BİTKİSEL VE MİKROALG İÇERİKLİ KREMLERİN GELİŞTİRİLMESİ, ANTİOKSİDAN VE ANTİ- TİROSİNAZ ENZİM AKTİVİTELERİNİN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Eftal Alp DORKEN T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİSEL VE MİKROALG İÇERİKLİ KREMLERİN GELİŞTİRİLMESİ, ANTİOKSİDAN VE ANTİ-TİROSİNAZ ENZİM AKTİVİTELERİNİN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Eftal Alp DORKEN 0000-0003-3120-3233 Prof. Dr. Saliha ŞAHİN (Danışman) YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI BURSA–2022 Her Hakkı Saklıdır. TEZ ONAYI Eftal Alp DORKEN tarafından hazırlanan “BİTKİSEL VE MİKROALG İÇERİKLİ KREMLERİN GELİŞTİRİLMESİ, ANTİOKSİDAN VE ANTİ-TİROSİNAZ ENZİM AKTİVİTELERİNİN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS olarak kabul edilmiştir. Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Başkan : Prof. Dr. Saliha ŞAHİN İmza 0000-0003-2887-5688 Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Turgay ÇAKMAK İmza 0000-0002-4953-8384 İstanbul Medeniyet Üniversitesi, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Önder AYBASTIER İmza 0000-0002-0380-1992 Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Hüseyin Aksel EREN Enstitü Müdürü ../../…. B.U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; − tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, − görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, − başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, − atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, − kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, − ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. …/…/……… Eftal Alp DORKEN TEZ YAYINLANMA FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezimin/raporumun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kâğıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma iznini Bursa Uludağ Üniversitesi’ne verdiğimi bildiririm. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet haklarım bende kalacak, tezimin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları bana ait olacaktır. Tezimde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanması zorunlu metinlerin yazılı izin alarak kullandığımı ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederim. Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” kapsamında yönerge tarafından belirtilen kısıtlamalar olmadığı takdirde tezimin YÖK Ulusal Tez Merkezi / B.U.Ü. Kütüphanesi Açık Erişim Sistemi ve üye olunan diğer veri tabanlarının (Proquest veri tabanı gibi) erişime açılması uygundur. Öğrencinin Adı-Soyadı Tarih İmza Bu bölüme öğrenci tez teslimi sırasında el yazısı ile okudum anladım yazmalı ve imzalamalıdır. ÖZET Yüksek Lisans Tezi BİTKİSEL VE MİKROALG İÇERİKLİ KREMLERİN GELİŞTİRİLMESİ, ANTİOKSİDAN VE ANTİ-TİROSİNAZ ENZİM AKTİVİTELERİNİN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Eftal Alp DORKEN Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Bu tez kapsamında, Zingiberaceae familyasına ait Alpinia officinarum (havlıcan) için ekstraksiyon yöntemi geliştirilmiş ve ekstraktlarda bulunan fenolik maddeler, kantitatif olarak HPLC-DAD (yüksek performanslı sıvı kromatografi-diod serili dedektör) ile belirlenmiştir. Ayrıca hazırlanan dört farklı polaritedeki (%80 etanol, %80 metanol, %50 etanol ve %50 metanol) ekstraktlarda bulunan toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite değerleri de belirlenmiştir. En yüksek galangin içeriği olan %80 etanol ekstraktı kullanılarak kolon kromatografisi ile ekstrakttan galangin saflaştırılmıştır. Daha sonra galangin betasiklodekstrin ile enkapsule edildikten sonra, galangin-betasiklodekstrin kalıntısı, sodyum aljinat ve CaCl2 kullanılarak hidrojel yapımında kullanılmıştır. Maksimum galangin salınımı için galangin-aljinat hidrojelini oluşturma koşulları merkezi kompozit dizayn yöntemi ile optimize edilmiştir. ANOVA analiz sonuçlarına göre sodyum aljinat yüzdesi %0,69 (w/v); CaCl2 yüzdesi %1 (w/v); zaman 43,55 (dk); ekstrakt yüzdesi %0,48 (w/v) olarak bulunmuştur. Bu değerler ile yapılan hidrojelden elde galangin salınım derişimi, tahmini değer ile uyumlu bulunmuştur. Elde edilen galangin-aljinat hidrojelinin FT-IR ve SEM ile yapısal karakterizasyon çalışmaları da yapılmıştır. Mikroalg olarak Chlorella vulgaris örneği de ekstrakte edilip, antioksidan özellikleri belirlenmiştir. Daha sonra galangin- betasiklodekstrin kalıntısı, C.vulgaris kalıntısı ve galangin-aljinat hidrojeli krem örneklerine de eklenerek, kremlerin antioksidan özellikleri ve antitirosinaz etkileri de incelenmiştir. Çalışmamızda hazırlanan krem örneklerinin aday örnekler olabileceği sonucuna varılmıştır. Anahtar Kelimeler: Havlıcan, Chlorella vulgaris, hidrojel, antioksidan, mikroalg, krem, tirosinaz 2022, ix+84 sayfa. i ABSTRACT MSc Thesis DEVEPLOPMENT OF CREAM INCLUDING PLANT AND MICROALGAE INVESTIGATION OF THEIR ANTIOXIDANT AND ANTI-TYROSINASE ENZYME ACTIVITIES BY ANALYTICAL METHODS Eftal Alp DORKEN Bursa Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN With in the scope of this thesis, an extraction method was developed for Alpinia officinarum (galangal) belonging to the Zingiberaceae family, and the phenolic substances in the extracts were quantitatively determined by HPLC-DAD (high performance liquid chromatography-diode series detector). In addition, the total phenolic substance and antioxidant capacity values in the extracts of four different polarities (80% ethanol, 80% methanol, 50% ethanol and 50% methanol) were determined. Galangin was purified from the extract with column chromatography by using 80% ethanol extract including the highest galangin content. Subsequently, after galangin was encapsulated with betacyclodextrin, the residue of galangin- betacyclodextrin was used in hydrogel making by using sodium alginate and CaCl2. For maximum galangin release, the conditions for forming galangin-alginate hydrogel were optimized by the central composite design method. According to the ANOVA analysis results, the percentage of sodium alginate was 0.69% (w/v); percentage of CaCl2 1% (w/v); time 43.55 (min); extract percentage was found to be 0.48% (w/v). The galangin release concentration obtained from the hydrogel made with these values was found to be compatible with the estimated value. Structural characterization studies of the obtained galangin-alginate hydrogel were also performed with FT-IR and SEM. As microalgae Chlorella vulgaris sample was also extracted and its antioxidant properties were determined. Subsequently, galangin-betacyclodextrin residue, C. vulgaris residue and galangin-alginate hydrogel were added to the cream samples, and the antioxidant properties and antityrosinase effects of the creams were also investigated. It was concluded that the cream samples prepared in our study could be candidate samples. Key words: Galangal, Chlorella vulgaris, hydrogel, antioxidant, microalgae, cream tyrosinase 2022, ix+84 pages. ii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR Yüksek lisans başlangıcından bitimine kadar olan stresli süreçte her motivasyon kaybı yaşadığımda beni motive eden, yardımını esirgemeyen, bilgi ve birikimini paylaşan saygı değer danışman hocam Prof. Dr. Saliha ŞAHİN’e Tez dönemi boyunca bilgisini ve yardımlarını esirgemeyen saygı değer hocam Dr. Önder AYBASTIER’e Yüksek lisans deneysel çalışmalarım boyunca bana yardım ve destekleriyle yardım eden laboratuvar arkadaşlarım Büşra KARKAR, Gizem BAYAÇLI ve İlkyaz PATIR’a Tez dönemi boyunca her çıkmaza girdiğimde yanımda olan desteğini ve sevgisini eksik etmeyen eşim Cansu SEVEN DORKEN’e Beni bugünlere getiren iyi günde kötü günde hep yanımda olan sevgili annem Alime DORKEN ve babam Ercüment DORKEN’e Hayatım boyunca örnek aldığım desteğini hiç esirgemeyen, eğitim gördüğüm süre zarfında bana maddi ve manevi destek olan rahmetli abim Cenk DORKEN’e TEŞEKKÜR EDERİM Eftal ALP DORKEN …/…/……. iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.................................................................................................................................. i ABSTRACT ...................................................................................................................... ii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR .................................................................................................. iii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ...................................................................... vi ŞEKİLLER DİZİNİ ......................................................................................................... vii 1. GİRİŞ……………… .................................................................................................... 1 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI ....................................... 3 2.1. Fenolik Bileşikler ....................................................................................................... 3 2.1.1. Fenolik Asitler ......................................................................................................... 3 2.1.2. Flavonoidler ............................................................................................................ 7 2.2. Polifenolik İçerikli Ürünler ........................................................................................ 7 2.3. Kozmetik ürünleri ...................................................................................................... 8 2.4. Kremlerin Önemi ve Özellikleri .............................................................................. 10 2.5. Hidrojeller ................................................................................................................ 12 2.6. Aljinat………… ....................................................................................................... 14 2.7. Havlıcan Bitkisi ve Önemi ....................................................................................... 15 2.8. Galangin ................................................................................................................... 18 2.9. Antitirosinaz İnhibisyonu ......................................................................................... 22 2.10. Yüzey Analiz teknikleri ......................................................................................... 28 2.11. Chlorella vulgaris .................................................................................................. 28 3. MATERYAL ve YÖNTEM ........................................................................................ 33 3.1. Materyal ................................................................................................................... 33 3.1.1. Tez Kapsamında Çalışılan Bitki Materyali ........................................................... 33 3.1.2. Tez Kapsamında Kullanılan Cihazlar ................................................................... 33 3.1.3. Tez Kapsamında Kullanılan Kimyasallar ............................................................. 34 3.1.4. Tez Kapsamında Kullanılan Sarf Malzemeler ...................................................... 35 3.1.5. Tez Kapsamında Kullanılan Çözeltiler ................................................................. 35 3.2. Yöntem……….. ....................................................................................................... 38 3.2.1. Örnek Hazırlama İşlemleri .................................................................................... 38 3.2.2. Spektroskopik Yöntemler...................................................................................... 39 3.2.3. Kromatografik Yöntemler ..................................................................................... 41 3.2.4. HPLC-DAD cihazı ile karotenoidlerin kantitatif analizi ...................................... 41 3.2.5. Saflaştırma Çalışmaları ......................................................................................... 42 3.2.6. Kemometrik Çalışmalar ........................................................................................ 45 3.2.7. Anti-tirosinaz enzim aktiviteleri ........................................................................... 48 4. BULGULAR ............................................................................................................... 50 4.1. Spektroskopik Sonuçlar ........................................................................................... 50 4.2. Kromatografik Sonuçlar ........................................................................................... 50 4.3. Saflaştırma Çalışmaları ............................................................................................ 52 4.4. Kemometrik Çalışmalar ........................................................................................... 55 4.5. Anti-tirosinaz enzim aktivite çalışmaları ................................................................. 63 5. TARTIŞMA ve SONUÇ ............................................................................................. 65 5.1. Spektroskopik Yöntemler......................................................................................... 65 5.2. Kromatografik Yöntemler ....................................................................................... 67 5.3. Saflaştırma çalışmaları ............................................................................................. 67 5.4. Kemometrik Yöntemler .......................................................................................... 68 iv 5.5. Anti-tirosinaz enzim aktivite çalışmaları ................................................................. 72 KAYNAKLAR ............................................................................................................... 74 ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................... 84 v SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama α Alfa β Beta % Yüzde oranı nm Nanometre mL Mililitre mg Miligram mM Milimolar mg/L Miligram/Litre mg/g Miligram/gram cm Santimetre m Metre dk Dakika L Litre μL Mikrolitre M Molarite Rpm Dakikadaki devir sayısı Kısaltmalar Açıklama ABTS 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) HPLC Yüksek performanslı sıvı kromatografisi UV-VIS Ultraviyole/Görünür bölge UV Ultraviyole LOD Tayin limiti LOQ Tespit limiti DAD Diyot seri dedektör FTIR Fourier Dönüşümlü Kızıl Ötesi Spektrometresi DNA Deoksiribo nükleik asit RNA Ribonükleik asit CCD Merkezi kompozit dizayn N Toplam deney sayısı w/v Hacimce ağırlıkça yüzde v/v Hacim yüzde w/w Kütlece yüzde EtOH Etanol MeOH Metanol vi ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Fenol bileşiğin yapısı ........................................................................................ 3 Şekil 2.2. Hidroksisinnamik asit türevlerinin yapıları ...................................................... 5 Şekil 2.3. Hidroksibenzoik asitlerin yapıları ..................................................................... 6 Şekil 2.4. Hidroksisinnamik asitlerin yapıları ................................................................... 6 Şekil 2.5. Flavonoidlerin yapıları (R grupları fonksiyonel gruplardır) ............................. 7 Şekil 2.6. Sodyum aljinat yapısı ...................................................................................... 14 Şekil 2.7. Yumurta kafes modeli (Kabaş 2006) .............................................................. 15 Şekil 2.8. Havlıcan bitkisi (Alpinia officinarium) (Ding ve ark. 2019) .......................... 15 Şekil 2.9. Galangin yapısı ............................................................................................... 18 Şekil 2.10. Galanginin başlıca metabolik oluşumu (Mak ve ark. 2018) ........................ 19 Şekil 2.11. Melanin sentez reaksiyonu (Bronze-Uhle ve ark. 2016) .............................. 23 Şekil 2.12. Kozmetikte kullanılan beyazlatıcı etken maddelerin bazıları ....................... 25 Şekil 2.13. Karotenoidlerin kimyasal yapıları................................................................. 30 Şekil 2.13. Karotenoidlerin kimyasal yapıları (devam) .................................................. 31 Şekil 2.13. Karotenoidlerin kimyasal yapıları (devam) .................................................. 32 Şekil 3.1. Havlıcan bitkisinin ekstraksiyon yöntemi ....................................................... 38 Şekil 3.2. Kolon metodu ile fenolik maddelerin saflaştırılması (etanol ve metanol) ...... 42 Şekil 3.3. Havlıcanlı yüz kreminin hazırlanışı ................................................................ 43 Şekil 3.4. Toplam fenol ve antioksidan kapasite ölçümleri için krem örneklerinin hazırlanışı ........................................................................................................................ 43 Şekil 3.5. Chlorella vulgaris ekstraksiyon aşamaları...................................................... 44 Şekil 3.6. Chlorella vulgaris ekstraktlı krem .................................................................. 44 Şekil 3.7. Havlıcan ekstraktının enkapsülasyonu ............................................................ 45 Şekil 3.8. Hidrojellerin elde edilişi ................................................................................. 46 Şekil 3.9. Salınım testinin HPLC analiz için hazırlanışı ................................................. 47 Şekil 3.9. Salınım çalışması için analiz şeması ............................................................... 47 Şekil 3.10. Şişme oranı testi için analiz şeması .............................................................. 47 Şekil 4.1. 320 nm’de etanol ekstraktının fraksiyon/absorbans grafiği ............................ 52 Şekil 4.2. 360 nm’de etanol ekstraktının fraksiyon/absorbans grafiği ............................ 52 Şekil 4.3. 320 nm’de metanol ekstraktının fraksiyon/absorbans grafiği ......................... 53 Şekil 4.4. 360 nm’de etanol ekstraktının fraksiyon/absorbans grafiği ............................ 53 Şekil 4.5. Havlıcanlı yüz kremi ....................................................................................... 54 Şekil 4.6. Chlorella vulgaris krem formu ....................................................................... 55 Şekil 4.7a. Kemometrik yüzey analizi grafikleri (Zaman- CaCl2 etkisi) ........................ 57 Şekil 4.7b. Kemometrik yüzey analizi grafikleri (Zaman-Ekstrakt etkisi) ..................... 58 Şekil 4.8. Galangin-β-siklodekstrin kalıntısının görüntüsü ............................................ 59 Şekil 4.9. Hidrojel görüntüsü .......................................................................................... 