Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 46 (2) 181-188, 2020 DOI: https://doi.org/10.32708/uutfd.722097 ÖZGÜN ARAŞTIRMA Kisspeptin’in Gelişimsel Döneme Bağlı Olarak Dişi Sıçanlarda Medial Preoptik Bölgede in Vitro Noradrenalin Salıverilmesi Üzerine Etkisi* Zülfiye GÜL1, Rıfat Levent BÜYÜKUYSAL2 1 Bahçeşehir Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Farmakoloji Anabilim Dalı, İstanbul. 2 Bursa Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Farmakoloji Anabilim Dalı, Bursa. ÖZET Üçüncü ventrikülün rostral periventriküler bölgesinde lokalize olan kisspeptin nöronlarının, ovulasyon öncesi LH salıverilmesinden sorumlu olan GnRH nöronlarının major stimülatörü olduğu son yıllarda yapılan çalışmalar ile ortaya konmuştur. GnRH salıverilmesinin bir diğer ana modülatörü ise noradrenerjik sistemdir. Kisspeptinerjik ve noradrenerjik nöronların medial preoptik bölgedeki (MPB) yerleşimleri çok yakınlık göstermekle birlikte, bu iki sistem arasındaki ilişkinin yapılacak çalışmalar ile aydınlatılmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Yapılan bu çalışma gelişim dönemi farklı dişi Sprague Dawley sıçanların MPB’sinden hazırlanan beyin dilimleri kullanılarak kisspeptinin noradrenalin (NA) salıverilmesi üzerine direk etkisinin olup olmadığını ortaya koymak amacı ile yapılmıştır. Oksijenlenmiş Krebs solüsyonu içeren inkübasyon kuyucuklarına yerleştirilen dilimler preinkübasyon dönemi ardından 60 dakika boyunca kisspeptin (40 ve 400 μM) ile inkübe edildi. İnkübasyon periyodu sonrasında inkübasyon ortamı salınan NA düzeylerinin belirlenmesi amacıyla kullanıldı. Salıverilmenin Ca2+ ile ilişkisini incelemek amacıyla Ca2+’suz Krebs solüsyonu ve hücre dışı Ca2+ şelasyonu için 400 μM BAPTA kullanıldı. Prepubertal, adölesan ve yetişkin dişi sıçanların MPB’den elde edilen dilimlerin 40 ve 400 μM kisspeptin ile inkübasyonu prepubertal dönemdeki dilimlerden NA salıverilmesini etkilemezken, adölesan ve yetişkin sıçanlarda ise salıverilmenin anlamlı olarak arttığı gözlendi. Ca2+’un ortamdan uzaklaştı- rılmasının kisspeptin kaynaklı NA salıverilmesinde anlamlı bir düşüşe (p‹0.05) neden olması veziküler salım mekanizmasının ekstrasellüler Ca+2 iyonlarına bağımlı olduğunu göstermiştir. Kisspeptinin NA salıverilmesini direkt olarak uyarabildiğini gösteren bu bulgular, söz konusu peptidin NA salıverilmesi üzerinden GnRH salıverilmesini indirekt olarak modüle edebileceğini düşündürmektedir. Anahtar Kelimeler: Kisspeptin. Noradrenalin. GnRH. Medial preoptik alan. Beyin dilimleri. Kisspeptin Stimulates In Vitro Noradrenaline Release in Medial Preoptic Area of the Female Rats Depending on Developmental Stage ABSTRACT Kisspeptin neurons localized in the rostral periventricular area of the third ventricle are considered to provide a major stimulatory input to the GnRH neuronal network which is responsible for triggering the preovulatory LH surge. Noradrenaline (NA) is one of the main modulators of GnRH release. Although NA fibers are found in close opposition to kisspeptin neurons, interaction between kisspeptin and NA neurons needs to be clarify. Thus, present study was undertaken to determine whether kisspeptin can directly regulate NA release from brain slices prepared from medial preoptic area (MPOA) of the rats. Brain slices prepared from female prepubertal, adolescents or adult Sprague Dawley rats were placed incubation wells containing oxygenated Krebs. After preincubation period, slices were incubated with two different concen- trations of kisspeptin (40 and 400 μM) for 60 min. At the end of kisspeptin incubation, incubation medium was used for determination of NA released from the slices. When used Ca+2-free medium, 400 μM of BAPTA was also added into the medium to chelate the extracellular Ca+2. Incubation of the brain slices prepared from MPOA of the adolescent and adult female rats with 40 and 400 μM of kisspeptin caused signifi- cant increase in NA release, unlike prepubertal rat. Since removal of the Ca+2 from the medium caused significant decline in kisspeptin- induced NA release (p‹0.05), a vesicular release mechanism seems to be likely involved. The results presented here probably indicate that in addition to direct effect of kisspeptin, it may also modulate GnRH release indirectly by increasing NA release from MPOA of hypothalamus. Key Words: Kisspeptin. Noradrenaline. GnRH. Medial preoptic area. Brain slices. Geliş Tarihi: 17.Nisan.2020 * “17th European Congress of Neuroendocrinology” kong- Kabul Tarihi: 07.Ağustos.2020 resinde (Milano/İtalya, 2015) poster bildiri olarak sunul- muştur. Dr. Zülfiye GÜL Bahçeşehir Üniversitesi Tıp Fakültesi, Yazarların ORCID ID Bilgisi: Tıbbi Farmakoloji Anabilim Dalı, Zülfiye GÜL: 0000-0002-8872-0074 İstanbul. Rıfat Levent BÜYÜKUYSAL: 0000-0003-0749-2426 Tel: 0541 384 12 68 E-posta: zulfiye.gul@med.bau.edu.tr 181 Z. Gül ve R.L. Büyükuysal Hipotalamo-hipofizer-gonadal aks, üreme yeteneğinin birlikte noradrenalin (NA) nöronlarının kazanılması ve sürdürülmesine aracılık eden ve diğer hipolatalamusta GnRH nöronlarının terminalleriyle sistemlerle kompleks ilişkileri olan merkezi bir sistem aynı bölgede bulunduğunun gösterilmesi sonrası olarak bilinmektedir1. Pubertede üreme sistemi akti- GnRH ve NA arasında salıverilme miktarı ve ritmi vasyonunun nöroendokrin kontrolünde rol alan başlıca açısından yakın bir ilişki olduğu da gösterilmiştir18-22. hormonlar pulsatil salgılanan gonadotropin salıverici Diğer taraftan NA geri alım inhibitörü hormon (GnRH), folikül stimüle edici hormon (FSH) desmetilimipramin (DMİ) kullanılarak yapılan bir ve lüteinleştirici hormondur (LH)1. GnRH sistemi, mikrodiyaliz çalışmasında, söz konusu ilacın hormon salıverilmesini inhibitör ve eksitatör sinyaller- hipotalamusta GnRH ve NA salıverilmesini benzer le düzenleyen ve hipotalamusun farklı bölgelerinde aralıklarla arttırdığı rapor edilmiştir23. kümelenmiş nöronlardan oluşmaktadır1. Puberte sıra- GPR54-null farelerde yapılan bir çalışmada, sında bu sistemin nasıl aktive olduğu, uyarıcı veya intraserebroventriküler NMDA enjeksiyonu ile düşük inhibitör sistemler arasındaki ilişki uzun yıllar araştı- olan LH düzeylerinde kontrol düzeylerine varan bir rılmış, ancak aydınlatılamayan yönleri ile popüler bir artış gözlenmiş ve immünohistokimyasal analizler ile araştırma alanı olma özelliğini korumuştur. Son yıl- bu artışa medial preoptik alandaki (MPOA) larda yapılan çalışmalar ile, GnRH etkinliğinin katekolaminerjik nöronların aktivasyonunun aracılık hipotalamustan salıverilen kisspeptinler tarafından ettiği bulunmuştur24. Kisspeptin nöronlarının, regüle edildiği saptanmış ve kisspeptinin puberte baş- noradrenerjik ve GnRH nöronları ile aynı bölgede langıcındaki tetikleyici mekanizmanın kritik bir bile- bulunması ve GnRH salıverilmesini doğrudan etkile- şeni olduğu ortaya konmuştur2-6. mesi, kisspeptin ve NA arasında bir ilişki olabileceğini Kisspeptinler, Kiss-1 geni tarafından transkribe edilen düşündürmekle birlikte, kisspeptin salıverilmesinin öncül bir proteinden türeyen, puberte ve fertilitede ve/veya kisspeptin reseptör aktivasyonunun söz konu- önemli roller aldıkları yapılan çalışmalarla gösterilen, su bölgede NA düzeylerini nasıl etkilediği bilinme- farklı aminoasit uzunluklarındaki peptidler olarak mektedir. Bu çalışma ile kisspeptinin MPOA’da NA bilinmektedirler3-5. Hipotalamusta biri rostral salıverilmesi üzerine direkt bir etkisinin varlığı ve eğer periventriküler alanda (RP3V) diğeri arkuat çekirdekte varsa bu etkinin gelişimsel dönem ile ilişkili olup olmak üzere iki ana kisspeptin nöron popülasyonu olmadığı araştırılmıştır. bulunur7. Hem RP3V’daki hem de ARC’daki kisspeptin nöronlarının doğrudan GnRH nöronlarına projeksiyon yaptıkları gösterilmiştir8,9. Kisspeptinin ve Gereç ve Yöntem reseptörü olan G-protein reseptör 54’ün (GPR54) üreme fonksiyonlarının kazanılması ve bu fonksiyon- Materyaller ların sürdürülmesine aracılık ettiği literatürde birçok çalışma ile rapor edilmiştir3. Kisspeptin reseptörü Deneylerde kullanılan Kisspeptin-10 Tocris GPR54 ile ilgili insan ve hayvanlarda yapılan çalışma- Bioscience (Bristol, UK) firmasından, BAPTA, NA ve larda, bu reseptör fonksiyonunun kaybına neden olan albumin Sigma Chem Co firmasından (St. Louis, MO, mutasyonların pubertal gelişim geriliği ve üreme USA) temin edilmiştir. Krebs solüsyonu hazırlamada fonksiyon kaybı ile karakterize hipogonadotropik kullanılan kimyasallar ile diğer kimyasallar Carlo hipogonadizme neden olduğu tespit edilmiştir; bu Erba Reagents (Val de Reuil, FR) veya Merck firmala- bulgular GPR54 reseptörünün puberte döneminde rından temin edilmiştir. normal GnRH aktivitesi için gerekli olduğunu göster- mektedir2,6,7 Deney Hayvanı: . GPR54 -/- farelerde yapılan bir çalışma- da pubertal gelişim geriliği ve üreme fonksiyon kaybı Bu çalışmada yapılan deneyler için Uludağ Üniversi- görülmesine rağmen, GnRH nöronlarının median tesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan eminense projeksiyon yaptıkları ve normal morfoloji- (HADYEK) 16.02.2016 tarih ve 2016-03/05 numaralı ye sahip oldukları gösterilmiş ve kisspeptin-GPR54 etik kurul onayı alındı. Tüm deneysel çalışmalarda sisteminin, GnRH sistemi üzerinde yer alacak bir hipogonadal aksın farklı çalıştığı zaman aralıkları göz mekanizma olarak devreye girebileceği yorumu ya- önünde bulundurularak, henüz efektif