ÇEŞİTLİ GIDALARDAN İZOLE EDİLEN LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN (LAB) TANIMLANMASI VE BİYOFİLM OLUŞTURMA YETENEKLERİ İLE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI Gökşen ARIK T.C. ULUDAĞ ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ ÇEŞİTLİ GIDALARDAN İZOLE EDİLEN LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN (LAB) TANIMLANMASI VE BİYOFİLM OLUŞTURMA YETENEKLERİ İLE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI Gökşen ARIK Prof. Dr. Mihriban KORUKLUOĞLU (DanıĢman) DOKTORA TEZĠ GIDA MÜHENDĠSLĠĞĠ ANABĠLĠM DALI BURSA–2018 Her Hakkı Saklıdır U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; - tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, - görsel, iĢitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, - baĢkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, - atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, - kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, - ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya baĢka bir üniversitede baĢka bir tez çalıĢması olarak sunmadığımı, beyan ederim. 06/04/2018 GökĢen ARIK ÖZET Doktora Tezi ÇEġĠTLĠ GIDALARDAN ĠZOLE EDĠLEN LAKTĠK ASĠT BAKTERĠLERĠNĠN (LAB) TANIMLANMASI VE BĠYOFĠLM OLUġTURMA YETENEKLERĠ ĠLE ANTĠBĠYOTĠK DĠRENÇLĠLĠKLERĠNĠN ARAġTIRILMASI Gökşen ARIK Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Mihriban KORUKLUOĞLU Bu çalıĢmada çeĢitli gıda örneklerinden izole edilerek tanılanan laktik asit bakterilerinin (LAB) biyofilm oluĢturma özellikleri ve antibiyotik dirençlilikleri belirlenmiĢtir. Gıda örnekleri Bursa‟ daki farklı pazarlardan temin edilerek, uygun koĢullarda laboratuvar ortamına getirilmiĢtir. Potansiyel LAB kültürleri, gıda örneklerinden izole edilerek, saflaĢtırılmıĢtır. Ġzolatlara biyokimyasal testler uygulanarak, potansiyel LAB suĢları belirlenmiĢ ve moleküler yöntemler ile suĢların tanılanması yapılmıĢtır. Olası LAB kültürlerinin cins ve tür bazında belirlenebilmesi için 16S rRNA bölgesi PZR ile evrensel 27F (5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3') ve 1492R (5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3') primerleri kullanılarak çoğaltılmıĢ ve elde edilen PZR ürünleri sekanslanmıĢtır. Sekans sonuçlarına göre 40 izolatın tanılanması yapılmıĢtır. Ġdentifikasyonu yapılan LAB suĢlarının biyofilm oluĢturma kapasiteleri kalitatif bir yöntem olan “Tüp yöntemi” ve kantitatif sonuçlar veren “Mikro plaka (96 kuyucuklu plaka) yöntemi” ile belirlenmiĢtir. Biyofilm oluĢumu 30 ve 37ºC‟ de 24 ve 48 saatlik inkübasyonun ardından gözlemlenmiĢ olup, farklı sıcaklık ve inkübasyon süreleri kullanılarak stres koĢulları oluĢturulmaya çalıĢılmıĢtır. SuĢların dört ayrı antibiyotiğe (streptomisin (25 ve 300µg), ampisilin (25µg), tetrasiklin (50µg) ve vankomisin (30µg)) karĢı dirençleri disk difüzyon yöntemi ile inkübasyonun ardından disklerin etrafında oluĢan zon çapları ölçülerek belirlenmiĢtir. Tanısı yapılan 40 LAB suĢu arasından 21‟ inin (%52,5) biyofilm üreticisi olduğu belirlenmiĢtir. LAB suĢlarında en yoğun biyofilm oluĢumu 37ºC‟ de 48 saat inkübasyon koĢullarında gözlemlenmiĢtir. 37ºC‟ de 48 saatlik inkübasyon koĢulunda suĢların %20‟ sinin (8 adet) “orta düzeyde”, %25‟ inin (10 adet) ise “zayıf düzeyde” biyofilm oluĢturduğu gözlemlenmiĢtir. Ayrıca suĢların %72,5‟ inin streptomisine (25 µg), %65‟ inin vankomisine (30 µg) dirençli olduğu, ancak %77,5‟ inin ampisiline (25 µg) ve %95‟ inin ise tetrasikline (50 µg) duyarlı oldukları belirlenmiĢtir. Anahtar Kelimeler: laktik asit bakterileri, tanılama, biyofilm, antibiyotik dirençlilik 2018, 118 sayfa. i ABSTRACT Ph. D. Thesis IDENTIFICATION OF LACTIC ACID BACTERIA (LAB) ISOLATED FROM DIFFERENT FOODS AND INVESTIGATIONS OF THEIR BIOFILM FORMATION AND ANTIBIOTIC RESISTANCE Gökşen ARIK Uludag University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Mihriban KORUKLUOĞLU In this research, the biofilm formation properties and antibiotic resistance of lactic acid bacteria (LAB) isolated from different food samples, were determined. The potential LAB cultures were isolated and purified after the food samples were collected from the bazaars in different regions of Bursa and they were transported to the laboratory under appropriate conditions. The biochemical analyses were performed to the cultures and the possible LAB strains were identified by molecular methods. 16S rRNA was amplified by PCR with using universal bacterial primers 27F (5' AGAGTTT GATCMTGGCTCAG 3'), 1492R (5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3') and the PCR products were sequenced. According to the sequencing results, 40 isolates were identified. The biofilm forming capacity of the identified LAB strains was examined by “Tube adherence method” a qualitative method and “Microtiter plate (96 well-plate) assay” a quantitative method. Biofilm formation was observed after the incubation at 30 and 37 ºC for 24 and 48 hours, thus stress conditions were tried to be provided by using different temperatures and incubation periods. Susceptibility of all the strains to four antibiotics (streptomycin (25 and 300 µg), ampicillin (25 µg), tetracycline (50 µg), and vancomycin (30 µg)) was tested with the disk diffusion method by measuring the zone diameter formed around the disks after the incubation. Among the identified 40 isolates, 21 LAB strains (52,5%) were determined as a biofilm producer. The most biofilm formation among the strains was observed under the conditions at 37ºC for 48 hours. It was observed that among the strains, 20% (8 strains) produced biofilm at “medium level” and 25% (10 strains) at “weak level” after the incubation at 37ºC for 48 hours. Besides, it has been determined that among the strains, 72,5% were resistant to streptomycin (25 µg) and 65% were resistant to vancomycin (30 µg), moreover, 77,5% were susceptible to ampicillin and 95% to tetracycline (50 µg). Key Words: lactic acid bacteria, identification, biofilm, antibiotic resistance 2018, 118 pages. ii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR Bu çalıĢma Uludağ Üniversitesi BAP OUAP(Z)-2015/8 nolu “ÇeĢitli gıdalardan elde edilen laktik asit bakterilerinin probiyotik özellikleri ile biyofilm oluĢturma koĢullarının araĢtırılması” konulu proje çalıĢmasının bir bölümüdür. ÇalıĢmalarımın planlanmasında ve yürütülmesinde emeği geçen ve akademik hayatımda desteğini esirgemeyen danıĢman hocam Sayın Prof. Dr. Mihriban KORUKLUOĞLU‟ na (Uludağ Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü), bilgi, tecrübe ve fikirlerini benimle paylaĢarak, çalıĢmalarımda önemli katkılarda bulunan tez izleme komitesi üyeleri Sayın Doç. Dr. AyĢegül KUMRAL (Uludağ Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü) ve Sayın Prof. Dr. Sezai TÜRKEL (Uludağ Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü) hocalarıma, ıĢığıyla yolumu aydınlatan Sayın Prof. Dr. Filiz ÖZÇELĠK (Ankara Üniversitesi, Gıda Mühendisliği Bölümü) hocama, bana her zaman manevi destek veren, bu zorlu süreçte yardım ve sevgilerini her daim hissettiğim değerli eĢim Burak ARIK‟ a ve aileme, bana moral kaynağı olan yardımsever arkadaĢlarım AraĢ. Gör. Seyit UĞUZ‟ a (Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Biyosistem Mühendisliği Bölümü), AraĢ. Gör. Bilge ARSLAN‟a (Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Biyosistem Mühendisliği Bölümü) ve AraĢ. Gör. Ezgi KURTULMUġ‟ a (Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Biyosistem Mühendisliği Bölümü) en içten teĢekkürlerimi sunarım. GökĢen ARIK Bursa, Nisan 2018 iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.................................................................................................................................. i ABSTRACT ...................................................................................................................... ii ÖNSÖZ ve TEġEKKÜR .................................................................................................. iii SĠMGELER ve KISALTMALAR DĠZĠNĠ ...................................................................... vi ġEKĠLLER DĠZĠNĠ ........................................................................................................ viii ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ .................................................................................................... ix 1. GĠRĠġ ............................................................................................................................ 1 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAġTIRMASI ....................................... 4 2.1. Laktik Asit Bakterilerinin Genel Özellikleri .............................................................. 4 2.1.1. Lactococcus ............................................................................................................. 6 2.1.2. Leuconostoc ............................................................................................................ 6 2.1.3. Lactobacillus ........................................................................................................... 7 2.1.4. Weissella ................................................................................................................. 8 2.1.5. Enterococcus ........................................................................................................... 9 2.2. Laktik Asit Bakterilerinin Önemi ve Kullanım Alanları............................................ 9 2.3. Laktik Asit Bakterilerinin Tanılanması ve Uygulanan Yöntemler .......................... 16 2.3.1. Kültüre bağlı tanılama yöntemleri ........................................................................ 17 2.3.2. Kültürden bağımsız tanılama yöntemleri .............................................................. 20 2.4. Biyofilm ................................................................................................................... 21 2.4.1. Biyofilm oluĢumunun dezavantajları ve engelleme yolları .................................. 25 2.4.2. Biyofilm oluĢumunun avantajları ve LAB suĢlarında biyofilm oluĢumu ............. 29 2.5. Laktik Asit Bakterilerinde Antibiyotik Direnci ....................................................... 32 2.6. Laktik Asit Bakterilerinde Biyofilm OluĢumu ile Antibiyotik Direnci Arasındaki ĠliĢki ................................................................................................................................ 35 3. MATERYAL VE YÖNTEM ...................................................................................... 38 3.1. Materyal ................................................................................................................... 38 3.1.1. AraĢtırma örnekleri ............................................................................................... 38 3.1.2. Kullanılan besiyerleri ve çözeltiler ....................................................................... 39 3.2. Yöntem ..................................................................................................................... 41 3.2.1. Laktik asit bakterilerinin izolasyonu ..................................................................... 41 3.2.2. Laktik asit bakterilerinin morfolojik özelliklerinin belirlenmesi .......................... 41 3.2.3. Laktik asit bakterilerinin biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi ...................... 42 3.2.4. Laktik asit bakterilerinin genotipik yöntem ile tanılanması .................................. 42 3.2.5. Tanılanan laktik asit bakterilerinin biyofilm oluĢturma yeteneklerinin belirlenmesi ......................................................................................................................................... 48 3.2.6. Tanılanan laktik asit bakterilerinin antibiyotik dirençlerinin belirlenmesi ........... 50 3.2.7. Ġstatistiksel analiz .................................................................................................. 51 4. BULGULAR VE TARTIġMA ................................................................................... 53 4.1. Laktik Asit Bakterilerinin Ġzolasyonu ...................................................................... 53 4.2. Laktik Asit Bakterilerinin Tanılanması .................................................................... 54 4.2.1. Fenotipik yöntem .................................................................................................. 54 4.2.2. Genotipik yöntem .................................................................................................. 56 4.3. Tanılanan Laktik Asit Bakterilerinin Biyofilm OluĢturma Yeteneklerinin Belirlenmesi .................................................................................................................... 67 4.3.1. “Tüp yöntemi” ile biyofilm oluĢumunun incelenmesi .......................................... 67 iv 4.3.2. “96 kuyucuklu plaka yöntemi” ile biyofilm oluĢumunun incelenmesi ................. 68 4.3.3. Biyofilm oluĢumunun belirlenmesinde kullanılan tüp ve 96 kuyucuklu plaka yöntemlerinin karĢılaĢtırılması ........................................................................................ 72 4.4. Tanılanan Laktik Asit Bakterilerinin Antibiyotik Dirençlerinin Belirlenmesi ........ 82 5. SONUÇ ....................................................................................................................... 89 KAYNAKLAR ............................................................................................................... 94 Ek 1- Ġzolatların “Tüp Yöntemi” ile belirlenen biyofilm oluĢturma kapasiteleri ......... 109 Ek 2- Ġzolatların “96 Kuyucuklu Plaka Yöntemi” ile belirlenen biyofilm oluĢturma kapasiteleri .................................................................................................................... 111 Ek 3- Tanısı yapılan laktik asit bakterilerinin bazı antibiyotiklere karĢı dirençleri ve zon çapı (mm) ölçüm sonuçları............................................................................................ 113 ÖZGEÇMĠġ .................................................................................................................. 115 v SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama α Alfa β Beta ºC Celcius % Yüzde < Küçüktür > Büyüktür ≤ Küçük ya da eĢit ≥ Büyük ya da eĢit µ Mikro g Santrifüj kuvveti Kısaltmalar Açıklama AFLP Amplified fragment length polymorphism (ÇoğaltılmıĢ parça uzunluk polimorfizmi) bç Baz çifti BLAST The Basic Local Alignment Search Tool CO2 Karbondioksit d Dakika DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis (Denatüre gradyan jel elektroforezi) DNA Deoksiribonükleik asit EFSA Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi EMBL European molecular biology laboratory EPS Ekzopolisakkarit EtBr Etidyum bromür FAME Fatty acid methyl esters (Yağ asiti metil ester) FISH Floresan in stu hibridizasyonu FKI Fenol:kloroform:isoamil alkol GI-sistem Gastro-intestinal sistem GRAS Generally recognised as safe H2O2 Hidrojen peroksit HCl Hidroklorik asit HePS Heteropolisakkarit HoPS Homopolisakkarit KCl Potasyum klorür L Litre LAB Laktik asit bakterileri MgCl2 Magnezyum klorür MĠK Minimum inhibisyon konsantrasyonu mL Mililitre mm Milimetre vi Kısaltmalar Açıklama mM Milimolar MRS De man-rogosa-sharpe NaCl Sodyum klorür ng Nanogram nm Nanometre O2 Oksijen PFGE Pulsed-field gel electrophoresis (Darbeli alan jel elektroforezi) PZR Polimeraz zincir reaksiyonu QS Quorum sensing (Çoğunluk algılanması) RAPD Random Amplified Polymorphic DNA (Rastgele arttırılmıĢ polimorfik DNA) RFLP Restriction fragment length polymorphism (Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi) RNA Ribonükleikasit rRNA Ribozomal ribonükleik asit s Saniye SDS-PAGE Sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi spp Subspecies (Alt türler) TBE Tris Borat EDTA UV Ultra viyole vii ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa ġekil 2.1. LAB üyelerinin filogenetik olarak gruplandırılması ........................................ 5 ġekil 2.2. Biyofilm oluĢum evreleri ................................................................................ 24 ġekil 2.3. Biyofilm oluĢum aĢamalarının makroskobik Ģemaları ve elektron mikroskobu görüntüleri ....................................................................................................................... 24 ġekil 2.4. Gıda iĢletmelerinde kullanılan boru sistemlerinin içinde biyofilm tabakası oluĢumu ........................................................................................................................... 27 ġekil 4.1. Ġzolatların elde edildikleri kaynaklar .............................................................. 53 ġekil 4.2. [Lactobacillus spp. FE26 (a)], [Leuconostoc lactis FE5, Leuconostoc garlicum FE5 (b)], [Leuconostoc pseudomesenteroides FE14, Leuconostoc mesenteroides FE14 (c)] ve [Lactobacillus curvatus FE41 (d)] suĢlarından izole edilen DNA‟ların absorbans grafikleri ve konsantrasyonları .................................................... 56 ġekil 4.3. FE1-FE23 arası kod numaralı izolatların agaroz jel elektroforezi sonucunda oluĢturduğu bantlar.......................................................................................................... 57 ġekil 4.4. FE24-FE43 arası kod numaralı izolatların agaroz jel elektroforezi sonucunda oluĢturduğu bantlar.......................................................................................................... 58 ġekil 4.5. Lactobacillus rhamnosus FE1 suĢunun ileri primer ile sekans okuma grafiği59 ġekil 4.6. Lactobacillus rhamnosus FE1 suĢunun geri primer ile sekans okuma grafiği 59 ġekil 4.7. Leuconostoc pseudomesenteroides FE10 suĢunun ileri primer ile sekans okuma grafiği .................................................................................................................. 60 ġekil 4.8. Leuconostoc pseudomesenteroides FE10 suĢunun geri primer ile sekans okuma grafiği .................................................................................................................. 60 ġekil 4.9. Ġzole edilen mikroorganizmaların tür bazında dağılımı (%) ........................... 63 ġekil 4.10. L. plantarum FE29 suĢunun 30°C ve 37°C‟ de 24 saat inkübasyonu sonunda biyofilm oluĢturma kapasitesi; “a”, “c”: Tüp yöntemi; “b”, “d”: 96 kuyucuklu plaka yöntemi ............................................................................................................................ 76 ġekil 4.11. L. lactis FE40 suĢunun 30°C ve 37°C‟ de 48 saat inkübasyonu sonunda biyofilm oluĢturma kapasitesi; “a”, “c”: Tüp yöntemi; “b”, “d”: 96 kuyucuklu plaka yöntemi ............................................................................................................................ 78 ġekil 4.12. Laktik asit bakterilerinin 30 ve 37°C‟ de 48 saat inkübasyonu sonucunda belirlenen biyofilm oluĢturma kapasiteleri...................................................................... 80 viii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Bazı gıda örneklerinden izole edilen LAB suĢları ...................................... 13 Çizelge 3.1. Örneklere iliĢkin bilgiler ............................................................................. 38 Çizelge 3.2. PZR için hazırlanan stok çözeltide bulunan reaktifler ve konsantrasyonları ......................................................................................................................................... 46 Çizelge 3.3. Laktik asit bakterileri için uygulanan PZR koĢulları .................................. 47 Çizelge 4.1. Bakteri izolatlarının fenotipik özellikleri .................................................... 54 Çizelge 4.2. SaflaĢtırılan izolatların özellikleri ............................................................... 61 Çizelge 4.3. Ġzolatların cins ve tür bazında tanılama sonuçlarına ait bilgiler ................. 64 Çizelge 4.4. Tanılanan LAB suĢlarının antibiyotik direçlilikleri .................................... 83 Çizelge 4.5. LAB suĢlarının MAR indeksi değerleri ...................................................... 84 ix 1. GİRİŞ Laktik asit bakterileri (LAB) geliĢtikleri ortamlarda fermentasyon sonucunda laktik asit üretmekte ve son ürüne kendine has tat, koku ve aroma kazandırmaktadır. LAB, Gram pozitif, fakültatif anaerob, katalaz negatif, çoğunluğu spor oluĢturmayan, hareketsiz bakteriler olarak bilinmektedir. Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Tetragonococcus, Carnobacterium, Vagococcus, Weissella, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactosphaera, Melissococcus, Aerococcus ve Oenococcus cinsleri, LAB üyeleri arasında yer almaktadır (Dinçer ve ark. 2009, Evren ve ark. 2011, Özteber 2013, Mahony ve ark. 2014). Ġlk kez 19. yüzyılda sütü pıhtılaĢtıran mikroorganizmalar olarak tanınmaya baĢlamıĢ ve sonrasında laktik asit bakterileri olarak gruplandırılarak, özellikle fermente gıdaların üretimindeki önemleri ortaya çıkmıĢtır (Yerlikaya 2014). Laktik asit bakterilerinin süt ve et ürünleri, bazı alkollü içkiler ve bazı bitkilerin yanı sıra meyve-sebzelerden izole edildiği bilinmektedir. Ayrıca, insan ve hayvanların gastro-intestinal sistemlerinden (GI-sistem) ve nadir olarak da topraktan izole edilebilmektedir. LAB, çok eski çağlardan beri fermente gıda ve yem üretiminde önemli rol oynamakta olup, günümüzde de fermente ürünlerde starter olarak sıklıkla kullanılmaktadır (Wassie ve Wassie 2016). LAB türleri yaygın olarak izole edilen, karbonhidratları fermente ederek laktik asit üreten ve heterojen bir familya olan mikroorganizma grubunun üyeleri olarak bilinmektedir. Laktik asit fermentasyonu ile mikroorganizma için gerekli olan enerji elde edilmektedir (Kocková ve ark. 2011, Stoyanova ve ark. 2012, Saranraj ve ark. 2013, Sun ve ark. 2014). Laktik asit bakterilerinin büyük çoğunluğu gıdalarda kullanımı açısından güvenilir (generally recognised as safe (GRAS)) kabul edilmektedir. Bu nedenle laktik asit bakterilerine ait birçok tür starter olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, fermentasyon sonucunda meydana gelen metabolitleri de doğal gıda koruyucuları olarak sıklıkla 1 kullanılmaktadır (Baruah ve ark. 2016). Bu metabolitler baĢta laktik asit olmak üzere bakteriyosin, hidrojen peroksit, ekzopolisakkarit (EPS) vb. bileĢenler olup, gıda ürünlerinde kıvam artırıcı ve tat-aroma geliĢtirici olarak da kullanılabilmektedir (Hassan 2008, Mostefaoui ve ark. 2014, Baruah ve ark. 2016). LAB türleri, gıda endüstrisinde probiyotik olarak da kullanılmaktadır. Probiyotik LAB suĢları intestinal sistemde tutunarak, hızla çoğalabilmektedir. Probiyotikler, “konakçının intestinal sisteminde yeterli miktarlarda bulunduğunda sağlığı olumlu yönde etkileyen yaĢayan mikroorganizmalar” olarak tanımlanmaktadır (Arroyo-Lopez ve ark. 2012, Reis ve ark. 2016). Özellikle anne sütü ile beslenen yeni doğan bebeklerde sütte bulunan oligosakkaritler, prebiyotik özellik göstererek LAB‟ nin bağırsak mukozasında geliĢmeleri için uygun bir ortam oluĢturmaktadır. Prebiyotikler, faydalı mikroorganizmaların bağırsak sisteminde geliĢimini destekleyen ve sindirilemeyen gıda katkıları olarak bilinmektedir (Özyurt ve ÖtleĢ 2014, Reis ve ark. 2016). LAB türleri tarafından üretilen EPS‟ nin enerji kaynağı olarak metabolize edilemeği, ancak sindirim siteminde prebiyotik özellik gösterdiği ve LAB türleri için bariyer görevi görerek, olumsuz koĢullara karĢı direnci artırdığı bildirilmektedir (Ahi 2011, Ergene 2015). LAB üyeleri fermente gıda ürünlerinde istenilen özelliklerin kazanılmasını sağlamaktadır. Ancak bazı gıdalarda bozucu mikroorganizmalar olarak bilinmekte olup, ortamda bulunması istenmemektedir. Özellikle bazı et ürünlerinde, mayonez ve salata soslarında, fermente soya fasülyesinde ve Ģaraplarda LAB bulunması istenmemektedir (Kubota ve ark. 2008). Gıdaların bozulmasına neden olan mikroorganizmalar arasında laktik asit bakterilerinin gıdada meydana getirdiği değiĢimin, Gram negatif bakterilere göre daha yavaĢ olduğu bilinmektedir. Bu nedenle bozulma daha geç meydana gelmektedir (Johansson ve ark. 2011). LAB suĢları farklı koĢullar altında biyofilm tabakası oluĢturabilmektedirler. Biyofilm tabakası, ekstraselüler matriks içinde gömülü halde bulunan ve canlı/ canlı olmayan yüzeylere tutunma özelliği gösteren mikroorganizmaların oluĢturduğu koloniler olarak bilinmektedir. Yüzeye tutunan mikroorganizma sayısı zamanla artmakta ve hücreler 2 daha güçlü Ģekilde bağlanmaktadır. Hücre sayısının artması ile oluĢturdukları biyofilm tabakası da kalınlaĢmaktadır. KalınlaĢan biyofilm tabakası yüzeylere daha sıkı bağlandığından, olgun bir tabakanın ortamdan uzaklaĢtırılması da zorlaĢmaktadır. Biyofilm tabakasında mikroorganizmalar, metabolitleri ve mikroorganizmalar tarafından üretilen EPS matriks bulunmaktadır. LAB-EPS iliĢkisinin biyofilm oluĢumu ve yüzeylere tutunmada kilit noktası olduğu bilinmektedir. EPS üretimi ve biyofilm oluĢumu sayesinde farklı yüzeylerde mikrobiyel kolonizasyon gerçekleĢebilmektedir (Johansson ve ark. 2011). Biyofilm oluĢumu genellikle patojenite ile iliĢkilendirilmekte olup, patojen mikroorganizmaların özellikle antibiyotik dirençlerinin biyofilm oluĢumu ile doğrudan alakalı olduğu bilinmektedir. Bu nedenle özellikle klinik öneme sahip patojen mikroorganizmaların kontrolünde, biyofilm oluĢumunun engellenmesi amaçlanmaktadır. Ancak biyofilm oluĢumu gıda endüstrisi açısından öneme sahip farklı mikroorganizma gruplarında da gözlenmekte olup, özellikle starter olarak kullanılan LAB kültürlerinden biyofilm oluĢturma yeteneğine sahip olanların, olumsuz çevre koĢullarına daha dirençli olabilecekleri düĢünülmektedir. Bu durum göz önüne alınarak, tez kapsamında farklı gıda örnekleri toplanarak, uygun koĢullarda laboratuvar ortamına getirilmiĢ ve olası laktik asit bakterileri izole edilerek saflaĢtırılmıĢtır. Saf kültürler biyokimyasal ve moleküler yöntemler ile tanılanmıĢtır. Ġzole edilerek tanılanan LAB suĢlarının biyofilm oluĢturabilme özellikleri ve antibiyotik dirençlilikleri incelenmiĢ olup, biyofilm oluĢumunun antibiyotik direnci üzerine etkileri belirlenmeye çalıĢılmıĢtır. 3 2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Laktik Asit Bakterilerinin Genel Özellikleri Laktik asit bakterileri heksozları fermente ederek laktat oluĢturmaktadır. LAB üyelerinin tamamı Gram pozitif, katalaz negatif, çubuk ya da kok Ģekilli, genellikle spor oluĢturmayan ve büyük çoğunluğu hareketsiz olan bakteriler olarak bilinmektedir (Tunail 2009, Yerlikaya 2014). Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Weissella cinslerine ait türler LAB üyeleri arasında yer almaktadır. Ayrıca, filogenetik olarak LAB grubuna bağlı olmasa da Bifidobacterium, Propionibacterium ve Brevibacterium türleri de gıda endüstrisinde kullanılmaktadır. Çünkü genellikle LAB suĢlarına benzer özellikler göstermekte ve benzer metabolitler üretmektedirler. Gıdalarda kullanılmaları da güvenilir olarak kabul edilmekte ve özellikle probiyotik özellik gösteren türleri fonksiyonel gıdalarda sıklıkla kullanılmaktadır (Temmerman ve ark. 2004, Tunail 2009, Yerlikaya 2014). Laktik asit bakterilerinin filogenetik grupları ġekil 2.1‟ de verilmiĢtir. Laktik asit bakterileri, karbonhidratları metabolize etme Ģekillerine göre homo- ve hetero-fermentatif olmak üzere iki gruba ayrılmaktadırlar. Pediococcus spp., Lactococcus spp. gibi homo-fermentatif LAB, karbonhidrat kaynaklarını fermentasyon sonucunda %90 oranında laktik aside dönüĢtürebilmektedir. Weissella ve Leuconostoc gibi hetero-fermentatif LAB ise karbon kaynaklarının en fazla %50‟ sini laktik aside dönüĢtürülebilmektedir. Hetero-fermentatif LAB tarafından gerçekleĢtirilen fermentasyon sonucunda laktik asit dıĢında CO2, formik ve asetik asit gibi bazı organik asitler, ayrıca etanol üretimi söz konusu olmaktadır (Tunail 2009, Evren ve ark. 2011, Kocková ve ark. 2011, Stoyanova ve ark. 2012, Saranraj ve ark. 2013, Tokatlı 2013, Sun ve ark. 2014). 4 LAB türlerinin genellikle anaerobik koĢullarda fermentasyon yolu ile enerjilerini sağladıkları bilinmekte olup, genetik yapıları farklı olan bazı türlerin ise aerobik koĢullarda daha iyi geliĢebildiği belirtilmektedir (Valenzuela ve ark. 2015). Şekil 2.1. LAB üyelerinin filogenetik olarak gruplandırılması (Stiles ve Holzapfel 1997) Özellikle O2‟li ortamda geliĢebilen LAB suĢlarının fermente gıdalarda aroma geliĢimi ve K2 vitamini üretiminde daha etkili ve verimli oldukları bildirilmektedir (Valenzuela ve ark. 2015). K2 vitamini eksikliği, yeni doğanlarda hemorajik hastalıklara ve kemiklerde kırılganlığı artıran osteoporoz gibi bazı rahatsızlıklara neden olmaktadır. Bu 5 nedenle K2 vitamini üreten LAB suĢlarının gıdalarda kullanılması insan sağlığını olumlu yönde etkilemektedir (Patel ve ark. 2013). 2.1.1. Lactococcus Laktokoklar; homofermentatif, mikroaerofilik, Gram pozitif bakteriler olarak bilinmekte olup, 10ºC‟ de geliĢebilirlerken, 45ºC‟ de geliĢim gösterememektedirler. Çift ya da zincir Ģeklinde kok hücre morfolojisine sahip oldukları için, hücre yapıları bakımından Streptococcus ve Enterococcus cinsine ait türlere de benzerlik göstermektedirler. Lactococcus cinsine ait türler, geliĢme sıcaklıklarının farklılığından yararlanılarak, Streptococcus ve Enterococcus cinslerinden ayrılabilmektedir (Samaržija ve ark. 2001, Tokatlı 2013). Lactococcus cinsine ait en önemli türlerden biri olan L. lactis, gıda sanayiinde sıklıkla kullanılan, çiğ süt ve süt ürünlerinde rastlanılan LAB türlerinden biri olarak bilinmekte olup, bitkisel gıdalardan da izole edilebildiği bildirilmektedir (Demir 2014, Kim ve Lee 2016, Khemariya ve ark. 2017). Gıda endüstrisinde ticari öneme sahip starterlerden biri olup, fermente süt ürünlerinde kullanım alanı bulmakta ve bazı patojenlere karĢı inhibisyon etkisi bulunmaktadır (Kim ve Lee 2016, Khemariya ve ark. 2017). 2.1.2. Leuconostoc Gram pozitif, heterofermentatif ve EPS (dekstran, levan) üretme yeteneği ile ön plana çıkan Leuconostoc cinsine ait türler genellikle Ģeker üretim hatlarında oluĢturdukları Ģlam yapısı ile bağdaĢtırılmaktadır (Dimic 2006). Leuconostoc spp. hücrelerinin kok Ģeklinde ve hareketsiz bir morfolojiye sahip olduğu bilinmektedir. Ayrıca genellikle çift halinde ya da zincir halinde oldukları bildirilmektedir (Tokatlı 2013). Leuconostoc spp. daha çok bitkisel ürünler, sebze-meyve yüzeylerinden izole edilebilmekte ve ayrıca süt ürünlerinde de reolojik ve aromatik özelliklerin kazandırılmasında starter olarak kullanım alanı bulmaktadır. Karbonhidratları fermente ederek, laktik asit yanında CO2, etanol, laktat, asetaldehit gibi ürünler de oluĢturmaktadır. Ayrıca süt ürünlerinde aroma 6 maddesi olarak kullanılan diasetil üretme yeteneği ile de gıda sanayiinde geniĢ kullanım alanı bulmaktadır. Özel olarak üretilen peynirlerde büyük gözenekli yapının oluĢmasında Leuconostoc türlerinin kullanıldığı bilinmektedir. EPS üretimi ile gıdalarda koruyucu özellik göstermekte olup, ayrıca oligosakkarit, mannitol, bakteriyosin ve bazı vitaminleri de sentezleyebildiği belirtilmektedir (Cardamone ve ark. 2011, Shin ve Han 2015). Leuconostoc cinsine ait türlerin streptomisine direnç gösterebildiği, ancak penisilin, ampisilin gibi β-laktam grubu antibiyotiklere karĢı duyarlı oldukları bildirilmektedir (Flórez ve ark. 2016). 2.1.3. Lactobacillus Lactobacillus cinsine ait türler LAB grupları arasında en çok çeĢitlilik gösteren grup olarak yer almakta ve sekizden fazla tür içermektedir. Homo- ve hetero-fermentatif türlerin bulunduğu bu geniĢ grupta, morfolojik yapılar da farklılık ve çeĢitlilik göstermektedir. Hücre morfolojisi uzun ya da kısa çubuk Ģeklinde tanımlanmakta olup, bazı türleri kokoid-kokobasil hücre yapısına sahip olabilmekte ve bazı türlerinin ise oldukça ince bir hücre yapısına sahip olduğu gözlemlenmektedir. Lactobacillus grubunda bulunan türlerin spor oluĢturmadıkları, Gram pozitif oldukları, katalaz enzimlerinin bulunmadığı bilinmektedir. Lactobacillus cinsine ait türler proteolitik ve lipolitik özellik gösteremediklerinden, geliĢmeleri için bulundukları ortamda özellikle peptit, aminoasit, bazı vitaminler ve yağ asitlerine ihtiyaç duymaktadırlar (Ahi 2011, Tokatlı 2013). Lactobacillus spp. meyve-sebze ve bitkisel ürünlerden, süt ve ürünlerinden, fermente gıdalardan yaygın olarak izole edilmektedir. Bazı türlerinin güçlü düzeyde biyofilm oluĢturabildiği, EPS üretim yeteneğinin olduğu ve streptomisin, vankomisin gibi bazı antibiyotiklere direnç gösterebildikleri belirtilmektedir (Jalilsood ve ark. 2015, Jose ve ark. 2015, Salas-Jara ve ark. 2016). 7 2.1.4. Weissella Ġlk olarak 1993 yılında ayrı bir grup olması önerilen Weissella cinsine ait türlerin Gram pozitif, katalaz negatif, spor oluĢturmayan, hareketsiz (W. beninensis hariç), sitokrom oksidaz enzimine sahip olmayan türler olduğu bilinmektedir (Fessard ve Remize 2017). Kısa çubuk ya da kokoid Ģeklinde hücre yapıları olan ikili ya da kısa zincirler Ģeklinde gözlemlenen Weissella spp.‟nin günümüze kadar 19 türü tanımlanmıĢ hepsinin heterofermentatif oldukları, laktik asit, etanol, CO2 ve asetat üretebildikleri rapor edilmiĢtir (Srionnual ve ark. 2007, Goh ve Philip 2015, Li ve ark. 2017, Deatraksa ve ark. 2018). Fakültatif anaerob olan Weissella cinsine ait türler genel olarak 15-37ºC‟ de geliĢmekte olup, W. cibaria ve W. confusa türlerine ait bazı suĢların 45ºC‟ de de geliĢebildiği bildirilmektedir. Morfolojik inceleme yapıldığında Leuconostoc spp. ile karıĢtırılabilmektedir. Ayrıca biyokimyasal testler uygulandığında da diğer LAB üyelerinden ayrımı konusunda hatalı sonuçlar elde edilebilmekte olup, Weissella cinsinin tanısında mutlaka moleküler yöntemlerin kullanılması gerektiği bildirilmektedir (Fessard ve Remize 2017). Genellikle prebiyotik olarak ya da baĢka amaçlar için kullanılmak üzere EPS üretiminde Weissella türlerinden sıklıkla yararlanılmaktadır. Bazı türlerinin de probiyotik olduğu belirtilmektedir. Bakteriyosin benzeri bileĢenler ve folat ürettiği belirlenen bazı Weissella türlerinin de olduğu önceki çalıĢmalarda belirtilmektedir (Srionnual ve ark. 2007, Goh ve Philip 2015, Li ve ark. 2017, Deatraksa ve ark. 2018). Weissella spp. fermente gıdalardan, iĢlenmemiĢ sebze-meyvelerden, süt ve çeĢitli peynirlerden izole edilebilmektedir. W. cibaria‟ nın bazı Lactobacillus spp. türlerinden çok daha fazla EPS (glukan ve dekstran) üretebildiği rapor edilmiĢtir. Ayrıca W. cibaria suĢlarının vankomisin, streptomisin, penisilin, gentamisin gibi birçok antibiyotiğe karĢı dirençli oldukları ancak, ampisilin, tetrasiklin, eritromisine karĢı duyarlı oldukları bildirilmektedir (Fessard ve Remize 2017). 8 2.1.5. Enterococcus Enterococcus cinsi, ikili ya da kısa zincir halinde bulunan fakültatif anaerob, kok ya da kokoid morfolojiye sahip bakteriler olarak bilinmektedir. LAB üyeleri arasında yer alan enterokokların gıdaların tat, aroma ve sertlik-yumuĢaklık gibi reolojik özelliklerinin oluĢmasında etkili oldukları belirtilmektedir (Ahi 2011). Enterococcus cinsinin optimum geliĢme sıcaklığı 37ºC olarak belirtilmektedir. Bazı türleri vankomisine direnç gösterirken, bazılarının ise duyarlı oldukları belirtilmektedir. Çiğ süt ve süt ürünlerinden izole edilen bazı Enterococcus türlerinin ise eritromisin ve tetrasikline karĢı dirençli oldukları belirlenmiĢtir (Lukasova ve Sustackova 2003). Morfolojik incelemelerde Streptococcus ile ayırt edilmesi mümkün olamamakta ve tür bazında tanılanmaları için 16S rRNA dizi analizine ihtiyaç duyulmaktadır (Demir 2014). E. feacalis ve E. faecium türlerinin biyofilm oluĢturabildikleri bildirilmekte olup (Mohamed ve Huang 2007), sütten izole edilen ve biyofilm oluĢturan Enterococcus spp. türlerinin çiğ sütte yoğun olarak gözlemlendiği, ancak sütün iĢlenmesi ile elde edilen peynir çeĢitlerinde daha az rastlandığı bildirilmektedir (Necidova ve ark. 2009). 2.2. Laktik Asit Bakterilerinin Önemi ve Kullanım Alanları Gıdaların saklanmasında kullanılan önemli yöntemlerden biri fermentasyon olup, çiğ gıdada doğal olarak bulunan mikrobiyotanın aktivitesi ile gerçekleĢmekte ve bu sayede ürünün kendine özgü duyusal özellikleri ön plana çıkmaktadır. Ayrıca doğal olarak gerçekleĢen fermentasyon ile gıda güvenliği de sağlanmaktadır. Eski çağlardan beri gıdaların korunması amacı ile kullanılan bir yöntem olan fermentasyon sayesinde düĢük pH ve su aktivitesi gibi olumsuz koĢullara dayanıklılık gösteren LAB suĢlarının ortamda rekabetleri sonucunda, patojen ve/veya bozucu mikroorganizmalar ile gıdanın bulaĢması engellenmekte ve son ürünün raf ömrü uzamaktadır. Lactobacillus sakei, L. curvatus ve L. plantarum türleri süt ve ürünlerinden sıklıkla izole edilebilmektedir. Fermentasyon sonucunda meydana gelen CO2, hidrojen peroksit (H2O2), bakteriyosin gibi metabolitlerin de son ürünün güvenliğinde ve bozulmadan depolanabilmesinde etkili olduğu belirtilmektedir (Quijada ve ark. 2018). Farklı ürünlerden izole edilen L. sakei 9 ve L. curvatus türlerinin fermentasyon süresince sakasin ve kurvasin A gibi bakteriyosinler üreterek, patojen mikroorganizmaları inhibe edebildiği rapor edilmiĢtir (Cebirbay 2014, Palamutoğlu ve Kasnak 2014). Çiğ sütün LAB suĢları ile doğal fermentasyonu sonucunda elde edilen Ġran‟ a özgü geleneksel bir peynir çeĢidi olan Lighvan peynirinin tüketiminden sonra gıda kaynaklı bir enfeksiyona rastlanmamaktadır. LAB suĢlarının çiğ süt içinde geliĢerek hâkim mikrobiyota haline geldiği ve ortamdaki patojen mikroorganizmaları tamamen inhibe edebildiği düĢünülmektedir (Attar ve ark. 2018). Süt ürünleri probiyotik LAB suĢları için uygun bir ortam oluĢturmaktadır. Probiyotik süt ürünlerinin yanında ülkemizde ve dünyada sebze bazlı fermente ürünlerin de sıklıkla tüketildiği bilinmektedir. Bazı durumlarda süt proteinlerine karĢı alerji ya da kolesterol problemi olanlar için fermente süt ürünleri sınırlayıcı etken olabilmektedir. Hem süt ürünlerinde hem de bitkisel fermente gıdalarda ve ham meyve-sebzelerde LAB üyelerinin doğal olarak bulunduğu bilinmektedir. TurĢu üretiminde ve farklı sebzelerden fermente içecek üretiminde de LAB suĢlarından faydalanılmaktadır. Ayrıca Türkiye‟ deki hıyar turĢularından farklı olarak, Hindistan ve Nepal‟ de olgun hıyarların açık havada kurutulduktan sonra 3-5 gün süre ile L. plantarum ve Pediococcus pentosaceus türleri ile fermentasyona bırakılmasının ardından “khalpi” olarak adlandırılan geleneksel yiyeceğin tüketime sunulduğu bildirilmektedir (Panghal ve ark. 2018). Fermente süt ürünlerinde sıklıkla karĢılaĢılan LAB suĢlarının yanında çiğ sütlerin doğal biyotasında da L. lactis, L. plantarum, L. paracasei gibi LAB suĢlarının varlığı bilinmektedir (GüneĢ AltuntaĢ ve ark. 2010). LAB‟ nin GRAS olarak gıdalarda kullanılabilme nedenlerinin baĢında hücre yapıları ve özellikleri gelmektedir. LAB suĢlarında hücre duvarı yapısında bulunan polisakkaritlerin özellikle biyofilm tabakasının oluĢumunda, antimikrobiyel peptidlere karĢı direncin geliĢiminde, hücre morfolojisinin ve bakteriyofajların tanınmasında rol aldığı bilinmektedir. Hücre duvarı yapısında yer alan proteinlerin ise hem fonksiyonel, hem de yapısal özelliklerin kazanılmasında farklı rolleri olduğu bilinmektedir (Chapot- Chartier ve Kulakauskas 2014). 10 Laktik asit fermentasyonu birçok gıdada ekĢime ve bozulmaya neden olabilmektedir. Ancak fermentasyonun yoğurt, peynir, turĢu, sucuk ve salam çeĢitleri gibi birçok gıdanın üretiminde olması gerektiği bilinmektedir (Ertekin 2007, Tunail 2009, Evren ve ark. 2011). Ayrıca sofralık zeytin üretiminde ortama starter eklenmeden, ham zeytinin üzerinde bulunan doğal flora ile fermentasyon gerçekleĢtirilmektedir. Sofralık zeytinin fermentasyonunda, özellikle LAB türleri ile mayalar rol oynamaktadır. LAB suĢları salamurada pH‟ yı düĢüren en önemli faktör olup, bu sayede bozucu mikroorganizmaların inhibisyonu sağlanmaktadır (Hurtado ve ark. 2012, Bonatsou ve ark. 2017). Bazı gıdalarda arzu edilen, bazılarında ise istenmeyen sonuçlara neden olan LAB üyelerinden özellikle Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides gibi sakkarozdan yoğun Ģekilde dekstran üretebilen türlerin Ģekerleme fabrikalarında sorun oluĢturduğu bilinmektedir (Ertekin 2007, Tunail 2009, Evren ve ark. 2011). LAB, özellikle zengin besin içeriğine sahip olan gıdalarda Ģlam oluĢturabilmektedir, bu nedenle bozulma olan gıdalarda yapıĢkan Ģlam yapısı da gözlemlenebilmektedir. Ayrıca, LAB üyeleri, gıdaların doğal renk, aroma ve görünüĢünü de değiĢtirebilmektedir (Johansson ve ark. 2011). Bazı Lactobacillus acetotolerans ve L. fructivorans suĢlarının yüksek konsantrasyondaki asetik asite karĢı dayanıklı oldukları bilinmektedir. Özellikle sirke prosesinde Lactobacillus spp.‟ nin ortamda canlı kalabilme ihtimalleri, son üründe bozulma riskini de beraberinde getirmektedir (Kubota ve ark. 2008). Ayrıca laktik asit bakterilerinden L. plantarum da biyofilm oluĢturabilen türlerden biri olup, asit ve etanole karĢı direnç göstermektedir. Bu nedenle özellikle lahana turĢusu gibi asitli gıdalarda gözlenen tipik bozulma nedeni olarak ön plana çıkmaktadır. L. plantarum suĢu kırmızı Ģaraplardan da izole edilmiĢ ve düĢük pH değerlerinde (3,2-3,6) bile canlılığını koruyabildiği ve geliĢebildiği belirlenmiĢtir (Kubota ve ark. 2009). Gıdalarda kullanılan LAB suĢlarının ortam asitliğini hızla artırabilme, proteolitik etki, tuz toleransı, fajlara karĢı direnç gibi gıda endüstrisinde istenilen özelliklere sahip olduğu bilinmektedir (Ho ve ark. 2018). Ayrıca LAB kültürlerinin fermentasyonu ile 11 meydana gelen metabolitlerin, fırıncılık ürünlerinin de raf ömrünü uzattığı belirtilmektedir (Minervini ve ark. 2018). Fermente bir ürün olan Kimchi, Kore‟ ye özgü geleneksel sebze yemeği olarak bilinmektedir. Jeong ve Lee‟ nin (2015) yaptıkları bir çalıĢmada Kimchi‟ den izole ederek, tanıladıkları Weissella ve Leuconostoc cinslerine ait farklı türlerin antibiyotik dirençliliklerini araĢtırmıĢ ve tüm suĢların ampisilin, kloramfenikol, eritromisin ve tetrasikline duyarlı olduğunu belirlemiĢlerdir. SuĢların penisiline karĢı da duyarlı olduklarını, ancak Weissella türlerinin Leuconostoc türlerinden iki kat daha fazla penisilin konsantrasyonunda inhibe olabildiklerini gözlemlemiĢlerdir. Weissella suĢlarında gözlemlenen antibiyotik direncinin ise sonradan kazanılmıĢ bir direnç olmadığını belirtmektedirler. Ayrıca Kim ve Kim (2014), Jimenez ve ark. 2018 ve Maksimovic ve ark. (2018) ise yaptıkları çalıĢmalarda, “kimchi” ve Peru‟ ya özgü “tocosh” isimli geleneksel fermente patatesten izole ettikleri LAB suĢlarının folat, riboflavin ve tiramin gibi insan sağlığı için gerekli ve önemli olan, enzimatik aktivitelerde kofaktör görevini üstlenen vitaminleri de üretebildiğini belirlemiĢlerdir. LAB suĢlarının insan sağlığını olumlu yönde etkileyen metabolitler (EPS, biyofilm, vitaminler, antimikrobiyel bileĢenler vb.) üretmesi, onları ilaç ve gıda sektöründe de önemli hale getirmektedir. Ayrıca endüstriyel proseslerde LAB üyelerinin ortamda biriken metabolitleri sayesinde gıda güvenliği de sağlanmaktadır. Fonksiyonel fermente gıda üretiminde de LAB suĢlarının metabolitleri yeni ürünlerin geliĢtirilmesinde önemli bileĢenler olarak bilinmektedir (Yüksekdağ ve Zeydanlı 2013, Deatraksa ve ark. 2018). Fermente gıdaların üretilmesinde LAB suĢları arasından özellikleri bilinen, doğal antibiyotik direnci olanların seçilmesi ve starter olarak kullanılması gerektiği bilinmektedir. Antibiyotik direnci olan bakterilerin, duyarlı türlere göre insan sindirim sisteminde daha kolay kolonize olabildikleri, yetersiz koĢullar altında daha uzun süre canlılıklarını koruyabildikleri ve daha dirençli oldukları bilinmektedir. Ayrıca antibiyotik direncin patojen mikroorganizmalara aktarılamaması da istenilen özelliklerden biridir. Bu özelliklere sahip olan suĢlarda bakteriyosin üretiminin de olması, direnç mekanizmasını güçlendirmektedir. Jeong ve Lee (2015) yaptıkları 12 çalıĢmada fermente gıdalardan izole ettikleri Leuconostoc ve Weissella türlerinde bakteriyosin üretiminin olduğunu rapor etmiĢlerdir. Bazı gıdalarda bulunan LAB suĢları Çizelge 2.1‟de verilmiĢtir. Çizelge 2.1. Bazı gıda örneklerinden izole edilen LAB suĢları Gıda örneği LAB türü Referans Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Korukluoğlu ve ark. ĠĢlenmemiĢ Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis, 2002, Tokatlı ve ark. zeytin Leuconostoc lactis, Leuconostoc garlicum, Weissella 2012 spp., Leuconostoc citreum Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, KarakuĢ 1994, Durlu- Lactobacillus plantarum, Weissella cibaris, Özkaya ve ark. 2001, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Coeuret ve ark. 2003, Lactobacillus graminis, Lactobacillus pentosus, ĠĢleroğlu ve ark. 2008, Lactobacillus curvatus, Evren ve ark. 2011, Peynir Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, ġimĢek ve ark. 2014, Pediococcus acidilactici, Ertürkmen ve Öner Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, 2015, Singh ve ark. Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus 2015, Akoğlu ve ark. rhamnosus 2017 Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Delavenne ve ark. Enterococcus faecalis, Pediococcus spp. 2012, Singh ve ark. Çiğ süt Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus 2015, Doğan ve rhamnosus Özpınar 2017 Evren ve ark. 2011, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc Leite ve ark. 2015, mesenteroides, Lactococcus lactis, Lactobacillus Kefir Doğan ve Özpınar kefiranofaciens, Lactobacillus kefiranofaciens, L. 2017, Jeong ve ark. delbrueckii, L.rhamnousus, L. casei, L. paracasei 2017 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus pentosus, Lactococcus lactis subsp. Azadnia ve Khan- cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. Nazer 2009, Evren ve cremoris, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus Yoğurt ark. 2011, brevis, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc Alexandraki ve ark. mesenteroides subsp. cremoris, Streptococcus 2017 salivarius ssp. thermophilus, Enterococcus faecium, Enterococcus durans Lactobacillus brevis, L. parabrevis, Lactobacillus Ġç ve Özçelik 1995, plantarum, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus Evren ve ark. 2011, namurensis, Lactobacillus diolivorans, Pediococcus Bağder-Elmacı ve ark. TurĢu parvulus, Pediococcus ethanolidurans, Pediococcus 2015, Tokatlı ve ark. cerevisiae, Enterococcus casseliflavus, 2015, Tokatlı ve ark. Enterococcus faecalis, Leuconostoc mesenteroides, 2017 13 Vakevainen ve ark. (2018)‟ ları yaptıkları çalıĢmada Meksika‟ ya özgü fermente bir mısır ürünü olan “atole agrio”dan izole ettikleri LAB suĢlarının özelliklerini incelemiĢler ve suĢların EPS üretebildiklerini belirlemiĢlerdir. SuĢların EPS üretimi, %2 glikoz, laktoz, maltoz, rafinoz ya da sakkaroz içeren MRS Agar üzerinde her bir kültürün geliĢtirilmesi ile belirlenmiĢtir. GeliĢme sonucunda rop oluĢturan koloniler EPS üretebilen kültürler olarak iĢaretlenmiĢtir. L. plantarum Q8212 suĢu da pozitif kontrol olarak denemede kullanılmıĢtır. Bahsi geçen çalıĢmada L. plantarum ve P. pentosaceus suĢları, en çok EPS üretebilen suĢlar olarak belirlenmiĢtir. Probiyotik LAB suĢları üzerine yapılan bir baĢka çalıĢmada yeĢil lahanadan izole edilerek tanılanan L. plantarum, L. paraplantarum, L. brevis ve P. pentosaceus‟ un teknolojik özellikleri araĢtırılmıĢtır. Fermente yeĢil lahanadan izole edilen suĢlarının tamamının nalidiksik asite karĢı dirençli oldukları, çoğunluğunun da streptomisin ve kanamisine direnç gösterdikleri belirtilmektedir. Mikroorganizma kaynaklı hastalıkların tedavisinde antibiyotik kullanımı sonrasında bağırsak mukozasına tutunmuĢ halde bulunan probiyotik suĢların ortamda hâkim mikrobiyota halinde kalabilmesi için antibiyotiklere karĢı dirençli olmaları gerekmektedir. Bu nedenle antibiyotik dirençlilik, probiyotik mikroorganizmalarda aranan önemli özelliklerden biri olarak belirtilmektedir (Gotcheva ve ark. 2002). Bahsi geçen çalıĢmada tanılanan suĢlarda gözlemlenen antibiyotik dirençliliğin sonradan kazanılmıĢ bir özellik olmadığı bildirilmektedir. Ayrıca suĢların çoğunluğunun düĢük pH değerlerinde geliĢebildiği de belirlenmiĢtir. ÇalıĢmada bazı özellikleri belirlenen LAB suĢlarının potansiyel probiyotik bakteriler olabileceğine değinilmektedir (Michalak ve ark. 2018). Listeria monocytogenes, bazı gıdalarda rastlanan patojen bir bakteridir. Laktik asit bakterilerinden özellikle L. plantarum tarafından üretilen plantarisinin L. monocytogenes‟ i inhibe ettiği bilinmektedir. Bu nedenle plantarisin gıdalarda doğal koruyucu ajan olarak kullanılmaktadır. Antimikrobiyel bileĢenler, bakteriyosin vb. metabolitler üreterek ya da biyofilm oluĢturarak gıdaların raf ömrünü uzatan LAB suĢlarının, metabolit üretim yeteneklerinin ortam koĢullarına göre Ģekillendiği bilinmektedir. Engelhardt ve ark. (2018) tarafından yapılan bir çalıĢmada L. curvatus 14 ‟un bakteriyosin üretme hızının NaCl konsantrasyonu, pH ve sıcaklıktan etkilendiği gözlemlenmiĢtir. NaCl konsantrasyonu arttıkça ve sıcaklık düĢtükçe, L. plantarum suĢunun bakteriyosin üretme yeteneğinin de azaldığı sonucuna varılmıĢtır. LAB suĢlarının doğal koruyucu olarak kullanılabilme potansiyellerinin araĢtırılmasında, metabolitlerinin hangi koĢullarda daha yoğun üretildiği belirlenerek, o koĢullarda üretimi uygun olan gıdalarda kullanılmalarının etkili sonuç vereceği düĢünülmektedir. Son yıllarda starter olarak kullanılan LAB suĢlarının enkapsülasyonu ile ilgili çalıĢmalar da hız kazanmıĢtır. Çok eski çağlardan beri doğal fermentasyon yolu ile elde edilen gıdaların endüstriyel olarak üretilmeye baĢlanmasından sonra starter kavramı ön plana çıkmıĢ ve suĢların seçiminde de bazı kriterler önemli hale gelmiĢtir. LAB kültürlerinde ürünün hızla fermente olabilmesi için, fermentasyon gücü yüksek, farklı ortam koĢullarına dayanıklı, hızlı geliĢme özelliği bulunan suĢlar, starter olarak seçilmektedir. LAB suĢlarının fermentasyon sonucunda oluĢan metabolitlere genellikle dayanıklı olduğu bilinmektedir, ancak metabolit konsantrasyonu arttıkça, canlı hücre sayısında da azalma olması kaçınılmaz hale gelmektedir. Enkapsülasyon iĢlemi ile starterlerin dıĢ ortamdan etkilenme ihtimali düĢük seviyeye inmektedir (Kavitake ve ark. 2018, Prasanna ve Charalampopoulos 2018). Özellikle antibiyotik direnci olan, EPS ve biyofilm üretebilen LAB suĢlarının da dayanıklılıklarının artırılmasında enkapsülasyon uygulamalarının yararlı olabileceği düĢünülmektedir. Kullanılan enkapsülasyon materyalinin özellikleri sayesinde starterin korunabileceği ve duyusal özelliklerin de daha uzun süre saklanabileceği düĢünülmektedir (Kavaz-Yüksel ve ark. 2015, Pulaj ve ark. 2016, Schoina ve ark. 2018). Ġnkübasyon koĢulları, ortama salgılanan metabolitlerin çeĢit ve miktarını değiĢtirmekte olup, özellikle bazı fermentasyon koĢullarında LAB suĢları tarafından üretilen biyojenaminlerin birikebildiği ve insan sağlığını tehdit edebildiği belirlenmiĢtir. (Peñas ve ark. 2010, Xiong ve ark. 2014). Ġnsan sağlığına zarar verebilecek metabolitler yanında, takip edilmeyen fermentasyon koĢullarında arzu edilen miktardan daha fazla yapıĢkan madde (EPS vb.) üretimi sonucunda ürünün duyusal özelliklerinde de bozulmalar meydana gelebilmektedir. Süt ürünlerinde yapıĢkan (ropy) kültür olarak 15 bilinen EPS üreten LAB suĢlarının tercih edildiği bilinmektedir. Bu ürünlerde istenilen kıvamlı yapının elde edilmesi, EPS üretme yeteneği olan LAB suĢlarının kullanımı ile mümkün hale getirilebilmekte ve bu sayede kıvam artırıcı katkı maddelerinin kullanımı azaltılabilmektedir. Ayrıca EPS tabakasının doğal koruyuculuğu nedeni ile starterin uzun süre fermentasyonda kullanılabilmesi de mümkün olabilmektedir (Suyuçok ve ark. 2016). Ancak bazı fermente gıdalarda (fermente et ürünleri vb.) yapıĢkan EPS tabakasının yoğun olması ürünün duyusal özelliklerini de bozabilmektedir. Bu nedenle gıda üretiminde kullanılan LAB suĢlarının metabolit üretme koĢullarının belirlenmesi ve fermentasyonun takibi önemli birer üretim basamağı olarak bilinmektedir (Makela ve ark. 1992, Kröckel 2013). 2.3. Laktik Asit Bakterilerinin Tanılanması ve Uygulanan Yöntemler Gıdalardan izole edilen LAB üyeleri incelendiğinde genel olarak, Lactobacillus türleri süt, et, sebze ve tahıl ürünlerinden, Lactococcus türleri süt ve ürünlerinden, Leuconostoc türleri süt ve sebzelerden, Pediococcus türleri, et ve sebzelerden, Oenococcus türleri Ģaraplardan ve Enterococcus ve Streptococcus türleri ise süt ve ürünlerinden izole edilerek tanılanmıĢtır. LAB suĢlarının tanılanmasında fenotipik ve genotipik yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemler kültüre bağlı ve kültürden bağımsız teknikler olarak iki grup altında incelenmektedir (Temmerman ve ark. 2004, Paveljšek ve ark. 2014 Yerlikaya 2014). Günümüzde rutin mikrobiyolojik analizlerde uygulanabilen hızlı fenotipik tanılama yöntemleri bulunmasına rağmen, bu yöntemler genotipik yöntemler kadar hassas ve güvenilir sonuçlar vermemektedir (Donelli ve ark. 2013, Paveljšek ve ark. 2014). Moleküler yöntemler; gıdalar gibi karmaĢık ekosistemlerde bulunan mikroorganizmaların saptanması, tanılanması ve özelliklerinin belirlenmesi için kullanılan teknikleri kapsamaktadır. Özellikle gıda mikrobiyolojisi alanında son yıllarda kültüre bağlı olmayan tanılama yöntemleri dikkat çekmektedir. Kültüre bağlı ya da kültürden bağımsız yöntemler mikrobiyel DNA‟ nın doğrudan örnekten ya da kültür ortamında geliĢtirilen mikroorganizma kolonisinden alınıp alınmama durumuna göre 16 gruplandırılmaktadır. Geleneksel yöntemler ile mikroorganizmaları kültüre alma teknikleri göz önüne alındığında, karmaĢık bir mikrobiyotanın tamamının tanılanması mümkün olamamakta ve bu nedenle kültürden bağımsız tanılama teknikleri üzerine çalıĢmalar hızla devam etmektedir (Yerlikaya 2014). 2.3.1. Kültüre bağlı tanılama yöntemleri Mikroorganizmaların incelenmesinde eski tarihlerden beri uygulanan yöntemlere göre numunelerden izole edilen mikroorganizmaların laboratuvar ortamında geliĢmesine olanak sağlanmıĢ ve mikrobiyel geliĢme in vitro koĢullarda gerçekleĢtirilmiĢtir (Gürsoy ve Otlu 2017). Gıda endüstrisinde kullanılan LAB suĢlarının özelliklerinin bilinmesi gerekmektedir. Bu nedenle de suĢların tanılanmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Tanılamada kullanılan fenotipik yöntemler daha ekonomik olduğu için, genotipik yöntemlerden daha fazla tercih edilmektedir. Bu nedenle fenotipik tanılama iĢlemlerinde spesifik tanılama kitleri kullanılmaktadır. Kültürlerin genel olarak özellikleri fenotipik yöntemler ile belirlenebilse bile benzer fenotipe sahip olan suĢların DNA dizileri arasında farklılık olması durumunda birbirinden farklı davranıĢ sergileyebileceği de bilinmektedir. Farklı genotipe sahip olmalarına rağmen fenotipik yöntemler ile aynı tür olarak tespit edilen suĢların tanılama sonuçlarında hataların olabileceği genellikle gözden kaçmaktadır (Temmerman ve ark. 2004, Yerlikaya 2014, Fguiri ve ark. 2015). Fenotipik tanılama yöntemleri Özellikle, endüstride ve gıda mikrobiyolojisi laboratuvarlarında mikroorganizmaların tanılanmasında fenotipik testler rutin olarak kullanılmaya devam etmektedir. Bu yöntemler; mikroorganizmaların morfolojik ve fizyolojik karakteristiklerinin, farklı sıcaklıklarda geliĢme düzeylerinin, karbonhidrat metabolizması ve protein profillerinin belirlenmesi olarak bilinmektedir. Yapılan çalıĢmalar, fenotipik tanılama yöntemlerinin taksonomik ayırım gücünün sınırlı olduğu ve tekrarlanabilirliğinin düĢük olduğu gibi 17 önemli sonuçları ortaya çıkarmaktadır. Fenotipik yöntemlerin popüler olmasının nedeni ise spesifik bir cihaz ya da ekipman gerektirmemesine bağlanmaktadır (Temmerman ve ark. 2004, Yerlikaya 2014). Fenotipik yöntemler, kültüre bağlı teknikler olarak bilinmekte olup, hedef mikroorganzimanın kültüre alınabilir olması gerekliliği ön plandadır. Mikroorganizmaların kültüre alınması her zaman mümkün olamamakta ve bu nedenle sonuçlar bazen yanlıĢ yorumlanabilmektedir (Gürsoy ve Otlu 2017). Mikroorganizmaların fenotipik tanılanmasında spesifik test kitleri (API 50 CHL vb.), sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi (Temmerman ve ark. 2004, Donelli ve ark. 2013, Bağder-Elmacı ve ark. 2015), organik asitlerin ince tabaka kromatografisi ve yağ asiti metil ester (FAME) analizi (Temmerman ve ark. 2004, Donelli ve ark. 2013) ve bu analizlere ek olarak, gerekli görüldüğü durumlarda rastgele arttırılmıĢ polimorfik DNA-PZR (RAPD-PZR) tekniklerinin (Temmerman ve ark. 2004, Donelli ve ark. 2013, Bağder-Elmacı ve ark. 2015) kullanıldığı bilinmektedir. Fenotipik yöntemlerde alt türlerin birbirinden ayırımında bazı hatalı sonuçlar elde edilebilmekte olup, bu yöntemlerin özellikle laktobasiller ve bifidobakterilerin tanılanmasında yetersiz kaldığı belirtilmektedir (Donelli ve ark. 2013). Fenotipik yöntemlerde en doğru sonuca ulaĢabilmek için, birden fazla yöntemin kombinasyonunun kullanılması ve analizlerin tekrarlanabilirliğinin tespit edilmesi önerilmektedir (Temmerman ve ark. 2004, Bağder-Elmacı ve ark. 2015). Genotipik tanılama yöntemleri Birçok genotipik tanılama yöntemi, spesifik olarak hedef bir DNA parçasının amplifikasyonuna izin veren polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) prensibine dayanmaktadır. Teorik olarak PZR primerleri kontrollü reaksiyon koĢulları altında tüm türlere özgü olacak Ģekilde tasarlanabilmektedir. Ġlk primer tasarımı 1997 yılında 16S rRNA parçasının amplifikasyonunu sağlayacak Ģekilde gerçekleĢmiĢ ve tasarlanan primerin sadece bifidobakterilere özgü olduğu belirtilmiĢtir. Bu sayede gıda matriksinde 18 gene özgü tanılama iĢlemi bifidobakteriler için mümkün hale gelmiĢtir. Bifidobacterium adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve ve B. longum insan sindirim sisteminde sıkça rastlanan bakterilerdendir. Son zamanlarda LAB türlerine özgü primerler de tasarlanmakta ve faj bağlantılı primerler bu amaçla sıklıkla kullanılmaktadır (Matsuki ve ark. 2004, Temmerman ve ark. 2004, Ward ve Roy 2005). Genotipik yöntemlerde, numuneden yapılan ekimler sonucunda mikroorganizmaların in vitro koĢullarda besi ortamında geliĢmesi sağlanmakta ve koloni oluĢumu gözlemlenmektedir. Mikroorganizmalar, zenginleĢtirme besiyerlerinde geliĢtirilerek koloni oluĢumu desteklenebilmektedir. Mikroorganizmanın saf kolonisi elde edildikten sonra DNA izolasyonu ve uygun primerler kullanılarak PZR amplifikasyonu gerçekleĢtirilmektedir. PZR ürünleri saflaĢtırılarak sekans analizi yapılmakta ve dizi analizinde elde edilen elektroferogramlar değerlendirilerek, tanılama iĢlemi tamamlanmaktadır (Demirel 2012). Mikroorganizmanın cins ve türünün tahmin edilemediği durumda, türler arasında en iyi ayrımı sağlayan 16S ya da 23S rRNA sekanslama yapılması önerilmektedir. Dizi analizi ile elde edilen sekansın, önceden sekansı tanılanan ve veritabanında yer alan diziler ile karĢılaĢtırılması sonucunda yakın akrabalıklar tespit edilmekte ve türler arasındaki benzerlik oranları kontrol edilerek, mikroorganizmanın türü belirlenebilmektedir. Online veritabanları arasında en çok kullanılanlar, EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl/) ve Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) olarak bilinmektedir. Veritabanlarında bulunan ve test mikroorganizması ile uyumlu olan sekansların belirlenmesi için BLAST ya da FASTA gibi arama algoritmaları kullanılmaktadır. Bu tanılama yöntemi oldukça güvenilir olmasına rağmen, alt türlerin tanılanması, veritabanlarındaki taksonomik tür sayısı ile sınırlı kalmaktadır. Ayrıca operonlar arası baz diziliminden dolayı meydana gelen varyasyonlar da bazı tanılama hatalarına neden olabilmektedir (Temmerman ve ark. 2004). 19 2.3.2. Kültürden bağımsız tanılama yöntemleri Kültüre bağlı tanılama yöntemlerindeki yaklaĢımlar, kültürün bulunduğu ortama (gıda, toprak vb.) bağlı olarak tasarlanmıĢtır. GeçmiĢ yıllarda yapılan çalıĢmalarda kültüre bağlı yöntemlerin kullanılması sayesinde mikroorganizmalar hakkında önemli bilgiler elde edilebilmiĢtir. Ancak, kültürden bağımsız moleküler tanılama yöntemlerinin uygulanması sonucunda, özellikle kültüre alınamayan mikroorganizmaların özelliklerinin de belirlenebilmesi sağlanmıĢtır. Bu yöntemde DNA, doğrudan örnekten izole edilerek analiz edilmektedir (Gürsoy ve Otlu 2017). Toplam DNA ya da seçici PZR reaksiyonu sonunda meydana gelen PZR ürünleri (amplikonlar) ile gerçekleĢtirilen ayrım gücü yüksek, kültürden bağımsız teknikler bulunmaktadır. Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) (Temmerman ve ark. 2004, Claisse ve ark. 2007), darbeli alan jel elektroforezi (PFGE) (Çetinkaya ve Ayhan 2012, Munoz-Atienza ve ark. 2016), çoğaltılmıĢ parça uzunluk polimorfizmi (AFLP) (Temmerman ve ark. 2004, Demirel 2012), laktobasillere özgü spesifik primerlerin kullanılması ile ayrım hassasiyeti yüksek olan rastgele arttırılmıĢ polimorfik DNA yöntemi (RAPD) (Kılıç ve ark. 2003, Temmerman ve ark. 2004) ve floresan in stu hibridizasyonu (FISH) (Demirel 2012, Gürsoy ve Otlu 2017), bu yöntemler arasında yer almaktadır. Kültürden bağımsız tanılama yöntemleri ile mikroorganizmaların alt türleri de kolaylıkla belirlenmektedir. Yapılan çalıĢmalarda kültürden bağımsız teknikler ile tuf geninin tespiti ile yakın akraba olan 9 adet Lactobacillus alt türünün belirlenebildiği belirtilmektedir (Temmerman ve ark. 2004, Demirel 2012, Park ve ark. 2012). Ayrıca kültürden bağımsız denatüre gradyan jel elektroforezi (DGGE) yöntemi de bir örnekteki DNA parçalarının karĢılaĢtırılmasını sağlayan moleküler parmak-izi teknikleri olarak bilinmektedir (Temmerman ve ark. 2004, Claisse ve ark. 2007, Demirel 2012, Gürsoy ve Otlu 2017). LAB suĢlarında antimikrobiyel bileĢenlere direnç genlerinin de bu yöntemler ile tespit edilebildiği bildirilmektedir (Demiray ve Yılmaz 2005). Özellikle fenotipik tanılama yöntemlerinin yetersiz olması, araĢtırmacıları daha güvenilir sonuçlar elde edebilecekleri ve kesin bir taksonomik ayrımın anlaĢılmasına 20 olanak sağlayacak yaklaĢımlara yönlendirmiĢ ve dolayısı ile mikroorganizmaların DNA yapılarının detaylı olarak incelenmesi gerekliliği doğmuĢtur. Genotipik yöntemler de DNA dizilerinin ve genetik özelliklerin anlaĢılmasına yönelik teknikleri içermektedir. AraĢtırmalar sonucunda, uygulanan modern taksonomik yöntemlerin fenotipik ve genotipik yöntemleri birlikte kullanmaya teĢvik ettiği bilinmektedir (Tokatlı 2013). 2.4. Biyofilm Mikroorganizmaların çoğunluğu yüzeylere tutunma konusunda doğal bir yeteneğe sahiptir. Bir yüzey üzerinde tutunmuĢ halde bulunduklarında ortamdaki besin maddelerinden daha çok faydalanabilmekte ve daha hızlı geliĢerek sayılarını çoğaltabilmektedirler (Araújo ve ark. 2011, Kostaki ve ark. 2012, Fonteini 2015). Biyofilm, canlı/ cansız bir yüzeye geri dönüĢümlü ya da dönüĢümsüz olarak tutunmuĢ kendi ürettikleri ekstraselüler matriks tarafından çevrelenmiĢ ve salgıladıkları sinyal maddeleri ile birbiri ile haberleĢebilen mikroorganizma toplulukları olarak tanımlanmaktadır (Kam Hepdeniz ve Seçkin 2017, Ünal ve Tayfur 2017). Matriksi oluĢturan tabakanın, biyofilm katmanları içinde yer alan mikroorganizmalar tarafından üretilen ağ yapısı Ģeklinde jele benzer polisakkarit bir yapı olduğu bilinmektedir. Biyofilm tabakasının %97‟ sini su oluĢturmaktadır. Geri kalan kısımlarda ise mikroorganizmalar, EPS, proteinler, nükleik asit, lipit ve fosfolipitler yer almaktadır. Ortam koĢullarına, biyofilm tabakasında bulunan mikrobiyel biyotaya ve mikroorganizmaların tutundukları yüzey koĢullarına göre, biyofilm matriksi içinde bulunan bileĢenlerin yüzde oranları da değiĢebilmektedir (Gün ve Ekinci 2009, Abebe 2013, Ünal ve Tayfur 2017). Mikroorganizmalar tarafından biyofilm tabakasının oluĢturulma nedenleri aĢağıdaki gibidir (Jefferson 2004); 1. DıĢ faktörlerden korunmak, 2. Besin maddelerine eriĢebilme imkânını artırmak, 3. Diğer mikroorganizmalar ile iletiĢim halinde olarak, topluca hareket etmek 21 4. Diğer mikroorganizma grupları ile sinyal molekülleri ile haberleĢerek, ortam koĢullarına uygun olacak Ģekilde yeni ve farklı genetik özellik ve davranıĢ Ģekilleri sergileyebilmek Biyofilm oluĢturan mikroorganizmalar geliĢim evrelerine göre planktonik ve yerleĢik (sessile) olmak üzere iki gruba ayrılmaktadır. Planktonik hücrelerin bireysel olarak ve serbest halde yaĢadıkları, sessile hücrelerin ise bir yüzeye tutunarak mikrokoloni halinde yaĢamlarını devam ettirdikleri bilinmektedir. Mikroorganizmaların yüzeye tutunma aĢamaları zamana bağlı olarak değiĢmekte ve yüzeyde tutunmuĢ olan mikrokoloni ile salgıladıkları metabolitlerinin oluĢturduğu jele benzer matriks de zamanla kalın bir tabaka haline gelmektedir. Stres koĢullarında canlı kalabilme gibi bazı karakteristik özellikler, mikroorganizmalar arasında genetik olarak aktarılabilmektedir. Tutunulan yüzeyin yapısı ve mikroorganizmanın tutunma kabiliyeti, biyofilm oluĢumunda önemli olan temel iki faktör olarak bilinmektedir. Ayrıca ortam pH‟ sı ve sıcaklığının dıĢında mikroorganizmanın türü, hücre zarı ve duvarının yapısı, yüzeye tutunan hücre sayısı, mikroorganizmanın hareket kabiliyeti, ortamın iyon konsantrasyonu ve ortamdaki besin maddelerinin miktarı/ içeriği gibi birçok yan faktörün de biyofilm oluĢumunda rol aldığı belirtilmektedir (Gün ve Ekinci 2009, Akan ve Kınık 2014, Fonteini 2015). Biyofilm oluĢumunda birden fazla geliĢim aĢaması gözlemlenmektedir. Mikroorganizmaların biyofilm oluĢturabilme kabiliyetlerine göre ve biyofilm oluĢum aĢamasına bağlı olarak yüzeylere tutunmanın tersinir ya da tersinmez Ģekilde gerçekleĢtiği bilinmektedir. Bu durum da genetik faktörlere bağlı olarak değiĢkenlik gösterebilmektedir. Bu nedenle dayanıklı mikroorganizmaların canlılığını daha uzun süre devam ettirebilmek için EPS üreterek, yüzeylere geri dönüĢümsüz olarak tutunmaya çalıĢtıkları bilinmektedir (Araújo ve ark. 2011, Kostaki ve ark. 2012, Fonteini 2015). EPS üretiminin mikroorganizmaların kendi aralarında haberleĢmesini sağlayan sinyal üretimlerini tetiklediği bildirilmektedir. EPS salgısı hücrelerin dehidrasyona uğrama riskini azalttığı için, stres koĢullarına daha dayanıklı hale gelmelerini sağlamaktadır (Patel ve ark. 2014). EPS salgısı ile biyofilm tabakasının zamanla olgunlaĢtığı ve buradaki mikroorganizmaların, salgıladıkları sinyal molekülleri sayesinde etkileĢime geçtikleri bilinmektedir. Sinyal molekülleri ile 22 gerçekleĢen hücreler arası iletiĢim “Quorum sensing (QS)” olarak adlandırılmaktadır. QS mekanizması sayesinde planktonik haldeki mikroorganizma hücrelerinde gözlemlenmeyen bazı özelliklerin biyofilm tabakası içinde gözlemlendiği bildirilmektedir. Mikroorganizmaların yüzeylere tutunması ve zamanla daha güçlü bağlar ile tersinmez olarak bağlanması konusunda da QS mekanizmasının rol aldığı belirtilmektedir (Araújo ve ark. 2011, Patel ve ark. 2014, Fonteini 2015). Biyofilm oluĢum aĢamaları ġekil 2.2‟ de gösterilmektedir. Biyofilm oluĢumu beĢ aĢamada meydana gelmektedir. Ġlk aĢamada mikroorganizma hücreleri yüzeye hidrojen bağları gibi güçlü olmayan bağlar ile tersinir Ģekilde tutunmaktadır. Yüzeye tutunma zamanla daha güçlü bağlar ile gerçekleĢmekte ve mikroorganizma hücrelerinin yüzeye geri dönüĢümsüz olarak tutunması ile ikinci aĢama tamamlanmaktadır. Üçüncü aĢamada ise mikrokoloni oluĢumları meydana gelerek, EPS üretimi hızlanmakta ve biyofilm tabakası biraz kalınlaĢmaya baĢlamaktadır. Biyofilm tabakasının olgunlaĢması aĢamasında (dördüncü aĢama) QS mekanizmasının aktif olduğu ve hücre sayısının daha çok arttığı bilinmektedir. Bu sayede biyofilm tabakasında yer alan mikroorganizma hücreleri stres koĢullarına karĢı dayanıklı hale gelmektedir. OlgunlaĢma aĢamasını ise dağılma evresi (beĢinci aĢama) takip etmektedir. Biyofilm tabakasından ayrılan planktonik hücreler baĢka yüzeylere tutunarak, yeniden biyofilm oluĢum aĢamalarını devam ettirme eğilimde olmaktadırlar. Biyofilm geliĢim aĢamalarında gözlemlenen kopma veya ayrılma evresinde tek bir mikroorganizma hücresi ya da mikroorganizma kümesi biyofilm tabakasından koparak ortama yayılmaktadır. Bu ayrılma ve dağılma iĢlemi, dıĢ kuvvetlerin etkisi ile olabileceği gibi biyofilm oluĢum aĢamasının bir parçası olarak, tek ya da çoklu hücrelerin kopması sonucunda da gerçekleĢebilmektedir (Gün ve Ekinci 2009). ġekil 2.3„ te biyofilm aĢamalarının makroskobik ve mikroskobik görünümleri verilmiĢtir. 23 Şekil 2.2. Biyofilm oluĢum evreleri (YeĢilçimen-AkbaĢ 2015) Şekil 2.3. Biyofilm oluĢum aĢamalarının makroskobik Ģemaları (A ve C) ve elektron mikroskobu görüntüleri (B) (Ma ve Wood 2009) 24 2.4.1. Biyofilm oluşumunun dezavantajları ve engelleme yolları Biyofilm oluĢumu ilk olarak patojen mikroorganizmalarda tespit edilmiĢtir, bu nedenle biyofilm oluĢumu ile insan sağlığının olumsuz etkileneceği önyargısı oluĢmuĢ ve bilimsel araĢtırmalarda da genellikle biyofilm oluĢumunun engellenmesi üzerinde durulmuĢtur. Biyofilm yapısı ilk olarak 1980‟li yıllarda diĢ plaklarında gözlemlenmiĢtir (Donlan ve Costerton 2002, Bjarnsholt ve ark. 2013). Özellikle patojenler gibi insan sağlığını olumsuz etkileyen mikroorganizmaların bir yüzeye tutunup, geliĢmesi istenmemektedir. Ortamda hakim mikrobiyota halini aldığı zaman enfeksiyon riskleri ve salgınlar ortaya çıkabilmekte ve mikrokolonilerin biyofilm oluĢturması sonucunda da antimikrobiyel ajanlara karĢı direnç geliĢebilmektedir. Patojen mikroorganizmaların direnç geliĢtirmesi, onlarla mücadeleyi zorlaĢtırmaktadır. Bu nedenle özellikle klinik mikrobiyolojide hastalık etmeni olan mikroorganizmaların oluĢturduğu biyofilmin engellenmesi ile ilgili çalıĢmalar devam etmektedir (Annous ve ark. 2009, Gün ve Ekinci 2009). Yapılan bir çalıĢmada, bazı patojen bakterilerin planktonik formlarının geliĢme süreci takip edilmiĢtir. Planktonik formun durağan fazdaki antibiyotik dirençliliği ile biyofilm formlarının antibiyotik direçlilikleri aynı bulunmuĢtur. Mikroorganizmaların özellikle QS mekanizması ile haberleĢebilmeleri sonucunda ortam koĢullarına göre davranıĢ Ģekillerini değiĢtirdikleri belirlenmiĢtir. Biyofilm formunda olmasalar bile toplu halde bulunan hücrelerin durağan fazda, stres faktörlerine direnç gösterebilme eğilimlerinin de QS mekanizması ile alakalı olduğu düĢünülmektedir. Biyofilm oluĢturan mikroorganizmaların ortam koĢullarına hızlı adapte olabilme ve daha dirençli hale gelme özellikleri de QS mekanizmasını destekler nitelikte bulunmuĢtur (Spoering ve Lewis 2001, Vu ve ark. 2009). Biyofilm tabakası, mikroorganizmalar için koruyucu bir kalkan görevi görmektedir. Özellikle antimikrobiyel ajanlar ve dezenfektanlara karĢı, planktonik formlarına oranla 500 kat daha dayanıklı oldukları rapor edilmiĢtir. Bu konu ile ilgili yapılan bir 25 çalıĢmada, mikroorganizmaların biyofilm tabakasından ayrılarak, geliĢmeleri için uygun bir sıvı besiyerine aĢılanmaları durumunda, antimikrobiyel ajanlara duyarlı olan eski hallerine döndükleri de belirtilmektedir (Akan ve Kınık 2014, Diani ve ark. 2016). Tıbbi alanda sorun teĢkil eden biyofilm oluĢturabilen patojen mikroorganizmalar ile mücadele önemli bir araĢtırma konusudur. Özellikle gıda endüstrisinde de biyofilm oluĢumunun gıda güvenliği açısından önemli riskleri olduğu bilinmektedir. Özellikle süt iĢletmeleri, içme suyu dolum ve ĢiĢeleme fabrikaları, meyve-sebze iĢleme ve et iĢleme fabrikaları gibi gıda sektöründe bulunan iĢletmeler için en büyük risklerden biri, gıda hammadde ve son ürünün temas ettiği yüzeylere Bacillus cereus gibi özellikle sporlu patojen mikroorganizmaların bulaĢması ve ortamdan uzaklaĢtırılması konusunda yetersiz kalınmasıdır. Gıda kaynaklı patojen mikroorganizmalar insan sağlığını tehdit etmektedir. Bu nedenle gıda iĢletmelerinde alet-ekipman temizliği önem taĢımaktadır. Özellikle üretimin tamamen kapalı sistemler ile gerçekleĢtiği iĢletmelerde hijyen kontrolünün daha önemli olduğu bilinmektedir. Süt ve Ģekerleme fabrikalarında sıvı hammaddenin geçtiği boru sistemlerinin iç yüzeylerinin temizliği diğer ekipmanlara göre daha zor ve risklidir. Benzer Ģekilde gıda ile temas eden yüzeylerde hijyen eksikliği durumunda, besinsel yönden zengin olan kalıntı içerisinde çeĢitli mikroorganizma grupları geliĢme imkanı bulmakta ve gıda hatlarında çapraz kontaminasyonuna neden olmaktadır. Ayrıca mikroorganizmalar yüzeylerde geliĢmeye baĢladıkları andan itibaren zamanla biyofilm oluĢturan türler ortamda hâkim biyota haline gelebilmekte ve dolayısı ile EPS üretimi de hızlanmaktadır. Mikrokolonilerin yüzeylere güçlü kimyasal bağlar ile bağlanması sonucunda biyofilm tabakasının kalınlığı artmaya baĢlamaktadır. Boru iç yüzeylerinde biyofilm tabakasının kalınlaĢması ile korozyon meydana gelmektedir. Ayrıca sürtünme kuvvetinin artması ve boru iç hacminin de daralmasından dolayı sıvı geçiĢ hızı da düĢmektedir. Bu durumda ekonomik kayıp, üretim hızında düĢme ve kontaminasyondan dolayı ürün kaybı gibi hasarlar meydana gelebilmektedir (Garrett ve ark. 2008, Kiskó ve Szabó- Szabó 2011, Winkelstroter 2015). OlgunlaĢmıĢ biyofilm tabakasının yüzeylerden uzaklaĢtırılması zorlaĢtığı için, yeterli dezenfeksiyonun sağlanamama ihtimali doğmaktadır. Biyofilm oluĢumuna izin verilmeden etkili ve yeterli bir sanitasyon iĢlemi gerekliliği tüm gıda 26 fabrikaları için geçerlidir (Kumari ve Sarkar 2016). Gıda iĢletmelerinde yer alan sistemlerde boru cidarlarında farklı mikroorganizma gruplarının tutunması ile meydana gelen biyofilm tabakası ġekil 2.4‟ te Ģematize edilmiĢtir. Şekil 2.4. Gıda iĢletmelerinde kullanılan boru sistemlerinin içinde biyofilm tabakası oluĢumu (http://watter.nl/en/sustainable-disinfection/removing-biofilm/) Yapılan bir çalıĢmada et fabrikalarında temizlik ve dezenfeksiyon iĢlemlerini takiben gıda hatlarında bulunan konveyörlerden Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Listeria spp., Serratia spp. ve Staphylococcus spp. türlerinin izole edildiği belirlenmiĢ ve biyofilm oluĢturma koĢulları ile dezenfektanlara karĢı dirençleri araĢtırılmıĢtır. Denemede biyofilm oluĢturma kapasitesi en yüksek olan suĢların dezenfeksiyon iĢlemlerinden sonra bile ortamdan izole edilebilen bakteriler olan Pseudomonas, Acinetobacter ve Listeria cinslerine ait olduğu tespit edilmiĢtir. Bu durumun çapraz kontaminasyona neden olarak, tüketime hazır et ürünlerinde risk oluĢturacağı ifade edilmektedir (Fagerlund ve ark. 2017). Biyofilm oluĢumunun risk oluĢturduğu alanlardan biri de su arıtma tesisleridir. Tesislerde yapılan mikrobiyel kontrollerde özellikle Ģlam oluĢturan Pseudomonas ve bazı küf türlerinin izole edildiği belirtilmektedir. Biyofilm oluĢumunu engellemek için etkin dezenfeksiyon sistemlerinin bulunması gerekliliği vurgulanmaktadır (Rao ve ark. 2017). 27 Bir diğer gıda kaynaklı patojen bakteri türü olan Staphylococcus aureus ile yapılan bir çalıĢmada ise bakterinin ürettiği biyofilm geliĢimi üzerine bazı bitki esansiyel yağlarının etkileri incelenmiĢtir. Özellikle Cinnamomum cassia ve Salvia officinalis esansiyel yağlarının beraber kullanıldığı denemede 24 saatlik inkübasyon sonunda S. aureus geliĢiminin 3 log birimlik azaldığı ve biyofilm oluĢumunun da 90 dakikalık muamelenin ardından %68 oranında azaldığı belirlenmiĢtir (Campana ve ark. 2017). Tarçın ve limon esansiyel yağları ile yapılan bir baĢka çalıĢmada E. coli ve B. cereus suĢları arasında meydana gelen QS mekanizması engellenerek biyofilm oluĢumunun azaldığı anlaĢılmıĢtır (Kerekes ve ark. 2013). Biyofilm oluĢumunu engelleyici yeni doğal koruyucu ajanların tespit edilmesi gıda endüstrisi açısından çok önemlidir. Nostro ve ark. (2016)‟ nın yaptığı çalıĢmada Punica granatum L. ve Rhus coriaria L. bitki ekstraktlarının gıda kaynaklı patojenlerden olan Esherichia coli ve Pseudomonas aeruginosa tarafından oluĢturulan biyofilm tabakalarını sırası ile %25-40 ve %20-30 arasında azalttığı belirlenmiĢtir. Biyofilm oluĢumu 96-kuyucuklu plaka yöntemi ile belirlenmiĢtir. Yapılan bazı çalıĢmalar da ultrasonik ses dalgalarının P. aureginosa tarafından oluĢturulan biyofilm tabakasını parçalayabildiğini göstermektedir (Masak ve ark. 2014). Gıda kaynaklı hastalıkların ve kontaminasyonun engellenmesi açısından, gıda iĢletmelerinde ham madde giriĢinden son ürün çıkıĢına kadar gıda ile temas eden alet- ekipman ve konveyör sistemlerinin düzenli olarak dezenfekte edilmesi, ayrıca belirli aralıklarla dezenfeksiyon kontrollerinin yapılması çok önemlidir. Düzenli kontroller ile mikroorganizmaların biyofilm oluĢturmalarına izin verilmeden, hijyen sağlanabilmektedir. Mikroorganizmalar bir yüzeye tutunduktan sonra biyofilm oluĢumu genellikle 10 gün süre içerisinde gerçekleĢmektedir. Bu durumun engellenmesi açısından uygun antimikrobiyel ajanlar yardımı ile iĢletme içi hijyenin sağlanması önerilmektedir (Akan ve Kınık 2014). Özellikle geçtiğimiz yıllarda Avrupa ve Ġskandinav ülkelerinde görülen paketlenmiĢ taze yeĢilliklerden kaynaklanan salgınlar sonrasında Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) toplantılar düzenlemiĢ ve konu ile ilgili çalıĢmalara baĢlamıĢtır. Yapılan 28 araĢtırma sonuçlarına göre özellikle salata için hazırlanarak tüketime sunulan paketlenmiĢ ıspanak ve karıĢık yeĢillik ambalajlarında bitki özsularının biriktiği gözlenmiĢtir. Bu sızıntının özellikle Salmonella spp. geliĢmesi için uygun bir ortam yarattığı ve bakteri geliĢiminin denemedeki kontrol grubuna göre çok daha fazla olduğu belirtilmektedir. Enterobacter ve Salmonella gibi enterik patojenler, taze yeĢillik çeĢitlerinin bulunduğu ambalajlarda biriken sıvı ile geliĢme olanağı bulmakta ve biyofilm oluĢturmaktadır. Bu nedenle tüketime hazır yeĢilliklerin depolama ve transfer süreçlerinde mikrobiyel geliĢmeye ve biyofilm oluĢumuna uygun hale geldikleri bildirilmektedir. Taze olarak tüketilen yeĢillikler çok az iĢlem gördükleri için, patojenler ile kontamine olmaları da kaçınılmaz hale gelmektedir. Tüketime hazır yeĢilliklerin dekontaminasyonu amacı ile organik asit, hidrojen peroksit ya da klor uygulamaları yapılmıĢ ancak, sanitasyon uygulamalarının yeĢilliklerin tekstürel yapısını bozduğu anlaĢılmıĢtır. YeĢillik yapraklarında LAB suĢlarının kolonizasyonu sağlandığında ve bazı bakteriyofajların yapraklara uygulanması sonucunda enterik patojenlerin sayısının düĢtüğü ve biyofilm oluĢumunun azaldığı gözlemlenmiĢ, ancak tam inhibisyonun sağalanabileceği en uygun yöntem henüz belirlenememiĢtir (Koukkidis ve ark. 2017). 2.4.2. Biyofilm oluşumunun avantajları ve LAB suşlarında biyofilm oluşumu Biyofilm oluĢumu özellikle LAB suĢları gibi insan sağlığına faydalı mikroorganizmalarda gözlemlendiğinde, hücrelerin olumsuz ortam koