137 J Fac Vet Med 20 (2001) 137-145 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Pcr) ve Bazı Tavuk İnfeksiyonlarındaki Yeri Vildan CANER* K. Tayfun ÇARLI** Geliş Tarihi: 17.07.2000 Özet: Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); günümüzde önemli bakteriyel, viral ve mikotik infeksiyonların tanısında, etkenlerin karakterizasyonunda, hastalıkların patogenezisinin belirlenmesinde ve aşı hazırlanmasında büyük uygulama alanı bulan bir nükleik asit teknolojisi yöntemidir. PCR ile infeksiyöz etkenlere ait bazı spesifik gen segmentlerinin in vitro amplifikasyonu yapılmaktadır. Bu derlemede, PCR’ın bazı kanatlı infeksiyonlarının tanısındaki yeri tartışılmaktadır. Anahtar Kelimeler: Polimeraz Zincir Reaksiyonu, tavuk infeksiyonları Polymerase Chain Reaction (PCR) and its Applications to Some Avian Infectious Diseases Summary: Polymerase chain reaction (PCR) is one of the nucleic acid technology methods, which is widely used for diagnosis of bacterial, viral and mycotic infections, characterization of the agents, elucidating the pathogenesis of the diseases, and predicting the vaccine strains of some special organisms. In vitro amplifications of some specific gene segments belonging to infectious agents were performed by PCR. In this review, some important implementations of PCR into diagnosis of avian infections are discussed. Key Words: Polymerase Chain Reaction, avian infectious diseases Giriş eden kovalent fosfodiester bağları ile birleşerek polinükleotid zincirleri meydana getirir. Bir DNA Deoksiribonükleik asit (DNA), baz çiftleri molekülü, birbirine sarmal şekilde bağlanan ve ve şeker-fosfat omurgası olmak üzere iki birbirinin tamamlayıcısı olan antiparalel iki bölümden oluşmaktadır. DNA molekülünde yer polinükleotid zincirden oluşur. Tipik bir hayvan alan bazlar pirimidin (Sitozin ve Timin) ve pürin hücresi yaklaşık 3 X109 nükleotidden meydana (Adenin ve Guanin) bazlarıdır. Normal DNA gelen bir DNA’ya sahiptir. DNA molekülünün yapısında Guanin (G) - Sitozin (C) çifti Adenin her bir helikal dönüşünde yaklaşık 10 nükleotid (A) - Timin (T) çifti ile yaklaşık aynı büyüklükte bazı vardır ve 3.4 mm uzunluğundadır1,2. olmasının yanı sıra, G her zaman C ile A de T ile DNA molekülünde spiral şeklindeki bir eşleşir. Pirimidin veya pürin bazlarından biri ile iplikçik, karşılıklı bazlar arasında non-kovalent pentoz şekerinin birleştiği yapı “nükleosid” hidrojen bağları (A ve T iki hidrojen bağı ile, G olarak adlandırılır. Nükleosidlerin fosfat ve C üç hidrojen bağı ile birbirlerine bağlanır) ile molekülü ile birleşerek oluşturduğu birleşiğe de diğer iplikçiğe bağlanır. Hidrojenin oksijen ve “nükleotid” adı verilmektedir. Yan yana bulunan nitrojen gibi elektro-negatif atomlara bağlandığı nükleotidler, bir nükleotidin 5’karbon ucundan zaman pozitif akıma doğru yönelmesi sonucu diğer nükleo-tidin 3’karbon ucuna kadar devam oluşan hidrojen bağları, şeker fosfat omurgasının * Araş. Gör.; U.Ü. Vet. Fak., Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bursa-TÜRKİYE ** Prof. Dr.; U.Ü., Vet. Fak., Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bursa-TÜRKİYE 138 kovalent fosfodiester bağlarının yaklaşık 1/10 4. Taq polimeraz: Doğal olarak Thermus gücüne sahiptir. Bu özellik, DNA’nın double aquaticus bakterisinin polimeraz enzimidir. helix yapısında tek bir iplikçiğe zarar vermeksizin Yapay olarak rekombinant yapıda olanları da iplikçiklerin birbirinden ayrılmalarını sağlar2. vardır. Molekül ağırlığı 94 kDa’dur. Sıcaklığa DNA’nın temel fiziko-kimyasal dayanıklıdır ve 95°C’de yarılanma ömrü 40 davranışlarından yararlanılarak geliştirilen DNA- dakikadır. Bu nedenle DNA denaturasyonunda tabanlı testlerden biri olan PCR, ilk kez 1985 yıkımlanmaz. Her PCR için genellikle 2 ünite yılında Kary Mullis tarafından uygulandığı yeterlidir. bildirilmektedir. PCR, bilinen iki DNA dizisi 5. Buffer: Polimeraz aktivitesi için ortam pH’sı arasındaki gen segmentlerini amplifiye etmek için ve bivalent katyon (magnesium) varlığı çok kullanılan bir nükleik asit teknolojisi yöntemidir. önemlidir. MgCl2 konsantrasyonu genellikle Mikrobiyoloji alanında, PCR ile klinik 0.5-5.0 mM arasındadır, ve optimum materyallerde bulunan veya izole edilen etkenlere konsantrasyon deneysel olarak ait DNA’ların veya bazı spesifik gen belirlenmektedir. Mg+2 iyonlarının dNTP’ler segmentlerinin in vitro enzi-matik ile eriyebilir bir kompleks oluşturmak, amplifikasyonu yapılmaktadır. Bu