59 Şekil 4.10. Sodyum aljinat, ß-siklodekstrin+havlıcan ekstraktı, ß-siklodekstrin ve hidrojelin FTIR spektrumları .......................................................................................... 60 Şekil 4.11. Galangin-β-siklodekstrin kalıntısının SEM görüntüsü (500 büyütme) ......... 60 Şekil 4.12. Galangin-β-siklodekstrin kalıntısının SEM görüntüsü (1000 büyütme) ....... 61 Şekil 4.13. Galangin-β-siklodekstrin kalıntısının SEM görüntüsü (3000 büyütme) ....... 61 Şekil 4.14. Hidrojel SEM görüntüsü (200 büyütme) ...................................................... 62 Şekil 5.1. Galangin-aljinat hidrojelinin hazırlanması ..................................................... 69 Şekil 5.2. β-siklodekstrin yapısı ...................................................................................... 70 Şekil 5.3. Siklodekstrinlerin 3 boyutlu yapıları (Zhang ve Rees 1999) .......................... 70 vii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Fenolik antioksidanların sınıflandırılması (Shahidi ve Ambigaipalan 2015) ........................................................................................................................................... 4 Çizelge 2.2. Fenolik maddelerin kullanım alanları ........................................................... 8 Çizelge 2.3. Kozmetikte kullanılan hammaddelerin özellikleri (Baki ve Alexander 2015, Salvador ve Chisvert 2007) ............................................................................................... 9 Çizelge 2.4. Kozmetik ürünler ve kullanım nedenleri (Bakı ve Alexander 2015, Salvador ve Chisvert 2007) ............................................................................................... 9 Çizelge 2.4. Kozmetik ürünler ve kullanım nedenleri (Bakı ve Alexander 2015, Salvador ve Chisvert 2007) (devam)............................................................................... 10 Çizelge 2.5. Kremlerin kullanım amaçları ...................................................................... 11 Çizelge 2.6. Fenolik bileşiklerin krem formülasyonlarındaki kullanımı (Soto ve ark. 2015) ............................................................................................................................... 11 Çizelge 2.7. Hidrojellerin uygulama alanları (Sop 2013) ............................................... 12 Çizelge 2.8. Hidrojellerin sınıflandırılması (Akalın 2011, Ulusoy ve Dikmen 2020) ... 13 Çizelge 2.9. Hidrojel avantajları ve dezavantajları (Ekmen 2019) ................................. 14 Çizelge 2.10. Havlıcan bitkisinin yerel isimleri .............................................................. 16 Çizelge 2.11. Havlıcan bitkisinin kullanıldığı hastalıklar (Zhang ve ark. 2020) ............ 16 Çizelge 2.12. Havlıcan köksapında bulunan uçucu yağ içerikleri (Rana ve ark. 2010) . 17 Çizelge 2.13. Havlıcan bitkisinde bulunan flavonoid ve türleri (Ding ve ark. 2019) ..... 17 Çizelge 2.14. Galanginin biyolojik aktieleriyle ilgili geleceğe yönelik çalışmalar (Mak ve ark. 2018).................................................................................................................... 21 Çizelge 2.15. Beyazlatıcı ajanların tayinleri ................................................................... 27 Çizelge 2.16. Chlorella vulgaris içeriğinde bulunan bileşenler (Nasir ve ark. 2017) .... 29 Çizelge 3.1. Cihaz özellikleri ve kullanım amaçları ....................................................... 33 Çizelge 3.2. Analizlerde kullanılan kimyasallar ............................................................. 34 Çizelge 3.2. Analizlerde kullanılan kimyasallar (devam) ............................................... 35 Çizelge 3.3. Analizlerde kullanılan sarf malzemeler ...................................................... 35 Çizelge 3.4. Folin-Ciocalteu kalibrasyon verileri ........................................................... 39 Çizelge 3.5. ABTS kalibrasyon verileri .......................................................................... 40 Çizelge 3.6. CHROMAC kalibrasyon verileri ................................................................ 40 Çizelge 3.7. HPLC çalışma programı ............................................................................. 41 Çizelge 3.8. HPLC çalışma programı ............................................................................. 42 Çizelge 3.9. Merkezi kompozit dizayn için faktörler ve kodlanmış seviye değerleri ..... 45 Çizelge 3.10. Gerçek seviye değerleri için merkezi kompozit dizayn tablosu ............... 45 Çizelge 3.10. Gerçek seviye değerleri için merkezi kompozit dizayn tablosu (devam) . 46 Çizelge 3.11. IC50 değerleri belirlenecek örnekler ve kullanıldığı miktarlar................. 48 Çizelge 3.12. A, B, C ve D çözelti hacimleri .................................................................. 49 Çizelge 3.13. %İnhibisyon kalibrasyon verileri ............................................................. 49 Çizelge 4.1. Spektroskopik bulgular ............................................................................... 50 Çizelge 4.2. HPLC-DAD için hazırlanan fenolik maddelerin kalibrasyon grafikleri ..... 51 Çizelge 4.3. Havlıcan ekstraktlarında bulunan fenolik madde miktarları ....................... 51 Çizelge 4.4. Spektroskopik bulgular ............................................................................... 54 Çizelge 4.5. Kemometrik deneysel ve tahmini değerler ................................................. 56 Çizelge 4.6. Kemometrik yanıt değerleri için ANOVA analizi sonuçları ...................... 56 Çizelge 4.7. Kuadratik polinom denklemleri (x1:Na-Al yüzdesi (%w/v), x2:CaCl2 yüzdesi (%w/v), x3:Zaman (dk), x4:Ekstrakt yüzdesi (%w/v)) ........................................ 57 viii Çizelge 4.8. Kemometrik optimum koşullar ve deneysel/tahmini değerler .................... 57 Çizelge 4.9. Şişme oranları ............................................................................................. 63 Çizelge 4.10. Örneklerin IC50 değerleri ......................................................................... 64 IC50 Değeri (mg/mL) ..................................................................................................... 64 Çizelge 5.1. Siklodekstrinlerin yardımcı madde olarak kullanım alanları ...................... 70 ix 1. GİRİŞ Yaşamımız boyunca maruz kaldığımız genetik faktör, UV ışığı ve çevresel faktörlerin cildimize doğrudan veya dolaylı temas etmesi sonucu, vücudumuzda pigmentasyon bozukluklarına neden olmaktadır. Melanin pigmentlerinin sentezinde düzensizlikler meydana gelerek ciltte ton uyuşmazlığı, lekeler ve izler meydana gelmektedir. Dermokozmetik krem formunda satılan ürünlerin etken maddesi olarak sentetik bazlı kimyasalların tercih edilmesi ve uzun süre kullanımlar sonucu canlılarda bazı yan etkiler olabilmektedir. Yan etkileri azaltmak amacıyla günümüzde etken özellik olarak fenolik ve flavonoid içeriği yüksek bitkisel ağırlıklı dermokozmetik ürünler ön plana çıkmaktadır. Havlıcan, çok yıllık bir bitki ve 1000 yıldan uzun süre Çin ve Avrupa bölgelerinde baharat olarak tüketilmiş, zengin fenolik ve flavonoid içeriğine sahip zencefil familyasına ait bir bitki türüdür. Havlıcan keskin kokulu ve odunsu bir yapıya sahiptir. Baharat olarak kullanmak için birkaç işlemden geçirilerek toz kıvamına getirilir. Havlıcan besin öğelerine bakıldığında %5,25 protein, %76,9 karbohidrat, %2,26 yağ, %17 ham lif ve eser miktarda elementlerden oluşmaktadır. Havlıcanın antienflamatuar, antioksidan, antiemetik ve antikanser özelliklere sahiptir. Chlorella vulgaris yağ asitleri, pigment, steroller, vitaminler, mineral, antioksidanlar, karbohidrat ve fenolik maddelerce zengin olması nedeniyle piyasada takviye edici gıda ve kozmetik ürün olarak kullanılmaktadır. Chlorella vulgaris besin kaynağı olarak %51- 58 protein, %12-17 karbohidrat ve %14-22 yağ içermesi nedeniyle takviye edici gıdalarda diyet için önemli bir tercih nedeni olmuştur. Chlorella vulgaris içeriğinde bulunan diğer önemli grup ise karotenoidlerdir. Kozmetik, canlıların güzelleşmek daha iyi bir görünüme sahip olmak, cilt kusurlarını kapatmak veya tedavi için tercih edilen cilt bakım ürünleridir. Kozmetik tarihi M.Ö. 4000 yıllarında mısırlılara dayanmaktadır. O zamanlarda da insanlar görünümlerine özen göstermekte saç, yüz ve göz çevresini farklı renkte boyalar ile boyamaktadırlar. Gözlere sürdükleri boyaların güneşin zararlı etkilerinden korumak amaçlı kullanıldığı düşünülmektedir. M.Ö. 2000 yıllarında Mezopotamya’da bitkilerden ve baharatlardan 1 ilaç, kozmetik ve boyaların hazırlandıkları ve kınalar ile saç boyamaya başladıkları bilinmektedir. M.Ö. 500’lerde Hint uygarlığında kozmetik ürünlerin üretiminde tütsü, sandal ağacı ve değişik kokular kullanılmaya başlanmış, Çinli kadınlar ise yüz bakımı için çay yağı ve pirinç tozu maskesi kullanmıştır (Sungur ve ark. 2018). Geçmişten günümüze kadar kozmetik hayatımızın hep bir köşesinde bizimle beraber olmuştur. Günümüzde ise sentetik ürünlerin yerine doğal içerikli bileşiklerin kullanılması hem insan sağlığı hem de çevre kirliliği açısından daha çok tercih edilmektedir. Bu nedenle çalışmamızda bitkisel ve mikroalg içerikli krem geliştirilip, antioksidan ve anti-tirosinaz enzim aktivitelerinin analitik yöntemlerle araştırılması amaçlanmıştır. Tez kapsamında Chlorella vulgaris ve havlıcandan elde edilen ekstraktların antioksidan özellikleri kromatografik ve spektroskopik yöntemlerle belirlenmiştir. Daha sonra ilgili ekstraktlardan fenolik madde ve karotenoid saflaştırılması yapılmıştır. İzole edilen fraksiyonlar krem formulasyonuna eklenerek, kremin antioksidan ve antitirosinaz inhibisyon özellikleri incelenmiştir. Ayrıca galangin-alginat hidrojellerinin hazırlanması için merkezi kompozit dizayn yöntemiyle optimizasyon yapılmıştır. Optimum koşullarda hazırlanan galangin-aljinat hidrojeli krem formuna eklenerek antioksidan ve antitirosinaz inhihisyon özellikleri belirlenmiştir. Hazırlanan galangin-aljinat hidrojelinin yapısal karakterizasyon çalışmaları da yapılmıştır. 2 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Fenolik Bileşikler Benzen halkasına bir veya birden fazla hidroksil grubu içeren bileşiklere fenolik bileşikler veya polifenoller adı verilir. En basit fenolik yapı (Şekil 2.1) bir benzen halkasına bağlı hidroksil grubunun bulunduğu yapı olup, diğer fenolik maddelerin bundan türediği bilinmektedir. Fenolik antioksidanlar, kökenlerine göre sentetik ve doğal olarak sınıflandırılabilir (Çizelge 2.1). OH Şekil 2.1. Fenol bileşiğin yapısı Bitkilerde bulunan fenolik bileşikler zararlı hayvan ve güneş ışınlarından, parazitlerden, mantarlardan, mikroorganizmalardan ve olumsuz çevre şartlarından bitkinin korunmasını sağlamaya çalışırlar. Fenolik antioksidanların sınıflandırılması Çizelge 2.1’de verilmiştir. 2.1.1. Fenolik Asitler Fenolik asitler bitkilerde sekonder metabolit olarak bulunurken az miktarda da doğada serbest olarak bulunurlar. Bitkilerin rengi, tadı ve kokusundan sorumludurlar. Hidroksibenzoik asit ve hidroksisinnamik asit türevleri fenolik asitleri oluştururlar. Hidroksisinnamik asit türevlerinden en yaygınlarından bazıları; klorojenik asit, neo- klorojenik asit, izoklorojenik asit, kriptoklorojenik asit ve kaftarik asitlerdir (Şekil 2.2). Hidroksibenzoik asitler, en basit yapılı fenolik bileşiği olan fenol bileşiğine karboksil gruplarının bağlanmasıyla oluşan yapılardır. p-hidroksibenzoik asit, gallik asit ve protokatekuik asit örnek olarak verilebilir (Şekil 2.3). 3 Çizelge 2.1. Fenolik antioksidanların sınıflandırılması (Shahidi ve Ambigaipalan 2015) Fenolik Antioksidan Sentetik Doğal Bütillenmiş Hidroksitoluen Fenolik Asitler Lignanlar Tanenler Kumarinler Stilbenler Bütillenmiş hidroksianisol Tersiyer-bütilhidrokinon Flavonoidler Propil gallat Hidrolize Yoğ unlaştırılmış Hidroksibenzoik Hidroksisinnamik edilebilir tanenler tanenler Asit Türevleri Asit Türevleri Resveratrol Flavonoller Flavononoller Antosiyanidinler Flavonlar Flavanoller İzoflavonoidler 4 O HO O OH HO OH O OH HO HO O O HO OH HO OH O OH Klorojenik asit Neo-klorojenik asit O OH O O O OH HO HO O OH OH HO HO HO OH O HO O Kaftarik asit Kriptoklorojenik asit O HO OH O O O O OH HO OH OH OH İzoklorojenik asit Şekil 2.2. Hidroksisinnamik asit türevlerinin yapıları Fenolik asitleri oluşturan hidroksisinnamik asitlerin en yaygın olarak bilinen yapılarından bazıları; p-kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit, izoferulik asit ve sinapik asitler olduğu bilinmektedir (Şekil 2.4). 5 O OH O OH O OH HO OH OH OH OH OH p-hidroksibenzoik asit Gallik asit Protokatekuik asit Şekil 2.3. Hidroksibenzoik asitlerin yapıları OH O OH O OHO HO O OH OH CH3 OH OH p-kumarik asit Kafeik asit Ferulik asit O OH O OH O O OH O CH3 OH CH3 CH3 Sinapik asit İzoferulik asit Şekil 2.4. Hidroksisinnamik asitlerin yapıları 6 2.1.2. Flavonoidler Flavonoidler canlı sağlığı açısından günümüzde çok önemli bir yere sahiptir. Bitkiler ve meyvelerde çok fazla bulunmaktadırlar. Serbest radikaller; daha çok canlı yapıdaki organ, doku zedelenmesi, yararlı hücrelerin işlevselliğinin engellenmesini sağlayarak, DNA ve RNA yapılarını bozarak insan vücuduna zarar veren yapılardır. Flavonoidler, serbest radikaller ile reaksiyon gerçekleştirip, onların zararsız hale dönüştürülmesini sağlayan güçlü antioksidanlardır. Serbest radikal süpürme özelliği dışında antimikrobiyal, antiradyasyon, immünomodülatör, antifungal ve antiinflamatuar özellikleriyle de bilinirler. Flavon, flavonol, flavanol, flavonon ve katesin flavonoid olarak bilinen yapılardır (Şekil 2.5). R1 O R O OR2 O OH Flavon Flavonol R R2 2 R O R1 O OH O O Flavonon Kateşin Şekil 2.5. Flavonoidlerin yapıları (R grupları fonksiyonel gruplardır) 2.2. Polifenolik İçerikli Ürünler Fenol bileşikler takviye edici gıdalarda, gıda ürünlerinde ve kozmetik ürünlerinde kullanılmaktadır. Takviye edici gıdaların içinde etken madde olarak yani insan için gerekli olan mineral ve vitaminlerin eksikliğinde kullanılmaktadır. Kozmetik ürünlerinde daha çok spesifik rahatsızlıklara uygun fenolik etken maddeler tercih edilmektedir. Kremler, makyaj malzemeleri, nemlendiriciler vb. gibi kozmetik ürünlerin asıl işlevini sağlayan etken madde fenolik bileşiklerdir. Doğal veya sentetik olarak elde 7 edilebilmektedirler. Doğal olarak fenoller meyve ve sebzelerde bulunurlar. Kozmetik formülasyonlarına ilaveleri için ön işlemlerden geçirilerek uygun hale getirilirler. Fenolik içeren ürünler yapısındaki antioksidan, antimikrobiyal, antienflamatuvar ve antiviral özelliklerinden dolayı kozmetik ürünlerinde tercih edilmektedir. Bitmiş ürünün içeriği fenol dışında vitaminler ve mineraller ile zenginleştirilmektedir (Çizelge 2.2). Çizelge 2.2. Fenolik maddelerin kullanım alanları Fenolik ürün Kullanım Alanı Kaynak Yaban mersini Kozmetik ürünleri, Hui ve ark. 2021, Schiavon ve ark. gıda takviyeleri 2019 Vitamin C Kozmetik ürünleri, Cercamondi ve ark. 2013, Zerbinati gıda takviyeleri ve ark. 2021 Vitamin B3 Kozmetik ürünleri, Final Report of the Safety gıda takviyeleri Assessment of Niacinamide and Niacin, 2005 Vitamin E Kozmetik ürünleri, Juncan ve ark. 2019, Waniek ve ark. gıda takviyeleri 2018 Koenzim Q10 Kozmetik ürünleri, Pegoraro ve ark. 2017, Petrangolini gıda takviyeleri ve ark. 2019 Hyaluronik asit Kozmetik ürünleri, Janik-Hazuka ve ark. 2020, Torreao gıda takviyeleri ve ark. 2021 Böğürtlen Kozmetik ürünleri, Correa ve ark. 2021 gıda takviyeleri Siyah frenk üzümü Kozmetik ürünleri, Çağlar ve Demirci 2017, May ve Guenther 2020, Skrede ve ark. 2000 Ahududu Kozmetik ürünleri, Oh ve ark. 2020, Wu ve ark. 2018 gıda takviyeleri 2.3. Kozmetik ürünleri Kozmetik, belirli koşullar ve şartlar altında en az iki veya daha fazla üründen elde edilen kişisel temizlik, cilt sorunlarını giderme veya bakım amaçlı kullanılan opak/şeffaf görünümlü ürünlerdir. Kozmetikler gaz, sıvı ve krem formunda olabilir. Ürünü oluşturan hammaddelerin karakteristik özellikleri vardır. Bunlardan bir kısmı Çizelge 2.3’de verilmiştir. Kozmetik sanayisi geçmişten günümüze kadar sürekli gelişip büyümektedir. Bunun en büyük sebepleri insanların sürekli kusurlarını kapatıp güzelleşmeye olan isteklerinden kaynaklanmaktadır. Canlılar kozmetik ürünlerini güzelleşmenin yanı sıra cilt rahatsızlıklarının tedavisi içinde tercih etmektedirler. 8 Kozmetik ürünleri ve kullanım nedenlerinden bazıları Çizelge 2.4’de verilmiştir. Kozmetik ürünler insanların sağlık ve cilt bozukluğu sorunlarından dolayı önem kazanmıştır. İnsanların daha güzel bir görünüme kavuşmak adına olan uğraşlarının sonucunda daha kusursuz, daha parlak cilde olan ilgileri kozmetik sektörünün parlamasının nedenlerinden biridir. Çizelge 2.3. Kozmetikte kullanılan hammaddelerin özellikleri (Baki ve Alexander 2015, Salvador ve Chisvert 2007) Kullanılan hammade Özelliği Kıvamlaştırıcılar Su gibi akışkan özellikteki yapının içerisinde şişerek viskoz krem formuna dönüştürülmesinde kullanılan ürünlerdir Etken maddeler Canlılarda sağlık sorunlarını (pigmentasyon, güneş yanıkları, mantar vb) tedavi etmek için kullanılan kozmetik formülasyonlarında bulunan maddelerdir. Güneş kremleri/losyonlarında kullanılan UV filtreler örnek verilebilir Emülgatörler Birbiri ile karışmayan su ve yağ formundaki maddelerin belirli oranlarda karışmasını sağlayan maddelerdir Koruyucular Bitmiş kozmetik ürünlerinin içerisinde üreme oluşmasını engelleyen maddelerdir Esans Bitmiş kozmetik ürünlerindeki kokuların kaynağıdır Boya Bitmiş ürünlerin renklerini belirlemekte kullanılır Estetik modifiye ajan Daha çok bitmiş ürünlerin bulanıklığını gidermek için kullanılan opaklaştırıcı ajanlardır Nemlendiriciler Cilt sıvı dengesini ve ısıyı düzenleyerek cildin gerekli nemi tutmasını sağlamaktadırlar Çizelge 2.4. Kozmetik ürünler ve kullanım nedenleri (Bakı ve Alexander 2015, Salvador ve Chisvert 2007) Kozmetik Ürünler Kullanım nedenleri Ruj Dudakları nemlendirir ve renklendirir Oje Tırnakların kırılmasını önler ve renklendirir Peeling Cildin dış tabakasındaki ölü deri hücrelerinin soyulmasını sağlayarak cildin yenilenmesi sağlanır Parfüm ve deodorant Terlemede oluşan kötü kokuların giderilmesinde kullanılır Güneş kremleri Zararlı güneş ışınlarının ciltte olan zararlarının engellemesinde kullanılır 9 Çizelge 2.4. Kozmetik ürünler ve kullanım nedenleri (Bakı ve Alexander 2015, Salvador ve Chisvert 2007) (devam) Kremler (el,ayak ve Kuru ciltlerin nemlendirilmesinde ve kötü çevre yüz) koşullarında ciltte bariyer oluşturarak çatlamasını engellemek için kullanılır Losyon Vücudun gerekli nem dengesini ve cildin yumuşaklık sağlaması amacıyla kullanılır. Şampuan Saç temizliğinde kirlerin uzaklaştırılmasında kullanılır Pudra Ciltteki kusurları kapatmak için kullanılır Tonik Gün boyu kirlenen cildin temizlenmesi için kullanılır Maskara Kirpiklerin belirginleştirmesi ve koyulaştırması için kullanılır Saç boya Saç, kaş ve bıyıkların renklendirilmesinde kullanılır Mantar kremi Mantar hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır Çatlak kremi Aşırı kilo alıp vermekten kaynaklanan çatlakların tedavisinde kullanılır Kırışıklık giderici İlerleyen yaşlarda oluşan kırışıklıkların giderilmesinde krem kullanılır. 2.4. Kremlerin Önemi ve Özellikleri Kremler kozmetik ürün çeşitliliğinin en önemli payına sahip ürünlerden biridir. Kremler birden fazla hammadde karışımından oluşan genellikle opak görünüme sahip yapılardan oluşur. Kremler insan sağlığı açısından çok önemli bir yere sahip olmasının insan zihnini ve bedenini rahatlamasından kaynaklanmaktadır. Kullanım için seçilecek ürünlerin cilt tipine ve kullanım alanına uygun seçilmelidir. Kremlerin kullanımı açısından bakarsak insan vücudunun rahatlaması, nemlendirilmesi, saç köklerin güçlendirilmesi, kırışıklık giderilmesi, pigmentasyon bozuklukların giderilmesi, zararlı güneş ışınlarına karşı cildin korunması vb. gibi birçok özellik, kremlerin içeriğindeki etken maddelere bağlıdır. Dünya üzerinde binlerce farklı formülasyona sahip farklı yapıda kremler bulunmaktadır. Kullanım alanına göre kremler Çizelge 2.5’de gösterilmiştir. Kozmetik ürünler dışında dermatoloji, tıp ile kozmetik kelimesinden türeyen dermokozmetik insan sağlığı açısından önemlidir. Kozmetik cilt bakımı güzelleşmek için kullanılırken, dermokozmetik ise daha çok cilt hastalıklarının tedavisi amacıyla kullanılmaktadır. Polifenolik maddelerin kozmetik ürünlerdeki kullanımı oldukça yaygındır (Çizelge 2.6). Bunun nedeni içeriğindeki antioksidan maddeler 10 sayesinde reaktif oksijen türlerine ve UV ışınlarına karşı vücudun savunmasını destekleyerek kullanım amacına uygun yerlerde olumlu gelişmeler göstermesidir. Çizelge 2.5. Kremlerin kullanım amaçları Krem çeşidi Amacı Masaj kremi Ağrıyan bölgeyi rahatlatmak amacıyla kullanılan kremlerdir. İçeriğinde besleyici yağlar dışında fresh maddeler ile vücudun rahatlaması sağlanır (Law ve ark. 2008) Leke kremi Cilt üzerindeki leke, akne, ton uyuşmazlığı, deri hastalıklarında Beyazlatıcı krem kullanılır (Kim ve ark. 2011) Nemlendirici Kuru cilte sahip kişiler vücut nem dengesini sağlamak amacıyla krem kullanılmaktadır (Alam ve ark. 2020) Peeling Cilt temizleme ve kapalı gözenekleri açmak için kullanılmaktadır (Dorgham ve ark. 2020) Anti-aging krem Yaşlanma sonrası ortaya çıkan kırışıklıkların giderilmesinde kullanılmaktadır (Astuti ve ark. 2021) Güneş kremi Güneşin zararlı ışınlarından cildin korunması için koruyucu bariyer oluşturmak için kullanılır (Torbati ve Javanbakht 2020) Mantar kremi Cilt hastalığı olarak bilinen mantarların tedavisinde kullanılmaktadır (Taofiq ve ark. 2016) Çatlak kremi Genel olarak kuru ciltlerde el ve ayak bölgelerinde sıklıkla görülen çatlakların giderilmesinde kullanılmaktadır (Zhu ve Kannan 2020) Pişik kremi Genellikle ıslak ve hava almayan bölgelerde oluşumuna engel olması için kullanılmaktadır (Garcia Bartels ve ark. 2014) Çizelge 2.6. Fenolik bileşiklerin krem formülasyonlarındaki kullanımı (Soto ve ark. 2015) Bileşik Aktivite Kozmetik kullanım Gallik asit, kateşin, epikateşin, Antioksidan, Yaşlanma karşıtı konjuge flavonoidler, radikal temizleyici, koruyucu proantosiyanidinler, resveratrol, hücre büyümesinin melanin uyarılması Ferulik asit, kafeik asit, gallik asit, Işın koruyucu Güneş koruyucuları, resveratrol, proantosiyanidinler dudak koruyucuları Tartarik asit Peeling, Kimyasal ve fiziksel karartıcı, peeling ajanı, pH düzenlemesi kararma önleyici, pH düzeltici Oleik asit, linoleik asit, linolenik Antioksidan, Gece ve gündüz kremi asit, vitamin C, vitamin E besleyici (yaşlanma karşıtı) 11 2.5. Hidrojeller Hidrojel, birbirine çapraz bağlı polimerlerin oluşturduğu büyük karmaşık yapılardır. Suda çözünmeyen yapılardır. Sulu ortamlarda suyun bir kısmını yapı içerisinde tutarak şişer dolayısıyla kütle ve hacmi doğru oranda artar. Hidrojeller hacimlerinin 100 katı kadar şişebilir, kuru ortamda suyu dışarı salarak tekrar eski hacimlerine dönebilir. Doğal ve sentetik olarak bulunabilirler. Hidrojellerin suda çözünmemelerinin nedeni kimyasal veya fiziksel çapraz bağlanmalarından kaynaklanmaktadır. Fiziksel çapraz bağlar, Van der waals etkileşimleri ve hidrojen bağları gibi bağların kristal yapıyla zayıf etkileşimleri olabilir (Shapiro 2011). Çapraz bağlar ağ yapısını ve fiziksel bütünlüğü sağlarlar. Günümüzde kullanım alanları önem kazanmıştır. Akıllı polimer olarak bilinen hidrojeller ile kontrollü ilaç salınımının vücut içerisinde taşınarak kontrollü olarak istenilen bölgede salınması üzerine çalışmalar mevcuttur. Bu çalışmalarda akıllı polimerlerin sıcaklık, pH, basınç, nem, elektriksel alan ve manyetik alan gibi çevresel etkilere karşı cevap verebilme özelliğinden yararlanılmıştır (Ahmed 2015). Akıllı polimerlerin çevresel etkilere hızlı tepkime vermesi uygulama alanlarında önem kazanmasını arttırmıştır (Çizelge 2.7). Çizelge 2.7. Hidrojellerin uygulama alanları (Sop 2013) Uygulama Alanı Hidrojel Yara örtüsü Poliüretan, polivinilpirolidon, polietilen glikol, metil selüloz, karboksimetil selüloz, aljinat İlaç taşınımı Polivinilpirolidon, poliakrilik asit, karboksimetil selüloz, polivinil alkol, akrilik asit, metakrilik asit, 2-akrilo,2-metil sülfonik asit, kitosan Diş malzemesi Hidrokolloidler Doku mühendisliği, implantlar Polivinil alkol, poliakrilik asit, hyalüronan, kollajen Enjekte edilebilir polimer sistemler Poliesterler, polipeptitler, kitosan Kozmetik, farmasotik uygulamalar Arap zamkı, pektin, kitin, kitosan, heparin, nişasta, aljinat Hidrojellerin sınıflandırılması hazırlama yöntemine göre, iyon yüküne göre, kaynağına göre ve bağlanma şekline göre Çizelge 2.8’de verilmiştir. Hidrojeller kullanım alanlarına göre seçilmeli veya sentezlenmeleri gerekmektedir. Hidrojellerin avantajları 12 ve dezavantajları düşünüldüğünde (Çizelge 2.9) karşılaştırılma yapılması gerekiyorsa diğer alternatif ürünlere yönlenmelidir. Çizelge 2.8. Hidrojellerin sınıflandırılması (Akalın 2011, Ulusoy ve Dikmen 2020) Hidrojellerin Sınıflandırılması Hazırlama yöntemine göre Homo polimer hidrojeller Kopolimer hidrojeller Çoklu polimer hidrojeller IPN (interpenetrating networks) hidrojeller İyon yüküne göre Amfoterik hidrojeller Nötral hidrojeller Anyonik hidrojeller Katyonik hidrojeller Kaynağına göre Doğal hidrojeller Sentetik hidrojeller Hibrit hidrojeller Bağlanma şekillerine göre Fiziksel çapraz bağlı hidrojeller Kimyasal çapraz bağlı hidrojeller 13 Çizelge 2.9. Hidrojel avantajları ve dezavantajları (Ekmen 2019) Avantajları Dezavantajları Biyouyumludurlar Sterilize etmek zordur Hücrelerden kolaylıkla geçebilirler Mekanik etkiye karşı zayıftırlar Hücre ligandlarıyla kolayca modifiye edilebilirler İlaç yüklenmesi ve in vitro olarak bağ oluşumu zordur Vücut sıcaklığında sıvı formda enjekte edilebilirler Bazı durumlarda kullanımları zordur (Ermiş 2007). Sulu ortamdan hücreleri ve dayanıklı olmayan Maliyetlidir ilaçları koruyabilirler (Ermiş 2007). 2.6. Aljinat Aljinatlar kahverengi deniz yosunlarından elde edilen şelatlama özellikleri bulunan aljinik asitin sodyum tuzu (Şekil 2.6) formudur. Sodyum aljinatlar daha çok soğuk su bölgelerinde yetişip gelişen, kahverengi deniz yosunlarından elde edilmektedir. Aljinik asit, 1,4-glikosidik bağlantılar ile birleştirilen β-D-mannuronik asit ve α-L-glukuronik asit kalıntılarından oluşan doğrusal bir blok kopolimer polisakkarittir (Doğrusoy 2018). Soğuk ve sıcak su ortamında yüksek düzeyde aljinasyon etkisi sayesinde çözünme kabiliyetine sahiptir. Ortamda kalsiyum olması durumunda katalizör olmasa bile jel oluşturma yeteneğine sahiptir. Na O HO O O O OH OH Şekil 2.6. Sodyum aljinat yapısı Jelleşmenin oluşumuna etki eden onun zayıf yada daha kuvvetli yapısının oluşmasına, pH, iyonik güç, sıcaklık, aljinat konsantrasyonu, ortam koşulları, bağ yapısı vb. faktörlere bağlıdır. Aljinatın katyonlarla güçlü çapraz bağlanma etkileşimleri şu şekilde sıralanır; +3 değerlikli katyonlar> Pb2+> Cu2+> Cd2+> Ba2+> Sr2+>Ca2+. Kalsiyum iyonu etkileşim gücü düşük olmasına rağmen en çok tercih edilip kullanılandır. Jel oluşurken kalsiyum ile aljinat arasında iyon değişimi gerçekleşir, kalsiyum iyonları aljinattaki karboksil ve hidroksil gruplarıyla yumurta-kafes (Şekil 2.7) yapısını oluşturur. 14 Şekil 2.7. Yumurta kafes modeli (Kabaş 2006) 2.7. Havlıcan Bitkisi ve Önemi Havlıcan, zencefil familyasına ait keskin kokulu aromatik bir bitki türüdür. Rizomları 1- 2 cm kalınlığında ve kırmızı renklidir. Boyları yaklaşık olarak 3 metreye kadar uzanabilen çiçekli, çok yıllık bir bitkidir (Şekil 2.8). Tropik bölgelerde yetişir. Yetiştiği bölge ve iklim koşullarına göre farmakolojik fonksiyonlar üzerinde etkileri farklılık göstermektedir. Avrupa ve Çin’de 1000 yılı aşkın süredir baharat olarak kullanılmaktadır. Havlıcan bitkisi güneydoğu Asya, Çin’in belli bölgeleri, Hindistan ve Laosta yetişmektedir (Lin ve ark. 2015, Rana ve ark. 2010). Şekil 2.8. Havlıcan bitkisi (Alpinia officinarium) (Ding ve ark. 2019) Yapılan çalışmalar gösteriyor ki havlıcanın, antiinflamatuar, antioksidan (Srividya ve ark. 2010), antiemetik (Shin ve ark. 2002) ve antikanser (Ding ve ark. 2019) olduğunu göstermiştir. Havlıcan köksapında %5,25 protein, %76,9 karbohidrat, %2,26 yağ, %15 ham lif ve çeşitli eser miktarda elementler içerir (Indrayah ve ark. 2009). Ayrıca 15 bölgelere göre havlıcan bitkisinin bir kaç yerel ismi vardır (Çizelge 2.10). Havlıcan bitkisinin günümüzde tedavi amaçlı kullanıldığı diğer hastalıklar Çizelge 2.11’de gösterilmiştir. Uçucu yağlar, tüm bitkinin %1,5'ini oluşturan köksaptaki ana bileşenlerden biri olarak havlıcan aromasına katkıda bulunur. Çizelge 2.10. Havlıcan bitkisinin yerel isimleri Lokal adı Ülke Kaynak Gao linang jiang Çin Salgado ve ark. 2007 Heha Çin Pei 1985 Chitrarathai Hindistan/Tamil Abubakar 2018 chooranam Aichhia or Dum aidu Hindistan/Mizoram Sharma ve ark. 2001 Khoulanjan İran Fard ve Shojaii 2013, Rezaei ve ark. 2015 Ryokyo Japonya An ve ark. 2008 Khoudenjal Fas Jamila ve Mostafa 2014 Kulanja Yemen Fleurentin ve Pelt 1982 Havlıcan Türkiye Güzel ve ark. 2015 Kha Ling Tayland Lim 2015 Petite galangal Fransız Lim 2015 Galanga Hollanda Lim 2015 Çizelge 2.11. Havlıcan bitkisinin kullanıldığı hastalıklar (Zhang ve ark. 2020) Bitki Tedavisinde kullanılan hastalıklar Havlıcan Diyabet Yüksek kan basıncı Deri hastalıkları Bağırsak kanseri Karın ağrısı Yaşlanma Romatizma ve eklem ağrıları Dizanteri Yağlarda GC-MS ile yapılan çalışmalarda 75 bileşik tanımlanmıştır ve ana bileşenler (Çizelge 2.12) aşağıda verilmiştir. Havlıcan köksapındaki uçucu yağlar, serum azot monoksit seviyesini ve mide mukozasının mikro sirkülasyonunu iyileştirebilir. Oksijen serbest radikallerini ortadan kaldırıp mukoza bariyerini güçlendirerek anti-gastrik ülser aktivitesi göstermiştir (Gao ve ark. 2016). 16 Çizelge 2.12. Havlıcan köksapında bulunan uçucu yağ içerikleri (Rana ve ark. 2010) Havlıcan kök sapındaki yağlar % İçerik 1,8-sineol 28,3 α-fenkil asetat 15,2 Karotol 8,9 α-terpineol 6,7 α-eudesmol 4,5 Ê-metilsinnamat 4 Kamfor 3,4 ß-pinen 3,1 Kamfen 2,3 Borneol 1,7 Eprinen-4-ol 1,2 α-pinen 1,2 Çizelge 2.13. Havlıcan bitkisinde bulunan flavonoid ve türleri (Ding ve ark. 2019) Flavonoidler türü Flavonoidler Flavonoid aglikon Galangin Galangin-3-metileter Kamferol Kamferol-4-metileter Kuersetin Kuersetin-3- metileter Apigenin Isorhamnetin Ramnositrin Pinocembrin 7–hidroksi-3,5-dimetoksiflavon Dihidrogalanginol Kateşin Flavonoid glikozit Galangin-3-β- D-glukozit Kamferol-4’ -metileter-3-β-d-glukozit Parfüm, ilaç, oda spreyi, losyon ve kozmetik ürünlerin hazırlanmasında da kullanılabilir. Flavonoidler, flavonoid aglikonlar ve glikozitler havlıcanın ana kimyasal yapılarından biridir. Havlıcan üzerindeki araştırmalarda bulunan izole edilmiş flavonoid ve türleri Çizelge 2.13’de verilmiştir. Flavonoidler, canlılarda bulunan serbest radikallerin üretimini inhibe ederek azalmasını sağlar ve serbest radikallerin zararlı etkilerini önlemesini sağlayan güçlü bir antioksidandırlar (Köse ve ark. 2015). Ayrıca galanginle ilgili diğer araştırmalarda tümör oluşumunu engellemesi ve antitümör proliferasyonu gibi çoklu antikanser etkileri olduğu gözlenmiştir (Tolomeo ve ark. 17 2008). Diarilheptanoidler, havlıcanın ana yapısında bulunan karakteristik bileşenlerden biridir. Havlıcan köksapı üzerinde yapılan çalışmalarda şimdiye kadar 48 diarilheptanoid bileşiği izole edilmiştir. Bunlardan 43 tanesi lineer diarilheptanoid, üç- siklik diarilheptanoid ve bir diarilheptanoid taşıyan flavonol kısmıdır (Ding ve ark. 2019). Havlıcanda bulunan diarilheptanoidler çeşitli biyoaktiveteler göstermiştir; B16 melanom hücrelerinin neden olduğu melanogenezi inhibisyonu, indüklenen apoptoz inhibisyonu, S-fazı inhibisyonu, insan lökotrienlerin biyoesentez inhibisyonu, proinflamatuar mediatör inhibisyonudur. Diarilheptanoidler bazı virüslere karşı (influenza virüsü, solunum sinsityal virüsü, çocuk felci virüsü, kızamık virüsü, herpes simpleks virüsü, tip 1 çocuk felci virüsü) antiviral biyoaktivite gösterdiği belirlenmiştir (Sawamura ve ark. 2010a, Sawamura ve ark. 2010b). Havlıcan rizomunun metanollü eksktraktlarından dokuz glikozit ve yedi fenilalanin bileşiği izole edilmiştir (Ly ve ark. 2002, Ly ve ark. 2003). Havlıcan rizomu üzerinde yapılan diğer çalışmalarda seskiterpenler, monoterpenler, organik asitler ve laktonların varlığı gözlenmiştir (Ding ve ark 2019). Havlıcan köksapında çinko, mangan, demir, magnezyum, kalsiyum ve temel eser miktarda elementlerin varlığı da tespit edilmiştir (Ding ve ark 2019). 2.8. Galangin Havlıcan ve ölmez çiçek bitkilerinin ana bileşeni olarak bulunmaktadır. Galangin (Şekil 2.9), flavonollerin kimyasal sınıfına aittir. Zayıf asidik bileşiktir, suda kolay çözünmez. Kuersetin, kamferol, morin ve myrisetin türü flavanoidler arasında en lipofilik bileşiktir (Imamura ve ark. 2000). Asya kültüründe uzun zamandır diyabet, ishal, öksürük, mide ve bağırsak hastalarında kullanılan halk ilacı olarak bilinmektedir (Zhang ve ark. 2013). Kimyasal yapısına bakıldığında antimutajenik, enzim düzenleyici ve antioksidan etkilere sahiptir (Heo ve ark. 2001). HO O OH OH O Şekil 2.9. Galangin yapısı 18 RO O Glukuronidasyon OR UGT1A1,1A9, 2B15 OR O R=Glukononat HO O R'O O Sülfatlaşma SULT1A1, 1A3 OH OR' OH O OR' O R'=-SO H Oksidasyon 3 Galangin CYP1A1, IA2, 2C9 OH HO O OH OH O Kamferol UGT: Üridin 5'-difosfo (UDP)-glukuroniltransferaz SULT: Sülfotransferaz CYP: Sitokrom P450 Şekil 2.10. Galanginin başlıca metabolik oluşumu (Mak ve ark. 2018) Galanginin metabolik yolları Şekil 2.10’da gösterilmiştir. Galangin metabolizması tercihen 3,5 ve 7 hidroksil grubunun sülfatlanması ve oksidasyonu ile glukuronidasyon yolu ile gerçekleşir. Glukuronidasyon, UDP-glukoroniltransferaz (UGT)1A9, UGT1AI ve UGT2B15 enzimleri tarafından katalize edilir. Sülfatasyon, tüm sülfotransferaz (SULT) izoformları tarafından ancak tercihen SULT1AI ve SULT1A3 izoformları tarafından katalize edilir. Oksidasyon, sitokrom P450 (CYP450) enzimi, özellikle CYP1A1, CYP1A2 ve CYP2C9 tarafından katalize edilir (Chen ve ark. 2015, Mak ve ark. 2018, Otake ve ark. 2002). Galangin metabolizmaya uğradığı için oral 19 biyoyararlanımda çok az miktarda serbest haldedir. Galangin, yapısal androstan reseptörünün (CAR) dolaylı aktivasyonu yoluyla CYP450 enzimlerini indükler (Carazo Fernández ve ark. 2015) (Şekil 2.10). Galangin ve oksitlenmiş metaboliti kamferol, CYP1A1 yapısını inhibe eder. Pasif difüzyon sırasında galangin, galangin sülfat ve kamferolden daha fazla absorpsiyona sahiptir (Barrington ve ark. 2009). Dünya çapında birçok araştırmacı galanginin potansiyel biyolojik aktiviteleri ve havlıcan bazı özellikleri (antikanser, antienflamatuar, antioksidan, antimikrobiyal, antiartrit, antiobezite, nöroprotektif, antihipertrofik, antivitiligo, anti-iskemik ve hepatoprotektif özellikler) üzerinde çalışmaları bulunmaktadır. Aynı zamanda galangin biyolojik aktivitelerini ve potansiyelini doğrulamak için fonksiyonel gıda maddesi olarak kullanılabilirliği de araştırma konuları olmuştur (Çizelge 2.14) . 20 Çizelge 2.14. Galanginin biyolojik aktieleriyle ilgili geleceğe yönelik çalışmalar (Mak ve ark. 2018) 21 2.9. Antitirosinaz İnhibisyonu Tirosinaz, melanin biyosentezinde kilit görev alan içeriğinde bakır içeren, deri ve saç rengini belirleyen enzimdir. Pigmentasyon, melanin hücrelerin gereğinden fazla veya az sentezlenmesinde kaynaklı cilt hastalıklarına neden olmaktadır. Melanin alt birimi olan feomelanin ve eumelanin karışımları saç, cilt ve gözlerin renk tonlarını belirler. Melanin sentezi, tirosinaz tarafından katalize edilen bir reaksiyonda amino asit tirozinin l-3,4- dihidroksifenilalanine hidroksilasyonu ile başlar. Melanin sentezine neden olan etkenler; ▪ Melanin sentezini gerçekleştiren melanositlerin miktarı ▪ Genetik faktör ▪ UV ışığı ve çevresel faktörler ▪ Melanojenik aktivite ▪ Melanin tipi ▪ Melanozomların büyüklüğü, sayısı ve dağılımı ▪ Deri pigmentasyonu Melanin hiperpigmentasyonu ile ilişkili deri hastalıklarının tedavisinde tirosinaz inhibisyonunun klinik olarak kullanımı söz konusudur. Ayrıca kozmetikte cilt rengini açma etkisi ile de önem arz etmektedir. Tirosinaz aktivitesini inhibe etmek için kojik asit gibi birçok sentetik inhibitör geliştirilmiş olmasına rağmen bunların uzun periyotta toksik etkilerinin bulunması, alternatif olarak doğal inhibitörlerin belirlenmesine yönelik çalışmaları hızlandırmıştır (Tocco ve ark. 2009). 