çalışmaya baş- pılmıştır10. Bu bilgilere ek olarak kisspeptinin sıçan- lamadığı için prepubertal (23-25 günlük), çalışmaya larda ve primatlarda GnRH antagonistleri ile geri yeni başladığı adölesan (35-40 gün) ve düzenli çalış- döndürülebilen LH ve FSH düzeylerini arttırdığı11,12 maya devam ettiği yetişkin (2-3 aylık) dişi Sprague ve prepubertal dişilerde kispeptinin ovulasyonu indük- Dawley sıçanlar kullanıldı. Uludağ Üniversitesi Deney lediği de bildirilmiştir13. Hayvanları Yetiştirme Uygulama ve Araştırma Mer- Alfa adrenerjik reseptör antagonistleri ile tedavi altın- kezi’nden temin edilen sıçanlar, ısısı 20-24 oC olacak daki hastalarda gözlenen önemli bir bulgu, GnRH şekilde sabit tutulan, 12 saat aydınlık ve 12 saat karan- salgılanmasının bozulması ve buna bağlı olarak FSH lık (07.00-19.00 arası aydınlık) döngüsüyle çalışan bir ve LH düzeylerinin azalmasıdır14-17. Bu bulgular ile ortamda barındırıldı ve herhangi bir su ve yem kısıt- laması yapılmadı. 182 Kisspeptin’in Noradrenalin Salıverilmesi Üzerine Etkisi Beyin dilimlerinin hazırlanması ve inkübasyonu: Protokol 3: Kisspeptinin preoptik dilimlerde NA salı- verilmesi üzerine etkisinin ekstrasellüler Ca+2 ile iliş- Dekapitasyon sonrası en kısa sürede çıkartılan beyin- kisi: ler önceden soğutulmuş ve oksijenlendirilmiş (%95 O2 ve %5 CO2 ile) fizyolojik Krebs içine alındı. Kullanı- Protokol 2’de inkübasyon ortamına eklenen lan Krebs çözeltisinin kompozisyonu şöyledir kisspeptinin preoptik dilimlerden NA salıverilmesini (mmol/L): NaCl 120, CaCl 1.3, MgSO 1.2, arttırdığı gösterildikten sonra, bu artışın ekstrasellüler 2 4 +2 +2 NaH2PO4 1.2, KCl 3.5, NaHCO 25 ve 10 mmol/L Ca ile bağımlılığı Ca içermeyen ve ekstrasellüler 3 +2 glukoz. Hızlı bir şekilde preoptik bölge diseke edildi Ca ile şelat oluşturarak onu bağlayan BAPTA (200 ve doku dilimleyicisine (McIlwain) yerleştirilerek 0.3 M; 1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N',N'- mm kalınlığında dilimlendi. Dilimlenmiş doku, içinde tetraacetic acid) eklenmiş Krebs kullanılarak test edil- soğuk ve oksijenlenmiş fizyolojik sıvı bulunan petri di. kabına alınıp ve fırça yardımıyla dilimler birbirlerin- den ayrıldı. Elde edilen doku dilimleri fırça yardımıyla Noradrenalin ölçümü 0.3 ml oksijenlenmiş Krebs içeren ve 37oC dereceye Dilimlerden salıverilen ve doku NA düzeyleri elektro- ayarlanmış su banyosu içindeki inkübasyon kuyucuk- kimyasal dedektör (Electrochemical cell: Model 5041, larına, her bir kuyucukta 1 dilim olacak şekilde yerleş- Guard cell: Model 5020) bağlantılı yüksek basınçlı tirildi25,26. Bir sıçandan elde edilen dilimler her gruba sıvı kromatografisi (ESA, Coulochem 3, Model 5300- n sayısı 1 olarak dağıtıldı ve her deney 7 kez tekrar 32) sistemi kullanılarak ölçülmüştür. Bu sistemde edildi (her grup için n=7 sıçan). Bir saatlik mobil faz olarak 150 mM NaH2PO4 tamponu, (1 mM preinkübasyon döneminde, dilimlerin inkübe edildik- 1-Octane sulfonik asit, 100 μM EDTA, %15 Metanol), leri ortam her 15 dakikada bir taze oksijenlenmiş analitik kolon olarak da C18 kolon (ESA C18 Krebs ile değiştirildi. Denge döneminin ardından narrowbore) kullanıldı. Sistemde kolon sıcaklığı 30 oC aşağıdaki deney protokolleri uygulandı. olacak ve mobil faz akış hızı 0,4 ml/dakikaya ayarlan- dı. HClO4 ile asitlendirilmiş inkübasyon ortamları (20 Deney Protokolü l) ve doku süpernatant örnekleri (20 l) direkt olarak Protokol 1: Prepubertal, adölesan ve yetişkin sıçanlar- HPLC sistemine enjekte edildi. Kromatografik analiz dan hazırlanan preoptik dilimlerde bazal NA salıve- sonrası elde edilen pikler, 0,4 N asit içinde hazırlanan rilmesinin ve doku NA düzeylerinin incelenmesi ve örneklerle paralel bir şekilde çalışılan standartların 0.3 ml Krebs içeren inkübasyon kuyucuklarına yerleş- pikleri ile karşılaştırılarak miktar tayini yapıldı. tirilen dilimler 60 dakikalık pre-inkübasyon dönemi- Protein Ölçümü nin ardından 60 dakika boyunca 0.3 ml Krebs içinde inkübasyona bırakıldı. Bu sürenin sonunda Ölçülen NA miktarları total doku proteinine oranlana- inkübasyon ortamları salıverilen NA ölçümü için rak verildi. Total doku protein düzeyi Lowry ve arka- toplandı ve NA oksidasyonunu önlemek için HClO4 daşlarının 46 yöntemine göre 50 µl doku homojenatı ile asitlendirildi (son konsantrasyon 0.4 N). Dokular kullanılarak ölçüldü. Protein standartları koyun serum ise 0.3 ml 0.4 N HClO4 içine alınarak homojenize albümini kullanılarak 0,4 N HClO4 içinde hazırlandı edildi. Homojenatın bir kısmı (50 l) doku total pro- ve doku örnekleriyle birlikte çalışıldı. tein ölçümü için kullanılırken, kalan homojenat santri- füj edildi (10 dakika, 12.000 rpm) ve elde edilen İstatistiksel Analizler süpernatant