TÜRKİYE’DEKİ KESTANE ARI POLENLERİNİN FENOLİK BİLEŞİKLERİNİN VE ANTİOKSİDAN ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI BÜŞRA KARKAR T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TÜRKİYE’DEKİ KESTANE ARI POLENLERİNİN FENOLİK BİLEŞİKLERİNİN VE ANTİOKSİDAN ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI Büşra KARKAR Doç. Dr. Saliha ŞAHİN (Danışman) YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI BURSA – 2018 Her Hakkı Saklıdır ÖZET Yüksek Lisans Tezi TÜRKİYE’DEKİ KESTANE ARI POLENLERİNİN FENOLİK BİLEŞİKLERİNİN VE ANTİOKSİDAN ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI Büşra KARKAR Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Saliha ŞAHİN Arı poleni, zengin ve doğal gıda içeriğine sahip besinsel ve tıbbi değeri yüksek, vücut tarafından çok çabuk sindirilen, kana karışan ve insanlar tarafından tüketilebilen değerli bir üründür. Arı poleni aminoasit, protein, hormon, enzim, karbohidrat, mineral, yağ, vitamin, fenolik bileşikler, fitokimyasallar ve antioksidatif ajanlar içermektedir. Arı poleninin kimyasal içeriği, coğrafi ve botanik özelliklere göre değişmektedir. Bu çalışmada Marmara ve Karadeniz Bölgeleri’nden toplanan kestane arı poleni örneklerinde bulunan fenolik bileşikler ve karotenoidler HPLC-DAD cihazı ile tayin edilmiştir. Örneklerin toplam fenolik madde içeriği ve antioksidan kapasiteleri Folin- Ciocalteu, FRAP (demir iyonu indirgeyici antioksidan güç) ABTS ve CHROMAC (Cr (VI) indirgen antioksidan kapasite) yöntemleri ile belirlenmiştir. Zengin fenolik bileşik içeriğine sahip olan kestane arı poleni örneklerinin Fenton ortamında, DNA oksidasyonunu %11 oranında önlediği tespit edilmiştir. Ayrıca GC-MS/MS ile oksidatif stres sonucu oluşan DNA baz hasar ürünleri incelenmiştir. Kestane arı poleninin DNA baz hasar ürünlerinin oluşumunu %68,12 oranında önlediği belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Kestane arı poleni, fenolik bileşik, karotenoid, oksidatif stres, HPLC-DAD 2018, x + 102 sayfa. i ABSTRACT MSc Thesis INVESTIGATION OF THE PHENOLIC COMPOUNDS AND ANTIOXIDANT PROPERTIES OF CHESTNUT BEE POLLEN IN TURKEY Büşra KARKAR Uludag University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Bee pollen is a rich and natural food with high nutritional and medicinal content. It can be very quickly digested by the body, bloodstream and can be consumed by humans. Bee pollen contains amino acids, proteins, hormones, enzymes, carbohydrates, minerals, fats, vitamins, phenolic compounds, phytochemicals and anti-oxidative agents. Chemical composition of bee pollen can be varied according to geographical and botanical features. In this study, phenolic compounds and carotenoids in chestnut bee pollen samples collected from the Marmara and Black Sea regions were determined by HPLC-DAD. The total phenolic contents and antioxidant capacities of the samples were determined by Folin-Ciocalteu, FRAP (ferric reducing antioxidant power), ABTS and CHROMAC (Cr(VI) reduction antioxidant capacity) methods. It was identified that chestnut bee pollen samples with rich phenolic compound content prevented DNA oxidation by 11% in the Fenton environment. In addition, oxidative stress-induced DNA base damage products were examined by GC-MS / MS. It was determined that chestnut bee pollen prevented the formation of DNA base damage products by 68.12%. Key words: chestnut bee pollen, phenolic compound, carotenoid, oxidative stress, HPLC-DAD 2018, x + 102 pages. ii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR Bilgi, deneyim ve disiplinli çalışma prensibiyle bana her zaman yol gösteren, annelik ruhunu ve desteğini üzerimden hiç eksik etmeyen, öğrencisi olmaktan her zaman onur duyduğum danışman hocam Doç. Dr. Saliha ŞAHİN’e, Öneri ve yardımlarını esirgemeyen, samimi ve içten sohbetleriyle çalışmaktan keyif aldığım değerli hocam Dr. Önder AYBASTIER’e, Yüksek lisans eğitimim boyunca birlikte eğlenip birlikte üzüldüğüm, onları tanımaktan haz duyduğum canım meslektaşlarım Recep KARALI, Buse PARLAK, Merve GÜMRÜKÇÜ, Tuğçe YAZICI ve Tuğba YAPICI’ya, Deneysel çalışmalarım boyunca yardım ve desteklerini esirgemeyen laboratuvar arkadaşlarım Çiğdem YÜKSEL, Eftal Alp DORKEN ve Gökhan ÇOLAKOĞLU’na, Hayatım boyunca maddi manevi her daim destekçim olan, bana inanan, güvenen, sevgilerini hiç eksilmeden her zaman hissettiğim değerlilerim annem Semiha ve babam Mehmet KARKAR’a, Her bunaldığımda varlıklarıyla bana huzur veren, zor zamanlarımda en büyük destekçilerim olan kıymetlilerim Ebru ve Derya KARKAR’a Pozitif enerjisi ile gücüme güç katan, varlığına her an şükrettiğim anne yarım Deniz YILDIZ ve bana olan inancını, sevgisini, desteğini her an hissettiğim canım teyzem Gülşen KÜRKÜT’e, Her çıkmaza girdiğimde desteğiyle bana yeniden doğru yolu gösteren, zor zamanlarımda yanımda olup bana tekrar ayağa kalkma gücü veren biricik dayım ve en değerli meslektaşım Doğan YILDIZ’a, Bu tez çalışmasını HDP(F)-2016/66 nolu proje kapsamında destekleyen U.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne TEŞEKKÜR EDERİM. Büşra KARKAR …/…/…… iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.................................................................................................................................. i ABSTRACT ...................................................................................................................... ii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR .................................................................................................. iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ .............................................................................. vi ŞEKİLLER DİZİNİ ........................................................................................................ viii ÇİZELGELER DİZİNİ .................................................................................................... ix 1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI ....................................... 3 2.1. Kestane ....................................................................................................................... 3 2.2. Kestane Üretimi ve Dünya Sıralaması ....................................................................... 4 2.3. Kestane ve Kestane Ürünlerinin Önemi ..................................................................... 5 2.4. Arı Poleni ................................................................................................................... 5 2.5. Arı Poleninin İçeriği ve Önemi .................................................................................. 6 2.6. Fenolik Bileşikler ve Önemi ...................................................................................... 8 2.7. Polenin Antioksidan Özelliği ve Fenolik Bileşiklerin Tayini .................................. 10 2.8. Fenolik Bileşiklerin Spektroskopik Tayini .............................................................. 16 2.9. DNA ve Oksidasyonu .............................................................................................. 16 3. MATERYAL ve YÖNTEM ........................................................................................ 18 3.1. Materyal ................................................................................................................... 18 3.1.1. Tez kapsamında çalışılan kestane arı polenleri ..................................................... 18 3.1.2. Tez kapsamında kullanılan cihazlar ...................................................................... 18 3.1.3. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar ................................................................ 20 3.1.4. Tez kapsamında kullanılan sarf malzemeler ......................................................... 23 3.1.5. Tez kapsamında kullanılan çözeltiler .................................................................... 23 3.2. Yöntem ..................................................................................................................... 26 3.2.1. Kestane arı poleni örneklerinin toplanması .......................................................... 26 3.2.2. Kestane arı poleni örneklerinin palinolojik analizleri ........................................... 27 3.2.3. Örnek hazırlama işlemleri ..................................................................................... 28 3.2.4. Spektroskopik yöntemler ...................................................................................... 30 3.2.5. Kromatografik yöntemler ...................................................................................... 36 4. BULGULAR ............................................................................................................... 41 4.1. Spektroskopik Yöntemler......................................................................................... 41 4.1.1. İndirgen şeker tayini .............................................................................................. 41 4.1.2. Toplam fenolik madde tayini ................................................................................ 41 4.1.3. Antioksidan kapasite tayini ................................................................................... 43 4.1.4. Kestane arı polenlerinin DNA oksidasyonunu önleme etkisi ............................... 46 4.2. Kromatografik Yöntemler ........................................................................................ 47 4.2.1. Fenolik bileşiklerin analizi için validasyon parametrelerinin belirlenmesi .......... 47 4.2.2. Kestane arı poleni örneklerinde bulunan fenolik maddelerin tayini ..................... 53 4.2.3. Kestane arı poleni örneklerinde bulunan karotenoidlerin tayini ........................... 65 4.2.4. Kestane arı poleni örneklerinin DNA oksidatif baz hasar ürünlerine etkisi ......... 72 5. TARTIŞMA ve SONUÇ ............................................................................................. 75 iv 5.1. Spektroskopik Yöntemler......................................................................................... 76 5.1.1. Kestane arı poleni örneklerinin antioksidan özelliklerinin belirlenmesi .............. 76 5.1.2. Kestane arı poleninin DNA oksidasyonuna etkisinin incelenmesi ....................... 79 5.2. Kromatografik Yöntemler ........................................................................................ 79 5.2.1. Kestane arı poleninde bulunan fenolik bileşiklerin tayini .................................... 79 5.2.2. Kestane arı poleninde bulunan karotenoidlerin tayini .......................................... 91 5.2.3. Ekstraksiyonda Kullanılan Çözücülerin ve Ekstraksiyon Yönteminin Etkisi....... 94 5.2.4. Kestane arı poleninin DNA hasarını önleme kabiliyetinin incelenmesi ............... 95 KAYNAKLAR ............................................................................................................... 97 ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................. 102 v SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ Simge Açıklama A Absorbans dk Dakika C Derişim eV Elektrovolt G Gram 3 g/cm Gram/santimetreküp 2 R Korelasyon Katsayısı L Litre m Metre µm Mikrometre µL Mikrolitre µg Mikrogram µg/mL Mikrogram/mililitre µM Mikromolar mbar Milibar mg Miligram mg/100g Miligram/100gram mg/kg Miligram/kilogram mg/L Miligram/litre mg/mL Miligram/mililitre mL Mililitre mL/dk Mililitre/dakika mM Milimolar mm Milimetre Ε Molar absorpsiyon katsayısı M Molarite ng/L Nanogram/litre Nm Nanometre o C Santigrat Derece % Yüzde vi Kısaltmalar Açıklama ABTS 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) TPTZ 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazin 2HA 2-hidroksiadenin FapyGua 2,6-diamino-4-hidroksi-5-formamidopirimidin 28DHA 2,8-dihidroksiadenin 46D5NP 4,6-diamino-5-nitropirimidin FapyAde 4,6-diamino-5-(formilamino)pirimidin 5H5MH 5-hidroksi-5-metilhidantonin 5HH 5-hidroksihidantonin 5FU 5-formilurasil 5HU 5-hidroksiurasil 5HMU 5-hidroksimetilurasil 5HC 5-hidroksisitozin 5HMC 5-hidroksimetilsitozin 56DHT 5,6-dihidrotimin 56DHU 5,6-dihidrourasil 8HA 8-hidroksiadenin 8HG 8-hidroksiguanin Alx Allakson DNA Deoksiribo nükleik asit DAD Diyot seri dedektör GC Gaz Kromatografisi DW Kuru ağırlık SIM Seçili iyon izleme SRM Seçili reaksiyon izleme LOQ Tayin limiti LOD Tespit limiti TG Timin glikol TMCS Trimetilklorosilan MS Kütle spektrometri BSTFA N,O-Bis(trimetilsilil)trifloroasetamid UV Ultraviyole UV/VIS Ultraviyole/Görünür bölge HPLC Yüksek Perfomanslı Sıvı Kromatografisi vii ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Antioksidan kapasite tayin yöntemleri 16 Şekil 3.1. Kestane arı poleni örneklerinin lokaliteleri 18 Şekil 3.2. Kestane arı poleni örneklerinin ultrasonik ekstraksiyon akım 29 şeması Şekil 3.3. Kestane arı poleni örneklerinin katı-faz ekstraksiyon akım şeması 30 Şekil 3.4. GC-MS/MS analizi için örnek hazırlama aşamaları 40 Şekil 4.1. DNA’nın oksidatif strese karşı durumu 46 Şekil 4.2. DNA’nın kestane arı poleni varlığında oksidatif strese karşı 47 durumu Şekil 4.3. Standart fenolik bileşiklerin 280 nm’deki kromatogramları 50 Şekil 4.4. M0 numaralı kestane arı poleni etanol ekstraktının HPLC-DAD 53 kromatogramı Şekil 4.5. Kestane arı poleni etanol ekstraktlarının HPLC-DAD 55 kromatogramları Şekil 4.6. Kestane arı poleni etanol ekstraktlarının HPLC-DAD karotenoid 66 kromatogramları Şekil 5.1. Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 80 Şekil 5.2. Kestane arı poleni örneklerinin karotenoid profilleri 92 Şekil 5.3. Kestane poleninin DNA baz hasar ürünlerinin oluşumunu önleme 96 etkisi viii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. 2000-2009 yılları arasında Dünya’daki kestane üretimi 4 Çizelge 2.2. Türkiye’de kestane üretiminin durumu 5 Çizelge 2.3. Arı poleninin kimyasal içeriği 7 Çizelge 2.4. Çeşitli coğrafi bölgelerdeki farklı arı poleni örneklerinin fenolik 1 2 bileşik içerikleri Çizelge 2.5. Hidroksil radikalinin oluşumu 17 Çizelge 3.1. Çalışmalarda kullanılan cihazların özellikleri ve kullanım 19 amaçları Çizelge 3.2. Çalışmalarda kullanılan kimyasallar 20 Çizelge 3.3. Çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler 23 Çizelge 3.4. Kestane arı poleni örneklerinin lokaliteleri 27 Çizelge 3.5. İndirgen şeker tayini kalibrasyon verileri 31 Çizelge 3.6. Toplam fenol tayini kalibrasyon verileri 31 Çizelge 3.7. ABTS yöntemi kalibrasyon verileri 32 Çizelge 3.8. FRAP yöntemi kalibrasyon verileri 33 Çizelge 3.9. CHROMAC yöntemi kalibrasyon verileri 34 Çizelge 3.10. Fenton reaksiyonu için hazırlanan örnek karışımları 35 Çizelge 3.11. Fenolik bileşiklerin tayini için HPLC-DAD gradient hareketli faz 37 programı Çizelge 3.12. Karotenoidlerin tayini için HPLC-DAD gradient hareketli faz 38 programı Çizelge 3.13. GC-MS/MS cihazı çalışma koşulları 39 Çizelge 3.14. GC-MS/MS cihazı için sıcaklık programı 39 Çizelge 4.1. Kestane arı poleni örneğinin indirgen şeker sonuçları 41 Çizelge 4.2. M0 kestane arı poleni ekstraktlarının toplam fenolik madde 42 miktarı Çizelge 4.3. Kestane arı poleni örneklerinin toplam fenolik madde miktarları 43 Çizelge 4.4. M0 kestane arı poleni ekstraktlarının antioksidan kapasite 44 sonuçları Çizelge 4.5. Kestane arı poleni örneklerinin antioksidan kapasite miktarları 45 Çizelge 4.6. Standart fenolik bileşiklerin alıkonma zamanları ve kodlaması 49 Çizelge 4.7. Standart fenolik bileşiklerin validasyon parametreleri 51 Çizelge 4.8. M0 numaralı kestane arı polenindeki fenolik madde miktarları 53 (mg/kg örnek) Çizelge 4.9. Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik madde miktarları 61 (mg/kg örnek) Çizelge 4.10. Standart karotenoid bileşiklerin alıkonma zamanları ve 65 kodlaması Çizelge 4.11. Standart karotenoidlerin validasyon parametreleri 65 Çizelge 4.12. Kestane arı poleni örneklerindeki karotenoid miktarları (mg/kg 72 örnek) Çizelge 4.13. DNA oksidatif baz hasar ürünlerinin validasyon parametreleri 73 ix Çizelge 4.14. Kestane poleninin DNA hasarını önleme etkisi (%) 74 x 1. GİRİŞ Yaşamımız boyunca hücrelerde meydana gelen kimyasal reaksiyonlar veya UV-ışınları, sigara dumanı, çevre kirlilikleri gibi birçok dış etkenlerle birlikte vücudumuzda serbest radikal oluşumu gerçekleşmektedir. Oluşan bu serbest radikaller oldukça kararsız ve reaktif özellikte olduklarından lipit, protein, DNA gibi hücresel yapılara saldırarak yapılarda oksidatif hasara sebep olurlar. DNA’da oluşan hasarlar yaşlanma, kanser, mutasyon gibi durumların oluşmasına neden olur. Hücrelerde gerçekleşen reaksiyonlar sonucu oluşan serbest radikalleri vücuttaki doğal savunma mekanizmaları önlemektedir. Ancak dış etkenlerle serbest radikal miktarının artmasıyla bu savunma mekanizmaları yetersiz kalır. Dolayısıyla bu serbest radikallerle savaşacak, antioksidan özellik gösteren bileşenlerin vücuda alınması oldukça önem arz etmektedir. Gıdalar, önemli biyolojik aktiviteleri olan çeşitli sağlık destekleyici maddelerin doğal kaynağıdır. Meyve, sebze ve tıbbi bitkilerin içerdikleri doğal fenolik bileşikler sayesinde gösterdikleri antioksidan etki son yılların en önemli araştırma konuları arasında yer almıştır. Özellikle flavonoidler açısından zengin olan arı ürünleri, sahip oldukları anti-kanserojenik, anti-allerjik, anti-inflamatuar, anti-oksidan gibi biyoaktif özellikleri nedeni ile ilgi çekmektedir. Diğer arı ürünleri gibi zengin ve doğal gıda içeriğine sahip, besinsel ve tıbbi değeri yüksek bir ürün olan arı poleni yüzyıllardır halk tarafından kullanılmaktadır. Aminoasit, protein, hormon, enzim, karbohidrat, mineral, yağ, vitamin, fenolik bileşikler, fitokimyasallar ve antioksidatif ajanlar bakımından oldukça zengin olmasının yanında vücut tarafından çok çabuk sindirilen, kana karışan ve insanlar tarafından tüketilebilen değerli bir üründür. Kimyasal içeriği botanik ve coğrafik özelliklere göre değişkenlik gösteren arı poleni %1-5 oranında fenolik bileşik (flavonoid, fenolik asit, antosiyanin ve tanen) içermektedir. Dünya’daki kestane üretimi her geçen yıl artış göstermekte ve Türkiye’de bu artışa destek olmaktadır. Türkiye, 2009 yılında gerçekleştirdiği 61 697 tonluk üretimle dünya üçüncüsü olmuştur. Türkiye’nin kestane üretimi açısından Dünya sıralamasında önemli bir yere sahip olması ve literatüre bakıldığında kestane arı poleninin fenolik 1 bileşiklerinin kantitatif analizine dayalı yapılmış bir çalışma olmaması bizim için ilgi çeken nokta olmuştur. Bu doğrultuda, tez kapsamında Marmara ve Karadeniz bölgelerinin farklı coğrafi kesimlerinden toplanan kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik içeriğinin kalitatif ve kantitatif olarak belirlenmesi amaçlanmıştır. Hedeflenen amaç kapsamında, kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik ve karotenoid içerikleri kromatografik olarak belirlenmiştir. Yüksek fenolik içeriği spektroskopik olarak yapılan antioksidan kapasite tayin yöntemleri ile desteklenmiştir. Son olarak kestane arı poleninin fenolik maddelerce zengin olması göz önüne alınarak, DNA oksidatif hasarını önleme kabiliyeti incelenmiştir. 