22 O O O – HO – O – O Tirozinaz + O Tirozinaz + O + NH NH 3 NH3 3 O HO O H O HO 2 H O O 2 2 2 Tirozin L-Dopa Dopakinon O O HO O + – HO NH O + –HO NH2 O Dopakrom CO Siklodopa in vivo in vitro 2 Tryp2 kendiliğinden O OH HO – + O NH2 OH M HO NH DHICA E DHI O L O 2 2 A Tryp1 N Tirozinaz (DHICA oksidaz) İ 2H O 2H O 2 2 N O O O – + O NH NH2 O O Şekil 2.11. Melanin sentez reaksiyonu (Bronze-Uhle ve ark. 2016) 23 Tirosinaz, tirosinaz protein-1 (TRP-1) ve dopakrom tautomeraz olarak da bilinen tirosinaz ilgili protein-2 (TRP-2), melanogenezi düzenleyen üç enzimdir (Şekil 2.11). Melanogenezin ilk basamağı, L-tirozin ve/veya L-DOPA’nın dopakinona oksidasyonu ile başlamaktadır. İlk basamak aynı zamanda, reaksiyonun geri kalanı fizyolojik bir pH’ta kendiliğinden devam edebileceğinden, melanogenezin tek hız sınırlayıcı basamağıdır. Bu basamakta melanogenezin anahtar enzimi olan tirosinaz enzimi görev almaktadır. Dopakinon siklize olarak dopakromu oluşturmakta, oluşan dopakrom kendiliğinden dekarboksile olarak 5,6-dihidroksiindol (DHI), daha sonra TRP-2 varlığında DHI-2-karboksilik asit (DHICA) meydana getirmektedir. Son olarak oluşan DHI ve DHICA okside ve polimerize olarak eumelanini oluşturmaktadır. Bu süreçte DHICA'nın oksidasyonunu TRP-1 katalize etmektedir. Sistein veya glutatyon varlığında ise dopakinon, sisteinildopa veya glutatiyonildopaya dönüştürülmekte ve sonuçta kırmızı-sarı çözünür feomelanin pigmentleri elde edilmektedir. Melanogenez yolağında tirosinaz, TRP-1 ve TRP-2 olmak üzere üç enzim görev almakla birlikte kilit enzim tirosinazdır ve melanin sentezi için şarttır (Adak 2019). Beyazlatıcı kozmetik ürünler, güneş kremi ürünleri, bronzlaştırıcı ürünler dışında diğer bir tanesi melanin biyosentezinde farklı mekanizmalarla engelleyici etkisiyle cilt renginin açılmasını sağlayan beyazlatıcı kimyasallardan oluşturulmuş ticari amaçlı kullanılan preparatlardır (Cabanes ve ark. 1994). Beyazlatıcı kremlerin etkinliğin arttırılmasında özellikle formülasyon içerisine ilave, ß-hidroksiasitler (glikolik, laktik veya malik asitler) veya α-hidroksiasitler (salisilik asit) gibi peelingte kullanılan kimyasalları içerebilirler. Bu kimyasallar ciltteki ölü deri ve hücrelerini uzaklaştırarak ağartıcı etkinliğin uygulanabilirliğini kolaylaştırmaktadır (Ghadishah ve Gorchynski 2002). Güneş kremlerine ilave edilen bu kimyasallar güneş ışınların karartıcı etkisinden korunmak için ilave edilirler (Piamphongsant 1998). Cilt beyazlatıcı kremlerinde kullanılan etken maddelerin farklı olarak antioksidan, yumuşatma, kenetleme veya tamponlama gibi başka özelliklerde içerebilmektedirler. Beyazlatıcı kremlerde kullanılan en popüler bileşikler arbutin, askorbit asit, azelaik asit, hidrokinon (ve onun monometil, monoetil ve monobenzil eterleri) kojik asit, retinoik asit ve fitik asit şeklinde sayılabilir (Şekil 2.12). 24 Kojik asitin beyazlatıcı etkisi dışında oksidatif özelliğinden dolayı dipalmitik esteri, yani kojik dipalmitat aracılığıyla kozmetik formülasyonlara ilave edilmektedir. Kullanılan etken maddelerin türevleri ana bileşiğin çözünürlüğünü değiştirdiğinden ve yeni preparatlar formüle etmekte kullanılabilecekleri düşünülmektedir. Cilt ağartıcı olarak kullanılan civa preparatları zararlı etkilerinin ortaya çıkmasından sonra yarar- zarar dengesi tartışılır olmasından kullanımları yasaklanmıştır. HO OH OH O O HO HO O OH O HO OH OH Arbutin Askorbik asit O OH HO OH HO O Hidrokinon Kojik asit CH CH H C 3 3 O 3 CH O 3O OH HO OH CH3 Azelaik asit Retinoik asit Şekil 2.12. Kozmetikte kullanılan beyazlatıcı etken maddelerin bazıları 25 Cilt beyazlatma ürünleri için son olarak yayınlanmış geçici inceleme yazısına göre (FR, 1982), sadece FDA (gıda ve ilaç dairesi) tarafından izin verilmiş cildi beyazlatıcı OTC ürünlerinde (%1,5-2 oran aralığında) bir kimyasal olan hidrokinona özel olarak dikkat edilmelidir. Bu bileşiğin zararlı yan etkilerinden kaynaklı AB kozmetik yönergesi 24.adaptasyonunun (Komisyon Yönergesi 2000/6EC) yürürlüğe girişinden itibaren AB çerçevesinde beyazlatıcı aktif bileşiği olarak izin verilmez. Hidrokinon sadece özel şart ve koşullar altında olmak üzere yapay tırnak sistemlerinde ve saç boya maddesi olarak kullanımına izin verilmektedir. Fakat türevleri olan hidrokinon monoetil ve hidrokinon monobenzil kozmetik kullanımı yasaktır. Araştırmalara göre kanserojen özellik ve dermatolojik yan etkilere sebep olarak hidrokinonun kozmetik içerisinde kullanımı gösterilmiştir (Joseph ve ark. 1998). Cildin iltihaplanması bölgesel uygulanan retinoik asite bağlanmıştır (Nordqvist ve Merh 1977). Kojik asit (Nakagawa ve ark. 1995) ve azelaik asit kozmetik kullanımlarına bakıldığında alerjik özellikte olduğu saptanmıştır. Beyazlatıcı etken madde tayinlerinde analitik yöntemler kullanılmaktadır. Avrupa birliği kozmetiklerde kullanılan beyazlatıcı ajanların kontrolü sağlama açısından tek bir analitik yöntem kullanılmaktadır (Komisyon yönergesi 95/32/EC). Belirtilen bu yöntem Avrupa Komisyonu tarafından kitap halinde düzenletmiştir. Metod hidrokinon ve onun zararlı türevlerin tayinine odaklanmıştır. İnce tabaka kromatografisi ile kalitatif analizi yapılarak maddelerin belirlenmesi ve sıcaklık altında homojen su/metanol karışımı ile ekstrakte edilmiş numunenin UV/VIS cihazı ile dedeksiyonlu LC kullanarak madde miktarların tayinine dayanır. Şunu söylemek gerekir ki beyazlatıcı ajan tayinlerinde kullanılacak standart bir yöntem yoktur. Fakat genel olarak bakıldığında beyazlatıcı ajanların tayinleri Çizelge 2.15’de verilmiştir. 26 Çizelge 2.15. Beyazlatıcı ajanların tayinleri Kozmetik Örnek Hazırlama Hedeflenen Ajanlar Analitik Teknik Kaynak Türü Kremler Numune THF: 0,025 M fosfat tamponu (pH AP, MAP (Aynı şekilde DPV, karbon pasta elektrot kullanarak SPE+LC- Sottofattori ve ark. 1998 3,5) karışımıyla homojen süspansiyon elde farklı koruyucular da UV/VIS, mobil faz olarak MeCN: fosfat tamponu ile edilinceye kadar karıştırılır tayin edildi) C18 kolonu Kremler Kremler suda çözülür ve süzülür, sonra bir KA LC-UV/VIS, mobil faz olarak gradientli MeOH: pH 3,5 Shih ve Zen 1999 ve parçası pH’ı 10 olan tamponla karıştırılır. olan 0,025 M fosfat tamponu ile CN kolonu Losyonlar Losyonlar tamponla direk karıştırılır Kremler Krem örneği suda çözülür ve pH’ı 10 olan ARB DPV, ekran baskılı karbon elektrot kullanılarak Shih ve Zen 2000 amonyum tamponuyla seyreltilir Kremler Numune MeOH: su karışımı ile karıştırılır HQ, HQDM, HQMB, DPV, ekran baskılı karbon elektrot kullanılarak Desiderio ve ark. 2000 ve ısıtarak vortekslenir. Son olarak süzülür HQMP, HQMPh Kremler Numune suyla ekstrakte edilir ve süzülür KA, MAP LC-UV//VIS Mobil faz olarak MeCN: 0,05 M fosfat Shih 2001 ve tampon (pH 2,5) ile diol kolonu (Tanımlama amaçlı Losyonlar oalrak TLC kullanılır) Kremler Numune suyla karıştırılır ve 25 oC’da AA, ARB, MAP GC-MS Chang ve Chang 2003 sonikasyon yapılır. Sonra süzülür ve N2 ile oksijen uzaklaştırılır. Numune 0,05 M fosfat tamponu (pH 2,5) AG, ARB, HQ, KA, MAP FI-AMP, grafit elektrodu Huang ve ark. 2004 ile ekstrakte edilir Kremler Örnek suyla seyreltilir. Sonra karıştırılır. ARB LC-UV/VIS, Mobil faz olarak 1 mM TBAB içeren Lin ve ark. 2005 ve Diyaliz şişesine gönderilir ve online olarak MeOH: 0,01 M fosfat tampon ile C18 kolonu losyonlar enjekte edilir AA: Askorbik asit, AG: askorbil glukozit, AP: askorbil palmitat, ARB: arbutin, HQ: hidrokinon, HQDM: hidrokinondimetil eter, HQMB: hidrokinon monobenzil eter, HQMP: hidrokinonmonopropil eter, HQMPh: hidrokinon monofenil eter, KA: kojik asit, MAP: magnezyum askorbil fosfat, THF: tetrahidrofuran, MeOH: metanol, TBAB: tetrabutil amonyum bromür, MeCN: asetonitri 27 2.10. Yüzey Analiz teknikleri Optimizasyon, bir uygulama ya da deney prosesini en az maliyetle en iyi duruma getirmek için tercih edilen yöntemler ve uygulamalardır. Belirli kurallara göre uygulanıp istatistiksel hesaplamalar yapılır. Optimizasyon yöntemleri genel olarak yüzey analiz teknikleri (Response surface methodology) başlığı altında incelenir (Şahin ve ark. 2019). Literatürde pek çok deneysel parametrelerin verim değerleri üzerindeki etkisini incelemek için yüzey analiz teknikleri kullanılır. Merkezi kompozit dizayn (CCD) yöntemi de RSM içinde en çok tercih edilen yöntemdir. Aşağıdaki denklem (2.1), bir CCD'deki toplam deney sayısını (N) hesaplamak için kullanılabilir: N = 2k + 2k + x0 (2.1.) burada k değişken sayısıdır. CCD ile tahmin edilen yanıtları hesaplamak için tüm etkileşim terimlerini içeren ikinci dereceden polinom denklemi (2.2) kullanılır. 𝑦 = 𝑏0 + ∑ 4 𝑖=1 𝑏𝑖𝑥𝑖 + ∑ 4 𝑖=1 𝑏𝑖𝑖𝑥 2 𝑖 + ∑ 3 𝑖=1 ∑ 4 𝑗=𝑖+1 𝑏𝑖𝑗𝑥𝑖𝑥𝑗 (2.2.) burada y yanıt değişkenidir, b0 bir sabittir ve bi, bii ve bij sırasıyla doğrusal, ikinci dereceden ve değişkenler arası etkileşim katsayılarıdır. xi ve xj bağımsız değişkenlerdir (i≠j). Değişkenler belirlendikten sonra oluşturulan deneysel dizayn tablosuna göre deneyler yapılır. Deneylerin sonuçları Design Expert programı (7.0.0 versiyonu) kullanılarak istatistiksel olarak ANOVA analizi ile hesaplanır. 2.11. Chlorella vulgaris Mikroalgler içerdiği yağ asitleri, karbohidrat, pigment, vitaminler, mineral, antioksidanlar, steroller ve biyoaktif polifenoller içeren zengin bir kaynak sunan mikroskop yardımıyla görülebilen sularda yaşayan canlılardır (Yılmaz 2019). Algler metabolizma olarak otorofik veya heterotrofik bir yapıya sahip olabilir. Ototrofik gruplar büyümek için inorganik bileşenlere tuz, karbondioksit ve ışık enersine ihtiyaç duyar. Heterotrofik gruplar, fotosentetik olmamalarından dolayı mikroalgler harici bir organik bileşen kaynağına ihtiyaç duymaktadır. Kozmetikte kullanılan mikroalgler ekstrakt formunda formülasyonlara ilave edilir. Etken madde olarak kullanılan mikroalglerin seçimi önemlidir. Mikroalgler ciltteki kollajen üretimini arttırmasıyla cildin yenilenmesini destekler ve kırışıkların zamanla azalmasına yardımcı olan cilt bakım ürünlerinde kullanılabilir. Ayrıca erken yaşlanma karşıtı, yüz, cilt, saç bakım, 28 güneş koruycu, cilt sıkılaştırma ve çatlak kremlerinde kullanılabilmektedir (Metin ve Baygar 2018). Chlorella vulgaris’in göz çevresi kreminde, Spirulina platensis’in krem formülasyonlarında kullanılmaktadır (Koluman ve Selçuk 2016). Tek hücreli mikroalg olan Chlorella vulgaris’in içeriği Çizelge 2.15’de verilmiştir. Çizelge 2.16. Chlorella vulgaris içeriğinde bulunan bileşenler (Nasir ve ark. 2017) Chlorella vulgaris % içerik Protein 51 - 58 Karbohidrat 12 - 17 Yağ 14 - 22 Chlorella vulgaris’in yapısı çekirdek gibi ve küreye benzer. Kendini dış ortamlardan hücre duvarı sayesinde koruyabilmektedir. Chlorella vulgaris eşeysiz ve hızlı üreyebilen autospordur. Stresli koşullar altında büyüyebilir. Chlorella türlerinin kullanım amaçlarından bazıları; aktif immünostimülatör, serbest radikal süpürücü, kan lipidlerini azaltımı, mide ülserlerinin, yaraların ve kabızlığın önlenmesi ve gıda katkı maddesi olarak kullanılır (Hamed 2016). Chlorella vulgaris fazla miktarlarda klorofil ve karotenoid bileşikleri bulunur. Karotenoidler insan veya hayvanlarda sentezlenmeyen sadece mikroorganizma ve meyvelerde sentezlenen doğal pigmentlerdir. Lipofilik ve isoprenoit moleküller, deniz canlıları, bitkiler, meyve ve sebze renklerinin belirlenmesinde sorumlu bileşiklerdir (Ben-Amotz ve Fishler 1998, Gouveia ve Empis 2003). Kloroplast, bitkilerdeki kromoplastlar ve diğer fotosentetik organizmalarda da bulunabilmektedir. Dünya üzerinde bilinen 700’ün üzerinde karotenoid vardır. Çift bağlarının sayısına göre cis-trans izomerlerini içerir. Karotenoid yapısındaki konjuge çift bağlar Uv ışınları, oksijen, sıcaklıkla parçalanabilir ve oksidasyona uğrarlar (Nasir ve ark. 2017). Karotenoidler, karotenler ve ksantofiller olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Karotenoidlerin kimyasal yapıları şekil 2.12’de verilmiştir. 29 H3C OH CH CH3 3 H3C CH3 H3C CHCH3 CH 3 3 HO CH3 Lutein H3C CH CH CH H C3 3 3 3 CH3 CH CH CH3 3 3 CH3 β-karoten H3C CH CH CH3 3 3 H3C CH CH33 CH3 CH3 CH3 α-karoten H3C OH CH CH3 3 H3C CH3 H C CH CH 33 CH 3 3 HO CH3 Zeaksantin H3C CH3 CH3 CH CH3 3 CH3 CH3 CH3 Likopen H3C CH3 Şekil 2.13. Karotenoidlerin kimyasal yapıları 30 H3C OH CH CH CH3 3 H3 3 C CH3 CH CH CH3 3 3 CH3 β-kriptoksantin CH CH3 3 O H3C CH3 CH3 OH CH3 CH3 H3C HO CH3 H3C Kapsantin O H3C CH CH3 3 H3C CH3 H C CH CH 33 CH 3 3 CH3 O Kantaksantin H3C OH CH CH3 3 H3C CH3 O O H3C CHCH3 CH 3 3 HO CH3 Violaksantin HO CH H C CH3 3 3 H3C CH3 O H C CH CH H C OH3 3 CH3 3 3 Antreaksantin Şekil 2.13. Karotenoidlerin kimyasal yapıları (devam) 31 CH H C O 33 CH3 CH3 CH CH O3 3 O O OH H3C OH H H3C CH3 CH3 CH3 Fukosantin Şekil 2.13. Karotenoidlerin kimyasal yapıları (devam) Karotenoidler, insan sağlığına etkileri pek çok faktöre (dağılımi absorpsiyon, ulaşım ve depolama vb.) bağlıdır (Yeum ve Russell 2002). Renkli meyve ve sebzeler başlıca karotenoid bileşikler içerirler. β-karoten ve α-karoten sarı-turuncu sebze ve meyvelerde, α-kriptoksanthin turuncu meyvelerde, lutein koyu yeşil sebzelerde ve likopen domates ve domates ürünlerinde karotenoid açısından zengindir (Rao ve Rao 2007). Karotenoidlerin son yıllar üzerinde yapılan çalışmalar insan sağlığını tehdit eden hastalıkları önlemek amacıyla yapılmaktadır. Yapılan literatür çalışmasında Chlorella vulgaris yapısında β-karoten, α-karoten ve lutein karotenoidleri belirlenmiştir (Nasir ve ark. 2017). Ayrıca yapılan çalışmalarda Chlorella vulgaris ekstraktının kollajen sentezine katkı sağladığı için, cilt dokusuna destek ve kırışıkların azalmasına yardımcı olması ile kozmetikte cilt bakım ürünlerinde kullanılabileceği anlaşılmıştır (Metin ve Baygar 2018, Wang ve ark. 2015). Başka bir çalışmada hidrojel bazlı Chlorella vulgaris, cilt yaraların hızlı iyileştirilmesi, iltihap önleyici, akut ve kronik yaraların iyileşmesinde potansiyel kozmetik ürün olabileceği belirtilmiştir (de Melo ve ark. 2019) 32 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Tez Kapsamında Çalışılan Bitki Materyali Tez kapsamında kullanılan ve 2020 yılında Doğu Hindistan’dan hasat edilen havlıcan bitkisi, 2021 yılında Türkiye/Bursa/Nilüfer ilçesinde bulunan bir aktardan toz formunda temin edildi. 3.1.2. Tez Kapsamında Kullanılan Cihazlar Aşağıda bulunan Çizelge 3.1’de cihazların kullanım özellikleri ve kullanım amaçları verilmiştir. Çizelge 3.1. Cihaz özellikleri ve kullanım amaçları Kullanılan Model Kullanım Amacı Cihazlar HPLC 1200 Series, Havlıcanda bulunan fenolik maddelerin Agilent kantitatif tayininde kullanılmıştır. Technologies UV-VIS Cary 50 Conc, Spektroskopik analizlerde kullanılmıştır. spektrofotometresi Varian Vorteks VM-10, Wisd Analizlerde kullanılacak kimyasalların karıştırılmasında kullanılmıştır. Döner Re100 Analizlerde organik fazların buharlaştırıcı uçurulmasında kullanılmıştır. Ultrasonik 2,8 L, United Analizlerde kullanılacak kimyasalların, karıştırıcı çözeltilerin hazırlanmasında 8’li manyetik MS-MP8, Wisd kullanılmıştır. karıştırıcı Hassas analitik MS105DU, Mettler Analizlerde kullanılacak kimyasalların terazi (± 0,00001 g) tartımında kullanılmıştır. pH metre HI 221, Hanna Antioksidan kapasite tayininde pH kontrolünde kullanılmıştır. Santrifüj Z206 A, Hermle Havlıcan ekstraksiyon işlemlerinde kullanılmıştır. Distile su cihazı Option Q DV25, Analizler için gerekli saf suyu temin ElgaPurelab etmek için kullanılmıştır. FT-IR Thermoscientific, Hidrojellerin yapısal analizleri için Nicolet 6700 kullanılmıştır. SEM Carl Zeiss Evo 40, Hidrojellerin yapısal analizleri için Germany kullanılmıştır. 33 3.1.3. Tez Kapsamında Kullanılan Kimyasallar Analizlerde kullanılan kimyasallar Çizelge 3.2’de belirtilmiştir. Çizelge 3.2. Analizlerde kullanılan kimyasallar Kullanılan Kimyasallar Firma Ürün Kodu β-Siklodekstrin Sigma-Aldrich 779105 1,5-difenilkarbazit Sigma-Aldrich 259225 ABTS Sigma-Aldrich A1888 Alginik asit Sigma-Aldrich 71238 Aseton Merck 100013 Asetonitril Sigma-Aldrich 34851 Bakır (II) sülfat pentahidrat Sigma-Aldrich 209198 Di-Potasyum hidrojen fosfat Merck A964801 Etanol Merck 100983 Folin-Ciocalteau reaktifi Sigma-Aldrich F9252 Formik asit Merck 100264 Fosforik asit Merck 100563 Galangin Extrasynthese 1114S Gallik asit Sigma-Aldrich 27645 Gliserin Kale kimya - Hidroklorik asit Merck 100314 Oktildodekanol Kalekimya - Kalsiyum klorür dihidrat Merck 102382 Kamferol Sigma-Aldrich K0133 Kojik asit Sigma-Aldrich K3125 Metanol Merck 106007 L-DOPA Sigma-Aldrich D9628 p-kumarik asit Sigma-Aldrich C9008 Potasyum dihidrojen fosfat Fisher scientific P/4760/60 Potasyum dikromat Sigma-Aldrich 207802 Potasyum klorür Sigma-Aldrich 746436 Potasyum peroksidisülfat Merck 105091 Sephadex LH-20 Sigma-Aldrich LH20100 34 Çizelge 3.2. Analizlerde kullanılan kimyasallar (devam) Tirosinaz Sigma-Aldrich T3824 Kıvamlaştırıcı Kalekimya - (Hidroksietil akrilat, Sodyum akriloil dimetil, Taurat kopolimer, Isohekzadekan, Polisorbat 60) Sitrik asit monohidrat Kimetsan KIM-SAM/01CP Sodyum dihidrojen fosfat Merck 141677 Sodyum hidroksit Sigma-Aldrich 795429 Sodyum karbonat Sigma-Aldrich 791768 Sodyum potasyum tartarat tetrahidrat Sigma-Aldrich 217255 Kondisyoner Kale kimya - (Dimetikon) Koruyucu Kale kimya - (Etilheksilgliserin, Fenoksietanol) Tri-sodyum sitratdihidrat Merck 106448 Kuersetin Sigma-Aldrich Q4951 pH 7,00 fosfat tamponu VWR Chemical 32096291 3.1.4. Tez Kapsamında Kullanılan Sarf Malzemeler Analizde kullanılan sarf malzemeler Çizelge 3.3’de belirtilmiştir. Çizelge 3.3. Analizlerde kullanılan sarf malzemeler Malzemeler Model Katalog Kodu Mikropipet (10 – 100 μL) Eppendorf Research Z683809 Mikropipet (100 – 1000 μL) Eppendorf Research Z683825 Mikropipet (500 – 5000 μL) Eppendorf Research Z683833 3.1.5. Tez Kapsamında Kullanılan Çözeltiler Toplam fenolik madde tayininde kullanılan çözeltiler ▪Lowry A çözeltisi: 0,4 g NaOH katısı (0,1 M) %2’lik Na2CO3 çözeltisi içerisinde çözülerek hazırlanır (100 mL). ▪ Lowry B çözeltisi: 0,5 g CuSO4, %1’lik NaKCuH4O6 çözeltisi içerisinde çözülerek hazırlanır (100 mL). 35 ▪ Lowry C çözeltisi: 50:1 (v:v) oranında Lowry A ve Lowry B çözeltileri karıştırılır. ▪ Folin-Ciocalteu çözeltisi: Folin-Ciocalteu çözeltisi 1:3(v:v) oranında saf su ile seyreltilir. ▪ Gallik asit çözeltisi: 0,1 g gallik asit az miktar metanolde çözülür ve balon jojede hacmi 100 mL’ye tamamlanır. Antioksidan kapasite tayininde kullanılan çözeltiler ABTS metodu ▪ABTS çözeltisi: 2,45 mM K2S2O8 katısı 7 mM ABTS çözeltisi içerisinde çözülür (25 mL). 16 saat karanlık ortamda bekletilir. Analizler öncesi 1:10 (v:v) oranında saf su ile seyreltilir. ▪Troloks çözeltisi: 0,1 g Troloks katısı az miktar metanolde çözülür ve balon jojede hacmi 100 mL’ye tamamlanır. CHROMAC metodu ▪ 0,2 M KCl çözeltisinin hazırlanışı: Toplam hacim 100 mL(balon jojede) olacak şekilde bir miktar saf suda 1,49 g KCl çözülür ve hacmi 100 mL’ye tamamlanır. ▪ 0,2 M HCl çözeltisinin hazırlanışı: Derişik HCl asitten (12,06 M) 1,66 mL alınarak toplam hacim 100 mL (balon jojede) olacak şekilde saf su ile seyreltilir. ▪ pH 1,2 tamponun hazırlanışı: Toplam hacim 100 mL (balon jojede) olacak şekilde 0,2 M KCl (25 mL) ve 0,2 M HCl (42,5 mL) karıştırılır saf su ile tamamlanır. ▪ pH 2,8 tamponun hazırlanışı: Toplam hacim 1 L (balon jojede) olacak şekilde 6,24 g NaH2PO4.2H2O 0,68 mL %85’lik (w/w) H3PO4 bir miktar saf suda çözülür 1 L’ye tamamlanır. ▪ K2Cr2O7 çözeltisinin hazırlanışı: 0,5 mg K2Cr2O7 katısı bir miktar saf suda çözülür 100 mL’ye (balon jojede) saf su ile tamamlanır. ▪ 100 mg/L 1,5-difenilkarbazit çözeltisinin hazırlanışı: 0,1 g 1,5-difenilkarbazit katısı 70 mL aseton, 30 mLpH 2,8 tampon çözeltisinde çözülür. 100 mg/L 1,5-difenilkarbazit 8,25 mg/L’ye pH 2,8 tampon çözeltisiyle seyreltilir. ▪ Troloks çözeltisinin hazırlanışı: 0,1 g troloks katısı bir miktar metanolde çözülür son hacim olan 100 mL’ye (balon jojede) tamamlanır. 36 Anti-tirosinaz inhibisyonu tayininde kullanılan çözeltiler ▪1 M 100 mL KH2PO4 çözeltisi; 17,4183g katı tartılarak bir miktar saf suda çözünmesi sağlanır. Çözünme tamamlanınca 100 mL’lik balon joje içerisinde saf su ile hacim tamamlaması gerçekleştirilir. ▪ 1 M 100 mL K2HPO4 çözeltisi; 13,6092 g katı tartılarak bir miktar saf suda çözünmesi sağlanır. Çözünme tamamlanınca 100 mL’lik balon joje içerisinde saf su ile hacim tamamlaması gerçekleştirilir. ▪ 50 mmol/L pH 6,80 tamponunun hazırlanışı; Hazırlanan 1 M KH2PO4 ve K2HPO4 çözeltilerinden sırasıyla 26,5 mL ve 23,5 mL 1000 mL’lik balon jojeye alınır hacim saf su ile tamamlanır. ▪ 0,9 mg/mL L-DOPA çözeltisinin hazırlanışı; L-DOPA katısından 45 mg tartılıp beher içerisinde 6,80 tampon çözelti ile çözülür ve 50 mL’lik balon joje’de hacim fosfat tamponuyla tamamlanır. ▪ 1000 µM kojik asit çözeltisinin hazırlanışı; 14,22 mg kojik asit katısından tartılır bir miktar pH 6,80 fosfat tamponu ile çözülüp 100 mL’lik balon joje’de son hacim tamamlanır. 100 µL alınarak 9,9 mL pH 6,8 fosfat tamponu ile hacim tamamlaması yapılarak 100 µM Kojik Asit çözeltisi hazırlandı. ▪ 500 U/mg 20 mL Tirosinaz çözeltisinin hazırlanışı; 10 mg Tyrosinase from mushroom tartılarak bir miktar pH 6,8 fosfat tamponunda çözülür, 20 mL’lik balon jojede son hacim fosfat tamponu ile tamamlanır Kromatografik analizlerde kullanılan çözeltiler ▪ %1’lik formik asit çözeltisinin hazırlanışı: 10 mL derişik formik asit çözeltisi bir miktar saf su içerisinde çözülür son hacim saf su ile 1 L’ye balon jojede tamamlanır. ▪ Havlıcan örneklerindeki fenolik bileşiklerin kantitatif tayini için standart fenolik bileşikler metanol ile çözülerek 1 ile 20 mg/L derişimleri arasında çözeltiler hazırlanmıştır. Bu çözeltiler yardımıyla kalibrasyon grafikleri hazırlanmıştır. Kemometrik çalışmalarda kullanılan çözeltiler ▪ pH 5,5 sitrat tamponun hazırlanışı: 2,8257g sitrik asit monohidrat(C6H8O7.H2O) katısı bir miktar saf suda çözülür üzerine 0,7128g sodyum sitratdihidrat(C6H5Na3O7.2H2O) katısı ilave edilir. Hacim 250 mL’ye balon jojede saf su ile tamamlanır. 37 ▪%2 (w/v) CaCl2 çözeltisinin hazırlanışı: 1 g CaCl2.2H2O katısı bir miktar su içerisinde çözülür balon jojeye aktarılır, son hacim 50 mL’ye saf su ile tamamlanır. ▪ %1,5 (w/v) sodyum aljinat çözeltisinin hazırlanışı: Aljinik asit sodyum tuzundan 0,3g tartılır bir miktar suda çözülür balon jojeye aktarılır, son hacim 20 mL’ye saf su ile tamamlanır. ▪ β-siklodekstrin-havlıcan çözeltisi: 2,0630 g β-siklodekstrin tartıldı. Üzerine 48 mL havlıcan etanol ekstraktı (40 g havlıcan, 200 mL %80 EtOH (%v/v)) ve 55 mL havlıcan metanol ekstraktı (40 g havlıcan, 200 mL %80 MeOH (%v/v)) eklendi. Ektraksiyon hazırlanışı Şekil 3.1’de ayrıntılı olarak verilmiştir. 3.2. Yöntem Tez kapsamında yapılan çalışmaları altı ana başlık altında inceleyeceğiz. Bunlar; ▪ Örnek hazırlama işlemleri ▪ Spektroskopik yöntemler ▪ Kromatografik yöntemler ▪ Saflaştırma çalışmaları ▪ Kemometrik çalışmalar ▪ Anti-tirosinaz enzim aktiviteleri 3.2.1. Örnek Hazırlama İşlemleri Toz formunda temin edilen havlıcan bitkisi laboratuvarda oda sıcaklığında kapalı opak bir kapta muhafaza edilmiştir. Havlıcan bitkisinin ekstraksiyon yöntemi Şekil 3.1’ de gösterilmiştir. 20 g havlıcan bitkisi tartılır. Üzerine organik çözücü ilave edilir. Karıştırıcıda 4 saat boyunca ağzı kapalı olacak şekilde 10˚C’de ekstrakte edilir. Süzgeç kağı dı ile süzülür. Şekil 3.1. Havlıcan bitkisinin ekstraksiyon yöntemi Ekstraksiyon işlemlerinde organik çözücü olarak 100 mL %50 ve %80 etil alkol ve metanol olacak şekilde ayrı ayrı 4 farklı ekstrakt hazırlanır. 38 3.2.2. Spektroskopik Yöntemler Folin-Ciocalteu yöntemiyle toplam fenolik madde tayini Elektron transferi metoduna dayanan Folin-Ciocalteu yöntemiyle ekstraktlarda bulunan toplam fenolik madde miktarı tayini yapılmıştır (Güneş ve ark. 2016). Tüplere 100 μL havlıcan ekstraktı alınır, üzerine 1900 μL saf su, 2500 μL Lowry C çözeltisi ve 250 μL seyreltilmiş Folin-Ciocalteu çözeltisinden ilave edilir. Karıştırıldıktan sonra 30 dakika karanlıkta bekletilen örneklerin 750 nm’de UV-VIS spektrofotometresi ile absorbans ölçümleri yapılır. Kalibrasyon grafiği için gallik asit çözeltisi standart olarak kullanılmıştır. Belirli aralıklarla artan gallik asit çözeltileri hazırlanıp en küçük kareler yöntemi ile kalibrasyon grafiği çizilmiştir (Çizelge 3.4). Toplam fenolik madde miktarları mg gallik asit eşdeğeri (GAE)/g örnek olarak hesaplanmıştır. Çizelge 3.4. Folin-Ciocalteu kalibrasyon verileri Yöntem Derişim aralığı Doğru Denklemi Regresyon (mg/L) katsayısı (R2) Folin-Ciocalteu 1-50 y = 0,0180x - 0,0390 0,9950 ABTS yöntemiyle antioksidan kapasite tayini Havlıcandan elde edilen ekstraktların antioksidan kapasite tayini ABTS yöntemi ile yapılmıştır (Şahin ve ark. 2012, Re ve ark. 1999). 100 μL havlıcan ekstraktı tüpe alınır, 3900 μL etanol ilave edilir, karıştırılır. Üzerine 1 mL seyreltilmiş ABTS çözeltisi ilave edilir, karıştırılıp 6 dakika sonunda 734 nm’de UV-VIS spektrofotometresi ile absorbans ölçümleri yapılır (Aörnek). Kör çözelti olarak 4 mL etanol ve 1 mL ABTS ilave edilerek 6 dakika sonra absorbans ölçümü yapılarak Akör değeri kaydedilir. Absorbans değerleri kulanılarak %inhibisyon değerleri belirlenmiştir (Eşitlik 3.1.) 𝐴 −𝐴 % 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑦𝑜𝑛 = 𝑘ö𝑟 ö𝑟𝑛𝑒𝑘 𝑥 100 (3.1.) 𝐴𝑘ö𝑟 Kalibrasyon grafiği için standart olarak troloks çözeltisi kullanılmıştır. Belirli miktarlarla artan troloks çözeltileri hazırlanıp en küçük kareler yöntemiyle kalibrasyon grafiği belirlenmiştir (Çizelge 3.5). Kalibrasyon grafiği kullanılarak havlıcan ekstraktlarının antioksidan kapasite değerleri mg troloks eşdeğeri (TE)/g örnek olarak hesaplanmıştır. 39 Çizelge 3.5. ABTS kalibrasyon verileri Yöntem Derişim aralığı Doğru Denklemi Regresyon (mg/L) katsayısı (R2) ABTS 0,1-8 y = 10,2800x + 8,6750 0,9990 CHROMAC yöntemiyle antioksidan kapasite tayini Havlıcan ekstraktlarının antioksidan kapasite miktarları CHROMAC yöntemi ile de yapılmıştır (Karkar ve ark. 2020, Nasir ve ark. 2017). 100 μL havlıcan ekstraktından alınır üzerine 400 μL saf su, 3500 μL pH 2,8 fosfat tamponu, 500 μL potasyum dikromat çözeltisi eklenir ve karıştırılır. En son 500 μL 1,5-difenil karbazit eklenip karıştırılır, karanlık ortamda 50 dakika beklenir. Daha sonra 540 nm’de UV-VIS spektrofotometresi ile absorbans ölçümleri yapılır (Aörnek). Standart olarak troloks çözeltisi kullanılmıştır. Belirli aralıklarla artan troloks çözeltileri hazırlanıp en küçük kareler yöntemi ile kalibrasyon grafiği çizilmiştir (Çizelge 3.6). Çizelge 3.6. CHROMAC kalibrasyon verileri Yöntem Derişim aralığı Doğru Denklemi Regresyon (mg/L) katsayısı (R2) CHROMAC 0,1-50 y = 0,0040x + 0,3460 0,9940 Kör için pH 1,2 tamponu kullanılmıştır. 500 μL saf su üzerine, 3500 μL pH 1,2 tamponu, 500 μL potasyum dikromat çözeltisi ve 500 μL 1,5 difenilkarbazit çözeltileri eklenir karıştırılır ve 50 dakika karanlıkta bekletilip 540 nm’de UV-VIS spektrofotometresi ile absorbans ölçümleri yapılır (Akör). Eşitlik 3.2’ye göre örneklerin absorbansı hesaplanır. A = Akör − Aörnek (3.2.) 40 3.2.3. Kromatografik Yöntemler HPLC-DAD cihazı ile fenolik maddelerin kantitatif tayini Havlıcan içerisinde bulunan fenolik bileşiklerin tayini için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılmıştır. Dedektör olarak foto diyot serili dedektör (DAD) seçilmiştir. %1 (v/v) formik asit ve asetonitril çözeltileri sistemin hareketli fazını oluşturmaktadır. C18 kolonu (XBridge C18 3,5 µm; 4,6x250 mm) 0,5 mL/dk akış hızı 10 µL enjeksiyon hacmi ile analizler gerçekleştirilmiştir. Fenolik bileşiklerin HPLC tayinlerinde galangin, kamferol ve kuersetin için 360 nm, p-kumarik asit içinde 320 nm’de çalışılmıştır. HPLC çalışma programı Çizelge 3.7’de verilmiştir. Çizelge 3.7. HPLC çalışma programı Kullanılan hareketli fazlar (%) Zaman (dk) %1’lik formik asit Asetonitril 0 90 10 10 87 13 20 59 41 25 30 70 35 90 10 36 90 10 HPLC doğru denklemi, standart fenolik maddelerin artan konsantrasyonuna karşılık alınan pik alanları kullanılarak hesaplanmıştır. Çalışılan örneklerin pik alanı kalibrasyon denkleminde yerine konularak sonuçlar mg/g olarak hesaplanmıştır. 3.2.4. HPLC-DAD cihazı ile karotenoidlerin kantitatif analizi Chlorella vulgaris içerisinde bulunan karotenoid bileşiklerin tayini için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılmıştır. Dedektör olarak foto diyot serili dedektör (DAD) seçilmiştir. %95 metanol-%5 H2O (H2O: %0,05 trimetilamin içermektedir) ve tert-bütil metil eter çözücüleri ile gradient programlı hareketli faz sistemi kullanılmıştır. YMC Carotenoid C30 (250x4.6 mm, 5μm, YMC Co., Ltd) kolonu, 1,0 mL/dk akış hızı ve 20 μL enjeksiyon hacmi ile analizler gerçekleştirilmiştir. Karotenoidlerin HPLC tayini için 450 nm’de çalışılmıştır. HPLC çalışma programı Çizelge 3.8’de verilmiştir. 41 Çizelge 3.8. HPLC çalışma programı Kullanılan hareketli fazlar (%) Zaman (dk) %95 metanol ter-bütil metil eter 0 95 5 15 80 20 20 70 30 30 60 40 40 25 75 45 95 5 HPLC doğru denklemi, standart karotenoidlerin artan konsantrasyonuna karşılık alınan pik alanları kullanılarak hesaplanmıştır. Çalışılan örneklerin pik alanı kalibrasyon denkleminde yerine konularak sonuçlar mg/g olarak hesaplanmıştır. . 3.2.5. Saflaştırma Çalışmaları Hazırlanan %80 etanol ve %80 metanol havlıcan ekstraktlarında bulunan fenolik maddeler Sephadex LH-20 kolon kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Saflaştırma yöntemi Şekil 3.2’de özetlenmiştir. %80 organik (v/v) çözücü havlıcan ekstraktından 10 mL al ınır kolondan geçirilir. Daha sonra kolona 100 mL organik çözücü eklenir. Tüplere 3 mL kolondan elue olan fraksiyonlar toplanır. Şekil 3.2. Kolon metodu ile fenolik maddelerin saflaştırılması (etanol ve metanol) Elde edilen fraksiyonların (3 mL/tüp) 320 ve 360nm’de absorbans ölçümleri UV-VIS spektrofotometresi ile yapıldı. Sonra tüp numaralarına karşı absorbans değerleri her iki dalga boyu için ayrı ayrı grafiğe geçirildi. Daha sonra fraksiyonlar birleştirilerek saflaştırılan fenolik madde gruplarının ayrılması sağlanmıştır. Birleştirilen fraksiyonların toplam fenol ve antioksidan kapasite tayinleri yapılmıştır. Bu yöntemler bölüm 3.2.2’de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 42 Havlıcanlı-krem hazırlanışı Kolondan toplanıp birleştirilen fraksiyonlarda bulunan metanol (50˚C) döner buharlaştırıcı ile uzaklaştırıldıktan sonra elde kalan kalıntı alınıp tartıldı. Saflaştırılan fenolik madde kalıntısı krem hazırlanışında kullanıldı (Şekil 3.3). Behere 182,9 g saf su alınır. Kıvamlaştırıcıdan 5,60 g saf suyun üz erine yavaş yavaş ilave edilirken 1500 devirde 15 dk boyunca karıştırıcı ile karıştırılıp kıvam alması sağlanır. Kıvam aldıktan sonra sırasıyla 3,50 g gliserin; 5,00 g oktildodekanol; 1,5 g kondisyoner; 1,5 g koruyucu ilave edilir. Böylece toplamda 200 g krem hazırlan mış olur Hazırlanan kremden tüpe 10,5765 g tartılıp üzerine %80 etanollü ekstraktın kolon kromatografisinden saflaştırılmış havlıcan katısından 0,0503 g ilave edilir. Vortex ile 5 dakika boyunca karıştırılır. +4oC’de buzdolabında saklanır. Şekil 3.3. Havlıcanlı yüz kreminin hazırlanışı Buzdolabından alınan krem üzerine 10 mL etanol eklenip, sıcak su banyosunda 15 dk bekletilir. Hazırlanan ürün 3000 rpm’de 15 dk boyunca santrifüjlenir. Mikropipet ile kremin üst kısmındaki sıvı fazdan 100 µL tüpe alınır 1:10 (v:v) etanol ile seyreltilir. Toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite ölçümleri seyreltilmiş numuneden çalışılır. Şekil 3.4. Toplam fenol ve antioksidan kapasite ölçümleri için krem örneklerinin hazırlanışı Ayrıca hazırlanan krem örneğinin toplam fenol ve antioksidan kapasite tayinleri yapılmıştır. Bu yöntemler Bölüm 3.2.2’de ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Toplam fenol ve antioksidan kapasite ölçümleri için hazırlanan örnekler Şekil 3.4’de anlatılmıştır. 43 Chlorella vulgaris ekstraksiyonu Tez kapsamında hazırlanacak kremlerde mikroalg ekstraktıda kullanılacaktır. Bu amaçla Chlorella vulgaris’in ekstraksiyon aşamaları Şekil 3.5’te anlatılmıştır. Chlorella vulgaris katısından 0,3014 g behere tartılır üzerine 20 mL etanol çözücüsü ilave edilip beherin ağzı parafinle kapatılır İki saat boyunca magnet yardımıyla oda sıcaklığında manyetik karıştırıcıda karıştırılır Karıştırma işlemi sonunda süzülür 10 mL etanol ile yıkama yapılır Elde edilen Chlorella vulgaris çözeltisi (30 mL) cam balona alınıp döner buharlaştırıcıda 40 oC’ta devir 5’te sıvı kısım uçurulur katı kısım elde edilmiştir Şekil 3.5. Chlorella vulgaris ekstraksiyon aşamaları Chlorella vulgaris içeren kremin hazırlanışı Chlorella vulgaris içeren kremin hazırlanışı Şekil 3.6’da anlatılmıştır Şekil 3.3’te anlatıldığı gibi hazırlanan 200 g kremden 3,7351 g krem tartılır Şekil 3.6’te elde edilen Chlorella vulgaris katısından 0,0145 g, krem (3,7351 g) üzerine tartılır ultrasonik banyoda çözülmüştür Hazırlanan krem +4 oC buzdolabında saklanmıştır Şekil 3.6. Chlorella vulgaris ekstraktlı krem Şekil 3.4’te belirtildiği gibi örneklerde toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite ölçümleri seyreltilmiş numuneden çalışılır. 44 3.2.6. Kemometrik Çalışmalar Kemometrik yöntemlerde kullanılacak ektsrakt kalıntısı için havlıcan ekstraktı β- siklodekstrin ile enkapsule edildi. Havlıcan ekstraktının enkapsülasyon işlemi Şekil 3.7’de anlatılmıştır. β-siklodekstrin-havlıcan çözeltisi Bölüm 3.1.5’te anlatıldığı gibi hazırlanmıştır. Magnetik karıştırıcıda 50 oC sıcaklığında çözücüsü tamamen uçuncaya kadar karıştırıldı. karıştırılır. Şekil 3.7. Havlıcan ekstraktının enkapsülasyonu Galangin-aljinat hidrojellerinin hazırlanması için kemometrik yöntemler kullanılmıştır. Bu amaçla kullanılan seviye değerleri ve deney bilgileri Çizelge 3.9.-3.10’da verilmiştir. Çizelge 3.9. Merkezi kompozit dizayn için faktörler ve kodlanmış seviye değerleri Faktör Kodlanmış seviyeler -2 -1 0 1 2 Na-Al (%w/v) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 CaCl2 (%w/v) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Zaman (dk) 10 20 30 40 50 Ekstrakt (%w/v) 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 Çizelge 3.10. Gerçek seviye değerleri için merkezi kompozit dizayn tablosu Deney x1 x2 x3 x4 Na-Al (%w/v) CaCl2 (%w/v) Zaman (dk) Ekstrakt (%w/v) 1 1 1,5 20 0,3 2 2 1,5 20 0,3 3 1 2,5 20 0,3 4 2 2,5 20 0,3 5 1 1,5 40 0,3 6 2 1,5 40 0,3 7 1 2,5 40 0,3 45 Çizelge 3.10. Gerçek seviye değerleri için merkezi kompozit dizayn tablosu (devam) 8 2 2,5 40 0,3 9 1 1,5 20 0,7 10 2 1,5 20 0,7 11 1 2,5 20 0,7 12 2 2,5 20 0,7 13 1 1,5 40 0,7 14 2 1,5 40 0,7 15 1 2,5 40 0,7 16 2 2,5 40 0,7 17 0,5 2 30 0,5 18 2,5 2 30 0,5 19 1,5 1 30 0,5 20 1,5 3 30 0,5 21 1,5 2 10 0,5 22 1,5 2 50 0,5 23 1,5 2 30 0,1 24 1,5 2 30 0,9 25 1,5 2 30 0,5 26 1,5 2 30 0,5 27 1,5 2 30 0,5 28 1,5 2 30 0,5 29 1,5 2 30 0,5 30 1,5 2 30 0,5 Hidrojel Oluşumu Çizelge 3.9’da belirtilen deneysel koşullara göre hidrojeller hazırlanır. 50 mL CaCl2 çözeltisi 125 rpm’de mag net ile karıştırılırken üzerine 2 mL’lik enjektör (0,7x32 mm, 22G) ile Na-Al çözeltisi damla damla ilave edilir. Damlatma işlemi bittiğinde 125 rpm hızında yaklaşık 30 dk daha karıştırılır. Adi süzgeç kağıdında süzülür, hidrojeller 20 mL saf su ile yıkanır. Süzülen hidrojeller kurutulmaya bırakılır. Şekil 3.8. Hidrojellerin elde edilişi 46 Kemometrik yöntemle oluşturulun hidrojellerin yapılışı Şekil 3.8’de anlatılmıştır. Hidrojellerden galangin salınım çalışması Kemometrik yöntemlerde yanıt değerlerinin belirlenmesi için elde edilen hidrojellerden galangin salınım çalışması yapılmıştır. Daha sonra galangin miktarları HPLC ile belirlenmiştir. Salınım çalışmasının planı Şekil 3.9’da anlatılmıştır. Hidrojellerden 0,1500 g tüpe konulur. 2 mL pH 5,50 sitrat tamponu eklenir. 2 dk boyunca vortex ile karıştırıl ır. 1 saat boyunca 37 oC’de inkübasyona bırakıldı. Sıvının üst kısmından viyale 1,5 mL çözeltiden alınır HPLC’de salınım sonrası galangin Şekil 3.9. Salınımmi ktetastriın binel HirlPeLniCr. analiz için hazırlanışı Şekil 3.9. Salınım çalışması için analiz şeması Hidrojellerin fizokimyasal ve yapısal analizleri Hidrojellerin fizikokimyasal olarak şişme testi analizi yapılmıştır (Şekil 3.10). Şişme testi için şişme oranı (%) aşağıdaki formülle hesaplanmıştır. Şekil 3.8’de elde edilen kurutulmuş (72 saat oda koşullarında) hidrojellerden 50 mL’lik balona 0,1000 g (W )tartılır. kuru Üzerine 10 mL pH tamponu (pH 5,5 sitrat tamponu) eklenir ve karıştırıcıda ağzı kapalı olacak şekilde 24 saat karıştırılır. Hidrojellerin kütleleri (Wşişme) belirlenir. Şekil 3.10. Şişme oranı testi için analiz şeması ş𝑖ş𝑚𝑒 𝑜𝑟𝑎𝑛𝚤 (%) = 𝚤𝑠𝑙𝑎𝑘 𝑘ütle(Wşişme)−𝑘𝑢𝑟𝑢 𝑘ü𝑡𝑙𝑒 (Wkuru) ×100 (3.3) 𝑘𝑢𝑟𝑢 𝑘ü𝑡𝑙𝑒 (Wkuru) Yapısal analizleri için fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FT-IR) ile analiz Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü’nde hizmet alımı 47 şeklinde yapılmıştır. Hidrojellerin yüzeyleri hakkında bilgi edinmek için SEM (Taramalı elektron mikroskobu) analizleri, Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Fizik Bölümü’nde bulunan taramalı elektron mikroskobu ile hizmet alımı şeklinde yapılmıştır. 3.2.7. Anti-tirosinaz enzim aktiviteleri Çizelge 3.11’de gösterilmiş olan örneklerin her birinin IC50 (Enzim’in %50’sini inhibe eden inhibitör konsantrasyonu) değerlerinin hesaplanmasında çalışıldığı miktarlar verilmiştir. Bu örnekler 5 mL dimetilsülfoksit çözeltisinde çözülerek hazırlandı. Her bir örneğin anti-tirosinaz enzim aktiviteleri için Çizelge 3.12’deki değerleri kullanılmıştır. 100 µL örnek, 1000 µL L-DOPA, 3400 µL pH 6,80 tamponu eklenir ve karıştırılır. En son 500 µL tirozinaz enzimi eklenir ve 1 dk boyunca karıştırılır. Daha sonra 450 nm’de UV-VIS spektrofotometresi ile absorbans ölçümleri yapılır. Elde edilen absorbans değerleri eşitlik 3.4’teki formülde yerlerine konularak %inhibisyon değerleri hesaplanır Standart olarak kojik asit çözeltisi kullanılmış belirli konsantrasyonlara karşı %inhibisyon değerlerini en küçük kareler yöntemi ile kalibrasyon grafiği çizilmiştir. Çizelge 3.11. IC50 değerleri belirlenecek örnekler ve kullanıldığı miktarlar Örnek Miktar (mg) Havlıcan ekstraktı katısı (EtOH) 10,15 Havlıcan ekstraktı Katısı (MeOH) 10,21 Hidrojel 99,41 Hidrojelli krem 1121,71 Havlıcanlı krem 1103,79 C. vulgaris içeren krem 1227,00 C. vulgaris katısı 51,33 Krem 1036,86 (𝐴−𝐵)−(𝐶−𝐷) %İ𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑦𝑜𝑛 = 𝑥100 (3.4) (𝐴−𝐵) Eşitlik 3.4’te bulunan A, B, C ve D değerlerinin elde edilmesi Çizelge 3.12’de verilmiştir. Her biri 450 nm’de örneklerin okunan absorbans değerleridir. 