doku NA düzeyinin ölçümü için kullanıldı. Elde edilen bütün değerler “ortalama ± standart sap- Protokol 2: Prepubertal, adölesan ve yetişkin sıçanlar- ma” şeklinde verildi. İstatistiksel analizler SPSS 22.0 dan hazırlanan preoptik dilimlerden NA salıverilmesi programı kullanılarak yapıldı (SPSS Inc. Chicago, IL, üzerine kisspeptidin etkisi: USA). Verilerin normallik analizleri Kolmogorov- Çalışmamızda kullanılacak kisspeptin dozunu belirle- Simirnov Z testi ile gerçekleştirildi. Karşılaştırmalarda mek amacıyla değişen kisspeptin dozlarında (0,1, 1, One Way ANOVA testi ardından post-hoc testi olarak, 10, 40, 400 µM) adölesan sıçanlardan elde edilen Tukey testi kullanıldı. Tüm testlerde istatistiksel an- dilimlerde tarama testi yapıldı ve çalışmanın deva- lamlılık değeri p<0,05 olarak kabul edildi. mında etkili bulunan 40 ve 400 µM dozlarında kulla- nıldı. Pre-inkübasyon döneminin ardından dilimler kisspeptin (40, 400 µM) içeren veya içermeyen or- Bulgular tamda 60 dakika boyunca inkübe edildi. İnkübasyon süresinin bitmesinin ardından dokular 0.4 N perklorik Prepubertal, adölesan ve yetişkin sıçanlardan hazır- asit içine alındı. Bu sürenin sonunda toplanan lanan preoptik dilimlerden bazal NA salıverilmesi ve inkübasyon ortamları ve dokular Protokol 1’de belir- doku NA düzeyleri: tildiği salıverilen ve doku NA düzeylerinin ölçümü Bir saatlik kontrol koşullarında bazal NA salıverilmesi için kullanıldı. prepubertal sıçanlarda 0,2 ± 0,01 pmol/mg protein, 183 Z. Gül ve R.L. Büyükuysal adölesan sıçanlarda 0,65 ± 0,06 pmol/mg protein, 0,39±0,03 pmol/mg protein; p>0,05, Şekil 2A). Doku yetişkin sıçanlarda ise 1,68 ± 0,1 pmol/mg protein NA düzeylerinin de NA salıverilmesi ile benzer olarak bulundu. İstatistiksel olarak karşılaştırıldığında 40 ve 400 µM kisspeptin dozunda bir miktar azaldığı spontan NA salıverilmesinin adölesan (p<0.05) ve ancak bu azalmanın da anlamlı olmadığı tespit edildi yetişkin sıçanlarda (p<0.01) prepubertal sıçanlara göre (p>0,05, Şekil 2B). anlamlı olarak yüksek olduğu saptandı (Şekil 1A). Doku NA düzeyleri prepubertal ve adölesan sıçanlarda sırası ile 1,79 ± 0,05 ve 2,5 0 ± 0,3 pmol/mg protein bulundu (p>0.05). Yetişkin sıçanlarda ölçülen doku NA miktarının ise diğer iki yaş grubundaki sıçanlar- dan çok daha yüksek olduğu saptandı (17,3 ± 1 pmol/mg protein; p<0.001; Şekil 1B). Şekil 2. Şekil 1. Kisspeptin dozlarının MPOA’daki NA salıverilmesi Yaşın MPOA’daki NA salıverilmesi (A) ve doku düzey- (A), doku düzeyleri (B) ve kontrole göre yüzde salıve- leri (B) üzerine etkisinin pre-pubertal, adölesan ve rilmesi (C) üzerine etkisinin pre-pubertal, adölesan ve yetişkin dişi sıçanlarda değerlendirilmesi yetişkin dişi sıçanlarda değerlendirilmesi Pre-pubertal, adölesan ve yetişkin sıçanlardan hazırlanan Pre-pubertal, adölesan ve yetişkin sıçanlardan hazırlanan beyin dilimlerinin kontrol koşullarında 1 saatlik inkübasyon beyin dilimlerinin kisspeptin dozları ile (40 ve 400 µM) 1 sonrası ortama salıverilen NA düzeyleri (A) ve inkübasyon saatlik inkübasyon sonrası ortama salıverilen NA düzeyleri sonrası homojenize edilen dokulardan elde edilen (A) ve inkübasyon sonrası homojenize edilen dokulardan süpernatant doku NA düzeyleri (B) elektrokimyasal detek- elde edilen süpernatant doku NA düzeyleri (B) elektrokim- törlü HPLC aracılığı ile ölçüldü. Data ortalama ± standart yasal detektörlü HPLC aracılığı ile ölçüldü. Grupların NA hata olarak sunuldu (n=7). * p˂0.05, *** p˂0.001 pre- salınım yüzdeleri kontrol NA düzeylerine göre oranlanarak pubertal gruba göre anlamlı; ## p˂0.01, ### p˂0.001 adölesan hesaplandı (C). Data ortalama ± standart hata olarak sunuldu gruba göre anlamlı. (n=7). * p˂0.05, *** p˂0.001 kendi kontrol grubuna göre anlamlı. Prepubertal, adölesan ve yetişkin sıçanlardan hazır- lanan preoptik dilimlerden NA salıverilmesi üzerine Adölesan sıçanlardan hazırlanan preoptik dilimlerde kisspeptinin etkisi: 40 M konsantrasyonda kisspeptin NA salıverilmesini İnkübasyon ortamına eklenen kisspeptin (40 ve 400 bazal değeri olan 0,65 ± 0,06 pmol/mg proteinden M) pre-pubertal sıçanlardan hazırlanan preoptik 1,25 ± 0,2 pmol/mg proteine yükseltti (p<0,05). dilimlerden NA salıverilmesini hafif arttırsa da bu İnkübasyon ortamındaki kisspeptin miktarı 400 µM’a artış istatistiksel olarak anlamlılık seviyesine ulaşmadı çıkartıldığında ise NA salıverilmesinin daha da arttığı (40 M için 0,29±0,05 pmol/mg protein, 400 µM için saptandı (2,5 ± 0,08 pmol/mg protein, p<0,001, Şekil 2A). Doku NA düzeylerinin ise 40 ve 400 µM 184 Kisspeptin’in Noradrenalin Salıverilmesi Üzerine Etkisi kisspeptin konsantrasyonlarında bir miktar azaldığı proestrus fazında LH dalgalanmasından hemen önce ancak bu