Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 32 (3) 77-81, 2006 ORİJİNAL YAZI Streptozotosinle Oluşturulan Diabetin Sıçan Periferik Sinirleri Üzerine Etkisinin: Elektron Mikroskobik İncelenmesi Gülten KARABAY*, Ragıba ZAĞYAPAN**, Gülnur TAKE*** * Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Ankara. ** Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Anatomi Anabilim Dalı, Ankara. *** Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Ankara. ÖZET Bu çalışmada sıçanlarda streptozotosinle (STZ) oluşturulan diabetin akut etkisinin periferik sinir üzerinde oluşturduğu yapısal değişiklik- ler elektron mikroskop düzeyinde incelenmiştir. Çalışmada denekler, 24 erkek Wistar albino sıçan, kontrol grubu, Sham grubu, 15 ve 30 günlük diabet grubu olacak şekilde dört grup olarak ayrılmıştır. Kontrol grubuna hiçbir şey uygulanmazken, Sham grubuna STZ’nin çözündüğü sodyumsitrat, diabetik gruba ise sodyumsitrat içinde çözünmüş 45mg/kg STZ uygulanmıştır. Enjeksiyonu takiben 15 ve 30. günlerde sıçanlar yüksek doz anestezi altında sakrifiye edildi ve siyatik sinirlerinin medial bölgeleri çıkarılarak rutin elektron mikroskop takibine alındı. Doku kesitleri incelendiğinde hem 15 hem de 30 günlük diabetik grupta perinöryum ile sinir lifleri arasında belirgin bir açıklık meydana gelmiş ve miyelinli sinir liflerinde miyelin kılıf dejenerasyonları 30 günlük grupta daha belirgin bulunmuştur. Buna karşın, Schwann hücreleri ve miyelinsiz sinir lifleri normal yapıda gözlenmiştir. Sonuç olarak bu çalışmada sıçanlarda STZ ile oluşturulan diabet, n.ischiadicus’ta dejeneratanif değişiklikler oluşturmuş ve bu değişiklikler 30 günlük grupta daha belirgin bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Streptozotosin. Diabet. Periferik sinir. Elektron mikroskop. An Ultrastructural Study of Effects of Streptozotocin Induced Diabetes on Rats Peripheral Nerves ABSTRACT In this study, structural changes caused by acute effects of STZ induced diabetes on peripheral nerves were investigated with electron microscope. Twenty four male Wistar Albino rats were divided into 4 groups: control, sham, 15 days and 30 days diabetic groups. Nothing applied to control group; sodium citrate, as STZ solvent, to Sham group and 45 mg/kg STZ solved in sodium citrate to diabetic group. 15 and 30 days after injections, rats were sacrified under high dose anesthesia, and sciatic nerves were extracted for electron microscopic examination. A evident gap between perineurium and nerve fibres were observed in both 15 and 30 days diabetic groups. And in 30 days group, myelin sheath degenerations were more obvious in myelinated nerve fibres. On the other hand, Schwann cells and unmyelinated nerve fibres appeared normal. Consequently, STZ induced diabetes were seen to cause degenerative changes in n. ischiadicus and those changes were more evident in 30 days diabetic group. Key Words: Streptozotocin. Diabetes. Peripheral nerves. Ultrastructure. İnsülin bağımlı diabetes mellitus (DM), nöropati gibi azalma bulunmuştur5,6,7,8,9. Sharma ve ark.10 diabetik uzun süreli sekonder komplikasyonlara neden olan hayvanları kontrol ile kıyasladıklarında miyelinli lif kronik metabolik bir hastalıktır. Diabetik nöropatinin boyutlarının artışının yavaş bir oranda olduğunu nedeninin genellikle hiperglisemi ile birlikte olduğu göstermiştir. Bunun diabetin metabolik etkilerine d üşünülür1. Diabetik durum hem insanlarda hem sekonder bir zarar olduğu öne sürülmüştür11. dGeenlieşy T ahra 2,3 ihyi:v 1a0n.0la8r.