T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIP FAKÜLTESİ İMMÜNOLOJİ ANABİLİM DALI MEME KANSERİ ALT-GRUPLARINDA MONOSİT/MAKROFAJ/ALVEOLAR MAKROFAJ ARASI ETKİLEŞİMLERİN METASTAZ VE İMMÜN MODÜLASYON ÜZERİNE ETKİLERİ ONUR ETGÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) BURSA-2022 ONUR ETGÜ İMMÜNOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ 2022 T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TIP FAKÜLTESİ İMMÜNOLOJİ ANABİLİM DALI MEME KANSERİ ALT-GRUPLARINDA MONOSİT/MAKROFAJ/ALVEOLAR MAKROFAJ ARASI ETKİLEŞİMLERİN METASTAZ VE İMMÜN MODÜLASYON ÜZERİNE ETKİLERİ ONUR ETGÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) DANIŞMAN: Prof.Dr. Haluk Barbaros ORAL BURSA-2022 T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ETİK BEYANI Yüksek Lisans tezi olarak sunduğum ‘’MEME KANSERİ ALT-GRUPLARINDA MONOSİT/MAKROFAJ/ALVEOLAR MAKROFAJ ARASI ETKİLEŞİMLERİN METASTAZ VE İMMÜN MODÜLASYON ÜZERİNE ETKİLERİ’’ adlı çalışmanın, proje safhasından sonuçlanmasına kadar geçen bütün süreçlerde bilimsel etik kurallarına uygun bir şekilde hazırlandığını ve yararlandığım eserlerin kaynaklar bölümünde gösterilenlerden oluştuğunu belirtir ve beyan ederim. ONUR ETGÜ 25.06.2022 II TEZ KONTROL ve BEYAN FORMU 25/06/22 Adı Soyadı: Onur ETGÜ Anabilim Dalı: Tıp-İmmünoloji Tez Konusu: MEME KANSERİ ALT-GRUPLARINDA MONOSİT/MAKROFAJ/ALVEOLAR MAKROFAJ ARASI ETKİLEŞİMLERİN METASTAZ VE İMMÜN MODÜLASYON ÜZERİNE ETKİLERİ ÖZELLİKLER UYGUNDUR UYGUN DEĞİLDİR AÇIKLAMA Tezin Boyutları q q Dış Kapak Sayfası q q İç Kapak Sayfası q q Kabul Onay Sayfası q q Sayfa Düzeni q q İçindekiler Sayfası q q Yazı Karakteri q q Satır Aralıkları q q Başlıklar q q Sayfa Numaraları q q Eklerin Yerleştirilmesi q q Tabloların Yerleştirilmesi q q Kaynaklar q q DANIŞMAN ONAYI Unvanı Adı Soyadı: Prof Dr. H. Barbaros ORAL İmza: IV İÇİNDEKİLER ETİK BEYANI ...................................................................................................... II KABUL ONAY .................................................................................................... III TEZ KONTROL ve BEYAN FORMU ............................................................... IV İÇİNDEKİLER ...................................................................................................... V TÜRKÇE ÖZET ................................................................................................. VII İNGİLİZCE ÖZET ........................................................................................... VIII 1. GİRİŞ ……………………………………………………………………………..1 2. GENEL BİLGİLER ............................................................................................ 2 2.1 Karsiyogenez ...................................................................................................... 2 2.2. Tümör İmmünolojisi .......................................................................................... 3 2.3 Meme Kanseri .................................................................................................... 6 2.4 Meme Kanseri Metastazı ..................................................................................... 9 2.5 Meme Kanseri Kök Hücresi .............................................................................. 10 2.6 Meme Kanseri ve Miyeloid Hücreler ................................................................ 12 2.7 Meme Kanseri ve Monosit/Makrofaj İlişkisi ..................................................... 16 2.8 Doku Yerleşik Makrofajlar ............................................................................... 19 2.9 Akciğer ve Doku Yerleşik Makrofajlar ............................................................. 20 3. GEREÇ ve YÖNTEM ....................................................................................... 22 3.1 Çalışmada Kullanılan Maddeler ........................................................................ 22 3.2 Hazırlanan Tamponlar ve Çözeltiler .................................................................. 22 3.3. Hücre Hatları İle İn-vitro Çalışmaların Planlanması ......................................... 23 3.3.1 Hücre Hatlarının Kültürü…...………………………………………………23 3.3.1.1 Meme Kanseri Hücre Hatlarının Kültürü ..................................................... 23 3.3.1.2 Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Polarizasyonu ve Kültürü .......... 24 3.3.2 Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Karakterizasyonu ......................... 26 3.3.2.1 Flow Sitometri Yöntemi İle Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Karakterizasyonu…………………………………………………………………..26 3.3.2.2 Morfolojik Analizler İle Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Karakterizasyonu .................................................................................................... 27 3.4 Ko-kültür Deneyleri .......................................................................................... 28 3.5 Floresan Aktive Hücre Saflaştırma (FACS) Yöntemi ........................................ 29 3.6 EMG/MEG Değişimlerinin CD24/CD44 Düzeyi İle Belirlenmesi ..................... 30 3.7 İnvazyon Testi İle EMG/MEG Değişimlerinin İncelenmesi............................... 30 3.8 İstatiksel Analiz ................................................................................................ 31 4. BULGULAR ..................................................................................................... 32 4.1 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattının (Al-Maq) Seçilimi ve Karakterizasyonu .................................................................................................... 32 4.2 Meme Kanseri Hücre Hatları Ve Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofaj-Benzeri Hücre Alt-Gruplarının Ko-Kültür Deneyleri………………………………………...40 5. TARTIŞMA ve SONUÇ ................................................................................... 66 6. KAYNAKLAR .................................................................................................. 70 7. SİMGELER VE KISALTMALAR .................................................................. 84 8. EKLER .............................................................................................................. 87 9. TEŞEKKÜR ...................................................................................................... 88 10. ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................... 89 V TÜRKÇE ÖZET Meme kanseri kadın kanserleri arasında birinci sırada yer almaktadır. İlk olarak akciğere olmakla beraber, kemik, karaciğer ve beyin metastazı görülür. Kanser kök hücresi/kanser başlatıcı hücrelerin metastazdan sorumlu olduğu ve primer meme tümöründe bulunan kanser kök hücresi popülasyon ve yüzdesinin bu yayılımda sorumlu olduğu ileri sürülmektedir. Kanser kök hücresi ve immün modülasyon/kaçış ile ilgili birçok çalışma litaratürde bulunmakla beraber, monosit/makrofaj/doku yerleşik makrofajları ve kanser kök hücresi arasındaki ilişki henüz bilinmemektedir. Ayrıca, akciğer doku yerleşik makrofajları ile ilgili yapılacak çalışmalarda bu hücreler için bir hücre hattı mevcut değildir. İlgili tez kapsamında, monositik bir hücre hattı olan THP-1’den, spontan seçilim ile alveolar makrofaj benzeri bir hücre hattı (Al- Maq/D6P30-DAİSY5) oluşturulmuştur. Bu hücre hattı CD206, CD163, CD169, CD11b, CD11c, CD14, HLA-DR, CD16 ve CD68 belirteçleri kapsamında karakterize edilmiştir. İlgili hücre hattı seçilirken farklı yüzey ve ekstrasellüler matris bileşenleri kullanılarak, farklılaşmayı en çok destekleyen koşul ile devam edilmiştir. Oluşturulan alveolar makrofaj benzeri hücre hattı meme kanseri hücre hatları ile ko-kültüre edilerek CD44/CD24 belirteç düzeylerindeki değişim araştırılmıştır. Kullanılan meme kanseri hücre hatlarından MDA-MB-468 ve T47D hücrelerinin ‘’karışık tip’’ kanser kök hücresi alt-klonlarını bulundurduğu ve en çok bu hücrelerin alveolar makrofaj karakterini desteklediği görülmüştür. BT474 hücrelerinin CD14+ monositik alt-grupları arttırırken, CD169 belirtecini en az uyaran hücre hattı olduğu belirlendi. Tüm bu sonuçlar neticesinde, kanser kök hücresi alt-tiplerinin farklı monosit/makrofaj ve doku yerleşik makrofaj alt-grubunu destekleyebileceği belirlendi. Bu veriler ışığında ileri mekanistik çalışmalar planlanarak mekanizmanın aydınlarılması hedeflenmektedir. Anahtar Kelimeler: Meme kanseri, kanser kök hücresi, doku yerleşik makrofajlar, alveolar makrofaj, kanser ilişkili immün yanıtlar VI İNGİLİZCE ÖZET THE EFFECT OF MONOCYTE/MACROPHAGE/ALVEOLAR MACROPHAGE AXİS EFFECT ON METASTASİS AND İMMUNE MODULATİON İN BREAST CANCER SUBTYPES Breast cancer is one of the most common cancer type among women. Lung is still the most common site of metastasis for breast cancer, followed by bone, liver and brain metastasis. It has been suggested that cancer stem cell/cancer initiating cells are responsible for metastasis of cancer and the population and/or percentage of cancer stem cells found in the primary tumor are responsible for this metastasis. Although there are many studies about cancer stem cell and their immune modulation/evasion in the literature, the axis between monocyte/macrophage/tissue resident macrophages and cancer stem cells is unknown. In addition, a cell line is not available for future studies on lung tissue resident macrophages. Within the scope of the thesis, an alveolar macrophage-like cell line (Al-Maq/D6P30-DAISY5) was generated from a monocytic cell line, THP-1, by spontaneous selection. This cell line has been characterized by using the markers CD206, CD163, CD169, CD11b, CD11c, CD14, HLA-DR, CD16 and CD68. While performing the spontaneous selection of the alveolar macrophage- like cell line, the condition that most favors differentiation was selected by using different surface and extracellular matrix components. The alveolar macrophage-like cell line was co-cultured with breast cancer cell lines to investigate the change in CD44/CD24 surface expression levels. Among the breast cancer cell lines used, MDA- MB-468 and T47D cells contained "mixed type" cancer stem cell subclones and mostly supported the alveolar macrophage character of these cells. While BT474 cells increased CD14+ monocyte subsets, it was determined that they were the cell line that stimulates the CD169 expression at least. As a results, it was determined that cancer stem cell subtypes could support different monocyte/macrophage and tissue resident macrophage subsets. With these data, it is aimed to elucidate the mechanism by planning mechanistic and functional studies. Keywords: Breast cancer, breast cancer stem cell, tissue-resident macrophages, alveolar macrophage, cancer-associated immune responses VII 1. GİRİŞ Kanser ilişkili ölümler dünyada hala ilk sıralarda yer almakta olup, meme kanseri kadın kanserleri arasında ilk sırada yer almaktadır. Kanser ile ilgili tedavi yaklaşımlarından kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi konvansiyonel tedavi olarak halen uygulanmakta olup, metastatik odakların eliminasyonunda yetersiz kalmaktadır. Son yıllarda kanserin bireye özgü bir immün sistem hastalığı olarak tanımlanmaya başlamasından beri bakış açısı değiştirilerek bu alanda yapılan çalışmalar hızlandırılmıştır. Bu kapsamda immün sistemin birçok hücre veya molekülü denenmekte olup, elde edilen bazı sonuçlar umut vaad etmektedir. Meme kanserinde metastaz genellikle akciğer, kemik, karaciğer ve beyne olmakla beraber, özellikle, üçlü negatif meme kanseri (triple negative breast cancer; TNBC) alt-gruplarında ilk metastatik organ olarak tümörün akciğeri tercih ettiği bildirilmiştir. Bu mekanizma ile ilgili çeşitli spekülasyonlar bulunsa da mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu tez çalışmasında meme kanseri akciğer metastaz biyolojisi ile ilgili immün mekanizmayı aydınlatabilmek amacı ile, monosit/makrofaj/alveolar makrofaj ve meme kanseri etkileşimi sonucunda gelişen alt-klonların metastatik karakterleri ve immün modülasyon kapasiteleri incelenmiştir. Bu kapsamda kullanılan alveolar makrofaj benzeri hücreleri ise, monosit kaynaklı bir hücre hattından alt-klon seçilimi ile elde edilerek karakterize edilmiş ve kullanılmıştır. 1 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Karsinogenez Biyolojik sistemlerden hayvanlar alemine ait metazoalar hücresel organizasyon ve gelişimsel farklılıkları açısından oldukça karmaşık ve çeşitlilik gösteren bir yapıya sahiptir. Evrimsel süreçte kazanmış oldukları bu plastisite yetenekleri sayesinde birçok özelleşmiş dokunun şekillenmesi sağlanmıştır. Ayrıca, organizmanın ve dokuların devamlılığı için birçok hücrenin farklı kapasitelerde proliferasyon ve kendini yenileme özelliği mevcuttur. Bu süreçlerin bir parçası olan mitoz bölünme esnasında hücrenin genetik materyalinin replikasyonu, korunumu, modifikasyonları vb., süreçlerin oldukça dikkatli kontrol edilmesi gerekmektedir. Hücrenin genetik veya epigenetik düzenlemeler sırasında geçirdiği mutasyonlar birçok kontrol mekanizması ile elimine edilebilmektedir. Fakat, hücrede ardarda meydana gelen birikimli, başlatıcı ve ilerletici mutasyonlar sonucunda hücre i) dış sinyallerden bağımsız proliferasyon kapasitesine sahip, ii) büyüme ve çoğalma sinyalllerine aşırı duyarlı hale gelmiş, iii) kontak inhibisyon yeteneğini kaybetmiş, iv) bulunduğu organın genetik kimliğinden uzaklaşmaya başlamış, v) epitelyal-mezenkimal dönüşüm (Epithelial-to-Mesenchymal Transition, EMT) yeteneği kazanarak (Dongre, &Weinberg, 2019; Roche, 2018) başka organlara gidip orada yerleşen ve çoğalmaya devam eden, vi) neoanjiyogenez uyarma kapasitesi sayesinde dolaşıma geçebilen ve zamanla bir çok organda baskın hale gelerek ilgili organların kendi fonksiyonlarını yapamaz hale gelmesini sağlayan bir ‘’istilacı fenotipe’’ dönüşür. Bulunduğu organda başlamış olduğu anormal ökaryotik hücre davranış karakteri ile ilk olarak sadece bu organda sınırlı ve aşırı proliferasyon yeteneğine sahip bu kanser hücresi ‘’beningn tümör’’ olarak adlandırılır. Fakat, zaman içerinde bu hücrede birikmeye başlayan ve çeşitli sebepler ile tamir edilemeyen mutasyonlar sebebi ile hücre hem bulunduğu organın fonksiyonlarına zarar vermeye başlar hem de geçirmiş olduğu başkalaşım neticesinde oluşturduğu alt-klonların bazıları anjiyogenez ve metastaz yeteneği kazanmış hücrelere dönüşerek EMT kapasiteleri sayesinde başka organlara giderek 2 buralarda kolonize olurlar ve fonksiyon kaybına sebep verirler. Hem primer organda proliferasyona ek olarak diğer karakterleri kazanan hem de diğer organlara yayılım gösteren bu hücrelere ise ‘’malign tümör’’ denilmektedir (Dongre, &Weinberg, 2019; Roche, 2018). Kanser patolojisindeki en önemli ve ölümle birebir korele özellik metastatik karakterdir. Primer tümörden kaynaklanan kanser hücreleri farklı organlara da giderek bu organların fonkisyonlarının işlevsiz hale gelmesine sebep olur. Günümüzde kanser vakaları Amerikan Kanser Derneği’nin (American Cancer Society, ACS) 2022 yılı verilerine göre, 1,918,030 yeni kanser vakası ve 609,360 adet kanser ilişkili ölüm raporlanmıştır. 2014-2018 yılları arasında gerçekleştirilmiş istatistiksel çalışmalar ve popülasyon temelli analizlere bakıldığında meme kanseri vakalarının görülme sıklığının yıllık %0,5’lik artış gösterdiği raporlanmıştır. Meme kanseri kaynaklı ölümlere bakıldığında ise, hafif bir azalma olduğu raporlanmış ve bunun sebebi olarak da tarama programları ile erken teşhislerin artışı, hedefli ve yenilikçi akıllı tedaviler ve immünoterapi başarısının artışı gösterilmiştir (Siegel, Miller, Fuchs, & Jemal, 2022). Dünyada ölümle sonuçlanan hastalıklar listesinde ilk olarak kalp ve damar hastalıkları ve daha sonra kanser yer almaktadır. Kanser zor bir tedavi prosedürüne sahiptir ve günümüzde çağın hastalığı olarak bildirilir. Dünya Sağlık Örgütü’nün (WHO) 2020 verilerine göre yıl içerisinde19,3 milyon yeni kanser vakası görülürken; 10 milyon ölüm kanserden dolayı meydana gelmiştir. Uluslararası Kanser Araştırma Derneği (İARC) verilerine göre, meme kanseri görülme sıklığı en yüksek olan akciğer kanserini geçmiştir (Sung ve ark., 2021). 2.2 Tümör İmmünolojisi Karsinogenez süreci, çoklu ve birikimli bir patoloji ile tanımlanmış olup, tüm karakteristik özelliklerini gösterebilmesi için, immün yanıttan kaçması gereklidir. İmmün sistem tüm organizmanın kontrolünü sağlayan bir ağ sistemidir. Karsinogenez süreci ile beraber hem tümör hücreleri hem de immün sistem hücreleri karşılıklı olarak seçilime uğrarlar. Bu seçilim sırasında, immün sistem hücreleri tarafından tanınamayan kanser hücreleri, metastaz ve immün baskılama süreçlerinde yer alır ve 3 hayatta kalmaya devam eder (Dongre, &Weinberg, 2019; Blomberg, Spagnuolo, & Visser, 2018). Tümör mikroçevresi; içerisinde farklı alt-klonları barındıran kanser hücrelerinin, ekstraselüler matris bileşenlerinin ve doğal/adaptif immün sistem hücrelerini bulunduran heterojen bir yapıdır. Primer tümörde kanser hücreleri büyüyüp, farklılaşırken hali hazırda var olan ve infltre olan immün sistem komponentleri tümörün metastatik karakter kazanmasında oldukça öneme sahiptir. Karsinogenez sürecindeki immün gözetimden kaçış tümör mikroçevresinde başlayıp, periferde (dalak, kemik iliği, kan ve metastatik organ) de oldukça etkili olduğu için kanser hücreleri uygun koşullarda metastaz sürecine katılabilmektedir (Dongre, &Weinberg, 2019). Karsinogenez sürecinde immün sistemin hem tümör büyümesini ilerletici hem de engelleyici iki yönlü bir yanıt vermektedir. Tümör ve immün sistem arasındaki bu ilişki; tümörün algılanıp, ortadan kaldırılması yönünde olabileceği gibi karşılıklı eliminasyon sonucunda ortaya çıkan tümör hücresi alt-klonları immün sistemden kaçıp ve baskılama fonksiyonları da kazanabilir. Bu çift taraflı etki; immün sistem hücreleri, kanser hücreleri, stromal hücreler ve soluble faktörler arasındaki etkileşim sonucu oluşmaktadır (Dongre, &Weinberg, 2019; Ferguson, Diaz, & Reya, 2021; Keibel, Singh, & Sharma,2009; Kumar, Patel, Tcyganov, & Gabrilovich, 2016)Dongre, &Weinberg, 2019). ‘’3E Kuralı’’ olarak açıklanmaya çalışılan bu mekanizma eliminasyon (elemination, E), denge (equilibrium, E) ve kaçış (escape, E) aşamalarından oluşmaktadır (Dunn, Bruce, Ikeda, Old, & Schreiber, 2004). İmmün sistem tarafından tanınabilen kanser hücre klonları öldürülürken (eleminasyon), hayatta kalabilen klonlar ve immün sistem hücreleri bir süre dengede kalmaktadır (equilibrium). Bu kanser hücre klonları daha dirençli fenotipte olup, immün sistemi pro-tümör yönde farklılaştırarak veya baskılayarak immün kaçış mekanizmaları (escape) geliştirmektedirler (Dunn ve ark., 2004, Kim, Emi, & Tanabe, 2007). Genelde eliminasyon aşamasında anti-tümör immün yanıtlar için CD8+ sitotoksik T lenfositler (cytotoxic T cells), doğal öldürücü hücreler (natural killer, NK) ve M1 tip makrofajlar etkili rol oynamaktadırlar. Aynı zamanda eleminasyon aşamasında yüksek oranda salgılanan IFN-γ sitokini ile makrofajların M1 yönünde polarize olduğu ve IL-12, IL- 23, IL-6 ve TNF-a gibi sitokinleri salgıladıkları bilinmektedir (Dunn ve ark., 2004, 4 Kim ve ark., 2007). Fakat, makrofajlar ortamda gelişen immün yanıt sonucu M2 makrofajlara da polarize olabilmekte ve tümör ilişkili makrofajlar (TAM) (Tumor associated macrophages) olarak nitelendirilen bu hücreler tümörün büyümesini destekleyebilmektedirler (Allavena, Sica, Solinas, Porta, & Mantovani, 2008). Bu hücreler genel olarak IL-4 ve IL-13 gibi sitokinlerle polarize olmakta ve pro- tümörijenik özellik kazanıp, yüksek oranda IL10, TGF-beta salgılamaktadırlar (Allavena ve ark., 2008). Ayrıca, CD8+ sitotoksik T hücrelerin aktivasyonunu engelleyip, CD4+ hücrelerin düzenleyici T (Treg) (Regulatory T) hücrelerine dönüşümünü de desteklemektedirler (Awad, De Vlaeminck, Maebe, Goyvaerts, & Breckpot, 2018; Elliott, Doherty, Sheahan, & Ryan, 2017). Eliminasyon aşamasında salgılanan en güçlü anti-tümör sitokinlerden olan IFN-gamma’ya karşı kanser hücreleri ve özellikle TAM’ların bazı alt grupları ‘adaptif direnç’ (Kursunel, & Esendagli, 2016) denilen bir mekanizma geliştirmekte ve üzerlerinde PD-L1 baskılayıcı ligandını yüksek düzeylerde ifade etmeye başlamaktadırlar. Tümörde bulunan CD8+ T hücreler de IFN-g sitokini ile belirli düzeylerde aktifleşirken, eş zamanlı olarak üzerlerinde PD-L1’in reseptörü olan PD- 1’i taşımaya başlamaktadırlar. Bu reseptör ligand etkileşiminin tümör mikroçevresinde bulunması tümöre saldırmak üzere infiltre olmuş CD8+ T hücrelerini yanıtsızlaştırmaktadır (Elliott ve ark., 2017; Kursunel, & Esendagli, 2016;, Yoyen- Ermis ve ark., 2019). Tümör dokusuna yerleşik; veya tümör ilişkili kronik inflamasyon sonucu dalak, kemik iliği ve metastatik organlarda biriken veya periferik kanda bulunan immün hücrelerden özellikle pro-tümör özellikte olan tip 2 monosit/makrofaj, miyeloid-kökenli baskılayıcı hücreler (MDSC) (myeloid-derived suppressor cells) ve baskılayıcı fonksiyona sahip nötrofiller; neo- anjiyogenez, T hücre ilişkili anti-tümör yanıtların baskılanması, tümör gelişimi ve metastazı için gerekli faktörlerin ve bağ dokunun yeniden şekillendirilmesi gibi karsinogenez için kritik fonksiyonlara sahiptirler (Awad ve ark., 2018; Kalluri, & Zeisberg, 2006; Marvel, & Gabrilovich, 2015; Mlecnik ve ark., 2011; Pietras, & Ostman, 2010). 