azalmanın anlamlılık seviyesine ulaşmadığı NA salıverilmesinin arttığı bildirilmiştir30,31. GnRH görüldü (p>0,05, Şekil 2B ve Şekil 2C). nöronlarının adrenerjik reseptörlere sahip olduğu 34,48 Yetişkin sıçanlardan elde edilen veriler değerlendiril- bilgisi de literatürde mevcuttur . Bu bilgilere ek 32,33 diğinde, 40 µm konsantrasyonda kisspeptinin NA olarak, NA sentez inhibisyonunun , alfa-adrenerjik 34,35 salıverilmesini 3,22 ± 0,2 pmol/mg protein’e, 400 µm reseptörlerin bloke edilmesinin veya A6 dozunda ise 3,82±0,4 pmol/mg protein’e yükselttiği noradrenerjik çekirdeğin36 elektrolitik lezyonunun saptandı (her iki kisspeptin konsantrasyonu için de sıçanlarda LH artışını baskıladığı da çalışmalar ile p<0,001; Şekil 2A). Doku NA düzeylerinin ise 400 ortaya konmuştur. Farelerde yapılan diğer bir çalışma- µm kisspeptin ile anlamlı olarak arttığı görüldü da da A2 ve A6 noradrenerjik hücrelerin GnRH nö- (p<0.001, Şekil 2B ve Şekil 2C). ronları ile direkt bağlantılı olduğu saptanmıştır 49. Elektrofizyoloji çalışmaları ile NA'in GnRH nöron Kisspeptinin preoptik dilimlerde NA salıverilmesi +2 aktivitesi üzerinde direk bir etkisinin olduğu da göste-üzerine olan etkisinde ekstrasellüler Ca ’un rolü: rilmiştir37. Bütün bu bulgular noradrenerjik sistemin Kisspeptinin neden olduğu NA salıverilmesinde GnRH salıverilmesinin regülasyonunda oldukça ekstrasellüler Ca2+’un rolü adölesan sıçanlardan hazır- önemli bir role sahip olduğunu açık bir şekilde ortaya lanan preoptik dilimlerde test edildi ve ölçülen değer- koymaktadır. ler kontrol koşullarda saptanan NA salıverilme miktar- Kisspeptin ile bunun reseptörü olan GPR54’ün GnRH larına göre yüzde değişim olarak hesaplandı. Buna 2+ ve LH salıverilmelerinin regülasyonunda önemli bir göre inkübasyon ortamından ekstrasellüler Ca ’un role sahip olduğu özellikle son 10 yıldır yapılan ça- çıkartılması bazal NA salıverilmesini %19,7 ± 2,5, lışmalar ile gösterilmiştir2-6. Kisspeptin preoptik böl- (p>0.05), 400 µM kisspeptin’in neden olduğu NA gedeki GnRH nöronlarını stimüle ederek GnRH salı- salıverilmesini ise anlamlı olarak azaldığı gözlendi verilmesini arttırır. Bu stimülasyonun, insan ve hay- (%153,3; p<0.001, Şekil 3). vanlarda pubertal gelişimin başlaması ve üreme fonk- siyonları için gerekli ve temel bir fizyolojik fonksiyon olduğu araştırmacılar tarafından ortaya konmuştur3-7. Kisspeptinlerin pubertede ve hipotalamus-hipofiz- gonadal aksdaki kritik rollerinin aydınlatılması sonrası, infertilite ve üreme bozukluklarının tedavisinde yeni bir potansiyel terapötik hedef olarak görülmeye baş- lanmıştır4. Kisspeptinin GnRH salıverilmesi üzerinde sadece direkt etkili olmadığı, bazı düzenleyici meka- nizmalar aracılığı ile GnRH salıverilmesi üzerinde indirekt etkisinin olabileceği bildirilmiştir38. Bu çalış- malar detaylı incelendiğinde, GnRH salıverilmesi üzerinde etkili nöropeptid Y39, agouti ilişkili protein40 Şekil 3. 2+’ ve melanosit stimüle edici hormon 41 gibi Ca un kisspeptin ile indüklenen NA salıverilmesi üzerine etkisinin adölesan dişi sıçanlarda değerlendi- nöropeptidlerin kisspeptin ile direkt veya indirekt rilmesi ilişkisinin olabileceği görülmektedir. Bu çalışmalara ek olarak nörotransmitterler ile ilgili yapılan çalışma- Adölesan sıçanlardan hazırlanan beyin dilimlerinin larda, kisspeptinin glutamat 42, GABA43 ve serotonin50 kisspeptin ile 1 saatlik normal Krebs ve Ca2+’suz gibi nörotransmitterler ile direkt veya indirekt ilişkisi Krebs+BAPTA çözeltisinde inkübasyon sonrası ortama olduğu rapor edilmiştir salıverilen NA düzeyleri elektrokimyasal detektörlü HPLC NA ve kisspeptin ilişkisi literatürde detaylı incelendi- aracılığı ile ölçüldü. Data ortalama ± standart hata olarak sunuldu (n=7). *** p˂0.001 Kisspeptin 400 µM grubunun ğinde, Fernandois ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada Kisspeptin 400 µM-Ca+2 suz-BAPTA grubuna göre anlamlı. yaş ile beraber sıçan yumurtalıklarında kisspeptin ekspresyonunun anlamlı olarak arttığı gösterilmiştir. Bununla birlikte yumurtalık NA düzeylerinin de yaş ile beraber arttığı ve bu artışın kisspeptin artışı ile Tartışma ve Sonuç yüksek korelasyon gösterdiği ortaya konmuştur44. Noradrenerjik sistemin GnRH salıverilmesinin regü- Fernandois ve arkadaşlarının yaptığı bir diğer çalış- lasyonunda önemli bir role sahip olduğu bilinmekte- mada ise beta adrenerjik blokerlerin yumurtalık 45 dir27. A1, A2 ve A6 noradrenerjik hücre grupları kisspeptin ekspresyonunu azalttığı bulgusu , GnRH nöronlarının perikarya ve terminallerinde yer- kisspeptin ile noradrenerjik sistem arasındaki ilişki leşim gösterirler ve buradan MPOA ve medial bazal olabileceğini göstermiştir. Diğer taraftan alfa-1 anta- hipotalamusa