to 4.39% in pseudohypeal growth. Growth on different nitrogen sources had low level effects on the PRF rate, depending on the nitrogen sources. While the PRF rate is 14.78% in ammonia containing medium, it decreases to 11.82% in urea medium. PRF rate decreased to 10.78% in ethanol stress applied cells. Furthermore, caffeine had a significant effect on the PRF rate and PRF rate decreased to 8.9% in caffein applied cultures. When ethanol is present as the sole carbon and energy source PRF rate decreased to 1%. Overall, this result indicated that PRF rate of EST3 can be controlled depending on the growth conditions. Keywords: S. cerevisiae, Programmed ribosomal frameshifting, Nitrogen signaling, Telomerase, Translational regulation, EST3. 2016, VIII + 41 pages ii TEġEKKÜR Akademik çalıĢmalarıma Türkiye‟de devam etmemi sağlayan aileme, Uludağ Üniversitesinde bulunduğum sürede bana her konuda destek olan danıĢmanım Prof.Dr. Sezai Türkel‟e, tez deneylerim sırasında bana hep destek olan laboratuvar arkadaĢlarım Süeda, Canan, Tuğçe ve Aylin‟e çok teĢekkürler ederim, Mahmoud ARAFAT 20. 09. 2016 iii ĠÇĠNDEKĠLER Sayfa ÖZET.................................................................................................................................. i ABSTRACT ...................................................................................................................... ii TEġEKKÜR ..................................................................................................................... iii ĠÇĠNDEKĠLER ................................................................................................................ iv SĠMGELER ve KISALTMALAR DĠZĠNĠ ....................................................................... v ġEKĠLLERĠN DĠZĠNĠ .................................................................................................... vii ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ .................................................................................................. viii 1. GĠRĠġ ........................................................................................................................... 1 2. KAYNAK ÖZETLERĠ ................................................................................................. 2 2.1. S. cerevisiae‟nın Genetik Yapısı ............................................................................ 2 2.2. Maya Genetiği Terminolojisi ................................................................................. 3 2.3. Telomerlerin Yapısal Özellikleri ............................................................................ 4 2.4. EST3 Geninin Yapısı ve EST3 proteinin Sentezi ................................................... 7 2.5. Azot Sinyal Ġletim Yolağı ve Önemi ................................................................... 10 3. MATERYAL VE YÖNTEM ...................................................................................... 12 3.1. AraĢtırmada Kullanılan S. cerevisiae SuĢları ..................................................... 12 3.2. S. cerevisiae SuĢlarının Üretilmesi ..................................................................... 12 3.3. EST3 Ekspresyon Vektörlerinin Yapısı ............................................................... 12 3.4. S. cerevisiae SuĢlarına Transformasyon.............................................................. 14 3.5. S. cerevisiae Transformantlarının Üretilmesi ....................................................... 15 3.6. -Galaktozidaz Aktivitelerinin Tayini ................................................................. 17 4. BULGULAR ............................................................................................................... 19 4.1. Üreme AĢamalarının EST3‟de Frame Shift‟e Etkisi .......................................... 19 4.2. Azot Sinyal Ġletim Yolağının EST3‟de Frame Shift‟e Etkisi .............................. 21 4.3. Pseudohifsel Üremenin EST3‟de Frame Shift‟e Etkisi ....................................... 23 4.4. Etanol ve Kafein Stresinin EST3‟de Frame Shift‟e Etkisi .................................. 25 5. TARTIġMA VE SONUÇ ............................................................................................ 28 KAYNAKLAR DĠZĠNĠ .................................................................................................. 31 EKLER ............................................................................................................................ 35 Ek 1: Besiyeri ve çözeltilerin hazırlanması ................................................................. 35 Ek 2: β-gal aktivitesi hesaplanması ............................................................................. 37 ÖZGEÇMĠġ .................................................................................................................... 40 iv SĠMGELER ve KISALTMALAR DĠZĠNĠ Simgeler Açıklama %: Yüzde °C: Santigrat derece µm: Mikron g: Gravity (santrifuj birimi) S: Svedberg (sedimentasyon birimi) α: Alfa β: Beta Δ: Delta, delesyon μg: Mikrogram μl: Mikrolitre Kısaltmalar Açıklama A-site: Ribozomal amino açil tRNA bölgesi ADP: Adenozin difosfat ATP: Adenozin trifosfat DNA: Deoksiribonükleik asit E. coli: Escherichia coli E-site: Ribozomal boĢ tRNA bölgesi eEF: Translasyonel devam faktörü EST: "Ever shorter telomere" Gln: Glutamin lacZ: β -galaktozidaz geni Leu: Lösin M: Molar MAT: Mating tipi mg: Miligram ml: Mililitre mM: Milimolar mRNA: Mesajcı ribonükleik asit nmol: Nanomol OD: "Optical Density" ONPG: O-Nitro-Fenil-β-D- Galaktosidaz P-site: Ribozomal peptidil-tRNA bölgesi PEG: Polyetilen glikol Pro: Prolin pH: Hidrojen iyonu konsantrasyonu RNA: Ribonükleik asit rpS: Ribozomal küçük altbirim proteini rRNA: Ribozomal ribonükleik asit S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae SC- Ura: "Syntethic complete minus uracil" v SGD: "Saccharomyces Genome Database" TE: Tris-EDTA TLC: "Telomerase component" TOR: "Target of rapamycin" tRNA: TaĢıyıcı ribonükleik asit URA: "Uracil" Val: Valin YNB: "Yeast Nitrogen Base" YPD: "Yeast extract pepton dextrose" vi ġEKĠLLERĠN DĠZĠNĠ Sayfa ġekil 2.1. S. cerevisia‟nın yaĢam döngüsü. 2 ġekil 2.2. S. cerevisiae‟da telomer yapısı 4 ġekil 2.3. S. cerevisiae‟da telomer yapısında bulunan faktörler 5 ġekil 2.4. S. cerevisiae‟da telomeraz enzim kompleksinin yapısı 6 ġekil 2.5. Farklı türlerde telomer tekrarlarının sekans yapısı 7 ġekil 2.6. EST3 geni kodlama bölgesi ve amino asit dizisi 8 ġekil 3.1. EST3 ekspresyon vektörlerinin genel yapısı 13 ġekil 4.1. S. cerevisiae sigma 1278b suĢunda pseudohifsel üreme 24 vii ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ Sayfa Çizelge 4.1. Logaritmik aĢamadaki S. cerevisiae suĢlarında EST3‟de frame shift oranları 20 Çizelge 4.2. Durağan aĢamadaki S. cerevisiae suĢlarında EST3‟de frame shift oranları 20 Çizelge 4.3. Normal azot kaynaklarının EST3‟de frame shift‟e etkisi 22 Çizelge 4.4. Alternative azot kaynaklarının EST3‟de frame shift‟e etkisi 22 Çizelge 4.5. Pseudohifsel üremenin EST3‟de frame shift„e etkisi 25 Çizelge 4.6. Kafein‟in EST3‟de frame shift„e etkisi 26 Çizelge 4.7. Etanol‟ün EST3‟de frame shift oranına etkisi 27 viii 1. GĠRĠġ S. cerevisiae genom yapısı, üretimde sağladığı avantajlar ve kolaylıkla genetik değiĢim yapılabilmesi gibi teknik üstünlükleri dolayısyla ökaryotik moleküler genetik araĢtırmalarında kullanılan önemli bir model organizmadır. Genomu sekanslanan ilk ökaryot olma özelliği taĢır. S. cerevisiae bu araĢtırmanın konusu olan telomer yapılarının da araĢtırıldığı ilk organizmadır. S. cerevisiae‟nın da model organizma olarak kullanıldığı ökaryotlarda telomer yapılarının aydınlatılması ile ilgili çalıĢmalar 2009 yılında “Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü” ile ödüllendirilmiĢtir. Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider, ve Jack W. Szostak telomer yapılarının aydınlatılması ve telomerazlar ile ilgili çalıĢmaları dolayısıyla 2009 yılında Nobel Tıp ödülü alan araĢtırmacılardır (Szostak ve Blackburn, 1982) . Ökaryotik kromozomlarda telomer replikasyonu ve telomer uzunluklarının korunması kromozomların korunması ve genomun devamlılığı için oldukça önemlidir. Telomerlerdeki kısalma yaĢlanmanın genetik nedenlerinden birisidir. Bu nedenle telomer replikasyonu ile ilgili moleküler çalıĢmalar önem kazanmaktadır. S. cerevisiae‟da telomeraz enzimi çok alt birimden oluĢur. S. cerevisiae‟da telomer replikasyonu ve telomerlerin korunması ile ilgili olarak 400 gen bulunur. Bu genlerden telomeraz enzimini oluĢturanlarda mutasyon oluĢtuğunda telomerlerin sürekli kısaldığı görülmüĢ ve bu nedenle de telomeraz enzim kompleksindeki peptidlerin kodlandığı genler Ever Shorter Telomere (EST) adı verilmiĢtir. Bu araĢtırmada kontrol mekanziması incelenen Est3p de telomeraz enziminin düzenleyici alt birimidir, EST3 geninden kodlanmaktadır. EST3 geni ifadesinin translasyonun devamı sırasında +1 programlı ribozomal çerçeve kayması (PRF) ile kontrol edildiği bulunmuĢtur. Telomerlerin replikasyonu ve uzunluklarının üreme koĢullarına bağlı olarak uzadığı veya kısaldığı bilinmektedir. Bazı stres faktörlerine maruz bırakıldığında telomer uzunluklarında önemli değiĢiklikler rapor edilmiĢtir. Bu araĢtırmada da EST3 gen ifadesinde PRF‟e bazı üreme koĢullarının etkileri incelenmiĢtir. Elde ettiğimiz sonuçlar EST3‟de PRF oranının özellikle durağan fazda ve pseudohifsel üremede çok azaldığı göstermektedir. 1 2. KAYNAK ÖZETLERĠ 2.1. S. cerevisiae’nın Genetik Yapısı S. cerevisiae tomurcuklanma (budding) ile çoğalan önemli bir ökaryotik model organizmadır. Ökaryotlarda temel genetik ve hücresel olayların moleküler ve biyokimyasal temellerini aydınlatmak için birçok araĢtırmada yaygın olarak kullanılmaktadır. S. cerevisiae üç çeĢit hücre olarak bulunabilir, bunlar haploit MATa ve MAT hücreleri ile diploit MATa/ hücreleridir. Haploit MATa ve MAT hücrelerinin uygun koĢullarda eĢleĢmesi ile diploit hücreler meydana gelir. Diploit S. cerevisiae hücreleri de olumsuz Ģartlarda sporulasyona uğrayıp tekrar haploit maya hücrelerini meydana getirir (ġekil 2.1) (Feldman, 2012). Saccharomyces cerevisiae haploit S. cerevisiae genomunda 16 kromozom bulunur. Kromozomlar Pulse Field elektroforez ile kolayca ayrıĢtırılabilir. Ayrıca yeast genomunda 2 mikron plazmiti, RNA virüsleri, ve Ty elementleri (Transposon Yeast) bulunmaktadır (Feldman, 2012). ġekil 2.1. S. cerevisia‟nın yaĢam döngüsü (Duina ve ark. 2014). 2 S. cerevisiae‟nın haploit laboratuvar suĢlarının birçoğu tam olarak sekanslanmıĢtır, 12.500 kbç uzunluğundadır. Protein kodlayan genler yaklaĢık 6600 adettir. Bu genlerden yaklaĢık %76‟nın iĢlevi bilinmektedir. Genellikle maya genomda daha az intron bulunur, bu da genom yapısının çok yoğun olduğunu (compact genom) göstermektedir. Protein kodlayan genlerinde intron yüzdesi %3.8 olarak belirlenmiĢtir. Genler arası mesafe de (200-1000 bç) insan genomu ile karĢılaĢtırıldığında çok kısadır (Goffeau ve ark. 1996). S. cerevisiae‟da bulunan genlerin yapısal özellikleri ve kontrol mekanizmaları ile ilgili kapsamlı araĢtırma sonuçları Genome Data Base (SGD) adlı veri tabanında bulunur ve kolaylıkla eriĢilebilir (Cherry ve ark. 2012). SGD vertabanının sağladığı bilgiler ve yapısı ile ökaryotik genetik çalıĢmalarında önemli yer tutar (Cherry ve ark. 2012; Winzeler ve ark. 1999) 2.2. Maya Genetiği Terminolojisi S. cerevisiae kromozomları büyüklüklerine göre alfabetik olarak sıralanmıĢtır. 16 kromozomdan en kısa kromozomu 240 Kbç olup en uzun kromozom da yaklaĢık 2000 Kbç kadardır. S. cerevisiae genlerinin adlandırılmasında 3 harf sistemi kullanılır. Her genin hem geleneksel, fenotip ile ilgili bir veya birden çok adlandırılması ve bir de sistematik adı vardır. Örnek olarak araĢtırmamızda incelenecek olan EST3 geninin adlandırılması verilecektir. EST3 geni mutasyon sonucu telomerlerde sürekli kısalma olduğundan Ever Shorter Telomere 3 geni (EST3) olarak adlandırlmıĢtır. Sistematik adı ise YIL009C‟dır. Y: Yeast‟in kısaltılmasıdır. I: I-kromozomu (Kromozom 9), L veya R: Kodlama bölgesinin sentromere göre sağ veyasol tarafta olduğunu, C veya W: ilgili genin Watson veya Crick zincirinde olup olmadığını (EST3 Crick zincirindedir). 009 ise ilgili genin sentromerden sonra kaçıncı gen olduğunu gösterir (http://www.yeastgenome.org). Gen adları italik verilir, EST3 gibi. Genlerden kodlanan proteinleri gen isimlerinden ayırt etmek için ise “p” kullanılır. Örnek: EST3, gen ismini ifade eder, Est3p ise proteini ifade eder. Gen delesyonları  ile gösterilir, örnek est3, EST3 geni delesyonu demektir. Gen füzyonları da EST3::HIS4 Ģeklinde verilir. Burada verilen EST3::HIS4 ifadesi EST3 geni ile HIS4 gen füzyonunu gösterir ve her iki gen de aktif ve fonksiyonel demektir. (Sherman, 2002). 3 2.3. Telomerlerin Yapısal Özellikleri Ökaryotlarda kromozom uçları “Telomer” olarak adlandırılır. Telomerlerin replikasyonu da DNA polimeraz değil Telomeraz enzimince yapılır. Telomer dizileri uzun tekrarlı nükleotidlerden meydana gelir ve çok sayıda protein tarafından da kapatılırlar (Wellingerve Zakian, 2012). Tekrarlanan nükleotid içeriği ve tekrar sayısı organizmaya göre değiĢiklik gösterir. S. cerevisiae telomer yapısı C1-3A/TG1-3 yapısında olup heterojen özelliktedir, 300 bç uzunluğundaki tekrarlı dizilerden oluĢur (ġekil 2.2 ve 2.3) (Wellinger ve Zakian, 2012) ġekil 2.2. S. cerevisiae‟da telomer yapısı (Wellingerve Zakian, 2012). Telomerik DNA bölgeleri çıplak DNA bölgeleri olmayıp bu bölgelere bağlı çok sayıda protein bulunmaktadır. Bu proteinlerden özellikle Rap1p S. cerevisiae‟da çok bol bulunan ve çok fonksiyonlu bir proteindir (ġekil 2.3). Bu proteinlerin de telomeraz enzimine ek olarak S. cerevisiae‟da telomer yapılarının korunmasında ve replikasyonda iĢlevleri vardır. Ayrıca bu proteinler telomer uçlarında rekombinasyonu da önler. Telomer uzunlukları hücre veya organizmaların hayatı boyunca değiĢiklik gösterir. ÇeĢitli çevresel faktörlerin telomer uzunluklarına etki ettiği bazılarının telomerlerde kısalma, bazı faktörlerin de telomerlerde uzamaya yol açtığı çeĢitli araĢtırıcılar tarafından rapor edilmiĢtir. Bu konuda en kapsamlı çalıĢmalar da S. cerevisiae‟nın model organizma olarak kullanıldığı çalıĢmalardır (Romano ve ark. 2013; Harari ve 4 Kupiec, 2014). Üreme ortamında sub-letal seviyede kafein, hidrojen peroksit, hidroksiüre gibi maddelerin bulunması telomerlerde önemli kısalmalara yol açar. Asetik asit, bakır sülfat, ve etanol‟ün de konsantrasyonlarına bağlı olarak telomerlerde önemli sayıda uzamaya yol açtığı gösterilmiĢtir (Romano ve ark. 2013). Spor, fiziksel etkinlik, bazı vitaminler, omega 3,6 ve Vitamin-D‟nin telomer uzunluğunu stimüle ettiği de gösterilmiĢtir (Wolkowitz, ve ark. 2008). Kalp-damar hastalığı, bazı metabolik bozukluklar, sigara tüketimi gibi faktörelerin de telomerlerde kısalmaya yolaçtığı rapor edilmiĢtir (Freitas-Simoes, ve ark., 2016). ġekil 2.3. S. cerevisiae‟da telomere yapısında bulunan faktörler (Harari ve Kupiec, 2014). 5 ġekil 2.4. S. cerevisiae‟da telomeraz enzim kompleksinin yapısı (Harari ve Kupiec 2014'ten değiĢtirilerek alınmıĢtır) S. cerevisiae‟da telomeraz enzim kompleksi her birisi tek kopya olarak bulunan 3 farklı polipeptid ve kalıp RNA olarak kullanılan TLC1 RNA molekülünden meydana gelir (Ģekil 2.4). Bu telomeraz kompleksinde Telomeraz enzim kompleksini kodlayan genlerin delesyonu hücre döngüsünde önemli yavaĢlama ve telomerlerde kısalmaya yol açtığı genetik çalıĢmalar ile gösterilmiĢtir (Lundblad ve Szostak, 1989). Telomeraz kompleksindeki polipeptidlerin iĢlevleri de belirlenmiĢtir. Est2p telomeraz enziminin katalik alt birimidir, TLC1 RNAsına bağlanıp revers transkriptaz benzeri aktivite ile telomer replikasyonunu sağlar (Lingner ve ark., 1997; Singer ve Gottschling, 1994). Est1p ve Est3p ise düzenleyici alt birimlerdir. Est1p‟nin Est2p-TLC1 RNA kompleksinin oluĢumu için gerekli olduğu, Est3p‟nin de Est2p‟nin N-ucuna bağlanıp katalitik aktiviteyi kontrol ettiği rapor edilmektedir (Sharanov ve ark., 2006; Yang ve ark., 2006). Telomerik DNA‟daki tekrarlı dizilerde türlere göre farklılıklar görülebilir (ġekil 2.5). EST3 geninin kontrol mekanizmalarından birisi programlı ribozomal frameshift‟tir. EST3 mRNA‟sından iki farklı polipeptid kodlanmaktadır. Telomer yapısında bulunan tam uzunluktaki Est3p +1 PRF ile transle edilir. Kısa peptidin iĢlevi ise henüz aydınlatılamamıĢtır. 6 ġekil 2.5. Farklı türlerde telomer tekrarlarının sekans yapısı (Frydrychova ve ark. 2013). 2.4. EST3 Geninin Yapısı ve EST3 proteinin Sentezi EST3 geni S. cerevisiae‟da 9. kromozomda bulunur, sistematik adı YIL009C-A‟dır. Telomer yapısına etki eden genlerin taranması sırasında klonlanmıĢtır. est3 mutant fenotipi için SGD kayıtlarına çok sayıda özellik tanımlanmıĢtır. Bu mutant fenotiplerden bazıları; koloni yapılarında anormallik, telomerlerde kısalma, neomycin ve higromisin dirençliliğinde azalma, üreme hızında azalma olarak verilmektedir. Bu negatif fenotipik özelliklere rağmen est3 mutasyonu letal değildir, mutant S. cerevisiae suĢlarında üreme hızında önemli düĢüĢ olmasına rağmen est3 mutantı maya hücreleri için letal değildir (http://www.yeastgenome.org/locus/S000006432/phenotype). 