teknik, total polimeraz aktivitesini uyarmak ve genomik DNA içinde yer alan nanogram primer/template etkileşiminin erime ısısını düzeyindeki template DNA’nın miktarını 105-106 arttırmak gibi önemli görevleri vardır. Teorik kat arttırabilir. Teknikte bilinmesi gereken ilk olarak nükleotidler 1:1 oranında mag-nesiuma bilgi, hedef DNA dizisinin ne olduğudur. bağlandığından, testte total nükleotid Böylelikle, DNA sentezleyici kullanılarak konsantrasyonunun 2 katı magnesium reaksiyon için gerekli primerler (öncü DNA konsantrasyonu kullanılması önerilir. molekülleri) sentezlenir1-3. Genellikle, düşük Mg+2 konsantrasyonu düşük PCR yönteminde kullanılan reagentler ürünlere (ya da ürün oluşmama) ve yüksek aşağıdaki gibidir: Mg+2 konsantrasyonu da nonspesifik ürünlerin 1. Template: Amplifiye edilecek DNA bölgesi (değerlendirilemeyen) toplanmasına neden 1 veya bu bölgeyi içeren hedef DNA’yı ifade olur . eder. Bu bakteri, virus veya başka bir hücrenin PCR reaksiyonu nüklotidler (dNTP’ler), genomik DNA’sının bir bölümü olabilir. primerler, template DNA ve polimeraz enzimi 2. Primerler: DNA öncüleri veya oligonük- içeren ince duvarlı eppendorf veya kapillar leotidler olarak da adlandırılmaktadır. Hedef tüplerde yapılır. PCR’unun her bir siklusunda yer DNA’dan yeni DNA sentezini başlatan ufak alan önemli basamaklar template denatürasyonu, DNA parçacıklarıdır. En az 16, ortalama 20- primerlerin birleşmesi ve primerlerin uzamasıdır. 24 baz uzunluğunda olmalıdır. Bazı özel Template Denatürasyonu: PCR’unun ilk şartlarda daha kısa veya daha uzun olabilir. basamağı, DNA iplikciklerini ayırmak yani Genellikle, ortalama 30 siklusluk PCR için 1 denatüre etmektir. Bu işlem, ortalama 94-95 µM konsantrasyon yeterlidir. Primerlerde °C’de PCR karışımındaki template iplikçiklerin polibaz (örn. poly dG) veya tekrarlayan birbirinden tamamen ayrılması sağlanana kadar, dizilerin uzun olmamasına dikkat edilmelidir. kısa bir süre devam ettirilir. Böylece primerler’in Çünkü bu tür diziler, template üzerinde ilgisiz bağlanması için komplementer alanların açılması bölümlerle bağlanabilmektedir. Primerlerin sağlanır. Denatürasyon süresinin uzun olması, birbirinden uzaklıkları ve kullanılacak Taq polimeraz enziminin aktivitesindeki kaybı primerlerin konsantrasyonu, testin başarılı hızlandırmaktadır1. olmasında önemli diğer faktörlerdir. Bir Primerlerin Birleşmesi (Annealing): primerin molar konsantrasyonu 260 nm Reaksiyonun ikinci basamağı primerlerin (A260)’de absorbanslığı temel alınarak bağlanmasıdır. Primer annealing sıcaklığı, hesaplanabilir. PCR’unun başarısında önemli bir parametredir. 3. Deoksiribonükleosid trifosfatlar (dNTP’ler): Her bir oligonükleotid için karekteristik olan Bunlar dATP, dTTP, dCTP ve dGTP’dir. annealing sıcaklığının belirlenmesinde, Primerler ve dNTP’ler, hedef DNA’nın ampli- oligonükleotidin uzunluğu ve reaksiyon fikasyonu için gerekli olan hammaddeyi buffer’ının iyonik gücü kadar primerin baz sağlarlar. kompozisyonu da önemlidir. PCR karışımında 139 bulunan 5’→3’ ve 3’→5’ yönündeki iki primer, Nükleik asit teknolojisinde, PCR’dan denatürasyon sonrası birbirinden ayrılan faydalanılarak bazı tavuk infeksiyonlarında iplikçiklerdeki kendi komplement-er alanlarına yapılabilecek önemli işlemler: spesifik olarak bağlanır. Bu işlem 50-65°C’de 1. Campylobacter infeksiyonlarının teşhisi4-6, gerçekleştirilir. Annealing sıcaklığının çok 2. Chicken Infectious Anemia Virus (CIAV)’- yüksek olduğu durumlarda primer bağlanması unun saptanması ve miktar tayini7, şekillenmezken, sıcaklığın çok düşük olduğu 8,9 durumlarda da primerler yanlış yerlere 3. Haemophilus gallinarum’un tanısı , bağlanabilir veya primer dimerleri oluşabilir1,2. 4. Infectious Bronchitis Virus (IBV)’unun tanısı Bunun için optimal “annealing” sıcaklığın ve genotipinin belirlenmesi 10-13, belirlenmesi gereklidir. 5. Infectious Bursal Disease Virus (IBDV)’unu Primerlerin Uzaması (Ekstensiyon): identifiye etmek ve virusun serotiplerinin 14-16 Primer ekstensiyonu, genellikle 72°C’de veya belirlenmesi , DNA polimerazın optimum sıcaklığında 6. Infectious Laryngotracheitis Virusu’nun gerçekleştirilir. PCR’unda genellikle 2 dakikalık saptanması17, bir ekstensiyon süresi tam ekstensiyona ulaşmak 7. Marek Hastalığı ve Reticuloendotheliasis için yeterli bir süre olmakla birlikte, bu süre hastalığının tanılarını koymak ve Marek amplifiye olacak DNA bölgesinin uzun olması Hastalığı Virusu (MDV)’nun patojenik olup halinde arttırılabilir. Bu basamakta Taq polimeraz olmadığının belirlenmesi18-21, enzimi 5’→3’ yönünde aktivite göstererek, 8. Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae ve primerlerin 3’ uçlarından başlamak üzere M.iowae infeksiyonlarının tanısı22-25, ortamdaki nükleo-tidleri de kullanarak hedef DNA diziliminin kopyasını yapar. Reaksiyon ısısı 9. Newcastle Disease Virusu (NDV)’nun tanısı 26-28 tekrar yükseltilerek final ekstensiyon sıcaklığı ve patotipinin belirlenmesi , 94°C’ye çıkarılır. Böylece 1 siklus tamamlanmış 10. Ornithobacter rhinotracheale infeksiyonunun 29 olur ve her siklusta DNA miktarı bir kat artar1,2. tanısı , 30 Siklus Sayısı: Etkin bir DNA amplifikas- 11. Reovirus identifikasyonu , yonu için gerekli olan siklus sayısı genellikle 25- 12. Salmonella infeksiyonlarının belirlenmesi31-34, 40 arasındadır. Ancak, siklus sayısındaki artışla 13. Tavuk Çiçeği (Fowl Pox) Virusu’nun tanısı35, birlikte daha fazla sayıda farklı yapıların (örneğin değerlendirilemeyen ürünler gibi) meydana gelme 14. Turkey Rhinotracheitis Virus (TRTV)’unun identifikasyonu36-38olasılığı artar2. , olarak sıralanabilir. Yukarıda verilen örneklerle ilgili bazı detaylar şu şekilde açıklanabilir: PCR ve İnfeksiyöz Bronşitis: IBV’unu identifiye etmek ve gruplandırmak (serotiplendi- rmek) amacı ile genellikle virus nötralizasyon testleri yapılmaktadır. IBV’u çok geniş antijenik varyasyon göstermektedir. Virus nötralizasyon Grafik 1: testleri ile yapılan IBV’unun gruplandırılması ve PCR basamakları (PCR steps) daha sonra bu gruplamaya göre yapılan aşılama programlarından elde edilen başarısızlıklar, farklı PCR ürünü DNA’ları görüntülemek için jel yöntemlerle yapılacak IBV’unun gruplandırıl- elektoforezisi (Ultraviole altında DNA bantlarının masının daha anlamlı olacağını 12,39,40 gözlenmesi), kolorimetrik yöntemler (ELISA ve düşündürmüştür . Bununla birlikte reverse-dot blot gibi) ve fluorometrik (Light laboratuvarlarda yapılan serolojik test Cycler sistemleri) yöntemlerden sonuçlarından elde edilen titrelerin aşı suşuna mı, yararlanılmaktadır. patojenik suşa mı ait olduğu belirlenmelidir. PCR, IBV’unun genotipini belirler ve bu nedenle korunmada en güvenilir suş belirleme yöntemidir11,12,41-43. Aşılama amacıyla IBV’unun 140 gruplarını oluşturmada krosimmuni-zasyon ırklarına göre farklılıklar göstermesi nedeni ile testleri ile elde edilen koruyucu tiplerin ve son her zaman belirlenemeyebilir. Bununla birlikte zamanlarda nükleik asit teknikleriyle anti-jenik anti-REV antikorları izolasyonu varyasyonların incelenmesiyle ortaya çıkan zorlaştırabilmektedir19,54. genotiplerin daha anlamlı olduğu görülmüştür. Marek hastalığında antikorlarının Ancak genotiplendirmenin de her zaman protektif bulunuşunun anlamı klinik açıdan sınırlıdır. anlamda antijenik varyantları belirlemediği rapor Onkojenik MDV’ları (serotip1) ve aşı virus edilmektedir10,13,44. suşlarının glikoproteinleri arasında ortak antijenik PCR ve Gumboro: IBDV infeksiyonu, determinantların varlığı nedeni ile konvensiyonel yemden yararlanımın azalmasından immuno- serolojik metodlar uygulanarak belirlenen supresif etkiye kadar çok değişik klinik tablo ile antikorların gösterimiyle aşı-saha tip virus seyreden olgulara neden olur. Serotip1 tavuklar infeksi-yonunun ayırımı yapılamaz. Söz konusu için patojendir ve Türkiye’de virulent IBDV infeksiyonda in situ hibridizasyon, restriksiyon varlığı bildirilmiştir. IBDV infeksiyonunun tanısı endonükleaz analizleri ve serolojik analizler virus nötralizasyon, virusun IF, ELISA, VN ve serotip ayırımını olanaklı hale getirseler bile AGP ile gösterimiyle ve oluşan spesifik patojenik ve attenüe serotip 1’in ayırımını antikorların tespiti ile yapılmaktadır. Ayrıca yapamamaktadır18,20,21. Konvensiyonel IBDV, IF ve IP testleri ile doku kesitlerinde metotlardaki bu aksaklıklar, REV provirusunun direkt olarak da belirlenebilmektedir3,45. ve MDV’unun direkt olarak DNA’sının amplifiye Subklinik infeksiyon-larda, virusun doku ve edilerek PCR’la ortaya koyulması ile organlarda sayıca az miktarda bulunması virusun giderilmiştir55-57. izolasyonunu ve virusun direkt olarak PCR ve Mycoplasma İnfeksiyonları: gösterilmesini olumsuz yönde Mycoplasma taramasında kullanılan testler serum etkilemektedir16,46,47. Antikor varlığını gösteren pleyt aglutinasyon testi (SPA), serum pleyt testlerle IBDV infeksiyonu tanısının koyulması, dilusyon aglutinasyon testi (SPDA), hemagluti- aşılama sonu oluşan antikorların varlığı nedeni ile nasyon inhibisyon testi (HI), kültür-etken önemini kaybetmiştir15,48,49. Bu testler ancak izolasyonu ve identifikasyonu, ELISA, DNA- aşılamalar sonrası tavukların immun durumlarının Prob testleri ve PCR-Tabanlı testlerdir3,58. SPA ve belirlenmesinde yararlı olabilir. 