5 2.3 Meme Kanseri Meme kanseri tüm dünyada kadın cinsiyetin en sık görülen kanser tipidir. Klinikte erken evrelerde saptanan %70-80 hastada tamamen iyileşme sağlanabilirken, uzak organ metastazı varlığında elimizdeki mevcut tedaviler ile kür mümkün değildir. Meme kanseri moleküler düzeyde incelendiğinde biyolojik davranışların ve tedavi yaklaşımarının farklı olduğu alt grupları olan oldukça heterojen bir hastalıktır. Tedavide cerrahi, radyasyon tedavisi ve sistemik tedavileri (kemoterapi, anti-HER2, endokrin tedaviler, PARP inhibitorleri, immunoterapiler) içeren multidisipliner yaklaşımlar kullanılmaktadır (Harbeck ve ark., 2019). Erken evre meme kanseri, meme dokusu ve yalnızca komşu aksiller lenf nodlarına sınırlı hastalık olarak tanımlanır. Tedavide son 10-15 yılda kat edilen gelişmeler ile günümüzde erken evre hastalık büyük oranda tamamen iyileşme ile sonuçlanmaktadır, ancak ileri evre (metastatik) hastalıkta tamamen iyileşme mümkün değilken; daha az yan etkiler ile hastalığın semptomları kontrol altına almak ve sağkalımı uzatmak hedeflenmektedir. Günümüzde meme kanserinin sınıflaması ve tedavisi temel olarak moleküler düzeyde patogenezde sorumlu histolojik ve genetik değişiklikleri ölçü ve hedef olarak almaktadır. En sık kullanılan sınıflamada östrojen reseptör (ER), progesteron reseptör (PR) eksprese eden tümör hormon reseptör pozitif meme kanseri olarak adlandırılırken, ER, PR ve HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) ekspresyonu göstermeyen tümör triple negatif meme kanseri olarak adlandırılır (Harbeck ve ark., 2019). Meme kanserinin başlangıcı ve mekanizması tam olarak aydınlatılmamış olmakla beraber klonal evrim modeli ve kanser kök hücre modeli kabul görmüş; son çalışmalarda kanser kök hücresinin klonal seleksiyon ile seçilimi üzerinde durulmuştur (Harbeck ve ark., 2019; Petersen, & Polyak, 2010). Normal meme dokusunda iki tip epitelyal hücre tipi bulunmaktadır. Kanal veya lobüllerdeki tek katlı epitel hücreler ‘’luminal epitelyal’’ hücreler olarak isimlendirilirken; bu hücre katmanının etrafındaki ikinci katmandaki hücreler ise ‘’bazal miyoepitelyal’’ hücreler olarak tanımlanır. Bazal miyoepitelyal hücreler bazal memran ile yakın temas halindedir. Bu nedenle meme kanseri alt-tipleri tanımlanırlen kullanılan bazal ve luminal ifadesi bu hücre orjini sebebiyle kullanılmaktadır 6 (Petersen, & Polyak, 2010; Valentin da Silva, Privat, Alaoui-Jamali, & Bignon, 2012). Meme kanserinde de bu var olan ekstraselüler matriks ve farklı hücrelerin oluşturduğu kompleks mikroçevre daha da karışık bir yapı haline dönüşmektedir. Meme kanseri mikroçevresinde sıklıkla kanser ilişkili fibroblastlar ve lökosit serinin elemanları (lenfositler, makrofajlar, myeloid türevi stromal hücreler) bulunmaktadır. Farklı alt tipler arasında immunojenik kapasite değişkenlik gösterirken, triple negatif ve HER2 pozitif meme kanseri daha immunojenik özellik gösterirken, luminal A ve luminal B alt tipleri daha az immunojeniktir. Neoadjuvan tedavilere yanıt ve prognoz tümör infiltre eden lökositler ile pozitif olarak ilişkili olarak bulunmuştur (Harbeck ve ark., 2019; Petersen ve ark., 2010; Visvader, &Lindeman, 2006). Meme kanserine oluşturulan immun yanıt, tümör hücrelerinde oluşan genetik değişiklikler sonucu ekspresyon gösterdiği neoantijenler ile başlatılır. Antijen sunucu hücreler tarafından sunulan neoantijenler CD8+ sitotoksik ve CD4+ yardımcı T hücre aktivasyonu ile sonuçlanır. Anti-tümör immun yanıt temel olarak T hücre reseptörü aktivasyonu ile CD8+ T hücreler tarafından sitolitik perforin ve granzim moleküllerinin salınımı ve tümör hücre lizisi ile oluşturulur. CD4+ T hücreler ise IFNγ, IL-2 ve tümör nekrozis faktör gibi sitokinlerin salınımı ile CD8+ T hücre yanıtını güçlendirir. CD8+ T hücreler Fas ligand ekspresyonunu artırarak ve TNF ilişkili apoptoz ligandlarının (TRAIL) indüksiyonu ile tümör hücre apoptozunu gerçekleştirir. Ayrıca doğrudan tümör hücre ölümünde doğal immunitenin parçası olan NK ve NK T hücreleri da önemli rol oynar. Tümör hücreleri CTLA-4, PD-L1 gibi immun checkpoint düzenleyici molekül ekspresyonu anti-tümör immun yanıtı baskılamak için kullanırken sonuç olarak T hücreler kronik olarak tümör hücrelerine maruz kalır ve işlevsiz hale gelir (Harbeck ve ark., 2019). Meme kanseri tedavisinde standart olarak kemoterapi, radyoterapi veya cerrahi kullanılmaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar ile tek hedefli tedaviler yerine kombine tedavi stratejilerinin kullanılmasının gerekliliği literatürde tartışılmaktadır. Kemoterapi ve cerrahi özellikle yüksek invaziv ve toksisite problemleri barındırdığı için, bu etkiyi minimale taşıyacak ve hedefli bir ek tedavi protokolü aranmaktadır. Ayrıca, aranılan bu yeni tedavi yaklaşımlarında immün sistem hücrelerinin kanser tedavisinde önemini vurgulamakta ve immün sistem hücrelerinin seçici olarak hedeflenmesi gerekliliği bilim camiasında yüksek etkili dergiler ve bilim insanları 7 tarafından önerilmektedir (Charmsaz, Collins, Perry, & Prencipe 2019; Chun, Page, & McArthur 2019; Hiam-Galvez, Allen & Spitzer 2019; Murciano-Goroff, Warner & Wolchok, 2020; Pucci, Chiara & Gianni 2019; Zhao ve ark., 2019). Meme kanserinin, Dünya Sağlık Örgütünün 2012 tümör sınıflamasında da bildirildiği gibi, konvansiyonel (geleneksel) tipine kıyasla daha az karşılaşılan çeşitli subtipleri (özel tipleri) bulunmaktadır. Yapılan morfolojik ve moleküler çalışmalarda, bu subtiplerin farklı hormonal profilleri ile tedavi modalitelerine farklı yanıtlar verdikleri ve prognozlarının da farklı olduğu gösterilmiştir (de Ronde, Bonder, Lips, Rodenhuis, & Wessels 2014). Hatta aynı kanser tipinin aynı tedaviye, farklı hastada farklı yanıt verdiği de saptanmıştır. Bu durum, günümüzde kişiye yönelik tedavi yöntemlerini gündeme getirmiş, tedavi protokollerinin kişiye göre düzenlenmesi gereksinimini doğurmuştur. Özellikle son 20 yılda moleküler çalışmaların artmasıyla meme kanserinin moleküler subtipleri tanımlanmıştır. Perou ve ark. tarafından yapılan çalışmada gen ekspresyon profiline (GEP) dayalı bir moleküler sınıflama yapılmıştır. Bu çalışmada toplam 42 hastaya ait 36 invaziv duktal karsinom, 2 invaziv lobüler karsinom, 1 DKİS, 1 fibroadenom ve 3 normal meme dokusu örneklerinin gen ekspresyon profiline bakarak birbirleri arasında ekspresyonları belirgin farklılık gösteren 496 adet gen ile intrensek gen setini oluşturmuşlardır. Bu intrensek gen seti ile hiyerarşik kümelenmelere bakıp bunları prognoz, tedaviye yanıtları ile korele ederek ‘luminal’ grup, ‘bazal-benzeri’ grup, ‘HER-2 aşırı eksprese eden’ grup ve ‘normal meme benzeri’ grup olarak 4 alt gruba ayırmışlardır (Perou ve ark., 2000). Hormon reseptörü eksprese eden luminal alt-grup ise, ER reseptör eksprese etme durumu ve sağ kalım göz önüne alınarak tekrar değerlendirilmiş ve luminal A ve luminal B olarak yeniden kategorize edilmiştir (Sørlie ve ark., 2001). Bu çalışmalara ek olarak, birçok grup tarafından farklı çalışmalar yapılmış ve gen ekspresyon profili, tümör morfolojisi, biyolojik davranış, tedaviye yanıt, prognoz durumu beraber değerlendirilerek moleküler sınıflama üzerinde çalışılarak kişiye yönelik hedef tedavi geliştirme yöntemleri araştırılmaktadır (Guiu ve ark., 2012; Perou ve ark., 2000; Sørlie ve ark., 2001). Meme kanseri ile yapılan bilimsel çalışmalarda birçok patolojide olduğu gibi hücre kültürü çalışmları büyük önem arz etmektedir. Meme kanserinde birçok farklı özellikte hücre hattı bulunmakta ve mekanistik çalışmalarda sıklıkla tercih 8 edilmektedir. Bu hücre hatlarından çalışmamızda BT474, T47D, MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 hücre hatları kullanılarak immün yanıtlar araştırıldı. T47D ve BT 474 hücre hatları invaziv duktal karsinoma olup luminal alt-tipindedir. MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 metastatik adenokarsinom alt-tipindeki bazal hücre hatlarıdır. Bazal alt-tiplere bakıldığında ise, MDA-MB-231 Bazal-B; MDA-MB-468 ise Bazal-A olarak kategorize edilmiştir (Driessens, Kline, & Gajewski, 2009). 2.4 Meme Kanseri Metastazı Meme kanserinde metastaz genellikle akciğer, kemik, karaciğer ve beyne olmaktadır. (Bailleux, Eberst, & Bachelot 2021; Pollock, Albares, Wendt, & Hubel, 2013). Özellikle, üçlü negatif meme kanseri (triple negative breast cancer; TNBC) alt-gruplarında ilk metastatik organ olarak tümörün akciğeri tercih ettiği bildirilmiştir (Smid ve ark., 2008). Bu metastatik tercih sırasında kanser hücrelerinin neden ilk olarak akciğeri seçtiğine dair farklı spekülasyonlar bulunsa da (Altorki ve ark., 2019; Jin ve ark., 2018; Medeiros, & Allan, 2019; Yousefi ve ark., 2018) mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır. Özellikle geçtiğimiz son bir kaç yıl içerisinde, akciğerde var olan doku yerleşik makrofajların inflamasyon ve akciğer dokusundaki önemleri vurgulanmaya başlanmıştır (Altorki, ve ark., 2019; Fares, Fares, Khachfe, Salhab, & Fares, 2020; Hu G, & Christman, 2019). Bu özelde yayınlanan çalışmalar ise, genellikle deneysel hayvan modellerinde gösterilen sonuçları göstermekte veya akciğerin kendine has var olan yapısını kanser özelinde speküle etmektedir. Akciğerin kendine has ekstraselüler komponent bileşimi ve oldukça karışık hücre alt-gruplarından oluşmaktadır. İmmün sistem hücrelerinden özellikle doku yerleşik makrofajlar, akciğerin devamlı immün hücre alt-grubunu oluşturmaktadır. Özellikle geçtiğimiz son bir yıl içerisinde, akciğerde var olan doku yerleşik makrofajların inflamasyon ve akciğer dokusundaki önemleri vurgulanmaya başlanmıştır (Hu G, & Christman, 2019). Farklı kanser tipleri karşılaştırıldığında ise, özellikle primer meme dokusunda en fazla infiltre olan lökosit alt-grubunun makrofajlar olduğu gösterilmiştir (Cassetta ve ark., 2008). Ancak, metastatik organlardaki doku yerleşik veya sekonder tümör mikroçevresinde bulunan makrofajlar ile ilgili bilgilerimiz oldukça sınırlıdır. Literatürde var olan bilgiler genellikle kanser 9 ilişkili makrofajlar veya deneysel hayvan modellerinde yapılmış sonuçları göstermekte olup (Cacho-Díaz ve ark., 2020; Cotechini, Atallah, & Grossman, 2021; Qian ve ark., 2009; Zhu ve ark., 2017) özellikle doku yerleşik makrofajlar özelinde meme kanseri hasta örnekleri ile yapılmış genel veya detaylı/mekanistik hiç bir çalışma bulunmamaktadır. 2.5 Meme Kanseri Kök Hücresi Sağlıklı meme dokusu hormon ve büyüme faktörlerine açık ve dinamik bir yapıdadır. Bu dinamizmini sahip olduğu kök hücre havuzu ile devam ettirir. Bu kök hücre grubu genel olarak lin-CD44+ CD24- olarak bildirilmiştir. Ayrıca, EpCAM-, CD49+, CD44+, CD24-, PROC+ karaktere sahiptir. Bu hücreler dış sinyallere bağlı olarak EpCAM+, CD49+, ALDH1+, SSEA4+ öncül hücrelere farklılaşırlar. Bu hücreler ise, EpCAM+, CD49-, CD24+, GATA3+, ER+, MUC1+ duktal/lobüler hücrelere ve EpCAM-, CD49+, CD24-, CD44+, CD10+, CD29+ miyoepitelyal hücrelere farklılaşırlar (Petersen ve ark., 2010; Visvader & Lindeman, 2006). Duktal/Lobuler hücreler Bazal seri hücreler Öncül hücreler Miyoepitelyal hücreler Şekil 2.1. İnsan meme dokusundaki faklı epitelyal hücre serilerinin hiyerarşik gelişim ve faklılaşmasını gösteren şematik model (Petersen & Polyak, 2010’dan uyarlanmıştır). Meme dokusunda bulunan CD44+/CD24- hücrelerin bazal karakterde olduğu ve gen ekspresyon profillerine bakıldığında hücre göç kapasitesi ile ilgili genleri 10 eksprese ettikleri gösterilmiştir. CD44-/CD24+ hücreler ise, daha diferansiye hücreler olan luminal epitelyal hücre fenotipini gösterir ve bu hücreler hormon reseptörleri ilişkili gen ekspresyonu profiline sahiptir (Fillmore, & Kuperwasser, 2008). CD24 yüzey belirteci, hücrelerin iletişiminde, adhezyonunda ve proliferasyonunda fonksiyona sahiptir (Kristiansen, Sammar, & Altevogt, 2004; Li, Zheng, & Liu, 2004; Lim, & Oh, 2005). Kanser kök hücresi ise, normal kök hücrelerin de sahip olduğu gibi dokusu içerisinde kendini yenileme kapasitesine ve farklı klonlara farklılaşma yeteneğine sahip olan, tümörün oluşumu ve idamesini sağlayan, uzak metastazdan sorumlu ve tedavi direncine katkıda bulunan hücre alt grubudur. Bu özellikleri ile yeni geliştirilen tedavilerin hedefi haline gelmiştir. Sıklıkla kanser kök hücreleri epithelial-mezenkial farklılaşma ile ilişkili bulunmuştur. Meme kanser kök hücreleri yüzey belirteci olarak CD44high/CD24low eksprese ederken, aldehit dehidrogenaz (ALDH1) aktivitesi gösterirler. CD44 hücre adezyonu, proliferasyon, farklılaşma ile ilişkili hücre yüzey transmembran glikoproteinidir. CD24 sialoprotein ekspresyonu adezyon ve metastaz ile ilişkilidir. ALDH1 kök hücre proliferasyonu ve farklılaşmasına katkıda bulunmaktadır. (Li ve ark., 2021; Zhang, Powell, & Li, 2020). Meme kanseri kök hücresi ile yürütülen çalışmalarda birçok meme kanseri hücre hattı kullanılmakta ve metastatik mekanizma çözülmeye çalışılmaktadır. Bu çalışamalarda hücre hatlarında CD44+CD24- hücrelerin baskın olduğu hücre hatları bazal; CD44-CD24+ hücrelerin baskın olduğu hücre hatları luminal; hem CD44+ hem de CD24+ hücreleri barındıran gruplar ise ‘’karışık tip’’ olarak raporlanmıştır. Bu hücre hatlarındaki parantel hücrelerden tanımlanmış bu alt-gruplar koşullara bağlı olarak farklılaşmaktadır (Fillmore, & Kuperwasser, 2008). Bunun yanı sıra, Vassilopoulos ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada, CD24+ hücre alt- gruplarının da metastatik karaktere sahip hücreler olabildiği gösterilmiştir (Nielsen ve ark., 2004; Potemski ve ark., 2005; Rakha ve ark., 2006; Rakha, & Ellis, 2009). Vassilopoulos, Chisholm, Lahusen, Zheng, & Deng, 2014). Meme kanseri kök hücreleri ile ilgili birçok çalışmada farklı yüzey belirteçleri de önerilse de, asıl bu hücre grubunu tanımlayan durum metastatik ve anjiyogenz karakteri ve EMT/MET dönüşüm kapasitesi olarak belirtilmiştir (Zhou ve ark., 2019). Litaratürde genel olarak luminal ve bazal benzeri hücre grubunun normal sağlıklı memede orijin aldığı 11 hücrelerden kaynaklandığı için bu ismi aldığı bildirilse de, yeni yapılan çalışmalarda bu hücre bazal kökenli hücrelerden luminal; luminal orjinli hücrelerden de bazal tipte meme kanseri hücreleri gelişebildiği bildirilmiştir (Zhou ve ark., 2019). Bu teori, kanser kök hücrelerinin sadece farklılaşmış hücrelerdeki mutasyonlardan kaynaklanmadığı ve farklı kanser kök hücresi hipotezlerine göre de yorumlanarak anlaşılmaya çalışılmaktadır. Kanser kök hücresi teorisine göre bir hücre i) kök hücre iken, ii) öncül hücre iken, iii) farklılaşmış bir hücre iken mutasyona uğrayabilir ve kanser kök hücresi oluşur. Özellikle, farklılaşmış bir hücrenin mutasyonlar sonucu de- diferansiye (geri farklılaşması, kök hücre haline geri dönmesi) olarak kök hücre karakterine dönüşebilmesi luminal bir hücreden de bazal-benzeri kanser hücresi şekillenmesini açıklayabilmektedir (Polyak, 2007). Meme kanseri kök hücreleri ile ilgili birçok teori ve litaratür bilgisi bulunsa da, immün hücreler ile etkileşimi ile ilgili veriler oldukça sınırlıdır. Ayrıca, bu hücrelerin karakterizasyonu ve sınıflaması ile ilgili daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır (Dittmer, & Rody, 2013; Oliveira, Jeffrey, & Ribeiro-Silva, 2010; Owens, & Naylor, 2013; Ricardo ve ark., 2011). 2.6 Meme Kanseri ve Miyeloid Hücreler Tümörün gelişimi, mikroçevresinde bulunan immun hücrelere ve salgıladıkları mediyatörlere göre şekillenir (Stanton, Adams, & Disis 2016). Tümör mikroçevresinde tümör ilişkili makrofajlar (tumor-associated macrophages, TAM), tolerojenik dendritik hücreler (tolerogenic dendritic cell, tDC), düzenleyici doğal öldürücü hücreler (regulatory natural killer cell, NKreg), mezenkimal kök hücreler (mesenchymal stem cell, MSC), miyeloid kökenli baskılayıcı hücreler (myeloid derived suppressor cell, MDSC), düzenleyici T hücreler (regulatory T cell, Treg) ve düzenleyici B hücreler (regulatory B cell, Breg) bulunur. Bu hücreler tümör hücre büyümesini, metaztazını, göçünü, anjiyogenezini etkileyecek inhibitör sitokinleri salgılayarak tümör mikroçevresini değiştirebilirler (Şekil 2.2) (Lan ve ark., 2021). 12 Şekil 2.2 Meme kanseri mikroçevresinde bulunan immun hücrelerin rolleri. TAM, Tumor-associated macrophage:Tümör ilişkili makrofaj; Treg, regulatory T cell: T regülatör hücre; tDC, tolerogenic dendritic cell: tolorojenik dendritik hücre; NKreg, regulatory natural killer cell : regülatör doğal öldürücü hücre; Breg, regulatory B cell : regülatör B hücre; MSC, mesenchymal stem cell : mezenkimal kök hücre; MDSC, myeloid derived suppressor cell : Miyeloid kökenli baskılayıcı hücre; mDC, myeloid dendritic cell: miyeloid dendritik hücre; CTL, cytotoxic T cell : sitotoksik T hücre (Lan ve ark., 2021’den uyarlanmıştır). Monositler interferon-gamma, lipopolisakkarit ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) varlığında M1 anti-tümör fenotipinde TAM polarizasyonu indüklenirken; makrofaj koloni uyarıcı faktör 1 (macrophage colony-stimulating factor-1, CSF-1), interlökin- 4 (IL-4), interlökin-10 (IL-10), dönüştürücü büyüme faktörü-β (Transforming growth factor-β, TGF-β) ve interlökin-13 (IL-13) M2 fenotipindeki pro tümör TAM polarizasyonuna katkıda bulunur. M2 makrofajları ayrıca IL-4 ve IL-13 tarafından 13 M2a'ya farklılaştırılır ve tip II inflamasyon ve T yardımcı hücre 2 (T helper 2,Th2) yanıtında rol oynar. M2 makrofajlarının M2b'ye farklılaşması, immün kompleks ve toll benzeri reseptör ligandı yoluyla Th2 aktivasyonuna ve immün regülasyona yol açar. IL-10 ve IL-6 ile M2c ve M2d farklılaşması, sırasıyla immünoregülasyon, matriks birikimi ve doku yeniden şekillenmesi ve tümör hücre kitlelerinin indüksiyonu ve büyümesi ile ilişkilidir. MDSC'ler, GM-CSF, vasküler endotelyal büyüme faktörü (vascular endothelial growth factor , VEGF), IL-6 ve Interlökin-1B varlığında kemik iliği öncü hücrelerinden gelişir. CD11b+ CD14 +HLA-DR −/düşük CD15 − monositik MDSC'ler arginaz 1 sagılarlar; CD11b + CD14–HLA-DRdüşük/− CD15+ granülositik MDSC'ler, indüklenebilir nitrik oksit sentaz (inducible nitric oxide synthase, iNOS), nitrik oksit (nitric oxide, NO) ve reaktif oksijen türleri (reactive oxygen species, ROS) salgılar. Bunlar arasında monositik MDSC'ler TAM'lere farklılaşabilir. Meme kanserinde, CCL2, CCL5 ve CXCL12, TAM ve/veya MDSC’lerin tümör mikroçevresine gelmesinde etkilidir (Şekil 2.3) (Cha, & Koo, 2020; Lu ve ark., 2013; Mantoyani ve ark., 2004; Martinez, & Gordon, 2014; Ohama ve ark., 2015). Şekil 2.3 Tümör ilişkili miyeloid hücrelerin farklılaşması ve özellikleri. GM-CSF, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor: granülosit-makrofaj stimüle edici faktör; VEGF, vascular endothelial growth factor: vasküler endotelyal büyüme 14 faktörü; IL-6, interleukin-6: interlökin-6; IL-1B, interleukin 1B: interlökin 1B; İNOS, inducible nitric oxide synthase:indüklenebilir nitrik oksit sentaz; NO, nitric oxide: nitrik oksit; M-MDSC, monocytic-myeloid-derived suppressor cell: monositik- miyeloid kökenli baskılayıcı hücre; G-MDSC, granulocytic-myeloid-derived suppressor cell: granülositik miyeloid kökenli baskılayıcı hücre; TAM, tumor- associated macrophage: tümör ilişkili makrofaj; Th2, T helper 2, Yardımcı T hücre 2. (Cha, & Koo, 2020’den uyarlanmıştır). Tümör dokusuna yerleşik; veya tümör ilişkili kronik inflamasyon sonucu dalak, kemik iliği ve metastatik organlarda biriken veya periferik kanda bulunan immün hücrelerden özellikle pro-tümör özellikte olan tip 2 monosit/makrofaj, MDSC’ler ve baskılayıcı fonksiyona sahip nötrofiller; neo- anjiyogenez, T hücre ilişkili anti-tümör yanıtların baskılanması, tümör gelişimi ve metastazı için gerekli faktörlerin ve bağ dokunun yeniden şekillendirilmesi gibi karsinogenez için kritik olan önemli fonksiyonlara sahiptirler (Awad, Vlaeminck, Öaebe, Goyvaerts, & Breckpot, 2018; Gabrilovich, 2015; Kalluri, & Zeisberg, 2006; Marwel, & Gabrilovich 2015; Mlecnik ve ark., 2011; Pietras, & Ostman,2010). Kanserin erken evrelerinde, TAM'ler, anti-tümör bağışıklığını aktive etmek ve tümör anjiyogenezini inhibe etmek için M1 fenotipini benimserken tümörün ileri evrelerinde, TAM'ler M2 fenotipine geçer ve anjiyogenezi kolaylaştırır. Meme kanserindeki TAM’lar M2 makrofajlar ya da alternatif yolla aktive edilmiş makrofajlar olarak bilinirler ve spesifik olarak CD68, CD163 ve CD206 yüzey belirteçlerini ve Arg1, EGF, IL-10, TGF-b, IDO, CCL2 VE CCL22’yi ifade ederler. Bağ doku onarımı, anjiyogenez ve bağışıklık tepkilerini baskılama gibi pro-tümör özelliklere sahiptirler. Tümör mikroçevresinde bulunan tümör hücreleri arasındaki hücre-hücre ilişkileri ve tümör hücrelerinin metastazından sorumludurlar. İnsan meme kanserinde TAM’ların yoğunluğu kötü prognoz ile ilişkilidir ve anjiyogenez ile birlikte infiltrasyonları artar. Yapılan fare modeli çalışmalarında tümör mikroçevresinden TAM’ların çıkarılması tümör ilerlemesinin yavaşlamasını sağlamıştır (Lan ve ark., 2021; Leek ve ark., 1996; Munir ve ark., 2021; Najafi ve ark., 2019; Obeid, Nanda, Fu, & Olopade, 2013; Tan ve ark., 2018). 