 30-35 mm T. C. ULUDAĞ ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ PATOLOJĠ ANABĠLĠM DALI SIĞIRLARDA MYCOPLASMA BOVIS PNÖMONĠLERĠNDE HĠSTOPATOLOJĠK VE ĠMMUNOHĠSTOKĠMYASAL BULGULAR RahĢan YILMAZ (DOKTORA TEZĠ) Bursa-2009 T. C. ULUDAĞ ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ PATOLOJĠ ANABĠLĠM DALI SIĞIRLARDA MYCOPLASMA BOVIS PNÖMONĠLERĠNDE HĠSTOPATOLOJĠK VE ĠMMUNOHĠSTOKĠMYASAL BULGULAR RahĢan YILMAZ (DOKTORA TEZĠ) DanıĢman: Yard.Doç.Dr. Ġ.Taci CANGÜL Bursa-2009 Bu tez Uludağ Üniversitesi Bilimsel AraĢtırma Projeleri Biriminin V2008/12 nolu projeye sağlamıĢ olduğu finansal destek ile gerçekleĢtirilmiĢtir. ĠÇĠNDEKĠLER TÜRKÇE ÖZET………………………………………………………….…….................... III ĠNGĠLĠZCE ÖZET…………………………………………………………………………. IV GĠRĠġ……………………………………………………………………………………...... 1 GENEL BĠLGĠLER……………………………………………………………………….... 3 PNÖMONĠLER…………………………………………………………………….... 3 1. Bronkopnömoni………………………………………………………………….... 3 2. Ġntersitisyel pnömoni…………………………………………………………….... 5 3. Özel pnömoni Ģekilleri……….………………………………………………........ 7 Embolik-metastatik pnömoni…………………………………………………. 7 Aspirasyon pnömonisi………………………………………………………… 7 Gangrenli pnömoni……………………………………………………………. 7 Granülomatöz pnömoni……………………………………………………….. 8 MYCOPLASMA BOVIS…………………………………………………………….... 9 Tarihçe……………………………………………………................................ 9 Taksonomi…………………………………………………………………...... 9 M. bovis’in biyolojik özellikleri………………………………………………. 9 M. bovis enfeksiyonunun epidemiyolojisi…………………………………….. 10 M. bovis’in enfeksiyonunun patogenezisi ve etkenin immunojenitesi …...…... 11 M. bovis enfeksiyonunda klinik bulgular……………………………………... 12 M. bovis enfeksiyonunun tanısı………...……………………………………... 13 M. bovis pnömonileri………………………………………………………….. 13 GEREÇ ve YÖNTEM……………………………………………………………………… 15 Hayvan materyali……………………………………………………………............. 15 Dokuların iĢlenmesi………………………………………………………………….. 15 Hematoksilen-eozin boyama yöntemi………………………………………………... 16 Hematoksilen-eozin boyama sonuçları için değerlendirme kriterleri……................... 16 Ziehl-Neelsen boyama yöntemi……………………………………………………… 17 Mikrobiyolojik inceleme……………………………………………………………... 17 Ġmmunohistokimyasal boyama yöntemi……………………………………………... 18 Ġmmunohistokimyasal boyama sonuçları için değerlendirme kriterleri……………… 20 Preparatların incelenmesi…………………………………………………….............. 21 Ġstatistiksel değerlendirme…………………………………………………………… 21 I BULGULAR……………………………………………………………………………….. 22 M. bovis pnömonilerinin yaygınlığı………………………..………………………… 22 Makroskobik bulgular……………………………………………………………….. 23 Histopatolojik bulgular………………………………………………………………. 23 Farklı pnömoni tipleri-pnömoni Ģiddeti arasındaki iliĢki………………….................. 24 Ziehl-Neelsen boyama sonuçları……………………………………………………... 26 Mikrobiyolojik inceleme sonuçları…………………………………………………... 26 Pnömoni Ģiddeti ile koenfeksiyon varlığı arasındaki iliĢki…………………….…….. 29 Ġmmunohistokimyasal boyama sonuçları…………………………………….............. 29 M. bovis boyama sonuçları…………………………………………………………... 29 M. bovis mikrobiyolojik ekim-immunohistokimya sonuçlarının karĢılaĢtırılması ….. 29 Ġmmunohistokimyasal M. bovis pozitivitesi-pnömoni Ģiddeti arasındaki iliĢki……… 33 Ġmmunohistokimyasal M. bovis pozitivitesi-nekroz varlığı arasındaki iliĢki…………. 33 Yangı hücreleri için yapılan boyamaların sonuçları…………………………............. 33 Yangı hücrelerinin yoğunluğu ve dağılımı…………………………………………... 34 Bakteriyel koenfeksiyon varlığı-yangı hücresi sayısı arasındaki iliĢki………………. 35 Nekroz varlığı-yangı hücresi sayısı arasındaki iliĢki………………………………… 35 Ġmmunohistokimyasal M. bovis pozitivitesi-yangı hücresi sayısı arasındaki iliĢki....... 36 TARTIġMA ve SONUÇ………………………………………………………………….... 37 Etkenin yaygınlığı……………………………………………………………………. 37 Makroskobik bulgular………………………………………………………………... 38 Mikroskobik bulgular………………………………………………………………… 38 Pnömonilerin sınıflandırılması………………………………………………............. 38 Hastalığın geliĢiminde bronĢ ve bronĢiyollerin rolü…………………………………. 39 Nekroz geliĢimi………………………………………………………………………. 39 Koenfeksiyonlar……………………………………………………………………… 40 Ġmmunohistokimyasal boyamalar……………………………………………………. 41 M. bovis boyamaları………………………………………………………….............. 41 Yangı hücrelerinin boyamaları……………………………………………….............. 43 KAYNAKLAR…………………………………………………………………………….. 45 TEġEKKÜR………………………………………………………………………………... 53 ÖZGEÇMĠġ………………………………………………………………………………... 54 II ÖZET Bu çalıĢmada Bursa ili ve çevresinde yer alan mezbahalarda kesilen sığırlarda Mycoplasma bovis pnömonilerinin prevalansının ortaya konması, etkenin oluĢturduğu pnömoninin histopatolojik incelenmesi, etkenin bakteriyolojik ve immunohistokimyasal olarak ortaya konması ve etkene karĢı geliĢen yangısal yanıtın karakterize edilmesi amaçlanmıĢtır. ÇalıĢmada mezbahalarda kesilen toplam 1413 sığırın akciğerleri incelenmiĢ, bunlardan 136’sında (% 9,63) pnömoni bulguları gözlenerek örnek alınmıĢtır. Yine Patoloji Anabilim Dalı arĢivindeki pnömoni bulgulu 10 vaka da çalıĢmaya dahil edilmiĢtir. Yapılan mikrobiyolojik ekim ve immunohistokimyasal boyamalar sonrası toplam 39 hayvanda M. bovis pnömoni sebebi olarak ortaya konmuĢ, böylece bölgemizde pnömoni bulguları gösteren hayvanlarda M. bovis’in prevalansı % 26,71 olarak tespit edilmiĢtir. Ġncelenen olgularda M. bovis pozitif hayvanlarda en sık olarak etkilenen akciğer lobunun sağ kranial lobun pars kranialisi (pars cranialis dextra) olduğu saptanmıĢtır. M. bovis 30 vakada tek etken olarak bulunurken, 8 vakada diğer bakteriyel etkenler de izole edilmiĢtir. Bir vakada sadece immunohistokimyasal inceleme sonucunda teĢhis konmuĢtur. Pnömoniler eksudat yapısı ve etkilenen kısımlar yönünden incelendiğinde toplamda 7 grupta sınıflandırılmıĢ, en fazla gözlenen pnömoni tiplerinin fibrinopurulent bronkopnömoni (10 hayvan), non-purulent bronkointersitisyel pnömoni (6 hayvan) ve nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömoni (6 hayvan) olduğu görülmüĢtür. M. bovis pnömonili hayvanların 18’inde akciğerlerde nekrotik alanların (11 kazeifikasyon nekrozu ve 7 koagulasyon nekrozu) varlığı gözlenmiĢtir. Etken 24 hayvanda immunohistokimyasal boyamalar ile ortaya konmuĢ, etkene en fazla bronĢ ve bronĢiyol epitellerinde (20 hayvan) rastlanmıĢtır. Yangı hücreleri için yapılan boyamalar M. bovis pnömonilerinde en fazla bulunan yangı hücresinin T lenfosit olduğunu göstermiĢ ve M. bovis pnömonilerinde hücresel savunmanın rolünü desteklemiĢtir. Anahtar Kelimeler: M. bovis, pnömoni, immunohistokimya, sığır III SUMMARY The aim of this study was to determine the prevalence of M. bovis pneumonia in slaughtered cattle in Bursa region, to perform the histopathological investigation of these cases, to demonstrate the agent with bacteriological and immunohistological examination and to characterize the inflammatory response against the agent. A total of 1413 lungs were examined at slaugherhouses and 136 lungs (9.63 %) with signs of pneumonia were sampled. Ten pneumonic lungs from the department archive were also included in the study. Bacteriological and immunohistochemical examination revealed M. bovis as the cause of pneumonia in 39 animals, thus the prevalence of M. bovis in pneumonic lungs in Bursa region was determined as 26.71 %. The most commonly affected lung lobe was the cranial part of the right cranial lobe. M. bovis was the only microorganism in 30 animals, whereas in 8 animals other bacteria were also isolated. In one case, the diagnosis was made solely on the basis of the immunohistochemical examination results. In the classification of pneumonia regarding the exudate and the anatomic pattern, the most common pneumonia type was fibrinopurulent bronchopneumonia (10 animals), non-purulent bronchointersititial pneumonia (6 animals) and necrotic-fibrinopurulent bronchopneumonia (6 animals). Necrotic areas (11 caseification and 7 coagulation) were observed in a total of 18 cases. The agent was demonstrated by immunohistochemistry in 24 animals, bronchi and bronchioli epithelia being the most commonly (20 animals) invaded histological structures. Immunohistochemistry revealed T cell as the most prominent inflammatory cell in M. bovis pneumonia, thus supporting the role of cellular defense in the pathogenesis of these pneumonia in cattle. Keywords: M. bovis, pneumonia, immunohistochemistry, cattle IV GĠRĠġ Türkiye Ġstatistik Kurumu (TÜĠK) 2008 yılı geçici verilerine göre ülkemizde toplam 10.859.942 adet sığır bulunmakta ve 482.458 ton olan yıllık et üretiminin % 76,78’i (370.619 ton) ve 10.889.044 ton olan yıllık süt üretiminin % 90.93’ü (9.901.180 ton) sığırlardan sağlanmaktadır (1). Bu rakamlar ülke ekonomisi açısından sığırcılığın ne kadar önemli olduğunu açıkça ortaya koymaktadır. Ülkemiz sığır yetiĢtiriciliği bakımından oldukça geniĢ potansiyele sahip olmasına rağmen, üretim açısından istenen düzeyin gerisinde bulunmaktadır. Hayvansal üretimin istenen düzeyde olmamasının nedenleri arasında hayvanlarda gözlenen enfeksiyonlar, hayvan yetiĢtiricilerinin yeterince eğitimli olmaması, hayvanlarda bakım Ģartlarının kötülüğü ve bilinçsiz besleme önemli bir yer tutmaktadır. YetiĢtiricilikte ekonomik kazanç ancak sağlıklı hayvan populasyonlarının varlığı ile sağlanabilir. KomĢu ülkelerden ülkemize kaçak hayvan giriĢinin olması, bölgeler arası hayvan hareketlerinin kontrolsüz yapılması, farklı bölgelerden gelen hayvanların bir arada tutulması gibi faktörler hayvanlar arasında hastalıkların kolayca yayılmasına ve hastalıklar ile mücadelenin daha da zorlaĢmasına neden olmaktadır. Gerek dünyada, gerekse ülkemizde sığır yetiĢtiriciliğini olumsuz yönde etkileyen en önemli faktörlerden birisi de solunum sistemi enfeksiyonlarıdır. Sığırlarda Ģekillenen solunum sistemi enfeksiyonları yemden yararlanmada ve canlı ağırlık artıĢ oranında azalmalara sebep olmakta, Ģiddetli olaylar ölümle sonuçlanmaktadır. Hastalık sürecinde kullanılan ilaç ve veteriner hekim masrafları ile mezbahalarda kesilen hayvanlarda pnömoni lezyonlarına bağlı olarak Ģekillenen kayıplar, ekonomik zararın boyutlarının daha da büyümesine neden olmaktadır. Yine hastalıklı et ve et ürünleri ile insanlara bulaĢan bazı zoonoz hastalıklar için akciğer dokusu kaynak oluĢturabilmektedir. Sığırlarda gözlenen solunum sistemi enfeksiyonlarının büyük kısmını pnömoniler oluĢturur. Pnömoniler pek çok etiyolojik sebebe bağlı olarak, bronĢ ve bronĢiyollerin yangısı ile baĢlayan, çeĢitli hazırlayıcı faktörlerin de etkisi ile lobar pnömoni ve plöropnömoni Ģekline kadar dönüĢebilen akut, subakut ve kronik seyirli enfeksiyonlardır (2). Pnömonilerin oluĢmasında patojen bakteriler, viruslar ve mantarlar önemli rol oynayan etkenlerdir. Bakım ve besleme hataları, ani iklim değiĢiklikleri, tozlu havanın solunması, yorgunluk, sıkıĢık barındırma ve vücut direncini zayıflatan diğer hastalıklar da pnömonilerin hazırlayıcı nedenleridir (3-7). 1 Mikoplazmalar sığırlarda gözlenen bakteriyel pnömoni olaylarında önemli bir yer tutmaktadır (8). Mikoplazmaların serolojik teĢhisi için spesifik ve hassas ticari kitler bulunmadığı için, büyükbaĢ hayvanlarda sebep olduğu enfeksiyonların önüne geçmek ve bunları kontrol altına alarak ekonomik kayıpların önüne geçmek zorlaĢmaktadır. Ayrıca etkili tedavi ve aĢılama programı olmadığı için et ve süt endüstrisinde, özellikle prevalansın yüksek olduğu Avrupa ve Kuzey Amerika ülkelerinde, önemli ekonomik kayıplar meydana gelmektedir (6, 7). Ülkemizde, sığırlarda solunum sistemi enfeksiyonlarından kaynaklanan ekonomik kayıplar üzerine yapılmıĢ detaylı çalıĢmalar bulunmamaktadır. Ġngiltere’de yılda yaklaĢık 1.9 milyon sığırın solunum sistemi enfeksiyonu geçirdiği ve oluĢan kaybın 54 milyon Sterlin olduğu hesaplanmıĢtır (8). YaklaĢık 90 milyon baĢ sığırın bulunduğu Avrupa’da solunum sistemi enfeksiyonlarının yaklaĢık 576 milyon Avro kayba sebep olduğu ve bu kayıpların yaklaĢık dörtte birinden Mycoplasma bovis’in sorumlu olduğu düĢünülmektedir (6). Amerika BirleĢik Devletleri’nde ise sadece M. bovis’ten kaynaklanan kilo kaybı ve karkas değerinin azalmasına bağlı olarak yıllık 32 milyon ABD Doları kayıp meydana geldiği hesaplanmaktadır (7). Ülkemizde Erzurum ilinde sığırlarda gözlenen 167 pnömoni olgusu üzerinde yapılan bir araĢtırmada Mycoplasma spp’nin prevelansının % 3,6 olduğu bildirilmiĢtir (9). Trakya ve Marmara Bölgesi’nde buzağı ve dana pnömonilerinde etken izolasyonuna yönelik olarak yapılan bir araĢtırmada da M. bovis’in prevalansının % 7,5 olduğu ortaya konmuĢtur (10). Kars bölgesinde 100 adet pnömonili hayvanda yapılan bir diğer çalıĢmada fibrinli pnömoni görülen 4 hayvanda bakteriyolojik incelemeler sonrasında M. bovis tek baĢına, 1 olayda ise M. bovirhinis ile koenfekte M. bovis ve M. dispar izole edilmiĢtir (11). Ayrıca Pendik AraĢtırma Enstitüsü’nde 75 buzağı akciğeri üzerinde yapılan bir çalıĢmada buzağı akciğerlerinde M. bovis’in prevalansının % 41,3 olduğu rapor edilmiĢtir (12). Konya bölgesi mezbahalarında kesilen 4062 besi danasından 473’ünde (%11,64) pnömoni saptanmıĢ, ancak etken izolasyon ve identifikasyonu yapılmamıĢtır (13). Bu çalıĢmanın amacı, Bursa bölgesindeki mezbahalarda kesilen sığırlara ait pnömonili akciğerlerde M. bovis’in varlığını mikrobiyolojik ekim ve izolasyon ile göstermek, immunohistokimya yöntemi ile etkeni ortaya koymak, hastalığın farklı tablolarını sınıflandırmak, bu tablolarda görülen yangısal reaksiyonun niteliğini yine immunohistokimya yöntemi ile ortaya koymak ve hastalık hakkındaki temel bilgilere katkıda bulunmaktır. 2 GENEL BĠLGĠLER PNÖMONĠLER Pnömoni, en basit haliyle çeĢitli etkenlere bağlı olarak akciğerlerin yangılanması olarak tanımlanabilir. Kongenital ve edinsel yetersizlik, çevre koĢulları, bakteriyel, viral ve mikotik etkenler, taĢınma stresi, dehidrasyon, aĢırı soğuk, toksik gaz ve partiküllerinin solunması, uzun süreli kortikosteroid kullanımı ve kronik kalp hastalıkları gibi çeĢitli etkiler sonrasında pnömoni Ģekillenmektedir (14, 15). Pnömoni geliĢimi etkenin yapısına, bulaĢma yoluna ve virülensine bağlı olarak değiĢim gösterir. Pnömoniler; - Sebep olan etkene göre (Pasteurella pnömonisi, distemper pnömonisi gibi) - Eksudatın tipine göre (supuratif, fibrinli pnömoni gibi) - Morfolojik özelliğine göre (gangrenöz, proliferatif, embolik pnömoni gibi) - Lezyonun dağılımına göre (fokal, kranioventral, difüz, lobar pnömoni gibi) - Epidemiyolojik özelliğine göre (enzootik bulaĢıcı sığır pnömonisi gibi) - Coğrafi bölgelerine göre (Montana progresif pnömonisi gibi) - ÇeĢitli özelliklerine göre (atipik, aspirasyon pnömonisi gibi) - Süresine göre (akut, subakut, kronik pnömoni gibi) isimlendirilebilir. Ancak evcil hayvanlarda pnömonileri patolojik olarak kıvam, dağılım, görünüm ve eksudatını baz alarak lobuler ve lobar bronkopnömoniler, intersitisyel pnömoniler ve özel pnömoni Ģekilleri (embolik-metastatik, aspirasyon, gangrenli ve granülomatöz pnömoni) olarak sınıflandırmak mümkündür (14, 16). 