1989-1992 SPDA’da Mycoplasma gallisepticum (MG), M. yıllarında IBDV-RNA’sının aranması için dot- synoviae (MS) ve diğer mycoplasmalar blot hibridizasyon tekniklerinde işaretli cDNA arasındaki ortak antijenite, ve HI testinde test prob-ları kullanılmıştır. Son yıllarda bu tekniğin antijeni olarak kullanılan MG ile infeksiyonu yerini, çok daha duyarlı ve spesifik olan RT-PCR oluşturan MG arasındaki antijenik varyasyonlar tekniği almıştır14,16,46,50, ve aynı zamanda PCR ile gibi birçok nedenle serolojik test sonuçları tam suşların tiplendirilmesi de yapılabilmektedir51-53. tanı sağlamayabilir. Bu gibi durumlarda testin PCR ve Marek Hastalığı, Retiküloen- yenilenmesi yerine mycoplasmaların izolasyonu doteliosis Virus İnfeksiyonu: Marek hastalığının ve identi-fikasyonu, daha hızlı ve tanı için daha etkeni avian alfa herpervirustur ve T lenfositleri kesin sonuç vermektedir. MG, izolasyonu en zor infekte eder. Retiküloendoteliosis virusu, pre T ve kanatlı mikroorganizması ve hatta pre B lenfositlerin genomuna integre olan bir mycoplasmalarından biridir. Bununla birlikte retrovirustur. Marek hastalığında ve Retiküloen- MG’un identifikasyonu zaman alıcıdır ve doteliosis Virus infeksiyonunda tümör nonpatojenik mycoplasmalar patojenik görünümleri ve yerleşimleri birbirine benzerlik mycoplasmaların izolasyonunu zorlaştırmaktadır. göstermektedir. Bu infeksiyonların tanısı, virus DNA prob testleri, etkenin sayıca fazla olduğu izolasyonu ve spesifik antikorların gösterimi ile klinik semptom gösteren hayvanlarda teşhis yapılmaktadır. Ancak, bu işlemler uzun zaman amacı ile kullanılmaktadır. Ancak, klinik örnekte alır ve zordur. Aynı zamanda bir klinik olguda iki az sayıda MG ve MS mikroorganizmasının var etken (MDV ve REV) bir arada olduğu subklinik infekte veya portör hayvanları bulunabilmektedir19. belirleyememektedir24,58-60. REV infeksiyonunda, virusun izolasyonu PCR-tabanlı moleküler biyoteknolojik her zaman yapılamamakla birlikte, oluşan yöntemlerle mycoplasmaların DNA’ları spesifik antikorların da, kanda kalış süreleri tavuk olarak saptanabilmekte ve başka bir teyit testine 141 gerek olmaksızın teşhis yapılma imkanı kullanıldığı birçok test geliştirilmiştir. Ancak bu sağlamaktadır. Son yıllarda kullanıma giren yöntemlerin duyarlılıkları ve özgünlükleri ile inaktif ve canlı MG aşıları, sahada infekte ilgili problemler rutin kullanımlarını hayvanların serolojik testlerle teşhisini güçleştirmektedir3,69. güçleştirmiştir. PCR tekniği ile bu problemin PCR ile klinik ve çevreye ait örneklerde üstesinden gelinmektedir. PCR, MG suşlarının var olan Salmonella’yı belirleyebilecek hedef canlı aşı suşu mu veya infeksiyonu oluşturan DNA segmentlerinin oldukça yüksek bir patojenik suş mu olduğunu rahatlıkla ortaya duyarlılıkta ve spesifiklikte amplifikasyonu çıkarabilmektedir22,61-63. yapılabilmektedir33,34,70,71. PCR ve Newcastle Hastalığı: NDV PCR ve Turkey Rhinotracheitis: Serum serotipleri epidemiyolojik açıdan önemlidir ve nötralizasyon testleri TRTV’nun tüm izolatlarının monoklonal antikorlarla belirlenirler. Bununla aynı serotipe ait olduğunu göstermektedir. Diğer birlikte NDV’unun patotiplendirmesi hastalığın taraftan TRTV’nun subtiplerinin (A ve B) olduğu, tanısı açısından şarttır. NDV izolatları, tavuklarda etkenin G proteinini kodlayan genlerin oluşturdukları hastalığın şiddetine göre 3 ana analizleriyle gösterilmiştir72,73. Bu bilgiler en patotip altında değerlendirilmektedir. Konvansi- azından sahada, o bölgede kullanılacak aşı yonel olarak patotiplendirme, embriyoları suşunun belirlenmesine ışık tutacaktır. Aynı ortalama öldürme zamanı (EMDT) ve klinik semptomlara yol açabilen IBV, NDV ve intraserebral patojenisite indeksi (ICPI) ile TRTV’nun patojenik tiplerinin aynı klinik tablo belirlenebilmektedir. Bu işlemler zahmetlidir ve içinde bulunup bulunmadığı da belirlenmelidir36- uzun zaman alır3,28. 