BİBERDE TSWV DAYANIMININ YERLİ KAPYA BİBER ÇEŞİTLERİNE MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLER KULLANILARAK AKTARILMASI Onur ÇOBAN T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİBERDE TSWV DAYANIMININ YERLİ KAPYA BİBER ÇEŞİTLERİNE MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLER KULLANILARAK AKTARILMASI Onur ÇOBAN 0000-0003-3282-5325 Prof. Dr. Ahmet İPEK (Danışman) YÜKSEK LİSANS BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI BURSA – 2021 Her Hakkı Saklıdır Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında;  tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi,  görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu,  başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu,  atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi,  kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı,  ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 16/02/2021 Onur ÇOBAN ÖZET Yüksek Lisans Tezi BİBERDE TSWV DAYANIMININ YERLİ KAPYA BİBER ÇEŞİTLERİNE MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLER KULLANILARAK AKTARILMASI Onur ÇOBAN Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Ahmet İPEK Ülkemizde yoğun bir şekilde üretimi ve tüketimi yapılan biber tiplerinin başında kapya biberi gelmektedir. Taze tüketimin yanı sıra, sanayi alanında da çok fazla kullanım alanları bulunmaktadır. Son dönemlerde kapya biber üretimini etkileyen faktörlerin başında tomato spotted wilt virüs (TSWV) hastalığı gelmektedir. TSWV hastalığının kimyasal mücadelesi bulunmamasından dolayı, üretimlerde verim kayıplarına sebep olarak, tarımda büyük ekonomik kayıplara neden olmaktadır. TSWV hastalığı ile en etkin mücadele yöntemlerinin başında, bu hastalığa dayanıklı çeşitlerin kullanılması gelmektedir. Bu çalışmada, yerel kapya biber çeşidine (Ata-16) TSWV ye dayanıklı olduğu bilinen ticari olarak satışı yapılan kapya biber çeşidinden (Nr-07), moleküler markör yöntemleri kullanılarak TSWV dayanıklılık geninin aktarılmasını sağlayarak, üretimde hem ekonomik kayıpları en aza indirmek, hem de yerel kapya biber çeşidimizin yok olmasının önüne geçilmesi hedeflenmiştir. Buna ek olarak, bu tez sonucunda elde edilen bitkisel materyaller (TSWV) hastalığına dayanıklı yeni kapya biber çeşitlerinin geliştirilmesi için gen kaynağı olabilecektir. Anahtar Kelimeler: TSWV, Kapya biber, Moleküler işaretleyici 2021, vii + 41 sayfa. i ABSTRACT MSc Thesis TRANSFER OF TSWV RESISTANT TO LOCAL PEPPER VARIETIES USING MOLECULAR MARKERS Onur ÇOBAN Bursa Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Horticulture Supervisor: Prof. Dr. Ahmet İPEK A Capia pepper is one of the important types of pepper varieties that are produced and consumed extensively in our country. In addition to fresh consumption, there are many areas of use in industry. In recent years, TSWV disease of Tomato spotted wilt virus (TSWV) disease is the leading factor affecting capia pepper production. Due to the lack of chemical control of TSWV Tomato spotted wilt virus disease, it causes great economic losses in agriculture by causing yield losses in production. One of the most effective methods of combating TSWV disease is the use of resistant varieties. In this study, by using molecular marker methods to transfer the TSWV resistance gene from the commercially sold capia pepper variety (Nr-07), which is known to be TSWV resistant to the local capia pepper variety (Ata-16), It was aimed to both minimize economic losses and to prevent the extinction of our local capia pepper variety. In addition, the plant materials obtained from this thesis can be a gene source for the development of new capia pepper varieties resistant to (TSWV) disease. Key words: TSWV, Capia pepper, Molekular markırs 2021, vii + 41 pages. ii TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca bilgi ve tecrübelerini bana aktaran ve bitirme tezim süreci boyunca desteği ile her zaman yanımda olan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Ahmet İPEK hocama sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Hayatım boyunca ve tez çalışmam süresince yanımda olan ve desteklerini esirgemeyen başta ablam Demet ÇOBAN olmak üzere, tüm aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Onur ÇOBAN 16/02/2021 iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.................................................................................................................................. i ABSTRACT ...................................................................................................................... ii TEŞEKKÜR ..................................................................................................................... iii İÇİNDEKİLER.................................................................................................................iv SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ....................................................................... v ŞEKİLLER DİZİNİ .......................................................................................................... vi ÇİZELGELER DİZİNİ ................................................................................................... vii 1.GİRİŞ……………..........................................................................................................1 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI ......................................................................................... 8 2.1. Virüslerin Morfolojik Yapısı...................................................................................... 8 2.2. Virüslerin Belirtileri ................................................................................................... 8 2.3. Virüslerin Yayılma Yolları ........................................................................................ 9 2.4. Virüslerle Mücadele Yöntemi .................................................................................. 10 2.5. Virüslerin Bulunuşu ve Yayılışı .............................................................................. 10 3. MATERYAL ve YÖNTEM ........................................................................................ 15 3.1. Materyal....................................................................................................................15 3.2.Yöntem.......................................................................................................................16 3.2.1 Biber Bitkilerinin Yetiştirilmesi ............................................................................ .16 3.2.2 Mekanik İnokulasyon ............................................................................................. 17 3.2.3 DNA İzolasyonu..................................................................................................... 17 3.2.4 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ...................................................................... 21 3.2.5 PCR ile Çoğaltılan DNA Parçasının TaqI Enzimi ile Kesilmesi ........................... 21 3.2.6 Agaroz Jel Elektroforezi ........................................................................................ 22 4. BULGULAR ............................................................................................................... 24 5. TARTIŞMA ve SONUÇ ............................................................................................. 33 KAYNAKLAR ............................................................................................................... 36 ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................... 41 iv SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama ℃ Santigrat derece ml Mililitre µl Mikrolitre cm Santimetre dk Dakika da Dekar ha Hektar % Yüzde oranı g Gram L Litre mM Milimolar μM Mikromolar U Ünite Kısaltmalar Açıklama RFLP Kesilmiş Çoğaltılmış Polimorfik DNA RAPD Rastgele Çoğaltılmış DNA Farklılıkları ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay AFLP Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Farklılığı SNP Tek Nükleotit Farklılıkları SRAP Sekansa Dayalı Çoğaltılmış DNA Farklılıkları BATEM Batı Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü CAPS Kesilip Çoğaltılmış Polimorfik Diziler DAS Double Antibody Sandwich CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide CAPS Bölünerek Çoğaltılmış Polimorfik Diziler FAO Food and Agriculture Organization TUIK Türkiye İstatistik Kurumu TSWV Tomato spotted wilt virüs DNA Deoksiribo Nükleik Asit RNA Ribo Nükleik Asit TBE Tris Boric Asit EDTA GM1 Geri Melez 1 AW1 Wash buffer 1 AW2 Wash buffer 2 AE buffer Elution buffer PR Geri melez PF İleri melez dNTP Deoksinükleotidtrifosfat Taq Termo stabil polimeraz enzimi v ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. TSWV'nin biber yaprağındaki simptomları......................................................8 Şekil.2.2. TSWV'nin meyve üzerindeki simptomları........................................................9 Şekil 3.1. Ata-16 kapya biber çeşidine, Nr-07 nolu kapya biber hattından TSWV hastalık geninin aktarılması şeması…………………………………………………….16 Şekil 3.2. Saksılara dikilmiş bitkilerin en uç kısımlarındaki genç yapraklarda alınan numuneler…………………………………………...