ı2n0d0a6 oksidatif stres ile birliktedir . Streptozotosinle diabet oluşturulmuş sıçanlarda AKarbtmulı Tş aorikhis: i2d6a.t1if2 .2s0tr0e6s olasılıkla diabetik komplikas- periferik duyu siniri anormallikleri kantitatif olarak y onların gelişmesinde pathogenetik bir faktördü. değerlendirilmiş ve miyelinli sinir liflerinin azalması RDre.a Gkütilfte no kKsAiRjeAnBABaşkent Üniversite stü Y i Tr lıepr Fi a(kRüOlteSsi), nin nöropatiyi içeren ile birlikte aksonal atrofi gösterilmiştir 12. STZ ile dHiiasbtoelotijik v ek oEmbprliiykoalosjyi Aonnalabrilıinm Dpaatlıo genezi için potansi- diabet oluşturularak yapılan çalışmalarda periferik yBealğ lbıcira fKaakmtöpru soul dEusğkuiş edhüirş yüonluü l2m0.e kmte dir4. Bazı yazarlar sinire ait çok sayıda çalışma bulunmasına karşın d0e6n53e0y sEetlim heispgeurtg/ lAisNeKmAiRnAin bazı organlarda ROS üreti- ultrastrüktürüne ait sınırlı sayıda çalışma bulunmuş- mTelFaixn : d0312 234 10 10 / 1573 : 0e3k1i2 234 11y 8ü0k selmeyi gösteren lipit tur. Bu nedenle bu çalışmada STZ ile diabet oluştu- pee-mroakil:s igdkaasrayboanyu@ndbaas akretnışt.ae dyuo.tlr açtığını göstermişlerdir. rulmuş sıçanlarda n.ischiadicusta oluşan değişiklikler Sgutrlteepntkoazroabtoasyi@nlyea h(SooT.cZo)m d iyabet oluşturulmuş sıçanla- elektron mikroskop düzeyinde incelenecektir. rın periferik sinirlerindeki miyelinli lif boyutlarında 77 G. Karabay, ark. Gereç ve Yöntem Bu çalışmada kullanılan Sprague Dawley sıçanlar Başkent Üniversitesi Labaratuar Hayvanları Yetiş- tirme ve Deneysel Araştırma Merkezi’nden elde edildi. Üniversitemizin Araştırma Kurulu ve Hayvan Deneyi Etik Kurulu onayı alındıktan sonra çalışmada, ağırlıkları ortalama 200 gram olan 24 erkek Wistar albino sıçan kullanıldı. Çalışma, 1.grup kontrol grubu (n=6), 2.grup Sham grubu (n=6) ve 3.grup STZ ile diabet oluşturulacak 15 günlük grup (n=6) ve 4.grup STZ ile diabet oluşturulacak 30 günlük grup (n=6) olacak şekilde dört grup olarak planlandı. Kontrol grubuna hiçbir şey uygulanmazken, Sham grubuna STZ’nin çözündüğü sodyumsitrat, diabetik gruba ise sodyumsitrat içinde (ph:4,5) çözünmüş 45mg/kg STZ, 35 mg/kg sodyum pentotal anestezi altında kuyruk venlerinden uygulandı. Enjeksiyon işlemi öncesi ve sonrasında tüm denekler serbest diyet ve su ile bes- lendi. Deneklerin bir ay süresince her hafta aynı saatte ağırlık ve kan şekerleri ölçüldü. Enjeksiyonu Şekil 1: takiben 15 ve 30. günlerde sıçanlar yüksek doz anes- 15 Gün kontrol grubu; normal yapıda olan miyelinli tezi altında sakrifiye edildi. Siyatik sinirlerinin (ML) ve miyelinsiz (SL) sinir lifleri X 2156. medial bölgeleri çıkarılarak %2,5’luk fosfat tampon- lu