T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ ve EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI FARKLI HİSTOLOJİK BOYAMA YÖNTEMLERİNİN KIKIRDAK DOKUSUNDA KARŞILAŞTIRILMASI Esra ŞEN (YÜKSEK LİSANS TEZİ) Bursa–2014 T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ ve EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI FARKLI HİSTOLOJİK BOYAMA YÖNTEMLERİNİN KIKIRDAK DOKUSUNDA KARŞILAŞTIRILMASI Esra ŞEN (YÜKSEK LİSANS TEZİ) Danışman: Prof. Dr. Şahin A. SIRMALI Bursa–2014 SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ’NE Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Öğrencisi Esra ŞEN tarafından hazırlanan "Farklı Histolojik Boyama Yöntemlerinin Kıkırdak Dokusunda Karşılaştırılması" konulu Yüksek Lisans tezi ………/………/…………günü, …………–……… saatleri arasında yapılan tez savunma sınavında jüri tarafından oybirliği/oyçokluğu ile kabul edilmiştir. Adı–Soyadı İmza Tez Danışmanı Prof. Dr. Şahin A. SIRMALI Üye Üye Üye Üye Bu tez Enstitü Yönetim Kurulu’nun ………………………………………. tarih ve ………………………. sayılı toplantısında alınan ……………………… numaralı kararı ile kabul edilmiş- tir. Prof. Dr. Metin PETEK Enstitü Müdürü İÇİNDEKİLER TÜRKÇE ÖZET ii İNGİLİZCE ÖZET iii GİRİŞ 1 GENEL BİLGİLER 4 GEREÇ ve YÖNTEM 25 Doku preparatlarının hazırlanması 25 Doku preparatlarının boyanması 25 BULGULAR 26 TARTIŞMA ve SONUÇ 89 KAYNAKLAR 94 TEŞEKKÜR 96 ÖZGEÇMİŞ 97 i ÖZET Günümüzde kıkırdak doku bileşenlerini göstermek için kullanılan bazı temel boyama yöntemleri vardır ve istenilen amaç doğrultusunda iyi sonuç vermektedirler. Ancak bu yöntemlerin her biri kullanışlılık açısından bir takım dezavantajlara da sahiptir. Bu nedenle %10’luk formalinde fikse edilen dokulardan alınan kesitler, rutin sitolojik vaginal smear boyamasında kullanılan Shorr boyası ve bununla birlikte on farklı teknikle boyandı. Böylece gerek bu yöntemlerin ve gerekse Shorr boyama yönteminin avantaj ve dezavantajları kıyaslanabildi. Sonuç olarak, dezavantajları en aza indirecek ve araştırmacıların istediği boyama sü- resi, solüsyon sayısı ve maliyet açısından daha ekonomik olan Shorr boyasının kıkırdak doku bileşenlerini ışık mikroskobik düzeyde oldukça iyi gösteren bir boyama yöntemi ola- cağı kanısındayız. Anahtar Kelimeler: Kıkırdak boyama yöntemleri ii SUMMARY COMPARISON of DIFFERENT HISTOLOGICAL STAINING METHODS in CARTILAGE TISSUE At the present time there are some basic staining techniques that used to detect the car- tilage tissue components and these techniques show better results on for purposes. However each of these methods also has some disadvantages in terms of feasibility. Therefore we stained the incisions which are collected from the tissues that 10% for- malin fixed with Shorr, routinely used in cytological vaginal smear staining, and with other ten different techniques. Thus we had the opportunity to compare the advantages and di- sadvantages of Shorr and other staining techniques. As a result, we are of the opinion that Shorr staining which is more affordable in terms of staining duration, the number of solutions and cost, will minimize the disadvantages the- refore Shorr is a better staining technique for cartilage tissue in presentation of lighting microscobe. Key Words: Staining procedures of cartilages iii GİRİŞ Günümüzde klasik histoloji teknikleri kitaplarında ışık mikroskobik düzeyde kıkırdak doku bileşenlerinin gösterilmesi için birçok yöntem önerilmektedir. van Gieson boyası (1); bütünüyle en iyi bilinen bağ dokusu boyalarından birisidir. Bağ dokusu boyalarından birisi olan Verhoeff yöntemi (3) ile benzerlik göstermektedir. De- mirli Hematoksilenli van Gieson boyası (2); kollajen, kas, çekirdek, keratinize epitel ve hi- yalin yapılarını göstermek için kullanılmıştır. Verhoeff boyası (3); elastik ve kollajen lif ayırımını gösterdiği için elastik dokular bu yöntemle boyanmıştır. Masson trikrom boya- masıyla (3) çekirdek, sitoplazma, kollajen, kas ve interselüler lifler gösterilmiştir. van Gie- son boyasının Fast Green modifikasyonuyla (4); bağ dokuları, kas, sitoplazma, eritrositler ve çekirdeklerin gösterilmesi amaçlanmıştır. Modifiye edilmiş Gallego elastik doku boyası (4) elastik dokuları göstermek amacıyla kullanılmıştır. Bu boya (4) sonucu elastik lifler, kollajen, kas, kıkırdak ve mukus yapıları gösterilmiştir. Frankel’in elastik dokuları için önerdiği Orsein yöntemi (4) ile elastin, kollajen, kas ve çekirdek yapıları boyanmıştır. Bi- elschowsky yöntemiyle (4) ince ve kalın kollajen liflerin, elastik liflerin, kas liflerinin, çe- kirdek ve sitoplazma yapılarının boyanması gösterilmiştir. Lillie modifikasyonu (4) ile ka- lın kollajen lifler, ince kollajen lifler ve diğer yapılar boyanmıştır. Lillie modifikasyonuyla (4) hücreler, sitoplazma, kas ve kollajen boyanması gösterilmiştir. Weiggert’in Resorsin Fuksin yöntemiyle (4) elastik ve kollajen lifler boyanmıştır. Mollier’in Qadruple boyama yöntemiyle (4) elastik dokular, iskelet ve düz kaslar, kollajen lifler, epitel ve kromatin gös- terilmiştir. Komhauser’in Quad boyama yöntemiyle (4) elastik, kollajen, sinir lifleri ile çe- kirdek ve kompleks dokuların elemanter yapılarının çoğu gösterilmiştir. Mayer’in Hema- lum ve Eosin Mavimsi boyama yöntemiyle (4) kollajenli dokular gösterilmiştir. Bauer’in yöntemiyle (2); çekirdek ve kıkırdak matriksi boyanmıştır. Biebrich Scarlet boyama yön- temiyle (2); farklı pH’larda kollajen lifler, elastik lifler ve kas boyanmıştır. Metil Green ile birlikte kullanılan Bismark Brown yöntemiyle (2) kıkırdak, goblet hücreleri ve tüm hücre çekirdeklerinin farklı tonlarda boyandığı gösterilmiştir. Pyroninli Metil Yeşil boyaması sonucu (2); kıkırdak matriks boyanması gösterilmiştir. Custer yöntemiyle (2); biyopsi ma- teryali olan kemik iliğinde kıkırdak, kemik, çekirdek ve eritrosit yapıları farklı tonlarda bo- yanmıştır. 1 Klasik kitaplarda önerilen bu boyama yöntemleri kıkırdak dokusu bileşenlerini göster- mek için oldukça doyurucu sonuçlar vermektedirler. Ancak bu yöntemlerin birtakım ko- şullara gereksinme göstermeleri, araştırmacıları daha kullanışlı yeni yöntemler geliştir- meye yöneltmiştirler. Taranabilen literatürde, farklı amaçlar için kıkırdak dokusunu gös- termede kullanılan yöntemlere rastlanmaktadır. Bleys ve arkadaşları (5), beş insandan aldıkları burun parçalarının septal ve lobular kı- kırdak dokularını Mallory–Cason, Azan, Herovici, Verhoeff–van Gieson ve Lawson yön- temleriyle boyayarak perikondral kılıfı göstermişlerdir. Wei ve arkadaşları (6), çalışmalarında Safranin O boyama yöntemini kullanarak osteo- artritik kıkırdak ile normal kıkırdağı karşılaştırmışlardır. Naumann ve arkadaşları (7), tav- şan kıkırdak alt tiplerini belirlemek amacıyla Safranin O boyama yöntemini kullanmışlar- dır. Lee ve arkadaşları (8), Hematoksilen–Eosin ve Safranin O boyalarını kullanarak insan nazal kıkırdağındaki yaşa bağlı değişimleri göstermişlerdir. Xue ve arkadaşları (9), hücre kültürü çalışması sonucu elde ettikleri aselüler kıkırdak adacıklarının kondrojenik farklılaş- masını göstermek amacıyla, histolojik doku analizi için Hematoksilen–Eosin boyama yön- temini kullanırken, glikozaminoglikan birikimini göstermek için Safranin O ve Toluidine Blue boyama yöntemlerini kullanmışlardır. Loewi (10), Alcian Blue yöntemiyle kıkırdaktaki mukoproteinlerin lokalizasyonunu göstermiştir. Stockwell (11), yaşlanan kıkırdaktaki glikozaminoglikanları araştırmak ama- cıyla Alcian Blue yöntemini kullanmıştır. Brisby ve arkadaşları (12), Alcian Blue yönte- mini kullanarak oluşturdukları sıçan modelindeki koşu egzersizinin intervertebral diskler- deki ekstraselüler matriks üretimini araştırmışlardır. Terry ve arkadaşları (13), Alcian Blue ve Toluidine Blue boyalarını hücre kültürü çalışmalarında artiküler kıkırdak tarafından sentezlenen proteoglikanları ve glikoproteinleri mikrogram miktarında ölçmek amacıyla kullanmışlardır. Björnsson (14), çalışmasında ‘Alcian Blue Dot Blot’ analiz yöntemiyle biyolojik sıvılardaki glikozaminoglikanların miktar olarak ölçümünü göstermiştir. Brada- mante ve arkadaşları (15), sıçan dış kulağındaki ikincil elastik kıkırdağın farklılaşmasını Alcian Blue–Pas, Hemalaum–Eosin boyamalarını kullanarak ekstraselüler matriksi, Mas- son boyaması kullanarak hücresel yapıların etrafındaki bağ dokusu yapılarını göstermişler- dir. Crossmon (16), Mallory’nin Aniline Blue yöntemini modifiye ederek daha etkili bir boyama elde etmeyi amaçlamıştır. 2 Özcan ve arkadaşları (17), metakromaziyi tanımlamış ve kıkırdak dokusunda metakro- matik etki gösteren boyaların özelliklerini ve metakromaziye neden olan faktörleri bildir- mişlerdir. Smith ve arkadaşları (18), çalışmalarında insan fetal, koyun yenidoğan ve yetişkin ek- lem dokularındaki proteoglikanların lokalizasyonunu belirlemek için Toluidine Blue yönte- mini kullanmışlardır. Fast Green FCF solüsyonuyla ise zemin boyanması gerçekleştiril- miştir. Hattori ve arkadaşları (19), çalışmalarında süperfisyal zondaki kondrosit progenitör hücrelerini belirlemek amacıyla Toluidine Blue boyama yöntemini kullanarak histolojik değerlendirme yapmışlardır. Bos ve arkadaşları (20), tavşan aurikular kıkırdağında yara modeli oluşturarak, Thionin boyama yöntemiyle yara iyileşmesini göstermişlerdir. Cross ve arkadaşları (21), sitrik asit ve sodyum fosfatla hazırladıkları solüsyonda fikse ettikleri dokuları değişik birleşim ve yoğunluktaki Azure A ve Eosin boyalarını kullanarak kıkırdak boyanmasını göstermişlerdir. Klasik histolojik boyama teknikleri kitaplarında önerilen kıkırdak doku boyama yön- temleri gerçekten başarılıdır. Ancak araştırmacılar ya bu yöntemleri modifiye edebilmek ya da bu yöntemlerin yerine geçecek daha kullanışlı yöntemler bulabilmek için bir çaba içindedirler. Bu çabaların başlıca nedenleri; boyama süresini kısaltmak, rutin fiksatif olan %10 formalin ya da nötral formalinde fikse edilmiş parçaları da boyayabilmek, sabitleştir- meye ya da farklılaştırmaya gerek duymamak ve boyamayı tek bir solüsyonda gerçekleştir- mektir. Sonuçta daha ekonomik ve kullanışlı bir boyama yöntemi bulabilmek, esas amaç- tır. Bu çalışmada; %10 formalinde fikse edilen dokularda, daha önce parafin kesitlerde kı- kırdak boyamak için denenmemiş olan, Shorr ile tek bir solüsyonda sabitleştirmeye ve farklılaştırmaya gerek duyulmadan kıkırdak doku bileşenleri gösterilmeye çalışıldı. Bunun yanı sıra başka dokuların da boyandığı görüldü. Ayrıca klasik boya yöntemleri de uygula- narak, kullanılan boyanın avantaj ve dezavantajları belirlenmeye çalışıldı. 3 GENEL BİLGİLER Kıkırdak Kıkırdağa Genel Bakış Kıkırdak, kondrosit adı verilen hücreler ve yüksek düzeyde özelleşmiş ekstraselüler matriksten oluşan bir bağ dokusu şeklidir. Kıkırdak, kondrositlerden ve bol miktarda ekstraselüler matriksten oluşan avasküler bir dokudur. Kıkırdak hacminin %95’den çoğu, bu dokunun işlevsel bir elemanı olan ekst- raselüler matriksten oluşmaktadır. Kondrositler, matriksin üretimi ve devamlılığı için ge- rekli öğelerdir (22). Şekil 1. Kondrosit (K) (23). Kıkırdağın ekstraselüler matriksinin katı ve sabit şekilli, aynı zamanda da katlanabilir olması dirençliliğini açıklamaktadır. Kıkırdakta damar ağı bulunmaması nedeniyle ekstra- selüler matriksin yapısı, kondrositlerin yaşamını sürdürebilmesi için çok önemlidir. Kıkırdak matriksinde glikozaminoglikanların tip II kollajen liflerine oranının yüksek olması, çevreleyen bağ dokusundaki kan damarları ile matrikste dağılmış olan kondrositler 4 arasında maddelerin difüzyonuna izin vermekte ve böylece doku canlılığının devamlılığı sağlanmaktadır. Zıt biyofiziksel özelliklere sahip iki yapısal molekül sınıfı arasında yakın ilişki görül- mektedir. Bu moleküller, gerilime direnç gösteren kollajen lif ağı ve yüksek miktarlardaki yoğun bir şekilde hidrate proteoglikan kümeleridir. Proteoglikan kümeleri kopma konu- sunda çok zayıf olmakla birlikte, kıkırdağı özellikle sinoviyal eklemler gibi hareket nokta- larında ağırlık taşımaya uygun hale getirmektedirler. Büyüme sırasında bile bu özelliği ko- ruduğu için; kıkırdak, fetal iskeletin ve büyümekte olan çoğu kemiğin gelişiminde anahtar dokudur. Üç tip kıkırdak görünüm olarak farklıdır ve mekanik özellikleri matrikslerinin karakte- ristiklerine göre farklılıklar göstermektedir. 