38,74. NDV’unun patojenitesinin moleküler temeli füzyon (F) proteininin parçalanma Sonuç alanındaki amino asit dizisi ile ilgilidir. F proteinini kodlayan genlerin belirlenmesini hedef Rutin konvensiyonel tanı prosedürlerine alan nükleik asit metotları, düşük (lentojenik) ve moleküler biyolojik yöntemlerin eklenmesiyle ve yüksek (mezojenik ve velojenik) patojenisiteye bazen birlikte kullanımlarıyla, kanatlılarda sahip NDV suşlarının ayırımını hastalıklarla ilgili koruma ve kontrol yapabilmektedir26,28,64-66. Bu metotlar NDV yöntemlerinin daha etkin ve yararlı bir biçimde hastalığı gibi çabuk yayılan bir infeksiyonun hızlı uygulanabileceği açıktır. Moleküler biyolojik tanısı açısından konvan-siyonel olarak uygulanan yöntemlerden biri olan PCR, tavuk hastalıkları ICPI testleri gibi testlerden hızlı olmaları özel alanında bazen yalnız, bazen de var olan ünite-malzeme ve özel deney hayvanı yöntemlerle birlikte kullanıldığında tanı, proflaksi gerektirmedikleri için önemli görülmektedir. ve patogenezis ile ilgili bilgilerin doğru bir Günümüzde nükleik asit metodolojisi biçimde tanımlanmasına oldukça önemli bir uygulanarak (RT-PCR) virusun patotiplen- biçimde yardım etmektedir. dirmesi 24 saatte yapılabilmektedir27,67,68. PCR ve Salmonella İnfeksiyonları: Kaynaklar Kanatlılarda Salmonella infeksiyonlarının teşhisi serolojik testler ve kültür-etken identifikasyonu 1. ABBAS, F., ANDREASSEN, J.R., JACKWOOD, ile yapılmaktadır. Salmonella serovarlarının M.W.: Development of a polymerase chain kültürü ve identifikasyonu için yapılan standart reaction and a radioactive DNA probe for laboratuvar işlemleri 4-8 gün almaktadır. Aynı infectious laryngotracheitis virus. Avian Dis., 40: zamanda taşıyıcı hayvanlarda ve bazı durumlarda 56-62, (1996). (klinik örnekte Salmonella’yı inhibe eden 2. ADZAHR, A., SHAW, K., BRITTON, P., mikroorganizmaların varlığı, antibiyotik CAVANAGH, D.: Universal oligonucleotides for kullanımı gibi) klinik örneklerde etken sayıca az the detection of infectious bronchitis virus by the bulunduğundan Salmonella izolasyonu polymerase chain reaction. Avian Pathol., 25: 817- yapılamamaktadır. Her iki nedenle çok daha hızlı 836, (1996). ve duyarlı bir yönteme gereksinim duyulmuş, ve 3. AKIN, A., WU, C.C., LIN, T.L.: Amplification bu amaçla daha seçici kültür metodları, DNA and cloning of infectious bursal disease virus hibridizasyon testleri ve immunglobulinlerin genomic RNA segments by long and accurate PCR. J. Virol. Methods, 82 (1): 55-61, (1999). 142 4. ALI, A., REYNOLDS, D.L.: A reverse immunochemiluminescent Southern blot and transcription-polymerase chain reaction assay for nested PCR. J. Virol. Methods, 79 (2): 237-241, the detection of avian pneumovirus. Avian Dis., (1999). 43(3): 600-603, (1999). 15. DAVIDSON, I., BOROVSRAYA, A., PERL, S., 5. AMONSIN, A., WELLEHAN, F.J.X., LI, L.L., MALKINSON, M.: Use of the polymerase chain VAN DAMME, P., LINDEMAN, C., EDMAN, reaction for the diagnosis of natural infection of M., ROBINSON, R.A., KAPUR, V.: Molecular chickens and turkeys with Marek’s disease virus epidemiology of Ornithobacterium rhinotracheale. and reticuloendotheliosis virus. Avian Pathol., 24: J. Clin. Microbiol., 35: 2894-2898, (1997). 69-94, (1995). 6. BALLAGI-PORDANY, A., WEHMANN, E., 16. DE LEEUW, O., PEETERS, B.: Complete HERCZEG, J., BELAK, S., LOMNICZI, B.: nucleotide sequence of Newcastle disease virus: Identification and grouping of Newcastle disease evidence for the existence of a new genus within virus by restriction site analysis of a region from the subfamily Paramyxovirinae. J. Gen. Virol., 80 the F gene. Arch. Virol., 141(2): 243-261, (1996). (Pt 1): 131-136, (1999). 7. BAYON-AUBOYER, M.H., JESTIN, V., 17. ENDOH, D., KON, Y., HAYASHI, M., TOQUIN, D., CHERBONNEL, M., MORIMURA, T., CHO, K.O., IWASAKI, T., ETERRADOSSI, N.: Comparison of F-, G– and N- SATO, F.: Detection of transcripts of Marek’s based RT-PCR protocols with conventional disease virus serotype 1 iCP4 homologue (MDV1 virological procedures for the detection and typing ICP4) by in situ hybridization. J. Vet. Med. Sci., 58 of turkey rhinotracheitis virus. Arch. Virol., 144 (10): 969-975, (1996). (6): 1091-1109, (1999). 18. FADLY, A.M., WITTER, R.L., SMITH, E.J., 8. BECKER, Y., ASHER, Y., TABOR, E., SILVA, R.F., REED, W.M., HOERR, F.J., DAVIDSON, I., MALKINSON, M., WEISMAN, PUTNAM, M.R.: An outbreak of lymphomas in Y.: Polymerase chain reaction for differentiation commercial broiler breeder chickens vaccinated between pathogenic and non-pathogenic serotype 1 with a fowlpox vaccine contaminated with Marek’s disease viruses (MDV) and vaccine reticuloendotheliosis virus. Avian Pathol., 25: 35- viruses of MDV-serotypes 2 and 3. J. Virol. 