1. Bronkopnömoni Pnömoninin bronĢ, bronĢiyol ve alveollerde oluĢmasıdır (16). Bronkopnömonide yangı bronĢioalveolar bölgede baĢlar, daha sonra proksimalde bronĢiyol ve bronĢlara, distalde alveolar duktus ve respiratorik asinuslardaki alveollere yayılır (14). Evcil hayvanlarda en sık rastlanan pnömoni tipidir (16). Lezyonlara daha çok akciğerin kraniyoventral bölgelerinde rastlanmaktadır. Bu durum kraniyal bölgelerde hava yollarının kısa ve çok dallı olması, hava sirkulasyonunun farklı olması ile iliĢkilidir (14-16). Distal respiratorik sistemdeki bronĢioalveolar bölgeler enfeksiyöz etkenlerin kolayca hasar oluĢturabileceği alanlardır. Yapılan birçok çalıĢmada akciğerdeki savunma sisteminin olumsuz yönde etkilenmesi sonucu patojen birçok etkenin bronĢioalveolar bölgeyi kolayca geçerek bronkopnömoniye neden olduğu ortaya konmuĢtur. Bronkopnömoniler genellikle bakteri ve mikoplazma etkenlerine bağlı veya aspirasyon kökenlidir. Etken genel anlamda 3 aerojen yoldan veya aspirasyon yoluyla akciğere ulaĢır. Bronkopnömonilerde öncelikle bronĢ ve bronĢiyol mukozası etkilenir, daha sonra yangı bronĢ ve bronĢiyollerin submukozası ile alveollere ilerler. Sporadik bronkopnömoni olaylarında düĢkünlük, immun yetmezlik, daha öncesinde varolan kardiyopulmoner bir hastalık ve uzayan anestezi yardımcı ya da hazırlayıcı rol oynar (16). Bronkopnömonilerdeki tipik makroskobik görünüm kraniyoventral bölgelerdeki düzensiz konsolide alanlardır. Hafif Ģiddetteki olaylarda plöra genellikle düzgün ve parlaktır. Ancak yangı Ģiddetlendiğinde plörada sarı-gri renkli fibrinli ya da fibrinopurulent eksudat toplanır; kırmızımsı bir renk ve pürüzlü bir görünüm dikkati çeker. BronĢiyol epitellerinde pnömoniye sebep olan etkene bağlı olarak nekrotikten hiperplastiğe değiĢen derecelerde lezyonlar görülür ve peribronĢiyolar bağ dokuda hafif akut yangı belirtileri dikkati çeker. BronĢlarda da benzer durum gözlenir, ancak Ģiddeti daha düĢüktür (14, 15). Bronkopnömoniler eksudatın tipine göre supuratif ve fibrinli (lobar) pnömoni Ģeklinde isimlendirilir. Ancak bazen isimlendirme zordur; bu iki tip bir arada bulunur veya birbirine dönüĢebilir. Supuratif bronkopnömoni kraniyoventral loblara yerleĢimiyle karakterizedir ve organa yapılan enine kesitlerde kesit yüzünden değiĢik renk ve kıvamda mukopurulent eksudat akıĢı ile kendini gösterir. Bu tip pnömoni çoğunlukla lobuler konsolidasyon Ģeklindedir ve bu yüzden lobuler pnömoni Ģeklinde de isimlendirilir. Patojenin tipi ve yangının süresine bağlı olarak akciğerin makroskobik görüntüsü farklı Ģekiller alır. Genellikle ilk 12 saat içinde akciğerler hiperemik ve ödemlidir. YaklaĢık 48 saat sonra bölgeye nötrofillerin de infiltre olmasıyla konsolidasyon ve sert bir kıvam oluĢur. Hiperemik görüntü 3-5 gün içinde kaybolur ve gri-pembe görüntü oluĢur (16). Bronkopnömonilerde akciğerler makroskobik olarak et renginde ve kıvamında görülür; lezyonlar yama tarzındadır (14). Hava boĢluklarına eksudat dolması sebebiyle akciğerden alınan parçalar tespit sıvısına atıldığında yüzmez. Yangının kronik hal aldığı durumda ise lökosit infiltrasyonu, fibrin çıkıĢında ve kapillar hacmindeki küçülme sonucunda renk açılarak grileĢir. ĠyileĢmesi tam olarak mümkün olmayan bu tipteki yangı genellikle fibrozis, bronĢiektazi, atelektazi, adezyon ve apseleĢmeler ile sonuçlanır. Kronik supuratif pnömonilerde goblet hücrelerinde ve bronĢ iliĢkili lenfoid dokuda (bronchus associated lymphoid tissue-BALT) hiperplazi görülebilir. Fibrinli (lobar) bronkopnömoniler supuratif bronkopnömonilerden farklı olarak lobüllerde sınırlı değildir. Birçok hasta lobül vardır ve yangı tüm lobu kaplayana kadar hızla yayılır. Genel olarak fibrinli bronkopnömoni daha ciddi akciğer zedelenmelerinde 4 oluĢur ve daha Ģiddetli seyrederek hayvanın ölümüne sebep olur. Olayların yaklaĢık olarak % 30’unda Ģiddetli toksemi sonucunda klinik belirtiler ve ölüm ortaya çıkar. Supuratif tipteki pnömonilerde olduğu gibi baĢlangıçta kırmızı konsolidasyon alanları vardır. YaklaĢık 24 saat sonrasında interlobuler septum ödem ve fibrin çıkıĢı ile geniĢler; arteriol, venül ve lenf damarları içerisinde trombozlar görülür. Akciğer lobları makroskobik olarak mermer görüntüsü alır. Fibrinli içerik, Kohn porları aracılığıyla alveolden alveole geçer. Fibrin, nötrofiller için kemotaktiktir ve bir süre sonra alveol lümenlerine nötrofiller ve ardından makrofajlar infiltre olur. Nötrofillerden salgılanan fibrinolitik enzimler ile geliĢen lizis devresi hayvanlarda oldukça seyrek Ģekillenir; bunun yerine evcil hayvanlarda lezyonlu dokularda çoğunlukla organizasyon Ģekillenir (16). Bunun nedenleri: 1- Fibrinli eksudatın çoğunlukla eritilememesi ve 2- Lenf damarlarındaki trombozların rezorpsiyonu güçleĢtirmesidir. Akciğer zamanla küçülerek et rengi ve kıvamını alır (carnification) (15). Organize olmuĢ eksudatın bronĢiyol lümenine yapıĢmasıyla oluĢan duruma bronĢiyolitis obliterans denir. Nekrotik akciğer dokusunda saprofitik bakteri üremesiyle gangrenli pnömoni oluĢur. Kronik plörit sonucu toraks duvarına ve perikarda yapıĢmalar Ģekillenir (16). Kollajen ipliklerin artmasıyla granulasyon dokusu nedbe dokusuna dönüĢür (akciğer indurasyonu veya sklerozisi). Bronkopnömonilerdeki kalıcı lezyonlardan ilki atelektazidir ve bunu kalıcı obstruktif bronĢiyolitis ve bronĢitis izler. Lobuler septumun geliĢiminin belirgin olduğu hayvanlarda bronkopnömoninin zayıf rezolüsyonu ve kollateral ventilasyonun yetersizliğine bağlı olarak kronik bronkopnömoni Ģekillenebilir. ġiddetli enfeksiyonlarda lobüllerde nekrozlar meydana gelebilir (pneumonia fibrinosa necroticans – necrotic fibrinous pneumonia). Ruminantlarda mikoplazmaların neden oldukları fibrinli pnömonilerde çoğunlukla geniĢ nekrotik akciğer dokusunu saran bağ doku ile karakterize sekesterler oluĢur. Ayrıca akciğer apseleri, plöra empiyemi ve akciğer gangreni gibi komplikasyonlar da geliĢebilir (15, 16). 2. Ġntersitisyel Pnömoni Alveol duvarının üç katmanından (alveol epiteli, basal membran, damar endoteli) herhangi birinde hasar ve yangı oluĢmasıdır. Bu tip pnömoniler nekropside teĢhisi en zor olan ve histopatolojik incelemeyi zorunlu kılan pnömoni tipidir. Patojenezinde aerojen veya hematojen yolla akciğere gelen etken önemli bir rol oynasa da toksik gazlar, viral infeksiyonlar (Influenza, IBR, distemper, vs), septisemi ve endotoksinler de aktif olarak bu tipteki yangılara sebep olabilirler. Ġntersitisyel pnömoniler histolojik olarak akut ve kronik 5 olarak sınıflandırılırlar. Akut intersitisyel pnömoni, tip I pnömositler ve endotelde oluĢan hasar sonucu alveol lümenine plazma proteini geçmesiyle baĢlar (16). Mikroskobik olarak peribronĢial, intralobuler ve interlobuler intersitisyel pnömoniler ayırt edilebilir. PeribronĢial ve intralobuler intersitisyel pnömoniler genellikle birlikte bulunur. Plöra yangılarından kaynaklanan interlobuler intersitisyel pnömoniler seyrektir. PeribronĢial intersitisyel pnömonilerde bronĢların çevresinde manĢet tarzında çoğunlukla mononükleer hücre infiltrasyonları Ģekillenir (peribronĢitis nodoza) (14). Yangının takip eden sürecinde alveollerde hiyalin membranlar oluĢur ve tip I pnömositlerdeki kaybı karĢılamak için tip II pnömositlerin prolifere olmasıyla alveol duvarı kalınlaĢır. Akut devre süresince gözlenen en belirgin lezyon alveollerin seröz- fibrinli bir eksudat ile dolu olması, alveol duvarında ödem ve konjesyondur. Alveolar eksudatta eritrosit ve lökositler karıĢık haldedir. Yangı alveol duvarında daha baskın olsa da bronĢiyol ve alveol lümenlerinde dökülmüĢ epitel hücrelerini, makrofaj ve lenfosit infiltrasyonlarını görmek mümkündür (16). Alveol septumunda yıkım çoğu zaman hematojen yolla olmaktadır. Kanla gelen kimyasal maddeler mikrozomal enzim sistemi ile reaktif ara ürünlere metabolize olduktan sonra toksik etkilerini gösterebilirler. Kimyasal madde ve etkilenen hayvan türüne bağlı olarak yıkım Clara hücreleri ile sınırlı kalabilir ya da diffuz lezyonlar meydana gelebilir. ġiddetli, akut ve diffuz yıkım toksik maddenin konsantrasyonu ile iliĢkilidir (14, 16). Pnömoni etkeni kalıcıysa yangı kronik forma dönüĢür ve bu da alveol duvarında fibrozis, mononükleer hücre infiltrasyonu ve tip II pnömosit hiperplazisi ile karakterizedir (16). Yangı devam etmez ve alveol duvarında Ģiddetli fibrözleĢme olmazsa tip II epiteli, tip I epiteline dönüĢerek tam bir iyileĢme gerçekleĢebilir. Alveolar tip II hücrelerinin çoğalması intersitisyel pnömonilerin eksudatif devreden proliferatif devreye geçtiğini gösterir. Kronik olgularda bağ dokusu artıĢı nedeniyle intersitisyumda geniĢleme, peribronĢial nodüller ve yaygın amfizem görülür. Ġntersitisyel pnömoniler tamamen veya bakteriyel komplikasyonlar sonucu organizasyonla iyileĢirler. Makroskobik olarak lezyonlara tüm akciğer loblarına dağılmıĢ vaziyette rastlanılmasına rağmen, dorsokaudal bölgeler daha sıklıkla etkilenir. Ġntersitisyel pnömoniye sahip akciğer loblarının kesit yüzü et görünümündedir ve nekropside karakterisik olarak toraks açılınca üzerinde kaburga izleri bulunan akciğer loblarında kollaps Ģekillenmez ve belirgin bir eksudata rastlanmaz (14). Bronkointersitisyel pnömoni terimi hem intersitisyel, hem de bronkopnömoni özelliklerinin birlikte görüldüğü pnömonileri tanımlamak için kullanılır. Epitelde hasara 6 yol açan sitokinlerden dolayı bölgeye nötrofiller gelir. Tip I pnömosit hasarını dengeleyebilmek için Tip II pnömosit proliferasyonu gözlenir (16). 3. Özel Pnömoni ġekilleri Embolik-Metastatik Pnömoni Akciğerdeki hasarın hematojen kaynaklı olduğu ve yangının arteriol ve kapillar merkezli Ģekillendiği pnömonilerdir. Bakterilerin akciğer enfeksiyonu yapabilmesi için akciğer epiteline, damar endoteline veya damar içinde trombusa tutunması gerekir. Bakteri bir kez tutunduğunda ilgili hücrelere zarar verir ve daha derin dokulara (bazal membran, intersitisyum) ulaĢır (16). Embolik pnömoni bütün loblara yayılmıĢ multifokal lezyonlarla karakterizedir. Erken dönemde lezyonlar hiperemik haleyle çevrili küçük beyaz noktalar Ģeklindedir. Oldukça Ģiddetli olmadığı sürece bu pnömoni tipi ölümcül değildir ve nekropside görülmesi nadirdir (16). ApseleĢmenin komplikasyonları plöral fistülleĢme ve empiyem, yırtılan kan damarlarına bağlı kanamalar ve apselerin bronĢlara açılması sonucu Ģekillenen öldürücü supuratif pnömonilerdir (15). Aspirasyon Pnömonisi Yabancı cisimlerin, çoğunlukla da sıvıların hava yolları ile akciğere ulaĢması sonucu oluĢan pnömoni tipidir. Aspire edilen materyalin yapısı, bakteri taĢıyıp taĢımadığı ve bu materyalin akciğerdeki dağılımına göre yangısal yanıt değiĢiklik gösterir (15). Yutkunma güçlüğüne neden olan kuduz, farinks felci, Aujesky hastalığı, botulismus, baĢ travmaları, özefagus tıkanmaları gibi farklı durumlarda gıda maddeleri aspire edilebilir. Yine üst solunum yollarının irinli nekrotik yangıları, perforasyonları, hatalı traheatomi, larenks operasyonları ve intubasyon anestezisi sırasında da aspirasyon ile yabancı cisimler öncelikle kranioventral akciğer kısımlarında irinli-apseli bronkopnömoni oluĢturabilir. Gangrenli Pnömoni Akciğer parankiminde Ģiddetli nekrozun bulunduğu diğer formdaki pnömonilerin bir komplikasyonudur. Saprofitik ve putrefaktif bakteriler ile birlikte yabancı cisimlerin aspirasyonu sonucu oluĢabilir. Sarımtırak-siyah ya da yeĢilimsi-siyah renk ve kötü koku ile karakterizedir. Kısa sürede çok sayıda, düzgün Ģekilli olmayan kavitasyonlar Ģekillenir. Bu odaklar plöraya kadar uzanırsa kötü kokulu empiyem ve putrefaktif pnömotoraks ile sonuçlanabilir (15). 7 Granülomatöz Pnömoni Aerojen veya hematojen yolla gelen enfeksiyöz veya baĢka tipte etkene karĢı fagositozun baĢ edemediği durumlarda makrofaj, lenfosit, dev hücreleri ve az miktarda nötrofilin lokal olarak yangı oluĢturmasıdır. Bu tip pnömoni embolik ve intersitisyel pnömoniye benzer özellik gösterir. Bu pnömoninin ayrı baĢlık altında incelenmesinin sebebi çok özel bir yangısal cevabın oluĢmasıdır. Genel kural olarak etkenin fagositoza dayanıklı ve dokuda uzun süre kalabilen özellikte olması gerekmektedir (16). En önemli nedenler arasında tüberküloz ve mantar enfeksiyonları yer alır. Actinobacillus, Actinomyces ya da Nocardia spp. gibi etkenlere bağlı olarak, akciğer parankiminde travma ya da aspire edilen yabancı cisimler ile ilgili lokal yıkım sonucu ya da sistemik immun yetersizlik durumlarında oluĢabilir. Ayrıca solunan ya da aspire edilen çözünmeyen partiküller de (örneğin niĢasta) granülomatöz pnömoniye neden olabilmektedir (15). Feline infectious peritonitis (FIP) virusu granülomatöz pnömoniye sebep olan nadir viral etkenlerdendir. Bu hastalıkta çeĢitli dokulardaki damar endotellerine antijen-antikor kompleksleri çökelir, vaskülit oluĢur ve granülomatöz yangı geliĢir. Granülomatöz pnömonide kazeöz veya kazeöz olmayan granülomlara rastlanır. Mikroskopisinde granülomlar, ortada nekrotik bir alan ve çevreleyen makrofaj, dev hücreleri ve bütün bunları çevreleyen lenfosit infiltrasyonlarıyla, bağ doku Ģeklinde tipik yapı göstermektedir. Özel boyamalarla etkeni görmek çoğu olayda mümkündür (16). 8 MYCOPLASMA BOVIS Tarihçe Mycoplasma ilk olarak 100 yıl önce Pasteur Enstitüsü’nde artritisli ve pnömonili, sığırlardan izole edilmiĢtir. M. bovis (Mycoplasma agalactiae subsp. bovis) ise ilk olarak 1961 yılında ABD’de mastitisli süt sığırlarından (17) ve 1976 yılında da pnömonili buzağılardan bir solunum sistemi etkeni olarak izole edilmiĢtir (18). Taksonomi Mikoplazmalar Mollicutes sınıfının üç ailesinden biri olan Mycoplasmataceae ailesinin iki cinsinden biridir. Mycoplasma (Mikoplazma) terimi; ‘myces’ (mantar) ve ‘plasma’ (biçim) kelimelerinin bir araya gelmesiyle oluĢmuĢtur (19). M. bovis, Mycoplasma türüne dahildir (20). Etken pek çok yönden M. agalactiae’ya benzer. Bu iki tür arasında 16S RNA’da sadece 8 nükleotid fark bulunmaktadır (21). Tola ve arkadaĢları M. bovis’in genomik büyüklüğünü 961 ± 18,9 Kbp olarak belirlemiĢlerdir (22). Mycoplasma Mycoplasmataceae Ureaplasma Acholeplasma Mollicutes Acholeplasmataceae v Anaoeroplasma Anaeroplasmataceae Asteroplasma ġema-1 Mollicutes sınıfının taksonomisi (19) M. bovis’in Biyolojik Özellikleri Diğer mollicuteslere benzer Ģekilde etken pleomorfik yapıdadır. Hücre duvarı yerine lipid, karbonhidrat ve proteinlerden oluĢan unit membrana (23) ve DNA’sında düĢük Guanin (G) ve Sitozin (C) oranına (% 27,8-32,9) sahiptir (24). M. bovis glukozu fermente etmez, arjinini hidrolize etmez; bunların yerine organik asitlerden laktat ve piruvatı enerji kaynağı olarak kullanır (25). Mikoplazmalar besiyerine hayvansal protein, sterol komponenti ve DNA kaynağı ilavesine ihtiyaç duyarlar. Tipik koloni yapısı ‘sahanda yumurta’ Ģeklinde görülür ve bu yüzeyde ve agarın derinlerine doğru üremeden kaynaklanır (19). 