48 Çizelge 3.12. A, B, C ve D çözelti hacimleri pH 6,80 tampon Örnekler L-DOPA Kojik asit Tirosinaz çözeltisi A 1000 µL 3500 µL 500 µL - B 1000 µL 4000 µL - - pH 6,80 tampon L-DOPA Örnek Tirosinaz çözeltisi C 1000 µL 3400 µL 100 µL 500 µL pH 6,80 tampon L-DOPA Örnek Tampon çözeltisi D 1000 µL 3400 µL 100 µL 500 µL Çizelge 3.13. %İnhibisyon kalibrasyon verileri Yöntem Derişim aralığı Doğru Denklemi Regresyon (µM) katsayısı (R2) %İnhibisyon 1-20 y = 3,0130x + 9,9540 0,9940 49 4. BULGULAR Tezde sunulan bulguları beş ana başlık altında inceleyeceğiz. Bunlar; ▪ Spektroskopik sonuçlar ▪ Kromatografik sonuçlar ▪ Saflaştırma sonuçları ▪ Kemometrik sonuçlar ▪ Anti-tirosinaz enzim aktiviteleri 4.1. Spektroskopik Sonuçlar Havlıcan ekstraktlarının spektroskopik tayinleri için (toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite) bulunan sonuçlar Çizelge 4.1’de verilmiştir. Çizelge 4.1. Spektroskopik bulgular Ekstrakt türü Folin-Ciocalteu ABTS CHROMAC (mg GAE/g örnek) (mg TE/görnek) (mg TE/g örnek) %80 Etanol 363,558± 0,738 113,607 ± 5,122 282,622 ± 4,743 %80 Metanol 224,124 ± 0,092 78,836 ± 4,870 41,463 ± 0,862 %50 Etanol 266,470 ± 0,369 99,666 ± 3,598 223,171 ± 0,862 %50 Metanol 188,499 ± 0,461 68,292 ± 3,172 79,878 ± 0,862 4.2. Kromatografik Sonuçlar HPLC-DAD cihazı için havlıcan bitkisinde bulunan fenolik madde miktarları tayininde kullanılan galangin (360 nm), p-kumarik asit (320 nm), kuersetin (360 nm) ve kamferol (360 nm) fenolik standartlarından 1-20 mg/L konsantrasyon aralığında kalibrasyon grafiği çizilmiş ve Çizelge 4.2’de verilmiştir. Ayrıca ekstraksiyon çalışmaları için fenolik maddelerin geri kazanım çalışmaları da yapıldı. Ekstraksiyon yönteminde içerisinde 10 mg/L galangin ve 1 mg/L kamfeol, kuersetin ve p-kumarik asit içeren ekstraktlar kullanılmıştır. Bunun için geri kazanım çalışmaların %80 etanol ve %80 metanol ekstraktları kullanılmıştır. 50 Çizelge 4.2. HPLC-DAD için hazırlanan fenolik maddelerin kalibrasyon grafikleri Fenolik Kalibrasyon R2 LOQ LOD Geri kazanım (%) Madde denklemi (mg/L) (mg/L) / Ekstraksiyon türü Galangin y = 57,77x + 1,30 0,998 0,0513 0,0154 95,63 ± 1,75 (32,67 dk) /EtOH 96,11 ± 0,24 /MeOH p-kumarik y = 131,20x + 5,03 0,999 0,2737 0,0821 88,85 ± 3,56 asit /EtOH (24,16 dk) 82,45 ± 0,11 /MeOH Kuersetin y = 78,23x – 32,59 0,998 0,1603 0,0481 93,23 ± 4,77 /EtOH (27,90 dk) 90,58 ± 2,34 /MeOH Kamferol y = 78,35x – 16,96 0,998 0,0747 0,0224 97,06 ± 0,09 /EtOH (29,40 dk) 100,55 ± 0,26 /MeOH Çizelge 4.3. Havlıcan ekstraktlarında bulunan fenolik madde miktarları Ekstraksiyon Galangin p-kumarik asit Kuersetin Kamferol türü (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) %50 Etanol 10,2368 ± 0,0048 ± 0,0613 ± 0,2112 ± 0,0461 0,0004 0,0019 0,0018 %80 Etanol 11,4343 ± 0,0061 ± 0,0612 ± 0,2199 ± 0,0729 0,0001 0,0015 0,0015 %50 Metanol 9,9447 ± 0,0031 ± 0,0534 ± 0,0762 ± 0,3770 0,0002 0,0001 0,0022 %80 Metanol 10,4906 ± 0,0031 ± 0,0604 ± 0,1968 ± 0,1146 0,0002 0,0001 0,0018 HPLC-DAD cihazında hazırlanan fenolik bileşiklerin kalibrasyon grafikleri ile havlıcan bitkisinde bulunan galangin, p-kumarik asit, kamferol ve kuersetin fenolik bileşiklerin ekstraksiyon verimleri Çizelge 4.2’de verilmiştir. Havlıcan bitkisindeki fenolik madde miktarları kalibrasyon grafiğinden hesaplanmış ve sonuçları Çizelge 4.3’de verilmiştir. 51 4.3. Saflaştırma Çalışmaları %80 etanol (v/v) ve %80 metanol (v/v) havlıcan ekstraktından ayrı ayrı 10 mL alınarak kolondan geçirildi. 100 mL metanol geçirilerek fraksiyonlar (3 mL) toplandı. Herbir fraksiyondan 0,1 mL alınıp 4,9 mL metanol ile seyreltildi ve UV-VIS spektrofotometresinde 320 ve 360 nm’de absorbanslar ölçüldü. 320 ve ve 320 nm’de fraksiyonların absorbans değerleri verilmiştir. Şekil 4.1. 320 nm’de etanol ekstraktının fraksiyon/absorbans grafiği Şekil 4.2. 360 nm’de etanol ekstraktının fraksiyon/absorbans grafiği 52 Şekil 4.3. 320 nm’de metanol ekstraktının fraksiyon/absorbans grafiği Şekil 4.4. 360 nm’de etanol ekstraktının fraksiyon/absorbans grafiği Her iki ekstraktın fraksiyonları 15-34 nolu tüpler birleştirildi ve döner buharlaştırıcı ile çözücü uzaklaştırıldı. Elde edilen kalıntılardan 0,0805 g etanol ekstrakt ve 0,0305 g metanol ekstrakt kalıntısı elde edildi. Etanol ekstrakt kalıntısı daha fazla olduğu için havlıcanlı krem çalışmalarında kullanıldı. Bu elde edilen kalıntıların HPLC-DAD ile analizleri yapıldı. Saflaştırma işlemi sonrası etanol kalıntısında 0,4454 mg/g kuersetin, 3,2345 mg/g kamferol, 217,056 mg/g galangin, 0,0102 mg/g p-kumarik asit, metanol kalıntısında 0,3885 mg/g kuersetin, 3,0028 mg/g kamferol, 215,4150 mg/g galangin, 0,0117 mg/g p-kumarik asit bulundu. Havlıcanlı kreminin görüntüsü Şekil 4.5’te verilmiştir. 53 Şekil 4.5. Havlıcanlı yüz kremi Krem çalışmalarında ayrıca Chlorella vulgaris ekstraktı da kullanılmıştır (Şekil 4.6). Daha sonra hem krem örneklerinde hem de Chlorella vulgaris ekstraktında spektroskopik çalışmalar yapılmıştır (Çizelge 4.4). Çizelge 4.4. Spektroskopik bulgular Örnek Folin-Ciocalteu ABTS CHROMAC (mg GAE/g örnek) (mg TE/g örnek) (mg TE/g örnek) C. vulgaris ekstraktı 84,263±0,794 17,314±0,120 69,007±0,086 Krem 0,047±0,001 0,136±0,003 0,332±0,012 C.vulgaris içeren 2,235±0,006 1,751±0,055 10,913±0,214 krem Havlıcan krem 0,279±0,022 0,242±0,004 0,874±0,036 Ayrıca C.vulgaris ekstraktında bulunan karotenoidler HPLD-DAD ile analiz edilip miktarları belirlenmiştir. Buna göre C.vulgaris ekstraktında 0,1302±0,0002 mg/g lutein bulunmuştur. 54 Şekil 4.6. Chlorella vulgaris krem formu 4.4. Kemometrik Çalışmalar Çizelge 3.8 ve 3.9’da verilen seviyelere göre Şekil 3.8’de belirtilen işlem basamaklarına göre 30 hidrojel örneğinden galangin salınım çalışması yapılmıştır. Daha sonra hidrojellerden salınan galangin miktarları HPLC-DAD ile belirlenmiştir. Elde edilen 30 hidrojel için galangin salınım değerleri kullanılarak Design Expert 7.0.0 (Stat-Ease inc. USA) programı ile ANOVA analizi yapılmıştır. Merkezi kompozit dizayn yöntem ile bulunan tahmini galangin salınım değerleri Çizelge 4.5’te verilmiştir. Ayrıca (Çizelge 4.6) bulunan ikinci dereceden denklemler ile tahmini değerler hesaplanmıştır (Çizelge 4.7). 55 Çizelge 4.5. Kemometrik deneysel ve tahmini değerler Deney Salınan galangin derişimi (mg/L) Deneysel değerler Tahmini değerler 1 2,65 2,49 2 1,52 1,33 3 2,29 2,34 4 1,30 1,55 5 3,16 3,35 6 2,39 2,06 7 2,13 1,88 8 0,95 0,96 9 3,26 3,22 10 2,09 2,34 11 3,15 3,49 12 3,19 2,98 13 3,67 3,43 14 2,50 2,43 15 2,20 2,38 16 1,57 1,75 17 3,93 3,90 18 2,06 2,11 19 3,00 3,30 20 2,75 2,47 21 2,35 2,20 22 1,66 1,82 23 0,63 0,84 24 2,54 2,35 25 2,86 2,76 26 2,86 2,76 27 2,31 2,76 28 2,84 2,76 29 3,08 2,76 30 2,63 2,76 Çizelge 4.6. Kemometrik yanıt değerleri için ANOVA analizi sonuçları Yöntem Galangin salınım derişimi (R2 =0,9214) DF SS MS F P değeri değeri Model 14 15,58 1,11 12,56 < 0,0001 Lack of fit 10 0,98 0,098 1,43 0,3641 Pure error 5 0,34 0,069 DF: serbestlik derecesi, SS: karelerin toplamı, MS: ortalamaların karesi 56 Çizelge 4.7. Kuadratik polinom denklemleri (x1:Na-Al yüzdesi (%w/v), x2:CaCl2 yüzdesi (%w/v), x3:Zaman (dk), x4:Ekstrakt yüzdesi (%w/v)) Yanıt Kuadratik polinom denklemi Salınan galangin y = 2,76 -0,45x1 -0,21x2 -0,094x3+ 0,38x4 -0,33x2x3 -0,16x3x4 - miktarı 0,19x 23 -0,29x 2 4 Çizelge 4.8. Kemometrik optimum koşullar ve deneysel/tahmini değerler Faktör Optimum Maksimum salınan galangin derişimi koşullar (mg/L) Tahmini değer Deneysel değer Na-Al (%w/v) 0,69 4,97 5,02±0,10 CaCl2 (%w/v) 1,00 Zaman (dk) 43,55 Ekstrakt (%w/v) 0,48 Galangin-aljinat hidrojellerinin hazırlanması için kemometrik yöntemlerden merkezi kompozit dizayn kullanılmıştır. Yapılan ANOVA analizine göre salınan galangin derişimi sonuçları üzerinde faktörlerin etkisini gösteren yüzey analiz grafikleri Şekil 4.7a ve 4.7b’de verilmiştir. 3.8 2.9 2 Galangin derişimi 1.1 (mg/L) 0.2 10 1.0 20 1.5 30 2.0 40 2.5 ZCa: mTimane ( dk) C aBC: Cla C(%l2 w /v) 50 3.0 2 Şekil 4.7a. Kemometrik yüzey analizi grafikleri (Zaman- CaCl2 etkisi) 57 SON 3 2.25 1.5 Galangin derişimi 0.75 (mg/L) 0 0.1 0.3 10 20 0.5 30 E kDs: tEranckatp (s%ulew e/xvtr)a ct 0.7 40 Zam a C0.9 50 n : T(dimke) Şekil 4.7b. Kemometrik yüzey analizi grafikleri (Zaman-Ekstrakt etkisi) Hidrojellerin fizikokimyasal ve yapısal analizleri Kemometrik yöntem çalışmaları için ilk önce havlıcan ekstraktı β-siklodekstrin ile enkapsule edildi. Enkapsulasyon sonrası elde edilen galangin-β-siklodekstrin kalıntısının görüntüsü Şekil 4.8’de verilmiştir. Bu kalıntı kullanılarak hazırlanan hidrojellerin görüntüsüde Şekil 4.9’da verilmiştir. Elde edilen hidrojeller için FT-IR spektrumu (Şekil 4.10), hem galangin-β-siklodekstrin kalıntısının (Şekil 4.11-13) hem de hidrojelin (Şekil 4.14-16) SEM görüntüleri de verilmiştir. 58 SON Şekil 4.8. Galangin-β-siklodekstrin kalıntısının görüntüsü Şekil 4.9. Hidrojel görüntüsü 59 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Dalga sayısı (cm-1) Sodyum-aljinat β-siklodekstrin+Havlıcan ekstraktı β-siklodekstrin Hidrojel Şekil 4.10. Sodyum aljinat, ß-siklodekstrin+havlıcan ekstraktı, ß-siklodekstrin ve hidrojelin FTIR spektrumları Şekil 4.11. Galangin-β-siklodekstrin kalıntısının SEM görüntüsü (500 büyütme) 60 Geçirgenlik(%) Şekil 4.12. Galangin-β-siklodekstrin kalıntısının SEM görüntüsü (1000 büyütme) Şekil 4.13. Galangin-β-siklodekstrin kalıntısının SEM görüntüsü (3000 büyütme) 61 Şekil 4.14. Hidrojel SEM görüntüsü (200 büyütme) Şekil 4.15. Hidrojel SEM görüntüsü (2000 büyütme) 62 Şekil 4.16. Hidrojel SEM görüntüsü (3000 büyütme) Hidrojellerin fizikokimyasal olarak şişme testi analizi yapılmıştır. Şişme testi için şişme oranı (%) hesaplanıp Çizelge 4.9’da verilmiştir. Çizelge 4.9. Şişme oranları Örnek Şişme oranı (%) Galangin-aljinat hidrojeli 7928±384 4.5. Anti-tirosinaz enzim aktivite çalışmaları Örneklerin anti-tirosinaz enzim aktiviteleri ölçülerek örneklerin melanin inhibisyonu konusunda IC50 değerleri bulunmuştur. Çizelge 3.11’deki örneklerin absorpsiyon değerleri eşitlik 3.4’te yerine konularak tirosinaz inhibisyon analiz (IC50) değerleri bulunmuştur (Çizelge 4.10). 63 Çizelge 4.10. Örneklerin IC50 değerleri Örnek Adı IC50 Değeri (mg/mL) Havlıcan ekstraktı katısı (EtOH) 0,446±0,040 Havlıcan ekstraktı Katısı (MeOH) 0,074±0,001 Hidrojel 1,076±0,029 Hidrojelli krem 6,656±0,170 Havlıcanlı krem 4,027±0,212 C. vulgaris içeren krem 5,488±0,135 C. vulgaris katısı 0,308±0,006 Krem 5,644±0,052 Kojik asit 0,0019 64 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Antioksidan özelliği içeren kremlerin geliştirilmesi konusunda yapılan tez çalışmamız beş ana başlık altında toplanabilir. Bunlar; • Spektroskopik yöntemler • Kromatografik yöntemler ▪ Saflaştırma çalışmaları ▪ Kemometrik çalışmalar ▪ Anti-tirosinaz enzim aktivite çalışmaları 5.1. Spektroskopik Yöntemler Yapılan araştırmalar incelendiğinde antioksidan özelliklerin belirlenmesinde spektroskopik yöntemler adı altında genel olarak Folin-Ciocalteu, CHROMAC, FRAP, CUPRAC, ABTS ve DPPH gibi yöntemler kullanılmaktadır. Tez kapsamında yapılan çalışmamızda toplam fenolik madde içeriğinin belirlenmesinde Folin-Ciocalteu, antioksidan özelliğinin belirlenmesinde ABTS ve CHROMAC yöntemleri kullanılmıştır. Bu yöntemlerde çözücü ekstraksiyonu yapıldıktan sonra, ekstraksiyon oranları %80 etanol, %80 metanol, %50 etanol ve %50 metanol ekstraksiyonlarıyla çalışılmış ve en yüksek sonuçlar %80 etanol ekstraktlarında bulunmuştur. Tez kapsamında çalışılan havlıcan örneğinin %80 etanol, %80 metanol, %50 etanol ve %50 metanol ekstraktlarının toplam fenolik madde içerikleri sırasıyla 363,558±0,738; 224,124 ± 0,092; 266,470±0,369; 188,499±0,461 mg GAE/g olarak hesaplanmıştır. Mayachiew ve Devahastin (2008), havlıcan üzerinde yapılan toplam fenolik madde içeriği 40,9±0,2 mg GAE/g olarak bulmuştur. Bu çalışmada ekstraksiyon koşullarının ve ekstrakt içeriğinin farklı olması vb. nedenlerden dolayı sonuçların farklılık gösterdiği, çalışma sonuçlarının daha yüksek bulunduğu belirlenmiştir. %80 etanol, %80 metanol, %50 etanol ve %50 metanol ekstraktlarının antioksidan kapasite sonuçları sırasıyla 113,607±5,122; 78,836±4,870; 99,666±3,598 ve 68,292±3,172 mg TE/g olarak bulunmuş olup, en yüksek değer %80 etanol ekstraktında elde edilmiştir. Ayusuk ve ark. (2009) yaptığı çalışmada, havlıcan bitkisi üzerinde yapılan ABTS antioksidan kapasite değeri 167,48 ± 5,19 μmol TE/g (41,918 mg TE/g) olarak bulmuştur. Buna göre farklı sonuçların bulunması örneğin toplandığı coğrafya ve 65 ekstraksiyon işlemleri (sıcaklık, süre vb) gibi faktörlerden kaynaklanabilir. Genel olarak literatüre bakıldığında galangin maddesi havlıcanda bulunan temel fenolik madde olup suda çözünürlüğü azdır. Yapılan ekstraksiyon çalışmalarında da su miktarı arttıkça toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite değerleri azaldığı gözlenmiştir. Ekstraktlarda bulunan galangin miktarının da toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite değerlerine olan katkısı da çözünürlüğüne bağlı olarak değişmektedir. Tez kapsamında hazırlanan Chlorella vulgaris ekstraktının da toplam fenolik madde (84,263±0,794 mg GAE/g örnek) ve antioksidan kapasite (17,314±0,120 mg TE/g örnek ABTS yöntemi, 69,007±0,086 mg TE/g örnek CHROMAC yöntemi) çalışmaları da yapılmıştır. Habashy ve ark. (2018) yaptığı çalışmada, Chlorella vulgaris mikroalgi için toplam fenol tayin miktarı 5,18 mg GAE/g olarak bulunmuştur. Agregán ve ark. (2018) yaptığı çalışmada ise, Chlorella vulgaris mikroalginin antioksidan kapasite değeri 15,64 mg TE/g olarak bulunmuştur. Tez kapsamında hazırlanan ekstraktların toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite miktarları literatürdeki çalışmalarla karşılaştırıldığında farklı sonuçların elde edildiği gözlemlenmiştir. Havlıcan ve Chlorella vulgaris türünün yetiştiği coğrafi bölgelerin farklı olması, iklim koşulları, bulundukları çevre, saklama koşulları, örnek hazırlama teknikleri ve ekstraksiyon koşulları gibi faktörlerde örneklerin fenolik madde içeriğini etkilemektedir. Doğal ürünlerde bulunan antioksidan maddelerin kimyasal özellikleri, çözünürlükleri, stabiliteleri farklı olduğu için uygulanan antioksidan kapasite tayin yöntemlerinde farklı sonuçlar elde edilmektedir. Bu nedenle tez çalışmamızda antioksidan kapasite tayin yöntemi olarak CHROMAC yöntemi de kullanılmıştır. CHROMAC ve ABTS yöntemlerine göre sonuçların farklı olması farklı ortam koşullarında antioksidan maddelerin özellikleri de değişmektedir. Bu nedenle sonuçlarda farklılık gözlenebilmektedir. Nasir ve ark. (2017) yaptığı çalışmada, Chlorella vulgaris için antioksidan kapasite değeri (325,26±1,93 mg TE/g) sonuçlarımızdan yüksek bulunmuştur. Ekstraksiyonda kullanılan çözücüler, ekstraksiyon sıcaklığı, ekstraksiyon süresi, kullanılan mikroalgin toplandığı coğrafi bölge, antioksidan yöntem öncesi yapılan diğer yöntemler bu değerin farklı olmasının sebebi olabilir. 66 5.2. Kromatografik Yöntemler Bu çalışmada zencefil familyasından olan havlıcan (Alpinia officinarum) içerisinde bulunan fenolik maddeler HPLC-DAD cihazı ile kantitatif olarak tayin edilmiştir. Havlıcan ekstraktlarında HPLC-DAD ile tayin edilen fenolik maddeler; galangin, kamferol, kuersetin ve p-kumarik asittir. Havlıcanda bulunan fenolik maddelerin kalibrasyon denklemi, LOD, LOQ ve %geri kazanım değerleri Çizelge 4.2’de, fenolik madde miktarları ise Çizelge 4.3’de verilmiştir. Havlıcanın 2 farklı çözücü (metanol ve etanol) kullanılarak 4 farklı polarite ortamında ekstraksiyon yapılmıştır. Bu yapılan ekstraksiyonlarda en iyi verimi %80’lik etanol çözeltisinden elde edilmiştir. Çözücü ekstraksiyonu doğal ürünlerde bulunan fenolik maddelerin ekstraksiyonu için kullanılan en genel ekstraksiyon yöntemidir. Fenolik maddeler için daha çok su, metanol, etil asetat, aseton ve bunların farklı karışımları çözücü olarak kullanılmaktadır. Fenolik maddelerin ekstraksiyon verimleri bu fenolik maddelerin kullanılan çözücülerdeki çözünürlüğüne bağlıdır. Bu nedenle tez kapsamında farklı çözücü karışımları kullanılarak ekstraksiyon çalışması yapılmış ve havlıcan için en uygun çözücü %80 etanol olarak belirlenmiştir. Chlorella vulgaris ekstraktında ise HPLC-DAD yöntemi ile 0,1302±0,0002 mg/g lutein bulunmuştur. Bu sonuç Nasir ve ark. (2017) yaptığı çalışma ile uyumlu bulunmuştur. 5.3. Saflaştırma çalışmaları Saflaştırma çalışmalarında havlıcan için, en yüksek fenolik madde ve toplam fenolik madde içeriğine sahip antioksidan özelliği yüksek %80 etanol ve metanol ekstraktları kullanılmıştır. Bu ekstraktların Sephadex LH-20 kolon kromatografisi saflaştırma çalışmaları sonucu havlıcan için dört fraksiyon elde edilmiştir (Şekil 4.1-4.2-4.3-4.4.). Sephadex LH-20 kolon kromatografisi sonucu elde edilen fraksiyonlarıni 360 nm ve 320 nm’de absorbans ölçümleri yapıldıktan sonra tüp fraksiyonları birleştirilmiştir. Daha sonra HPLC-DAD cihazı ile kantitatif analizleri yapılmıştır. HPLC-DAD ile elde edilen sonuçlara göre saflaştırma işlemi sonrası etanol ekstraktında 0,4454 mg/g kuersetin, 3,2345 mg/g kamferol, 217,056 mg/g galangin, 0,0102 mg/g p-kumarik asit, metanol ekstraktında 0,3885 mg/g kuersetin, 3,0028 mg/g kamferol, 215,4150 mg/g galangin ve 0,0117 mg/g p-kumarik asit bulunmuştur. En yüksek saflaştırma sonucu 67 etanol ekstraktında 217,056 mg/g galangin bulunmuştur. Saflaştırma sonucu havlıcan için elde edilen en yüksek galangin içeriğine sahip etanol ekstraktından ve C.vulgaris ekstraktından elde edilen kalıntılar kullanılarak krem çalışmaları da yapılmıştır. Elde edilen örnekler için spektroskopik sonuçlar incelendiğinde (Çizelge 4.4) kontrol olarak hazırlanan krem örneği ile karşılaştırıldığında antioksidan madde içeren kremlerin toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite sonuçları artmıştır. Buna göre havlıcan için elde edilen en yüksek galangin içeriğine sahip etanol ekstraktından ve C.vulgaris ekstraktından elde edilen kalıntılar kullanılarak hazırlanan kremler daha iyi etkinliğe sahip aday kozmetik ürün olabileceği sonucuna varılmıştır. CHROMAC sonuçlarına göre C.vulgaris ekstraktı eklendiğinde 30 kat, havlıcan ekstraktı eklendiğinde 3 kat antioksidan değerleri artmıştır. 