47, (1996). Methods, 40 (3): 307-322, (1992). 19. FALCONE, E., D’AMORE, E., DI TRANI, L., 9. CAO, Y.C., YEUNG, W.S., LAW, M., BI, Y.Z., SILI, A., TOLLIS, M.: Rapid diagnosis of avian LEUNG, F.C., LIM, B.L.: Molecular infectious bronchitis virus by the polymerase chain characterization of seven Chinese isolates of reaction. J. Virol. Methods, 64 (2): 125-130, infectious bursal disase virus: classical, very (1997). virulent, and variant strains. Avian Dis., 42 (2): 20. FAN, H.H., KLEVEN, S.H., JACKWOOD, M.W.: 340-351, (1998). Application of polymerase chain reaction with 10. CAVANAGH, D., MAWDITT, K., SHAW, K., arbitrary primers to strain identification of BRITTON, P., NAYLOR, C.: Towards the routine Mycoplasma gallisepticum. Avian Dis., 39 (4): application of nucleic acid technology for avian 729-735, (1995). disease diagnosis. Acta Vet. Hung., 45 (3): 281- 21. GARCIA, M., JACKWOOD, M.W., HEAD, M., 298, (1997). LEVISOHN, S., KLEVEN, S.H.: Use of species- 11. CHEN, X., MIFLIN, J.K., ZANG, P., specific oligonucleotide probes to detect BLACKALL, P.J.: Development and application of Mycoplasma gallisepticum, M.synoviae, and DNA probes and PCR tests for Haemophilus M.iowae PCR amplification products. J. Vet. paragallinarum. Avian Dis., 40: 398-407, (1996). Diagn. Invest., 8 (1): 56-63, (1996). 12. COHEN, N.D., WALLIS, D.E., NEIBERGS, H.L., 22. GOODING, C.M., CHOUDARY, P.V.: HARGIS, B.M.: Detection of Salmonella Comparison of different primers for rapid detection enteritidis in equine feces using the polymerase of Salmonella using the polymerase chain reaction. chain reaction and genus-specific oligonucleotide Mol. Cell. Probes, 13 (5): 341-347, (1999). primers. J. Vet. Diagn. Invest., 7 (2): 219-222, 23. HARMON, K.M., RANSOM, G.M., WESLEY, (1995). I.V.: Differentiation of Campylobacter jejuni and 13. ÇÖVEN, F., ÇARLI, K.T.: Türkiye’de broyler ve Campylobacter coli by polymerase chain reaction. yumurtacı tavuklardan Infectious Bursal Disease Mol. Cell. Probes, 11(3): 195-200, (1997). Virusu’nun izolasyonu ve identifikasyonu. Pendik 24. HUW LEE, L., HWA LEE, K.: Application of the Vet. Mikrobiyol. Derg., 28 (2): 141-152, (1997). polymerase chain reaction for the diagnosis of fowl 14. DANI, M.A., DURIGON, E.L., ARNS, C.W.: poxvirus infection. J. Virol. Methods, 63(1-2): 113- Molecular characterization of Brazilian avian 119, (1997). pneumovirus isolates: comparison between 143 25. INNIS, M.A., GELFAND, D.H.: Optimization of avian mycoplasmosis. Acta Vet. Hung., 45 (3): PCRs. In: PCR Protocols, A Guide to Methods and 373-386, (1997). Applications. Ed. by Innis, M.A., Gelfand, D.H., 37. KING, D.J., SEAL, B.S.: Biological and molecular Sninsky, J.J. and White, T.J. Academic Press, characterization of Newcastle disease virus (NDV) California, 3-12, (1990). field isolates with comparisons to reference NDV 26. JACKWOOD, D.J., JACKWOOD, R.J.: Infectious strains. Avian Dis., 42(3): 507-516, (1998). bursal disease viruses: molecular differantation of 38. KLEVEN, S.H., FAN, H.H., TURNER, K.S.: Pen antigenic subtypes among serotype 1 viruses. trial studies on the use of live vaccines to displace Avian Dis., 38 (3): 531-537, (1994). virulent Mycoplasma gallisepticum in chickens. 27. JACKWOOD, D.J., JACKWOOD, R.J.: Molecular Avian Dis., 42 (2): 300-306, (1998). identification of infectious bursal disease virus 39. KONKEL, M.E., GRAY, S.A., KIM, B.J., strains. Avian Dis., 41 (1): 97-104, (1997). GARVIS, S.G., YOON, J.: Identification of the 28. JACKWOOD, D.J., NIELSEN, C.K.: Detection of enteropathogens Camylobacter jejuni and infectious bursal disease viruses in commercially Campylobacter coli based on the cadF virulence reared chickens using the reverse trancriptase / gene and its product. J. Clin. Microbiol., 37 (3): polymerase chain reaction-restriction endonuclease 510-517, (1999). assay. Avian Dis., 41 (1): 137-143, (1997). 40. KWAN, H.M., JACKWOOD, M.W., BRAWN, 29. JACKWOOD, M.W., YOUSEF, N.M.H., HILT, T.P., HILT, D.A.: Polymerase chain reaction and a D.A.: Further development and use of a molecular biotin labelled DNA probe for detection of serotype identification test for infectious bronchitis infectious bronchitis virus in chickens. Avian Dis., virus. Avian Dis., 41: 105-110, (1997). 37: 149-156, (1993). 30. JIA, W., KARACA, K., PARRISH, C.R., NAQI, 41. KWANG, J., LITTLEDIKE, E.T., KEEN, J.E.: S.A.: A novel variant of avian infectious bronchitis Use of the polymerase chain reaction for virus resulting from recombination among three Salmonella detection. Let. Appl. Microbiol., 22 (1): different strains. Arch. Virol., 140(2): 259-271, 46-51, (1996). (1995). 42. LAIGRET, F., DEAVILLE, J., BOVE, J.M., 31. JUHASZ, K., EASTON, A.J.: Extensive sequence BRADBURY, J.M.: Specific detection of variation in the attachment (G) protein gene of Mycoplasma iowae using polymerase chain avian pneumovirus: evidence for two distinct reaction. Mol. Cell. Probes, 10 (1): 23-29, (1996). subgroups. J. Gen. Virol., 75 (11): 2873-2880, 43. LE, L., BRASSEUR, R., WEMERS, C., (1994). MEULEMANS, G., BURNY, A.: Fusion (F) 32. KANT, A., KOCH, G., VAN ROOZELAAR, D.J., protein gene of Newcastle disease virus: sequence BALK, F., TER HUMRNE, A.: Differentiation of and hydrophobicity comparative analysis between virulent and non-virulent strains of Newcastle virulent and avirulent strains. Virus Genes, 1(4): disease virus within 24 hours by polymerase chain 333-350, (1988). reaction. Avian Pathol., 26: 837-849, (1997). 44. LIN, T.L., WU, C.C., ROSENBERGER, J.K., 33. KATARIA, R.S., TIWARI, A.K., SAIF, Y.M.: Rapid differentation of infectious BANDYOPADHYAY, S.K., KATARIA, J.M., bursal disease virus serotypes by polymerase chain BUTCHAIAH, G.: Detection of infectious bursal reaction. J. Vet. Diagn. Invest., 6 (1): 100-102, disease virus of poultry in clinical samples by RT- (1994). PCR. Biochem. Mol. Biol. Int., 45 (2): 315-322, 45. LIU, H.J., GIAMBRONE, J.J., DORMITORIO, T.: (1998). Detection of genetic variations in serotype I 34. KEELER, C.L. JR., REED, K.L., NIX, W.A., isolates of infectious bursal disease virus using GELB, J.JR.: Serotype identification of avian polymerase chain reaction and restriction infectious bronchitis virus by RT-PCR of the endonuclease analysis. J. Virol. Methods, 48(2-3): peplomer (S-1) gene. Avian Dis., 42 (2): 275-284, 281-291, (1994). (1998). 46. LIU, X., GIAMBRONE, J.J., DORMITORIO, T.: 35. KEMPF, I., GESBERT, F., GUITTET, M., Simplified sample processing combined with a BENNEJEAN, G.: Mycoplasma gallisepticum sensitive nested polymerase chain reaction assay infection in drug-treated chickens: comparison of for detection of infectious bursal disease virus in diagnosis methods including polymerase chain the bursa of Fabricius. Avian Dis., 42 (3): 480-485, reaction. Zentralbl Veterinarmed [B], 41 (9): 597- (1998). 602, (1994). 47. MARIN, M.C., VILLEGAS, P., BENNETT, J.D., 36. KEMPF, I.: DNA amplification methods for SEAL, B.S.: Virus characterization and sequence diagnosis and epidemiological investigations of of the fusion protein gene cleavage site of recent Newcastle disease virus field isolates from the 144 southeastern United States and Puerto Rico. Avian rewiev with special reference to Mycoplasma Dis., 40(2): 382-390, (1996). galisepticum and M.synoviae. Vet. Bulletin, 62 (6): 48. MASE, M., ASAHI, S., IMAI, K., NAKAMURA, 511- 516 , (1992). K., YAMAGUCHI, S.: Detection of turkey 59. SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F.: In vitro rhinotracheitis virus from chickens with swollen amplification of DNA by the polymerase chain head syndrome by reverse transcriptase- reaction: In “Molecular Cloning: A Laboratory polymerase chain reaction (RT-PCR). J. Vet. Med. Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Sci., 58(4): 359-361, (1996). Press, Cold Spring Harbor, N. Y.,14.5 – 14.35, 49. MIFLIN, J.K., CHEN, X., BRAGG, R.R., (1989). WELGEMOED, J.M., GREYLING, J.M., 60. SEAL, B.S., KING, D.J., BENNETT, J.D.: HORNER, R.F., BLACKALL, P.J.: Confirmation Characterization of Newcastle Disease Virus that PCR can be used to identify NAD-dependent isolates by reverse transcription PCR coupled to and NAD-independent Haemophilus direct nucleotide sequencing and development of paragallinarum isolates. Onderstepoort J. Vet. Res., sequence database for pathotype prediction and 66 (1): 55-57, (1999). molecular epidemiological analysis. J. Clin. 50. MOORE, K.M., BENNETT, J.D., SEAL, B.S., Microbiol., 33: 2624-2630, (1995). JACKWOOD, M.W.: Sequence comparision of 61. SILVA, R.F.: Differentiation of pathogenic and avian infectious bronchitis virus S1 glycoproteins non-pathogenic serotype 1 Marek’s disease viruses of the Florida serotype and five variant isolates (MDVs) by the polymerase chain reaction from Georgia and California. Virus Genes, 17 (1): amplification of the tandem direct repeats within 63-83, (1998). the MDV genome. Avian Dis., 36 (3): 521-528, 51. NAKAMURA, K., MASE, M., TANIMURA, N., (1992). YAMAGUCHI, S., NAKAZAWA, M., YUASA, 62. SOINE, C., WATSON, S.K., RYBICKI, E., N.: Swollen head syndrome in broiler chickens in LUCIO, B., NORDGREN, R. M., PARRISH, C. Japan: its pathology, microbiology, and chemistry. R., SCHAT, K.A.: Determination of detection limit Avian Pathol., 26: 139-154, (1997). of the polymerase chain reaction for chicken 52. NG, L.K., KINGOMBE, C.I., YAN, W., infectious anaemia virus. Avian Dis., 37: 467-476, TAYLOR, D.E., HIRATSUKA, K., MALIK, N., (1993). GARCIA, M.M.: Specific detection and 63. SOUMET, C., ERMEL, G., ROSE, N., DROUIN, confirmation of Campylobacter jejuni by DNA P., SALVAT, G., COLIN, P.: Identification by a hybridization and PCR. Appl. Environ. Microbiol., multiplex PCR-based assay of Salmonella 63 (11): 4558-4563, (1997). typhimurium and Salmonella enteritidis strains 53. QIAN, B., KIBENGE, F.S.: Observations on from environmental swabs of poultry houses. Lett. polymerase chain reaction amplification of Appl. Microbiol., 29 (1): 1-6, (1999). infectious bursal disease virus dsRNA. J. Virol. 64. STONE, G.G., OBERST, R.D., HAYS, M.P., Methods, 47 (1-2): 237-242, (1994). MCVEY, S., CHENGAPPA, M.M.: Detection of 54. RAHN, K., DE GRANDIS, S.A., CLARKE, R.C., Salmonella serovars from clinical samples by MCEVEN, S.A., GALAN, J.E., GINOCCHIO, C., enrichment broth cultivation – PCR procedure. J. CURTISS III, R., GYLES, C.L.: Amplification of Clin. Microbiol., 32 (7): 1742-1749, (1994). an invA gene sequence of Salmonella typhimurium 65. STRAM, Y., MEIR, R., MOLAD, T., by polymerase chain reaction as a specific method BLUMENKRANZ, R., MALKINSON, M., of detection of Salmonella. Mol. Cell. Probes 6: WEISMAN, Y.: Applications of the polymerase 271-279, (1992). chain reaction to detect infectious bursal disease 55. RAJ, G.D., JONES, R.C.: Infectious bronchitis virus in naturally infected chickens. Avian Dis., 38 virus: immunopathogenesis of infection in the (4): 879-884, (1994). chickens. Avian Pathol., 26: 677-706, (1997). 66. TAKAGI, M., ISHIKAWA, K., NAGAI, H., 56. RAZIN, S.: DNA probes and PCR in diagnosis of SASAKI, T., GOTOH, K., KOYAMA, mycoplasma infections. Mol. Cell. Probes, 8 (6): H.:Detection of contamination of vaccines with the 497-511, (1994). reticuloendotheliosis virus by reverse transcriptase 57. REIMANN, I., WERNER, O.: Use of the polymerase chain reaction (RT-PCR). Virus Res, polymerase chain reaction for the detection of 40 (2): 113-121, (1996). reticuloendotheliosis virus in Marek’s disease 67. TUCHILI, L.M., KODAMA, H., SHARMA, R.N., vaccines and chicken tissues. Zentralbl TAKATORI, I., PANDEY, G.S., KABILIKA, S., Veterinarmed [B], 43 (2): 75-84, (1996). MUKAMOTO, M., TSUJI, S., BABA, T.: 58. SALAMI, J.O., ADDO, P., UMOH, J.V., Detection of Salmonella DNA in chicken embryos ADEGBOYE, D.S.: Chicken mycoplasmosis: a 145 and environmental samples by polymerase chain infectious bronchitis virus. Mol. Cell. Probes, 13 reaction. J. Vet. Med. Sci., 58 (9): 881-884, (1996). (1): 1-7, (1999). 68. TURNER, K.S., KLEVEN, S.H.: Eradication of 72. XIE, Z., FADL, A.A., GIRSHICK, T., KHAN, live F strain Mycoplasma gallisepticum vaccine M.I.: Amplification of avian reovirus RNA using using live ts-11 on a multiage commercial layer reverse transciptase-polymerase chain reaction. farm. Avian Dis., 42 (2): 404-407, (1998). Avian Dis., 41: 654-660, (1997). 69. WANG, C., MIGUEL, B., AUSTIN, F.W., KEIRS, 73. YANG, C.Y., CHANG, P.C., HWANG, J.M., R.W.: Comparision of the immunofluorescent SHIEH, H.K.: Nucleotide sequence and assays and reverse transcription-polymerase chain phylogenetic analysis of Newcastle disease virus reaction to detect and type infectious bronchitis isolates from recent outbreaks in Taiwan. Avian virus. Avian Dis., 43 (3): 590-596, (1999). Dis., 41(2): 365-373, (1997). 70. WANG, H., FADL, A.A., KHAN, M.I.: Multiplex 74. ZHU, G.S., OJIMA, T., HIRONAKA, T., IHARA, PCR for avian pathogenic mycoplasmas. Mol. Cell. T., MIZUKOSHI, N., KATO, A., UEDA, S., Probes, 11 (3): 211-216, (1997). HIRAI, K.: Differentiation of oncogenic and 71. WANG, X., KHAN, M.I.: A multiplex PCR for nononcogenic strains of Marek’s disease virus type Massachusetts and Arkansas serotypes of 1 by using polymerase chain reaction DNA amplification. Avian Dis., 36 (3): 637-645, (1992).