1. Hiyalin kıkırdak; tip II kollajen lifleri, glikozaminoglikanlar, proteoglikanlar ve çoklu yapışkan glikoproteinler içeren matriks ile karakterizedir. 2. Elastik kıkırdak; hiyalin kıkırdağın matriks materyallerine ek olarak elastik lifler ve elastik lamellerle karakterizedir. 3. Fibröz kıkırdak; hiyalin kıkırdağın matriks materyalinin yanında bol miktarda tip I kollajen lifleri ile karakterizedir. Kıkırdak Tipleri I. Hiyalin Kıkırdak Hiyalin kıkırdak, homojen ve amorf matriks ile ayırt edilmektedir. Hiyalin kıkırdağın matriksi canlı durumda camsı görünmektedir ve bu nedenle hiyalin olarak isimlendirilmiş- tir (Gr. hyalos, camsı). Kıkırdak matriksi içinde laküna adı verilen boşluklar bulunmakta- dır. Bu lakünalarda kondrositler yerleşmiştir. Hiyalin kıkırdak basit, eylemsiz homojen bir madde değil, yaşayan karmaşık bir dokudur. Düşük sürtünmeli bir yüzey sağlar, sino- viyal eklemlerin kayganlaştırılmasına katkıda bulunur ve uygulanan güçleri alttaki kemiğe dağıtır. Onarım kapasitesinin sınırlı olmasına karşın, normal koşullarda yaşam boyu abraz- yona bağlı yırtılma ile ilgili bir bulgu göstermez. Bunun istisnası, çoğu bireyde yaşlanma ile bozulan eklem kıkırdağıdır. 5 Hiyalin kıkırdak matriksinin makromolekülleri, kollajen (baskın olarak tip II lifler ve kıkırdağa özgün diğer kollajen molekülleri), glikozaminoglikanları içeren proteoglikan kü- meleri ve çoklu yapışkan glikoproteinlerdir (non–kollajen proteinler) (22). Şekil 2. Hiyalin kıkırdağın Verhoeff boyama yöntemiyle gösterimi (24). Hiyalin Kıkırdak Matriks Yapısı Hiyalin kıkırdak matriksi kondrositler tarafından üretilmektedir ve üç ana molekül sı- nıfını içermektedir. 1. Kollajen Molekülleri Kollajen ana matriks proteinidir. Nispeten ince (20 nm çapında) ve kısa matriks lifle- rinden oluşan üç boyutlu ağın oluşumunda dört tip kollajen rol almaktadır. a) Tip II kollajen, liflerin gövdelerini oluşturur. b) Tip IX kollajen, lifin matriks proteoglikan molekülleri ile etkileşimini kolaylaştı- rır. c) Tip XI kollajen, lifin boyutunu düzenler. ç) Tip X kollajen, kollajen liflerini, başarılı bir mekanik işlev için çok önemli olan üç boyutlu hekzagonal örgü halinde düzenler. d) Tip VI kollajen, kondrositlerin çevresinde yer alır ve bu hücrelerin matriks ağına tutunmalarına yardım eder. 6 e) Tip II, VI, IX, X ve XI yalnızca kıkırdak matriksinde önemli miktarda bulunduk- ları için kıkırdağa özgün kollajen molekülleri olarak adlandırılmaktadır (22). 2. Proteoglikanlar Kıkırdağın normal büyüme ve gelişimi, kıkırdak matriksinde önemli oranda proteogli- kanların bulunmasına bağlıdır. Kıkırdak proteoglikanları göreceli olarak büyük, karmaşık makromoleküllerdir. Bun- lar, tekrar eden, çeşitli sayıda glikozaminoglikan zincirine eklenmiş çekirdek proteininden ve negatif yüklü ve uzunluğu değişen disakkarit birimlerinden oluşur. Ana kıkırdak prote- oglikan monomerinin çekirdek proteini 2.000’den çok aminoasit içerir ve üç bölgeye ayrı- lır, hiyaluronik asit bağlayan bölge, distalindeki keratan sülfattan zengin bölge ve dista- linde kondroitin sülfattan zengin bölge (kondroitin sülfat ve keratan sülfat glikozaminogli- kan örnekleridir). Ortalama kıkırdak proteoglikanı 80–100’den çok kondroitin sülfat zin- ciri, 50–60 keratan sülfat zinciri ve değişken sayıda daha küçük oligosakkarit zinciri içere- bilir. Böylece proteoglikan monomerinin total moleküler ağırlığı milyonları bulur. Kıkırdak matriksindeki çoğu proteoglikanlar monomer değildir; ancak, diğer iki mat- riks bileşeni, hiyaluronik asit ve bağlantı proteinleri ile agregatlar oluşturur. Bu agregat çeşitli sayılarda proteoglikan monomerleri içerir, monomerler hiyaluronik asit bağlanma bölgesi aracılığı ile tek hiyaluronik asit zincirine non–kovalent olarak bağ- lanmıştır, monomer ve hiyaluronik asit ile link proteinlerinin non–kovalent birlikteliği ile stabilize olur. Böyle bir agregatın tipik moleküler ağırlığı 100 milyona (gram/mol) yakla- şır. Bu kümelerin, kollajen liflerinden oluşan girift matriks içinde kapana kısılmaları hiya- lin kıkırdağın kendine has biyomekanik özelliklerinin nedenidir. Kıkırdak matriksi diğer proteoglikanları (dekorin, biglikan, fibromodulin) da içermektedir. Bu proteoglikanlar küme oluşturmazlar; ancak, diğer molekülleri bağlayarak matriksin stabil duruma getiril- mesinde yardımcı olurlar. Proteoglikan agregatlarının tüm bileşenleri kondroblastlar ve kondrositler tarafından sentez edilir ve ekstraselüler alana kendiliğinden taşınır. Proteoglikan monomerleri bir araya geldiğinde ve salgılandığında, kıkırdak hücreleri de doğadaki en büyük moleküler yapılardan biri olan dev proteoglikan agregatlarının son durumunun oluşturulması için ge- rekli hiyaluronik asit ve link proteinlerinin sentezini ve salınımını yapar. 7 Eklem kıkırdağı, elastik kıkırdak ve fibröz kıkırdağın proteoglikan içeriği, bu dokulara karakteristik özelliklerini verir. Örneğin, hiyalin kıkırdağın kritik mekanik özellikleri (kompresyona karşı esneklik ve sertlik) vardır, çünkü proteoglikan agregatları suyu ayırabilir. Sonuçta, sülfatlanmış şekerlerin üzerindeki elektronegatif yükler, monomer kenarların- daki zincirlerin birbirini itmesine ve suya bağlanmasına neden olur. Ekstraselüler sıvıdaki su molekülleri dipol rolü üstlenir. Pozitif yüklü hidrojen atomları, negatif yüklü sülfatlarla birleşir ve sudaki negatif yüklü oksijen atomları birbirini iter. Sonuç dev bir hidrasyon alanıdır. Bu alan basınca karşı koyabilir ve basınç gücü orta- dan kalktığında suyu geri emebilir. Kollajen moleküllerinin varlığı bu sisteme gerilme di- renci verir, proteoglikan agregatlarının hareketini engeller ve suyun maksimum emilimini sınırlar. Çünkü kıkırdak avasküler olduğundan doku sıvısında, besinlerin difüzyonu ve ar- tık ürünlerin atılımı gerçekleşir (25). 3. Çoklu Yapışkan Glikoproteinler Non–kollajenöz ve proteoglikanlara bağlı olmayan glikoproteinler olarak da bilinmek- tedirler ve kondrositler ile matriks proteinleri arasındaki etkileşimi etkilemektedirler. Çoklu yapışkan glikoproteinler, kıkırdak döngüsü ve dejenerasyonunun belirteçleri olarak klinik değere sahiptirler. Böyle proteinlere örnek olarak, kondrositler üzerinde kol- lajen reseptörü olarak işlev gören 34 kilodaltonluk küçük bir molekül olan ankorin CII ve kondrositlerin matrikse bağlanmasına yardımcı olan tenaskin ve fibronektin verilebilir. Hiyalin kıkırdak matriksi yüksek düzeyde hidratedir ve bu sayede dirençlilik ve küçük metabolitlerin difüzyonuna olanak sağlar. Diğer bağ dokusu matriksleri gibi kıkırdak matriksi de yüksek düzeyde hidratedir. Hi- yalin kıkırdağın net ağırlığının %60–%80’i interselüler sudur. Bu suyun çoğu agrekan–hi- yaluronan kümelerine sıkıca bağlıdır ve kıkırdağa direnç kazandırır. Bununla birlikte su- yun bir bölümü küçük metabolitlerin kondrositlere ve kondrositlerden difüzyonuna izin ve- recek yeterlilikte gevşek bağlanmıştır. 8 Normal matriks döngüsü, kondrositlerin matriks kompozisyonundaki değişimleri algı- layabilme yeteneklerine bağlıdır. Sonrasında kondrositler uygun tipte yeni moleküller sen- tezleyerek yanıt verirler. Buna ek olarak matriks, içine gömülü kondrositler için sinyal dö- nüştürücüsü olarak davranır. Böylece sinoviyal eklemlerde olduğu gibi kıkırdağa uygulanan basınç yükleri, kondro- sitlerin sentez aktivitelerini yönlendirmeye yardımcı olan mekanik, elektriksel ve kimyasal sinyaller oluştururlar. Bununla birlikte, vücut yaşlandıkça, matriks kompozisyonu değişir ve kondrositler bu uyarılara yanıt verme yeteneklerini kaybederler. Kondrositler, ekstraselüler matriksi üreten ve devamlılığını sağlayan özelleşmiş hücre- lerdir. Hiyalin kıkırdakta kondrositler tek tek ya da izogen gruplar adı verilen kümeler ha- linde dağılmışlardır. Yeni bölünen kondrositler kendilerini çevreleyen matriks materyalini ürettikçe birbirlerinden uzaklaşırlar. Aynı zamanda genişlemelerine ve büyümekte olan izogen grup içinde kendilerine yeniden pozisyon verebilmelerine olanak sağlayan, kıkırdak matriksini yıkan enzimler olan metalloproteinazları salgılarlar. Kondrosit sitoplazmasının görünümü kondrosit aktivitesine göre değişkenlik göster- mektedir. Matriks üretiminde aktif olan kondrositler protein sentezinin göstergesi olan si- toplazmik bazofili alanları ve büyük Golgi aygıtının göstergesi olan saydam alanları sergi- lerler. Kondrositler yalnızca matrikste bulunan kollajeni değil, aynı zamanda glikozami- noglikanları ve proteoglikanları da salgılamaktadırlar. Yaşlı ve az aktif olan hücrelerde Golgi aygıtı daha küçüktür ve bu nedenle belirgin olan saydam sitoplazma alanları genellikle erimiş lipit damlacıklarını ve glikojen depola- rını temsil etmektedir. Böyle örneklerde kondrositler dokunun hazırlanması sırasında gli- kojen ve lipit kaybedildikten sonraki büzüşme sonucunda belirgin distorsiyon (şekil bozuk- luğu) gösterirler. Hiyalin kıkırdak matriksinin bileşenleri eşit şekilde dağılmamıştır. Hiyalin kıkırdağın proteoglikanları yüksek yoğunlukta bağlı sülfat grupları içerdikleri için ara madde bazik boyalarla ve hematoksilenle boyanmaktadır. Böylece boyanmış kıkırdak kesitlerinde görü- len bazofili ve metakromazi sülfatlı proteoglikanların dağılımları ve nispi yoğunluklarına ilişkin bilgi sağlar. Bununla birlikte matriks homojen bir biçimde boyanmaz. 9 Matriksin boyanma özelliklerini temel alan üç farklı alan tanımlanmıştır: 1. Kapsüler (periselüler) matriks, kondrositin hemen çevresinde yer alan, daha yo- ğun boyanan matriks halkasıdır. Proteoglikanları, hiyaluronanı, biglikanları ve bazı çoklu yapışkan glikoproteinleri (örnek; fibronektin, dekorin ve laminin) en yüksek yoğunlukta içermektedir. Kapsüler matriks neredeyse yalnızca tip VI kollajen lifle- rini içermektedir ve bu lifler her bir kondrositin çevresinde sıkıca örülmüş bir çift oluştururlar. Tip VI kollajen, hücre yüzeyindeki integrin reseptörlerine bağlanır ve kondrositleri matrikse sabitler. Kapsüler matrikste yüksek yoğunlukta tip IX kolla- jen de bulunmaktadır. 2. Teritoryal matriks, kondrositlerin yakın çevresinden uzakta kalan alandır. İzogen grupları çevreler ve rastgele düzenlenmiş tip II kollajen lifleri ile az miktarda tip IX kollajen içermektedir. Daha düşük yoğunlukta sülfatlı proteoglikanları içermekte- dir ve kapsüler matrikse göre daha az yoğun boyanır. 