7 Tam uzunluktaki fonksiyonel Est3p 181 amino asitten oluĢur ve bu tam uzunluktaki Est3p‟nin translasyonu +1 PRF gerektirir. BaĢlangıç kodonuna göre 0-çerçevede yapılan translasyonda ise kısa (93 amino asitlik) ve iĢlevi henüz bilinmeyen peptid sentezi ile sonuçlanır. ĠĢlevsel Est3p‟nin translasyonu için ise frameshift bölgesinde belirli oranda +1 yönünde ribozomların +1 çerçeve yönünde kayma yapmaları gerekir. Bu kayma sonucu yeni bir translasyon çerçevesinde tam uzunlukta ve iĢlevsel olan, telomeraz yapısında bulunan Est3p sentezlenir. EST3 geni kodlama bölgesi ve proteininin amino asit dizisi Ģekil 2,6‟da verilmiĢtir. E ST3 Geni Kodlama Bölgesi Sekansı (Genomik DNA). 1 ATGCCGAAAG TAATTCTGGA GTCTCATTCA AAGCCAACAG ACTCAGTTTT TCTACAACCA 61 TGGATAAAGG CATTAATTGA AGACAACTCG GAGCATGATC AATATCATCC CTCTGGCCAT 121 GTAATTCCTA GCTTGACCAA GCAGGACTTA GCGCTACCGC ATATGAGCCC GACAATTTTA 181 ACCAATCCGT GCCATTTCGC CAAAATTACA AAATTTTATA ACGTTTGCGA CTACAAGGTA 241 TACGCATCGA TAAGAGATTC CTCACACCAA ATACTTAGTT GAGTTTTCCC AAGAGTGTGT 301 ATCTAATTTT GAAAGGACTC ATAATTGCAG GATCACATCT GAGACGACCA ATTGCTTAAT 361 GATCATTGGC GATGCTGACT TAGTCTACGT AACAAATTCT CGAGCAATGT CTCACTTCAA 421 AATTTGCCTA AGCAACATTT CGTCCAAAGA AATAGTGCCC GTTCTCAATG TAAACCAGGC 481 CACGATATTT GATATTGATC AAGTCGGATC GTTAAGTACT TTCCCATTTG TATATAAATA 541 TTTATGA Est3 Protein : 1 MPKVILESHS KPTDSVFLQP WIKALIEDNS EHDQYHPSGH VIPSLTKQDL ALPHMSPTIL 61 TNPCHFAKIT KFYNVCDYKV YASIRDSSHQ ILVEFSQECV SNFERTHNCR ITSETTNCLM 121 IIGDADLVYV TNSRAMSHFK ICLSNISSKE IVPVLNVNQA TIFDIDQVGS LSTFPFVYKY 181 L ġekil 2.6: EST3 geni kodlama bölgesi ve amino asit dizisi. Frameshift bölgesi alt çizgili olarak gösterilmiĢtir. (Kaynak http://www.yeastgenome.org). 8 Tam uzunluktaki Est3p‟nin translasyonu için translasyonun devamı sırasında belirli oranda/sayıda ribozomun mRNA okuma çerçevesinde +1 yönünde kayma yapması gerekir. Bu translasyonel kaymanın olduğu bölgeye frameshift-site (FS) denir ve EST3 mRNA‟sı üzerinde CCU AGU U sekansının olduğu bölgede gerçekleĢir (ġekil 2.6). FS‟in meydana gelebilmesi için FS bölgesinin 3′ tarafında yaklaĢık 27-30 nükleotid uzunlukta bir uyarıcı dizinin (stimulatory sequence) de olması gerektiği gösterilmiĢtir (Talieferro ve Farabaugh, 2007). EST3 mRNA‟sındaki bu uyarıcı sekansın moleküler iĢlevi de halen bilinmemektedir. EST3 mRNA‟sının normal translasyonunda ribozomun P-bölgesindeki peptidil tRNA (tRNA-Ser-GCU) CUU kodonu ile etkileĢir ve A-bölgesi kodonuna da tRNA-Ser-UCG bağlanır. Normal kodon-antikodon etkileĢimi sonucu bir sonraki kodon stop kodon olduğundan translasyon bu bölgede sona erer ve kısa, fonksiyonu bilinmeyen Est3p sentezlenir (Talieferro ve Farabaugh, 2007). Fakat translasyon yapan ribozomlarda belirli bir sıklıkta/oranda EST3 mRNA‟sının bu bölgesinde (FS-Site) yavaĢlama olur. Translasyondaki bu yavaĢlama ile FS bölgesinde +1 yönünde 1 nükleotid kayması ile meydana gelir. Normal translasyon sırasında CUU kodonu ile etkileĢen tRNA-Ser- GCU +1 kayma sonucu UUA kodonu ile etkileĢir (ġekil 2.6). Bunun sonucu olarak da okuma çerçevesinde ribozomda A- bölgesi de normalde bulunan kodon AGU kodonu iken 1 nükleotid kayarak GUU kodonu olarak yer alır. GUU kodonu da tRNA val-CAI tarafından kodlanır ve translasyon kodlama bölgesi sonuna kadar devam eder (Talieferro ve Farabaugh, 2007). Programlı ribozomal frameshift‟in her zaman sabit bir hızda yapıldığı var sayılıyordu. Fakat laboratuvvarımızda daha önce Ty virüslerinde PRF ile ilgili yapılan çalıĢmalarda, Ty virüslerinde PRF oranının glukoz sinyali ve üreme koĢullarına göre artıĢ veya azalma gösterebildiği rapor edilmiĢtir (Türkel ve ark. 2011). 9 2.5. Azot Sinyal Ġletim Yolağı ve Önemi S. cerevisiae‟da azot metabolizması üreme ve gen ifadesinin kontrolü için en az glukoz kullanımı ve glukoz sinyal iletimi kadar önemlidir. S. cerevisiae azot kaynağı olarak çok farklı azotlu bileĢikleri kullanabilir. Tercih edilen azot kaynakları amonyum ve glutamindir. Üre, allantoin ve prolin gibi azotlu bileĢiklerin kullanımı ise tercih edilmez (Magasanik ve Kaiser, 2002). Üreme ortamında amonyum veya glutamin bulunduğunda Nitrogen Catabolite Repression (NCR) olarak adlandırılan sinyal iletim sistemi alternatif azot kaynaklarının hücreye giriĢi ve kullanımı ile ilgili genleri baskılar. Amonyum veya glutamin yerine üreme ortamında üre, allantoin ve zayıf amino asitler bulunduğunda ise bu azotlu bileĢiklerin kullanımı ile ilgili genler aktive edilir. Azot metabolizması ile ilgili genlerin aktivasyonu veya baskılamasını gerçekleĢtiren transkripsiyon faktörleri S. cerevisiae‟da topluca GATAA faktörleri olarak adlandırılırlar. Bu faktörler ilgili genlerin promotor bölgelerinde GATAA dizisine tekli, homodimer veya heterodimer olarak bağlanarak azot metabolizması genlerini aktive eder veya baskılarlar. Aktivator olarak iĢlevi olan baĢlıca GATA faktörü Gln3p‟dir. Amonyumlu ortamda Gln3p-Ure2p ile kompleks oluĢturmuĢ Ģekilde ve fosfo protein olarak sitoplazmada inaktif kompleks olarak bulunur. Azot kısıtlaması olduğunda, Gln3p defosforile olarak Ure2p‟den ayrılıp sitoplazmadan nükleusa geçerek Gat1p ile heterodimer oluĢturup hedef genlerin aktivasyonunu sağlar (Magasanik ve Kaiser, 2002). Azot sinyal iletiminde asıl sensörün sitoplazmik protein kinaz olan TOR kompleksi olduğu rapor edilmiĢtir. TOR kompleksi S. cerevisiae‟da TOR1 ve TOR2 olarak iki ayrı kompleks olarak bulunur. Metabolizma kontrolü için önemli olan TOR1 kompleksidir (Rohde ve ark., 2008). TOR kinaz kompleksi S. cerevisiae‟da genel besin sensörü gibi çalıĢarak üreme ortamı koĢulları optimum olduğunda baĢta transkripsiyon ve translasyon olmak üzere genel metabolizma ile ilgili çok sayıda genin aktivasyonunu sağlar, otofajiyi de engeller. Ayrıca, üreme ortamı koĢulları optimum olduğunda ribozom biyogenezini ve dolayısıyla translasyonu da aktive eder (Rohde ve ark., 2008; Reiling ve Sabatini, 2006). TOR kinaz optimum Ģartlarda aktif olmasına rağmen üreme ortamında azot kısıtlaması olduğu durumda, veya üreme ortamına Rapamycin veya 10 kafein ilave edildiğinde inaktive olur ve TOR‟un kontrol ettiği genlerin iĢleyiĢinde önemli değiĢiklikler olur, translasyonda yavaĢlama görülür. TOR1 kompleksinin translasyon baĢlama faktörü eIF2 aktivitesini kontrol ederek translayonu da kontrol ettiği tayin edilmiĢtir (De Virgilio ve Loewith, 2006). TOR kompleksinin Snf1 aracılığı ile S. cerevisiae‟da pseudohifsel üremeyi de kontrol ettiği öne sürülmektedir (Orlova ve ark., 2006) 11 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. AraĢtırmada Kullanılan S. cerevisiae SuĢları Bu tez araĢtırmasında standart yaban tip S. cerevisiae suĢu olarak BY4741 suĢu kullanıldı. Bu S. cerevisiae suĢu bazı amino asitler ve urasil için okzotrofik olup bilinen genotipi: MATa, his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0 olarak verilmektedir. Bu maya suĢu Frankfurt Üniversitesi Mikrobiyoloji Enstitüsü‟ndeki EUROSCARF koleksiyonundan temin edildi (Brachmann ve ark, 1998). AraĢtırmamızda özellikle azot sinyal iletim yolu ve pseudohifsel üreme çalıĢmaları için amino asitler için prototrof olan S. cerevisiae suĢuna ihtiyaç duyulduğundan bu araĢtırmalar için de S. cerevisiae Σ1278b suĢu kullanıldı. S. cerevisiae Σ1278b suĢunun içerdiği ras2 mutasyonu dolayısıyla diğer S. cerevisiae suĢlarına göre daha kolay pseudohif oluĢturduğu bilinmekte olup bu suĢun bilinen genotipi ise MATa, ura3-52, olarak verilmektedir (Zurita-Martinez ve Cardenas, 2005). Bu S. cerevisiae suĢu ise Prof.Dr. Maria E. Cardenas‟dan (Duke Universitesi, Moleküler Hücre Biyolojisi Programı, Durham. North Caroline, ABD) temin edildi. 3.2. S. cerevisiae SuĢlarının Üretilmesi AraĢtırmada kullanılan S. cerevisiae suĢlarının üretilmesinde kullanılan besiyerlerinin bileĢenleri ve hazırlanması tezin ekler bölümünde verildi. S. cerevisiae suĢları kısa süre +4 C‟de depo etmek ve transformasyon için ön kültür hazırlamak için zengin ortam olarak kullanılan YPD üreme ortamı içeren petrilerde üretildi (Ek 1) (Rose ve ark. 1990). Maya suĢları deneyler süresince petrilerde 4ºC‟de muhafaza edildi. Ayrıca, S. cerevisiae suĢlarını uzun süreli olarak depo etmek için taze YPD besi yerlerinde üretilen S. cerevisiae suĢlarından steril kürdan ile alınan maya örnekleri steril 1 ml %20 gliserolda süspanse edildi ve 70ºC‟de saklandı. 