…………………………...….….18 Şekil 3.3. Saksılara dikmiş olduğumuz bitkilerin en uç kısımlarındaki genç yapraklardan alınan numunelerin plietilen tüplerin içerisine toplanması…………………..………....18 Şekil 3.4. Polietilen tüpler içerisine konan yaprak numunelerinin liyofilizatör cihazında kurutulmaları…………………………………………………………………………...19 Şekil 3.5.Elektroforez tepsisindeki kaışıma elektrik akımı (120 volt) uygulanarak (yaklaşık 120 dk.) elektroforezin yürütülmesi………………………….………………22 Şekil 3.6. Elektrik akımı işlemi tamamlandıktan sonra elektroforez tepsisinden çıkarılan jel, UV görüntüleme kutusunun içerisine alınarak DNA’nın görüntülenmesi.23 Şekil 4.1. Siyah zemin üzerinde, çiçeklerden alınan polen tozları……………………..24 Şekil 4.2. Melezleme yapmak için en uygun çiçek tomurcukları………………..……..25 Şekil 4.3. TSWV hastalığına dayanıklılık genini taşıyan F1 bitkilerinin belirlenmesi. A) Moury ve ark. (2000) tarafından geliştirilen primerler kullanılarak çoğaltılmış DNA parçasının agaroz jel görüntüsü. B) Çoğaltılan DNA örneklerinin TagI enzimi ile kesildikten sonraki agaroz jel görüntüsü……………………………………………….26 Şekil 4.4. GM1-003 ve GM1-004 nolu genotipler……………………………….…….28 Şekil 4.5. GM1-008 ve GM1-022 nolu genotipler………………………………...…...29 Şekil 4.6. GM1-025 ve GM1-026 nolu genotipler…………………………..….……...29 Şekil 4.7. GM1-008 ve GM1-022 nolo genotiplerin fide aşamasındaki yaprakların şekli……………………………………………………………………………………..30 Şekil 4.8. TSWV hastalığına dayanıklılık genini taşıyan GM1 bitkilerinin belirlenmesi. A) Moury ve ark. (2000) tarafından geliştirilen primerler kullanılarak çoğaltılmış DNA parçasının agaroz jel görüntüsü. B) Çoğaltılan DNA örneklerinin TagI enzimi ile kesildikten sonraki agaroz jel görüntüsü………………………………………...……..31 Şekil 4.9. Nr-07 süs biber tipi…………….…………………...………………………..32 Şekil 4.10. Nr-07 mazamort biber tipi…………………..……………………………...32 Şekil 4.11. Nr-07 balık biber tipi……………………..………………………………...32 Şekil 4.12. Nr-07 kardola biber tipi…………………………………………………….32 vi ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1.1. Dünya'daki biber üretim miktarı ve alanı .................................................... 2 Çizelge 1.2. Dünya'da yoğun biber üretimi yapan ülkelerin üretim miktarları ................. 2 Çizelge 1.3. Türkiye'de üretimi yapılan biber çeşitlerinin, yıllara göre üretim miktaları . 3 Çizelge 1.4. Türkiye'de üretimi yapılan biber çeşitlerinin, yıllara göre üretim alanları ... 4 Çizelge 1.5. Ülkemizde yoğun kapya biber üretimi yapılan iller ..................................... 4 Çizelge 3.1. Termal döngü cihazı koşulları………………………………………….…21 Çizelge 4.1. Elde edilen TSWV' ye dayanıklı kapya bibr hatlarının meyve özellikleri..27 Çizelge 4.2. Elde edilen TSWV' ye dayanıklı kapya biber hatlarının bitki özellikleri....28 vii 1. GİRİŞ 1492 yılında Cristof Colomb ve arkadaşlarının Amerika’yı keşfetmesi ile birlikte, burada bitkilerin üzerindeki meyvelerin tadının çok acı olduğu bir türün yetiştirildiğini görmüşlerdir. Güney Hindistan’da karabiber yetiştiriciliğinin yoğun olmasından dolayı Cristof Colomb ve arkadaşları ilk olarak bulundukları bölgenin Güney Hindistan olduğunu düşünmüşlerdir. Fakat araştırmacıların 500 yıl süre içerisinde yapmış oldukları araştırmalar ve elde ettikleri yeni veriler neticesinde Cristof Colomb ve arkadaşlarının keşfettikleri yerin Amerika Kıtası olduğunu, buldukların bitkisin ise sos yapımında yoğun olarak kullanılan ve geniş alanlarda üretimi yapılan acı biber olduğunu keşfetmişlerdir. Böylece Cristof Colomb ve arkadaşları, Amerika Kıtası ile birlikte biberi de bulmuşlardır. Amerika ‘nın keşfi ile birlikte dünyada biber ekilişinin yayıldığı görülmektedir ( Eşiyok 2006). Biberin anavatanının, Amerika kıtasının Orta ve Güney bölgesi olduğu bilinmektedir (Verit ve ark. 2001, Ahmed 2013). Bolivya’nın, acı biberin anavatanı olduğu bildirilmektedir (McLeod ve ark. 1983, Pickersgill 1984). Biberin ticari olarak yetiştiriciliği 1600’lü yıllarda başlayıp, zaman içerisinde tüketimi hızlı bir şekilde artış göstermiştir (Dewitt ve ark. 1990). Kapya biberi Güney Amerika, Kosta Rika, Peru, Bolivya, Meksika ve tüm Güney Avrupa ülkelerinde yoğun bir şekilde üretimi yapılmaktadır (Kumari 2012). Ülkemize girişi ise 16 yy.‘ın ortalarında Avrupalılar ile yapmış olduğumuz ticaretler sonucunda giriş yaptığı ve zamanla tüm Anadolu’ya yayıldığı belirtilmektedir (Vural ve ark. 2000). Biber, Solanales takımı, domates ve patlıcan gibi sebze türlerini de içinde barındıran Solanaceae (Patlıcangiller) familyasından, Capsicum cinsi içerisinde yer alan bir sebze türüdür. Biber sıcak iklim bitkisidir. Bu sebepten dolayı tropik iklimlerde çok yıllık, ılıman iklimlerde ise tek yıllık bir sebze türüdür (Aybak 2002, Pernezny ve ark. 2003). Kapya biberi (Capsicum annuum L.), bir diğer adı ile ‘yağlık biber’ olarak ta tanımlanmaktadır. İlk zamanlar taze tüketim olarak salça yapımında kullanıldığı gibi, gelişen teknolojinin ve insanoğlunun tüketim alışkanlıklarının değişmesi sonucu, endüstriyel sektörde hazır gıda olarak, dondurulmuş gıda, acı sos, turşu, baharat ve 1 konserve içerisine közlenmiş şekilde de tüketiminin yaygın olarak arttığı görülmektedir (Özdikmenli ve ark. 2013). Dünya’daki biber üretimine baktığımızda, hazır gıda tüketiminin artması ile birlikte, endüstriyel alanda da biber ihtiyacının arttığı öngörülmektedir. Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü (FAO)’nun verilerine göre dünyadaki biber üretim alanı 2015 yılında 1.879.989 ha iken, 2018 yılında 1.990.423 ha yükseldiği görülmektedir (Çizelge 1.1). Biberin dünyadaki üretim miktarlarına baktığımızda ise Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü (FAO)’nun verilerine göre 2015 yılında 33.189.148 ton iken, 2018 yılında bu oran yaklaşık olarak %10 artış ile birlikte 36.771.482 tona ulaşmıştır (FAO, 2020). Çizelge 1.1. Dünya’daki biber üretim miktarı ve alanı YILLAR ÜRETİM MİKTARI (Ton) ÜRETİM ALANI (Ha) 2105 33.189.148 1.879.989 2016 34.567.250 1.931.365 2017 35.988.989 1.962.491 2018 36.771.482 1.990.423 FAO 2018 yılı verilerine göre, dünyadaki biber üretiminin yaklaşık olarak % 50’si, 18.214.018 ton ile Çin’de gerçekleştirilmiştir. 2. sıra da 3.379.289 ton ile Meksika, 3. sıra da ise 2.554.974 ton ile Türkiye yer almaktadır (Çizelge1.2). Çizelge 1. 2. Dünya’da yoğun biber üretimi yapan ülkelerin üretim miktarları ÜLKELER ÜRETİM MİKTARI (Ton) Çin 18.214.018 Meksika 3.379.289 Türkiye 2.554.974 Endonezya 2.542.358 İspanya 1.275.457 2 Türkiye’de birçok biber çeşidinin üretimi (macar biberi, süs biberi, california wonder, jalopen vs.) yapılsa da, en yoğun olarak kapya, sivri, dolma ve çarliston çeşitlerinin üretimi yapılmaktadır. Türkiye’deki biber üretiminin yoğun bir şekilde yapıldığı bölgeler Ege, Marmara, Karadeniz, Güney ve Güneydoğu Anadolu bölgeleridir. Ege, Marmara ve Karadeniz bölgelerinde üretilen biber genellikle taze tüketim için ve endüstriyel amaçlı (közleme, salça vs.) kullanılmaktadır. Doğu ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde üretilen biberler ise, acı sos, toz ve pul biber yapımında kullanılmaktadır. Türkiye İstatistik Kurumu (TUİK) 2019 verilerine göre, Ülkemizde en yoğun üretimi yapılan biber çeşidi %47 lik oranı ile kapya biber ilk sırada bulunmaktadır. Bunu sırası ile %34 oranı ile sivri, %14 oranı ile dolma ve %5 oranı ile çarliston biberi takip etmektedir (Çizelge 1.3). Çizelge 1. 3. Türkiye’de üretimi yapılan biber çeşitlerinin, yıllara göre üretim miktarları YILLAR KAPYA (ton) SİVRİ (ton) DOLMA (ton) ÇARLİSTON (ton) 2015 879.775 919.004 393.190 115.568 2016 957.030 967.466 418.435 114.891 2017 1.107,713 945.361 420.904 134.194 2018 1.128,060 930.349 397.175 99.390 2019 1.234.423 902.203 371.918 117.125 Kapya biberi, taze tüketimin yanında, hazır gıdada da yoğun olarak kullanılmasından dolayı, diğer biber çeşitleri ile kıyasladığımızda en fazla ekim alanına sahip olduğu görülmektedir. Türkiye İstatistik Kurumu (TUİK) 2019 verilerine göre, Ülkemizdeki toplam biber ekim alanının %47’lik kısmını oluşturan kapya biber üretimi ilk sırada yer almaktadır. Bunu sırası ile sivri biber (%35), dolma biberi (%15) ve çarliston biber (%3) takip ettiği görülmektedir (Çizelge 1.4). 3 Çizelge 1. 4. Türkiye’de üretimi yapılan biber çeşitlerinin, yıllara göre üretim alanları (da) YILLAR KAPYA SİVRİ DOLMA ÇARLİSTON 2015 308.417 313.149 143.626 27.425 2016 325.584 147.145 316.716 26.187 2017 333.132 141.534 303.341 27.159 2018 346.248 131.351 290.885 18.040 2019 372.775 122.952 277.642 19.305 Ülkemizde illere göre kapya biber üretimlerine baktığımızda ise, Türkiye İstatistik Kurumu (TUİK) 2019 verilerine göre, Çanakkale ilimiz ülkemizdeki toplam kapya üretim alanının %8,36’lık kısmını karşılayarak 66.277 da üretim alanı ile ilk sırada, 50.371 da üretim alanı ile Şanlıurfa ilimiz 2. sırada, 35.362 da üretim alanı ile Manisa ilimiz 3. sırada yer aldığı görülmektedir (Çizelge 1.5). Çizelge 1. 5. Ülkemizde yoğun kapya biber üretimi yapılan iller İLLER ÜRETİM ALANI (da) ÜRETİM MİKTARI (ton) Çanakkale 66.277 234.735 Şanlıurfa 50.371 134.896 Manisa 35.362 134.349 Samsun 30.375 76.063 Bursa 21.646 91.103 İzmir 20.484 56.678 Adana 19.180 105.668 Antalya 15.587 131.920 Türkiye İstatistik Kurumu (TUİK) 2019 verilerine göre, Ülkemizdeki kapya biber üretimin de elde edilen üretim miktarlarına baktığımızda ise, üretim alanında olduğu gibi elde edilen üretim miktarlarında da 234.735 ton ile Çanakkale ilimiz ilk sırada bulunmaktadır, 2. Sırada 134.896 ton ile Şanlıurfa ilimiz, 3. sırada ise 134.349 ton ile Manisa ilimizin yer aldığı görülmektedir (Çizelge 1.5). 4 Biberin ekonomik değeri kadar, bünyesinde barındırdığı besin maddeleri bakımından da önemli bir sebze türü olduğu görülmektedir. Bu besin değerleri oranı iklim, toprak, çeşit seçimi, sulama, gübreleme, bakım gibi faktörlere bağlı olarak değişim göstermektedir. Ancak biber genel olarak bünyesinde 340 mg/100 gr oranında C vitamini bulundurması ile meyveler arasında en yüksek oranda C vitaminine sahip olduğu görülmektedir (Govindarajan ve ark. 1986a). Bunun yanında A, E, B1, B2 ve B3 vitaminleri, P, S, Fe, Mg ve Ca mineralleri yönünden zengindir (Govindarajan ve ark. 1986b). Bibere acılık tadını veren capsaicin (C18H27NO3) maddesidir. Capsaicin, alkoloid bileşenli bir yapıya sahiptir. Tıpkı havuçta olduğu gibi, biberinde rengini veren alfa ve beta karotenleridir. Karetonoid pigmentler biberin renginin (sarı, turuncu, yeşil, kırmızı) belirlenmesinde önemli rol oynamaktadır. Bu tip capsaicin ve renk pigmentleri olan karetonoidlerin biber meyvesindeki miktarı meyvenin olgunlaşma süresine göre farklılıklar gösterebilmektedir (Govindarajan 1986b). Biberin son yıllarda üretim ve tüketiminin artmasının nedenlerinden biri de, insan sağlığına yapmış olduğu katkıya dayanmaktadır. Özellikle acı biberin bünyesinde bulunan capsaicin maddesi kanser hücrelerinin pasifleşmesine katkısı olduğu, biber çeşitleri içerisinde kapya biberde bulunan lutein maddesinin gözlerde meydana gelebilecek hastalıkları azalmasını sağladığı, sindirim sistemini rahatlattığı, kalp ve damar hastalıklarına karşı olumlu yönde katkıda bulunduğu görülmektedir (Akıncı ve Akıncı,. 1999, Kumar Shaha ve ark. 2013). İklim, su, gübreleme, toprak yapısı, arazi yapısı vs. gibi etmenler hasat zamanında tarımsal ürünlerin verimini etkilediği gibi, aynı zamanda da bitki patojenleri (virüs, bakteri ve fungus) de tarımsal ürünler üzerinde olumsuz etki yaratarak, çeşitli hastalıkların oluşmasına neden olmaktadır. Tarımsal ürünlerin ekonomik kayba uğramasına neden olan virüsler arasında ilk sıralarda yer alan Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (TSWV)‘dür (Goldbach ve ark. 1994, Griep ve ark. 2000). TSWV (Domates Lekeli Solgunluk Virüsü) hastalığı, bitki yetiştiriciliği açısından çok önem teşkil etmektedir. Bunun en büyük nedenlerinden biri, kimyasal mücadelesinin 5 bulunmamasıdır. İster açık saha yetiştiriciliği olsun, isterse örtü altı yetiştiriciliği olsun, tohumdan hasada kadar geçen süre içerisinde bitkilerin vejetatif ve generatif kısımlarında istenmeyen deformasyonların görülmesine neden olabilmektedir (Anonim, 2006a). Bitkideki belirtileri; bodurlaşma, yaprakların, meyvelerin ve gövdenin üzerinde mozaik şeklinde kahverengi halkalı lekeler, klorotik ve nekrotik lekeler ve sararmalar, yaprakların üzerinde bulunan damarlar arasında küçülmeler, meyvelerde şekil bozuklukları ve meyve üzerinde kahverengi lekeler şeklinde belirtiler oluşturduğu görülmektedir. TSWV hastalığının bitkiler arasında yayılmasında vektör böcekler önemli rol almaktadır. Bu vektör böceklerin başında da thrips yer almaktadır (Anonim, 2006b). TSWV (Domates Lekeli Solgunluk Virüsü)’nin kültür bitkilerinde neden olduğu ürün kaybından kaynaklanan ekonomik kayıp miktarı, yetiştirilen ürüne (biber, domates, patlıcan, marul, kereviz vs.), bölge şartlarına (yayla, ova, ortamdaki nem vs.) ve mevsim şartlarına göre değişim gösterebilmektedir. Bundan dolayı tarımsal ürünlerin TSWV’nin etkisinden dolayı yaşanan ürün kayıplarından doğan ekonomik kayıp miktarının rakamsal değeri net bir şekilde belirtmek güç olmaktadır (Bos 1982, Strange ve Scott, 2005). Ancak TSWV’nin dünyada kültür bitkilerinde neden olduğu ekonomik kaybın miktarının 1 milyar doların üzerinde olduğu düşünülmektedir (Uhrig ve ark. 1999, Griep ve ark. 2000). TSWV hastalığının kimyasal mücadelesinin olmamasından dolayı, kültürel mücadeleye önem verilmesi gerekmektedir. Kültürel mücadele olarak, açık saha ve örtü altı yetiştiricilikte, hava sirkülasyonunu sağlayan seranın pencerelerine ve kapı girişine, thrips vektörleri ve diğer böceklerin geçmesini engellemek için 0,2-0,3 mm genişliğinde tüllerin takılması, sarı ve lacivert feromon tuzakların asılması, alet ve ekipmanları kullanmaya başlamadan önce iyice dezenfekte edilmesi, hastalık görülen bitkiler kökü ile birlikte seranın dışına çıkarılarak imha edilmesi, yabancı otların sera içinde ve etrafında bulundurulmaması şeklinde önlemler alınabilmektedir. Fakat en önemli mücadele yöntemi TSWV’ye dayanıklı çeşitlerin tercih edilmesidir. 6 Bitki ıslahı çalışmalarında TSWV’ye dayanıklı biber çeşitleri elde etmek öncelikli hedeflerden biri olmalıdır. Islah çalışmalarına başlayabilmek için ilk adım olarak ıslahçının elinde bitkisel genetik kaynaklarının bulunması gerekmektedir. Artık yavaş yavaş yok olmaya başlayan atalarımızdan kalma yerel çeşitler, en iyi bitkisel genetik kaynak materyali olarak kullanılabilmektedir. Islah çalışmaları çok uzun yıllar almaktadır. Bu durum hem zaman kaybına, hem de maddi yönden bir kayba neden olmaktadır. Teknolojinin gelişmesi ile birlikte ıslahçılar, moleküler markır yöntemlerini kullanarak (RFLP, RAPD, AFLP, SNP, SRAP) ıslah çalışmalarında daha kısa sürede hedefe ulaşabilmektedirler. Bu durum daha kısa sürede ve daha düşük maliyetlerle piyasadaki çeşitliliğin artmasına ve yeni çeşitlerin daha kısa sürede daha ekonomik olarak elde edilmesini sağlamaktadır (Li ve Quiros, 2001). Bu çalışmada, yerel kapya biber çeşitlerinin yok olmasının önüne geçmek amacı ile moleküler işaretleyiciler kullanarak, yerel kapya biber çeşidine TSWV dayanımı kazandırıp, hastalık dayanımını artırarak verim artışı sağlamak, böylece kaybolmaya yüz tutmuş yerel çeşitlerimizi tekrar tarıma kazandırmaktır. Aynı zamanda da bu çalışmalar sırasında elde edilecek yeni genotipleri, ıslah çalışmalarında kullanılmak üzere gen havuzunda saklanması planlanmıştır. 7 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Virüslerin Morfolojik Yapısı Virüslerin yapısı nükleik asit, protein kılıfından meydana gelmektedir. Virüslerin karakterlerinin taşınmasında nükleik asitler görev almaktadır. Nükleik asitlerin dışında protein zar bulunmaktadır. Böylelikle protein zar, nükleik asitlerin korunmasında rol oynamaktadır. Virüsler canlı hücrelerde çoğalabilen nükleoproteinlerdir. Sadece canlı hücrelerde yaşayabilmektedirler. Bitkilerin bünyesine mekanik ya da böcek emgilerinin neden olduğu yaralardan girebilmektedirler. Virüsler yapısal olarak farklı şekillere sahiptirler. TMW çubuk şeklinde, CMW küresel şekline sahip virüslerdir. Eksiksiz yapıya sahip olan virüslere virion adı verilmektedir. Virion virüslerine örnek olarak TSWV gösterilebilmektedir. (De Haan ve ark. 1990). 2.2. Virüslerin Belirtileri Virüsler, bitkilerin yaprak, gövde, kök, çiçek ve meyveler üzerinde farklı simptomlara neden olmaktadır. Yapraklar üzerinde görülen simptomlar, klorofil miktarlarında azalmasına sebep olmasından dolayı, yaprak renklerinin sarımsı renk almasına ve bazı durumlarda da bitkinin yaprak renginin kırmızımsı renk almasına, uçlarda kırılmalar, damarlarda bantlaşma, halkalı leke şeklinde, gövde üzerinde görülen simptomlar ise bodurlaşma, dal uçlarında yanma şeklinde kurumalar, meyveler üzerindeki belirtileri ise, şekil bozuklukları, siğil şeklinde kabarcıklar, dairesel lekeler şeklindedir (Soler ve ark. 1998). Şekil 2.1. TSWV'nin biber yaprağındaki simptomları (Çelik 2019) 8 Şekil 2.2. TSWV'nin meyve üzerindeki simptomları (Anonim 2021) 2.3. Virüslerin Yayılma Yolları Virüslerin bitkilere taşınmasında birçok etken sebep olabilmektedir. Mekanik (rüzgarla, hayvanla, insanla, alet ekipmanla vs.), tohumla (tohum kabuğunda, tohumun endosperminde, tohumun embriyosunda), toprakla (nematodla, fungusla), parazit bitkilerle (küsküt gibi tam parazit bitkiler), böceklerle (vektörler) ve akarlar yolu ile taşınabilmektedirler (Gordillo ve ark. 2008). Tez konusu olan TSWV virüsü, genellikle thrips türleri aracılığı ile taşınmaktadır. Virüsün taşınmasında en etkin rol oynayan thrips türleri, Thrips tabaci ve Frankliniella occidentalis vektörleridir (Tunç ve Göçmen, 1995). Thripsler, yaprağın en üst ve en alt yapısını oluşturan epidermal dokusunda 15-30 dakika arasında beslenmesi durumunda, virüsü bünyesine alabilmektedir. Bu sürenin uzaması, virüsün taşınmasında daha etkin rol oynamaktadır (Wijkamp ve Peters, 1993). Virüsün yayılmasını sağlayan vektörler, larva döneminde ağız yolu ile aldıkları virüsleri orta bağırsak kısmında çoğaltarak, salgı kanallarına taşıyarak virüsü bulaştırmaktadırlar (German ve ark. 1992). Virüsü bünyesinde bulunduran vektörler, en fazla 1 ay süre içerisinde virüsü bulaştırma yeteneğine sahiptirler (Nagata ve ark. 2002). 9 2.4. Virüslerle Mücadele Yöntemi Black ve ark. 1991, Capsicum annum L. türü içerinde TSWV’ye dayanıklılık geni bulunmadığını, sadece capsicum türleri içerisinde yer alan Capsicum chinense gibi bazı türlerinde dayanıklılık geni bulunduğunu belirtmişlerdir. Cheng ve ark. 1989, PI-152225 ve PI-159236 numaralı Capsicum chinense türü içerisinde yer alan hatlar ile Capsicum annum’un uyumlu bir şekilde melezleme işleminin yapılabileceğini belirtmişlerdir. Moury ve ark. 1998, homozigot gen kaynaklarının dayanım gücünün, heterezigot gen kaynaklarının dayanım gücüne göre daha yüksek olduğunu, bu yüzden yüksek sıcaklıklarda yapılan ıslah çalışmalarında sağlıklı sonuçlar elde etmek için homozigot gen kaynaklarının kullanılmasının daha sağlıklı olduğunu belirtmişlerdir. 2.5. Virüslerin Bulunuşu ve Yayılışı Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (TSWV), dünyada ilk kez 1915 yılında Avustralya’da görülmüştür. Buradan da hızlı bir şekilde sıcak iklim kuşağı bölgelerine doğru yayılarak, dünya çapında bitki türleri için önemli bir hastalık teşkil eden virüs haline gelmiştir (Rosello ve ark. 1996). İran’da TSWV virüsü ilk olarak patates, soya ve domates bitkilerinde ELİSA-DAS yöntemi uygulanarak 1999-2000’li yıllarda tespit edilmiştir (Golnaraghi 2001, Pourrahim ve ark. 2001). Holcomp ve ark. 1999 yılında Melampodium divaricatum ve Nicotiana bentamiana bitkilerine dışarıdan mekanik yollarla TSWV inokulasyon çalışması yapmışlardır. Uygulama yapılan bitkilerde ilk simptom belirtileri, uygulama yapıldıktan 2 hafta sonra Nicotiana bentamiana da, 2 ay sonra da Melampodium divaricatum da TSWV belirtileri görülmeye başlanmıştır. Melampodium divaricatum bitkisinin simptom gösteren yapraklardan numune alınarak, ELISA yöntemi ile testleme yapılmıştır. Yapılan 10 testleme sonucunda TSWV olduğu saptanmıştır. Böylece 1999 yılında Güney Amerika’da ilk TSWV görüldüğü ispatlanmıştır. Arjantin’de ilk TSWV Lisionthus bitkisinde görülmüştür. Simptom gösteren yapraklardan alınan numuneler ELISA testine tabii tutularak TSWV olduğu kanıtlanmıştır (Wolcan ve ark. 1996). TSWV virüsü ABD’nin Georgia eyaletinde ilk kez hastalığın konukçusu olan tütünde 1986 yılında görüldüğü bildirilmiştir. TSWV tütün tarlalarının tamamında görülmesine rağmen, zarar kaybının %2’nin altında olduğu tespit edilmiştir (Culbreath ve ark. 1991). Florida eyaletinde TSWV virüsünün ilk kez 2000 yılında DAS-ELİSA testi kullanılarak Habanero ve Tobasco biberlerinde tespit edilmiştir. Biberlerin yapraklarında simptom belirtilerinin görülmesi üzerine DAS-ELİSA yöntemi ile testleme yapılmış olup, testleme sonucunda da hastalık oranının Habanero da %1,5 oranında, Tobasco da ise %1 oranında olduğu bildirilmiştir (Momol 2000). Graves ve ark. 2002 yılında Carolina eyaletinde 28 adet yıllık ve çok yıllık bitki türleri üzerinde en az 2 yıl üretim yapılmamış arazide yapmış oldukları çalışmada, TSWV vektörü olarak en yoğun tütün thripsine rastlandığını bildirmişlerdir. Lousiniana eyaletinde TSWV ilk olarak 1972 yılında domates, tütün ve biber bitkilerinde görüldüğü bildirilmiştir (Black 1973, Greenogh ve ark. 1990). TSWV’nin bu ürünler üzerinde büyük ölçüde ekonomik kayıplar meydana getirdiği rapor edilmiştir (Bond ve ark. 1983). Lousiana eyaletinde yapılan bir araştırmada, malçlama yönteminin, thriplerin popülasyonu üzerindeki etkileri ve buna bağlı olarak ta TSWV’nin yayılmasına etkileri üzerine bir çalışma yapılmıştır. Domates ve biberde yaptıkları uygulama da, arazinin rastgele bölümlerine alüminyum renkli plastik malç malzemesi ile siyah renkli plastik malç malzemesi sermişlerdir. Arazinin bir kısmına ise malç malzemesi sermemişlerdir ve thrips popülasyonunu ölçmek için sarı yapışkan tuzaklar yerleştirmişlerdir. Yapılan 11 çalışma sonucunda malçlama yapılan kısımların, malçlama yapılmayan kısma göre TSWV oranının ortalama %65, sarı tuzaklardaki thrips popülasyonun da ortalama %35 oranında bir düşüşe neden olduğunu bildirmişlerdir (Greenogh ve ark. 1985). Hausbeck ve ark. 1992 yılında Pennsylvani’da ticari olarak süs bitkileri üretimi yapılan seralarda, camgüzeli ve begonya da TSWV ile infekteli bitkilerin olduğunu tespit etmişlerdir. Yudin ve ark. 1990 yılında üreticilerin ekonomik yönden kayıplarının minumum düzeyde olması için, TSWV ile mücadelenin erken dönemde mi yoksa thrips popülasyonunun çoğaldığı dönemde mi üreticilerin mücadeleye başlamaları gerektiği konusunda bir çalışma yapmışlardır. Bu çalışma sonucunda TSWV ile mücadelenin thrips popülasyonu çoğalmadan önce, erken yapılan müdahalelerde, üreticilerin ekonomik kayıpların minimum seviyede olduğunu tespit etmişlerdir. Mandal ve ark. 2002’nin yapmış olduğu çalışmada farklı yerfıstığı genotiplerinin düşük (<30) ve yüksek sıcaklıklarda (>30) mekanik inokulasyon yönteminde kullandıkları TSWV’nin gösterecekleri tepkilere bakmışlardır. Yüksek sıcaklıklarda C11-2-39 yerfıstığı genotipinin TSWV’ye direncinin en yüksek olduğunu ve yüksek sıcaklıklarda TSWV infeksiyonun da azalma olduğunu bildirmişlerdir. Tekinel ve ark. 1969 yılında Mersin ilinde farklı bitki türleri (marul, biber, fasulye, patlıcan) üzerinde yapmış oldukları hastalık etmenlerini belirleme çalışmalarında, marulda TSWV hastalığı olabilecek bulgular elde etmelerine rağmen, ülkemizde ilk kez 1980 li yılların ortalarında Çanakkale ilinde Azeri (1981) tarafından yapılan çalışmada tütün bitkisinde TSWV hastalığı tespit edilmiştir. Ülkemizin sahil kesimi olan Akdeniz Bölgesine ise TSWV hastalığı ilk olarak 1995 yılında giriş yaptığı görülmektedir (Güldür ve ark. 1995). Çanakkale ilinde 2003 yılında başlatılıp ve 2 yıl süren çalışmada, yaklaşık olarak 1.000 dekarlık dikili domates alanlarından TSWV hastalığı simptomunun belirtisi olabilecek yapraklardan numune alınmıştır. Yaklaşık olarak 2 yıl içerisinde toplamda alınan 200 12 yaprak örneği, ELISA yöntemi kullanılarak yapılan testleme sonucunda, toplamda 9 bitkide hastalığın bulaşık olduğunu saptamışlardır (Turhan ve Korkmaz 2006). Çelik ve ark. 2018’de yapmış oldukları çalışmada, Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (TSWV) ne dayanıklı sivri biber hatlarını geliştirmişlerdir. BATEM (Batı Akdeniz Tarımsal Araştırma Enstitüsü) den alınan TSWV’ye hassas hem açık saha hem de örtüaltı üretimine uygun serademre 8 (P1) adında sivri biber çeşidi ile TSWV’ye dayanıklı üç adet hibrit (P2, P3, P4) çeşidi materyal olarak kullanmışlardır. Melezleme çalışmasında ise ana ebeveyn olarak P1, baba ebeveyn olarak ta P2, P3 ve P4 hibrit çeşitleri kullanılarak, 3 kombinasyon şeklinde melezleme yapmışlardır. Melezlemeden sonra elde edilen f1 tohumları fide haline getirilerek, genç yapraklardan numune alınarak mekanik inokulasyon yöntemlerinden biri olan ELISA testine tabii tutarak dayanım aktarılmış çeşitleri keşfetmişlerdir. ELISA testini uygularken kontrol çeşit olarak hastalığa hassas çeşit olan serademre 8 ve hastalığa dayanıklı olan PI 152225 genotipini kullanmışlardır. Yaptıkları ELISA testini doğrulamak için ise moleküler testlemeden faydalanmışlardır. CTAB yöntemini kullanarak, bitkilerin genç yapraklarından numune alınarak DNA izolasyonuna bakmışlardır (Doyle ve Doyle, 1990). Bu yöntemde CAPS primeri olan SCAC568 primerini kullanmışlardır. SCAC568 primeri Moury ve ark. 2000 tarafından bulunmuştur. Bu yöntemleri kullanarak elde ettikleri dayanıklı genotipleri seraya dikim yaparak seleksiyon yapmışlardır. Seleksiyonda genotiplerin morfolojik ve fenolojik karakteristik gözlemlemelerini yapmışlardır. Bu tip gözlemleme yöntemine pedigri yöntemi denilmektedir (Kalloo 1988). Pedigri yöntemini kullanarak yapmış oldukları gözlem sonuçlarını bir çizelge haline getirerek istenilen özelliklere sahip üç yeni genotip bulmuşlardır. Buldukları üç yeni genotipi de yeni çeşitlerin ıslahında kullanılmak üzere özel sektörde bir tohum firması ile anlaşma imzalayarak, buldukları hatları kullanmalarına izin vermişlerdir. Şimşek ve ark. 2015’de yapmış oldukları çalışmada, tospovirüs ve tobamovirüslere dayanıklı yeni dolmalık biber hat ve çeşitlerini geliştirmişlerdir. Materyal olarak 50 adet F6 genotipi ile ticari çeşitler olarak ta 8 adet TSWV (Domates Lekeli Solgunluk Virüsü) ye dayanıklı ve 4 adette TSW’ye dayanıklı çeşitleri kullanmışlardır. Dayanıklılık 13 testlemesini DNA izolasyon modifiye CTAB yöntemini kullanarak yapmışlardır (Doyle ve ark. 1990). Dayanıklılık testlemesinden sonra GM1F1 elde etmek için, dayanıklı olan saf biber hatları ile heterozigot hibrit (F1) biber çeşitlerini melezlemişlerdir. Elde edilen tohumları tekrar çimlendirilerek, moleküler markırları kullanarak dayanaklı olan allelleri tespit etmişlerdir. Tespit edilen dayanıklı genotipler ile hassas ebeveynler tekrar melezlenerek GM2F1’i elde etmişlerdir. GM2F1’i kendileyerek, GM2F2’yi elde etmişlerdir. Bu şekilde GM3F6 ve GM2F6 olana kadar kendileme işlemine devam etmişlerdir. F6 kademesindeki hatlardan L3 /L4 ve Tsw dayanımlarından en az ikisine sahip hatlar ile meyve şekli, bitki habitusu, verim vs. gibi üstün özelliklere sahip hatlar arasında melezleme yapmışlardır. Elde ettikleri bulgulara göre F6 kademesinde 25 adet Tsw, 14 adet L3, 20 adet Tsw+L3, ve 13 adet L4 homozigot dayanıklılık allellerini taşıyan saf hatlar elde etmişlerdir. Bu hatlar arasındaki melezleme çalışmaları sonucunda yapılan kapsamlı gözlem neticesinde 4 adet F1 çeşit adayı bulmuşlardır. Bu bulmuş oldukları çeşitlerden birini, piyasada ticari olarak satılan 3 çeşit ile deneme parselleri kurup, iyi bir gözlemleme yaparak, yapılan gözlemlemeleri de, tablo haline getirmişlerdir. Bu deneme sonucunda bir çeşidin denemede kullandıkları ticari 3 çeşitten daha üstün özelliklere sahip olduğunu saptamışlardır. Bunun neticesinde de bu çeşidi TTSM’ye başvurarak Armada F1 adında tescil ettirmişlerdir. Brezilya’da biber üretimlerinde karşılaşılan TSWV sorunundan dolayı toplam üretim miktarının yaklaşık olarak %50’den fazla kayba neden olduğu tespit edilmiştir (Cupertino ve ark. 1984). 14 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1 Materyal Ata-16 nolu iki-üç loblu, geniş omuzlu, kalın etli ve uzun meyve yapısına sahip olan yerel kapya biber çeşididir ve Marmara Bölgesinde farklı lokasyonlarda üretici arazilerinde üretimi gerçekleştirilmektedir. Yapılan gözlem sonuçlarında TSWV hastalığına duyarlı olduğu anlaşılmıştır. Farklı lokasyonlarda dikimi yapılan Ata-16 bitkisinden yaprak numuneleri alınıp, laboratuvar ortamında moleküler işaretleyiciler yöntemi kullanılarak yapılan testleme sonucunda, Ata-16 kapya biber çeşidinin TSWV’ye hassas olduğu saptanmıştır. Ata-16 kapya biber çeşidi, geniş ve kalın etli meyveye sahip olmasından dolayı sanayiciler için közlemeye çok uygun bir çeşittir. En büyük dezavantajı ise üretimde büyük kayıplara sebep olan TSWV hastalığına duyarlı olmasıdır. Tohum piyasasında ticari olarak satışı yapılan Nr-07 F1 kapya biber çeşidinin TSWV’ye karşı dayanımı olduğu bilinmektedir. Geri melezleme yöntemi ile dayanıklılık geni Ata-16 kapya biber çeşidine aktarılması için bu Yüksek Lisans Tezi gerçekleştirilmiştir. Melezleme işlemini rahat bir şekilde gerçekleştirmek için, rüzgar olmayan ortam tercih edilmelidir. Bunun içinde en uygun ortam örtü altı (sera) koşullarıdır. Sera içerisinde rüzgar olmadığından dolayı, baba hattındaki çiçeklerden polen tozları daha sağlıklı şekilde alınıp, ana olarak kullanılan bitkinin dişiçik borusuna aktarılması (melezleme) işlemi daha rahat bir şekilde gerçekleştirilebilmektedir. Kapalı ve kontrollü alan (sera) aynı zamanda yabancı tozlanma olasılığını da düşürmektedir. Nr-07 (baba hat) ile Ata-16 (ana hat) arasında melezleme yapılmıştır (Şekil 3.1). Melezleme sonucu elde edilen F1 bitkilerden yaprak örnekleri alınarak hangi bitkilerin dayanıklılık genini taşıdığı tespit edilmiştir. Dayanıklılık genini taşıyan F1 bitkiler hassas ebeveyn ile tekrar melezlenerek Geri Melez 1 (GM1) bitkileri elde edilmiştir. GM1 tohumları fidelik ortamında çimlendirilerek fide haline getirilmiştir. Fidelerden alınan yaprak numuneleri laboratuvar ortamında moleküler işaretleyiciler yardımı ile hangi GM1 bitkisinin TSWV hastalığına dayanıklılık genini taşıdığı tespit edilmiştir. Dayanıklılık genini taşıdığı belirlenen bitkiler saksılara şaşırtılmış ve kendileme 15 yapılarak dayanıklılık genini homozigot olarak taşıyan bitkilerin belirlenmesi amaçlanmıştır (Şekil 3.1). Ata-16 × Nr-07 F1 × Ata-16 GM1 (Geri Melez 1)  (Kendileme) S1 Şekil 3.1. Ata-16 kapya biber çeşidine, Nr-07 nolu kapya biber hattından TSWV hastalık geninin aktarılması şeması. 3.2 Yöntem 3.2.1 Biber Bitkilerinin Yetiştirilmesi Denemede kullanılacak biber bitkilerini yetiştirmek için biber tohumlarının ekim işlemi gerçekleştirilmiştir. Torf-vermikulit-perlit şeklinde, 3:1:1 oranında toprak karışımı içeren 210’luk viyollerin içerisine, her bir göze 1 adet tohum gelecek şekilde tohum ekimi yapılmıştır. Tohum ekimi yapılan viyollerin üzeri vermikulit ile kapatılıp, üzerine can suyu verilerek, viyol çimlendirme odasına alınmıştır. Çimlendirme odasında viyoller 24 ℃ sıcaklık ve %90 nem bulunan ortamda 7 gün bekletilerek, tohumların çimlenmesi sağlanmıştır. Çimlenme odasından çıkarılan viyoller 18-20 ℃ sıcaklıktaki seraya alınarak, yaklaşık 40 gün gerekli bakımları (sulama-gübreleme-ilaçlama) yapılarak kapya biber fideleri hazır hale getirilmiştir. 16 3.2.2. Mekanik İnokulasyon Geri melez 1 kapya biber fidelerini mekanik inokulasyonda kullanmak üzere içerisinde 12 L torf, 4 L perlit ve 4 L kum karışımı bulunan 20 L hacimli saksılara dikimi gerçekleştirilmiştir. Ayrıca kontrol çeşit olarak da, ticari olarak satışı yapılan postal kapya biber fidesi saksılara şaşırtılmıştır. Çevre arazilerinden TSWV ile bulaşık olduğu tahmin edilen biber bitkilerinden mekanik inokulasyonda kullanılmak üzere polietilen tüplerin içerisine alınan yaprak numuneleri, buz kutusunun içerinde muhafaza edilerek laboratuvar ortamına getirilmiştir. Virüs inokulumu, 1:4 oranında, pH’nın 7,0 olduğu, 0,01 M kadar fosfat buffer içeren karışımın içerisinde hastalık ile bulaşık yapraklar ezilerek özü çıkarıldıktan sonra, üzerine 600 mesh-karborandum tuzu ile silisyum oksit ilave edilerek hastalık inokulum solüsyonu hazırlanmıştır. Fidelerin dikiminden yaklaşık olarak 10 gün sonra, virüs inokulumunun bitkinin dokularına direkt etki etmesi amacı ile genç yaprakların üzeri bir jilet yardımıyla çizilerek küçük yara dokuları oluşturulmuştur. Virüs inokulumu yaprakların üzerinde bulunan bu yara dokularının üzerine pamuklu bir bez yardımı ile sürülmüştür. Bulaştırma işlemi tamamlandıktan 5 dakika sonra yaprakların üzerinde fazladan olan inokulumunu temizlemek amacı ile 2 L’lik üstten basınçlı el pompası ile yaprakların üzerine su püskürtülmüş ve fazladan bulunan inokulum solüsyonunun yaprak üzerinden uzaklaştırılması sağlanmıştır. Yaklaşık 7 gün sonra aynı işlem 2. kez tekrarlanmıştır. İnokulasyon yapıldıktan sonra bitkilerin genel bakımlarına (sulama- gübreleme-ilaçlama) devam edilmiştir. Yaklaşık olarak 12-18 gün gün sonra, virüs inokulumu ile bulaşık bitkilerden gözlemler alınmıştır. 3.2.3. DNA İzolasyonu F1 ve GM1 biber bitkilerinin DNA örneklerini elde edebilmek için, saksılara dikmiş olduğumuz bitkilerin en uç kısımlarındaki genç yapraklardan alınan numuneler polietilen tüplerin içerisine toplanmış, buz üzerinde DNA izolasyonunun yapılacağı laboratuvara getirilmiştir (Şekil 3.2, Şekil 3.3). Soğuk zincirle laboratuvara getirilen yaprak örnekleri liyofilizatörde kurutulmuştur (Şekil 3.4). 17 Şekil 3.2. Saksılara dikilmiş bitkilerin en uç kısımlarındaki genç yapraklardan alınan numuneler. Şekil 3.3. Saksılara dikmiş olduğumuz bitkilerin en uç kısımlarındaki genç yapraklardan alınan numunelerin polietilen tüplerin içerisine toplanması. 18 Şekil 3.4. Polietilen tüpler içerisine konan yaprak numuneleri liyofilizatör cihazında kurutulmaları Kapya biber bitkilerinden alınan yaprak numunelerinin DNA izolasyonu için PCR yöntemi kullanılarak, Therme Gene Jet protokolü uygulanmıştır. Küçük tüpler içerisine (2 ml’lik), yaklaşık olarak 100 mg kurutulmuş yaprak örneğinden koyarak, üzerine Lizis buffer A (350 µl) ilave edilerek hücrelerin bu özel solüsyon içerisinde parçalanmaları sağlanmıştır. Parçalama sırasında bitki dokusunun çok küçük parçalara ayrılmasını sağlamak ve solüsyonun dibinde tortu oluşmasını önlemek için thissvelyser cihazı kullanılmıştır. Purifikasyon (saflaştırma) işleminde tüpün içerisine RNA’nın parçalanmasında yardımcı olan RNAse A enziminden 20 µl ve bir miktar Lizis buffer B (50 µl) ilave edilerek solüsyonun dairesel bir şekilde (girdap şeklinde) karışmasını sağlamak için vortex cihazından yararlanılmıştır. İnkubasyon işlemini gerçekleştirmek için solüsyon, yüksek sıcaklıkta (65℃) yaklaşık 12 dk. tutulmuştur. 19 Solüsyonun içine protein hücrelerini parçalamak için bir miktar presipitation solüsyonundan (120 µl) ilave edilerek, solüsyonun homojen bir şekilde karışmasını sağlamak için vortex cihazı ile karıştırılarak, inkubasyon işlemi için solüsyon buzun içerisinde yaklaşık 6 dk. bekletilmiştir. Daha önceden parçaladığımız hücre kalıntılarını solüsyondan ayırmak için, yaklaşık 6 dk. santrifüjleme işlemi yapılarak, hücre kalıntılarının solüsyonun alt kısmına tortu oluşturup çökmesi sağlanmıştır. Santrifüjleme ve presipitation işlemleri yapıldıktan sonra solüsyonun üst kısmında kalan sıvı kısmı (süpernantant) yeni bir polietilen tüpün içerisine alınmıştır (350-400 µl). DNA zincirinin çift sarmal haline dönüşmesini engellemek için solüsyonun içerisine bir miktar DNA bindingsolition (400 µl) ve DNA’ nın sulu solüsyonun dibine çökmesini sağlamak için %96’lık etanol alkol ilave edilerek solüsyon karıştırılmıştır. Elde edilen karışım (400-500 µl) spin kolona alınarak, DNA’nın kolon üzerine bağlanıp, saflığı yüksek bir izolasyon sağlanmıştır. Kolonun içerisindeki istenmeyen hücre kalıntılarının solüsyonun dibine çökmesini sağlamak için 60 saniye santrifüjleyip (6000 g), dibe çöken kısım ortamdan uzaklaştırılmıştır. Bu işlem ikinci kez tekrar edilerek, kolonun dibinde kalan kalıntılar uzaklaştırılarak, saflaştırma izolasyonun kalitesi yükseltilmiştir. Kolonun içerisine, DNA’yı yıkamak amacı ile 500 µl AW1 (wash buffer 1) ilave edilip, yaklaşık olarak 60 saniye santrifüjlenerek (8000 g) kolonun dibinde kalan istenmeyen materyaller ortamdan uzaklaştırılmıştır. DNA’yı ikinci kez yıkamak için kolonun içerisine 500 µl AW2 (wash buffer 2) ilave edilip, yaklaşık olarak 180 saniye santrifüjleme (20000 g) işlemi yapılmıştır. DNA’yı yıkama işlemi tamamlandıktan sonra kolon, yaklaşık olarak 60 saniye daha santrifüjlenmiştir (20000 g). Santrifüjleme işlemleri tamamlandıktan sonra kolon, daha önceden steril edilmiş olan tüplerin (1,5 ml’lik) içerisine alınmıştır. Kolonun membranına yapışık olan DNA’yı tüpün içerisine akıtabilmek için, içerisine 100 µl AE buffer (elution buffer) ilave edilip, 20 ℃’de inkübe işlemi yapılıp daha sonra da yaklaşık olarak 60 saniye boyunca santrifüjleyerek (8000 g), DNA’nın tüpün içerisine akması sağlanmıştır. Tüpün 20 içerisinde elde edilen DNA’nın bozulmadan bekletilebilmesi için tüpler -20 ℃ ‘deki ortama alınmıştır. 3.2.4 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) PCR yöntemi kullanılarak, yaprak örneklerinden elde edilen DNA numunelerinin her biri çoğaltılmıştır. PCR analizi biberde TSWV hastalığına dayanıklılık sağlayan gen ile bağlantılı moleküler işaretleyiciyi geliştiren Moury ve ark. (2000) tanımladığı yönteme göre yapılmıştır. PCR analizi için SCAC568 ileri ve geri primerleri kullanılmıştır. SCAC568 F 5’-GTGCCAGAGGAGGATTTAT-3’ ve SCAC568 R 5- GCGAGGTGGACACTGATACT-3’ primerlerinin nükleotid dizileridir. Her bir PCR reaksiyonu 25 ng DNA, 200 uM dNTP karışımı, 0.3 uM ileri primer, 0.3 uM geri primeri, 1.5 mM MgCl2 ve 1.25 U DNA polimeraz içermektedir. PCR reaksiyonları steril ddH2O ile 25 uL’ye tamamlanmıştır. Reaksiyon karışımı buz üzerinde hazırlanmıştır. DNA’nın çoğaltılması için PCR reaksiyonu aşağıda verilen sıcaklık döngüsüne tabii tutulmuştur. Çizelge 3.1’de verilen PCR döngüsünde 2. 3. ve 4. basamaklar 45 defa tekrarlanmıştır. Çizelge 3.1. Termal Döngü Cihazı Koşulları BASAMAK NO SICAKLIK (℃) SÜRE (dk) 1. 94 2:00 2. 94 1:00 3. 60 1:00 4. 72 2:00 5. 72 10:00 6. 4 ∞ 3.2.5 PCR ile Çoğaltılan DNA Parçasının TaqI Enzimi ile Kesilmesi Polimorfizmi gözlemleyebilmek için PCR reaksiyonu ile çoğaltılan DNA parçası Moury ve ark. (2000) tarafından belirtildiği gibi TaqI enzimi ile aşağıda verilen reaksiyon karışımı kullanılarak kesilmiştir. Çoğaltılmış DNA parçasını içeren 10 μl PCR 21 reaksiyonuna 18 μl sterile ddH2O, 2 μl 10X reaksiyon tamponu ve 1 μl (10U) TaqI kesim enzimi eklenmiştir. Enzimin DNA parçasını kesebilmesi için reaksiyon karışımı 65℃’de 3 saat tutulmuştur. 3.2.6 Agaroz Jel Elektroforezi F1 ve GM1 bitkilerinin dayanıklılık genini taşıyıp taşımadığını gözlemlemek için Taq1 enzimi ile kesilen DNA parçaları %2 agaroz jeli kullanılarak büyüklüğüne göre ayrıştırılmıştır. DNA kesimi tamamlandıktan sonra DNA’nın kesilmesi için hazırlanan reaksiyonların üzerine 3 μl yükleme tamponu (0.25 g bromophenol mavisi, 6 ml %50 gliserol, 4 ml ddH2O, pH 8) eklenmiştir. Yükleme tamponu içeren 20 μl kesim enzimi reaksiyonu 1X TBE (10X TBE tamponun 1 litresinde; 110 g Tris-basic, 50 g Borik asit, 20 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0) çözeltisi içerisindeki %2’lik agaroz jele yüklenmiştir. DNA’lar agaroz jel içerisinde 70 volt (5 volt/cm) uygulayarak 120 dk. yürütülmüştür (Şekil 3.5). Büyüklüğüne göre ayrıştırılan DNA parçaları ultraviyole ışık kullanılarak gözlemlenmiş ve fotoğrafı çekilmiştir (Şekil 3.6). Şekil 3.5. Elektroforez tepsisindeki karışıma elektrik akımı (120 volt) uygulanarak (yaklaşık 120 dk.) elektroforezin yürütülmesi. 22 Şekil 3.6. Elektrik akımı işlemi tamamlandıktan sonra elektroforez tepsisinden çıkarılan jel, UV görüntüleme kutusunun içerisine alınarak DNA’nın görüntülenmesi. 23 4. BULGULAR Sabah saatlerinde baba hattının (Nr-07) çiçeklerinden alınan polenlerin, melezleme işleminde başarı yüzdesinin daha yüksek olduğu saptanmıştır (Şekil 4.1). Melezleme yapmaya en uygun çiçek, taç yaprak renginin yeşilden beyaza döndüğü ve taç yapraklarını açmaya yakın olduğu dönemde yapıldığında, başarı oranın daha yüksek olduğu tespit edilmiştir (Şekil 4.2). Melezleme işlemi yapıldıktan 3-4 gün sonra, dişicik borusunun hafif morumsu şeklinde renk değişimine uğraması ve dişi organın yumurtalık kısmının hafif şişmesi şeklinde belirtiler göstermesi, melezlemenin gerçekleştiğini göstermektedir. Şekil 4.1. Siyah zemin üzerinde, çiçeklerden alınan polen tozları 24 Şekil 4.2. Melezleme yapmak için en uygun çiçek tomurcukları Yapılan gözlemler sonucunda, elde edilen 6 farklı F1 biber genotipinde herhangi bir hastalık simptomu gözlemlenmemiştir. Kontrol çeşit olarak saksılara dikimini yaptığımız kapya biber bitkilerinde yapılan gözlemler sonucunda ise, hastalığa hassas olduğu tespit edilmiştir. Bitkilerde bodurlaşma, yaprakların üzerinde halkalı siyah lekeler gibi hastalık simptomlarına rastlanmıştır. SCAR yöntemi ile elde edilen 28 F1 genotipinin, TSWV hastalığına dayanıklılık durumlarına bakılmıştır. 6 farklı F1 bitkisinin TSWV hastalığına dayanıklılık geni taşıdığı tespit edilmiştir (Şekil 4.3). Moury ve ark. (2000) tarafından geliştirilen primerler kullanılarak gerçekleştirilen PCR analizinde 568 baz çifti (bç) büyüklüğünde sadece bir DNA parçası çoğaltılmıştır (Şekil 4.3A). F1 bitkilerin dayanıklılık genini taşıyıp taşımadığını belirlemek için çoğaltılan bu DNA parçası TaqI DNA kesim enzimi ile kesilmiştir (Şekil 4.3B). Dayanıklılık genini taşıyan bitkilerin çoğaltılan DNA parçası enzim ile kesilmiş ve 3 farklı DNA bandı gözlemlenmiştir. F1 bitkiler TSWV hastalığına dayanıklılık geninin hem hassas hem de dayanıklı allellerini heterozigot olarak taşımaktadır. Bu nedenle TaqI enzimi genin dayanıklı alleline kesmekte ancak hassas allelini kesmemektedir. Bu nedenle 3 farklı DNA bandına sahip olan tüm bitkiler geni heterozigot olarak taşımaktadır. Ancak dayanıklılık genini taşımayan bitkilerin 25 DNA örnekleri kullanılarak çoğaltılan DNA parçası TaqI enzimi tarafından kesilmediğinden sadece 1 DNA bandı gözlemlenmiştir (Şekil 4.3B). Şekil 4.3. TSWV hastalığına dayanıklılık genini taşıyan F1 bitkilerinin belirlenmesi. A) Moury ve ark. (2000) tarafından geliştirilen primerler kullanılarak çoğaltılmış DNA parçasının agaroz jel görüntüsü. B) Çoğaltılan DNA örneklerinin TaqI enzimi ile kesildikten sonraki agaroz jel görüntüsü. Dayanıklılık genini taşıdığını tespit ettiğimiz 6 farklı F1 bitkisi ana bitki olarak kullanılmış ve Ata-16 yerli kapya biber çeşidi ile tekrar melezlenerek GM1 tohumları elde edilmiştir. Her bir melezlemeden elde edilen GM1 tohumlarından 15’er adet tohum, viyollere ekilmiştir. 003 nolu genotipten 11 tohum, 004 nolu genotipten 13 tohum, 008 nolu genotipten 15 tohum, 022 nolu genotipten 12 tohum, 025 nolu genotipten 15 tohum, 026 nolu genotipten 15 tohum çimlenmiş ve elde edilen fideler saksılara şaşırtılmıştır. 26 Elde edilen toplam 6 F1 bitkinin Ata-16 ile melezlemesinden elde edilen GM1 bitkileri kullanılarak her bir F1 bitkisinin meyve özellikleri Cizelge 4.1’de verilmiştir. Genotipler arası ortak özelliklere baktığımızda, hepsinin olgunlaşma öncesi meyve dış rengi kuyu yeşil, olgunlaşma sonrası meyve dış rengi parlak koyu kırmızı, meyve eti kalın ve meyve lop sayısı ise 3’lü ve 4’lü olduğu görülmüştür. Genotipler arası farklarda ise göze çarpan özellik olarak 026 nolu genotipin diğer genotiplere göre yaklaşık olarak 10 gün daha erkenci olduğu tespit edilmiştir. Çizelge 4.1. Elde edilen TSWV’ye dayanıklı kapya biber hatlarının meyve özellikleri F1 TOPLAM BİTKİ HASAT HASAT MEYVE MEYVE MEYVE NO SAYISI BAŞINA SÜRESİ RENGİ EN BOY LOP MEYVE (gün) (cm) (cm) SAYISI 003 11 14-15 80-90 Kırmızı 5-6 16-17 3-4 004 13 10-13 80-90 Kırmızı 5-6 13-14 3-4 008 15 10-12 80-90 Kırmızı 4-5 16-18 3-4 022 12 8-10 80-90 Kırmızı 4-5 8-10 3-4 025 15 8-10 80-90 Kırmızı 6-7 16-17 3-4 026 15 12-14 70-75 Kırmızı 6-7 20-18 2-3 Elde edilen 6 farklı genotipin bitki yapısına baktığımızda ise, genel olarak bitki boyu uzun, sarkık çiçek yapısı, güçlü bitki şeklinde gözlem yapılmıştır (Çizelge 4.2). 022 nolu genotip, kısa meyve boyu ve zayıf bitki yapısı ile dikkat çekmiştir. 27 Çizelge 4.2. Elde edilen TSWV’ye dayanıklı kapya biber hatlarının bitki özellikleri GM1 BİTKİ YAPISI BÜYÜME BİTKİ BOYU ÇİÇEK NO GÜCÜ SAPININ DURUŞU 003 Yarı Dik Güçlü Uzun Sarkık 004 Yarı Dik Güçlü Uzun Sarkık 008 Yarı Dik Orta Orta Sarkık 022 Yarı Dik Zayıf Kısa Sarkık 025 Yarı Dik Güçlü Uzun Sarkık 026 Yarı Dik Güçlü Uzun Sarkık Şekil 4.4. GM1-003 ve GM1-004 nolu genotipler 28 Şekil 4.5. GM1-008 ve GM1-022 nolu genotipler Şekil 4.6. GM1-025 ve GM1-026 nolu genotipler 29 Genotiplerin fide aşamasındaki durumlarına baktığımızda ise, Sekil 4.6.’da görüldüğü gibi GM1-008 ve GM1-022 nolu genotiplerin bazı yapraklarında, 2 yaprak bitişik görünümlü şekle sahip olduğu saptanmıştır. Bu tip yaprak şekli, genotiplerin genetik özelliğinden kaynaklandığı düşünülmektedir. Şekil 4.7. GM1-008 ve GM1-022 nolu genotiplerin fide aşamasındaki yaprakların şekli GM1 bitkilerinden hangisinin dayanıklılık genini taşıdığını belirlemek için moleküler işaretleyici analizi tekrar edilmiştir (Şekil 4.8). Şekil 4.8A’da görüldüğü gibi Moury ve ark. (2000) tarafından geliştirilen primerler kullanılarak gerçekleştirilen PCR analizinde 568 baz çifti (bç) büyüklüğünde sadece bir DNA parçası çoğaltılmıştır. PCR analizi ile çoğaltılan DNA parçaları TaqI enzimi ile kesildiğinde dayanıklılık genini taşıyan bitkilerde 3 farklı büyüklükteki DNA bandı gözlemlenmiştir. Bu 3 farklı büyüklükteki DNA bandını bulunduran bitkiler dayanıklılık genini heterozigot olarak taşıdığından dayanıklı olan ve fenotipi kapya biber çeşidinde aranan özelliklere sahip olan bitkiler kendilenmiştir. Kendilenmiş bitkiler arasında geni homozigot olarak taşıyan bitkiler belirlenecektir. 30 Şekil 4.8. TSWV hastalığına dayanıklılık genini taşıyan GM1 bitkilerinin belirlenmesi. A) Moury ve ark. (2000) tarafından geliştirilen primerler kullanılarak çoğaltılmış DNA parçasının agaroz jel görüntüsü. B) Çoğaltılan DNA örneklerinin TaqI enzimi ile kesildikten sonraki agaroz jel görüntüsü. Ticari çeşit olan Nr-07 F1 kapya biber çeşidini kendileme yaptığımızda, çok farklı genotipler elde edilmiştir. Bu genotiplerin bazıları meyve şekli yuvarlak ve acılık brixi çok yüksek olan süs biberi tipinde (Şekil 4.9), bazı genotiplerin meyve uç kısımları küt şeklinde, meyve duruşu yukarı yönde olan mazamort biber tipinde (Şekil 4.10), bazı genotiplerin meyve şekli hafif basık uç kısma doğru incelen balık biber tipinde (Şekil 4.11), bazı genotiplerin kardola biber tipinde (Şekil 4.12) olduğu gözlemlenmiştir. Nr- 07 F1 kapya biber çeşidinin tatlı olması, kendileme sonucunda elde edilen genotipler arasındaki acı biberin, acılık geninin resesif olduğu tespit edilmiştir. 31 Şekil 4.9. Nr-07 süs biber tipi Şekil 4.10. Nr-07 mazamort biber tipi Şekil 4.11. Nr-07 balık biber tipi Şekil 4.12. Nr-07 kardola biber tipi 32 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Dünyada nüfusun artması, aynı zamanda da gıda tüketiminin artmasına sebep olmaktadır. Tüketim artışını karşılayabilmek için ise, tarımsal üretimin arttırılması gerekmektedir. Tarımda, üretimi etkileyen en büyük sorunların başında hastalık ile mücadele gelmektedir. Bazı hastalıkların mücadelesinde kimyasal yöntemler uygulayarak, hastalık ile mücadele edilebilmektedir. Fakat bazı hastalıkların kimyasal mücadelesi bulunmamaktadır. Bu tür hastalıkların başında da TSWV (Tomato Spotted Wild Virus) gelmektedir. TSWV hastalığı, tohum, fide, konukçu bitkiler (süs bitkileri vs.), vektörler vasıtasıyla kolaylıkla yayılabilmektedir. Bu durumun sonucunda da tarımsal üretimde çok fazla ekonomik kayıplara neden olmaktadır. TSWV hastalığı ile ilgili en iyi mücadele yöntemlerinden birisi, üretimde bu hastalığa dayanıklı çeşitler tercih edilmesidir. Son dönemlerde TSWV hastalığına dayanıklı çeşitler elde etme konusunda dünyada olduğu kadar, ülkemizde de çok fazla sayıda çalışmalar yapılmaktadır. Bunun sonucunda da tarımsal üretimde ekonomik kayıplar minimuma indirilmiş olacaktır. Bu çalışmada, yerel kapya biber çeşidine (Ata-16) son dönemlerde üretimde büyük ekonomik kayıplara neden olan TSWV hastalığına karşı dayanım kazandırarak, tarımsal üretimde uzun yıllar kullanılmasına olanak sağlayıp, yerel çeşitlerin yok olup gitmesinin önüne geçilmesi hedeflenmiştir. Ticari satışı yapılan Nr-07 kapya biber çeşidinin TSWV dayanımına sahip olduğu firması tarafından beyan edilmiştir. Ata-16 yerel kapya biber çeşidinin TSWV ye karşı dayanımının olmadığını laboratuvar şartlarında tespiti yapılmıştır. Bu iki kapya biber çeşitleri (Nr-07 ve Ata-16) arasında melezleme işlemi yapılıp, F1 şeklinde genotipler elde edilmiştir. F1 genotiplerinin tohumları çimlendirilip, elde edilen fidelerden yaprak numuneleri alınıp, laboratuvar ortamında testlemesi yapılıp TSWV ye dayanıklı olan genotipler tespit edilmiştir. Dayanıklı olan genotiplerin fideleri saksılara dikilerek, tekrar Ata-16 yerel kapya biber çeşidi ile melezleme yapılıp geri melez 1 (GM1) genotipleri elde edilmiştir. Elde edilen GM1 genotiplerinin tohumları tekrardan çimlendirilip, elde edilen fidelerin yapraklarından numuneler alınıp laboratuvar ortamında testlemesi yapılıp TSWV ye dayanıklı olan genotipler tespit edilmiştir. Elde edilen TSWV ye dayanıklı GM1 hererozigot genotiplerin tohumları tekrardan fide haline getirilip, kendileme işlemi yapılıp, 33 dayanıklı homozigot saf hatlar elde edilecektir. Elde edilen homozigot saf hatların hastalık dayanımı moleküler markör yardımı ile tespiti yapılacaktır. Çelik ve ark. 2010 yılında biberde TSWV hastalığının yayılması ve dayanıklılık konusunda yapmış oldukları çalışmada, TSWV'nin tüm dünyada üretimde ekonomik yönden çok fazla kayıplara neden olduğunu, bitkiler üzerindeki belirtilerinin bodurlaşma, yapraklar üzerinde kahverengi dairesel lekeler ve meyvelerin üzerinde lekeler ve şekil bozukluklarının görülerek üretimde kayıplara sebebiyet verdiğini, ayrıca TSWV hastalığının teşhisinde en güvenilir etkin yöntemlerin mekanik inokulasyon, PCR ve DAS-ELISA yöntemleri olduğunu belirtmişlerdir. Bu çalışmada TSWV'nin biber üretiminde ekonomik kayıpların önüne geçmek için, bu hastalığa hassas olan Ata- 16 yerel kapya biber çeşidine TSWV dayanıklılık geni aktarılarak, bu genin aktarıldığının tespiti için de güvenilir yöntemlerden biri olan mekanik inokulasyon ve PCR yöntemleri kullanılmıştır. Çelik ve ark. 2018 yılında yapmış oldukları çalışmada, TSWV ye dayanıklı demre biber hatları geliştirmişlerdir. Ticari olarak satışı yapılan fakat dayanımı olmayan SD8 demre biber çeşidi ile testleme sonucunda dayanıklı olduğu tespit edilen 3 farklı demre biber çeşidini melezlemişlerdir. SD8 demre biber çeşidini ana hat olarak, diğer 3 çeşidi de baba hat olarak kullanmışlardır. İlk melezlemeden sonra elde edilen hibrit (F1) tohumlar beş kez kendileme yapılarak beşinci generasyona kadar ulaşmışlardır. Her kendilemeden sonra elde edilen generasyon teste tabii tutularak, dayanıklı bireyler tespit edilip, kendileme işlemine dayanıklı bireyler ile devam etmişlerdir. Bu işlemlerin sonucunda biber ıslahında kullanılabilecek 10 yeni hat elde etmişlerdir. Bu çalışmada TSWV ye dayanıklı ticari çeşit olan Nr-07 kapya biber çeşidi ile TSWV dayanımı olmayan yerel kapya biber çeşidi olan Ata-16 arasında geri melezleme yapılmıştır. Ana hat olarak Ata-16 çeşidi, baba hat olarak ta Nr-07 çeşidi kullanılmıştır. Melezleme işlemi yapıldıktan sonra her generasyon testlemeye tabii tutularak, dayanıklı olduğu tespit edilen genotipler kendilenmiştir. Sonuç olarak TSWV dayanımlı 6 farklı kapya biber hattı elde edilmiştir. 34 Başarılı şekilde sonuçlanan bu tez çalışmasında, elde edilen TSWV’ye dayanıklı yeni kapya biber çeşidinin Türk tarımına önemli bir ekonomik katkı sağlayacağını ve yeni ebeveyn hatların, kapya biber ıslah çalışmalarında ıslahçılara yardımcı olacağı düşünülmektedir. 35 KAYNAKLAR Ahmed, S.M. 2013. Inter-simple sequence repeat (ISSR) markers in the evaluation of genetic polymorphism of Egyptian Capsicum L. hybrids. African Journal of Biotechnology, 12 (7): 665-669. Akıncı, S., Akıncı, İ.E. 1999. Kahramanmaraş Kırmızı Biber Yetiştiriciliğinin Sorunları. Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği Karşısında Kahramanmaraş Biberinin Sorunları ve Çözüm Önerileri Paneli, 6 Mart 1999, Kahramanmaraş. Anonim 2006a. Zirai Mücadele Teknik Talimatı, Domates lekeli solgunluk virüsü s.1- 2. Anonim 2006b. Zirai Mücadele Teknik Talimatı, Domates lekeli solgunluk virüsü s. 3- 4. Anonim 2021. https://plantpath.ifas.ufl.edu/u-scout/pepper/tomato-spotted-wilt.html (Erişim tarihi: 29.01.2021). Aybak, H.Ç. 2002. Biber Yetiştiriciliği Hasad Yayıncılık s. 155. Azeri, T. 1981. Preminary Report Of Tomato Spotted Wilt Virüs And İts Epidemy On Tobacco İn The Çanakkale Region Of Turkey. Journal Turkish Phytopathology, 10(2- 3): 79-87. Black, L., Hobbs, H.A. and Gatti, J.M. Jr. 1991. Tomato spotted wilt virüs resistance in capsicum chinense ‘PI-1522252 and ‘PI-159236’. Plant Disease Journal, 75 (8):863. Black, L.L. 1973. Research on virüs diseases of peppers in Lousiana. Pages 12-13 in: Proc. 1st Natl. Pepper Conf. B. Villalon, ed. Pickle Packers Intl., St. Charles, IL. Bond, W.P., Wıhıtam, H.K., and Black, L.L. 1983. Indigeneus Weeds as Reservoirs of Tomato Spotted Wilt İn Locisiana. Phytopathology, 73:493. Bos L. 1982. Crop losses caused by viruses, Crop Protection, 1(3): 263-282. Cheng, S. S., Green, S.K., Griggs, T.D., Mclean, B.T. 1989. The use of Capsicum chinense as sweet pepper cultivars and Pepper Production in the Tropics. Proceedings of the international symposium on integrated management practices, Tainani Taiwan, 21- 26. March 1988. AVRDC Publication No.89-317:55-62. Culbreath, A.K., Csınes, A.S., Bertrant, P.F., Demskı, J.W. 1991. Tomato Spotted Wilt Virüs. Epidemic in Flue-Cured Tobacco in Georgia. Plant Disease Journal, 75: 483-485. Cupertına, F.P., Lin, M.T., Munoz, J.O. 1984. Perdas na produgao do pimentae induzidas pelo virüs de vira-cabega do tomaterio. Fitopatool. bras 9: 397. 