3. İnterteritoryal matriks, teritoryal matriksi çevreleyen bölgedir ve kondrosit grup- ları arasındaki alanı kaplar. Sülfatlı glikozaminoglikanların yoğunlukları ve kollajen liflerinin dağılımlarındaki bu bölgesel farklılıklara ek olarak, kıkırdak yaşlandıkça ortaya çıkan proteoglikan içeriğinde azalma da söz konusudur ve boyanma farklılıkları ile kendini gösterir. Hiyalin kıkırdak fetusun gelişmekte olan iskeleti için bir model oluşturur. Erken fetal gelişimde hiyalin kıkırdak, endokondral kemikleşme süreci ile gelişen kemikler için pre- kürsördür. Başlangıçta çoğu uzun kemik, olgun kemiğin şekline benzeyen kıkırdak model- leri ile temsil edilir. Kıkırdağın çoğunun kemik ile yer değiştirdiği gelişim sürecinde, ge- riye kalan kıkırdak epifizyal büyüme plağı (epifizyal disk) adı verilen büyüme bölgesi ola- rak hizmet eder. Bu kıkırdak, kemik uzunluk olarak büyüdüğü sürece işlevsel kalır. Tam olarak büyümüş bireyde gelişmekte olan iskeletten geriye kalan kıkırdak, eklemlerin arti- küler (eklem) yüzeylerinde (eklem kıkırdağı) ve göğüs kafesinde (kostal kıkırdaklar) bu- lunmaktadır. Hiyalin kıkırdak da yetişkinde iskelet birimi olarak trakea, bronşlar, larinks ve burunda bulunmaktadır (22). 10 Kapsüler matriks Teritoryal matriks İnterteritoryal matriks Şekil 3. Matriksin boyanma özelliklerini temel alan üç farklı alan (26). Şekil 4. Endokondral kemikleşme süreci (24). Hiyalin kıkırdağı, sıkıca tutunmuş bir bağ dokusu olan perikondriyum sarar (Şekil 1). Perikondriyum, fibroblastlardan ayırt edilemeyen hücrelerden oluşan sıkı bağ dokusu- dur. Çoğu açıdan perikondriyum, bezleri ve pek çok organı saran kapsülü temsil etmekte- dir. Aynı zamanda, yeni kıkırdak hücrelerinin kaynağı olarak da hizmet etmektedir. Peri- kondriyum aktif olarak büyürken, yeni kıkırdak hücrelerini oluşturan bir iç selüler tabaka ve bir dış fibröz tabakaya ayrılmış görünür. Bu ayrım her zaman, özellikle de aktif olarak yeni kıkırdak üretmeyen perikondriyumda ya da çok yavaş büyüyen kıkırdakta belirgin de- ğildir. Büyüyen kıkırdakta yeni kondrositlerin farklılaşmaları sırasında ortaya çıkan deği- şiklikler resmedilmiştir. Artiküler eklem yüzeylerinin hiyalin kıkırdağı perikondiyuma sa- hip değildir. Oynar eklemlerin artiküler yüzeylerini kaplayan hiyalin kıkırdak için eklem kıkırdağı terimi kullanılmaktadır. Genel olarak, eklem kıkırdağının yapısı hiyalin kıkırdağınkine benzemektedir. Bununla birlikte serbest ya da artiküler yüzeyin perikondriyumu yoktur. 11 Kıkırdağın kemiğe temas ettiği zıt yüzeyde de perikondriyum yoktur. Eklem kıkırdağı, ge- lişmekte olan kemiğin orijinal hiyalin kıkırdak şablonunun kalıntısıdır ve yetişkinin yaşamı boyunca varlığını sürdürür. Yetişkinlerde eklem kıkırdağı 2–5 mm kalınlığındadır ve dört zona ayrılmaktadır. • Süperfisyal (tanjansiyel zon), artiküler yüzeye en yakın ve basınca dirençli böl- gedir. Yüzeye paralel fasiküller halinde düzenlenmiş, yoğunlaşmış tip II kollajen lifleri ile sarılmış çok sayıda uzamış ve yassı kondrositler içermektedir. • Ara (transizyonel) zon, süperfisyal zonun altında uzanmaktadır ve matriks içinde rastgele dağılmış yuvarlak kondrositler içerir. Kollajen lifleri az düzenlidirler ve yüzeye biraz oblik yönde düzenlenmişlerdir. • Derin (radial) zon, kıkırdağın serbest yüzeyine dik yerleşen kısa sütunlar halinde düzenlenmiş küçük, yuvarlak kondrositlerle karakterizedir. Kollajen lifler kemi- ğin uzun eksenine paralel sütunlar arasında yer almaktadırlar. • Kalsifiye zon, küçük kondrositlerin varlığı ile beraber kalsifiye matriks ile karak- terizedir. Bu zon, derin (radial) zondan yumuşak, dalgalı, yüksek düzeyde kalsi- fiye hat olan tidemark (gelgit izi) ile ayrılmıştır. Bu hattın üzerinde, kıkırdak lakünalarındaki kondrositlerin çoğalması interstisyel büyüme için yeni hücreler sağlar. Eklem kıkırdağı yenilenmesinde kondrositler bu bölgeden eklem yüzeyine doğru göç ederler. Olgun eklem kıkırdağının yenilenme süreci çok yavaştır. Bu yavaş büyüme, yüksek düzeyde stabil tip II kollajen ağının ve proteoglikan moleküllerinin uzun yarı ömürlerinin yansımasıdır. Sağlıklı eklem kıkırdağında metalloproteinaz (MMP–1 ve MMP–13) aktivi- tesi de düşüktür. II. Elastik Kıkırdak Elastik kıkırdak, kıkırdak matriksinde elastin bulunmasıyla ayırt edilir. Elastik kıkırdak matriksi, hiyalin kıkırdak matriksinin normal bileşenlerini içermesine ek olarak, dallanan ve anastomozlaşan yoğun elastik lif ağı ve birbiri ile birleşen elastik materyal yaprakları da içermektedir. Bu lifler ve lameller en iyi parafin kesitler ve Rezorsin Fuksin ve Orsein gibi özel boya- larla gösterilirler. Elastik materyal kıkırdağa hiyalin kıkırdağın karakteristikleri olan di- rençlilik ve katlanabilirliğe ek olarak elastik özellikler vermektedir. 12 Şekil 5. Elastik kıkırdağın Rezorsin boyama yöntemiyle gösterilmesi (23). Elastik kıkırdak dış kulakta, eksternal akustik meatusun duvarlarında, tuba auditivada ve larinksin epiglottisinde bulunmaktadır. Bu bölgenin tamamının kıkırdağı, çoğu hiyalin kıkırdağın çevresinde bulunana benzer perikondriyum ile sarılmıştır. Yaşlanma ile kalsifiye olan hiyalin kıkırdağın aksine elastik kıkırdağın matriksi yaş- lanma sürecinde kalsifiye olmamaktadır. III. Fibröz Kıkırdak Fibröz kıkırdak kondrositlerden ve bunların sıkı bağ dokusu ile karışmış matriks ma- teryalinden oluşmaktadır. Fibröz kıkırdak, sıkı bağ dokusu ve hiyalin kıkırdağın bir birleşimidir. Kondrositler, kollajen liflerinin arasında tek tek, dizi ve izogen gruplar halinde dağılmışlardır. Bu kond- rositler hiyalin kıkırdağın kondrositlerine benzer görünürler, ancak daha az kıkırdak mat- riks materyaline sahiptirler. Hiyalin ve elastik kıkırdakta olduğu gibi çevreleyen perikondriyumda yoktur. Fibröz kıkır- dak içeren bir kesitte tipik olarak yuvarlak çekirdekli hücre popülasyonu ve çevreleyen az 13 miktarda matriks materyali görülebilir. Bu çekirdekler kondrositlere aittir. Fibröz alanla- rın arasında yassılaşmış ve uzunlamasına çekirdekler bulunur. Bunlar fibroblast çekirdek- leridirler. Fibröz kıkırdak tipik olarak intervertebral diskler, simfizis pubis, sternoklaviküler ve temporomandibuler eklemlerin artiküler diskleri, diz ekleminin menisküsleri ve tendonla- rın kemiklere tutundukları bazı yerlerde bulunmaktadır. Bu bölgelerde fibröz kıkırdak bu- lunması dokuda hem basınç hem de yırtma kuvvetlerine karşı direnç gerektiğinin gösterge- sidir. Kıkırdak daha çok bir şok emici olarak hizmet etmektedir. Böyle güçlerin ortaya çıkma derecesi, mevcut kıkırdak matriks materyal miktarı ile yansıtılır. Fibröz kıkırdağın ekstraselüler matriksi hem tip I hem de tip II kollajen liflerin bulun- ması ile karakterizedir. Fibröz kıkırdağın hücreleri yalnızca gelişim aşamasında değil, aynı zamanda olgun, tam farklılaşmış durumunda da geniş çeşitlilikte ekstraselüler matriks moleküllerini sentez- lemektedirler. Bu durum, fibröz kıkırdağın dış ortamdaki değişikliklere (mekanik güçler, beslenme değişiklikleri ve hormonların ve büyüme faktörlerinin düzeylerinde değişiklik- leri) yanıt vermesine olanak sağlar. Fibröz kıkırdağın ekstraselüler matriksi belirgin dü- zeyde hem tip I kollajen (bağ dokusu matriksinin karakteristik özelliği) hem de tip II kolla- jen (hiyalin kıkırdağın karakteristik özelliği) içermektedir. Bu kollajenlerin nispi oranları değişiklik gösterebilir. Örneğin, diz ekleminin menis- küsleri yalnızca az miktarda tip II kollajen içerirken, intervertebral disk eşit miktarda tip I ve tip II kollajen lifleri içermektedir. Fibröz kıkırdaktaki tip I ve tip II kollajen arasındaki oran yaş ile değişmektedir. Yaşlı bireylerde, tip II kollajen liflerini sürekli üreterek çevreleyen matriks içine boşaltan kond- rositlerin metabolik aktiviteleri nedeniyle tip II kollajen daha çoktur. Bunun yanında, fib- röz kıkırdağın ekstraselüler matriksi, agrekandan (kondrositler tarafından üretilir) daha yüksek miktarlarda versikan (fibroblastlar tarafından salgılanan bir proteoglikan monomer) içermektedir. Versikan da yüksek düzeyde hidrate proteoglikan kümeleri oluşturmak üzere hiyaluronanı bağlayabilir. 14 Şekil 6. Fibröz kıkırdağın Picrosir ius–Hematoksilen boyama yöntemiyle gösteril- mesi (23). Kondrogenez ve Kıkırdağın Büyümesi Kondrogenez sırasında çoğu kıkırdak mezenkimden kaynaklanmaktadır. Kıkırdak gelişimi süreci olan kondrogenez, kondroprogenitör mezenkimal hücrelerin yuvarlak, birbirine yaklaşmış hücre kütlesi oluşturmak üzere kümelenmesi ile başlar. Ka- fada kıkırdağın çoğu nöral krista hücrelerinden türeyen ektomezenkim kümelerinden kay- naklanmaktadır. Hiyalin kıkırdak oluşum alanı başlangıçta kondrojenik düğümcük olarak bilinen mezenkimal ya da ektomezenkimal hücre kümesi ile tanınır. Transkripsiyon fak- törü SOX–9’un ekspresyonu bu hücrelerin kondroblastlara farklılaşmalarını tetikler ve bu hücreler sonradan kıkırdak matriksi salgılarlar (SOX–9 ekspresyonu, tip II kollajen salgı- lanması ile aynı zamana rastlamaktadır). Kondroblastlar matriks biriktirdikçe birbirlerin- den daha da uzaklaşırlar. Matriks materyali ile tümüyle çevrelendiklerinde hücreler kond- rosit olarak adlandırılırlar. Kondrojenik düğümcüğün hemen çevresindeki mezenkimal doku perikondriyumu oluşturur. 15 Şekil 7. Kondrogenez (23). Kondrogenez pek çok molekül tarafından düzenlenmektedir. Bunların arasında ekstra- selüler ligandlar, nüklear reseptörler, transkripsiyon faktörleri, adezyon molekülleri ve matriks proteinleri bulunmaktadır. Ayrıca, kıkırdak iskeletin gelişimi biyomekanik güçler tarafından da etkilenmektedir. Bu güçler kıkırdağın yalnızca şekil, rejenerasyon ve yaşlan- masını düzenlemezler, aynı zamanda kıkırdak içindeki hücre ekstraselüler matriks etkile- şimlerini de modifiye ederler. Kıkırdak appozisyonel ve interstisyel olmak üzere iki tip büyüme yeteneğine sahiptir. Matriks salgılanmasının başlaması ile birlikte kıkırdak büyümesi iki sürecin birleşimi üzerinden devam eder: 1. Appozisyonel büyüme, mevcut kıkırdağın yüzeyinde yeni kıkırdak oluşumu ve 2. İnterstisyel büyüme, mevcut kıkırdak kütlesi içinde yeni kıkırdak oluşumu süreci- dir. Appozisyonel büyüme sırasında üretilen yeni kıkırdak hücreleri, kıkırdağı saran pe- rikondriyumun iç bölümünden türemektedirler. Hücreler biçim ve işlev olarak fibroblast- lara benzerler ve perikondriyumun kollajen bileşenini üretirler (tip I kollajen). Bununla birlikte, kıkırdak büyümesi başladığında hücreler transkripsiyon faktörü SOX–9 ekspresyonu ile yönlendirilen farklılaşma sürecine girerler. Sitoplazmik uzantıları kaybolur, çekirdek yuvarlaklaşır ve sitoplazma miktarı ve belirginliği artar. 