15 Meme kanseri de dahil olmak üzere birçok kanser türünde düşük lenfosite karşı yüksek nötrofil oranının kötü prognozla ilişkili olduğu görülmüştür. Tümör dokusuna infiltre CD66b+ nötrofiller ile E-kadherin ekspresyonu arasında ters orantı gözlenmiştir. Bu nedenle bu hücrelerin artışı EMT sürecini ve tümör hücrelerinin migrasyonunu indükleyebilir (Azab ve ark., 2012; Hu ve ark., 2015; Shaul, & Fridlender, 2019). Tümör ilişkili nötrofiller (Tumor associated neutrophils, TAN) yüzeylerinde eksprese ettikleri nötrofil elastaz (neutrophil elastase, NE), matris metalloproteinaz 9 (matrix metalloproteinase 9, MMP9) ile tümör proliferasyonunu destekler. Ayrıca MMP9 tümör anjiyogenezi ile güçlü şekilde ilişkilidir (Wu, & Zhang, 2020). Meme kanserinde tümör tipine bağlı olarak MDSC’ler, CCL2, CXCL5 ve CXCL12 dahil olmak üzere çeşitli kemokinler tarafından tümör bölgelerine alınırlar. MDSC’ler meme kanseri olan hastalarda yüksek oranda bulunurlar ve klinik evre ve metastaz ile ilişkilidirler. Özellikle monositik-MDSC’ler meme kanserinin metastazı ile ilişkilidir. MDSC’ler tarafından salgılanan iNOS, NOS, ROS, Arg1, IL-10, TGF-β ve programlanmış ölüm ligand 1 (programmed death-ligand 1, PD-L1) ile immünosupresyonun indüklenmesi tümör hücrelerinin bağışıklıktan kaçışını kolaylaştırır (Cha, & Koo, 2020; Kumar, Patel, Tcyganov, & Gabrilovich, 2016; Lan ve ark., 2021; Markowitz, Wesolowski, Papenfuss, Brooks, & Carson, 2013; Shou ve ark., 2016). 2.7 Meme Kanseri ve Monosit/Makrofaj İlişkisi Makrofajlar, doku homeostazını koruyan ve patojenlere karşı savunmada önemli rol oynayan doğal bağışıklık hücreleridir. Heterojen fenotipleri ve işlevleri bulundukları doku ortamı tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir (Kitamura ve ark., 2015). Makrofajlar, genellikle miyeloid progenitörlerden gelişirlerken patofizyolojik koşullarda monositlerden türevlenirler. Farklı monosit alt kümeleri (CD14/CD16 yüzey belirteçlerine göre) TAM’ların öncülleri olup pro-tümör aktiviteye sahiptirler. Dolaşımdaki monositlerin tümör içine alınması, sitokinler, kemokinler, kompleman bileşenleri vb. dahil olmak üzere tümör hücrelerinden veya malign olmayan stromal hücrelerden salınan kemotaktik sinyallere bağlıdır. Meme kanserinde monositten 16 türevlenen makrofajlar tümör büyümesi ve metastaz için önemli hücreler olup alternatif yolla aktive edilen M2 makrofajlara benzerdirler. Bu hücreler tümör hücrelerinin sağkalımını ve çoğalmasını destekler. Ayrıca kan damarlarına yakın bölgelere yerleşerek tümör hücrelerinin migrasyonunda etkili olurlar (Goswami ve ark., 2005; Ma ve ark., 2020; Olingy, Dinh, & Hedrick, 2019; Qian ve ark., 2011; Patysheva ve ark., 2022; Riabov ve ark., 2014 Ma ve ark., 2020; Qian ve ark., 2011; Wyckoff ve ark., 2007; Yang ve ark., 2013; Zhang ve ark., 2017; Zhang, Chen, Li, Zhu, & Li, 2021). TAM’lar salgıladıkları CSF-1, MMP-9 ve TGF-b ile tümör metastazını; epidermal büyüme faktörü (epidermal growth factor, EGF) ve CSF-1 ile tümör hücrelerinin migrason ve invazyonunu; tümör hücre yüzeyindeki PD-L1ve PD-L2, T hücrelerin yüzeyindeki PD-1’e bağlanarak T hücrelerin apoptozunu ve inaktivasyonunu; tümör hücrelerinin yüzeyindeki sinyal düzenleyici protein alfa (signal regulatory protein alpha, SIRP-a) makrofajların yüzeyindeki CD47 ile etkileşimi sonucu makrofajların fagositozlarının inhibisyonunu; salgıladıkları vasküler endotelyal büyüme faktörü (vascular endothelial growth factor, VEGF) ile anjiogenezi; VEGF ve platelet kökenli büyüme faktörü (platelet-derived growth factor, PDGF) ile tümör hücrelerinin büyümesinde etkilidirler (Şekil 2.4) (Aramimi ve ark., 2021; Keibel, Singh, & Sharma, 2009). 17 Şekil 2.4 Tümör ilişkili makrofajların tümör gelişimindeki rolleri. VEGF, vascular endothelial growth factor: vasküler endotelyal büyüme faktörü; PDGF, platelet- derived growth factor: platelet kökenli büyüme faktörü; CSF-1, macrophage colony- stimulating factor-1: makrofaj koloni stimüle edici faktör-1; CSF-1R, macrophage colony-stimulating factor receptor-1: makrofaj koloni stümile edici faktör reseptörü 1; MMP-9, matrix metalloproteinase 9: matriks metollaproteinaz-9; TGF-b, Transforming growth factor-β: dönüştürücü büyüme faktörü -b; EGF, epidermal growth factor: epidermal büyüme faktörü; IL-10, interleukin-10: interlökin-10; SIRP- a, signal regulatory protein alpha: sinyal düzenleyici protein-a; PD-L1/2, programmed death-ligand 1/2 : programlanmış ölüm ligandı 1/2. (Aramini ve ark., 2021’den uyarlanmıştır). Tümör hücreleri tarafından salgılanan IL-4 ve IL-10 gibi sitokinler makrofajlardan proinflamatuar sitokin ve kemokinlerin salgılanmasını engeller ve TAM’a benzeyen immünosupresif bir fenotipi destekler. İnsan THP-1 hücre dizisi, yaygın olarak kullanılan bir monosit/makrofaj modelidir ve bu hücrelerinin biyolojik davranışı, yapışma, fagositik kapasite ve yüzey belirteci ve sitokin ekspresyonu açısından monosit türevli makrofajlar olan TAM’lara benzerdir (Stewart, Yang, Makowski, & Troester, 2012; Yang, Ma, Shao, Clark, & Wells, 2016). 18 2.8 Doku Yerleşik Makrofajlar Doku yerleşik makrofajlar, embriyonik gelişim döneminde fötal karaciğer ve vitellüs kesesinden köken almaktadır. Doğum ile birlikte hematopoez kemik iliğine geçer. Kemik iliği progenitör hücrelerinden kökenlenen periferik kan monositleri dokulara infiltre olarak makrofajlara polarize olurlar. Doku makrofajları toplam hücre sayısının %10-15’ini oluşturmakla birlikte çok farklı dokularda bulunmakta ve farklı fenotip ile fonksiyon göstermektedirler. Akciğerde alveolar makrofaj, dalakta kırmızı pulpa, beyinde mikroglia hücresi, karaciğerde kupffer hücresi, deride langerhans hücresi, kemikte osteoklast ve bağ dokuda da histiyosit hücresi olarak adlandırılırlar (Şekil 2.5) (Geissmann ve ark., 2010; Hopkinson-Woolley, Hughes, Gordon, & Martin, 1994; İtaliani, & Boraschi, 2014; Pei,& Yeo, 2016). Şekil 2.5 Makrofaj Gelişimi ve Doku Makrofajları (Pei, & Yeo, 2016’dan uyarlanmıştır). Kemik iliğinden farklılaşan monosit türevli makrofajlar yüzeylerinde yüksek derecede CD11b, MHC-II ve CCR2 ifade eder. Yolk kesesi ya da fetal karaciğerden farklılaşan doku yerleşik makrofajlar ise yüksek düzeyde F4/80 ve CX3CR1 ifade eder. Monosit türevli makrofajlar enfeksiyon sırasında patojenleri fagosite ederler ve proinflamatuar durumlarda sitokin salgılarlar. Doku yerleşik makrofajlar ise apoptotik hücreleri fagosite ederek doku homoestazını sürdürür ve doku yeniden şekillenmesi 19 için sitokinler salgılar (Şekil 2.6) (A-Gonzalez ve ark., 2017; Ham, Lima, Lek, & Möller, 2020; Mass ve ark., 2016; Zhu ve ark., 2017). Şekil 2.6 Monosit türevli makrofajlar ve doku yerleşik makrofajlar arasındaki farklar (Ham ve ark., 2020’den uyarlanmıştır). 2.9 Akciğer ve Doku Yerleşik Makrofajlar İntersitisyal ve alveolar makrofajlar olmak üzere akciğerde iki farklı fenotipte doku yerleşik makrofaj vardır. Bunlardan tip I ve II epitel hücreleri arasında bulunanlara alveolar makrofaj; mikrovasküler endotel ile alveolar epitel arasındaki parankimde bulunanlarada intersitisyal makrofajlar denilmiştir. Alveolar makrofajlar yüzeylerinde CD11b, CD11c, CD16, CD64, CD103, CD141, CD163, CD169, CD206 ve HLA-DR belirteçlerini ifade eder. CD163’ü orta ya da yüksek ifade etmelerine bağlı olarak alveolar makrofajlar farklı bölgelere lokalize olurlar (Bharom, Rankin, Blomberg, & Smed-Sörensen, 2017; Bharat ve ark., 2016; Liegeois, Legrand, Desmet, Marichal, & Bureau,2018; Yu ve ark., 2016). Alveolar makrofajların fonksiyonel fenotipi bulunduğu akciğer dokusunun mikro ortamı tarafınca şekillenir. Alveolar makrofajlar doku homoestazı, konak savunması, sürfaktan ve hücre kalıntılarının temizlenmesi, patojenleri tanıma, akciğerdeki inflamasyonun başlatılması ve hasarlı dokunun tamir edilmesi gibi önemli 20 işlevlere sahiptir (Xue ve ark., 2014). Fizyolojik koşullarda düşük seviyerlerde sitokin üretirlerken yüksek fagositik aktiviteye sahiptirler (Hussell, & Bell, 2014). Homoestatik koşullar altında epitalyal hücrelerin yüzeyinde bulunan CD200 ve epitelyal hücrelerden salgılanan IL-10 ve TGF-b’nın alveolar makrofaj yüzeyinde bulunan CD200R, IL-10R ve TGF-bR tarafından tanınması alveolar makrofajların immünosupresif özellik kazanmasını sağlar. Sonrasında alveolar makrofajlar TGF-b salgılayarak ve retinal dehidrojenazları 1/2 (retinal dehydrogenases 1/2, RALDH1/2) salgılayarak Treg oluşumuna katkıda bulunur. Ölmekte olan hücreleri fagosite ederek de doku homoestazını korurlar (Şekil 2.7A). İnflamatuar koşullarda ise Toll benzeri reseptör (Toll-like receptor, TLR) sinyalleri ya da nötrofil hücre dışı tuzakları (neutrophil extracellular traps, NET) alveolar makrofajların pro-inflamatuar tepkilerini tetikler (Şekil 2.7B) (Woo, Jeong, & Chung, 2021). Şekil 2.7 Alveolar makrofajların İmmünolojik İşlevleri. TGF-b, Transforming growth factor-β: dönüştürücü büyüme faktörü -b; TGF-bR, Transforming growth factor-β receptor: dönüştürücü büyüme faktörü -b reseptörü; IL-10, interleukin-10: interlökin- 10; IL-10R, interleukin 10 receptor: interlökin 10 reseptörü; RALDH1/2, retinal dehydrogenases 1/2: retinal dehidrojenazlar 1/2; TLR, toll like receptor: toll benzeri reseptör. (Woo ve ark., 2021’den uyarlanmıştır. 21 3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1 Çalışmada Kullanılan Maddeler Bu tez kapsamında kullanılan kimyasal ve biyolojik malzemeler firmalarına göre sıralanmıştır. Fosfat tamponlanmış tuz çözeltisi (PBS) (EUROIMMUN, Almanya) ; Fötal Buzağı Serumu (FBS) (Biowest, Fransa); Penisilin-Streptomisin (Biowest, Fransa); RPMI 1640 (Biowest, Fransa); Ficoll 1.077g/mL (Capricorn Scientific, Almanya); FACS Flow Cell Wash (BD, ABD); RBC Liziz Tamponu (Sony Biotechnology, ABD) Tripsin EDTA (Biowest, Fransa); Propidyum İodür Çözeltisi (Biolegend, ABD); Forbol 12-Miristat 13- Asetat (PMA) (Sigma, ABD); L-glutamin (Lonza, Belçika); Anti insan CD45 (klon:J33) mAb (Beckman Coulter, ABD); Anti insan CD16 (klon:3G8) mAb (Beckman Coulter, ABD); Anti insan CD14 (klon:RMO52) mAb (Beckman Coulter, ABD); Anti insan CD11b (klon: D12) mAb (Becton Dickinson, ABD);Anti insan CD80 (klon: L307.4) mAb (Becton Dickinson, ABD); Anti insan CD86 (klon: IT2.2) mAb (Becton Dickinson, ABD); Anti insan CD206 (klon:19.2) mAb (Becton Dickinson, ABD); Anti insan CD163 (klon:GHI/61) mAb (Biolegend, ABD); Anti insan CD69 (klon:7-239) mAb (Biolegend, ABD); Anti insan PD-L1 (klon:MIH2) mAb (Biolegend, ABD); Anti insan PD-L2 (klon:MIH18) mAb (Becton Dickinson, ABD); Anti insan CD68 (klon:Y1/82A) mAb (Biolegend, ABD); Anti insan HLA-DR(klon:L243) mAb (Becton Dickinson, ABD); Anti insan CD44 (klon: 515) mAb (Becton Dickinson, ABD); Anti insan CD24 (klon: ML5) mAb (Becton Dickinson, ABD). 3.2 Hazırlanan Tamponlar ve Çözeltiler PBS Çözeltisi: Steril PBS tablet 1000mL başına bir adet olacak şekilde dH2O’ya eklenerek (1X) çözüldü ve otoklavlanarak sterilize edildi. Oda sıcaklığında (25℃) muhafaza edildi. 22 Tam RPMI 1640 Hücre Kültürü Ortamı: L-glutamin içeren RPMI 1640 üzerine son konsantrasyonu %10 v/v olacak şekilde FBS (ısı-inaktive), %1 v/v olacak şekilde penisilin/streptomisin eklendi ve +4℃’de saklandı. Tam DMEM Hücre Kültürü Ortamı: L-glutamin içeren DMEM üzerine son konsantrasyonu %10 v/v olacak şekilde FBS (ısı-inaktive), %1 v/v olacak şekilde penisilin/streptomisin eklendi ve +4℃’de saklandı. Tam DMEM Hücre Kültürü Ortamı: L-glutamin içeren DMEM üzerine son konsantrasyonu %5 v/v olacak şekilde FBS (ısı-inaktive), %1 v/v olacak şekilde penisilin/streptomisin eklendi ve +4℃’de saklandı. Karboksifloresan Süksinimidil Ester (CFSE) çözeltisi: CFSE tuzu (50µg) üzerine 18µl DMSO eklenerek çözüldü ve -86℃’de saklandı. Tripan Mavisi Çözeltisi: Steril ortamda tartım sonrasında 1X PBS ile 0.4’lük çözelti hazırlandı ve 0.22µm’lik filtreden geçirildi. Oda sıcaklığında (25℃) muhafaza edildi. 3.3 Hücre Hatları İle İn-vitro Çalışmaların Planlanması 3.3.1 Hücre Hatlarının Kültürü Çalışmamızda meme kanseri hücre hattı olarak MDA-MB-231, MDA-MB- 468, BT-474, T-47D, monosit/makrofaj hücre hattı olarak THP-1 hücre hatları kullanıldı. 3.3.1.1 Meme Kanseri Hücre Hatlarının Kültürü; MDA-MB-231, MDA-MB-468, BT-474 ve T-47D -160°C’den alınarak, 37°C’ye önceden ısıtılmış su banyosunda bulunan içi steril dH2O ile dolu behere alındı. Tam çözünmeleri beklemeden hücrelerin bulunduğu tüpler alkollenerek 23 laminer akım kabinine alındı, üzerlerine önceden 37°C’ye ısıtılmış tam media kültür ortamı pastör pipeti ile eklendi. Hücreler hızlı bir şekilde donduruldukları tüplerden yeni tüplere alındı, santrifüj edildi ve sonrası süpernatan hızlıca uzaklaştırıldı, taze tam hücre kültür ortamında hücreler yeniden süspanse edildi. Hücreler öncelikle 25 cm2‘lik hücre kültür kabına aktarıldı, kültür kabını doldurdukları zaman besiyeri ile beraber 75 cm2‘lik kültür kaplarına alındı ve tam hücre kültür ortamında büyütüldü. Hücreler istenilen yoğunluğa ulaştığında (~1x106 hücre/ml) pasajlanarak ilgili deneylerde kullanıldı. Pasajlama haftada iki kez gerçekleştirildi ve hücre kültürünün devamlılığı sağlandı. Hücrelerin pasaj sayısı 7-10 defadan fazla devam ettirilmedi ve bu pasaj sayısına ulaşan hücreler atılarak her defasında yeni hücreler açıldı. Hücreler 37°C’de, nemli ve %5 CO2 içeren inkübatörde muhafaza edildi. (Şekil 3.1) Şekil 3.1 Hücre hatlarının açılımı (biorender.com kullanılarak hazırlanmıştır.) 3.3.1.2 Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Polarizasyonu ve Kültürü THP-1 hücre hattı monositik hücre hattı modeli olarak kullanıldı. Ayrıca, bu hücre hattının phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) ile uyarılması ile makrofaja farklılaştırıldığı, popülasyon içinde spontan olarak yapışarak büyüyen alt-grubun da alveolar makrofaj karakterinde olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle çalışmamızda bu hücre hattı tercih edildi. 24 THP-1 hücre hattı yukarıda belirtildiği gibi açılarak hücreler devam ettirildi. *Monositik hücreler için (mo-THP-1); THP-1 hücre hattı dikey pozisyonda devam ettirilecek ve dört günde bir yarı yarıya pasajlandı. *Makrofajları mimik etmek için (p-THP-1); THP-1 hücre hattı yatay pozisyonda, 72 saat boyunca PMA (final konsantrasyon; 40nM) ile uyarıldı. *Alveolar makrofaj polarizasyonu için (Al-Mak-THP-1); THP-1 hücre hatları (~2,5x105 hücre/ml) 6-kuyucuklu plakalara ekildi spontan olarak hücrelerin yapışması beklendi. Yaklaşık dört günde bir süspanse fraksiyon atıldı, yapışanların prolifere olması desteklendi. Yukarıda belirtilen hücrelerin eldesi için kullanılacak kültür koşulları şematik olarak aşağıda gösterilmiştir. Şekil 3.2 Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofaj hücrelerinin THP-1 monositik hücre hattından farklılaştırılması (biorender.com kullanılarak hazırlanmıştır.) 25 Tüm hücre kültürü deneylerinde ana hücre stoğu açıldıktan sonraki ilk pasaj dondurularak, hücreler stoklandı. Ayrıca, hücre kültürünün sağlığı için hücrelerden ayda bir supernatan toplanarak mikoplazma testi yapıldı. 3.3.2 Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Karakterizasyonu Yukarıda anlatıldığı üzere kullanılacak olan miyeloid hücre hatlarının karakterize edilebilmesi için üçlü doğrulama stratejisi kullanıldı. Bu kapsamda; 3.3.2.1 Flow Sitometri Yöntemi İle Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Karakterizasyonu Anti-insan CD14, CD16, CD11b, CD80, CD86, CD206, CD163, CD169, CD63, CD45, PD-L1, PD-L2, CD68 ve HLA-DR belirteçleri analiz edildi. Genel çalışma prensibi olarak hücreler akım sitometri tüplerine toplandı ve yukarıda belirtilen antikorlar ile işaretlendi. Yüzey belirteçlerine karşı monoklonal antikorlar ve izotipik kontrol antikorları (IgG1/G1) uygun konsantrasyonlarda (10ug/mL) eklendi tüpler vortekslendi ve inkübasyona (45 dk, 4°C, karanlık) alındı. İnkübasyon süresinin sonunda 1.5 mL Cell Wash (BD Biosciences, ABD) çözeltisi eklendi, santrifüj (1800 rpm, 5 dk, 4°C) edildi ve süpernatan atıldı. Tüplere 150 µL Cell Wash eklendi ve vortekslendi. Hücreler Flow sitometri cihazında değerlendirildi. İlgili belirteç için pozitif olan hücrelerin yüzdesi belirlenirken ilk olarak tek tek düşen hücreler kapılandı. Bunun için forward scatter (FSC)-A ve FSC-H grafiğinden diagonal alanda saçılım gösteren hücreler analiz edildi (doublet discrimination). Bu hücrelerden granülarite (side scatter-area, SSC-A) ve boyutları (FSC-A) göz önünde bulundurularak yeni bir grafik daha çizildi ve ilgilenilen hücreler yeniden kapıldı. Bu genel kapılama stratejisinin ardından antikorların konjuge edildiği renkleri gösteren histogram veya nokta saçılım grafikleri çizildi ilgili hücrelerin yüzdesi ve gerektiğinde ortalama/ortanca floresan yoğunlukları (mean/median fluorescence intensity, MFI) hesaplandı. Tablo 3.1 Akım sitometride kullanılan antikorlar ve özellikleri 26 Antikor (anti-insan) Florokrom Eklenen miktar Tedarikçi CD14 APC Alexa Flour 700 1 µl Beckman Coulter, ABD CD16 PE 2.5 µl Beckman Coulter, ABD CD11b APC Alexa Flour 750 1 µl Beckman Coulter, ABD CD80 APC 1 µl Beckman Coulter, ABD CD86 PC5 2 µl Beckman Coulter, ABD CD206 FITC 9 µl Becton Dickinson, ABD CD163 PE 9 µl Becton Dickinson, ABD CD169 APC 9 µl Becton Dickinson, ABD CD45 Krom Orange 1 µl Beckman Coulter, ABD PD-L1 PE 9 µl Becton Dickinson, ABD PD-L2 PE 9 µl Becton Dickinson, ABD HLA-DR APC 1 µl Beckman Coulter, ABD Pasific Blue 3 µl 3.3.2.2 Morfolojik Analizler İle Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Karakterizasyonu 6 kuyulu hücre kabında bulunan hücrelere diff quick boyaması yapılarak monosit/makrofaj karakterleri değerlendirildi. Hücreler ilk olarak 6 kuyulu hücre kabına ekildi ve 24 saat inkübasyona bırakıldı daha sonra PBS ile yıkanarak besiyeri ortamdan uzaklaştırıldı ardından %10’luk formaldehit her bir kuyucuğa eklendi ve 5 dakika inkübasyona bırakıldı daha sonra PBS yardımı ile formaldehid ortamdan uzaklaştırıldı ardından PBS de ortamdan uzaklaştırıldı ve boyama işlemleri başladı. İlk olarak hemacolor red eklenerek 3.5 dakika inkübasyona bırakıldı yıkama yapılmadan hemen arkasından hemacolor blue eklenerek 2.5 dk inkübasyona bırakıldı ve son olarak PBS ile yıkanarak mikroskopta değerlendirildi (Şekil 3.4). 27 Şekil 3.4 Morfolojik analizler ile Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Karakterizasyonu (biorender.com kullanılarak hazırlanmıştır.) Şekil 3.5 Morfolojik analizler ile Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofajların Karakterizasyonun Işık Mikroskopi ve Diff Quick Boyama İle Karşılaştırılması 3.4. Ko-Kültür Deneyleri Meme kanseri hücre hatları ve THP-1’den farklılaştırılmış hücre hatları (Mo- THP-1, TAM-THP-1, AM- THP-1) hem hücre/hücre etkileşimini anlamak, hem de salgılanan faktörlerin etkisini değerlendirmek için ikili olarak kültüre edildi. 28 Bu kapsamda, -Meme kanseri hücre hatları+miyeloid hücre hatları ko-kültüre edildi. 3.5. Floresan Aktive Hücre Saflaştırma (Facs) Yöntemi İlgili belirteçlere karşı geliştirilmiş floresan konjuge antikor ile işaretlenmiş pozitif hücrelerin içinden tek tek düşen hücreler kapılandı. Bunun için forward scatter (FS)-INT ve side scatter (SS)-TOF veya forward scatter (FSC)-A ve FSC-H grafiğinden tek tek düşen hücreler analiz edildi (doublet discrimination). Sonrasında tek tek düşen hücrelerin içinden granülarite (SSINT) ve boyutuna (FS-INT) göre yeni bir kapılama yapıldı. Bu genel kapılama stratejilerinin ardından antikorların CD163’ya göre bir nokta saçılım grafiği çizildi. CD163’ı yüksek düzeyde taşıyan hücreler kapılandı ve bu kapılamalara göre hücreler saflaştırıldı (Şekil 3.6)Daha sonrasında CD206 ekspresyonuna bakıldı. Analizler Flow.jo programı kullanılarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.7). Şekil 3.6 FACS yöntemi öncesi ve sonrası D6P30 (Al-Maq) hücrelerin akım sitometri yöntemi ile gösterimi. 