projeksiyon yaparlar28,29. NA salıveril- gonist prazosinin sıçanlarda MPOA’da kisspeptin ve 46 mesi ile ilgili çalışmalarda, ovariektomize sıçanlarda GnRH ekspresyonunu azalttığı gösterilmiştir . Yuka- 185 Z. Gül ve R.L. Büyükuysal rıda özetlenen konu ile ilgili çalışmalar bu iki sistemin Sonuç olarak bu çalışma, kisspeptinin NA salıverilme- ilişkili olabileceğini göstermesine rağmen, sini direkt olarak arttırabildiğini göstermesi ve bu kisspeptinin NA salıverilmesi üzerine direkt etkisi etkinin kisspeptin ile noradrenerjik sistemin direkt olup olmadığına dair herhangi bir çalışma bulunma- ilişkisinin ortaya koyan literatür bilgileri ile uyumlu maktadır. olması açısından önemlidir. Hipotalamo-hipofizer- Çalışmamızdaki bulgulardan ilki MPOA’daki spontan gonadal aks üzerinde kisspeptin molekülünün rolünün NA salıverilmesinin ve doku düzeylerinin gelişimsel daha detaylı bir şekilde incelenerek ortaya konması, dönemle ilişkili olarak arttığının gösterilmesidir. Bu kisspeptin reseptör mutasyonlu hastalarda yeni tedavi bulgu literatürdeki daha önceki çalışmalar ile uyumlu- seçeneklerinin araştırılması veya puperteden sorumlu dur27-31,44,45. Yaş ile beraber MPOA’da kisspeptin hormonların salgılanmasının düzenlemeleri konusun- ekspresyonunun değişimi ile ilgili literatürde herhangi da yeni çalışmalara ışık tutabilir. bir çalışma olmamasına rağmen yumurtalıklarda yaş ile birlikte kisspeptin ekspresyonunun arttığı gösteril- Etik Kurul Onay Bilgisi: miştir44,46. Çalışmamızdaki diğer bir önemli bulgu da Onaylayan Kurul: Uludağ Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel adölesan ve yetişkin sıçanlardan (fakat prepubertal Etik Kurulu. Onay Tarihi: 16.02.2016 değil) elde edilen dilimlerin kisspeptin ile Karar No: 216-03/05 inkübasyonu sonucu NA salıverilmesinin artmış olma- sıdır. Ancak bu artışın bazal NA salıverilmesine göre yüzdesi hesaplandığında en yüksek yüzde artışın Kaynaklar adölesan grupta meydana gelmiş olmasıdır. Bu bulgu- ların ışığında adölesan MPOA’daki noradrenerjik 1. Herbison AE. Physiology of the adult gonadotropin-releasing nöronların kisspeptine karşı daha duyarlı olduğu söy- hormone neuronal network. In: Plant T, Zeleznik A, eds. lenebilir. Kisspeptin ile NA salıverilmesi adölesan ve Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. 4th ed. London: Elsevier 2015;399–467. yetişkin sıçanlarda artmasına rağmen, doku NA dü- zeyleri sadece yetişkin sıçanlarda değişiklik göster- 2. Seminara SB, Messager S, Chatzidaki EE, et al. The GPR54 gene as a regulator of puberty. N Engl J Med 2003;349:1614– miştir. Pre-pubertal ve adölesan sıçanlarda kisspeptin 27. ile doku NA düzeylerinin bir miktar azaldığı ancak bu 3. Dhillo WS. Kisspeptin: a novel regulator of reproductive azalışın anlamlı olmadığı, yetişkin sıçanlarda ise dü- function. J Neuroendocrinol 2008;20:963–70. şük doz kisspeptin de değişmeyip yüksek doz 4. Seminara SB, Crowley WF Jr. Kisspeptin and GPR54: kisspeptin ile arttığını gözlemledik. Bu durum ile, discovery of a novel pathway in reproduction. J kisspeptinin pre-pubertal ve adölesan sıçanlarda vezi- Neuroendocrinol 2008;20:727–31. küllerde biriken NA salıverilmesini uyardığını, ancak 5. Jayasena CN, Dhillo WS, Bloom SR. Kisspeptin and the control of gonadotropin secretion in humans. Peptides yetişkin sıçanlarda hem salıverilmeyi, hem de NA 2009;30:76–82 sentezini arttırdığı ileri sürülebilir. Ancak bu hipotezin 6. de Roux N, Genin E, Carel JC, Matsuda F, Chaussain JL, ekspresyon çalışmaları ile desteklenmesi gerekmekte- Milgrom E. Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of dir. Diğer taraftan kisspeptin ile uyarılan NA salıve- function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54. Proc rilmesinin, ekstrasellüler Ca2+ iyonlarına bağlı olması, Natl Acad Sci U S A 2003;100:10972–6. salıverilmenin veziküler olabileceğini düşündürmekle, 7. Dungan HM, Gottsch ML, Zeng H,et al. The role of kisspeptin mekanizmanın tam olarak aydınlatılması (endojen GPR54 signaling in the tonic regulation and surge release of + gonadotropin-releasing hormone/luteinizing hormone. J firing veya voltaja duyarlı Na kanallarının rolü gibi) Neurosci 2007; 27(44):12088 –95. için daha fazla çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. 8. Herbison AE. Estrogen positive feedback to gonadotropin- Beyin dilimlerini kullanarak daha önce yaptığımız releasing hormone (GnRH) neurons in the rodent: the case for çalışmaların bir kısmında, cinsiyete bağlı bir farklılık the rostral periventricular area of the third ventricle (RP3V). 