T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SU ÜRÜNLERİ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI GÖKKUŞAĞI ALABALIĞI (Oncorhynchus mykiss WALBAUM 1792) KULUÇKAHANELERİNDE HASTALIK OLUŞTURAN FLAVOBACTERİUM TÜRLERİNİN GENOTİPİK KARAKTERİZASYONU VE ANTİMİKROBİYAL DİRENÇ GELİŞİMİNDE ROL OYNAYAN GENLERİN VARLIĞI- YAYGINLIĞININ BELİRLENMESİ İZZET BURÇİN SATICIOĞLU (DOKTORA TEZİ) BURSA-2018 İZZET BURÇİN SU ÜRÜNLERİ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ 2018 SATICIOĞLU T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SU ÜRÜNLERİ HASTALIKLARI ANABİLİM DALI GÖKKUŞAĞI ALABALIĞI (Oncorhynchus mykiss WALBAUM 1792) KULUÇKAHANELERİNDE HASTALIK OLUŞTURAN FLAVOBACTERİUM TÜRLERİNİN GENOTİPİK KARAKTERİZASYONU VE ANTİMİKROBİYAL DİRENÇ GELİŞİMİNDE ROL OYNAYAN GENLERİN VARLIĞI- YAYGINLIĞININ BELİRLENMESİ İZZET BURÇİN SATICIOĞLU (DOKTORA TEZİ) DANIŞMAN: Prof. Dr. Soner ALTUN 116O626-TÜBİTAK BURSA-2018 İÇİNDEKİLER Dış Kapak İç Kapak ETİK BEYANI .......................................................................................................... II KABUL ONAYI ....................................................................................................... III TEZ KONTROL ve BEYAN FORMU .................................................................. IV İÇİNDEKİLER ......................................................................................................... V TÜRKÇE ÖZET ................................................................................................... VIII İNGİLİZCE ÖZET .................................................................................................. IX 1. GİRİŞ ................................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER ............................................................................................ 3 2.1. Gökkuşağı alabalığı üretimi .................................................................................. 3 2.2. Alabalık kuluçkahanelerinde görülen önemli bakteriyel hastalıklar ..................... 4 2.3. Flavobactericiae ailesi .......................................................................................... 5 2.3.1. Flavobacterium psychrophilum ......................................................................... 6 2.3.1.1. Tarihçe............................................................................................................. 6 2.3.1.2. Etiyoloji ........................................................................................................... 7 2.3.1.3. Epidemiyoloji .................................................................................................. 7 2.3.1.4. Klinik bulgular ................................................................................................ 9 2.3.2. Flavobacterium columnare ................................................................................ 9 2.3.2.1. Tarihçe............................................................................................................. 9 2.3.2.2. Etiyoloji ......................................................................................................... 10 2.3.2.3. Epidemiyoloji ................................................................................................ 10 2.3.2.4. Klinik bulgular .............................................................................................. 12 2.3.3. Flavobacterium branchiophilum ...................................................................... 12 2.3.3.1. Tarihçe........................................................................................................... 12 2.3.3.2. Etiyoloji ......................................................................................................... 12 2.3.3.3. Epidemiyoloji ................................................................................................ 13 2.3.3.4. Klinik bulgular .............................................................................................. 14 2.3.4. Diğer Flavobacterium türleri ............................................................................ 14 2.3.5. Flavobacterium spp. enfeksiyonlarında teşhis ................................................. 15 2.3.6. Flavobacterium enfeksiyonlarında koruma-kontrol ......................................... 22 2.3.6.1. İşletme yönetimi ............................................................................................ 22 V 2.3.6.2. Probiyotikler ve immunstimulanlar............................................................... 23 2.3.6.3. Dirençli balıkların yetiştirilmesi ................................................................... 23 2.3.6.4. Bakteriyofaj ................................................................................................... 24 2.3.6.5. Aşılama ......................................................................................................... 24 2.3.6.6. Tedavi ............................................................................................................ 26 2.4. Antimikrobiyal direnç ......................................................................................... 27 3. GEREÇ VE YÖNTEM ..................................................................................... 33 3.1. Bakteri izolatları .................................................................................................. 33 3.2. Moleküler identifikasyon .................................................................................... 37 3.2.1. DNA ekstraksiyonu .......................................................................................... 37 3.2.2. PCR ile identifikasyon ..................................................................................... 37 3.2.2.1. F. psychrophilum’un dubleks PCR ile identifikasyonu ................................ 37 3.2.2.2. Flavobacterium spp. türlerinin 16S rRNA bölgesinin PCR ile amplifikasyonu ............................................................................................................. 38 3.2.3. Flavobacterium spp.’nin dizi analizi ............................................................... 38 3.3. Moleküler karakterizasyon .................................................................................. 39 3.3.1. F. psychrophilum’un restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi PCR-RFLP analizi ........................................................................................................................... 39 3.3.2. Flavobacterium spp. türlerinin restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (PCR- RFLP) ........................................................................................................................... 41 3.4. RFLP verilerinin değerlendirilmesi..................................................................... 41 3.5. Antimikrobiyal duyarlılık konsantrasyonlarının belirlenmesi ............................ 42 3.5.1. Disk difüzyon ................................................................................................... 42 3.5.2. Minimum inhibisyon konsantrasyonunun belirlenmesi (MİK)........................ 42 3.6. Antimikrobiyal direnç genleri ............................................................................. 43 4. BULGULAR ...................................................................................................... 46 4.1. Bakteri izolatları .................................................................................................. 46 4.2. Flavobacterium izolatlarının moleküler identifikasyonu .................................... 48 4.2.1. PCR ile identifikasyon ..................................................................................... 48 4.2.1.1. F. psychrophilum’un dubleks PCR ile identifikasyonu ................................ 48 4.2.1.2. Flavobacterium spp. türlerinin PCR ile amplifikasyonu .............................. 48 4.2.2 Flavobacterium spp.’nin dizi analizi ................................................................ 49 4.3. Moleküler karakterizasyon .................................................................................. 51 4.3.1. F. psychrophilum’un restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi PCR-RFLP analizi ........................................................................................................................... 51 4.3.2. Flavobacterium spp.’nin restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi PCR-RFLP analizi ........................................................................................................................... 58 V I 4.4. Antimikrobiyal duyarlılık konsantrasyonlarının belirlenmesi ............................ 70 4.4.1. Disk difüzyon ................................................................................................... 70 4.4.2 Minimum inhibisyon konsantrasyonunun belirlenmesi (MIK)......................... 78 4.5. Antimikrobiyal direnç genleri ............................................................................. 81 5. TARTIŞMA ve SONUÇ ................................................................................... 85 6. KAYNAKLAR ................................................................................................ 103 7. SİMGELER ve KISALTMALAR ................................................................. 117 8. TEŞEKKÜR .................................................................................................... 118 9. ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................... 119 V II TÜRKÇE ÖZET Flavobacterium genusuna ait türlerin balıklarda oluşturduğu salgınlar önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu türlerden en fazla bilinenleri Flavobacterium psychrophilum, F. columnare ve F. branchiophilum’dur. Son yıllarda birçok yeni Flavobacterium türünün de balıklardan izole edildiği bildirilmiştir. Bu araştırmada gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss), Anadolu/dağ alabalığı (Salmo trutta macrostigma), Çoruh alabalığı (Salmo coruhensis), kaynak alabalığı (Salvelinus fontinalis) ve Karadeniz alabalığından (Salmo trutta labrax) izole edilmiş 109 Flavobacterium spp. izolatının dizi analizi ile identifikasyonu, PCR-RFLP profiline göre genotiplendirilmesi, antimikrobiyal direnç durumunun belirlenmesi amaçlanmıştır. Flavobacterium türlerinin identifikasyonu 16S rRNA bölgesinin dizi analiziyle, PCR-RFLP analizi ise 16S rRNA, gyrA, gyrB gen bölgeleri kullanılarak yapılmıştır. Ayrıca Flavobacterium türlerinin amoksisilin, oksitetrasiklin, oksalinik asit, sulfamethoksazol/trimetoprim, enrofloksasin, eritromisin ve florfenikol antimikrobiyallerine karşı dirençliliği fenotipik (disk difüzyon, minimum inhibitör konsantrasyonları) ve genotipik (floR, tetA, tetB, tetC, tetE, tetH, tetM, tetL, sul1, sul2 sul3, qnrA, qnrB ve qnrS) olarak belirlenmiştir. Dizi analizi sonucunda 27 farklı Flavobacterium türü identifiye edilmiştir. Bu türlerden 26’sı ülkemizde ilk kez izole edilmiştir. F. antarticum, F. terrigena, F. granuli, F. frigoris, F. saccharophilum, F. xueshanense ve F. cutihirudinis türleri ise balıklarda ilk defa tespit edilmiştir. F. psychrophilum izolatları genotipik olarak homojen bir yapı göstermiş ve amoksisilin, florfenikole karşı duyarlı, enrofloksasin ile oksalinik asite ise duyarlılığının azalmılş olduğu belirlenmiştir. F. branchiarum, F. branchiicola, F. collinsii, F. frigoris ve F. psychrophilum türlerinde floR ve F. branchiarum, F. branchiicola, F. collinsii, F. oncorhynchi, F. plurextorum, F. psychrophilum, F. spartansii, F. terrigena ve F. tiangeerense türlerinde ise sul2 direnç geni bu çalışmada ilk defa tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler; Flavobacterium spp., Antimikrobiyal Direnç, RFLP VI II İNGİLİZCE ÖZET Genotypic characterisation, detection and prevalance of antimicrobial resistance genes on Flavobacterium species cause of disease in Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum 1792) hatcheries. Outbreaks in fish species due to the Flavobacterium genus cause significant economic losses. The best known of these species are Flavobacterium psychrophilum, F. columnare and F. branchiophilum, but in recent years, it has been reported that many new Flavobacterium species have also been isolated from fishes. The present study focused on three main goals: 1) to identify the isolate by sequence analysis, 2) to detect genotypes by their PCR-RFLP profiles and 3) to determine the antimicrobial resistance status of 109 Flavobacterium spp. that were isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), Anatolian/mountain trout (Salmo trutta macrostigma), çoruh trout (Salmo coruhensis), brook trout (Salvelinus fontinalis) and black sea trout (Salmo trutta labrax). Each Flavobacterium species was identified by sequence analysis of the 16S rRNA region and by PCR-RFLP analysis using the 16S rRNA, gyrA and gyrB gene regions. Resistance of the Flavobacterium species to amoxicillin, oxytetracycline, oxalinic acid, sulfamethoxazole/trimethoprim, enrofloxacin, erythromycin and florfenicol antimicrobials was determined phenotypically (disk diffusion, minimum inhibitor concentrations) and genotypically (floR, tetA, tetB, tetC, sul1, sul2 sul3, qnrA, qnrB and qnrS). As a result of the sequence analysis, 27 different Flavobacterium species were identified. Twenty-six of these species were isolated for the first time in Turkey. F. antarcticum, F. terrigena, F. granuli, F. frigoris, F. saccharophilum, F. xueshanense and F. cutihirudinis species were the first Flavobacterium species detected in fish. F. psychrophilum isolates showed a genotypically homogeneous structure, and it was determined that the isolates were susceptible to amoxicillin and florfenicol, while enrofloxacin and oxalinic acid susceptibility was decreased in this species. Also in this study, the floR antimicrobial resistance gene in the F. branchiarum, F. branchiicola, F. collinsii, F. frigoris and F. psychrophilum species as well as the sul2 resistance gene in the F. branchiarum, F. branchiicola, F. collinsii, F. oncorhynchi, F. plurextorum, F. psychrophilum, F. spartansii F. terrigena and F. tiangeerense species were detected for the first time. Keywords; Flavobacterium spp., Antimicrobial Resistance, RFLP IX 1. GİRİŞ Ülkemizde son otuz yıl içerisinde gökkuşağı alabalığı üretimi hızlı bir gelişim göstermiş ve 2016 yılında toplam üretim miktarı 107.000 tonu ve toplam su ürünleri ihracatı ise 854 milyon doları bulmuştur (TUİK, 2018). Kültür balıkçılığında ekonomik kayıplara neden olan faktörlerin başında hastalıklara bağlı sorunlar gelmektedir. Balıkçılığın ve balık yetiştiriciliğinin sürdürülebilirliğinin sağlanması, balıkların uygun koşullarda yetiştirilmesi ve başarılı koruyucu hekimlik uygulamalarının geliştirilmesine bağlıdır (Peeler ve Taylor, 2011). Alabalık kuluçkahanelerinde ekonomik kayıplara neden olan faktörlerin başında hastalıklara bağlı sorunlar gelmektedir (Yilmaz ve ark., 2011). Yumurta ve frylarda bağışıklık sistemi tam olarak gelişmediğinden dolayı yetişkin balıklara göre hastalıklara karşı çok daha duyarlıdır. Bu yüzden alabalık kuluçkahanelerinde yavru balıkların sağlık durumlarının korunması büyük önem taşımaktadır. Kuluçkahanelerde bakteriyel, fungal ve paraziter enfeksiyonlar, genetik bozukluklar, besinsel ve çevresel faktörler önemli ekonomik kayıplara neden olabilmektedir (Faruk ve Anka, 2017). Özellikle Flavobacterium genusunun en fazla tanınan türleri olan Flavobacterium psychrophilum, F. columnare ve F. branchiophilum etkenlerinin neden olduğu enfeksiyonlar gökkuşağı alabalıkları yetiştiriciliğinin ilk basamağı olan kuluçkahanelerde önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır (Loch ve Faisal, 2015). Balık hastalıklarının tedavisinde kullanılan ve mikro kirletici olarak kabul edilen antimikrobiyaller, organizmalar üzerindeki toksik etkilerinin yanı sıra akuatik florada yer alan bakterilerde de direnç gelişimine neden olmaktadır. Bu durumda hastalıkların tedavisi için de yüksek dozda antibiyotik kullanılması gerekebilir. Yüksek dozda antimikrobiyal kullanılması, akuatik çevrede aktif kalıntı miktarının artmasına, antimikrobiyallere dirençli bakterilerin çoğalmasına ve yaygınlaşmasına neden olmaktadır (De Liguoro ve ark., 2003; Yang ve Carlson, 2004). Ülkemizde balık hastalıklarının tedavisinde kullanılmak üzere Tarım ve Orman Bakanlığı tarafından 6 farklı etken maddeye ait 46 farmasötik ürün ruhsatlandırılmıştır. Bu ürünlerden kültür balıklarında en yaygın kullanılan 1 antimikrobiyaller sırasıyla florfenikol, oksitetrasiklin ve sulfamethoksazol/trimetoprim olarak sıralanabilir. Gökkuşağı alabalığı, doğal alabalık ve yetiştiricilik ortamlarından izole edilen bakterilerden antimikrobiyal direnç gelişimi konusunda çok sayıda rapor bulunmaktadır (Akinbowale ve ark., 2007; Alcaide ve ark., 2005; Balta, 1997; Duman ve ark., 2017a; Duman ve ark., 2017b; Ture ve Boran, 2015). Bu doktora tez çalışmasında  Ülkemizde moleküler yöntemler kullanılarak doğrulaması yapılan Flavobacterium türlerinden kaynaklanan hastalıkların belirlenmesi,  Ülke genelinde Flavobacterium türlerinin genetik yakınlığı, çeşitliliği ve epidemiyolojik özelliklerinin saptanması  Akuakültürde sık kullanılan antimikrobiyallere karşı (florfenikol, oksitetrasiklin, sulfamethoksazol/trimetoprim, enrofloksasin ve oksalinik asit) gelişen aktarılabilir ve/veya kromozomal direnç genlerinin varlığı, yaygınlığının belirlenmesi  Alabalık yetiştiriciliğinde hedefe yönelik etkili antimikrobiyal kullanımının sağlanması ve gereksiz antimikrobiyal kullanımının azaltılarak direnç yayılımı ve ekonomik kaybın önlenmesi amaçlanmıştır. 2 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Gökkuşağı alabalığı üretimi Ülkemizde su ürünleri yetiştiriciliğinin geçmişi çok eski olmamasına rağmen hızlı bir gelişme göstermiştir. Su ürünleri yetiştiriciliğinde üretim miktarı 2016 yılında 253 bin tona ulaşarak toplam su ürünleri üretiminin % 43'ünü oluşturmuştur (TÜİK, 2018). Nitekim FEAP (Avrupa akuakültür yetiştiricilik federasyonu) verilerine göre Türkiye Avrupa'da, 100 bin ton porsiyonluk gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) üretimi ile açık ara lider konumundadır (FEAP, 2018). Ülkemizde kültür balığı yetiştiriciliğinde gökkuşağı alabalığı üretimi yetiştiricilik sektöründe öncü konumuna gelmiştir. Balıkçılık ve Su Ürünleri Genel Müdürlüğü (BSGM) verilerine göre 2016 yılında iç sularda gerçekleştirilen gökkuşağı alabalığı üretimi toplam yetiştiricilik üretiminin yaklaşık %42'sini oluşturmuştur (TÜİK, 2018). Ülkemizde gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliği tüm coğrafi bölgelere yayılmış ve halen 74 ilde aktif olarak üretim yapılmaktadır. Gökkuşağı alabalığı üretiminin en fazla yapıldığı il Elazığ'dır (14,286 ton). İkinci sırada ise Muğla ili yer almakta olup bu ilin üretim miktarı 13,900 ton olarak gerçekleşmiştir. Orta Anadolu'da yer alan Kayseri, 11.227 ton üretim ile üçüncü, Batı Anadolu'da yer alan Burdur 9,724 ton üretim ile dördüncü sıradadır. Doğu ve Güneydoğu Anadolu'da yer alan Malatya ve Şanlıurfa'nın üretim miktarları sırasıyla 4,350 ve 4,297 ton olduğu bildirilmiştir (TÜİK, 2013). Son yıllarda, iç sularda onaylı gökkuşağı alabalığı işletmelerinin sayı ve kapasiteleri her geçen gün önemli artışlar göstermektedir. 1994 yılında 284 adet gökkuşağı alabalığı işletmesi bulunurken 2005 yılında bu sayı 1,273'e 2014 yılında 1,945'e yükselmiştir. Kapasite dağılımında da 90'lı yıllara nazaran önemli farklılıklar göze çarpmaktadır. 90'lı yıllarda genelde küçük ölçekli işletmeler oransal olarak yaygın iken özellikle 2005 yıllından sonra orta ve büyük ölçekli işletmelerin sayısında artış gözlenmektedir (Şen ve Rad, 2016). 3 2.2. Alabalık kuluçkahanelerinde görülen önemli bakteriyel hastalıklar Gökkuşağı alabalığı işletmelerinin en önemli ünitesi olan kuluçkahanelerde oluşacak ekonomik kayıpların engellenmesinde veya azaltılmasında, hastalıklara karşı koruyucu önlemlerin alınması ve sürdürülebilir yetiştiriciliğin sağlanması büyük önem taşımaktadır. Yumurta ve frylar hastalıklara karşı yetişkin balıklara göre çok daha duyarlıdır. Bu yüzden kuluçkahane yönetimine balık çiftliklerinde ayrı bir önem verilmektedir. Kuluçkahanelerde mikroorganizma kaynaklı enfeksiyonların yanı sıra, genetik bozukluklar, beslenme ve çevresel faktörler önemli ölçüde ekonomik kayba yol açmaktadır (Faruk ve Anka, 2017). Alabalıklardaki bağışıklık sistemi 2 gram ve daha büyük balıklarda geliştiği için bu ağırlıktan küçük balıklarda aşılamalar yeterli koruma sağlayamamaktadır. Bundan dolayı hastalıkların kontrolünde yoğun antimikrobiyal kullanım kaçınılmaz olmaktadır (Nya ve Austin, 2011). F. psychrophilum Avrupa ülkelerinin büyük bir bölümünde de gökkuşağı alabalığı kuluçkahanelerinin en önemli bakteriyel hastalığı olarak bildirilmiştir. Ülkemizde de gökkuşağı alabalığı kuluçkahanelerinde büyük ekonomik kayıplara yol açtığı bilinmektedir (Kubilay ve ark., 2009). Flavobakteriyozisde mortalite oranı, su sıcaklığı ve balık büyüklüğüne göre değişiklik gösterebilmektedir. Gökkuşağı alabalığı frylarında (RTFS), kuluçkahane su sıcaklığının 10ºC’nin altında olduğu işletmelerde ilk beslenmeden başlayarak 4 ve 7 haftalık dönemde RTFS şiddetli bir seyir gösterir ve alabalık yetiştiriciliğinin ilk basamağında sektörde önemli ekonomik kayıplara yol açar (Madetoja ve ark., 2002; Wiklund ve ark., 1994). Kuluçkahanelerde de 0,1-2 g ağırlığındaki yavru alabalıklarda (RTFS) %70 ve daha yüksek oranda ölüm görülebilmektedir (Cipriano ve Holt, 2005). Akuatik çevrede yaygın olarak bulunan F. columnare; genellikle su sıcaklığı 13ºC’nin üzerine çıktığı zamanlarda balıkların yüzgeçlerinde dejenerasyon ve solungaçlarda nekroza yol açarak kolumnaris olarak isimlendirilen hastalığa neden olmaktadır. Kolumnaris hastalığına her yaş ve boydaki balıklar duyarlıdır ancak daha çok genç balıklar etkilenir. Salgınlar, genellikle su sıcaklığının 12-15ºC ve üzerine çıktığı dönemlerde görülmektedir. Mortalite, su sıcaklığına bağlı olarak %10-100 arasında değişmekte, stres ve su kalitesinin bozulması durumunda ölüm miktarı artmaktadır (Bernardet ve Bowman, 2015; Decostere ve ark., 1997). 4 Bakteriyel Solungaç Hastalığı (BGD); farklı yaş ve ağırlıktaki balıkları etkileyebilmektedir. Fakat yavru balıkların daha çok etkilendiği bildirilmiştir. BGD; genellikle ilkbahar, yaz başında su sıcaklıklarında meydana gelen artışa bağlı olarak özellikle kültür yapılan balıklarda ortaya çıkmakta ve daha sık olarak yavru balıkları etkilemektedir (Bernardet ve Bowman, 2015; Loch ve Faisal, 2015). 2.3. Flavobactericiae ailesi Şube; Bacteroidetes Sınıf: Flavobacteriales Takım: Flavobacteriales Aile: Flavobacteriaceae Flavobacteriaceae olarak ilk isimlendirme Jooste tarafından 1985 yılında yapılmıştır (Jooste ve ark., 1985). 1989 yılında Bergey Manualde yer alan Flavobacteriaceae ailesi Reichenbach tarafından Flavobacterium cinsi temel alınarak kısa bir şekilde tanımlanmıştır. 1996 yılında ise Bernardet tarafından yapılan polifazik çalışmalarla Flavobacteriaceae ailesinin tanımlanması kapsamlı bir şekilde ilk defa yapılmıştır. Bernardet’in tanımlamasına göre Flavobacteriaceae ailesinde Flavobacterium cinsinin yanı sıra; Chryseobacterium, Bergeyella, Capnocytophaga, Ornithobacterium, Weeksella, Riemerella, Myroides ve Tenacibaculum cinsleri yer almaktadır (Bernardet ve Bowman, 2015; Loch ve Faisal, 2015). Daha sonra Bernardet tarafından hazırlanan ve 2015 yılında yayımlanan Bergey Manual’in sistematik bakteriyoloji kitabında ise bu aile 54 cinsin yer aldığı bildirilmiştir (Bernardet ve Bowman, 2015). Flavobacteriaceae ailesinin karakteristik özellikleri;  Gram negatif,  Sporsuz-kapsülsüz,  Basil (2- 20 µm),  Aktif hareket yok fakat bazı türlerde kayma hareketi var,  Koloni morfolojisi olarak sirküler/ rizoid/ düz veya konveks yapılarda olabilmekte, 5  Birçok türde karotenoid ve/veya flexirubin pigmenti bulunurken bazılarında bulunmaz,  Genellikle aerobik olup bazı türler mikroaerofillik veya anaerobik özellik gösterebilmekte,  Oksidaz ve katalaz pozitif,  Birçok tür, proteinler (ör. kazein, jelatin vb.), basit ve/veya kompleks karbonhidratlar (ör. nişasta, eskülin, pektin, kitin, karboksimetilseloz) ve lipitler (ör., tween) de dahil olmak üzere birçok organik substratı parçalayabilmekte,  Birçok tür halofilik ve mezofilik özellikte, bazı türler psikrofilik olabilmekte,  Yağ asitleri profilini genellikle C15 ve C17 yağ asitleri oluşturmaktadır. Bu familyadaki bakterilerin büyük çoğunluğu tatlı su ve tuzlu su ortamında doğal olarak bulunur. Ayrıca, toprak, gıda, işleme tesisleri, beşeri ve hayvan hastaneleri gibi birçok yaşam alanından izole edildiği bildirilmiştir (Bernardet ve ark., 2002; Bernardet ve Bowman, 2015). 2.3.1. Flavobacterium psychrophilum 2.3.1.1. Tarihçe Etken ilk olarak 1948 yılında Batı Virginia’daki hastalık semptomu gösteren yavru koho salmonların (Oncorhynchus kisutch) böbrek ve yüzgeç lezyonlarından izole edilmiştir. Bakteri ilk olarak biyokimyasal özelliklerine göre Cytophaga psychrophila olarak isimlendirilmiş olup, daha sonra DNA homolojisine göre yapılan sınıflandırmada Flexibacter psychrophilus olarak yeniden adlandırılmıştır (Bernardet ve Grimont, 1989). Son olarak ise 1996 yılında DNA-rRNA hibridizasyonu, DNA G+C içeriği, yağ asidi ve protein profili göz önünde bulundurularak Flavobacteriaceae ailesine dahil edilmiş ve Flavobacterium psychrophilum olarak adlandırılmıştır (Bernardet ve ark., 1996). 6 2.3.1.2. Etiyoloji Etken, Gram negatif, ince, uzun (0,3-0.75 x 1,5-7,5μm) bir basil olup, boyutu ve morfolojisi üreme dönemine göre değişiklik gösterebilmektedir. Genç kültürleri genellikle ince, uzun çubuk şeklindeyken, yaşlı olanlar nadirde olsa daha şişman segmentler halinde gözlemlenebilmektedir. Aktif hareket yapamaz, ancak genç kültürlerde kayma hareketi görülmektedir (Cipriano ve Holt, 2005; Holt ve ark., 2012). F. psychrophilum, kollajen, fibrinojen, kazein, jelatin, elastin, chondroitin sülfat, tributyrin, tyrosin, haemoglobini parçalayabilen farklı tipte proteolitik enzimleri salgılayabilmektedir. Fakat glukoz, sükroz, laktoz gibi çok sayıda karbonhidratı kullanabilme aktivitesi zayıftır (Dalsgaard ve Madsen, 2000; Nematollahi ve ark.,2003). F. psychrophilum izolatları, S tipi (düzgün kenarlı sirküler ve hafif kabarık) ve R tipi (kenarları düzgün olmayan, yüzeyi buruşuk ve granüler) karakterde sarı renkli koloniler oluşturabilir ve fleksirubin pigment üretebilmektedirler (Jooste ve Hugo, 1999). Pepton buyyon’da üretildiğinde S tipi koloniler, tüplerin tabanında çökelti oluşturur; R tipi kolonilerde ise çökelti görülmez (Bernardet ve Kerouault, 1989; Högfors-Rönnholm ve Wiklund, 2010). Balıklardan izole edilen her iki koloni tipine sahip izolatların virülent özellik gösterebildiği, dış membran protein ve lipopolisakkarit profillerinin benzer olduğu ve S tipi fenotiplerin daha hidrofobik ve daha fazla yapışkan özellik gösterdiği bildirilmiştir (Högfors-Rönnholm ve Wiklund, 2010) . F. psychrophilum tryptone yeast extract salts (TYES) agar veya Cytophaga agar gibi düşük nutrientli besiyerlerinde üreyebilmektedir. TYES agarda üreyen koloniler sahanda yumurta görünümünde parlak sarı görülmektedir. Kanlı agar ve nutrient agarda üreyemeyen etken, 5-23°C arasında ve %0-1 NaCl’de üreyebilmektedir. Etken optimal olarak 15°C’de üremekte ve koloniler 5-7 günde oluşmaktadır (Holt ve ark., 2012; Madsen ve ark., 2005) 2.3.1.3. Epidemiyoloji Salgınların özellikle koho salmon ve gökkuşağı alabalığı gibi salmonid balıklarda 10°C altındaki su sıcaklıklarında görülmesi nedeniyle 1960 yılında Borg, F. 7 psychrophilum’un neden olduğu hastalığa bakteriyel soğuk su hastalığı adını vermiştir (Holt ve ark., 1993). 1980'li yıllarda Avrupa'daki yavru gökkuşağı alabalıklarında yüksek mortalite ile seyreden ve gökkuşağı alabalığı yavru sendromu (RTFS) olarak adlandırılan hastalığın etkenin F. psychrophilum olduğu bildirilmiştir (Lorenzen ve ark., 1991; Madsen ve Dalsgaard, 1999). Daha büyük balıklarda kronik seyir gösteren ve kuyruk bölgesinde erozyonlara sebep olan hastalık, pedünkül hastalığı olarak adlandırılmıştır. F. psychrophilum’un neden olduğu enfeksiyonlar tüm salmonid grubu balıkları etkilemekle beraber gökkuşağı alabalığı ve koho salmonların en duyarlı türler olduğu rapor edilmiş ve ayu, yılan balığı ve sazan gibi endemik balık türlerinin, baraj ve nehir sistemlerinde yaşayan salmonid türleri için rezervuar olabileceği bildirlmiştir (Nematollahi ve ark., 2003). Etkenin klinik semptom göstermeyen endemik balıklardan da izole edilmesi doğal mikrobiotada yer aldığını göstermektedir (Madetoja ve ark., 2002; Madsen ve ark., 2005). Bulaşma; horizantal ve vertikal yolla olabilmekte, duyarlı balıkların etkenle teması ve anaç balıkların sperm ve yumurtaları aracılığı ile hastalık yayılmaktadır. (Kumagai ve Nawata, 2011). Etkenin kıtalararası yayılımında ise canlı balık ve yumurta ticareti önemli bir risk faktörüdür (Holt ve ark., 2012). Laboratuvar çalışmalarında, F. psychrophilum’un 15°C su sıcaklığında 300 gün hayatta kalabilme yeteneğine sahip olduğu belirlenmiştir (Madetoja ve ark., 2003). Soğuk su hastalığında özellikle 15°C ’ye kadar su sıcaklıklarında %50’ye varan mortalite görülürken, gökkuşağı alabalığı yavru Sendromu (RTFS)’nda, su sıcaklığının 10ºC’nin altında olduğu işletmelerde ortalama 0,1- 2 gram’lık balıklarda % 70’e varan mortalite oluşabilmektedir (Bernardet ve Bowman, 2015; Cipriano ve Holt, 2005). Ülkemizde yetiştiricilik yapılan gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) kuluçkahanelerinden F. psychrophilum’un etken olduğu salgınlar 1997 yılından itibaren sıklıkla rapor edilmiştir (Balta, 1997; Çağırgan ve ark., 1997; Didinen ve ark., 2007; Diler ve ark., 2003; İspir ve ark., 2004; Korun ve Timur, 2001; Kubilay ve ark., 2009; Ozcan ve Sarieyyupoglu, 2014; Timur ve ark., 2004). 