16 Bu değişiklikler hücrenin kondroblast olması ile sonuçlanır. Kondroblastlar, tip II kollajen salgılanmasını da içerecek şekilde kıkırdak matriksi üretiminde işlev görürler. Yeni matriks kıkırdak kütlesini arttırırken eş zamanlı olarak perikondriyumun hücre popü- lasyonunun sürekliliğini sağlamak için yeni fibroblastlar üretilir. İnterstisyel büyüme sırasında üretilen yeni kıkırdak hücreleri, lakünalarındaki kond- rositlerin bölünmeleri ile oluşurlar. Bu, kondrositlerin bölünme yeteneklerini korumaları ve kondrositleri çevreleyen matriksin gerilebilir olması ve böylece daha çok salgı aktivite- sine izin vermesi ile olasıdır. Başlangıçta bölünmekte olan kondrositlerin kardeş hücreleri aynı lakünada bulunmaktadır. Yeni matriks salgılanmadıkça kardeş hücreler arasında bölme oluşur. Bu noktada her hücre kendi lakünasında bulunmaktadır. Matriksin sürekli salgılanmasıyla hücreler birbirlerinden daha da uzağa hareket ederler. Kıkırdağın toplam büyümesi kondrositler tarafından yeni matriks materyalinin interstisyel olarak salgılanma- sını ve yeni farklılaşan kondrositler tarafından matriks materyalinin appozisyonel olarak salgılanmasının sonucudur. Hiyalin Kıkırdağın Onarımı Kıkırdağın sınırlı onarım yeteneği bulunmaktadır. Kıkırdak çok miktarda yoğun ve tekrarlayıcı stresi tolere edebilir. Bununla birlikte, kı- kırdak en küçük hasarlarda bile çarpıcı şekilde iyileşme yetersizliği göstermektedir. Bu, hasara yanıtsızlık kıkırdağın avasküler olmasına, kondrositlerin hareketsizliğine ve olgun kondrositlerin sınırlı çoğalma yeteneğine bağlanabilir. Bozukluk yalnızca perikond- riyumda olduğunda biraz onarım meydana gelebilir. Bu hasarlarda onarım, perikondri- yumda bulunan pluripotent progenitör hücrelerin aktivitesi ile oluşur. Bununla birlikte, böyle bir durumda üretilse bile az kıkırdak hücresi üretilir. Onarım çoğunlukla sıkı bağ dokusunun üretimi şeklinde olur. Moleküler düzeyde kıkırdak onarımı, tip I kollajenin skar dokusu halinde biriktirilmesi ile kıkırdağa özgün kollajenlerin ekspresyonu yoluyla onarım arasındaki kararsız bir den- gedir. Bununla birlikte, yetişkinlerde iyileşmekte olan yara bölgesinde sıklıkla yeni kan damarları gelişir ve asıl kıkırdak onarımı yerine kemik büyümesini uyarır. Kıkırdağın kendini sınırlı onarım yeteneği, göğüs kavitesine girmek için kosta kıkır- daklarının kesilmesinin gerektiği koroner arter baypas greft cerrahisi gibi kardiyotorasik 17 cerrahide önemli problemlere neden olabilir. Çeşitli tedaviler eklem kıkırdağının iyileşme- sini arttırabilirler. Bunların arasında perikondral greftler, hücre transplantasyonu, yapay matrikslerin ek- lenmesi ve büyüme faktörlerinin uygulanması bulunmaktadır. Hiyalin kıkırdak kalsifiye olduğunda kemik ile yer değiştirmektedir. Hiyalin kıkırdak, kalsifiye fosfat kristallerinin kıkırdak matriksine eklendiği bir süreç olan kalsifikasyona yatkındır. Hiyalin kıkırdağın matriksi iyi tanımlanmış üç durumda normal olarak kalsifi- kasyona uğramaktadır: • Büyümekte olan ve yetişkin kemiklerinde, kemik dokusu ile temasta olan eklem kı- kırdağı bölümü kalsifiye olur, ancak yüzey bölümü kalsifiye olmaz. • Bir bireyin büyüme döneminde, kemikle yer değiştirmek üzere olan kıkırdakta (en- dokondral kemikleşme) her zaman kalsifikasyon oluşur. • Yetişkindeki hiyalin kıkırdak yaşlanma sürecinin bir parçası olarak zamanla kalsi- fiye olur. Bu durumların çoğunda yeterli zaman verildiğinde kalsifiye olan kıkırdağın yerini kemik alır. Örneğin, yaşlı bireylerde trakeadaki kıkırdak halkalarının bazı bölümleri sık- lıkla kemik dokusuyla yer değiştirirler. Normalde kondrositler tüm besin maddelerinin ve atıkların uzaklaştırılmasını materyallerin matriks boyunca difüzyonu yoluyla sağlamakta- dırlar. Matriks yoğun bir şekilde kalsifiye olduğunda difüzyon engellenir ve kondrositler şişerek ölürler. Bu olayın nihai sonucu kalsifiye matriksin uzaklaştırılması ve yerini ke- miğin almasıdır. Bazı araştırmacılar kıkırdağın uzaklaştırılmasının kondroklast adı verilen özellikli bir hücre tipi tarafından yapıldığına inanmaktadır. Bu hücre hem morfoloji hem de litik işlev olarak osteoklasta benzer şekilde tanımlanmaktadır. Bu hücrelerin kıkırdağa yeni tomurcuklanan kan damarları üzerinden girdiği ve aslında perivasküler ya da kemik iliği kök hücrelerinden türedikleri düşünülmektedir. Bununla birlikte, bu hücrelerin kesin kö- kenleri bilinmemektedir. Kondroklastların kıkırdağın uzaklaştırıldığı bölgelerde ortaya çıkan hücreler olmaları olasıdır. Endokondral kemik oluşumu ile ilgili rolleri tartışmalıdır (22). 18 Boyama Çok küçük ayrıcalıklar dışında dokuların büyük bir bölümü renksizdir ve boyanmadığı sürece ışık mikroskobunda incelenmesi zordur. Çeşitli doku ve hücre bölümlerinin yapıları nedeniyle farklı kimyasal özellikteki boyaları farklı bir şekilde tutmaları histolojide boya- manın temelini oluşturur. Histolojik araştırmalarda kullanılan boyaların büyük bir çoğun- luğu asit ya da baz özelliğinde olup dokudaki iyonize köklerle elektrostatik bağlantı yapar- lar. Bu şekilde doku ve hücrelerin daha belirgin bir şekilde ortaya çıkması sağlanırken di- ğer yandan kimyasal yapısını bildiğimiz boyalarla reaksiyona giren yapıların kimyasal özellikleri ortaya konmuş olur (27). Histolojik boyalar renklendirici gruplarının asit ya da baz oluşuna göre asit ve bazik boyalar olmak üzere iki ana grupta toplanırlar. Bazik boya- lar, renkli katyon ve renksiz anyon içerirken; asidik boyalar, renksiz katyon ve renkli an- yon içerirler. Asidik boyalar zemin boyamada ya da asit pH’lı ortamlarda kullanılırlar. Bazik boyaları çeken, o boyanın renginde boyanan hücre ve doku bölümleri bazofil boya- nıyor ya da bazofili gösteriyor diye tanımlanır (28). Genel olarak granüllü endoplazmik retikulumun yoğun olduğu bölümler, hücre çekir- deği bazofili gösteren yapılardır. Asit boyalarla reaksiyona girerek onun renginde boyanan hücre ya da doku bölümleri için asidofil boyanıyor ya da asidofili gösteriyor denir. Bazı ayrıcalıkları olmakla birlikte hücre sitoplazması, kollajen lifler, mitokondrium ve lizozom- lar asidofilik yapılardır. Bazik boyalara örnek olarak Safranin, Hematoksilen, Nüklear Fast Red verilebilir. Eosin, Pikrik Asit, Asit Fuksin, Oranj G, Light Green gibi boyalar asit bo- yalara örnektir. Boyalar bazı yöntemlerde tek olarak kullanılır. Bazı yöntemlerde ikili ya da daha çok boya içeren birleşik yöntemler kullanılır. Birleşik yöntemlerde kesitler birbiri ardından ba- zik ve asit boyalarla işleme tabi tutulurlar. Birleşik boya yöntemlerinden ikili olanlara ör- nek olarak çok yaygın bir boyama yöntemi olan Hematoksilen–Eosin yöntemi gösterilebilir (27). 19 Bu Çalışmada Kullanılan Boya Solüsyonlarının Özellikleri Hematoksilen–Eosin (HE) Boya Solüsyonları Hematoksilen Nüklear boya olarak en çok kullanılan Hematoksilen (29), Bakkam ağacı (Haemotoxy- lon campechianum)'nın kabuğundan elde edilir. Hematoksilen kendi başına bir boya değil- dir, aslında oksidasyon ürünü olan hematein zayıf anyonik boyadır. Hemateinin dokuya afinitesi azdır, ancak metalik mordantlar eklendiğinde özellikle çekirdeklere afinitesi artar ve kuvvetli boyar. Bazı hematoksilen solüsyonlarında oksidasyon ajanları mordant görevi yapar; bu solüsyonlar (çoğunlukla demirli hematoksilenlerdir), kalıcı değildir. Kalıcılığı arttırmak için mordantın, oksidasyon ajanı olarak görev yapmaması gereklidir. Amonyum ya da potasyum alüminyum sülfat, fosfotungstik asit ve fosfomolibdik asit non–oksidan mordantlardır. Eosin Y ‘Staining Procedures’ teknik kitabında; Eosin Y’nin (30) Hematoksilen–Eosin boya- masında Hematoksilen için zemin boyaması olarak kullanıldığı belirtilmektedir. van Gieson Boya Solüsyonları Asit Fuksin Asit Fuksin (30); Basic Fuksin’in kontrollü sülfatlanmasıyla yapılan mavimsi–kır- mızı trifenilmetan boyasıdır. ‘Staining Procedures’ teknik kitabı; plazma, doku ve kollajen boyanmasını içeren yöntem ve kaynakçaları içermektedir. Bunlar; Pikrik asit ve Hematoksilen’in birlikte kul- lanıldığı van Gieson bağ doku boyası; Ehrlich Biond’un Orange G ve Methyl Green (neut- ral kan boyası) ile birlikte kullanıldığı triasit boyaması; Mallory’nin bağ doku boyamasıdır. Pikrik asit Pikrik asit (4); hücrelerin büzüşmesine neden olduğu için; genelde, basit solüsyonlar için kullanılmaz. Dokuya hızlı ve iyi şekilde dokuya nüfuz eder. Tüm proteinleri çöktürür ve kolayca suda çözünebilen pikrat molekülleri oluşturur. 20 Proteindeki glikojenleri tutar. Dokunun yumuşak kalmasını sağlar ve karışım halinde kullanıldığında daha kolay bir boyama sağlar (4). Masson trikrom Boya Solüsyonları Celestine Blue (Mordant Blue) Celestine Blue (30); katyonik oksazin boyasıdır. Suda kuvvetli bir şekilde çözünürken alkolde yavaş bir şekilde çözünür. Celestine Blue (30); Hematoksilen yerine kullanılan bir çekirdek boyamasıdır. Lillie ve arkadaşları; yetmişli yılların başında, diğer mordant boyaların yanında Hematoksilen yerine kullanmak amacıyla Celestine Blue’yu değerlendirmiştir. Lillie ve arkadaşları, bazı uygulamalarda Celestine Blue’yu Hematoksilen’in yedeği olarak düşünmüşlerdir. ‘Staining Procedures’ teknik kitabında Hematoksilen ve Asit Fuk- sin ile birlikte Celestine Blue’dan yararlanılarak van Gieson boyaması ve glikol metakri- lata gömülmüş dokuların boyanması için genel boyama yöntemleri önerilmektedir. Bu yöntemlerle; çekirdeğin siyah, kasın sarı ve kollajenin kırmızı boyandığı rapor edilmiştir. Light Green SF Yellowish (Acid Green) Light Green SF (30) mavimsi yeşil, anyonik trifenilmetan boyasıdır. Suda kuvvetli bir şekilde çözünürken, etanolde yavaş çözünür. Light Green SF; plazma için çok önemli bir zıt boyadır. Bu uygulamada Light Green; Hematoksilen ya da Safranin gibi nüklear boya- malara zıt boyama olarak kullanılır. Lillie; Mallory’nin Masson trikrom boyamasının modifiye edilmiş yöntemindeki Ani- line Blue yerine Light Green SF kullanıldığında kollajen liflerin tatmin edici bir şekilde boyandığını rapor etmiştir. van Gieson ve Masson–van Gieson yöntemleri kullanıldığında daha az kalitede boyama rapor edilirken, Masson trikrom boyama yönteminde kaliteli bir boyama elde edildiği bildirilmiştir. 21 Safranin O Boya Solüsyonları Fast Green FCF (Food Green 3) Fast Green FCF (30); mavimsi–yeşil, anyonik trifenilmetan boyasıdır. Suda kuvvetli bir şekilde çözünürken alkolde yavaş bir şekilde çözünmektedir. ‘Staining Procedures’ ki- tabı bu boyayla ilgili uygulamaları yöntem ve kaynakçaları listelemektedir. Bunlar; van Gieson boyasının Fast Green modifikasyonu; Masson’un trikrom boyasının Lillie modifi- kasyonu; Kornhauser’in ‘Quad’ boyası; Orcein ve Feulgen teknikleridir. Safranin O Safranin O (30); kırmızı, katyonik azine boyasıdır. Suda ve metil Cellosolve’da kuv- vetli çözünme gösterirken, etanol, glikol ve pridinde daha yavaş çözünme gösterir. Safra- nin O histolojik çalışmalar için çok önemli bir nüklear boyamadır. ‘Staining Procedures’ kitabı Safranin O’yu içeren birçok yöntem ve kaynakçaları sağ- lamaktadır; kalsiyum depolarını göstermek amacıyla kullanılan gümüş nitrat yönteminde zemin boyaması gibi kullanılmıştır. Mallory’nin Aniline Blue Boya Solüsyonları Aniline Blue Aniline Blue (30); histoloji ve sitoloji değerlendirmelerinde zıt boyama elde etmek amacıyla kullanılmaktadır. Cons, Mallory’nin Aniline Blue yönteminde bu boya solüsyo- nunun kullanılarak iyi sonuçlar elde edildiğini rapor etmiştir. Orange G Orange G (30); anyonik monoazo boyasıdır. Yaygın bir şekilde zemin boyamada ya da önemli nüklear boyamalara zıt boyama (kontrast) amacıyla kullanılmaktadır. Mükem- mel bir plazma boyasıdır. Alcian Blue 8GX Boya Solüsyonları Alcian Blue 8GX Steedman Alcian Blue 8 GX’in (30) asidik polisakkaritler için ayrımsal bir boya oldu- ğunu bildirmiştir. 22 Boyama yapılırken pH değişimi kontrolü; sülfomusinleri, sialomusinleri ve üronik asit musinleri ayırmada kullanılabilir. Alcian Blue; doku kesitlerindeki glikozaminoglikanların gösterilmesinde yararlanılan katyonik boyalardan en çok kullanılanlardan birisidir. Boya mekanizması katyonik boya molekülleri ve glikozaminoglikan anyonik alanları arasındaki bozulabilen elektrostatik bağları göstermektedir. Nuklear Fast Red Nuklear Fast Red (30); sodyum sülfitli Purpurin muamelesiyle hazırlanan anyonik an- takinon boyasıdır. Pigment Red 84 formunu elde etmek için başınç altında amonyum ile kaynatılır. McGee–Russell; Calcium Red adı altında dokudaki kalsiyumu belirtmek ama- cıyla kullanmıştır. Sams ve Davies; kıkırdak ve kemik gelişimini radyootograflarında nuk- lear zemin boyama amacıyla Nuklear Fast Red’in ticari örneklerinin kullanılmasının uygun olduğunu belirtmiştir. Toluidine Blue O Boya Solüsyonları Toluidine Blue O (30); metakromatik, katyonik thiazine boyasıdır. Thionin ya da Me- tilen Blue’nun yer aldığı biyolojik boya uygulamalarında sık kullanılır. Aynı deneysel for- müle sahip, Azure B’ye yapı olarak benzeyen nuklear bir boyadır. Buna rağmen görünür UV absorbans spektrumu ve boya özellikleri Azure A’ya çok benzerdir. Shorr Boya Solüsyonları Biebrich Scarlet Biebrich Scarlet (30); kırmızı, anyonik disazo boyasıdır. Suda kuvvetli çözünürken, metil Cellosolve ve etanolde yavaş çözünmektedir. Biebrich Scarlet Red büyük moleküllü bir boyadır ve tıbbi olarak yara iyileşmesini uyardığı bildirilmiştir. Gurr ‘Hematoksilenden sonra zemin boyaması olarak kullanılan eosin gibi kullanulan ikinci bir boyadır’ tanımla- masını yapmıştır. Lillie; kullanışlı bir plazma boyası olduğunu bildirmiştir. Fosfotungstik asit ve fosfomolibdik asit Her ikisi de non–oksidan mordanttır (29). 23 Azure E Azure E (30); katyonik boya Azure A ile anyonik boya Eosin Y’nin reaksiyona girme- siyle oluşan nötral boyadır. Bu boya yalnızca metanol, etanol ve gliserolde çözünür. Thionin Thionin (30); metakromatik, katyonik thiazin boyasıdır. 24 GEREÇ ve YÖNTEM Bu çalışmada Yeni Zelanda beyaz tavşanı (31) kullanılmıştır. Uludağ Üniversitesi De- ney Hayvanları Yetiştirme Uygulama ve Araştırma Merkezi'nden ‘B.30.ULU.0.8Z.00.00/83’ sayılı etik kurul kararı ile temin edilen tavşanlar; Anestezik madde (Ketamin HCl ve Xylazin, 35/5 dozda) cerrahi işlem uygulanacağı sırada tek se- ferde intra muskuler olarak verilerek, anestezi altındaki hayvanların trakea, epiglottis ve kulak kepçesi çıkartılmıştır. Elde edilen dokular %10 formalin (1) solüsyonunda bir hafta süresince fikse edildi. Fiksasyon tamamlandıktan sonra doku takibi (1) uygulandı ve parafin bloklar döküldü. Pa- rafin bloklardan kızaklı mikrotomda 7µ kalınlığında alınan kesitler lamlara yapıştırıldı ve daha sonra aşağıdaki boyama yöntemleri uygulandı: 1. Harris’in Hematoksilen–Eosin (HE) Boyama Yöntemi (1), 2. van Gieson Boyama Yöntemi (2), 3. Masson Trikrom Boyama Yöntemi (1), 4. Safranin O Boyama Yöntemi (32), 5. Mallory’nin Aniline Blue Boyama Yöntemi (2), 6. Alcian Blue 8GX Boyama Yöntemi (3), 7. Toluidine Blue O Boyama Yöntemi (4), 8. Tamponlu Azure Eosin Boyama Yöntemi (4), 9. Thionin Boyama Yöntemi (4), 10. Shorr Boyama Yöntemi (33). Boyanmış preparatlar entellan ile kapatılıp Zeiss Primo Star mikroskobunda incelenip değerlendirildi ve Olympus BX50 mikroskobuna takılı Olympus DP71 kamera ile fotoğraf- ları çekildi. 25 BULGULAR HE (1) ile boyanan preparatlarda; çekirdekler mor, sitoplazma pembe boyanırken, kı- kırdak matriks heterojen bazofil görüldü. Kıkırdak matriksteki teritoryal alan koyu mor boyanırken, interteritoryal alanın daha açık mor boyandığı görüldü. Kollajen lifler, elastik lifler ve kas yapıları pembe tonlarında boyandı. Perikondriyum pembe renkte görüldü. Epitel hücre çekirdekleri mor boyanırken, bu hücrelerin sitoplazmaları pembe boyandı. Damar duvarı koyu pembeyken, eritrositler kırmızı tonlarında boyandı. Yine bu boya- mada, müköz bez asinuslarında soluk boyalı sitoplazmanın yanı sıra hücrelerin bazal kıs- mında yerleşik yassı çekirdekler görüldü (Şekil 8–1, Şekil 8–2, Şekil 8–3, Şekil 8–4, Şekil 8–5, Şekil 8–6, Şekil 8–7, Şekil 8–8, Şekil 8–9, Şekil 8–10, Şekil 8–11, Şekil 8–12). van Gieson’un demirli hematoksilenle birlikte kullanıldığı yöntemle (2) boyanan pre- paratlarda; kıkırdak matriks soluk pembe görüldü. Kıkırdak matriksi teritoryal alan ve in- terteritoryal alanlar olarak ayırt edildi. Perikondrium kırmızı tonlarında boyandı. Hücre çekirdekleri siyahımsı boyandı. Epitel sarı–kahvrengi tonlarında boyandı. Kas ve eritro- sitlerin sarı boyandığı görüldü (Şekil 9–1, Şekil 9–2, Şekil 9–3, Şekil 9–4, Şekil 9–5, Şekil 9–6, Şekil 9–7, Şekil 9–8, Şekil 9–9, Şekil 9–10, Şekil 9–11, Şekil 9–12). Masson trikromu (1) ile boyanan preparatlarda; çekirdek koyu mor boyanırken, sitop- lazma daha açık mor–pembe tonlarında boyandı. Kıkırdak matriksi yeşil tonlarında gö- rüldü. Perikondriyum turkuaz mavisi–yeşil tonlarında boyandı. Epitel hücre çekirdekleri koyu mor boyanırken, sitoplazması daha açık mor–koyu pembe tonlarında görüldü. Damar duvarı ve kas mor–koyu pembe tonlarında görülürken, lümendeki eritrositler pembe tonla- rında boyandı (Şekil 10–1, Şekil 10–2, Şekil 10–3, Şekil 10–4, Şekil 10–5, Şekil 10–6, Şe- kil 10–7, Şekil 10–8, Şekil 10–9, Şekil 10–10, Şekil 10–11, Şekil 10–12). Safranin O yöntemiyle (32) boyanan preparatlarda çekirdek siyahımsı renkte boyandı. Kıkırdak matriksinin turuncudan kırmızıya değişen tonlarda, kas, damar duvarı, eritrosit yapılarının mavimsi yeşil renkte boyandığı görüldü (Şekil 11–1, Şekil 11–2, Şekil 11–3, Şekil 11–4, Şekil 11–5, Şekil 11–6, Şekil 11–7, Şekil 11–8, Şekil 11–9, Şekil 11–10, Şekil 11–11, Şekil 11–12). Mallory’nin Aniline Blue boyama yönteminde (2) Zenker fiksatifi önerilirken biz %10’luk formalin fiksatifi kullanmamıza karşın sağlıklı bir boyama elde edildi. Çekirdek 26 kırmızı renkte boyandı. Kıkırdak matriks mavinin çeşitli tonlarında boyanırken, perikond- riyumun yoğun mavi boyandığı görüldü (Şekil 12–1, Şekil 12–2, Şekil 12–3, Şekil 12–4, Şekil 12–5, Şekil 12–6, Şekil 12–7, Şekil 12–8, Şekil 12–9, Şekil 12–10, Şekil 12–11, Şe- kil 12–12). Alcian Blue 8GX ve Nuklear Fast Red’in birlikte kullanıldığı boyama yöntemiyle (3); kıkırdak matriksinin turkuaz renkte boyandığı, çekirdeklerin ise kırmızı boyandığı görüldü (Şekil 13–1, Şekil 13–2, Şekil 13–3, Şekil 13–4, Şekil 13–5, Şekil 13–6, Şekil 13–7, Şekil 13–8, Şekil 13–9, Şekil 13–10, Şekil 13–11, Şekil 13–12). 27 Şekil 8–1. Trakea, HE boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); La- mina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). Şekil 8–2. Trakea, HE boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); La- mina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). 28 M Şekil 8–3. Trakea, HE boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria(Lp). P Şekil 8–4. Trakea, HE boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teritoryal matriks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 29 Şekil 8–5. Epiglottis, HE boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 8–6. Epiglottis, HE boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Kapiller (Kp); Erit- rosit (E); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). 30 Şekil 8–7. Epiglottis, HE boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkır- dak matriksi (Km); Perikondrium (P); Müköz asinus (Ma); Arter (A); Kapiller (Kp); Eritrosit (E). Şekil 8–8. Epiglottis, HE boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kond- rosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Lipit damlacıkları (Ld); Teritoryal matr iks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Pe- r ikondrium (P). 31 Şekil 8–9. Aurikular kıkırdak, HE boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikond- rium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Kıl folikülü (Kf); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). Şekil 8–10. Aurikular kıkırdak, HE boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). 32 Şekil 8–11. Aurikular kıkırdak, HE boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka). Şekil 8–12. Aurikular kıkırdak, HE boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Lipit damlacıklar ı (Ld); Teritoryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matr iks (İm); Kıkırdak mat- r iksi (Km); Perikondrium (P). 33 Şekil 9–1. Trakea, van Gieson boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). Şekil 9–2. Trakea, van Gieson boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). 34 Şekil 9–3. Trakea, van Gieson boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kı- kırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Kapiller (Kp); Eritrosit (E); Respiratuar epitel (Re). Şekil 9–4. Trakea, van Gieson boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teritoryal mat- r iks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 35 Şekil 9–5. Epiglottis, van Gieson boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikond- rium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Respiratuar epitel (Re); Non–kerati- nize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 9–6. Epiglottis, van Gieson boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Kapiller (Kp); Eritrosit (E); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). 36 Şekil 9–7. Epiglottis, van Gieson boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Müköz asinus (Ma); Eritrosit (E); Respira- tuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 9–8. Epiglottis, van Gieson boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Lipit damlacıklar ı (Ld); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 37 Şekil 9–9. Aurikular kıkırdak, van Gieson boyamas ı , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Pe- r ikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Kıl folikülü (Kf), Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). Şekil 9–10. Aurikular kıkırdak, van Gieson boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). 38 Şekil 9–11. Aurikular kıkırdak, van Gieson boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka). Şekil 9–12. Aurikular kıkırdak, van Gieson boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çe- kirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Lipit damlacıklar ı (Ld); Teritoryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 39 Şekil 10–1. Trakea, Masson Trikrom boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). Şekil 10–2. Trakea, Masson Trikrom boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar Epitel (Re); Kapiller (Kp); Eritrosit (E). 40 Şekil 10–3. Trakea, Masson Trikrom boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Kapiller (Kp); Eritrosit (E). Şekil 10–4. Trakea, Masson Trikrom boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 41 Şekil 10–5. Epiglottis, Masson Trikrom boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Respiratuar epitel (Re); Non– keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 10–6. Epiglottis, Masson Trikrom boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Kı- kırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Ka- piller (Kp); Eritrosit (E); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). 42 Şekil 10–7. Epiglottis, Masson Trikrom boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Kapiller (Kp); Eritrosit (E). Şekil 10–8. Epiglottis, Masson Trikrom boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekir- deği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Lipit damlacıklar ı (Ld); Perikondrium (P); Kıkırdak matriksi (Km). 43 Şekil 10–9. Aurikular kıkırdak, Masson Trikrom boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Kıl folikülü (Kf); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). Şekil 10–10. Aurikular kıkırdak, Masson Trikrom boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kapiller (Kp); Eritrosit (E); Kıl folikülü (Kf); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ep). 44 Şekil 10–11. Aurikular kıkırdak, Masson Trikrom boyaması , x20 büyütme. Kondro- sitli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Ka- piller (Kp); Eritrosit (E); Kıl folikülü (Kf). Şekil 10–12. Aurikular kıkırdak, Masson Trikrom boyaması , x40 büyütme. Kondro- sit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teritoryal matr iks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Pe- r ikondrium (P). 45 Şekil 11–1. Trakea, Safranin O boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). Şekil 11–2. Trakea, Safranin O boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikond- rium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). 46 Şekil 11–3. Trakea, Safranin O boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). Şekil 11–4. Trakea, Safranin O boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 47 Şekil 11–5. Epiglottis, Safranin O boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikond- rium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Respiratuar epitel (Re); Non–kerati- nize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 11–6. Epiglottis, Safranin O boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Kapiller (Kp); Eritrosit (E); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). 48 Şekil 11–7. Epiglottis, Safranin O boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Kapiller (Kp). Şekil 11–8. Epiglottis, Safranin O boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 49 Şekil 11–9. Aurikular kıkırdak, Safranin O boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). Şekil 11–10. Aurikular kıkırdak, Safranin O boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). 50 Şekil 11–11. Aurikular kıkırdak, Safranin O boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka). Şekil. 11–12. Aurikular kıkırdak, Safranin O boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çe- kirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teritoryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km). 51 Şekil 12–1. Trakea, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). Şekil 12–2. Trakea, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). 52 Şekil 12–3. Trakea, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Eritrosit (E). Şekil 12–4. Trakea, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teritoryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Peri- kondrium (P). 53 Şekil 12–5. Epiglottis, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 12–6. Epiglottis, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). 54 Şekil 12–7. Epiglottis, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x20 büyütme. Kondro- sitli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Müköz asinus (Ma); Kapil- ler (Kp); Eritrosit (E). Şekil 12–8. Epiglottis, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Lipit damlacıklar ı (Ld); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 55 Şekil 12–9. Aurikular kıkırdak, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Kıl folikülü (Kf); Ke- ratinize çok katlı yassı epitel (KE). Şekil 12–10. Aurikular kıkırdak, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). 56 Şekil 12–11. Aurikular kıkırdak, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka). Şekil 12–12. Aurikular kıkırdak, Mallory’nin Aniline Blue boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Lipit damlacıkları (Ld); Teritoryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 57 Şekil 13–1. Trakea, Alcian Blue 8GX boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). Şekil 13–2. Trakea, Alcian Blue 8GX boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). 58 Şekil 13–3. Trakea, Alcian Blue 8GX boyaması , x20 büyütme. Boş laküna (Bl); Kı- kırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Kapiller (Kp); Eritrosit (E). Şekil 13–4. Trakea, Alcian Blue 8GX boyaması , x40 büyütme. Boş laküna (Bl); Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teritoryal matriks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 59 Şekil 13–5. Epiglottis, Alcian Blue 8GX boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 13–6. Epiglottis, Alcian Blue 8GX boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Kı- kırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Res- piratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). 60 Şekil 13–7. Epiglottis, Alcian Blue 8GX boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Kapiller (Kp); Eritrosit (E). Şekil 13–8. Epiglottis, Alcian Blue 8GX boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekir- deği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teri- toryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 61 Şekil 13–9. Aurikular kıkırdak, Alcian Blue 8GX boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). Şekil 13–10. Aurikular kıkırdak, Alcian Blue 8GX boyaması , x10 büyütme. Kıkır- dak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Kıl folikülü (Kf); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). 62 Şekil 13–11. Aurikular kıkırdak, Alcian Blue 8GX boyaması , x20 büyütme. Boş laküna (Bl); Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp). Şekil 13–12. Aurikular kıkırdak, Alcian Blue 8GX boyaması , x40 büyütme. Boş laküna (Bl); Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); Teritoryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Pe- r ikondrium (P). 63 Toluidine Blue O (4) boyanan preparatlarda kıkırdak matriksi metakromatik boyanır- ken, çekirdek ve sitoplazmanın soluk mavi boyandığını, bazı preparatlarda ise boyanma ol- madığı görüldü. Teritoryal matriks yoğun bir boyanma gösterirken, interteritoryal matrik- sin soluk boyandığı görüldü (Şekil 14–1, Şekil 14–2, Şekil 14–3, Şekil 14–4, Şekil 14–5, Şekil 14–6, Şekil 14–7, Şekil 14–8, Şekil 14–9, Şekil 14–10, Şekil 14–11, Şekil 14–12). Tamponlu Azure Eosin boyama yönteminin (4) de Toluidine Blue O (4) ve Thionin (4) yöntemlerindeki gibi kıkırdak matriksi menekşe moru boyarken, çekirdek ve sitoplaz- mayı mavi renkte boyadığı görüldü (Şekil 15–1, Şekil 15–2, Şekil 15–3, Şekil 15–4, Şekil 15–5, Şekil 15–6, Şekil 15–7, Şekil 15–8, Şekil 15–9, Şekil 15–10, Şekil 15–11, Şekil 15– 12). Tamponlu Azure–Eosin boyasının; Thionin boyasına göre daha keskin bir boyama sağladığı görüldü. Thionin (4) ile boyanan preparatlarda da kıkırdak matriks metakromatik boyanırken, çekirdeğin mavi ve sitoplazmanın soluk mavi–mor boyandığı, bazı preparatlarda ise bo- yanma olmadığı görüldü. Thionin boyama yönteminin literatürde (4) belirtildiği süreden daha uzun sürede boyadığı görüldü (Şekil 16–1, Şekil 16–2, Şekil 16–3,Şekil 16–4, Şekil 16–5, Şekil 16–6, Şekil 16–7, Şekil 16–8, Şekil 16–9, Şekil 16–10, Şekil 16–11, Şekil 16– 12). Shorr yöntemiyle (33) boyanan preparatlarda çekirdek kırmızı tonlarında boyanırken sitoplazma turuncu–kahverengi tonlarda boyandı. Kıkırdak matriksinde teritoryal alanın yeşil, interteritoryal alanların kahverengi, perikondriumun ise yeşil boyandığı görüldü. Damar duvarı açık kahverengi tonlarında boyanırken, lümendeki eritrositler turuncu gö- rüldü. Epiteldeki hücrelerin çekirdekleri siyahımsı görülürken, sitoplazması kiremit kırmı- zısı–kahverengi tonlarında boyandı (Şekil 17–1, Şekil 17–2, Şekil 17–3, Şekil 17–4, Şekil 17–5, Şekil 17–6, Şekil 17–7, Şekil 17–8, Şekil 17–9, Şekil 17–10, Şekil 17–11, Şekil 17– 12). 64 Şekil 14–1. Trakea, Toluidine O boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikond- rium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). Şekil 14–2. Trakea, Toluidine Blue O boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). 65 Şekil 14–3. Trakea, Toluidine Blue O boyaması , x20 büyütme. Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Respiratuar epitel (Re). Şekil 14–4. Trakea, Toluidine Blue O boyaması , x40 büyütme. Boş laküna (Bl); Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); Teri- toryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 66 Şekil 14–5. Epiglottis, Toluidine Blue O boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Respiratuar epitel (Re); Non– keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 14–6. Epiglottis, Toluidine Blue O boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Kı- kırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Res- piratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). 67 Şekil 14–7. Epiglottis, Toluidine Blue O boyaması , x20 büyütme. Boş laküna (Bl); Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). Şekil 14–8. Epiglottis, Toluidine Blue O boyaması , x40 büyütme. Boş laküna (Bl); Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teritoryal matriks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 68 Şekil 14–9. Aurikular kıkırdak, Toluidine Blue O boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). P Şekil 14–10. Aurikular kıkırdak, Toluidine Blue O boyaması , x10 büyütme. Kıkır- dak (K); Perikondrium (P). 69 Şekil 14–11. Aurikular kıkırdak, Toluidine Blue O boyaması , x20 büyütme. Boş laküna (Bl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). Şekil 14–12. Aurikular kıkırdak, Toluidine Blue O boyaması , x40 büyütme. Boş laküna (Bl); Teritoryal matr iks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 70 P Şekil 15–1. Trakea, Tamponlu Azure E boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Respiratuar epitel (Re). Şekil 15–2. Trakea, Tamponlu Azure E boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). 71 Şekil 15–3. Trakea, Tamponlu Azure E boyaması , x20 büyütme. Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). Şekil 15–4. Trakea, Tamponlu Azure E boyaması , x40 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Teritoryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Pe- r ikondrium (P). 72 Şekil 15–5. Epiglottis, Tamponlu Azure E boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Pe- r ikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Respiratuar epitel (Re); Non– keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 15–6. Epiglottis, Tamponlu Azure E boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Kapiller (Kp); Eritrosit (E); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epi- tel (Ne). 73 Şekil 15–7. Epiglottis, Tamponlu Azure E boyaması , x20 büyütme. Boş laküna (Bl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). Şekil 15–8. Epiglottis, Tamponlu Azure E boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekir- deği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Kı- kırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 74 Şekil 15–9. Aurikular kıkırdak, Tamponlu Azure E boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). Şekil 15–10. Aurikular kıkırdak, Tamponu Azure E boyaması , x10 büyütme. Kıkır- dak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). 75 Şekil 15–11. Aurikular kıkırdak, Tamponlu Azure E boyaması , x20 büyütme. Boş laküna (Bl); Kıkırdak matriksi (Km). Şekil 15–12. Aurikular kıkırdak, Tamponlu Azure E boyaması , x40 büyütme. Kond- rosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks);Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teritoryal matr iks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Pe- r ikondrium (P). 76 Şekil 16–1. Trakea, Thionin boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Respiratuar epi- tel (Re). Şekil 16–2. Trakea, Thionin boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Respiratuar epi- tel (Re). 77 Şekil 16–3. Trakea, Thionin boyaması , x20 büyütme. Kıkırdak (K); Boş laküna (Bl). Şekil 16–4. Trakea, Thionin boyaması , x40 büyütme. Boş laküna (Bl); İzogen grup (İg); Teritoryal matr iks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm). 