25,51 Brain Res Rev. 2008;57(2):277–287. görmediğimiz için dişi sıçanları kullanmıştık . Her 9. Han S-K, Gottsch ML, Lee KJ, et al. Activation of ne kadar, dişi sıçanlarda menstural siklusun gonadotropin releasing hormone neurons by kisspeptin as a hipotalamus nörotransmitter düzeylerinin değiştirdiği neuroendocrine switch for the onset of puberty. J Neurosci. gösterilmişse de50, in vitro beyin dilimlerinde siklusun 2005;25(49):11349–56. nörotrasnmitter salıverilmesi etkileyebileceği ile ilgili 10. Messager S, Chatzidaki EE, Ma D, et al. Kisspeptin directly herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Siklusun in stimulates gonadotropin releasing hormone release via G prote- vitro nörotransmitter salıverilmesi üzerinde olası bir in-coupled receptor 54. Proc Natl Acad Sci U S A 2005;102:1761–6. etkisinin olabileceği düşünülürse, bu çalışmada kulla- 11. Matsui H, Takatsu Y, Kumano S, Matsumoto H, Ohtaki T. nılan yetişkin sıçanların sikluslarının göz ardı edilmiş Peripheral administration of metastin induces marked olması, çalışma sonuçlarının yorumlanmasını sınırla- gonadotropin release and ovulation in the rat. Biochem Biophys yan bir olasılık gibi görülmektedir. Bu nedenle, konu- Res Commun 2004;320:383–8. nun aydınlatılması için daha fazla çalışma yapılması 12. Navarro VM, Castellano JM, Fernández-Fernández R, et al. gerektiği kanısındayız. Effects of KiSS-1 peptide, the natural ligand of GPR54, on follicle-stimulating hormone secretion in the rat. Endocrinology 2005;146:1689–97. 186 Kisspeptin’in Noradrenalin Salıverilmesi Üzerine Etkisi 13. Shahab M, Mastronardi C, Seminara SB, Crowley WF, Ojeda temporal relationship with plasma secretory surges of prolactin SR, Plant TM. Increased hypothalamic GPR54 signaling: a and luteinising hormone. J Neuroendocrinol 2007;19(5):374– potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proc 382. Natl Acad Sci U S A 2005;102:2129–34. 31. Szawka RE, PoletiniMO, Leite CM, et al. Release of 14. Sawyer CH. First Geoffrey Harris Memorial lecture. Some norepinephrine in the preoptic area activates anteroventral recent developments in brain-pituitary-ovarian physiology. periventricular nucleus neurons and stimulates the surge of Neuroendocrinology 1975;17: 97–124. luteinizing hormone. Endocrinology 2013;154(1):363–374. 15. Weiner RI, Ganong WF. Role of brain monoamines and 32. Gnodde HP, Schuiling GA. Involvement of catecholaminergic histamine in regulation of anterior pituitary secretion. Physiol and cholinergic mechanisms in the pulsatile release of LH in Rev 1978; 58: 905–976. the longterm ovariectomized rat. Neuroendocrinology 16. Gallo RV. Neuroendocrine regulation of pulsatile luteinizing 1976;20(3):212–23. hormone release in the rat. Neuroendocrinology 1980; 30: 122– 33. Kalra PS, Kalra SP, Krulich L, Fawcett CP, McCann SM. 131. Involvement of norepinephrine in transmission of the 17. Kalra SP. Neural circuitry involved in the control of LHRH stimulatory influence of progesterone on gonadotropin release. secretion: a model for preovulatory LH release. Front Endocrinology 1972;90(5):1168–76. Neuroendocrinol 1986; 9: 31–75. 34. 34.Le W, Berghorn KA, Smith MS, Hoffman GE. 1-Adrenergic 18. Ramirez VD, Ramirez AD, Slamet W, Nduka E. Functional receptor blockade blocks LH secretion but not LHRH cFos characteristics of the luteinizing hormone-releasing hormone activation. Brain Res 1997;747(96):236–45. pulse generator in trial, unrestrained female rabbits: activation 35. Weick RF. Acute effects of adrenergic receptor blocking drugs by norepinephrine. Endocrinology 1986; 118: 2331–2339. and neuroleptic agents on pulsatile discharges of luteinizing 19. Terasawa E, Krook C, Hei DL, Gearing M, Schultz NJ, Davis hormone in the ovariectomized rat. Neuroendocrinology GA. Norepinephrine is a possible neurotransmitter stimulating 1978;26(2):108–17. pulsatile release of luteinizing hormone-releasing hormone in 36. Anselmo-Franci JA, Franci CR, Krulich L, Antunes-Rodrigues the rhesus monkey. Endocrinology 1988; 123: 1808–1816. J, McCann SM. Locus coeruleus lesions decrease 20. Pau KY, Hess DL, Kaynard AH, Ji WZ, Gliessman PM, Spies norepinephrine input into the medial preoptic area and medial HG. Suppression of mediobasal hypothalamic gonadotropin- basal hypothalamus and block the LH, FSH and prolactin releasing hormone and plasma luteinizing hormone pulsatile preovulatory surge. Brain Res 1997;767(2):289–296. patterns by phentolamine in ovariectomized rhesus macaques. 