9 Mikoplazmaların yüksek sıcaklık, deterjanlar, dezenfektanlar ve kuruma gibi çevresel faktörlere duyarlı oldukları bilinmektedir (19). Buna rağmen M. bovis 4 °C’deki sütte yaklaĢık 2 ay, tahta yüzeylerde 20 gün, su içerisinde 17 gün canlılığını koruyabilir. DonmuĢ sperm içerisinde etken yıllarca canlı kalabilir. Genel dezenfeksiyon amacıyla formalin ve perasetik asitin uygun olduğu bulunmuĢtur (26). M. bovis Enfeksiyonunun Epidemiyolojisi Klinik olarak sağlıklı hayvanlar, etkeni herhangi bir bulgu göstermeksizin burun, konjuktiva, ağız, bağırsak ve genital kanal mukozasında taĢıyabilirler. Ayrıca keçilerin kulak kanalında bazı patojen mikoplazmalar bulunur (27). Pnömoni ve plöropnömoniyi içeren solunum yolu problemi mikoplazmaların memelilerde en sık oluĢturduğu klinik belirtidir. Bunun dıĢında oküler ve genital problemler ile mastitise de neden olabilir (28). Etken M. bovis’ten ari sürülere suni tohumla sırasında dondurulmuĢ sperma ile bulaĢabilir. Klinik olarak sağlıklı inekler etkeni sütleriyle yayarlar ve bu yol süt emen buzağılarda temel enfeksiyon kaynaklarından biridir (29). Etken koyunlarda (30) ve keçilerde de (31, 32) enfeksiyon oluĢturabilir ve bu hayvanlardan sığırlara bulaĢabilir. Etkenin insanlardan da izole edildiği rapor edilmiĢtir ki (33) bu durum sığırlarla çalıĢan insanların da taĢıyıcı olabileceklerini düĢündürmektedir . Etken temel olarak solunum kanalında bronkoalveolar bölgeye yerleĢir ve öksürük ile damlacık enfeksiyonu tarzında çevreye yayılır. Kontamine toz parçacıkları da enfeksiyon kaynağı olabilir. Solunum sisteminde enfeksiyonun geliĢimini takiben, hastalık sürü içerisinde hızla yayılır. Hastalıklı bir buzağı ile teması takiben etken 24 saat içerisinde hayvanların burun akıntılarında bulunur. Etkenin ilk izolasyonundan bir hafta sonra M. bovis sürüdeki hayvanların çoğundan izole edilebilir (34-36). Buzağılarda eklemler etkenlerin kan yolu ile yayılması sonrası etkilenir. Bu durum genellikle sürüde enfeksiyonun yaygın olduğu durumlarda meydana gelir (37). Meme enfeksiyonları genellikle etkenin meme baĢından girmesi sonrası geliĢir. Meme enfeksiyonlarının geliĢiminde stres faktörlerinin ve kötü bakımın etkili olduğu belirtilmiĢtir. Dolayısıyla M. bovis’e bağlı mastitisler genel olarak kötü bakım Ģartlarının bulunduğu büyük sürülerde görülmektedir (38) . Erkek hayvanlarda genital sistemin enfeksiyonu kontamine ortamda bulunmakla ya da M. bovis enfeksiyonuna sahip hayvanlarla doğrudan temas sonrası geliĢir. Prepusyumdan giren etken genital kanal boyunca ilerler. Bu Ģekilde erkek hayvanlarda 10 orĢitis, vezikülitis geliĢir; semen kalitesi düĢer, etken semenle atılır (39). DiĢi hayvanlarda genital kanal enfeksiyonu erkeklerdekine benzer Ģekilde asendens olarak geliĢir (40, 41). ÇalıĢmalar enfekte inekten yavruya uterus veya daha sıklıkla süt yoluyla bulaĢma Ģeklinde bir döngü bulunduğunu göstermiĢtir (34). Hastalık sırasında antikor titresi yüksektir. Düvelerde ise gebelik sırasında alınan hiçbir örnekten M. bovis izole edilemez. Ancak doğumdan sonra amnion sıvısı, endometrium ve fötustan etken izolasyonu mümkündür ki bu da vertikal bulaĢmanın bir göstergesidir (36, 42, 43). Ġnekler, M. bovis tarafından oluĢturulan mastitislere en çok doğum ve laktasyonun yoğun olduğu dönemlerde duyarlıdır. M. bovis Enfeksiyonunun Patogenezisi ve Etkenin Ġmmunojenitesi Etkenin konağa girmede karmaĢık yollar izlediği bilinse de, enfeksiyonun patogenezisi tam olarak anlaĢılamamıĢtır. Patogenezisin ilk basamağı etkenin konak hücrelerine yapıĢmasıdır. PG45 suĢu, adezyonun mekanizmasının anlaĢılması için embriyonik sığır akciğer hücre kültüründe çalıĢılmıĢtır (44-46). Yapılan çalıĢmalar özel adezyon proteinleri, özellikle P26 proteininin, siyalik asit kalıntıları ve sülfatid gruplarının katılımıyla, bağlayıcı reseptör olarak spesifikliğini ve bu olayın kinetiğini göstermiĢtir (44). Bazı değiĢken yüzey lipoproteinlerinin de PG45 suĢunun adezyonuna katıldığı gösterilmiĢtir (46). Vsps A, B, E ve F genlerinin tekrarlayan sekanslarından oluĢan oligopeptidlerin bu tip adezyonu kısmen engelleme özelliği vardır. Vsp geni immunojenik epitopların kodlanmasında önemlidir. M. bovis’le yapılan in vivo ve in vitro çalıĢmalarda diğer mikoplazma türlerinden farklı olarak silialı trahea epiteline spesifik olarak bağlanmadığını göstermiĢtir (47). M. bovis’in makrofajlar tarafından fagosite edilse dahi lizise direnç gösterdiği bilinmektedir (48). Etken bu fagositlerin yüzeyine tutunabilmekte ve burada çoğalabilmektedir (49). Makrofaj ve nötrofil hücre kültürlerine M. bovis’e karĢı spesifik hiperimmun serum eklenmesiyle, etkenin sindirilebildiği ve yok edildiği gözlenmiĢtir (49, 50). Etkenin fagositozu nasıl engellediği tam olarak bilinmemektedir. Epitel hücrelerinin yüzeyinde yerleĢen M. dispar’dan farklı olarak, M. bovis trahea ve bronĢ epiteline de girer ve burada çoğalabilir (47). Etken, solunum epiteline penetre olarak, kendisine kalıcılık sağlar ve kronik enfeksiyonlarda konağın bağıĢıklık sisteminden kaçmıĢ olur (47, 51). Etken dolaĢım sistemine geçerek artritise de neden olur. Bu aĢamada etken karaciğer ve böbrek gibi çeĢitli organlardan izole edilebilir (52). 11 Etken akciğerlerde nekroz geliĢimine sebep olur. Nekrozun geliĢim mekanizması tam olarak ortaya konmuĢ olmasa da, etken tarafından oluĢturulan kompleks polisakkarid yapıdaki bir toksinin ve etkene karĢı geliĢen Ģiddetli konakçı cevabının nekroz geliĢiminde önemli olduğu düĢünülmektedir (53-55). M. bovis’in hücre zarında glukoz, glukozamin, galaktozamin ve bir heptozdan oluĢan ve proteinlerle sıkıca bağlanmıĢ, ısıya dayanıklı polisakkarit kompleksi vardır. Bu polisakkarit ekzotoksin gibi davranmasa da kılcal damar geçirgenliğini arttırır ve komplement sistemini uyararak immun yanıtı tetikler. Bu mekanizma Gram (-) bakterilerin lipopolisakkaritlerinin mekanizmasına benzer (54). AĢılı hayvanlarda enfeksiyonun tekrar etmesi durumunda, lezyonların aĢırı Ģekilde ortaya çıkması tip IV aĢırı duyarlılık reaksiyonu ve hücresel bağıĢıklıkla açıklanmaktadır (56). M. bovis’in hem immunreaktif, hem de immun baskılayıcı olduğu gösterilmiĢtir. M. bovis’le inkube edilen alveolar makrofajların aktive olduğu ve TNF-α ve nitrik oksit salgıladığı gösterilmiĢtir (57). Etken nötrofil degranülasyonunu ve oksidatif radikal oluĢumunu engelleyerek ve lenfositlerde mitojenler tarafından oluĢturulan proliferasyonu durdurarak immun baskılayıcı özellik gösterir (48, 58, 59). Etkenin in vitro ortamda lenfositlerde apoptozisi uyardığı gösterilmiĢtir (60). Yine in vitro ortamda antijene maruz bırakıldığında CD4+ T hücreleri ile daha az oranda CD8+ T hücrelerinin aktive oldukları çalıĢmalarla ortaya konmuĢtur (61). M. bovis antijenik yapısını hızla değiĢtirebilme yeteneğine sahiptir ki bu özelliği ticari olarak tanı testlerinin üretimi ve koruyucu aĢı üretiminde çeĢitli sorunlar yaratır (62). Bu antijenik yapıyı değiĢtirme kabiliyetinde, lipoprotein olan yüzey antijeni sentezinden sorumlu olan Vsp geni rol oynar (62-64). Vsp genleri, M. bovis etkenine konak hücrelerine tutunmada, konağın bağıĢıklık sisteminden kaçmada ve konak ile çevredeki değiĢik durumlara uyum sağlamada yardımcı olur (52). M. bovis Enfeksiyonunda Klinik Bulgular M. bovis sıklıkla diğer patojen mikroorganizmalarla (BRSV, PI-3 virusu, sığır adenovirusları, BVD virusu, Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, Actinobacillus pyogenes, Histophilus somni, M. dispar, M. canis ve Ureaplasma diversum) birlikte hastalık oluĢturabilir (65). ÇeĢitli stres faktörlerine bağlı olarak Bovine Respiratory Disease Complex (BRDC veya shipping fever) geliĢmesinden 7-14 gün sonra mycoplasmosis Ģekillenebilir (66). M. bovis çeĢitli solunum yolu semptomlarına neden olur, ancak bunlar spesifik değildir. AteĢ, iĢtah kaybı, depresyon, hiperventilasyon, dispne, 12 burun akıntısı, öksürük gibi klinik bulgular beĢ günlük genç buzağılarda bile oluĢabilir (36). Deneysel olarak etkenin eklem içi, damar içi veya bronĢ içine inokulasyonu buzağılarda Ģiddetli poliartritise neden olabilir. Artritis bazen ergin sığırlarda da gözlenir (67). Doğal enfeksiyonlarda artritise genel olarak tarsal ve karpal eklemlerde rastlansa da diğer eklemler de etkilenebilir. Sığırlarda bir veya birden fazla eklemin etkilenmesiyle topallık meydana gelir. Eklemdeki ĢiĢkinlik kapsül ve çevre dokulardaki yangıya bağlı oluĢur (66). Makroskopik olarak eklem boĢluğunda fibrinopurulent eksudatın varlığı, fibrinopurulent sinovitis veya tenosinovitis görülür. Eklem kıkırdağında erozyonlara ve polipoid granulasyon dokusuna rastlanabilir (68). Deneysel olarak az sayıdaki M. bovis’in meme içi inokulasyonu bile Ģiddetli mastitise neden olduğu gösterilmiĢtir (69). Mastitisli sürülerde en sık izole edilen mikoplazma türü M. bovis’tir (70). Süt sığırı sürülerinde hastalık sporadik seyirlidir ancak bulaĢma hızlı olur (71). Etkene bağlı mastitisler kıĢın daha sıklıkla görülür (72-74). Birden fazla meme lobunun etkilendiği vakalarda süt genellikle seropurulent özelliktedir. Mastitis genellikle süt veriminin azalması dıĢında herhangi bir sistemik klinik bulguya sebep olmaz (52, 71). Doğal enfekte vakalarda nadiren genital enfeksiyon ve abort görülebilir (75). Semenin M. bovis ile bulaĢık olması semenin kalitesini ve fertilitesini etkiler (76, 77). M. bovis Enfeksiyonunun Tanısı Etkenin izolasyonu için burun, göz, genital kanal ve kulaktan svab, taze süt, sinoviyal sıvı, bronkoalveoler lavaj sıvısı örnek olarak alınabilir. Nekropsi materyali olarak alınan akciğer dokusu, lenf yumruları ve plöra sıvısından etkeni izole etmek mümkündür (78, 79). Tanıyı etkenin izolasyonu ve identifikasyonu yoluyla, ELISA, PCR, SDS-PAGE, Western Blot gibi yöntemlerle ve immunohistokimya ile ortaya koymak mümkündür (80- 82). M. bovis Pnömonileri M. bovis pnömonileri dört ana baĢlıkta ele alınabilir. Bunlar kazeonekrotik bronkopnömoni, koagulasyon nekrozunun olduğu bronkopnömoni, nekrozun olmadığı supuratif bronkopnömoni ve apse oluĢumunun bulunduğu kronik bronkopnömoni tipleridir. Kazeonekrotik bronkopnömilerde kranial ve medial akciğer lobları daha çok etkilenirler. Akciğerin etkilenmiĢ alanlarında kazeöz nekroz içeren nodüller bulunur ve 13 genelde konsolide akciğer dokusu bu alanlara komĢudur. Kazeonekrotik nodüllerin büyüklüğü birkaç mm’den birkaç cm çapa kadar ulaĢabilir. Genellikle bu tipteki nodüller dairesel Ģekilde, beyaz renkli, kuru ve kolayca parçalanabilen ve plöral yüzeyden dıĢarı taĢmıĢ nodüler tipte lezyonlardır (51, 83-85). Kazeoz lezyonlar zamanla sekestre olup tüm loba yayılabildiği gibi bronĢiektazi Ģekillendirebilmektedir (51, 84). Özellikle diğer bakteriler ile koenfeksiyonun Ģekillendiği olaylarda bu kazeoz nekroz alanları kuru parçalanabilir materyal yerine sıvı, irin ile dolu bir yapı haline gelebilir (86). Histolojik olarak kazeoz nekroz küçük bronĢiyollerden, alveollerden veya interlobar intersitisyel dokudan baĢlayabilir. Erken lezyonlarda alveol ve bronĢiyollerin lümeni nötrofiller ile doludur, zamanla bu hücreler nekroza uğrayıp sitoplazmalarında hipereozinofili gözlenir. Hücresel sınırlar nekroze olmasına rağmen seçilebilmektedir. Ġleri olgularda bu eozinofilik materyal bir pıhtı oluĢturur. Pıhtının periferi nekrotik lökositler, makrofaj, lenfosit ve bağ doku hücreleri ile sarılabilir (51, 83-85). Bu infiltre olabilen hücreler CD4, CD8 pozitif T hücreleri ve immunglobulin G üreten plazma hücrelerinden oluĢmaktadır (87). Koagulasyon nekrozunda düzensiz Ģekilli, ten renginde, kolay parçalanmayan nekroz odakları ile bu alanlarda hayali olarak Ģekilleri belli olan alveol ve bronĢiyoller görülür. Akciğerde Ģekillenen apselerde ise kazeifikasyon nekrozundan farklı olarak akıĢkan kıvamlı irin bulunur (88). 14 GEREÇ VE YÖNTEM Hayvan Materyali ÇalıĢmada kullanılan akciğer dokuları 2008 yılının Ocak-Nisan ayları arasında Bursa ili ve çevresinde bulunan mezbahalara bizzat gidilerek sağlandı. YaĢ, cinsiyet ve ırk ayrımı yapılmadan toplam 1413 hayvanın akciğerleri (Tablo 1) incelendi ve bu hayvanların 136’sında (% 9,63) renk, kıvam ve kesit yüzünde gözlenen patolojik değiĢiklikler göz önünde bulundurularak pnömoni odağı olduğundan Ģüphe edilen akciğer loblarından, her lobdan bir örnek olacak Ģekilde, toplam 271 örnek alındı. Bu vakalara ilave olarak bu dönemde Patoloji Anabilim Dalı laboratuvarına gelen 10 vaka da çalıĢmaya dahil edildi. Mezbahalardan elde edilen örneklerde hayvanların ırkı, yaĢı, cinsiyeti ve geldikleri yerler hakkındaki bilgiler toplanmadı. Tablo-1 AraĢtırma materyalinin kaynaklara göre dağılımı Materyal Kaynağı Ġncelenen Akciğer Sayısı Lezyonlu Akciğer Sayısı Et-Ba Et Kombinası 807 84 Kayarlar Et Kombinası 475 42 Çim-Et Et Kombinası 118 8 Çalı Belediye Mezbahası 13 2 Anabilim Dalı Laboratuvarı 10 10 Toplam 1423 146 Dokuların ĠĢlenmesi Mezbahalardan alınan akciğer örnekleri % 10’luk tamponlu formaldehit içerisinde anabilim dalı laboratuvarına getirilerek burada trimleri yapıldı. Trimlenen dokular kasetlere alındı ve % 10’luk tamponlu formaldehit solüsyonunda 48 saat tespite bırakıldı. Tespit sonrası dokular bir gece akar suda yıkandıktan sonra birer saat 70, 80, 90 ve 100’lik alkolde dokuların suyu giderildi. Ksilol 1 ve 2 solüsyonlarında birer saat bekletildikten sonra kasetler 56 C’ye ısıtılmıĢ etüvdeki parafin 1 ve 2’de birer saat tutuldu ve ardından bloklama iĢlemi yapıldı. Bloklanan dokulardan RM 2155 model mikrotomda (Leica, Wetzlar, Almanya) 5 μm kalınlığında kesitler alındı ve lama çekildi. 15 Hematoksilen-Eozin Boyama Yöntemi Lamlar köprüye yerleĢtirildikten sonra sırası ile 3’er dakika süre ile seri halde 3 kez ksilolde bekletilerek parafin uzaklaĢtırıldı. Lamlar 3’er dakika süre ile 100, 90, 80 ve 70’lik alkollerde rehidre edildi. Distile suda yıkandıktan sonra, 10 dakika Harris hematoksilende (Merck, New Jersey, NJ, ABD) hücre çekirdeklerinin mor renk alması sağlandı. Akarsuda yıkanarak hematoksilenin fazlası uzaklaĢtırıldıktan sonra, lamlar 10’ar saniye asit alkol ve amonyaklı sudan geçirilerek dokular mavileĢtirildi. Lamlar eozinde (Merck) 5 dakika bekletilerek hücre sitoplazmalarının pembe renk alması sağlandı. Daha sonra lamlar akarsuda yıkanarak eozinin fazlası uzaklaĢtırıldı. Preparatlar 70’lik alkolde 5 saniye, 80 ve 90’lik alkolde 1’er dakika ve iki ayrı 100’lik alkolde 3’er dakika bekletildikten sonra havada kurutuldu. Kuruyan preparatlar 3’er dakika süre ile seri halde 3 kez ksilolden geçirilerek parlatıldıktan sonra, lamların üzerine Entellan (Merck) damlatılarak dokular lamel ile kapatıldı. Hematoksilen-Eozin Boyama Sonuçları için Değerlendirme Kriterleri Pnömonilerin sınıflandırılması esnasında temel olarak eksudatın tipine ve lezyonun akciğer dokusu içerisindeki dağılımına bakıldı. Ayrıca nekroz olup olmadığı, varsa tipi, kireçlenme Ģekillenip Ģekillenmediği, bağ doku üremesi varsa bunun yerleĢimi, dev hücrelerinin ve sinsitiyal hücrelerin bulunup bulunmadığı, amfizem ve atelektazi Ģekillenip Ģekillenmediği, pnömosit II bulunup bulunmadığı gibi değiĢiklikler incelendi. Pnömonilerin Ģiddetlerinin değerlendirilmesinde alınan kesitte etkilenen alanın geniĢliği ve yangı hücrelerinin infiltrasyon Ģiddeti esas alındı ve daha önce yapılan bir çalıĢmadakine benzer bir derecelendirme kullanıldı (53). Buna göre etkilenen akciğer alanının hesaplanmasında toplam kesit sahasında % 1-25 etkilenme durumunda 1, % 26-50 etkilenme durumunda 2, % 51-75 etkilenme durumunda 3, % 75’ten fazla etkilenme durumunda ise 4 Ģeklinde derecelendirme yapıldı. Toplam yangı hücresi infiltrasyonunun Ģiddetinin hesaplanmasında kesitte x400 büyütmede geliĢigüzel 5 alan seçilerek bu alanlardaki yangı hücreleri sayıldı. Hücre sayısına göre 1-15 hücre: 1, 16-30 hücre: 2, 31- 45 hücre: 3 ve >45 hücre olanlar 4 Ģeklinde skorlandı. Toplam pnömoni Ģiddetinin belirlenmesinde etkilenen alana yönelik skorla, yangı hücresi yoğunluğuna yönelik skor toplanarak, elde edilen değer kullanıldı. Birden fazla lobdan örnek alınan durumlarda, en Ģiddetli pnömoni bulguları gösteren kesitler incelendi. Pnömonilerin eksudat bakımından yapılan değerlendirmesinde intersitisyel dokuda, alveol lümenlerinde ve yer yer de bronĢ 16 ve bronĢiyol lümenleri içerisinde fibrin gözlenen vakalar fibrinli olarak değerlendirilirken, çok sayıda nötrofil lökosit görülen vakalar purulent; yangı hücresi olarak nötrofillerin bulunmadığı ya da çok azınlıkta kaldığı, lenfosit, plazma hücresi ve makrofajların görüldüğü olaylar ise non-purulent olarak isimlendirildi. Yaygın nekroz alanlarının görüldüğü olaylar nekrotik olarak kabul edilirken; sağlam ve dejenere nötrofil lökositlerden oluĢan bir merkez ve bu merkezi çevreleyen lenfosit, plazma hücresi ve makrofajlar ile bağdoku geliĢimi olan olaylar piyogranülomatöz olarak değerlendirildi. Yangı hücresi olarak daha çok lenfosit ve plazma hücrelerinin yer aldığı, bağ doku oluĢumunun sınırlı olduğu olaylar subakut olarak isimlendirilirken; lenfosit, plazma hücresi, makrofajların yanısıra, belirgin bağ doku oluĢumunun gözlendiği olaylar kronik; her iki türde de değiĢikliğin olduğu olaylar ise subakut-kronik olarak değerlendirildi. Ziehl-Neelsen Boyama Yöntemi Alınan örneklerde tüberküloz olasılığını ortadan kaldırmak amacıyla M. bovis pozitif tüm vakalara ait kesitler Ziehl-Neelsen metodu ile boyandı (89). Pozitif kontrol olarak anabilim dalına daha önce gelen ve paratüberküloz teĢhisi konmuĢ bir keçiye ait mezenteriyel lenf yumrusu dokusu kullanıldı. Boyama sonrası kesitler mikroskopta incelenerek asidorezistans bakterilerin bulunup bulunmadığı araĢtırıldı. Mikrobiyolojik Ġnceleme ÇalıĢmanın mikrobiyolojik incelemeleri Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalında aĢağıda özetlendiği Ģekilde yapıldı: Histopatolojik ve immunohistokimyasal inceleme için örnek alınan akciğer loblarından mikrobiyolojik ekimler için de örnekler alınarak buz kalıpları içerisinde laboratuvara ulaĢtırıldı. Örnekler daha sonra bakteriyolojik olarak incelenmek üzere -20 °C’de derin dondurucuda muhafaza edildi. Mikrobiyolojik ekimler için laboratuvara getirilen akciğer örnekleri derin dondurucudan çıkarılarak 10’lu gruplar halinde çalıĢıldı. Bu amaçla akciğer doku parçaları (birden fazla akciğer lobundan örnek alındıysa her lobdan ayrı parçalar) içerisinde 5 ml PPLO broth bulunan steril homojenat tüpünün içerisine atıldı ve ultraturaksta homojenize edildikten sonra Mycoplasma selektif agar (MSA) ve Mycoplasma selektif broth (MSB) besiyerlerine ekim yapıldı. Ekim yapılan besiyerleri 37 °C’de, % 5 CO2’li ve nemli ortamda inkübe edildi. MSB üreme özellikleri yönünden her gün kontrol edildi; MSA 2-3 günde bir stereomikroskop altında tipik sahanda yumurta görünümlü kolonilerin varlığı yönünden incelendi. Ekim yapılan 17 besiyerinde üreme belirtisi varsa hemen pasajı yapıldı. Üreme belirtisi görülmeyen besiyerlerinden ise 7 gün ara ile kör pasaj yapıldı. Daha sonra üreyen koloniler klonlandı ve inkübe edildi. Son inkübasyondan sonra seçilen tek kolonilerden üç kez klonlandıktan sonra incelendiğinde orijinal morfolojisini koruyan koloniler Mycoplasma spp. olarak değerlendirildi. Saf kültürü hazırlanan ve Mycoplasma spp. olarak değerlendirilen izolatların biyokimyasal testler ve üreme inhibisyon testleri ile identifikasyonları gerçekleĢtirildi. Bu amaçla digitonin sensitivitesi, glukoz fermentasyonu, arjinin hidrolizi, fosfataz aktivitesi, tetrazolium redüksiyonu ve üreme inhibisyon testi yapıldı; etkenlerin film ve spot oluĢumu özellikleri incelendi. Testlerde standard M. bovis suĢu olarak Pendik Veteriner Kontrol ve AraĢtırma Enstitüsü’nden sağlanan M. bovis NCTC 10131 suĢu kullanıldı. Ġmmunohistokimyasal Boyama Yöntemi Bloklanan dokulardan 5 μm kalınlığında kesilen dokular poli-l-lizinli (Sigma- Aldrich Corp, St. Louis, MO, ABD) lamlara alındıktan sonra immunohistokimyasal boyamalar yapıldı. Ġmmunohistokimyasal boyamalar için kullanılan primer antikorlarla sekonder antikorun isimleri, üreticileri, ürün kodları ve sulandırma oranları Tablo 2’de verilmektedir. Tablo-2 Ġmmunohistokimyasal boyamalar için kullanılan primer antikorların ve sekonder antikorun isimleri, üreticileri, ürün kodları ve sulandırma oranları Antikorun ismi Üreticisi, Sulandırma Kodu oranı Rabbit anti-Mycoplasma bovis Dr. Enrico Radaelli 1:10.000 (poliklonal) (Milano Veteriner Fakültesi, Ġtalya) Rabbit anti-human CD3 Lab Vision (Fremont, CA, ABD) 1:150 (monoklonal) RM-9107-S0 Mouse anti-human CD79αcy DAKO (Glostrup, Danimarka) 1:50 (monoklonal) M7051 Rabbit anti-human kappa light chains DAKO 1:10.000 (poliklonal) A0191 Rabbit anti-human lambda light chains DAKO 1:10.000 (poliklonal) A0193 Biotinylated goat anti-polyvalent Lab Vision - antibody (poliklonal) TP-125-BN 18 Etkeni immunohistokimyasal olarak ortaya koymaya yönelik olarak yapılan boyamalarda pozitif kontrol olarak Dr. Enrico Radaelli (Milano Veteriner Fakültesi, Ġtalya) tarafından sağlanan akciğer dokusu kullanıldı. GeliĢen yangısal cevabın ölçülmesi amacıyla yapılan boyamalarda CD3 antikoru T hücrelerinin, CD79 antikoru B hücrelerinin ve kappa hafif zincirleri ile lambda hafif zincirleri antikorları plazma hücrelerinin gösterilmesi amacıyla kullanıldı. Yangı hücrelerini göstermek için yapılan immunohistokimyasal boyamalarda pozitif kontrol olarak sığır mediastinal lenf yumrusu seçildi. Negatif kontrol olarak primer antikor eklenmemiĢ antikor sulandırma solüsyonu kullanıldı. Ġmmunohistokimyasal boyamalar için streptavidin-biotin-peroksidaz yöntemi kullanıldı ve aĢağıda açıklanan iĢlemler yapıldı: 1- Hazırlanan parafin bloklardan 5 μm’lik kesitler poli-l-lizinli (Sigma-Aldrich) lama çekildi. 2- Deparafinizasyon iĢlemi için kesitler 2 defa 10’ar dakika süre ile ksilolden geçirildikten sonra, 100’lik alkolde 5 dakika x 2, 90, 80 ve 70’lik alkollerde 5’er dakika süre ile rehidre edildi. Ardından dokular 5 dakika distile su içerisinde yıkandı. 3- Endojen peroksidaz aktivitesini ortadan kaldırmak için lamlar nemli odacığa alınıp % 3’lik H2O2 uygulandı. Ardından dokular 5’er dakika süre ile 2 defa PBS ile yıkandı. 4- Sitratlı tampon çözeltisi (pH 6.0) içerisinde dokulara antijen açığa çıkarma iĢlemi uygulandı. 5- Lamlar tampon çözeltisi içerisinde oda ısısına gelene kadar bekletildi. Ardından dokular 5’er dakika süre ile 2 defa PBS ile yıkandı. 6- Protein bloklama solüsyonu (Large Volume Ultra V Block, TA-125-UB; Lab Vision) dokuların üzerini kapatacak Ģekilde eklendi ve 30 dakika oda ısısında inkübe edildi. 7- Protein bloklama solusyonu uzaklaĢtırıldıktan sonra yıkama iĢlemi yapılmaksızın lamların üstüne uygun oranda sulandırılmıĢ (Large Volume UltrAb Diluent, TA-125-UD; Lab Vision) primer antikor konularak dokular inkübasyona bırakıldı. Ġnkübasyonu takiben primer antikor uzaklaĢtırıldı ve lamlar 5’er dakika süre ile 2 defa PBS ile yıkandı. 8- Sekonder antikor dokuların üzerini kapatacak Ģekilde uygulandı ve 30 dakika oda ısısında inkübe edildi. Ardından lamlar 5’er dakika süre ile 2 defa PBS ile yıkandı. 19 9- Lamlar üzerine streptavidin-peroksidaz (TS–125-HR; Labvision) eklendi ve 30 dakika oda ısısında inkübe edildi. Ardından lamlar 5’er dakika süre ile 2 defa PBS ile yıkandı. 10- Lamlar üzerine kromojen olarak diaminobenzidine (DAB, TA-012-HDC ve DAB substrate buffer, TA-125-HDS; Lab Vision) uygulandı. Ardından lamlar akar suda 5 dakika yıkandı. 11- Harris hematoksilende (Merck) çekirdekler mavileĢinceye kadar karĢı boyama yapıldıktan sonra lamlar akar suda 5 dakika yıkandı. 12- Lamlar 5’er dakika süre ile 70, 80 ve 90’lik alkol ve 5 dakika x 2 defa 100’lik alkolden ve 10 dakika x 2 defa ksilolden geçirildikten sonra dokular Entellan kullanılarak lamel ile kapatıldı. Tüm yıkamalar esnasında dokuları taĢıyan Ģaleler OS20 model orbital karıĢtırıcı (Biosan, Ġstanbul) üzerine yerleĢtirildi. Aksi belirtilmediği sürece tüm iĢlemler oda sıcaklığında gerçekleĢtirildi. Farklı antikorlar ile boyamalar arasında çeĢitli basamaklarda gerçekleĢtirilen farklı uygulamalar Tablo 3’te gösterilmiĢtir. Tablo-3 Ġmmunohistokimyasal boyama protokolündeki farklılıklar Kappa hafif Lambda hafif M. bovis CD3 CD79 zincirleri zincirleri Antijen açığa 20 dakika, 95 20 dakika, 120 15 dakika, 10 dakika, 15 dakika, çıkarma iĢlemi watt, C, 1 atm, 600 watt, 600 watt, 600 watt, (antigen retrieval) mikrodalga otoklav mikrodalga mikrodalga mikrodalga Antijen açığa Antijen açığa Antijen açığa Antijen açığa Antijen açığa çıkarmadan çıkarmadan çıkarmadan çıkarmadan çıkarmadan H2O2 uygulaması önce 15 dakika sonra 30 dakika sonra 30 sonra 30 sonra 30 dakika dakika dakika Primer antikor 38 dakika, 1 saat, 1 saat, 20 dakika, 30 dakika, uygulama süresi 37 C oda ısısında oda ısısında oda ısısında oda ısısında ve sıcaklığı DAB kromojen 3 dakika 10 dakika 10 dakika 5 dakika 10 dakika uygulama süresi Ġmmunohistokimyasal Boyama Sonuçları için Değerlendirme Kriterleri CD3, CD79, kappa hafif zincirleri ve lambda hafif zincirleri antikorları ile boyanmıĢ olan kesitlerde yangı hücresi skorlarının belirlenmesinde yukarıda hematoksilen- eozin ile boyanmıĢ olan kesitlerin incelenmesi kısmında anlatıldığı Ģekilde bir skorlama 20 yapıldı. Anti-M. bovis antikoru ile yapılan boyamalarda etkenin akciğer dokusu içerisindeki yerleĢimine bakıldı (53). Preparatların Ġncelenmesi Tüm mikroskobik incelemeler ve fotoğraf çekimleri U-D03 model Olympus marka mikroskopta (Tokyo, Japonya) gerçekleĢtirildi. Ġncelemeler esnasında araĢtırmacı hangi hayvana ait dokuyu incelediğini ve hangi boyamaya baktığını bilmiyordu. Ġstatistiksel Değerlendirme Elde edilen verilerin istatistiksel analizi Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Zootekni Anabilim Dalı, Biyoistatistik Bilim Dalında SPSS 13.0 (Chicago, IL, ABD) programı kullanılarak yapıldı. Analizlerde sürekli değiĢkenler için ortalama ± standard sapma değerleri hesaplandı. Ġkiden fazla grup olan karĢılaĢtırmalarda non-parametrik testlerden Kruskal- Wallis testi kullanıldı. Gruplar arasında fark bulunduğunda, bu farkın hangi gruptan kaynaklandığını bulabilmek amacıyla Mann-Whitney U testi uygulandı. Kategorik değiĢkenler için gruplar arasındaki farkların bulunması amacıyla Pearson’ın ki-kare testi yapıldı. Ġstatistiksel önem derecesi olarak p < 0,05 kabul edildi. 21 BULGULAR M. bovis Pnömonilerinin Yaygınlığı ÇalıĢmada Bursa ili ve çevresinde yer alan mezbahalarda kesilen toplam 1413 hayvanın akciğerleri incelendi ve bu hayvanların 136’sında (% 9,63) pnömoniye yönelik bulgular gözlenerek örnek alındı. Yine Patoloji Anabilim Dalı laboratuvarına getirilen ve pnömoni bulguları gösteren 10 akciğer dokusu da çalıĢmada incelendi. Alınan akciğer dokularında M. bovis’in saptanması amacıyla mikrobiyolojik ekim ve immunohistokimyasal boyamalar yapıldı. Toplam 39 hayvanda M. bovis pnömoni sebebi olarak ortaya kondu. Böylece Bursa ili ve çevresindeki mezbahalarda kesilen ya da Patoloji Anabilim Dalı laboratuvarına getirilen ve pnömoni bulguları gösteren hayvanlarda M. bovis’in yaygınlık oranı % 26,71 olarak tespit edildi. M. bovis (+) ve M. bovis (-) hayvanlarda etkilenen akciğer loblarının (ġekil-1A) sayısı ve yüzdeleri Tablo 4’te görülmektedir. Tablo-4 M. bovis (+) ve M. bovis (-) hayvanlarda etkilenen akciğer loblarının sayısı ve yüzdesi M. bovis (+) hayvanlar (n=39) M. bovis (-) hayvanlar (n=107) % % Loblar Hayvan sayısı (x/39) Hayvan sayısı (x/107) Pars cranialis dextra 22 56,41 65 60,75 Pars caudalis dextra 15 38,46 35 32,71 Pars medialis dextra 14 35,90 25 23,36 Caudalis dextra 12 30,77 27 25,23 Lobus accessorius 13 33,33 26 24,30 Pars cranialis sinistra 19 48,72 36 33,64 Pars caudalis sinistra 19 48,72 42 39,25 Caudalis sinistra 12 30,77 26 24,30 p > 0,05 M. bovis (+) hayvanlarda en sık olarak etkilenen akciğer lobunun sağ kranial lobun pars kranialisi (pars cranialis dextra) olduğu, bunu sol kranial lobun pars kranialis (pars cranialis sinistra) ve pars kaudalisinin (pars caudalis sinistra) takip ettiği gözlendi. Sağ 22 kranial lobun pars kranialisi (pars cranialis dextra) M. bovis (-) hayvanlarda da en sık olarak etkilenen akciğer lobuydu. Ancak yapılan istatistiksel analizde etkilenme bakımından loblar arasında belirgin fark gözlenmedi (p > 0,05). Makroskobik Bulgular Etkilenen akciğer loblarında mermer manzarası görünümünde konsolidasyon sahaları ile grimsi krem renkte, multifokal nekroz alanları görüldü (ġekil-1B). Bu nekroz alanları yer yer sert kıvamdaydı ve nodüler yapı göstermekteydi. Nekrozun özellikle bronĢ ve bronĢiyoller etrafındaki akciğer bölgelerini etkilemiĢ olduğu dikkati çekti. Nekroz alanlarının kesit yüzlerinde bağ dokudan kapsül ile çevrelenmiĢ nekrotik-irinli bölgeler veya koagulasyon nekrozları gözlendi. BronĢ ve bronĢiyol lümenlerinde yer yer irinli eksudat ile karĢılaĢıldı. Histopatolojik Bulgular M. bovis pozitif hayvanların akciğerlerinden alınan doku örneklerinin ıĢık mikroskobik inceleme sonuçları özet olarak Tablo 5’te verilmektedir. Pnömoniler eksudat yapısı ve etkilenen kısımlar yönünden incelendiğinde toplamda 7 grupta sınıflandırılmıĢlardır. Bu gruplar ve bu gruplara giren hayvan sayıları aĢağıdaki Ģekildedir: 1. Fibrinopurulent bronkopnömoni (10 hayvan): Purulent bronkopnömoniye benzemekle beraber alveoller içerisinde yoğun Ģekilde fibrin birikimleri gözlendi (ġekil- 1C). Bu vakalarda lenfatik damarlar içerisinde fibrin tıkaçlarının ĢekillenmiĢ olması dikkate değer bir bulguydu (ġekil-1D). BronĢ ve bronĢiyol epitellerinde dökülme ve lümen içerisinde dökülmüĢ epitel hücreleri ile nötrofil, lenfosit, plazma hücresi ve makrofajlardan oluĢan yangısal eksudatın yer aldığı dikkati çekti (ġekil-1E). 2. Non-purulent bronkointersitisyel pnömoni (6 hayvan): BronĢ, bronĢiyol submukozaları ile intersitisyel doku içerisinde mononükleer hücreler (lenfositler, plazma hücreleri ve makrofajlar) gözlendi (ġekil-1F). BALT’ın hiperplaziye uğradığı ve bronĢ- bronĢiyol lümenlerinin daralmıĢ olduğu görüldü. BronĢ ve bronĢiyol epitellerinde dökülme ve lümen içerisinde dökülmüĢ epitel hücreleri ile lenfositler, plazma hücreleri ve makrofajlardan oluĢan yangı hücrelerinin yer aldığı dikkati çekti (ġekil-2A). 3. Non-purulent bronkopnömoni (3 hayvan): BronĢ ve bronĢiyol submukozası ile bronĢ, bronĢiyol ve alveol lümenleri içerisinde lenfosit, plazma hücreleri ve makrofajlardan oluĢan yangı hücrelerinin varlığı, bronĢ ve alveol epitellerinde yer yer dökülmeler ile BALT hiperplazisi dikkati çekti. 23 4. Purulent bronkopnömoni (5 hayvan): BronĢ, bronĢiyol submukozası ile alveol lümenleri içerisinde çok sayıda sağlam ya da dejenere olmuĢ nötrofil lökositin varlığı ile karakterizeydi. Yer yer BALT hiperplazisi görüldü. 5. Nekrotik-purulent bronkopnömoni (5 hayvan): Akciğer dokusu içerisinde yer yer yaygın nekroz alanları ile bazı bölgelerde bronĢ, bronĢiyol ve alveol epitellerinde dökülmeler gözlendi. BronĢ, bronĢiyol ve alveol lümenleri içerisinde çok sayıda nötrofil lökositin varlığı dikkati çekti. 6. Nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömoni (6 hayvan): Nekrotik-purulent bronkopnömoniden farklı olarak özellikle alveoller içerisinde belirgin fibrin çıkıĢları gözlendi. Bazı lenf damarlarında fibrin tıkaçlarının ĢekillenmiĢ olduğu dikkati çekti. 7. Piyogranülomatöz bronkopnömoni (4 hayvan): Akciğer dokusu içerisinde yer yer piyogranülomatöz odakların varlığı dikkati çekti (ġekil-2B). Bu odakların çevresinde kalan bölgelerde nötrofil, lenfosit, plazma hücresi ve makrofajlardan oluĢan yangı hücrelerinin bulunduğu görüldü. BronĢ, bronĢiyol ve alveol epitellerinde yer yer dökülmeler gözlendi. Yukarıdaki bu bulgulara ilave olarak hemen hemen tüm vakalarda akciğerlerde değiĢen derecelerde amfizem ve atelektazi alanları gözlendi. Kronik vakalarda intersitisyel bölgelerde bağ doku oranının artmıĢ olduğu gözlendi. Dökülen bazı alveol epitellerinin yerlerinde tip II pnömositlerin üremesi tarzında iyileĢme faaliyetlerinin baĢlamıĢ olduğu gözlendi. Bazı alveoller içerisinde sinsitiyal hücreler (ġekil-2C) ile alveolar makrofajların (ġekil-2D) varlığı dikkati çekti. ġiddetli eksudasyonun olduğu bazı vakalarda bronĢiyol lümenleri nekrotik eksudat ile tamamen dolmuĢtu (bronĢiyolitis obliterans). M. bovis pnömonili hayvanların 18’inde akciğerlerde nekrotik alanların varlığı gözlendi. Bu olayların 11’inde nekroz kazeifikasyon (ġekil-2E) tarzındayken, 7 vakada koagulasyon nekrozunun (ġekil-2F) varlığı dikkati çekti. Kazeifikasyon nekrozu ĢekillenmiĢ olan hayvanlardan 4’ünde nekrotik alan içerisinde kalsifikasyon (ġekil-2E) geliĢtiği görüldü. Farklı Pnömoni Tipleri-Pnömoni ġiddeti Arasındaki ĠliĢki Farklı tipteki pnömonilerde ortalama pnömoni Ģiddetleri Ģu oranlarda bulundu: Non-purulent bronkointersitisyel pnömoni (4,00 ± 1,55), piyogranülomatöz bronkopnömoni (6,00 ± 1,41), fibrinopurulent bronkopnömoni (6,30 ± 1,42), nekrotik- purulent bronkopnömoni (6,80 ± 1,30), purulent bronkopnömoni (7,00 ± 1,00), nekrotik- 24 Tablo-5 M. bovis (+) hayvanlarda pnömoninin tipi (ve Ģiddeti), nekroz ve kalsifikasyon durumu No Pnömoni tipi (ve Ģiddeti*) Nekroz (+kalsifikasyom) 1 Non-purulent bronkointersitisyel pnömoni (1, 2) - 2 Piyogranülomatöz bronkopnömoni (2, 3) Kazeifikasyon 3 Fibrinopurulent bronkopnömoni (3, 4) - 4 Non-purulent bronkointersitisyel pnömoni (1, 2) - 5 Nekrotik-purulent bronkopnömoni (2, 3) Kazeifikasyon+kalsifikasyon 6 Nekrotik-purulent bronkopnömoni (4, 4) Kazeifikasyon+kalsifikasyon 7 Piyogranülomatöz bronkopnömoni (2, 4) Kazeifikasyon 8 Purulent bronkopnömoni (3, 3) Kazeifikasyon 9 Fibrinopurulent bronkopnömoni (3, 4) Koagulasyon 10 Piyogranülomatöz bronkopnömoni (4, 4) Kazeifikasyon 11 Purulent bronkopnömoni (4, 4) - 12 Non-purulent bronkointersitisyel pnömoni (3, 3) Kazeifikasyon 13 Fibrinopurulent bronkopnömoni (3, 4) - 14 Fibrinopurulent bronkopnömoni (3, 3) - 15 Fibrinopurulent bronkopnömoni (3, 4) - 16 Non-purulent bronkointersitisyel pnömoni (1, 2) - 17 Nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömoni (3, 4) Kazeifikasyon 18 Fibrinopurulent bronkopnömoni (4, 4) - 19 Non-purulent bronkopnömoni (2, 3) - 20 Nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömoni (4, 4) Koagulasyon 21 Non-purulent bronkopnömoni (2, 1) - 22 Piyogranülomatöz bronkopnömoni (2, 3) Kazeifikasyon+kalsifikasyon 23 Fibrinopurulent bronkopnömoni (3, 3) - 24 Non-purulent bronkopnömoni (1, 1) - 25 Nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömoni (4, 3) - 26 Nekrotik-purulent bronkopnömoni (3, 4) Kazeifikasyon+kalsifikasyon 25 27 Nekrotik-purulent bronkopnömoni (4, 4) Koagulasyon 28 Nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömoni (3, 4) Kazeifikasyon 29 Purulent bronkopnömoni (3, 4) Koagulasyon 30 Purulent bronkopnömoni (3, 3) - 31 Purulent bronkopnömoni (4, 4) - 32 Non-purulent bronkointersitisyel pnömoni (3, 3) - 33 Fibrinopurulent bronkopnömoni (3, 4) - 34 Fibrinopurulent bronkopnömoni (1, 2) - 35 Non-purulent bronkointersitisyel pnömoni (1, 2) - 36 Fibrinopurulent bronkopnömoni (2, 3) Koagulasyon 37 Nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömoni (4, 4) Koagulasyon 38 Nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömoni (4, 4) - 39 Nekrotik-purulent bronkopnömoni (4, 2) Koagulasyon *Parantez içerisindeki ilk rakam toplam kesitte etkilenen alan oranına göre 1-4 arası derecelendirmeyi, ikinci rakam ise yangı hücresi sayısına göre 1-4 arası derecelendirmeyi göstermektedir. Toplam pnömoni Ģiddeti bu iki rakamın toplanması ile elde edilmiĢtir. fibrinopurulent bronkopnömoni (7,50 ± 0,55), non-purulent bronkopnömoni (3,33 ± 1,53). Bu sonuçlara göre en yüksek Ģiddet skoru nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömonilerde gözlenirken, en hafif Ģiddet skoruna non-purulent bronkopnömonilerde rastlanmıĢtır. Ziehl-Neelsen Boyama Sonuçları Pozitif kontrol olarak kullanılan dokuda asidorezistant bakteriler açık mavi fonda parlak kırmızı olarak gözlenirken, M. bovis (+) hayvanların hiçbirinde asidorezistant bakteri bulunmadı. Mikrobiyolojik Ġnceleme Sonuçları Mikrobiyolojik incelemesi yapılan 148 akciğer örneğinden 38’inde M. bovis izole ve identifiye edildi. Bu vakalardan 30’unda M. bovis izole edilebilen tek etkendi. Sekiz hayvanda ise M. bovis’in yanısıra Ģu etkenler izole ve identifiye edildi: P. multocida (22, 28, 34, 36 nolu hayvanlar), Streptococcus spp. (16 ve 28 nolu hayvanlar), A. pyogenes (22 ve 39 nolu hayvanlar) ve M. haemolytica (25 ve 38 nolu hayvanlar). 26 A ġekil-1: Sığırda Ģematik akciğer ve M. bovis izole edilen akciğerlere ait makroskobik ve mikroskobik bulgular A- Sığırda akciğer loblarının Ģematik görünümü (PCD-Pars cranialis dextra, PCaD-Pars caudalis dextra, LM-Lobus medialis, LA-Lobus accessorius, LCD-Lobus caudalis dextra, PCS-Pars cranialis sinistra, PCaS-Pars caudalis sinistra, LCS-Lobus caudalis sinistra) B- Akciğerin sağ loblarında gözlenen pnömoni tablosu C- Fibrinopurulent pnömoni. Alveol lümenlerinde fibrin birikimi (ince oklar) ve nötrofil lökosit infiltrasyonları (kalın oklar). H&E, Bar = 50 µm (18 nolu hayvan) D- Ġnterlobuler intersitisyumdaki lenfatik damarlarda fibrin tıkaçları (oklar), alveol lümenindeki fibrin birikimi (ok baĢları) ve alveol lümenlerindeki nötrofil lökosit infiltrasyonları (saydam oklar), H&E, Bar = 200 µm (18 nolu hayvan) E- BronĢiyol lümeninde purulent eksudat (ok), H&E, Bar = 100 µm (9 nolu hayvan) F- Yaygın Ģiddetli, bronkointersitisyel pnömoni, H&E, Bar = 100 µm (1 nolu hayvan) 27 ġekil-2: M. bovis izole edilen pnömonili akciğerlerdeki mikroskobik lezyonlar A- ġiddetli bronĢiyolitis. BronĢiyol lümeni (BL) içerisindeki ve çevresindeki yangı hücreleri (ince oklar) ve sağlam kalmıĢ bronĢiyol epiteli (kalın ok), H&E, Bar = 200 µm (6 nolu hayvan) B- Piyogranülomatöz yangı odağı, kazeifikasyon nekrozu (N) ve nekroz çevresindeki nötrofil lökosit infiltrasyonları (oklar). H&E, Bar = 100 µm (10 nolu hayvan) C- Alveol lümenlerinde sinsitiyal hücre oluĢumları (oklar), H&E, Bar = 50 µm (37 nolu hayvan) D- Alveolar makrofajlardaki aktivasyon (ince oklar) ve alveol lümenlerinde nötrofil lökosit kümeleri (kalın oklar), H&E, Bar = 50 µm (37 nolu hayvan) E- Kazeifikasyon nekrozu (N) ve kalsifikasyon (ince ok) ile kazeifikasyon nekrozu çevresindeki yangı hücreleri (kalın ok). H&E, Bar = 200 µm (6 nolu hayvan) F- Yaygın, Ģiddetli koagulasyon nekroz alanı (N), H&E, Bar = 200 µm (20 nolu hayvan) 28 Pnömoni ġiddeti ile Koenfeksiyon Varlığı Arasındaki ĠliĢki Sadece M. bovis (+) izole edilen hayvanlarla, koenfeksiyon gözlenen hayvanların farklı Ģiddetteki pnömonilere göre dağılımı Tablo 6’da verilmektedir. Tablo-6 M. bovis (+) hayvanlarda farklı pnömoni Ģiddetlerinin koenfeksiyon olan ve olmayan hayvanlara göre dağılımı Pnömoni ġiddeti 2 3 4 5 6 7 8 Koenfeksiyon olan hayvan sayısı (n=8) 0 2 0 2 1 2 1 Koenfeksiyon olmayan hayvan sayısı (n=31) 1 4 0 3 7 8 8 p=0,328 Koenfeksiyonun oluĢtuğu 8 hayvanın pnömoni Ģiddetinin ortalaması (5,50 ± 1,85) ile, olmadığı 31 hayvanın pnömoni Ģiddetinin ortalaması (6,16 ± 1,77) arasında istatistiksel fark ortaya konamadı (p=0,328). Ġmmunohistokimyasal Boyama Sonuçları M. bovis Boyama Sonuçları Ġmmunohistokimyasal incelemesi yapılan 39 vakadan 24’ünde etken nekrotik odakların merkezinde ve çevresinde (ġekil-3A); bronĢ, bronĢiyol ve alveol epitelleri (ġekil-3B) ile varsa bu yapıların içerisindeki eksudat içerisinde; nötrofil (ġekil-3C), makrofaj ve alveolar makrofaj sitoplazmaları içerisinde kahverengi granüler boyanma tarzında gözlendi. Ġmmunohistokimyasal boyama sonuçlarına göre M. bovis’in akciğer dokusundaki yerleĢimi Tablo 7’de gösterilmektedir. Buna göre etkene en fazla bronĢ ve bronĢiyol epitellerinde (20 hayvanda), makrofaj (14 hayvan) ve nötrofil (11 hayvan) sitoplazmaları içerisinde rastlandı. Etkenin en az görüldüğü yer alveol epitelleriydi. M. bovis Mikrobiyolojik Ekim-Ġmmunohistokimya Sonuçlarının KarĢılaĢtırılması Mikrobiyolojik inceleme sonuçlarına göre M. bovis izole edilen 38 vakadan 24’ünde immunohistokimya ile etken gösterilirken, diğer 14 vakada M. bovis sadece mikrobiyolojik olarak ortaya konabildi. Bir hayvanda (hayvan no 37) ise immunohistokimyasal boyama ile etken bronĢ ve bronĢiyol epitel hücreleri içerisinde, 29 ġekil-3: M. bovis (+) akciğer örneklerinde etkenin, CD3 (+) T hücrelerinin ve CD79 (+) B hücrelerinin görünümü A- Koagulasyon nekrozu (N), nekrotik alanın periferal kısımlarındaki M. bovis (oklar) etkeni, nekroz alanını sınırlayan dejenere-nekrotik nötrofil lökositler (kar tanesi) ve diğer yangı hücreleri (kalın ok), Streptavidin- biotin-peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 50 µm (20 nolu hayvan) B- BronĢiyol epiteli (ince oklar) ve bronĢiyol bez epitelindeki (kalın ok) etkenlerin gösterilmesi, Streptavidin- biotin-peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 50 µm (27 nolu hayvan) C- Alveol lümenlerindeki nötrofil lökositler içerisinde yerleĢen etkenler (oklar), Streptavidin-biotin- peroksidaz methodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 50 µm (37 nolu hayvan) D- BronĢiyol etrafındaki lenfoid dokuda CD3 (+) T lenfositler (oklar), Streptavidin-biotin-peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 100 µm (19 nolu hayvan) E- Nekroz alanı çevresinde CD3 (+) T lenfositler (oklar), nekroz alanı (N), nekroz alanı etrafındaki bağ doku (b), Streptavidin-biotin-peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 100 µm (5 nolu hayvan) F- BronĢiyol (kalın ok) etrafındaki lenfoid dokuda CD79 (+) B hücreleri (ince oklar), Streptavidin-biotin- peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 200 µm (36 nolu hayvan) 30 ġekil-4: M. bovis (+) akciğer örneklerinde CD79 (+), kappa hafif zinciri (+) ve lambda hafif zinciri (+) B hücreleri ve plazma hücrelerinin görünümü A- Nekroz alanı (N) etrafındaki CD79 (+) B hücreleri (oklar), Streptavidin-biotin-peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 100 µm (17 nolu hayvan) B- Nekroz alanı (N) etrafındaki kappa hafif zincirleri (+) plazma hücreleri (oklar), Streptavidin-biotin-peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 50 µm (17 nolu hayvan) C- BronĢiyol propria mukozasında kappa hafif zincirleri (+) plazma hücreleri (ince oklar) ve bronĢiyol epiteli (kalın ok), Streptavidin-biotin-peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 50 µm (6 nolu hayvan) D- Ġnterlobuler intersitisyumda bağ doku artıĢı ve kappa hafif zincirleri (+) plazma hücreleri (oklar), Streptavidin-biotin- peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 50 µm (12 nolu hayvan) E- Nekroz alanı (N) etrafında lambda hafif zincirleri (+) plazma hücreleri (oklar), Streptavidin-biotin-peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 100 µm (6 nolu hayvan) F- Yangılı bir bronĢiyol etrafındaki lambda hafif zincirleri (+) plazma hücreleri (oklar), Streptavidin-biotin-peroksidaz metodu, karĢı boyama Harris Hematoksilen, Bar = 50 µm (25 nolu hayvan) 31 Tablo-7 Ġmmunohistokimyasal boyama sonuçlarına göre M. bovis’in akciğer dokusundaki yerleĢimi Nekroz Nekroz Eksudat Yangı hücrelerinin BronĢ, Alveol Alveolar merkezinde çevresinde içerisinde sitoplazmasında bronĢiyol epitelinde makrofaj No epitelinde içerisinde Nötrofil Makrofaj 2 - + - + + + + _ 3 - - + + + + - + 5 - + _ + + + - - 6 - - + + + + + - 7 + + - _ + - - - 10 + + + + + + - + 12 - - + + + + - - 17 + + - - - - - - 18 - - - - + + - + 19 - - + - - + - - 20 + + - + - + - + 21 - - - - - + - - 23 - - + + + + - + 27 + + - - + + - - 28 - - - - - + - - 29 - + - + + - - - 30 - - - - - + + + 31 - - + - + + - + 32 - - - - - + - - 33 - - + - + + - + 34 - - + + - + - - 36 - + - - + + - + 37 - - + + - + - - 39 + + - - - - - - n=24 6 10 10 11 14 20 3 9 32 nötrofil lökositlerin sitoplazmalarında ve bronĢiyol ve alveol lümenleri içerisinde gözlenirken, mikrobiyolojik incelemede etken üretilemedi. Ġmmunohistokimyasal M. bovis Pozitivitesi-Pnömoni ġiddeti Arasındaki ĠliĢki Ġmmunohistokimyasal inceleme sonucu etkenin gösterildiği 24 hayvanda ortalama pnömoni Ģiddeti 6,38 ± 1,50 olarak bulunurken, etkenin sadece mikrobiyolojik inceleme sonucu ortaya konduğu 15 hayvanda 5,47 ± 2,10 olarak saptandı. Ġki değer arasında istatistiksel açıdan önem bulunmadı (p=0,246). Ġmmunohistokimyasal M. bovis Pozitivitesi-Nekroz Varlığı Arasındaki ĠliĢki Ġmmunohistokimyasal olarak etkenin gösterildiği ve gösterilmediği hayvanlar ile bu hayvanlardan akciğerlerinde nekrotik değiĢiklikler olanların sayıları Tablo 8’de verilmektedir. Tablo-8 Ġmmunohistokimyasal boyama sonuçlarına göre M. bovis (+) ve M. bovis (-) hayvan sayıları ile bu hayvanların akciğerlerindeki nekroz durumu Ġmmunohistokimya Ġmmunohistokimya M. bovis (+) M. bovis (-) Nekroz var (n=18) 14 4 Nekroz yok (n=21) 10 11 p=0,053 Yapılan istatistiksel analizde önem derecesi sınıra çok yakın olarak (p=0,053) bulundu. Yangı Hücreleri Ġçin Yapılan Boyamaların Sonuçları Yangı hücreleri için yapılan immunohistokimyasal boyamalarda elde edilen sonuçlar Ģu Ģekildeydi: CD3: Pozitif boyanan hücreler bronĢ ve bronĢiyoller çevresinde, interalveolar septumda, interlobuler intersitisyumda, plörada, BALT’ta (ġekil-3D) ve nekrotik alanlar çevresindeki hücre infiltrasyonu sahalarında (ġekil-3E) gözlendi. Boyanma hücre zarında koyu kahve renkte görüldü. 33 CD79: Pozitif boyanan hücreler belirgin olarak BALT’ta (ġekil-3F), bunun yanısıra bronĢ ve bronĢiyoller çevresinde, interalveolar septumda, interlobuler intersitisyumda ve nekrotik odaklar çevresinde (ġekil-4A) görüldü. Boyanma çekirdek zarında, koyu kahve renkte gözlendi. Kappa hafif zincirleri: Pozitif boyanan hücreler çoğunlukla nekrotik alanlar çevresindeki hücre infiltrasyonu sahalarında (ġekil-4B), bronĢ ve bronĢiyoller çevresinde (ġekil-4C) ve daha az olarak da interalveolar septumda ve interlobuler intersitisyumda gözlendi. Boyanma hücre sitoplazmasında ve koyu kahve renkte görüldü. Lambda hafif zincirleri: Pozitif boyanan hücreler interalveolar septumda ve interlobuler intersitisyumda (ġekil-4D), nekrotik alanlar çevresindeki hücre infiltrasyonu sahalarında (ġekil-4E) ve yoğun olarak da bronĢ ve bronĢiyoller çevresinde (ġekil-4F) gözlendi. Boyanma hücre sitoplazmasında ve koyu kahve renkte görüldü. Yangı Hücrelerinin Yoğunluğu ve Dağılımı M. bovis (+) 39 hayvanda yangı hücrelerinin ortalama değerleri incelendiğinde en fazla yangı hücresinin 3,06 ± 0,77 ile CD3 (+) boyanan hücreler olduğu gözlendi. Bunu 2,30 ± 0,99 ile lambda hafif zincirleri (+) hücreler, 2,24 ± 1,03 ile CD79 (+) hücreler ve 2,16 ± 0,85 ile kappa hafif zincirleri (+) hücreler takip etti. Farklı yoğunlukta hücre infiltrasyonu olan alanlarda, farklı tipteki hücrelerin dağılımını bulmak amacıyla, pnömonilerin Ģiddetlerinin hesaplanmasında kullanılan yangı hücresi skorları ile aynı preparatlarda immunohistokimyasal boyamaların incelenmesi sonucu elde edilen skorlar kullanıldı. Sonuçlar Tablo 9’da gösterilmektedir. Tablodan da görüldüğü gibi CD79 (+), kappa hafif zincirleri (+) ve lambda hafif zincirleri (+) hücrelerde, toplam hücre yoğunluğunun artıĢına bağlı olarak genel bir artıĢ eğilimi gözlenirken, en yüksek CD3 (+) hücre sayısına hücre yoğunluğu skoru 3 olan hayvanlarda rastlandı. 34 Tablo-9 M. bovis (+) hayvanlarda farklı Ģiddetteki pnömonilerde yangı hücrelerinin değerleri (ortalama skor ± standard sapma) Hücre Kappa Hafif Lambda Hafif Yoğunluğu CD3 CD79 Zincirleri Zincirleri Skoru* b b b b 2 2,38 ± 0,59 1,27 ± 0,43 1,33 ± 0,24 1,53 ± 0,53 a ab a ab 3 3,37 ± 0,48 2,34 ± 1,03 2,21 ± 0,73 2,06 ±1,05 a a a a 4 3,14 ± 0,82 2,55 ± 1,02 2,47 ± 0,88 2,76 ± 0,89 *Yoğunluk skoru 1 bulunan grupta sadece 2 hayvan yer aldığı için bu hayvanlara ait değerler istatistik analize alınmamıĢtır. a, b Aynı sütun içerisinde farklı harfler belirgin farkı ifade etmektedir (p < 0,05) Bakteriyel Koenfeksiyon Varlığı-Yangı Hücresi Sayısı Arasındaki ĠliĢki M. bovis (+) hayvanlarda bakteriyel koenfeksiyon olma ve olmama durumu ile yangı hücrelerinin sayısı arasındaki iliĢki Tablo 10’da sunulmaktadır. Tablo-10 M. bovis (+) hayvanlarda bakteriyel koenfeksiyon olup olmama durumlarında yangı hücrelerinin değerleri (ortalama skor ± standard sapma) Kappa Hafif Lambda Hafif CD3 CD79 Zincirleri Zincirleri Koenfeksiyon olan hayvan 3,05 ± 0,83 2,35 ± 0,99 2,22 ± 0,87 2,34 ± 0,98 sayısı (n=8) Koenfeksiyon olmayan hayvan 3,11 ± 0,53 1,81 ± 1,13 1,91 ± 0,81 2,15 ± 1,12 sayısı (n=31) p > 0,05 Yapılan istatistiksel analizde M. bovis (+) hayvanlarda bakteriyel koenfeksiyon olup olmamasının yangı hücrelerinin sayısı üzerine belirgin derecede etki etmediği görülmüĢtür (p > 0,05). Nekroz Varlığı-Yangı Hücresi Sayısı Arasındaki ĠliĢki M. bovis (+) hayvanlarda nekroz olma ve olmama durumu ile yangı hücrelerinin sayısı arasındaki iliĢki Tablo 11’de sunulmaktadır. 35 Tablo-11 M. bovis (+) hayvanlarda nekroz olup olmama durumlarında yangı hücrelerinin değerleri (ortalama skor ± standard sapma) Kappa Hafif Lambda Hafif CD3 CD79 Zincirleri Zincirleri a b Nekroz yok (n=21) 3,08 ± 0,73 2,10 ± 1,02 3,58 ± 7,93 1,96 ± 0,99 b a Kazeifikasyon nekrozu (n=11) 3,32 ± 0,40 2,60 ± 1,07 2,68 ± 0,40 2,77 ± 0,84 a ab Koagulasyon nekrozu (n=7) 2,60 ± 1,17 2,07 ± 1,01 1,94 ± 0,85 2,59 ± 0,95 a, b Aynı sütun içerisinde farklı harfler belirgin farkı ifade etmektedir (p < 0,05) Kappa hafif zincirleri için yapılan boyamalarda nekroz olmayan hayvanlardaki değerler, kazeifikasyon nekrozu ĢekillenmiĢ olan hayvanlardan (p=0,022) ve kazeifikasyon nekrozu ĢekillenmiĢ olan hayvanlardaki değerler de koagülasyon nekrozu ĢekillenmiĢ olan hayvanlardan (p=0,027) önemli derecede yüksek bulunmuĢtur. Lambda hafif zincirleri (+) hücre sayısı kazeifikasyon nekrozu ĢekillenmiĢ olan hayvanlarda, nekroz olmayan hayvanlara göre belirgin derecede yüksek olarak gözlenmiĢtir (p=0,022). Ġmmunohistokimyasal M. bovis Pozitivitesi-Yangı Hücresi Sayısı Arasındaki ĠliĢki M. bovis (+) 39 hayvandan immunohistokimyasal boyama ile etkenin gösterildiği 24 hayvan ile gösterilmediği 15 hayvandaki yangı hücrelerinin dağılımı Tablo 12’de gösterilmektedir. Tablo-12 Ġmmunohistokimyasal boyamalar sonucu etkenin gösterildiği ve gösterilmediği hayvanlarda yangı hücresi değerleri (ortalama skor ± standard sapma) Kappa Hafif Lambda Hafif CD3 CD79 Zincirleri Zincirleri Ġmmunohistokimya M. bovis (+) 3,13 ± 0,79 2,44 ± 1,01 2,25 ± 0,75 2,46 ± 0,98 (n=24) Ġmmunohistokimya M. bovis (-) 2,95 ± 0,77 1,91 ± 1,02 2,00 ± 1,00 2,05 ± 1,00 (n=15) p > 0,05 Etkenin immunohistokimya ile gösterildiği hayvanlarla, gösterilmediği hayvanlar arasında yangı hücreleri bakımından belirgin fark olmadığı gözlendi (p > 0,05). 36 TARTIġMA VE SONUÇ Bu çalıĢmada Bursa ili ve çevresinde yer alan mezbahalarda kesilen veya Patoloji Anabilim Dalı laboratuvarına incelenmek üzere getirilen pnömonili sığır akciğerlerinde M. bovis pnömonilerinin prevalansı ortaya konmuĢ, etkenin oluĢturduğu pnömoninin histopatolojik incelemesi yapılmıĢ, etken bakteriyolojik olarak izole ve identifiye edilmiĢ ve immunohistokimyasal olarak gösterilmiĢ, ayrıca etkene karĢı geliĢen yangısal yanıt incelenmiĢtir. ÇalıĢmanın deneysel bir çalıĢma olmaması ve mezbahada kesilen hayvanlarla yürütülmüĢ olması beraberinde çeĢitli güçlükleri de getirmiĢtir. Hayvanların kesildiği ortamla, karkasın incelendiği ve akciğerlerin karkastan ayrıldığı ortamların birbirinden farklı yerler olması hayvanlardan kan alınmasını ve hayvanlardaki diğer lezyonların takip edilmesini güçleĢtiren bir faktördür. Dolayısıyla serolojik muayene ve pnömoni ile birlikte hayvanlarda gözlenen diğer patolojik değiĢikliklerin incelenmesi bu çalıĢmanın amacı olarak ortaya konmamıĢtır. Benzer sebeplerden dolayı hayvanların geldikleri bölgelere ve yaĢlarına ait bilgiler de toplanamamıĢtır. Ancak mezbahalarda sorumlu olan veteriner hekimlerle yapılan görüĢmelerde hayvanların tamama yakınının Marmara bölgesinde yetiĢtirilen hayvanlar olduğu öğrenilmiĢtir. Etkenin Yaygınlığı Yapılan çalıĢmada Bursa ili ve çevresindeki mezbahalarda kesilen ya da Patoloji Anabilim Dalı laboratuvarına incelenmek üzere getirilen pnömonili sığır akciğerlerinde M. bovis’in prevalansı % 26,71 olarak tespit edilmiĢtir. Bu sonuçlar M. bovis’in bölgemizde en yaygın solunum sistemi patojenlerinden biri olduğunu ortaya koymaktadır. M. bovis’in sığır pnömonilerindeki yaygınlığına yönelik olarak elde edilen oran, etkene yönelik olarak daha önce yapılmıĢ olan çalıĢmalarla uyumludur (90-95). Etkenin özellikle Avrupa’daki yaygınlığı konusunda çok sayıda çalıĢma bulunmaktadır. Pnömonili hayvanların akciğerlerinden ortalama % 20-30 arasında değiĢen oranlarda M. bovis izole edilmektedir. M. bovis açısından yapılan serolojik testlerde Fransa’da % 10-20 (96), Macaristan’da % 11 (80) ve Ġngiltere’de % 22 (97) seropozitivite tesbit edilmiĢtir. Bu çalıĢmada serolojik bir inceleme yapılmamıĢ, sadece pnömoni bulguları gösteren hayvanlardan alınan örneklerde etken mikrobiyolojik ve immunohistokimyasal inceleme ile ortaya konmuĢtur. Makroskobik lezyon göstermeksizin etkeni akciğerlerinde bulundurabilen hayvanlar da olabileceği ve hastalığı geçirmiĢ olan hayvanların uzun süre 37 seropozitif oldukları göz önünde bulundurulduğunda, yapılacak serolojik testlerde sonuçların çok daha yüksek olarak bulunacağı beklenebilir. Son dönemde Ġtalya’da yapılan bir çalıĢmada yetiĢkin sığırlarda % 76, buzağılarda da % 100 oranında M. bovis seropozitivitesi saptanmıĢ, rakamların bu kadar yüksek çıkmasının sebebi olarak da Ġtalya’da sığır yetiĢtiriciliğinde çiftlik yönetiminin kötü yapılması, hayvanların aĢırı kalabalık olarak yetiĢtirilmesi ve dıĢarıdan sürülere kontrolsüz hayvan giriĢlerinin olması gösterilmiĢtir (53). Benzer Ģekilde, yönetim koĢulları bakımından pek çok eksiğin bulunduğu ülkemizde etkenin bu kadar yaygın olmasının sebepleri arasında yönetimsel hataların ve kötü bakım Ģartlarının etkili olduğu düĢünülebilir. Bu çalıĢmada gerek M. bovis (+), gerekse M. bovis (-) hayvanlarda en sık olarak etkilenen akciğer lobunun sağ kranial lobun pars kranialisi (pars cranialis dextra) olduğu gözlenmiĢ, ancak istatistiksel analiz sonucu M. bovis’in yerleĢimi bakımından loblar arasında belirgin bir fark olmadığı görülmüĢtür. Akciğer lobları arasında belirgin bir fark olmaması pnömoninin akciğer içerisinde hızlı bir Ģekilde diğer loblara da yayıldığı ve etkenin yerleĢmeyi özellikle tercih ettiği bir lobun olmadığı tarzında yorumlanabilir. Makroskobik Bulgular ÇalıĢmada M. bovis (+) hayvanların akciğerlerinde mermer manzarası görünümünde konsolidasyon sahaları ile multifokal kazeifikasyon ve koagülasyon nekrozu alanları görülmüĢ, nekrotik alanların yer yer nodüler yapılar tarzında olduğu dikkati çekmiĢtir. Khodakaram-Tafti ve Lopez (84) sığırlarda gözlenen nekrotik bronkopnömonilerde, özellikle de bu nekroz bronĢ ve bronĢiyoller çevresinde yerleĢmiĢ olan piyogranülomatöz bir yangının parçası ise, M. bovis pnömonisinden Ģüphe edilmesi gerektiğini vurgulamıĢlardır. Piyogranülomatöz yangı ile birlikte kazeifikasyon nekrozu alanlarının gözlenmesi M. bovis için karakteristikken, koagülasyon nekrozu gözlenen olaylar M. haemolytica ve H. somni enfeksiyonlarından ayırt edilmelidir (84). Mikroskobik Bulgular Pnömonilerin Sınıflandırılması ÇalıĢmada M. bovis pnömonileri akciğer dokusu içerisindeki dağılımı ve eksudat karakteri bakımından birlikte değerlendirildiğinde, lezyonların en sağlıklı olarak 7 grupta toplanabileceği görülmüĢtür. Yapılan sınıflandırmada en fazla gözlenen pnömoni tipi 10 hayvan ile fibrinopurulent bronkopnömoni olmuĢtur. Bunu 6’Ģar hayvan ile non-purulent bronkointersitisyel pnömoni ve nekrotik-fibrinopurulent bronkopnömoni takip etmiĢtir. 38 M. bovis’e bağlı pnömonilerin sınıflandırılmasında çeĢitli çalıĢmalar arasında farklar mevcuttur. Radaelli ve arkadaĢları (53) pnömonileri kronik bronkointersitisyel pnömoni, kronik kataral bronkopnömoni, kronik nekrotik-irinli bronkopnömoni, kronik- subakut fibrinonekrotik pnömoni ve eozinofilik bronkointersitisyel pnömoni olarak kategorize etmiĢlerdir. Bir baĢka çalıĢmada Khodakaram-Tafti ve Lopez (84) pnömonileri nekrotik-irinli bronkopnömoni, fibrinli-irinli-nekrotik bronkopnömoni, fibrinli-nekrotik bronkointersitisyel bronkopnömoni, irinli bronkopnömoni, kronik bronkointersitisyel pnömoni, fibrinli-nekrotik bronkopnömoni ve nekrotik bronkopnömoni olarak sınıflandırmıĢtır. Radaelli ve arkadaĢlarının (53) yaptıkları sınıflandırma ile bu çalıĢmada kullanılan sınıflandırma karĢılaĢtırıldığında genel olarak benzerlikler olduğu gözlenmektedir. Ancak adı geçen araĢtırmacıların rapor ettikleri kataral bronkopnömoni tipine ve sadece nekroz ve fibrinin gözlendiği pnömoni tipine bu çalıĢmada rastlanmamıĢtır. Yine Radaelli ve arkadaĢları (53) tarafından rapor edilen eozinofilik bronkointersitisyel pnömoniye benzer bir tablo bu çalıĢmada gözlenmemiĢtir. Yine Khodakaram-Tafti ve Lopez (84) tarafından bahsedilen sadece nekrotik ve nekrotik-fibrinli pnömoni tiplerine de bu çalıĢmada rastlanmamıĢtır. Hastalığın GeliĢiminde BronĢ ve BronĢiyollerin Rolü Daha önce yapılan immunohistokimyasal çalıĢmalarda etkenin akciğer dokusu içerisindeki dağılımına bakılarak M. bovis’e bağlı olarak geliĢen lezyonların bronkojenik yapıda olduğu (bronĢ ve bronĢiyollerden etrafa doğru yayıldığı) iddia edilmiĢtir (53). Yapılan bu çalıĢmada pnömonilerin dağılım olarak 33 hayvanda bronkopnömoni tarzında Ģekillendiği, 6 hayvanda ise bronkointersitisyel pnömoni tarzında geliĢtiği gözlenmiĢ, kısaca her vakada bronĢ ve bronĢiyollerde etkilenme durumu görülmüĢtür. Yine etkenin immunohistokimyasal olarak gösterilebildiği 24 vakanın 20’sinde etken bronĢ ve bronĢiyol epitelleri içerisinde tesbit edilirken, sadece 3 vakada alveol epitelleri içerisinde gözlenmiĢtir. Bu bulgular etkenin yayılımının bronĢ ve bronĢiyollerden çevreye doğru olduğu konusundaki düĢünceleri desteklemektedir. Nekroz GeliĢimi M. bovis pnömonilerinde geliĢen nekrozun tipi hakkında farklı raporlar mevcuttur. Bazı araĢtırmacılar etkilenen akciğerlerde kazeifikasyon nekrozu geliĢtiğini rapor ederlerken, bazı araĢtırmacılar ise koagülasyon nekrozu ve pulmoner apse geliĢimlerini bildirmektedir (98). Bu çalıĢmada M. bovis saptanan 39 hayvandan 18’inde akciğerlerde 39 nekrotik alanların varlığı gözlenmiĢ, bu olayların 11’inde kazeifikasyon nekrozu bulunurken, yedi vakada koagülasyon nekrozunun varlığı dikkati çekmiĢtir. Kazeifikasyon nekrozu ĢekillenmiĢ olan akciğerlerin dördünde nekrotik alan içerisinde ayrıca kalsifikasyon geliĢimi görülmüĢtür. Etkenin en bol olarak nekrotik alanlar içerisinde ve çevresinde gözlenmiĢ olması Ģekillenen nekrozda M. bovis’in doğrudan etkisini düĢündürmektedir. Spesifik patolojik ve immunohistokimyasal bulgular detaylı olarak rapor edilmiĢ olmasına rağmen (53, 98), M. bovis’in akciğerlerde Ģekillenen nekrotik-irinli odakların geliĢimindeki rolü tam olarak ortaya konamamıĢ, ancak M. bovis tarafından oluĢturulan kompleks polisakkarid yapıdaki bir toksin ile Ģiddetli konakçı yanıtının bu lezyonların geliĢiminden sorumlu olabileceği ileri sürülmüĢtür (53-55). Radaelli ve arkadaĢları (53) nekrotik-irinli lezyonların bulunmadığı, daha çok bronkointersitisyel pnömoni ve intersitisyel pnömoni tarzında seyreden olaylarda, folliküler bronĢitis ve bronĢiyolitis fibroza obliterans benzeri kronik bulgular rapor etmiĢlerdir. Benzer bulgular, sadece M. bovis tarafından oluĢturulan doğal ya da deneysel pnömoni olaylarında diğer araĢtırmacılar tarafından da gözlenmiĢtir (55, 98). Bu çalıĢmalarda yapılan immunohistokimyasal boyamalar, az sayıdaki etkenin bronĢ ve bronĢiyol epitellerinin sitoplazmaları içerisinde ve peribronĢiyoler intersitisyum içerisindeki histiositler içerisinde bulunduğunu ortaya koymuĢtur. In vitro çalıĢmalarda, alveolar makrofajlar tarafından etkenin öldürülebilmesi için spesifik antikorlara ihtiyaç duyulduğu ortaya konmuĢtur (99). Dolayısıyla epitel hücreleri içerisindeki az sayıdaki etken humoral yanıttan ve alveolar makrofajlardan kaçarak kronik yangısal cevabın oluĢumuna sebep olabilir (53, 100). Bu çalıĢmada etkenin immunohistokimyasal olarak gösterilebildiği 24 vakanın 20’sinde bronĢ ve bronĢiyol epitel hücrelerinin sitoplazmaları içerisinde etkenin boyandığı gözlenmiĢtir. Etkenin yüzey antijenlerini sık sık değiĢtirmesi de savunma sisteminden kaçmasında etkin olan bir faktördür (62, 101, 102). M. bovis’in ayrıca nötrofillerin fonksiyonlarını bozduğu bilinmektedir (48). Koenfeksiyonlar Bu çalıĢmada 8 hayvanda M. bovis’in yanısıra bakteriyel etken olarak P. multocida, Streptococcus spp., A. pyogenes ve M. haemolytica izole edilmiĢtir. M. bovis’in konakçı savunma sistemini zayıflattığı ve diğer patojenlerin yerleĢmesi için akciğerlerde uygun bir ortam oluĢturduğu, dolayısıyla miks enfeksiyonların görülebildiği daha önceki çalıĢmalarda rapor edilmiĢtir (61, 103-105). M. bovis ile birlikte akciğerlerden izole 40 edilebilen baĢlıca patojenler P. multocida, M. haemolytica, H. somni, A. pyogenes, E. coli, P. aeruginosa ve Salmonella spp.’dir (53, 90, 98, 106). Viral etkenlerden bovine viral diarrhoea (BVD) virus, bovine herpes virus 1 (BHV1), bovine parainfluenza 3 (BPIV3) virusları da sıklıkla M. bovis pnömonilerine eĢlik eder (85, 91). Bu çalıĢmada M. bovis ile baĢka bir patojenin birlikte görülme oranı % 20,51 olarak tesbit edilmiĢtir. M. bovis ile birlikte lezyonlardan en fazla izole edilen etken P. multocida olmuĢtur. Kuzey Ġrlanda’da 1993-1998 dönemini kapsayan bir çalıĢmada M. bovis-pozitif 287 hayvanda pnömoni olaylarından izole edilen en yaygın diğer etkenler M. haemolytica (% 20,56), A. pyogenes (% 9,06) ve P. multocida (% 8,36) olarak bulunmuĢtur (90). Ġtalya’da yapılan bir baĢka çalıĢmada ise 70 buzağının % 17,14’ünde M. bovis saf olarak izole edilirken % 5,7’sinde diğer etkenlerle birlikte (3 vakada P. multocida, 1 vakada A. pyogenes) izole edilmiĢtir (53). Ġncelendiğinde hem bu çalıĢmada, hem de diğer çalıĢmalarda M. bovis’e bağlı pnömoni geliĢen hayvanlarda izole edilen diğer etkenlerin benzer oldukları görülmektedir. M. bovis ile birlikte diğer etkenlerin birlikte görüldüğü pnömonilerde akciğerlerde Ģekillenen lezyonların daha Ģiddetli olduğu rapor edilmiĢtir (53, 84, 98, 103, 107). Akciğerlerin savunma mekanizmasını bozan ve akciğerleri bakteriyel enfeksiyonlara duyarlı hale getiren bazı viral etkenlere (108) benzer Ģekilde, M. bovis’in de enfekte buzağılarda immunsupresyon yapabileceği gösterilmiĢtir. In vitro çalıĢmalar M. bovis’in aktif hale getirilmiĢ sığır lenfositlerinde apoptosisi tetiklediğini (60) ve ayrıca lenfo- inhibitör bir peptid salgıladığını (105) göstermiĢtir. M. bovis tarafından üretilen spesifik endonükleazların lenfositlerde oluĢturduğu Ģiddetli DNA hasarının bu hücrelerde apoptotik sinyali tetiklediği düĢünülmektedir (104). Ancak bu çalıĢmada istatistik analiz sonucu bakteriyel koenfeksiyon olan hayvanlarda ĢekillenmiĢ olan pnömoninin, bakteriyel koenfeksiyon olmayan hayvanlardakinden daha Ģiddetli olmadığı ortaya çıkmıĢtır. Bu durum Marmara Bölgesinde etkenin patojenitesinin yüksek olmuĢ olmasından ya da birlikte seyreden viral enfeksiyonlardan kaynaklanmıĢ olabilir. Dikkatli incelendiğinde koenfeksiyon olsun ya da olmasın M. bovis pnömonilerinin çok Ģiddetli olarak seyrettiği (39 hayvandan 26’sında Ģiddet derecesi olarak 6-8) gözlenmiĢtir. Ġmmunohistokimyasal Boyamalar M. bovis Boyamaları Bu çalıĢmada etken hem bakteriyolojik olarak izole ve identifiye edilmiĢ, hem de immunohistokimya yöntemi kullanılarak ortaya konmuĢtur. Ġncelemesi yapılan toplam 148 akciğer dokusu örneğinden 38’inde M. bovis izole ve identifiye edilirken, 41 immunohistokimyasal olarak etkenin ortaya konması daha az vakada (n=24) mümkün olmuĢtur. Ġlk aĢamada teknik bir problem düĢüncesi oluĢturan bu durum, daha önce çeĢitli araĢtırmacılar tarafından da ortaya konmuĢ olan bir bulgudur. Radaelli ve arkadaĢları (53) yaptıkları çalıĢmada pnömonili 64 buzağının 16’sında M. bovis izole etmiĢ, ancak immunohistokimyasal olarak bu vakalardan sadece 7’sinde etkeni gösterebilmiĢlerdir. Bu araĢtırmacılar bakteriyolojik olarak pozitif, immunohistokimyasal olarak negatif olan olayların kataral bronkointersitisyel pnömoni ile iliĢkili olduğunu, etkenin immunohistokimyasal olarak ortaya konabildiği olaylarda ise pnömoninin bronkojenik nekrotik-irinli ve fibrinonekrotik olduğunu belirterek, etkenin immunohistokimyasal olarak ortaya konabilmesi ile pnömoninin Ģiddeti arasında iliĢki olduğunu ileri sürmüĢlerdir. Benzer çalıĢmalarda M. bovis antikoru ile güçlü boyanmanın olduğu olaylarda lezyonların kronik irinli bronkopnömoni, nekrozlaĢma ve apseleĢme tarzında olduğu rapor edilmiĢtir (85, 98). Bu çalıĢmada da akciğerlerde yaygın nekroz alanları ĢekillenmiĢ vakalarda, etkeni nekroz odakları içerisinde ve çevresinde görmek daha kolayken, nekroz olaylarının daha sınırlı olduğu ya da hiç nekrozun görülmediği olaylarda etkeni ortaya koymak için detaylı inceleme yapmak gerekmiĢtir. Etken nekrotik alanların yanısıra bronĢ, bronĢiyol ve alveol epitellerinde; yine bronĢ, bronĢiyol ve alveoller içerisinde yer alan eksudat içerisinde ve makrofaj ve nötrofil sitoplazmaları içerisinde de gösterilmiĢtir. Hayvanlarda nekroz bulunması ile immunohistokimyasal olarak etkenin ortaya konması arasında istatistiksel olarak iliĢki olup olmadığını bulmaya yönelik olarak yapılan incelemede, önem derecesinin sınıra çok yakın (p=0,053) çıkması hayvanların akciğerlerinde nekroz ĢekillenmiĢ olmasının immunohistokimyasal incelemede M. bovis etkeninin gösterilebilme ihtimalini arttırdığını düĢündürmektedir. Radaelli ve arkadaĢları (53) diğer etkenlerle birlikte seyreden enfeksiyonlarda, M. bovis boyanmasının daima pozitif olduğunu bulmuĢlardır. Bu çalıĢmada koenfeksiyonun gözlendiği 8 vakadan 4’ünde etken immunohistokimya ile de ortaya konmuĢtur. Bu sonuçlar, yukarıda bahsedilen sonuçlarla birlikte ele alındığında, M. bovis pnömonilerinde sadece histopatolojik inceleme yaparak ya da etkeni immunohistokimyasal olarak ortaya koymaya çalıĢarak kesin teĢhise gitmeye çalıĢmanın yetersiz olduğunu göstermektedir. Daha önceki çalıĢmalardan farklı olarak, bu çalıĢmada bir vakada etken sadece immunohistokimya ile ortaya konarken, yapılan bakteriyolojik ekimlerde etkeni üretmek mümkün olmamıĢtır. Bu vakada gerek bakteriyolojik ekim metodu yönünden, gerekse immunohistokimyasal inceleme amacıyla yapılan laboratuvar iĢlemleri açısından diğer hayvanlardakinden farklı bir uygulama yapılmadığı göz önünde bulundurulduğunda, bu 42 hayvanda kesim öncesi yüksek dozda antibiyotik uygulaması yapılmıĢ olabileceği ya da akla gelmeyen baĢka bir sebebin bu sonuçtan sorumlu olduğu düĢünülebilir. Yangı Hücrelerinin Boyamaları Ġmmunsupresyon özellikleri olmasına rağmen M. bovis vücuda girdiği zaman bir immun yanıtın doğmasına sebep olur ve bu immun yanıtın detaylı olarak anlaĢılabilmesi hastalığın tedavi sürecine katkı yapacaktır. Bu çalıĢmanın temel amaçlarından biri de M. bovis’e bağlı olarak geliĢen immun yanıtta yangı hücrelerinin dağılımının incelenmesi olmuĢtur. Bu amaçla T lenfositler için CD3, B lenfositler için CD79 ve plazma hücreleri için kappa hafif zincirleri ve lambda hafif zincirleri antikorları kullanılarak söz konusu savunma hücrelerinin dokulardaki varlığı incelenmiĢtir. Mycoplasma pnömonilerinde yaygın olarak gözlenen bulgulardan biri akciğerlerde mononükleer hücre sayısının artmasıdır (31). Bu durum peribronĢiyolar ve perivaskuler bölgelerde bu hücrelerin artmasına sebep olur. Rodriguez ve arkadaĢları (31) keçilerde deneysel olarak oluĢturdukları Mycoplasma pnömonisinde BALT’ta B lenfosit ve plazma hücresi sayısının artmıĢ olmasına rağmen, temel artıĢın CD3 (+) T lenfositlerde olduğunu görmüĢ ve hücre aracılı immunitenin önemini vurgulamıĢlardır. Yapılan çalıĢmada yangı hücrelerinin sayısının hücre yoğunluğu skorunun artmasına bağlı olarak artma eğiliminde olduğu gözlenmiĢtir. Ortalama yangı hücresi sayıları incelendiğinde, bu çalıĢmadaki M. bovis pnömonilerinde en fazla bulunan yangı hücresinin T lenfosit olduğu görülebilir. Bu durum M. bovis enfeksiyonlarında hücre aracılı immunitenin önemine vurgu yapan çalıĢmalarla uyum içerisindedir (31, 61). Bu çalıĢmada etkenin immunohistokimyasal olarak gösterildiği vakalarla, immunohistokimyasal boyamalarda negatif sonuç alınan vakalar arasında yangı hücrelerinin sayısı bakımından fark gözlenmemiĢ, yine koenfeksiyon olan durumlarla, M. bovis’in izole edilen tek etken olduğu durumlarda farklı yangı hücrelerinin yoğunluğu açısından belirgin farklar olmadığı ortaya konmuĢtur. Nekrozun Ģekillenmediği hayvanlarla, kazeifikasyon nekrozu ve koagulasyon nekrozu olan hayvanlarda T hücreleri ve B hücreleri yönünden belirgin farklar gözlenmezken, kappa hafif zincirleri (+) ve lambda hafif zincirleri (+) hücreler yönünden bazı farklar görülmüĢtür. Bu durumun detaylı olarak incelenmesinin M. bovis pnömonilerinde nekroz geliĢim mekanizmasının anlaĢılmasına katkı yapabileceği düĢünülmektedir. Sonuç olarak bu çalıĢma ile M. bovis’in Marmara Bölgesindeki sığır pnömonilerinde çok yaygın olarak bulunan bir etken olduğu ortaya konmuĢtur. M. bovis bu 43 pnömonilerin büyük çoğunluğundan tek baĢına sorumluyken, bazı vakalarda diğer bakteriyel etkenler de rol almaktadır. Akciğerlerde gözlenen patolojik lezyonların çok Ģiddetli olması, bölgemiz sığırlarında pnömoniye sebep olan M. bovis’in patojenitesinin çok yüksek olduğunu düĢündürmüĢtür. Ġmmunohistokimyasal olarak yapılan çalıĢmalarla hastalığın teĢhisine ve patojenezinin anlaĢılmasına yönelik olan bilgilere katkı yapıldığı umulmaktadır. 44 KAYNAKLAR 1. TÜRKĠYE ĠSTATĠSTĠK KURUMU. http://www.tuik.gov.tr/VeriBilgi.do?tb_id=46&ust_id=13 (GiriĢ tarihi: 5 Haziran 2009). 2. ALĠBAġOĞLU M, YEġĠLDERE T. Veteriner sistemik patoloji, cilt:1, KardeĢler Basımevi, Ġstanbul, sayfa 233-248, 1988. 3. BLECHA F, BOYLES SL, RILEY JG. Shipping suppresses lymphatic blastogenic responses in Angus and Brahman x Angus feeder calves. Journal of Animal Science, 59: 576-583, 1984. 4. COLE NA. Review of bovine respiratory disease: Nutrition and disease interactions. Editor: SMITH R, Review of bovine respiratory disease- Schering-Plough Animal Health. Veterinary Learning Systems, Trenton, pages 57-74, 1996. 5. CASWELL JL, ARCHAMBAULT M. Mycoplasma bovis pneumonia in cattle. Animal Health Research Reviews, 8: 161-186, 2008. 6. NICHOLAS RA, AYLING RD. Mycoplasma bovis: disease, diagnosis, and control. Research in Veterinary Science, 74: 105-112, 2003. 7. ROSENGARTEN R, CITTI C. The role of ruminant Mycoplasmas in systemic infection. Editors: STIPKOVITS L, ROSENGARTEN R, FREY J, Mycoplasmas of ruminants: Pathogenicity, diagnostics, epidemiology and molecular genetics, volume 3, European Commission, Brussels, pages 14-17, 1999. 8. REEVE-JOHNSON L. The impact of Mycoplasma infections in respiratory disease in cattle in Europe. Editors: STIPKOVITS L, ROSENGARTEN R, FREY J, Mycoplasmas of ruminants: Pathogenicity, diagnostics, epidemiology and molecular genetics, volume 3, European Commission, Brussels, pages 18-31, 1999. 9. DĠNLER U, SAĞLAM YS. Pneumoni’li sığır akciğerlerinde Mycoplasma spp. ve Pasteurella multocida'nın izolasyonu, identifikasyonu ve patolojik araĢtırmalar. Selçuk Üniversitesi Veteriner Bilimleri Dergisi, 14: 133-145, 1998. 10. ERDAĞ O, ERDOĞAN Ġ, TÜRKASLAN J, GÜREL A. Buzağı ve dana pneumonilerinde Mycoplasma ve bakteriyel etkenlerin izolasyon, identifikasyon ve antibiyotik duyarlılıkları. Animal Ġnformasyon, 112: 115-119, 1995. 11. ÖZEN H, KARAMAN M, ġAHĠN M, ÖZCAN K. Pnömonili sığırlarda Mycoplasma bovis, M. dispar, M. bovirhinis ve M. mycoides subsp. mycoides (küçük koloni tip)’in PZR ile belirlenerek patolojik bulguların incelenmesi. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 15: 125-133, 2009. 12. ÖZDEMĠR Ü, TÜRKYILMAZ MA. Buzağılarda önemli pnömoni etkenlerinden Mycoplasma bovis’in izolasyonu ve identifikasyonu, VIII. Ulusal Veteriner Mikrobioloji Kongresi Bildiri Kitabı, Van, sayfa 82, 2008. 13. ORTATATLI M, ÇĠFTÇĠ MK. Konya bölgesi mezbahalarında kesilen besi danalarında pnömonilerin insidensi ve patolojisi. Veterinarium, 16: 24-35, 2005. 14. DUNGWORTH DL. The respiratory system. Editor: JUBB KVF, KENNEDY PC, PALMER N. Pathology of domestic animals, volume 2, fourth edition, Academic Press, San Diego, pages 589-613, 1993. 45 15. HAZIROĞLU R, MĠLLĠ ÜH. Veteriner Patoloji, cilt 2, 1. baskı, Tamer Matbaacılık, Yayıncılık, Tanıtım ve Hizmetleri Ticaret ve Pazarlama Ltd. ġti., Ankara, sayfa 46-64, 1998. 16. LOPEZ A. Respiratory System. Editors: MCGAVIN MD, ZACHARY JF, Pathologic basis of veterinary disease, fourth edition, Mosby Elsevier, St. Louis, pages 505-517, 2007. 17. HALE HH, HELMBOLDT CF, PLASTRIDGE WN, STULA EF. Bovine mastitis caused by Mycoplasma species. Cornell Veterinarian, 52: 582-591, 1962. 18. GOURLAY RN, THOMAS LH, , HOWARD CJ. Pneumonia and arthritis in gnotobiotic calves following inoculation with Mycoplasma agalactiae subsp. bovis. Veterinary Record, 98: 506-507, 1976. 19. QUINN PJ, MARKEY BK, CARTER ME, DONNELLY WJC, LEONARD FC. Mycoplasmas, Editors: QUINN PJ, MARKEY BK, CARTER ME, DONNELLY WJC, LEONARD FC, Veterinary microbiology and microbial disease, Blackwell Publishing, Iowa, pages 189-195, 2002. 20. RAZIN S, FREUNDT EA. The Mycoplasmas. Editors: RAZIN S, FREUNDT EA, Bergey’s manual of systematic bacteriology, volume I, Williams and Wilkins, Baltimore, pages 740-770, 1984. 21. MATTSSON JG, GUSS B, JOHANSSON KE. The phylogeny of Mycoplasma bovis as determined by sequence analysis of the 16S rRNA gene. FEMS Microbiology Letters, 115: 325-328, 1994. 22. TOLA S, IDINI G, ROCCHIGIANI AM, MANUNTA D, ANGIOI PP, ROCCA S, COCCO M, LEORI G. Comparison of restriction pattern polymorphism of Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis by pulsed field gel electrophoresis. Zentralblatt für Veterinärmedizin B, 46: 199-206, 1999. 23. WILLIAM AS, ROUSE H, FISHER BD. Mycoplasma, Editors: HARVEY AR, CHAMPE AP, Microbiology, Lippincott Williams&Wilkins, Philadelphia, pages 229- 234, 2001. 24. HERMANN R. Genome structure and organization. Editor: MANILOFF J. Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis. American Society of Microbiology, Washington DC, pages 157-168, 1992. 25. MILES RJ, WADHER BJ, HENDERSON CL, MOHAN K. Increased yields of Mycoplasma spp. in the presence of pyruvate. Letters in Applied Microbiology, 7: 149- 151, 1988. 26. PFÜTZNER H, SCHERWA B, TRUBNER S. Sensitivity of Mycoplasma bovis to disinfection agents applied to the udder area. Archiv für Experimentelle Veterinärmedizin, 37: 485-489, 1983. 27. WALKER RL. Mollicutes, Editors: HIRSH DC, ZEE YC, Veterinary microbiolgy, third edition, Blackwell Publishing, Iowa, pages 165-172, 1999. 28. WHITHER K. Diseases due to Mycoplasmas, Editors: WILLIAMS ES, BARKER I, Infectious diseases of wild mammals, third edition, Blackwell Publishing, Iowa, page 415, 2001. 29. PFÜTZNER H. Epizootiology of the Mycoplasma bovis infection of cattle. Zentralblatt für Bakteriologie Supplement, 20: 394-399, 1990. 46 30. BOCKLISCH H, KREUSEL S, BRYS A, PFÜTZNER H. Experimental infection of the udder of ewes due to Mycoplasma bovis. Zentralblatt für Veterinärmedizin B, 38: 385-390, 1991. 31. RODRIGUEZ F, SARRADELL J, POVEDA JB, BALL HJ, FERNÁNDEZ A. Immunohistochemical characterization of lung lesions induced experimentally by Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma bovis in goats. Journal of Comparative Pathology, 123: 285-293, 2000. 32. EGWU GO, AMEH JA, ALIYU MM, MOHAMMED FD. Caprine Mycoplasmal mastitis in Nigeria. Small Ruminant Research, 39: 87-91, 2001. 33. MADOFF S, PIXLEY BQ, DELGIUDICE RA, MOELLERING RC Jr. Isolation of Mycoplasma bovis from a patient with systemic illness. Journal of Clinical Microbiology, 9: 709-711, 1979. 34. PFÜTZNER H, SCHIMMEL D. Mycoplasma bovis isolation in the offspring of cows with M. bovis mastitis and its epizootiological significance. Zentralblatt für Veterinärmedizin, B, 32: 265-279, 1985. 35. PFÜTZNER H, KIELSTEIN P, MARTIN J, SCHIMMEL D. Mycoplasma infection of calves. 2. Experimental infection of calves with Mycoplasma bovis. Archiv für Experimentelle Veterinärmedizin, 37: 445-451, 1983. 36. STIPKOVITS L, RIPLEY P, VARGA J, PALFI V. Clinical study of the disease of calves associated with Mycoplasma bovis infection, Acta Veterinaria Hungarica, 48: 387-395, 2000. 37. ROMVÁRY J, RÓZSA J, STIPKOVITS L, MÉSZAROS J. Incidence of diseases due to Mycoplasma bovis in a cattle herd. I. Pneumo-arthritis syndrome in calves. Acta Veterinaria Hungarica, 27: 29-37, 1977. 38. THOMAS CB, WILLEBERG P, JASPER DE. Case-control study of bovine mycoplasmal mastitis in California. American Journal of Veterinary Research, 42: 511- 515, 1981. 39. KREUSEL S, BOCKLISCH H, PFÜTZNER H, BRYS A, LEIRER R, ZIEGENHALS U. Experimental infections of bulls with Mycoplasma (M.) bovis and M. bovigenitalium. Archiv für Experimentelle Veterinärmedizin, 43: 705-712, 1989. 40. EAGLESOME MD, GARCIA MM. The effect of Mycoplasma bovis on fertilization processes in vitro with bull spermatozoa and zona-free hamster oocytes. Veterinary Microbiology, 21: 329-337, 1990. 41. RICHTER A, PFÜTZNER H. Detection of mycoplasmas in experimentally-infected bull sperm. Archiv für Experimentelle Veterinärmedizin, 43: 721-724, 1989. 42. PFÜTZNER H, SACHSE K. Mycoplasma bovis as an agent of mastitis, pneumonia, arthritis and genital disorders in cattle. Revue Scientifique et Technique, 15: 1477- 1494, 1996. 43. HORVÁTH GY, STIPKOVITS L, VARGA ZS, ZOLDÁG L, MÉSZAROS J. Infection of cows by Mycoplasma bovis. Archiv für Experimentelle Veterinärmedizin, 37: 401-403, 1983. 44. SACHSE K, PFÜTZNER H, HELLER M, HANEL I. Inhibition of Mycoplasma bovis cytadherence by a monoclonal antibody and various carbohydrate substances. Veterinary Microbiology, 36: 307-316, 1993. 47 45. SACHSE K, GRAJETZKI C, ROSENGARTEN R, HANEL I, HELLER M, PFÜTZNER H. Mechanisms and factors involved in Mycoplasma bovis adhesion to host cells. Zentralblatt für Bakteriologie, 284: 80-92, 1996. 46. SACHSE K, HELBIG JH, LYSNYANSKY I, GRAJETZKI C, MULLER W, JACOBS E, YOGEV D. Epitope mapping of immunogenic and adhesive structures in repetitive domains of Mycoplasma bovis variable surface lipoproteins. Infection and Immunity, 68: 680-687, 2000. 47. HOWARD CJ, THOMAS L H, PARSONS KR. Comparative pathogenicity of Mycoplasma bovis and Mycoplasma dispar for the respiratory tract of calves. Israel Journal of Medical Sciences, 23: 621-624, 1987. 48. THOMAS CB, VAN ESS P, WOLFGRAM LJ. Adherence to bovine neutrophils and suppression of neutrophil chemiluminescence by Mycoplasma bovis. Veterinary Immunology and Immunopathology, 27: 365-381, 1991. 49. HOWARD CJ. Comparison of bovine IgG1, IgG2 and IgM for ability to promote killing of Mycoplasma bovis by bovine alveolar macrophages and neutrophils. Veterinary Immunology and Immunopathology, 6: 321-326, 1984. 50. HOWARD C J, TAYLOR G, COLLINS J, GOURLAY R N. Interaction of Mycoplasma dispar and Mycoplasma agalactiae subsp. bovis with bovine alveolar macrophages and bovine lacteal polymorphonuclear leukocytes. Infection and Immunity, 14: 11-17, 1976. 51. RODRIGUEZ F, BRYSON DG, BALL HJ, FORSTER F. Pathological and immunohistochemical studies of natural and experimental Mycoplasma bovis pneumonia in calves. Journal of Comparative Pathology, 115: 151-162, 1996. 52. POUMARAT F, LE GRAND D, BERGONIER D. Propriétés générales des mycoplasmes et hypervariabilité antigénique. Point Veterinaire, 28: 761-767, 1996. 53. RADAELLI E, LUINI M, LORIA GR, NICHOLAS RAJ, SCANZIANI E. Bacteriological, serological, pathological and immunohistochemical studies of Mycoplasma bovis respiratory infection in veal calves and adult cattle at slaughter. Research in Veterinary Science, 85: 282-290, 2008. 54. GEARY SJ, TOURTELLOTTE ME, CAMERON JA. Inflammatory toxin from Mycoplasma bovis: isolation and characterization. Science, 212: 1032-1033, 1988. 55. RODRIGUEZ F, BRYSON DG, BALL HJ, FORSTER F. Pathological and immunohistochemical studies of natural and experimental Mycoplasma bovis pneumonia in calves. Journal of Comparative Pathology, 115: 151-162, 1996. 56. BRYSON DG, BALL HJ, BRICE N, FORSER F, POLLOCK DS. Pathology of induced Mycoplasma bovis calf pneumonia in experimentally vaccinated animals. Editors: STIPKOVITS L, ROSENGARTEN R, FREY J, Mycoplasmas of ruminants: pathogenicity, diagnostics, epidemiology and molecular genetics, volume 3, European Commission, Brussels, pages 128-132, 1999. 57. JUNGI TW, KRAMPE M, SILEGHEM M, GRIOT C, NICOLET J. Differential and strain-specific triggering of bovine alveolar macrophage effector functions by mycoplasmas. Microbial Pathogenesis, 21: 487-498, 1996. 58. FINCH JM, HOWARD CJ. Inhibitory effect of Mycoplasma dispar and Mycoplasma bovis on bovine immune responses in vitro. Zentralblatt für Bakteriologie, Suppl. 20, 563–569, 1990. 48 59. THOMAS CB, METTLER J, SHARP P, JENSEN-KOSTENBADER J, SCHULTZ RD. Mycoplasma bovis suppression of bovine lymphocyte response to phytohemagglutinin. Veterinary Immunology and Immunopathology, 26: 143-155, 1990. 60. VANDEN BUSH TJ, ROSENBUSCH RF. Mycoplasma bovis induces apoptosis of bovine lymphocytes. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 32: 97-103, 2002. 61. VANDEN BUSH TJ, ROSENBUSCH RF. Characterization of the immune response to Mycoplasma bovis lung infection. Veterinary Immunology and Immunopathology, 94: 23-33, 2003. 62. ROSENGARTEN R, BEHRENS A, STETEFELD A. Antigen heterogeneity among isolates of Mycoplasma bovis is generated by high-frequency variation of diverse membrane surface proteins. Infection and Immunity, 62: 5066-5074, 1994. 63. BEHRENS A, HELLER M, ROSENBUSCH R, KIRCHHOFF H. Immunoelectron microscopic localization of variable proteins on the surface of Mycoplasma bovis. Microbiology, 142: 1863-1871, 1996. 64. POUMARAT F, SOLSONA M, BOLDINI M. Genomic, protein and antigenic variability of Mycoplasma bovis. Veterinary Microbiology, 40: 305-321, 1994. 65. GOURLAY RN, HOUGHTON SB. Experimental pneumonia in conventionally reared and gnotobiotic calves by dual infection with Mycoplasma bovis and Pasteurella haemolytica. Research in Veterinary Science, 38: 377-382, 1985. 66. CURRIN JF, CURRIN N, WHITTIER WD. Mycoplasma in Beef Cattle. Virginia Cooperative Extension Publication, publication no: 400-304, pages 1-4, 2007. 67. HENDERSON JP, BALL HJ. Polyarthritis due to Mycoplasma bovis infection in adult dairy cattle in Northern Ireland. Veterinary Record, 145: 374-376, 1999. 68. RYAN MJ, WYAND DS, HILL DL, TOURTELOTTE ME, YANG TJ. Morphologic changes following intraarticular inoculation of Mycoplasma bovis in calves. Veterinary Pathology, 20: 472-487, 1983. 69. ILLING K. Clinical picture of experimental Mycoplasma bovis mastitis in cattle. Archiv für Experimentelle Veterinärmedizin, 33: 945-948, 1979. 70. BENNETT RH, JASPER DE. Bovine mycoplasmal mastitis from intramammary inoculations of small numbers of Mycoplasma bovis: local and systemic antibody response. American Journal of Veterinary Research, 41: 889-892, 1980. 71. KUNKEL JR. Isolation of Mycoplasma bovis from bulk milk. Cornell Veterinarian, 75: 398-400, 1985. 72. BROWN MB, SHEARER JK, ELVINGER F. Mycoplasmal mastitis in a dairy herd. Journal of American Veterinary Medical Association, 196: 1097-1101, 1990. 73. FEENSTRA A, BISGAARD ME, FRIIS NF, MEYLING A, AHRENS P. A field study of Mycoplasma bovis infection in cattle. Zentralblatt für Veterinärmedizin B, 38: 195- 202, 1991. 74. GONZALEZ RN, SEARS PM, MERRILL RA, HAYES GL. Mastitis due to Mycoplasma in the state of New York during the period 1972-1990. Cornell Veterinarian, 82: 29-40, 1992. 49 75. PFÜTZNER H, SACHSE K. Mycoplasma bovis as an agent of mastitis, pneumonia, arthritis and genital disorders in cattle. Revue Scientifique et Technique, 15: 1477- 1494, 1996. 76. IBRAHIM MAR, STIPKOVITS L, BOLDIZSÁR H, VARGA ZS. Amino acid composition and characteristic indices of bovine seminal plasma in case of infection of semen by mycoplasmas. Acta Veterinaria Hungarica, 32: 15-21, 1984. 77. KISSI B, JUHÁSZ S, STIPKOVITS L. Effect of mycoplasma contamination of bull semen on fertilization. Acta Veterinaria Hungarica, 33: 107-117, 1985. 78. NICHOLAS R, BAKER S. Recovery of Mycoplasmas from Animals. Editors: MILES R, NICHOLAS R, Methods in molecular biology, volume 104, Mycoplasma protocols, pages 37-44, New Jersey, Humana Press, 1998. 79. THOMAS A, DIZIER I, TROLIN A, MAINIL J, LINDEN A. Comparison of sampling procedures for isolating pulmonary Mycoplasmas in cattle. Veterinary Research Communications, 26: 333-339, 2002. 80. TENK M, STIPKOVITS L, HUFNAGEL L. Examination of the role of Mycoplasma bovis in bovine pneumonia and a mathematical model for its evaluation. Acta Veterinaria Hungarica, 52: 445-456, 2004. 81. TENK M, BÁLINT A, STIPKOVITS L, BIRÓ J, DENCSO L. Detection of Mycoplasma bovis with an improved PCR assay. Acta Veterinaria Hungarica, 54: 427- 435, 2006. 82. DÉNES B, TENK M, TEKES L, VARGA I, FERENCZNÉ IP, STIPKOVITS L. Recognition of multiple Mycoplasma bovis antigens by monoclonal antibodies. Hybridoma and Hybridomics, 22: 11-16, 2003. 83. GAGEA MI, BATEMAN KG, SHANAHAN RA, VAN DREUMEL T, MCEWEN BJ, CARMEN S, ARCHAMBAULT M, CASWELL JL. Naturally occurring Mycoplasma bovis associated pneumonia and polyarthritis in feedlot beef calves. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 18: 29-40, 2006. 84. KHODAKARAM-TAFTI A, LOPEZ A. Immunohistopathological findings in the lungs of calves naturally infected with Mycoplasma bovis. Journal of Veterinary Medicine Series A, 51: 10-14, 2004. 85. SHAHRIAR FM, CLARK EG, JANZEN E, WEST K, WOBESER G. Coinfection with bovine viral diarrhea virus and Mycoplasma bovis in feedlot cattle with chronic pneumonia. Canadian Veterinary Journal, 43: 863-868, 2002. 86. BASHIRUDDIN JB, DE SANTIS P, VARGA E, STIPKOVITS L. Confirmation of the presence of Mycoplasma bovis in Hungarian cattle with pneumonia resembling pleuropneumonia. Veterinary Record, 148: 743-746, 2001. 87. HOWARD CJ, THOMAS LH, GOURLAY RN, TAYLOR G. Vaccination against natural outbreaks of respiratory disease in calves associated with Mycoplasma bovis and Mycoplasma dispar for the respiratory tract of calves. Israel Journal of Medical Sciences, 23: 621-624, 1987. 88. CASWELL CL, ARCHAMBAULT M. Mycoplasma bovis pneumonia in cattle. Animal Health Research Review, 8: 161-186, 2008. 89. LUNA LG. Manual of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology, 3rd edition, McGraw-Hill Book Company, New York, page 220, 1968. 50 90. BRICE N, FINLAY D, BRYSON DG, HENDERSON J, MCCONNELL W, BALL HJ. Isolation of Mycoplasma bovis from cattle in Northern Ireland 1993-1998. Veterinary Record, 146: 643-644, 2000. 91. BYRNE WJ, MCCORMACK R, BRICE N, EGAN J, MARKEY B, BALL HJ. Isolation of Mycoplasma bovis from bovine clinical samples in the Republic of Ireland. Veterinary Record, 148: 331-333, 2001. 92. LE GRAND D, PHILLIPPE S, CALAVALAS D, BEZILLE P, POUMARAT F. Prevalence of Mycoplasma bovis infection in France. Editors: POVEDA J, FERNANDEZ A, FREY J, JOHNANSSON KE, Mycoplasmas of ruminants: pathogenicity, diagnostics, epidemiology and molecular genetics, volume 5, European Commission, Brussels, pages 106-109, 2001. 93. GAGEA MI, BATEMAN KG, VAN DREUMEL T, MCEWEN J, CARMAN S, ARCHAMBAULT M, SHANAHAN RA, CASWELL JL. Diseases and pathogens associated with mortality in Ontario beef feedlots. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 18: 18-28, 2006. 94. KUSILUKA LJ, OJENIYI B, FRIIS NF. Increasing prevalence of Mycoplasma bovis in Danish cattle. Acta Veterinaria Scandinavica, 41: 139-146, 2000. 95. TER LAAK EA, WENTINK GH, ZIMMER GM. Increased prevalence of Mycoplasma bovis in the Netherlands. Veterinary Quarterly, 14: 100-104, 1992. 96. GRAND DL, CALAVAS D, BRANK M, CITTI C, ROSENGARTEN R, BE´ZILLE P, POUMARAT F. Serological prevalence of Mycoplasma bovis infection in suckling beef cattle in France. Veterinary Record, 150: 268-273, 2002. 97. AYLING RD, BASHIRUDDIN SE, NICHOLAS RAJ. Mycoplasma species and related organisms isolated from ruminants in Britain between 1990 and 2000. Veterinary Record, 155: 413-416, 2004. 98. ADEGBOYE DS, HALLBUR PG, CAVANAUGH DL, WERDIN RE, CHASE CC, MISKIMINS DW, ROSENBUSCH RF. Immunohistochemical and pathological study of Mycoplasma bovis associated lung abscesses in calves. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 7: 333-337, 1995. 99. HOWARD CJ, GOURLAY RN. Immune response of calves following the inoculation of Mycoplasma dispar and Mycoplasma bovis. Veterinary Microbiology, 8: 45-56, 1983. 100. THOMAS A, SACHSE K, FARNIR F. Adherence of Mycoplasma bovis to bovine bronchial epithelial cells. Microbial Pathogenesis, 34: 141-148, 2003. 101. BEIER T, HOTZEL H, LYSNYANSKY I. Intraspecies polymorphism of Vsp genes and expression profiles of variable surface protein antigens (Vsps) in field isolates of Mycoplasma bovis. Veterinary Microbiology, 63: 189-203, 1998. 102. LE GRAND D, SOLSONA M, ROSENGARTEN R. Adaptive surface antigen variation in Mycoplasma bovis to the host immune response. FEMS Microbiology Letters, 144: 267-275, 1996. 103. GOURLAY RN, THOMAS LH, WYLD SG. Increased severity of calf pneumonia associated with the appearance of Mycoplasma bovis in a rearing herd. Veterinary Record, 124: 420-422, 1989. 51 104. SOKOLOVA IA, VAUGHAN AT, KHODAREV NN. Mycoplasma infection can sensitize host cells to apoptosis through contribution of apoptotic-like endonuclease(s). Immunology and Cell Biology, 76: 526-534, 1998. 105. VANDEN BUSH TJ, ROSENBUSCH RF. Characterization of a lympho-inhibitory peptide produced by Mycoplasma bovis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 315: 336-341, 2004. 106. HOUGHTON SB, GOURLAY RN. Synergism between Mycoplasma bovis and Pasteurella haemolytica in calf pneumonia. Veterinary Record, 113: 41-42, 1983. 107. HAINES DM, MARTIN KM, CLARK EG, JIM GK, JANZEN ED. The immunohistochemical detection of Mycoplasma bovis and bovine viral diarrhea virus in tissues of feedlot cattle with chronic, unresponsive respiratory disease and/or arthritis. Canadian Veterinary Journal, 42: 857-860, 2001. 108. AL-HADDAWI M, MITCHELL GB, CLARK ME, WOOD RD, CASWELL JL. Impairment of innate immune responses of airway epithelium by infection with bovine viral diarrhea virus. Veterinary Immunology and Immunopathology, 116: 153-162, 2007. 52 TEġEKKÜR Tez konumun seçilmesi, planlanması, projelendirilmesi, deneylerin gerçekleĢtirilmesi sırasında karĢılaĢtığım tüm sorunlarda hep yardımcı olan, her konuda bana rehberlik eden sevgili danıĢmanım Yard. Doç. Dr. Ġ. Taci CANGÜL’e sonsuz teĢekkürlerimi sunarım. Tezimin hazırlanması sırasında yardımlarını esirgemeyen Tez Ġzleme Komitesi üyesi sayın Prof. Dr. AyĢin ġEN’e çok teĢekkür ederim. Anabilim Dalı BaĢkanımız Prof. Dr. Gürsel SÖNMEZ ve Anabilim Dalı öğretim üyeleri Prof. Dr. M. Müfit KAHRAMAN ve Prof. Dr. Deniz MISIRLIOĞLU’na bilimsel geliĢimime katkılarından dolayı teĢekkür ederim. Projede yardımcı araĢtırmacı olan ve Amerika’dan, literatürler konusunda bana yardımcı olan Yard. Doç. Dr. M. Özgür ÖZYĠĞĠT’e çok teĢekkür ederim. Yine projede yardımcı araĢtırmacı olan, deneysel aĢamada engin tecrübelerinden yararlandığım, yazım aĢamasında sürekli yardımına baĢvurduğum AraĢ. Gör. Dr. Ahmet AKKOÇ’a sonsuz teĢekkür ederim. Her konuda manevi desteğini esirgemeyen mesai arkadaĢım AraĢ. Gör. Dr. Aylin ALASONYALILAR, aramıza geç katılan ancak hem tezimin deneysel kısmında, hem de yazım aĢamasında bana yardımcı olan sevgili mesai arkadaĢım Dokt. Öğr. Ezgi AKDEġĠR’e sonsuz teĢekkür ederim. Artık emekli olduğu için aramızda olmayan bölüm teknisyenimiz Mehmet Ali KARAHAN’a ve yeni teknisyenimiz Eylem PARLAK’a laboratuvar çalıĢmaları esnasındaki yardımlarından dolayı çok teĢekkür ederim. Mezbahalardan akciğer dokularının toplanmasında bana yardımcı olan ve mikrobiyolojik incelemeleri yapan sevgili arkadaĢım AraĢ. Gör. Kaan ÖNAT’a teĢekkür ederim. Tezimin istatistiksel analizleri kısmında yardımcı olan AraĢ. Gör. Ender ÇARKUNGÖZ’e çok teĢekkür ederim. Tezim için gerekli, eksik malzemelerin temininde büyük yardımları olan Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı BaĢkanı Prof. Dr. Sema ÖZUYSAL ve öğretim üyesi Prof. Dr. Ömer YERCĠ’ye teĢekkür ederim. Bilgisayar ile ilgili karĢılaĢtığım problemlerde her zaman rahatlıkla yardım isteyebildiğim AraĢ. Gör. Dr. Ġlker ARICAN’a teĢekkür ederim. Mesai saatleri dıĢında, eĢinin bana yardım etmesinden dolayı eĢinden ayrı geçen uzun saatler için gösterdiği sabırdan dolayı AraĢ. Gör. Dr. Cansel Güzin ÖZGÜDEN AKKOÇ’a teĢekkür ederim. ÇalıĢma hayatım boyunca her zaman beni destekleyen eĢim Bestami YILMAZ’a sabrından dolayı sonsuz teĢekkür ediyorum. Biricik oğlum Mahmut BaĢar YILMAZ’a çalıĢmalarım sırasında hayatıma kattığı güzelliklerden dolayı çok teĢekkür ederim. Beni bugünlere getiren, her konuda yardımlarını sunan canım aileme sonsuz teĢekkürlerimi sunuyorum. Daima desteklerini arkamda hissettiğim eĢimin ailesine çok teĢekkür ederim. 53 ÖZGEÇMĠġ 18 Nisan 1975 tarihinde Malatya’da doğdum. Ġlköğrenimimi AĢağı Güzelyurt Ġlkokulu’nda, ortaokul ve lise öğrenimini Güzelyurt Lisesi’nde tamamladım. 1995 yılında kazandığım Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi’nden, 2000 yılında mezun oldum. 2002 yılında Harran Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’nda AraĢtırma Görevlisi olarak çalıĢmaya baĢladım. 2003 yılında Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı’nda doktora eğitimine baĢladım. Evliyim ve bir oğlum var. 54