3.3. EST3 Ekspresyon Vektörlerinin Yapısı Bu tez araĢtırmasında EST3 geninde frame shift oranını tayin etmek için kullanılan ekspresyon vektörleri olan EST3-lacZ Frame Shift (EST3-FS) ve EST3-lacZ 12 FrameFusion (EST3-FF) yapılarını içeren plazmitler daha önceki araĢtırmalarda hazırlanmıĢtır (Taliaferro ve Farabaugh 2007). EST3-FS vektöründe EST3 geninin frame shift bölgesi lacZ genine normal Ģekilde bağlanmıĢtır. Bu vektörde EST3-lacZ hibrit mRNA‟sının translasyonu için +1 frame shift olması gerekir. EST3-FF vektöründe ise frame shift bölgesinden 1 nükleotid çıkarıldığı için EST3-lacZ mRNA‟sının translasyonu frame shift‟e uğramadan direkt olarak yapılır. Bu ekspresyon vektörleri YEp (Yeast Episomal plazmit) tipi maya vektörü olup shuttle vektör özelliğini de taĢımaktadırlar. Bu nedenle hem E. coli ve hem de S. cerevisiae‟da replikasyon için orijin bölgeleri ve seleksiyon için de markör gen içerirler. E. coli‟de seleksiyon için ampisiline direnç sağlayan -laktamaz geni, S. cerevisiae‟da seleksiyon için ise URA3 geni yapılarında bulunmaktadır (Taliaferro ve Farabaugh 2007). EST3-FS ve EST3-FF gen füzyonlarını içeren ekspresyon vektörlerinin yapısı ġekil 3.1'de verildi. YEp vektörlerinin seçici üreme ortamında üretilen S. cerevisiae transformantlarında kopya sayılarının değiĢmediği ve maya hücrelerinde stabil olarak kaldıkları gösterilmiĢtir (Liao ve ark. 1987). ġekil 3. 1. EST3 ekspresyon vektörlerinin genel yapısı 13 3.4. S. cerevisiae SuĢlarına Transformasyon EST3 FS veya EST3-FF ekspresyon kasetlerini içeren plazmitler S. cerevisiae BY4741 ve S. cerevisiae S1278b suĢuna daha önce açıklandığı Ģekilde lityum asetat-polietilen glikol yöntemi ile transform edildi (Rose ve ark. 1990). Bu yönteme göre transfromasyon yapabilmek için maya suĢları önce 5 ml‟lik YPD sıvı besiyerinde standart Ģartlarda bir gece üretildi. Ertesi sabah bu ön kültürler kullanılarak bu kez 25 ml‟lik taze YPD besiyerlerine baĢlangıç OD600 değerleri 0.2 olacak Ģekilde ekim yapıldı. Bu maya kültürleri standart Ģartlarda (30 C, 140 devir/dk dönüĢ) logaritmik aĢamaya kadar (OD600: 1.5-2.0) üretildi. Logaritmik aĢamaya kadar üretilen maya kültürleri transformasyon için kompetent hale getirebilmek için daha önce açıklanan yöntem değiĢiklik yapılmadan aĢağıda kısaca açıklandığı Ģekilde uygulandı (Rose ve ark. 1990). Logaritmik aĢamadaki maya kültürleri masa üstü santrifüjde 3000 g‟de 5 dakika çöktürüldü. Sıvı faz atıldı. Maya çökeltisi 25 ml‟lik steril saf suda yıkandı ve maya hücreleri tekrar çöktürüldü. Sıvı faz atıldı ve çöktürülen maya hücreleri 1 ml 0.1M lityum asetat‟da süspanse edildi ve tekrar mikrosantrifüjde 12500 rpm‟de 30 sn çöktürüldü. Sıvı faz atıldı ve çöktürülen maya hücreleri bu kez 450 l 0.1 M lityum asetat‟da süspanse edildi. Bu maya süspansiyonlarından taze mikrofüj tüplerine 50 l alınarak maya hücreleri tekrar mikrosantrifüjde 12500 rpm‟de 30 sn çöktürüldü. Sıvı faz pipet ile alındı. Maya çökeltileri üzerine aĢağıda verilen sırada ve miktarlarda ilgili çözeltiler ve plazmit DNA‟ları eklenerek transformasyon karıĢımları hazırlandı. 240 l %50 Polietilen glikol (Mw: 3500) 36 l 1 M Lityum asetat 6 l denature edilmiĢ herring sperm DNA‟sı (toplam 5 g olacak Ģekilde) 4-5 g plazmit DNA‟sı steril saf su (toplam hacim 350 l olacak Ģekilde) Bu Ģekilde hazırlanan transfromasyon karıĢımları 30 C‟de etüv de 30 dakika bekletildi. Daha sonra aynı karıĢımlar etüvden alınarak 42 C‟de su banyosunda 30 dakika daha inkübe edildi. Bu bekleme süreleri sonunda transformasyon karıĢımları mikrosantrifüjde 14 12500 rpm‟de 1 dakika santrifüj edilerek çöktürüldü. Sıvı faz atıldı. Çökelti 500 l steril saf su ile süspanse edildi. Bu Ģekilde hazırlanan transformants maya hücrelerinden koloni elde edebilmek için 100 l alınarak seçici üreme ortamı olan ve urasil içermeyen Sc-Ura+%2 glukoz içeren petrilerine yayma ekimi yapıldı. Maya ekimi yapılan petriler 30 C‟de etüvde koloniler belirgin oluncaya kadar inkübe edildi. Bu süre genellikle 3-4 gündür. Kolonilerin elde edilmesinden sonra sıvı kültürlere ekim yapabilmek için transformants maya kolonilerinden iyi Ģekilde izole olanlar seçilerek taze seçici üreme petrilerine küçük pasajlar (6-8 pasaj/petri) yapıldı. Transformant pasajların petride üremesi için de petriler 30 C‟de 2-3 gün inkübe edildi. Maya transformantları ve pasaj petrileri deneyler süresince +4 C‟de buzdolabında saklandı. 3.5. S. cerevisiae Transformantlarının Üretilmesi Üreme aĢamalarının EST3‟de frame shift oranına etkilerini tayin edebilmek için S. cerevisiae BY4741 ve S. cerevisiae Σ1278b suĢlarının EST3-FS ve EST3-FF transformantları 5 ml‟lik sıvı SC-Ura+%2 glukoz ortamında çalkalamalı inkübatörde 140 devir /dakika hızda ve 30 C‟de yaklaĢık 18 saat üretilerek ön kültürler elde edildi. Bu ön kültürlerden taze 5 ml‟lik Sc-Ura+%2 glukoz ortamına baĢlangıç hücre yoğunluğu OD600:0.2 olacak Ģekilde ekim yapıldı. Bu kültürler standart Ģartlarda logaritmik aĢamaya (OD600:1.5-2.0) veya durağan aĢamaya (OD600:9.0-10.0) kadar üretildi. Üreme aĢaması sonunda maya hücreleri masa üstü santrifüjde 3000 g‟de 5 dakika çöktürüldü. Sıvı faz atıldı ve çöktürülen hücreler 1 ml steril saf suda süspanse edilerek mikrofüj tüplerine aktarıldı. Maya hücreleri mikrofüj tüplerinde tekrar 12500 rpm‟de 1 dakika çöktürüldü. Çöktürülen maya hücreleri 200 l lizis tampon çözeltisinde (break buffer) süspanse edildi. EST3-FS veya EST3-FF ekspresyon vektörlerini içeren bu maya transformantları gen füzyonlarından yapılan ekspresyon miktarlarını tayin edebilmek için aĢağıda açıklandığı Ģekilde -galaktozidaz aktivitelerinin tayininde kullanıldı. Lizis tampon çözeltisinde süspanse edilen mayalar kısa süreli olarak -20 C‟de daha uzun süreli olarak da -80 C‟de derin dondurucuda saklanabilmektedir. EST3‟de frame shift oranına farklı azot kaynaklarının etkilerini tayin edebilmek için EST3-FS ve EST3-FF vektörlerinin S. cerevisiae Σ1278b transformantlarından yukarıda 15 açıklandığı Ģekilde ön kültürler elde edildi. Bu ön kültürler kullanılarak amonyum içermeyen yeast nitrogen base (YNB) üreme ortamına son konsantrasyonları bölüm 4.2‟de açıklandığı Ģekilde amonyum (%0.5) , glutamin (%0.2), prolin (%0.2), üre (%0.2) veya lösin (%0.2) ilave edildi. Bu Ģekilde maya transformantları farklı türlerde azot kaynağı içeren minimal ortamda logaritmik aĢamaya kadar üretilerek yukarıda açıklandığı Ģekilde -galaktozidaz aktivitelerinin ölçümü için hazırlandı. Pseodohifsel üremenin EST3‟de frame shift oranına etkilerini incelemek için EST3-FS ve EST3-FF vektörlerinin S. cerevisiae Σ1278b transformantlarından yukarıda açıklandığı Ģekilde ön kültürler elde edildi. Bu ön kültürler kullanılarak taze YNB+%2 glukoz ortamına ekim yapıldı ve maya transformantları standart Ģartlarda logaritmik aĢamaya kadar üretildi. Bu aĢamada maya transformantları 3000 g‟de 5 dakika çöktürüldü ve steril 5 ml saf suda süspanse edilerek tekrar çöktürüldü. Maya transformantları bu kez düĢük miktarda azot içeren 5 ml‟lik SLAD (Synthetic Low ammonium dextrose) üreme ortamında süspanse edildi ve standart Ģartlarda 24 saat inkübe edildi. Ġnkübasyon süresi sonunda maya hücrelerinin pseudohif oluĢturmalarını tayin edebilmek için üreme ortamından örnek alınarak ıĢık mikroskobunda 10x100 büyütme ile immersiyon objektifi kullanılıp fotoğraflandı. Pseudohif oluĢturduğu kesinleĢen kültürler çöktürülerek transformantların -galaktozidaz aktivitelerini tayin edebilmek için yukarıda açıklandığı Ģekilde hazırlandı. Kafein‟in EST3‟de frame shift‟e etkisini belirlemek için EST3-FS ve EST3-FF ekspresyon vektörlerinin S. cerevisiae BY4741 ve S. cerevisiae -Ura+%2 glukoz ortamında ve yukarıda açıklandığı Ģekilde hazırlandı. Erken logaritmik aĢamada (yaklaĢık OD600: 0.7-0.8) üreme ortamlarına son konsantrasyonu 0.8 mM olacak Ģekilde kafein ilave edildi ve maya kültürleri 6 saat standart Ģartlarda üretildi. Ġnkübasyon periodu sonunda maya hücreleri çöktürülerek yukarıda açıklandığı Ģekilde -galaktozidaz ölçümleri için hazırlandı. Etanol stresinin EST3‟de frame shift‟e etkisini tayin edebilmek için S. cerevisiae BY4741 transformantlarından yukarıda açıklandığı Ģekilde Sc-Ura+%2 glukoz 16 ortamında ön kültürler ve daha sonrada logaritmik aĢama kültürleri elde edildi. Logaritmik aĢamadaki maya kültürlerine son konsantrasyonu %8 olacak Ģekilde etanol ilave edildi ve transformantlar standart üreme koĢullarında 6 saat daha üretildi. Üreme periyodu sonunda maya hücreleri çöktürülerek -galaktozida aktivitelerinin tayini için hazırlandı. Karbon kaynağı olarak bulunduğunda etanol‟ün etkisini tayin etmek için ise S. cerevisiae BY4741 transformantları Sc-Ura+%2 etanol ortamında önce durağan aĢamaya kadar üretilerek ön kültürler elde edildi. Daha sonra bu ön kültürler kullanılarak tekrar Sc-Ura+%2 etanol ortamına ekim yapılarak logaritmik aĢamaya kadar üretildi. Logaritmik faz kültürleri çöktürülerek yukarıda açıklandığı Ģekilde - galaktozidaz aktivilerinin tayini için hazırlandı. 3.6. -Galaktozidaz Aktivitelerinin Tayini Farklı üreme ortamlarında üretilip çöktürülen ve 200 l lizis tampon çözeltisinde süspanse edilen maya transformantlarına permeabilizasyon için stok çözeltilerden 20 μl saf kloroform ve %0.1‟lik 20 μl SDS ilave edilip 15-20 sn en üst hızda vortek karıĢtırıldı ve hücre lizatları elde edildi. Hücre lizatlarındaki -galaktozidaz aktivitesini tayin etmek için 1x10 cm‟lik deney tüplerine 20 l hücre lizatı ve 980 l Z-buffer (- gal tampon çözeltisi) ilave edildi ve deney tüpleri 30 C‟de su banyosuna bırakıldı. 2 dk‟lik ön inbübasyondan sonra her bir deney tüpüne 200 l ONPG (reaksiyonun substratı) ilave edilip baĢlangıç zamanı kronometrede kayıt edildi. Reaksiyon baĢlangıçtaki renksiz durumdan açık sarı renk meydana gelinceye kadar beklendi. Açık sarı renk görüldüğünde reaksiyon 500 l 1 M sodyum karbonat ilave edilerek durduruldu ve geçen zaman kayıt edildi. Reaksiyon tüplerinde hücre lizatlarından gelen parçalı materyali çöktürmek için reaksiyon tüpleri masa üstü santrifüjde 4 dk 1600 rpm‟de santrifüj edildi. Reaksiyon çözeltileri 2 mL‟lik spektrofotometre küvetlerine aktarılıp absorbansları 420 nm dalga boyunda ölçülerek kayıt edildi. (Guarente, 1983). Maya transformantlarındaki -galaktozidaz aktivitelerini normalize edebilmek için yukarıda açıklandığı Ģekilde hazırlanan maya hücre lizatlarının toplam protein konsantrasyonları da Lowry metodu ile tayin edildi (Lowry ve ark. 1951). Bunun için 1x10 cm‟lik deney tüplerine 180 μl‟lik steril steril saf su, 20 l hücre lizatı eklendi. Bu 17 lizat karıĢımına taze hazırlanmıĢ Lowry-C çözeltisinden 1 ml ilave edildi, en üst hızda vorteks ile 10-15 sn karıĢtırılıp oda sıcaklığında 10 dk beklendi. Daha sonra bu karıĢıma 1N folin fenol (Sigma F 9252) çözeltisinden 100 μl eklenerek vorteks edildi (Ek 1). KarıĢım oda sıcaklığında 30 dk bekletildi. Denet tüpleri hücre lizatlarından gelen parçalı materyalin çöktürülmesi için masa üstü santrifüjde 1600 rpm‟de 4 dakika santrifüj edildi. Berrak hale getirilen protein çözeltileri 2 ml‟lik spektrofotometre küvetlerine aktarıldı ve çözelti absorbansları 750 nm‟de ölçülerek kayıt edildi. EST3-FF ve EST3-FS gen füzyonlarından yapılan ekspresyon seviyeleri (β- galaktozidaz aktiviteleri) Ek 2‟de verilen formüle göre hesaplandı (Ausubel ve ark. 1987). Ekspresyon seviyeleri hücre lizatlarındaki 1 mg protein tarafından 1 dakikada hidroliz edilen nmol ONPG (nmol ONPG/dk/ mg protein) olarak elde edildi. EST3‟de yapılan çerçeve kayması oranlarını hesap edebilmek için EST3-FS gen füzyonlarından ekspres edilen enzim aktivitesi değerleri EST3-FF'den ekspres edilen aktiviteye bölünerek elde edildi. Bütün enzim deneyleri 3‟erli olarak yapıldı ve en az bir kez tekrarlandı. Bu nedenle sonuçlar bölümünde verilen % FS oranları ortalama 9 farklı enzim deneyinin ortalamasıdır. Sonuçların çoğunda standart sapmanın % 10‟nun altında olduğu tayin edildi. 18 4- BULGULAR 4.1. Üreme AĢamalarının EST3’de Frame Shift’e Etkisi Tam uzunluktaki Est3p‟nin sentezi için translasyon sırasında +1 translasyonel çerçeve kayması olması gerektiği daha önce rapor edilmiĢtir (Morris ve Lundblad, 1997). AraĢtırmamızın baĢlangıç aĢamasında Est3p‟nin sentezi için gerekli olan frame shift‟in gerçekleĢmesinde maya hücrelerinin üreme aĢamalarının etkisinin olup olmadığı incelendi. Bunun için seçilen iki farklı S. cerevisiae laboratuvar suĢu olan BY4741 ve Sigma 1278b suĢlarında hem logaritmik aĢamada ve hem de 24-26 saat üreme sonucu elde edilen durağan faz aĢamasındaki transformantlarda % frame shift (bundan sonra % FS olarak verilecektir) oranları tayin edildi. Logaritmik aĢamadaki hücre yoğunlukları OD600: 1.5-1.7±0.4 olarak ölçüldü. Durağan aĢamadaki hücre yoğunlukları ise OD600: 9.0-10.0 ±0.4 olarak tayin edildi. Standart Ģartlarda üretilen logaritmik aĢamadaki S. cerevisiae BY4741 maya kültürlerinde EST3‟de % FS yaklaĢık olarak %13 olarak belirlendi (çizelge 4.1). S. cerevisiae Σ1278b suĢunda ise EST3‟de % FS oranında önemli bir artıĢ olduğu ve bu maya suĢunda logaritmik aĢamada frameshift oranının yaklaĢık %17 olarak gerçekleĢtiği görüldü (çizelge 4.1). Frameshift oranının S. cerevisiae suĢlarına göre farklılık gösterebildiği daha önce rapor edilmiĢtir. Durağan faz aĢamasındaki S. cerevisiae transformantlarında ise önemli düĢü olduğu tayin edildi. Durağan fazdaki BY4741 maya suĢunda frameshift oranı % 7.25 olarak, sigma 1278b suĢunda ise % 7.56 olarak ölçüldü (çizelge 4.2). Frame shift oranında durağan aĢamada görülen azalma veya düĢüĢ BY4741 suĢu için % 44.74, sigma 1278b suĢu için ise % 55.39 olarak hesap edildi. 19 Çizelge 4.1. Logaritmik aĢamadaki S. cerevisiae suĢlarında EST3‟de frame shift oranları Maya SuĢu Ekspresyon vektörü Ekspresyon seviyesi* % FS pDT265 (FS) 111 BY4741 13.12 pDT261 (FF) 846 pDT265 88 Σ1278b 16.95 pDT261 519 *Ekspresyon seviyesi nmol ONPG/dakika/mg protein olarak verilmiĢtir. %FS frame shift oranını göstermektedir. FS: Frameshift vektör, FF: Frame fusion vektör Çizelge 4.2. Durağan aĢamadaki S. cerevisiae suĢlarında EST3‟de frame shift oranları Maya SuĢu Ekspresyon vektörü Ekspresyon seviyesi* % FS pDT265 83 BY4741 7.25 pDT261 1144 pDT265 33 Σ1278b 7.56 pDT261 436 *Ekspresyon seviyesi nmol ONPG/dakika/mg protein olarak verilmiĢtir. 20 4.2. Azot Sinyal Ġletim Yolağının EST3’de Frame Shift’e Etkisi Üreme ortamındaki azot kaynağı S. cerevisiae‟da üreme hızına ve birçok metabolik olaya direkt olarak etki eden önemli bir bileĢendir. Karbonhidrat kaynağında olduğu gibi, azot kaynağı olarak da S. cerevisiae tarafından öncelikli olarak kullanılan veya alternatif olarak kullanılan azotlu bileĢikler vardır. Azot kaynağının kullanımı ile ilgili metabolik yolakda (azot sinyal iletim yolağı) önemli bir faktör de TOR (Target of Rapamycin) kinazdır. Amonyum veya glutamin gibi tercih edilen azot kaynakları bulunduğunda TOR1 kinaz diğer üreme koĢulları da uygun ise hücrede bir çok metabolik yolağı aktive edebilir. Buna bağlı olarak da hücre döngüsü, DNA replikasyonu, translasyon gibi olaylar da bölünme hızına göre kontrol edilir. Bundan dolayı bu tez araĢtırmasında EST3‟de programlı ribozomal frameshift oranına azot kaynaklarının ve dolayısıyla da TOR1 kinazın etkisinin olup olmadığı incelendi. TOR kinaz aktivitesini aktive edebilmek için üreme ortamına azot kaynağı olarak amonyum sülfat veya glutamin ilave edilerek logaritmik aĢamadaki S. cerevisiae hücrelerinde frameshift oranları tayin edildi. Normal üreme koĢulları olarak kabul edilen bu Ģartlarda gerçekleĢen frameshift oranı ile tercih edilmeyen azot kaynağı olan prolin, lösin, üre gibi azotlu bileĢiklerin bulunduğu üreme ortamında gerçekleĢen frame shift oranları da tayin edilerek karĢılaĢtırıldı. Üreme ortamında azot kaynağı olarak amonyum sülfat bulunduğunda EST3‟de frame shift oranı S. cerevisiae BY4741suĢunda %14.78 olarak tayin edildi. EST3‟de frameshift oranı glutamin içeren üreme ortamında ise %12.67 olarak belirlendi (çizelge 4.3). TOR1 kinazın aktif olmadığı, azot kaynağı olarak prolin bulunan besiyerinde üretilen S. cerevisiae suĢunda ise EST3‟de frameshift oranının %17.31 olarak gerçekleĢtiği bulundu. (çizelge 4.4). Prolinden farklı olarak azot kaynağı olarak üre içeren ortamda üretilen S. cerevisiae kültürlerinde frameshift oranı %11.82, lösin içeren ortamda üretilen kültürde ise frameshift oranının %14.44 olduğu bulundu. 21 Çizelge 4.3. Normal azot kaynaklarının EST3‟de frame shift‟e etkisi Üreme ortamı Ekspresyon vektörü Ekspresyon seviyesi* % FS pDT265 218 YNB+%2 dekstroz 14.78 *(%0.5 NH4) pDT261 1479 pDT265 205 YNB+%2 dekstroz 12.67 *(%0.2 Gln) pDT261 1617 *NH4: NH4(SO4)2, Gln: Glutamin‟i göstermektedir. Çizelge 4.4. Alternative azot kaynaklarının EST3‟de frame shift‟e etkisi Üreme ortamı Ekspresyon vektörü Ekspresyon seviyesi* % FS pDT265 234 YNB+%2 dekstroz 17.31 *(%0.2 Prolin) pDT261 1350 pDT265 393 YNB+%2 dekstroz 14.44 *(%0.2 Lösin) pDT261 2723 YNB+%2 pDT265 250 dekstroz 11.82 *(%0.2 Üre) pDT261 2115 22 4.3. Pseudohifsel Üremenin EST3’de Frame Shift’e Etkisi S. cerevisiae hücreleri minimal üreme ortamında azot kaynağı kısıtlı olduğu zaman farklı bir üreme Ģekli olan pseudohifsel üreme aĢamasına geçmektedir. Bu aĢamadaki maya hücrelerinde bölünen hücreler ana hücreden ayrılmadan kalırlar. mantarlarda görülen hifsel üremeden farklı olarak pseudohifsel üreme gösteren hücreler arasında hücre duvarı vardır, hücresel sinsizyum görülmez (Zaragoza ve Gancedo, 2000). Pseudohifsel üreme özellikle Σ1278b suĢunda kolaylıkla uyarılmaktadır. Bu nedenle pseudohifsel üremenin EST3‟de frameshifte olan etkisi sadece bu maya suĢunda tayin edilmiĢtir. Normal üreme ortamından SLAD ortamına aktarılan maya transformantları pseudohifsel üremenin gerçekleĢmesi için bu ortamda 24 saat bekletildi. Transformantların pseudohif oluĢturduğu mikroskobik olarak tayin edildi ve 10x100 objektifi ile immersiyon uygulanarak fotoğraflandı (ġekil 4.1). Pseudohif meydana getirdiği görülen maya kültürleri çöktürülerek frame shift ve frame fusion vektörlerinden yapılan transkript miktarları -Galaktozidaz aktiviteleri ölçülerek tayin edildi ve % FS oranları hesaplandı (Çizelge 4.5). 