37. Han S-K, Herbison AE. Norepinephrine suppresses Endocrinology 1989; 124: 891–898. gonadotropin releasing hormone neuron excitability in the adult 21. Pau KY, Gliessman PM, Oyama T, Spies HG. Disruption of mouse. Endocrinology 2008;149(3):1129–35. GnRH pulses by anti-GnRH serum and phentolamine 38. Marraudino M, Miceli D, Farinetti A, Ponti G, Panzica G, Gotti obliterates pulsatile LH but not FSH secretion in S. Kisspeptin innervation of the hypothalamic paraventricular ovariectomized rabbits. Neuroendocrinology 1991; 53: 382– nucleus: sexual dimorphism and effect of estrous cycle in 391. female mice. J Anat 2017;230:775–86. 22. Kafa MI, Eyigör Ö. Kisspeptins and Kisspeptin Neurons: 39. Navarro VM, Castellano JM, McConkey SM, et al. Interactions Effects on Reproductive System and Hypothalamic between kisspeptin and neurokinin B in the control of GnRH Localizations. Uludağ Tıp Fakültesi Dergisi 2011:37 (1) 53-60, secretion in the female rat. Am J Physiol Endocrinol Metab 23. Francis Pau KY, Cyrus JL, Cowles A, Yang SP, Hess DL, 2011;300:E202–E210. Spies HG. Possible Involvement of Norepinephrine Transporter 40. Padilla SL, Qiu J, Nestor CC, et al. AgRP to Kiss1 neuron Activity in the Pulsatility of Hypothalamic Gonadotropin- signaling links nutritional state and fertility. Proc Natl Acad Sci Releasing Hormone Release: Influence of the Gonad. Journal of USA Biol Sci 2017: 201621065. Neuroendocrinology 1998; 10:21–29. 41. Manfredi-Lozano M, Roa J, Ruiz-Pino F, et al. Defining a 24. Tassigny X, Ackroyd K.J, Chatzidaki E.E, Colledge WH. novel leptin–melanocortin–kisspeptin pathway involved in the Kisspeptin Signaling Is Required for Peripheral But Not Central metabolic control of puberty. Mol Metab 2016;5:844–57. Stimulation of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons by 42. Min L, Adeola O, Carroll RS, Kaiser UB. Glutamate Acts as a NMDA. The Journal of Neuroscience, June 23, 2010. Cofactor in the Activation of KISS1R by Kisspeptin, Signaling 30(25):8581– 8590. Originating from Membrane Receptors. Endocrine Society 25. Gul Z, Buyukuysal MC, Buyukuysal RL. Brain slice viability 2013; SUN-402-SUN-402. determined under normoxic and oxidative stress conditions: 43. Cheong RY, Czieselsky K, Porteous R, Herbison AE. involvement of slice quantity in the medium. Neurological Expression of ESR1 in glutamatergic and GABAergic neurons Research 2020;42:228-238. is essential for normal puberty onset, estrogen feedback, and 26. Gul Z, Demircan C, Bagdas D, Buyukuysal RL. Aging protects fertility in female mice. J Neurosci 2015;35:14533–43. rat cortical slices against to oxygen-glucose deprivation 44. Fernandois D, Na E, Cuevas F, Cruz G, Lara H, Paredes AH. induced damage. International Journal of Neuroscience 2020;1- Kisspeptin is involved in ovarian follicular development during 9. aging in rats. J Endocrinol 2016;228:161–70. 27. Herbison AE. Noradrenergic regulation of cyclic GnRH 45. Fernandois D, Cruz G, Na EK, Lara HE, Paredes AH. secretion. Rev Reprod 1997;2(1):1– 6. Kisspeptin level in the aging ovary is regulated by the 28. Helena CVV, Szawka RE, Anselmo-Franci JA. Noradrenaline sympathetic nervous system. J Endocrinol 2017;232:97–105. involvement in the negative-feedback effects of ovarian 46. Kalil B, Ribeiro AB, Leite CM, et al. The Increase in Signaling steroids on luteinising hormone secretion. J Neuroendocrinol by Kisspeptin Neurons in the Preoptic Area and Associated 2009;21(10):805–12. Changes in Clock Gene Expression That Trigger the LH Surge 29. Haywood SA, Simonian SX, van der Beek EM, Bicknell RJ, in Female Rats Are Dependent on the Facilitatory Action of a Herbison AE. Fluctuating estrogen and progesterone receptor Noradrenaline Input. Endocrinology 2016;157:323–35. expression in brainstem norepinephrine neurons through the rat 47. Du XJ, Bobik A, Esler MD, Dart MA. Effects of Intracellular estrous cycle. Endocrinology 1999;140(7):3255–63. Ca2+ Chelating on Noradrenaline Release ın Normoxic and 30. Szawka RE, Franci CR, Anselmo-Franci JA. Noradrenaline Anoxic Hearts. Clinical and Experimental Pharmacology and release in the medial preoptic area during the rat oestrous cycle: Physiology 1997;24:819-23. 187 Z. Gül ve R.L. Büyükuysal 48. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL. Protein measurement 50. Barth C, Villringer A, Sacher J. Sex hormones affect with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry neurotransmitters and shape the adult female brain during 1951;193: 265-275. hormonal transition periods. Front Neurosci 2015:37:1-20. 49. Campbell RE, Herbison AE. Definition of brainstem afferents 51. Demircan C, Gul Z, Buyukuysal RL. High glutamate attenuates to gonadotropin-releasing hormone neurons in the mouse using S100B and LDH outputs from rat cortical slices enhanced by con- ditional viral tract tracing. Endocrinology 2007;148:5884- either oxygen–glucose deprivation or menadione. 90. Neurochemical research 2014:39:1232-1244. 188