8 2.3.1.4. Klinik bulgular F. psychrophilum; koho salmon ve gökkuşağı alabalığı gibi duyarlı türlerde yumurta kabuğunda yumuşama, erken çatlama ve yumurta kesesinde yırtılma gibi sorunlara neden olabilmektedir (Holt ve ark., 2012; Kubilay ve ark., 2009; Madetoja ve ark., 2002). Ayrıca gökkuşağı alabalığı frylarında iştahsızlık, deride hiperpigmentasyon (kararma), adipoz ve kaudal yüzgeç çevresinde omuriliğe kadar ulaşan ülseratif lezyonlar görülebilmektedir. Yavru ve genç balıklarda soğuk su hastalığında, alt çenede ülser, solungaç ve karaciğerde solgunluk, egzoftalmus, deride hiperpigmentasyon, pullarda dökülme, asites, spiral tarzda yüzme, dalakta büyüme ve özellikle kaudal pedünkülde erozyon sıklıkla bildirilen semptomlardır. Pedünkül hastalığı ise daha çok 100 g ve üzeri balıklarda görülebilmektedir. Deride hiperpigmentasyon, iştahsızlık gibi genel semptomların yanı sıra adipoz yüzgeç etrafından başlayarak kaudal pedinküle doğru ilerleyen erozyonlar görülmektedir (Austin ve Austin, 2016; Nilsen ve ark., 2011a ve Nilsen ve ark., 2011b). 2.3.2. Flavobacterium columnare 2.3.2.1. Tarihçe Kolumnaris ilk olarak 1922 yılında Davis tarafından Mississippi Nehri'nde sazan balıklarından izole edilmiştir. Etken bu yıllarda kültüre edilememiş ancak doku lezyonlarından hazırlanan preparatlarda çok sayıda ince uzun basilin görüldüğü bildirilmiştir. Bu nedenle etken ilk olarak Bacillus columnaris olarak isimlendirilmiştir (Declercq ve ark., 2013). Daha sonra 1944 yılında Ordal ve Rucker tarafından sockeye salmonlarında (Onchorhynchus nerka) söz konusu etken kültüre edilerek izole edilmiştir. Morfolojik özellikler dikkate alınarak yapılan sınıflandırmada etken Myxobacteria takımına dahil edilmiş ve yaşlı kültürlerde mikrokistik (fruiting bodies) yapılar oluşturmasından dolayı Chondrococcus columnaris olarak adlandırılmıştır (Ordal ve Rucker, 1944). 1945 yılında Garnjobst, morfolojik olarak Chondrococcus columnaris'e benzeyen fakat mikrokist yapısını oluşturmayan etkeni Cytophagaceae familyasına dahil etmiş ve Cytophaga columnaris olarak isimlendirilmiştir (Declercq ve ark., 2013; Garnjobst, 1945). 1980’li yılların sonuna doğru Bernardet ve Grimont 9 etkeni yeniden sınıflandırarak Flexibacter genusuna dahil etmiş ve Flexibacter columnaris olarak isimlendirmiştir (Bernardet ve Grimont, 1989). 1996 yılında DNA- rRNA hibridizasyon, protein ve yağ asit profillerine göre yapılan son sınıflandırmada ise etken Flavobacteriaceae ailesine aktarılarak Flavobacterium columnare olarak isimlendirilmiştir (Bernardet ve ark., 1996). 2.3.2.2. Etiyoloji F. columnare; rizoid yapıda, düz, yaygın kenarlı sarı renkli koloni oluşturan, fleksirubin pigment üreten Gram negatif ince uzun (4–8×0,5–0,7 μm) bir basildir. Etken hareketsiz (flagella, fimbria ve pilus bulunmama) olup kayma hareketi yapmaktadır. Oksidaz, katalaz, H2S, kongo red absorbsiyonu pozitif özellik gösterirken metil red, voges proskauer indol, lizin ve ornithin dekarboksilaz negatif olup nitratı indirgeyebilir. Kazein, jelatin ve tributyrini hidrolize edebilirken eskülin, selüloz, kitin, nişasta ve tyrosini parçalayamamaktadır. F. columnare genellikle 4- 30°C aralığında ve %0-0,5 NaCl’de üreyebilmektedir. Ayrıca arabinoz, sellobiyoz, glukoz, laktoz, mannitol, raffinoz, salisin, sukroz ve ksiloz fermente edememektedir (Austin ve Austin, 2016). 2.3.2.3. Epidemiyoloji Akuatik çevrede yaygın olarak bulunan F. columnare’nin neden olduğu kolumnaris hastalığı; yavru alabalıklarda (1-3 g) genellikle su sıcaklığının 13ºC'nin üzerine çıktığı dönemlerde görülmekte, yüzgeçlerde aşınma, vücut üzerinde yaygın eritemik odaklar ve solungaç flamentlerinde nekroza neden olmaktadır (Austin ve Austin, 2016; Bernardet ve Bowman, 2006). Kolumnaris hastalığına; kanal kedi balığı (Ictaalurus punctatus), sazan (Cyprinus carpio), goldfish (Cyprinus auratus), yılan balığı (Anguilla rostrata, A. japonica, A. anguilla), tilapia (Oreochromis spp.), gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss), kahverengi alabalık (Salmo trutta), kaynak alabalığı (Salvelinus fontinalis) başta olmak üzere 36 farklı tatlı su balığının duyarlı olduğu rapor edilmiştir (Declercq ve ark., 2013). 10 Kolumnaris hastalığına her yaş ve boydaki balıklar duyarlı olup daha çok yavru balıklar etkilenmektedir (LaFrentz ve ark., 2012). Su sıcaklığı, çözünmüş oksijen seviyesi, stok yoğunluğu gibi çevresel stres faktörleri hastalığın şiddetini etkileyebilmektedir (Bernardet ve Bowman, 2006; Wakabayashi, 1993). F. columnare horizantal yolla bulaşma göstermektedir. Portör balıklar, alet ekipman ve balık nakilleri hastalığın yayılmasında önemli rol oynamaktadır. Hastalığın vertikal olarak bulaşma göstermediği bilinmektedir. Ancak 2016 yılında Loch ve Faisal salmonid balıkların üreme sıvılarında etkeni izole ettiklerini bildirmişlerdir. (Loch ve Faisal, 2017). Kolumnaris hastalığında mortalite, su sıcaklığına bağlı olarak %10-100 arasında değişmekte, stres ve düşük su kalitesi gibi durumlarda enfeksiyonun şiddeti artmaktadır. Salmonid balıklarda salgınlar genellikle su sıcaklığının 12°C’nin üzerinde olduğu dönemlerde görülmektedir (Austin ve Austin, 2016; Bowser, 1973). Hastalık özellikle durgun sularda yaşayan yılan balıklarında yüksek mortalitelere neden olmakta; böylece mortaliteler sudaki çözünmüş oksijen seviyesi ile ters orantılı seyir göstermektedir (Chen ve Kuo, 1982). Ayrıca, çözünmüş oksijen seviyesi yeterli iken, amonyak seviyesindeki artışla birlikte ölümlerinde arttığı bildirilmiştir. Collins (1970) göl suyundaki ötrifikasyonun artışına paralel olarak sudaki F. columnare etkenlerinin artığını göstermiştir. F. columnare laboratuvar koşullarında distile suda konakçı dışında en az 5 ay, göl suyunda 2 yıldan fazla hayatta kalabilmektedir. F. columnare konakçı dışında hayatta kaldığında, enerji kullanımını azaltmak için, koloni morfolojisini değiştirerek virulens formdan daha az virulens forma dönüşür (Loch ve Faisal, 2017). Ülkemizde F. columnare ilk defa 1998 yılında gökkuşağı alabalığı işletmesinde ortaya çıkan salgından izole edilmiştir (Balta ve Cagırgan, 1998). Daha sonra Aydın, Denizli, Isparta, Kayseri, Manisa, Mersin, Muğla ve Ordu'dan de izole edildiği bildirilmiştir (Kubilay ve ark., 2008; Öztürk ve Altınok, 2014; Yıldırım ve Özer, 2010). 11 2.3.2.4. Klinik bulgular Kolumnaris hastalığında yavru balıklarda, ölümden önce önemli bir patolojik bulgu dikkat çekmemekte, ancak solungaç dokusunda dejenerasyonlar görülebilmektedir (Austin ve Austin, 2016; Loch ve Faisal, 2017). Fingerling ve büyük balıklarda; solungaçların çevresinde başlayan ve solungaç kemerinin tabanına doğru yayılan sarı turuncu renkte nekroz alanları görülür. Zamanla solungaç filamentlerinin tamamında nekroz alanları şekillenir. Dorsal ve pelvik yüzgeçlerde şekillenen erozyon ilerleyen dönemlerde kas tabakasına kadar uzanabilmekte ve bu lezyonlar toplam balık yüzeyinin %20-25'ini kaplayabilmektedir. Dorsal yüzgeçte eyer şeklinde deformasyonların oluşması sebebiyle hastalık sırtı eyerli anlamına gelen "saddle-back" isimi ile de bilinmketedir (Loch ve Faisal, 2017; Sarti ve Giorgettii, 1996; Wakabayashi, 1991). 2.3.3. Flavobacterium branchiophilum 2.3.3.1. Tarihçe Bakteriyel solungaç hastalığı ilk olarak Amerika’da 1926 yılında Davis tarafından kaynak alabalığı ve gökkuşağı alabalığında meydana gelen salgından rapor edilmiştir. Fakat etken 1978'e kadar konvansiyonel besiyerlerinde üretilememiştir (Kimura ve ark., 1978). İlk olarak Kimura ve ark. (1978) Amerika, Japonya ve Macaristan’daki hasta balıklardan izole edilen etkenin fenotipik karakterizasyonunu yaparak Flavobacterium branchiophila olarak isimlendirilmiştir (Farkas, 1985; Wakabayashi ve ark., 1989). Von Graevenitz tarafından 1990 yılında yapılan son sınıflandırmada ise etken Flavobacterium branchiophilum olarak isimlendirilmiştir (Starliper, 2012; Von Graevenitz, 1990). 2.3.3.2. Etiyoloji F. branchiophilum, Gram negatif, aerobik, genellikle ikili üçlü zincirler halinde bulunan ince uzun (5–8 × 0.5 μm) bir basildir. Etken sirküler, kenarları düzgün S tipi karakterde karotenoid pigmenti bulunmasından dolayı sarı renkte koloniler vermekte 12 ve fleksirubin pigmenti üretmemektedir. Flagellasız olduğu için aktif hareket yapmamakta ve kayma hareketi görülmemektedir. Oksidaz ve katalaz pozitif özellik gösterirken H2S ve indol negatif olup nitratı indirgeyemez. Kazein, jelatin, lesitin, nişasta, tween, ve tiyrozini hidrolize edebilirken selüloz ve kitini parçalayamazlar (Bernardet ve Nakagawa, 2006). F. branchiophilum 5-30°C ’de ve 0- 0,1 % NaCl’de üreyebilmektedir. Sellobioz, fruktoz, glukoz, inulin, maltoz, melibiose, raffinoz, sukroz ve trehaloz gibi karbonhidratları fermente edebilirken, adonitol, arabinoz, dulcitol, galaktoz, inositol, laktoz, mannitol, salisin, sorbitol ya da ksilozu fermente edemezler (Austin ve Austin, 2016; Ko ve Heo, 1997; Starliper, 2012). 2.3.3.3. Epidemiyoloji Bakteriyel Solungaç Hastalığı (BGD) etkeni F. branchiophilum akuatik çevrede yaygın olarak bulunabilmektedir. Hastalık Amerika, Kanada, Japonya, Kore, Macaristan, Hindistan ve Hollanda gibi birçok ülkede rapor edilmiştir (Farkas, 1985; Heo ve ark.,1990; Ko ve Heo, 1997; Ostland ve ark., 1994; Swain ve ark., 2007; Wakabayashi ve ark., 1989). Ülkemizde Bakteriyel solungaç hastalığının bildirimi henüz yapılmamıştır (Öztürk ve Altınok, 2014). Etken gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) başta olmak üzere birçok salmonid (Salvelinus fontinalis, Salv. fontinalis timagamensis, Salv. namaycush, Salv. fontinalis X Salv. namaycush, O. tshawytscha, O. masou, O. nerka, Salmo salar, Salm. trutta) ve salmonid olmayan balıklardaki [yayın (Silurus glanis), turna (Stizostedion vitreum), sazangillerden (Labeo rohita, Catla catla, Hypophthalmichthys molitrix)] hastalık salgınlarından rapor edilmiştir (Starliper, 2012). BGD; genellikle ilkbahar, yaz başında su sıcaklıklarında meydana gelen artışa bağlı olarak özellikle kültür yapılan balıklarda ortaya çıkmakta ve daha sık olarak yavru balıkları etkilemektedir (Bernardet ve Bowman, 2006). F. branchiophilum; su sıcaklığının 5-19°C arasında olduğu dönemlerde hastalık vakalarından izole edilebilmekte ve su-sedimentte uzun süre canlı kalabilmektedir (Bullock ve ark.,1991; Bullock ve ark., 1994; Farkas, 1985). Hastalığın şiddetlenmesinde stok yoğunluğu artması, su kalitesinin düşmesi (amonyak 13 konsantrasyonun artması, türbidite ve düşük oksijen seviyesi) gibi çevresel ve stres faktörleri önemli rol oynamaktadır (Austin ve Austin, 2016; Starliper, 2012). F. branchiophilum balıklarda çok bulaşıcı olup, horizantal yol ile yayılmaktadır. Etkenin solungaç dokusuna kolonize olması 1 saatten kısa bir sürede gerçekleşebilmektedir (Ferguson ve ark., 1991). Virülent ve avirülent F. branchiophilum suşları solungaçlara tutunabilmekte fakat sadece virülent olan suşlar kolonize olabilmektedir (Ostland ve ark., 1995). Ortamdan ölü balıklar uzaklaştırılmadığı ve hızlı bir şekilde tedaviye başlanılmadığı durumlarda morbidite %80, mortalite ise % 50’ye ulaşabilmektedir (Austin ve Austin, 2016). 2.3.3.4. Klinik bulgular Bakteriyel solungaç hastalığı etkeni non-invazif bir özellikte olup genel olarak solungaç dokusunu etkilemektedir. Hastalık durumunda solungaçlar etkilediğinden solunum fonksiyonunda azalmaya bağlı olarak su yüzeyinde yüzme, hızlı bir şekilde soluk alıp verme, iştahsızlık, letarji, operkulumda bilateral şişme ve aşırı mukus artışı en yaygın görülen semptomlardır (Austin ve Austin, 2016). 2.3.4. Diğer Flavobacterium türleri Flavobacteriaceae ailesi oldukça geniş bir ekolojik yaşam alanına sahiptir. Bu ailedeki türler; omurgasızlar, amfibianlar, reptiller, kuşlar ve hatta memelilerde de hastalıklara sebep olabilmektedir. Flavobacteriaceae ailesinde balıklarda enfeksiyona sebep olan türler arasında Flavobacterium spp., Tenacibaculum spp., ve Chryseobacterium spp. gibi önemli türler de bulunmaktadır (Bernardet ve Bowman, 2015; Loch ve Faisal, 2015; Loch ve Faisal, 2017). Flavobacterium türlerinin son sınıflandırılması ve ilgili literatür incelemelerine göre 196 Flavobacterium türü bildirilmiştir (Anonim, 2018). Flavobacterium spp. su ürünleri yetiştiriciliği ve doğada yaşayan balıklarda oluşturduğu salgınlar nedeniyle önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır (Loch ve Faisal, 2015). 14 Balıklardaki Flavobacterium türlerinin neden olduğu hastalık salgınları ve bunlarla mücadeleyi amaçlayan çalışmaların büyük çoğunluğu Flavobacterium psychrophilum, F. columnare ve F.branchiophilum’ı konu alırken, son zamanlarda yeni Flavobacterium türlerinin de balıklarda hastalık salgınlarına yol açtığı rapor edilmiştir (Loch ve Faisal, 2015; Loch ve Faisal, 2017). F. johnsoniae’nin; salmonid, yılan balığı (Anguilla mossambica), sazan (Cyprinus carpio) ve jüvenil barramundi (Lates calcarifer) balıklarının deri, yüzgeç ve çenesinde ülseratif lezyonlara sebep olduğu (Carson ve ark., 1993; Rintamäki- Kinnunen ve ark., 1997) tespit edilmiştir. Bir başka çalışmada ise gökkuşağı alabalıklarında etkenin koch postulatlarını sağladığı bildirilmiştir (Soltani ve ark.,1994). Türkiye'de ise etken ilk defa sağanak yağış sonrası Rus mersin balıklarında vücut yüzeyinde ülser alanları ile seyreden bir salgından izole edilmiştir (Karataş ve ark., 2010). Amerika’da bakteriyel solungaç hastalığı semptomları gösteren salmonidlerden F. hydatis, chinook salmon fingerlinglerinin (O. tshawytscha) kaudal yüzgeçlerindeki erezyonlardan ise F. succinicans izole edilmiştir (Anderson ve Ordal, 1961). Son yıllarda; yetiştiricilikte su kalitesinin bozulması ve strese bağlı olarak salmonidlerde görülen eksternal lezyonlardan F. oncorhynchi, F. araucananum, F. chilense, F. plurextorum ve F. spartani sp. gibi yeni türler rapor edilmiştir (Loch ve Faisal, 2015; Loch ve Faisal, 2017). Fakat izole edilen bu yeni Flavobacterium türlerin ekolojisi, bulaşması ve patogenezi hakkında ayrıntılı bir bilgiye ulaşılamamıştır (Austin ve Austin, 2016; Loch ve Faisal, 2017). 2.3.5. Flavobacterium spp. enfeksiyonlarında teşhis Teşhis, su kalitesi parametreleri, balık davranışları, klinik bulgular, histopatoloji ve etken izolasyonu ile fenotipik karekterizasyonu dikkate alınarak yapılmalıdır. Teşhisin doğrulanmasında mutlaka moleküler ve serolojik testlerin yapılması önerilmektedir (Loch ve Faisal, 2017). 15 2.3.5.1. Klinik ve postmortem inceleme Klinik olarak Flavobacterium enfeksiyonlarda genellikle solungaç ve deride lezyonlar gözlemlenmektedir. Lezyonlu bölgelerden hazırlanan tuşe preparatların ışık mikroskobunda incelenmesinde tek tek veya saman yığını şeklinde kümelenmiş uzun basillerin görülmesi teşhise yardımcı olabilmektedir (Loch ve Faisal, 2017). 2.3.5.2. Primer izolasyon ve ön teşhis Etken, eksternal lezyonlar, karaciğer, böbrek dalak, beyin ve asites sıvısından izole edilebilir. İzolasyon için Tryptone-yeast Extract-salts agar (TYES agar) veya Anacker Ordal Agar kullanılmalı ve 18°C 5-7 güne kadar inkube edilmelidir (Austin ve Austin, 2016; Loch ve Faisal, 2017). Saf olarak üretilen sarı renkli kolonilerden ön teşhis; Gram negatif uzun basil, oksidaz, katalaz pozitif, spor oluşturmayan, fleksirubin ve/veya karatoneid pigment üreten, aktif hareket yapmayan, kayma hareketi görülme/görülmeme gibi özellikler dikkate alınarak yapılır. Bu özellikleri taşıyan bakterilerin Flavobacteriaceae üyesi (Flavabacterium spp., Crysobacterium spp. Myroides spp. vb) olarak ön teşhis yapılabilmektedir. Bazı Flavobacterium spp. etkenlerinin fenotipik özelliklerine ilişkin ayırıcı özellikleri Tablo 1’de verilmiştir (Austin ve Austin, 2016; Bernardet ve Bowman, 2015; Loch ve Faisal, 2017). 2.3.5.3. Serolojik teşhis F. psychrophilum için poliklonal antikor kullanılarak geliştirilen ELISA (enzim ilintili immün test) ve floresan antikor testi (FAT) geliştirilmiştir. Fakat poliklonal antikorların, Flavobacterium genusundaki diğer bakterilerle çapraz reaksiyon verdikleri için kullanımı sınırlıdır. 2009 yılında Lindstorm ve ark. tarafından F. psychrophilum’un spesifik dış memran proteinleri kullanılarak oluşturulan monoklonal antikorlar serolojik teşhisde (ELISA ve FAT) kullanılabilmektedir (Lindstrom ve ark., 2009). F. columnare için monoklonal antikorlar kullanılarak yapılan indirekt floreasan antikor testiyle (IFAT) etken solungaç ve bağırsak dokusundan tespit edilebilmektedir. 2006 yılında Panangalal ve arkadaşları monoklonal antikor kullanılarak IFAT yöntemi 16 ile de bakteri kültürlerinden çok kısa bir sürede serolojik teşhis yapılabildiğini bildirilmişlerdir (Panangala ve ark., 2006). F. branchiophilum’un serolojik teşhisi ise poliklonal antiserum ve monoklonal antikor kullanılarak IFAT ile solungaç dokusundan yapılabilmektedir (Loch ve Faisal, 2017). 2.3.5.4. Moleküler teşhis F. psychrophilum’un; taze, donmuş ve formalinle fikse edilmiş doku ve çevresel örneklerden, PCR, nested PCR (nPCR), multiplex PCR, reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) ve quantitative PCR (qPCR) gibi moleküler yöntemler kullanılarak teşhisi yapılabilmektedir (Loch ve Faisal, 2017). Teşhisde genel olarak 16S rRNA bölgesi ve korunmuş gen bölgeleri kullanılır. Nested PCR metodu ile etken dokudan veya sudan 3 kob/mg konsantrasyonlarına kadar tespiti yapılabilmektedir (Madetoja ve Wiklund, 2002). Ayrıca F. psychrophilum’un PCR ile teşhisinde hem gyrA hemde gyrB bölgesi birlikte kullanılarak dubleks PCR yapılmaktadır (Siekoula-Nguedia ve ark., 2012). Welker ve ark. (2005); F. columnare’nin konvansiyonel PCR analizinde16S- 23S rDNA ara bölgelerinin kullanmış ve bu bölgenin spesifite ve sensivite açısından diğer gen bölgelerine oranla daha hassas sonuçlar verdiğini bildirmiştir (Welker ve ark., 2005). Ayrıca qPCR ile 3 kob/mg konsantrasyonlarına kadar etkenin tespiti yapılabilmektedir (Panangala ve ark., 2007). F. branchiophilum’un moleküler teşhisinde konvansiyonel PCR ve daha pahalı bir metod olan yeni nesil dizi analizi kullanılmaktadır (Loch ve Faisal, 2017). 2011 yılında Lievens ve arkadaşları tarafından geliştirilen multiplex PCR ile aynı anda F. psychrophilum, F. columnare ve F. branchiophilum’un teşhisi PCR ile yapılabilmektedir (Lievens ve ark., 2011). Diğer Flavobacterium türlerinin teşhisinde ise spesifik bir metot bulunmamaktadır. Son yıllarda Flavobacterium spp. türlerinin moleküler teşhisi için önce universal primerler kullanılarak 16S rRNA amplifiye edilmekte, sonrasında elde edilen PCR ürünleri çift yönlü dizi analizine tabi tutularak tür identifikasyonu yapılmaktadır (Loch ve Faisal, 2017). 17 Tablo 1. Flavobacterium genusundaki türlerin ayırıcı biyokimyasal ve morfolojik özellikleri. F. aquatile F. aquidurense F. antarcticum F. branchiarum F. branchiicola F. branchiophilum F. collinsii F. columnare İzolasyon Ilık tatlı su Ilık tatlı su Kutuplarda Solungaç Solungaç Ilık tatlı su, tatlı su Tatlı su Ilık tatlı su, toprak dokusunda dokusunda balıkları balık iç tatlı su organ balıkları Koloni Morfolojisi Konveks, Düz, yaygın ve Konveks, Sarı sirküler, Sarı sirküler, Sarı, sirküler, Sarı, Düz, ağara sirküler ve düzensiz kenarlı sirküler, düzgün düzgün kenarlı düzgün kenarlı düzgün kenarlı sirküler, yapışan ve düzgün kenarlı düzgün rizoid kenarlı kenarlı Kongo Red absorbsiyonu - Nd - - - - - + Kayma Hareketi D - D - - - - + Fleksirubin Pigment üretimi - + - + + - + + Marine Agarda üreme - Nd + - - - - - TSA’da Üreme (+) + + + + - + - Üreyebildiği Sıcaklık Aralığı 15-30 13-30 5-24 15-25 15-25 5-30 15-25 15-37 (°C) Optimum Üreme Sıcaklığı Nd 19-28 21 20 20 18-25 22 25-30 (°C) Tuz Toleransı (% NaCl) 0 0-1 0-4 0-2 0-2 0-0.2 0-2 0-0,5 Glukoz Kullanımı Nd + - - - + - - Karbonhidratlardan asit + Nd + - - + - - üretimi Jelatini hidrolizi + - + - - + - + Kazein hidrolizi + + + + + + + + Nişasta hidrolizi + + - + + + + + Eskülin hidrolizi + + - + + - + - Üreaz üretimi - - - - + - - - Oksidaz + + + + + + + + β-Galactosidase + + - - - + - - H 2S üretimi - Nd - - - - - + Nitratı indirgeme + D - - + - - D DNA G+C oranı (mol%) 32 34 38 35,4 33,6 29-31 35,5 30 1 8 Tablo 1’in devamı F. cutihirudinis F. frigidarium F. frigidimaris F. frigoris F. glaciei F. granuli F. hercynium F. hibernum İzolasyon Sülük deri yüzeyi Polar sediment Polar sediment Polar sediment Donmuş Toprak Atık su, bitki Ilık tatlı su Polar tatlı su göleti Koloni Morfolojisi Sarı, sirküler, Düz, Sirküler, Düz, sirküler Düz, Sirküler, nd Düz, sirküler ve Düz ve Düz, sirküler düzgün kenarlı düzgün kenarlı filamentöz düzgün kenarlı düzgün kenarlı kenarları ve rizoid kenarlı belirsiz kenarlı Kongo Red absorbsiyonu - D - - - - nd - Kayma Hareketi + - + D - - + + Fleksirubin Pigment üretimi + - + - - - + + Marine Agarda üreme - + + + - - nd - TSA’da Üreme + + + + + + + + Üreyebildiği Sıcaklık Aralığı 10-30 0-24 2-26 5-25 4-25 15-37 12-29 (-7) - 30 (°C) Optimum Üreme Sıcaklığı (°C) 28 15 18 Nd 21 25 20 26 Tuz Toleransı (% NaCl) 0-3 0-9 0-3 0-5 0-1 0-2 0-1 0-2 Glukoz Kullanımı + + + + + + + + Karbonhidratlardan asit + - + - - - nd + üretimi Jelatini hidrolizi + + + - + - D + Kazein hidrolizi + + + + + - + + Nişasta hidrolizi + - + + + - + + Eskülin hidrolizi + + + + + Nd + + Üreaz üretimi - - - - - + - - Oksidaz + + - + + + + + β-Galactosidase Nd - + - - + + + H 2S üretimi - - - - - - Nd - Nitratı indirgeme Nd - - D + - + + DNA G+C oranı (mol%) 32 35 35 34-35 37 36 38 34 1 9 Tablo 1’in devamı F. hydatis F. oncorhynchi F. pectinovorum F. piscis F. plurextorum F. psychrophilum F. reichenbachii F. saccharophilum İzolasyon Ilık tatlı su Gökkuşağı Toprak Gökkuşağı Gökkuşağı Ilık tatlı su ve tatlı Acı sulardan Ilık tatlı su alabalığı alabalığı alabalığı böbrek su balıklarının doku böbrek ve yumurta ve organları Koloni Morfolojisi Düz, yaygın Sirküleri Hafif konveks, Sirküler, Sirküler, Sirküler, düzgün Sirküler, yaygın Düz, yaygın ağara ve konveks ve sirküler, düzgün düzgün düzgün kenarlı kenarlı veya sahanda üreyen, kenarları gömülü tarzda filamentöz düzgün kenarlı kenarlı kenarlı yumurta şeklinde düzgün olmayan üreme kenarlı Kongo Red absorbsiyonu - - - - - - Nd - Kayma Hareketi + - + - - + + + Fleksirubin Pigment üretimi + + + + + + + + Marine Agarda üreme - - - - - - - - TSA’da Üreme + + + + + - + + Üreyebildiği Sıcaklık Aralığı 5-35 15-30 ?-30 15-30 15-30 5-23 6-30 4-30 (°C) Optimum Üreme Sıcaklığı 20-25 25 20-25 25 25 15-20 20-26 25 (°C) Tuz Toleransı (% NaCl) 0-2 0-3 ?-1 0-3 0-3 0-1 0-2 0-2 Glukoz Kullanımı + - + + + - - + Karbonhidratlardan asit + - + - - - Nd Nd üretimi Jelatini hidrolizi + - + + - + + + Kazein hidrolizi + + + + - + + + Nişasta hidrolizi + + + + + - + + Eskülin hidrolizi + + + + + - + + Üreaz üretimi - - - - - - Nd - Oksidaz D + V + + + + D β-Galactosidase + + + - - - + + H 2S üretimi - - - - - - Zayıf + Nitratı indirgeme + + + + + - - + DNA G+C oranı (mol%) 32-34 33 34 (36) 34 33.2 32 (33-34) 34,3 32-36 2 0 Tablo 1’in devamı F. spartansii F. succinicans F. terrigena F. tiangeerense F. tructae F. xueshanense İzolasyon Chinook Ilık tatlı su Toprak Buzul Alabalık Buzul Salmon böbrek dokusu Koloni Morfolojisi Düz, yaygın ve Düz, yaygın ve Sirküler, konveks Sirküler, konveks Sirküler, Sirküler, konveks ve filamentöz kenarlı filamentöz kenarlı ve düzgün kenarlı ve düzgün kenarlı konveks ve düzgün kenarlı düzgün kenarlı Kongo Red absorbsiyonu - - - - - - Kayma Hareketi + + - - - - Fleksirubin Pigment üretimi + - + - + - Marine Agarda üreme - - - - - Nd TSA’da Üreme + + - + + + Üreyebildiği Sıcaklık Aralığı (°C) Nd 2-37 10-30 4-26 15-30 2-18 Optimum Üreme Sıcaklığı (°C) 22 25 25 22-23 25 14 Tuz Toleransı (% NaCl) 0-2 Nd Nd 0-0,5 0-3 0-0,5 Glukoz Kullanımı - + Nd - + + Karbonhidratlardan asit üretimi Nd + - - - + Jelatini hidrolizi + + + - + - Kazein hidrolizi + + + + + + Nişasta hidrolizi + + - - + - Eskülin hidrolizi + + - + + + Üreaz üretimi - + Nd - - Oksidaz + D + + + + β-Galactosidase D + - - - - H 2S üretimi - - - - - - Nitratı indirgeme + D - - + - DNA G+C oranı (mol%) 35,6 38 (34-37) 38,2 34,8 36,2 37,2 Nd: Tespit edilmemiş, D: Değişken 2 1 2.3.6. Flavobacterium enfeksiyonlarında koruma-kontrol 2.3.6.1. İşletme yönetimi Balıkları olabildiğince stresten uzak tutma ve su kalitesinin devamlılığını sağlama gibi işletme yönetimi ilgili faktörler Flavobacteriumların türlerinin neden olduğu ölümlerin azaltılmasında koruyucu rol oynamaktadır (Loch ve Faisal, 2017). Suda, nitrit ve organik madde miktarının artması, F. columnare ve F. psychrophilum etkenlerinin balıkların solungaçlara tutunması ve kolonizasyonunu artırmaktadır (Decostere ve ark., 1999; Nematollahi ve ark., 2003). Aynı şekilde sudaki çözünmüş oksijen konsantrasyonunun düşmesi ve amonyak miktarının artması da bakteriyel solungaç hastalığının ortaya çıkışını kolaylaştırmaktadır (Loch ve Faisal, 2017). Kuluçkahaneye giren suyun ultraviyole (UV) ile dezenfekte edilmesi ile; sudaki Flavobacterium sp.’nin yükü azaltılabilmekte veya tamamen elemine edilebilmektedir. Hedrick ve arkadaşları (2000), birçok Gram negatif etkenin dezenfeksiyonunda santimetre kareye 42 miliwat (mWs/cm2) UV ışınların yeterli olabileceğini ancak F. psychrophilum’un elemine edilebilmesi için 126mWs/cm2 UV’nin gerekli olduğunu bildirmişlerdir (Loch ve Faisal, 2017). Benzalkonyum klorür çözeltisi (600 mg/l) F. psychrophilum ’u 10 dakikada inhibe ederken (Oplinger ve Wagner, 2010), virkon, halamid, glutaraldehid’in % 2’lik, 50 ppm iyot ve etenolün %70’lik çözeltileri F.columnare ve F. psychrophilum’u 1 dakikada inhibe edebilmektedir (Mainous ve Smith, 2012). Salmonid balıklara, 1000 ppm dozunda formaldehit ile banyo uygulanması ile F. columnare’nin 1 dakikada elimine olduğu ancak F. psychrophilum ’u eliminasyonu için 10-20 dakika banyo uygulanmasının gerekli olduğu bildirilmiştir. Ayrıca potasyum permanganat solüsyonu F. columnare’yi 1 dakikada inhibe ederken, F. psychrophilum’u 1 saat içerisinde bile tam olarak elimine etmediğini bildirmişlerdir ( Loch ve Faisal, 2017; Mainous ve Smith, 2012). F. psychrophilum'un yüzeylere oluşturduğu biyofilm tabakası ile antimikrobiyallerin ve dezenfektanların etkisini azalttığı bildirilmektedir (Sundell ve Wiklund, 2011). Gökkuşağı alabalığı gibi salmonid balıkların gonad ve gonadal sıvılarına özel ilgisi olan F. psychrophilum (Brown ve ark., 1997), anaç balıklardan yumurtalara 22 vertikal olarak taşınabilmektedir. F. psychrophilum’un yayılımının önlenmesinde yumurta dezenfeksiyonu büyük önem göstermektedir (Avendafio-Herrera ve ark., 2014). Yumurta dezenfeksiyonunda;  Povidon-iyot 50 mg/l, 30 dakika veya 100 mg/l, 10 dakika,  Hidrojen peroksit 100 mg/l, 10 dakika  Glutaraldehitde 200mg/l, 20 dakika süreyle kullanımı etkilidir (Cipriano ve Holt, 2005). 2.3.6.2. Probiyotikler ve immunstimulanlar Yem katkı maddesi olarak kullanılan alginik asit ekstraktının, F. columnare'a karşı etkili olduğu ve mortaliteyi önemli ölçüde düşürdüğü bildirilmiştir (Suomalainen ve ark., 2009). Bazı Pseudomonas türlerinin in vitro koşullarda Flavobacterium spp.’nin üremesini engellediği ve bu türlerin oluşturduğu enfeksiyonlara karşı balıklarda koruma sağladığı rapor edilmiştir. Yapılan in vitro çalışmalarda probiyotik olarak kullanılan Pseudomonas spp.’nin inhibisyon etkisinin F. psychrophilum serotipleri arasında değişkenlik gösterebileceği bildirilmiştir (Ström‐Bestor ve Wiklund, 2011). Boutin ve ark. (2012), kaynak alabalığının deri ve mukusundan izole edilerek hazırladığı çok sayıda probiyotik bakterinin F. columnare’yi in vitro olarak inhibe etme yeteneğine sahip olabileceğini bildirmiştir. Aynı araştırmacıların yaptığı farklı bir çalışmada ise balıklarda kolonize olmayan fakat biyofilm oluşturma yeteneği olan Rhodococcus spp.’nin kahverengi alabalıkların doğal mikrobiyotasını bozmadan probiyotik etki sağladığı ve F. psychrophilum enfeksiyonlarında balıklarda mortaliteyi azalttığı bildirilmiştir (Boutin ve ark., 2013). 2.3.6.3. Dirençli balıkların yetiştirilmesi Batı Virjinya’da bakteriyel soğuk su hastalığına karşı direnç gösteren bir gökkuşağı alabalığı hattı geliştirilmiştir (Leeds ve ark., 2010; Silverstein ve ark., 2009; 23 Wiens ve ark., 2014). Bakteriyel soğuk su hastalığına karşı geliştirilen dirençli gökkuşağı alabalığı hatlarının aynı zamanda kolumnaris hastalığına karşı da dirençli olabildiği belirlenmiştir (Evenhuis ve ark., 2015). 2.3.6.4. Bakteriyofaj Son zamanlarda Flavobacterium türlerinden kaynaklanan enfeksiyonların kontrol edilmesinde bakteriyofajların (litik aktivite) kullanılmasına yönelik çalışmalar oldukça önem kazanmıştır (Loch ve Faisal, 2017). Prasad ve ark., (2011); F. columnare izolatlarını lize eden F. columnare-spesifik fajlar izole ettiklerini ve bu fajların kullanımıyla enfekte yayın balıklarının (Clarias batrachus) tedavisinde % 100 başarı elde ettiklerini bildirmişlerdir (Prasad ve ark., 2011). F. psychrophilum ile deneysel olarak enfekte edilen gökkuşağı alabalıklarında faj tedavisi ile mortalitenin azaltılabileceği bildirmiştir (Castillo ve ark., 2012). Fakat aynı araştırmada F. psychrophilum’un zamanla fajlara karşı direnç geliştirebileceği belirtilmiştir (Castillo ve ark., 2014). 2.3.6.5. Aşılama F. psychrophilum’a karşı bugüne kadar geliştirilmiş bir lisanslı ticari aşı mevcut değildir. Bunun yapılamasını zorlaştıran bazı engeller bulunmaktadır. Bu engellerin başında; RTFS enfeksiyonlarında olduğu gibi henüz bağışıklık sistemi gelişmemiş olan fry’ların hastalıktan etkilenmesi ve 15 g’ın altındaki balıklara enjeksiyon yöntemiyle aşılamanın yapılamaması gelmektedir (Sundell ve ark., 2014). Şimdiye kadar, ticari aşılarla koruma yalnızca kolumnaris hastalığına karşı sağlanmışken, bakteriyel soğuk su hastalığına karşı sadece Norveç, İngiltere ve Şili gibi birkaç ülkede otojen aşılar kullanılmaktadır (Sundell ve ark., 2014). Diğer bir engel ise doğal yol (kohabitasyon) veya immersiyon yöntemiyle tekrarlanabilir deneysel enfeksiyon modelinin oluşturulamamış olmamasıdır. Ayu balıklarında (Plecoglossus altivelis) immersiyon yöntemiyle deneysel enfeksiyon modeli geliştirilmişken (Kondo ve ark., 2003), salmonid balıklarda enjeksiyon yöntemi dışında deneysel enfeksiyon modeli oluşturulamamıştır (Lorenzen ve ark., 2010). 24 Adjuvanlı veya adjuvansız inaktif deneysel aşılarla (bakterin) periton içi yolla aşılanması sonrasında, gökkuşağı alabalığı ve ayu balıklarında spesifik antikor artışı ve iyi bir koruma elde edildiği bildirilmiştir (LaFrentz ve ark., 2002; Sundell ve ark., 2014). F. psychrophilum zorunlu psikrofilik karakterde, yavaş üreyen (5-7 gün) bir bakteri olduğu için, tüm hücre aşısının ticari olarak hazırlanması ekonomik değildir (Sundell ve ark., 2014). Bu nedenle son yıllarda, rekombinant subunit aşıların geliştirilebilmesi için antijen olarak kullanılabilecek; immünojenik hücre yüzey molekülleri, proteinler veya fraksiyonlarının tanımlanması üzerinde durulmaktadır (Crump ve ark., 2005; Gliniewicz ve ark., 2012; LaFrentz ve ark., 2004). Subunit aşılar, yavru balıklara (fry) oral veya immersiyon yöntemiyle uygulanabilir. Fakat bu subunit aşıların yeterli koruma sağlayamadığı veya koruma süresinin yetersiz olduğu bildirilmiştir (Högfors ve ark., 2008; Rahman ve ark., 2000). ATP sentazβ, factor-Tu ve SufB Fe-S protein gibi proteinler kullanılarak üretilen rekombinant aşıların spesifik antikor miktarında artışa neden olduğu ancak balıklarda yeterli koruma sağlamadığı bildirilmiştir (Plant ve ark., 2011). Dış membran proteinlerinin subunit aşı hazırlanması için önemli bir komponent olduğu, periton içi yolla verilen subunit aşıların koruyuculuğunun jüvenil gökkuşağı alabalıklarında % 93–95 ve ayu balıklarında % 64–71 olduğu bildirilmiştir (Dumetz ve ark., 2006). Son zamanlarda Şili’de lisanslı F. psychrophilum aşısı (Flavomune®, Veterquimica) geliştirilmiştir. Ancak Avrupa ülkelerinde otovaksin aşılar kullanılmaktadır (Fredriksen ve ark., 2013). F. psychrophilum'a karşı hazırlanan otovaksin aşılar; Şili'de somon balığı (Bravo ve Midtlyng, 2007), Norveç'te gökkuşağı alabalığı (Johansen ve ark., 2011) ve İngiltere’de hem somon hem de gökkuşağı alabalıklarında kullanılmaktadır (Sundell ve ark., 2014). F. columnare ile ilgili olarak birçok çalışma yapılmış olmasına rağmen halen virülens mekanizması tam olarak belirlenememiş ve bilinen 4 ana serotipin virülens ile bağlantısının olmadığı bildirilmiştir (Loch ve Faisal, 2017). Balıkların erken yaşam evrelerinde immun sistem tam olarak gelişmediği için aşılama yoluyla kolumnaris hastalığının kontrolü zordur. Ayrıca F. columnare enfeksiyonları, yavru balıkları daha fazla etkilediği için enjeksiyonla aşılamanın 25 hastalığı kontrol etmek için uygun bir strateji olmadığı belirtilmiştir (Sundell ve ark., 2014). ABD ve Kanada'da salmonidler için ruhsatlı inaktif F. columnare immersiyon aşısı (Fryvacc 1) bulunmaktadır. Şili'de salmonidlere yönelik Fryvacc 1'e ek olarak, F. columnare ve Yersinia ruckeri bivalent Fryvacc 2 aşısı da kullanılmaktadır. (Bravo ve Midtlyng, 2007). Yayın balığı türlerinde kolumnaris hastalığının önlenmesi için 2005 yılında ABD'de canlı bir attenüe aşı olan Aquavac-Col® piyasaya sürülmüş ancak Aquavac- Col®'in salmonidlerdeki etkinliği bilinmemektedir (Sundell ve ark., 2014). Kanal kedi balığı ve iri yayın balıklarında (Micropterus salmoides) kullanılmak üzere Amerika’da lisanslı atenüe canlı F. columnare aşısı (Aquavac-Col®; Merck Hayvan Sağlığı) geliştirilmiştir. Bu aşı immersiyon olarak kanal kedi balığı frylarında %57-97 oranında etkili olduğu bildirilmiştir. (Shoemaker ve ark., 2011). Asetonla inaktive edilmiş F. branchiophilum’un gökkuşağı alabalıklarına immersiyon veya intraperitoneal (İP) enjeksiyon yoluyla vererek bağışıklıkları değerlendirmiş ve 6 hafta ara ile 3 kez banyo yolu ile verilen aşının periton içi uygulamadan daha yüksek bir koruma sağladığı rapor edilmiştir (Lumsden ve ark., 1994). 2.3.6.6. Tedavi Flavobacterium spp. etkenlerinden kaynaklanan hastalıklara yönelik olarak çok sayıda tedavi seçeneği önerilmiştir. Fakat tedavide kullanılacak kimyasalların ruhsatlandırılması ülkelere göre farklılık göstermektedir. Örneğin Amerika’da salmonidlerde F. columnare ve F. psychrophilum’un tedavisinde florfenikol 10-15 mg/kg CA dozunda 10 gün veya oksitetrasiklin 80 mg/kg CA dozunda 10 gün süreyle kullanılmaktadır (Austin ve Austin, 2016; Loch ve Faisal, 2017). Eksternal F. columnare enfeksiyonlarının tedavisi için; hidrojen peroksit genç ve yetişkin balıklarda gün aşırı kullanılarak 3 kez, 50-75 mg/l dozda 60 dakika banyo yaptırılması, aynı şekilde kloramin T’ninde 10-20 mg/l dozda 60 dakika banyo yaptırılması önerilmektedir (Loch ve Faisal, 2017). 26 Gökkuşağı alabalığı fingerlinglerinde görülen F. branchiophilum enfeksiyonlarının tedavisinde; 5% NaCl çözeltisinde 2 dakika veya %8 NaCl çözeltisinde 30 saniye banyo yaptırılması önerilmektedir (Loch ve Faisal, 2017). RTFS'yi tedavisinde sıklıkla kullanılan oksitetrasiklin ve florfenikole karşı antimikrobiyal direnç geliştiği bildirilmiştir (Henríquez-Núñez, ve ark., 2012; Smith ve ark., 2016). Kültür balıkçılığının sürdürülebilirliği açısından, tedaviye başlamadan önce etkenin izolasyonun mutlaka yapılması ve antimikrobiyal duyarlılık testlerinde elde edilen sonuçlara göre tedavi uygulanmasına dikkat edilmelidir. 2.4. Antimikrobiyal direnç Balık hastalıklarının tedavisinde kullanılan ve mikro kirletici olarak kabul edilen antimikrobiyaller, organizmalar üzerindeki toksik etkilerinin yanı sıra akuatik florada yer alan bakterilerde direnç gelişimine neden olmaktadır. Bu durumda hastalıkların tedavisi için ya daha yüksek dozda antibiyotik kullanılması ya da antibiyotik tedaviden sonuç alınamaması söz konusu olmaktadır. Yüksek dozda antimikrobiyal kullanılması, akuatik çevrede aktif kalıntı miktarının artmasına, antimikrobiyallere dirençli bakterilerin çoğalmasına ve yaygınlaşmasına neden olmaktadır (De Liguoro ve ark., 2003; Yang ve Carlson, 2004). Balık, eklem bacaklı (kerevit, karides vd.) ve çift kabuklu yumuşakçalarda (midye, istiridye vd.) hastalık yapan yüzden fazla patojen bakteri bulunmaktadır. Ancak bu patojenlerin küçük bir bölümü kültür balıkçılığını önemli düzeyde etkiler. Akuakültürde patojenlerin eliminasyonu için antimikrobiyallerin kullanılması, direncin yaygınlığını artırabilir ve halk sağlığını tehdit edecek bir boyuta ulaşabilir. Akuakültürde gelişen direncin en riskli niteliği aktarılabilir karakterde olmasıdır (Alderman ve Hastings, 1998; WHO, 2006). Küresel olarak kültür balığı yetiştiriciliğinde sık karşılaşılan bakteriyel enfeksiyonlara karşı kullanılan antimikrobiyal bileşikler ve direnç mekanizmaları Tablo 2’de verilmiştir (Elliott ve Facklam, 1996; Goñi-Urriza ve ark., 2002; Miranda ve ark., 2013; Schmidt ve ark., 2000). Ülkemizde balık hastalıklarının tedavisinde kullanılmak üzere Tarım ve Orman Bakanlığı tarafından 6 farklı etken maddeye ait 46 farmasötik ürün 27 ruhsatlandırılmıştır. Bu ürünlerden kültür balıklarında en yaygın kullanılan antimikrobiyaller; sırasıyla florfenikol, oksitetrasiklin ve sulfonamid-trimetoprim olarak sıralanabilir. Gökkuşağı alabalıkları, akuatik çevre ve yetiştiricilik ortamlarından izole edilen bakterilerde antimikrobiyal direnç gelişimine yönelik çok sayıda rapor bildirilmiştir. (Akinbowale ve ark., 2007;Alcaide ve ark., 2005;Buschmann ve ark., 2012;Duman ve ark., 2017a; Ho ve ark., 2000). Tablo 2. Gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliğinde en sık izole edilen bakterilere karşı kullanılan antimikrobiyal bileşiklerin etki ve direnç gelişim mekanizmaları (Shah, 2012a). Antimikrobiyal duyarlılık testleri, herhangi bir antimikrobiyalin belli bir bakteri türüne karşı in vitro etkinliğini belirlemek amacıyla uygulanan testlerdir. İn vitro antimikrobiyal duyarlılığın belirlenmesinde; disk difüzyon, E-testi, agar dilüsyon, broth mikrodilüsyon ve broth makrodilüsyon gibi metotlar kullanılmaktadır. Bu metotların kullanımı ve sonuçlarının değerlendirilmesi sırasında CLSI veya EUCAST tarafından belirlenen standartlara uyulması önem arz etmektedir (Yıldırım, 2010.) Veteriner hekimlik alanında karasal hayvanlardan izole edilmiş olan bakteriyel patojenler için geliştirilmiş standart protokoller bulunmaktadır. Su hayvanlarında hastalığa neden olan birçok bakteriyel etken, karasal hayvanlardaki bakteriyel 28 patojenlerden farklı olarak psikrofilik karakterde olmaları nedeniyle üreme koşullarında da farklılıklar göstermektedir. Bu durum su hayvanlarında hastalık oluşturan bakteriyel etkenlerin antimikrobiyal duyarlılık testlerinin yapılmasında daha düşük inkübasyon sıcaklığı tercih edilmesine ve/veya besiyeri bileşenlerinde birtakım farklılıklar yapılmasına neden olabilmektedir. Yapılan literatür incelemelerinde; su hayvanlarından izole edilen patojenlerin antimikrobiyal duyarlılık testlerinin belirlenmesinde filogenetik olarak yakın ilişkili ve standartları belirlenmiş olan bir bakteriyi referans alınarak kullanıldığı görülmektedir (CLSI 2014a ve CLSI2014b). CLSI’nın 2014 yılında yayınladığı standartta sadece Aeromonas salmonicida için antimikrobiyal duyarlılık sınır değerleri verilmektedir. Halen birçok balık patojeninin antimikrobiyal duyarlılık sınır değerleri tam olarak belirlenmemiştir. Antimikrobiyal duyarlılık sınırının belirlenebilmesi için; test edilen izolat sayısının en az 30 olması, MİK değerleri ile klinik sonuçlar arasında korelasyon bulunması, test edilen antimikrobiyalin farmakodinamik ve farkmokokinetik özelliklerinin bilinmesi gerekmektedir (CLSI 2014a ve CLSI2014b). Ayrıca su hayvanlarından izole edilen bakterilerin MİK verilerinin yorumlanması sırasında klinik sınır değerlerin belirlenmesi ve uygulanmasını zorlaştıran birtakım faktörler bulunmaktadır. Kültür balığı yetiştiriciliğinde tuzluluk ve sıcaklık gibi çevresel parametrelerdeki değişimler ilaçların farmakodinamiğini etkileyebilmektedir. Bu nedenle, akuatik ortamda kullanılacak antimikrobiyallerin dozları, konakçının yaşam ortamına ve patojenin türüne göre farklılık gösterebilmektedir (CLSI 2014a ve CLSI2014b). Fenotipik antimikrobiyal duyarlılık testlerinde, antimikrobiyallerin antibakteriyel etkinlikleri, “duyarlı”, “orta derece duyarlı” veya “dirençli” olarak belirlenmektedir. Ayrıca son zamanlarda bunların dışında epidemiyolojik eşik/ duyarlılık değer (cut-off) olarak adlandırılan yeni bir yöntem kullanılmaya başlanmıştır. Birçok laboratuvarda antimikrobiyal duyarlılık sonuçlarının yorumlanmasında CLSI'nın "ECV" ve EUCAST'in ise "ECOFF" olarak isimlendirdiği epidemiyolojik eşik değerler kullanılmaktadır. Bu yeni yöntemde test edilen izolatların antimikrobiyal duyarlılıklarının duyarlı, orta derece duyarlı ve dirençli olarak sınıflandırılması doğru bir değerlendirme değildir. Epidemiyolojik eşik değer/duyarlılık sınırı yönteminde, duyarlı tip olarak isimlendirilen izolatlar “Wild 29 Tip, (WT)”; duyarlılığı azalmış olarak isimlendirilen izolatlar ise “Non-Wild Tip (N- WT)” olarak tanımlanmaktadır (CLSI 2014a ve CLSI2014b; Ngo ve ark., 2017; Smith ve ark., 2016) Epidemiyolojik eşik değer; türe spesifik olup farklı coğrafi bölgelerdeki laboratuvar araştırmalarından elde edilen MİK verilerinin dağılımını temel almaktadır. CLSI’nin 2014 yılında yayınladığı VET03/04-S2 kodlu standardı revize edilen yeni standartta; 5 farklı laboratuvarda, farklı bölgelerden izole edilmiş olan toplam 359 F. psychrophilum izolatının 6 farklı antimikrobiyale karşı belirlenen MİK değerleri normalize edilmiş yorumlama metodu (Normalized Resistance Interpretation, NRI) kullanılarak standardize edilen eşik değerler bulunmaktadır. Smith ve Kronvall (2015) farklı kalite kontrol suşları kullanılarak (E. coli ATCC 25922, A. salmonicida ATCC 33658 ve F. psychrophilum NCIMB 1947) yaptığı araştırmada disk difüzyon testinde oluşan zon çapı değerlerinin inkubasyon sıcaklığı ve süresi ile bağlantılı olduğunu bildirmiştir. Bununla birlikte aynı araştırmacılar; 22ºC’den daha düşük inkübasyon sıcaklığı ve normalden daha uzun süreli inkübasyonun hem laboratuvar içinde hem de farklı laboratuvarlar arasında test sonuçlarında farklılıklar oluşturduğunu bildirmiştir (Smith ve Kronvall, 2015). Bu durum F. psychrophilum izolatlarının disk difüzyon testi ile antimikrobiyal duyarlılığının belirlenmesinde her zaman doğru sonuçlar elde edilemeyeceğini göstermektedir. Akuatik çevrede bulunan patojen ve saprofit bakterilerde antimikrobiyal direncin tespit edilmesi, antimikrobiyal direncin karasal ortama (insan ve hayvan) aktarılmasına yönelik önlemlerin alınması yönüyle önem taşımaktadır (Burridge ve ark., 2010; Buschmann ve ark., 2012; Depaola ve ark., 1995). Akuatik ve karasal sistemde yaşayan canlılardan izole edilen bakterilerdeki antimikrobiyal direnç genleri birbirleriyle benzerlik göstermektedir (Cattoir ve Nordmann, 2009; Pan ve ark., 2008; Rhodes ve ark., 2000). Balık patojeni olan Yersinia ruckeri ile insan patojeni olan Yersinia pestis’in benzer antimikrobiyal direnç genleri ve plazmid bulundurmaları buna örnek olarak gösterilebilir (Barton, 2000). Sonuç olarak Akuakültürde kullanılan antimikrobiyal bileşiklerin akuatik çevreyi kirletmesi, dirençli bakterilerin direnç geni rezervuarı olarak bu genleri yayması ve akuatik ortamda gelişen direncin çoğunlukla 30 aktarılabilir karakterde olması; sürdürülebilir balıkçılık ve insan sağlığı açısından büyük bir risk oluşturmaktadır (Alcaide ve ark., 2005). Direnç genlerinin varlığı ve yayılımı üzerine birçok araştırma yapılmış olmasına rağmen ülkemizde gerek karasal hayvan gerekse su hayvanlarında hastalık oluşturan bakterilerde direnç gelişimi veya mekanizmaları konusunda çalışmalar sınırlı düzeydedir. Yapılan çalışmalarda; fenotipik olarak direnç tespit edilmiş (disk difüzyon, MİK) bakterilerde dirence neden olan genetik etmenlerin araştırılması önerilmektedir (Buschmann ve ark., 2012; Elliott ve Facklam, 1996). Gram negatif bakterilerde florfenikol direncinden primer olarak ilacın hücre dışına çıkartılmasından sorumlu olan floR geninin etkili olduğu bildirilmiştir (Fernández‐Alarcón ve ark., 2010). floR, salmonidlerde hastalık yapan Hafnia alveai, Pseudomonas spp., Citrobacter freundii gibi türlerde rastlanırken; Flavobacterium türlerinde henüz rapor edilmemiştir (Miranda ve ark., 2013). Farklı bakteri türlerinde tespit edilen tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, tetG, tetK ve tetL’nin dışa atım pompası aracılığı ile tetrasiklin bileşiklerinin hücre dışına çıkartılmasından, tetM, tetO, tetS’nin ribozomal korumadan ve tet34’ün ise enzimatik inaktivasyondan sorumlu olduğu bilinmektedir (Akinbowale ve ark., Barton, 2007). Çevresel (su ve sediment) örneklerden izole edilen Flavobacterium spp. türleri üzerine yapılan az sayıdaki araştırmada, tetA, tetB, tetC, tetE, tetM, tetH ve tetL genlerinin varlığı rapor edilmiştir (Akinbowale ve ark., 2007; Dolejska ve ark., 2009; Miranda ve ark., 2003). Folat sentezini inhibe eden sulfonamidler ile trimetoprim, gram negatif bakterilerin etken olduğu hastalıkların sağaltımında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Sulfonamidlere karşı oluşan aktarılabilir antimikrobiyal dirençten sul (sul1, sul2 ve sul3) genlerinin sorumlu olduğu bilinmektedir. Akuatik çevrede yaygın olarak bulunan Flavobacterium türlerinin sul (sul1, sul2 ve sul3) genlerini taşıdıkları rapor edilmiştir (Wang ve ark., 2014). Gram negatif bakterilerde kinolon direncinin yaygın olması, gyrA ve parC genlerindeki noktasal mutasyonlarla ilişkilendirilmektedir. Balıklarda patojen olduğu bilinen F. psychrophilum, A. salmonicida, Edwardsiella tarda ve Photobacterium damselae’da oksalinik asit direncinin gyrA bölgesindeki mutasyondan kaynaklandığı 31 bildirilmiştir (Gibello ve ark., 2004; Goñi-Urriza ve ark., 2002; Izumi ve ark., 2007; Kim ve ark., 2011; Miranda ve ark., 2013; Shah ve ark., 2014). Bu çalışmada;  Flavobacterium türlerinden kaynaklanan hastalıkların coğrafik dağılımlarının belirlenmesi,  Flavobacterium türlerinin genetik yakınlığı ve epidemiyolojik ilişkilerinin saptanması,  Akuakültürde sık kullanılan antimikrobiyallere (florfenikol, oksitetrasiklin, sulfamethoksazol/trimetoprim, enrofloksasin ve oksalinik asit) karşı gelişen aktarılabilir ve/veya kromozomal direnç genlerinin varlığı/yaygınlığının belirlenmesi,  Alabalık yetiştiricilerinin bilgilendirilmesi ile gereksiz antimikrobiyal kullanımının azaltılması ve ekonomik kaybın önlenmesi amaçlanmıştır. 32 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Bakteri izolatları Bu tez çalışmasında Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Su Ürünleri Hastalıkları Anabilim Dalı Laboratuvarı kültür koleksiyonunda yer alan 109 adet Flavobacterium spp. izolatının yanı sıra ve beş F. psychrophilum referans izolatı kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan izolatların kökenleri ve izolasyon yılları Tablo 3’te, bölgesel dağılımları ise Şekil 1’de verilmiştir. Şekil 1. Flavobacterium spp. izolatlarının bölgesel dağılımları, Çalışmada kullanılan bakteriyel izolatların izole edildiği gökkuşağı alabalığı işletmeleri Türkiye haritasında mavi halka ile Anadolu/dağ alabalığı (Salmo trutta macrostigma), Çoruh Alabalığı (Salmo coruhensis), Kaynak Alabalığı (Salvelinus fontinalis), Karadeniz Alabalığı (Salmo trutta labrax) işletmeleri kırmız halka ile gösterilmiştir. Türkiye haritasında gösterilen yeşil noktalar ülkemizdeki projeli gökkuşağı alabalığı işletmelerinin dağılımını göstermektedir (Akova, 2015). 33 Tablo 3. Doktora Tez Çalışmasında kullanılan Flavobacterium izolatları Balık Ağırlığı Balık Ağırlığı İzolat No Balık Türü İzolasyon Yılı Bölge İzolat No Balık Türü İzolasyon Yılı Bölge (g) (g) Şubat 15 Eylül 13 F-5 R.T. 2 Ege F-70 R.T. 10 İç Anadolu F-6 R.T. 1 Ocak 15 Ege F-72 R.T. 0.3 Mart 14 İç Anadolu Ocak 15 Temmuz 14 F-10 R.T. 1 Ege FP-73 R.T. 5 İç Anadolu R.T. 3 Mart 15 Ege R.T. 20 Mayıs 14 F-16 F-74 Ege Ocak 15 Eylül 13 F-18 R.T. 1 Ege F-75 R.T. 7-9 Ege Mart 15 F-19 R.T. 0.5 Doğu Anadolu F-76 R.T. 0.3 Mart 14 İç Anadolu Şubat15 Mayıs 14 F-23 R.T. 2 Ege F-77 R.T. 0.3 İç Anadolu FP-24 R.T. 2 Mart 14 İç Anadolu F-81 R.T. 0.3 Mart 14 İç Anadolu Mart 14 Temmuz 14 F-25 R.T. 2 İç Anadolu FP-82 R.T. 5 İç Anadolu Mayıs 15 F-27 R.T. 20 Akdeniz R.T. 2 Haziran 14 F-83 Ege Mayıs 15 Mayıs 14 F-29 R.T. 20 Akdeniz F-84 R.T. 15 Ege Mayıs 15 F-30 R.T. 20 Akdeniz F-85 R.T. 0.5 Mart 14 İç Anadolu Ocak 15 Nisan 14 FP-34 R.T. 0.6 Marmara FP-90 R.T. 0.3 Ege Şubat 15 Mart 14 FP-37 R.T. 2-4 Karadeniz F-91 R.T. 0.6 İç Anadolu Şubat 14 Mayıs 14 F-47 R.T. 0.3 İç Anadolu F-92 R.T. 2 Ege F-57 R.T. 0.4 Nisan 14 Ege F-93 R.T. 0.6 Mart 14 İç Anadolu Eylül 13 Mart 14 F-58 R.T. 1 Ege FP-94 R.T. 0.6 İç Anadolu F-59 R.T. 4 Eylül 13 Ege R.T. 1 Haziran 14 FP-95 Ege Eylül 13 Mart 14 F-60 R.T. 1 Ege F-96 R.T. 2 İç Anadolu F-64 R.T. 0.3 Mart 14 İç Anadolu R.T. 2 Mart 14 F-97 İç Anadolu Mart 14 Mayıs 15 F-65 R.T. 0.3 İç Anadolu FP-100 R.T. 1 İç Anadolu F-67 R.T. 0.3 Mart 14 İç Anadolu R.T. 1 Mayıs 15 F-101 İç Anadolu Temmuz 14 Mayıs 15 F-68 R.T. 5 İç Anadolu FP-102 R.T. 1 İç Anadolu F-69 R.T. 7-8 Eylül 13 Ege F-106 R.T. 2 Nisan 14 Marmara 34 Tablo 3’ün Devamı Balık Ağırlığı Balık Ağırlığı İzolat No Balık Türü İzolasyon Yılı Bölge İzolat No Balık Türü İzolasyon Yılı Bölge (g) (g) May.15 Oca.17 FP-108 R.T. 1 Ege F-324 R.T. Yumurta Ege Haz.14 Oca.17 FP-109 R.T. 1 Ege F-325 R.T. 0.3 Ege Haz.14 Oca.17 FP-116 R.T. 1 Ege F-326 R.T. 0.2 Ege Haz.15 Oca.17 FP-120 R.T. 1 Ege F-327 S.T.M 4000 Ege Haz.15 Oca.17 F-122 R.T. 2 Ege F-328 R.T. 0.3 Ege Oca.17 FP-123 R.T. 0.3 Mar.15 Doğu Anadolu F-329 R.T. 0.3 Ege Tem.15 Oca.17 F-126 R.T. 200 Marmara F-331 R.T. 0.3 Ege Tem.15 Oca.17 F-129 R.T. 3000 Marmara F-333 S.T.M 4000 Ege May.15 Oca.17 F-130 R.T. 0.2 Marmara F-334 S.T.M 4000 Ege May.15 Oca.17 F-131 R.T. 100 Marmara FP-335 R.T. Sperm Ege May.15 Oca.17 F-135 R.T. 0.2 Marmara F-336 R.T. Yumurta Ege Oca.17 Oca.17 F-310 R.T. 1 Ege F-337 R.T. 0.3 Ege Oca.17 Oca.17 FP-311 R.T. 0.3 Ege F-338 R.T. 0.3 Ege Oca.17 Oca.17 FP-312 R.T. 0.3 Ege F-339 R.T. 0.3 Ege Oca.17 Oca.17 FP-313 R.T. 0.3 Ege F-340 S.T.M 4000 Ege Oca.17 Oca.17 FP-314 R.T. 0.3 Ege F-341 R.T. 0.3 Ege Oca.17 Oca.17 FP-315 R.T. 2-4 Ege F-342 R.T. 0.3 Ege Oca.17 Oca.17 F-319 R.T. 1 Ege F-343 R.T. 0.3 Ege Oca.17 Oca.17 F-320 R.T. 1 Ege F-345 R.T. 8-10 Karadeniz Oca.17 Oca.17 F-321 R.T. 200 Ege F-346 S.F. 4000 Karadeniz Oca.17 Oca.17 F-322 R.T. 4000 Ege F-347 S.L 0.2 Karadeniz Oca.17 Oca.17 F-323 R.T. Yumurta Ege F-348 R.T. 0.2 Karadeniz 35 Tablo 3’ün Devamı Balık İzolasyon Balık İzolasyon İzolat No Balık Türü Bölge İzolat No Balık Türü Bölge Ağırlığı (g) Yılı Ağırlığı (g) Yılı F-349 S.T.M 0.2 Oca.17 Karadeniz FP-368 R.T. 3-4 Oca.17 İç Anadolu F-351 R.T. 30-35 Oca.17 Karadeniz FP-369 S.C 0.1 Oca.17 Karadeniz F-352 R.T. Yumurta Oca.17 Karadeniz F-370 S.T.M 0.1 Oca.17 Karadeniz F-353 S.T.M Keseli fry Oca.17 Karadeniz F-371 R.T. Yumurta Oca.17 Karadeniz F-355 R.T. Yumurta Oca.17 Doğu Anadolu F-372 R.T. 1-2 Oca.17 Karadeniz F-359 R.T. 0.1 Oca.17 Karadeniz FP-374 S.F. 4000 Oca.17 Karadeniz F-360 R.T. 1-2 Oca.17 Karadeniz NCIMB 13383 R.T. fry 1990 Danimarka F-361 R.T. 130 Oca.17 İç Anadolu NCIMB 13384 R.T. fry 1991 Danimarka F-362 R.T. 130 Oca.17 İç Anadolu NCIMB 1947 C. S --- 1947 Amerika F-363 Sazan 400 Oca.17 İç Anadolu NCIMB 2282 C.S --- 1948 Amerika FP-367 R.T. 3-4 Oca.17 İç Anadolu ATCC 49511 R.T ---- 1986 Fransa R.T: Gökkuşağı alabalığı, S.T.M: Anadolu/dağ alabalığı (Salmo trutta macrostigma),S.F: Kaynak Alabalığı (Salvelinus fontinalis), S.L: Karadeniz Alabalığı (Salmo trutta labrax),S.C: Çoruh Alabalığı (Salmo coruhensis), C.S: Koho salmon (Oncorhynchus kisutch) 36 3.2. Moleküler identifikasyon 3.2.1. DNA ekstraksiyonu Fenotipik özellikleri belirlenen izolatların DNA ekstraksiyonu spin kolon filtrasyon (Qiagen, Almanya) yöntemine göre yapıldı. DNA ekstraksiyonu için; kit uygulama yönergesine uygun olarak bir öze dolusu bakteri kültürü DNAz, RNAz free ependorf tüplere alınarak 200 µl ATL buffer ve 20 µl Proteinaz K ile karıştırılmış ve 15 saniye vortekslendikten sonra karışım 56°C’de 2-3 saat bekletilmiştir. Karışımın üzerine 200 µl buffer AL eklenerek 15sn vortekslenmiş ve elde edilen ürün 70°C’de 10 dakika bekletilmiştir. Daha sonra %96’lık etanol ilave edilerek vortekslenmiş ve kit içerisinde bulunan spin kolonlara aktarılmıştır.Takiben 8000 rpm’de 1dakika santrifüj edilen bakteri süspansiyonuna 500µl buffer AW1 eklendikten sonra tekrar 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj edilmiş ve filtreden geçen sıvı uzaklaştırılmıştır. Spin kolon üzerine 500 µl buffer AW2 eklenerek 14000 rpm’de 3 dakika santifüj edilmiştir. Spin kolon steril ependorf tüpüne alındıktan sonra 150 µl buffer AE eklenerek 8000 rpm devirde 1 dakika santifüj edilmiş ve daha sonra örneklerin DNA ekstraksiyonları yapılmıştır. Elde edilen DNA ekstraktlarının Thermo Multiscan Go cihazında 260nm ve 260/280nm dalga boyunda ölçümleri spektrofotometrik olarak yapılarak, DNA miktarları ve saflıkları kontrol edilmiştir. 3.2.2. PCR ile identifikasyon 3.2.2.1. F. psychrophilum’un dubleks PCR ile identifikasyonu F. psychrophilum’un dupleks PCR ile identifikasyonunu yapmak için bakterinin gyrA ve gyrB bölgesinin amplifikasyonunu sağlayan primerler kullanılmıştır. Bu amaçla; GYRA-FP1F (5’-GAA ACC GGT GCA CAT AAG G–3’), GYRA-FP1R(5’-CCT GTG GCT CCG TTT ATT AA–3’) ve PSY-G1F (5’-TGC AGG AAA TCT TAC ACT CG–3’) ve PSY-G1R (5’-GTT GCA ATT ACA ATG TTG T–3’) primer setleri kullanılmıştır. PCR master miksi; 2,5 µl 10x PCR Buffer, 5µl 5x Q-Solution, 0,5 µl 0,2 mM dNTP mix (Her birinden 10 mM), her bir gyrA primerinden 25 pmol, her bir gyrB primerinden 37,5 pmol, 1 µl 25 mM MgCl2, 0,125 37 µl HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen, USA), 10-ng template DNA ve DNase⁄RNase-Free Distile su içerecek şekilde 25 µl hazırlanmıştır. Bu karışım 95°C’de 5 dakika ön denatürasyonu takiben 95°C’de 60 sn. denaturasyon, 56°C’de 60 sn. primer bağlanma, 72°C’de 90 sn. uzama olmak üzere 35 siklus ve 72°C’de 5 dakika final uzama koşullarında amplifikasyon işlemine tabi tutulmuştur. PCR ürünleri ve DNA marker, ethidium bromid (2μg/ml) içeren %1’lik agaroz elektroforeze (100 V’da 60 dakika) tabi tutulmuş ve oluşan bantlar UV transilluminatörde görüntülenmiştir. gyrA için 396 bp, gyrB için ise 1017 bp uzunluğunda bantlar pozitif olarak değerlendirilmiştir (Siekoula-Nguedia ve ark., 2012). 3.2.2.2. Flavobacterium spp. türlerinin 16S rRNA bölgesinin PCR ile amplifikasyonu Flavobacterium spp. olarak ön identifikasyonu yapılan izolatların moleküler identifikasyon için 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′) ve 1387R 5′- GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3 universal primerler kullanıldı. PCR master miksi; 5 µl 10x PCR Buffer, 10 µl 5x Q-Solution, 1 µl 0,2 mM dNTP mix (Her bir bazdan 10 mM), her bir primerden 2µM, 2 µl 25 mM MgCl2, 0,250 µl HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen, Almanya), 20-ng DNA template ve DNase⁄RNase-Free Distile su içerecek şekilde 50 µl hazırlanmıştır. Oluşturulan karışım 95°C’de 5 dakika ön denatürasyonu takiben 95°C’de 30 sn denatürasyon, 58°C’de 30 sn primer bağlanma, 72°C’de 1 dakika uzama olmak üzere 32 siklus ve 72°C’de 7 dakika final uzama koşullarında amplifikasyon işlemine tabi tutuldu (Biorad T100). PCR ürünleri ve DNA marker, etidium bromid (2μg/ml) içeren % 1,5 agaroz jel elektroforezi (100 V’da 60 dakika) sonrasında UV transilluminatör ile görüntülenmiştir. Bu işlemler sonucunda elde edilen 1465 bp uzunluğundaki bantlar Flavobacterium spp. izolatlarının amplifikasyonu için pozitif olarak değerlendirilmiştir (Loch ve ark., 2013). 3.2.3. Flavobacterium spp.’nin dizi analizi PCR analizi sonucunda 1465 bp uzunluğunda bant veren PCR ürünlerine hizmet alımı yoluyla dizi analizi yapılmıştır. Dizi analizi 27F ve 1387R primerleri 38 kullanılarak Sanger metoduna göre çift yönlü olarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen nükleotid dizilerinin birleştirilmesi Bionumerics (Aplied Maths-Belçika) programı ile yapılmıştır. İzolatların nükleotid dizileri gen bank (BLAST) veri tabanı ile karşılaştırılarak identifikasyonları yapılmıştır (Loch ve ark., 2013). 3.3. Moleküler karakterizasyon 3.3.1. F. psychrophilum’un restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi PCR-RFLP analizi F. psychrophilum izolatlarının RFLP ile analizinde 16S rRNA, gyrA ve gyrB gen bölgeleri kullanılmıştır. Amplifikasyonunda kullanılan primerler, PCR koşulları ve kesim yapılan enzimler Tablo 4’te verilmiştir. Amplifikasyon işleminden sonra amplifikasyon ürünleri %1’lik agaroz jelde elektroforeze tabi tutularak ethidium bromidle (2μg/ml) boyanmış ve oluşan bantlar UV transilluminatorle görüntülenmiştir. PCR sonucu elde edilen ürünler tabloda 4’de belirtilen restriksiyon enzimler ile kesilmiştir. Enzim ile kesme işleminden sonra oluşan ürünler ethidium bromidle (2μg/ml) boyanan jelde agaroz jelde (%1,5-3) elektroforeze tabi tutulmuştur. Oluşan bantlar UV transilluminator ile görüntülenmiştir. Sonuçlar BioNumerics Gel compare II (Applied Maths, Belçika) yazılım kullanılarak analiz edilmiştir. Her bir izolatın sonuçları farklı zamanlarda 3 kez yapılarak testin tekrarlanabilirliği kontrol edilmiştir. 39 Tablo 4. F. psychrophilum’un PCR-RFLP analizinde kullanılan primerler, enzimler ve PCR koşulları Hedef Primer Primer Seti Amplikon PCR koşulları Enzim Kaynak Bölge Büyüklüğü 16S FP1 GTTAGTTGGCATCAACAC 1092 95°C 5 dk TaqI Hesami ve ark., rRNA FP2 TCGATCCTACTTGCGTAG 95°C 30 sn. AluI 2008 52°C 1 dk X30 72°C 1 dk 72°C 10 dk 16S 336F AGACTCCTACGGGAGGCAGC 194 95°C 5 dk Mn II Soule ve ark., 2005 rRNA 517R ATTACCGCGGCTGCTGG 95°C 30 sn. 60°C 1 dk X30 72°C 1 dk 72°C 10 dk gyrA GYRA- GAAACCGGTGCACAGAAGG 396 94°C 4 dk Mph1103I Izumi ve ark., 2007 FP1F CCTGTGGCTCCGTTTATTAA 95°C 60 sn GYRA- 45°C 1 dk X30 FP1R 72°C 1 dk 72°C 10 dk gyrB PSY-G1F TGCAGGAAATCTTACACTCG 1017 94°C 4 dk Rsa I Izumi ve ark., 2003 PSY-G1R GTTGCAATTACAATGTTGT 95°C 60 sn. 45°C 1 dk X30 72°C 1 dk 72°C 10 dk 40 3.3.2. Flavobacterium spp. türlerinin restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (PCR-RFLP) Flavobacterium izolatlarının RFLP ile analizinde 16S rRNA bölgesi kullanılmıştır. Kullanılan gen bölgelerinin amplifikasyonunda kullanılan primerler, PCR koşulları ve kesim yapılan enzimler Tablo 5’te verilmiştir. Amplifikasyon işleminden sonra amplifikasyon ürünleri ethidium bromidle (2μg/ml) boyanan agaroz jelde (%1) elektroforeze tabi tutulmuş ve oluşan bantlar UV transilluminator ile görüntülenmiştir. PCR sonucu elde edilen ürünlerin her birinin enzimle ile ayrı ayrı kesimleri yapılmıştır. Enzim ile kesme işleminden sonra oluşan ürünler ethidium bromidle (2μg/ml) boyanarak agaroz jelde (%1,5-3) elektroforeze tabi tutulmuştur. Oluşan bantlar UV transilluminator ile görüntülenmiştir. Sonuçlar BioNumerics Gel compare II (Applied Maths, Belçika) kullanılarak analiz edilmiştir. Her bir izolatın sonuçları farklı zamanlarda 3 kez yapılarak testin tekrarlanabilirliği kontrol edilmiştir. Tablo 5. Flavobacterium spp.’nin PCR-RFLP analizinde kullanılan primerler, enzimler ve PCR koşulları Primer Primer Seti Amplikon PCR koşulları Enzim Kaynak Büyüklüğü FvpF1 GTTAGTTGGCATCAACAC 1193 95°C 5 dk TaqI Flemming ve FvpR1 TGCGATTACTAGCGAATC C 95°C 30 sn. AluI ark., 2007 50°C 1 dk X30 CfoI 72°C 1 dk HaeIII 72°C 10 dk HinfI MspI 3.4. RFLP verilerinin değerlendirilmesi RFLP verilerinin analizinde Gel-Compare II yazılımı (Applied Maths, Belçika) kullanılmıştır. İzolatların benzerlik oranlarının belirlenmesinde bantların varlığı ve yokluğunu temel alan Dice coefficient algoritması kullanılarak ağırlıksız çift grup yöntemi (UPGMA) ile filogenetik analiz yapılmıştır. Tüm RFLP profillerinin ağırlıksız çift grup yöntemi ile karşılaştırılmasında ortalama benzerlik katsayısı kullanılmıştır (Arias ve ark., 2007). 41 3.5. Antimikrobiyal duyarlılık konsantrasyonlarının belirlenmesi 3.5.1. Disk difüzyon F. psychrophilum izolatlarının antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesinde %5 Fötal dana serumu (FDS) eklenmiş Dilue Müller Hinton Agar (DMHA 1:7); diğer Flavobacterium türlerinin antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesinde ise FDS eklenmemiş DMHA kullanılmıştır. Bakteriyel izolatlar Anacker Ordal Buyyon (AOB)’da 18°C’de 72 saat inkübe edildikten sonra hazırlanan bakteriyel süspansiyonların yoğunlukları (OD) McFarland 0,5’e (BioMerieux, Fransa) ayarlanmıştır. Yoğunlukları ayarlanmış olan süspansiyonlar DMHA’a 0,1 ml miktarda inokule edilerek homojen bir şekilde yayılmıştır. Daha sonra petrilere antimikrobiyal diskler (Oxoid) [amoksisilin (25μg), oksitetrasiklin (30μg), oksalinik asit (10 μg), sulfamethoksazol/trimetoprim (25μg), enrofloksasin (5μg), eritromisin (15μg), florfenikol (30μg)] yerleştirilerek F. psychrophilum, 18°C’de 72 saat ve diğer Flavobacterium türleri ise 22°C’de 24-48 saat inkübasyona tabi tutulmuştur (CLSI, 2006). Kronvall (2010) tarafından belirlenen Normalize edilmiş direnç yorumlama (NRI) yöntemi kullanılarak MİK dağılımları analiz edilmiştir. NRI analizlerin yapılmasında on-line olarak mevcut olan (http://www.bioscand.se/nri/) elektronik excel tablosu kullanılmıştır (Kronvall, 2010; Ngo ve ark., 2017) 3.5.2. Minimum inhibisyon konsantrasyonunun belirlenmesi (MİK) Flavobacterium izolatlarının MİK değerlerinin belirlenmesi CLSI (2014) tarafından önerildiği şekilde; Katyon Düzeyi Ayarlanmış Dilüe Mueller-Hinton (4g/l) sıvı besi yeri kullanılarak mikro dilüsyon yöntemine göre belirlenmiştir. Çalışmada florfenikol (FFC; Sigma, F1427), oksitetrasiklin (OT; Sigma, PHR1537), oksalinik Asit (OA; Sigma, 67126), amoksisilin (AML; Sigma, A8523), eritromisin (ERM; Sigma, E5389), enrofloksasin (ENR; Sigma, 17849) ve sulfamethoksazol/Trimetoprim (19:1) (SUL; Sigma, S7507, TRI; Sigma, T7883) antimikrobiyalleri 0.008-256 konsantrasyon aralığında 2 katlı sulandırma yapılarak mikroplaklara dağıtılmıştır. F. psychrophilum izolatları 18°C’de 96 saat, diğer 42 Flavobacterium türlerine ait izolatlar ise 22°C’de 48 saat inkübe edildikten sonra mikroplakalar spektrofotometrik olarak Multiskan™ GO Microplate Reader (Thermo) cihazında okutulmuştur. Çalışmalar 2 tekerrür olarak yürütülmüştür (CLSI, 2014). Kronvall (2010) tarafından belirlenen Normalize edilmiş direnç yorumlama (NRI) yöntemi kullanılarak MİK dağılımları analiz edilmiştir. NRI analizlerin yapılmasında on-line olarak mevcut olan (http://www.bioscand.se/nri/) elektronik excel tablosu kullanılmıştır (Kronvall, 2010; Ngo ve ark., 2017). 3.6. Antimikrobiyal direnç genleri Flavobacterium türlerinde antimikrobiyal direnç genlerinin belirlenmesinde floR, tetA, tetB, tetC, tetE, tetH, tetM, tetL, sul1, sul2 ve sul3, gyrA, gyrB, parC, parE qnrA, qnrB ve qnrS gen bölgeleri incelenmiştir. İncelenen direnç genlerinin amplifikasyonunda Tablo 6’da verilen primerler ve PCR koşulları kullanılmıştır. PCR master miksi; 2,5 µl 10x PCR Buffer, 2,5 µl 5x Q-Solution, 0,5 µl 0,2 mM dNTP mix (Her bir bazdan 10 mM), her bir primerden 1µl, 1 µl 25 mM MgCl2, 0,125 µl HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen, Almanya), 20-ng DNA template ve DNase⁄RNase-Free Distile su içerecek şekilde 25 µl hazırlanmıştır. PCR ile amplifikasyon sonucunda herbir direnç geni için tablo 6’da uzunluğu verilen spesifik bantların görüntülenmesi pozitif sonuç olarak değerlendirilmiştir. Pozitif sonuç veren PCR ürünlerinin pürifikasyonu ve dizi analizleri (çift yönlü, sanger metodu) hizmet alımı ile yapılmıştır. Dizi analizi sonucunda elde edilen nükleotid profilleri BLAST’a girilerek referans profillerle karşılaştırılmıştır. 43 Tablo 6. Hedef direnç gen bölgelerine ait primer dizileri ve PCR protokolleri Primer Amplikon Primer dizisi Pcr koşulları Kaynak ismi büyüklüğü 94°C 4 dk 94°C 30 sn F. 5’-TATCTCCCTGTCGTTCCAG-3’ floR 399 bp 55°C 30 sn X30 Van ve ark., 2008 R. 5’-AGAACTCGCCGATCAATG-3’ 72°C 1 dk 72°C 7 dk 94°C 3 dk 94°C 30 sn F. 5’- GTAATCTGAGCACTGTCGC -3’ Akinbowale ve tetA 937 bp 53°C 40 sn X30 R. 5’- CTGCCTGGACAACATTGCTT -3’ 72°C 1 dk ark., 2007 72°C 10 dk 94°C 5 dk 94°C 1 dk F. 5’- GCGCGATCTGGTTCACTCG -3’ Akinbowale ve tetA 164 bp 55°C 1 dk X30 R. 5’- AGTCGACAGYRGCGCCGGC -3’ 72°C 1 dk ark., 2007 72°C 10 dk 95°C 5 dk 95°C 30 sn F. 5’- CGTTTGCTTTCAGGGATCA -3’ Stine ve ark., tetB 437 bp 50°C 45 sn X30 R. 5’- ACCATCATGCTATTCCATCC -3’ 72°C 1 dk 2008 72°C 10 dk 95°C 4dk 95°C 30sn F. 5’- GCGGGATATCGTCCATTCCG -3’ tetC 56°C 45sn X30 Aminov ve ark., R. 5’- 207 bp GCGTAGAGGATCCACAGGACG -3’ 72°C 1 dk 2002 72°C 10 dk 95°C 4 dk 95°C 30 sn F. 5’-GTGATGATGGCACTGGTCAT-3’ tetE 1179 bp 53°C 50 sn X30 Akinbowale ve R 5’-CTCTGCTGTACATCGCTCTT-3’ 72°C 1 dk ark., 2007 72°C 10 dk 94°C 4 dk 94°C 30 sn F. 5’- ATACTGCTGATCACCG -3’ 45°C 40 sn X30 Akinbowale ve tetH 1076 bp R. 5’ - TCCCAATAAGCGACGC -3’ 72°C 70 sn ark., 2007 72°C 10 dk 94°C 4 dk 94°C 30 sn F. 5’- GATTGGAGTTCTTTGTGGGG -3’ 52°C 30 sn X30 Stine ve ark., tetL 434 bp R. 5’ - CAATTGCAATACCTGTTCCC -3’ 72°C 1 dk 2008 72°C 7 dk 94°C 3 dk 94°C 30 sn F. 5’- ACAGAAAGCTTATTATATAAC -3’ Aminov ve ark., tetM 171 bp 48°C 40 sn X30 R. 5’- TGGCGTGTCTATGATGTTCAC -3’ 72°C 1 dk 2001 72°C 10 dk 95°C 5 dk 95°C 45 sn F. 5’-GTTAAATAGTGTTCTTGGAG-3’ Akinbowale ve tetM 656 bp 46°C 45 sn X30 R. 5’-CTAAGATATGGCTCTAACAA-3’ 72°C 1 dk ark., 2007 72°C 7 dk 94°C 4dk 94°C 30sn F. 5’-CGGCGTGGGCTACCTGAACG-3’ Wang ve ark., sul1 433 bp 55°C 30sn X30 R 5’-GCCGATCGCGTGAAGTTCCG-3’ 72°C 1dk 2014 72°C 7dk 44 Tablo 6’nın devamı 94°C 4 dk 94°C 30 sn F. 5’-GCGCTCAAGGCAGATGGCATT-3’ Wang ve ark., sul2 293 bp 55°C 30 sn X30 R 5’-GCGTTTGATACCGGCACCCGT-3’ 2014 72°C 1 dk 72°C 7 dk 94°C 5dk 94°C 30sn F. 5’-TCAAAGCAAAATGATATGAGC-3’ Wang ve ark., sul3 787 bp 52°C 30sn X30 R 5’-TTTCAAGGCATCTGATAAAGAC-3’ 2014 72°C 1dk 72°C 7dk 94°C 4 dk F. 5’- 94°C 30 sn GAAACCGGTGCACAGAAGG -3’ Shah ve ark., gyrA 395 bp 55°C 30 sn X30 R 5’- CCTGTGGCTCCGTTTATTAA -3’ 2012b 72°C 1 dk 72°C 7 dk 95°C 3 dk Shah ve ark., 95°C 30 sn 2012b F. 5’- AGATAACGGACGTGGTATTCC -3’ gyrB 1669 bp 58°C 45 sn X30 R 5’- TACGAGGCGGAACCTCATCTC -3’ 72°C 70 sn 72°C 10 dk 95°C 3 dk Shah ve ark., 95°C 30 sn 2012b F. 5’- ACACTATTAGGCGAGATATCA -3’ ParC 987 bp 58°C 45 sn X30 R 5’- CCGCCACGCAAACCATCGT -3’ 72°C 70 sn 72°C 10 dk 95°C 3 dk Shah ve ark., 95°C 30 sn 2012b F. 5’- ATGTAAATACCCAAGCCGTGT -3’ ParE 740 bp 58°C 45 sn X30 R 5’- CTGAGAAACCTCAAAGGCT -3’ 72°C 70 sn 72°C 10 dk 95°C 3 dk Shah ve ark., 95°C 30 sn 2012b F. 5’- TGCAGGAAATCTTACACTCG -3’ ParE1 1014 bp 58°C 45 sn X30 R 5’- GTTGCAATTACAATGTTGT -3’ 72°C 70 sn 72°C 10 dk 94°C 3 dk Shah ve ark., 94°C 30 sn 2012b F. 5’- TCAGCAAGAGGATTTCTCA -3’ qnrA 627 bp 55°C 30 sn X30 R 5’- GGCAGCACTATTACTCCCA -3’ 72°C 1 dk 72°C 7 dk 94°C 4 dk Shah ve ark., 94°C 30 sn 2012b F. 5’- GATCGTGAAAGCCAGAAAGG-3’ qnrB 469 bp 53°C 30 sn X30 R 5’- ACGATGCCTGGTAGTTGTCC -3’ 72°C 1 dk 72°C 7 dk 94°C 3 dk Shah ve ark., 94°C 30 sn 2012b F. 5’- ACGACATTCGTCAACTGCAA -3’ qnrS 417 bp 55°C 30 sn X30 R 5’- TAAATTGGCACCCTGTAGGC -3’ 72°C 1 dk 72°C 7 dk 45 4. BULGULAR 4.1. Bakteri izolatları Tez çalışmasında Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Su Ürünleri Hastalıkları Anabilim Dalı Laboratuvarı kültür koleksiyonunda yer alan 109 adet Flavobacterium spp. izolatlarının yanı sıra ve 5 adet Flavobacterium psychrophilum referans izolatı kullanılmıştır. Çalışmada kullandığımız izolatların izole edildiği bölge, konakçı, konakçı ağırlığı ve yıllara göre dağılımları Şekil 2-6’de verilmiştir. Şekil 2. Çalışmada kullanılan Flavobacterium spp. izolatlarının bölgesel dağılımları Şekil 3. Çalışmada kullanılan Flavobacterium psychrophilum izolatlarının bölgesel dağılımları 46 Gökkuşağı Alabalığı %89 Anadolu/Dağ Alabalığı %6 Kaynak Alabalığı %2 Karadeniz Alabalığı %1 Çoruh Alabalığı %1 Sazan %1 Şekil 4. Çalışmada kullanılan Flavobacterium izolatlarının izole edildiği konakçıya göre dağılımları 2013 5% 2014 2017 27% 46% 2015 22% Şekil 5. Çalışmada kullanılan Flavobacterium izolatlarının izole edildiği yıllara göre dağılımları 7% 6% 7% 0,1-2 g 17% 63% 3-20 g 21-200 g Anaç Sperm/Yumurta Şekil 6. Çalışmada kullanılan Flavobacterium izolatlarının izole edildikleri balık ağırlığına göre dağılımları 47 4.2. Flavobacterium izolatlarının moleküler identifikasyonu 4.2.1. PCR ile identifikasyon 4.2.1.1. F. psychrophilum’un dubleks PCR ile identifikasyonu F.psychrophilum’un dupleks PCR ile identifikasyonunu; gyrA ve gyrB bölgesine spesifik primerler kullanılarak yapılmıştır. gyrA bölgesi için 396 bp, gyrB bölgesi için ise 1017 bp uzunuğunda bantlar pozitif olarak değerlendirilmiştir (Şekil 7). 1017 bp 396 bp Şekil 7. Flavobacterium psychrophilum’un dupleks PCR ile identifikasyonunu (M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500). 4.2.1.2. Flavobacterium spp. türlerinin PCR ile amplifikasyonu Klasik testlerle Flavobacterium spp. olarak ön identifikasyonu yapılan izolatların PCR ile amplifikasyonunda 1465 bp uzunluğundaki bantların görülmesi izolatlarının amplifikasyonu için pozitif olarak değerlendirilmiştir (Şekil 8). 1465 bp Şekil 8. Flavobacterium spp. Türlerinin PCR ile Amplifikasyonu (M: Marker 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500) 48 4.2.2 Flavobacterium spp.’nin dizi analizi PCR analizi sonucunda 1465 bp uzunluğunda bant veren PCR ürünlerinin saflaştırılması ve dizi analizi hizmet alımı vasıtasıyla yapılmıştır. İzolatlara ait identifikasyon bilgileri Tablo 7’de verilmiştir. Çalışmada kullanılan izolatların 16S rRNA bölgesinin dizi analizi ile identifikasyonlarına ait dağılımları Şekil 9’da verilmiştir. Tablo 7. Flavobacterium türlerinin dizi analizi İzolat İdent. oranı* İdentifikasyon İzolat İdent. oranı* İdentifikasyon F-5 99 F. branchiarum F-72 99 F. branchiarum F-6 99 F. branchiarum FP-73 99 F. psychrophilum F-10 99 F. branchiarum F-74 99 F. tiangeerense F-16 99 F. branchiicola F-75 98 F. collinsii F-18 99 F. branchiarum F-76 99 F. branchiarum F-19 97 F. spartansii F-77 99 F. hibernum F-23 99 F. branchiarum F-81 99 F. branchiarum FP-24 99 F. psychrophilum FP-82 99 F. psychrophilum F-25 99 F. succinicans F-83 99 F. tiangeerense F-27 99 F. hercynium F-84 99 F. spartansii, F-29 98 F. granuli F-85 99 F. branchiarum F-30 98 F. xueshanense FP-90 99 F. psychrophilum FP-34 99 F. psychrophilum F-91 99 F. branchiarum FP-37 99 F. psychrophilum F-92 99 F. branchiarum F-47 98 F. frigoris F-93 99 F. branchiarum F-57 99 F. oncorhynchi FP-94 99 F. psychrophilum F-58 98 F. frigidarium FP-95 99 F. psychrophilum F-59 99 F. succinicans F-96 99 F. branchiarum F-60 97 F. frigidarium F-97 99 F. branchiarum F-64 99 F. branchiarum FP-100 99 F. psychrophilum F-65 98 F. tiangeerense F-101 99 F. piscis F-67 99 F. branchiarum FP-102 99 F. psychrophilum F-68 98 F. tiangeerense F-106 94 F. granuli F-69 100 F. plurextorum FP-108 99 F. psychrophilum F-70 99 F. branchiicola FP-109 99 F. psychrophilum 49 Tablo 7’nin devamı *NCBI veritabanındaki en yakın referans sekans verisine oranı izolat İdent. oranı* İdentifikasyon İdent. oranı* İdentifikasyon FP-116 99 F. psychrophilum F-336 99 F. collinsii FP-120 99 F. psychrophilum F-337 99 F. tiangeerense F-122 99 F. terrigena F-338 98 F. tructae FP-123 99 F. psychrophilum F-339 97 F. xueshanense F-126 99 F. spartansii, F-340 98 F. pectinovorum F-129 99 F. succinicans F-341 99 F. succinicans F-130 99 F. oncorhynchi F-342 97 F. tructae F-131 97 F. tructae F-343 99 F. piscis F-135 99 F. branchiicola F-345 98 F. saccharophilum F-310 98 F. frigidimaris F-346 99 F. aquidurense FP-311 99 F. psychrophilum F-347 99 F. piscis FP-312 99 F. psychrophilum F-348 99 F. collinsii FP-313 99 F. psychrophilum F-349 99 F. hibernum FP-314 99 F. psychrophilum F-351 99 F. hercynium FP-315 99 F. psychrophilum F-352 99 F. hydatis F-319 99 F. branchiarum F-353 97 F. collinsii F-320 99 F. pectinovorum F-355 100 F. collinsii F-321 98 F. tiangeerense F-359 98 F. cutihirudinis F-322 95 F. antarcticum F-360 99 F. saccharophilum F-323 98 F. oncorhynchi F-361 99 F. collinsii F-324 97 F. glaciei F-362 98 F. succinicans F-325 99 F. tiangeerense F-363 96 F. antarcticum F-326 99 F. succinicans FP-367 99 F. psychrophilum F-327 98 F. pectinovorum FP-368 99 F. psychrophilum F-328 97 F. tructae FP-369 99 F. psychrophilum F-329 98 F. tiangeerense F-370 99 F. reichenbachii F-331 99 F. tiangeerense F-371 99 F. reichenbachii F-333 99 F. hercynium F-372 98 F. terrigena F-334 98 F. pectinovorum FP-374 99 F. psychrophilum FP-335 99 F. psychrophilum 30 25 25 20 17 15 10 9 5 6 6 4 4 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 2 2 0 1 1 1 1 1 1 1 Şekil 9. 16S rRNA bölgesinin dizi analizi ile identifiye edilen Flavobacterium izolatlarının dağılımları 50 4.3. Moleküler karakterizasyon 4.3.1. F. psychrophilum’un restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi PCR-RFLP analizi F. psychrophilum izolatlarının RFLP analizine ilişkin sonuçlar Şekil 10-15 ve tablo 8’de verilmiştir. Amplifikasyonu yapılan gyrA bölgesinin Mph1103I enzimi ile kesimi sonrasında tüm izolatlar %100 duyarlılık ile tek bir genetik grupta toplanmıştır. Referans izolatlarda dahil olmak üzere tüm izolatlar 396 bp uzunluğunda tek bir bant vermiştir. Elde edilen sonuçlara ilişkin dendogram Şekil 10’da verilmiştir. Şekil 10. F. psychrophilum izolatlarının gyrA bölgesinin Mph1103I enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 51 Amplifikasyonu yapılan gyrB bölgesinin RsaI enzimi ile kesimi sonrasında tüm izolatlar %82,8 duyarlılık sınırı ile “R” ve “S” olmak üzere 2 genetik gruba ayrılmıştır. R genotipindeki izolatlar 327 ve 429 bp, S genotipindekiler ise 367 ve 429 bp uzunluğunda bantlar vermiştir. Sonuçlar ve yapılan filogenetik analiz Şekil 11’de gösterilmiştir. Şekil 11. F. psychrophilum izolatlarının gyrB bölgesinin RsaI enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 52 Amplifikasyonu FP1 ve FP2 primerleri ile yapılan 16S rRNA bölgesinin AluI ve TaqI enzimleri ile ayrı ayrı kesilmesi sonrasında %80 duyarlılık sınırına göre 2 genetik gruba ayrılmıştır. AluI enzimi ile kesim sonrası A-I genotipi 220 ve 350 bp uzunluğunda bant verirken A-II genotipi 220-350 ve 580 bp uzunluğunda 3 bant vermiştir. Taq enzimi ile kesim sonrası T-I genotipi 320 ve 750 bp uzunluğunda bant verirken T-II genotipi 320-410 ve 750 bp uzunluğunda 3 bant vermiştir. Elde edilen bu sonuçlara göre yapılan filogenetik analize ait dendogramlar Şekil 12-13’de gösterilmiştir. Şekil 12. F. psychrophilum izolatlarının 16S rRNA bölgesinin AluI enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 53 Şekil 13. F. psychrophilum izolatlarının 16S rRNA bölgesinin TaqI enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram Amplifikasyonu 337F ve 587R primerleri ile yapılan 16S rRNA bölgesinin MnII enzimi ile kesimi sonrasında %80 duyarlılık sınırına göre 3 genetik gruba 54 ayrılmıştır. MnII enzimi ile kesim sonrası Lin-I genotipi enzimle kesilmemiş 194 bp uzunluğunda bantın yanı sıra 62 ve 105 bp uzunluğunda 3 bant, Lin-II genotipi enzimle kesilmemiş 194 bp uzunluğunda 1 bant ve Lin-III ise enzimle kesilmemiş 194 bp uzunluğunda bantın yanı sıra ve 85 bp uzunluğunda 2 bant vermiştir. Elde edilen sonuçlar değerlendirilerek yapılan filogenetik analiz Şekil 14’te verilmiştir. Şekil 14. F. psychrophilum izolatlarının 16S rRNA bölgesinin MnII enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 16S rRNA bölgesini AluI, TaqI ve MnII enzimleri, gyrB bölgesinin de RsaI enzimi ile kesimi ile oluşturulan RFLP profillerinin ortalama benzerlik bağlantısı kullanılarak yapılan filogenetik analizinde 89,5 duyarlılık sınırına göre 3 genetik gruba ayrıldığı görülmüştür. Filogenetik analiz neticesinde oluşturulan dendogram Şekil 15’te verilmiştir. 55 Şekil 15. F. psychrophilum izolatlarının 16S rRNA ve gyrB bölgesinin RFLP profillerinin ortalama benzerlik bağlantıları analiz edilerek oluşturulan akrabalık ilişkilerine ait dendogram. 56 Tablo 8. F. psychrophi lum izolatlarının PCR- RFLP ile tiplendirilmesi RFLP İzolat Konakçı Coğrafik gyrB 16S 16S 16S Ortak Bölge RsaI rRNA rRNA rRNA RFLP TaqI AluI MnII Profili* FP-24 R.T İç Anadolu S T-I A-I Lin-III RFLP-III-b FP-34 R.T Marmara S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-37 R.T Karadeniz S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-73 R.T İç Anadolu S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-82 R.T İç Anadolu S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-90 R.T Ege S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-94 R.T İç Anadolu S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-95 R.T Ege S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-100 R.T İç Anadolu S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-102 R.T İç Anadolu S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-108 R.T Ege S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-109 R.T Ege S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-116 R.T Ege S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-120 R.T Ege S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-123 R.T Doğu S T-I A-I Lin-II RFLP-I Anadolu FP-311 R.T Ege R T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-312 R.T Ege S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-313 R.T Ege R T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-314 R.T Ege R T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-315 R.T Ege S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-335 R.T Ege S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-367 R.T İç Anadolu S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-368 R.T İç Anadolu S T-I A-I Lin-II RFLP-I FP-369 S.C Karadeniz S T-II A-I Lin-II RFLP-II FP-374 S. F Karadeniz- S T-II A-I Lin-II RFLP-II NCIMB R.T Danimarka R T-I A-I Lin-II RFLP-I 13383 NCIMB R.T Danimarka R T-I A-I Lin-II RFLP-I 13384 NCIMB C.S Amerika S T-I A-II Lin-I RFLP-III-a 1947 NCIMB C.S Amerika S T-I A-II Lin-I RFLP-III-a 2282 ATCC R.T Fransa S T-I A-I Lin-II RFLP-I 49511 (JIP02/8 6) * F. psychrophilum izolatlarının 16S rRNA ve gyrB bölgelerinin RFLP profillerinin filogenetik analizi neticesinde elde edilen ortak RFLP profili, R.T: Gökkuşağı alabalığı, S.T.M: Anadolu/dağ alabalığı (Salmo trutta macrostigma), S.F: Kaynak Alabalığı (Salvelinus fontinalis), S.L: Karadeniz Alabalığı (Salmo trutta labrax), S.C: Çoruh Alabalığı (Salmo coruhensis), C.S: Koho salmon (Oncorhynchus kisutch) 57 4.3.2. Flavobacterium spp.’nin restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi PCR- RFLP analizi Flavobacterium spp. izolatlarının 16S rRNA gen bölgesini çoğaltan FvpF1- FvpR1 primer çifti kullanılarak yapılan RFLP analizi sonuçlarına ait veriler Tablo 9 ve Şekil 16-22’de verilmiştir. RFLP analizinde:  MspI enzimi ile kesilmesi sonrasında %80 duyarlılık sınırına göre;  M-I genotipi 320 ve 430 bp,  M-II genotipi 101, 430 ve 653 bp,  M-III genotipi 450 bp,  M-IV genotipi 410 ve 653 bp,  M-V genotipi 410 ve 770 bp,  M-VI genotipi 390 ve 770 bp  M-VII genotipi 410 ve 750 bp uzunluğunda bantlar vererek 7 genetik gruba ayrılmıştır (Şekil 16).  AluI enzimi ile kesilmesi sonrasında %80 duyarlılık sınırına göre;  A-I genotipi 220 ve 350 bp,  A-II genotipi 220, 350 ve 580 bp,  A-III genotipi 200 ve 700 bp,  A-IV genotipi 220 ve 580 bp uzunluğunda bantlar vererek 4 genetik gruba ayrılmıştır (Şekil 17).  CfoI enzimi ile kesilmesi sonrasında %85,7 duyarlılık sınırına göre;  C-I genotipi 234 ve 690 bp,  C-II genotipi 234, 453 ve 690 bp,  C-III genotipi 234, 453, 690 ve 950 bp,  C-IV genotipi 234, 690, 950 ve 1193 bp,  C-V genotipi 234 ve 950 bp, 58  C-VI genotipi 234 ve 453 bp uzunluğunda uzunluğunda bantlar vererek 6 genetik gruba ayrılmıştır (Şekil 18).  HaeIII enzimi ile kesilmesi sonrasında %74,3 duyarlılık sınırına göre;  H-I genotipi 300 ve 480 bp,  H-II genotipi 300 ve 350 bp,  H-III genotipi 1193 bp uzunluğunda bant/bantlar vererek 3 genetik gruba ayrılmıştır (Şekil 19).  Taq enzimi ile kesilmesi sonrasında %69,7 duyarlılık sınırına göre;  T-I genotipi 370 ve 750 bp,  T-II genotipi 370 ve 670 bp,  T-III genotipi 220 ve 750 bp uzunluğunda bantlar vererek 3 genetik gruba ayrılmıştır (Şekil 20).  HinfI enzimi ile kesilmesi sonrasında %80,5 duyarlılık sınırına göre;  Hn-I genotipi 120 ve 500 bp,  Hn-II genotipi 80, 120 ve 500 bp,  Hn-III genotipi 120 ve 570 bp,  Hn-IV genotipi 120, 500 ve 570 bp,  Hn-V genotipi 300 bp uzunluğunda bant/bantlar vererek 5 genetik gruba ayrılmıştır (Şekil 21). Flavobacterium spp. izolatlarının 16S rRNA bölgesinin MspI, AluI, CfoI, HaeIII, TaqI ve HinfI enzimleri ile ayrı ayrı kesimi sonucunda ortaya çıkan RFLP profillerinin, ortalama benzerlik bağlantısı kullanılarak yapılan filogenetik analiz neticesinde % 89,4 duyarlılık sınırına göre 8 genetik gruba ayrıldığı görülmüştür (Şekil 22). 59 Şekil 16. Flavobacterium spp. izolatlarının 16S rRNA bölgesinin MspI enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 60 Şekil 17. Flavobacterium spp. izolatlarının 16S rRNA bölgesinin AluI enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 61 Şekil 18. Flavobacterium spp. izolatlarının 16S rRNA bölgesinin CfoI enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 62 Şekil 19. Flavobacterium spp. izolatlarının 16S rRNA bölgesinin HaeIII enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 63 Şekil 20. Flavobacterium spp. izolatlarının 16S rRNA bölgesinin TaqI enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 64 Şekil 21. Flavobacterium spp. izolatlarının 16S rRNA bölgesinin HinfI enzimi ile kesimi sonrasında akrabalık ilişkilerine ait dendogram 65 Şekil 22. Flavobacterium spp. izolatlarının 16S rRNA bölgesinin RFLP profillerinin ortalama benzerlik bağlantıları analiz edilerek oluşturulan akrabalık ilişkilerine ait dendogram. 66 Tablo 9. Flavobacterium spp. izolatlarının PCR- RFLP ile tiplendirilmesi İzolat No Balık Bölge 16S rRNA RFLP Türü MspI AluI CfoI HaeIII TaqI HinfI Ortak RFLP Tipi F-5 R.T. Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-6 R.T. Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-10 R.T. Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-16 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-III K-II F-18 R.T. Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-19 R.T. Doğu Anadolu M-I A-IV C-V H-I T-I Hn-I K-IV F-23 R.T. Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib FP-24 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-25 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-III H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-27 R.T. Akdeniz M-IV A-III C-I H-I T-I Hn-I K-IV F-29 R.T. Akdeniz M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-30 R.T. Akdeniz M-I A-IV C-I H-I T-I Hn-I K-III-a FP-34 R.T. Marmara M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-37 R.T. Karadeniz M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-47 R.T. İç Anadolu M-III A-III C-I H-I T-I Hn-I K-V F-57 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-58 R.T. Ege M-III A-IV C-I H-I T-I Hn-I K-III-b F-59 R.T. Ege M-I A-I C-VI H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-60 R.T. Ege M-III A-IV C-I H-I T-I Hn-I K-III-b F-64 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-65 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-67 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-68 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-69 R.T. Ege M-I A-I C-V H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-70 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-II K-Ib F-72 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib FP-73 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-74 R.T. Ege M-II A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-75 R.T. Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-III K-Ib F-76 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-77 R.T. İç Anadolu M-IV A-IV C-I H-I T-I Hn-I K-III-b F-81 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib FP-82 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-83 R.T. Ege M-II A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-84 R.T. Ege M-I A-I C-V H-I T-I Hn-I K-Ia-y F-85 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib FP-90 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-91 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-92 R.T. Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib 67 Tablo 9’un Devamı İzolat No Balık Bölge 16S rRNA RFLP Türü Msp AluI Cfo Hae Taq Hinf I Ortak III RFLP Tipi F-93 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib FP-94 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-95 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-96 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-97 R.T. İç Anadolu M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib FP-100 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-101 R.T. İç Anadolu M-II A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib FP-102 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-106 R.T. Marmara M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-108 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-109 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-116 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-120 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-122 R.T. Ege M-V A-IV C-I H-I T-I Hn-IV K-III-b FP-123 R.T. Doğu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x Anadolu F-126 R.T. Marmara M-I A-IV C-I H-I T-I Hn-IV K-III-a F-129 R.T. Marmara M-IV A-I C-VI H-III T-I Hn-I K-VII F-130 R.T. Marmara M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-131 R.T. Marmara M-I A-I C-V H-I T-I Hn-I K-Ia-y F-310 R.T. Ege M-IV A-IV C-I H-I T-II Hn-I K-III-b FP-311 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-312 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-313 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-314 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-315 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-319 R.T. Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-320 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-321 R.T. Ege M-I A-IV C-VI H-I T-III Hn-III K-VIII F-323 R.T. Ege M-I A-I C-II H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-324 R.T. Ege M- A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib VII F-325 R.T. Ege M-II A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-326 R.T. Ege M-II A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-327 S.T.M Ege M-I A-I C-VI H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-328 R.T. Ege M-I A-I C-V H-I T-I Hn-I K-Ia-y F-329 R.T. Ege M-II A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-331 R.T. Ege M-II A-IV C-I H-I T-I Hn-I K-III-a F-333 S.T.M Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-333 S.T.M Ege M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib 68 Tablo 9’un Devamı İzolat No Balık Bölge 16S rRNA RFLP Türü Msp AluI Cfo Hae Taq Hinf I Ortak III RFLP Tipi F-334 S.T.M. Ege M-I A-I C-VI H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-335 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-336 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-II K-Ia-x F-337 R.T. Ege M-II A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-338 R.T. Ege M-I A-I C-V H-I T-I Hn-I K-Ia-y F-339 R.T. Ege M-I A-I C-V H-I T-I Hn-I K-Ia-y F-340 S.T.M. Ege M-I A-I C-VI H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-341 R.T. Ege M-I A-I C-III H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-342 R.T. Ege M-I A-I C-V H-I T-I Hn-I K-Ia-y F-343 R.T. Ege M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-345 R.T. Karadeniz M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-346 S.F. Karadeniz M-IV A-IV C-I H-I T-I Hn-I K-III-b F-347 S.L. Karadeniz M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-348 R.T. Karadeniz M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-349 S.T.M. Karadeniz M-IV A-IV C-I H-I T-I Hn-I K-III-b F-351 R.T. Karadeniz M-I A-III C-I H-I T-I Hn-I K-IV F-352 R.T. Karadeniz M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-353 S.T.M. Karadeniz M-I A-I C-V H-I T-I Hn-IV K-Ia-y F-355 R.T. Doğu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x Anadolu F-359 R.T. Karadeniz M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-III K-II F-360 R.T. Karadeniz M-IV A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ib F-361 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-362 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-VI H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-363 Sazan İç Anadolu M-I A-III C-V H-I T-II Hn-V K-VI FP-367 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-368 R.T. İç Anadolu M-I A-I C-IV H-I T-I Hn-I K-Ia-x FP-369 S.C. Karadeniz M-I A-II C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x F-370 S.T.M. Karadeniz M-I A-IV C-I H-I T-I Hn-I K-III-a F-371 R.T. Karadeniz M-I A-IV C-I H-I T-I Hn-I K-III-a F-372 R.T. Karadeniz M-VI A-IV C-I H-II T-I Hn-I K-III-a FP-374 S.F. Karadeniz M-I A-II C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x NCIMB R.T. Denmark M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x 13383 NCIMB R.T. Denmark M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x 13384 NCIMB C. S. USA M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x 1947 NCIMB C.S. USA M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x 2282 ATCC R.T. France M-I A-I C-I H-I T-I Hn-I K-Ia-x 49511 R.T: Gökkuşağı alabalığı, S.T.M: Anadolu/dağ alabalığı (Salmo trutta macrostigma),S.F: Kaynak Alabalığı (Salvelinus fontinalis), S.L: Karadeniz Alabalığı (Salmo trutta labrax),S.C: Çoruh Alabalığı (Salmo coruhensis), C.S: Koho Salmon 69 4.4. Antimikrobiyal duyarlılık konsantrasyonlarının belirlenmesi 4.4.1. Disk difüzyon F. psychrophilum izolatlarının antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesinde %5 FDS eklenmiş DMHA kullanılarak 18°C’de 96 saat inkube edilmiş ve inkübasyon sonrası zon çapları ölçülmüştür. Antimikrobiyallere karşı direnç gelişiminin belirlenmesinde EUCAST ve CLSI’nın önerdiği Normalize Edilmiş Yorumlama (NIR) metodu kullanılmıştır. Epidemiyolojik eşik değerleri (cut-off) belirlenerek Flavobacterium spp. izolatları WT) ve N-WT) olarak sınıflandırılmıştır. F. psychrophilum’un amoksisiline karşı epidemiyolojik eşik değeri 47mm olarak bulunmuş olup zon çapı 47 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 47 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların tümünün amoksisiline karşı duyarlı olduğu tespit edilmiştir (Şekil 23). Flavobacterium psychrophilum AML 30 µg 25 20 15 10 5 0 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 Zon Çapları (mm) Şekil 23. F. psychrophilum izolatlarının amoksisiline (30 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. F. psychrophilum’un eritromisine karşı epidemiyolojik eşik değeri 31mm olarak bulunmuş olup zon çapı 31 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 31 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %40’ının N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 24). 70 İzolatların Yüzdesi (%) Flavobacterium psychrophilum ERM 15μg 20 15 10 5 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 Zone Çapları (mm) Şekil 24. F. psychrophilum izolatlarının eritromisine (15 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. F. psychrophilum’un enrofloksasine karşı epidemiyolojik eşik değeri 55 mm bulunmuş olup zon çapı 55 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 55 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %88’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 25). Flavobacterium psycrhophilum ENR 5µg 30 25 20 15 10 5 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 Zone Çapları (mm) Şekil 25. F. psychrophilum izolatlarının enrofloksasine (5 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. F. psychrophilum’un oksalinik asit karşı epidemiyolojik eşik değeri 27 mm bulunmuş olup zon çapı 27 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 27 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %88’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 26). 71 İzolatların Yüzdesi (%) İzolatların Yüzdesi (%) Flavobacterium psychrophilum OA 2µg 80 60 40 20 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 Zon Çapları (mm) Şekil 26. F. psychrophilum izolatlarının oksalinik asite (2 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. F. psychrophilum’un florfenikol’e karşı epidemiyolojik eşik değeri 52 mm bulunmuş olup zon çapı 52 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 52 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %28’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 27). Flavobacterium psychrophilum FFC 30 µg 14 12 10 8 6 4 2 0 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 Zone Çapları (mm) Şekil 27. F. psychrophilum izolatlarının florfenikole (30 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. F. psychrophilum’un oksitetrasiklin’e karşı epidemiyolojik eşik değeri 53 mm bulunmuş olup zon çapı 53 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 53 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %68’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 28). 72 İzolatların Yüzdesi (%) İzolatların Yüzdesi (%) Flavobacterium psychrophilum OT 30µg 15 10 5 0 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 Zon Çapları (mm) Şekil 28. F. psychrophilum izolatlarının oksitetrasikline (30 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. F. psychrophilum’un sulfamethoksazol + trimetoprim (19:1)’e karşı epidemiyolojik eşik değeri 24 mm bulunmuş olup zon çapı 24 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 24 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %88’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 29, Tablo 10). Flavobacterium psychrophilum SXT 25µg 80 70 60 50 40 30 20 10 0 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 Zon Çapları (mm) Şekil 29. F. psychrophilum izolatlarının sulfamethoksazol + trimetoprim (25 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. 73 İzolatların Yüzdesi (%) İzolatların Yüzdesi (%) Tablo 10. Çalışmada kullanılan antimikrobiyallere karşı disk difüzyon testinde F. psychrophilum izolatlarının duyarlılıkları Antimikrobiyal Epidemiyolojik Duyarlılık Duyarlı Tip (WT) Duyarlılığı azalan Tip (N-WT) Sınırı (WT ≥ mm) AML ≥ 47 25 (% 100) 0 (%0) ERM ≥ 31 15 (% 60) 10 (% 40) FFC ≥ 52 18 (% 72) 7 (% 28) ENR ≥ 55 3 (% 12) 22 (% 88) OA ≥ 27 3 (% 12) 22 (% 88) OT ≥ 53 8 (% 32) 17 (% 68) SXT ≥ 24 3 (% 12) 22 (% 88) Flavobacterium spp. izolatlarının antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesinde DMHA kullanılmış ve 22°C’de 48 saat inkube edilmiştir. Flavobacterium spp.’nin amoksisiline karşı epidemiyolojik eşik değeri 17mm bulunmuş olup zon çapı 17 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 17 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %18’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 30). Flavobacterium spp. AML 30 µg 20 15 10 5 0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Zon Çapları (mm) Şekil 30. Flavobacterium spp. izolatlarının amoksisiline (30 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. Flavobacterium spp.’nin eritromisine karşı epidemiyolojik eşik değeri 21mm bulunmuş olup zon çapı 21 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 21 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %53’ünün N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 31). 74 İzolatların Yüzdesi (%) Flavobacterium spp. ERM 15μg 25 20 15 10 5 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 Zone çapları(mm) Şekil 31. Flavobacterium spp. izolatlarının eritromisine (15 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. Flavobacterium spp.’nin enrofloksasine karşı epidemiyolojik eşik değeri 47 mm bulunmuş olup zon çapı 47 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 47 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %68’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 32). Flavobacterium spp. ENR 5µg 14 12 10 8 6 4 2 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 Zon Çapları (mm) Şekil 32. Flavobacterium spp. izolatlarının enrofloksasine (5 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. 75 İzolatların Yüzdesi (%) İzolatların Yüzdeleri (%) Flavobacterium spp.’nin oksalinik asit karşı epidemiyolojik eşik değeri 25 mm bulunmuş olup zon çapı 25 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 25 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %72’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 33). Flavobacterium spp. OA 2µg 20 15 10 5 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Zon çapları (mm) Şekil 33. Flavobacterium spp. izolatlarının oksalinik asite (2 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. Flavobacterium spp.’nin florfenikol’e epidemiyolojik karşı eşik değeri 37 bulunmuş olup zon çapı 37 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 37 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %86’nın N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 34). Flavobacterium spp. FFC 30 µg 25 20 15 10 5 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 Zone Çapları (mm) Şekil 34. Flavobacterium spp. izolatlarının florfenikole (30 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. 76 İzolatların Yüzdesi (%) İzolatların Yüzdesi (%) Flavobacterium spp.’nin oksitetrasiklin’e karşı epidemiyolojik eşik değeri 36 mm bulunmuş olup zon çapı 36 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 36 mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %92’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 35). Flavobacterium spp. OT 30µg 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 Zone çapları (mm) Şekil 35. Flavobacterium spp. izolatlarının oksitetrasikline (30 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. Flavobacterium spp.’nin sulfamethoksazol + trimetoprim (19:1)’e karşı epidemiyolojik eşik değeri 18 mm bulunmuş olup zon çapı 18 mm’den büyük olan izolatlar duyarlı (WT), 18mm’den küçük olanlar ise duyarlılığı azalmış (N-WT) olarak gruplandırılmıştır. İzolatların %45’inin N-WT grubunda olduğu tespit edilmiştir (Şekil 36, Tablo 11). Flavobacterium spp. SXT 25µg 35 30 25 20 15 10 5 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Zone çapları (mm) Şekil 36. Flavobacterium spp. izolatlarının sulfamethoksazol + trimetoprim (30 µg) karşı oluşturdukları zon çaplarının oransal dağılımı. Dikey kesikli dik çizgi duyarlılık sınırını belirtmektedir. 77 İzolatların Yüzdesi (%) İzolatların Yüzdesi (%) Tablo 11. Çalışmada kullanılan antimikrobiyallere karşı disk difüzyon testinde Flavobacterium spp. izolatlarının duyarlılıkları Antimikrobiyal Epidemiyolojik Duyarlılık Duyarlı Tip (WT) Duyarlılığı azalan Tip (N-WT) Sınırı (WT ≥ mm) AML ≥ 17 69 (% 82) 15 (%18) ERM ≥ 21 31 (% 37) 53 (% 63) FFC ≥ 37 11 (% 24) 73 (% 86) ENR ≥ 47 27 (% 32) 57 (% 68) OA ≥ 25 24 (% 28) 60 (% 72) SXT ≥ 18 46 (% 55) 38 (%45) OT ≥ 36 7 (% 8) 77 (% 92) 4.4.2 Minimum inhibisyon konsantrasyonunun belirlenmesi (MİK) Flavobacterium spp. izolatlarının antimikrobiyallere karşı duyarlılıklarının MİK yöntemiyle belirlenmesinde EUCAST ve CLSI tarafından önerilen Normalize Edilmiş Yorumlama (NRI) metodu kullanılmıştır. F. psychrophilum ve Flavobacterium spp. izolatlarının NRI yöntemi ile belirlenen duyarlılık durumları ve MİK Değerleri sırasıyla Tablo 12 ve Tablo 13’de verilmiştir. 78 Tablo 12. F. psychrophilum izolatlarının MİK Değerleri ve duyarlılığı azalmış tiplerin (N-WT) oranları 0.008 0.016 0.032 0.064 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 64 128 Duyarlılık N- Sınırı WT ( µg/ml) oranı (%) β laktamlar AML 9 4 12 ≤ 0,0625 0 Makrolidler ERM 3 5 6 2 4 5 ≤ 8 20 Fenikoller FFC 7 8 6 4 ≤ 2 0 Kinolonlar ENRO 1 2 1 8 7 5 1 ≤ 0.03 88 OA 2 1 3 4 9 6 ≤ 0.25 88 Tetrasiklinler OT 3 2 2 1 2 3 8 4 ≤ 0,25 72 0.008/0.15 0.015/0.30 0.03/0.59 0.06/1.19 0.12/2.38 0.25/4.75 0.5/9.5 1/19 2/38 4/76 Duyarlılık N- Sınırı WT oranı *Sülfametoksazol + trimetoprim (19:1) SXT 2 3 9 9 2 ≤ 16/304 - 79 Tablo13. Flavobacterium spp. izolatlarının MİK Değerleri ve duyarlılığı azalmış tiplerin (N-WT) oranları 0.008 0.016 0.032 0.064 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 Duyarlılık N- Sınırı WT ( µg/ml) oranı (%) β laktamlar AML 6 12 16 10 3 15 8 3 2 4 5 ≤ 0,25 26 Makrolidler ERM 1 2 5 2 13 2 15 1 5 5 6 9 8 4 1 5 ≤ 0,25 70 Fenikoller FFC 3 3 4 1 3 4 6 9 14 13 11 9 4 ≤ 0,5 83 Kinolonlar ENRO 7 8 5 5 7 8 5 7 9 8 7 8 ≤ 0.0625 77 OA 1 9 9 5 8 8 5 7 6 5 7 6 5 3 ≤ 0.125 72 Tetrasiklinler OT 8 3 2 6 13 12 11 4 3 5 4 9 2 2 ≤ 0,0312 87 0.008/0.15 0.015/0.30 0.03/0.59 0.06/1.19 0.12/2.38 0.25/4.75 0.5/9.5 1/19 2/38 4/76 Duyarlılık N- Sınırı WT ( µg/ml) oranı (%) *Sülfametoksazol + trimetoprim (19:1) SXT 2 5 10 10 6 5 5 26 15 ≤ 0,25/4,75 54 80 4.5. Antimikrobiyal direnç genleri Bu çalışmada;  25 F. psychrophilum izolatından birinin floR, 4’ünün sul2 direnç geni taşıdığı,  84 Flavobacterium spp. Izolatından 11’inin floR, 23’ünün sul2 direnç geni taşıdığı belirlenmiştir (Şekil 37, 38).  tetA, tetB, tetC, tetE, tetH, tetM, tetL, sul1, sul3, qnrA, qnrB ve qnrS direnç genleri tespit edilememiştir. Direnç geni tespit edilen Flavobacterium türlerinin MİK değerleri ve fenotipik duyarlılık durumlarına (NW/ N-WT) ilişkin sonuçlar tablo 14’e verilmiştir. PCR ile tespit edilen direnç genlerinin doğrulaması dizi analizi ile yapılmıştır. Şekil 37. floR geni pozitif örnekler 399 bp (M; Marker; 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, --; negatif kontrol) Şekil 38. Sul2 geni pozitif örnekler 293 bp (M; Marker; 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500) F. psychrophilum izolatlarında kinolon direncinin belirlenmesi için; DNA Giraz (gyrA, gyrB) ve topoisomeraz IV (parC ve parE) gen bölgelerinde meydana 81 gelen kromozomal mutasyonlar dizi analizi ile belirlendikten sonra NCBI’da kayıtlı referans suşlarla karşılaştırması yapılmıştır (Tablo 15). Fenotipik olarak kinolon direnci saptanan izolatların %95’inde gyrA bölgesinde 244. ve/veya 245. nükleotidin mutasyona uğradığı buna bağlı olarak 82. amino asit olan treonin değişime uğrayarak arjinin, valin veya isolösine dönüştüğü, ancak fenotipik olarak dirençli olmasına rağmen FP-374 nolu izolatta ise gyrA bölgesinde herhangi bir mutasyon oluşmadığı görülmüştür. F. psychrophilum izolatların %92’sinin gyrB bölgesinde. 474, 528, 642, 927, 1053, 1176, 1326, 1371, 1407, 1413, 1431, 1452, 1455, 1458, 1464, 1473 ve 1476. nükleotidlerde mutasyon şekillenmesine rağmen amino asit değişimi (sessiz mutasyon) oluşmadığı belirlenmiştir. İzolatların %8’sinin parC bölgesinde 159, 426, 537 ve 540. nükleotidlerde sessiz mutasyon (amino asit değişimi olmadığı) tespit edilmiştir. Buna karşılık izolatların %18’inde parE bölgesinde 1795. nükleotidin mutasyona uğradığı ve 599. aminoasit olan aspartanın değişime uğrayarak asparagine dönüştüğü saptanmıştır. Tablo 14. Flavobacterium izolatlarının antimikrobiyal duyarlılığı ve tespit edilen direnç genleri İzolat no FFC Duyarlılık floR SXT Duyarlılık sul2 Durumu Durumu F-5 8 N-WT 0,12/2,38 + F-6 16 N-WT 0,25/4,75 + F-10 16 N-WT + 0,015/0,30 WT F-23 8 N-WT + 0,015/0,30 WT F-47 4 N-WT + 0,015/0,30 WT F-64 32 N-WT + 0,12/2,38 + F-65 32 N-WT 2/38 + F-67 64 N-WT + 2/38 + F-69 32 N-WT 1/19 + F-70 0,064 WT 0,12/2,38 + F-72 64 N-WT + 1/19 + F-74 128 N-WT 0,06/1,19 + F-76 128 N-WT + 2/38 + F-81 64 N-WT + 0,5/9,5 + FP-82 0,5 WT 2/38 + F-84 32 N-WT 0,03/0,59 + F-85 32 N-WT 0,03/0,59 + FP-90 0,5 WT 1/19 + F-92 16 N-WT 2/38 + F-93 16 N-WT + 0,12/2,38 + F-97 8 N-WT 2/38 + FP-100 2 WT + 4/76 + FP-116 1 N-WT 4/76 + FP-120 0,25 WT 1/19 + F-122 4 N-WT 1/19 + FP-123 0,5 WT 2/38 + F-130 32 N-WT 1/19 + F-135 4 N-WT + 1/19 + F-319 64 N-WT 1/19 + F-353 4 N-WT + 0,06/1,19 + W: Wild Tip, NW: Non- Wild Tip, 82 Tablo 15. F. psychrophilum izolatlarının kinolon grubu antimikrobiyallerine karşı duyarlılığı ve tespit edilen kromozomal mutasyonları İzolat no ENR Duyarlılık OA Duyarlılık gyrA gyrB ParC ParE Durumu Durumu FP-24 1 N-WT 16 N-WT K.M S.M FP-34 0.25 N-WT 8 N-WT K.M S.M FP-37 0.25 N-WT 8 N-WT K.M S.M FP-73 1 N-WT 8 N-WT K.M S.M FP-82 2 N-WT 16 N-WT K.M S.M FP-90 0.5 N-WT 8 N-WT K.M S.M FP-94 1 N-WT 16 N-WT K.M S.M FP-95 0.5 N-WT 16 N-WT K.M S.M FP-100 0.5 N-WT 8 N-WT K.M S.M FP-102 0.5 N-WT 8 N-WT K.M FP-108 0.5 N-WT 4 N-WT K.M S.M K.M FP-109 0.25 N-WT 8 N-WT K.M S.M FP-116 0.5 N-WT 16 N-WT K.M S.M K.M FP-120 0.25 N-WT 8 N-WT K.M S.M FP-123 0.5 N-WT 8 N-WT K.M S.M K.M FP-311 0.008 WT 0.125 WT S.M FP-312 1 N-WT 16 N-WT K.M S.M FP-313 0.016 WT 0.064 WT FP-314 0.016 WT 0.064 WT S.M FP-315 1 N-WT 4 N-WT K.M S.M FP-335 0.25 N-WT 4 N-WT K.M S.M K.M FP-367 0.25 N-WT 2 N-WT K.M S.M FP-368 0.25 N-WT 4 N-WT K.M S.M FP-369 0.25 N-WT 2 N-WT K.M S.M S.M FP-374 0.125 N-WT 2 N-WT S.M S.M WT; Duyarlı, N-WT; Duyarlılığı azalmış, KM; Kayıp Mutasyon, SM; Sessiz Mutasyon Sarı ile işaretli gruplarda 245. Nükleotidin değişmesinden dolayı 82. Amino asit Treonin’den arjinine dönmüştür. Yeşil ile işaretli gruplarda 244 ve 245.. Nükleotidlerin değişmesinden dolayı 82. Amino asit Threonine’den Valine dönmüştür. Turkuaz ile işaretli gruplarda 245. Nükleotidin değişmesinden dolayı 82. Amino asit Threonine’den Isolösin’e dönmüştür. Kırmızı ile işaretli gruplarda 1795. Nükleotidin değişmesinden dolayı 599. Amino asit Aspartate’dan Asparagine dönmüştür. 83 Tez çalışmasında tespit edilen direnç genlerinin dizi analizi yapılmış ve genbank (NCBI) veritabına kaydı yapılmıştır. Gen kaydına ait kayıt numaraları Tablo 16.’da verilmiştir. Tablo 16. Tez çalışmasında tespit edilen direnç genlerini Genbank kayıt numaraları İzolat gyrA gyrB parC parE floR Sul2 No F- 5 MG494266 F-6 MG494267 F-10 MG495145 F-23 MG495146 FP-24 MG495157 MG495180 MG495203 MG525554 FP-34 MG495158 MG495181 MG495204 MG525555 FP-37 MG495159 MG495182 MG495205 MG525556 F-47 MG495147 F-64 MG495148 MG494268 F-65 MG494269 F-67 MG495149 MG494270 F-69 MG494271 F-70 MG494272 F-72 MG495150 MG494273 FP-73 MG495160 MG495183 MG495206 MG525557 F-74 MG494274 F-76 MG495156 MG494275 F-81 MG495151 MG494276 FP-82 MG495161 MG495184 MG495207 MG525558 MG494277 F-84 MG494278 F-85 MG494279 FP-90 MG495162 MG495185 MG495208 MG525559 MG494280 F-92 MG494281 F-93 MG495152 MG494282 FP-94 MG495163 MG495186 MG495209 MG525560 FP-95 MG495164 MG495187 MG495210 MG525561 F-97 MG494283 FP-100 MG495165 MG495188 MG495211 MG525562 MG495153 MG494284 FP-102 FP-108 MG495166 MG495189 MG495212 MG525563 FP-109 MG495167 MG495190 MG495213 MG525564 FP-116 MG495168 MG495191 MG495214 MG525565 MG494285 FP-120 MG495169 MG495192 MG495215 MG525566 MG494286 F-122 MG494287 FP-123 MG495170 MG495193 MG495216 MG525567 MG494288 F-130 MG494289 F-135 MG495154 MG494290 FP-311 MG495171 MG495194 MG495217 MG525568 FP-312 MG495172 MG495195 MG495218 MG525569 FP-313 FP-314 MG495173 MG495196 MG495219 MG525570 FP-315 MG495174 MG495197 MG495220 MG525571 F-319 MG494300 FP-335 MG495175 MG495198 MG495221 MG525572 F-353 MG495155 MG494301 FP-367 MG495176 MG495199 MG495222 MG525573 FP-368 MG495177 MG495200 MG495223 MG525574 FP-369 MG495178 MG495201 MG495224 MG525575 FP-374 MG495179 MG495202 MG495225 MG525576 84 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Flavobacteriaceae familyasına mensup türler; tatlı ve tuzlu suda yaşayan balıklar başta olmak üzere, bitkiler (Bernardet ve Nakagawa, 2006), omurgasızlar (Li ve ark., 2010), amfibiler (Xie ve ark., 2009), sürüngenler (Hernandez-Divers ve ark., 2009), kuşlar (Segers ve ark., 1993) ve insanların da dahil olduğu (Benedetti ve ark., 2011) birçok (Haburjak ve Schubert, 1997) canlı organizma türünde hastalık vakalarından bildirilmiştir (Loch ve Faisal, 2015). Bu türlerin fenotipik identifikasyonda; morfolojik, fizyolojik, metabolik, biyokimyasal, kemotaksonomik özellikler (hücre duvarı bileşikleri, yağ asiti profili vb.), faj tiplendirme, yüzey antijenleri ve antimikrobiyal duyarlılık profilleri kullanılmaktadır. Flavobacterium türlerinin fenotipik olarak identifikasyonunda; farklı sıcaklıklarda üreme, koloni morfolojisi, karbonhidrat fermantasyonu, jelatin ve eskülin hidrolizi, kondroitinaz üretimi, oksidaz, katalaz, nitrat indirgenmesi, hidrojen sülfit üretimi, tuzluluk toleransı ve fleksirubin pigment varlığı gibi birçok testin yapılması gerekmektedir. Bu testlerin yapılabilmesi için ortalama 7-10 gün bir süre gerekmektedir. Ancak söz konusu fenotipik özelliklerinin aynı tür içerisinde heterojenite göstermeleri (spontan mutasyonlar ve kromazal farklıklar nedeniyle büyüme koşullarındaki değişimler) ve tekrarlanabilirliklerinin zayıf olması, fenotipik testlerle yapılan identifikasyoların güvenirliliğinin sorgulanmasına yol açmaktadır. Ayrıca Flavobacterium türlerinde biyokimyasal ve fenotipik testler için harcanan sürenin uzun olması ve belirli bir standardının olmaması gibi nedenler araştırmacıları daha hızlı ve güvenilir sonuçlar veren moleküler yöntemlere yöneltmektedir. Flavobacterium türlerinin dizi analizi ile yapılan identifikasyonda 16S rRNA ve DNA gyrase bölgeleri kullanılmaktadır. Ancak 16S rRNA bölgesi birbiri ile çok yakın ilişkili olan türlerin birbirinden ayrılmasında yeterli olmayabilir (Bernardet ve Nakagawa, 2006; Fox ve ark., 1992). Bu gibi durumda bakterinin farklı bir gen bölgesi veya bölgeleri kullanılarak (23S rDNA 16S+23S rDNA, gyrA ve gyrB) cins veya tür düzeyinde identifikasyon yapılabilmektedir. 85 Bu çalışmada 16S rRNA bölgesi kullanılarak yapılan dizi analizinde 109 Flavobacterium spp. izolatından 27 farklı Flavobacterium türü identifiye edilmiştir. Bu türler içerisinde; F. psychrophilum (%23), F. branchiarum (%15,5) ve F. tiangeerense (%8)’nın en yaygın türler olduğu tespit edilmiştir. Flavobacterium türleri başta salmonid balıklar olmak üzere birçok tatlı su balık türünden izole edildiği bildirilmiştir (Loch ve Faisal, 2015). Çalışmamızda gökkuşağı alabalığı ve lokal olarak üretimi yapılan doğal alabalık türlerinde (Anadolu/dağ alabalığı, kaynak alabalığı, karadeniz alabalığı, Çoruh alabalığında) hastalık vakalarından Flavobacterium spp. izole edilmiştir. Bu izolatların yaklaşık %63’ü 0,1- 2 gram ağırlığındaki balıklardan izole edilmiştir. Bu durum gökkuşağı alabalığı kuluçkahanelerinde Flavobakteriyozisin önemli bir sorun olduğunu göstermektedir (Madetoja ve ark., 2002; Wiklund ve ark., 1994). F. psychrophilum Ülkemizde geçmiş yıllarda yapılan birçok araştırmada, gökkuşağı alabalıklarındaki hastalık vakalarından F. psychrophilum rapor edilmiştir (Çağırgan ve ark., 1997; Diler ve ark., 2003; Öztürk ve Altınok, 2014). Çalışmamızda da 5 farklı bölgeden F. psychrophilum izole edilmiştir. Brown ve arkadaşları (1997) F. psychrophilum’un vertikal olarak anaçlardan yavruya sperm ve yumurta vasıtasıyla geçtiğini; Kubilay ve ark (2009); F. psychrophilum’un anaçlardan, kuluçkahane suyundan ve yumurtalardan izole edildiğini, anaçlardan ve yumurtadan larvaya bulaşmanın mümkün olabildiğini bildirmişlerdir. Çalışmamızda gökkuşağı alabalığı anaçlarına ait spermden F. psychrophilum’un izole edilmesi araştırmacıların vertikal geçiş konusundaki raporlarını desteklemektedir. F. psychrophilum'un epidemiyolojik özelliklerinin belirlemesinde PFGE, PCR-RFLP, RAPD-PCR ve ribotiplendirme gibi yöntemler kullanmaktadır (Chakroun ve ark., 1997; Chakroun ve ark., 1998; Izumi ve ark., 2003; Lorenzen ve ark., 1997; Madsen ve Dalsgaard, 1999). PCR-RFLP yöntemi; izolatlar arasındaki genetik varyasyonun belirlemesinde kullanılan ayrım gücü yüksek, kolay uygulanabilen güvenilir bir metottur (Tabata, 2004). 