2 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Kestane Halk arasında ‘dağların ekmeği’ olarak bilinen aynı zamanda yetiştiği mevsimden dolayı ‘hüznün meyvesi’ olarak adlandırılan kestane, Fagaceae (kayıngiller) familyasının Castanea cinsine ait doğal bir orman ağacı meyvesidir (Karahocagil ve Tosun 2004, Karadeniz 2013). Kuzey yarım kürenin nemli-ılıman bölgelerinde yetişen kestane ağacının ilk yerleştiği yerin kesin olmamakla birlikte Anadolu olduğu bilinmektedir. Daha sonra kestane ağacı, Anadolu’dan Yunanistan’a oradan da İspanya ve Güney İtalya’ya yayılmıştır (Karahocagil ve Tosun 2004). Kestane ağaçları, gençken gri-çatlaksızken ileri yaşlarda kahverengi-çatlaklı bir yapıya dönüşen, 30 m’ye kadar boylanabilen dik bir gövde yapısına sahiptir. Geniş ve sert bir yapıda olan yaprakların üst yüzeyleri parlak yeşil, alt yüzeyleri ise tüylü gri-yeşil, kenarları ise dişlidir. Erkek ve dişi olmak üzere iki çeşit çiçek yapısına sahip olan kestane ağacının meyveleri (tohumları) ise sık-batıcı dikenlerle örtülü bir kabuk içerisinde yer almaktadır (Atasoy ve Altıngöz 2011, Karadeniz 2013). 200-500 yıl kadar yaşayabilen kestane ağaçları meyve türlerine, yaprak/dalların şekil ve tüylenmelerine göre sınıflandırılmaktadır (Atasoy ve Altıngöz 2011). 16 farklı türe sahip olan kestanenin, meyve türlerine göre ticari olarak en önemli türleri maddeler halinde verilmiştir (Atasoy ve Altıngöz 2011).  Castanea sativa Mill.  Castanea dentata Borkh.  Castanea mollisima Bl. Kestane Çiçeği Kestane Meyvesi  Castanea crenata Sieb.&Zucc. https://www.google.com.tr/sea https://www.google.com.tr/sea rch?q=kestank+%C3%A7i%C rch?q=kestane+meymeyv&sou 3%A7e%C4%9Fi&source=ln rce=lnms&tbm=isch&sa=X&v ms&tbm=isch&sa=X&ved=0a ed=0ahUahUKEwjDwqXgzu hUKEwiah_jhzODbAhWBAJ DbAahUKEwj1BL0Q_AUAU oKHUlrCU8Q_AUICiAU&bi ICi&biw=1242&bih=577#img w=1242&bih=577#imgrc=79x rc=WinrM-jfD-ZXIM: R74Y94mHbbM: Erişim tarihi: 18.06.2018 Erişim tarihi: 18.06.2018 3 Türkiye’de yetişen kestane türleri Castanea sativa Mill türü içerisinde yer almaktadır (Coşkuncu ve Mert 2011). 2.2. Kestane Üretimi ve Dünya Sıralaması Dünya’da kestane üretimi her geçen yıl artış göstermektedir. Dünya’daki toplam kestane üretimi 2000 yılında 937 747 ton iken 2009 yılında 1 408 329 tona yükselmiştir (Çizelge 2.1). Çin %77’lik (2009 yılı) bir oranla başlıca kestane üretimini gerçekleştiren ülke olmasına rağmen, 1980 yılında kestane üretiminde dünya altıncısı olan Türkiye, 2009 yılında gerçekleştirdiği 61 697 tonluk üretimle dünya üçüncüsü olmuştur (Atasoy ve Altıngöz 2011). Çizelge 2.1. 2000-2009 yılları arasında Dünya’daki kestane üretimi Üretim (Ton) Ülkeler 2000 2003 2005 2007 2009 2009 (%) Çin 465 197 797 168 1 031 860 925 000 1 085 000 77,2 Güney Kore 72 203 60 017 76 447 77 524 73 000 5,2 Türkiye 50 000 48 000 50 000 55 100 61 697 4,4 İtalya 38 884 42 416 52 000 50 000 52 146 3,7 Bolivya 26 752 50 000 57 057 42 801 53 577 3,8 Portekiz 25 910 33 267 22 327 22 000 20 752 1,5 Japonya 20 764 25 100 21 800 22 100 21 700 1,5 Yunanistan 11 900 16 800 19 086 14 999 14 000 1,0 İspanya 7 178 16 821 8 629 15 000 6 090 0,4 Fransa 10 284 10 118 8 144 8 284 8 692 0,6 Kuzey Kore 6 558 9000 11 528 9 000 7 785 0,6 Peru 1 547 759 600 778 864 0,06 Azerbaycan 462 937 1 937 1 887 839 0,06 Dünya 937 747 1 113 652 1 363 986 1 246 554 1 408 329 100 4 Kestane ağaçları kestane dal kanseri (Crphonectria parasitica) ve mürekkep (Phytopthora cambivora) hastalıkları ile savaşmaktadır (Karadeniz 2013, Karahocagil ve Tosun 2004). Ülkemizde kestane üretiminde yıllar geçtikçe artış-azalışların olduğu görülmektedir (Çizelge 2.2). Bu durumda kestane kanseri ve mürekkep hastalığının etkisi büyüktür. Son yıllarda üretimde artış gözlense de bu hastalıklarla mücadelede kültürel ve biyolojik önlemler dışında henüz bir yöntem uygulanmamaktadır. Çizelge 2.2. Türkiye’de kestane üretiminin durumu Üretim (ton) Ülke 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 Türkiye 61 697 59 171 60 270 57 881 60 019 63 762 63 750 64 750 2.3. Kestane ve Kestane Ürünlerinin Önemi Kestane kerestesi suya dayanıklı olmasından dolayı iskele, kayık, yat ve gemi yapımının yanı sıra ev ve ofis dekorasyonlarında (masa, sandalye, çit, kapı, pencere vb.) kullanılmaktadır. Ayrıca tanen içeriği zengin olan kestanenin meyve kabuğu, dal ve yaprakları boya sanayisinde renk pigmenti olarak kullanılmaktadır. Kestane meyvesi ise taze ve çerez olarak tüketilmenin haricinde reçel ve konserve sanayisi, bal üretimi, şeker, dondurma ve çikolata sanayisi gibi farklı gıda alanlarında da çok fazla kullanılmaktadır. Ayrıca yeterli buğday ununa sahip olmayan eski toplumlar ‘ekmek ağacı’ olarak ifade ettikleri kestaneyi un olarak kullanmışlardır. 2.4. Arı Poleni Apiterapi; bal, arı sütü, polen, propolis gibi arı ürünlerinin insan sağlığı için kullanılmasıdır ve yüzyıllardır halk tıbbında hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır (Yıldız ve ark. 2013, Amany ve ark. 2014). Arı ürünleri geleneksel tıbbın yanı sıra besin takviyesi olarak gıda alanında da kullanılmaktadır (Isla ve ark. 2001). Arı poleni, insanlar tarafından tüketilebilen, zengin ve doğal gıda içeriğine sahip besinsel ve tıbbi değeri oldukça yüksek olan özel bir gıda ürünü olarak kabul edilmektedir (Bogdanov 2004). Ayrıca diğer apikültürel ürünlerin yanı sıra anti-bakteriyel, anti-fungal gibi 5 terapötik özelliklere sahip olmasından dolayı arı poleni son yıllarda artan ilgiye sahiptir (Carpes ve ark. 2007). “Hayat veren toz” olarak adlandırılan arı poleni zengin protein içeriğinden dolayı bal arısı kolonilerinin hayatta kalması ve yeniden üreyebilmesi için gerekli olan temel besin kaynağıdır (Bogdanov 2004, Roman ve ark. 2007, Kao ve ark. 2011, Pascoal ve ark. 2014). Bitkilere nektar almak için konan işçi arılar, üzerlerine yapışan, bitkilerin erkek üreme organı olan, polen tozlarını ağızlarından çıkan salgı ile birlikte yapışkan hale getirerek arka ayaklarındaki polen sepetçiklerine yerleştirirler. Kovana gelen arılar polen sepetçiklerindeki polenlerin bir kısmını koloninin beslenmesi için kullanırken bir kısmını da kovan girişlerindeki tuzaklara süpürürler (Erdoğan ve Dodoloğlu 2005, Kao ve ark. 2011, Pascoal ve ark. 2014). Tuzaklarda biriken polenler arıcılar tarafından toplanarak temizlenir ve kurutulur. 2.5. Arı Poleninin İçeriği ve Önemi Arılar tarafından toplanan polen insan tüketimi için potansiyel bir enerji kaynağı olarak düşünülebilir. Arı poleni protein, amino asit, karbohidrat, mineral, yağ, vitamin, hormon, enzim gibi fitokimyasallara ek olarak flavonoidler başta olmak üzere önemli miktarda polifenolik madde içermektedir (Bogdanov 2004, Carpes ve ark. 2007, Eraslan ve ark. 2010, Feas ve ark. 2012, Hegazi 2012, Yıldız ve ark. 2013, Pascoal ve ark. 2014, Ulusoy ve Kolaylı 2014). Ancak arı poleninin kimyasal bileşimi bitki türüne, bitkinin yaşına ve beslenme durumuna, toprak tipine, iklim koşullarına ve arıcılık faaliyetlerine bağlı olarak değişmektedir (Feas ve ark. 2012, Pascoal ve ark. 2014). Buna bağlı olarak arı poleni taneleri biçim, boyut, açıklık, renk gibi morfolojik özellikleri bakımından farklılıklar göstermektedir (Carpes ve ark. 2007). Arı poleninin sahip olduğu bileşenlerin içeriği genel hatlarıyla Çizelge 2.3’te verilmiştir (Erdoğan ve Dodoloğlu, 2005). Arı poleni antioksidan (Morais ve ark. 2011), anti-bakteriyel (Basim ve ark. 2006), anti- fungal (Özcan 2004), anti-radyasyon (Bevzo 1997), anti-kanser (Furusawa 1995) hepatoprotektif (Eraslan ve ark. 2009), kemoprotektif (Pinto ve ark. 2010), anti- inflamauvar (Maruyama ve ark. 2010) gibi birçok terapötik özelliklere sahiptir (Kao ve 6 ark. 2011, Feas ve ark. 2012, Carpes ve ark. 2013, Yıldız ve ark. 2013, Pascoal ve ark. 2014, Ulusoy ve Kolaylı 2014). Arı poleninin bu terapötik ve koruyucu etkileri bünyesindeki polifenolik madde içeriğinden kaynaklanmaktadır (Pascoal ve ark. 2014). Çizelge 2.3. Arı poleninin kimyasal içeriği Bileşen İçerik Enerji 2,46 kcal/g Protein %23,7 Karbohidrat %27 Yağ %4,8 Su %11 İndirgenmiş şeker %26 İndirgen olmayan şeker %3 Nişasta %3 Aminoasit Bilinen tüm aminoasitler Enzim Diastaz, fosfotaz, amilaz vb. Vitaminler C, E, B1, B2, B3, B5, B6, B9 Mineraller Makro Elementler: K, Na, Ca, Mg, P, S. İz Elementler: Al, B, Cl, Cu, I, Fe, Mn, Ni, Si, Ti, ve Zn. Büyüme düzenleyicileri Auxins, brassins, gibberellins, kinins Flavonoidler En az 8 çeşit Karotenoidler En az 11 çeşit Organik asitler Fenolik asitler dahil en az 6 çeşit Zengin ve doğal içeriği sebebiyle günlük ihtiyacımız olan bileşenleri karşılamamıza büyük ölçüde yardımcı olan arı poleni vücudumuz için oldukça önemli bir besin maddesidir. Arı poleni soğuk algınlığı, solunum yolu hastalıkları, kardiyovasküler ve sindirim sistemi hastalıkları, ülser, anemi gibi hastalıkların tedavisinde yararlı etkileri olduğu tespit edilmiştir (Medeiros ve ark. 2008, Kao ve ark. 2011, Pascoal ve ark. 2014, Ulusoy ve Kolaylı 2014). Ayrıca arı poleninin; 7  Alerjik hastalıkların tedavisinde etkili olduğu,  Aşırı stresin etkisini ortadan kaldırdığı,  Büyüme ve gelişmenin hızlanmasında etkili olduğu,  Zekâyı kuvvetlendirdiği,  Prostatı iyileştirici etkiye sahip olduğu,  Saç dökülmelerini önlediği,  Yanık ve yaraların tedavisinde etkili olduğu,  Yüksek tansiyon hastaları için iyileştirici etkisi olduğu,  Mikrop öldürücü etkiye sahip olduğu,  Kısırlık sorununun çözülmesinde etkili olduğu,  Radyasyon ve X-ışınlarının zararlı etkilerinden koruduğu,  Yaşlanmayı geciktirdiği rapor edilmiştir. Arı poleni apiterapi dışında,  Verimliliklerini ve gelişimlerini arttırmak için evcil hayvanların beslenmesinde,  Gıda sanayisinde pasta, kek, çörek gibi ürünlerin yapımında,  Hücre yenileyici etkisi sayesinde kozmetik sanayisinde krem, yüz temizleme losyonu, yüz temizleme sütü gibi ürünlerin yapımında kullanılmaktadır. 2.6. Fenolik Bileşikler ve Önemi Benzen halkasına bir ya da daha fazla hidroksil (-OH) grubunun bağlı olduğu bileşikler polifenoller ya da fenolik bileşikler olarak adlandırılır. Fenolik bileşikler, fenolik asitler ve bitkisel fenoliklerin en önemli kısmını oluşturan flavonoidler olmak üzere ikiye ayrılmaktadır. 8 Fenolik bileşikler meyve ve sebzelerin lezzetinin oluşmasında aynı zamanda renklerinin belirlenmesinde etkili olan doğal bileşenlerdir. Genellikle güçlü antioksidan aktivitelerine atfedilen sağlığa yararlı etkileriyle bilinirler. Emilimden önce gastrointestinal sistemde görülürler. Flavonoidler elde edilen yüksek konsantrasyonları sebebiyle gastrointestinal sistemde direk antioksidan etki gösterebilir veya toksin metabolize edici enzimleri düzenleyebilirler (Sousa ve ark. 2015). Antioksidan aktivite genellikle antioksidan enzimlerinin (peroksidaz, katalaz vb.) aktivitesine bağlı olduğu kadar karotenoid, askorbik asit, tokoferoller ve fenolik maddeler gibi düşük moleküllü bileşenlerin içeriğine de bağlıdır (Leja ve ark. 2007). Antioksidan bileşiklerin en önemli kaynakları insan beslenmesi için sağlığı geliştiren meyve ve sebzelerdir (Leja ve ark. 2007). Meyve ve sebzelerin sahip olduğu bu antioksidan özellikler bünyelerinde barındırdıkları C-E vitaminleri ve karotenoidlerden çok flavonoidlerden kaynaklanmaktadır. Besin fitokimyasallarının antioksidatif aktivitesi, yüksek miktarda meyve ve sebze tüketen popülasyonlarda insan dejeneratif hastalıklarında azalma ile ilişkilendirilmiştir (Caldwell 2003). Flavonoidler, insan vücudunda metabolizma sonrası ortaya çıkan serbest radikallerin sebep olduğu oksidatif hasarı etkisiz hale getirerek, doku fonksiyonlarının bozulması sonucu ortaya çıkan birçok hastalığa neden olabilecek zincir reaksiyonları önlediği bilinmektedir (Leja ve ark. 2007, Kolaç ve ark. 2017). Bu doğal antioksidanların (flavonoidler) serbest radikal süpürücü özellikleri ile reaktif oksijen türleri arasındaki etkileşimi; iltihaplanmalarda, kalp hastalığı veya kanser gibi anjiogenez ile ilgili hastalıklarda olumlu etkilere sebep olmaktadır (Saric ve ark. 2009). Flavonoidler farklı yapısal özelliklere sahiptirler ve bu farklı yapılarından dolayı çeşitli biyolojik aktiviteler gösterirler. Epidemiyolojik çalışmalar, fenolik antioksidanların tüketiminin artması ile kardiyovasküler hastalık ve belirli kanser türlerine yakalanma riskinin azalması arasında bir ilişki olduğunu göstermiştir (Cook ve Samman 1996, Pinto ve ark. 2010). Ayrıca flavonoidlerin östrojenik ve anti-östrojenik etkileriyle menopozal semptomları ve menopoz sonrası osteoporozu önleyebileceği veya hafifletebileceği, kadınlarda meme kanserinin önlenmesinde kullanılabileceği önerilmiştir (Oh ve Chung 2006, Saric ve ark. 2009). 9 Flavonoidlerin antioksidan ve radikal süpürücü özellikleriyle tanınmalarının yanı sıra anti-mikrobiyal, anti-fungal, anti-radyasyon, immünomodülatör ve anti-inflamatuar aktiviteleri ile de bilinir, proinflamatuar sitokin üretimini ve reseptörleri inhibe ederler. Ayrıca alerjik ve inflamatuar tepkilerde yer alan birçok enzim sistemini etkilemektedirler (Medeiros ve ark. 2008, Pascoal ve ark. 2014). Flavonoidler antioksidan, anti-inflamatuar ve anti-kanser aktivitenin yanı sıra in-vitro hücre sistemlerinde mutajenik, pro-oksidan veya pro-apoptotik oldukları kanıtlanmıştır (Pinto ve ark. 2010). Gıdalar, önemli biyolojik aktiviteleri olan çeşitli sağlık destekleyici maddelerin doğal kaynağıdır. İnsan sağlığını geliştirmek için gıda bileşenlerinin fonksiyonel ve besinsel özellikleri incelenmektedir. Meyve, sebze ve tıbbi bitkilerin farklı fenolik içerikleri ile antioksidan özellikleri arasındaki karşılıklı bağımlılık uzun yıllardan beri incelenmektedir (Leja ve ark. 2007). Özellikle flavonoidler açısından zengin olan bal arısı ürünlerinin araştırılması son yıllarda önem ve hız kazanmıştır (Leja ve ark. 2007). Fenolik bileşiklerin araştırılmasında ve antioksidan kapasitenin belirlenmesinde çeşitli yöntemler mevcuttur. Ancak bu yöntemler deney prensipleri ve koşulları açısından farklılık göstermektedirler (Mohdaly ve ark. 2015). Bu nedenle sağlam, hassas, seçici ve güvenilir analitik tekniklerin kullanılması son derece önemlidir (Fanali ve ark. 2013). Flavonoid ve türevlerinin nitel ve nicel olarak incelenmesinde kullanılan en popüler ve en güvenilir kromatografik teknikler; HPLC-DAD (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi-Diot Serili Dedektör), HPLC-MS (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi-Kütle Dedektörü), UHPLC (Ultra-Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi), LC-UV (Sıvı Komatografisi-Ultraviyole Dedektör) ve LC-MS olarak sıralanabilir (Sıvı Kromatografisi-Kütle Dedektörü) (Fanali ve ark. 2013). 2.7. Polenin Antioksidan Özelliği ve Fenolik Bileşiklerin Tayini İşlenmiş gıdalar yapay tatlar, renklendirici maddeler, emülsiye edici bileşenler, stabilizatörler ve sentetik antioksidanlar içermektedir. Bütil hidroksi anisol (BHA) ve bütil hidroksi tolüen (BHT) gibi sentetik fenolik bileşikler gıda endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak son yıllarda bu sentetik fenolik bileşiklerin düzenli olarak kullanımının sağlıksız ve kanserojen olabileceği yönünde endişeler ortaya 10 çıkmaya başlamıştır. Bu nedenle sentetik bileşenlerin yerini doğal bileşenlerin almasına yönelik gıda bilimcileri tarafından yapılan çalışmalar hız kazanmıştır (Carpes ve ark. 2013, Mohdaly ve ark. 2015). Arı poleni antioksidanlar olarak hareket edebilen vitaminler ve başlıca flavonoidler olmak üzere polifenolik bileşenlerce zengin olan doğal bir besin maddesidir (Ulusoy ve Kolaylı 2014). Çeşitli çalışmalar polifenollerin redoks özellikleri olan, indirgeyici ajanlar olarak hareket eden antioksidanlar olduğunu ortaya koymuştur (Caldwell 2003). Örneğin Cheng ve ark. (2013) tarafından yapılan bir çalışmada, fareler tarafından alınan arı poleninin lipit oksidasyon ürünlerinin seviyesini düşürdüğü ve antioksidan enzimlerin aktivitesini arttırdığı gözlemlenmiştir. Arı poleni üzerine yapılan çalışmalarda, farklı coğrafi veya bitkisel kökenli yetişen bitkilerden toplanan polenlerin farklı fenolik bileşik içeriğine sahip olduğu görülmüştür (Saric ve ark. 2009). Çizelge 2.4’te farklı coğrafi bölgelerdeki farklı türde toplanan arı poleni örneklerinin fenolik bileşik içerikleri verilmiştir. 