5.4. Kemometrik Yöntemler Hidrojel, birbirine çapraz bağlı polimerlerin oluşturduğu büyük karmaşık ve suda çözünmeyen yapılardır. Kontrollü aktif madde salınımı sağladıkları da pekçok alanda kullanımı tercih edilmektedir. Bu amaçla çalışmamızda kozmetik kremde kullanılan galanginin hidrojelleri hazırlanarak krem çalışmasında kullanılabilirliği de araştırılmıştır. Bu amaçla galangin-aljinat hidrojelinde maksimum galangin salınımı için koşulların optimizasyon çalışması yapılmıştır. Optimum koşulların belirlenmesi için merkezi kompozit dizayn yöntemi kullanılmıştır. Elde edilen kromatografik deneysel değerler ile tahmini değerler Çizelge 4.5’de verilmiştir. Tahmini ve deneysel değerlerin birbirleri ile uyumlu olduğu görülmüştür. Deneysel değerlere göre galangin derişimi 0,63 mg/L ile 3,93 mg/L arasında değişmektedir. Çizelge 4.6’ya bakıldığında galangin salınım derişiminin (4,97 mg/L) maksimum elde edilmesi için, optimum koşullar %0,69 (w/v) Na-Al, %1 (w/v) CaCl2, %0,48 (w/v) ekstrakt ve 43,55 dk olarak belirlenmiştir. Optimum koşullarda yapılan hidrojelden elde edilen galangin salınım değeri de 5,02±0,1 bulunmuştur. Çizelge 4.6’da galangin salınım derişimi için p-değeri <0,0001 olarak bulunmuştur. P-değeri ile kuadratik polinom modelindeki yanıt ve değişkenler arasındaki ilişkiyi tanımlamada kullanılmış ve birbiriyle anlamlı olduğu bulunmuştur. Modelin F değeri 12,56 hesaplanmış %95 güven aralığında anlamlı kabul edilmiştir. Modelin lack of fit p-değeri 0,3641 olarak hesaplanmış modelin geçerli olduğunu göstermiştir. Hidrojel oluşumunda etkili faktörlerin (zaman, CaCl2 yüzdesi ve 68 ekstrakt oranı) ANOVA yöntemine göre salınan galangin derişimi üzerindeki etkilerini gösteren yüzey analiz grafikleri Şekil 4.7a ve Şekil 4.7b’de verilmiştir. Yüzey analiz grafiklerine göre zaman-CaCl2 etkisi açısından bakıldığında zaman ve CaCl2 yüzdesi arttıkça salınan galangin derişimi azalmaktadır. En iyi sonuç zamana karşı %1 CaCl2 konsantrasyonunda elde edilmiştir. Zaman ve ekstrakt oranı açısından bakıldığında zaman azaldıkça salınan galangin derişimi azalmakta, ekstrakt oranı arttıkça salınan galangin derişimi parabolik olarak artıp azalmaktadır. En iyi sonuç zamana karşı %0,5 ekstrakt konsantrasyonunda elde edilmiştir. Çizelge 4.6’da galangin için yüksek regresyon katsayısı (R2 = 0,9214) hesaplanmıştır. Çizelge 4.7’ye bakıldığında x1 (Na-Al yüzdesi (%w/v)), x2 (CaCl2 yüzdesi (%w/v)), x3 (Zaman (dk)), x4 (Ekstrakt yüzdesi (%w/v)), x x 2 22 3, x3x4, x3 , ve x4 en anlamlı değişkenler olarak bulunmuştur (p<0,05). Ancak x1x2, x1x3, x1x4, x 2 2 2x4, x1 ve x2 etkisi düşük değişkenler olarak bulunmuştur (p >0,05). Çalışmamızda havlıcandan izole edilen galanginin hidrojel yapımında kullanılmadan önce enkapsule edilmiştir (Şekil 5.1). Enkapsülasyon işlemi sırasında β- siklodekstrin (Şekil 5.2) kullanılmıştır. Şekil 5.1. Galangin-aljinat hidrojelinin hazırlanması β-siklodekstrin (Şekil 5.2) kullanımının amacı, sudaki çözünürlüğü düşük olan galangin fenolik maddesi (havlıcandan izole edilen) ile bariyer oluşturarak galanginin hem korunmasını hem de çözünürlüğünü arttırmaktır. β-siklodekstrin üç boyutlu yapısında da (Şekil 5.3) görüldüğü gibi hidrofobik yüzeyi ile galangini kafes şeklinde sarıp, hidrofilik dış yüzeyi ile sudaki çözünürlüğü arttırmıştır. Siklodekstrinlerin 3 boyutlu 69 yapısı konik silindir görünümünde olan iç kısmı hidrofobik dış yüzey kısmı hidrofilik özellik taşımaktadır. Glikozil transferaz enziminin nişastayı parçalamasıyla β- siklodekstrin ve türevleri elde edilmektedir. İndirgen değildir, α(1-4) glikozidik bağ yapısına sahip siklik maltooligosakkaritlerdir. Siklodekstrinler gıda endüstrisinde geniş bir kullanım alanına sahiptir. Her yıl siklodekstrinlerin endüstride kullanım oranı %20 ile %30 arası artış göstermektedir. Şekil 5.2. β-siklodekstrin yapısı Şekil 5.3. Siklodekstrinlerin 3 boyutlu yapıları (Zhang ve Rees 1999) Çizelge 5.1. Siklodekstrinlerin yardımcı madde olarak kullanım alanları Kullanıldığı Alan Kullanım Amacı Isı, ışık ve oksijene duyarlı gıda ürünler Koruyucu olarak Kötü tat ve kokuları Maskeleme Aroma, vitamin, yağ asitleri Stabilizasyonunda Gıda bileşenlerinin Kontrollü salınımı yapması Süt ve süt ürünleri Kolesterol uzaklaştırma Vitaminler ve renk maddeleri Çözünürlüğünün arttırılmasında 70 Siklodekstrinler %90’lara varan kullanım oranıyla en çok gıda endüstrisinde tercih edilmektedir. Bileşiklerin kimyasal, fiziksel ve biyolojik özellikleri enkapsülasyon işlemi ile önemli ölçüde korunabilmektedir. Siklodekstrinlerin kullanım alanları Çizelge 5.1’de verilmiştir. Hazırlanan galangin-aljinat hidrojelinin yapısal özelliklerinin belirlenmesi için FT-IR (Şekil 4.10) ve SEM (Şekil 4.11-16) analizleri de yapılmıştır. IR spektrumlarında 1500 cm-1 ve sağ tarafında kalan kısım parmak izi bölgesi 1500 cm-1 ve sol tarafında kalan kısım ise tanımlama bölgesi olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle moleküllerin kıyaslamasına bakarken genelde tanımlama bölgesine bakılmaktadır. Sodyum aljinatın IR spektrumuna bakıldığında; 3200-3300 cm-1 aralığında görülen bant O-H bağının varlığını, 2900 cm-1 frekansında görülen pik sp3 hibritleşmesini, 2000 – 2500 cm-1 arasında dalgalanma halkalı yapının varlığını, 1600-1610 cm-1 arasındaki bantlar, O-C- O karboksilat asimetrik gerilme bantlarıdır. ß-siklodekstrinin IR spektrumuna bakıldığında; 3000 – 3700 cm-1 civarındaki geniş bant frekansı hidrojen bağı yani OH grubunun varlığını, 2900 cm-1 dalga sayısına karşılık gelen pik sp3 hibritleşmesini, 2000 – 2500 cm-1 arasında dalgalanma halkalı yapının varlığını belirtmektedir. Hidrojel yapısının kızıl ötesi spektrumunda 3000 -3700 cm-1 arasında geniş bant spektrumu gözlenmekte yani hidrojen bağlı (OH) bir grubun varlığını, 2900 cm-1 küçük bir pik olmasına rağmen sp3 hibritleşmesinin varlığını, 2000-2500 cm-1 aralığına gelen titreşimli piklerin halkalı yapıya ve 1500-1700 cm-1 aralığında bulunan pik alifatik ve aromatik çift bağları içerdiğini belirtmektedir. ß-siklodekstrin-havlıcan ekstrakt karışımının spektrumuna bakıldığında, diğerleri ile aynı dalga sayılarında pikler gözlenmektedir. IR analizinde, spektrumlar karşılaştırıldığında, hemen hemen aynı dalga sayılarına yakın yerlerde pik elde edilmiştir. Bunun sebebi molekül yapıları aynı olmasa bile birbirlerine benzeyen yapılara ve bağlara sahiptirler. Dikkat etmemiz gereken en önemli husus ß- siklodekstrin-galangin karışımının diğerlerine göre kıyaslandığında geçirgenlik oranları daha düşük gözükmektedir. Bu da karışımın ışığı diğerlerine göre daha çok tutması (absorblaması) anlamına gelmektedir. Yapının güçlü bir kompleks yapıya dönüştüğünü 71 diğerlerine göre bağların daha kuvvetli olduğu ve ışığı daha çok absorpladığı anlamına gelmektedir. Enkapsule edilen β-siklodekstrin-havlıcan yapısında daha çok kümelenmiş ve galanginin β-siklodekstrin tarafından sarıldığı görülmektedir. β-siklodekstrinn-havlıcan karışımınun görünümü daha çok dallanmış ağacı anımsatmaktadır. Burada dallanmış yapısının temel nedeni β-siklodekstrinin aromatik yapılarla kompleks oluşturma yeteneğine dayanmaktadır. Galangin-aljinat hidrojellerde ise yuvarlık ve gözenekli yapılar gözlenmektedir. Bu durum hidrojel yapısındaki aljinatın şişmeye dayalı fiziksel özelliğinden kaynaklanmaktadır. 5.5. Anti-tirosinaz enzim aktivite çalışmaları Melanin, cildin dış faktörlere (zararlı güneş ışını, kirli hava vb.) maruz kalması ile meydana gelen cilt ton farklılıklarından sorumlu olan pigmenttir. Melaninin fazla sentezlenmesinden dolayı olan pigmentasyon reaksiyonlarının üretimini belirleyen kısım L-DOPA ile reaksiyon veren tirozinaz enzimidir. Burada tirozinaz enzimini inhibe ederek L-DOPA reaksiyonunda oluşacak dopakinon konsantre miktarını azaltarak doğru orantılı olarak melanin miktarını azaltacaktır ve ciltteki ton farklılıkların önüne geçilecektir. Tez kapsamında yapılan farklı örnek üzerinde tirosinaz üzerindeki IC50 (Çizelge 4.10) sonuçlarına baktığımızda tirozinazın %50 inhibisyonu için en etkili olan kojik asit gözlenmektedir. Fakat kojik asitin uzun süre kullanımlarında yan etkilerin olduğundan dolayı tercih edilmemektedir. Kojik asitten sonra tirosinaz enzimini en iyi %50 inhibe edebilen örnekler havlıcan ekstraktı katısı (MeOH), C. vulgaris katısı ve havlıcan ekstraktı katısı (EtOH) gelmektedir. Krem formülasyonunda bulunan havlıcan ekstraktın IC50 değeri diğerlerine göre biraz daha düşük çıkmasının sebebi krem içersinde çözünürlüğü ile açıklanabilir. Krem formülasyonlarındaki diğer hammaddelerin tirozinaz inhibe edici özelliği olanlar seçilebilir. Ekstraksiyon işlemindeki çözücü değiştirilebilir. Kozmetik için gerekli olan 72 organik maddelerin bulunup onlar üzerinde çalışmaların yapılması gerekmektedir. Bu tezde amaçlanan hedef havlıcan ve Chlorella vulgaris ilerleyen zamanlarda kozmetik, gıda ve ilaç endüstrilerinde daha fazla yer bulmaları için özellikleri araştırılmıştır. 73 KAYNAKLAR Abubakar, I. B., Malami, I., Yahaya, Y. ve Sule, S. M.(2018). A review on the ethnomedicinal uses, phytochemistry and pharmacology of Alpinia officinarum Hance. Journal of Ethnopharmacology, 224, 45–62. https://doi.org/10.1016/j.jep.2018.05.027 Adak, T. (2019). Kojik Asit Türevi Bileşiklerin Tasarımı, Sentezi ve Melanoma Hücresine Karşı Sitotoksisiteleri ile Tirozinazİnhibisyonu Etkilerinin Değerlendirilmesi (Yüksek lisans tezi) Hacettepe Üniversitesi/Sağlık bilimleri enstitüsü/ Farmasötik Kimya/Ankara Erişim adresi: http://www.openaccess.hacettepe.edu.tr:8080/xmlui/bitstream/handle/11655/8630/ 10214344.pdf?sequence=1&isAllowed=y Agregán, R., Munekata, P., Franco, D., Carballo, J., Barba, F.ve Lorenzo, J. (2018). Antioxidant Potential of Extracts Obtained from Macro- (Ascophyllum nodosum, Fucus vesiculosus and Bifurcaria bifurcata) and Micro-Algae (Chlorella vulgaris and Spirulina platensis) Assisted by Ultrasound. Medicines, 5(2), 33. https://doi.org/10.3390/medicines5020033 Ahmed, E. M.(2015). Hydrogel: Preparation, characterization, and applications: A review. Journal of Advanced Research, 6(2), 105–121. https://doi.org/10.1016/j.jare.2013.07.006 Akalın, G. O. (2011).Akalın, O. G. (2011). Jelatin Hidrojellerinin Sentezlenmesi, Şişme/ Bozunma Davranışlarının İncelenmesi ve Uygun İmmobilizeLipaz–Jelatin Hidrojel Sisteminin Oluşturulması (Yüksek lisans tezi). Gazi Üniversitesi/Fen bilimleri enstitüsü/Ankara. Erişim adresi: https://tez.yok.gov.tr/UlusalTezMerkezi/tezSorguSonucYeni.jsp Alam, S., Algahtani, M. S., Ahmad, M. Z. ve Ahmad, J.(2020). Investigation utilizing the HLB concept for the development of moisturizing cream and lotion: In-vitro characterization and stability evaluation. Cosmetics, 7(2), 43. https://doi.org/10.3390/cosmetics7020043 An, N., Zou, Z. M., Tian, Z., Luo, X. Z., Yang, S. L. ve Xu, L. Z. (2008). Diarylheptanoids from the rhizomes of Alpinia officinarum and their anticancer activity. Fitoterapia, 79(1), 27–31. https://doi.org/10.1016/j.fitote.2007.07.001 Astuti, I. Y., Yupitawati, A. ve Nurulita, N. A.(2021). Anti-aging activity of tetrahydrocurcumin, Centella asiatica extract, and its mixture. Advances in Traditional Medicine, 21(1), 57–63. https://doi.org/10.1007/s13596-020-00532-9 Ayusuk, S., Siripongvutikorn, S., Thummaratwasik, P. ve Usawakesmanee, W.(2009). Effect of heat treatment on antioxidant properties of tom-kha paste and herbs/spices used in tom-kha paste. Kasetsart Journal - Natural Science, 43(5), 305–312. Baki, G. ve Alexander S. K. (2015). IntroductiontoCosmeticFormulationandTechnology. Erişim adresi: https://books.google.com.tr/books?hl=tr&lr=&id=tM_0BgAAQBAJ&oi=fnd&pg= PR15&dq= cosmetic+general+information&ots=raeN- 74 4aVhA&sig=ISizicQQz27_LvoBxMetS5FzfKg&redir_esc=y#v=onepage&q=cos metic%20general%20information&f=false Barrington, R., Williamson, G., Bennett, R. N., Davis, B. D., Brodbelt, J. S. ve Kroon, P. A.(2009). Absorption, conjugation and efflux of the flavonoids, kaempferol and galangin, using the intestinal CaCo-2/TC7 cell model. Journal of Functional Foods, 1(1), 74–87. https://doi.org/10.1016/j.jff.2008.09.011 Ben-Amotz, A. ve Fishler, R. (1998). Analysis of carotenoids with emphasis on 9-cis β- carotene in vegetables and fruits commonly consumed in Israel. Food Chemistry, 62(4), 515–520. https://doi.org/10.1016/S0308-8146(97)00196-9 Bronze-Uhle, E. S., Paulin, J. V., Piacenti-Silva, M., Battocchio, C., Rocco, M. L. M. ve Graeff, C. F. de O.(2016). Melanin synthesis under oxygen pressure. Polymer International, 65(11), 1339–1346. https://doi.org/10.1002/pi.5185 Cabanes, J., Chazarra, S., GarciaCarmona, F. (1994). Kojic Acid, a Cosmetic Skin Whitening Agent, is a Slowbinding Inhibitor of Catecholase Activity of Tyrosinase. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 46(12), 982–985. https://doi.org/10.1111/j.2042-7158.1994.tb03253.x Carazo Fernández, A., Smutny, T., Hyrsová, L., Berka, K. ve Pavek, P.(2015). Chrysin, baicalein and galangin are indirect activators of the human constitutive androstane receptor (CAR). Toxicology Letters, 233(2), 68–77. https://doi.org/10.1016/j.toxlet.2015.01.013. Cercamondi, C. I., Egli, I. M., Mitchikpe, E., Tossou, F., Hessou, J., Zeder, C., … Hurrell, R. F.(2013). Iron bioavailability from a lipid-based complementary food fortificant mixed with millet porridge can be optimized by adding phytase and ascorbic acid but not by using a mixture of ferrous sulfate and sodium iron EDTA. Journal of Nutrition, 143(8), 1233–1239. https://doi.org/10.3945/jn.113.175075 Chang, M. L. ve Chang, C. M. (2003). Simultaneous HPLC determination of hydrophilic whitening agents in cosmetic products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 33(4), 617–626. https://doi.org/10.1016/S0731- 7085(03)00343-1 Chen, F., Tan, Y. F., Li, H. L., Qin, Z. M., Cai, H. D., Lai, W. Y., … Zhang, J. Q.(2015). Differential systemic exposure to galangin after oral and intravenous administration to rats. Chemistry Central Journal, 9(1), 1–10. https://doi.org/10.1186/s13065-015-0092-5 Correa, M. S., Fetzer, D. L., Hamerski, F., Corazza, M. L., Scheer, A. P. Ve Ribani, R. H.(2021). Pressurized extraction of high-quality blackberry (Rubus spp. Xavante cultivar) seed oils. Journal of Supercritical Fluids, 169, 105101. https://doi.org/10.1016/j.supflu.2020.105101 Çağlar, M. Y. ve Demirci, M.(2017). Phenolic compounds in berry fruits and their importance in nutrition. European Journal of Science and Technology, 7(11), 18– 26. de Melo, R. G., de Andrade, A. F., Bezerra, R. P., Viana Marques, D. de A., da Silva, V. A., Paz, S. T., de Lima Filho, J. L., Porto, A. L. F.2019. Hydrogel-based Chlorella vulgaris extracts: a new topical formulation for wound healing treatment. 75 Journal of Applied Phycology, 31(6), 3653–3663. https://doi.org/10.1007/s10811- 019-01837-2 Desiderio, C., Ossicini, L. ve Fanali, S. (2000). Analysis of hydroquinone and some of its ethers by using capillary electrochromatography. Journal of Chromatography A, 887(1–2), 489–496. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(99)01197-8 Ding, P., Yang, L., Feng, C. ve Xian, J.(2019). Research and application of Alpinia officinarum in medicinal field. Chinese Herbal Medicines, 11(2), 132–140. https://doi.org/10.1016/j.chmed.2019.04.003 Doğrusoy, Ş. (2018).Aljinat/KappaKerajinHidrojel Sistemlerinden TimololMaleatınSalımının İncelenmesi (Yüksek lisans tezi). Yıldız TekniikÜniversitesi/Fen bilimleri enstitüsü/Kimya mühendisliği/İstanbul. Erişim adresi: https://tez.yok.gov.tr/UlusalTezMerkezi/tezSorguSonucYeni.jsp Dorgham, N. A., Hegazy, R. A., Sharobim, A. K. ve Dorgham, D. A.(2020). Efficacy and tolerability of chemical peeling as a single agent for melasma in dark-skinned patients: A systematic review and meta-analysis of comparative trials. Journal of Cosmetic Dermatology, 19(11), 2812–2819. https://doi.org/10.1111/jocd.13725 Ekmen, M. (2019).İzolösin Türevi Tetraamit Bileşiklerinin Jelleşme Özelliklerinin İncelenmesi. (Yüksek lisans tezi) Batman Üniversitesi/Fen bilimleri enstitüsü/Batman Erişim adresi: https://hdl.handle.net/20.500.12402/2334 Ermiş, S. (2007).Terbinafinin Yarı Katı İlaç Şekilleri Üzerinde Çalışmalar (Yüksek lisans tezi) Gazi üniversitesi/Sağlık bilimleri enstitüsü/Ankara. Erişim adresi: https://tez.yok.gov.tr/UlusalTezMerkezi/tezSorguSonucYeni.jsp Fard, M. A. ve Shojaii, A. (2013). Efficacy of Iranian traditional medicine in the treatment of epilepsy. BioMed Research International, 2013. https://doi.org/10.1155/2013/692751 Fleurentin, J. ve Pelt, J. M. (1982). Repertory of drugs and medicinal plants of Yemen. Journal of Ethnopharmacology, 6(1), 85–108. https://doi.org/10.1016/0378- 8741(82)90073-3 Final Report of the Safety Assessment of Niacinamide and Niacin, (2005). International journal of toxicology, 24, 1–31. https://doi.org/10.1080/10915810500434183 Gao, J., Yang, H. ve Li, B.(2016). Investigating the Roles of Dissolved Organic Matter on Arsenic Mobilization and Speciation in Environmental Water. Clean - Soil, Air, Water, 44(7), 818–828. https://doi.org/10.1002/clen.201500610 Garcia Bartels, N., Lünnemann, L., Stroux, A., Kottner, J., Serrano, J. ve Blume- Peytavi, U.(2014). Effect of diaper cream and wet wipes on skin barrier properties in infants: A prospective randomized controlled trial. Pediatric Dermatology, 31(6), 683–691. https://doi.org/10.1111/pde.12370 Ghadishah, D. ve Gorchynski, J. (2002). Airway Compromise After Routine Alpha- Hydroxy Facial Peel Administration: The Journal of Emergency Medicine, Vol. 22(4), 353–355. https://doi.org/10.1016/S0731-7085(03)00343-1 Gouveia, L. ve Empis, J. (2003). Relative stabilities of microalgal carotenoids in 76 microalgal extracts, biomass and fish feed: Effect of storage conditions. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 4(2), 227–233. https://doi.org/10.1016/S1466-8564(03)00002-X Güneş, M. E., Şahin, S., Demir, C., Borum, E. ve Tosunoğlu, A.(2016). Determination of phenolic compounds profile in chestnut and floral honeys and their antioxidant and antimicrobial activities. Journal of Food Biochemistry, 41(3), 1–12. https://doi.org/10.1111/jfbc.12345 Güzel, Y., Güzelşemme, M. ve Miski, M. (2015). Ethnobotany of medicinal plants used in Antakya: A multicultural district in Hatay Province of Turkey. Journal of Ethnopharmacology, 174, 118–152. https://doi.org/10.1016/j.jep.2015.07.042 Habashy, N. H., Abu Serie, M. M., Attia, W. E. ve Abdelgaleil, S. A. M.(2018). Chemical characterization, antioxidant and anti-inflammatory properties of Greek Thymus vulgaris extracts and their possible synergism with Egyptian Chlorella vulgaris. Journal of Functional Foods, 40(December 2017), 317–328. https://doi.org/10.1016/j.jff.2017.11.022 Hamed, I. (2016). The Evolution and Versatility of Microalgal Biotechnology: A Review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 15(6), 1104– 1123. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12227 Heo, M. Y., Sohn, S. J. ve Au, W. W.(2001). Anti-genotoxicity of galangin as a cancer chemopreventive agent candidate. Mutation Research - Reviews in Mutation Research, 488(2), 135–150. https://doi.org/10.1016/S1383-5742(01)00054-0 Huang, S. C., Lin, C. C., Huang, M. C. ve Wen, K. C. (2004). Simultaneous determination of magnesium ascorbyl phosphate, ascorbyl glucoside, kojic acid, arbutin and hydroquinone in skin whitening cosmetics by HPLC. Journal of Food and Drug Analysis, 12(1), 13–18. https://doi.org/10.38212/2224-6614.2660 Hui, X., Wu, G., Han, D., Gong, X., Stipkovits, L., Wu, X., … Brennan, C. S.(2021). Bioactive compounds from blueberry and blackcurrant powder alter the physicochemical and hypoglycaemic properties of oat bran paste. Lwt, 143(September 2020), 111167. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2021.111167 Imamura, Y., Migita, T., Uriu, Y., Otagiri, M. ve Okawara, T.(2000). Inhibitory effects of flavonoids on rabbit heart carbonyl reductase. Journal of Biochemistry, 127(4), 653–658. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a022653 Indrayah, A. K., Agrawal, P., Rathi, A. K., Shatru, A., Agrawal, N. K. ve Tyagi, D. K.(2009). Nutritive value of some indigenous plant rhizomes resembling Ginger. Natural Product Radiance, 8(5), 507–513. Jamila, F. ve Mostafa, E. (2014). Ethnobotanical survey of medicinal plants used by people in Oriental Morocco to manage various ailments. Journal of Ethnopharmacology, 154(1), 76–87. https://doi.org/10.1016/j.jep.2014.03.016 Janik-Hazuka, M., Szafraniec-Szczęsny, J., Kamiński, K., Odrobińska, J. ve Zapotoczny, S.(2020). Uptake and in vitro anticancer activity of oleic acid delivered in nanocapsules stabilized by amphiphilic derivatives of hyaluronic acid and chitosan. International Journal of Biological Macromolecules, 164, 2000– 77 2009. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.07.288 Joseph, P., Klein-Szanto, A. J. P. ve Jaiswal, A. K. (1998). Hydroquinones cause specific mutations and lead to cellular transformation and in vivo tumorigenesis. British Journal of Cancer, 78(3), 312–320. https://doi.org/10.1038/bjc.1998.492 Juncan, A. M., Rus, L. L., Gligor, F. G. ve Morgovan, C.(2019). Determination of alpha-tocopherol acetate in an anti-aging cosmetic cream by gas chromatography. Revista de Chimie, 70(2), 555–559. https://doi.org/10.37358/rc.19.2.6954 Kabaş , Z. (2006).. İndometasinin, Kalsiyum Klorür İle Çapraz Bağlanmış Sodyum Aljinat ve Poli(vinil alkol) / Sodyum aljinat Mikrokürelerden Kontrollü Salımı. (Yüksek lisans tezi) Gazi üniversitesi/Fen bilimleri enstitüsü/Ankara Erişim adresi: https://tez.yok.gov.tr/UlusalTezMerkezi/tezSorguSonucYeni.jsp Karkar, B., Şahin, S. ve Güneş, M. E. (2020). Evaluation of antioxidant properties and determination of phenolic and carotenoid profiles of chestnut bee pollen collected from Turkey. Journal of Apicultural Research, 0(0), 1–10. https://doi.org/10.1080/00218839.2020.1844462 Kim, T., Kim, H. J., Cho, S. K., Kang, W. Y., Baek, H., Jeon, H. Y., … Kim, D.(2011). Nelumbo nucifera extracts as whitening and anti-wrinkle cosmetic agent. Korean Journal of Chemical Engineering, 28(2), 424–427. https://doi.org/10.1007/s11814- 010-0357-6 Koluman, N. M. A. ve Süzgeç-Selçuk, S. (2016). Eczaneler’de Fitokozmetikler. Marmara Pharmaceutical Journal, 20(1), 7–20. https://doi.org/10.12991/mpj.201620774965 Köse, L. P., Gülçin, I., Gören, A. C., Namiesnik, J., Martinez-Ayala, A. L., Gorinstein, S.(2015). LC-MS/MS analysis, antioxidant and anticholinergic properties of galanga (Alpinia officinarum Hance) rhizomes. Industrial Crops and Products, 74, 712–721. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2015.05.034 Law, F., Evans, L. A., Knudtson, S., Nus,J., Scholl, S., K. ve Sluka, K. A.(2008). Massage Reduces Pain Perception and Hyperalgesia in Experimental Muscle Pain: A Randomized, Controlled Trial. Journal of Pain, 9(8), 714–721. https://doi.org/10.1016/j.jpain.2008.03.009 Lim, T. K. (2015). Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants (Vol. 10). https://doi.org/10.1007/978-94-017-7276-1 Lin, C. H., Wu, H. L. ve Huang, Y. L. (2005). Microdialysis sampling coupled to on- line high-performance liquid chromatography for determination of arbutin in whitening cosmetics. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 829(1–2), 149–152. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2005.10.008 Lin, L. Y., Peng, C. C., Yeh, X. Y., Huang, B. Y., Wang, H. E., Chen, K. C. ve Peng, R. Y.(2015). Antihyperlipidemic bioactivity of Alpinia officinarum (Hance) Farw Zingiberaceae can be attributed to the coexistance of curcumin, polyphenolics, dietary fibers and phytosterols. Food and Function, 6(5), 1600–1610. https://doi.org/10.1039/c4fo00901k 78 Ly, T. N., Yamauchi, R., Shimoyamada, M. ve Kato, K.(2002). Isolation and structural elucidation of some glycosides from the rhizomes of smaller galanga (Alpinia officinarum Hance). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(17), 4919– 4924. https://doi.org/10.1021/jf025529p Ly, T. N., Shimoyamada, M., Kato, K. ve Yamauchi, R.(2003). Isolation and characterization of some antioxidative compounds from the rhizomes of smaller galanga (Alpinia officinarum Hance). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(17), 4924–4929. https://doi.org/10.1021/jf034295m Mak, K. K., Tan, J. J., Marappan, P., Balijepalli, M. K., Choudhury, H., Ramamurthy, S. ve Pichika, M. R.(2018). Galangin’s potential as a functional food ingredient. Journal of Functional Foods, 46(March), 490–503. https://doi.org/10.1016/j.jff.2018.04.054 Mayachiew, P. ve Devahastin, S.(2008). Antimicrobial and antioxidant activities of Indian gooseberry and galangal extracts. LWT - Food Science and Technology, 41(7), 1153–1159. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2007.07.019 May, N. ve Guenther, E.(2020). Shared benefit by Material Flow Cost Accounting in the food supply chain – The case of berry pomace as upcycled by-product of a black currant juice production. Journal of Cleaner Production, 245(1), 118946. https://doi.org/10.1016/j.jclepro.2019.118946 Metin, C. ve Baygar, T. (2018). Denizel Kaynaklardan Elde Edilen Biyoaktif Maddeler ve Kozmetik Alanında Kullanımı. Süleyman Demirel Üniversitesi Eğirdir Su Ürünleri Fakültesi Dergisi, 14(4), 339–350. https://doi.org/10.22392/egirdir.399363 Nakagawa, M., Kawai, K. ve Kawai, K. (1995). Contact allergy to kojic acid in skin care products. Contact Dermatitis, , 9–13. https://doi.org/10.1111/j.1600- 0536.1995.tb00832.x Nasir, N. T. B. M, Sahin, S. ve Çakmak, Z. E. ve Çakmak, T.(2017). Optimization of ultrasonic-assisted extraction via multiresponse surface for high antioxidant recovery from Chlorella vulgaris (Chlorophyta). Phycologia, 56(5), 561–569. https://doi.org/10.2216/16-132.1 Nordqvist, C. B., ve Mehr K. (1977). Allergic Contact Dermatitis to Retinoic Acid. Concat Dermatitis, 3(1), 55-56. https://doi.org/10.1111/j.1600- 0536.1977.tb03594.x Oh, Y. S., Shin, S. Y., Kim, S., Lee, K. H., Shin, J. C. ve Park, K. M.(2020). Comparison of antiaging, anti-melanogenesis effects, and active components of Raspberry (Rubus occidentalis L.) extracts according to maturity. Journal of Food Biochemistry, 44(11), 1–10. https://doi.org/10.1111/jfbc.13464 Otake, Y., Hsieh, F. ve Walle, T.(2002). Glucuronidation versus oxidation of the flavonoid galangin by human liver microsomes and hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition, 30(5), 576–581. https://doi.org/10.1124/dmd.30.5.576 Pegoraro, N. S., Barbieri, A. V., Camponogara, C., Mattiazzi, J., Brum, E. S., Marchiori, M. C. L., … Cruz, L.(2017). Nanoencapsulation of coenzyme Q10 and 79 vitamin E acetate protects against UVB radiation-induced skin injury in mice. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 150, 32–40. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2016.11.013 Pei, S. J. (1985). Preliminary study of ethnobotany in xishuang banna, people’s republic of china. Journal of Ethnopharmacology, 13(2), 121–137. https://doi.org/10.1016/0378-8741(85)90001-7 Petrangolini, G., Ronchi, M., Frattini, E., De Combarieu, E., Allegrini, P. ve Riva, A.(2019). A New Food-grade Coenzyme Q10 Formulation Improves Bioavailability: Single and Repeated Pharmacokinetic Studies in Healthy Volunteers. Current Drug Delivery, 16(8), 759–767. https://doi.org/10.2174/1567201816666190902123147 Piamphongsant, T. (1998). Treatment of melasma: A review with personal experience. International Journal of Dermatology, 37(12), 897–903. https://doi.org/10.1046/j.1365-4362.1998.00585.x Rana, V. S., Verdeguer, M. ve Blazquez, M. A.(2010). GC and GC/MS Analysis of the Volatile Constituents of the Oils of Alpinia galanga (L.) Willd and A. Officinarum Hance Rhizomes. Journal of Essential Oil Research, 22(6), 521–524. https://doi.org/10.1080/10412905.2010.9700388 Rao, A. V. ve Rao, L. G. (2007). Carotenoids and human health. Pharmacological Research, 55(3), 207–216. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2007.01.012 Re. R., Pellegrini, N., Proteggente. A., Pannala, A., Yang, M. ve Evans, R. C. (1999). Antioxidant Activity Applying An Improved Abts Radical Cation Decolorization Assay, 26, 1231-1237. https://doi.org/10.1016/S0891-5849(98)00315-3 Rezaei, A., Farzadfard, A., Amirahmadi, A., Alemi, M. ve Khademi, M. (2015). Diabetes mellitus and its management with medicinal plants: A perspective based on Iranian research. Journal of Ethnopharmacology, 175, 567–616. https://doi.org/10.1016/j.jep.2015.08.010 Salgado, B., Paramo, R. ve Sumano, H. (2007). Successful treatment of canine open cervix-pyometra with Yun-Nan-Pai-Yao, a Chinese herbal preparation. Veterinary Research Communications, 31(4), 405–412. https://doi.org/10.1007/s11259-006- 3438-6 Salvador, A. ve Chisvert, A. (2007). Analysis of Cosmetic Products. Erişim adresi: https://books.google.com.tr/books?hl=tr&lr=&id=IYf8FDXlD5oC&oi=fnd&pg=P P1&dq=coscosmetic+general+information&ots=wlJckrep K&sig=Vxk4VJeKDjkBvZDOK9XRqtVFbPQ&redir_esc=y#v=onepage&q=cosm etic%20general%20information&f=false Sawamura, R., Shimizu, T., Sun, Y., Yasukawa, K., Miura, M., Toriyama, M., … Kurokawa, M.(2010). In vitro and in vivo anti-influenza virus activity of diarylheptanoids isolated from Alpinia officinarum. Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 21(1), 33–41. https://doi.org/10.3851/IMP1676 Sawamura, R., Sun, Y., Yasukawa, K., Shimizu, T., Watanabe, W. ve Kurokawa, M.(2010). Antiviral activities of diarylheptanoids against influenza virus in vitro. 80 Journal of Natural Medicines, 64(1), 117–120. https://doi.org/10.1007/s11418-009- 0372-2 Schiavon, D., Martini D. N., Brocco, G., Santos, J. S., Anzolin, A. P., Grazziotin, L., … Bertol, D. C. (2019). Multifunctional Cosmetic Containing Blueberry and Tinosorb M-Loaded Microparticles Improves Sunscreen Performance, 9(2), 241-248. doi: 10.15171/apb.2019.027 Shahidi, F. ve Ambigaipalan, P.(2015). Phenolics and polyphenolics in foods, beverages and spices: Antioxidant activity and health effects - A review. Journal of Functional Foods, 18, 820–897. https://doi.org/10.1016/j.jff.2015.06.018 Shapiro, Y. E.(2011). Structure and dynamics of hydrogels and organogels: An NMR spectroscopy approach. Progress in Polymer Science (Oxford), 36(9), 1184–1253. https://doi.org/10.1016/j.progpolymsci.2011.04.002 Sharma, H. K., Chhangte, L. ve Dolui, A. K. (2001). Traditional medicinal plants in Mizoram, India. Fitoterapia, 72(2), 146–161. https://doi.org/10.1016/S0367- 326X(00)00278-1 Shih, Y. (2001). Simultaneous Determination of Magnesium L-Ascorbyl-2-Phosphate and Kojic Acid in Cosmetic Bleaching Products by Using a Microbore Column and Ion-Pair Liquid Chromatography. Journal of AOAC International 84(4), 1045- 1049. https://doi.org/10.1093/jaoac/84.4.1045 Shih, Y. ve Zen, J. M. (1999). Determination of magnesium ascorbyl phosphate in cosmetic bleaching products using a disposable screen-printed carbon electrode. Journal of the Chinese Chemical Society, 46(6), 865–870. https://doi.org/10.1002/jccs.199900117 Shih, Y. ve Zen, J. M. (2000). An Electrochemical Sensor Based On a Clay-Coated Screen-Printed Electrode For The Determination Of Arbutin.Analytica Chimica Acta, 412(1-2), 63-68. https://doi.org/10.1016/S0003-2670(00)00725-X Shin, D., Kinoshita, K., Koyama, K. ve Takahashi, K.(2002). Antiemetic principles of Alpinia officinarum. Journal of Natural Products, 65(9), 1315–1318. https://doi.org/10.1021/np020099i Skrede, G., Wrolstad, R. E. ve Durst, R. W.(2000). Changes in anthocyanins and polyphenolics during juice processing of highbush blueberries (Vaccinium corymbosum L.). Journal of Food Science, 65(2), 357–364. https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2000.tb16007.x Sop, E. S. (2013). Doku Genişletme Amaçlı Hidrojel Sentezi, Karakterizasyonu ve Şişme Kinetiği (Yüksek lisans tezi). Hacettepe Üniversitesi/Kimya mühendisliği/Ankara Erişim adresi: http://www.openaccess.hacettepe.edu.tr:8080/xmlui/handle/11655/2808 Soto, M. L., Falqué, E. ve Domínguez, H.(2015). Relevance of natural phenolics from grape and derivative products in the formulation of cosmetics. Cosmetics, 2(3), 259–276. https://doi.org/10.3390/cosmetics2030259 Sottofattori, E., Anzaldi, M., Balbi, A. ve Tonello, G. (1998). Simultaneous HPLC determination of multiple components in a commercial cosmetic cream. Journal of 81 Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 18(1–2), 213–217. https://doi.org/10.1016/S0731-7085(98)00173-3 Srividya, A. R., Dhanabal, S. P., Misra, V. K. ve Suja, G.(2010). Antioxidant and antimicrobial activity of Alpinia officinarum. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 72(1), 145–148. https://doi.org/10.4103/0250-474X.62233 Sungur A. S., Şahne, S. B., Yeğenoğlu, S.2018. Kozmetik ürünlerı̇ tarı̇hçesı̇, ürün tanitimlarinin yasal durumu ve tüketı̇cı̇ davranişi açisindan değerlendı̇rı̇lmesı̇. Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Lokman Hekim Tıp Tarihi ve Folklorik Tıp Dergisi, 8(3), 191–197. https://doi.org/10.31020/mutftd.432259 Şahin, S., Işik, E., Aybastier, Ö. ve Demir, C. (2012). Orthogonal signal correction- based prediction of total antioxidant activity using partial least squares regression from chromatograms. Journal of Chemometrics, 26(7), 390–399. https://doi.org/10.1002/cem.2450 Şahin, S., Nasir, N. T. B. M., Erken, I., Çakmak, Z. E. ve Çakmak, T.(2019). Antioxidant composite films with chitosan and carotenoid extract from Chlorella vulgaris: Optimization of ultrasonic-assisted extraction of carotenoids and surface characterization of chitosan films. Materials Research Express, 6(9). https://doi.org/10.1088/2053-1591/ab2def Taofiq, O., Heleno, S. A., Calhelha, R. C., Alves, M. J., Barros, L., Barreiro, M. F., … Ferreira, I. C. F. R.(2016). Development of Mushroom-Based cosmeceutical formulations with Anti-Inflammatory, Anti-Tyrosinase, antioxidant, and antibacterial properties. Molecules, 21(10), 1–12. https://doi.org/10.3390/molecules21101372 Tocco, G., Fais, A., Meli, G., Begala, M., Podda, G., Fadda, M. B., … Berretta, S.(2009). PEG-immobilization of cardol and soluble polymer-supported synthesis of some cardol-coumarin derivatives: Preliminary evaluation of their inhibitory activity on mushroom tyrosinase. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 19(1), 36–39. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2008.11.020 Tolomeo, M., Grimaudo, S., Di Cristina, A., Pipitone, R. M., Dusonchet, L., Meli, M., … Simoni, D.(2008). Galangin increases the cytotoxic activity of imatinib mesylate in imatinib-sensitive and imatinib-resistant Bcr-Abl expressing leukemia cells. Cancer Letters, 265(2), 289–297. https://doi.org/10.1016/j.canlet.2008.02.025 Torbati, T. V. ve Javanbakht, V.(2020). Fabrication of TiO2/Zn2TiO4/Ag nanocomposite for synergic effects of UV radiation protection and antibacterial activity in sunscreen. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 187(November 2019), 110652. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2019.110652 Torreao, P., Phua, E., Clark, R., Fernandes, E., Pontes, T., Fonseca, A. P., … Kerob, D.(2021). Evaluation of the efficacy and tolerance of a cosmetic mask containing 89% of vichy volcanic mineralizing water and hyaluronic acid after facial laser procedures. Journal of Cosmetic Dermatology, (December 2020), 1–7. https://doi.org/10.1111/jocd.13972 Ulusoy, A. ve Dikmen, N.(2020). Hidrojellerin Tıpta Uygulamaları. Arşiv Kaynak Tarama Dergisi, 29(2), 129–137. https://doi.org/10.17827/aktd.603432 82 Yeum, K. J. ve Russell, R. M. (2002). Carotenoid bioavailability and bioconversion. Annual Review of Nutrition, 22, 483–504. https://doi.org/10.1146/annurev.nutr.22.010402.102834 Yılmaz, A. (2019). Chlorella protothecoides Mikroalg Yağının Karakterizasyonu, Biyoaktif Özellikleri ve Antifungal Etkinliği. Akademik Gıda, 17(2), 217–225. https://doi.org/10.24323/akademik-gida.613575 Wang, H. M. D., Chen, C. C., Huynh, P. ve Chang, J. S. (2015). Exploring the potential of using algae in cosmetics. Bioresource Technology, 184, 355–362. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2014.12.001 Waniek, S., Di Giuseppe, R., Esatbeyoglu, T., Plachta-Danielzik, S., Ratjen, I., Jacobs, G., … Lieb, W.(2018). Vitamin E (α-and γ-tocopherol) levels in the community: Distribution, clinical and biochemical correlates, and association with dietary patterns. Nutrients, 10(1). https://doi.org/10.3390/nu10010003 Wu, T., Yang, L., Guo, X., Zhang, M., Liu, R. ve Sui, W.(2018). Raspberry anthocyanin consumption prevents diet-induced obesity by alleviating oxidative stress and modulating hepatic lipid metabolism. Food and Function, 9(4), 2112–2120. https://doi.org/10.1039/c7fo02061a Zerbinati, N., Sommatis, S., Maccario, C., Di Francesco, S., Capillo, M. C., Rauso, R., … Mocchi, R.(2021). The anti-ageing and whitening potential of a cosmetic serum containing 3-o-ethyl-l-ascorbic acid. Life, 11(5). https://doi.org/10.3390/life11050406 Zhang, L., Pan, C., Ou, Z., Liang, X., Shi, Y., Chi, L., … Xiang, H.(2020). Chemical profiling and bioactivity of essential oils from Alpinia officinarum Hance from ten localities in China. Industrial Crops and Products, 153(May), 112583. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2020.112583 Zhang, M. Q. ve Rees, D. C. (1999). A review of recent applications of cyclodextrins for drug discovery. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 9(12), 1697–1717. https://doi.org/10.1517/13543776.9.12.1697 Zhang, W., Tang, B., Huang, Q. ve Hua, Z.(2013). Galangin inhibits tumor growth and metastasis of B16F10 melanoma. Journal of Cellular Biochemistry, 114(1), 152– 161. https://doi.org/10.1002/jcb.24312 Zhu, H. ve Kannan, K.(2020). Parabens in stretch mark creams: A source of exposure in pregnant and lactating women. Science of the Total Environment, 744, 141016. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.141016 83 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı :Eftal Alp DORKEN Doğum Yeri ve Tarihi :Bursa / 02.08.1991 Yabancı Dil :İngilizce Eğitim Durumu Lise :Mimar Sinan Endüstri Meslek Lisesi (Açık öğretim) Lisans :Uludağ Üniversitesi Fen/Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Yüksek Lisans :Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı Çalıştığı Kurum/Kurumlar :Ogannaturel Bitkisel Sağlik Ürünleri Gıda Kozmetik Hayvancılık Kimyevi Mitis Kimya Sanayi ve Ticaret Anonim Şirketi İletişim (e-posta) :eftalalpdorken@gmail.com Yayınları :Dorken, E. A. ve Şahin S. (2021). Galangin İçeren Kozmetik Hedefli Ürünün Antioksidan Özelliklerinin Araştırılması. 33.Ulusal Kimya Kongresi Bildiri Özetleri Kitabı, 7-9 Ekim 2021, sf. 203. Şahin, S., Aybastıer, Ö. ve Dorken, E. A. (2021). Galangin İçeren Yeni Bir Hidrojel TPE (Başvuru numarası: 2021/015961) 84