86 Bu çalışmada daha önce yapılan çalışmalara benzer olarak F. psychrophilum izolatının genetik yakınlıklarının belirlenmesinde PCR-RFP kullanılmıştır. İzolatların genetik yakınlıklarının belirlenmesi için gyrA’nın 396 bp uzunluğundaki kısmının Mph1103I enzimi ile kesilmesi neticesinde elde edilen profiller karşılaştırılmıştır. Izumi ve ark., (2007) ayu ve gökkuşağı alabalıklarından izole edilen F. psychrophilum izolatlarını kullanarak yaptığı genotiplendirmede; ayu balıklarında QR genotipinin (%82,4) ve gökkuşağı alabalıklarında QS genotipinin (%82,3) yaygın olduğunu bildirilmiştir. Çalışmamızda ise gökkuşağı alabalığı ve diğer lokal alabalık (Çoruh alabalığı ve kaynak alabalığı) izolatlarının tamamının QS genotipine ait olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada F. psychrophilum izolatlarının gyrB bölgesi kullanılarak yapılan RFLP analizinde gökkuşağı alabalığı izolatlarının %87’sinin S genotipinde, %13’ünün R genotipinde olduğu ve ayrıca Çoruh ve kaynak alabalığı izolatlarının ise S genotipinde yer aldığı belirlenmiştir. Japonya'da gökkuşağı alabalığından izole edilen F. psychrophilum izolatları kullanılarak yapılan bir çalışmada izolatların %90,3'ünün “R” genotipinde olduğu, (İzumi ve ark. 2003) ve Şili’de ise gökkuşağı alabalıklarından izole edilen izolatlarının %55,6’sının R genotipinde olduğunu bildirmiştir (Valdebenito ve Avendaño-Herrera, 2009). Bu çalışmada kullanılan F. psychrophilum izolatlarının %87’sinin S genotipinde yer almasıyla Japonya ve Şili izolatları ile yapılan araştırmalardan farklılık gösterdiği tespit edilmiştir. F. psychrophilum izolatlarının 16S rRNA bölgesinin MnII enzimi ile kesilerek yapılan RFLP analizinde, Solue ve ark., (2005) ve Hesami ve ark., (2008) 2 genotip (Lin I ve II) bildirirken, çalışmamızda bu iki genotipe ilaveten Lin-III olarak adlandırdığımız yeni bir genotip belirlenmiştir. Bu çalışmada Lin-I’de: koho salmonlardan izole edilmiş olan NCIMB 1947, NCIMB 2248 suşları yer alırken, Lin- II’de; gökkuşağı alabalığı, Çoruh alabalığı ve kaynak alabalığından izole edilen izolatlar, Lin III’de; gökkuşağı alabalığından izole edilmiş olan FP-24 yer almıştır. Ramsrud ve ark., (2007) 4 farklı kıta ve 11 farklı balık türünden izole edilmiş olan 73 F. psychrophilum izolatı ile yaptığı çalışmada pasifik salmonlarda her iki genotipinde (Lin I ve II) bulunabildiğini, gökkuşağı alabalığından izole edilen izolatların ise sadece Lin-II’genotipinde yer aldığını bildirmesi, çalışma sonuçlarımızla benzerlik göstermiştir (Ramsrud ve ark., 2007). Gelecekteki araştırmalarda, izolatların izole 87 edildiği balık türüyle bağlantılı olarak farklılık gösterebilme durumu ve Lin-III genotipinde yer alan FP-24 nolu izolatın farklı bir profil vermesi üzerinde durulmalı ve ayrıntılı dizi analizleri yapılarak, farklılığın nedenleri üzerinde çalışılmalıdır. Bu çalışmada 16S rRNA’nın (1092 bp) bölgesi AluI ve TaqI enzimleri ayrı ayrı kesilmesi sonucunda sırasıyla A-I, A-II ve T-I, T-II olmak üzere iki farklı RFLP profili belirlenmiştir. Her iki enzimle kesim sonrasında benzer profiller elde edilmiştir. Gökkuşağı alabalığı ve koho salmon izolatlarının aynı grupta (A-I ve T-I), Çoruh ve kaynak alabalığı izolatlarının ise A-II ve T-II farklı bir grupta yer aldığı tespit edilmiştir. AluI veya TaqI enzimi kullanımı durumunda konakçı ayrımının kısmi olarak yapılabildiği ancak coğrafik bölge ayrımının tam olarak yapılamadığı görülmüştür. gyrB ve 16S rRNA bölgelerinin PCR-RFLP analizi ile oluşturulan ortak RFLP profillerinin ortalama benzerlik bağlantısı kullanılarak yapılan filogenetik analizde 3 genetik gruba ayrıldığı görülmüştür. RFLP-I grubunu yalnızca gökkuşağı alabalığı izolatlarından oluşurken RFLP-II grubu Çoruh ve kaynak alabalıklarından izole edilen izolatlardan oluşmaktadır. RFLP-III grubu ise %95 benzerlik oranı ile 2 genotipe ayrılmıştır. RFLP-IIIa genogrubu koho salmon izolatlarından oluşurken RFLP-IIIb genotipi 2014 yılında İç Anadolu’dan izole edilen FP-24 nolu izolattan oluşmaktadır. Bu izolatın diğer gökkuşağı alabalığı izolatlarına benzerliği %86,9 bulunmuştur. Bu çalışmada kullanılan tüm RFLP profillerinin coğrafik ve konakçı ayrımının yapılabilmesi amacıyla jel görüntülerinin ayrı ayrı ve kombine edilerek karşılaştırılması yapıldı. Tek tek analizi yapılan jel görüntülerinin konakçı ayrımını tam olarak yapamadığı görülmüştür. Jel görüntülerinin kombine edilerek birlikte kullanılmasıyla oluşturulan ortak RFLP profilinde ise bakterinin izole edildiği konakçının ayrımının yapılabildiği fakat coğrafik bölge ayrımının yapılamadığı belirlenmiştir. Ülkemizde 5 farklı bölgesinden izole edilen F. psychrophilum izolatlarının genotipik olarak homojen bir yapıda olması, işletmeler arasında yumurta ve yavru balık transferlerinin yapılması, aynı su kaynağında çok sayıda işletme olması sebebiyle etkenin yayılım göstermesine bağlanabilir. RTFS/BCWD'ye birçok aşı çalışması yapılmasına rağmen etkili bir ticari aşı mevcut değildir. F. psychrophilum ’e karşı antibiyotik kullanımına alternatif olarak 88 sunulan faj tedavisi ve probiyotik bakterilerin kullanımına yönelik çalışmalar son yıllarda artış göstermiştir. Fakat bunların F. psychrophilum enfeksiyonunu önlemede etkisinin tam olarak kanıtlanması için daha ileri çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Bu nedenle, RTFS/BCWD salgınlarını kontrol etmek için antibiyotiklerin kullanımı tek seçenektir. Bu durumun F. psychrophilum’da antimikrobiyallere karşı direnç geliştirmesine neden olacağı şüphesizdir (Gomez ve ark., 2014). F. psychrophilum'un antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesine yönelik çok sayı çalışma mevcuttur (Boyacıoğlu ve ark., 2015; Boyacioglu ve Akar, 2012; Bruun, ve ark., 2003; Durmaz ve ark., 2012; Kum ve ark., 2008; Michel ve Garcia, 2003; Smith ve ark., 2016; Soule ve ark., 2005). Ancak, bu çalışmalarda farklı besi yerleri ve inkübasyon sıcaklıkların kullanılması antimikrobiyal duyarlılık testlerindeki verilerin karşılaştırılmasını zorlaştırmaktadır. Bu çalışmada F. psychrophilum’un antimikrobiyal duyarlılığının fenotipik olarak belirlenmesinde disk difüzyon ve MİK testleri kullanılmıştır. AML, ENR, OT ve OA antimikrobiyallerinde disk difüzyon sonuçları MİK testiyle birbirine benzerlik gösterirken, ERM, FFC ve SXT’de bu iki test arasında farklılık görülmüştür. Bu nedenle zorunlu psikrofilik bir bakteri olan F. psychrophilum gibi bakterilerin antimikrobiyal duyarlılıklarının belirlenmesinde MİK testinin kullanılması önerilmektedir (Smith ve Kronvall, 2015; Smith ve ark., 2018). Bu çalışmada F. psychrophilum izolatlarının florfenikole karşı eşik değerinin 2 mg/l olduğu bulunmuştur. Bu sonuçlar; CLSI (2018), Van Vliet ve ark. (2017), Ngo ve ark., (2017) ve Smith ve ark., (2016)’nın çalışma sonuçları ile benzerlik göstermiş ve çalışmamızda da kullanılan tüm F. psychrophilum izolatlarının florfenikole karşı duyarlı tipte (WT) olduğu belirlenmiştir. Gram negatif bakterilerde florfenikol direncinden primer olarak ilacın hücre dışına çıkartılmasından sorumlu olan floR geninin sorumlu olduğu bilinmektedir (Fernández‐Alarcón ve ark., 2010). Bu gen, salmonidlerde hastalık yapan Hafnia alveai, Pseudomonas spp., Citrobacter freundii gibi türlerde rastlanırken; Flavobacterium türlerinden henüz rapor edilmemiştir (Miranda ve ark., 2013). Verner-Jeffreys ve ark. (2017); Flavobacterium spp. ile aynı genusda yer alan Chryseobacterium spp. izolatlarında florfenikol (floR), tetrasiklin (tetX), streptotrisin ve kloramfenikol asetiltransferaz genlerini içeren gen kaseti tespit etmiştir. Fakat tespit 89 edilen bu gen kasetinin Flavobacteriaceae izolatlarında yaygın olmadığını bildirmiştir (Verner-Jeffreys ve ark., 2017). Çalışmamızda daha önce F. psychrophilum izolatlarında bildirilmemiş olan floR geni FP-100 nolu izolatta tespit edilmiş ancak FP 100 nolu izolatın florfenikole karşı duyarlı (WT) tipte olduğu ve direnç geni varlığını fenotipine yansımadığı görülmüştür. Bu durum floR geninin ekspresyon sentezinin düzenlenmesi ve florfenikol direncinin fenotipik ekspresyonuyla bağlantılı konakçı faktörlerinin belirlenmesine yönelik daha ayrıntılı çalışmalar yapılmasına ihtiyaç olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada F. psychrophilum izolatlarının eşik değerinin enrofloksasinde 0,03 mg/l, oksalinik asitte ise 0,25 mg/l olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan epidemiyolojik eşik değer; CLSI (2018), Van Vliet ve ark. (2017), Ngo ve ark., (2017) ve Smith ve ark., (2016)’nın aynı yöntemle belirlemiş oldukları eşik değerlerle benzerlik göstermektedir. Ngo ve ark., (2017); İngiltere’den izole edilmiş olan izolatlarla yaptıkları çalışmada; enrofloksasin ve oksalinik asite karşı duyarlılıkları azalan izolatların (N-WT) oranını sırasıyla %85 ve %84 olarak belirlemiştir. Smith ve ark., (2014); İngiltere ve Danimarka izolatlarıyla yaptıkları çalışmada oksalinik asitin N-WT oranının %48 olduğunu bildirmiştir. Van Vliet ve ark. (2017) ise Amerika’dan izole edilmiş izolatlarla yaptıkları çalışmada hem enrofloksine hem de oksalinik asite karşı tüm izolatların duyarlı tipte (WT) olduğunu rapor etmiştir. Bu çalışmada da, F. psychrophilum izolatlarının enrofloksasin ve oksalinik asit antimikrobiyallerinde N-WT oranı %88 olarak tespit edilmiştir. Gram negatif bakterilerde gyrA, gyrB, parC ve parE genlerindeki noktasal mutasyonlar sonucunda kinolonlara karşı oluşan direnç seviyesinin oldukça yüksek olduğu bilinmektedir. Akuakültürde kinolonların yaygın kullanımı sonucunda A. salmonicida, Edwardsiella tarda ve Photobacterium damselae gibi bazı balık patojenlerinde tespit edilen oksalinik asit direncinin gyrA bölgesindeki mutasyondan kaynaklandığı bildirilmiştir (Goñi-Urriza ve ark., 2002; Kim ve ark., 2011). Farklı araştırmacılar tarafından F. psychrophilum’un kinolonlara karşı direnç geliştirdiği bu direncinde DNA giraz ve topoizomeraz IV’de meydana gelen mutasyonlardan kaynaklandığı rapor edilmiştir. (Gibello ve ark., 2004; Izumi ve ark., 2007; Miranda ve ark., 2013; Shah ve ark., 2014). 90 F. psychrophilum izolatlarında kinolon direncinin genetik olarak tespit edilmesi amacıyla yapılan bir çalışmada; gyrA bölgesindeki 82. amino asit olan treoninin değişime uğrayarak arjinine dönüştüğü bildirilmiştir. Aynı çalışmada, fenotipik olarak dirençli olduğu belirlenen izolatların tümünde, kromozomal mutasyona bağlı olarak genetik direnç geliştiği tespit edilmiştir (Shah ve ark., 2012b). Shah ve ark., (2012b)’nın bildirdiği gibi çalışmamızda da gyrB ve parC bölgelerinde amino asit değişimine yol açmayan sessiz mutasyonlar tespit edilmiş ve aktarılabilir plazmid aracılı kinolon (qnr) direnç genlerini taşıyan herhangi bir izolat tespit edilememiştir. ParC ve parE bölgelerindeki mutasyonların sıklıkla gyrA bölgesinde meydana gelen mutasyonları ile birlikte şekillendiği, parC veya parD biriminde meydana gelen bir mutasyonun tek başına bakterinin kinolon duyarlılığını değiştirmediği bildirilmiştir (Cengiz, 2010). Çalışmamızda fenotipik olarak kinolanlara duyarlılığı azalmış (N- WT) olarak belirlenen 4 izolatın gyrA ve parE bölgesinde mutasyon şekillendiği belirlenmiştir. Hooper, 1999; gyrA ile birlikte parC veya parE birimlerinde görülen mutasyonların yüksek etkili direnç oluşturduğunu bildirmiştir (Hooper, 1999). Bu durumda ülkemizde FP-108, FP, 116, FP-123, FP-335 izolatlarının yüksek etkili kinolon direnci geliştirmiş olduğu söylenebilir. Bu çalışmada F. psychrophilum izolatlarının oksitetrasiklin eşik değeri, Ngo ve ark., (2017)’nın yaptığı çalışmada olduğu gibi 0,25 mg/l belirlenmiştir. CLSI (2018), Smith ve ark., (2016) ve Van Vliet ve ark. (2017)’nın yaptıkları çalışmalarda ise oksitetrasiklin eşik değeri 0,125 mg/l olarak rapor edilmiştir. Ngo ve ark., (2017); oksitetrasikline karşı antimikrobiyal duyarlılıkları azalan izolatların (N-WT) oranını %58; Smith ve ark., (2014); %36(N-WT); Van Vliet ve ark. (2017)’ ise %24(N-WT) olduğunu bildirmişlerdir. Çalışmamızda ise N-WT oranı %72 olduğu tespit edilmiştir. Bu durumda, F. psychrophilum enfeksiyonlarının tedavisinde Avrupa, Amerika’da olduğu gibi ülkemizde de ruhsatlı olan oksitetrasiklinin antimikrobiyal duyarlılığın azaldığı söylenebilir. Yersinia ruckeri, Lactococcus garvieae gibi birçok akuatik bakteri türünde tetrasiklin direnç genlerinin varlığı rapor edilmiştir (Akinbowale ve ark., Barton, 2007). Su ve sediment örneklerinden izole edilen Flavobacterium spp. türlerinde antimikrobiyal dirence yönelik yapılan az sayıdaki araştırmada ise; tetA, tetB, tetC, 91 tetE, tetM, tetH ve tetL genlerinin varlığı rapor edilmiştir (Akinbowale ve ark., 2007; Dolejska ve ark., 2009; Miranda ve ark., 2003). Çalışmamızda oksitetrasikline karşı antimikrobiyal duyarlılığı azalan türlerde dahi tetrasiklin direnç genleri tespit edilememiştir. Bu durum fenotipik olarak tespit edilen antimikrobiyal direncin her zaman genotipe yansımayabileceğini göstermektedir. Bu çalışmada F. psychrophilum izolatlarının eritromisin eşik değerinin 8 mg/l olarak tespit edilmesi; CLSI, Van Vliet ve ark. (2017) ve Ngo ve ark., (2017)’nın çalışmalarınnda elde edilen eritromisinin eşik değerlerine ilişkin sonuçları desteklemektedir. Ngo ve ark., (2017) ve Van Vliet ve ark. (2017)’nın yaptıkları çalışmalarda tüm izolatların eritromisine duyarlı tipte (WT) olduğu bildirilmiştir. Çalışmamızda ise eritromisine duyarlılığı azalmış tipte (N-WT) izolat oranının %20 olduğu belirlenmiştir. Bu durum; balıklarda kullanım için Avrupa, Amerika ve Türkiye’de ruhsatlı olmayan ve genellikle Gram pozitif patojenlerin tedavisinde kullanılan eritromisinin etiket dışı olarak ülkemizde yoğun bir şekilde kullanılması ile ilişkilendirilebilir. Bu çalışmada F. psychrophilum izolatlarının amoksisilin eşik değeri 0,064 mg/l olarak belirlenmiştir. Ngo ve ark., (2017)’nın 133 izolatla yaptıkları çalışmada izolatlarının yaklaşık %70’inin MİK değerin minimum konsantrasyonun altında çıkmasından dolayı eşik değer saptanamamıştır. Çalışmamızda kullanılan tüm izolatların amoksisiline duyarlı tipte (WT) olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada F. psychrophilum izolatlarının sulfamethoksazol + trimetoprim eşik değeri 16/304 mg/l olarak kaydedilmiştir. Smith ve ark., (2016) ’nın yaptığı çalışmada 1/19 mg/l, Van Vliet ve ark. (2017) ’nın yaptığı çalışmada 0,5/9,5, Ngo ve ark., (2017) ’nın yaptığı çalışmada ise 8/152 mg/l olarak bildirilmiştir. CLSI’nın revize standartlında da belirtildiği gibi laboratuvarlar arasında F. psychrophilum izolatlarının Sulfamethoksazol + trimetoprim için belirlenen MİK değerlerinin çok değişken olması ve standart hatalarının fazla olması nedeniyle eşik değerlerde farklılıklar ortaya çıkmıştır. Bu durum standardize edilmemiş eşik değerlerle kesin bir sonuca varılamayacağını göstermektedir. Minogue ve ark., (2012) A. salmonicida ve E. tarda ile yaptıkları çalışmalarda sulfamethoksazol/trimetoprim duyarlılığındaki yüksek varyasyonların, aktarılabilir niteliktedeki sul (sul1, sul2 ve sul3) direnç genlerinin varlığından kaynaklanabileceğini bildirmiştir (Minogue ve ark., 2012). 92 Wang ve ark., (2014) akuatik çevrede yaygın olarak bulunan Flavobacterium spp.’de sul (sul1, sul2 ve sul3) genlerini tespit ettiğini bildirmiştir. Bu çalışmada ise daha önce F. psychrophilum izolatlarıyla ilgili bildirim yapılmamış olan sul2 geni; FP 82, FP 90, FP 100, FP 116, FP 120, FP 123 nolu izolatlarda tespit edilmiştir. Flavobacterium spp. Flavobacterium türlerinin neden olduğu hastalık salgınları ve bunlarla mücadeleyi amaçlayan çalışmaların büyük çoğunluğu Flavobacterium psychrophilum, F. columnare ve F. branchiophilum’ı konu almıştır. Son yıllarda birçok yeni Flavobacterium türünün de sistemik olarak enfekte veya klinik belirti gösteren balıklardan izole edildiği bildirilmiştir (Loch ve Faisal, 2015). Bu yeni Flavobacterium türlerinin ekolojisi, epidemiyolojisi ve patogenezi hakkında bilgilerin sınırlı olduğu görülmüştür (Austin ve Austin, 2016; Loch ve Faisal, 2017). Son yıllarda tespit edilen Flavobacterium türlerinin hastalığın asıl etkeni olup olmadığına ilişkin fazla bir çalışma bulunmamaktadır. Yapılmış olan sınırlı sayıdaki çalışmada F. johnsoniae ve F. spartansii’nin Koch postulatlarını sağladığını bildirilirken diğer Flavobacterium türlerinin sağlayıp sağlamadığına yönelik bir bilgiye rastlanılamamıştır (Loch, ve Faisal, 2014; Soltani ve ark.,1994). Gökkuşağı alabalığı, kahverengi alabalık ve koho salmon üzerine yapılan çalışmalarda Flavobacterium spp.’nin solungaç, bağırsak, döllenmiş/gözlenmiş yumurtaların doğal mikrobiyotasında bulunduğu bildirilmiştir (Lowrey ve ark., 2015; Romero ve Navarrete, 2006; Wilkins ve ark., 2015; Wong ve ark., 2013). Bu kapsamda yapılmış en kapsamlı çalışma Michigan State Üniversitesi’nde bulunan araştırmacı Thomas Loch tarafından yapılmıştır. Loch ve ark., (2013), 2003- 2010 yılları arasında Michigan'da (ABD) bulunan tatlı su kaynaklarında yaşayan sağlıklı veya hastalık semptomu gösteren doğal ve kültür balıklarında yaptıkları saha taramasında 21 farklı balık türünden toplam 211 Flavobacterium spp. izole etmiştir. Söz konusu izolatları 16S rRNA bölgesi kullanılarak %96,5-100 oranında identifiye etmiş ve 21 farklı Flavobacterium türü rapor etmiştir. Çalışmamızda ise 2013-2017 yılları ülkemizin 6 farklı bölgesinden gerek hastalık semptomu gösteren gerekse sağlıklı görülen ve yetiştiriciliği yapılan 5 farklı salmonid türünden toplam 109 93 Flavobacterium spp. izole edilmiştir. 16S rRNA bölgesi kullanılarak yapılan dizi analizinde 109 Flavobacterium spp. izolattından 27 farklı Flavobacterium türü identifiye edilmiştir. Loch ve ark., (2013) araştırma sonuçlarına benzer olarak çalışmamızda da F. aquidurense, F. frigidimaris, F. glacei, F. hercynium, F. hibernum, F. hydatis, F. oncorhynchi, F. pectinovorum, F. psychrophilum, F. reichenbachii F. succinicans ve F. tiangeerense türleri izole edilmiştir.  F. branchiarum ilk olarak Zamora ve ark. tarafından 2013 yılında gökkuşağı alabalıklarının solungaç ve karaciğerlerinden izole edilmiştir. Bu çalışmada F. psychrophilum’dan sonra en fazla izole edilen tür olan F. branchiarum; su sıcaklığının 8-12°C arasında olduğu dönemlerde gökkuşağı alabalığı frylarının (0,2-3g) böbreklerinden izole edilmiştir. Gözlerde uni-bilateral egzoftalmus, renkte hiperpigmentasyon gibi genel semptomlar gösteren balıklarda ciddi ölümlerin olmadığı belirlenmiştir. RFLP ile yapılan genotiplendirme çalışmasında F. branchiarum izolatların homojen bir yapıda olduğu saptanmıştır.  İlk olarak Çin’de Xin ve ark., Uygur Özerk bölgesindeki (2009) buzullardan izole edilen F. tiangeerense, daha sonra Loch ve ark., (2013) tarafından hastalık semptomu göstermeyen gökkuşağı alabalığı (200-250 g), kahverengi alabalık fingerlinglerinin solungaçlarından ve anaç boydaki koho salmonların böbreklerinden izole edilmiştir. Çalışmamızda ise etken farklı su sıcaklıklarında (10-18°C) gökkuşağı alabalıklarının (0,3-200g) böbrek ve karaciğerlerinden izole edilmiştir. Balıklarda renkte hiperpigmentasyon, iştahsızlık gibi genel semptomların yanı sıra deride ülseratif lezyonlar görülmüştür. Çalışmamızda, dokuz F. tiangeerense izolatının 3 farklı genotipe ayrıldığı belirlenmiştir. Amerika’da yapılan bir çalışmada ise üç F. tiangeerense izolatının 2 ayrı genotipte yer aldığı rapor edilmiştir (Loch ve ark., 2013).  F. collinsii ilk olarak Zamora ve ark. tarafından 2013 yılında gökkuşağı alabalıklarının karaciğerinden izole edilmiştir. Çalışmamızda izolatlar su sıcaklığının 10-12°C olduğu dönemde herhangi bir klinik bulgu göstermeyen gökkuşağı alabalığı (yumurta ve 0,2-130g) ve Anadolu alabalığından (keseli 94 frylardan) izole edilmiştir. Çalışmamızda RFLP analizlerinde F-353 nolu Anadolu alabalığı izolatı ile F-75, F-336, F-348, F-355, F-361 nolu gökkuşağı alabalığı izolatlarının balık orijini bakımından ayrımının yapılabildiği görülmüştür.  F. succinicans ilk olarak Anderson ve Ordal (1961) tarafından chinook salmon fingerlinglerinin (Oncorhynchus tshawytscha) kaudal yüzgeçlerindeki erozyonlardan izole edilmiştir. Daha sonra Loch (2012) tarafından Michigan’daki tatlı su kaynaklarında bulunan balıklar üzerinde yapılan rutin sağlık taramasında klinik bulgu ve mortalite göstermeyen, kaynak alabalığı, gökkuşağı alabalığı, kahverengi alabalık ve beyaz göl balığından (Coregonus clupeaformis) etken izole edilmiştir. Çalışmamızda ise F. succinicans 12-15°C su sıcaklığında yaşayan ve herhangi bir klinik bulgu göstermeyen gökkuşağı alabalıklarından (0,2-3000g) izole edilmiştir. Çalışmamızda, altı F. succinicans izolatının 2 farklı genotipe ayrıldığı görülmüşken Loch ve ark., (2013) yaptıkları çalışmada 16 F. tiangeerense izolatının 4 genotipe ayrıldığını bildirmiştir.  İlk olarak Christensen, (1977) tarafından İngiltere’nin güneybatısında topraktan izole edilen F. pectinovorum, daha sonra Loch ve ark., (2013) tarafından gökkuşağı alabalığı fingerlingleri ve koho salmonlardan görülen salgınlardan izole edilmiştir. Araştırmacılar solungaçlarda ve karaciğerde solgunluk, yüzgeç diplerinde erezyon ve dalakta büyüme gibi klinik bulgular rapor etmiştir. Çalışmamızda ise etken 10-12°C su sıcaklığında yaşayan gökkuşağı alabalığı (1g) ve Anadolu alabalığının (4000 g) böbrek ve karaciğerlerinden izole edilmiştir. Klinik bulgu olarak ise sadece yüzgeç diplerinde erezyon görülmüştür. Çalışmamızda, dört F. pectinovorum izolatının 2 ayrı genotipde yer aldığı saptanmasına karşılık, Loch ve ark., (2013) 28 izolat ile yaptığı filogenetik analizde izolatların 3 farklı genotipe ayrıldığını bildirmiştir.  F. tructae ve F. piscis ilk olarak İspanya’da gökkuşağı alabalıklarında septisemi ile seyreden bir salgından solungaç, karaciğer ve böbrekten izole edilmiştir (Zamora ve ark., 2014). Çalışmamızda ise F. tructae ve F. piscis su sıcaklığının 10-15°C olduğu dönemde görülmüştür. F. tructae 0,3-100 g 95 gökkuşağı alabalıklarından, F. piscis ise gökkuşağı alabalığı (0,2-1 g) ve karadeniz alabalığından (0,2 g) izole edilmiştir. Solungaçlarda hafif şişlik ve anemi, iştahsızlık, karaciğerde anemi, dalakta büyüme gibi semptomların görülmesi Zamora’nın belirttiği septisemi bulguları ile benzerlik göstermiştir. Çalışmamızda, F. tructae izolatlarının homojen bir yapıda olduğu görülürken, F. piscis izolatlarının heterojen bir yapıda (2 genotip) olduğu görülmüştür.  F. branchiicola ilk olarak Zamora ve ark. tarafından 2013 yılında gökkuşağı alabalıklarının karaciğerinden izole edilmiştir. Çalışmamızda izolatlar genellikle su sıcaklığının 10-15°C olduğu dönemde gökkuşağı alabalığından (0,2-10 g) izole edilmiştir. Gözlerde hafif uni-bilateral egzoftalmus, solungaçlarda şişlik ve anemi gibi semptomlar gösteren balıklarda ciddi ölümlerin olmadığı görülmüştür. Çalışmamızda, F. branchiicola izolatlarının heterojen bir yapıda (2 genotip) olduğu görülmüştür.  F. hercynium ilk olarak Almanya’nın kuzeyinde bulunan dere suyundan izole edilmiştir. (Cousin ve ark., 2007). Amerika’da yapılan başka bir çalışmada ise yüzgeçlerde aşınma ve nekroz, asites, unilateral egzoftalmus, karaciğerde solgunluk, dalakta büyüme ve enteritis belirtileri gösteren kaynak alabalığı, gökkuşağı alabalığı ve kahverengi alabalık frylarından izole edilmiştir (Loch ve ark., 2013). Çalışmamızda ise etken su sıcaklığının 10-15 ° olduğu dönemlerde Anadolu alabalığı (4000 g) ve gökkuşağı alabalıklarından (20-35 g) izole edilmiştir. Yüzgeç diplerinde kanama, asites ve enteritis gibi semptomların görülmesi Loch ve ark., (2013)’nın belirttiği klinik bulguları ile benzerlik göstermiştir. Çalışmamızda, üç F. hercynium izolatının 2 farklı genotipte yer aldığı belirlenmiştir. Loch ve ark., (2013); 33 izolat ile yaptığı filogenetik analizde ise F. hercynium izolatlarının 5 farklı genotipe ayrıldığını bildirmiştir.  F. oncorhynchi ilk olarak İspanya’da juvenil gökkuşağı alabalıklarında soğuk su hastalığı benzeri semptomlar gösteren bir salgından, dalak, karaciğer ve böbrekten izole edilmiştir (Zamora ve ark., 2012). Amerika’da yapılan başka bir çalışmada ise unilateral egzoftalmus, karaciğer ve böbrekte solgunluk, dalakta büyüme ve solungaçlarda epiteliyel hiperplazi belirtileri gösteren kaynak alabalığı, gökkuşağı alabalığı ve kahverengi alabalık fingerlinglerinden 96 izole edilmiştir (Loch ve ark., 2013). Çalışmamızda ise etken su sıcaklığının 10-13°C olduğu dönemde gökkuşağı alabalıklarından (0,2 g) izole edilmiştir. Solungaçlarda anemi ve dalakta büyüme gibi semptomların görülmesi Loch ve ark., (2013)’nın belirttiği klinik bulguları ile benzerlik göstermiştir. Çalışmamızda, üç F. oncorhynchi izolatında aynı genotipte olduğu tespit edilmişken Loch ve ark., 2013’de yaptıkları çalışmada 20 F. oncorhynchi izolatının 2 farklı genotipte yer aldığını bildirmiştir.  F. spartansi ilk olarak Amerika’da; egzoftalmus, dermiste multifokal kanama, dalakta büyüme, hemorajik enterit ve karaciğerde solgunluk semptomları gösteren anaç ve fingerling boydaki chinook salmonların dalak, karaciğer ve solungaçlarından izole edilmiştir (Loch ve Faisal, 2014) Çalışmamızda ise etken su sıcaklığının 13°C olduğu dönemde gökkuşağı alabalıklarından (0,5- 200 g) izole edilmiştir. Solungaç ve karaciğerde solgunluk, dalakta büyüme gibi semptomların görülmesi Loch ve ark., (2013)’nın belirttiği klinik bulguları ile benzerlik göstermiştir. Çalışmamızda, üç F. oncorhynchi izolatının 2 farklı genotipte olduğu görülmüştür (Loch ve ark., 2013).  F. frigidarium ilk olarak Antartika’da Adelaide adasının çevresinde bulunan deniz sedimentinden izole edilmiştir. (Humphry ve ark., 2001). Daha sonra Tazmanya'da amoebik solungaç hastalığı bulunan Atlantik salmon (Salmo salar) balıklarının solungaçlarından izole etmiştir (Bowman ve Nowak, 2004). Patojenitesine ilişkin herhangi bir bilgi verilmemiştir. Çalışmamızda ise söz konusu etkenin 15°C su sıcaklığında ve herhangi bir klinik bulgu göstermeyen gökkuşağı alabalıklarından (1 g) izole edilmiştir. Çalışmamızda, iki F. frigidarium izolatının aynı genotipde olduğu görülmüştür.  F. hibernum ilk olarak kutuplarda bulunan Crooked gölünden izole edilmiştir (McCammon ve ark., 1998). Daha sonra Loch (2013) tarafından Michigan’daki tatlı su kaynaklarında bulunan balıklar üzerinde yapılan rutin sağlık taramasında klinik bulgu ve mortalite göstermeyen iskorpit balığından (Cottus bairdii) etken izole edilmiştir. Çalışmamızda ise etken 13-15°C su sıcaklığında yaşayan ve herhangi bir klinik bulgu göstermeyen Anadolu alabalığı (0,2 g) ve gökkuşağı alabalıklarından (3 g) izole edilmiştir. 97 Çalışmamız, Loch ve ark., (2013)’nın yaptığı çalışmaya benzer olarak iki F. hibernum izolatınında aynı genotipte olduğu görülmüştür.  F. reichenbachii ilk olarak kuzey Almanya’da dere suyundan izole edilmiştir. (Ali ve ark., 2009). Daha sonra Loch (2013) tarafından Michigan’daki tatlı su kaynaklarında bulunan balıklar üzerinde yapılan rutin sağlık taramasında klinik bulgu ve mortalite göstermeyen kaynak alabalığı ve kahverengi alabalığının böbrek ve solungaçlarından izole edilmiştir. Çalışmamızda ise etken 10°C su sıcaklığında yaşayan ve herhangi bir klinik bulgu göstermeyen Anadolu alabalığı (0,1 g) ve gökkuşağı alabalıklarından (gözlenmiş yumurta) izole edilmiştir. Çalışmamızda, iki F. reichenbachii izolatınında aynı genotipde yer aldığı saptanmasına karşılık, Loch ve ark., (2013) 3 izolat ile yaptığı filogenetik analizde izolatların 2 farklı genotipe ayrıldığını bildirmiştir.  F. aquidurense ilk olarak Almanya’nın kuzeyinde bulunan dere suyundan izole edilmiştir. (Cousin ve ark., 2007). Amerika’da yapılan başka bir çalışmada ise spiral tarzda yüzme, unilateral egzoftalmus, yüzgeç tabanlarında kanama, solungaçlarda solgunluk ve nekroz, dalakta büyüme ve karaciğerde solgunluk belirtileri gösteren koho salmon frylarından F. aquidurense izole edilmiştir (Loch ve ark., 2013). Çalışmamızda ise, su sıcaklığının 9°C olduğu dönemde Karadeniz bölgesindeki bir kaynak alabalığı anacından F. aquidurense izole edilmiştir. Solungaçlarda solgunluk gibi semptomların görülmesi Loch ve ark., 2013’ün belirttiği klinik bulguları ile benzerlik göstermiştir.  F. frigidimaris ilk olarak Güney kutbunda deniz suyundan izole edilmiştir. (Nogi ve ark., 2005). Amerika’da yapılan başka bir çalışmada ise spiral tarzda yüzme, karaciğerde beneklenme, solungaçlarda solgunluk ve yüzgeç tabalarında erezyon belirtileri gösteren koho salmon ve kahverengi alabalıklardan (fry ve fingerling) izole edilmiştir (Loch ve ark., 2013). Çalışmamızda ise etken su sıcaklığının 10-13°C olduğu dönemde gökkuşağı alabalıklardan (0,2 g) izole edilmiştir. Solungaçlarda solgunluk ve dalakta büyüme gibi semptomların görülmesi Loch’un belirttiği klinik bulguları ile benzerlik göstermektedir. Çalışmamızda, iki F. frigidimaris izolatınında aynı genotipte olduğu belirlenmiştir. Loch ve ark., (2013) ise 12 F. frigidimaris izolatı ile yaptığı filogenetik analizde 3 genotipte görüldüğünü bildirmiştir. 98  F. glaciei ilk olarak Çin’in 1 nolu buzullarından izole edilmiştir (Zhang ve ark., 2006). Daha sonra Loch (2013) tarafından Michigan’daki tatlı su kaynaklarında bulunan balıklar üzerinde yapılan rutin sağlık taramasında klinik bulgu ve mortalite göstermeyen koho salmon frylarının beyninden izole edilmiştir. Çalışmamızda ise etken 10°C su sıcaklığında yaşayan gökkuşağı alabalıklarından (gözlenmiş yumurta) izole edilmiştir.  F. hydatis ilk olarak Amerika’da bakteriyel solungaç hastalığı semptomları gösteren chinook salmonlardan izole edilmiştir (Strohl ve Tait, 1978). Daha sonra Loch (2013) tarafından Michigan’daki tatlı su kaynaklarında bulunan balıklar üzerinde yapılan rutin sağlık taramasında klinik bulgu ve mortalite göstermeyen kaynak alabalığı (200-250g) ve kahverengi alabalıklarının (200- 250g) solungaçlarından izole edilmiştir (Loch ve ark., 2013). Çalışmamızda ise etken 10°C su sıcaklığında bulunan gözlenmiş gökkuşağı alabalığı yumurtasından izole edilmiştir.  F. plurextorum ilk olarak İspanya’da gökkuşağı alabalıklarında septisemi ile seyreden bir salgından solungaç, karaciğer ve yumurtadan izole edilmiştir (Zamora ve ark., 2013b). Amerika’da yapılan başka bir çalışmada ise yine septisemi belirtileri gösteren gökkuşağı alabalığı ve kahverengi alabalık frylarından izole edilmiştir (Loch ve Faisal, 2014a). Çalışmamızda ise etken su sıcaklığının 15°C olduğu dönemde gökkuşağı alabalığından (7-8 g) izole edilmiştir. Solungaçlarda şişlik ve anemi, iştahsızlık, renkte hiperpigmentasyon, karaciğer solgunluk, dalak büyüme ve perikarditis gibi semptomların görülmesi Zamora ve Loch’un belirttiği septisemi bulguları ile benzerlik göstermektedir.  Ayrıca bu çalışmada daha önce balıklarda hastalık yaptığı rapor edilmeyen F. antarticum, F. terrigena, F. granuli, F. frigoris, F. saccharophilum, F. xueshanense ve F. cutihirudinis türleri balıklardan ilk defa izole edilmiştir. Bu türler proje çalışmaları kapsamında 2013-2017 yılları arasında yapılan saha örneklemelerinde herhangi bir klinik bulgu göstermeyen gökkuşağı alabalıklarının iç organlardan izole edilmiştir. 99 Flavobacterium spp. türlerinin antimikrobiyal duyarlılığı ve direnç genlerinin belirlenmesi konusunda pek fazla araştırma yapılmamıştır. Yapılan sınırlı sayıdaki çalışmalarda Flavobacteriaceae familyasında yer alan türlerin, antimikrobiyallerin yüksek konsantrasyonlarını bile tolere edebildiği ve birçok antimikrobiyale karşı duyarlılıklarının azaldığı bildirilmiştir (Aber ve ark., 1978; Chang ve ark., 1997; Clark, ve ark., 2009.; Fraser ve Jorgensen, 1997; Loch ve ark.,2013; Verner-Jeffreys ve ark., 2017). Çalışmamızda incelenen Flavobacterium spp. izolatlarının %54’ünün sulfamethoksazol + trimetoprim (19:1), %70’inin eritromisin, %72’sinin oksalinik asit, %77’sinin enrofloksasin, %83’ünün florfenikol, %87’sinin oksitetrasiklin için duyarlılığı azalan tipte (N-WT) olduğunun belirlenmesi daha önce bu konuda yapılan araştırma sonuçlarını desteklemiştir. Verner-Jeffreys ve ark., (2017); Flavobacterium spp. izolatlarının (86 izolat) büyük bir kısmının 16mg/l gibi yüksek konsantrasyonda bile amoksisiline tolerans gösterdiğini bildirmiştir. Çalışmamızda ise izolatların sadece %76’sının amoksisilin için eşik değer olan 0,25mg/l’den daha düşük konsantrasyonda (WT) MİK değerlerine sahip olması Verner-Jeffreys ve ark., 2017’nin bildirdiği sonuçlardan farklılık göstermiştir. Bu farklılığın amoksisilinin ülkemizde ruhsatlandırılmış olmasına rağmen alabalık yetiştiriciliğinde yaygın kullanılmamasından kaynaklanabileceğini düşündürmüştür. Gram-negatif bakteriler arasında doğal direncin yanı sıra transpozonlar ve plazmidlerin neden olduğu aktarılabilir nitelikteki direnç yaygın olarak görülmektedir. Flavobacteriaceae ailesindeki türlerde görülen direncin, aktarılabilir ve/veya kromozomal dirençten ziyade doğal direnç mekanizmalarından kaynaklandığı bildirilmiştir (Verner- Jeffreys ve ark., 2017). Çalışmamızda da Flavobacterium spp. izolatlarında yüksek oranda antimikrobiyal direnç tespit edilmesi Flavobacterium türlerinin bazı antimikrobiyallere doğal olarak dirençli olabileceğini düşündürmüştür. Akuakültürden izole edilen Flavobacterium spp. türleri üzerinde, sınırlıda olsa, antimikrobiyal dirence yönelik yapılan araştırmalarda tetA, tetB, tetC, tetE, tetM, tetH ve tetL ve sul (sul1, sul2 ve sul3) genlerinin varlığı rapor edilmiştir (Akinbowale ve ark., 2007; Stine ve ark., 2007, Miranda ve ark., 2003). Çalışmamızda ise 84 Flavobacterium spp. izolatından 11’inin floR, 23’ünün sul2 direnç geni taşıdığı 100 belirlenmiştir. Ayrıca fenotipik olarak oksitetrasikline duyarlılığı azalan tipte (N-WT) olan Flavobacterium türlerinde tetrasiklin direnç genleri tespit edilememiştir Bu çalışmada;  16S rRNA bölgesi kullanılarak yapılan dizi analizi sonucunda 27 farklı Flavobacterium türü identifiye edildiği,  F. psychrophilum (%23), F. branchiarum (%15,5) ve F. tiangeerense (%8)’nın en yaygın türler olduğu,  Ülkemizde salmonid balıklarından F. branchiarum, F. tiangeerense, F. collinsii, F. succinicans, F. pectinovorum, F. tructae, F. piscis, F. branchiicola, F. hercynium, F. oncorhynchi, F. spartansi, F. frigidarium, F. hibernum, F. reichenbachii, F. aquidurense, F. frigidimaris, F. glaciei, F. hydatis, F. plurextorum, F. antarticum, F. terrigena, F. granuli, F. frigoris, F. saccharophilum, F. xueshanense ve F. cutihirudinis türlerinin ilk defa tespit edildiği,  Balıklarda bugüne kadar rapor edilmemiş olan F. antarticum, F. terrigena, F. granuli, F. frigoris, F. saccharophilum, F. xueshanense ve F. cutihirudinis türlerinin tespit edildiği,  Flavobakteriyozisin özellikle 0,1-2 gram ağırlığındaki gökkuşağı alabalığı yavrularında önemli bir sorun olduğu,  Ülkemizde F. psychrophilum izolatlarının genotipik olarak homojen bir yapı gösterdiği,  F. psychrophilum izolatlarının amoksisilin ve florfenikole duyarlı, enrofloksasin ve oksalinik asite ise duyarlılığının azaldığı,  F. branchiarum, F. branchiicola, F. collinsii, F. frigoris ve F. psychrophilum türlerinde floR ve F. branchiarum, F. branchiicola, F. collinsii, F. oncorhynchi, F. plurextorum, F. psychrophilum, F. spartansii, F. terrigena ve F. tiangeerense türlerinde ise sul2 direnç geninin ilk defa tespit edildiği sonucuna varılmıştır. 101 Bu çalışma sonuçlarına göre sürdürülebilir gökkuşağı alabalığı yetiştiriciliğinin yapılabilmesi için; 1. Flavobacterium spp. türlerinin epidemiyolojik özellikleri ve patojenitelerinin belirlenmesi, 2. Hastalık salgınlarında mutlaka identifikasyon yapılması ve MİK sonuçları göz önünde bulundurularak tedavi protokollerinin hazırlanması, 3. Tüm genom ve biyoenformatik analizleri ile Flavobacterium türlerinde görülen doğal direnç mekanizmalarının belirlenmesi, 4. Gökkuşağı alabalığı işletmelerinde bakteriyel etkenlerin ve antimikrobiyal direnç genlerinin karasal ekosisteme ve insanlara yayılmasının önlenmesi için işletmelerde biyogüvenlik sistemlerinin kurulması ve belirli aralıklarda kontrol edilmesi önerilmektedir. 102 6. KAYNAKLAR Aber RC, Wennersten C, Moellering RC (1978) Antimicrobial susceptibility of flavobacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 14: 483–487. Akinbowale OL, Peng H, Barton MD (2007) Diversity of tetracycline resistance genes in bacteria from aquaculture sources in Australia. Journal of Applied Microbiology 103: 2016–2025. Akova SB (2015) Aquaculture and its distribution in Turkey. Population (billions) 6: 1–7. Alcaide E, Blasco M-D, Esteve C (2005) Occurrence of drug-resistant bacteria in two European eel farms. Applied and Environmental Microbiology 71: 3348–3350. Alderman DJ, Hastings TS (1998) Antibiotic use in aquaculture: development of antibiotic resistance–potential for consumer health risks. International Journal of Food Science & Technology 33: 139–155. Ali Z, Cousin S, Frühling A et al (2009) Flavobacterium rivuli sp. nov., Flavobacterium subsaxonicum sp. nov., Flavobacterium swingsii sp. nov. and Flavobacterium reichenbachii sp. nov. isolated from a hard water rivulet. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 59(10): 2610- 2617. Aminov RI, Garrigues-Jeanjean N, Mackie RI (2001) Molecular Ecology of Tetracycline Resistance: Development and Validation of Primers for Detection of Tetracycline Resistance Genes Encoding Ribosomal Protection Proteins. Applied and Environmental Microbiology 67: 22–32. Aminov RI, Chee-Sanford JC, Garrigues N et al (2002) Development, Validation, and Application of PCR Primers for Detection of Tetracycline Efflux Genes of Gram- Negative Bacteria. Applied and Environmental Microbiology 68: 1786–1793. Anderson RL, Ordal EJ (1961) Cytophaga succinicans sp. nov., a facultatively anaerobic, aquatic myxobacterium. Journal of Bacteriology 81(1): 130-138. Anonim (2018) Flavobacterium spp. güncel taksonomisi, http://www.bacterio.net/flavobacterium.html, (02.05.2018) Arias CR, Olivares-Fuster O, Hayden K et al (2007) First Report of Yersinia ruckeri Biotype 2 in the USA. Journal of Aquatic Animal Health 19: 35–40. Austin B, Austin DA (2016) Bacterial fish pathogens Disease of Farmed and Wild Fish. 6. Baskı, Springer International Publishing, Switzerland, pp: 397-465. Avendaño-Herrera R, Houel A, Irgang R et al (2014) Introduction, expansion and coexistence of epidemic Flavobacterium psychrophilum lineages in Chilean fish farms. Veterinary Microbiology 170: 298–306. Balta F (1997) Kültürü yapılan alabalıklarda (Oncorhynchus mykiss)) görülen Flexibacter psychrophila enfeksiyonu. IX. Ulusal Su Ürünleri Sempozyumu 19: 621–648. Balta F, Cagırgan H (1998) Kültürü Yapılan Alabalıklarda (Oncorhynchus mykiss)) Görülen Flexibacter columnaris enfeksiyonu. Doğu Anadolu Bölgesi III. Su Ürünleri Sempozyumu. pp: 163–169. Barton MD (2000) Antibiotic use in animal feed and its impact on human healt. 103 Nutrition Research Reviews 13: 279–299. Benedetti P, Rassu M, Pavan G et al (2011) Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection 39: 161–165. Bernardet JF, Segers P, Vanca EYT et al (1996) Cutting a Gordian Knot: Emended Classification and Description of the Genus Flavobacterium, Emended Description of the Family Flavobacteriaceae, and Proposal of Flavobacterium hydatis norn. nov. (Basonym, Cytophaga aquatilis Strohl and Tait 1978). International Journal of Systematic Bacteriology 46: 128–148. Bernardet JF, Nakagawa Y, Holmes B et al (2002) Proposed minimal standards for describing new taxa of the family Flavobacteriaceae and emended description of the family. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52(3): 1049-1070. Bernardet JF, Bowman JP (2006) The Genus Flavobacterium. Editör: Balows A, Trüper HG, Dworkin M, Harder W & Schleifer KH, The Prokaryotes. 2. Baskı, Springer-Verlag, New York, NY, pp: 481–531. Bernardet J and Bowman JP (2015). Flavobacterium. Editör: Whitman WB, Rainey F, Kämpfer P, Trujillo M, Chun J, DeVos P, Hedlund B and Dedysh S, Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Wiley, New York: 2015, pp: 1- 75. Bernardet JF, Grimont PAD (1989) Deoxyribonucleic Acid Relatedness and Phenotypic Characterization of Flexibacter columnaris sp. nov., nom. rev., Flexibacter psychrophilus sp. nov., nom. rev., and Flexibacter maritimus Wakabayashi, Hikida, and Masumura 1986. International Journal of Systematic Bacteriology 39: 346–354. Bernardet JF, Kerouault B (1989) Phenotypic and genomic studies of Cytophaga psychrophila isolated from diseases rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in France. Applied and Environmental Microbiology 55: 1796–1800. Bernardet JF, Nakagawa Y (2006) An Introduction to the Family Flavobacteriaceae. The Prokaryotes. Springer New York, pp: 455–480. Boutin, S., Bernatchez, L., Audet, C., ve Derôme, N. (2012). Antagonistic effect of indigenous skin bacteria of brook charr (Salvelinus fontinalis) against Flavobacterium columnare and F. psychrophilum. Veterinary Microbiology 155(2-4): 355-361. Boutin S, Audet C, Derome N (2013) Probiotic treatment by indigenous bacteria decreases mortality without disturbing the natural microbiota of Salvelinus fontinalis. Canadian Journal of Microbiology 59: 662–670. Bowman JP, Nowak B (2004) Salmonid gill bacteria and their relationship to amoebic gill disease. Journal of Fish Diseases 27: 483–492. Bowser PR (1973) Seasonal Prevalence Of Chondrococcus columnaris Infection in Black Bullheads From Clear Lake, Iowa. Journal of Wildlife Diseases 9: 115– 118. Boyacıoğlu M, Kum C, Kırkan Ş et al (2015) Comparison of in vitro and in vivo antibacterial efficacy for the control of Flavobacterium psychrophilum in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)) fry: the first genotypical evidence in West Aegean region of Turkey. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences 39: 314–321. Boyacioglu M, Akar F (2012) Isolation of Flavobacterium psychrophilum Causing 104 Rainbow Trout Fry Syndrome and Determination of an Effective Antibacterial Treatment in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Fry. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakultesi Dergisi 18: 197–203. Bravo S, Midtlyng PJ (2007) The use of fish vaccines in the Chilean salmon industry 1999-2003. Aquaculture 270: 36–42. Brown LL, Cox WT, Levine RP (1997) Evidence that the causal agent of bacterial cold-water disease Flavobacterium psychrophilum is transmitted within salmonid eggs. Diseases of Aquatic Organisms 29: 213–218. Bruun MS, Madsen L, Dalsgaard I (2003) Efficiency of oxytetracycline treatment in rainbow trout experimentally infected with Flavobacterium psychrophilum strains having different in vitro antibiotic susceptibilities. Aquaculture 215(1-4): 11-20. Bullock GL, Herman RL, Waggy C (1991) Hatchery efficacy trials with chloramine- T for control of bacterial gill disease. Journal of Aquatic Animal Health 3: 48– 50. Bullock G, Herman R, Heinen J et al (1994) Observations on the occurrence of bacterial gill disease and amoeba gill infestation in rainbow trout cultured in a water recirculation system. Journal of Aquatic Animal Health 6: 310–317. Burridge L, Weis JS, Cabello F et al (2010) Chemical use in salmon aquaculture: a review of current practices and possible environmental effects. Aquaculture 306: 7–23. Buschmann AH, Tomova A, López A et al (2012) Salmon aquaculture and antimicrobial resistance in the marine environment. PloS one 7(8)-e42724:1-11. Çağırgan H, Tanrıkul TT, Balta F (1997) Characteristics of yellow pigmented bacteria isolated from diseased Rainbow trout (Oncorhyncus mykiss). Eighth International Conference Diaseases of Fish and Shell Fish, pp: 73–81. Carson J, Schmidtke LM, Munday BL (1993) Cytophaga johnsonae: a putative skin pathogen of juvenile farmed barramundi, Lates calcarifer Bloch. Journal of Fish Diseases 16: 209–218. Castillo D, Higuera G, Villa M et al (2012) Diversity of Flavobacterium psychrophilum and the potential use of its phages for protection against bacterial cold water disease in salmonids. Journal of Fish Diseases 35: 193–201. Castillo D, Christiansen RH, Espejo R et al (2014) Diversity and geographical distribution of Flavobacterium psychrophilum isolates and their phages: patterns of susceptibility to phage infection and phage host range. Microbial Ecology 67: 748–757. Cattoir V, Nordmann P (2009) Plasmid-mediated quinolone resistance in gram- negative bacterial species: an update. Current Medicinal Chemistry 16: 1028– 1046. Cengiz M (2010) Bakterilerde Kinolon Direncinin Genetiği. Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 29(1): 55-60. Chakroun C, Urdaci MC, Faure D et al (1997) Random Amplified Polymorphic DNA analysis provides rapid differentiation among isolates of the fish pathogen Flavobacterium psychrophilum and among Flavobacterium species. Diseases of Aquatic Organisms 31: 187–196. Chakroun C, Grimont F, Urdaci MC et al (1998) Fingerprinting of Flavobacterium psychrophilum isolates by ribotyping and plasmid profiling. Diseases of Aquatic Organisms 33: 167–177. 105 Chang J-C, Hsueh P-R, Wu J-J et al (1997) Antimicrobial Susceptibility of Flavobacteria as Determined by Agar Dilution and Disk Diffusion Methods. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 41: 1301–1306. Chen C-R, Chung Y-Y, Kuo G-H (1982) Studies on the pathogenicity of Flexibacter columnaris . Effect of dissolved oxygen and ammonia on the pathogenicity of Flexibacter columnaris to eel (Anguilla japonica). CAPD Fisheries Series 8: 87– 61. Cipriano RC, Holt RA (2005) Flavobacterium psychrophilum , cause of Bacterial Cold-Water Disease and Rainbow Trout Fry Syndrome. Fish Disease Leaflet: 44- 50. Clark SE, Jude BA, Danner GR et al Identification of a multidrug efflux pump in Flavobacterium johnsoniae. Veterinary Research 40(6): 1-10. CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) (2006) Methods for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing of Bacteria Isolated from Aquatic Animals; Approved Guidelines. CLSI, Document, VET04-A2, Wayne, Pennsylvania, pp:1-20 CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) (2014a) Methods for broth dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals: approved guideline. CLSI, Document VET04-A2, Wayne, Pennsylvania, pp: 1-20. CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) (2014b) Performance standards for antimicrobial susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals; second informational supplement. CLSI document M42/49-S1. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pennsylvania, pp: 1-20. Collins, V. G. (1970). Recent studies of bacterial pathogens of freshwater fish. Society for Water Treatment and Examination 19: 3-31 Cousin S, Päuker O, Stackebrandt E (2007) Flavobacterium aquidurense sp. nov. and Flavobacterium hercynium sp. nov. from a hard-water creek. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57(2): 243-249. Crump EM, Burian J, Allen PD et al (2005) Identification and expression of a host- recognized antigen, FspA, from Flavobacterium psychrophilum. Microbiology 151: 3127–3135. Dalsgaard I, Madsen L (2000) Bacterial pathogens in rainbow trout, (Oncorhynchus mykiss) (Walbaum), reared at Danish freshwater farms. Journal of Fish Diseases 23: 199–209. Declercq AM, Haesebrouck F, Van den Broeck W et al (2013) Columnaris disease in fish: a review with emphasis on bacterium-host interactions. Veterinary Research 44: 27. Decostere A, Haesebrouck F, Devriese LA (1997) Shieh medium supplemented with tobramycin for selective isolation of Flavobacterium columnare (Flexibacter columnaris) from diseased fish. Journal of Clinical Microbiology 35: 322–4. Decostere A, Haesebrouck F, Turnbull JF et al (1999) Influence of water quality and temperature on adhesion of high and low virulence Flavobacterium columnare strains to isolated gill arches. Journal of Fish Diseases 22: 1–11. Depaola A, Peeler JT, Rodrick GE (1995) Effect of oxytetracycline-medicated feed on antibiotic resistance of gram-negative bacteria in catfish ponds. Applied and Environmental Microbiology 61: 2335–2340. Didinen BI, Diler Ö, Ekiçi S et al (2007) Flavobacterium psychrophilum izolatlarının teşhisinde API ZYM kullanımı ve ATB VET ile antimikrobiyal duyarlılığın belirlenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi Eğirdir Su Ürünleri Fakültesi 106 Dergisi 1(2): 64-70. Diler Ö, Altun S, Işıklı BI (2003) Kültürü yapılan gökkuşağı alabalıkları (Oncorhynchus mykiss)’ndan izole edilen Flavobacterium psychrophilum’un fenotipik karakterleri. SDÜ Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi 7: 1–8. Dolejska M, Bierošová B, Kohoutova L et al (2009) Antibiotic‐resistant Salmonella and Escherichia coli isolates with integrons and extended‐spectrum beta‐ lactamases in surface water and sympatric Black‐headed Gulls. Journal of Applied Microbiology 106: 1941–1950. Duman M, Altun S, Cengiz M et al (2017a) Genotyping and antimicrobial resistance genes of Yersinia ruckeri isolates from rainbow trout farms. Diseases of Aquatic Organisms 125(1): 31-44. Duman M, Saticioglu IB, Buyukekiz AG et al (2017b) Molecular characterization and antimicrobial resistance profile of atypical Citrobacter gillenii and Citrobacter sp. isolated from diseased rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Global Antimicrobial Resistance 10: 136-142. Dumetz F, Duchaud E, LaPatra SE et al (2006) A protective immune response is generated in rainbow trout by an OmpH-like surface antigen (P18) of Flavobacterium psychrophilum. Applied and Environmental Microbiology 72: 4845–4852. Durmaz Y, Onuk EE, Çiftci A (2012) Investigation of the presence and antibiotic susceptibilities of Flavobacterium psychrophilum in rainbow trout farms (Oncorhynchus mykiss) Walbaum, 1792) in The Middle and Eastern Black Sea Regions of Turkey. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 59: 141–146. Elliott J a, Facklam RR (1996) Antimicrobial susceptibilities of Lactococcus lactis and Lactococcus garvieae and a proposed method to discriminate between Antimicrobial Susceptibilities of Lactococcus lactis and Lactococcus garvieae and a Proposed Method To Discriminate between Them. Journal of Clinical Microbiology 34(5): 1296-1298. Evenhuis JP, Leeds TD, Marancik DP et al (2015) Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) resistance to columnaris disease is heritable and favorably correlated with bacterial cold water disease resistance. Journal of Animal Science 93: 1546– 1554. Farkas J (1985) Filamentous Flavobacterium sp. isolated from fish with gill diseases in cold water. Aquaculture 44: 1–10. Faruk M, Anka I (2017) An overview of diseases in fish hatcheries and nurseries. Fundamental and Applied Agriculture 2: 311. FEAP (Federation of European Aquaculture Producers) (2018). European Aquaculture Production Report 2008-2016. http://www.feap.info/default.asp?SHORTCUT=582 (18.07.2018). Ferguson HW, Ostland VE, Byrne P et al (1991) Experimental production of bacterial gill disease in trout by horizontal transmission and by bath challenge. Journal of Aquatic Animal Health 3: 118–123. Fernández‐Alarcón C, Miranda CD, Singer RS et al (2010) Detection of the floR gene in a diversity of florfenicol resistant Gram‐negative bacilli from freshwater salmon farms in Chile. Zoonoses and Public Health 57: 181–188. Flemming L, Rawlings D, Chenia H (2007) Phenotypic and molecular characterisation of fish-borne Flavobacterium johnsoniae-like isolates from aquaculture systems in South Africa. Research in Microbiology 158(1): 18-30. 107 Fox GE, Wisotzkey JD, Jurtshuk JR P (1992) How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 42: 166–170. Fraser SL, Jorgensen JH (1997) Reappraisal of the antimicrobial susceptibilities of Chryseobacterium and Flavobacterium species and methods for reliable susceptibility testing. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 41: 2738–2741. Fredriksen BN, Olsen RH, Furevik A et al (2013) Efficacy of a divalent and a multivalent water-in-oil formulated vaccine against a highly virulent strain of Flavobacterium psychrophilum after intramuscular challenge of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Vaccine 31: 1994–1998. Garnjobst L (1945) Cytophaga columnaris (Davis) in pure culture: a myxobacterium pathogenic to fish. Journal of Bacteriology 49: 113. Gibello A, Porrero MC, Blanco MM et al (2004) Analysis of the gyrA gene of clinical Yersinia ruckeri isolates with reduced susceptibility to quinolones. Applied and Environmental Microbiology 70: 599–602. Gliniewicz K, Plant KP, LaPatra SE et al (2012) Comparative proteomic analysis of virulent and rifampicin‐attenuated Flavobacterium psychrophilum. Journal of Fish Diseases 35: 529–539. Gómez E, Méndez J, Cascales D et al (2014) Flavobacterium psychrophilum vaccine development: a difficult task. Microbial Biotechnology 7: 414–423. Goñi-Urriza M, Arpin C, Capdepuy M et al (2002) Type II topoisomerase quinolone resistance-determining regions of Aeromonas caviae, A. hydrophila, and A. sobria complexes and mutations associated with quinolone resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46: 350–359. Von Graevenitz A (1990) Revised nomenclature of Campylobacter laridis, Enterobacter intermedium, and “Flavobacterium branchiophila.” International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 40: 211. Haburjak J, Schubert T (1997) Flavobacterium breve meningitis in a dog. Journal of the American Animal Hospital Association 33: 509–512. Henríquez-Núñez H, Evrard O, Kronvall G et al (2012) Antimicrobial susceptibility and plasmid profiles of Flavobacterium psychrophilum strains isolated in Chile. Aquaculture 354: 38-44.. Heo G-J, Kasai K, Wakabayashi H (1990) Occurrence of Flavobacterium branchiophila associated with bacterial gill disease at a trout hatchery. Fish Pathology 25: 99–105. Hernandez-Divers SJ, Hensel P, Gladden J et al (2009) Investigation of shell disease in map turtles (graptemys spp.). Journal of Wildlife Diseases 45: 637–652. Hesami S, Allen KJ, Metcalf D et al (2008) Phenotypic and genotypic analysis of Flavobacterium psychrophilum isolates from Ontario salmonids with bacterial coldwater disease. Canadian Journal of Microbiology 54: 619–629. Ho S-P, Hsu T-Y, Chen M-H et al (2000) Antibacterial effect of chloramphenicol, thiamphenicol and florfenicol against aquatic animal bacteria. Journal of Veterinary Medical Science 62: 479–485. Högfors-Rönnholm E, Wiklund T (2010) Phase variation in Flavobacterium psychrophilum: characterization of two distinct colony phenotypes. Diseases of Aquatic Organisms 90: 43–53. Högfors E, Pullinen K, Madetoja J et al (2008) Immunization of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) (Walbaum), with a low molecular mass fraction isolated 108 from Flavobacterium psychrophilum. Journal of Fish Diseases 31: 899–911. Holt R., Rohovec JS, Fryer JL (1993) Bacterial cold-water disease. Editör: Inglis, Roberts & Brombage, Bacterial Diseases of Fish. Blackwell Scientific Publications, Oxford, pp: 3–22. Holt RA, Bertolini J, Cain K et al (2012) Coldwater Disease. Editör: AFS-FHS (American Fisheries Society-Fish Health Section), FHS blue book: suggested procedures for the detection and identification of certain finfish and shellfish pathogens. 2016 yılı baskısı, Bethesda, Maryland, pp:1-30 Hooper DC (1999) Mechanisms of fluoroquinolone resistance. Drug Resistance Updates 2: 38–55. Humphry DR, George A, Black GW et al (2001) Flavobacterium frigidarium sp. nov., an aerobic, psychrophilic, xylanolytic and laminarinolytic bacterium from Antarctica. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51: 1235–1243. İspir Ü, Şeker E, Sağlam N et al (2004) Doğu Anadolu bölgesinde bazı gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss) işletmelerinde görülen Flavobacterium psychrophilum enfeksiyonunun araştırılması. Fırat Üniversitesi Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi 16: 718–724. Izumi S, Aranishi F, Wakabayashi H (2003) Genotyping of Flavobacterium psychrophilum using PCR-RFLP analysis. Diseases of Aquatic Organisms 56: 207–214. Izumi S, Ouchi S, Kuge T et al (2007) PCR-RFLP genotypes associated with quinolone resistance in isolates of Flavobacterium psychrophilum. Journal of Fish Diseases 30: 141–147. Johansen L-H, Jensen I, Mikkelsen H et al (2011) Disease interaction and pathogens exchange between wild and farmed fish populations with special reference to Norway. Aquaculture 315: 167–186. Jooste PJ, Britz TJ, Haast J De (1985) A numerical taxonomic study of Flavobacterium‐Cytophaga strains from dairy sources. Journal of Applied Bacteriology 59: 311–323. Jooste PJ, Hugo CJ (1999) The taxonomy, ecology and cultivation of bacterial genera belonging to the family Flavobacteriaceae. International Journal of Food Microbiology 53: 81–94. Karatas S, Ercan D, Steinum TM et al (2010) First isolation of a Flavobacterium johnsoniae like bacteria from cultured Russian sturgeon in Turkey. Journal of Animal and Veterinary Advances 9: 1943–1946. Kim JH, Hwang SY, Son JS et al (2011) Molecular characterization of tetracycline- and quinolone-resistant Aeromonas salmonicida isolated in Korea. Journal of Veterinary Science 12: 41–48. Kimura N, Wakabayashi H, Kudo S (1978) Studies on Bacterial Gill Disease in Salmonids. Fish Pathology 12: 233–242. Ko Y-M, Heo G-J (1997) Characteristics of Flavobacterium branchiophilum isolated from rainbow trout in Korea. Fish Pathology 32: 97–102. Kondo M, Kawai K, Okabe M et al (2003) Efficacy of oral vaccine against bacterial coldwater disease in ayu Plecoglossus altivelis. Diseases of Aquatic Organisms 55: 261–264. Korun J, Timur G (2001) Gökkuşağı Alabalıklarında (Onchorhynchus mykiss) fry mortalite sendromu (FMS) üzerinde bir çalışma. İstanbul Üniversitesi Su 109 Ürünleri Dergisi 12: 15–30. Kronvall G (2010) Normalized resistance interpretation as a tool for establishing epidemiological MIC susceptibility breakpoints. Journal of Clinical Microbiology 48: 4445–4452. Kubilay A, Altun S, Diler Ö et al (2008) Isolation of Flavobacterium columnare from Cultured Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) Fry in Turkey. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 8: 165–169. Kubilay A, Altun S, Didinen BI et al (2009) Isolation of Flavobacterium psychrophilum in Farmed Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakultesi Dergisi 15(5): 709-715. Kum C, Kirkan S, Sekkin S et al (2008) Comparison of in vitro antimicrobial susceptibility in Flavobacterium psychrophilum isolated from rainbow trout fry. Journal of Aquatic Animal Health 20(4): 245-251. Kumagai A, Nawata A (2011) Concentration of Flavobacterium psychrophilum in the Ovarian Fluid and Milt of Cultured Salmonids. Fish Pathology 46: 116–119. LaFrentz BR, LaPatra SE, Jones GR et al (2002) Characterization of serum and mucosal antibody responses and relative per cent survival in rainbow trout, (Oncorhynchus mykiss) (Walbaum), following immunization and challenge with Flavobacterium psychrophilum. Journal of Fish Diseases 25: 703–713. LaFrentz BR, LaPatra SE, Jones GR et al (2004) Protective immunity in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) following immunization with distinct molecular mass fractions isolated from Flavobacterium psychrophilum. Diseases of Aquatic Organisms 59: 17–26. LaFrentz BR, Goodwin AE, Shoemake. CA (2012) Columnaris Disease Editör: AFS- FHS (American Fisheries Society-Fish Health Section), FHS blue book: suggested procedures for the detection and identification of certain finfish and shellfish pathogens. 2016 yılı baskısı, Bethesda, Maryland, pp:1-20. Leeds TD, Silverstein JT, Weber GM et al (2010) Response to selection for bacterial cold water disease resistance in rainbow trout. Journal of Animal Science 88: 1936–1946. Li H, Qiao G, Gu J et al (2010) Phenotypic and genetic characterization of bacteria isolated from diseased cultured sea cucumber Apostichopus japonicus in northeastern China. Diseases of Aquatic Organisms 91: 223–235. Lievens B, Frans I, Heusdens C et al (2011) Rapid detection and identification of viral and bacterial fish pathogens using a DNA array-based multiplex assay. Journal of Fish Diseases 34: 861–875. De Liguoro M, Cibin V, Capolongo F et al (2003) Use of oxytetracycline and tylosin in intensive calf farming: evaluation of transfer to manure and soil. Chemosphere 52: 203–212. Lindstrom NM, Call DR, House ML et al (2009) A quantitative enzyme-linked immunosorbent assay and filtration-based fluorescent antibody test as potential tools to screen broodstock for infection with Flavobacterium psychrophilum. Journal of Aquatic Animal Health 21(1): 43-56. Loch TP, Fujimoto M, Woodiga SA et al (2013a) Diversity of Fish‐Associated Flavobacteria of Michigan. Journal of Aquatic Animal Health 25: 149–164. Loch TP, Faisal M (2014a) Flavobacterium spartansii sp. nov., a pathogen of fishes, and emended descriptions of Flavobacterium aquidurense and Flavobacterium araucananum. International Journal of Systematic and Evolutionary 110 Microbiology 64: 406–412. Loch TP, Faisal M (2014b) Deciphering the biodiversity of fish-pathogenic Flavobacterium spp. recovered from the Great Lakes basin. Diseases of Aquatic Organisms 112: 45–57. Loch TP, Faisal M (2015) Emerging flavobacterial infections in fish: A review. Journal of Advanced Research 6(3): 283-300. Loch TP, Faisal M (2017) Flavobacterium spp. Editör: Woo PTK & Cipriano RC, Fish viruses and bacteria: pathobiology and protection. CABI, Wallingford, pp: 211– 232. Lorenzen E, Dalsgaard I, From J et al (1991) Preliminary investigations of fry mortality syndrome in rainbow trout. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 11(2):77-79. Lorenzen E, Brudeseth BE, Wiklund T et al (2010) Immersion exposure of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fry to wildtype Flavobacterium psychrophilum induces no mortality, but protects against later intraperitoneal challenge. Fish & Shellfish Immunology 28: 440–444. Lorenzen E, Olesen NJ (1997) Characterization of isolates of Flavobacterium psychrophilum associated with coldwater disease or rainbow trout fry syndrome II: Serological studies. Diseases of Aquatic Organisms 31(3): 197-208. Lowrey L, Woodhams DC, Tacchi L et al (2015) Topographical mapping of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) microbiome reveals a diverse bacterial community in the skin with antifungal properties. Applied and Environmental Microbiology: AEM-01826:1-12. Lumsden JS, Ostland VE, MacPhee DD et al (1994) Protection of rainbow trout from experimentally induced bacterial gill disease caused by Flavobacterium branchiophilum. Journal of Aquatic Animal Health 6: 292–302. Madetoja J, Dalsgaard I, Wiklund T (2002) Occurrence of Flavobacterium psychrophilum in fish-farming environments. Diseases of Aquatic Organisms 52: 109–118. Madetoja J, Nystedt S, Wiklund T (2003) Survival and virulence of Flavobacterium psychrophilum in water microcosms. FEMS Microbiology Ecology 43: 217–223. Madetoja J, Wiklund T (2002) Detection of the fish pathogen Flavobacterium psychrophilum in water from fish farms. Systematic and Applied Microbiology 25: 259–266. Madsen L, Moller JD, Dalsgaard I (2005) Flavobacterium psychrophilum in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss) (Walbaum), hatcheries: studies on broodstock, eggs, fry and environment. Journal of Fish Diseases 28: 39–47. Madsen L, Dalsgaard I (1999) Reproducible methods for experimental infection with Flavobacterium psychrophilum in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Diseases of Aquatic Organisms 36: 169–176. Mainous ME, Kuhn DD, Smith SA (2012) Efficacy of common aquaculture compounds for disinfection of Flavobacterium and F. psychrophilum. Journal of Applied Aquaculture 24: 262–270. McCammon SA, Innes BH, Bowman JP et al (1998) Flavobacterium hibernum sp. nov., a lactose-utilizing bacterium from a freshwater Antarctic lake. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 48: 1405–1412. Michel C, Garcia C (2003) Virulence stability in Flavobacterium psychrophilum after storage and preservation according to different procedures. Veterinary Research 34: 127–132. 111 Minogue E, Barry T, Carroll C et al (2012) Setting epidemiological cut-off values for Aeromonas salmonicida disc diffusion data capable of discriminating between strains on the basis of their possession of sul1 genes. Aquaculture 364: 329–332. Miranda CD, Kehrenberg C, Ulep C et al (2003) Diversity of Tetracycline Resistance Genes in Bacteria from Chilean Salmon Farms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47: 883–888. Miranda CD, Tello A, Keen PL (2013) Mechanisms of antimicrobial resistance in finfish aquaculture environments. Frontiers in Microbiology 4:233. Nematollahi A, Decostere A, Pasmans F et al (2003) Flavobacterium psychrophilum infections in salmonid fish. Journal of Fish Diseases 26: 563–574. Ngo TPH, Smith P, Bartie KL et al (2017) Antimicrobial susceptibility of Flavobacterium psychrophilum isolates from the United Kingdom. Journal of Fish Diseases 41(2): 309-320. Nilsen H, Olsen AB, Vaagnes Ø et al (2011) Systemic Flavobacterium psychrophilum infection in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss) (Walbaum), farmed in fresh and brackish water in Norway. Journal of Fish Diseases 34: 403–408. Nogi Y, Soda K, Oikawa T (2005) Flavobacterium frigidimaris sp. nov., isolated from Antarctic seawater. Systematic and Applied Microbiology 28(4): 310-315. Nya EJ, Austin B (2011) Development of immunity in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), Walbaum) to Aeromonas hydrophila after the dietary application of garlic. Fish & Shellfish Immunology 30: 845–850. Oplinger RW, Wagner E (2010) Disinfection of Contaminated Equipment: Evaluation of Benzalkonium Chloride Exposure Time and Solution Age and the Ability of Air‐Drying to Eliminate Flavobacterium psychrophilum. Journal of Aquatic Animal Health 22: 248–253. Ordal EJ, Rucker RR (1944) Pathogenic myxobacteria. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 56: 15–18. Ostland VE, Lumsden JS, MacPhee DD et al (1994) Characteristics of Flavobacterium branchiophilum, the cause of salmonid bacterial gill disease in Ontario. Journal of Aquatic Animal Health 6: 13–26. Ostland VE, MacPhee DD, Lumsden JS et al (1995) Virulence of Flavobacterium branchiophilum in experimentally infected salmonids. Journal of Fish Diseases 18: 249–262. Ozcan M, Sarieyyupoglu M (2014) Identification and Investigation of Phenotypic and Genotypic Characteristics of Flavobacterium psychrophilum in Fry Raınbow Trouts (Oncorhynchus mykiss) in Some Trout. International Journal of Sciences (3): 24-34. Öztürk RÇ, Altınok İ (2014) Bacterial and Viral Fish Diseases in Turkey. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 14: 275–297. Pan J-C, Ye R, Wang H-Q et al (2008) Vibrio cholerae O139 multiple-drug resistance mediated by Yersinia pestis pIP1202-like conjugative plasmids. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 52: 3829–3836. Panangala VS, Shelby RA, Shoemaker CA et al (2006) Immunofluorescent test for simultaneous detection of Edwardsiella ictaluri and Flavobacterium columnare. Diseases of Aquatic Organisms 68: 197–207. Panangala VS, Shoemaker CA, Klesius PH (2007) TaqMan real‐time polymerase chain reaction assay for rapid detection of Flavobacterium columnare. Aquaculture Research 38: 508–517. 112 Peeler EJ, Taylor NG (2011) The application of epidemiology in aquatic animal health -opportunities and challenges. Veterinary Research 42(1): 94. Plant KP, LaPatra SE, Call DR et al (2011) Immunization of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss) (Walbaum), with Flavobacterium psychrophilum proteins elongation factor‐Tu, SufB Fe‐S assembly protein and ATP synthaseβ. Journal of Fish Diseases 34: 247–250. Prasad Y, Kumar D, Sharma AK (2011) Lytic bacteriophages specific to Flavobacterium columnare rescue catfish, Clarias batrachus (Linn.) from columnaris disease. Journal of Environmental Biology 32(2): 161-168. Rahman MH, Ototake M, Iida Y et al (2000) Efficacy of oil-adjuvanted vaccine for coldwater disease in ayu Plecoglossus altivelis. Fish Pathology 35: 199–203. Ramsrud AL, LaFrentz SA, LaFrentz BR et al (2007) Differentiating 16S rRNA alleles of Flavobacterium psychrophilum using a simple PCR assay. Journal of Fish Diseases 30: 175–180. Rhodes G, Huys G, Swings J et al (2000) Distribution of oxytetracycline resistance plasmids between aeromonads in hospital and aquaculture environments: implication of Tn1721 in dissemination of the tetracycline resistance determinant Tet A. Applied and Environmental Microbiology 66: 3883–3890. Rintamäki-Kinnunen P, Bernardet J-F, Bloigu A (1997) Yellow pigmented filamentous bacteria connected with farmed salmonid fish mortality. Aquaculture 149: 1–14. Romero J, Navarrete P (2006) 16S rDNA-based analysis of dominant bacterial populations associated with early life stages of coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Microbial Ecology 51: 422–430. Sarti M, Giorgettii G (1996) A survey of flexibacteriosis or Cytophaga lb. diseases on trout farms. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists 16: 8–12. Schmidt AS, Bruun MS, Dalsgaard I et al (2000) Occurrence of Antimicrobial Resistance in Fish-Pathogenic and Environmental Bacteria Associated with Four Danish Rainbow Trout Farms. Applied and Environmental Microbiology 66: 4908–4915. Segers P, Mannheım W, Vancanneyt M et al (1993) Riemerella anatipestifer gen. nov., comb. nov., the Causative Agent of Septicemia Anserum Exsudativa, and Its Phylogenetic Affiliation within the Flavobacterium-Cytophaga rRNA Homology Group. International Journal of Systematic Bacteriology 43: 768–776. Şen İ, Rad F (2016) Türkiye’de Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss), Walbaum, 1792) Yetiştiriciliğinde. Turkish Journal Agricultural Economics 22: 1–8. Shah SQA (2012a) Antimicrobial resistance in Fish Pathogenic and Aquatic Environmental Bacteria. Akademika Publishing, Oslo, pp:23-25. Shah SQA, Nilsen H, Bottolfsen K et al (2012b) DNA gyrase and topoisomerase IV mutations in quinolone-resistant Flavobacterium psychrophilum isolated from diseased salmonids in Norway. Microbial Drug Resistance 18: 207–214. Shah SQA, Cabello FC, L’Abée-Lund TM et al (2014) Antimicrobial resistance and antimicrobial resistance genes in marine bacteria from salmon aquaculture and non-aquaculture sites. Environmental Microbiology 16(5): 1310-1320. Shoemaker CA, Klesius PH, Drennan JD et al (2011) Efficacy of a modified live Flavobacterium columnare vaccine in fish. Fish & Shellfish Immunology 30: 304–308. 113 Siekoula-Nguedia C, Blanc G, Duchaud E et al (2012) Genetic diversity of Flavobacterium psychrophilum isolated from rainbow trout in France: Predominance of a clonal complex. Veterinary Microbiology 161: 169–178. Silverstein JT, Vallejo RL, Palti Y et al (2009) Rainbow trout resistance to bacterial cold-water disease is moderately heritable and is not adversely correlated with growth. Journal of Animal Science 87: 860–867. Smith P, Endris R, Kronvall G et al (2016) Epidemiological cut-off values for Flavobacterium psychrophilum MIC data generated by a standard test protocol. Journal of Fish Diseases 39(2): 143-154. Smith P, Finnegan W, Ngo T et al (2018) Influence of incubation temperature and time on the precision of MIC and disc diffusion antimicrobial susceptibility test data. Aquaculture 490: 19–24. Smith P, Kronvall G (2015) Effect of incubation temperature and time on the precision of data generated by antibiotic disc diffusion assays. Journal of Fish Diseases 38: 629–636. Soltani M, Munday B, Carson J (1994) Susceptibility of some freshwater species of fish to infection by Cytophaga johnsonae. Bulletin of European Fish Pathologists 14: 133–135. Soule M, LaFrentz S, Cain K et al (2005) Polymorphisms in 16S rRNA genes of Flavobacterium psychrophilum correlate with elastin hydrolysis and tetracycline resistance. Diseases of Aquatic Organisms 65: 209–216. Starliper CE (2012) Bacterial Gill Disease. Editör: AFS-FHS (American Fisheries Society-Fish Health Section), FHS blue book: suggested procedures for the detection and identification of certain finfish and shellfish pathogens. 2016 yılı baskısı, Bethesda, Maryland, pp:1-22. Stine OC, Johnson JA, Keefer-Norris A et al (2007) Widespread distribution of tetracycline resistance genes in a confined animal feeding facility. International Journal of Antimicrobial Agents 29: 348–352. Strohl WR, Taıt LR (1978) Cytophaga aquatilis sp. nov., a facultative anaerobe isolated from the gills of freshwater fish. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 28: 293–303. Ström‐Bestor M, Wiklund T (2011) Inhibitory activity of Pseudomonas sp. on Flavobacterium psychrophilum, in vitro. Journal of Fish Diseases 34: 255–264. Sundell K, Högfors-Rönnholm E, Wiklund T (2014) Vaccination against Diseases Caused by Flavobacteriaceae Species. Editör: Guddingn R, Lillehaug A & Øystein E, Fish Vaccination. 1st edn. Wiley-Blackwell, Oxford, pp: 273–282. Sundell K, Wiklund T (2011) Effect of biofilm formation on antimicrobial tolerance of Flavobacterium psychrophilum. Journal of Fish Diseases 34(5): 373-383. Suomalainen L, Bandilla M, Valtonen ET (2009) Immunostimulants in prevention of columnaris disease of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss) (Walbaum). Journal of Fish Diseases 32: 723–726. Swain P, Mishra S, Dash S et al (2007) Association of Flavobacterium branchiophilum in bacterial gill disease of Indian major carps. The Indian Journal of Animal Sciences 77(7):1-20. Tabata K (2004) Relationships of the infectivity of Flavobacterium psychrophilum between native fishes and released ayu Plecoglossus altivelis in a river. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries (Japan) 70(3): 318-323 Timur G, Timur M, Korun J (2004) A study on the outbreak of Flavobacterium 114 psychrophilum infection in a rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hatchery in Turkey. Istanbul University Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 17: 21–27. TÜİK (2018) Türkiye İstatistik Kurumu, Su Ürünleri İstatı̇stı̇klerı̇, https://www.tarim.gov.tr/sgb/Belgeler/SagMenuVeriler/BSGM.pdf, (04.06.2018). TÜİK (2013) Türkiye İstatistik Kurumu, Su Ürünleri İstatı̇stı̇klerı̇, Su Ürünleri İstatistikleri, http://www.tuik.gov.tr/IcerikGetir.do?istab_id=52, (04.06.2018). Ture M, Boran H (2015) Phenotypic and genotypic antimicrobial resistance of Lactococcus sp. strains isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy 59: 37–42. Valdebenito S, Avendaño-Herrera R (2009) Phenotypic, serological and genetic characterization of Flavobacterium psychrophilum strains isolated from salmonids in Chile. Journal of Fish Diseases 32(4): 321-333. Van TTH, Chin J, Chapman T et al (2008) Safety of raw meat and shellfish in Vietnam: an analysis of Escherichia coli isolations for antibiotic resistance and virulence genes. International Journal of Food Microbiology 124: 217–223. Verner-Jeffreys DW, Brazier T, Perez RY et al (2017) Detection of the florfenicol resistance gene floR in Chryseobacterium isolates from rainbow trout. Exception to the general rule?. FEMS Microbiology Ecology 93(4):1-11. Vliet D Van, Loch TP, Smith P et al Antimicrobial Susceptibilities of Flavobacterium psychrophilum Isolates from the Great Lakes Basin, Michigan. Microbial Drug Resistance 23(6): 791-798. Wakabayashi H, Huh GJ, Kimura N (1989) Flavobacterium branchiophila sp. nov., a causative agent of bacterial gill disease of freshwater fishes. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 39: 213–216. Wakabayashi H (1991) Effect of environmental conditions on the infectivity of Flexibacter columnaris to fish. Journal of Fish Diseases 14: 279–290. Wakabayashi H (1993) Columnaris disease. Editör: Inglis RJR & Bromage NR, Bacterial Diseases of Fish. V. edition, Blackwell science Ltd, Oxford, pp: 23–39. Wang N, Yang X, Jiao S et al (2014) Sulfonamide-Resistant Bacteria and Their Resistance Genes in Soils Fertilized with Manures from Jiangsu Province, Southeastern China (JL Balcazar, Ed. by ). PLoS ONE 9: e112626. Welker TL, Shoemaker CA, Arias CR et al (2005) Transmission and detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus. Diseases of Aquatic Organisms 63: 129–138. Wiens GD, LaPatra SE, Welch TJ et al (2014) Complete genome sequence of Flavobacterium psychrophilum strain CSF259-93, used to select rainbow trout for increased genetic resistance against bacterial cold water disease. Genome Announcements 2: e00889. WHO (2006) Report of a joint FAO/OIE/WHO Expert Consultation on antimicrobial use in aquaculture and antimicrobial resistance, Seoul, Republic of Korea, 13–16 http://www.fao.org/3/a-bq501e.pdf, (03.07.2018). Wiklund, Kaas, Lonnstrom et al (1994) Isolation of Cytophaga psychrophila (Flexibacter psychrophilus) from wild and farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Finland. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol 14(2): 44-46. Wilkins LGE, Rogivue A, Schütz F et al (2015) Increased diversity of egg-associated bacteria on brown trout (Salmo trutta) at elevated temperatures. Scientific Reports 5: 17084. 115 Wong S, Waldrop T, Summerfelt S et al (2013) Aquacultured rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) possess a large core intestinal microbiota that is resistant to variation in diet and rearing density. Applied and Environmental Microbiology: AEM-00924. Xie Z-Y, Zhou Y-C, Wang S-F et al (2009) First isolation and identification of Elizabethkingia meningoseptica from cultured tiger frog, Rana tigerina rugulosa. Veterinary Microbiology 138: 140–144. Yang S, Carlson K (2004) Routine monitoring of antibiotics in water and wastewater with a radioimmunoassay technique. Water Research 38: 3155–3166. Yıldırım Y (2010) Antimikrobiyel Duyarlılık Testleri; İlgili Metodlar, Sonuçların Yorumlanması ve Kanatlılarda Bulunan Bazı Bakterilerdeki Dirençlilik. Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi 7(2): 117–129. Yilmaz E, Yilmaz A, Bilgin B et al (2011) Alabalık Kuluçkahanelerinde Görülen Önemli Hastalıklar ve Tedavi Yöntemleri. Türk Bilimsel Derlemeler Dergisi (2): 37-39. Yıldırım S, Özer S (2010) Mersin İli Çağlarca Köyündeki Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus mykiss), Walbaum, 1792) Kuluçkahanelerinde Flavobacterium Spp. varlığı. Journal of FisheriesSciences. com 4(1): 112–122. Zamora L, Fernández-Garayzábal JF, Svensson-Stadler LA et al (2012) Flavobacterium oncorhynchi sp. nov., a new species isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Systematic and Applied Microbiology 35: 86–91. Zamora L, Vela AI, Sánchez-Porro C et al (2013a). Characterization of flavobacteria possibly associated with fish and fish farm environment. Description of three novel Flavobacterium species: Flavobacterium collinsii sp. nov., Flavobacterium branchiarum sp. nov., and Flavobacterium branchiicola sp. nov. Aquaculture 416: 346-353 Zamora L, Fernández-Garayzábal JF, Sánchez-Porro C et al (2013b) Flavobacterium plurextorum sp. nov. Isolated from Farmed Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). PLoS ONE 8(6): e67741. Zamora L, Vela AI, Sánchez-Porro C et al (2014) Flavobacterium tructae sp. nov. and Flavobacterium piscis sp. nov., isolated from farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64: 392–399. Zhang DC, Wang HX, Liu HC et al (2006) Flavobacterium glaciei sp. nov., a novel psychrophilic bacterium isolated from the China No. 1 glacier. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56(12): 2921-2925. 116 7. SİMGELER ve KISALTMALAR % : Yüzde AML : Amoksisilin BCWD : Bakteriyel soğuk su hastalığı BGD : Bakteriyel Solungaç Hastalığı Bp : Baz Çifti BSGM : Balıkçılık ve Su Ürünleri Genel Müdürlüğü CA : Canlı ağırlık Dk : Dakika DMHA : Dilue Müller Hinton Agar ELISA : Enzim ilintili immün test ENR : Enrofloksasin ERM : Eritromisin FAT : Floresan antikor testi FDS : Fötal dana serumu FEAP : Avrupa akuakültür yetiştiricilik federasyonu FFC : Florfenikol IFAT : İndirekt floreasan antikor Testi Kob : koloni oluşturan birim MİK : Minimum inhibisyon konsantrasyonu mM : Mili Molar NaCl : Sodyum klorür OA : Oksalinik Asit OT : Oksitetrasiklin PCR : Polimeraz zincir reaksiyonu pmol : Piko Mol RFLP : Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi RTFS : Gökkuşağı alabalığı yavru sendromu Sn : Saniye SXT : Sulfamethoksazol/trimetoprim TYES : Tryptone yeast extract salts agar µl : Mikro litre µM : Mikro Molar 117 8. TEŞEKKÜR Tez çalışmamın her aşamasında yardımlarını ve yol göstericiliğini esirgemeyen, akademik hayata atılmama vesile olan ve bugünlere gelmemde büyük emeği geçen danışmanım Sayın Prof. Dr. Soner ALTUN’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarımın örnekleme aşamasında bana yardımcı olan çalışma arkadaşım Ayşe Gül BÜYÜKEKİZ’e, fakültemizdeki öğrenci arkadaşlarım ve çalışmalarımda katkısı olan tüm arkadaşlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. Doktora çalışmalarım süresince yapılan proje çalışmalarında kapılarını sonuna kadar açan, çalışmalarımızda her türlü kolaylığı sağlayan ve tecrübelerini aktaran işletmelerin yönetim ve tüm çalışanlarına şükranlarımı sunuyorum. Tez çalışmalarımın proje ile maddi olarak desteklenmesine olanak sağlayan Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumuna (TÜBİTAK) çok teşekkür ederim. Tez çalışmalarımın gerek örnekleme ve laboratuvar çalışmaları kısmında, gerekse tezimin hazırlanması ve düzenlenmesi sırasında yardımlarını esirgemeyen değerli arkadaşım Araş. Gör. Dr. Muhammed DUMAN’a çok teşekkür ederim. Gerek lisans gerekse doktora eğitimim boyunca tüm zorlukları benimle göğüsleyen, her daim üşenmeden yardıma koşan değerli dostum Araş. Gör. Dr. Bayram SÜZER’e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bugünlere ulaşmamdaki en büyük pay sahibi olan, her zaman destek ve duaları ile yanımda olan, annem Serpil SATICIOĞLU’na, babam Mehmet SATICIOĞLU’na ve kardeşlerime teşekkürlerimi sunarım. Özellikle, bu zorlu doktora sürecinde bütün sıkıntılarıma sabır gösteren ve zaman zaman ihmal ettiğim eşim Betül SATICIOĞLU ve oğlum Mehmet Erdem SATICIOĞLU’e sonsuz sevgi, hürmet ve teşekkürlerimi sunarım. 118 9. ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı: İzzet Burçin SATICIOĞLU Doğum Yılı: 1988 Doğum Yeri: Diyarbakır EĞİTİM 2013-2018 Uludağ Üni. Veteriner Fak. Su Ürünleri Hastalıkları A.D. (doktora) 2008-2012 Uludağ Üniversitesi, Veteriner Fakültesi (Yüksek Lisans), Bursa 2006-2008 Ondokuz Mayıs Üniversitesi Veteriner Fakültesi 2004-2005 Atatürk Lisesi, Mersin 2002-2004 Ziya Gökalp Lisesi, Diyarbakır 1999-2002 Ali Emiri İlköğretim Okulu, Diyarbakır 1994-1999 Hüseyin Gazi İlkokulu, Zile/Tokat Yabancı Dil Yeteneği: İngilizce  77,5 (YDS, 2013- İlkbahar)  83,75 (YÖKDİL, 2017, Sonbahar) Alınan Eğitimler ve Sertifikalar 1. Deney Hayvanları Kullanım Sertifikası. Uludağ Üniversitesi. 2014 2. PCR Temelli Genetik Analizler Yaklaşımlar, Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü 2017 3. DNA Barkodlama ve Filogenetik Analiz, Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü 2017 4. TÜBİTAK-BİDEB Proje Yazma Eğitimi, Süleyman Demirel Üniversitesi, 2017 119 Projelerde Yaptığı Görevler: 1. Ülkemizde Gökkuşağı alabalığı İşletmelerinde Sıklıkla Karşılaşılan Motil Aeromonas (Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae), Yersinia ruckeri ve Lactococcus garvieae etkenlerinde antimikrobiyal direnç, Sülfonamidler Tetrasiklin Florfenikol ve Eritromisin ve IPN, VHS, IHN virüslerinin varlığının incelenmesi, TAGEM/14/AR- GE/26 (Tarımsal Araştırmalar ve Politikalar Genel Müdürlüğü), Araştırmacı, 21/07/2014 (ULUSAL). 2. Gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus mykiss, Walbaum 1792) kuluçkahanelerinde hastalık oluşturan Flavobacterium türlerinin genotipik karakterizasyonu ve antimikrobiyal direnç gelişiminde rol oynayan genlerin varlığı-yaygınlığının belirlenmesi, Bursiyer, TÜBİTAK, Proje no: 116O626, 2016-(devam ediyor) 3. Gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss Walbaum 1792) Yersinia ruckeri, Listonella anguillarum, Lactococcus garvieae ve Deniz levreklerinde (Dicentrarchus labrax L., 1758) Listonella anguillarum, Photobacterium damselae subsp. piscicida’ya karşı monovalan banyo emülsiyon ve polivalan enjeksiyon emülsiyon inaktif aşı üretilmesi, Araştırmacı, , 01/07/2018 (ULUSAL) -(devam ediyor). 4. Akuakültürden izole edilen Vibrio spp. ve Pseudomonas spp. türlerinin identifikasyonu, genotiplendirilmesi, antimikrobiyal duyarlılık ve direnç genlerinin belirlenmesi, Araştırmacı, TÜBİTAK, Proje no: 118O420, 2018-(devam ediyor) Araştırma makaleleri Uluslararası hakemli dergilerde yayımlanan makaleler: 1. Saticioglu, I. B., Duman, M., & Altun, S. (2018). Antimicrobial resistance and molecular characterization of Pantoea agglomerans isolated from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fry. Microbial pathogenesis, 119, 131-136 2. Saticioglu, I. B., Duman, M., Wiklund T., Altun, S. (2018).Serological and genetic characterization of Flavobacterium psychrophilum isolated from farmed salmonids in Turkey. J Fish Dis. https://doi.org/ 10.1111/jfd.12901 3. Duman M, Satıcıoglu IB, Janda JM, Altun S. (2018). The determination of the infectious status and prevalence of motile Aeromonas species isolated from Disease cases in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and aquarium fish. J Fish Dis. 2018;00:1–15. https://doi.org/10.1111/jfd.12896 4. Duman, M., A. G. Buyukekiz, I. B. Saticioglu, M. Cengiz, P. Sahinturk. S. Altun, 2017. Epidemiology, Genotypic Diversity, and Antimicrobial Resistance of Lactococcus garvieae in Farmed Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Iranian Journal of Fisheries Science. In press. 5. Duman, M., I. B. Saticioglu, A. G. Buyukekiz, F. Balta, S. Altun, 2017. Molecular Characterization and Antimicrobial Resistance Profile of Atypical Citrobacter gillenii and Citrobacter sp. isolated from diseased rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Journal of Global Antimicrobial Resistance. S2213-7165(17)30101-7. https://doi.org/10.1016/j.jgar.2017.05.014. 6. Duman, M., S. Altun, M. Cengiz, I. B. Saticioglu, A. G. Buyukekiz, P. Sahinturk. 2017. Genotyping and antimicrobial resistance genes of Yersinia ruckeri isolates from rainbow trout farms. Diseases of Aquatic Organisms, DOI https://doi.org/10.3354/dao03132. 120 7. Büyükekiz A. G., Altun S., Furuseth Hansen E., Satıcıoğlu İ. B., Duman M., Markussen T., Rimstad E., 2017. Infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) serotype Sp is prevalent in Turkish rainbow trout farms. Journal of Fish Diseases DOI: 10.1111/jfd.12675. Uluslararası bilimsel toplantılarda sunulan ve bildiri kitaplarında (proceedings) basılan bildiriler: 1. Yavaş Ö., Duman M., Satıcıoğlu İ. B., Garip E., Karaer F., & Altun, S. Akuakültürde Tespit Edilen Fekal Koliform Kökenli Antimikrobiyal Direnç Genleri. 2018. Uluslararası Su ve Çevre Kongresi, 22-24 Mart, Bursa 2. Duman M., Altun S., Satıcıoğlu İ. B., Büyükekiz A. G. 2016. Genotyping of Lactococcus garvieae Isolated From Rainbow Trout By RAPD PCR Using M13 And P5 Primers In Turkey. AquaEpi I, Doi: 10.3389/conf.FVETS.2016.02.00017 (Özet Bildiri/) 3. Duman M., Altun S., Büyükekiz A. G., Satıcıoğlu İ. B. 2016. Genotyping of Yersinia ruckeri Isolated From Rainbow Trout In Turkey By RAPD PCR. AquaEpi I, Doi: 10.3389/conf. FVETS.2016.02.00016 (Özet Bildiri/) 4. Büyükekiz A. G., Altun S., Furuseth Hansen E., Burçin Satıcıoğlu İ. B., Duman M., Markussen T., Rimstad E., 2017. Infectious pancreatic necrosis virus is prevalent in farmed rainbow trout in Turkey. 10th International Symposium on Viruses of Lower Vertebrates. 5. Saticioglu I. B., Duman M., Buyukekiz A. G., Sahinturk P., Cengiz M., Altun S., 2017. Determination of Oxytetracycline Resistance of Yersinia ruckeri Isolated From Rainbow Trout in Turkey. 33. World Veterinary Congress, WVC Incheon, Korea. 6. Saticioglu I. B., Buyukekiz A. G., Duman M., Altun S., 2017.Detection of the First Sulfanamid Resistance Genes Positivity in Aquatic Myroides spp. Isolates in Turkey. 33. World Veterinary Congress, WVC Incheon, Korea. 7. Saticioglu I. B., Duman M., Buyukekiz A. G., Altun S., 2017. Atypical Strains of Enterobacter cloacae and Enterobacter asburiae Isolated From Rainbow Trouts. 33. World Veterinary Congress, WVC Incheon, Korea. Ulusal hakemli dergilerde yayımlanan makaleler: 1. Altun S., Saticioglu I. B., Duman M., Buyukekiz A. G., Oruç H. H. Akuakültürde Toksikoloji. Türkiye Klinikleri J. Vet. Sci. Pharmacol Toxicol- Special Topics 2015;1(3)27-36 2. Duman, M, Satıcıoglu, I , Altun, S . (2018). Biochemical Differences and Rapid Identification of Yersinia ruckeri and Lactococcus garvieae Isolated from Aquaculture. Uludag University Journal of the Faculty of Veterinary Medicine, 37 (1), 37-47. DOI: 10.30782/uluvfd.399275 3. Yavaş Ö., Duman M., Satıcıoğlu İ. B., Garip E., Karaer F., & Altun, S. Akuakültürde Tespit Edilen Fekal Koliform Kökenli Antimikrobiyal Direnç Genleri. İklim Değişikliği ve Çevre, 3(1), 22-26. 121 Ulusal bilimsel toplantılarda sunulan ve bildiri kitaplarında basılan bildiriler: 1. Duman M., Altun S., Cengiz M., Büyükekiz A. G., Satıcıoğlu İ. B. 2016. Gökkuşağı Alabalığı (Oncorhynchus Mykiss, Walbaum 1792) Çiftliklerinde Hastalık Oluşturan Lactococcus garvieae Enfeksiyonlarında Antimikrobiyal Direncin Yaygınlığı. 5. Ulusal Veteriner Farmakoloji ve Toksikoloji Kongresi, Bursa 2. Altun S., Duman M., Büyükekiz A. G., Satıcıoğlu İ. B. 2016. Türkiye’deki Gökkuşağı Alabalığı Çiftliklerinden İzole Edilen Yersinia ruckeri İzolatlarının Rapd-Pcr Yöntemiyle Genotiplendirilmesi. 12. Veteriner Hekimleri Mikrobiyoloji Kongresi 3. Altun S., Duman M., Satıcıoğlu İ. B. Büyükekiz A. G., 2016. Türkiye’deki Gökkuşağı Alabalığı Çiftliklerinden 2013-2015 Yılları Arasında İzole Edilen L. garvieae İzolatlarının Genetik Akrabalıklarının Belirlenmesi. 12. Veteriner Hekimleri Mikrobiyoloji Kongresi 4. Büyükekiz A.G., Altun S., Duman M., Satıcıoğlu İ. B. 2016. Türkiye’de Gökkuşağı Alabalığı İşletmelerinde İnfeksiyöz Pankreatik Nekrozis Hastalığının Dağılımı Nevşehir/Türkiye 5. Satıcıoğlu İ. B., Altun S., Duman M., Büyükekiz A.G. 2016. Kültürü Yapılan Balıklarda Aşı Kullanımı 12. Veteriner Hekimleri Mikrobiyoloji Kongresi, Nevşehir (Türkiye) 6. Altun S., Satıcıoğlu İ. B. Büyükekiz A. G., Duman M. 2013. Gökkuşağı Alabalığı İşletmelerindeki Hastalık Vakalarından İzole Edilen Bakteriyel Etkenlerin Antimikrobiyal Duyarlılıkların İncelenmesi İstanbul, P-142 122