78 Şekil 16–5. Epiglottis, Thionin boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Lamina prop- ria (Lp); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 16–6. Epiglottis, Thionin boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K). 79 Şekil 16–7. Epiglottis, Thionin boyaması , x20 büyütme. Boş laküna (Bl); Kıkırdak matriksi (Km). Şekil 16–8. Epiglottis, Thionin boyaması , x40 büyütme. Boş laküna (Bl); İzogen grup (İg); Teritoryal matriks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 80 K Şekil 16–9. Aurikular kıkırdak, Thionin boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); La- mina propria (Lp); Kas (Ka); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). Şekil 16–10. Aurikular kıkırdak, Thionin boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K). 81 Şekil 16–11. Aurikular kıkırdak, Thionin boyaması , x20 büyütme. Boş laküna (Bl). Şekil 16–12. Aurikular kıkırdak, Thionin boyaması , x40 büyütme. Boş laküna (Bl); Teritoryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matriks (İm); Kıkırdak matriksi (Km). 82 Şekil 17–1. Trakea, Shorr boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re). Şekil 17–2. Trakea, Shorr boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Ven (V); Eritrosit (E); Respiratuar epitel (Re). 83 Şekil 17–3. Trakea, Shorr boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkır- dak matriksi (Km); Perikondrium (P). Şekil 17–4. Trakea, Shorr boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kond- rosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Teritoryal matriks (Tm); İnterter itoryal matr iks (İm); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P). 84 Şekil 17–5. Epiglottis, Shorr boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 17–6. Epiglottis, Shorr boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Kıkırdak mat- r iksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). 85 Şekil 17–7. Epiglottis, Shorr boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kı- kırdak (K); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp); Müköz asinus (Ma); Arter (A); Ka- piller (Kp); Eritrosit (E); Respiratuar epitel (Re); Non–keratinize çok katlı yassı epitel (Ne). Şekil 17–8. Epiglottis, Shorr boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Lipit damlacık- lar ı (Ld); Perikondrium (P). 86 Şekil 17–9. Aurikular kıkırdak, Shorr boyaması , x4 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Kas (Ka); Kıl folikülü (Kf); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). Şekil 17–10. Aurikular kıkırdak, Shorr boyaması , x10 büyütme. Kıkırdak (K); Peri- kondrium (P); Lamina propria (Lp); Kapiller (Kp); Eritrosit (E); Kas (Ka); Kıl folikülü (Kf); Keratinize çok katlı yassı epitel (Ke). 87 Şekil 17–11. Aurikular kıkırdak, Shorr boyaması , x20 büyütme. Kondrositli laküna (Kl); Kıkırdak matriksi (Km); Perikondrium (P); Lamina propria (Lp). Şekil 17–12. Aurikular kıkırdak, Shorr boyaması , x40 büyütme. Kondrosit çekirdeği (Kç); Kondrosit sitoplazması (Ks); Kondrositli laküna (Kl); İzogen grup (İg); Lipit damlacıklar ı (Ld); Teritoryal matr iks (Tm); İnterteritoryal matr iks (İm); Kıkırdak mat- r iksi (Km); Perikondrium (P). 88 TARTIŞMA ve SONUÇ Kıkırdak dokusunu oluşturan doku bileşenlerini farklı bir boyama yöntemiyle göstere- bilmek amacıyla tavşanların farklı dokularından kıkırdak yapıları alındı. Konu ile ilgili ça- lışmacıların ortak amacı; güzel sonuç alabilecek bir boyama yöntemi bulmak olduğundan çalışmalarında fiksatif olarak nötral formalin ve Zenker fiksatifi kullanmışlardır. Ancak bizim çalışmalarımızda nötral formalinle sağlıklı bir sonuç elde edilemediği için %10 for- malin kullanıldı. Çalışmada şimdiye kadar kıkırdak dokusunda uygulanmamış bir boya kullanılması nedeni ile boyanın sonuçlarını değerlendirebilmek ve kıyaslama yapabilmek amacıyla, klasik histoloji teknik kitaplarında kıkırdak doku bileşenlerini göstermek için önerilen boyama yöntemleri referans (1, 2, 3, 4) olarak kullanıldı. Bu yöntemlerden biri olan HE (29); yalnızca kıkırdak için değil, laboratuvarlarda genel amaçlı olarak yaygın kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem (1) ile boyama sonucunda; çe- kirdeğin mavi–siyah renkte, hücre sitoplazması ve bağ dokusu elemanlarından kollajen lif- ler ve kas liflerinin aynı tonlarda boyandığı görüldü. Bu nedenle, kas ve bağ dokusunun birbirinden ayrımı güç olmaktadır. Yalnızca kas ve bağ dokusu için değil, tüm doku tipleri için yapıları pembe, kırmızı ve turuncu tonlarında boyamaktadır (Şekil 8–1, Şekil 8–2, Şe- kil 8–3, Şekil 8–4, Şekil 8–5, Şekil 8–6, Şekil 8–7, Şekil 8–8, Şekil 8–9, Şekil 8–10, Şekil 8–11, Şekil 8–12). Bizim boyamamızda (33) ise kas kahverengi, kollajen lifler yeşil bo- yandığından, iki yapı birbirinden kolayca ayırt edildi (Şekil 17–1, Şekil 17–2, Şekil 17–3, Şekil 17–4, Şekil 17–5, Şekil 17–6, Şekil 17–7, Şekil 17–8, Şekil 17–9, Şekil 17–10, Şekil 17–11, Şekil 17–12). Yöntemimizin (33) HE’e (1) göre en önemli avantajının boyanın tek bir solüsyonda yapılması ve HE boyama süresinin 1/20’si kadar bir sürede gerçekleşmesi olduğu düşünüldü. Bütünüyle en iyi bilinen bağ dokusu boyalarından biri olan van Gieson’un pikro fuk- sini (4) ile boyama yapıldığında kollajenlerin pembeden kırmızıya değişen tonlarda boya- nırken, kas ve eritrositlerin sarı boyandığı gözlemlenmiştir. Tek tek bulunan lifler pembe görülürken, yoğun lif demetlerinin ise koyu kırmızı boyandığı görülmüştür. Bizim çalış- mamızda ise van Gieson’un pikro fuksini ve Weigert’in demirli hematoksilen boyamasıyla (2), bunlara ek olarak çekirdeklerin siyahımsı boyandığı görüldü (Şekil 9–1, Şekil 9–2, Şe- kil 9–3, Şekil 9–4, Şekil 9–5, Şekil 9–6, Şekil 9–7, Şekil 9–8, Şekil 9–9, Şekil 9–10, Şekil 89 9–11, Şekil 9–12). Bu boyama kişilerin farklı amaçlar için kullanabileceği, kollajenlerin kolay bir şekilde ayırt edilmesinde kullanılan bir yöntemdir. van Gieson boyası (4) Verhoeff yöntemi (4) ile benzerlik göstermektedir. Verhoeff’un elastik dokular için kullanılan Hematoksilen ve van Gieson’un pikro fuksini boyamasının (4) tek avantajı elastik ve kollajen liflerin tatmin edici bir şekilde ayırt edilebilmesidir. Bu boyamayla (4) elastik lifler siyah boyanırken, kollajen liflerin kırmızı boyandığı ve çekirdeğin ise siyahımsı boyandığı gösterilmiştir. Kalın liflerin iyi bir şekilde gösterildiği ancak ince olanların farklılaştırma sırasında sık sık kaybedildiği belirtilmiştir. van Gieson’un Fast Green modifikasyonu (4) ile bağ dokuları ve kas yapılarının farklı renk ve tonlarda boyandığı gösterilmiştir. Çalışmamızda kullandığımız Shorr yönteminin (33) süresinin bu boyamanın süresinin yaklaşık 1/39’u kadar olduğu görüldü. Ayrıca tek boya solüsyonu kullanılması bakımından da daha avantajlı olduğu düşünüldü. Masson’un Trikrom boyası (1) van Gieson boyası yerine tercih edilebilir bir yöntem- dir. Masson’un trikrom boyaması sonucu; bağ dokusu ile kas liflerinin farklı renklerde bo- yandığı görüldü. Kollajen lifler yeşil boyanırken kas lifleri mor–eflatun renklerinde bo- yandı (Şekil 10–1, Şekil 10–2, Şekil 10–3, Şekil 10–4, Şekil 10–5, Şekil 10–6, Şekil 10–7, Şekil 10–8, Şekil 10–9, Şekil 10–10, Şekil 10–11, Şekil 10–12). Masson’un trikrom yönteminde (1) birden çok solüsyon kullanılmaktadır ve farklılaş- tırma ve drene etme basamakları içermektedir. Ayrıca yaklaşık 30 dakika sürmektedir. Yöntemimizin (33) süresi, bu sürenin 1/15’i kadar olması ve tek solüsyon içermesi yönün- den daha avantajlı olduğu düşünüldü. Safranin O boyası (8); kondroitin sülfat ve keratan sülfat içeren sülfatlı glikozaminog- likan zincirlerinden oluşan proteoglikan içeriğini boyamaktadır. Yüksek proteoglikan içe- riği nedeniyle Safranin O ile yoğun kırmızı boyanan kıkırdak, aktif kondrosit aktivitesini temsil etmektedir. Kıkırdak matriksindeki proteoglikan içeriğinin azalması nedeniyle kı- kırdaktaki boyanma azalmaktadır. Bunlara ek olarak kalsifiye kıkırdağın ise parlak pembe boyandığı gösterilmiştir. Araştırmacılar yaptıkları histopatolojik değerlendirmede (8) genç ve yaşlı hastalara ait örneklerdeki kondrosit aktivitesi bakımından farklılıkları göstermiştir. Çalışmada (8) Safranin O boyası kullanılarak yaş arttıkça kondrosit aktivitesinin azaldığı ve buna bağlı olarak kıkırdak matriksindeki proteoglikan içeriğinin azaldığı gösterilmiştir. 90 Yaptığımız Safranin O boyaması (32) sonucunda; çekirdeklerin siyah; kıkırdak matrik- sinin turuncudan kırmızıya değişen tonlarda; perikondriyum, kas, damar duvarı, eritrosit yapılarının mavimsi yeşil renkte boyandığını görüldü (Şekil 11–1, Şekil 11–2, Şekil 11–3, Şekil 11–4, Şekil 11–5, Şekil 11–6, Şekil 11–7, Şekil 11–8, Şekil 11–9, Şekil 11–10, Şekil 11–11, Şekil 11–12). Bizim çalışmamızın (33), Safranin O boyama süresinin yaklaşık 1/15’i kadar olduğu görüldü. Önerdiğimiz Shorr boyamamızla (33) kıyasladığımızda hem birden çok solüsyon kullanılması hem de boyama basamağının bizimkine göre çok olması ve bu basamakların uzun sürmesi nedeniyle bizim çalışmamızın daha avantajlı olduğu düşünüldü. Mallory’nin Aniline Blue boyama yönteminde (2) Zenker fiksatifi önerilirken, biz %10’luk formalin fiksatifi kullanmamıza rağmen sağlıklı bir boyama elde edildi. Çekir- dek; kırmızı renkte boyandı. Kıkırdak matriks mavinin çeşitli tonlarında boyanırken, kol- lajen liflerin yoğun mavi boyandığı görüldü (Şekil 12–1, Şekil 12–2, Şekil 12–3, Şekil 12– 4, Şekil 12–5, Şekil 12–6, Şekil 12–7, Şekil 12–8, Şekil 12–9, Şekil 12–10, Şekil 12–11, Şekil 12–12). Bizim yöntemimizin (33) süresinin bu boyama yönteminin süresinin yakla- şık 1/20’si kadar olduğu görüldü. Bu yöntemde (2) birden çok solüsyon kullanılırken bi- zim yöntemimizde (33) tek solüsyonla boyama gerçekleştirildi. Mallory’nin modifiye edil- miş bağ doku boyama yönteminde (16) araştırmacılar; eritrositlerin asit fuksine daha iyi bağlanması amacıyla önce Zenker fiksatifinde daha sonra ise formalin ve Bouin sıvısında fikse etmişlerdir. Mallory’nin Aniline Blue boyama yöntemine ek olarak hematoksilen bo- yaması yapılmıştır. Mallory’nin Aniline Blue solüsyonunda; Aniline Blue, Orange G ve fosfotungstik asit tek bir solüsyon halinde kullanılırken, Mallory’nin modifiye edilmiş Ani- line Blue boyama yönteminde araştırmacılar bu boyaları ayrı solüsyonlar halinde ayrı basa- maklar olarak kullanmışlardır. Alcian Blue 8GX (13); araştırmacılar tarafından nonradyoaktif glikozaminoglikanların mikrogram miktarında ölçmek amacıyla kullanılan tetrakatyonik bir boyadır. Bu çalışma- larda (13) glikozaminoglikanlar ve proteoglikanlar; düşük pH yoğunluklarında Alcian Blue yardımıyla çökelmektedir. Toluidine Blue da histokimyasal çalışmalarda dokudaki prote- oglikan yapılarını boyayan monokatyonik bir boyadır. Tuzlu solüsyonlarda Alcian Blue boyasıyla glikozaminoglikan birbirinden ayrılmazken, Toluidine Blue boyasıyla glikoza- minoglikanın birbirinden ayrılabildiği araştırmacılar tarafından bildirilmiştir. 91 Nuklear Fast Red boyası (34); yüksek kontrastlı karşıt boyama alanında kullanılan nüklear boyama yöntemidir. Ayrıca Nuklear Fast Red–alüminyum sülfat %0,1 çözeltisi ile parafin bölümlerinin yanı sıra kan ve kemik iliği simirlerinin de boyanabildiği gösterilmiş- tir. Alcian Blue 8GX ve Nuklear Fast Red’in birlikte kullanıldığı boyama yöntemiyle (3); kıkırdak matriksi ve bağ dokusu alanlarının turkuaz renkte boyandığı, çekirdeklerin ise kır- mızı boyandığını görüldü (Şekil 13–1, Şekil 13–2, Şekil 13–3, Şekil 13–4, Şekil 13–5, Şe- kil 13–6, Şekil 13–7, Şekil 13–8, Şekil 13–9, Şekil 13–10, Şekil 13–11, Şekil 13–12). Al- cian Blue 8GX–Nüklear Fast Red boyama yönteminde birden çok solüsyon kullanıldığı ve boyama süresinin uzun olduğu görüldü. Bizim boyama yöntemimizin (33); bu boyama yönteminin (3) yaklaşık 1/18’i kadar ol- ması ve daha çok renk tonuyla diğer yapıların da ayırt edilebilmesi nedeniyle daha avan- tajlı olduğu düşünüldü. Toluidine Blue O boyası (4); asidik maddelerdeki metakromatik boyamayı göstermek- tedir. Kıkırdak matriksi metakromatik boyanırken, çekirdek ve sitoplazmanın mavi boyan- dığı görüldü (Şekil 14–1, Şekil 14–2, Şekil 14–3, Şekil 14–4, Şekil 14–5, Şekil 14–6, Şekil 14–7, Şekil 14–8, Şekil 14–9, Şekil 14–10, Şekil 14–11, Şekil 14–12). Bu yöntemin (4) boyama süresinin kısa olması ve boyamanın tek solüsyonda gerçekleşmesi boyama yönte- minin avantajları olarak düşünüldü. Ancak boyamanın kesitlerin sürekli mikroskop altında denetlenerek yapılması ve bazı dokular için özgün boyama göstermesi bu yöntemin deza- vantajı olarak düşünüldü. Tamponlu Azure Eosin boyama yönteminin (4) de Toluidine Blue O (4) ve Thionin (4) yöntemlerindeki gibi kıkırdak matriksini menekşe moru boyarken, çekirdek ve sitoplaz- mayı mavi renkte boyadığı görüldü (Şekil 15–1, Şekil 15–2, Şekil 15–3, Şekil 15–4, Şekil 15–5, Şekil 15–6, Şekil 15–7, Şekil 15–8, Şekil 15–9, Şekil 15–10, Şekil 15–11, Şekil 15– 12). Tamponlu Azure Eosin boya (21) solüsyonunda kullanılan Azure A rutin bazofilik boya olan Hematoksilen’e göre birçok avantaja sahiptir. Metakromatik olduğu için belli yapıları boyar ve bu boyama Hematoksilen’den daha yoğundur. Azure A kesin bir şekilde 92 kıkırdak dokusunu ve goblet hücrelerini tanımlamaktadır. Bu yöntemin (21) başlıca deza- vantajı boya solüsyonlarının her gün taze bir şekilde hazırlanması ve boyama süresinin ge- nellikle bir saate kadar uzatılmasıdır. Bir başka metakromatik boya olan Thionin’in (4) de Toluidine Blue (4) boyasıyla bo- yama bakımından benzerlik gösterdiği görüldü. Kıkırdak matriksin metakromatik boyanır- ken, çekirdek ve sitoplazmanın mavi renkte boyandığı görüldü. Thionin’in Toluidine Blue O’ya göre daha zayıf boyama gösterdiği gözlemlendi (Şekil 16–1, Şekil 16–2, Şekil 16–3, Şekil 16–4, Şekil 16–5, Şekil 16–6, Şekil 16–7, Şekil 16–8, Şekil 16–9, Şekil 16–10, Şekil 16–11, Şekil 16–12). Shorr yöntemiyle (33) ise; hücre çekirdekleri kırmızı tonlarında boyanırken, sitop- lazma turuncu–kahverengi boyandı. Kollajen lifler çok net bir şekilde yeşil boyandı. Epi- tel kiremit kırmızısı–kahverengi tonlarında boyanması nedeniyle lamina propria ile arasın- daki sınır belirlendi. Damar duvarları açık kahverengi tonlarında boyanırken, eritrositler ise turuncu olarak seçildi. Tavşan kulak kepçesinden alınan kesitlerde keratin yapısının tu- runcu renkte boyandığı görüldü (Şekil 17–1, Şekil 17–2, Şekil 17–3, Şekil 17–4, Şekil 17– 5, Şekil 17–6, Şekil 17–7, Şekil 17–8, Şekil 17–9, Şekil 17–10, Şekil 17–11, Şekil 17–12). Shorr yöntemi (33, 35) bilindiği gibi vaginal smear boyaması için önerilen bir yöntem- dir. Taranan literatürde Shorr yönteminin kıkırdak dokusunu göstermek için kullanıldığına rastlanmadı, ancak kas dokusunu göstermek amacıyla kullanıldığı (36) ve parafin kesitler için önerildiği görüldü. Önerdiğimiz Shorr yöntemi; formalin ile fikse edilen dokularda kullanılması, tek bir boya solüsyonu kullanılması, boya solüsyonunun olgunlaştırmaya ihtiyaç duymaması, sa- bitleştiriciye gerek olmaması, boyama esnasında farklılaştırma işlemi uygulanmaması, boya süresinin diğer boya yöntemlerine göre kısa olması, boyama esnasında belli bir ısı or- tamına ihtiyaç duyulmaması, çoğu yönteme göre ekonomik oluşu ve boyama esnasında mikroskopla kontrol etmeye gerek göstermemesi nedenleriyle klasik histolojik boyama ki- taplarında kıkırdak boyamak için kullanılan yöntemlere göre daha pratik ve kullanışlı gibi görünmektedir. Bu yöntemle; kıkırdak dokuda ortaya çıkacak patolojik olguların hücresel ve matriks yönünden değerlendirilmesinde histopatolojik araştırmalara hız kazandırabile- ceği düşünülmektedir. 93 KAYNAKLAR 1. BANCROFT JD, STEVENS A. Theory and practice of histological techniques, 4th edition, Churchill Livingstone, Edinburgh, page 54–128, 1996. 2. CLARK G. Staining procedures, 4th edition, Williams and Wilkins, Baltimore, page 113–335, 1981. 3. SMITH A, BRUTON JA. Colour atlas of histological staining techniques, Wolfe medical books, page 24–170, 1977. 4. DEMİR R. Histolojik boyama teknikleri, Palme yayıncılık, Ankara, sayfa 61–189, 2001. 5. BLEYS RL, POPKO M, DE GROOT JW, HUIZING EH. Histological structure of the nasal cartilages and their perichondrial envelope. II. The perichondrial envelope of the septal and lobular cartilage. Rhinology, 45(2):153–7, 2007. 6. WEI F, ZHOU J, WEI X, ZHANG J, FLEMING BC, TEREK R, PEI M, CHEN Q, LIU T, WEI L. Activation of Indian Hedgehog promotes chondrocyte hypertrophy and up- regulation of MMP–13 in human osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis cartilage, 20(7):755–63, 2012. 7. NAUMANN A, DENNIS JE, AWADALLAH A, CARRINO DA, MANSOUR JM, KASTENBAUER E, CAPLAN AI. Immunochemical and mechanical characterization of cartilage subtypes in rabbit. J Histochem Cytochem, 50(8):1049–58, 2002. 8. LEE JW, MCHUGH J, KIM JC, BAKER SR, MOYER JS. Age–related histologic changes in human nasal cartilage. JAMA Facial Plast Surg, 15(4):256–62, 2013. 9. XUE JX, GONG YY, ZHOU GD, LIU W, CAO Y, ZHANG WJ. Chondrogenic differentiation of bone marrow–derived mesenchymal stem cells induced by acellular carti- lage sheets. Biomaterials, 33(24):5832–40, 2012. 10. LOEWI G. Localization of chondromucoprotein in cartilage. Ann Rheum Dis, 24(6):528–35, 1965. 11. STOCKWELL RA, SCOTT JE. Observations on the acid glycosaminoglycan (mu- copolysaccharide) content of the matrix of aging cartilage. Ann Rheum Dis. 24(4):341–50, 1965. 12. BRISBY H, WEI AQ, MOLLOY T, CHUNG SA, MURRELL GA, DIWAN AD. The effect of running exercise on intervertebral disc extracellular matrix production in a rat model. Spine, 35(15):1429–36, 2010. 13. TERRY DE, CHOPRA RK, OVENDEN J, ANASTASSIADES TP. Differential use of Alcian Blue and Toluidine Blue dyes for the quantification and isolation of anionic glycoconjugates from cell cultures: Application to proteoglycans and a high–molecular– weight glycoprotein synthesized by articular chondrocytes. Anal Biochem, 285(2):211–9, 2000. 14. BJORNSSON S. Quantitation of proteoglycans as glycosaminoglycans in biologi- cal fluids using an Alcian Blue dot blot analysis. Anal Biochem, 256(2):229–37, 1998. 15. BRADAMANTE Z, KOSTOVIĆ–KNEZEVIC L, LEVAK–SVAJGER B, SVAJ- GER A. Differentiation of the secondary elastic cartilage in the external ear of the rat. Int J Dev Biol, 35(3):311–20, 1991. 16. CROSSMON G. A modification of Mallory's connective tissue stain with a discus- sion of the principles involved. The Anatomical Record, 69(1):33 – 38, 2005. 17. ÖZCAN O, IRMAK MK, DALCIK H. Metakromazi (Metachromasia). T Klin Tıp Bilimleri, 15: 316–318, 1995. 94 18. SMITH SM, SHU C, MELROSE J. Comparative immunolocalisation of perlecan with collagen II and aggrecan in human foetal, newborn and adult ovine joint tissues de- monstrates perlecan as an early developmental chondrogenic marker. Histochem Cell Biol, 134(3):251–63, 2010. 19. HATTORI S, OXFORD C, REDDI AH. Identification of superficial zone articular chondrocyte stem/progenitor cells. Biochem Biophys Res Commun, 358(1):99–103, 2007. 20. BOS PK, VAN OSCH GJ, FRENZ DA, VERHAAR JA, VERWOERD–VER- HOEF HL. Growth factor expression in cartilage wound healing: Temporal ind spatial im- munolocalization in a rabbit auricular cartilage wound model. Osteoarthritis Cartilage, 9(4):382–9, 2001. 21. CROSS RF, MOORHEAD PD. An Azure and Eosin rapid staining technique. Can J Comp Med, 33(4):317, 1969. 22. ROSS MH, PAWLINA W. Histology: A text and atlas 6/E (Histoloji konu anlatımı ve atlas). Çevirmen: BAYKAL B, 6. baskı, Palme Yayıncılık, Ankara, sayfa 198–208, 2013. 23. JUNQUEIRA LC, CARNEIRO J. Basic histology (Temel histoloji). Çevirmenler: AYTEKİN Y, SOLAKOĞLU S. Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul, sayfa 136–140, 2006. 24. http://trdocs.org/docs/index-129.html?page=2 25. NETTER FH. The netter collection of medical illustrations. Çevirmenler: ARASIL T, AK GK. cilt 8, Güneş Tıp Kitabevleri, Ankara, sayfa 174–175, 2009. 26. KIERSZENBAUM AL. Histology and cell biology (Histoloji ve hücre biyolojisi). Çevirmen: DEMİR R. Palme Yayıncılık, Ankara, sayfa 113–117, 2006. 27. http://w2.anadolu.edu.tr/aos/kitap/EHSM/1219/unite01.pdf 28. http://w2.anadolu.edu.tr/aos/kitap/ehsm/1213/unite06.pdf 29. EKİCİOĞLU G, ÖZKAN N, ŞALVAAZAR E. Hematoksilen–Eozin (hematoxy- lin–eosin) (H&E). Aegean Pathology Journal, 2:58–61, 2005. 30. GREEN FJ. The Sigma–Aldrich handbook of stains, dyes and indicators, Sigma– Aldrich corporation, Wisconsin, page 18–703, 1991. 31. ÖZTUNA V. Ortopedi ve travmatolojide kullanılan deneysel hayvan modelleri (Te- mel ilkeler, etik unsurlar ve modeller). TOTBİD, 2007. 32. IHC World. Safranin O staining protocol for cartilage [Internet]. Available from: http://www.ihcworld.com/_protocols/special_stains/safranin_o.htm 33. CARLETON HM. Carleton’s histological technique, 4th edition, Oxford University Press, New York, Toronto, page 382–383, 1967. 34. https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma–aldrich/docs/Sigma/Product_In- formation_Sheet/2/n8002pis.pdf 35. STORTI–FILHO A, ESTIVALET SVIDIZINSKI TI, DA SILVA SOUZA RJ, DE MELLO IC, DA COSTA SOUZA P, LOPES CONSOLARO ME. Oncotic colpocytology stained with Harris–Shorr in the observation of vaginal microorganisms. Diagn Cytopathol, 36(6):358–62, 200838). 36. NOYAN S, SIRMALI ŞA. Shorr metodunun parafin kesitlere uygulanması. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 1-2-3: 13-16, 1995. 95 TEŞEKKÜR Yüksek lisans tez projemi destekleyen Uludağ Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje- leri Birimi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü ve Tıp Fakültesi Dekanlığı’na; tezimin gerçekleşme- sinde bana her zaman yol gösteren, göstermiş olduğu özveri ve katkıların ötesinde, eğiti- mim boyunca üzerimden manevi ve bilimsel desteğini esirgemeyen danışman hocam Prof. Dr.Şahin A. SIRMALI’ya; hocalarım Prof. Dr. Semiha ERSOY ve Prof. Dr. Zehra MİN- BAY ile bölümdeki diğer hocalarıma; deney hayvanlarının temini ve uygulamaların yapıl- masında destek sağlayan Uludağ Üniversitesi Deney Hayvanları Birimi ve çalışanlarına; yüksek lisans eğitimim boyunca her türlü bilgi ve manevi desteklerini esirgemeyen başta Araş. Gör. Sema SERTER ve Araş. Gör. Duygu GÖK YURTSEVEN’e ve diğer asistan ar- kadaşlarıma; tezimin düzenlenmesinde yardımcı olan biricik kuzenim Ergün NİZAM’a ve hayatım boyunca varlıklarından gurur duyduğum her koşulda beni destekleyen aileme çok teşekkür ederim. 96 ÖZGEÇMİŞ 15 Haziran 1989 tarihinde Bursa’da doğdum. Dörtçelik İlköğretim Okulu’nda ilk ve orta öğrenimimi tamamladım. Bursa Cumhuriyet Lisesi’nde lise öğrenimimi tamamladık- tan sonra 2008 yılında Balıkesir Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü’nü kazandım. 2012 yılında Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı’nda yüksek lisans eğitimime başladım. 97