23 ġekil 4.1: S. cerevisiae sigma 1278b suĢunda pseudohifsel üreme. 24 Çizelge 4.5. Pseudohifsel üremenin EST3‟de frame shift„e etkisi Maya SuĢu Ekspresyon Ekspresyon seviyesi* % FS vektörü pDT265 21 Σ1278b 4.39 pDT261 478 Pseudohifsel üremenin EST3‟de frame shift oranına çok önemli derecede etki ettiği ve % FS oranında en az 4-kat azalmaya neden olduğu görülmektedir. Logaritmik aĢamada S. cerevisiae Σ1278b suĢunda % 17 olan frame shift oranının aynı suĢta pseudohifsel üreme uygulandığında % 4.39‟a indiği görülmektedir (çizelge 4.5). Pseudohifsel üremenin özellikle frameshift ekspresyon vektöründen yapılan transkript seviyesinde önemli azalmaya yol açtığı da görülmektedir. Normal Ģartlardaki üreme ortamında frame shift vektöründen yapılan transkript 88 ünite iken aynı vektörden pseudohifsel üreme Ģartlarında 21 ünite kadar ekspresyon yapıldığı görülmektedir (çizelge 4.5). 4.4. Etanol ve Kafein Stresinin EST3’de Frame Shift’e Etkisi S. cerevisiae‟da telomeraz aktivitesine çeĢitli fizyolojik stres faktörlerinin etkileri ayrıntılı olarak çalıĢılmıĢtır. Kafein, hidrojen peroksit ve yüksek sıcaklığa maruz kalmanın S. cerevisiae‟da telomer uzunluğunda kısalmaya yol açtığı rapor edilmiĢtir (Romano ve ark., 2013). Etanol, metanol ve asetik asit ile inkübasyonun ise bu maddelerin konsantrasyonlarına da bağlı olarak S. cerevisiae telomerlerinde uzamaya yol açtığı aynı çalıĢmada gösterilmiĢtir (Romano ve ark., 2013). Kafein aynı zamanda TOR sinyal iletim yolağını da baskılayan bir madde olduğu için bu araĢtırmaya dahil edilmiĢtir (Tate ve Cooper, 2007). Est3p S. cerevisiae‟da telomeraz kompleksinin önemli alt birimidir, telomeraz aktivitesini de önemli derecede etkilemektedir. AraĢtırmamızda kafein ve etanol ile inkübasyonun EST3‟de frame shift oranına etkileri incelendi. Frame shift ve frame fusion vektörleri S. cerevisiae BY4741 suĢuna transfrom edildi. Kafein ile inkübasyonun frameshift oranına etkisini tayin etmek için 25 maya transformantları Sc-Ura +%2 dekstroz ortamında logaritmik aĢamaya kadar üretildi. Bu aĢamada üreme ortamına kafein ilave edilerek 5 saat standart Ģartlarda inkübasyona devam edildi ve kafeinin frameshift oranına etkileri hesap edildi (çizelge 4.6). Çizelge 4.6. Kafein‟in EST3‟de frame shift„e etkisi Maya SuĢu Ekspresyon Ekspresyon seviyesi* % FS vektörü pDT265 58 BY4741 8.9 pDT261 651 *Üreme ortamına son konsantrasyonu 8 mM olacak Ģekilde steril kafein ilave edilmiĢtir.. Kafein ile logaritmik aĢamada inkubasyonun EST3 frameshift oranında % 13‟den % 8.9 azalmaya neden olduğu görülmektedir (çizelge 4.1 ve 4.6). Etanol‟ün EST3‟de frame shift oranına etkisi ise iki farklı deneysel yaklaĢım ile tayin edilmiĢtir. Bilindiği gibi, etanol S. cerevisiae suĢları tarafından diğer karbonhidratlar üreme ortamında olmadığı zaman karbon kaynağı olarak da kullanılmaktadır. Etanol aynı zamanda üreme ortamında belirli konsantrasyonların üzerinde bulunduğunda (%5 veya daha fazla) kimyasal stres meydana getirebilmektedir. Bundan dolayı etanol‟ün hem karbon kaynağı olarak ve hem de kimyasal stres ajanı olarak EST3‟de frame shift oranına etkileri ayrı ayrı incelenmiĢtir. Etanol‟ün kimyasal stres ajanı olarak frame shift‟e etkisini belirlemek için S. cerevisiae BY4741 suĢunun EST3 frame shift ve frame fusion vektörü transformantları önce Sc-Ura %2 dekstroz ortamında logaritmik aĢamaya kadar üretilip bu aĢamada üreme ortamına son konsantrasyonu %8 olacak Ģekilde etanol ilave edildi. Transformant kültürleri etanol içeren bu ortamda 5 saat inkübe edildi. Stres ajanı olarak etanol‟ün üreme ortamında bulunmasının EST3 frame shift oranında azalmaya yol açtığı ve normal koĢullarda %13 olan frame shift oranının % 11‟e düĢtüğü belirlendi (Çizelge 4.7). 26 Üreme ortamında karbon kaynağı olarak etanol‟ün bulunması ise EST3 frame shift oranında aĢırı azalmaya ve yaklaĢık olarak frame shift‟in tamamen durmasına, frame shift oranının ise % 0.76 kadar düĢmesine neden olduğu görüldü (Çizelge 4.7). Çizelge 4.7. Etanol‟ün EST3‟de frame shift oranına etkisi Üreme Ekspresyon Ekspresyon % FS ortamı vektörü seviyesi* pDT265 108 Sc-ura+%2 dekstroz + 10.78 (%8 etanol) pDT261 1001 pDT265 9 Sc-ura+%2 0.76 etanol pDT261 1174 *Ekspresyon seviyesi nmol ONPG/dakika/mg protein olarak verilmiĢtir. 27 5. TARTIġMA VE SONUÇ Programlı ribozomal frameshift (PRF) gen ifadesinin translasyonun devamı aĢamasında meydana gelen bir çeĢit kontrol mekanizmasıdır. Bakterilerde, ökaryotik virüslerde ve ökaryotlarda birçok hücresel gende gen anlatımının PRF ile kontrol edildiği gösterilmiĢtir (Atkins ve ark, 2016; Namy ve ark. 2004; Farabaugh, 1996). Ġnsan sağlığı ile yakından ilgili olduğundan özellikle HĠV virüsünde PRF‟in moleküler mekanizması ayrıntılı olarak incelenmiĢtir (Varmus ve Jacks, 1985). S. cerevisiae EST3 geninden kodlanan Est3p proteini telomeraz enziminin düzenleyici alt birimidir ve est3 mutantı S. cerevisie hücrelerinde telomerlerin her bölünmede kısaldığı rapor edilmiĢtir (Wellinger ve Zakian, 2012). Telomer uzunluklarına etki eden diğer faktörler ise çeĢitli çevresel stres faktörleri ve hücresel yaĢlanmadır. Harriri vd‟nin (2007) yaptığı araĢtırmada bazı stres faktörlerinin telomer uzunluklarında önemli kısalmaya, bazı stres faktörlerinin ise telomerlerde uzamaya neden olduğu görülmüĢtür. Bu çalıĢmada strese maruz bırakılan S. cerevisiae hücrleri yaklaĢık 100 bölünme süresince stres faktörüne maruz bırakılmıĢ ve bu süre sonunda telomer uzunluklarındaki değiĢim incelenmiĢtir (Romano ve ark., 2013). S. cerevisiae üreme ortamı koĢullarının telomer uzunluklarına etkisi bilindiğinden bu araĢtırmada azot stresi, etanol ve kafein stresi gibi faktörlerin telomer replikasyonu için önemli bir peptid olan EST3 de PRF‟e etkileri incelenmiĢtir. Üreme ortamına uygulanan bu stres faktörlerine ek olarak üreme aĢamaları ve pseudohifsel üremenin de EST3 de PRF‟e etkileri incelenmiĢtir. Kupiec ve ekibi tarafından yapılan araĢtırmada telomer uzunluğuna çevresel stres faktörlerinin etkilerini tayin edebilmek için 50 veya 100 jenerasyonluk üreme süreci sonunda telomer uzunlukları tayin etmiĢtir (Romano ve Ark, 2013). Bizim araĢtırmamızda ise EST3 de framsehift oranları logaritmik aĢamada 2-3 generasyon süresi sonunda tayin edilmektedir. Çok uzun generasyon süreci plazmit kaybına yol açabileceğinden araĢtırmalarımızda jenerasyon süreci bir zorunluluk olarak kısa tutulmuĢtur. Bu nedenle toplam telomer uzunluğuna stress faktörlerin etkisi ile EST3 de frame shift oranları daha önceki çalıĢmalar ile uyumlu görülmemektedir. Örnek olarak 28 etanol stresinin telomerlerde uzmaya neden olduğu rapor edilmiĢtir. AraĢtırmamızda elde edilen sonuçlar ise etanol stresinin EST3 de frameshifte çok fazla etkinin olmadığını göstermektedir. Bu tez çalıĢmasının kaynak araĢtırması bölümünde de verildiği gibi S. cerevisiae‟da telomer yapısında çok sayıda faktör bulunmaktadır. Romano ve ark (2013) yaptıkları bu önemli çalıĢmada telomeraz aktivitesini de tayin etmemiĢlerdir. Yapılan bu çalıĢma telomer uzunluklarının tayini ile ilgilidir. TOR genel besin sensörüdür, tercih edilen azot kaynağı amonyum veya glutamin ve karbon kaynağı olarak da glukoz bulunduğunda baĢta üreme hızı olmak üzere birçok metabolik yolağı aktive eder (Rohde ve ark., 2008). Üre, allantoin veya prolin ise tercih edilmeyen azot kaynaklarıdır. Etanol gibi tercih edilmeyen ve direkt olarak da metabolize edilmeyen karbon kaynağı üreme hızını yavaĢlatmaktadır. Elde ettiğimiz sonuçlara göre tercih edilmeyen azot kaynaklarında üremenin PRF oranına fazla etki etmediğini göstermektedir. Bu da TOR sinyal yolağının veya azot kaynaklarının EST3‟de PRF oranına çok önemli bir etkisi olmadığını öne sürmektedir. TOR sinyal yolağı gen ifadesine transkripsiyon seviyesinde de etki etmektedir. Bu nedenle TOR etkisi EST3 genininde transkripsiyonel seviye de olabilir. Bundan dolayı farklı azot kaynaklarında üretilen S. cerevisiae hücrelerinde EST3 mRNA seviyesinin de karĢılaĢtırmalı