gluteraldehitte tespit edildi. Daha sonra %1’lik osmium tetraoksitte postfiksasyon yapıldıktan sonra dereceli alkol serilerinden geçirilerek dehidrate edildi. Dokular propilen oksitten geçirildikten sonra Araldit CY212, DDSA (2-dodecenyl succinic anhydride), BDMA (benzyldimethyl amin) ve dibutilat karışımı- na gömülerek bloklandılar. Bloklardan alınan yarı ince kesitler toluidin blue ile boyanarak uygun alan seçildi. Alınan ince kesitler kurşun sitrat-uranil asetat ile boyandıktan sonra tek bir araştırmacı tarafından 906E TEM’da incelendi. Bulgular ve Sonuçlar Bu çalışmada 15 ve 30 günlük diabetin periferik sinire etkisi elektron mikroskop düzeyinde incelendi. 15 günlük kontrol grubunda; perinöryum, endonöryum, miyelinli ve miyelinsiz sinir lifleri ve Schwann hücreleri normal yapıda izlendi. (Şekil 1-2) 15 günlük Sham grubu ise kontrol grubuna benzer bir görünümde izlendi. Şekil 2: 15 günlük diabetik grupta bulunan deneklerde gözle- 15 Gün kontrol grubu; normal yapıda nen değişiklikler şu şekildeydi; Perinöryum ile sinir perinöryumun (P) X 4646. lifleri arasında belirgin bir açıklık meydana gelmiş (Şekil 3) ve miyelinli sinir liflerinin miyelin kılıfla- rında dejenerasyonlar oluşmuştu. Buna karşın akson- 30 günlük kontrol grubu normal yapıda gözlenirken, ların normal yapıda olduğu gözlendi. Bazı alanlarda Sham grubu benzer görünümde izlendi. 30 günlük endonöryumda belirgin açılmalar bulunurken (Şekil diabet grubunda bulunan deneklerde, bazı alanlarda 4). Schwann hücreleri ve miyelinsiz sinir lifleri nor- perinöryum ile sinir liflerinde belirgin bir açıklık mal yapıda gözlendi. Ayrıca endonöral kapillerlerde meydana gelirken bazı alanlarda perinöryum, sinir yapısal bir değişiklik saptanmadı. liflerine yakın ancak son derece incelmiş olarak gö- 78 Streptozotosinle Diabetin Sıçan Periferik Sinirleri Üzerine Etkisi rüldü (Şekil 5-6). Miyelinli sinir tellerinde bulunan bazı aksonlarda çekilmeler olduğu dikkati çekerken (Şekil 7) miyelin kılıflarda oluşan dejenerasyonlar 15 günlük gruba göre daha belirgin bulundu. Miyelin kılıflar lif lif ayrılmış ve lifler arasında boşluklar oluşmuştu. Ayrıca miyelin kılıfın akson içine doğru parmak şeklinde çıkıntı oluşturması da belirgin deje- nerasyon değişikliklerindendi (Şekil 8). Çalışmamız- da bu grupta da endonöral kapillerlerde bir değişiklik saptanmadı. Şekil 5: 30 Gün diabet grubu; perinöryum (P) ile sinir lifleri arasındaki açıklık (A) 15 günlük gruptan daha fazla X 1670. Şekil 3: 15 Gün diabet grubu; perinöryum (P) ile sinir lifleri arasında büyük bir açıklık (A) bulunmakta X 2156. Şekil 6: 30 Gün diabet grubu; perinöryum (P) bazı alanlarda son derece incelmiş ve lif lif ayrılmış durumda X 1670. Şekil 4: Şekil 7: 15 Gün diabet grubu; miyelinli sinir liflerinin miyelin 30 Gün diabet grubu; miyelinli sinir liflerinin miyelin kılıflarında bazı dejeneratif değişiklikler (DM) kılıflarında birçok dejenesıçanif değişiklikler (DM) bulunmakla birlikte aksonlar (a) normal yapıda bulunmakla birlikte bazı aksonlarda da çekilmeler X 1293. bulunmakta (ok) X 10000. 79 G. Karabay, ark. miyelin biyosentezinde gerekli olan lipoprotein lipaz varlığı akut dönem diabet ve kontrol grupları ile karşılaştırıldığında diabet sonrası 2. günde lipoprotein lipazın azaldığını 35 gün sonra da azal- manın devam ettiğini bildirmişlerdir. 35 gün sonunda 4 gün boyunca uygulanan insülinin lipoprotein lipazın oranını kontrole yakın değere ulaştırdığı gös- terilmiştir. Sonuç olarak diabette oluşan miyelin kılıf kaybının lipoprotein lipaz düzeyindeki azalmayla ilişkili olabileceği vurgulanmıştır22. Bizim çalışma- mızda da miyelin kılıf dejenerasyonları 15 günlük diabetik grupta görülmüş ancak 30 günlük diabetli grupta daha belirginleşmiştir. Bu grupta miyelin kılıftaki ayrılmalar ve aksona doğru parmak şeklinde yapmış olduğu çıkıntılar dikkat çekici bulunmuştur. Nöropatili diabetik hastaların endonöral kapillerinde bazal membran kalınlaşması, endotel hücre hipertrofisi, hiperplazisi ve perisit dejenerasyonu bildirilmiştir23. Bizim çalışmamızda 15 ve 30 günlük diabetik grupta endonöral kapiller kesitlerinde deği- şiklik görülmemiş ve bunun diabetik süresinin kısa Şekil 8: olması ile bağlantılı olduğu düşünülmüştür. Diabetik 30 Gün diabet grubu; miyelin kılıfın akson içine sıçanlarda yapılan çalışmalarda kapiller bazal parmak şeklinde oluşturduğu çıkıntı bu grubun membran alanında artış olmadığı öne sürülmüştür17. belirgin dejenesıçanif (yıldız) değişikliklerden X 4646. Bizim çalışmamızda da endonöral kapiller bazal membranında kalınlaşma saptanmamıştır. Yapılan birkaç çalışmada bu bulguların aksine kapillerin Tartışma lüminal alanında belirgin artış ve endotel hücre bo- yutlarında azalma olduğu bildirilmiş ve bunun kan STZ ile diabet oluşturma sıçanlarda deneysel diabetik akımının artması ile orantılı olabileceği öne sürül- nöropati için kullanılan en yaygın modeldir ve sinir müştür. Alternatif olarak kan akımının azalmasına ileti hızının, ağrı eşiğinin ve kan akımının azalmasıy- bağlı dilate bir endonöral vasküler yatağı ya da art- la karakterizedir. Bu işlevsel bozuklukların altında mış arteriovenöz şantı da düşündürebileceği bildiril-24,25 yapısal anormallikler olup olmadığı kesin değildir. miştir . STZ diabetik sıçanlarda görülen azalmış Bu nedenle bu çalışmada STZ ile oluşturulan diabetin sinir iletim hızı, sinir kan akımı ve değişmiş ağrı periferik sinire akut etkilerinin yapısal değişiklikleri eşiği olarak adlandırılan üç yaygın fizyolojik anor- incelenmiştir. STZ ile diabet oluşturulan maymunlar- mallikler için yapısal bir temel olmadığı ayrıntılı da13, Çin hamsterlerinde14 db/db farelerde15 ve morfolojik çalışmalarla gösterilmiştir 26,27,28. STZ/alloksan-diabetik köpeklerde16 belirgin işlevsel Sonuç olarak; bu çalışmada STZ ile diabet oluşturu- bozuklukların altında belirgin bir morfolojik bozuk- lan sıçanlarda diabetin akut etkisi sonucu siyatik luk saptanmamıştır17. Ayrıca miyelinli lif yoğunlu- sinirde birtakım yapısal değişiklikler saptanmıştır. ğunda da belirgin bir azalma görülmemiştir. Spontan Diabetin erken dönemlerinde görülen sinir işlev bo- diabetik köpeklerde18 distalde miyelinli lif zukluklarının intrinsik ve akson zarındaki fizyolojik yoğunluğuda bir azalma görülmüş. db/db farelerde15 anormalliklerden kaynaklanabileceği öne sürülmüştür ise akson çapında azalma saptanmıştır. Bizim çalış- 29. Erken dönemde sinir akım hızında görülen anor- mamızda da 30 günlük diabet grubunda bazı akson- mallikler, daha proksimaldeki kan akımının larda çekilmelerin olduğu gözlenmiştir. nörahumoral kontrolündeki değişikliklerden kaynak- Ağrılı nöropatilerde miyelinsiz liflerde anormallikle- lanan işlevsel değişimlere bağlı da olabileceği bildi- rin oluştuğu bildirilmiştir 19,20,21. Buna karşın rilmiştir 30. Schwann hücrelerinde ve miyelinsiz lif akson grupla- rı arasındaki fark kontrole göre anlamlı bulunmamış- tır27. Bizim çalışmamızda da Schwann hücrelerinde Kaynaklar ve miyelinsiz sinir liflerinde değişiklik saptanmamış- tır. STZ ile diabet oluşturulmuş Spraque Dawley 1. Mohseni S, Hildebrand C. Hypoglycaemnic neuropathy in cinsi sıçanlarda periferik sinirde diabete bağlı dejene- BB/W or rats treated with insulin implans: Electron microscopic observations. Acta neuropathol (Berl) 1998; rasyonların patofizyolojik ilişkisi araştırılmıştır. 96:151-56. Fosfolipid sentezinde önemli role sahip, dolayısı ile 8 0 Streptozotosinle Diabetin Sıçan Periferik Sinirleri Üzerine Etkisi 2. Baynes JW. Role of oxidative stres in development of 17. Walker D, Carrington A, Canan C.A, Sawıckı D, Sredy J, complications in diabetes. Diabetes 1991; 40: 405-12. Boulton A.J.M. and Malık, R.A. Structural abnormalities do 3. Nickander K.K, Schmelzer JD, Rohwer DA, Low P.A. Effect not explain the early functional abnormalities in the prepheral of alphatocopherol deficiency on induces of oxidative stres in nerves of the streptozotocin diabetic rat. J. Anat, 1999;95: normal and diabetic peripheral nerve. J Neorol Sci. 1994; 126: 419-27. 6-14. 18. Sharma AK, Malık RA, Dhar P, Mehra RD, Ahmed I, Lowrie 4. Van dam PS, Bravenboer B, Van asbeck BS, Van oırschot CT. Peripheral nerve abnormalities in spontaneously diabetic JFLM, Marx JJM, Gispen WH. Effect of insulin treatment on dog.. İnt J Diabetes 1995; 3: 130-39 endoneurial and systemic oxidative stres in relation to nerve 19. Britland ST, Young RJ, Sharma AK, Clarke BF. Association conduction in streptozotocin-diabetic rats. Eur J Clin İnvest of painful and painless diabetic polyneuropathy with different 1996; 26: 1143-49. patterns of nerve fibre degeneration and regeneration. 5. Sharma AK, Thomas PK, and DeMolina AF. Peripheral nerve Diabetes 1990; 39 :898-908. fibre size in experimental diabetes. Diabetes 1977 ; 26: 689-92. 20. Llewelyn JG, Gilby SG, Thomas PK, Kıng RHM, Muddle JR, 6. Sharma AK, Thomas PK, Gabriel G, Stoliski C, Dockeri P, Watkins PJ. Sural nerve morphometry in diabetic autonomic Hollins GV. Peripheral nerve abnormalities in the diabetic and painful sensory neuropathy. Brain 1990; 114: 867-92. mutant mouse. Diabetes 1983; 32: 1152-61. 21. Malık RA. The pathology of human diabetic neuropathy. 7. Jakobsen J, Lundbeak K. Neuropathy in experimental diabetes. Diabetes 1997; 46: 50-3. An animal model. Br. Med J 1976; 2: 278-79. 22. Ferreira LD, Huey PU, Pulford BE, İshii DN, Eckel RH. 8. Jacobsen J. Axonal dwindling in early experimental diabetes, I. Sciatic nerve hipoprotein lipase is reduced in streptozotocin- A study of cross- sectioned nerves. Diabetologia 1976; 12: induced diabetes and corrected by insulin. Endocrinology 539-46. 2002; 143(4): 1213-7. 9. Jacobsen J. Early and preventable chances of peripheral nerve 23. Giannini C, Dyck PJ. Basement membrane reduplication and structure and function in insulin deficient diabetic rats. J. pericyte degeneration precede development of diabetic Neurol. Neurosurg. Psychiat 1979; 42: 509-18. polyneuropathy anda re associated with its severity. Ann Neurol 1995; 37: 498-504. 10. Sharma AK, Bajada S, Thomas PK. İnfluence of streptozotocin-induced diabetes on myelinated nerve fibre 24. Malik RA, Newrick PG, Sharma AK., Jennings A, Ah-see AK, maturation and on body growth in the rat. Acta Neuropathol. Mayhew TM. Microangiopathy in human diabetic neuropathy: (Berl.) 1981;53:257-65. relationship between capillary abnormalities and the severity of neuropathy. Diabetologia 1989; 32: 92-102. 11. Dockery P, Sharma AK. Ultrastructural abnormalities of miyelinated fibres in the tibial nerve of streptozotocin-diabetic 25. Khara M, Zollman PJ, Smithson IL, Lagerlund TD, Low PA. rats. J Neurol Sci. 1990;98: 327-45. Hypoxic effect of exogenous insulin on normal and diabetic peripheral nerve. Am J Physiol 1994; 266: 980-85. 12. Yagihashi S, Kamijo M, Watanabe K. Reduced myelinated fiber size correlates with loss of axonal neurofilaments in 26. Sharma AK, Thomas PK. Peripheral nerve structure and peripheral nerve of chronically streptozocotin diabetic rats. function in experimental diabetes. J Neurol Sci 1974; 23: 1-15. Am J pathol 1990; 136: 1365-73. 27. Brown MJ, Sumner AJ, Greene DA, Diamond SM., Asbury 13. Chopra JS, Sawhney BB, Chakravorty RN. Pathology and AK. Distal neuropathy in experimental diabetes mellitus. Ann time relationship of peripheral nerve changes in experimental Neurol 1980; 8: 168-78. diabetes. J Neurol Sci 1977; 32: 53-67. 28. Sugimura K, Windebank AJ, Natarajan V, Lambert EH, 14. Kennedy WR, Quick DC, Miyoshi T, Geritsen GC. Peripheral Schmid H, Dyck PJ. Interstitial hyperosmolarity may cause neurology of the diabetic Chinese hamster. Diabetologia 1982; axis cylinder shrinkage in streptozotocin diabetic nerve. J 23: 445-52. Neuropath and Exp Neur 1980; 39: 710-21. 15. Sharma AK, Thomas PK, Gabriel G, Stolinski C, Dockery P, 29. Quasthoff S.: The role of axonal ion conduntances in diabetic Hollins GW. Peripheral nerve abnormalities in the diabetic neuropathy: a review. Muscle & Nerve 1998; 21: 1246-55. mutant Mouse. Diabetes1983:32: 1152-61. 30. Boulton AJM, Malik RA. Diabetic neuropathy. Med Clin N 16. Walker D, Malık RA, Anderson H, Gardiner TA., Boulton Am 1998; 82: 909-29. AJM. The effects of Sulindac on peripheral nerve morphology in the chemically induced diabetic dog. Diabetologia 1997; 40 (suppl.1): A550. 81