11 Çizelge 2.4. Çeşitli coğrafi bölgelerdeki farklı arı poleni örneklerinin fenolik bileşik içerikleri Polen Türü Ekstraksiyon Türü Analiz Fenolik Bileşik Kaynak Yöntemi Sığırkuyruğu Çözücü (Metanol) LC-MS Siyanidin-3-O-glikozit, Naranjo ve ark. Ekstraksiyonu Siyanidin-3-O-rutinosid, 2004 Siyanidin-3-(6”-malonyl-glikozit), Peonidin-3-O-rutinosid, Delfinidin-3-O-rutinosid, Delfinidin-3-O-glikozit, Petunidin-3-O-glikozit Çiçek poleni Çözücü (Etanol) oaTOF-MS Asetin glikozit, Roman ve ark. Ekstraksiyonu 7-O-metilherbasetin-3-sophorosid, 2007 Galloil-glikoz, Kuersetin-3-sophorosid, Apigenin-6,8-di-C-glikozit, Kuersetin-3-rutinosid, Genistein-7-O-β-D-glikozit, Luteolin-7-O-glikozit, Apigenin-7-O-glikozit, 2′,4′,6′-trihidroksi-3′-formildihidrokalkon Çiçek poleni Çözücü (Metanol) HPLC-DAD Mirisetin, Tirisetin, Kamferol, Luteolin Medeiros ve (Mimoza,Okaliptüs, Ekstraksiyonu ark. 2008 Cecropia ve Sugüveyiotu) 12 Çizelge 2.4. (Devam) Çeşitli coğrafi bölgelerdeki farklı arı poleni örneklerinin fenolik bileşik içerikleri Laden Çözücü (Metanol) HPLC-UV/Vis Kamferol, Kuersetin, Mirisetin, İsorhamnetin, Saric ve ark. Ekstraksiyonu Galangin, Taksifolin, Luteolin, Pinocembrin, 2009 Naringenin, Genistein, Daidzein, Krisin, Kafeik asit Cistus sp. Çözücü (Etanol) HPLC-DAD Kuersetin-7-ramnosid, Kamferol-3-glikozit, Maruyama ve Brassica sp. Ekstraksiyonu Kuersetin, Kamferol, İsorhamnetin ark. 2010 C. incanus L. Çözücü (Etanol) HPLC-UV/Vis Kafeik asit, Kumarik asit, Galangin, İsorhamnetin, Pinto ve ark. S. alba L. Ekstraksiyonu Kamferol, Mirisetin, Kuersetin, Luteolin, Krisin, 2010 Daidzein, Genistein, Naringenin, Pinocembrin, Taksifolin Çay Çözücü (Etanol) RP-HPLC Gallik asit, Metil gallat, p-kumarik asit, Ferulik Kao ve ark. Ekstraksiyonu asit, Kafeik asit, Mirisetin, Rutin, Kateşin, 2011 Klorojenik asit Çözücü (Su) Ekstraksiyonu S. chinensis Çözücü (Etanol) HPLC-DAD Gallik asit, Protokatekuik asit, Vanilik asit, Cheng ve ark. Ekstraksiyonu p-kumarik asit, Resveratrol, Kuersetin, Hesperetin, 2013 Kamferol, Galangin Çiçek poleni Çözücü (Metanol) Nano-LC Gallik asit, Protokatekuik asit, p-hidroksibenzoik Fanali ve ark. Ekstraksiyonu asit, Gentisik asit, Vanilik asit, Kafeik asit, Siringik 2013 asit, p-kumarik asit, Ferulik asit, o-kumarik asit, Mirisetin, Kuersetin, Sinamik asit, Naringenin, Hesperetin, Kamferol 13 Çizelge 2.4. (Devam) Çeşitli coğrafi bölgelerdeki farklı arı poleni örneklerinin fenolik bileşik içerikleri Anzer Çözücü (Etanol) RP-HPLC Gallik asit, Kafeik asit, p-kumarik asit, Ulusoy ve Ekstraksiyonu Protokatekuik asit, Ferulik asit, o-kumarik asit, Kolaylı 2013 Epikateşin, Benzoik asit, Vanilik asit, p-hidroksibenzoik asit, Siringik asit, Klorojenik asit, trans-sinamik asit, Kateşin, Rutin, 2,4-cis,trans-absisik asit, Arı poleni Çözücü (Metanol) HPLC Gallik asit, Vanilik asit, Siringik asit, p-kumarik Mohdaly ve Ekstraksiyonu asit, Ferulik asit, Kafeik asit, Kuersitrin, Kateşin, ark. 2015 Epikateşin, α-kateşin, Kamferol, Apigenin, 3,4-dimetoksisinamik asit, Naringenin, Luteolin E. plantagineum Çözücü (Metanol) HPLC-DAD Kamferol-3-O-(4″-rhamnosil)-neohesperidosid, Sousa ve ark. Ekstraksiyonu Kamferol-3-O-sophorosid, 2015 Kamferol-3-O-neohesperidosid, Kamferol-3-O-neohesperidosid-7-O-rhamnosid, Kamferol-3-O-glikozit, Kamferol-3-O-rutinosid + Kamferol-3-O-(3″/4″- asetil)-neohesperidosid, Delfinidin-3-O-glikozit, Delfinidin-3-O-rutinosid, Petunidin-3-O-glikozit, Petunidin-3-O-rutinosid, Malvidin-3-O-rutinosid 14 Çizelge 2.4. (Devam) Çeşitli coğrafi bölgelerdeki farklı arı poleni örneklerinin fenolik bileşik içerikleri Karpuz tohumu, Sıvı-sıvı Ekstraksiyon LC-MS/MS Kamferol-3-O-ß-ɒ-glukosil-(2→l)-ß-ɒ-glikozit, Zhou ve ark. kolza, kamelya, Quercetin-3-O-ß-ɒ-glukosil-(2→l)-ß-glikozit, 2015 gelincik, mısır, Soxhlet Ekstraksiyonu Kamferol-3,4’di-O-ß-ɒ-glikozit aslan kulağı, karabuğday, Ultrasonik-destekli susam, bakla, gül Ekstraksiyon (Etanol) Arı poleni Çözücü (Etanol) HPLC-PDA p-kumarik asit, Ferulik asit, Rutin, Mirisetin, Almeida ve Ekstraksiyonu trans-sinamik asit, Kuersetin, Kamferol ark. 2017 15 2.8. Fenolik Bileşiklerin Spektroskopik Tayini Fenolik bileşikler, kolayca okside olabilen bileşenlerin oksidasyonunu büyük ölçüde önleyen bileşenler olarak bilinmektedirler. Bu nedenle doğal fenolik bileşiklerce zengin olan gıda ürünlerinin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi günümüzde ilgi odağı olmuştur. Antioksidan kapasiteyi belirlemek için çok fazla yöntem geliştirilmiştir. Geliştirilen bu yöntemler elektron ve hidrojen atomu transferi olmak üzere Şekil 2.1’de belirtildiği gibi iki türe ayrılmaktadır (Albayrak ve ark. 2010, Şahin ve Demir 2013). Analizlerde gerçekleşen renk değişimleri antioksidan maddenin miktarına göre değişmektedir. Antioksidan Kapasite Tayin Yöntemleri Hidrojen Transferine Elektron Transferine Dayalı Yöntemler Dayalı Yöntemler ORAC TRAP FCR DPPH CUPRAC ABTS FRAP CHROMAC Şekil 2.1. Antioksidan kapasite tayin yöntemleri 2.9. DNA ve Oksidasyonu DNA, tüm organizmaların hücresel işlevselliği için önemli olan ve genetik bilgileri taşıyan bir biyomakromoleküldür. Pürin (adenin ve guanin) ve pirimidin (sitozin ve timin) bazları arasındaki hidrojen bağları ile çift zincirli sarmal bir yapıya sahiptir (Hari ve ark. 2012). DNA’nın yapısının çeşitli sebeplerle bozulması olayına denatürasyon 16 denir ve bu bozulma 260 nm dalga boyundaki absorbansın ölçülmesiyle belirlenmektedir (Akçay 2006). Serbest radikaller; vücudun kendi metabolizması esnasında, UV ışını, sigara, stres, karbon monoksit, ozon, hava kirliliği, ilaç toksinleri gibi birçok etken tarafından oluşan, eşleşmemiş elektron içeren, kararsız ve reaktif olan bileşenlerdir. Bu reaktif olma özelliklerinden dolayı hücrelere, protein ve DNA’ya saldırarak hasar oluştururlar. DNA’nın yapısındaki pürin ve pirimidin bazlarına saldırması ile çeşitli DNA baz hasar ürünleri oluşur (Dizdaroğlu 2012). Serbest radikaller arasında biyomoleküllerle daha güçlü reaksiyona girmelerinden dolayı en toksik ve en reaktif özelliğe sahip olan hidroksil radikali (•OH) Haber-Weiss ve Fenton reaksiyonu ile oluşmaktadır (Çizelge 2.5) (Karabulut ve Gülay 2016). Çizelge 2.5. Hidroksil radikalinin oluşumu - - Haber-Weiss reaksiyonu O2• + H2O2 •OH + OH + O2 2+ - 3+ Fenton reaksiyonu Fe + OH •OH + OH + Fe Biyolojik sistemlerde önemli bir role sahip olan demir, canlı hücrelerde serbest formda iken toksik etki göstermektedir. Bu toksik etki sonucu DNA, lipit, protein gibi yapılarda meydana gelebilecek olan hasarlar, serbest demirin fazlasını demirin toksik olmayan formlarına dönüştüren hücre savunma mekanizmaları yardımıyla önlenmektedir (Albertsen 2006). Ancak dış etkenlerle serbest radikal miktarının artmasıyla bu savunma mekanizmaları yetersiz kalır ve oksidatif stres denilen durum oluşur. Oksidatif stres sonucu DNA’da meydana gelen hasar, yaşlanma, kanser, mutasyon gibi durumlar oluşur (Sastre ve ark 2000). 17 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Tez kapsamında çalışılan kestane arı polenleri Tez kapsamında 2016 yılında Marmara bölgesi Bursa/Uludağ/Cumalıkızık köyünden toplanan kestane arı poleni örneği ve 2017 yılında Karadeniz ve Marmara bölgelerinin farklı lokalitelerinden toplanan 17 kestane arı poleni örneği olmak üzere toplam 18 farklı örnek ile çalışılmıştır. Kestane arı poleni örnekleri Bursa (7 adet), Balıkesir (1 adet) ve Zonguldak (10 adet) illerinde yer alan kestane ormanlarında faaliyetlerini sürdüren arıcılardan temin edilmiştir. Arıcılar tarafından toplanan kestane poleni örneklerinin lokaliteleri Şekil 3.1’de gösterilmektedir. Örnekler analiz süresine kadar o -24 C’de saklanmıştır. Şekil 3.1. Kestane arı poleni örneklerinin lokaliteleri 3.1.2. Tez kapsamında kullanılan cihazlar Tez kapsamında yapılan çalışmalarda kullanılan cihazların özellikleri ve kullanım amaçları Çizelge 3.1’de verilmiştir. 18 Çizelge 3.1. Çalışmalarda kullanılan cihazların özellikleri ve kullanım amaçları Cihaz Adı Özellikleri Kullanım Amacı UV-VIS Cary 50 Conc, Kestane arı polenlerinin fenolik madde ve Spektrofotometresi Varian antioksidan kapasitesinin belirlenmesi ve DNA oksidasyonuna etkisinin incelenmesi çalışmalarında kullanılmıştır. Yüksek performanslı 1200 Series, Kestane arı polenlerindeki fenolik madde ve sıvı kromatografisi-diod Agilent karotenoidlerin kantitatif tayininde serili dedektör (HPLC- Technologies kullanılmıştır. DAD) Gaz kromatografisi- Trace 1300, DNA oksidatif baz hasar ürünlerinin tayininde kütle spektrometresi Thermo Scientific kullanılmıştır. /kütle spektrometresi (GC-MS/MS) Liyofilizatör FreeZone 2,5 Plus, Oksidatif baz hasar ürünlerinin Labconco belirlenmesinde örnek hazırlama aşamasında kullanılmıştır. Çoklu manyetik MS-MP8, Analizlerde kullanılacak çözeltilerin karıştırıcı Wisd hazırlanmasında kullanılmıştır. Isıtıcılı manyetik Are, Analizlerde kullanılacak çözeltilerin karıştırıcı Velp hazırlanmasında kullanılmıştır. Ultrasonik banyo 2,8 L, Kestane arı poleni örneklerinin United hazırlanmasında kullanılmıştır. pH metre HI 221, Analizlerde kullanılacak tampon çözeltilerin Hanna hazırlanmasında kullanılmıştır. Santrifüj Z 206 A, Kestane arı polenlerinin örnek hazırlama Hermle aşamasında kullanılmıştır. Peristaltik pompa Watson 323, Kestane arı polenlerinin katı faz ekstraksiyonu Marlow aşamasında kullanılmıştır. Etüv DRY-Line, DNA oksidatif baz hasar ürünlerinin tayininde VWR türevlendirme amacıyla kullanılmıştır. Vorteks karıştırıcı VM-10, Türevlendirme aşamasında örnek hazırlamada Wisd kullanılmıştır. Analitik terazi MS105DU, Kestane arı polenlerinin ve analizlerde METTLER kullanılacak kimyasalların tartımında (± 0,00001 g kullanılmıştır. hassasiyet) Saf su cihazı Option Q DV25, Analizlerde kullanılan saf suyun temininde Elga Purelab kullanılmıştır. 19 3.1.3. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar Analitik saflıktaki kimyasallar Tez kapsamında yapılan çalışmalarda kullanılan kimyasallar Çizelge 3.2.’de verilmiştir. Çizelge 3.2. Çalışmalarda kullanılan kimyasallar Kimyasal Adı Firma Katalog Numarası (-)-epigallokateşin Extrasynthese 0979 S (-)-epigallokateşin gallat Extrasynthese 0981 S (-)-epikateşin Extrasynthese 0977 S (+)-kateşin Extrasynthese 0976 S α-karoten Sigma-Aldrich 40395 β-karoten Sigma-Aldrich C4582 β-kriptoksantin Extrasynthese 0317 S 1,5-difenilkarbazit Sigma-Aldrich 259225 2-hidroksiadenin TRC I819000 2,4,6-tris (2-piridil)-s-triazin Sigma-Aldrich 93285 2,6-diamino-4-hidroksi-5- Pubchem 127546 formamidopirimidin 2,8-dihidroksiadenin TRC D45105 4,6-diamino-5-formamidopirimidin Santa Cruz 217034 4,6-diamino-5-nitropirimidin Sigma-Aldrich S454605 5-formil urasil IS Chemical Tech 1195080 5-hidroksi-5-metilhidantonin TRC H947500 5-hidroksihidantonin TRC H943000 5-hidroksimetil sitozin TRC H945870 5-hidroksimetil urasil Sigma-Aldrich 852589 5-hidroksiurasil Pubchem 73268 5-hidroksisitozin Pubchem 3014752 5,6-dihidroksi metilurasil Sigma-Aldrich D7628 5,6-dihidrotimin TRC D449440 8-hidroksi-2’-deoksiguanozin Sigma-Aldrich H5653 8-hidroksiadenin Pubchem 5355054 ABTS Sigma-Aldrich A1888 20 Çizelge 3.2. (Devam) Çalışmalarda kullanılan analitik saflıktaki kimyasallar Kimyasal Adı Firma Katalog Numarası Alloksan Titan Biotech 2244113 Amentoflavon Hwi Analytik GmbH 1617-53-4 Amonyum heptamolibdat tetrahidrat Merck 101180 Asetik asit Merck 100063 Astaksantin Dr. Ehrenstorfer GmbH CA10307000 Apigenin Sigma-Aldrich 10798 Bakır (II) sülfat pentahidrat Sigma-Aldrich 209198 Buzağı timüs DNA’sı Sigma-Aldrich D4522 D-(+) Glikoz Sigma-Aldrich 47829 Demir (III) klorid Merck 803945 Demir (II) sülfat heptahidrat Merck 103965 Ellagik asit Sigma-Aldrich E2250 Etanol Merck 100983 Folin-Ciocalteau reaktifi Sigma-Aldrich F9252 Formik asit Merck 100264 Fosforik asit Merck 100563 Galangin Extrasynthese 1114 S Gallik asit Sigma-Aldrich 27645 Genkvanin Extrasynthese 1147 Hidrojen peroksit Sigma-Aldrich 16911 Hidroklorik asit Merck 100314 Hiperozid HWI Analytik GMBH 482-36-0 İsorhamnetin Sigma-Aldrich 17794 Kamferol Sigma-Aldrich K0133 Kafeik asit-fenetil esteri Sigma-Aldrich C8221 Klorojenik asit Sigma-Aldrich C3878 Krisin Sigma-Aldrich 95082 Kuersetin-3-β-D-glikozit Sigma-Aldrich 17793 Kuersitrin Hwi Analytik GmbH 117-39-5 L-triptofan Sigma-Aldrich T0254 Lutein Extrasynthese 0306 S Luteolin Hwi Analytik GmbH 491-70-3 21 Çizelge 3.2. (Devam) Çalışmalarda kullanılan analitik saflıktaki kimyasallar Kimyasal Adı Firma Katalog Numarası Metanol Merck 106007 Mirisetin Sigma-Aldrich 70050 N,O-Bis(trimetilsilil)trifloroasetamid Sigma-Aldrich 15222 Naringin Sigma-Aldrich 71162 p-hidroksibenzoik asit Sigma-Aldrich 240141 Pinocembrin Sigma-Aldrich P5239 Piridin Sigma-Aldrich 270970 Potasyum dikromat Sigma-Aldrich 207802 Potasyum klorür Sigma-Aldrich 746436 Potasyum peroksidisülfat Merck 105091 Protokatekuik asit Sigma-Aldrich 08992 Rosmarinik asit Sigma-Aldrich 536954 Salisilik asit Sigma-Aldrich 247588 Sodyum arsenat dibazik heptahidrat Sigma-Aldrich A6756 Sodyum asetat trihidrat Sigma-Aldrich S8625 Sodyum bikarbonat Merck 106329 Sodyum dihidrojen fosfat Merck 141677 Sodyum hidroksit Sigma-Aldrich 795429 Sodyum karbonat Sigma-Aldrich 791768 Sodyum potasyum tartarat tetrahidrat Sigma-Aldrich 217255 Sodyum sülfat Merck 106649 Sülfürik asit Merck 100731 ter-bütil metil eter Merck 101845 trans-kalkon Sigma-Aldrich 136123 Trietilamin Merck 808352 Trimetilklorosilan Merck 102333 Troloks Sigma-Aldrich 238813 Vanilik asit Merck 841025 Viteksin Sigma-Aldrich 49513 Zeaksantin Dr. Ehrenstorfer GmbH CA17947500 22 3.1.4. Tez kapsamında kullanılan sarf malzemeler Tez kapsamında kullanılan sarf malzemeler Çizelge 3.3 ’te verilmiştir. Çizelge 3.3. Çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler Malzeme Adı Firma Katalog Özellikleri Numarası Bond Elut C18 kartuş Agilent Technologies 14256023 5 g / 20 mL / 120 μm Mikropipet Eppendorf Research Z683809 10 – 100 µL Mikropipet Eppendorf Research Z683825 100 – 1000 µL Mikropipet Eppendorf Research Z683833 500 – 5000 µL 3.1.5. Tez kapsamında kullanılan çözeltiler İndirgenmiş şeker tayininde kullanılan çözeltilerin hazırlanması  A çözeltisi: 2,5 g susuz Na2CO3, 2 g NaHCO3, 2,5 g NaKC4H4O6 ve 20 g susuz Na2SO4 saf su ile çözülerek toplam hacim 100 mL olacak şekilde hazırlanmıştır. 3 B çözeltisi: 15 g CuSO4 ve 1 damla derişik H2SO4 (%85, 1,84 g/cm ) saf su ile çözülerek toplam hacim 100 mL olacak şekilde hazırlanmıştır.  Alkali bakır tartarat çözeltisi: 96 mL A çözeltisi ve 4 mL B çözeltisi karıştırılarak hazırlanmıştır.  Arsenomolibdat reaktif çözeltisi: 45 mL saf suda çözülmüş 2,5 g (HH4)6Mo7O2, 3 2,5 mL derişik H2SO4 (1,84 g/cm ) ve 25 mL saf suda çözülmüş 0,3 g Na2AsO4.7H2O o karıştırılıp 37 C’de 48 saat boyunca inkübe edilerek hazırlanmıştır.  Glikoz çözeltisi: 10 mg C6H12O6 bir miktar saf su ile çözülüp toplam hacim 100 mL’ye tamamlanarak 100 mg/L glikoz çözeltisi hazırlanmıştır. Toplam fenolik madde tayininde kullanılan çözeltilerin hazırlanması  Lowry A çözeltisi: 0,1 M NaOH içinde %2’lik Na2CO3 çözülerek hazırlanmıştır.  Lowry B çözeltisi: %1’lik NaKC4H4O6 içinde %5’lik CuSO4 ‘ın çözünmesiyle hazırlanmıştır. 23  Lowry C çözeltisi: Lowry A ve Lowry B çözeltileri 50:1 oranında karıştırılarak hazırlanmıştır.  Folin-Ciocalteu çözeltisi: Folin-Ciocalteu reaktifinin 1:3 oranında saf su ile seyreltilerek hazırlanmıştır.  Gallik asit çözeltisi: 0,1 g gallik asit az miktarda metanol ile çözülüp toplam hacim 100 mL’ye metanolle tamamlanarak hazırlanmıştır. Antioksidan kapasite tayininde kullanılan çözeltilerin hazırlanması ABTS yöntemi:  ABTS radikal çözeltisi: 7 mM ABTS çözeltisi içinde 2,45 mM K2S2O8 su ile çözülerek 24 saat boyunca karanlık ortamda bekletilmiştir. 24 saat sonra ABTS radikal çözeltisi su ile 1:10 oranında seyreltilerek hazırlanmıştır.  Troloks çözeltisi: 0,1 g troloks az miktarda metanol ile çözülüp toplam hacim 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. FRAP yöntemi:  Sodyum asetat çözeltisi (0,1 M): 1,36 g CH3COONa.3H2O saf su ile çözülerek toplam hacim 100 mL olacak şekilde hazırlanmıştır. 3 Asetik asit çözeltisi (0,1 M): 0,6 mL derişik CH3COOH (%99,5, 1,05 g/cm ) çözeltisinin saf su ile 100 mL’ye tamamlanmasıyla hazırlanmıştır.  pH 3,6 asetat tamponu: 92,5 mL 0,1 M CH3COOH ve 7,5 mL 0,1 M CH3COONa çözeltilerinin karıştırılmasıyla hazırlanmıştır.  Hidroklorik asit çözeltisi (40 mM): 332 µL derişik HCl (12,06 M)’in saf su ile 100 mL’ye tamamlanmasıyla hazırlanmıştır.  TPTZ çözeltisi (10 mM): 0,3 g 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazin (TPTZ) 40 mM HCl içinde çözülerek toplam hacim 100 mL olacak şekilde hazırlanmıştır.  Demir (III) klorür çözeltisi (20 mM): 0,3 g FeCl3 saf su ile çözülerek toplam hacim 100 mL olacak şekilde hazırlanmıştır.  FRAP çözeltisi: pH 3,6 tamponu, TPTZ ve FeCl3 klorür çözeltilerinin sırasıyla 10:1:1 oranlarında karıştırılmasıyla hazırlanmıştır. 24  Troloks çözeltisi (1 mM): 25 mg troloks az miktarda metanol ile çözülüp 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. CHROMAC yöntemi:  pH 2,8 fosfat tamponu: 6,24 g NaH2PO4.2H2O az miktarda su ile çözülerek 3 %85’lik H3PO4 (1,685 g/cm ) (0,68 mL) ile asitlendirilir ve toplam hacim su ile 1 L’ye tamamlanır.  Potasyum klorür çözeltisi (0,2 M): 0,3725 g KCl tartılarak saf su ile 25 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır.  Hidroklorik asit (0,2 M): 41,45 mL derişik HCl (12,06 M) saf su ile 50 mL’ye tamamlanarak ara stok 10 M HCl hazırlanmıştır. Hazırlanan ara stoktan 0,5 mL alınarak saf su ile 25 mL’ye tamamlanarak 0,2 M HCl çözeltisi hazırlanmıştır.  pH 1,2 tamponu: 25 mL 0,2 M KCl ve 42,5 mL 0,2 M HCl karıştırılıp saf su ile 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır.  Potasyum dikromat çözeltisi: 5 mg K2Cr2O7 toplam hacim100 mL olacak şekilde pH 2,8 tamponu ile çözülerek hazırlanmıştır.  -41,5-difenilkarbazit çözeltisi (3,4x10 M): 0,08 mg 1,5-difenilkarbazit toplam hacim 100 mL olacak şekilde pH 2,8 tamponu ile çözülerek hazırlanmıştır.  Troloks çözeltisi: 0,1 g troloks az miktarda metanol ile çözülüp toplam hacim 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. DNA oksidasyonu çalışmalarında kullanılan çözeltilerin hazırlanması  Buzağı timüs DNA çözeltisi (0,5 mg/mL): 5 mg buzağı timüs DNA’sı 10 mL ultra saf su ile çözülerek hazırlandı.  H2O2 çözeltisi (10 mM): 9,79 M H2O2 çözeltisinden 205 µL alınıp saf su ile 10 mL’ye tamamlanarak 200 mM ara stok hazırlanmıştır. 10 mM H2O2 çözeltisi, 200 mM H2O2 çözeltisinden 2,5 mL alınıp saf su ile 50 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. 2+ Fe çözeltisi (10 mM): 0,278 g FeSO4.6H2O tartılarak bir miktar saf suda çözülüp toplam hacim 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. 25 Kromatografik analizler için kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması  Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik bileşiklerin kantitatif tayini için standart fenolik bileşikler kullanılarak kalibrasyon çözeltileri hazırlanmıştır. Her bir standart bileşik metanol ile çözülerek 0,20-10 mg/L derişim aralığında hazırlanmıştır.  Kestane arı poleni örneklerindeki karotenoidlerin kantitatif tayini için standart karotenoid bileşikler kullanılarak kalibrasyon çözeltileri hazırlanmıştır. Her bir standart bileşik diklorometan ile çözülerek 0,25-10 mg/L derişim aralığında hazırlanmıştır (Yüksel 2018).  Kestane arı poleni örneklerinin oksidatif stres sonucu oluşan DNA oksidatif hasar ürünleri üzerine etkisinin incelenmesi için DNA oksidatif baz hasar ürünlerinin kalibrasyon çözeltileri hazırlanmıştır. Her bir DNA oksidatif baz hasar ürününden 0,0050 g tartılarak piridin ile 25 mL’ye tamamlanmıştır. 200 mg/L derişiminde hazırlanan standartlar piridin ile seyreltilerek kalibrasyon çözeltileri hazırlanmıştır (Aybastıer 2016). 