olarak analizi gerekebilir. AraĢtırmalarımızda EST3‟de PRF oranına etki eden en önemli faktörün üreme aĢamaları, durağan faz ve pseudohifesel üreme olduğu bulunmuĢtur. Bu da EST3‟de PRF oranının üreme hızına göre kontrol edildiğini öne sürmektedir. Logaritmik fazda en hızlı seviyede olan DNA replikasyonu ve buna bağlı olarak gerçekleĢen telomer replikasyonu nedeni ile telomeraz aktivitesine ihtiyaç duyulmaktadır. durağan fazda ve pseudohifsel üremede ise üreme ya tamamen durmuĢtur veya çok yavaĢ gerçekleĢmektedir, bu nedenle bu aĢamalarda DNA ve telomer replikasyonu yapılamamaktadır. Karbon kaynağı olarak glukoz yerine etanolün bulunması da üreme hızını çok yavaĢlatır. EST3‟de PRF oranındaki azalma buna bağlı olarak gerçekleĢebilir. Durağan fazda ve pseudohifsel üremede aktif telomeraz enzimine fazla ihtiyaç duyulmadığından telomerazın düzenleyici alt birimi olan EST3‟de de gen ifadesi buna bağlı olarak azalabilir. S.cerevisiae‟da hücre döngüsü bütün ökaryotlarda olduğu gibi 29 G1, S, G2 ve M faz‟lardan meydana gelir. Hücre döngüsü CDK (cyclin dependent kinase) tarafından kontrol edilir (Enserink ve ark 2010). Pseudohyphe oluĢumu sırasında hücre döngüsünde G2/M fazı çok uzun sürede tamamlanır. Pseudohifsel üreme sırasında bazı siklinlerin baskılandığı ve bunun da MAP kinazlar tarafından yapıldığı gösterilmiĢtir (Zaragoza ve Gancedo, 2000). Kafein‟in telomer uzunluklarında kısalmaya yol açtığı gösterilmiĢtir (Romano ve ark. 2013). ÇalıĢmamızda üreme ortamında kafein bulunması ile EST3‟de PRF oranının yaklaĢık %32 azaldığı belirlenmiĢtir. Kafeinin aynı zamanda telomer yapısınında bulunan diğer faktörlere de etki ettiği gösterilmiĢtir (Romano ve ark. 2013). Etanol‟ün stres ajanı olarak üreme ortamında bulunması da EST3‟de PRF oranına fazla miktarda etki etmemektedir. PRF oranı normal ortamda % 13.2 iken %8 etanol varlığında bu oran %10.78‟e azalmaktadır. Romano ve ark. (2013) yayımladıkları araĢtırmada %7 etanol varlığında telomer uzunluklarında önemli artıĢ rapor etmiĢlerdir. Yalnız etanolün bu etkisini görebilmek için maya hücreleri 200 bölünme süresince yeast ekstrakt ve pepton ortamında (YPE) etanol stresine maruz bırakılmıĢtır. AraĢtırmalarımız plazmit vektörleri ile yapıldığından minimal ortamda ve kısa süreli olarak yapılabilmektedir. Bu nedenle etanol stresinde telomerlerde uzama görülürken EST3‟de PRF oranında beklenen önemli artıĢ görülememiĢ olabilir. Ökaryotlarda telomer yapıları çok kompleks DNA-protein yapılarıdır. S. cerevisia‟da telomer uzunluklarını kontrol eden yaklaĢık 400 gen rapor edilmiĢtir (Harrari ve Kupiec, 2014; Unger ve ark., 2009). EST3, Telomer Maintenance Genes (TLM) olarak adlandırılan bu genlerden sadece birisidir. EST3 geninin ekspresyonu transkripsiyonel seviyede olduğu gibi translasyonun elongasyon aĢamasında da ribozomal frameshift ile kontrol edilmektedir (Morris ve Lundblad, 1997; Taliferro ve Farabaugh, 2007). Elde ettiğimiz sonuçlar EST3 gen ifadesinin ribozomal frameshift ile kontrolünde özellikle üreme aĢamalarının ve buna bağlı olarak da üreme hızı, hücre bölünme hızının önemli olabileceğini göstermektedir. 30 KAYNAKLAR Atkins, F.J., Loughran, I., Bhatt, P.R., Firth A.E., Baranov, P.V. 2016. Ribosomal frameshifting and transcriptional slippage: From genetic steganography and cryptography to adventitious use. Nucleic Acids Res., 44 (15): 7007-7078. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. 1987. Current protocols in molecular biology. Green Publ. Assoc. and Wiley Interscience, New York, s. 1.6.1-1.6.6. Brachmann, C.B., Davies, A., Cost, G.J., Caputo, E., Li, J., Hieter, P., Boeke, J.D. 1998. Designer Deletion Strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a Useful set of Strains and Plasmids for PCR-mediated Gene Disruption and Other Applications. Yeast, 14: 115-132. Cherry, J.M., Hong, E.L., Amundsen,C., Balakrishman, R., Binkley, G., Chan, E.T., Christie, K.R., Costanzo, M.C., Dwight, S.S., Engel, S.R., Fisk, D.G., Hirschman, J.E., Hitz, B.C., Karra, K., Krieger, C.J., Miyasato, S.R., Nash, R.S., Park, J., Skrzypek, M.S., Simison,M., Weng, S., Wong, E.D. 2012. Saccharomyces genome database: the genomiks resource of budding yeast. Nucleic Acids Res., 40: 700- 705. De Virgilio, C., Loewith, R. 2006. Cell growth contro: Little eukaryotes make big contributions. Oncogene, 25: 6392-6415. Duina, A.A., Miller, M.E., Keeney, J.B. 2014. Budding Yeast for Budding Geneticists: A Primer on the Saccharomyces cerevisiae Model System. Genetics, 197: 33–48. Enserink, J.M., Kolodner, R.D. 2010. An overview of Cdk1-controlled targets and processes. Cell Div., 5: 11. Farabaugh, P.J. 1996. Programmed translational frameshifting. Microbiol. Rev., 60: 103-134. Feldman, H., 2012. Yeast: Molecular and cellular biology. Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany. Freitas-Simoes, T.M., Ros, E., Sala-Vila, A. 2016. Nutrients, foods, dietary patterns and telomere length: Update of epidemiological studies and randomized trials. Metabolism, 65: 406-415. Frydrychova, R., Mason, J. 2013. Telomeres: Their Structure and Maintenance. National Institute of Environmental Health Sciences, USA 31 Goffeau, A., Barrell, B.G., Bussey, H., Davis, R.W., Dujon, B., Feldmann, H., Galibert, F., Hoheisel, J.D., Jacq, C., Johnston, M., Louis, E.J., Mewes, H.W., Murakami, Y., Philippsen, P., Tettelin, H., Oliver, S.G. 1996. Life with 6000 genes. Science, 274(5287): 546, 563–567. Greider, C.W., Blackburn, E.H. 1987. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell, 51(6): 887-98. Guarente, L. 1983. Yeast promoters and lacZ fusions designed to study expression of cloned genes in yeast. Methods Enzymol., 101: 181-191. Harari, Y., Kupiec, M. 2014. Genome-wide studies of telomere biologyin budding yeast. Microbial Cell, 1(3): 70-80. Hughes, T.R., Evans, S.K., Weilbaecher, R.G., Lundblad, V. 2000. The Est3 protein is a subunit of yeast telomerase. Current biology, 10(13): 809-12. Klein, C.J., Olsson, L., Nielsen, J. 1998. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology, 144(Pt 1): 13–24. Liao, X.-B., Clare, J.J. Farabaugh, P.J. 1987. The upstream activation site of a Ty2 element of yeast is necessary but not sufficient to promote maximal transcription of the element. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8520-8524. Lingner, J., Cech, T.R., Hughes, T.R., Lundblad, V. 1997. Three Ever Shorter Telomere (EST) genes are dispensable for in vitro yeast telomerase activity. Proc Natl Acad Sci. USA, 94: 11190- 11195. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randal, R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193: 265-275. Lundblad, V., Szostak, J.W. 1989. A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell, 57(4): 633-43. Magasanik, B., Kaiser, C.A. 2002. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290:1-18 Morris, D.K., Lundblad, V. 1997. Programmed translational frameshifting in a gene required for yeast telomere replication. Current Biology, 7: 969-976. Namy, O., Rousset, J.P., Napthine, S., Brierley, I. 2004. Reprogrammed Genetic Decoding in Cellular Gene Expression. Molecular Cell, 13: 157–168. Orlova, M., Kanter, E., Krakovich,D., Kuchin, S. 2006. Nitrogen Availability and TOR Regulate the Snf1 Protein Kinase in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryotic Cell, 5: 1831-1837. 32 Reiling, J.H., Sabatini, D.M. 2006. Stress and mTORture signaling. Oncogene, 25: 6373-6383. Rohde, J.R., Bastidas, R., Puria, R., Cardenas, M.E. 2008. Nutritional control via Tor signaling in Saccharomyces cerevisiae. Current Opinion in Microbiology, 11: 153- 160. Romano, G.H., Harari, Y., Yehuda, T., Podhorzer, A., Rubinstein, L., Shamir, R., Gottlieb, A., Silberberg, Y., Peer, D,. Ruppin, E., Sharan, R., Kupiec, M. 2013. Environmental Stresses disrupt telomere length homeostasis. Plos Genetics, 9: e1003721. Rose, M.D., Winston, F., Heiter, P. 1990. Methods in Yeast Genetics -- A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, s. 119-195. Sharanov, S., Zvereva, M.I., Dontsova, O.A. 2006. Saccharomyces cerevisiae telomerase subunit EST3p binds DNA and RNA and stimulates unwinding of RNA/DNA heteroduplexes. FEBS Lett,. 580: 4683-4690. Sherman, F. 1998. An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae. University of Rochester Medical School, Rochester, NY 14642, USA. Singer, M.S., Gottschling, D.E. 1994. TLC1: template RNA component of Saccharomyces cerevisiae telomerase. Science, 266: 404-409. Szostak, J.W., Blackburn, E.H. 1982. Cloning yeast telomeres on linear plasmid vectors. Cell, 29: 245-255. Taliaferro, D., Farabaugh, P.J. 2007. An mRNA sequence derived from the yeast EST3 gene stimulates programmed +1 translational frameshifting. RNA, 13: 606-613. Tate, J.J., Cooper, T.G. 2007. Stress-responsive Gln3 localization in Saccharomyces cerevisiae is separable from and can overwhelm nitrogen source regulation. J. Biol.Chem., 282: 18467–18480. Türkel, S., Kaplan G., Farabaugh, P.J., 2011. Glucose signalling pathway controls the programmed ribosomal frameshift efficiency in retroviral-like element Ty3 in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 28: 799-808. Ungar, L., Yosef, N., Sela, Y., Shara, R., Ruppin, E., Kupiec, M. 2009. A genome- wide screen for essential yeast genes thataffect telomere lenght maintenance. Nucleic Acids Res., 37: 3840-3849. Varmus, H.E., Jacks, T. 1985. Expression of the Rous sarcoma virus pol gene by ribosomal frameshifting. Science. 230: 1237-1242. 33 Wellinger, R.J., Zakian, V.A. 2012. Everything you ever wanted to know about Saccharomyces cerevisiae telomeres: Beginning to end. Genetics, 191: 1073–1105. Winzeler, E.A., Shoemaker, D.D., Astromoff, A., Liang, H., Anderson, K., Andre, B., Bangham, R., Benito, R., Boeke, J.D., Bussey, H., Chu, A.M., Connelly, C., Davis, K., Dietrich, F., Dow, S.W., El Bakkoury, M., Foury, F., Friend, S.H., Gentalen, E., Giaever, G., Hegemann, J.H., Jones, T., Laub, M., Liao, H., Liebundguth, N., Lockhart, D.J., Lucau-Danila, A., Lussier, M.,M'Rabet, N., Menard, P., Mittmann, M., Pai, C., Rebischung, C., Revuelta, J.L., Riles, L., Roberts, C.J., Ross-MacDonald, P., Scherens, B., Snyder, M., Sookhai-Mahadeo, S., Storms, R.K., Véronneau, S., Voet, M., Volckaert, G., Ward, T.R., Wysocki, R., Yen, G.S., Yu, K., Zimmermann, K., Philippsen, P., Johnston, M., Davis, R.W. 1999. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science, 285: 901–906. Wolkowitz, OM., Epel, E.S., Mellon, S. 2008. When blue turns to grey: do stress and depression accelerate cell aging? World J. Biol. Psychiatry, 9: 2-5. Yang, C.P., Chen, Y.B., Meng, F.L., Zhou, J.Q. 2006. Saccharomyces cerevisiae Est3p dimerizes in vitro and dimerization contributes to efficient telomere replication in vivo. Nucleic Acids Res., 34: 407-416. Zaragoza, O., Gancedo, J.M., 2000. Pseudohyphal growth is induced in Saccharomyces cerevisiae by a combination of stress and cAMP signalling. Antonie Van Leeuwenhoek. 2: 187-194 Zurita-Martinez, S.A., Cardenas, M.E. 2005. Tor and Cyclic AMP Protein Kinase A: two parallel pathways regulating expression of genes required for cell growth. Euk Cell. 4: 63–71. 34 EKLER Ek 1: Besiyeri ve çözeltilerin hazırlanması 1:YPD (Yeast Ekstrakt, Pepton, Dekstroz) YPD besiyeri S. cerevisiae için üreme ortamı olarak kullanılan zengin besiyeridir. BileĢimi ve hazırlanması: 10 gram/litre Yeast Ekstrakt 20 gram/litre Pepton YPD petrilerini hazırlamak için sıvı besiyerine 20 gram/litre olacak Ģekilde agar agar eklendi ve 121°C‟de 25 dakika otoklavda steril edildi. Üreme ortamına ilave etmek için glukoz %20‟lik stok çözelti halinde hazırlandı, 121°C‟de 25 dakika otoklavda steril edildi. Üreme ortamına son konsantrasyonu %2 olacak Ģekilde ilave edildi. 2: Sentetik tam –Urasil Üreme Ortamı (Sc-Ura) S. cerevisiae transformantlarınıüretebilmek için kullanılan seçici besiyeridir. B ileĢimi ve hazırlanması: 1.7 gram/litre Yeast Nitrogen Base (YNB) 5 gram/litre Amonyum sülfat 1.92 gram/litre urasil içermeyen amino asit karıĢımı (SC-Ura) (Sigma Y-1501) Katı besiyerleri için son konsantrasyonu 20 gram/litre olacak Ģekilde agar agar ilave edildi, 121°C‟de 25 dakika süreyle olarak otoklavda sterilize edildi. Urasıl içermeyen amino asit karıĢımı 0.45 por çaplı disk filtrelerde steril edilerek kullanımdan hemen önce üreme ortamına ilave edildi. Glukoz %20‟lik steril stok çözeltiden deneylerde açıklanan konsantrasyonlarda kullanımdan hemen önce ilave edildi. 35 3: SLAD Üreme Ortamı (Synthetic Low Ammonium Dextrose) S. cerevisiae hücrelerinde pseudohifsel üremeyi sağlamak için kullanıldı. B ileĢimi: %0.67 Yeast Nitrogen Base (amino asitsiz ve amonyum sulfatsız) 0.05mM amonyum sülfat %2 glukoz. 4: Lityum Asetat Çözeltileri (1M ve 0.1M) S. cerevisiae hücrelerine transformasyon yapmak için kullanıldı. Lityum asetat (M.a: 102.02) son konsantrasyonu 1M olacak Ģekilde 50 ml stok çözelti olarak hazırlandı ve KarıĢım 0.45 μm por çaplı membran disk filtre ile steril edildi ve oda sıcaklığında depo edildi. 0.1M lityum asetat ise transformasyon iĢleminden hemen önce taze olarak hazırlandı. 5: Amino asit çözeltileri ve kafein: Tez araĢtırmasında alternatif azot kaynağı olarak kullanılan Glutamin, Prolin ve Lösin distile suda %2‟lik stok çözeltiler olarak hazırlandı ve disk filtre ile steril edilip oda sıcaklığında saklandı. Azot kaynağı olarak verilen konsantrasyonlarda kullanıldı. Kafein stok çözeltisi ise 500 mM olacak Ģekilde distile suda stok çözelti olarak hazırlandı ve verilen konsantrasyonlarda kullanıldı, oda sıcaklığında depo edildi. 6: Polietilen Gilikol (%50 PEG) S. cerevisiae hücrelerine transformasyon yapmak için kullanıldı. Polietilen Glikol (Ma: 3,350) distile suda %50‟lik stok çözelti olarak hazırlandı, 121°C‟de 25 dakika otoklavda steril edildi. 7: SDS (%0.1) ve Kloroform çözeltileri SDS ve kloroform S. cerevisiae hücrelerini permeabilized edip hücre lizatlarını elde etmek için kullanıldı. SDS deionize suda %0.1‟lik stok çözelti olarak hazırlandı. Kloroform direk olarak konsantre stoktan herhangi bir seyreltme yapılmadan kullanıldı. 36 7: Lizis tampon çözeltisi S. cerevisiae transformantlarını süspanse etmek ve lizat elde etmek için kullanıldı. B ileĢimi ve hazırlanması: 100 mM Tris.HCl (pH: 8) 1 mM 1,4-Dithio-DL-threitol (DTT) %20 Gliserol 4 mM Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF). Çözelti verilen maddeler son konsantrasyonları yukarıda olacak Ģekilde steril distile su ile hazırlandı ve +4°C‟de saklandı. 8: -Galaktozidaz tampon çözeltisi (Z Buffer) Bu tampon çözelti maya transformantlarından elde edilen lizatlarda β-galaktosidaz enzimatik aktivitesini tayin etmek için tampon çözelti olarak kullanıldı. B ileĢimi ve hazırlanması: 60 mM Na2HPO4.7H20, 40 mM NaH2PO4.H2O, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4.7H20 50 mM β-Merkepto-etanol çözeltisi Çözelti yukarıda verilen maddeler son konsantrasyonları verilen miktarlarda olacak Ģekilde steril distile su ile hazırlandı ve +4°C‟de saklandı. 9: Lowry Çözeltileri S. cerevisiae hücre lizatlarındaki protein konsantrasyonlarını tayin etmek için kullanıldı. Çözeltilerin bileĢimi ve hazırlanması: I: Lowry A çözeltisi: 20g Na2CO3 ve 4g NaOH toplam hacim 1 litre olacak Ģekilde distile suda çözüldü, stok çözelti olarak oda sıcaklığında depo edildi. II: Lowry-B1 çözeltisi: 1 gram CuSO4 toplam hacim 100 ml olacak Ģekilde distile suda çözüldü, stok çözelti olarak +4 C de depo edildi. III: Lowry-B2 çözeltisi: 2 gram Sodyum potasyum tartarat toplam hacim 100 ml olacak Ģekilde distile suda çözüldü, stok çözelti olarak +4 C de depo edildi. 37 IV: Lowry-C çözeltisi: Her deneyde taze olarak yukarıda verilen Lowry-A, Lowry-B1 ve Lowry-B2 stok çözeltilerden hazırlandı: Lowry-C çözeltisinin hazırlanması: 24.5 ml Lowry A, 250 μl Lowry B1, 250 μl Lowry B2, karıĢtırıldı ve taze olarak kullanıldı. 10: ONPG (O-Nitrofenil β-D-Galaktopiranozid) ONPG (Sigma N1127) son konsantrasyonu 4 mg/ml olacak Ģekilde Z-tampon çözeltisi içinde hazırlandı. +4°C‟de saklandı. 38 Ek 2: β- Galaktozidaz aktivitesi hesaplanması S. cerevisiae transformantlarından ölçülen -galaktozidaz aktivitesi aĢağıda verilen formül excel formatına göre hazırlanan çalıĢma tablosu kullanılarak hesap edildi. Aktivite: (OD420x 1.7/0.0045)/(txVxP) OD420: Sarı rengin absorbansı 1.7: Sarı rengin bulunduğu tüpün hacmi (980µl Z buffer, 20µl lizat, 200µl ONPG, 500 µl NaCO3) 0.0045: ONPG‟nin molar absorbsiyon katsayısı t: β-galaktozidaz reaksiyon süresi (dakika) V: B-Galaktozidaz ölçümünde kullanılan hücre lizatı hacmi (ml) P: Hücre lizatlarının protein konsantrasyonları (mg/ml) β-galaktozidaz aktivitesi biririmi: Dakikada 1 mg protein tarafından hidroliz edilen nmol ONPG (nmol ONPG/dk/ mg protein) cinsinden verilmiĢtir 39 ÖZGEÇMĠġ Adı Soyadı : Mahmoud ARAFAT Doğum Yeri ve Tarihi : Lübnan, 18.03.1990 Yabancı Dili : Ġngilizce, Türkçe, Fransızca Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Baalbak Devlet Lisesi/ Baalbak, Lübnan Lisans : Lebanase International University/ Bekaa, Lübnan Yüksek Lisans : Uludag Üniversitesi/ 2016 ÇalıĢtığı Kurum/Kurumlar ve Yıl : -------- ĠletiĢim (e-posta) : rastro_2@hotmail.com Yayınları : ---- 40 41