29 SAFLAŞTIRMA SONRASI SAFLAŞTIRMA SONRASI D6P30-DAİSY9 D6P30-DAİSY1 SAFLAŞTIRMA ÖNCESİ Şekil 3.7 CD206 ekspresyonunu ilerleyen pasajlarda kaybeden alveolar makrofaj benzeri THP-1 kökenli hücrelerin FACS ile saflaştırılması (CD163’e göre saflaştırma yapıldı) sonrasında CD206 ekspresyonuna sahip hücrelerin ilerleyen pasajlardaki durumu. İlgili hücreler FACS yöntemi ile saflaştırıldıktan sonra CD206 ekspresyonunu zaman içerisinde tekrar kaybetmelerini önlemek adına bu hücreler gelatin, Poly-L- lysin ve ekstracellular matrix (ECM) ile kaplanan hücre kültürü kaplarında büyütüldü. Bu koşullarda büyüyen hücreler kıyaslandığı zaman üç boyutlu hücre kültürüne bir nebze daha yakın olan bu kaplama koşullarında CD206 ekspresyonunun daha iyi korunduğu ön verisi elde edildi. Ayrıca, elde edilecek hücreler ilerleyen deneylerde meme kanseri ko-kültürlerinde kullanılacağı için ve bu meme kanseri hücreleri DMEM besiyerinde büyüdüğü için, DMEM ve RPMI koşulları da birbiri ile kıyaslandı. 3.6 EMG/MEG Değişimlerinin CD24/CD44 Düzeyi İle Belirlenmesi Ko-kültürler sonucunda meme kanseri hücre hatlarında var olan KHH’lerin (kanser kök hücresi) yüzdesinde meydana gelen farklılıklar araştırıldı. Bu kapsamda CD45-, CD44+, CD24-/düşük hücreler kanser kök hücresi olarak beklenmekte olup, akım sitometri yöntemi ile değerlendirildi. 3.7. İnvazyon Testi İle EMG/MEG Değişimlerinin İncelenmesi Ko-kültür ön sonuçlarına göre seçilen inkübasyon süresi sonrasında miyeloid hücre hatları ile karşılaşmış meme kanseri hücre hatları plakalardan toplandı. CD45 negatif hücreler (kanser) kapılanarak flow sitometri yöntemi ile saflaştırıldı. Elde 30 edilen hücreler 6-kuyulu plakalara ekildi, (çoğalma hızları göz önüne alınarak hücre sayısı ön deneyler ile belirlenecektir) 16 saat boyunca adheren faza geçmelerine izin verildi. İnkübasyon sonunda kuyu tam ortadan çizilerek fotoğraflandı. Yaralanan alanın ne kadar kapandığını ölçmek için 3 gün boyunca aynı alan fotoğraflandı. İlgili fotoğraflar Image J programında analiz edilerek yara kapanma hızı ölçüldü. 3.8 İstatiksel Analiz Tez çalışmasının verileri IBM SPSS 21.0 ve GraphPad Prism 7 programları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Normal dağılım gösteren değişkenler için student’s t (ikili karşılaştırma) ya da ANOVA (ikiden fazla karşılaştırma), normal dağılım göstermeyenler için Mann-Whitney U (ikili karşılaştırma) ya da Kruskal Wallis (ikiden fazla karşılaştırma), testlerinin kullanılması tercih edilmiştir. Gruplar arasındaki farklar ve anlamlılıkları two-way ANOVA testi (Bonferroni’s post hoc testi ile beraber) ile çoklu test metodu kullanılmıştır. p<0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiş olup, p<0,05 *; p<0,01 **; p<0,001 *** olarak grafiklerde kullanılmıştır. 31 4. BULGULAR 4.1 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı’nın (Al-Maq) Seçilimi ve Karakterizasyonu Çalışmamızda monositik hücre hattı olan THP-1 hücreleri yatay pozisyondan bekletilerek 4 günde bir besiyeri 1:1 oranında değiştirilmiştir. Zamanla yapışan hücreler seçilmeye başlanmış ve bu işlem 11 ay boyunca devam ettirilmiştir. Elde edilen spontan makrofaj alt-grubu CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR eksprese etme kapasitesine göre değerlendirilerek, alveolar makrofaj benzeri karaktere ne kadar yakın olduğu saptamaya çalışılmıştır. Bu kapsamda iki farklı klonal seçilim ile meydana getirilen hücre alt-grubu oluşturulmuştur. (Şekil 4.4-Şekil 4.15). D6P30-DAİSY5 olarak tanımlanan hücre grubunun ilk seçilimi 6 kuyucuklu plakalardan başladığı için ‘’D6’’ kodu buradan gelmektedir. İlerleyen pasajlar sonucunda, farklılaşmaya ilk başladığı pasaj 30. Pasaj olduğu içib ‘’P30’’ tanımlaması yapılmıştır. 30. pasajdan sonra devam eden ardışık pasajların 5. Pasajında dondurulduğu için de DAİSY5 takısı eklenmiştir (Şekil 4.4 ve Şekil 4.10). Alt-klon seçilimi T25lik flasklardan başlayıp, 12. Pasajda ilk karakteri sergileyen ve takiben 4. Pasajda dondurulan hücreler ise, ‘’DAİSY12-DAİSY4’’ olarak isimlendirilmiştir (Şekil 4.5 ve 4.8). İlgili hücrelerin karakterizasyonu yapılırken, genel hücre hatları prensibi de gereği popülasyonun tüm hücreleri adherent fazda ve seçilmiş popülasyonun %100 karakterini göstermemiştir. Bu nedenle karakterizasyon yapılırken seçilim sırasındaki hem süspanse faz hem de adherent faz değerlendirilmiştir (Şekil 4.4, Şekil 4.15). Alveolar makrofaj benzeri hücreler tutunarak büyüyen hücre alt-grupları (adherent) oldukları için, bu hücrelerin tutunmasını ve farklılaşmasını sağlayan ekstraselüler matriks bileşenleri de kullanılmıştır. Bu kapsamda, Poly-L-Lysin, Gelatin ve ekstrasellüler matriks bileşen karışımı (ECM) kullanılmıştır. Besiyeri içeriğine göre bir farklılaşma potansiyel farkı da göz önüne alınarak DMEM ve RPMI besiyerlerinin ikisi de bu koşullar ile ayrı ayrı denenmiştir (Şekil 4.4-Şekil 4.45). 32 Hem D6P30-DAİSY5 hem de DAİSY12-DAİSY4 alt-klonları değerlendirildiğinde adherent fazdaki hücrelerin süspanselere göre daha fazla makrofaj karakterinde olduğu belirlenmiştir (Şekil 4.3-Şekil 4.14). Farklı yüzey tutunma maddeleri kendi arasında kıyaslandığında D6P30-DAİSY5 en fazla Poly-L- Lysin DMEM koşulunda ve 9.günde CD206 ekspresyonunu arttırmıştır. Bu koşulda ayrıca, HLA-DR ekspresyonunun ve CD11c’nin orta düzeyde olması, alveolar makrofaj benzeri karakter ile uyumludur (Şekil 4.4). Al-Maq THP-1 Şekil 4.2 THP-1 hücre hattından spontan seçilim ile oluşturulan alveolar makrofaj benzeri (Al-Maq) hücre hattının akım sitometri analizleri ile karakterizasyonun temsili görüntüleri 33 Şekil 4.3 THP-1, p-THP-1 ve Al-Maq hücre hatlarının CD206, CD163 ve CD169 belirteçlerini ifade etme düzeylerini gösteren temsili akım sitometri görüntüleri CD11b CD11c CD206 CD14 100 100 20 100 80 80 15 80 60 60 60 10 40 40 40 5 20 20 20 0 0 0 0 I M I M I M I M I M I I M I M I M I M I M I MI M MI M MI M MI M MI M MI MI M MI M MI I IM M M M M M M I RP M E RP M ME P M M M ME P ME P ME P M PM E PM E PMM M ME P M ME P M ME P M RP M E RP M E RP M E RP E P E P P E P E P R R R R R R R R R R D D D DM R DM R R DM R DM R DM E P ME P ME P L L D IN D D D D D D D D D L L R D R D R MA A S IN IN N D D İD D N AL L IN N IN N D D İD D N A L IN IN TIN IN ED D LİD İD EN A L IN IN TIN IN ED D LİD İD EN R M LY YS LA T TI TE L İ E I T IA A TE O L G A S A RM M LY YS A T T E E L Lİ GE A ST O RM M LY YS LA AT ATS O T E O L AAG RM M LY S YS LA AT AT T E O L R - L L O A R - L A G NO O L L- GE E C O M S L L NO O L L- GE L LA OA A S SO L A O OR L - -L E EL CO O A M S E C O M L N L G S O LL O R L - -L E L O A S OO S L N LY Y O E C M L G M C EC M OL M C C N Y G C C M O N LY Y G M C C N CM O N LY Y L G G C O C E OL LY CM M E EC C O L C M E E 1 C O L C M M E C CM O 1 1 P O E C P E C P PO E EC İP P PO E EC İP P E TİP P O E EC P1 T T Tİ 3.GÜN 9.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR 25 80 80 30 20 60 60 20 15 40 40 10 10 5 20 20 0 0 0 0 I I I I I I PM I EM M I I P E M PM E M PM I M MI M MI MI M MI M MI M MI M MI M MI MI M MI M MIE P E P P E P E P E E E E E E M MI EM M I EM M I M EM M EMP P PM E M M EM M EM M P P P M L R D R M M D R D R D M R DM R R DM M L R D R D M R P P D M R D M R P RP M RP M RP M RP M RP PL D D D D M M D M R L R D N R D N R M R M R M R A L IN IN TIN N ED D İD D D D D D N M A S I E L İD E N A L IN IN TIN IN ED D LİD İD EN A N N D D NA S I I İ M E A L SI IN TI IN E ED L İ İD E A AL S IN T IN TE ED L İD E OR R -L Y YS LA AT AT T SO OL AG R M M LY YS LA AT AT T SO OL G M Y S A T T M -L E L O A S L O R - -L E L O A A M A T S L OR R -L -LY EL L A O A S O OLS LA G R M -LY Y S LA AT A AT SO O L AG N O Y L L G GE C CO M M L N O Y L L G GE C CO L R L L O N C O N CM M O N NO Y L L G E C O O L - E E C O S LL L Y M E C C L Y M E C L Y G M CC EC M M OL N OC N LY L G M O L C M O L C M O L C M C O LY G M C EC CME M C O P PO E EC 1İP P PO E E E C E EC İP 1 P PO E EC İP 1 P PO E EC P1 T T T Tİ Şekil 4.4 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu D6P30-DAİSY5 hücre hattının ‘adherent fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin %ekspresyon grafikleri DAİSY12-DAİSY4 ise en fazla gelatin RPMI koşulunda ve 9.günde CD206 ekspresyonunu arttırmıştır. Fakat, bu koşulda CD11c’de yüksek düzeyde olduğu için, dendritik hücre alt-gruplarının da farklılaştırığı düşünülmektedir. 34 D6P30-DAİSY5 ADHERENT FAZ %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon CD11b CD11c CD206 CD14 150 80 8 100 60 6 80 100 60 40 4 40 50 20 2 20 0 0 0 0 I I I I I I I I I I I I I M I M I M I M I M I I I I I I I PM ME M PM E M M M PM E PM E PM M M M M M M M M M M M M R R M R M R M R M E RP RP M E PM E PM E PM E PM E M PM E PM E PM E PM E PM E PM M E M E M E M E MM M M E M D R R R M M P R M R M R M R M R M R P M P M P M P M P M P L L IN D IN D D D D D D D N N D İD D N AL L IN N IN N ED D D R D R L D N D N D D D D D N L R D R D R D R D R D R MA A S SI AT TI TE E L Lİ GE A S I T I L İD İD EN A L SI IN TI IN E D Lİ İD E A L IN IN TIN IN ED İD N M Y T E M A S A T T E L G A S T ED L İD E OR R -L -LY L A A T O O A R M M LY YS LA AT A T SO OL AG R M -L Y Y L A A AT O M S A T L G L E L O A S S L O R L- -L E L O OA S L O OR L -L E EL CO O M S O A R M -LY Y T OL O E C O M L S R L N O L G E C M L N L G L NO O L L- GE L LA OA A S SO LA N N Y L GL Y G M C C CM O N LY Y G M C EC CM N Y G C C M O Y E C CO M M L O L C M E O C N G C O O C E 1 PO O L EC CM E 1 C PO L LYO EC M E C C L Y M C P E P P E P P EC M E 1 O L C M E E 1 C P E Tİ Tİ İ P P PO ET E C TİP 3.GÜN 9.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR 30 50 80 20 40 60 15 20 30 40 10 20 10 10 20 5 0 0 0 0 I M I M I M I I I I I I I I I IM E M E M E M EM M EM M M EM M EM M M M M I M I M I M I M I I M I M I M I M I M I RP M RP M RP M RP M RP M RP RP M RP M RP M E PM M M M M M M M M M M M M M M D D DM R DM E P R DM E P P E P E P E E E E E E E E R R DM R DM R DM R P M RP P P PD DM R R DM R DM P R DM P R DM R P P L D M R A AL D IN D IN D D DN N ED D İD D EN A L L IN N I TIN D İD N L L IN IN D D N L N N D D N M YS SI AT TI L İ İ L I I İ R M L Y L A AT T E O L AG A S RM M LY S A T IN TE ED OL Lİ D GE MA A YS SI N AT TI N TE ED OL Lİ D GE MA A S N N D DSI AT TI TE E L Lİ GEY O O R L- -L E EL O OA S O C S LL O OR L - -LY EL L A OA AT S O A R M -L Y L A A AT S O A R M -L Y L A A AT S O A N O Y L G C M M N N Y L G GE C C O CM SM OL L O OR L -L L OG C O N E O N Y L G GE C C CM S LL O R L -L N M O N N O Y L G E EL O LG C O M S L OL LY CM E C C C C M O P O E CM E 1 PO L LY CM M E EC C OL LY CM M E EC C OL LY CM M E EC C P E İP P O E EC P1İ P PO E EC P 1 İ P PO E C 1 T T T E TİP Şekil 4.5 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu DAİSY12-DAİSY4 hücre hattının ‘adherent fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin % ekspresyon grafikleri Tüm alt-klonlar ve koşullar beraber değerlendirildiğinde, alveolar makrofajlar için oldukça kritik olan CD206 belirtecinin D6P30-DAİSY5 hücre alt-klonu ve Poly- L-Lysin DMEM koşulunda olduğu belirlenmiştir. Meme kanseri hücreleri ile gerçekleştirilecek kültürler de DMEM ortamında olacağı için D6P30-DAİSY5’in alveolar makrofaj karakterini koruyacağı da desteklenmiştir. CD11b CD11c CD206 CD14 3.GÜN 9.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR 35 D6P30 DAİSY5/DAİSY12-DAİSY4 DAİSY12-DAİSY4 ADHERENT FAZ ADHERENT FAZ %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon Şekil 4.6 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu D6P30- DAİSY5/DAİSY12-DAİSY4 hücre hattının ‘adherent fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin % ekspresyon grafikleri CD11b 150 50 CD11c CD2066 80 CD14 40 60 100 4 30 40 50 20 2 10 20 0 0 0 0 MI M MI M MI M MI M MI M MI I I I I E E E E E EM M M M M M M M EM I M P P P P P P E M E M I EM R P P DM R DM R DM R DM R DM R DM R DM R DM E P ME RP M RP M RP M AL R D D D AL SI N N IN N AL L IN N IN N AL L IN N D L N N I T I A S I T I A S I TI N IN A AL IM S IN T I TIN RM M LY YS LA ATO R L- -L E L OR M M LY YS LA AT RM S- M LY A- A T R M LY YS A O R L L L A N L G E N O L L- G E E RNO O L L- LY EL R - L L N Y G N Y G N Y G GE L NO O L E L Y L L N LY Y L- G E O L O LY O Y G L 3.GÜN P PO P PO P PO L PO PO 9.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR 2.5 5 20 25 2.0 4 15 20 1.5 3 15 10 1.0 2 10 0.5 1 5 5 0.0 0 0 0 MI I IEM M EM M EMP P P PM I M MI M MI M MIE E E EM M I EMP P P P PM I M MI I I M M M M M M M M E E M M EM M EM R D R D R D R D R D R D R D R D R D M R P P DM R DM R P DM AL L IN LM A S IN T IN IN A AL I N S IN TI N T M TIN MA L L IN N IN N L L IN IN R M LY YS LA A R M LY A S I T I YS LA A R M LY YS LA AT RM A A S NY SI AT TI N O R L- L E L O R -O L E L O R - L E L O R M -L A N - LY EL L N LY Y L- G GE N L - L - L L N O Y L G GE N NO Y L G GE N NO Y L G GE PO O PO L LYO PO L LY OL Y P P PO P PO L Şekil 4.7 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu D6P30-DAİSY5 hücre hattının ‘süspanse fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin % ekspresyon grafikler. Süspanse fazlar değerlendirildiği zaman ise, D6P30-DAİSY5 hücre alt- klonunun bu koşulda da hala var olduğu saptanmıştır. Bu durum alveolar makrofaj benzeri hücre hattı seçim için destekleyici diğer bir veriyi oluşturmuştur (Şekil 4.5 ve Şekil 4.6). CD11b 60 CD11c 6 CD206 80 CD14 150 55 50 45 60 100 40 435 30 25 40 50 20 2 15 10 20 5 0 0 MI M MI I 0 0 I RP M ME ERP M RP M M M ME PM E PM I EM M I M MIE M M I M MI M MI M MI M I M L M L D IN D N D R P P E E P P E E E E A A S IN TI IN L L D M R DM R MN N D M ML R D R R M P M P M P M M M Y S A T A A SI IN TI IN A L IN D N IN N D L R R R L L D IN D N I DR NO OR L - L-L Y A N N GE L EL A RM M -LY Y S LA T M A YS S I AT TI A O R M YS SI AT TI N LY Y G N O L L- L E EL A R MO -L Y L A R M L Y L A O L N LY GY G N NO R L LY L - GE GE L O OR L - -L E EL P N L GPO L Y N LY Y GPO PO L PO OL POP PO L 3.GÜN 9.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR 4 5 30 20 3 4 15 20 3 2 10 2 10 1 1 5 0 0 0 0 PM I M MI M MI I I I I I I I I I ME P ME P ME M M PM E PM E M M EMP PM ME M PM E M PM E M M EM M EM M M L R D N R D RN D R DM R M M M E L D R D M L R D RN D R N D L R P M RP M RP M A L SI IN TI IN A L IN N IN N A L D D D M S I IN TI IN A L IN N IN N R RM A Y S A T M A YS SI AT TI A I T I O -L -LY EL LA R RM -L LY L LA OR M M LY S LA AT M A YS S A T N O Y L L G E NO O L L- GE R L- L Y E L R M -L LY L A N L Y G N LY G E N NO LY Y L - G GE N O OR L L- GE EL Y Y PO OL O OL PO L N L Y G P P P P O PO LPO 36 DAİSY12-DAİSY4 SÜSPANSE FAZ D6P30-DAİSY5 SÜSPANSE FAZ %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon Şekil 4.8 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu DAİSY12-DAİSY4 hücre hattının ‘süspanse fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin % ekspresyon grafikleri CD11b CD11c CD206 CD14 3.GÜN 9.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR Şekil 4.9 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu D6P30- DAİSY5/DAİSY12-DAİSY4 hücre hattının ‘süspanse fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin % ekspresyon grafikleri 2.0 CD11b 480 CD11c CD206400 300 CD141.5 1.0 380 350 250 0.5 280 300 200 180 250 1500.0 80 200 1000 150 20 -1 35 100 15 -2 3025 50 10-3 0 5 -4 2015 -5 10 0 0 -5 -5 5 -10 -10 0 -20 -20 -15 0 -40 -20 -20 -40 -60 -25 -40 -80 -30 -60 -60 -100 I I I I I I I I I I I I MIM M M M M M M M M I M MI M MI M P ME P ME P ME P ME M M PM EM PM EM PM EM PM EM PM E PMM ME M PM EM PM EM P E E E ER R R R M M M M R R R M R M R DM R P M RP M RP D D D DM IN S IN TIN D D D D D R D R D R D R N N D D IN TE ED L İ İD SIN IN IN N T I ED ED Lİ D D IN D IN D D D İD D SI IN TI IN E ED Lİ İD LY YS LA AT A T SO OL N N D Y S A T T D E O Lİ YS SI AT TI T TE OLL Y L A A T O L Y L A A S OL İD LY YS LA AT AT T O OL L- -L E EL CO A S - L E L O A S - L E L O A L- -L E EL CO OA S M S LY Y L G G M S L G C O CM M L - E C O M S L - E C O M Y G C C M O L C M E EC OL Y Y L G G M C C M LY Y L G G M C C M OL LY M C L C E CO C C M E EC P P E E P PO E EC M E E O CPO OL EC M E P EP EC P E 3.GÜN 9.GÜN CD16 700600 CD80 CD86140 725 HLA-DR150 500 100 400 120 575425 50 300 100200 80 275 5 100 60 125 4 20 40 125 3 15 20 105 2 10 855 105 651 45 0 0-5 0 25 0 -10-15 -5 5 -20 -15 -40 -20 -20 -20 -60 -40 -40 -40-60 -80 -60 -60 -100 -80 -80 -80 -100 -100 -100 MI M MI M MI M MI M MIE E E E P EM M I P EM M I P EM I M I M I M I M I M I M I M I M I M RP P P P M M M M M M M M M M R M R M R M R DM R DM R DM E E E E E E E E E D D D D IN IN RP M RP M RP M RP M RP M RP M RP M RP M RP M N SI IN TI N IN ED D LİD İD S SIN AT TIN D D İD D D E IN D IN D D D İD D N D N L İ N N E D D I I D D D Y T TE O L S I T I L İ IN T IN E D T E S D Lİ D İD -LY Y S A AT AT E L L Y L A A Y S A T L T E L -L EL L O A T SO SO L - -L E L O A S Y L G GE C CO CM M SO -L Y L A A AT SO O LY YS LA AT A T O OL Y L G GE C CO L M - E L O L S - Y M L A S L Y M C M O L C M E EC LY L L G GE C C O CM M Y LY M E C L Y L - GE EL O C O SG O L C M E C P PO E EC O L C M E L M M C CM M P E P O E C O C E EC PO E EC P E P PO E EC Şekil 4.10 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu D6P30-DAISY5 hücre hattının ‘’adherent fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin %değişim grafikleri 37 D6P30-DAİSY5 ADHERENT FAZ D6P30 DAİSY5/DAİSY12-DAİSY4 SÜSPANSE FAZ % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim 2.0 CD11b 480 CD11c CD206 500 CD14 1.5 380 1500 400 1.0 280 0.5 180 1000 2 30000 0.0 80 500 10 0 60 250 0 0 -1 50 0 -2 40 200 -3 30 150 -1 -2 -4 20 100 -3 -5 10 50 -4 -5 0 -5 -10 0 0 -20 0 --420-15 0 -20 -40 -20 -40 --60-25 -60-80 -60 -1 8000 MI M MI M MI M MI M I M I M I M I I I IP E P E P E P E PM E PM E PM E PM I M I M R M R M R M R M M M M ME PM E PM I M MI M MI M PM EM PM EM PM EM PM EM N E P E P E M M M M I N D IN N D D D D R R R R R M R M R M R M R D R D R D R D S I T I E D LİD D İD SIN IN TIN D D DN ED D İD D N D N D D D D D IN N IN N I L İ I I İ S I T I ED D LİD İD LY S A AT AT TE O L Y S A T AT TE O L S SINY L S O L Y L A O Y AT TI N TE ED OL Lİ D LY YS LA AT AT TE SO OL Y L - L-L GE EL C O OAC M M S L- -L E S - A G C Y L G GE L CO OA M S -L LY EL LA OA A T S SO L L-L GE EL O C M L - E O Y C CO M S L M PO OL Y CM M E EC OL LY C CM M E EC LY G C M G C E C P O E C O LY L G CM C L Y MEC CM O L C M E CP E P E P O E CM E P E P E P O E EC 3.GÜN 9.GÜN CD16 CD80 HLA-DR 300 450 CD86 725 400 250 350 100 575 200 300 425 150 250200 75 275 100 125 50 150 125100 50 105 20 50 25 8515 20 65 10 10 0 455 25 0 0 0 -10 -25 5 -20 -20 -15 -20 -50 -20-40 -60 -40 -40 -80 -60 -75 -60 -100 -80 -80 -100 -100 -100 I I I I IM M M M M M MI M MI M MI M MI M MI M MI M MI M MI M MI M PM EM PM EM I M I M P ME P ME M M R R RP M E P MER E E E E E E E E M M P ME P ME N D N D D D D D IN RP DM R P M RP M RP M RP M RP M RP M RP R R R R I I İ D D D N N E D D S IN TIN IN ED D LİD İD IN D IN D D D İD D M IN N DS I TIN N D D D D D S SI T TI L İ I T E L Y S A T T E O L S IN T IN E D L İD LY YS LA AT AT E ED Lİ Y A T O L İD L-L -LY EL LA A T A T T E S O E CO OA M SO O L-L LY L A O S A T S Y E L O A S Y A L- G E C CO M M S L-L -LY EL L A O AT S O SO L L- -L E EL CO OA M S LY Y L G G G M L C EC CM OL LY G CM M E C EC Y L G GE C CO M Y M OL LY G CM C M L M C L Y M C P O E CM EC EC PO PO E C E P O E EC P E PO OL EC CM E EC P E P E Şekil 4.11 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu DAİSY12-DAİSY4 hücre hattının ‘’adherent fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin %değişim grafikleri CD11b CD11c CD206 CD14 3.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR 9.GÜN Şekil 4.12 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu D6P30- DAİSY5/DAİSY12-DAİSY4 hücre hattının ‘’adherent fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin %değişim grafikleri 38 D6P30 DAİSY5/DAİSY12-DAİSY4 DAİSY12-DAİSY4 ADHERENT FAZ ADHERENT FAZ % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim CD11b CD11c CD206 CD14 100 120 200 250 80 100 200 60 80 150 150 40 6040 100 100 20 20 50 50 0 0 100 0 0 5 -10 -5 0 -5 -20 0-30 -10 -15 -5-40 -10 -50 -20 -10 MI M MI M MI M MI M MI M MI M PM I I EM PM EMP ME E E E E E R D R P DM P M P M P P M M N N R D RN N D N R M R M RN D R N D SI IN TI IN SI IN TI IN SI D IN TIN D I N S SIN I N Y S A T Y S A T Y S A TI T I L Y -L Y A T L- -L EL L A -L -LY EL LAL L-L -LY EL L A L L- LY L A L G E L G E L G E LY Y G E EL LY Y G LY Y G LY Y G L G O 3.GÜNO PO OL PO LP PO P O L P PO P 9.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR 60 400 80 40 300 50 60 200 40 40 20 100 3020 20 0 0 10 0 0 0 00 0 -20 -10 -2-20 -20 -30 -40 -4 -40 -60 -6-40 -80 -8 -60 -50 -100 -10 I I PM EM PM EM PM I EM I M MI M MIM E EM MIE P P EM M I EM R DM R M D R P R M R M P P IN IN IN D M R IN D M IN IN D S TIN IN D N R M D R M S IN T IN S IN T IN Y S A T SI IN TIN D Y S A AT Y S A AT -L IN L -LY EL LA Y S A AT Y L -L L-L Y GE L L EL L- L-L Y EL L E L Y L G Y G GE OL Y Y L GL G Y L - L Y L Y L Y L -L GE ELG PO P O PO L PO OL P PO OLP P Şekil 4.13 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu D6P30-DAİSY5 hücre hattının ‘süspanse fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin %değişim grafikleri CD11b CD11c CD206 CD14 200 100 600 150 80 60 500 100 60 50 400 50 40 40 300 0 20 200 0 0 30 100 -1 0 20 100 -2 80 -3 -5 10 60 -4 -10 0 40 -5 -15-20 20 -15 -25 -20 00 -30 -40 -40 -20-60 -40-45 -80 -60 -60-60 -100 -80 -80I I -100I I RP M EM PM EM M M M M MIM R E E M M I M MI M MIE EM IN N D IN N D M RP M RP P E E P PIN D IN D M R DM R P R M R M DM IN D IN D -LY S SI AT TI S SIN AT TIN SIN IN TIN Y IN YS SI N AT TIN Y L L- LY EL LA -L LY EL LA Y S A LAT L- -LY EL A E L EL L LY G G LY L L- G GE -Y L L-L Y L GE EL OL Y LY L G G PO O PO L Y P PO OLP OL Y G P PO 3.GÜN P 9.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR 50 40 30 150 250 20 0200 100 100 150 0-1 -20 100 -250 50 -3-4 0 0 -5 -40 0 -100 -10 -20-30 -60 -20 -40-20 -30 -50 -40 -60 -40 -50 -70 -80 -80 -60 -90 -60 -70 -100 I I -100 I I I M EM M EM I IM M I M M P P M M P E PM EM ERP M RP M EM R DMN N R DM PM E M E R M R M M I I D D YS SI N AT TIN R D M R P M IN D IN D SIN D N N IN TI N IN L-L L-L Y L A GE EL SI N IN TIN IN -LY S SI AT TI LY YS LA AT Y OL LY G LY YS LA A T Y L A L L-L GE EL Y L- - L- L GE EL PG P O L -L LY Y L G E EL Y G L Y G PO L LY PO OLO P P O PO L P Şekil 4.14 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu DAİSY12-DAİSY4 hücre hattının ‘süspanse fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin %değişim grafikleri 39 DAİSY12-DAİSY4 SÜSPANSE FAZ D6P30-DAİSY5 SÜSPANSE FAZ % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim % değişim CD11b CD11c CD206 CD14 3.GÜN CD16 CD80 CD86 HLA-DR 9.GÜN Şekil 4.15 Alveolar Makrofaj Benzeri Hücre Hattı Alt-Klonu D6P30- DAİSY5/DAİSY12-DAİSY4 hücre hattının ‘süspanse fazında’’ bulunan hücrelerdeki CD206, CD80, CD86, CD16, CD11c, CD11b, CD14 ve HLA-DR yüzey belirteçlerinin %değişim grafikleri 4.2 Meme Kanseri Hücre Hatları Ve Monosit/Makrofaj/Alveolar Makrofaj- Benzeri Hücre Alt-Gruplarının Ko-Kültür Deneyleri Şekil 4.16 Kanser Hücre Hatlatının Işık Mikroskopi İle Görüntüleri. Meme kanseri hücre hatları T47D, BT474, MDA-MB-231, MDA-MB-468 ve monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, pTHP-1, Al-Maq ile gerçekleştirilen ko- kültürler sonrasında CD24+CD44-, CD24-CD44+, CD24+CD44+, CD24-CD44- hücre alt gruplarının ekspresyon düzeylerine bakılmıştır (Şekil 4.17, Şekil 4.18, Şekil 4.19, Şekil 4.20). İlk olarak CD24+CD44- yüzey ekspresyon seviyelerine bakıldığında, bu ekspresyonun en çok luminal hücre hattı olan T47D’de over eksprese 40 D6P30 DAİSY5/DAİSY12-DAİSY4 SÜSPANSE FAZ edildiği görülmektedir. BT474, MDA-MB-231, MDA-MB-468’de ise ya hiç eksprese edilmediği ya da çok az edildiği görülmektedir. T47D’nin THP-1, pTHP-1, Al-Maq ile ko-kültürü sonrası pTHP-1’in THP-1’e göre CD24+CD44- ekspresyon düzeyinin arttığı istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur (Şekil 4.21, Şekil 4.22, Şekil 4.23, Şekil 4.24). BT474 hücre hattı tek başına CD24+CD44- eksprese etmezken, Al-Maq ve THP-1 ile ko-kültürü sonrası CD24+CD44- ekspresyonunu arttığı görülürken, pTHP- 1 ko-külltürü ile birlikte bu yüzey belirtecinin ekspresyonunda bir değişiklik görülmemiştir (Şekil 4.21, Şekil 4.22, Şekil 4.23, Şekil 4.24). Bazal hücre hatları MDA-MB-231, MDA-MB-468 tek başına CD24+CD44- ya hiç ya da çok az eksprese ederken, MDA-MB-231’de CD24+CD44- ekspresyonu özellikle Al-Maq ile önemli bir seviyede artarken, MDA-MB-468’te ise hem Al-Maq ko-kültürü hemde THP-1, pTHP-1 ko-kültürü sonrasında CD24+CD44- ekspresyonunun arttığı görülmektedir (Şekil 4.19, Şekil 4.20, Şekil 4.21, Şekil 4.22). Özellikle kanser kök hücresi yüzey belirteci olan CD24-CD44+ ekspresyonu BT474 ve MDA-MB-231 hücre hatlarında tek başına artmışken, T47D ve MDA-MB- 468 hücre hatlarında ekspresyonu görülmemektedir. Fakat bu iki hücre hattının özellikle THP-1 ve Al-Maq ile ko-kültürleri sonrası CD24-CD44+ ekspresyonlarının önemli bir düzeyde arttığı görülmektedir. BT474 ve MDA-MB-231 hücre hatlarının ise THP-1, pTHP-1, Al-Maq ile ko-kültürleri sonrası yine CD24-CD44+ ekspresyonlarının arttığı görülmektedir, fakat yüzde değişimi olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (Şekil 4.21, Şekil 4.22, Şekil 4.23, Şekil 4.24). CD24+CD44+ ekspresyonun ise bu sefer T47D ve MDA-MB-468 hücre hatlarında arttığı görülürken, T47D ve MDA-MB-231 hücre hatları ise CD24+CD44+ yüzey belirtecini çok az eksprese ettiği görülmektedir. Yine bu iki hücre hattının özellikle THP-1 ve Al-Maq ile birlikte ko-kültürü sonrasında, CD24+CD44+ ekspresyonunun istatiksel olarak anlamlı bir şekilde arttığı görülmektedir (Şekil 4.19, Şekil 4.22, Şekil 4.24, Şekil 4.26). Son olarak hem bazal hem de luminal bu dört hücre hattında da CD24-CD44- ekspresyonu çok fazla görülmemektedir. Luminal hücre hatları T47D ve BT474’ün THP-1 ve Al-Maq ile birlikte ko-kültürü sonrasında CD24-CD44- ekspresyonunun önemli bir düzeyde arttığı görülmektedir. Bazal hücre hatlarından MDA-MB-231’in 41 Al-Maq ile ko-kültürü sonrası, MDA-MB-468 hücre hattının ise hem Al-Maq, hem de THP-1 ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD24-CD44- ekspresyonunun anlamlı bir şekilde arttığı görülmektedir (Şekil 4.21, Şekil 4.22, Şekil 4.23, Şekil 4.24). T47D T47D +p-THP-1 T4D+Al-Maq T47D+THP-1 Şekil 4.17 Meme kanseri hücre hattı T47D ve monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, pTHP-1, Al-Maq ile gerçekleştirilen ko-kültürler sonrasında CD24+CD44-, CD24- CD44+, CD24+CD44+, CD24-CD44- hücre alt gruplarının ekspresyon düzeylerinin temsili akım sitometri grafikleri. 42 BT474 BT474 +p-THP-1 BT474 +Al-Maq BT474 +THP-1 Şekil 4.18 Meme kanseri hücre hattı BT474 ve monosit/makrofaj hücre hatları THP- 1, pTHP-1, Al-Maq ile gerçekleştirilen ko-kültürler sonrasında CD24+CD44-, CD24- CD44+, CD24+CD44+, CD24-CD44- hücre alt gruplarının ekspresyon düzeylerinin temsili akım sitometri grafikleri. MDA MB 231 MDA MB 231 +p-THP-1 MDA MB 231 +Al-Maq MDA MB 231 +THP-1 43 Şekil 4.19 Meme kanseri hücre hattı MDA MB 231 ve monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, pTHP-1, Al-Maq ile gerçekleştirilen ko-kültürler sonrasında CD24+CD44-, CD24-CD44+, CD24+CD44+, CD24-CD44- hücre alt gruplarının ekspresyon düzeylerinin temsili akım sitometri grafikleri. MDA MB 468 MDA MB 468 +p-THP-1 MDA MB 468 +Al-Maq MDA MB 468 +THP-1 Şekil 4.20 Meme kanseri hücre hattı MDA MB 468 ve monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, pTHP-1, Al-Maq ile gerçekleştirilen ko-kültürler sonrasında CD24+CD44-, CD24-CD44+, CD24+CD44+, CD24-CD44- hücre alt gruplarının ekspresyon düzeylerinin temsili akım sitometri grafikleri. 44 T47D MDA MB 231 BT474 MDA MB 468 * 60 * 3 ** * 2.0 ** * 8 * * 40 1.5 6 2 1.0 4 20 1 0.5 2 0 0 0.0 0 -1P aq P- 1 D 1 47 P- a q -1 31 1P- aqP 2 P- 1 74 P-1 aq P-1 68 TH l-M TH T TH 4 A Al- M H 4 M + P + PT MB TH l-M TH T H - HB +T Al T B+ + + + + +A +P + +P A M MD A MD ** ****40 ** **150 ** 150 * **** **** ** ** *** ** 40 **** 30 *** ** *** 100 100 30 20 20 50 50 10 10 0 0 0 0 P- 1 Ma q P- 1 47 D 1P- Ma q 1P- 31 -1 aq -1 4 -1 aq -1 68 TH l- TH T TH l- TH 2 P 7 P P A + A P H - M HP T4 H l-M H B 4+ + +P + + A M B +T Al T B +T+ P + A +P T + DA M MD M ** * ** ****** ** 50 ** 25 **** ** *** 25 *** ** 150 ** 40 *** 20 20 * **** 30 15 15 100 ** ** 20 10 10 50 10 5 5 0 0 0 0 -1 aq -1 7D -1 aq -1 31 P-1 aq P-1 74 - 1 aq -1 8P P P 46 TH Al- M TH P T4 TH P l-M TH P B 2 TH l-M TH T 4 TH l-M TH B + + +P + +A +P A M + +A B + A+P + +P DA M MD M *** * * ***** ** ** * *** * *40 *** 4 **** 1.5 ** 8 * ** 30 ***3 6 1.0 20 2 4 0.5 10 1 2 0 0 0.0 0 P-1 aqM P -1 7D P-1 aq4 M P -1 23 1 -1 q -1 74 -1 q -1 68 TH l- TH a a A T TH l- P P 4 TH B TH l-M TH BT TH P l-M H P T B 4 + + +P + +A +P A AA M + + +P + + +P A M MD MD Şekil 4.21 Meme kanseri hücre hatları (T47D, BT474, MDA-MB-231, MDA-MB- 468) ve monosit/makrofaj hücre hatları (THP-1, pTHP-1, Al-Maq) ile gerçekleştirilen ko-kültürler sonrasında CD24+CD44, CD24-CD44+, CD24+CD44+, CD24-CD44- hücre alt gruplarının %ekspresyon değişimleri. p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; p<0,0001**** 45 CD44-CD24- CD44+CD24+ CD44+CD24- CD44-CD24+ %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon T47D MDA MB 231 BT474 MDA MB 468 10 2000 1500 1000 1500 0 1000 1000 800 -10 500 500 600 -20 200 400150 300 400 -30 100 200 200 50 100 -40 0 0 0 P-1 aqM P- 1 -1 aq -1 -1 aq -1 -1 aq -1H +T Al - TH TH P l-M HP HP -M HPT H P A - M HP + +P + + +P + T Al+ +P T +T +A l +P T 800 1.0 0 40000 600 0.8 400 0.6 -50.4 30000 200 0.2 0.0 -100 0 0 20000 -5 -5 -15 -10 -10 -20 10000 -15 -15 -20 -20 -25 0 P-1 aq -1H l-M HP HP -1 aq -1 -1 aq -1 -1 q -1 T A T T l- M TH P HP l-M HP HP a + T T T l- M HP + T+P + +A +P + +A +P + +A +P 0 1500 2500 0 2000 -10 1000 1500 -10 -20 500 1000500 -20 -30 00 100 -30 -40 -10 80-20 60 -50 -30 40 -40 -40 20 -60 -50 0 -50 P-1 q -1 -1 q -1 - 1 aq -1 -1 q -1 TH l-M a HP HP l-M a HP HPT l-M H P P aH l-M HP+ +A PT +T T+ +A +P + +A T +P +T +A T+P 500 3000 1500 8000 400 300 2000 1000 200 6000 100 1000 500 10 400 100 4000 8 300 80 6 60 4 200 40 2000 2 100 20 0 0 0 0 P-1 q -1 1 qMa P P- - 1 -1 q -1 -1 q -1 TH l- TH TH l-M a HP P a H aA A T T Al- M HPT TH P M Al- TH P + + +P + + +P + + +P + + +P Şekil 4.22 Meme kanseri hücre hatları (T47D, BT474, MDA-MB-231, MDA-MB- 468) ve monosit/makrofaj hücre hatları (THP-1, pTHP-1, Al-Maq) ile gerçekleştirilen ko-kültürler sonrasında CD24+CD44, CD24-CD44+, CD24+CD44+, CD24-CD44- hücre alt gruplarının %değişim grafikleri. 46 CD44-CD24- CD44+CD24+ CD44+CD24- CD44-CD24+ %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim CD44-CD24+ CD44+CD24- CD44+CD24+ CD44-CD24- **** **** **** **** **** 50 **** 100 **** **** 25 **** **** **** 80 *** 35 ****80 * 2060 20 60 15 5 5 40 4 40 10 3 2 20 20 5 1 0 0 0 08 46 31 7D 4 8 1 D 4 2 4 47 46 23 47 47 68 1 7D 74 68 1 3 7D 74B M MB + T +B T MB MB +T BT 4 23 4 T4 4 2 4 T4 A A A A + T T D M B MB + +B M B MB + +B +M D +M +M D MD+ MD A DA D A M D A + + +M +M **** **** ******** **** *** **** **** *** **** **** **** 95 **** **** 8 *** **** *** **** 100 80 760 80 65 65 50 60 50 4 40 35 3 40 20 220 5 1 10 5 1.030 8 4 0.8 20 6 3 0.6 10 4 2 0.4 2 1 0.2 0 0 0 0.0 8 1 D 4 8 1 D 4 68 1 87D 74 46 31 7D 4 6 7 6 7 3 47 B 4 B 2 3 47 4 4 3 47 4 4 2 4 4 2 4 M + T BT 2 T T B T T B B +T BT A A M + A M B B + +B M MB + B A M + MA M +A A D MD MD D D MD D M D A + + +M +M + +M + + M **** **** **** **** **** **** ******** ** 95 **** **** 50 ****50 **** 100 40 90 **** **** 80 ****65 35 30 80 50 20 70 35 20 10 60 205 5 1.0 50 5 3 0.8 40 4 0.6 30 3 2 0.4 20 2 0.2 10 1 1 0.0 0 0 68 31 7D 4 0 4 2 T4 T4 7 8 1 D 4 8 1 D 4 8 4 B B + B B 46 23 4 7 7 6 7 1 D M M + B +T BT 4 4 23 T4 7 T4 46 23 47 47 A A M + MB B + TD A M A M + B MB B + T B M D D DA D A A A M + + +M +M M M D D + + +M +M +M D Şekil 4.23 Al-Maq, pTHP-1 ve THP-1 hücrelerinin, meme kanseri MDA-MB-468, MDA-MB-231, T47D ve BT474 hücre alt gruplarına etkisi. Yüzde ekspresyon grafikleri verilmiştir. p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; p<0,0001**** 47 THP-1 p-THP-1 Alveolar Makrofaj %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon CD44-CD24+ CD44+CD24- CD44+CD24+ CD44-CD24- 2000 40000 2000 6000 1500 30000 1500 5000 1000 20000 4000 10000 1000 3000 500 180000 500 2000 0 0 0 1000 0 64020 00 0 2000 -10 0 0 150 0 -20 -5 100-20 -10 -40 50 -30 -15-20 -60 0 46 8 31 7D 47 4 68 31 7D 74 6 8 4 31 7D 4 8 4 47 46 31 2 4 7 D 74 B B +T BT 4 B 2 T4 4 2 2 4 4 M M + M MB + +B T MB MB + T BT T T A + M B A M B + +B D DA A M MD D A D DAM MD A DA + +M + +M + +M + +M 1000 5000 100 8000 800 40003000 80 6000600 2000 400 1000 60 4000 200 1.0 2000 0.5 40 5 0.0 20 4 -0.5 70 -1.0 0 650403 -2 0 2 -4 1 --6 -20 3 8 -40 12 0 00 0 -10 0 68 31 7D 74 68 1 D 4 8 7 46 31 7D 74 68 4 4 31 7D 4 4 2 7 4 7 B B +T 4 T4 4 3 4 2 4 2 4 M +B B 2 T4 T T T T T M M B + B M + A M B B + +B MB B + B A A A A M A M +A D D D A +M D MD +M +M D +M M D + +M M D + + 800 25000 2500 3000 600 20000 200015000 1500 2500 400 10000 1000 200 5000 500 2000 0 0 0 160 0 1500 -10 120 -1080 1000 -20 40 -20 -30 0 -30 500 -40 -40 -40 0 8 4 8 D 4 8 4 46 8 1 3 7D 4 6 1 D 7 6 1 7 7 6 1 D 7 2 T4 T4 7 4 23 47 4 4 23B T T B T4 7 T4 4 23 4 4 B T T M MB + +B M M B + +B M MB + A + B M B A A A M B + +B DA A D DA D D A D M M +M M + +M + +M D M MD + + + Şekil 4.24 Al-Maq, pTHP-1 ve THP-1 hücrelerinin, meme kanseri MDA-MB-468, MDA-MB-231, T47D ve BT474 hücre alt gruplarına etkisi. Yüzde değişim grafikleri verilmiştir. p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; p<0,0001**** Meme kanseri hücre hatları T47D, BT474, MDA-MB-231 ve MDA-MB- 468’in monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD206, CD163, CD169 ve CD14 yüzey belirteçleri üzerine etkileri incelenmiştir (Şekil 4.25, Şekil 4.26, Şekil 4.27, Şekil 4.28). Alveolar makrofaj belirteçlerinden CD206 düzeyi BT474 hücre hattı ile gerçekleşen ko-kültürler sonrasında en çok Al-Maq hücrelerinde, sonrasında da THP- 1 hücre hatlarında gözlendi. CD163 genellikle makrofaj lokalizasyonu ile ilgili fikir veren bir molekül olup, BT474 ko-kültürü ile en az p-THP hücrelerinde artış gösterdi (Şekil 4.27, Şekil 4.28 ve Şekil 4.9). Bazal benzeri hücre hatları olan ve metastatik potansiyeli yüksek olduğu daha önceki çalışmalarda gösterilmiş MDA-MB-468 ve MDA-MB-231 hücre hatlarının ise, CD163 belirtecini en yüksek düzeylerde p-THP hücrelerinde arttırdığı görüldü (Şekil 4.29, Şekil 4.30 ve Şekil 4.31). CD169, alveolar makrofajlar üzerinde CD206 ile beraber görülen bir yüzey belirteci olup, MDA-MB-468 hücre hattı ile gerçekleşen ko-kültürlerin tümünde bu 48 THP-1 p-THP-1 Alveolar Makrofaj %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim %değişim belirtecin artış gösterdiği saptanmıştır. Bunun yanı sıra, MDA-MB-231 hücre hattının da Al-Maq alt-grubunda bu belirteci arttırdığı gösterilmiştir. En az uyarıcı hücre hattı ise, BT474 olarak belirlenmiştir (Şekil 4.29, Şekil 4.30). CD14 hem monosit hem de makrofajlar için kullanılan bir yüzey belirteci olup, özellikle monositler için kabul görmektedir. BT474, THP-1 hücre hattında tüm alt- gruplara göre CD14 belirtecini en yüksek düzeyde arttırmıştır. MDA-MB-468 ise, Al- Maq ve p-THP-1 hücrelerinde belirtecin artışını desteklemiştir (Şekil 4.29, Şekil 4.30). T47D 8 6 4 2 0 -1 aq -1 +TH P P +Al -M H +PT 15 * 10 T47D+ Al-Maq 5 0 THP -1 aq P-1 + +Al -M H +PT 60 40 T47D+pTHP-1 20 0 P-1 aq -1 +TH Al- M PTH P + + 60 ******** 40 T47D+THP-1 20 0 HP- 1 1 T Al-M aq P- + + +PT H Şekil 4.25 Meme kanseri hücre hattı T47D’nin monosit/makrofaj hücre hatları THP- 1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11c+ hücre kapısından CD206, CD163, CD169 ve CD14 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri 49 CD14 CD169 CD163 CD206 %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon 15 10 5 0 P-1 aqH - 1 T +Al -M THPP 6 BT474+Al-Maq 4 2 0 HP- 1 aq T P -1 + +Al -M H +PT 80 ** BT474 +pTHP-1 60 40 20 0 P-1 q -1 +TH +Al -Ma PTH P + 100 * 80 * BT474 +THP-1 60 40 20 0 1 HP- a q -1 P+T +Al-M +PTH Şekil 4.26 Meme kanseri hücre hattı BT474’ün monosit/makrofaj hücre hatları THP- 1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11c+ hücre kapısından CD206, CD163, CD169 ve CD14 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri 50 CD14 CD169 CD163 CD206 %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon 15 10 5 0 1 HP- l-Ma q 1 +T A PTH P- + + 20 15 MDA MB 231 10 + Al-Maq 5 0 P-1 aq -1 +TH +Al -M P +PT H 80 * ** 60 MDA MB 231 40 +pTHP-1 20 0 -1 1 THP Al-M aq P- + + +PT H 80 **** **** ** MDA MB 231 60 +THP-1 40 20 0 1 q 1 +TH P- Al-M a - + +PT HP Şekil 4.27 Meme kanseri hücre hattı MDA MB 231’in monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11c+ hücre kapısından CD206, CD163, CD169 ve CD14 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri ** 15 * 10 5 0 1 q 1 THP - l-Ma - +A PT HP **** 30 **** 25 20 15 MDA MB 468 105 3 + Al-Maq 2 1 0 P-1 q 1 +TH Al-M a HP- + +PT *** 100 *** 80 MDA MB 468 60 +pTHP-1 40 20 0 1 HP- l-Ma q HP- 1 +T +A +PT **** 100 **** MDA MB 468 8060 +THP-1 40 20 0 THP -1 aq P-1 + -M+Al +PT H 51 CD14 CD169 CD163 CD206 CD14 CD169 CD163 CD206 %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon Şekil 4.28 Meme kanseri hücre hattı MDA MB 468’in monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11c+ hücre kapısından CD206, CD163, CD169 ve CD14 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri T47D MDA MB 231 BT474 MDA MB 468 ** 8 15 15 15 * 6 10 10 10 4 5 5 5 2 0 0 0 0 P-1 aq P-1 P-1 aq P-1 P-1 aq P-1 P-1 aq 1TH l-M TH TH l-M - H M P + H+A P + +A PT+ + T +A l- PT H TH Al- M H + PT **** 15 * 20 6 30 ****25 20 15 15 10 4 10 10 53 5 2 5 2 1 0 0 0 0 P-1 aq P-1 P-1 aq P-1 P-1M a q P-1 P-1 aq -1H - +T Al PT H H -M +T Al PT H TH l-MA TH+ P +T H Al- M P + + + PT H + + + + + 60 80 * 80 * **** 100** *** 60 80 40 60 60 40 40 20 40 20 20 20 0 0 0 0 P-1 q 1 1 q 1 -1 qH -M a P- - -H HP -M a HP HP l-M a HP -1 P-1 aqM P- 1 +T +A l H H +P T +T +A l PT +T T T l - T + +A +P + +A +P 60 **** 80 **** 100 * ******** **** 100 **** 60 ** 80 * 80 40 60 40 60 40 20 40 20 20 20 0 0 0 0 P-1 aq P-1 P-1 aq P-1M - 1 H - a q -1 -1 l a q -1 +T +A PT H P P +T H M M PAl- HPT TH+ Al- PT H +TH Al- M HP + + + + + + T +P Şekil 4.29 T47D, BT474, MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 hücrelerinin THP-1, Al- Maq ve pTHP-1 hücreleriyle ko-kültürü sonrası CD11c+ hücre kapısından CD206, CD163, CD169 ve CD14 yüzey belirteçleri üzerine etkileri. p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; p<0,0001**** 52 CD14 CD169 CD163 CD206 %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon Alveolar Makrofaj p-THP-1 THP-1 15 15 * 10 * ** * ** 8 ** 10 10 6 4 5 5 2 0 0 0 1 3 8 D 4 1 8 D 4 1 8 D 4 2 4 6 47 47 6 7 7T 2 3 4 T4 T4 2 3 46 47 7 B B +T B B B + B B B +T BT 4 M M + M M + M M + DA MD A ADA D DA A +M + +M +M +M +M D *** *** 6 30 ** 8 6 4 20 4 2 10 2 0 0 0 1 8 D 4 1 6 7 7 3 68 7D 74 31 8 4 46 7D 47 B 23 4 2 4B +T 4 BT 4 2 4 4B B T4 T B B +T BT M A M + M A M + +B M A M + DA D DA MD MD A MD +M +M +M + + + * 60 * 100 100 ** * * * 80 80 40 60 60 40 20 40 20 20 0 0 0 1 23 68 D 4 4 1 8 47 47 31 6 8 4 47 D 4 47 23 4 6 47 D 744 B MB + T M B T B 2 B +T BT B B T T A A + M M + M A M + +B D MD DA D A DA MD+M + +M +M + M + ** **** 25 * 100 * 80 ******** 20 80 60 15 60 40 10 40 5 20 20 0 0 0 1 23 46 8 7D 74 1 8 D 4 1 8 D 4 B T4 T 4 23 46 7 7 3 6 7 7 B + B B B +T 4 T4 2 4 4 4 M M + M M +B B M B M + T BT A A + D D DA A D A M D A D + +M +M +M +M +M Şekil 4.30 Al-Maq, pTHP-1 ve THP-1 hücrelerinin MDA-MB-231, MDA-MB-468, T47D ve BT474 hücreleriyle ko-kültürü sonrası CD11c+ hücre kapısından CD206, CD163, CD169 ve CD14 yüzey belirteçleri üzerine etkileri. p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; p<0,0001**** 53 CD14 CD169 CD163 CD206 %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon Kanser hücre hatları ile gerçekleşen monosit/makrofaj ko-kültürlerinde, BT474 hücreleri CD80 ekspresyonu yönünden diğer kanserlere oranla daha fazla uyarılmıştır. En düşük ekspresyon THP-1 ile ko-kültüre edilen T47D hücrelerinde görülmüştür. En yüksek CD86 ekspresyonu p-THP-1 ile ko-kültür yapılan T47D hücrelerinde görüldü. Yine aynı zamanda en düşük CD86 ekspresyonu da THP-1 hücresi ile ko- kültür yapılan T47D hücrelerinde belirlendi. Al-Maq, p-THP-1 ve THP-1 hücreleri ile ko-kültür yapılan MDA-MB 231 ve BT474 hücre hatlarında PD-L1 diğer kanserlere oranla istatiksel olarak anlamlı bir şekilde arttığı tespit edildi. PD-L2 ekspresyonuna baktığımız zaman ise, BT474 hücre hattı diğer kanserlere göre istatiksel olarak anlamlı bulundu. CD80, CD86, PD-L1 ve PD-L2 ekspresyonları tüm kanserlerde p-THP-1 koşulunda en yüksek ekspresyon düzeyine sahipti (Şekil 4.35, Şekil 4.36). ** 5 ** 4 3 2 1 0 P-1 qH - 1 +T +Al -Ma +PT HP *** 15 *** 10 T47D+ Al-Maq 5 0 P-1 Maq P-1 +TH Al- PTH+ + 80 60 40 T47D+pTHP-1 20 0 P-1 aq -1 +TH l- M THP+A +P 80 60 40 T47D+THP-1 20 0 -1 +TH P Al-M aq 1 PTH P- + + Şekil 4.31 Meme kanseri hücre hattı T47D’nin monosit/makrofaj hücre hatları THP- 1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11b- hücre kapısından CD80, CD86, PD-L1, PD-L2 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri 54 PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon 15 10 5 0 1 q 1 +TH P- Al-M a P- + +PT H 15 * ** 10 5 BT474+Al-Maq 0 P-1 q 1 +TH Al- Ma P- + +PT H **** 100 ***** 80 60 40 BT474 +pTHP-1 20 0 THP -1 q l-M a THP -1 + +A +P 50 40 30 20 BT474 +THP-1 10 0 1 q 1 +TH P- Ma HP- +Al - + PT Şekil 4.32 Meme kanseri hücre hattı BT474’ün monosit/makrofaj hücre hatları THP- 1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11b- hücre kapısından CD80, CD86, PD-L1, PD-L2 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri 4 3 * 2 1 0 HP- 1 Maq P- 1 +T Al- PTH+ + 8 *** *** 6 4 2 MDA MB 231 + Al-Maq 0 P-1 Maq 1 +TH H P-- +Al +PT 150 *** *** 100 MDA MB 231 50 +pTHP-1 0 P-1 aqTH l-M THP -1 + +A +P 40 *** **** 30 MDA MB 231 20 +THP-1 10 0 THP -1 aq l-M THP -1 + +A +P Şekil 4.33 Meme kanseri hücre hattı MDA MB 231’in monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11b- hücre kapısından CD80, 55 PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon CD86, PD-L1, PD-L2 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri 15 10 5 0 HP- 1 l-Ma q HP- 1 +T +A +PT 15 10 5 MDA MB 468 + Al-Maq 0 THP -1 aq P-1 + +Al -M +PT H 80 ******** 60 40 MDA MB 468 20 +pTHP-1 0 THP -1 + Al-M aq -1 + +PT HP **** 30 ***** MDA MB 468 20 +THP-1 10 0 P-1 Maq 1 +TH Al- PTH P- + + Şekil 4.34 Meme kanseri hücre hattı MDA MB 468’in monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11b- hücre kapısından CD80, CD86, PD-L1, PD-L2 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri 56 PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon T47D MDA MB 231 BT474 MDA MB 468 ** 5 ** 4 15 15 4 3 * 10 10 3 2 2 5 1 1 5 0 0 0 0 P-1 qMa P- 1 -1 q -1 1 q 1 +T H Al- TH TH P Ma HP P- - P - a 1 1 + Al PT TH Al- M HP P- Ma q P- + + + + + + PT H - H+ +T l+A +P T *** 15 *** 8 *** 15 * 15*** 6 ** 10 10 10 4 5 5 5 2 0 0 0 0 P-1 aq P-1 P-1 aq 1 1M P- qM P- a P- 1 P-1 aq P-1TH Al- TH TH M M+ + +P + +A l- TH TH l- TH TH l- TH +P + +A +P + +A +P **** 80 150 *** 100 **** 80 **** * ******* 60 80 60 100 60 40 40 50 40 20 20 20 0 0 0 0 P-1 aq P-1 P-1 aq P-1 -1 aq -1 P-1 aq P-1 TH l-M H H -M+ +A PT +T A l + PT H HPT l-M H P TH l-M TH + + + +A +P T + +A +P **** 80 40 50 30 ******* * **** 60 30 40 20 30 40 20 20 10 20 10 10 0 0 0 0 1 1 P-1 aq P-1 -1 q -1 q1 1 P- a P- +T H l-M TH P Ma P P- aq P- TH l-M+A +P H - H TH +T Al PT TH l-M TH ++ + + A P + A +P + + Şekil 4.35 T47D, BT474, MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 hücrelerinin THP-1, Al- Maq ve pTHP-1 hücreleriyle ko-kültürü CD11b- hücre kapısından sonrası ko- stimülatör belirteçler CD80, CD86, PD-L1 ve PD-L2 üzerine etkileri. p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; p<0,0001**** 57 PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon Alveolar Makrofaj p-THP-1 THP-1 **** *** 10 * 15 ** 8 **** 10 ** ** * 8 ** 6 10 6 4 5 4 2 2 0 0 1 68 D 74 31 68 D 4 0 23 4 47 T4 2 7 B 4 4 4 7 8 4 B B +T 1 D B B +T B T 23 4 6 47 7T4 A M M + A M A M + B BA + T B D D D MD M M + +M +M + M + MD A DA + +M *** ** 4 * 15 6 * 3 10 4 2 5 2 1 0 0 0 31 8 D 4 8 4 1 8 D 4 2 4 6 T4 7 T4 7 23 1 46 D 6 7 B B T4 7 47 23 4 7 4 B + B B + T B B T4 BT M MA + M MA + B M M + A + MD A D A D DAM MD M D + + + +M + M + *** **** *** *** 100 *** 150 100 ****** ** *** 80 * ** 80 100 60 60 40 4050 20 20 0 0 0 31 68 D 8 4 2 4 47 47 4 31 6 7D 7 1 8 D 4 T T 2 B 4 T4 T4 2 3 46 7 7 B B + B B + B B B +T 4 T4 M M + M MA +A M A M +B A DA D D DA D +M D M +M +M+ +M +M * * 40 80 50 * 30 60 40 30 20 40 20 10 20 10 0 0 0 31 68 7D 74 1 8 2 4 4 T4 23 4 6 47 D 47 4 31 68 7D 4 B 4 4 4 7 MB M + T 2 + B MB B T T M + +B MB T T A M B + B A +D A A A A +M D +M D D D D +M +M +M +M Şekil 4.36 Al-Maq, pTHP-1 ve THP-1 hücrelerinin MDA-MB-231, MDA-MB-468, T47D ve BT474 hücreleriyle ko-kültürü sonrası CD11b- hücre kapısından ko- stimülatör belirteçler CD80, CD86, PD-L1 ve PD-L2 üzerine etkileri. p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; p<0,0001**** 58 PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından CD11b- kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon T47D hücre hattı ile gerçekleşen monosit/makrofaj ko-kültürlerinde, bu kanser alt-tipinin miyeloid hücrelerdeki HLA-DR ve CD80 ekspresyonunu en az düzeyde uyaran hücre hattı olduğu görüldü. BT474 hücre hattının ise en çok THP-1 hücre hattında daha sonrasında da Al-Maq (D6P30-DAİSY5) hücrelerinde HLA-DR ekspresyonunu desteklediği görüldü (Şekil 4.41, Şekil 4.42). MDA MB 468 hücre hattı ile gerçekleşen p-THP-1 ko-kültüründe, bu kanser alt-tipinin miyeloid hücrelerdeki CD80 ekspresyonunu en yüksek düzeyde uyaran hücre hattı olduğu görüldü. Miyeloid hücreler arasındaki en çok CD86 ekspresyonu p-THP-1’a MDA MB 231 ve BT474 hücre hatları eklendiğinde görülmüştür. Yine en düşük CD86 ekspresyonu T47D hücre hattı ile ko-kültür yapılan miyeloid hücrelerde görüldü. PD-L1 ve PD-L2 ekspresyonu en çok T47D hücreleri ile ko-kültür yapılan p- THP-1 hücrelerinde görüldü. MDA MB 468 hücre hattı ile ko-kültür yapılan miyeliod hücre hatlarında en düşük PD-L1 ve PD-L2 ekspresyon seviyeleri belirlendi. CD80, CD86, PD-L1, PD-L2 ve HLA-DR ekspresyonları tüm kanser hücre hatlarında, p- THP-1 koşulunda diğer miyeloidlere göre en yüksek sevilerde belirlendi (Şekil 4.41, Şekil 4.42). T47D+ Al-Maq T47D+pTHP-1 T47D+THP-1 Şekil 4.37 Meme kanseri hücre hattı T47D’nin monosit/makrofaj hücre hatları THP- 1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11b+ hücre kapısından HLA-DR, 59 HLA-DR PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 CD80, CD86, PD-L1 ve PD-L2 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri BT474+Al-Maq BT474 +pTHP-1 BT474 +THP-1 Şekil 4.38 Meme kanseri hücre hattı BT474’ün monosit/makrofaj hücre hatları THP- 1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11b+ hücre kapısından HLA-DR, CD80, CD86, PD-L1 ve PD-L2 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri MDA MB 231 + Al-Maq MDA MB 231 +pTHP-1 MDA MB 231 +THP-1 60 HLA-DR PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 HLA-DR PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 Şekil 4.39 Meme kanseri hücre hattı MDA MB 231’in monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11b+ hücre kapısından HLA- DR, CD80, CD86, PD-L1 ve PD-L2 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri MDA MB 468 + Al-Maq MDA MB 468 +pTHP-1 MDA MB 468 +THP-1 Şekil 4.40 Meme kanseri hücre hattı MDA MB 468’in monosit/makrofaj hücre hatları THP-1, Al-Maq ve pTHP-1 ile ko-kültürü sonrası CD11b+ hücre kapısından HLA- DR, CD80, CD86, PD-L1 ve PD-L2 yüzey belirteçleri üzerine etkilerinin temsili akım sitometri görüntüleri 61 HLA-DR PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 Şekil 4.41 T47D, BT474, MDA-MB-231 ve MDA-MB-468 hücrelerinin THP-1, Al- Maq ve pTHP-1 hücreleriyle ko-kültürü CD11b+ hücre kapısından sonrası ko- stimülatör belirteçler HLA-DR, CD80, CD86, PD-L1 ve PD-L2 üzerine etkileri. p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; p<0,0001**** 62 Alveolar Makrofaj p-THP-1 THP-1 **** * *** *** ******** * *** *** 15 *** *** 50 * 20 ** 40 ****15 10 30 10 20 5 10 5 0 0 0 31 46 8 7D 74 31 68 7D 74 31 68 7D 74 B 2 B +T 4 BT 4 2 4 4 T4 2 B 4 T4 T4T M M + B B M B M + +B M A M + +B DA MD A A DA A M MD M M D + M D + + + + + **** **** *** ******* **** 60 *** **** ***100 80 **** **** *** **** 80 60 40 60 40 20 40 20 20 0 0 0 1 68 D 74 1 8 D 4 31 8 4 23 4 47 4 3 46 47 47 2 B 4 6 7D 7 B T T 2 4 T T B +T BT 4 A M B A M + +B B MB + +B M A M + D MD DA M A DA D MD +M + M + +M +M + *** ** 50 ** 100 * 50 ** *** ** 40 80 40 30 60 30 20 40 20 10 20 10 0 0 0 31 46 8 7D 47 4 1 3 68 D 2 4 T 2 4 7 47 4 1 68 7D 74 B T 3 4 4 MB M + +B B MB +T 4 2 4 M +B T B B T T A DA A A M M + +B D M D D DA A +M + D +M +M +M +M *** 50 ******** 100 * 40 **** 40 80 30 ** 30 60 20 20 40 10 20 10 0 0 0 31 68 7D4 47 4 2 4 8 431 68 7D 74 31 6 7D B B +T BT 2 4 4 T4 2 4 T4 T4 7 M MA + MB B +T B B A M +D A M B M + +B MD M A+ D D A DA + +M D +M +M +M 20 40 30 * * 15 30 20 10 20 10 5 10 0 0 0 31 68 7D 74 31 68 7D 74 31 68 7D 4 2 4 T4 T4 2 4 T4 T4 2 4 T4 T4 7 MB M B + +B MB M B + +B MB M B + A A A + B MD A A A + +M D D D D D +M +M +M +M 63 HLA-DR PD-L2 PD-L1 CD86 CD80 CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından CD11b+ kapısından %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon %ekspresyon Şekil 4.42 Al-Maq, pTHP-1 ve THP-1 hücrelerinin MDA-MB-231, MDA-MB-468, T47D ve BT474 hücreleriyle ko-kültürü sonrası CD11b+ hücre kapısından ko- stimülatör belirteçler HLA-DR, CD80, CD86, PD-L1 ve PD-L2 üzerine etkileri. p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; p<0,0001**** MDA MB 231, MDA MB 468, T47D, BT474 hücre hatları ile ko-kültür edilen miyeloid hücreler, bu kanser hücrelerinde invazyonu desteklemişlerdir. En yüksek düzeyde invazyon MDA MB 231 hücre hattı ile THP-1 hücre hatının ko-kültür gurubunda belirlendi (Şekil 4.43, Şekil 4.44) Şekil 4.43 Al-Maq, pTHP-1 ve THP-1 hücrelerinin MDA-MB-231, MDA-MB-468, T47D ve BT474 hücreleriyle ko-kültürü sonrası metastatik karaktere olan etkisinin Scratch Assay yöntemi ile belirlenmesi. 64 Formül: (0.saat ölçülen alan) - (72.saat ölçüülen alan) 3000000 2000000 1000000 0 68 aq P-1 31 aq P-1 74 aq P-1 7D aq P-1 MB 4 M H 2 Al- - M H T4 +T MB Al +T B Al -M H T4 T l-M TH A 68 + 68 A +31 31 + 74 74 + +A + MD D B 4 B 4 D DM B 2 B 2 T4 BT 4 47 T4 7 M A M M B T M A MD A MD D A MDM Şekil 4.44 Al-Maq, pTHP-1 ve THP-1 hücrelerinin MDA-MB-231, MDA-MB-468, T47D ve BT474 hücreleriyle ko-kültürü sonrası metastatik karaktere olan etkisinin Scratch Assay yöntemi ile belirlenmesi. Piksel alanı hesaplanırken, (0.saatte ölçülen alan) - (72.saate ölçülen alan) formülasyonu uygulanmıştır. 65 piksel alanı 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Meme kanseri, kadın kanserleri arasında ilk sırada yer almaktadır ve özellikle üçlü negatif alt-tipi kanser ilişkili ölümlerde ilk sırada yer almaktadır (Siegel, Miller, Fuchs, & Jemal, 2022). Bunun sebebi olarak, kanser başlatıcı/kanser kök hücre alt- klonlarının bu kanser tipinde sayı ve yüzdece fazla olması olarak gösterilmektedir (Batlle, & Clevers, 2017; Dittmer, & Rody, 2013; Galassi, Musella, Manduca, Maccafeo, & Sistigu, 2021). Bu hücre alt-gruplarının EMT/MET dönüşüm kapasitelerinin yüksek (Zhou ve ark., 2019) ve immün modülasyon/kaçışta etkin olduğu tartışılmaktadır (Lei, & Lee, 2021). Kanser kök hücresi ve diğer adı ile kanser başlatıcı hücre veya sirküle tümör hücresinin litaratürde CD44, CD24 ve ALDH1 ekspresyonuna göre testip edilebileceği belirtilmektedir. Genel olarak, CD44+/CD24 negatif olarak belirtilse de, CD24+ hücrelerin de metastazda rol oynayabileceğini gösteren yayınlar mevcuttur (Li ve ark., 2021; Nielsen ve ark., 2004; Potemski ve ark., 2005; Rakha ve ark., 2006; Rakha ve ark., 2009; Ricardo ve ark., 2011; Vassilopoulos ve ark., 2014; Walcher ve ark., 2020; Zhang ve ark., 2020; Zhang ve ark., 2021). CD44- CD24- hücrelerin, uzak organ metastazlarında etkin olduğu litaratürde bildirilmiştir (Qiao ve ark., 2021). Litaratürde kanser kök hücre popülasyonları araştırılan hücre hatlarında CD44/CD24 belirtecinin eksprsyonuna göre Bazal, Luminal ve karışık alt-gruplardan bahsedilmektedir. CD44+ CD24+ hücrelerin tüm alt-grupları verebileceği raporlanmıştır (Yeung ve ark., 2010; Jaggupilli ve ark., 2012). Buna göre, tanımlanan ‘’karışık alt-grup’’ta CD44+/CD24-, CD44düşük/CD24- ve CD44-CD24+ kök hücre alt-grupları bulunabilmektedir (Fillmore & Kuperwasser, 2008). Tez çalışmamız kapsamında gerçekleştirdiğimiz deneylerde, litaratür ile uyumlu olarak MDA-MB-231 hücrelerinde CD44+/CD24- kanser kök hücresi popülasyonunun %90 civarlarında olduğu saptanmıştır (Şekil 4.17). Ayrıca, BT474 hücre hattının da luminal alt-tipte olmasına rağmen bu alt-popülasyonu MDA-MB- 231 hüre hattı kadar bulundurduğu görülmüştür (Şekil 4.17). MDA-MB-468 hücrelerinde CD44+/CD24- hücre alt-grubu bulunmaz iken, CD44+/CD24+ hücre 66 altgrubu %90 civarlarında belirlenmiştir. Bu da bu hücre hattının karışık alt-grup’ta yer alması gerektiğini düşündürmüştür (Fillmore & Kuperwasser, 2008) (Şekil 4.6). Bu hücre alt-tipi T47D hücrelerinde de %30 civarında tespit edilmiştir (Şekil 4.17). CD44-/CD24+ hücre hattının metastaz ile ilişkili olabileceği bildirilmiş olup, (Nielsen ve ark., 2004; Li ve ark., 2021; Potemski ve ark., 2005; Rakha ve ark., 2006; Rakha ve ark., 2009; Ricardo ve ark., 2011; Vassilopoulos ve ark., 2014; Walcher ve ark., 2020; Zhang ve ark., 2020; Zhang ve ark., 2021) T47D hücrelerinde %50 civarında CD44-/CD24+ hücre alt-grubu saptanmıştır (Şekil 4.17). Bu hücre hattında mix popülasyon varlığı da olduğu için (Şekil 4.17), luminal/karışık alt-grupta değerlendirilebileceği düşünülmektedir. Halihazırda CD44-CD24+ ekspresyonu olan T47D hücre hattı ile p-THP-1 ko-kültürü sonucunda p-THP-1’ın T47Dhücre hattındaki ekspresyonu desteklediği görüldü. Bu sonuç T47D’nin metastatik karakterinin desteklendiğini düşündürmektedir (Şekil 4.21, Şekil 4.23). Aynı zamanda CD44+CD24- ekspresyonu çok az iken Al-Maq hücresi ile ko-kültürü sonucunda meme kanseri kök hücresi karekteri kazandığı da yorumlanabilir (Şekil 4.21, Şekil 4.23). BT474’un bazal seviyede hiç CD44-CD24+ ekspresyonu yok iken Al-Maq hücresi ile ko-kültürü sonucu az da olsa CD44-CD24+ ekspresyonu kazandığı görülmektedir. Bu sonuç, BT474’ün metastatik karakterinin desteklenebildiğini düşündürmüştür (Şekil 4.21, Şekil 4.23). MDA MB 231 hücre hattının Al-Maq hücresiyle ko-kültüründe CD44-CD24+ ve CD44-CD24- belirteçlerinde ekspresyon düzeyinin artması, hücre karakterinin metastatik yönde desteklendiğini düşündürmüştür (Şekil 4.21, Şekil 4.23). MDA MB 468 hücre hattı ile Al-Maq hücre hattı ko-kültürü sonrasında CD44+CD24+ ekspresyonu düşerken CD44-CD24-, CD44+CD24-, CD44-CD24+ ekspresyonlarının artması, CD44+CD24+ alt-grubun tüm hücre alt-gruplarını verebileceği litaratür verisini desteklemektedir (Şekil 4.21, Şekil 4.23). Tüm kanser hücre hatları ve p-THP-1’ın ko-kültürü sonucunda kanser hücrelerindeki PD-L1, PD-L2’nin artışı ve miyeloid grupta p-THP-1’da CD80, CD86 artışı bu iki hücre gurubunun PD-L1/PD-L2/PD-1 etkileşimi ile immün kaçış yapabileceğini işaret etmektedir (Şekil 4.35, Şekil 4.36, Şekil 4.41, Şekil 4.42). Tüm kanser hücre hatları ve miyeloid hücre hatları ile yapılan ko-kültürün ardından invazyon testi ile miyeloid hücre hatlarının kanserde invazyonu destklediği düşünülmektedir (Şekil 4.43, Şekil 4.44) 67 Meme kanseri kök hücreleri ile ilgili birçok çalışmada farklı yüzey belirteçleri de önerilse de asıl bu hücre grubunu tanımlayan durum metastatik ve anjiyogenz karakteri ve EMT/MET dönüşüm kapasitesi olarak belirtilmiştir. (Zhou ve ark., 2019). M0 makrofajlardan, temelde M1 ve M2 makrofaj olmak üzere iki farklı makrofaj alt- tipi şekillenmektedir. M1 makrofajlar genellikle HLA-DR+, CD86+, CD14+, CD36+, CD163- immünofenotipe sahiptir (Lolmede ve ark., 2009). M2 makrofajlar ise, M2a, M2b, M2c ve M2d olmak üzere farklı alt-gruplar içermektedir (Kim ve ark., 2021; Lolmede ve ark., 2009; Yongli, Xiang-Hong & Liping 2019). M2 makrofajların da genel olarak CD206+, CD163+ ve CD86+ olduğu bildirilmiştir (Kim ve ark., 2021). M2a alt-grubu, CD206+, CD163+, HLA-DR+ olup, CD14 belirtecini düşük düzeyde eksprese etmektedir. Bu makrofajların doku tamiri ile alakalı fonksiyonlarda görev aldığı bildirilmiştir (Kim ve ark., 2021; Lolmede ve ark., 2009; Yao ve ark., 2019). M2b alt-grubu, CD86+ ve Th2 yanıtlarını modüle etmektedir (Kim ve ark., 2021; Yao ve ark., 2019). M2c alt-grubu, CD206+, CD163+ ve HLA-DR belirtecini düşük düzeylerde eksprese etmektedir. Bu hücreler apoptotik hücrelerin fagositozunda görev alır (Kim ve ark., 2021; Lolmede ve ark., 2009; Yao ve ark., 2019). M2d hücreler genellikle toll-benzeri reseptör (toll-like receptor, TLR) ekspresyonu ile karakterize olup, pro-tümör özellikleri vardır (Kim ve ark., 2021). Meme kanseri metastazında özellikle M2 makrofajların ve baskılayıcı monositlerin rolü olduğu bilinse de (Ham ve ark., 2020; Keibel ve ark., 2009; Kumar ve ark., 2016; Marvel & Gabrilovich, 2015; Cotechini ve ark., 2021) doku yerleşik makrofajlar ve kanser kök hücreleri arasındaki etkileşim konusunda bilgiler oldukça sınırlıdır. Bu tez çalışması ile amacımız, farklı kanser kök hücresi alt-gruplarının akciğerdeki doku yerleşik alveolar makrofaj benzeri hücre dönüşümüne etkisinin olup olmadığı konusunda ilk bilgileri elde etmek idi. Meme kanserinin metastatik odağı ilk olarak akciğer olduğu için, çalışmamızda akciğer doku yerleşik makrofajları olan alveolar makrofajlar araştırışmıştır. Alveolar makrofajlar yüzeylerinde CD11b, CD11c, CD16, CD64, CD103, CD141, CD163, CD169, CD206 ve HLA-DR belirteçlerini ifade eder. CD163 ekspresyonu bu hücrelerin hangi bölgelere lokalize olduğunu göstermektedir. (Bharom ve ark., 2017; Bharat ve ark., 2016; Liegeois ve ark.,2018; Yu ve ark., 2016). Alveolar makrofajlar ile yapılan insan kaynaklı hücre kültürü çalışmalarında büyük bir limitasyon bulunmaktadır. Litaratürde kabul görmüş 68 bir alveolar makrofaj hücre hattı bulunmamaktadır. Sadece bir çalışmada THP-1’den köken alan bir hücre alt-klonu oluşturulmuş ve bu hücrenin karakteristik hücrelerinin alveolar makrofaja yakın olduğu gösterilmiştir (Sadofsky ve ark., 2019). Fakat, bu çalışmada alveolar makrofaj CD206 ekspresyonun zamanla kaybolduğu belirtilmiş ve bu sebeple fonksiyonel deneylerde kullanılacak devamlılık sağlanamamıştır. Laboratuvar çalışmalarımız kapsamında THP-1 hücre hattından 11 aylık yapay seçilim süreci ile belirtilen bu hücre hattı elde edilmiştir. Özellikle, Poly-L-Lysin ve DMEM koşulu varlığında bu alt-klonların ko-kültürü ile CD206 belirteci modüle edilebilmiştir. Zaman içerisinde bizim hücre alt-klonlarımız da bu ekspresyonu kaybedebilme potansiyeline sahip olsa da hücre saflaştırma yöntemi ile CD206 eksprese eden alt-klonlar saflaştırılarak bol miktarda dondurulmuştur. Bu deneyler sonucunda, litaratürde alveolar makrofaja en yakın olduğu düşünülen bir hücre hattı tarafımızca önerilmiştir. Aynı zaman da tüm bu litaratür bilgisinin ışığında laboratuvarımızda alt-popülasyon olarak karakterize ettiğimiz D6P30-Daisy5, CD163+, CD206+ ve HLA-DR ekspresyonu düşük immünofenotipik karakteri ile M2c alt-grubuna benzer özellikler de göstermektedir. CD169+ makrofajların mide kanseri hastalarının lenf nodlarında yüksek düzeyde bulunmasının iyi prognoz ile ilişkilendirildiği bildirilmiştir (Kumamoto ve ark., 2021). Bu belirteçlere ek olarak, CD169 pozitifliğini yüksek düzeylerde gösteriyor olması da, tümör immün yanıtlarında potansiyel etkilerinin olabileceğini düşündürmektedir. Böylelikle, planladığımız meme kanseri ko-kültürleri ile gerçekleştirilecek fonksiyonel deneyler gerçekleştirilmiştir. Hem T47D hem de MDA-MB-468 hücre hatları kokültürlerde en çok alveolar makrofaj benzeri karakteri destekleyen hücre hattı olarak belirlenmiştir. Bu hücreler CD169, CD206 ve CD14 belirteçlerinin modülasyonunu uyarırken, özellikle T47D tüm monosit/makrofaj alt-gruplarında HLA-DR ekspresyonunu azalttığı için immün kaçışı destekleyebilecektir. Elde edilen tüm veriler ışığında, litaratürde alveolar makrofaj olarak önerilebilecek bir hücre hattı tanımlanmıştır. Bunun yanı sıra, meme kanseri kök hücrelerinden özellikle ‘’karışık tip’’ alt-grubunun alveolar makrofaj benzeri hücreleri uyarabildiği gösterilmiştir. Bu bilgi ile, bu tip kanserlerin metastatik odak doku yerleşik makrofajları metastazı destekleyici yönde şekillendirebileceği düşünülmektedir. 