3.2. Yöntem Bu tez kapsamında yapılan çalışmalar 4 ana başlık altında toplanabilir. Bunlar;  Örneklerin toplanması  Örnek hazırlama işlemleri  Spektroskopik yöntemler  Kromatografik yöntemler 3.2.1. Kestane arı poleni örneklerinin toplanması Ülkemizde doğal kestane ormanları Güney Marmara ve Batı Karadeniz bölgelerinde yer almaktadır. Kestane arı poleni örnekleri Zonguldak, Bursa ve Balıkesir illerinde yer alan kestane ormanlarında faaliyetlerini sürdüren arıcılar tarafından temin edilmiştir. Örneklerin temini Uludağ Üniversitesi, Süt ve Ürünleri Teknoloji Programı öğretim görevlisi Dr. M. Ertan Güneş tarafından sağlanmıştır. Kestane arı poleni örnekleri analiz 26 o süresi boyunca -24 C’de dondurucuda muhafaza edilmiştir. Toplanan kestane arı poleni örneklerinin lokaliteleri Çizelge 3.4’te verilmektedir. Çizelge 3.4. Kestane arı poleni örneklerinin lokaliteleri Bölge Yıl İl Lokalite Sembol 2016 Uludağ / Cumalıkızık köyü M0 Karacabey Boğazı M1 Orhangazi / Gürle köyü M2 Bursa Orhangazi M3 Marmara 2017 Uludağ / Cumalıkızık köyü M4 Uludağ / Cumalıkızık köyü M5 İnegöl M6 Balıkesir Erdek / Kapıdağ Yarımadası M7 Kilimli / Muslu köyü K1 Kilimli / Muslu köyü K2 Kilimli / Göbü köyü K3 Kilimli / Türkali köyü K4 Kilimli / Çatalağzı köyü K5 Karadeniz 2017 Zonguldak Kilimli / Çatalağzı köyü K6 Kilimli / Çatalağzı köyü K7 Kilimli / Merkez K8 Kilimli / Merkez K9 Kilimli / Merkez K10 3.2.2. Kestane arı poleni örneklerinin palinolojik analizleri Örneklerin melissopalinolojik analizleri için 10 g arı poleni kullanıldı. Louveaux ve ark. (1978)’nın yöntemine göre yapılan analizde polen örnekleri bazik fuksin ile renklendirilmiş gliserin-jelatin ile boyanmış ve ışık mikroskobunda analiz edilmiştir. 27 Polen tanelerinin sayısı, lamelin (22x22 mm) santimetre karesi başına tane olarak ifade edilmiştir. Farklı yazarlar tarafından farklı yüzdelik değerler elde edilmesine rağmen, bir polen örneğinin tek-çiçekli olarak kabul edilebilmesi için az %45 oranında o çiçek türünün içermesi gerekir (Louveaux ve ark. 1978, Persano Oddo ve Piro 2004). Tez kapsamında çalışılan arı poleni örneklerinin palinolojik analiz sonuçları %45’in üzerinde bulunarak örneklerin kestane arı poleni oldukları tespit edilmiştir. 3.2.3. Örnek hazırlama işlemleri Kestane arı poleni örneklerinin hazırlanmasında ultrasonik ekstraksiyon ve katı faz ekstraksiyon teknikleri kullanılmıştır. Ultrasonik ekstraksiyon ile örnek hazırlama işlemleri Su ve etanol çözücüleri kullanılarak ultrasonik ekstraksiyon gerçekleştirilmiştir. Ekstraksiyon balonlarına tartılan 3 g kestane arı poleni örneklerine ayrı ayrı 30 mL o etanol ve 30 mL su eklenerek balonlar ultrasonik banyoya yerleştirilmiş ve 65 C’de 30 dk boyunca ultrasonik ekstraksiyon yapılmıştır. Örneklerin pH’ları 10 M HCl kullanılarak 2’ye ayarlanmıştır. pH’ı ayarlanan örnekler ultrasonik banyoya tekrar o yerleştirilerek ikinci kez 65 C’de 30 dk boyunca ultrasonik ekstraksiyon yapılmıştır. o Ekstraksiyon sonrasında örnekler süzülerek -24 C’de muhafaza edilmiştir. Kestane arı poleni örnekleri için gerçekleştirilen ultrasonik ekstraksiyon akım şeması Şekil 3.2’de gösterilmiştir. 28 3 g kestane arı poleni örneğine 30 mL çözücü eklenir. (Çözücü olarak eta nol ve su ayrı ayrı ekstraksiyon için kullanılır.) o 65 C’de 30 dk boyunca ultrasonik ekstraksiyon yapılır. 10 M HCl ile pH 2’ye ayarlanır. o 65 C’de 30 dk boyunca ultrasonik ekstraksiyon yapılır. Etanol (E) ve su (S) ekstraktları süzülür. Şekil 3.2. Kestane arı poleni örneklerinin ultrasonik ekstraksiyon akım şeması Katı-faz ekstraksiyonu ile örnek hazırlama işlemleri Hazırlanan etanol ve su ekstraktlarının metanol ve etanol çözücüleri kullanılarak katı- faz ekstraksiyonları gerçekleştirilmiştir. Katı-faz ekstraksiyonu için C18 kolonu kullanılarak üç farklı ekstrakt elde edilmiştir. C18 kolonu 10 mL saf su ve 5 mL 10 M HCl ile şartlandırılmıştır. Şartlandırılan kolondan 5 mL etanol ekstraktı geçirilerek fenolik bileşikler kolonda tutturulmuştur. Tutturulan fenolik bileşikler kolondan geçirilen 3 mL metanol/etanol ile ayrı ayrı toplanarak metanol ve etanol ekstraktları elde edilmiştir. Aynı şekilde şartlandırılan kolondan 5 mL su ekstraktı geçirilerek kolonda tutturulan fenolik bileşikler 3 mL etanol ile toplanarak etanol ekstraktı elde edilmiştir. Kestane arı poleni örnekleri için gerçekleştirilen katı-faz ekstraksiyonu akım şeması Şekil 3.3’te gösterilmiştir. 29 5 mL etanol ekstraktı şartlanan C18 5 mL su ekstraktı şartlanan kolonunda tutturulur. C18 kolonunda tutturulur. 3 mL etanol 3 mL metanol 3 mL etanol kolondan kolondan geçirilir. kolondan geçirilir geçirilir. Etanol (EE) Metanol (EM) Etanol (SE) ekstraktı toplanır. ekstraktı toplanır. ekstraktı toplanır. Şekil 3.3. Kestane arı poleni örneklerinin katı-faz ekstraksiyon akım şeması 3.2.4. Spektroskopik yöntemler Nelson-Somogyi yöntemiyle indirgen şeker tayini Şekil 3.2.’de gösterildiği gibi elde edilen etanol ve su ekstraktları kullanılmıştır. Ancak indirgen şeker tayini için her iki ekstrakt ön işleme tabi tutulmuştur.  Etanol ekstraktı (E1): 2 mL etanol ekstraktı azot gazı ile uçurulduktan sonra kalıntı 3 mL suda çözülerek kullanılmıştır.  Su ekstraktı (E2): 0,1 mL su ekstraktı saf su ile 10 mL’ye tamamlanarak 100 kat seyreltilmiş halde kullanılmıştır. Kestane arı poleni örneklerindeki indirgen şeker tayinleri Nelson-Somogyi yöntemi ile yapılmıştır (Nelson 1944, Somogyi 1952). Deney tüplerine alınan 100 µL kestane arı poleni ekstraktları saf su ile 2 mL’ye tamamlanmıştır. Her tüpe 1 mL alkali bakır tartarat çözeltisi eklenerek 10 dk kaynayan suda bekletilmiştir. Ardından tüm deney tüpleri buzlu suda soğutularak 1 mL arsenomolibdat çözeltisi ve 6 mL saf su eklenmiştir. 10 dk bekletilen örneklerin 620 nm’de UV-Vis Spektrofotometresinde ölçümleri alınmıştır. Örneklerdeki indirgen şeker miktarını belirleyebilmek için standart olarak glikoz çözeltisi kullanılmıştır. 1-2-3-4-5-7-10 mg/L glikoz içerecek şekilde hazırlanan 30 örneklere Nelson-Somogyi yöntemi uygulanmıştır. Standart çözeltinin her bir derişimine karşılık absorbans değeri grafiğe geçirilerek kalibasyon denklemi belirlenmiştir (Çizelge 3.5). Elde edilen kalibrasyon denklemi kullanılarak kestane arı poleni örneklerindeki indirgen şeker miktarı mg/100 g kestane arı poleni olarak belirlenmiştir. Çizelge 3.5. İndirgen şeker tayini kalibrasyon verileri Yöntem Derişim aralığı Doğru denklemi Regresyon 2 (mg/L) katsayısı (R ) Nelson-Somogyi 1-10 y = 0,1039x + 0,0580 0,9997 Folin-Ciocalteu yöntemiyle toplam fenolik madde tayini Kestane arı polenlerinden elde edilen ekstraktların toplam fenolik madde tayini fenolik bileşiklerden molibdenyuma elektron transferine dayanan Folin-Ciocalteu yöntemi ile yapılmıştır (Singleton ve ark. 1999, Şahin ve ark. 2015). Analiz tüplerine alınan 100 µL kestane arı poleni ekstraktı üzerine 1,9 mL saf su ve 2,5 mL Lowry C çözeltisi eklendikten sonra 0,25 mL seyreltilmiş Folin-Ciocalteu çözeltisi eklenerek tüpler karıştırılmıştır. 30 dk boyunca karanlık ortamda bekletilen analiz tüplerinin 750 nm’de ölçümleri alınmıştır. Kalibrasyon grafiği için artan derişimlerde hazırlanan gallik asit çözeltisi standart madde olarak kullanılmıştır. Gallik asit derişimine karşı absorbans değerleri grafiğe geçirilerek en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır (Çizelge 3.6). Elde edilen doğru denklemi kullanılarak kestane arı poleni örneklerindeki toplam fenolik madde içeriği mg GAE/g örnek olarak belirlenmiştir. Çizelge 3.6. Toplam fenol tayini kalibrasyon verileri Yöntem Derişim aralığı Doğru denklemi Regresyon 2 (mg/L) katsayısı (R ) Folin-Ciocalteu 1-60 y = 0,0266x - 0,0237 0,9990 31 ABTS yöntemiyle antioksidan kapasite tayini Kestane arı polenlerinden elde edilen ekstraktların antioksidan kapasite tayini ABTS radikal katyonunun antioksidanlar tarafından inhibisyonuna dayanan ABTS yöntemi ile yapılmıştır (Şahin ve ark. 2012, Re ve ark. 1999). Kalibrasyon grafiği için artan derişimlerde hazırlanan troloks çözeltisi standart madde olarak kullanılmıştır. Analiz tüplerine alınan x mL örnek/standart üzerine (4-x) mL etanol eklenerek karıştırılmıştır. Her bir analiz tüpüne 1 mL ABTS radikal çözeltisi eklendikten 6 dk sonra örnek/standartların 734 nm’de absorbansları ölçülmüştür (Aörnek). (Akör: ABTS radikal katyonunun inhibisyona uğramadığı (örnek/standart içermez) haldeki absorbans değeridir.) Ölçümler sonucunda örnek ve standartların %inhibisyon değerleri belirlenmiştir (Eşitlik 3.1). A  A %İnhibisyon= kör örnek 100 (3.1) Akör Troloks derişimine karşı %inhibisyon değerleri grafiğe geçirilerek en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır (Çizelge 3.7). Elde edilen doğru denklemi kullanılarak kestane arı poleni örneklerinin antioksidan kapasite değeri mg TE/g örnek olarak belirlenmiştir. Çizelge 3.7. ABTS yöntemi kalibrasyon verileri Yöntem Derişim aralığı Doğru denklemi Regresyon 2 (mg/L) katsayısı (R ) ABTS 0,1-1,0 y = 6,1325x + 1,3406 0,9990 FRAP yöntemiyle antioksidan kapasite tayini 3+ Kestane arı polenlerinden elde edilen ekstraktların antioksidan kapasite tayini Fe - TPTZ (ferrictripiridiltriazin) kompleksinin asidik ortamda antioksidanların varlığıyla 2+ Fe ’ye indirgenmesine dayanan FRAP yöntemiyle yapılmıştır (Benzine ve Strain 1996). Örneklerdeki antioksidan kapasite değerinin belirlenebilmesi için standart madde olarak artan derişimlerde troloks çözeltisi hazırlanmıştır. Analiz tüplerine x mL 32 (<0,25 mL) örnek/standart ve (3-x) mL FRAP reaktifi eklenerek 30 dk boyunca karanlık ortamda bekletildikten sonra örnek/standartların 593 nm’de absorbansları okunmuştur. Absorbansa karşılık troloks derişimi grafiğe geçirilerek en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi belirenmiştir (Çizelge 3.8). Elde edilen doğru denklemi kullanılarak kestane arı poleni örneklerinin antioksidan kapasite değerleri mM TE/g örnek cinsinden belirlenmiştir. Çizelge 3.8. FRAP yöntemi kalibrasyon verileri Yöntem Derişim aralığı Doğru denklemi Regresyon 2 (mg/L) katsayısı (R ) FRAP 1-20 y = 0,1715x + 0,0957 0,9997 CHROMAC yöntemiyle antioksidan kapasite tayini 6+ Kestane arı poleni ekstraktlarının antioksidan kapasitesi ortama eklenen aşırı Cr ’nın 3+ 6+ antioksidanlar tarafından Cr ’e indirgenmesiyle arta kalan Cr ’nın 1,5-difenilkarbazit ile kompleks oluşturmasına dayanan CHROMAC yöntemi ile yapılmıştır (Şahin ve Demir 2013, Karkar ve ark. 2017). Örneklerdeki antioksidan kapasite değerinin belirlenebilmesi için standart madde olarak artan derişimlerde troloks çözeltisi hazırlanmıştır. Analiz tüplerine x mL (<0,5 mL) örnek/standart, (0,5-x) mL saf su, 3,5 mL pH 2,8 fosfat tamponu ve 0,5 mL potasyum dikromat çözeltisi eklenerek karıştırılmıştır. 1 dk sonra tüplere 0,5 mL 1,5-difenilkarbazit eklenerek örnekler 50 dk karanlık ortamda bekletilir. Reaksiyon sonucunda oluşan kompleksi belirleyebilmek için standart/örneklerin 540 nm’de ölçümleri alınmıştır (AGeriye kalan). CHROMAC analizinde kör numunesini hazırlayabilmek için pH 1,2 tamponu kullanılmıştır. Analiz tüpüne 0,5 mL saf su, 3,5 mL pH 1,2 tamponu ve 0,5 mL potasyum dikromat çözeltisi eklendikten 1 dk sonra 0,5 mL 1,5-difenilkarbazit eklenerek 50 dk boyunca karanlık ortamda bekletilir. Oluşan kompleksin 540 nm’de ölçümleri alınmıştır (AKör). 33 Buna göre örneklerdeki fenolik maddeler için absorbans değeri Eşitlik 3.2’de gösterildiği gibi hesaplanır: AÖrnek = AKör – AGeriye kalan (3.2) 6+ AKör : Antioksidan içermeyen ortamda bulunan aşırı Cr ‘nın yükseltgenme-indirgenme tepkimesi sonucu 1,5-difenilkarbazit ile oluşturduğu kompleksin absorbans değeri, 6+ AGeriye kalan : Aşırı Cr ‘nın fenolik madde ile yükseltgenme-indirgenme tepkimesi 6+ sonucu geriye kalan Cr ve 1,5-difenilkarbazitin oluşturduğu kompleksin absorbans değeridir. Troloks derişimine karşı AÖrnek değerleri grafiğe geçirilerek en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır (Çizelge 3.9). Elde edilen doğru denklemi kullanılarak kestane arı poleni örneklerinin antioksidan kapasite değeri mg TE/g örnek olarak belirlenmiştir. Çizelge 3.9. CHROMAC yöntemi kalibrasyon verileri Yöntem Derişim aralığı Doğru denklemi Regresyon 2 (mg/L) katsayısı (R ) CHROMAC 10-60 y = 0,0045x + 0,0844 0,9997 Buzağı timüs DNA’sının hazırlanması Buzağı timüs DNA çözeltisi 500 µg/mL olacak şekilde ultra saf su ile hazırlanmıştır. 24 saat sonra saf su içerisinde tamamen çözünen DNA’nın 260 ve 280 nm’de absorbansları ölçülmüştür. DNA’nın saflık derecesini belirleyebilmek için A260/A280 oranlanmıştır. DNA’nın miktarı Eşitlik 3.3’teki eşitlik kullanılarak hesaplanmıştır. µg DNA = A260 x 50 (3.3) 34 Buzağı timüs DNA’sı ile yapılan spektroskopik çalışmalar Bu çalışmada kullanılacak olan kestane arı poleni örneği;  Şekil 3.2’de belirtildiği şekilde hazırlanan etanol ekstraktının 3 mL’sinin azot gazı ile uçurularak geriye kalan kalıntının 3 mL saf su ile çözülmesiyle hazırlanmıştır. Kestane arı poleninin DNA oksidasyonuna etkisinin spektroskopik olarak incelenebilmesi için; +2 Öncelikle DNA’nın Fenton (Fe ve H2O2) reaksiyonu ile oksidasyona uğratıldıktan sonraki durumu incelenmiştir.  Daha sonra ortamdaki kestane arı poleni ekstraktının varlığında DNA’nın oksidasyon sonrası durumu incelenmiştir. Sonuç olarak Çizelge 3.10’da verilen, sadece DNA; sadece kestane arı poleni; DNA + 2+ 2+ 2+ Fe + H2O2; kestane arı poleni + Fe + H2O2; DNA + kestane arı poleni + Fe + H2O2 içeren örnek karışımları hazırlanmıştır. Çizelge 3.10. Fenton reaksiyonu için hazırlanan örnek karışımları 2+ Örnek DNA Kestane Arı Fe H2O2 Ultra Karışımı (µL) Poleni (µL) (µL) Saf Su (µL) (µL) 1 200 - - - 4800 2 200 - 75 150 4575 3 - 3000 - - 2000 4 - 3000 75 150 1775 5 200 3000 75 150 1575 Çizelge 3.10’da verilen örnek karışımlarının 1 saat boyunca 10 dakikada bir 200-400 nm aralığında spektrum taramaları alınmıştır. 1-numaralı örnek karışımının derişimi ve 260 nm’deki (DNA’nın maksimum absorbsiyon yaptığı dalga boyu) absorbans değeri Eşitlik 3.4’te yerine koyularak DNA’nın molar sönüm katsayısı (ε) hesaplanmıştır. Belirlenen molar sönüm katsayısı kullanılarak 2 ve 5 numaralı örnek karışımlarının 260 nm’deki derişimleri hesaplanmıştır. Her iki durum içinde DNA’nın oksidatif hasara 35 uğrama yüzdesi belirlenerek kestane arı polenindeki fenolik bileşiklerin DNA hasarını önleme etkisi incelenmiştir. A = εbc (3.4) 3.2.5. Kromatografik yöntemler Kestane arı polenlerinde bulunan fenolik maddelerin tayini Kestane arı poleni ekstraktlarındaki fenolik maddelerin analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografisi-fotodiyot serili dedektör cihazı (HPLC-DAD) kullanılmıştır. Metanol ve %1’lik sulu formik asitten oluşan gradient programlı hareketli faz sistemi kullanılmıştır. C18 (XBridge, 3,5 µm, 4,6 x 250 mm) kolonu, 0,5 mL/dk akış hızı ve 10 µL enjeksiyon hacmi ile analizler gerçekleştirilmiştir. Fenolik bileşiklerin HPLC tayinlerinde, protokatekuik asit, (-)-epigallokateşin, p-hidroksibenzoik asit, vanilik asit ve krisin için 260 nm; (-)-epigallokateşin gallat, epikateşin, (+)-kateşin, naringin, L- triptofan ve pinocembrin için 280 nm; rosmarinik asit, amentoflavon, klorojenik asit, salisilik asit, kafeik asit fenetil esteri ve trans-kalkon için 320 nm; hiperosid, kuersitrin, luteolin, apigenin, galangin, viteksin, kuersetin-3-β-D-glikozit, ellagik asit, mirisetin, kamferol, isorhamnetin ve genkvanin için 360 nm’de çalışılmıştır. Fenolik bileşiklerin tayini için HPLC-DAD çalışma koşulları Çizelge 3.11’de verilmiştir. 36 Çizelge 3.11. Fenolik bileşiklerin tayini için HPLC-DAD gradient hareketli faz programı Süre Hareketli faz bileşimi (dk) %1’lik Metanol formik asit 0 %95 %5 10 %85 %15 15 %70 %30 20 %60 %40 30 %55 %45 50 %40 %60 52 %20 %80 60 %20 %80 70 %95 %5 Standart fenolik bileşiklerin farklı derişimlerdeki çözeltileri ve kestane arı poleni örnekleri HPLC-DAD cihazı ile analiz edilmiştir. Her bir standardın derişimine karşılık pik alanı grafikleri çizilerek, en küçük kareler yöntemiyle doğru denklemleri hesaplanmıştır. Örneklerin pik alanı değerleri doğru denklemlerinde yerine konularak kestane arı poleninde bulunan fenolik maddeler mg/kg örnek cinsinden hesaplanmıştır. Kestane arı polenlerinde bulunan karotenoidlerin tayini Kestane arı poleni ekstraktlarındaki karotenoidlerin analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografisi-fotodiyot serili dedektör cihazı (HPLC-DAD) kullanılmıştır. %95 metanol-%5 H2O (H2O: %0,05 trimetilamin içermektedir) ve tert-bütil metil eter çözücüleri ile gradient programlı hareketli faz sistemi kullanılmıştır. YMC Carotenoid C30 (250x4.6 mm, 5μm, YMC Co., Ltd) kolonu, 1,0 mL/dk akış hızı ve 20 μL enjeksiyon hacmi ile analizler gerçekleştirilmiştir. Karotenoidlerin HPLC tayini için 450 nm’de çalışılmıştır. Karotenoidlerin tayini için HPLC-DAD çalışma koşulları Çizelge 3.12’de verilmiştir. 37 Çizelge 3.12. Karotenoidlerin tayini için HPLC-DAD gradient hareketli faz programı Süre Hareketli faz bileşimi (dk) %95 ter-bütil metanol metil eter 0 95 5 15 80 20 20 70 30 30 60 40 40 25 75 45 95 5 Standart karotenoidlerin farklı derişimlerdeki çözeltileri ve kestane arı poleni örnekleri HPLC-DAD cihazı ile analiz edilmiştir. Örneklerin pik alanı değerleri kalibrasyon denklemlerinde yerine konularak kestane arı poleninde bulunan karotenoidler mg/kg örnek cinsinden belirlenmiştir. Buzağı timüs DNA’sı ile yapılan kromatografik çalışmalar DNA oksidatif hasar ürünlerinin analizi için gaz kromatografisi kütle spektrometresi/kütle spektrometresi (GC-MS/MS) cihazı kullanılmıştır. GC-MS/MS ile DNA oksidatif baz hasar ürünlerinin ve örneklerin analizi için DB-5MS (Agilent 128- 5512) kapiler kolonu (12 m, 0,20 mm, 0,33 µm), seçilmiş reaksiyon görüntüleme (selected reaction monitoring, SRM) tekniği kullanılmıştır. Her bir madde için alıkonma zamanı, 70 eV ile yapılan 1. iyonlaşma sonrası taranacak kütleler, 2. iyonlaşma için uygulanacak en uygun enerji ve 2. iyonlaşma sonrası taranacak kütleler belirlenmiştir. GC-MS/MS cihazı için çalışma koşulları ve sıcaklık programı Çizelge 3.13 ve Çizelge 3.14’te verilmiştir. 38 Çizelge 3.13. GC-MS/MS cihazı çalışma koşulları Enjeksiyon hacmi 2 µL Enjeksiyon modu Split Split oranı 5 Enjeksiyon sıcaklığı o250 C o Ara yüzey sıcaklığı 280 C o İyon kaynağı sıcaklığı 250 C Hareketli faz akış hızı 1 mL/dk Tarama modu SRM (SIM/SIM) GC program süresi 17 dk Çizelge 3.14. GC-MS/MS cihazı için sıcaklık programı Oran Sıcaklık Bekleme süresi o o( C/dk) ( C) (dk) - 130 2 8 230 0 20 280 0 Kestane arı poleni örneklerinin, DNA’da oksidatif stres sonrası oluşan hasar ürünlerine olan etkisini incelemek için “M0” polen örneği kullanılmıştır. Öncelikle polen örneği, Şekil 3.2’de belirtildiği şekilde hazırlanan etanol ekstraktının 3 mL’sinin azot gazı ile uçurulup kalıntının 3 mL saf suda çözülmesiyle analize uygun hale getirilmiştir. Daha sonra aşağıda belirtilen şekilde (ultra saf su kullanılarak) hazırlanan örnek karışımları Şekil 3.4’te belirtilen aşamalardan geçirilerek analiz edilmiştir.  