36 Çelik, İ., Özalp, R., Çelik, N., Polat, İ., Sülü, G. 2018. Domates Lekeli Solgunluk Virüsüne Dayanıklı Sivri Biber Hatlarının Geliştirilmesi, s. 27-36. Çelik, İ., Özalp, R., Polat, İ. 2010. Biberde Domates Lekeli Solgunluk Virüs (Tomato Spotted Wilt Virus-TSWV) Hastalığı, Yayılışı ve Dayanıklılık Çalışmaları, VIII. Tarım Sempozyumu, s. 477-484. Çelik, K. 2019. Bazı Biber Genotiplerinin Domates Lekeli Solgunluk Virüsü (TSWV) ne Karşı Dayanıklılıklarının Belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, KİYÜ Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, Kilis. De Haan, P., Wagemakers, L., Peters, D., Goldbach, R. 1990. The S RNA segment of tomato spotted wilt virus has an ambisense character. Journal of General Virology, 71(5): 1001-1007. DeWitt, D., Gerlach, N. 1990. The whole chile pepper book. s. 110-125. Doyle, J.J., Doyle J.L. 1990. Isolatıon of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 13- 15. Eşiyok, D. 2006. http://www.dunyagida.com.tr/haber/biberin-anavatani-ve- yayilisi/2045 (Erişim tarihi: 09.03.2020). FAO, 2020. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome. http://www.fao.org (Erişim tarihi:20.06.2020). German, T. L., Ullman, D. E., Moyer, J. W. 1992. Tospoviruses: Diagnosis, Molecular Biology, Phylogeny And Vector Relatinonships. Annual Review of Phytopathology. 30: 315-348. Goldbach, R., D. Peters, 1994. Possible causes of the emergence of tospovirus diseases. Contribution to journal. 5: 113-120. Golnaraghi, A.R. 2001. First Report of Tomato Spotted Wilt Virüs on Soybean in Iran. Plant Disease Journal, 85(12): 1290. Gordillo, L.F. Stevens, M.R., Millard, M.A., Geary, B. 2008. Screening two Lycopersicon Peruvinanum Collections For Resistance to Tomato Spotted Wilt Virüs, Plant Disease Journal, 92(5): 694-704. Govindarajan, V.S. 1986a. Capsicum-Productıon, Technology, Chemistry, and Quality Part I. History, Botany, Cultivation and Primary Processsing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 22: 109. Govindarajan, V.S. 1986b. Capsicum-Productıon, Technology, Chemistry, and Quality Part III. Chemistry of the Color, Aroma, and Pungency Stimuli. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 24: 245. 37 Graves, R.L., Walgenbach, J.F., Moyer, J.W., Kennedy, G.G. 2002. The Role of Weed Hostr and Tabacco Thrips, Frankliniella fusca, in the Epidemiology of Tomato Spotted Wilt Virüs. Plant Disease Journal, 86: 573-582. Greenogh, D.R., Black, L.L., Story, R.N., Newson, L.D., Bond, W.P. 1985. Occurance of Frankliniella occidentalis in Lousiana:A possible cause for the increased incidence of Tomato Spotted Wilt Virüs (Abstr.) Phytapathology, 75: 1362. Greenogh, D.R., Black, L.L., Story, R.N., Newson, L.D., Bond, W.P. 1990. Occurance of Frankliniella occidentalis in Lousiana: A possible cause fort he increased incidence of Tomato Spotted Wilt Virüs (Abstr.), Phytapathology, 75: 1362. Griep, R.A., Prins, M., Van Twisk C., Keller J,H,G., Kerschbaumer R.J., Kormelink, R., Golbach R.W., Schots, A. 2000. Application of Phage display in selecting Tomato spotted wilt virus - Specific single - Chain antibodies (scFvs) for sensetive diagnosis in ELISA., Phytopathology 90: 183-190. Güldür, M.E., Marchouks, M.G.M., Yurtmen, E., Yılmaz, M.A. 1995. Mersin ve Çevresinde Yetiştirilen Domateslerde Zararlı Yen, Bir Virüs Tomato Spotted Wilt Virus. VII. Türkiye Fitopatoloji Kongresi, 26-29 Eylül 1995, Adana, s. 303-306. Hausbeck, M.K., Wellıver, R.A., Derr, M.A., Gılbow, F.E. 1992. Tomato Spotted Wilt Virus Survey Among Greenhouse Ornamentals İn Pennsylvania. Plant Disease Journal, 76: 795-800. Holcomb, G.E., Valverde, R.A. 1999. First Report of Oidium sp. Powdery Mildew and Tomato Spotted Wilt Virüs on Melampodium divaricatum. Plant Disease Journal, 84: 1152. Kaloo, G. 1988. Breeding Methods in Vegetable Crops (chapter 3). In: Vegetable Breeding. Vol. I:75-104, CRC Press, Boca Raton, Florida, USA. Kumar Shaha, R., Rahman, S., Asrul, A. 2013. Bioactive compounds in chilli pepper (Capsicum annuum L.) at various ripening (green, yellow and red) stage. Annals of Biological Research, 4(8): 27-34 Kumari, S. 2012. Influence of climate change in capsicum production. Vegetable production under changing climate scenario. 1-21 September. Nauni, Solan, s. 104-107. Li, G., Quiros, C.F. 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. The oretical and Applied Genetics, 103(2-3): 455-461. Mandal, B., Pappu, H.R., Culbreath, A.K., Holbrook, C.C., Garbet, D.W., Tood, J.W. 2002. Differantial Response of Selected Peanut (Arachis hypogea) Genatypes to Mechanical İnoculation by tomato Spotted Wilt Virüs. Plant Disease Journal, 86: 939- 944. 38 Mcleod, M.J., Guttman, S.I., Eshbaugh, W.H., Rayle, R.E. 1983. An Electrop horetic Study of the Evolution in Capsicum (Solanaceae). Evolution, 37: 562-574. Momol, M.T. 2000. Firs Report of Tomato Spotted Wilt Virüs in Habanero and Tabasco Peppers in Florida. Plant Disease Journal, 84(10): 1154. Moury B, Selassie-Gebre K, Marchoux G, Daubeze A.M., Palbix, A. 1998. High temperature effects on hypersensitive resistance to tomato spotted wilt tospovirus in pepper. European Journal of Plant Pathology, 104: 489-498. Moury, B., Pflieger, S., Blattes, A., Lefebvre, V., Palloix, A. 2000. A CAPS marker to assist selection of Tomato Spotted Wilt Virus resistance in pepper. Genome, 43(1): 137-142. Nagata, T., Almedia, A.C.L., De Resende, R.O., De Avila, A.C. 2002. The Transmission specificity and efficency of tospoviruses, Marulla R. Mound, L.A.(eds), Thrips and tospoviruses:Proceedings of the 7the İnternational Symposium on Thysanoptera. Canbera , Australian National İnsect Collection. s. 45-46. Özdikmenli, S., Zorba, N. 2013. Traditional Red Roasted Pepper (TFP_1780) The 2nd International Symposium on "Traditional Foods from Adriatic to Caucasus" 24-26 October 2013. Struga, Macedonia. Pernezny, K., Roberts P.D., Murphy J.F. and Goldberg N.P. 2003. Compendium of pepper diseases, The American Phytopathological Society, 63. Pickersgill, B. 1984. Migrations of chili peppers, Capsicum spp., in the Americas, p. 105-123. Pourrahim, R., Farzadfar, Sh., Moini, A.A., Shahrafer, N., 2001. First Report of Tomato Spotted Wilt Virüs on Potatoes in İran. Plant Disease Journal, 85: 442. Rosello, S., Diez, M.J., Nuez, F. 1996. Viral diseases causing the greatest economic losses to the tomato crop. I.The Tomato spotted wilt virus -a review. Scienta Horticulturae 67: 117-150. Soler, S., Diez, M. J., Nuez, F. 1998. Effect of Temperature Regime and Growth Stage İnteraction On Pattern of Virus Presence İ TSWV-Resistant Accessions of Capsicu Chinense, Plant Disease Journal, 82(11): 1199-1204. Strange R.N., Scott, P.R. 2005. Plant Disease: A Threat to Global Food Security. Annual Review of Phytopathology, 43: 83-116. Şimşek, D. 2015. Moleküler Islah Yöntemleri Kullanılarak Tospovirus ve Tobamo Viruslere Dayanıklı Çarli Biber (Capsicum Annum L.) Hat ve Çeşitlerinin Geliştirilmesi. Selçuk Tarım Bilimleri Dergisi, 1(1): 1-5. 39 Tekinel N., Dolar M.S., Nas Z.Y., Salcan Y. 1969. Çukurova Bölgesinde Sivri Biberlerdeki Mozaik Virüslerin Yağsız Sütle Önlenmesi Üzerinde Çalışmalar. Bitki koruma bülteni, s. 36-44. TUIK 2020. Türkiye istatistik kurumu. http://www.tuik.gov.tr (Erişim tarihi:23.03.2020). Tunç, İ., Göçmen, H. 1995. Antalya’da bulunan iki sera zararlısı Polyphagotar latus (Banks) (acarina, Tarsonemidae) ve Frankliniella occidentalis (Pengande) (Thysanoptera, Tyripidae) üzerine notlar. Türkiye Entomoloji Dergisi, 19: 101,10 Turhan, P., Korkmaz, S. 2006. Çanakkale İlinde Domates Lekeli Solgunluk Virüsünün Serolojik Ve Biyolojik Yöntemlerle Saptanması. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Tarım Bilimleri Dergisi, 12(2): 130-136, Uhrig, J.F., Soellick, T.R., Minke, C.J., Philipp, C., Kellmann, J.W., Schreier, P.H. 1999. Homotypic interaction and multimerization of nucleocapsid protein of Tomato spotted wilt tospovirus: Identification and characterization of two interacting domains. Proceedings of the National Academy of Sciences, 96: 55-60. Verit, A., Yeni, E., Ünal, D. 2001. Tarihten Günümüz Ürolojisine Kırmızı Acı Biber. Türk Üroloji Dergisi, 27(4): 399-402. Vural, H., Eşiyok, D., Duman, İ. 2000. Kültür sebzeleri sebze yetiştirme. Ege Üniversitesi, İzmir, s. 440. Wijkamp, I., Peters, D. 1993. Determination of the median the latent period of two tosporiviruses in franklinialla occidentalis using a novel leaf disk assay. Phytopathology, 82: 986-991. Wolcan, S., Ronco, L., Dal Bo, E., Lorı, G., Alıppı, H. 1996. Disease on Lisianthus in Argentina. Plant Disease Journal, 80: 223. Yudin, L.S., Tabashnik, B.E., Cho, J.J., Mitchell, W.C. 1990. Disease Prediction and Economic Models for Managing Tomato Spotted Wilt Virüs Disease in Lettuce. Plant Disease Journal, 74: 211-216. 40 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Onur ÇOBAN Doğum Yeri ve Tarihi : BURSA 03.02.1986 Yabancı Dil : İngilizce Eğitim Durumu Lise : Çınar Lisesi - 2003 Lisans : Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi - 2008 Yüksek Lisans : Uludağ Üniversitesi - 2021 Çalıştığı Kurum/Kurumlar : Metgen Tohumculuk Ltd. Şti. – 2010 İletişim (e-posta) : 16onurcoban@gmail.com 41