69 6. KAYNAKLAR A-Gonzalez, N., Quintana, J. A., García-Silva, S., Mazariegos, M., González de la Aleja, A., …Hidalgo, A. (2017). Phagocytosis imprints heterogeneity in tissue- resident macrophages. The Journal Of Experimental Medicine, 214(5), 1281– 1296. https://doi.org/10.1084/jem.20161375 Allavena, P., Sica, A., Solinas, G., Porta, C., & Mantovani, A. (2008). The inflammatory micro-environment in tumor progression: the role of tumor- associated macrophages. Critical Reviews İn Oncology/Hematology, 66(1), 1– 9. https://doi.org/10.1016/j.critrevonc.2007.07.004 Altorki, N. K., Markowitz, G. J., Gao, D., Port, J. L., Saxena, A., Stiles, B., … & Mittal, V. (2019). The lung microenvironment: an important regulator of tumour growth and metastasis. Nature Reviews. Cancer, 19(1), 9–31. https://doi.org/10.1038/s41568-018-0081-9 Aramini, B., Masciale, V., Grisendi, G., Banchelli, F., D'Amico, R., Maiorana, A., … Haider, K. H. (2021). Cancer stem cells and macrophages: molecular connections and future perspectives against cancer. Oncotarget, 12(3), 230– 250. https://doi.org/10.18632/oncotarget.27870 Awad, R. M., De Vlaeminck, Y., Maebe, J., Goyvaerts, C., & Breckpot, K. (2018). Turn Back the TIMe: Targeting Tumor Infiltrating Myeloid Cells to Revert Cancer Progression. Frontiers İn İmmunology, 9, 1977. https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.01977 Azab, B., Bhatt, V. R., Phookan, J., Murukutla, S., Kohn, N., Terjanian, T., & Widmann, W. D. (2012). Usefulness of the neutrophil-to-lymphocyte ratio in predicting short- and long-term mortality in breast cancer patients. Annals Of Surgical Oncology, 19(1), 217–224. https://doi.org/10.1245/s10434-011- 1814-0 Baharom, F., Rankin, G., Blomberg, A., & Smed-Sörensen, A. (2017). Human Lung Mononuclear Phagocytes in Health and Disease. Frontiers İn İmmunology, 8, 499. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00499 Bailleux, C., Eberst, L., & Bachelot, T. (2021). Treatment strategies for breast cancer brain metastases. British Journal Of Cancer, 124(1), 142–155. https://doi.org/10.1038/s41416-020-01175-y Balkwill F. (2004). Cancer and the chemokine network. Nature Reviews. Cancer, 4(7), 540–550. https://doi.org/10.1038/nrc1388 70 Batlle, E., Clevers, H. (2017). Cancer stem cells revisited. Nat Med 23, 1124–1134. https://doi.org/10.1038/nm.4409 Bharat, A., Bhorade, S. M., Morales-Nebreda, L., McQuattie-Pimentel, A. C., Soberanes, S., Ridge, K., … Misharin, A. V. (2016). Flow Cytometry Reveals Similarities Between Lung Macrophages in Humans and Mice. American Journal Of Respiratory Cell And Molecular Biology, 54(1), 147–149. https://doi.org/10.1165/rcmb.2015-0147LE Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., & de Visser, K. E. (2018). Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms, 11(10), dmm036236. https://doi.org/10.1242/dmm.036236 Bottazzi, B., Polentarutti, N., Acero, R., Balsari, A., Boraschi, D., Ghezzi, P., Salmona, M., & Mantovani, A. (1983). Regulation of the macrophage content of neoplasms by chemoattractants. Science (New York, N.Y.), 220(4593), 210– 212. https://doi.org/10.1126/science.6828888 Bray, F., Ferlay, J., Soerjomataram, I., Siegel, R. L., Torre, L. A., & Jemal, A. (2018). Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal For Clinicians, 68(6), 394–424. https://doi.org/10.3322/caac.21492 Cacho-Díaz, B., García-Botello, D. R., Wegman-Ostrosky, T., Reyes-Soto, G., Ortiz- Sánchez, E., & Herrera-Montalvo, L. A. (2020). Tumor microenvironment differences between primary tumor and brain metastases. Journal Of Translational Medicine, 18(1), 1. https://doi.org/10.1186/s12967-019-02189-8 Cassetta, L., Noy, R., Swierczak, A., Sugano, G., Smith, H., Wiechmann, L., & Pollard, J. W. (2016). Isolation of Mouse and Human Tumor-Associated Macrophages. Advances İn Experimental Medicine And Biology, 899, 211– 229. https://doi.org/10.1007/978-3-319-26666-4_12 Cha, Y. J., & Koo, J. S. (2020). Role of Tumor-Associated Myeloid Cells in Breast Cancer. Cells, 9(8), 1785. https://doi.org/10.3390/cells9081785 Charmsaz, S., Collins, D. M., Perry, A. S., & Prencipe, M. (2019). Novel Strategies for Cancer Treatment: Highlights from the 55th IACR Annual Conference. Cancers, 11(8), 1125. https://doi.org/10.3390/cancers11081125 Chun, B.M., Page, D.B. & McArthur, H.L. (2019). Combination Immunotherapy Strategies in Breast Cancer. Curr Breast Cancer Rep 11, 228–240 https://doi.org/10.1007/s12609-019-00333-3 Cotechini, T., Atallah, A., & Grossman, A. (2021). Tissue-Resident and Recruited Macrophages in Primary Tumor and Metastatic Microenvironments: Potential Targets in Cancer Therapy. Cells, 10(4), 960. https://doi.org/10.3390/cells10040960 71 de Ronde JJ, Bonder MJ, Lips EH, Rodenhuis S, Wessels LF. (2014). Breast cancer subtype specific classifiers of response to neoadjuvant chemotherapy do not outperform classifiers trained on all subtypes. PloS One 2014; 9 (2): e88551. Dittmer, J., & Rody, A. (2013). Cancer stem cells in breast cancer. Histology and histopathology, 28(7), 827–838. https://doi.org/10.14670/HH-28.827 Dongre, A., Weinberg, R.A. (2019). New insights into the mechanisms of epithelial– mesenchymal transition and implications for cancer. Nat Rev Mol Cell Biol 20, 69–84. https://doi.org/10.1038/s41580-018-0080-4 Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., & Schreiber, R. D. (2002). Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape. Nature İmmunology, 3(11), 991–998. https://doi.org/10.1038/ni1102-991 Driessens, G., Kline, J., & Gajewski, T. F. (2009). Costimulatory and coinhibitory receptors in anti-tumor immunity. Immunological Reviews, 229(1), 126–144. https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2009.00771.x Eliyatkın, N., Yalçın, E., Zengel, B., Aktaş, S., & Vardar, E. (2015). Molecular Classification of Breast Carcinoma: From Traditional, Old-Fashioned Way to A New Age, and A New Way. The Journal Of Breast Health, 11(2), 59– 66. https://doi.org/10.5152/tjbh.2015.1669 Elliott, L. A., Doherty, G. A., Sheahan, K., & Ryan, E. J. (2017). Human Tumor- Infiltrating Myeloid Cells: Phenotypic and Functional Diversity. Frontiers İn İmmunology, 8, 86. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00086 Ferguson, L. P., Diaz, E., & Reya, T. (2021). The Role of the Microenvironment and Immune System in Regulating Stem Cell Fate in Cancer. Trends İn Cancer, 7(7), 624–634. https://doi.org/10.1016/j.trecan.2020.12.014 Fillmore, C. M., & Kuperwasser, C. (2008). Human breast cancer cell lines contain stem-like cells that self-renew, give rise to phenotypically diverse progeny and survive chemotherapy. Breast Cancer Research: BCR, 10(2), R25. https://doi.org/10.1186/bcr1982 Gabrilovich D. (2015). Fatal attraction: How macrophages participate in tumor metastases. The Journal Of Experimental Medicine, 212(7), 976. https://doi.org/10.1084/jem.2127insight1 Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., & Sistigu, A. (2021). The Immune Privilege of Cancer Stem Cells: A Key to Understanding Tumor Immune Escape and Therapy Failure. Cells, 10(9), 2361. https://doi.org/10.3390/cells10092361 72 Geissmann, F., Manz, M. G., Jung, S., Sieweke, M. H., Merad, M., & Ley, K. (2010). Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science (New York, N.Y.), 327(5966), 656–661. https://doi.org/10.1126/science.1178331 Goff, S. L., & Danforth, D. N. (2021). The Role of Immune Cells in Breast Tissue and Immunotherapy for the Treatment of Breast Cancer. Clinical Breast Cancer, 21(1), e63–e73. https://doi.org/10.1016/j.clbc.2020.06.011 Goswami, S., Sahai, E., Wyckoff, J. B., Cammer, M., Cox, D., Pixley, F. J., … Condeelis, J. S. (2005). Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Research, 65(12), 5278–5283. https://doi.org/10.1158/0008- 5472.CAN-04-1853 Guiu, S., Michiels, S., André, F., Cortes, J., Denkert, C., Di Leo, A., … & Reis-Filho, J. S. (2012). Molecular subclasses of breast cancer: how do we define them? The IMPAKT 2012 Working Group Statement. Annals Of Oncology : Official Journal Of The European Society For Medical Oncology, 23(12), 2997–3006. https://doi.org/10.1093/annonc/mds586 Ham, S., Lima, L. G., Lek, E., & Möller, A. (2020). The Impact of the Cancer Microenvironment on Macrophage Phenotypes. Frontiers İn İmmunology, 11, 1308. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01308 Hanahan D. (2022). Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discovery, 12(1), 31–46. https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-21-1059 Harbeck, N., Penault-Llorca, F., Cortes, J., Gnant, M., Houssami, N., Poortmans, P., … Cardoso, F. (2019). Breast cancer. Nature Reviews. Disease Primers, 5(1), 66. https://doi.org/10.1038/s41572-019-0111-2 Hiam-Galvez, K. J., Allen, B. M., & Spitzer, M. H. (2021). Systemic immunity in cancer. Nature Reviews. Cancer, 21(6), 345–359. https://doi.org/10.1038/s41568-021-00347-z Hiam-Galvez, K.J., Allen, B.M. & Spitzer, M.H. (2021). Systemic immunity in cancer. Nat Rev Cancer 21, 345–359 https://doi.org/10.1038/s41568-021-00347-z Hopkinson-Woolley, J., Hughes, D., Gordon, S., & Martin, P. (1994). Macrophage recruitment during limb development and wound healing in the embryonic and foetal mouse. Journal Of Cell Science, 107 (Pt 5), 1159–1167. https://doi.org/10.1242/jcs.107.5.1159 Hu, G., & Christman, J. W. (2019). Editorial: Alveolar Macrophages in Lung Inflammation and Resolution. Frontiers İn İmmunology, 10, 2275. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02275 73 Hu, P., Shen, M., Zhang, P., Zheng, C., Pang, Z., Zhu, L., & Du, J. (2015). Intratumoral neutrophil granulocytes contribute to epithelial-mesenchymal transition in lung adenocarcinoma cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 36(10), 7789–7796. https://doi.org/10.1007/s13277-015-3484-1 Hussell, T., & Bell, T. J. (2014). Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nature Reviews. Immunology, 14(2), 81–93. https://doi.org/10.1038/nri3600 Italiani, P., & Boraschi, D. (2014). From Monocytes to M1/M2 Macrophages: Phenotypical vs. Functional Differentiation. Frontiers In Immunology, 5, 514. https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00514 Jin, L., Han, B., Siegel, E., Cui, Y., Giuliano, A., & Cui, X. (2018). Breast cancer lung metastasis: Molecular biology and therapeutic implications. Cancer Biology & Therapy, 19(10), 858–868. https://doi.org/10.1080/15384047.2018.1456599 Kalluri, R., & Zeisberg, M. (2006). Fibroblasts in cancer. Nature Reviews. Cancer, 6(5), 392–401. https://doi.org/10.1038/nrc1877 Keibel, A., Singh, V., & Sharma, M. C. (2009). Inflammation, microenvironment, and the immune system in cancer progression. Current Pharmaceutical Design, 15(17), 1949–1955. https://doi.org/10.2174/138161209788453167 Kim, R., Emi, M., & Tanabe, K. (2007). Cancer immunoediting from immune surveillance to immune escape. Immunology, 121(1), 1–14. https://doi.org/10.1111/j.1365-2567.2007.02587.x Kitamura, T., Qian, B. Z., Soong, D., Cassetta, L., Noy, R., Sugano, G., … Pollard, J. W. (2015). CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. The Journal Of Experimental Medicine, 212(7), 1043–1059. https://doi.org/10.1084/jem.20141836 Kristiansen, G., Sammar, M., & Altevogt, P. (2004). Tumour biological aspects of CD24, a mucin-like adhesion molecule. Journal Of Molecular Histology, 35(3), 255–262. https://doi.org/10.1023/b:hijo.0000032357.16261.c5 Kumar, V., Patel, S., Tcyganov, E., & Gabrilovich, D. I. (2016). The Nature of Myeloid-Derived Suppressor Cells in the Tumor Microenvironment. Trends in Immunology, 37(3), 208–220. https://doi.org/10.1016/j.it.2016.01.004 Kursunel, M. A., & Esendagli, G. (2016). The untold story of IFN-γ in cancer biology. Cytokine & Growth Factor Reviews, 31, 73–81. https://doi.org/10.1016/j.cytogfr.2016.07.005 74 Kumamoto, K., Tasaki, T., Ohnishi, K., Shibata, M., Shimajiri, S., Harada, M., Komohara, Y., & Nakayama, T. (2021). CD169 Expression on Lymph Node Macrophages Predicts in patients with gastric cancer. Frontiers in oncology, 11, 636751. https://doi.org/10.3389/fonc.2021.636751 Lambert, A.W., Weinberg, R.A. (2021). Linking EMT programmes to normal and neoplastic epithelial stem cells. Nat Rev Cancer 21, 325–338. https://doi.org/10.1038/s41568-021-00332-6 Lan, H. R., Du, W. L., Liu, Y., Mao, C. S., Jin, K. T., & Yang, X. (2021). Role of immune regulatory cells in breast cancer: Foe or friend?. International İmmunopharmacology, 96, 107627. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2021.107627 Leek, R. D., Lewis, C. E., Whitehouse, R., Greenall, M., Clarke, J., & Harris, A. L. (1996). Association of macrophage infiltration with angiogenesis and prognosis in invasive breast carcinoma. Cancer Research, 56(20), 4625–4629. Lei, M., & Lee, T. (2021). Cancer Stem Cells: Emerging Key Players in Immune Evasion of Cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9, 692940. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.692940 Li, J., Qi, D., Hsieh, T. C., Huang, J. H., Wu, J. M., & Wu, E. (2021). Trailblazing perspectives on targeting breast cancer stem cells. Pharmacology & Therapeutics, 223, 107800. https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2021.107800 Li, O., Zheng, P., & Liu, Y. (2004). CD24 expression on T cells is required for optimal T cell proliferation in lymphopenic host. The Journal of Experimental Medicine, 200(8), 10831089. https://doi.org/10.1084/jem.20040779 Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., & Bureau, F. (2018). The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology, 330, 91–96. https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2018.02.001 Lim, S. C., & Oh, S. H. (2005). The role of CD24 in various human epithelial neoplasias. Pathology, Research and Practice, 201(7), 479–486. https://doi.org/10.1016/j.prp.2005.05.004 Lin, E. Y., & Pollard, J. W. (2007). Tumor-associated macrophages press the angiogenic switch in breast cancer. Cancer Research, 67(11), 5064–5066. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-07-0912 Lin, E. Y., Li, J. F., Bricard, G., Wang, W., Deng, Y., Sellers, R., Porcelli, S. A., & Pollard, J. W. (2007). Vascular endothelial growth factor restores delayed tumor progression in tumors depleted of macrophages. Molecular Oncology, 1(3), 288–302. https://doi.org/10.1016/j.molonc.2007.10.003 75 Lu, J., Cao, Q., Zheng, D., Sun, Y., Wang, C., Yu, X., … Wang, Y. (2013). Discrete functions of M2a and M2c macrophage subsets determine their relative efficacy in treating chronic kidney disease. Kidney International, 84(4), 745– 755. https://doi.org/10.1038/ki.2013.135 Ma, RY, Zhang, H., Li, XF, Zhang, CB, Selli, C., Tagliavini, G., … Qian, BZ (2020). Monocyte-derived macrophages promote breast cancer bone metastasis outgrowth. The Journal of Experimental Medicine, 217(11), e20191820. https://doi.org/10.1084/jem.20191820 Mantovani, A., Allavena, P., Sozzani, S., Vecchi, A., Locati, M., & Sica, A. (2004). Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Seminars in Cancer Biology, 14(3), 155–160. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2003.10.001 Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., & Locati, M. (2004). The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends in Immunology, 25(12), 677–686. https://doi.org/10.1016/j.it.2004.09.015 Markowitz, J., Wesolowski, R., Papenfuss, T., Brooks, T. R., & Carson, W. E. (2013). Myeloid-derived suppressor cells in breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment, 140(1), 13–21. https://doi.org/10.1007/s10549-013-2618-7 Martinez, F. O., & Gordon, S. (2014). The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000prime Reports, 6, 13. https://doi.org/10.12703/P6-13 Marvel, D., & Gabrilovich, D. I. (2015). Myeloid-derived suppressor cells in the tumor microenvironment: expect the unexpected. The Journal of Clinical Investigation, 125(9), 3356–3364. https://doi.org/10.1172/JCI80005 Mass, E., Ballesteros, I., Farlik, M., Halbritter, F., Günther, P., Crozet, L., … Geissmann, F. (2016). Specification of tissue-resident macrophages during organogenesis. Science (New York, N.Y.), 353(6304), aaf4238. https://doi.org/10.1126/science.aaf4238 Matsushima, K., Larsen, C. G., DuBois, G. C., & Oppenheim, J. J. (1989). Purification and characterization of a novel monocyte chemotactic and activating factor produced by a human myelomonocytic cell line. The Journal of Experimental Medicine, 169(4), 1485–1490. https://doi.org/10.1084/jem.169.4.1485 Medeiros, B., & Allan, A. L. (2019). Molecular Mechanisms of Breast Cancer Metastasis to the Lung: Clinical and Experimental Perspectives. International Journal of Molecular Sciences, 20(9), 2272. https://doi.org/10.3390/ijms20092272 76 Mınkyu Kım, Jısoo Park, Mehdı Bouhaddou, Kyumın Kım, Ajda Rojc, Maya Modak, Margaret Soucheray, Mıchael J. Mcgregor, Patrıck O’leary, Denıse Wolferıca Stevensontzeh Keong Foo, Domınıque Mıtchell, Karı A. Herrıngton, Denıse P. Muñoz, Berıl Tutuncuoglu, Kueı-Ho Chen, Fan Zheng, Jason F. Kreısberg, Morgan E. Dıolaıtı, John D. Gordan, Jean-Phılıppe Coppé, Danıelle L. Swaney, Bıng Xıa, Laura Van ’T Veeralan Ashworth, Trey Ideker And Nevan J. Krogan (2021). A protein interaction landscape of breast cancer. Sciens, Vol 374, Issue 6563. https://doi.org/10.1126/science.abf3066 Mlecnik, B., Tosolini, M., Kirilovsky, A., Berger, A., Bindea, G., Meatchi, T., Bruneval, P., Trajanoski, Z., Fridman, W. H., Pagès, F., & Galon, J. (2011). Histopathologic-based prognostic factors of colorectal cancers are associated with the state of the local immune reaction. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology, 29(6), 610–618. https://doi.org/10.1200/JCO.2010.30.5425 Munir, M. T., Kay, M. K., Kang, M. H., Rahman, M. M., Al-Harrasi, A., Choudhury, M., Moustaid-Moussa, N., Hussain, F., & Rahman, S. M. (2021). Tumor- Associated Macrophages as Multifaceted Regulators of Breast Tumor Growth. International Journal of Molecular Sciences, 22(12), 6526. https://doi.org/10.3390/ijms22126526 Murciano-Goroff, Y. R., Warner, A. B., & Wolchok, J. D. (2020). The future of cancer immunotherapy: microenvironment-targeting combinations. Cell Research, 30(6), 507–519. https://doi.org/10.1038/s41422-020-0337-2 Najafi, M., Hashemi Goradel, N., Farhood, B., Salehi, E., Nashtaei, M. S., Khanlarkhani, N., … Mortezaee, K. (2019). Macrophage polarity in cancer: A review. Journal of Cellular Biochemistry, 120(3), 2756–2765. https://doi.org/10.1002/jcb.27646 Nielsen, T. O., Hsu, F. D., Jensen, K., Cheang, M., Karaca, G., Hu, Z., … Perou, C. M. (2004). Immunohistochemical and clinical characterization of the basal- like subtype of invasive breast carcinoma. Clinical Cancer Research: an Official Journal of the American Association for Cancer Research, 10(16), 5367–5374. https://doi.org/10.1158/1078 Obeid, E., Nanda, R., Fu, Y. X., & Olopade, O. I. (2013). The role of tumor-associated macrophages in breast cancer progression (review). International Journal of Oncology, 43(1), 5–12. https://doi.org/10.3892/ijo.2013.1938 Ohama, H., Asai, A., Ito, I., Suzuki, S., Kobayashi, M., Higuchi, K., & Suzuki, F. (2015). M2b macrophage elimination and improved resistance of mice with chronic alcohol consumption to opportunistic infections. The American Journal of Pathology, 185(2), 420–431. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2014.09.022 77 Ohshika, S., Saruga, T., Ogawa, T., Ono, H., & Ishibashi, Y. (2021). Distinction between benign and malignant soft tissue tumors based on an ultrasonographic evaluation of vascularity and elasticity. Oncology Letters, 21(4), 281. https://doi.org/10.3892/ol.2021.12542 Olingy, C. E., Dinh, H. Q., & Hedrick, C. C. (2019). Monocyte heterogeneity and functions in cancer. Journal of Leukocyte Biology, 106(2), 309–322. https://doi.org/10.1002/JLB.4RI0818-311R Oliveira, L. R., Jeffrey, S. S., & Ribeiro-Silva, A. (2010). Stem cells in human breast cancer. Histology and Histopathology, 25(3), 371–385. https://doi.org/10.14670/HH-25.371 Qian, B., Deng, Y., Im, J. H., Muschel, R. J., Zou, Y., Li, J., …& Pollard, J. W. (2009). A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PloS One, 4(8), e6562. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006562 Patysheva, M., Larionova, I., Stakheyeva, M., Grigoryeva, E., Iamshchikov, P., Tarabanovskaya, N., … Kzhyshkowska, J. (2022). Effect of Early-Stage Human Breast Carcinoma on Monocyte Programming. Frontiers in Oncology, 11, 800235. https://doi.org/10.3389/fonc.2021.800235 Peranzoni, E., Lemoine, J., Vimeux, L., Feuillet, V., Barrin, S., Kantari-Mimoun, Damotte, C., … Donnadieu, E. (2018). Macrophages impede CD8 T cells from reaching tumor cells and limit the efficacy of anti-PD-1 treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 115(17), E4041–E4050. https://doi.org/10.1073/pnas.1720948115 Perou CM, Sorlie T, Eisen MB, van de Rijn M, Jeffrey SS, Rees CA. (2000). Molecular portraits of human breast tumours. Nature;406 (6797):747-52. Petersen, O. W., & Polyak, K. (2010). Stem cells in the human breast. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2(5), a003160. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a003160 Pietras, K., & Ostman, A. (2010). Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research, 316(8), 1324–1331. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2010.02.045 Pollock, K., Albares, L., Wendt, C., & Hubel, A. (2013). Isolation of fibroblasts and epithelial cells in bronchoalveolar lavage (BAL). Experimental Lung Research, 39(3), 146–154. https://doi.org/10.3109/01902148.2013.781720 Polyak K. (2007). Breast cancer: origins and evolution. The Journal of Clinical Investigation, 117(11), 3155–3163. https://doi.org/10.1172/JCI33295 78 Potemski, P., Kusinska, R., Watala, C., Pluciennik, E., Bednarek, A. K., & Kordek, R. (2005). Prognostic relevance of basal cytokeratin expression in operable breast cancer. Oncology, 69(6), 478–485. https://doi.org/10.1159/000090986 Pucci, C., Martinelli, C., & Ciofani, G. (2019). Innovative approaches for cancer treatment: current perspectives and new challenges. Ecancermedicalscience, 13, 961. https://doi.org/10.3332/ecancer.2019.961 Qian, B. Z., Li, J., Zhang, H., Kitamura, T., Zhang, J., Campion, L. R., Kaiser, E. A., Snyder, L. A., & Pollard, J. W. (2011). CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature, 475(7355), 222–225. https://doi.org/10.1038/nature10138 Rakha EA, Putti TC, Abd El-Rehim DM, Paish C, Green AR, Powe DG, (2006). Morphological and immunophenotypic analysis of breast carcinomas with basal and myoepithelial differentiation. The Journal of Pathology.;208 (4):495-506. Rakha, E. A., & Ellis, I. O. (2009). Triple-negative/basal-like breast cancer: review. Pathology, 41(1), 40–47. https://doi.org/10.1080/00313020802563510 Riabov, V., Gudima, A., Wang, N., Mickley, A., Orekhov, A., & Kzhyshkowska, J. (2014). Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology, 5, 75. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00075 Ricardo, S., Vieira, A. F., Gerhard, R., Leitão, D., Pinto, R., Cameselle-Teijeiro, J. F. … Paredes, J. (2011). Breast cancer stem cell markers CD44, CD24 and ALDH1: expression distribution within intrinsic molecular subtype. Journal of Clinical Pathology, 64(11),937–946. https://doi.org/10.1136/jcp.2011.090456 Roche J. (2018). The Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Cancers, 10(2), 52. https://doi.org/10.3390/cancers10020052 S. Caspar-Bauguil, B. Cousin, S. Bour, L. Castiella, L. Penicaud and C. Carpéné. (2009). Adipose tissue lymphocytes: types and roles. J Physiol Biochem, 65 (4), 423-436. https://doi.org/10.1007/BF03185938 Shaul, M. E., & Fridlender, Z. G. (2019). Tumour-associated neutrophils in patients with cancer. Nature reviews. Clinical Oncology, 16(10), 601–620. https://doi.org/10.1038/s41571-019-0222-4 Shou, D., Wen, L., Song, Z., Yin, J., Sun, Q., & Gong, W. (2016). Suppressive role of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) in the microenvironment of breast cancer and targeted immunotherapies. Oncotarget, 7(39), 64505–64511. https://doi.org/10.18632/oncotarget.11352 79 Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., & Jemal, A. (2022). Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 72(1), 7–33. https://doi.org/10.3322/caac.21708 Smid, M., Wang, Y., Zhang, Y., Sieuwerts, A. M., Yu, J., Klijn, J. G., …Martens, J. W. (2008). Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research, 68(9), 3108–3114. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-07- 5644 Sørlie, T., Perou, C. M., Tibshirani, R., Aas, T., Geisler, S., Johnsen, H., …& Børresen-Dale, A. L. (2001). Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98(19), 10869– 10874. https://doi.org/10.1073/pnas.191367098 Stanton, S. E., Adams, S., & Disis, M. L. (2016). Variation in the Incidence and Magnitude of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Breast Cancer Subtypes: A Systematic Review. JAMA Oncology, 2(10), 1354–1360. https://doi.org/10.1001/jamaoncol.2016.1061 Stewart, D. A., Yang, Y., Makowski, L., & Troester, M. A. (2012). Basal-like breast cancer cells induce phenotypic and genomic changes in macrophages. Molecular Cancer Research: MCR, 10(6), 727–738. https://doi.org/10.1158/1541-7786.MCR-11-0604 Sung, H., Ferlay, J., Siegel, R. L., Laversanne, M., Soerjomataram, I., Jemal, A., & Bray, F. (2021). Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 71(3), 209–249. https://doi.org/10.3322/caac.21660 Tan, B., Shi, X., Zhang, J., Qin, J., Zhang, N., Ren, H., … Liu, M. (2018). Inhibition of Rspo-Lgr4 Facilitates Checkpoint Blockade Therapy by Switching Macrophage Polarization. Cancer Research, 78(17), 4929–4942. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-0152 Valentin, M. D., da Silva, S. D., Privat, M., Alaoui-Jamali, M., & Bignon, Y. J. (2012). Molecular insights on basal-like breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment, 134(1), 21–30. https://doi.org/10.1007/s10549-011-1934-z Vassilopoulos, A., Chisholm, C., Lahusen, T., Zheng, H., & Deng, C. X. (2014). A critical role of CD29 and CD49f in mediating metastasis for cancer- initiating cells isolated from a Brca1-associated mouse model of breast cancer. Oncogene, 33(47), 5477–5482. https://doi.org/10.1038/onc.2013.516 80 Visvader, J. E., & Lindeman, G. J. (2006). Mammary stem cells and mammopoiesis. Cancer Research, 66(20), 9798–9801. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-06-2254 Walcher, L., Kistenmacher, A. K., Suo, H., Kitte, R., Dluczek, S., Strauß, A., … Kossatz-Boehlert, U. (2020). Cancer Stem Cells-Origins and Biomarkers: Perspectives for Targeted Personalized Therapies. Frontiers in Immunology, 11, 1280. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.01280 Woo, Y. D., Jeong, D., & Chung, D. H. (2021). Development and Functions of Alveolar Macrophages. Molecules and Cells, 44(5), 292–300. https://doi.org/10.14348/molcells.2021.0058 Wu, L., & Zhang, X. H. (2020). Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages- Heterogenous but Not Chaotic. Frontiers in Immunology, 11, 553967. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.553967 Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., … Condeelis, J. (2007). Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Research, 67(6), 2649–2656. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-06-1823 Xue, J., Schmidt, S. V., Sander, J., Draffehn, A., Krebs, W., Quester, I., … Schultze, J. L. (2014). Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity, 40(2), 274–288. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2014.01.006 Yang, J., Liao, D., Chen, C., Liu, Y., Chuang, T. H., Xiang, R., …Luo, Y. (2013). Tumor-associated macrophages regulate murine breast cancer stem cells through a novel paracrine EGFR/Stat3/Sox-2 signaling pathway. Stem Cells (Dayton, Ohio), 31(2), 248–258. https://doi.org/10.1002/stem.1281 Yang, M., Ma, B., Shao, H., Clark, A. M., & Wells, A. (2016). Macrophage phenotypic subtypes diametrically regulate epithelial-mesenchymal plasticity in breast cancer cells. BMC Cancer, 16, 419. https://doi.org/10.1186/s12885-016-2411- 1 Ye, Y., Xu, C., Chen, F., Liu, Q., & Cheng, N. (2021). Targeting Innate Immunity in Breast Cancer Therapy: A Narrative Review. Frontiers in Immunology, 12, 771201. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.771201 Yoyen-Ermis, D., Tunali, G., Tavukcuoglu, E., Horzum, U., Ozkazanc, D., Sutlu, T., …& Esendagli, G. (2019). Myeloid maturation potentiates STAT3-mediated atypical IFN-γ signaling and upregulation of PD-1 ligands in AML and MDS. Scientific Reports, 9(1), 11697. https://doi.org/10.1038/s41598-019- 48256-4 81 Yongli Yao, Xiang-Hong Xu and Liping Jin (2019). Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Fronties in immunology. 10:792. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00792 Yousefi, M., Nosrati, R., Salmaninejad, A., Dehghani, S., Shahryari, A., & Saberi, A. (2018). Organ-specific metastasis of breast cancer: molecular and cellular mechanisms underlying lung metastasis. Cellular Oncology (Dordrecht), 41(2), 123–140. https://doi.org/10.1007/s13402-018-0376-6 Yu, Y. R., Hotten, D. F., Malakhau, Y., Volker, E., Ghio, A. J., Noble, P. W., … Tighe, R. M. (2016). Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 54(1), 13–24. https://doi.org/10.1165/rcmb.2015- 0146OC Zhang, B., Cao, M., He, Y., Liu, Y., Zhang, G., Yang, C., … Gao, F. (2017). Increased circulating M2-like monocytes in patients with breast cancer. Tumour Biology: The Journal of The International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, 39(6), 1010428317711571. https://doi.org/10.1177/1010428317711571 Zhang, Q., Le, K., Xu, M., Zhou, J., Xiao, Y., Yang, W., Jiang, Y., Xi, Z., & Huang, T. (2019). Combined MEK inhibition and tumor-associated macrophages depletion suppresses tumor growth in a triple-negative breast cancer mouse model. International Immunopharmacology, 76, 105864. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2019.105864 Zhang, X. M., Chen, D. G., Li, S. C., Zhu, B., & Li, Z. J. (2021). Embryonic Origin and Subclonal Evolution of Tumor-Associated Macrophages Imply Preventive Care for Cancer. Cells, 10(4), 903. https://doi.org/10.3390/cells10040903 Zhang, X., Powell, K., & Li, L. (2020). Breast Cancer Stem Cells: Biomarkers, Identification and Isolation Methods, Regulating Mechanisms, Cellular Origin, and Beyond. Cancers, 12(12), 3765. https://doi.org/10.3390/cancers12123765 Zhao, Z., Zheng, L., Chen, W., Weng, W., Song, J., & Ji, J. (2019). Delivery strategies of cancer immunotherapy: recent advances and future perspectives. Journal of Hematology & Oncology, 12(1), 126. https://doi.org/10.1186/s13045-019- 0817-3 Zheng, Q., Zhang, M., Zhou, F., Zhang, L., & Meng, X. (2021). The Breast Cancer Stem Cells Traits and Drug Resistance. Frontiers in Pharmacology, 11, 599965. https://doi.org/10.3389/fphar.2020.599965 Zhou, J., Chen, Q., Zou, Y., Chen, H., Qi, L., & Chen, Y. (2019). Stem Cells and Cellular Origins of Breast Cancer: Updates in the Rationale, 82 Controversies, and Therapeutic Implications. Frontiers in Oncology, 9, 820. https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00820 Zhu, Y., Herndon, J. M., Sojka, D. K., Kim, K. W., Knolhoff, B. L., Zuo, C., … DeNardo, D. G. (2017). Tissue-Resident Macrophages in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Originate from Embryonic Hematopoiesis and Promote Tumor Progression. Immunity, 47(2), 323–338.e6. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2017.07.014 83 7. SİMGELER VE KISALTMALAR ACS Amerikan kanser topluluğu ALDH1 Aldehit dehidrojenaz 1 Al-Maq Alveolar Makrofaj Breg Düzenleyici B hücre CTLA-4 Bağışıklık kontrol noktası inhibitör-4 CSF-1 Makrofaj koloni uyarıcı faktör-1 CFSE Karboksifloresan Süksinimidil Ester CD8+ Sitotoksik T lenfositler DKİS Duktal karsinoma in situ EMT Epitelden mezenkima geçiş ER Östrojen reseptör EGF Epidermal büyüme faktörü GEP Gen ekspresyon profilin GM-CSF Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör HER2 İnsan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 IL-2 İnterlökin-2 IL-4 İnterlökin-4 IL-10 İnterlökin-10 IL-13 İnterlökin-13 IFNγ İnterferon gamma İARC Uluslararası kanser araştırma derneği 84 İNOS İndüklenebilir nitrik oksit sentaz MDSC Miyeloid-kökenli baskılayıcı hücreler mDC Miyeloid dendritik hücre MSC Mezenkimal kök hücre MET Mezenkimal epitelyal geçiş MMP9 Matris metalloproteinaz 9 NET Nötrofil hücre dışı tuzakları NK Doğal öldürücü hücreler NK T Doğal öldürücü T hücreler NKreg Düzenleyici doğal öldürücü hücre NO Nitrik oksit PBS Fosfat tamponlanmış tuz çözeltisi PMA Forbol 12-Miristat 13- Asetat PD-L1 Programlanmış ölüm ligandı 1 PD-L2 Programlanmış ölüm ligandı 2 PARP Poli-ADP-riboz polimeraz inhibitörleri PDGF Trombosit kaynaklı büyüme faktörü PR Progesteron reseptör SIRP-a Sinyal düzenleyici protein alfa TAN Tümör ilişkili nötrofiller TAM Tümör ilişkili makrofajlar tDC Tolerojenik dendritik hücre TNBC Üçlü negatif meme kanseri TNF Tümör nekroz faktör 85 TGF-β Dönüştürücü büyüme faktörü-β Treg Düzenleyici T hücreler TRAIL Tümör nekroz faktörü ile ilişkili apoptozu indükleyen ligand TLR Toll benzeri reseptör VEGF Vasküler endotelyal büyüme faktörü WHO Dünya sağlık örgütü 3E Eleminasyon, Denge, Kaçış 86 8. EKLER Bu çalışma hücre hatları ile gerçekleştirildiği ve ilgili tüm tablo, şekil vb. dökümanlar metin içerinde kullanıldığı için bu bölüme bir belge konulmamıştır. 87 9. TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca bana hep destek olan, bilgi birikimi ile bana yol gösteren ve kendimi geliştirmem için beni hep cesaretlendiren ve içtenlikle destekleyen, bunun yanı sıra tedavi sürecimde de yanımda olan ve benim için bir hocadan çok öte danışmanım Sayın Prof. Dr. Haluk Barbaros Oral hocama en içten duygularla teşekkürü bir borç bilirim. Hem hoca olarak bilgilerinden yararlandığım hem de yeri geldiğinde bir arkadaş gibi dertlerimizi paylaşabildiğimiz, kariyerimde ufkumu açan ve beni hayatım boyunca çalışacağım alana yönlendiren ve o alanı sevdiren, yakın zamanda öğrendiğim ve hayatımda aklımın ucundan dahi geçmeyecek olan bir hastalığımın olduğunu öğrendikten sonra bu hastalıkla nasıl başa çıkacağımı bilmiyor iken beni yönlendiren belki de daha uzun süre bu dünyada yaşamaya devam etmemi sağlayan teşhis tanı ve tedavi süreçlerinde hep yanımda olan Sayın Dr. Öğr. Üyesi Diğdem Yöyen Ermiş hocama en içten teşekkürlerimi sunarım. Bana her zaman destek olan, zor zamanlarımda yanımdan ayrılmayan çalışma arkadaşlarım ve dostlarım Fatma Dombaz, Mehmet Karaçay ve Gözde Arslan’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ameliyatım sırasında bana hep destek ve moral kaynağı olan Diğdem Yöyen Ermiş, Haluk Barbaros Oral, Arzu Yılmaz Oral, Salih Haldun Bal, Esra Gülderen, Bahar Dakiki, Ekin Başpınar, Fatma Dombaz, Mehmet Karaçay, Gözde Arslan, Erkan Ermiş ve İmmünoloji Ailesine sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Her zaman beni seven, hep destekleyen, yaşamım boyunca en büyük moral kaynağım olan değerli canım anneme, babama ve kardeşlerime yürekten teşekkür ederim. Onur ETGÜ 25/06/2022 88 10. ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Onur ETGÜ Doğum Yeri ve Tarihi : Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lisans : Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü (2015-2019) Yüksek Lisans : Bursa Uludağ Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıp-İmmünoloji Anabilim Dalı (2019-Halen) İletişim (e-posta) : e Adres : Projeler Diğdem Yöyen-Ermiş, Haluk Barbaros Oral, Ferah Budak, Emin Halis Akalın, Salih Haldun Bal, Ali Asan, Eren Çağan. “COVID-19 Pozitif Hastalarda Miyeloid Hücre Alt-Gruplarındaki Değişimlerin Efektif Anti-Viral İmmün Yanıt Üzerine Etkileri Ve Biyobelirteç Olarak Kullanımı” TUBİTAK 1001 (01.09.2020-01.06.2021 Tarihleri arasında proje bursiyeri olarak görev aldım) Ödüller En iyi sözel sunum bildiri 3.lük ödülü. Arslan G., Karaçay M., Çelik E., Yumuşak E., Etgü O., Dombaz F., Dündar F., Yoyen-Ermis D., Ersoy F., Oral-Yilmaztepe A., Akkoç A., Sütlü T., Yalçın M., Oral H.B., Çoklu Gen Modifikasyonu İle Tolerans İndükleyici Hale Getirilmiş Dendritik Hücreleri İle Deneysel Allerjik Ensefalomiyelit Tedavisi: Ms Tedavisi İçin Yeni Bir Yaklaşım.12.Klinik Nöroimmünoloji Sempozyumu 12-15 Mayıs 2022 (Sözlü Sunum) Ulusal Kongre-Sözlü Sunum Yoyen-Ermis D., Dombaz F., Karacay M., Etgü O., Cagan E., Asan A., Kızmaz M.A., Simsek A., Karaca M., Arslan G., Pınar İ.E., Bal S.H., Özkocaman V., Özkalemkaş F., Akalın E.H., Budak F., Oral H.B., Çocuk ve Erişkin COVID-19 Pozitif Hastalarda Miyeloid Kökenli Baskılayıcı Hücre (MDSC) Kompozisyonunun Fenotipik ve Fonksiyonel Farklılıklarının Hastalık Seyri ile İlişkisi. XII. Aziz Sancar DETAE Günleri 10-11 Aralık 2020, Türkiye. Arslan G., Karaçay M., Çelik E., Yumuşak E., Etgü O., Dombaz F., Dündar F., Yoyen- Ermis D., Ersoy F., Oral-Yilmaztepe A., Akkoç A., Sütlü T., Yalçın M., Oral H.B., Çoklu Gen Modifikasyonu İle Tolerans İndükleyici Hale Getirilmiş Dendritik Hücreleri İle Deneysel Allerjik Ensefalomiyelit Tedavisi: Ms Tedavisi İçin Yeni Bir Yaklaşım.12.Klinik Nöroimmünoloji Sempozyumu 12-15 Mayıs 2022 (Sözlü Sunum) (En iyi 3. Sözel sunum bildiri ödülü) 89 Arslan G., Karaçay M., Çelik E., Yumuşak E., Etgü O., Dombaz F., Dündar F., Yoyen- Ermis D., Ersoy F., Oral-Yilmaztepe A., Akkoç A., Sütlü T., Yalçın M.,Oral H.B., Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (Eae) Fare Modelinde Farklı Yaklaşımlarla Oluşturulan Tolerojenik Dendritik Hücre Bazlı Tedavilerin Monositik/Granülositik ve T Hücre Yanıtları Üzerine Etkileri12.Klinik Nöroimmünoloji Sempozyumu 12-15 Mayıs 2022 (Sözlü Sunum) Yoyen-Ermis D., Dombaz F., Kızmaz M.A., Simsek A., Cagan E., Asan A., Karacay M., Etgü O., Karaca M., Arslan G., Pınar İ.E., Bal S.H., Özkocaman V., Özkalemkaş F., Akalın E.H., Budak F., Oral H.B., Covid-19 Pozı̇tı̇f Hastalarda Matür Monosı̇t ve/veya Nötrofı̇l Alt-Tı̇plerı̇ Ve İmmatür PMN-MDSC, M-MDSC ve/veya E-MDSC- Benzerı̇ Alt-Gruplarinin İncelenmesı̇ ve Hastalik Düzeyı̇ İle Değı̇şı̇mlerı̇n Değerlendı̇rı̇lmesı̇. XXV. Ulusal İmmünoloji Kongresi, 20-22 Kasım 2020, Türkiye. Uluslararası Kongre-Sözlü Sunum Yoyen-Ermis D., Dombaz F., Karacay M., Etgü O., Kızmaz M.A., Simsek A., Cagan E., Asan A., Yılmaz E., Kazak E., Pınar İ.E., Bal S.H., Arslan G., Karaca M., Özkocaman V., Özkalemkaş F., Akalın E.H., Budak F., Oral H.B., The distribution of mature and/or immature myeloid cells and their role in effective anti-viral immune responses in COVID-19 positive patients. 6th European Congress of Immunology,1-4 September 2021 Virtual Congress. Ulusal Kongre-Poster Sunum Karaca M., Simsek A., Etgu O., Dombaz F., Macuncuoglu A.C., Dirican M., Budak F., Oral H.B., Ortalama Floresan Yoğunluğu Yüksek Olan Negatı̇f PRA Testı̇ Sonuçlarının Karacı̇ğer İle İlı̇şkı̇sı̇nı̇n Değerlendı̇rı̇lmesı̇ XXV. Ulusal İmmünoloji Kongresi, 20-22 Kasım, Türkiye. Yoyen-Ermis D., Karacay M., Etgü O., Karaca M., Arslan G., Dombaz F., Kızmaz M.A., Simsek A., Cagan E., Asan A., Pınar İ.E., Bal S.H., Özkocaman V., Özkalemkaş F., Akalın E.H., Budak F., Oral H.B., COVID-19 Pozı̇tı̇f Hastalardakı̇ Granülosı̇tı̇k- Benzerı̇ Mı̇yeloı̇d Kökenlı̇ Baskılayıcı Hücrelerı̇n (PMN-MKBH) Baskılama Kapası̇te Farklılıklarının Araştırılması XXV. Ulusal İmmünoloji Kongresi, 20-22 Kasım, Türkiye. Yoyen-Ermis D., Arslan G., Karacay M., Karaca M., Dombaz F., Etgü O., Kızmaz M.A., Simsek A., Cagan E., Asan A., Pınar İ.E., Bal S.H., Özkocaman V., Özkalemkaş F., Akalın E.H., Budak F., Oral H.B., COVID-19 Pozitif Hastaların Farklı Yaş Grubu Dağılımındaki Hücre Proliferasyonlarının Değerlendirilmesi. XXV. Ulusal İmmünoloji Kongresi, 20-22 Kasım, Türkiye. Yoyen-Ermis D., Etgü O., Dombaz F., Karacay M., Pınar İ.E., Kızmaz M.A., Simsek A., Cagan E., Asan A., Karaca M., Arslan G., Bal S.H., Özkocaman V., Özkalemkaş F., Akalın E.H., Budak F., Oral H.B., SARS-COV2 İlı̇şkı̇lı̇ İmmün Yanıtta Perı̇ferı̇k Kan Mı̇yeloı̇d Serı̇ Hücrelerı̇nı̇n Olgunlaşma Düzeylerı̇, Reaktı̇f Oksı̇jen Türlerı̇ (ROS) 90 ve Nı̇trı̇k Oksı̇t (NO) Üretme Kapası̇tesı̇. XXV. Ulusal İmmünoloji Kongresi, 20-22 Kasım, Türkiye. Uluslararası Kongre-Poster Sunum Dombaz F., Karacay M., Etgü O., Kızmaz M.A., Simsek A., Cagan E., Pınar İ.E., Bal S.H., Özkocaman V., Özkalemkaş F., Budak F., Oral H.B., Yoyen-Ermis D., Phenotypes and Functions of Low(er)-Density Neutrophils (LDNs) in Early Childhood and Children. 6th European Congress of Immunology,1-4 September 2021 Virtual Congress. Etgü O., Karacay M., Dombaz F., Kızmaz M.A., Simsek A., Asan A., Yılmaz E., Kazak E., Pınar İ.E., Bal S.H., V., Özkalemkaş F., Akalın E.H., Budak F., Oral H.B., Yoyen-Ermis D., Macrophage Polarization Capacity of Peripheral Blood Monocytes and Monocytic Cell Line THP-1 in Response to Secreted Factors From COVID-19 Patients. 6th European Congress of Immunology,1-4 September 2021 Virtual Congress. Arslan G., Karacay M., Guvenc-Bayram G., Ozoglu E., Dombaz F., Etgu O., Yumusak E., Yoyen-Ermis D., Akkoc A., Yalcın M., Oral H.B., Evaluation of Some Blood Parameters and Percentage of CD4+ or CD8+ T Cells from Spleen and Liver from The Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model. 6th European Congress of Immunology,1-4 September 2021 Virtual Congress. Karacay M., Arslan G., Guvenc-Bayram G., Dombaz F., Etgu O., Yumusak E., Yoyen- Ermis D., Akkoc A., Yalcın M., Oral H.B., Evaluation of Monocytic/Granulocytic Cells from Spleen and Liver in The Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model. 6th European Congress of Immunology,1-4 September 2021 Virtual Congress. 91