DNA (20 µg/mL) örneği 2+ Fenton (Fe + H2O2) uygulanmış DNA (20 µg/mL) örneği 2+  3000 µL arı poleni içerecek şekilde Fenton (Fe + H2O2) uygulanmış DNA (20 µg/mL) örneği 39 o Hazırlanan örnekler -24 C’de dondurulmuştur. o Dondurulan örnekler -86 C’de 100 mbar basınç altında liyofilize edilmiştir. Liyofilize edilen örnekler 1 mL %60’lık formik o asit ile 130 C’de 30 dk bekletilerek asidik hidroliz yapılmıştır. Hidroliz edilen örnekler o -24 C’de dondurulmuştur. o Dondurulan örnekler -86 C’de 100 mbar basınç altında liyofilize edilmiştir. Liyofilize edilen örnekler 41,6 µL piridin ve o 58,4 µL %1 TMCS içeren BSTFA ile 120 C’de 40 dk bekletilip türevlendirilmiştir. Türevlendirilen örnekler direk olarak GC- MS/MS ile analiz edilmiştir. Şekil 3.4. GC-MS/MS analizi için örnek hazırlama aşamaları 40 4. BULGULAR Bu çalışmada elde edilen bulgular iki ana başlık altında toplanabilir.  Spektroskopik yöntemler  Kromatografik yöntemler 4.1. Spektroskopik Yöntemler 4.1.1. İndirgen şeker tayini 2016 yılında Marmara bölgesi Bursa/Uludağ/Cumalıkızık köyünden temin edilen kestane arı poleni örneğine (M0) indirgen şeker analizi yapılmıştır. Şekil 3.2’de belirtildiği şekilde etanol ve su çözücüleriyle hazırlanan ekstraktlardaki indirgen şeker miktarı mg/100 g örnek olarak Çizelge 4.1’de verilmiştir. Çizelge 4.1. Kestane arı poleni örneğinin indirgen şeker sonuçları Ekstrakt türü İndirgen şeker miktarı (mg/100 g örnek) E 2,66 ± 0,12 S 53,01 ± 0,05 Şekerin sudaki çözünürlüğünün fazla olmasından dolayı, su ekstraktındaki indirgen şeker miktarının etanol ekstraktına oranla daha fazla olduğu görülmektedir. 4.1.2. Toplam fenolik madde tayini Kestane arı poleni (M0) örneğinin Şekil 3.2 ve Şekil 3.3’te belirtildiği şekilde hazırlanan ekstraktlarının toplam fenolik madde miktarı Çizelge 4.2’de verilmektedir. 41 Çizelge 4.2. M0 kestane arı poleni ekstraktlarının toplam fenolik madde miktarı Ekstrakt türü Toplam fenolik madde miktarı (mg GAE/g örnek) E 43,48 ± 0,77 EM 13,91 ± 0,54 EE 14,77 ± 0,61 S 28,45 ± 0,76 SE 4,12 ± 0,09 Şekil 3.2’de belirtildiği şekilde ultrasonik destekli ekstraksiyon kullanılarak hazırlanan etanol ekstraktının (E) toplam fenolik madde içeriği diğer ekstraktlara oranla daha fazla bulunmuştur (Karkar ve ark. 2018). Bu nedenle kestane arı polenlerinin toplam fenolik madde miktarları etanol ekstraktları kullanılarak belirlenmiştir (Çizelge 4.3). 42 Çizelge 4.3. Kestane arı poleni örneklerinin toplam fenolik madde miktarları Kestane poleni Toplam fenolik madde miktarı (mg GAE/g örnek) M1 38,23 ± 0,69 M2 28,33 ± 0,68 M3 32,18 ± 0,25 M4 38,16 ± 0,98 M5 32,18 ± 0,25 M6 27,82 ± 0,83 M7 39,50 ± 0,45 K1 37,03 ± 1,06 K2 38,82 ± 0,01 K3 35,02 ± 0,00 K4 19,19 ± 0,25 K5 16,19 ± 1,17 K6 21,85 ± 1,73 K7 28,50 ± 0,42 K8 33,48 ± 0,34 K9 33,98 ± 0,88 K10 28,89 ± 0,49 4.1.3. Antioksidan kapasite tayini Kestane arı poleni (M0) örneğinin Şekil 3.2 ve Şekil 3.3’te belirtildiği şekilde hazırlanan ekstraktlarının antioksidan kapasite sonuçları Çizelge 4.4’te verilmektedir. 43 Çizelge 4.4. M0 kestane arı poleni ekstraktlarının antioksidan kapasite sonuçları Ekstrakt türü Antioksidan kapasite miktarı FRAP CHROMAC (mM TE/g örnek) (mg TE/g örnek) E 20,24 ± 1,15 34,33 ± 0,02 EM 5,58 ± 0,11 4,69 ± 0,06 EE 5,82 ± 0,10 5,22 ± 0,07 S 14,36 ± 0,79 19,34 ± 0,04 SE 3,15 ± 0,04 3,70 ± 0,05 Şekil 3.2’de belirtildiği şekilde ultrasonik destekli ekstraksiyon kullanılarak hazırlanan etanol ekstraktının (E) antioksidan kapasite miktarları diğer ekstraktlara oranla daha fazla bulunmuştur (Karkar ve ark. 2018). Bu nedenle kestane arı polenlerinin antioksidan kapasite miktarları etanol ekstraktları kullanılarak belirlenmiştir (Çizelge 4.5). 44 Çizelge 4.5. Kestane arı poleni örneklerinin antioksidan kapasite miktarları Ekstrakt türü Antioksidan kapasite miktarı ABTS FRAP CHROMAC (mg TE/g örnek) (mM TE/g örnek) (mg TE/g örnek) M1 31,00 ± 0,82 4,32 ± 0,02 47,34 ± 1,74 M2 17,58 ± 0,14 2,80 ± 0,07 67,85 ± 0,42 M3 22,65 ± 0,05 3,06 ± 0,11 73,09 ± 1,07 M4 38,56 ± 0,32 3,46 ± 0,01 65,50 ± 0,46 M5 38,47 ± 0,05 3,42 ± 0,02 67,95 ± 3,92 M6 23,39 ± 0,52 3,77 ± 0,05 60,83 ± 0,62 M7 42,58 ± 0,28 3,44 ± 0,01 89,63 ± 0,59 K1 32,72 ± 0,58 4,51 ± 0,02 88,33 ± 0,94 K2 31,89 ± 0,61 4,75 ± 0,02 45,48 ± 0,27 K3 30,79 ± 0,99 4,29 ± 0,03 78,39 ± 1,44 K4 13,85 ± 0,03 1,78 ± 0,00 62,45 ± 1,19 K5 17,08 ± 0,00 1,53 ± 0,06 60,51 ± 0,48 K6 19,14 ± 0,02 2,53 ± 0,14 54,62 ± 0,23 K7 22,36 ± 0,62 3,45 ± 0,01 63,85 ± 0,03 K8 30,35 ± 0,82 3,61 ± 0,00 110,47 ± 2,41 K9 31,42 ± 0,30 3,51 ± 0,02 115,58 ± 0,96 K10 24,94 ± 0,92 4,02 ± 0,01 98,44 ± 0,94 45 4.1.4. Kestane arı polenlerinin DNA oksidasyonunu önleme etkisi DNA, insan ve tüm organizmaların hücresel işlevselliği için önemli bir biyomoleküldür. DNA, UV ve iyonize radyasyonlar, kimyasallar ve reaktif oksijen türleri gibi eksojen ve endojenik faktörlerin etkisiyle hasara uğramaktadır (Chen ve ark. 2012). DNA’nın çeşitli etkenlerle hasara uğramasının nörodejeneratif, kardiyovasküler, kanser hastalıkları ve yaşlanma sorunları gibi birçok hastalığa sebep olduğu bilinmektedir (Dawbaa ve ark. 2017). Bu nedenle DNA hasarının tespiti ve bunun önlenmesi büyük ölçüde önemlidir. Bu amaçla yapılan çalışmada, Çizelge 3.10’da belirtildiği şekilde hazırlanan çözelti karışımlarının 200-400 nm dalga boyu aralığında 1 saat boyunca 10 dk’da bir UV/Vis spektrofotometresi ile spektrum taramaları alınmıştır. Öncelikle DNA’nın fenton ortamındaki durumu incelenmiştir. Şekil 4.1’de görüldüğü gibi fenton reaksiyonu ile oksidatif hasara uğrayan DNA’nın miktarında azalma meydana gelmektedir. 0,9 0,8 DNA DNA(Fenton)-0.dk 0,7 DNA(Fenton)-10.dk 0,6 DNA(Fenton)-20.dk 0,5 DNA(Fenton)-30.dk DNA(Fenton)-40.dk 0,4 DNA(Fenton)-50.dk 0,3 DNA(Fenton)-60.dk 0,2 0,1 0,0 200 250 300 350 400 Dalga boyu (nm) Şekil 4.1. DNA’nın oksidatif strese karşı durumu Antioksidan maddelerin DNA hasarını önlediği bilinmektedir. Kestane arı poleninin antioksidan madde içeriğinin yüksek olduğunun tespit edilmesi ile M0 numaralı örneğin DNA oksidasyonu üzerine etkisi incelenmiştir. 46 Absorbans Şekil 4.2’de verilen grafikte kestane arı poleninin oksidasyona uğrayan DNA’da oluşan hasarı önlediği görülmektedir. 20,0 µg/mL derişimindeki saf DNA miktarı Fenton reaksiyonu ile oksidatif hasara uğradıktan sonra 10,2 µg/mL’ye düşmüştür. Ancak kestane arı poleni varlığında oksidatif hasara uğraması sonucu DNA miktarının 12.4 µg/mL’ye düştüğü tespit edilmiştir. Normal şartlarda %49 oranında oksidatif hasara uğrayan DNA, kestane arı poleni varlığında %38 oranında oksidatif hasara uğramıştır. Yani kestane arı poleni örneğindeki fenolik bileşikler DNA’nın oksidatif hasara uğramasını %11 oranında önlemiştir (Karkar ve ark. 2018). 0,9 0,8 DNA 0,7 DNA+FENTON 0,6 DNA+POLLEN+FENTON 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 200 250 300 350 400 Dalga boyu (nm) Şekil 4.2. DNA’nın kestane arı poleni varlığında oksidatif strese karşı durumu 4.2. Kromatografik Yöntemler 4.2.1. Fenolik bileşiklerin analizi için validasyon parametrelerinin belirlenmesi Kestane arı poleni örneklerinin fenolik madde içeriğinin kalitatif ve kantitatif olarak belirlenebilmesi için standart fenolik bileşiklerin HPLC-DAD cihazı ile Çizelge 3.11’de belirtilen çözücü programı kullanılarak analizleri gerçekleştirilmiştir. Elde edilen kromatogramlardan fenolik bileşiklerin UV spektrumları ve alıkonma zamanları belirlenmiştir. Çizelge 4.6’da kullanılan standart fenolik maddelerin alıkonma zamanları ve kromatogramlarda kullanılacak olan alfabetik sıralaması verilmiştir. Standart fenolik 47 Absorbans bileşiklerin alıkonma zamanlarının çakışmaması için iki farklı grup oluşturularak analizlenmiş ve 4 mg/L derişimindeki kromatogramları Şekil 4.3’te verilmiştir. Daha sonra fenolik bileşiklerin 0,2–10 mg/L derişim aralığında kromatografik analizleri gerçekleştirilip derişime karşılık kromatogramlardan elde edilen pik alanları grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafikleri çizilmiştir. Her bir standart için belirlenen doğru 2 denklemi ve regresyon katsayıları (R ) Çizelge 4.7’de verilmiştir. Tüm standartlar için LOD (3s/m) ve LOQ (10s/m) değerleri hesaplanmıştır. Ayrıca fenolik bileşiklerin kromatografik ayrılmasının tamamen gerçekleşip, saf piklerin elde edildiğini belirlemek amacıyla standartların peak purity değerleri belirlenmiştir (Çizelge 4.7). Kestane arı poleni örneklerinin ekstraksiyon verimini hesaplayabilmek için fenolik bileşikler için geri kazanım çalışmaları yapılmıştır. Bunun için; 1 mg/L derişiminde hazırlanan standart fenolik bileşikler kromatografik olarak incelenerek pik alanları belirlenmiştir. Her bir standardın doğru denklemi kullanılarak belirlenen pik alanlarından asıl derişimleri hesaplanmıştır. Aynı zamanda her 1 mg/L derişiminde hazırlanan standart fenolik bileşikler kestane arı poleni örnekleri ile aynı koşullarda ekstrakte edilerek kromatografik olarak incelenmiş ve pik alanları belirlenmiştir. Her bir standardın doğru denklemi kullanılarak belirlenen pik alanlarından ekstraksiyon sonrası derişimleri hesaplanmıştır. Elde edilen veriler doğrultusunda her bir standart fenolik bileşiğin ekstraksiyon sonrası % verim değerleri belirlenmiştir (Çizelge 4.7). 48 Çizelge 4.6. Standart fenolik maddelerin alıkonma zamanları ve kodlaması Fenolik Bileşik Alıkonma zamanı Kodlama (dk) protokatekuik asit 19.956 a epigallokateşin 21.938 b epigallokateşin gallat 24.265 c p-hidroksibenzoik asit 24.993 ç epikateşin 25.883 d vanilik asit 26.696 e hiperosid 34.219 f naringin 35.526 g rosmarinik asit 39.308 ğ kuersitrin 39.970 h luteolin 51.251 ı apigenin 57.112 i amentoflavon 59.944 j krisin 61.674 k galangin 62.486 l kateşin 22.625 m klorojenik asit 24.040 n L-triptofan 24.555 o viteksin 31.556 ö kuersetin-3-β-D-glikozit 35.142 p ellagik asit 36.155 r mirisetin 39.658 s salisilik asit 44.687 ş kamferol 56.118 t isorhamnetin 57.186 u pinocembrin 60.597 ü kafeik asit fenetil esteri 61.319 v genkvanin 62.853 y trans-kalkon 63.918 z 49 100 1. Grup k 90 80 j 70 60 50 l 40 i 30 ç 20 c e ı a 4d f g ğ h 10 b 5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 100 2. Grup 90 ü 80 70 60 y z 50 v 40 30 n r 20 o u ö p t 10 m s ş 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) Şekil 4.3. Standart fenolik bileşiklerin 280 nm’deki kromatogramları (a:protokatekuik asit, b:epigallokateşin, c:epigallokateşin gallat, ç:p-hidroksibenzoik asit, d:epikateşin, e:vanilik asit, f:hiperosid, g:naringin, ğ:rosmarinik asit, h:kuersitrin, ı:luteolin, i:apigenin, j:amentoflavon, k:krisin, l:galangin, m:kateşin, n:klorojenik asit, o:L-triptofan, ö:viteksin, p:kuersetin-3-β-D-glikozit, r:ellagik asit, s:mirisetin, ş:salisilik asit, t:kamferol, u:isorhamnetin, ü:pinocembrin, v:kafeik asit fenetil esteri, y:genkvanin, z:trans-kalkon) 50 mAU mAU Çizelge 4.7. Standart fenolik bileşiklerin validasyon parametreleri 2 Fenolik Bileşik Doğru Denklemi R LOD LOQ Peak purity Geri Kazanım (mg/L) (mg/L) (%) (%) Protokatekuik asit y = 52,5146x - 0,3731 0,9990 0,01 0,02 100 92,28 ± 2,63 Epigallokateşin y = 2,7158x + 5,0915 0,9966 0,66 2,20 100 105,34 ± 2,52 p-hidroksibenzoik asit y = 212,1504x - 29,1589 0,9993 0,02 0,06 100 76,30 ± 3,24 Vanilik asit y = 129,2840x - 33,8123 0,9973 0,02 0,06 100 81,13 ± 1,62 Krisin y = 236,7684x + 3,4142 0,9996 0,01 0,02 100 102,41 ± 4,01 Kateşin y = 20,7172x - 0,3917 0,9998 0,04 0,13 100 81,84 ± 0,77 Epigallokateşin gallat y = 33,8247x - 10,6869 0,9959 0,02 0,07 98 83,33 ± 0,40 L-triptofan y = 29,6191x + 0,4569 0,9997 0,02 0,05 99 72,00 ± 1,12 Epikateşin y = 18,1091x - 2,0975 0,9963 0,01 0,03 100 91,80 ± 1,59 Naringin y = 69,6990x - 36,8440 0,9905 0,01 0,03 99 88,85 ± 0,11 Pinocembrin y = 151,2686x - 3,8115 0,9999 0,02 0,06 100 80,10 ± 2,92 Klorojenik asit y = 52,0073x - 7,9491 0,9993 0,01 0,04 99 75,24 ± 2,00 Rosmarinik asit y = 51,2436x - 5,6164 0,9996 0,01 0,02 100 82,43 ± 1,52 Salisilik asit y = 28,6791x - 1,4160 0,9991 0,02 0,07 100 87,98 ± 0,24 Amentoflavon y = 144,6839x - 14,7692 0,9992 0,01 0,02 100 99,91 ± 2,43 51 Çizelge 4.7. (Devam) Standart fenolik bileşiklerin validasyon parametreleri 2 Fenolik Bileşik Doğru Denklemi R LOD LOQ Peak purity Geri Kazanım (mg/L) (mg/L) (%) (%) Kafeik asit-fenetil esteri y = 148,3947x - 5,8774 0,9985 0,01 0,04 99 70,76 ± 3,63 trans-kalkon y = 212,7187x - 6,1592 0,9998 0,01 0,02 100 78,63 ± 2,61 Viteksin y = 27,9491x - 1,1822 0,9976 0,01 0,03 98 88,62 ± 0,11 Hiperosid y = 77,8172x - 23,9091 0,9984 0,01 0,05 99 70,12 ± 2,24 Kuarsetin-3-β-D-glikozit y = 51,9346x - 14,3341 0,9980 0,01 0,03 100 95,67 ± 0,82 Ellagik asit y = 51,4244x - 14,8506 0,9963 0,02 0,05 100 97,22 ± 3,73 Mirisetin y = 135,7644x - 47,5975 0,9985 0,01 0,02 100 99,32 ± 0,17 Kuarsitrin y = 58,8957x - 14,2057 0,9973 0,01 0,02 100 85,73 ± 2,30 Luteolin y = 174,4071x - 29,2560 0,9991 0,07 0,24 99 89,43 ± 1,11 Kamferol y = 135,3056x - 20,4210 0,9985 0,02 0,05 100 85,06 ± 0,60 Apigenin y = 138,6645x - 14,2679 0,9999 0,05 0,18 99 73,01 ± 3,84 Isorhamnetin y = 159,3570x - 27,9280 0,9992 0,01 0,04 100 84,83 ± 1,52 Galangin y = 114,7031x - 4,0577 0,9991 0,01 0,03 99 88,04 ± 1,57 Genkvanin y = 158,5893x - 10,4198 0,9981 0,01 0,02 100 74,91 ± 3,05 52 4.2.2. Kestane arı poleni örneklerinde bulunan fenolik maddelerin tayini Şekil 3.2’de belirtildiği şekilde hazırlanan M0 numaralı kestane arı poleni etanol ekstraktı kromatografik olarak Çizelge 3.11’de belirtilen HPLC-DAD çözücü programı kullanılarak analiz edilmiştir. Kestane arı poleni örneğinin HPLC-DAD kromatogramı Şekil 4.4’te verilmiştir. Elde edilen kromatogramdaki piklerin UV spektrumları ve alıkonma zamanları standartlarla karşılaştırılarak örnekteki fenolik bileşik içeriği tespit edilmiştir (Çizelge 4.6). Daha sonra tespit edilen bu fenolik bileşiklerin pik alanları her bir standart için belirlenen kalibrasyon grafiğinde yerine koyularak örnekteki miktarları ekstraksiyon verimleri dikkate alınarak mg/kg örnek olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.8). 3000 M0 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 ü 500 t f u k l 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) Şekil 4.4. M0 numaralı kestane arı poleni etanol ekstraktının HPLC-DAD kromatogramı (a:protokatekuik asit, b:epigallokateşin, c:epigallokateşin gallat, ç:p- hidroksibenzoik asit, d:epikateşin, e:vanilik asit, f:hiperosid, g:naringin, ğ:rosmarinik asit, h:kuersitrin, ı:luteolin, i:apigenin, j:amentoflavon, k:krisin, l:galangin, m:kateşin, n:klorojenik asit, o:L-triptofan, ö:viteksin, p:kuersetin-3-β-D-glikozit, r:ellagik asit, s:mirisetin, ş:salisilik asit, t:kamferol, u:isorhamnetin, ü:pinocembrin, v:kafeik asit fenetil esteri, y:genkvanin, z: trans-kalkon.) Çizelge 4.8. M0 numaralı kestane arı poleninindeki fenolik madde miktarları (mg/kg) Örnek HİP KAM KRS GAL İSOR PİN M0 171,94±0,82 606,32±14,63 324,00±2,94 139,08±2,63 73,15±0,97 1556,00±11,14 Ortalama ± standart sapma, HİP: hiperosid, KAM: kamferol, KRS: krisin, GAL: galangin, İSOR: issorhamnetin, PİN: pinocembrin. 53 mAU M0 numaralı kestane arı poleni örneği ile yapılan ön deneme çalışmaları sonrası tez kapsamında 2017 yılında toplanan tüm kestane arı poleni örnekleri Şekil 3.2’de belirtildiği şekilde hazırlanmıştır. Kestane arı poleni etanol ekstraktları kromatografik olarak Çizelge 3.11’de belirtilen HPLC-DAD çözücü programı kullanılarak analiz edilmiştir. Kestane arı poleni örneklerinin HPLC-DAD kromatogramları Şekil 4.5’te verilmiştir. Elde edilen kromatogramlardaki piklerin UV spektrumları ve alıkonma zamanları standartlarla karşılaştırılarak örneklerdeki fenolik bileşik içeriği tespit edilmiştir (Çizelge 4.6). Daha sonra tespit edilen bu fenolik bileşiklerin pik alanları her bir standart için belirlenen kalibrasyon grafiğinde yerine koyularak örneklerdeki miktarları tayin edilmiştir. Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik bileşiklerin miktarları ekstraksiyon verimleri dikkate alınarak mg/kg örnek olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.9). 54 3500 M1 numaralı örnek 3000 2500 2000 1500 1000 ğ ı 500 f a b n ö p ü 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 3000 M2 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 500 f ğ ı j b ö i k z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) Şekil 4.5. Kestane arı poleni etanol ekstraktlarının HPLC-DAD kromatogramları (a:protokatekuik asit, b:epigallokateşin, c:epigallokateşin gallat, ç:p-hidroksibenzoik asit, d:epikateşin, e:vanilik asit, f:hiperosid, g:naringin, ğ:rosmarinik asit, h:kuersitrin, ı:luteolin, i:apigenin, j:amentoflavon, k:krisin, l:galangin, m:kateşin, n:klorojenik asit, o:L-triptofan, ö:viteksin, p:kuersetin-3-β-D-glikozit, r:ellagik asit, s:mirisetin, ş:salisilik asit, t:kamferol, u:isorhamnetin, ü:pinocembrin, v:kafeik asit fenetil esteri, y:genkvanin, z: trans-kalkon.) 55 mAU mAU 3000 M3 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 ğ 500 f ü ö a i l z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 3000 M4 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 500 ğ ı ü ö f z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 3500 M5 numaralı örnek 3000 2500 2000 1500 1000 ğ ı 500 f o ö u z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) Şekil 4.5. (Devam) Kestane arı poleni etanol ekstraktlarının HPLC-DAD kromatogramları (a:protokatekuik asit, b:epigallokateşin, c:epigallokateşin gallat, ç:p- hidroksibenzoik asit, d:epikateşin, e:vanilik asit, f:hiperosid, g:naringin, ğ:rosmarinik asit, h:kuersitrin, ı:luteolin, i:apigenin, j:amentoflavon, k:krisin, l:galangin, m:kateşin, n:klorojenik asit, o:L-triptofan, ö:viteksin, p:kuersetin-3-β-D-glikozit, r:ellagik asit, s:mirisetin, ş:salisilik asit, t:kamferol, u:isorhamnetin, ü:pinocembrin, v:kafeik asit fenetil esteri, y:genkvanin, z: trans-kalkon.) 56 mAU mAU mAU 2500 M6 numaralı örnek 2000 1500 1000 500 ğ ö f m o ü 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 3500 M7 numaralı örnek 3000 2500 2000 1500 1000 ğ ı 500 f ö u y z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 3500 K1 numaralı örnek 3000 2500 2000 1500 1000 500 ğ f n e ö k z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) Şekil 4.5. (Devam) Kestane arı poleni etanol ekstraktlarının HPLC-DAD kromatogramları (a:protokatekuik asit, b:epigallokateşin, c:epigallokateşin gallat, ç:p- hidroksibenzoik asit, d:epikateşin, e:vanilik asit, f:hiperosid, g:naringin, ğ:rosmarinik asit, h:kuersitrin, ı:luteolin, i:apigenin, j:amentoflavon, k:krisin, l:galangin, m:kateşin, n:klorojenik asit, o:L-triptofan, ö:viteksin, p:kuersetin-3-β-D-glikozit, r:ellagik asit, s:mirisetin, ş:salisilik asit, t:kamferol, u:isorhamnetin, ü:pinocembrin, v:kafeik asit fenetil esteri, y:genkvanin, z: trans-kalkon.) 57 mAU mAU mAU 3500 K2 numaralı örnek 3000 2500 2000 1500 1000 ğ ı 500 f a b ö z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 3500 K3 numaralı örnek 3000 2500 2000 1500 1000 ğ 500 ı k ö f ü v yz 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 1200 K4 numaralı başlık 1000 800 600 ı 400 f h ö 200 bm d e g r t l ky z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) Şekil 4.5. (Devam) Kestane arı poleni etanol ekstraktlarının HPLC-DAD kromatogramları (a:protokatekuik asit, b:epigallokateşin, c:epigallokateşin gallat, ç:p- hidroksibenzoik asit, d:epikateşin, e:vanilik asit, f:hiperosid, g:naringin, ğ:rosmarinik asit, h:kuersitrin, ı:luteolin, i:apigenin, j:amentoflavon, k:krisin, l:galangin, m:kateşin, n:klorojenik asit, o:L-triptofan, ö:viteksin, p:kuersetin-3-β-D-glikozit, r:ellagik asit, s:mirisetin, ş:salisilik asit, t:kamferol, u:isorhamnetin, ü:pinocembrin, v:kafeik asit fenetil esteri, y:genkvanin, z: trans-kalkon.) 58 mAU mAU mAU 500 K5 numaralı örnek 400 300 200 100 ü m c ö f p h s k z b n ç 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) K6 numaralı örnek 1200 1000 800 600 400 200 j ö ü k yz 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 3000 K7 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 500 ğ ö i j k m ü y 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) Şekil 4.5. (Devam) Kestane arı poleni etanol ekstraktlarının HPLC-DAD kromatogramları (a:protokatekuik asit, b:epigallokateşin, c:epigallokateşin gallat, ç:p- hidroksibenzoik asit, d:epikateşin, e:vanilik asit, f:hiperosid, g:naringin, ğ:rosmarinik asit, h:kuersitrin, ı:luteolin, i:apigenin, j:amentoflavon, k:krisin, l:galangin, m:kateşin, n:klorojenik asit, o:L-triptofan, ö:viteksin, p:kuersetin-3-β-D-glikozit, r:ellagik asit, s:mirisetin, ş:salisilik asit, t:kamferol, u:isorhamnetin, ü:pinocembrin, v:kafeik asit fenetil esteri, y:genkvanin, z: trans-kalkon.) 59 mAU mAU mAU 3000 K8 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 ğ 500 ı ö f i k z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 3000 K9 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 ğ ı 500 ö f u v ü k z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) 2000 K10 numaralı örnek 1500 1000 ş 500 ğ ı ö f u ü v k z 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman (dk) Şekil 4.5. (Devam) Kestane arı poleni etanol ekstraktlarının HPLC-DAD kromatogramları (a:protokatekuik asit, b:epigallokateşin, c:epigallokateşin gallat, ç:p- hidroksibenzoik asit, d:epikateşin, e:vanilik asit, f:hiperosid, g:naringin, ğ:rosmarinik asit, h:kuersitrin, ı:luteolin, i:apigenin, j:amentoflavon, k:krisin, l:galangin, m:kateşin, n:klorojenik asit, o:L-triptofan, ö:viteksin, p:kuersetin-3-β-D-glikozit, r:ellagik asit, s:mirisetin, ş:salisilik asit, t:kamferol, u:isorhamnetin, ü:pinocembrin, v:kafeik asit fenetil esteri, y:genkvanin, z: trans-kalkon.) 60 mAU mAU mAU Çizelge 4.9. Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik madde miktarları (mg/kg örnek) Örnek ROS VİT LU HİP PİN SA AME M1 7161,44 ± 45,43 662,85 ± 14,96 872,52 ± 6,70 370,22 ± 4,41 60,01 ± 1,42 x x M2 2042,16 ± 111,29 354,05 ± 3,17 287,66 ± 1,46 231,53 ± 0,74 x x 301,44 ± 14,69 M3 5135,24 ± 181,43 512,62 ± 3,54 x 288,33 ± 7,98 385,07 ± 13,90 x x M4 9328,10 ± 396,82 705,53 ± 8,34 780,91 ± 20,22 583,81 ± 18,69 232,11 ± 6,02 x x M5 13495,19 ± 335,27 1481,81 ± 36,34 906,53 ± 12,48 574,71 ± 14,64 x x x M6 4528,11 ± 146,83 487,93 ± 0,26 x 231,74 ± 6,01 60,09 ± 0,32 x x M7 6844,70 ± 193,97 734,88 ± 45,62 837,63 ± 13,19 456,55 ± 10,60 x x x K1 11581,52 ± 173,65 824,57 ± 34,52 x 274,51 ± 4,11 x x x K2 11519,32 ± 118,35 691,76 ± 29,18 806,47 ± 25,38 353,93 ± 9,89 x x x K3 5991,37 ± 9,17 1218,60 ± 4,68 742,31 ± 21,81 280,12 ± 4,69 87,41 ± 5,57 x x K4 x 1719,96 ± 34,83 576,03 ± 9,87 1126,03 ± 19,17 x x x K5 x 1115,02 ± 72,43 x 178,15 ± 10,21 66,19 ± 0,28 x x K6 x 382,58 ± 8,79 x x 71,67 ± 1,46 x 166,88 ± 1,12 K7 3400,32 ± 179,40 577,16 ± 1,80 x x 162,05 ± 15,69 x 42,75 ± 1,56 K8 7618,89 ± 306,50 675,73 ± 49,22 449,91 ± 9,75 330,61 ± 8,01 x x x K9 8048,24 ± 145,35 1364,63 ± 51,44 412,25 ± 14,22 275,35 ± 8,95 138,22 ± 4,07 x x K10 4344,46 ± 166,15 1332,05 ± 11,13 291,94 ± 4,88 283,02 ± 14,49 118,90 ± 6,65 2095,03 ± 6,70 x Ortalama ± standart sapma, x: tespit edilemedi, ROS: rosmarinik asit, VİT: viteksin, LU: luteolin, HİP: hiperosid, PİN: pinocembrin, SA: salisilik asit, AME: amentoflavon. 61 Çizelge 4.9. (Devam) Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik madde miktarları (mg/kg örnek) Örnek EA PHBA KAM MİR KAFE VA GENK KRS M1 x x x x x x x x M2 x x x x x x x 26,17 ± 0,79 M3 x x x x x x x x M4 x x x x x x x x M5 x x x x x x x x M6 x x x x x x x x M7 x x x x x x 47,72 ± 2,06 x K1 x x x x x 50,12 ± 3,31 x 18,47 ± 0,23 K2 x x x x x x x x K3 x x x x 43,14 ± 0,92 x 18,40 ± 0,52 33,74 ± 0,05 K4 35,83 ± 0,62 x 23,77 ± 0,58 x x 72,67 ± 0,18 20,36 ± 0,46 24,21 ± 0,44 K5 x 4,82 ± 0,20 x 80,70 ± 5,66 x x x 34,17 ± 0,78 K6 x x x x x x 21,82 ± 0,85 34,38 ± 1,06 K7 x x x x x x 32,95 ± 2,15 44,88 ± 2,35 K8 x x x x x x x 20,00 ± 0,38 K9 x x x x 42,95 ± 0,20 x x 37,45 ± 0,22 K10 x x x x 24,11 ± 1,33 x x 33,84 ± 0,12 Ortalama ± standart sapma, x: tespit edilemedi, EA: ellagik asit, PHBA: p-hidroksi benzoik asit, KAM: kamferol, MİR: mirisetin, KAFE: kafeik asit-fenetil esteri, VA: vanilik asit, GENK: genkvanin, KRS: krisin. 62 Çizelge 4.9. (Devam) Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik madde miktarları (mg/kg örnek) Örnek LTR TKAL KU APİ KUG İSOR GAL M1 x x x x 540,86 ± 52,67 x x M2 x 49,36 ± 2,18 x 6239,95 ± 9,59 x x x M3 x 60,96 ± 0,80 x 759,72 ± 10,11 x x 69,42 ± 6,19 M4 x 29,42 ± 0,52 x x x x x M5 201,14 ± 0,21 7,51 ± 0,27 x x x 235,44 ± 17,64 x M6 126,13 ± 2,49 x x x x x x M7 x 27,51 ± 0,29 x x x 45,96 ± 1,65 x K1 x 33,54 ± 3,94 x x x x x K2 x 28,70 ± 0,31 x x x x x K3 x 38,28 ± 0,27 x x x x x K4 x 14,50 ± 0,84 950,57 ± 11,80 x x x 17,32 ± 0,90 K5 x 36,25 ± 0,31 199,36 ± 3,86 x 44,42 ± 2,02 x x K6 x 15,13 ± 0,62 x x x x x K7 x x x 322,77 ± 6,52 x x x K8 x 58,24 ± 0,20 x 303,87 ± 8,63 x x x K9 x 52,53 ± 0,28 x x x 163,42 ± 6,16 x K10 x 35,12 ± 0,59 x x x 117,30 ± 7,39 x Ortalama ± standart sapma, x: tespit edilemedi, LTR: L-triptofan, TKAL: trans-kalkon, KU: kuersitrin, APİ: apigenin, KUG: kuersetin-3-β-D-glikozit, İSOR: isorhamnetin, GAL: galangin. 63 Çizelge 4.9. (Devam) Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik madde miktarları (mg/kg örnek) Örnek KLO NA PKA KAT EKAT EGK EGKG M1 171,22 ± 0,52 x 6,17 ± 0,04 x x 165,89 ± 0,25 x M2 x x x x x 49,84 ± 0,25 x M3 x x 12,99 ± 0,18 x x x x M4 x x x x x x x M5 x x x x x x x M6 x x x 19,37 ± 0,38 x x x M7 x x x x x x x K1 104,36 ± 3,83 x x x x x x K2 x x 6,51 ± 0,41 x x 155,40 ± 1,23 x K3 x x x x x x x K4 x 181,47 ± 8,41 x 145,26 ± 8,59 260,04 ± 16,67 300,64 ± 1,98 x K5 8,39 ± 0,07 x x 145,53 ± 2,63 x 331,58 ± 2,22 72,74 ± 1,73 K6 x x x x x x x K7 x x x 205,74 ± 2,04 x x x K8 x x x x x x x K9 x x x x x x x K10 x x x x x x x Ortalama ± standart sapma, x: tespit edilemedi, KLO: klorojenik asit, NA: naringin, PKA: protokatekuik asit, KAT: kateşin, EKAT: epikateşin, EGK: epigallokateşin, EGKG: epigallokateşin gallat. 64 4.2.3. Kestane arı poleni örneklerinde bulunan karotenoidlerin tayini Kestane arı poleni örneklerinin karotenoid içeriğinin kalitatif ve kantitatif olarak belirlenebilmesi için standart karotenoidlerin kromatografik analizleri Çizelge 3.12’de belirtilen HPLC-DAD çözücü programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen kromatogramlardan karotenoidlerin UV spektrumları ve alıkonma zamanları belirlenmiştir. Çizelge 4.10’da kullanılan standart karotenoid bileşiklerinin alıkonma zamanları ve kromatogramlarda kullanılacak olan kodlamaları verilmiştir. Standart karotenoid bileşiklerinin 0,25–10 mg/L derişim aralığında çizilen kalibrasyon 2 eğrilerinin doğru denklemleri ve regresyon katsayıları (R ) Çizelge 4.11’de verilmiştir. Çizelge 4.10. Standart karotenoid bileşiklerinin alıkonma zamanları ve kodlanması Karotenoid Alıkonma Zamanı Kodlama (dk) Astaksantin 17.3 1 Lutein 19.7 2 Zeaksantin 21.8 3 β-kriptoksantin 28.5 4 β-karoten 33.4 5 α-karoten 35.9 6 Çizelge 4.11. Standart karotenoidlerin validasyon parametreleri 2 Karotenoid Doğru Denklemi R Derişim aralığı (mg/L) Astaksantin y=153,6x – 86,3 0,995 0,25-10 Lutein y=71,2x – 1,9 0,998 0,25-10 Zeaksantin y=265,7x – 23,0 0,998 0,25-10 β-kriptoksantin y=57,7x – 22,3 0,997 0,25-10 β-karoten y=154,4x – 19,5 0,998 0,25-10 α-karoten y=118,0x – 17,2 0,999 0,25-10 65 Şekil 3.2’de belirtildiği şekilde hazırlanan kestane arı poleni etanol ekstraktları kromatografik olarak Çizelge 3.12’de belirtilen HPLC-DAD çözücü programı kullanılarak analiz edilmiştir. Kestane arı poleni örneklerinin HPLC-DAD karotenoid kromatogramları Şekil 4.6’da verilmiştir. Elde edilen kromatogramlardaki piklerin UV spektrumları alıkonma zamanlarına göre standartlarla karşılaştırılarak örneklerin karotenoid içerikleri tespit edilmiştir. Daha sonra tespit edilen bu karotenoidlerin pik alanları her bir standart için belirlenen kalibrasyon grafiğinde yerine koyularak örneklerdeki miktarları tayin edilmiştir. Kestane arı poleni örneklerindeki karotenoidlerin miktarları mg/kg örnek olarak Çizelge 4.12’de verilmiştir. 160 M1 numaralı örnek 140 120 100 80 60 40 3 20 2 6 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 250 M2 numaralı örnek 200 150 100 50 6 3 2 4 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) Şekil 4.6. Kestane arı poleni etanol ekstraktlarının HPLC-DAD karotenoid kromatogramları (1: astaksantin, 2: lutein, 3: zeaksantin, 4: β-kriptoksantin, 5: α- karoten, 6: β-karoten.) 66 mAU mAU 180 M3 numaralı örnek 160 140 120 100 80 3 60 40 6 20 2 4 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 120 M4 numaralı örnek 100 80 60 40 20 3 6 1 2 4 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 180 M5 numaralı örnek 160 140 120 100 80 60 3 40 20 6 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) Şekil 4.6. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin HPLC-DAD karotenoid kromatogramları (1: astaksantin, 2: lutein, 3: zeaksantin, 4: β-kriptoksantin, 5: α- karoten, 6: β-karoten.) 67 mAU mAU mAU 3000 M6 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 500 6 2 3 4 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 160 M7 numaralı örnek 140 120 100 80 60 3 40 20 2 6 4 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 250 K1 numaralı örnek 200 150 100 50 2 3 6 4 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) Şekil 4.6. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin HPLC-DAD karotenoid kromatogramları (1: astaksantin, 2: lutein, 3: zeaksantin, 4: β-kriptoksantin, 5: α- karoten, 6: β-karoten.) 68 mAU mAU mAU 1200 K2 numaralı örnek 1000 800 600 400 200 6 2 3 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 1800 K3 numaralı örnek 1600 1400 1200 1000 800 600 400 6 200 2 3 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 180 K4 numaralı örnek 160 140 120 100 80 60 40 6 20 2 3 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) Şekil 4.6. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin HPLC-DAD karotenoid kromatogramları (1: astaksantin, 2: lutein, 3: zeaksantin, 4: β-kriptoksantin, 5: α- karoten, 6: β-karoten.) 69 mAU mAU mAU 3000 K5 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 6 500 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 3000 K6 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 500 6 2 3 4 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 2500 K7 numaralı örnek 2000 1500 1000 500 6 2 3 4 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) Şekil 4.6. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin HPLC-DAD karotenoid kromatogramları (1: astaksantin, 2: lutein, 3: zeaksantin, 4: β-kriptoksantin, 5: α- karoten, 6: β-karoten.) 70 mAU mAU mAU 3000 K8 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 500 6 2 3 4 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 3000 K9 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 500 6 2 3 4 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) 3000 K10 numaralı örnek 2500 2000 1500 1000 6 500 2 3 4 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Zaman (dk) Şekil 4.6. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin HPLC-DAD karotenoid kromatogramları (1: astaksantin, 2: lutein, 3: zeaksantin, 4: β-kriptoksantin, 5: α- karoten, 6: β-karoten.) 71 mAU mAU mAU Çizelge 4.12. Kestane arı poleni örneklerindeki karotenoid miktarları (mg/kg örnek) Örnek AST LU ZEA β-KRİP α-KAR β-KAR M1 x 15,00 ± 0,10 17,30 ± 0,56 x x 4,45 ± 0,01 M2 x 18,75 ± 0,02 15,82 ± 0,16 24,13 ± 0,29 x 21,01 ± 0,18 M3 x 5,91 ± 0,09 6,97 ± 0,14 9,41 ± 0,06 x 8,39 ± 0,17 M4 6,88 ± 0,05 20,20 ± 0,03 36,38 ± 0,21 21,51 ± 0,05 6,63 ± 0,02 40,81 ± 0,00 M5 x 7,30 ± 0,15 32,44 ± 0,28 x x 2,42 ± 0,01 M6 x 33,42 ± 0,35 20,73 ± 0,30 44,67 ± 0,61 x 294,42 ± 8,43 M7 x 7,22 ± 0,02 25,15 ± 0,06 7,81 ± 0,05 x 9,51 ± 0,16 K1 x 4,40 ± 0,07 8,03 ± 0,05 7,55 ± 0,10 6,84 ± 0,09 19,31 ± 0,12 K2 x 18,59 ± 0,18 27,20 ± 0,04 x 152,42 ± 0,04 116,68 ± 0,03 K3 x 13,19 ± 0,38 16,32 ± 0,00 x 9,80 ± 0,10 179,68 ± 1,60 K4 x 3,88 ± 0,08 4,88 ± 0,05 x 6,20 ± 0,01 31,42 ± 0,33 K5 x x x x x 388,20 ± 9,77 K6 x 8,77 ± 0,03 8,72 ± 0,10 30,49 ± 0,16 25,99 ± 0,36 296,12 ± 0,33 K7 x 12,58 ± 0,07 12,21 ± 0,34 14,65 ± 0,07 19,84 ± 0,12 289,38 ± 3,86 K8 x 8,12 ± 0,04 13,14 ± 0,03 32,47 ± 0,10 x 271,25 ± 0,08 K9 x 9,50 ± 0,03 11,84 ± 0,12 18,68 ± 0,18 7,95 ± 0,05 289,52 ± 1,47 K10 x 12,98 ± 0,15 15,57 ± 0,22 34,21 ± 0,20 31,06 ± 0,15 395,02 ± 2,48 Ortalama ± standart sapma, x: tespit edilemedi, AST: astaksantin, LU: lutein, ZEA: zeaksantin, β-KRİP: β-kriptoksantin, α-KAR: α-karoten, β-KAR: β-karoten. 4.2.4. Kestane arı poleni örneklerinin DNA oksidatif baz hasar ürünlerine etkisi DNA çeşitli mekanizmalarla sürekli olarak oksidatif hasara uğrar (Dizdaroglu 2012). DNA’da oluşan bu oksidatif hasarın doğal sebze ve meyvelerin içerdikleri antioksidanlar tarafından korunduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, yüksek antioksidan özelliklere sahip bir ürün olan kestane arı poleninin DNA oksidatif hasarı üzerindeki etkileri incelenmiştir. 72 Kestane arı poleni örneklerinin DNA oksidasyonunu önleme etkisinin incelenmesi için Şekil 3.4’te belirtilen şekilde hazırlanan DNA oksidatif baz hasar ürünlerinin kromatografik olarak Çizelge 3.13 ve Çizelge 3.14’te belirtilen GC-MS/MS çalışma koşullarında analizleri gerçekleştirilmiştir. Her bir hasar ürününün belli derişim aralıklarında belirlenen doğru denklemleri ve regresyon katsayıları Çizelge 4.13’te verilmiştir. Çizelge 4.13. DNA oksidatif baz hasar ürünlerinin validasyon parametreleri 2 DNA Doğru denklemi R Derişim aralığı baz hasar ürünü (µg/L) 56DHT y = 16646x + 18767 0,9999 0,25-200 56DHU y = 29866x + 26116 0,9999 0,25-200 5H5MH y = 139484x + 40828 0,9995 0,25-200 5HH y = 332926x + 456151 0,9999 0,10-200 5FU y = 37526x + 182000 0,9985 0,50-200 5HU y = 180247x – 71952 0,9983 0,25-200 5HMU y = 35141x + 5368 0,9997 0,05-200 Alx y = 403716x – 448535 0,9985 0,10-200 5HC y = 234156x – 344006 0,9969 0,10-200 46D5NP y = 25379x – 19999 0,9978 0,50-200 TG y = 650289x + 807385 0,9966 0,10-200 5HMC y = 12495x – 2449 0,9991 0,10-200 FapyAde y = 123507x + 139198 0,9998 0,10-200 8HA y = 204511x + 825496 0,9918 0,10-200 2HA y = 8172x + 55630 0,9104 0,25-200 FapyGua y = 99348x – 214935 0,9962 0,25-200 28DHA y = 63055x – 139448 0,9976 0,50-400 8HG y = 82775x + 2508 0,9874 0,10-25 73 Fenton reaksiyonu ile oksidatif strese uğratılan DNA ve kestane arı poleni ilave edilerek oksidatif strese uğratılan DNA örnekleri Şekil 3.4’te belirtildiği şekilde analize hazırlanmıştır. Hazırlanan örnekler Çizelge 3.13 ve Çizelge 3.14’te belirtilen GC- MS/MS çalışma koşullarında analiz edilerek her bir standart baz hasar ürününün oluşum miktarları belirlenmiştir. Çizelge 4.13’te verilen sonuçlara göre M0 numaralı kestane arı poleni örneğinin oksidatif stres sonrası DNA’da oluşan baz hasar ürünlerinin oluşumunu önleme etkisi hesaplanmıştır (Çizelge 4.14). Çizelge 4.14. Kestane poleninin DNA hasarını önleme etkisi (%) DNA oksidatif DNA DNA+Polen Kestane poleninin DNA baz hasar (ng/g DNA) (ng/g DNA) hasarını önleme etkisi ürünleri (%) 56DHU 5,52 3,11 43,64 5H5MH 22,18 5,91 73,36 5HH 29,42 8,94 69,61 5HU 5,23 0,38 92,81 5HMU 8,57 2,78 67,55 Alx 4,05 0,58 85,60 5HC 3,85 3,73 3,01 46D5NP 1,30 1,30 0,00 TG 0,93 0,68 26,85 5HMC 0,34 0,34 0,00 46D5FP 0,00 0,00 0,00 8HA 0,00 0,00 0,00 2HA 0,00 0,00 0,00 FapyGua 3,02 2,96 1,71 28DHA 0,73 0,42 42,54 8HG 7,74 1,26 83,78 TOPLAM 92,87 32,39 65,12 74 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Yaşamımız boyunca hücrelerde meydana gelen kimyasal reaksiyonlar veya UV-ışınları, sigara dumanı, çevre kirlilikleri gibi çeşitli dış etkenlerle birlikte vücudumuzdaki oksidan-antioksidan dengesi bozularak serbest radikal oluşumu gerçekleşmektedir. Oluşan bu duruma karşı vücudun savunma mekanizması yetersiz kaldığında serbest radikaller DNA, yağ, protein gibi yapılara saldırarak bu yapılarda oksidatif hasar oluştururlar. Askorbik asit, tokoferol, karotenoid ve fenolik bileşik gibi antioksidan özellikli moleküller serbest radikallere elektron vererek onları etkisiz hale getirirler. Böylece serbest radikal etkisini ortadan kaldırarak doku fonksiyonlarının bozulması sonucu ortaya çıkabilecek ve birçok hastalığa neden olabilecek zincir reaksiyonları, önlemiş olurlar (Leja ve ark. 2007, Kolaç ve ark. 2017). Günümüzde fenolik bileşiklere olan ilgi antioksidan özelliği ve serbest radikal süpürücü aktivitesine bağlı olarak artmıştır. Eski çağlardan beri bal, polen, propolis gibi arı ürünleri zengin içeriğinden dolayı geleneksel tıbbın yanı sıra besin takviyesi olarak da kullanılmaktadır (Isla ve ark. 2001). Arı poleni zengin fenolik madde içeriği sebebiyle diğer arı ürünlerine nazaran sahip olduğu anti-bakteriyel, anti-fungal, anti-kanser, anti- inflamatuar gibi terapötik özellikleri açısından son zamanların ilgi odağı olmuştur (Carpes ve ark. 2007). Bu doğrultuda farklı coğrafi ve bitki kökenli arı poleni örneklerinin antioksidan özelliklerinin araştırılması önem kazanmıştır. Türkiye’nin kestane üretimi açısından Dünya sıralamasında önemli bir yere sahip olması ve literatüre bakıldığında kromatografik olarak (nicel analiz) kestane arı poleni ile yapılmış çok fazla çalışma olmaması sebebiyle bu tez kapsamında farklı coğrafi bölgelerden toplanan kestane arı poleni örnekleriyle çalışılmıştır. Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik bileşiklerin tayininin doğru bir şekilde yapılabilmesi için örnek hazırlama aşaması son derece önemlidir. Fenolik bileşikler serbest formda bulunup bulunmadığına, yağ asitleri (çözünebilir esterler) veya çözünmeyen makromoleküller gibi diğer moleküllere kovalent olarak bağlı olup olmadığına bağlı olarak serbest, esterlenmiş ve çözünmeyen-bağlı formlara ayrılabilir. Çözünmeyen-bağlı fenoliklerin çoğu, kimyasal olarak, pektin, selüloz ve yapısal proteinler dahil olmak üzere hücre duvarı maddeleri ile kovalent bağlar oluştururlar. 75 Gıdaların antioksidan özelliğinden, çözünür fenoliklere kıyasla çözünmeyen bağlı fenolik bileşiklerin nispeten daha büyük bir miktarda sorumlu olduğu bilinmektedir (Shahidi ve Yeo 2016). Bağlı fenolik bileşikleri serbest bırakmak için alkali, asidik veya enzimatik hidroliz yöntemleri kullanılabilir (Sani ve ark. 2012, Su ve ark. 2014). Çalışma kapsamında kestane arı poleni örneklerinin ekstraksiyonu, bağlı fenolikleride ekstrakte edebilmek için asidik hidroliz yöntemi kullanılmıştır (Şekil 3.2). Tez kapsamında ekstrakte edilen kestane arı poleni örneklerindeki fenolik bileşiklerin tayini için kullanılan yöntemler iki ana başlıkta toplanabilir. Bunlar;  Spektroskopik yöntemler  Kromatografik yöntemler 5.1. Spektroskopik Yöntemler 5.1.1. Kestane arı poleni örneklerinin antioksidan özelliklerinin belirlenmesi Literatüre bakıldığında spektroskopik olarak antioksidanlar Folin-Ciocalteu, CHROMAC, FRAP, CUPRAC, ABTS ve DPPH gibi yöntemler kullanılarak tayin edilmiştir. Yapılan tez çalışmasında toplam fenolik madde miktarının tespiti için Folin- Ciocalteu yöntemi, antioksidan kapasitesinin belirlenmesi için ise CHROMAC, FRAP ve ABTS yöntemleri kullanılmıştır. Karadeniz ve Marmara Bölgeleri’nin farklı lokalitelerinden toplanan kestane arı poleni örneklerinin toplam fenolik madde içerikleri 16,19 ± 0,25 ile 39,50 ± 0,45 mg GAE/g örnek arasında bulunmuştur (Çizelge 4.3). Yıldız ve ark. (2013), 2008 yılında Zonguldak’tan toplanan kestane poleninin toplam fenolik madde miktarını 28,87 mg GAE/g DW olarak tespit etmişlerdir. Sonuç, tez kapsamında 2017 yılında Zonguldak ilinin farklı bölgelerinden toplanan kestane poleni örneklerinin toplam fenolik madde içerikleri ile karşılaştırıldığında ortalama değerin altında olduğu gözlenmiştir. Aynı şekilde Karadeniz bölgesinden toplanan kestane poleni örneği (Yıldız ve ark. 2014) ile 2013 yılında Sinop’un farklı bölgelerinden toplanan kestane poleni örneklerinin (Avşar ve ark. 2016) toplam fenolik madde miktarları sırasıyla 52,12 mg GAE/g kestane poleni 76 ve 64,02 - 103,8 mg GAE/g kestane poleni olarak bulunmuştur. Sonuçlar elde ettiğimiz verilerle karşılaştırıldığında tez sonuçlarının daha düşük olduğu görülmüştür. Gözlenen bu farklılıklar kestane poleni örneklerinin farklı coğrafi ve botanik özelliklere sahip olması ile ekstraksiyon yöntemlerinin farklı olmasından kaynaklanmaktadır. Kestane arı poleni örneklerinin antioksidan kapasite sonuçları FRAP yöntemi ile 1,53 ± 0,06 - 4,75 ± 0,02 mM TE/g kestane arı poleni, ABTS ve CHROMAC yöntemi ile sırasıyla 13,85 ± 0,03 - 42,58 ± 0,28 mg TE/g kestane arı poleni ve 45,48 ± 0,27 - 115,58 ± 0,96 mg TE/g kestane arı poleni olarak bulunmuştur (Çizelge 4.5). Zonguldak’tan alınan kestane balı örneği (Sarıkaya ve ark 2009) ile 2014 yılında Karadeniz’in farklı coğrafi bölgelerindeki arıcılardan temin edilen kestane balı örneklerinin (Kolaylı ve ark. 2016) FRAP yöntemi ile antioksidan kapasite sonuçları sırasıyla, 94,27 ± 0,91 – 104,42 ± 1,01 µM TE/g kestane balı ve 355 ± 23,08 – 462 ± 18,48 µmol FeSO4/100 g kestane balı olarak bulunmuştur. Almeida ve ark. (2017) ‘nın liyofilize arı poleni ile yaptıkları çalışmada antioksidan kapasite değeri FRAP yöntemi ile 60,64 ± 0,63 mmol Fe/g arı poleni olarak bulunmuştur. Ulusoy ve Kolaylı (2014) ‘nın 2007-2008 yıllarında toplanan anzer polenleri ile yaptıkları diğer bir çalışmada ise antioksidan kapasite sonuçları 11,77 ± 0,63 ile 105,06 ± 0,59 µmol TE/g anzer poleni aralığında bulunmuştur. Yıldız ve ark. (2013) ‘nın kestane poleni ile yaptıkları çalışmada ise antioksidan kapasite sonucu (FRAP) 82,31 ± 2,41 mM TE/g DW olarak tespit edilmiştir. Ayrıca Karadeniz Bölgesi’nden toplanan kestane balı, kestane poleni ve kestane propolisinin antioksidan kapasite değerleri sırasıyla, 24,11 ± 1,10, 124,62 ± 4,88 ve 509,86 ± 12,11 mM TE/g örnek olarak kaydedilmiştir (Yıldız ve ark. 2014). Genel olarak bakıldığında tez kapsamında FRAP yöntemi ile elde edilen antioksidan kapasite değerleri literatürden daha yüksek bulunmuştur. Almeida ve ark. (2017) liyofilize arı poleninin antioksidan kapasitesini ABTS yöntemi ile belirlemiş ve 120,10 ± 0,21 µmol TEAC/g arı poleni olarak bulmuşlardır. Yapılan diğer bir çalışmada ise Türkiye’nin farklı bölgelerindeki arıcılardan temin edilen kestane ballarının antioksidan kapasite değerleri 1,06 ± 0,06 ve 6,22 ± 0,23 mg TE/g kestane balı aralığında bulunmuştur (Güneş ve ark. 2016). Buna göre tez kapsamında çalışılan kestane arı poleni örneklerinin antioksidan özelliği daha yüksektir. 77 CHROMAC yöntemi yeni gelişen bir yöntem olduğundan literatürde çok çalışma bulunmamaktadır. Bildiğimiz kadarıyla Güneş ve ark. (2016) ‘nın kestane ve çiçek ballarıyla yaptıkları araştırma dışında herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Elde ettikleri verilere göre kestane ballarının antioksidan kapasite değerleri 10,80 ± 0,01 ve 22,00 ± 1,00 mg TE/kg arasında değişmektedir. Bu veriler doğrultusunda tez kapsamında analiz edilen kestane arı polenlerindeki antioksidan kapasite değerleri kestane ballarına oranla daha yüksek bulunmuştur. Genel olarak kestane arı poleni örneklerinin antioksidan kapasite ölçümlerinde 3 faklı yöntem kullanılmıştır. Çünkü antioksidan kapasitenin belirlenmesinde kullanılan yöntemlerin her biri farklı çalışma mekanizmasına sahiptir. Etki ettikleri fenolik bileşikler farklı olduğu için örneklerdeki antioksidan kapasite değerleride farklı olacaktır. Bu nedenle sonuçlar literatürdeki örneklerle karşılaştırılırken aynı yöntemler birbiri ile karşılaştırılarak yorumlanırsa daha sağlıklı sonuçlara ulaşılacaktır. Yapılan tez çalışmasında spektroskopik yöntemler birbirleriyle karşılaştırıldığında, yöntemler arasında yüksek korelasyonların olduğu gözlenmiştir. Folin-Ciocalteu yöntemi ile 2 ABTS ve FRAP yöntemleri arasındaki korelasyon katsayıları (R ) sırasıyla, 0,8991 ve 2 0,8114, ABTS ile FRAP yöntemleri arasındaki korelasyon katsayısı (R ) ise 0,6294 olarak belirlenmiştir. Yöntemler arasındaki yüksek korelasyon, toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite sonuçlarının birbiriyle uyumlu olduğunu göstermektedir. Kestane arı poleni örneklerindeki toplam fenolik madde içeriği ve antioksidan kapasite miktarları literatürdeki çalışmalarla karşılaştırıldığında farklı sonuçların elde edildiği gözlemlenmiştir. Flavonoid ve fenolik asit gibi fenolik bileşikler, her bir bitki için benzersiz bir profile sahiptir. Kestane ağaçlarının coğrafi bölgelerinin farklı olmasından dolayı toprak tipi ve iklim koşullarındaki farklılıklar kestane arı poleni örneklerindeki fenolik bileşik içeriğini belirlemektedir. Ayrıca arıcılık faaliyetleri, saklama koşulları, örnek hazırlama teknikleri ve ekstraksiyon koşulları gibi faktörlerde örneklerin fenolik madde içeriğini etkilemektedir. 78 5.1.2. Kestane arı poleninin DNA oksidasyonuna etkisinin incelenmesi DNA hasarı, canlı hücrelerde çeşitli mekanizmalarla oksidatif olarak ortaya çıkmaktadır (Dizdaroğlu 2012). İnsan vücudunda doğal olarak var olan savunma mekanizması yetersiz kaldığında DNA hasarı tamir edilemez ve çeşitli mutasyonlar, kanser gibi birçok hastalık oluşmaya başlar. Sebze ve meyvelerin bünyelerinde doğal olarak içerdikleri fenolik bileşiklerin antioksidatif etki göstererek DNA hasarını koruduğu bilinmektedir. Bu çalışmada yüksek antioksidan özelliklere sahip, doğal bir ürün olan kestane arı poleninin DNA hasarı üzerindeki etkisi incelenmiştir. 20,0 µg/mL derişimindeki saf DNA’nın Fenton reaksiyonu ile oksidatif hasara uğradıktan sonra miktarının 10,2 µg/mL ’ye düştüğü görülmüştür. Ancak kestane arı poleni varlığında oksidatif hasara uğratılan DNA’nın miktarının 12,4 µg/mL’ye düştüğü tespit edilmiştir. Normal şartlarda %49 oranında oksidatif hasara uğrayan DNA, kestane arı poleninin varlığında %38 oranında oksidatif hasara uğramıştır. Kestane arı poleni örneğindeki fenolik bileşiklerin DNA’nın oksidatif hasara uğramasını %11 oranında önlediği belirlenmiştir (Şekil 4.2) (Karkar ve ark. 2018). 5.2. Kromatografik Yöntemler 5.2.1. Kestane arı poleninde bulunan fenolik bileşiklerin tayini Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik bileşikleri kromatografik olarak HPLC-DAD ile analiz edebilmek için öncelikle uygun kolon, çözücü ve çözücü programı belirlenmiştir. Bunun için literatürdeki benzer çalışmalar incelenmiş ve XBridge C18 (3,5 µm, 4,6 x 250 mm) kolonu ile çalışılmıştır. Ters faz kromatografisi kullanılarak metanol ve %1’lik sulu formik asit gibi polar çözücülerden oluşan gradient programlı (Çizelge 3.11) hareketli faz sistemi kullanılmıştır. 0,5 mL/dk akış hızı ve 10 µL enjeksiyon hacmi ile standart fenolik bileşiklerin ve kestane poleni etanol ekstraktlarının analizleri gerçekleştirilmiştir. 79 0,2-10,0 mg/L derişim aralığında Çizelge 3.11’de belirtilen çözücü programı kullanılarak tüm standartlar analiz edilmiştir. Elde edilen kromatogramlardan fenolik bileşiklerin pik alanları belirlenerek kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur (Çizelge 4.7). Aynı koşullarda analiz edilen kestane arı poleni örneklerinin kromatogramları incelenerek fenolik bileşik profilleri belirlenmiştir. Daha sonra belirlenen kalibrasyon grafikleri yardımıyla fenolik bileşiklerin miktarları mg/kg örnek olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.8). Farklı lokaliteleden toplanan kestane arı poleni örneklerinin oldukça farklı fenolik bileşik içeriğine sahip olduğu gözlemlenmiştir. Şekil 5.1’de kestane arı poleni örneklerindeki fenolik bileşiklerin bar grafikleri verilmiştir. Rosmarinik asit 15000 10000 5000 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Viteksin 2000 1500 1000 500 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 80 mg / kg örnek mg / kg örnek Luteolin 1000 800 600 400 200 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Hiperosid 1200 1000 800 600 400 200 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Pinocembrin 400 300 200 100 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 81 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek Salisilik asit 2500 2000 1500 1000 500 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Amentoflavon 400 300 200 100 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Ellagik asit 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 82 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek p-hidroksibenzoik asit 5 4 3 2 1 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Kamferol 25 20 15 10 5 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Mirisetin 100 80 60 40 20 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 83 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek Kafeik asit-fenetil esteri 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Vanilik asit 80 60 40 20 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Genkvanin 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 84 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek Krisin 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni L-triptofan 250 200 150 100 50 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni trans-kalkon 80 60 40 20 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 85 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek Kuersitrin 1000 800 600 400 200 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Apigenin 8000 6000 4000 2000 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Kuersetin-3-β-D-glikozit 600 500 400 300 200 100 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 86 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek İsorhamnetin 250 200 150 100 50 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Galangin 80 60 40 20 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Klorojenik asit 200 150 100 50 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 87 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek Naringin 200 150 100 50 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Protokatekuik asit 15 10 5 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Kateşin 250 200 150 100 50 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 88 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek Epikateşin 300 200 100 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Epigallokateşin 400 300 200 100 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Epigallokateşin gallat 80 60 40 20 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.1. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik profilleri 89 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek Karadeniz ve Marmara bölgelerinden toplanan örneklerde bulunan en önemli fenolik bileşiğin rosmarinik asit olduğu tespit edilmiştir. K4, K5 ve K6 numaralı örnekler dışında tüm örneklerde bulunan rosmarinik asidin en yüksek miktarı 13495,19 ± 335,27 mg/kg örnek olarak M5 numaralı örnekte, en düşük miktarı ise 5991,37 ± 9,17 mg/kg örnek olan K3 numaralı örnekte bulunmuştur. İkinci önemli fenolik bileşik olarak ise viteksin tespit edilmiştir. Tüm örneklerde tespit edilen viteksin 354,05 ± 3,17 (M2) ile 1719,96 ± 34,83 (K4) mg/kg örnek aralığında bulunmuştur. Kestane arı poleni örneklerinde üçüncü ve dördüncü olarak luteolin ve hiperosid fenolikleri tespit edilmiştir. Hemen hemen tüm örneklerde bulunan lutein ve hiperosid sırasıyla 287,66 – 906,53 mg/kg ile 178,15 – 1115,02 mg/kg aralığında bulunmuştur. Kamferol, p-hidroksibenzoik asit, vanilik asit, kafeik asit- fenetil esteri, ellagik asit ve mirisetin yalnızca Karadeniz Bölgesi’ndeki örneklerde ve düşük miktarlarda bulunmuştur. Protokatekuik asit ise Karadeniz Bölgesi’ndeki K2 numaralı örnekte 6,51 mg/kg örnek olarak bulunurken, Marmara Bölgesi’ndeki M1 numaralı örnekte 6,17 mg/kg örnek iken M3 numaralı örnekte yaklaşık olarak iki katı miktarda (12,99 mg/kg örnek) bulunmuştur. Galangin Marmara Bölgesi’ndeki M3 numaralı örnekte (69,42 mg/kg örnek), Karadeniz Bölgesi’ndeki K4 numaralı örneğe (17,32 mg/kg örnek) göre daha yüksek bulunmuştur. Genkvanin K3, K4, K6 ve K7 numaralı örneklerde M7 numaralı örneğe (47,72 mg/kg örnek) göre daha düşük bulunmuştur. Kuersetin-3-β-D-glikozit K5 numaralı örnekte düşük miktarda (44,42 ±2,02 mg/kg örnek) bulunurken M1 numaralı örnekte yüksek miktarda (540,86 ± 52,67 mg/kg örnek) tespit edilmiştir. Kestane arı poleni örneklerinde bulunan krisin ve trans-kalkon miktarları sırasıyla 18,47- 44,88 mg/kg örnek ile 7,51 – 60,96 mg/kg örnek aralığında tespit edilmiştir. kateşin (K4, K5, K7 ve M6), epigallokateşin (K2, K4, K5, M1 ve M2), epikateşin (K4) ve epigallokateşin gallat (K5) gibi flavonoller çoğunlukla Karadeniz Bölgesi’nde bulunmasının yanında Marmara Bölgesi’ndeki örneklerde de düşük miktarlarda gözlenmiştir. Salisilik asit sadece K10 numaralı örnekte bulunmasına rağmen oldukça yüksek miktarda (2095,03 mg/kg örnek) tespit edilmiştir. 90 Birçok bitki flavonoid ve fenolik asitler gibi çok miktarda fenolik bileşik içerdiğinden ve her bitki kendine özgü bir profile sahip olduğundan, polenlerdeki fenolik bileşikler ve miktarları bitkilerin botanik kökenine bağlıdır. Bitkinin yetiştiği yer, iklim koşulları, büyüme veya olgunlaşma aşamasındaki farklılıklar fenolik bileşik içeriğinde değişikliklere neden olur. Güneş ve ark. (2017)’nın kestane balları ile yaptığı çalışma ile kestane polenlerindeki fenolik bileşikler karşılaştırıldığında rosmarinik asit, luteolin, amentoflavon, kateşin ve türevleri gibi birçok farklı fenolik bileşik tespit edilmiştir. Ayrıca kestane arı polenlerinde, kestane balları ile ortak olarak bulunan fenolik bileşikler ballara oranla çok daha yüksek miktarda bulunmuştur. Sonuç olarak, yüksek fenolik bileşik içeriği nedeniyle kestane arı poleninin kestane ballarından daha değerli doğal bir kaynak olduğu belirlenmiştir. 5.2.2. Kestane arı poleninde bulunan karotenoidlerin tayini Kestane arı poleni örneklerinin fenolik bileşik içerikleri belirlendikten sonra fenolik bileşiklerin haricinde antioksidan özellik gösteren karotenoidlerin tayini gerçekleştirilmiştir. Karotenoidlerin analizinde C18 kolonu ile iyi bir ayrım yapılamamasından dolayı YMC Carotenoid C30 (250x4.6 mm, 5μm, YMC Co., Ltd) kolonu ile çalışılmıştır. Ters faz kromatografisi kullanılarak %95 metanol-%5 H2O (H2O: %0,05 trimetilamin içermektedir) ve tert-bütil metil eter gibi polar çözücülerden oluşan gradient programlı (Çizelge 3.12) hareketli faz sistemi kullanılmıştır. 1,0 mL/dk akış hızı ve 20 μL enjeksiyon hacmi ile kestane arı poleni örneklerinin kromatografik analizleri gerçekleştirilmiştir. Kestane arı poleni örneklerinin kromatogramları incelenerek kalibrasyon grafikleri yardımıyla karotenoidlerin miktarları mg/kg örnek olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.11). Karadeniz ve Marmara Bölgeleri’nden toplanan kestane arı poleni örneklerinde astaksantin, lutein, zeaksantin, β-kriptoksantin, α-karoten ve β-karoten karotenoidleri tespit edilmiştir. Şekil 5.2’de kestane arı poleni örneklerindeki karotenoidlerin bar grafikleri verilmiştir. 91 Astaksantin 8 6 4 2 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Lutein 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Zeaksantin 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.2. Kestane arı poleni örneklerinin karotenoid profilleri 92 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek β-kriptoksantin 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni α-karoten 200 150 100 50 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni β-karoten 400 300 200 100 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 Kestane arı poleni Şekil 5.2. (Devam) Kestane arı poleni örneklerinin karotenoid profilleri 93 mg / kg örnek mg / kg örnek mg / kg örnek Sadece M4 numaralı örnekte tespit edilen astaksantin 6,88 mg/kg örnek olarak bulunmuştur. Lutein ve zeaksantin K5 numaralı örnek dışında tüm örneklerde tespit edilmiş ve miktarları sırasıyla 5,91 – 20,20 mg/kg örnek ile 4,88 – 36,38 mg/kg örnek aralığında bulunmuştur. β-kriptoksantin en düşük miktarda (K1: 7,75 mg/kg örnek) Karadeniz Bölgesi’ndeki örnekte gözlenirken, en yüksek miktarda (M6: 44,67 mg/kg örnek) Marmara Bölgesi’ndeki örnekte tespit edilmiştir. K2 numaralı örnekte 152,42 mg/kg olarak en yüksek miktarda bulunan ve çoğunlukla Karadeniz Bölgesi’ndeki örneklerde gözlenen α-karoten, Marmara Bölgesi’ndeki M4 numaralı örnekte 6,63 mg/kg olarak tespit edilmiştir. β-kaoten ise tüm örneklerde gözlenmesine rağmen Karadeniz Bölgesi’ndeki örneklerde oldukça yüksek miktarlarda tespit edilmiştir. Conte ve ark. (2017) İtalya’dan toplanan kestane arı poleninin karotenoid içeriğini neoksantin, anteraksantin, lutein, zeaksantin, α-karoten ve β-karoten olarak tespit etmişlerdir. Sonuçlar karşılaştırıldığında, Türkiye’deki kestane arı poleni örneklerinin İtalya’daki kestane arı poleni örneklerine oranla daha yüksek karotenoid içeriğine sahip olduğu gözlemlenmiştir. Karotenoidlerin sahip olduğu antioksidan özellikleri sayesinde, DNA’ya zarar veren ve kanser gibi tehlikeli hastalıkların oluşumunda etkili olan serbest radikallerin etkisini yok ettiği ve böylelikle kanser hücreleri oluşumuna neden olan zincir reaksiyonları önledigi bilinmektedir. Dembınska-Kiec (2005)’in yaptığı in-vivo ve in-vitro çalışmalarda β- karotenin serbest radikallerin DNA üzerinde oluşturduğu hasara karsı koruyucu etkisi olduğu belirlenmiştir. Yapılan birçok çalışmada, β-karoten gibi provitamin A aktivitesi gösteren karotenoidlerin yanında lutein, astaksantin gibi provitamin A aktivitesi göstermeyen karotenoidlerin de antioksidatif özellikleri nedeniyle kanser oluşumunu önlediği tespit edilmiştir (Seppanen ve Csallany 2002, Baker ve Günther 2004, Dembınska-Kiec 2005). 5.2.3. Ekstraksiyonda Kullanılan Çözücülerin ve Ekstraksiyon Yönteminin Etkisi Bitkilerde bulunan ve antioksidan özellik gösteren fenolik bileşiklerin ekstraksiyonu için kullanılan yöntemlerden en uygun olanı çözücü ekstraksiyonudur. Fenolik bileşiklerin polar özellik göstermelerinden dolayı ekstraksiyon yöntemlerinde yaygın 94 olarak kullanılan çözücüler su, etanol, metanol, aseton, etil asetat ve bu çözücülerin farklı oranlardaki asitli ve asitsiz karışımlarıdır. Asidik hidroliz yöntemi ile glikozit bağların parçalanması sonucu bağlı olan fenolik bileşiklerde serbest hale geçeceğinden daha fazla fenolik madde ekstrakte edilmiş olur. Bitkilerdeki fenolik bileşiklerin ekstraksiyon verimi kullanılan çözücülerin çözünürlüğüne bağlı olduğu kadar tercih edilen ekstraksiyon yöntemlerine de bağlıdır. Kestane arı poleni örneklerindeki fenolik bileşiklerin ekstraksiyonu için ultrasonik ekstraksiyon (Şekil 3.2) ile katı faz ekstraksiyonu (Şekil 3.3) yöntemleri su, etanol ve metanol çözücüleri kullanılarak karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.2 ve 4.4’de verilen toplam fenolik madde ve antioksidan kapasite sonuçlarına bakıldığında, katı faz ekstraksiyonuna göre ultrasonik ekstraksiyon yöntemi ile elde edilen sonuçların daha yüksek olduğu görülmüştür. Ayrıca sonuçlar karşılaştırıldığında kestane arı poleni örnekleri için en uygun etanol çözücüsü ile daha fazla fenolik maddenin ekstrakte edildiği belirlenmiştir. 5.2.4. Kestane arı poleninin DNA hasarını önleme kabiliyetinin incelenmesi M0 numaralı kestane arı poleninin DNA’da meydana gelen oksidatif hasarı %11 oranında önlediğini spektroskopik olarak tespit edilmişti. Bu çalışmada ise kestane arı poleninin (M0 numaralı örnek) DNA’nın oksidatif hasara uğraması ile oluşan baz hasar ürünlerine etkisi incelenmiştir. Fenton reaksiyonu ile oksidatif strese uğratılan DNA ve kestane arı poleni ilave edilerek oksidatif strese uğratılan DNA örnekleri Şekil 3.4’te belirtildiği şekilde analize hazırlanmıştır. Hazırlanan örnekler DB-5MS (Agilent 128- 5512) kapiler kolonu (12 m, 0,20 mm, 0,33 µm) ve seçilmiş reaksiyon görüntüleme (selected reaction monitoring, SRM) tekniği kullanılarak GC-MS/MS ile Çizelge 3.13 ve Çizelge 3.14’te belirtilen çalışma koşullarında analiz edilmiştir. Aynı şartlarda analiz edilerek belirlenen DNA oksidatif baz hasar ürünlerinin kalibrasyon eğrileri (Çizelge 4.12) kullanılarak oksidatif stres sonrası oluşan miktarlar belirlenmiştir (Çizelge 4.13). Şekil 5.3’teki grafikte görüldüğü gibi oksidatif stres sonrası oluşan baz hasar ürünlerinin miktarları kestane arı poleni varlığında azalmaktadır. Kestane arı poleni örneğinin baz hasar ürünlerinin oluşmasını en fazla 5-hidroksi urasil (5HU) başta olmak üzere Allakson (Alx) ve 8-hidroksiguaninde (8HG) önlediği görülmektedir. 95 Sayısal veriler dikkate alındığında kestane arı poleni örneğinin DNA oksidatif baz hasar ürünlerinin oluşumunu toplamda miktarsal olarak %68,12 oranında önlediği belirlenmiştir. 30,0 25,0 DNA(Fenton) DNA+Polen(Fenton) 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 DNA oksidatif baz hasar ürünleri Şekil 5.3. Kestane poleninin DNA baz hasar ürünlerinin oluşumunu önleme etkisi 96 ng/g KAYNAKLAR Akçay, T. 2006. Nükleik asitler: İnsan Biyokimyası, Editörler: Onat, R., Emerk, K., Sözmen, E.Y., Palme, Ankara, s. 395-488. Albayrak, S., Sağdıç, O., Aksoy, A. 2010. Bitkisel ürünlerin ve gıdaların antioksidan kapasitelerinin belirlenmesinde kullanılan yöntemler. Erciyes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 26(4): 401-409. Albertsen, J. 2006. The toxicity of iron, an essential element. Veterinary Medicine, 82- 90. Almeida-Muradian, I.L.P.M.L.M. 2010. Stability of Antioxidants Vitamins in Bee Pollen Samples. Química Nova, 33 (3): 514-518. Amany, A.T., Ehab, M.A., Rasha, R.A., Yara, K.A. 2014. Assessment of anti- mutagenic, anti-histopathologic and antioxidant capacities of Egyptian bee pollen and propolis extracts. Cytotechnology, 66: 283–297. Atasoy, E., Altıngöz, Y. 2011. Dünya ve Türkiye’de Kestanenin Önemi ve Üretimi. Coğrafya Dergisi, 22: 1-13. Avşar, C., Özler, H., Berber, İ., Civek, S. 2016. Phenolic composition, antimicrobial and antioxidant activity of Castanea sativa Mill. pollen grains from Black Sea region of Turkey. International Food Research Journal, 23 (4): 1711-1716. Aybastıer, Ö. 2016. DNA’nın oksidatif hasarı üzerine fenolik maddelerin etkisi. Doktora Tezi, UÜ Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Bursa. Baker, R., Günther, C. 2004. The role of carotenoids in consumer choice and the likely benefits from their inclusion into products for human consumption. Trends in Food Science&Technology, 15: 484-488. Basim, E., Basim, H., Özcan, M. 2006. Antibacterial activities of Turkish pollen and propolis extracts against plant bacterial pathogens. Journal of Food Engineering, 77: 992–996. Benzine, I.F.F., Strain, J.J. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: The FRAP assay. Anal Biochem, 239: 70-76. Bevzo, V., Grygor’eva, N.P. 1997. Effect of bee pollen extract on glutathione system activity in mice liver under X-ray irradiation. Ukr. Biokhim. Zh., 69: 115–117. Bogdanov, S. 2004. Quality and Standards of Pollen and Beeswax. Apiacta, 38: 334– 341. Carpes, S.T., Begnini, R., Alencar, S.M., Masson, M.L. 2007. Study of preparations of bee pollen extracts, antioxidantand antibacterialactivity. Ciênc. agrotec, 31 (6): 1818- 1825. Carpes, S.T., Alencar, S.M., Cabral, I.S.R., Oldoni, T.L.C., Mourão, G.B., Haminiuk, C.W.I., Luz, C.F.P., Masson, M.L. 2013. Polyphenols and palynological origin of bee pollen of Apis mellifera L. from Brazil. Characterization of polyphenols of bee pollen. CyTA - Journal of Food, 11 (2): 150-161. Chen, Y., Xiong, H., Zhang, X., Wang, S. 2012. Electrochemical detection of in situ DNA damage induced by enzyme-catalyzed Fenton reaction. Part I: in phosphate buffer solution. Microchimica Acta, 178: 37–43. Cheng, N., Ren, N., Gao, H., Lei, X., Zheng, J., Cao, W. 2013. Antioxidant and hepatoprotective effects of Schisandra chinensis pollen extract on CCl4-induced acute liver damage in mice. Food and Chemical Toxicology, 55: 234–240. 97 Cook, N.C., Samman, S. 1996. Flavonoids-Chemistry, metabolism, cardioprotective effects, and dietary sources. Nutritional Biochemistry, 7: 66-76. Dawbaa, S., Aybastıer, Ö., Demir, C. 2017. Ultrasensitive determination of DNA oxidation products by gas chromatography–tandem mass spectrometry and the role of antioxidants in the prevention of oxidative damage. Journal of Chromatography B, 1051: 84–91. Dembınska-Kıec, A. 2005. Carotenoids: risk or benefit for health. Biochimica et Biophysica Acta, 1740: 93-94. Dizdaroglu, M. 2012. Oxidatively induced DNA damage: Mechanisms, repair and disease. Cancer Letters, 327: 26–47. Eraslan, G., Kanbur, M., Silici, S. 2009. Effect of carbaryl on some biochemical changes in rats: The ameliorative effect of bee pollen. Food and Chemical Toxicology, 47: 86–91. Eraslan, G., Kanbur, M., Silici, S., Karabacak, M. 2010. Beneficial Effect of Pine Honey on Trichlorfon Induced Some Biochemical Alterations in Mice. Ecotoxicology and Environmental Safety, 73(5): 1084–1091. Erdoğan, Y., Dodoloğlu, A. 2005. Bal arısı (Apis mellifera L.) kolonilerinin yaşamında polenin önemi. Uludag Arıcılık Dergisi, 5: 79-84. Fanali, C., Dugo, L., Rocco, A. 2013. Nano-Liquid Chromatography in Nutraceutical Analysis: Determination of Polyphenols in Bee Pollen. Journal of Chromatography A, 1313: 270-274. Feás, X., Vázquez-Tato, M.P., Estevinho, L., Seijas, J.A., Iglesias, A. 2012. Organic Bee Pollen: Botanical Origin, Nutritional Value, Bioactive Compounds, Antioxidant Activity and Microbiological Quality. Molecules, 17: 8359-8377. Furusawa, E., Chou, S.C., Hirazumi, A., Melera, A. 1995. Antitumour potential of pollen extract on lewis lung carcinoma implaned intraperitoneally in syngeneic mice. Phytother. Res., 9: 255–259. Guneş, M.E., Saliha Şahin, S., Demir, S., Borum, E., Tosunoğlu, A. 2017. Determination of Phenolic Compounds Profile in Chestnut and Floral Honeys and Their Antioxidant and Antimicrobial Activities. Journal of Food Biochemistry, 41:e12345. Hari, Y., Obika, S., İmanishi, T. 2012. Towards the sequence-selective ecognition of double-stranded DNA containing pyrimidine-purine interruptions by triplex-forming oligonucleotides. Eur. J. Org. Chem., 2875-2887. Hegazi, A.G. 2012. Medical Importance of Bee Products. Uludag Bee Journal, 12: 136–146 Isla, M.I., Moreno, M.I.N., Sampietro, A.R., Vattuone, M.A. 2001. Antioxidant activity of Argentine propolis extracts. Journal of Ethnopharmacology, 76: 165–170. Kao, Y., Lu, M., Chen, C. 2011. Preliminary Analyses of Phenolic Compounds and Antioxidant Activities in Tea Pollen Extracts. Journal of Food and Drug Analysis, 19(4): 470-477. Karabulut, H., Gülay, M.Ş. 2016. Serbest Radikaller. Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 4(1): 50-59. Karadeniz, V. 2013. Türkiye’de kestane tarımı ve başlıca sorunları. The Journal of International Social Research, 6 (27): 289-291. Karahocagil, P., Tosun, İ. 2004. Kestane. Tarımsal Ekonomi Araştırma Enstitüsü, 7: 1-4. 98 Karkar, B., Şahin, S., Güneş, M.E. 2018. Antioxidative Effect of Turkısh Chestnut Bee Pollen on Dna Oxidation System and Its Phenolic Compounds. The Journal of Food, 43 (1): 34-42. Kolaç, T., Gürbüz, P., Yetiş, G. 2017. Doğal ürünlerin fenolik içeriği ve antioksidan özellikleri. İ.Ü. Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu Dergisi, 5 (1): 1-17. Kolayli, S., Can, Z., Yildiz, O., Sahin H., Alpay Karaoglu, S. 2016. A Comparative Study of the Antihyaluronidase, Antiurease, Antioxidant, Antimicrobial and Physicochemical Properties of Different Unifloral Degrees of Chestnut (Castanea sativa Mill.) Honeys. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 31 (3): 96–104. Louveaux, J., Maurizio, A., Vorwohl, G. 1978. Methods of melissopalynology. Bee World, 59: 139–157. Leja, M., Mareczek, A., Wyzgolik, G., Klepacz-Baniak, J., Czekonska, K. 2007. Antioxidative properties of bee pollen in selected plant species. Food Chemistry, 100: 237–240. Maruyama, H., Sakamoto, T., Araki, Y., Hara, H. 2010. RAesneatrcih- ianrticflleammatory effect of bee pollen ethanol extract from Cistus sp. of Spanish on carrageenan-induced rat hind paw edema. Complementary and Alternative Medicine,10 (30): 1-11. Medeirosa, K.C.P., Figueiredo, C.A.V., Figueredo T.B., Freirea, K.R.L., Santosd, F.A.R., Alcantara-Neves, N.M., Silvaa, T.M.S., Piuvezama, M.R. 2008. Anti- allergic effect of bee pollen phenolic extract and myricetin in ovalbumin-sensitized mice. Journal of Ethnopharmacology, 119: 41–46. Mohdaly, A.A.A., Mahmoud, A.A., Roby, M.H.H., Smetanska, I., Ramadan, M.F. 2015. Phenolic Extract from Propolis and Bee Pollen: Composition, Antioxidant and Antibacterial Activities. Journal of Food Biochemistry, 39: 538–547. Morais, M., Moreira, L., Feás, X., Estevinho, L.M. 2011. Honeybee-collected pollen from five Portuguese Natural Parks: Palynological origin, phenolic content, antioxidant properties and antimicrobial activity. Food and Chemical Toxicology, 49: 1096–1101. Naranjo, R., Sánchez, J., Paramás, A., Gonzalo, J. 2004. Liquid Chromatographic– Mass Spectrometric Analysis of Anthocyanin Composition of Dark Blue Bee Pollen from Echium Plantagineum. Journal of Chromatography, 1054: 205–210. Nelson, N. 1944. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. J. Biol. Chem, 153: 375-380. Oh, S.M., Chung, K.H. 2016. Antiestrogenic activities of Ginkgo biloba extracts. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 100: 167–176. Özcan, M. 2004. Inhibition of Aspergillus parasiticus NRRL 2999 by pollen and propolis extracts. J. Med. Food, 7: 114–116. Persano Oddo, L., Piro, R. 2004. Main European unifloral honeys: Descriptive sheets. Apidologie, 35: 38–81. Pinto, B., Caciagli, F., Riccio, E., Reali, D., Saric, A., Balog, T., Likic, S., Scarpato, R. 2010. Antiestrogenic and antigenotoxic activity of bee pollen from Cystus incanus and Salix alba as evaluated by the yeast estrogen screen and the micronucleus assay in human lymphocytes. European Journal of Medicinal Chemistry, 45: 4122-4128 Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., Rice-Evans, C. 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, 26: 1231-1237. 99 Pascoal, A., Rodrigues, S., Teixeira, A., Feás, X., Estevinho, L.M. 2014. Biological Activities of Commercial Bee Pollens: Antimicrobial, Antimutagenic, Antioxidant and Anti-inflammatory”. Food and Chemical Toxicology, 63: 233-239. Román, D.A., Zurek, G., Bäßmann, C., Almaraz-Abarca, N., Quirantes, R., Segura-Carretero, A., Fernández-Gutiérrez, A. 2007. Identification of phenolic compounds from pollen extracts using capillary electrophoresis–electrospray time-of- flight mass spectrometry. Anal Bioanal Chem, 389: 1909–1917. Sani, I.M., Iqbal, S., Chan, K.W., Ismail, M. 2012. Effect of Acid and Base Catalyzed Hydrolysis on the Yield of Phen/olics and Antioxidant Activity of Extracts from Germinated Brown Rice (GBR). Molecules,17: 7584-7594. Sarıkaya, A.O., Ulusoy, E., Öztürk, N., Tunçel, M., Kolaylı, S. 2009. Antıoxidant Activity and Phenolic Acid Constituents of Chestnut (Castania sativa Mill.) Honey and Propolis. Journal of Food Biochemistry, 33: 470–481. Sastre, J., Pallardo, F.V., Vina, J. 2000. Mitochondrial Oxidative Stress Plays a Key Role in Aging and Apoptosis. IUBMB Life, 49: 427-435. Seppanen, C.M., Csallany, A.S. 2002. The effect of paprika carotenoids on in vivo lipid peroksidation measured by urinary excretion of secondary oxidation products. Nutrition Research, 22: 1055-1065. Shahidi, F., Yeo, J. 2016. Insoluble-Bound Phenolics in Food. Molecules, 21: 1216- 1238. Singleton, V.L., Orthofer, R., Lamuela-Raventos, R.M. 1999. Analysis of Total Phenols and Other Oxidation Substrates and Antioxidants by Means of Folin-Ciocalteu Reagent. Methods in Enzymology, 299: 152-178. Somogyi, M. 1952. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem, 195: 19-23. Sousa, C., Moita, E., Valentão, P., Fernandes, F., Monteiro, P., Andrade, P. 2015. Effects of Colored and Noncolored Phenolics of Echium Plantagineum L. Bee Pollen in Caco‑2 Cells under Oxidative Stress Induced by tert-butyl Hydroperoxide. Journal of Agricultural and Food Chemisrty, 63: 2083−2091. Su, D., Zhang, R., Hou, F., Zhang, M., Guo, J., Huang, F., Deng, Y., Wei, Z. 2014. Comparison of the free and bound phenolic profiles and cellular antioxidant activities of litchi pulp extracts from different solvents. Complementary and Alternative Medicine, 14 (9): 6282-6292. Şahin, S., Işik, E., Aybastıer, Ö., Demir, C. 2012. Orthogonal signal correction-based prediction of total antioxidant activity using partial least squares regression from chromatograms. Journal of Chemometrics, 26: 390–399. Şahin, S., Demir, C. 2013. Antioksidan kapasite tayin yöntemi. Türkiye, Retrieved from http://online.turkpatent.gov.tr/EPATENT/servlet/PreSearchRequestManager- (Erişim tarihi: 20.05.2018). Şahin, S., Oran, S., Şahintürk, P., Demir, C., Öztürk, Ş. 2015. Ramalina Lichens and Their Major Metabolites As Possible Natural Antioxidant And Antimicrobial Agents. Journal of Food Biochemistry, 39: 471-477. Ulusoy, E., Kolaylı, S. 2014. Phenolic Composition and Antioxidant Properties of Anzer Bee pollen. Journal of Food Biochemistry, 38: 73-82. Yıldız, O., Can, Z., Saral, Ö., Yuluğ, E., Öztürk F., Aliyazıcıoğlu, R., Canpolat, S., Kolaylı, S. 2013. Hepatoprotective Potential of Chestnut Bee Pollen on Carbon Tetrachloride-Induced Hepatic Damages in Rats. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Article ID 461478, 9 sayfa. 100 Yildiz, O., Karahalil, F., Can, Z., Sahin, H., Kolayli, S. 2014. Total Monoamine Oxidase (MAO) Inhibition by Chestnut Honey, Pollen and Propolis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 29(5): 690-694. Yüksel, Ç. 2018. Farklı oksidatif stres ortamlarında mikroalglerde bulunan karotenoidlerin analizi. Yüksek Lisans Tezi, UÜ Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Bursa. Zhou, J., Qi, Y., Ritho, J., Zhang, Y., Zheng, X., Wu, L., Li, Y., Sun, L. 2015. Flavonoid Glycosides as Floral Origin Markers to Discriminate of Unifloral Bee Pollen by LC-MS/MS. Food Control, 57: 54-61. 101 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı :Büşra KARKAR Doğum Yeri ve Tarihi :OSMANGAZİ – 27/09/1992 Yabancı Dili :İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise :Hasan Coşkun Lisesi, 2010 Lisans :Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, :Kimya Bölümü, 2015 Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl :- İletişim (e-posta) :busraakarkar@gmail.com Yayınları Karkar, B., Şahin, S., Güneş, M.E. 2018. Antioxidative Effect of Turkısh Chestnut Bee Pollen on Dna Oxidation System and Its Phenolic Compounds. The Journal of Food, 43 (1): 34-42. 102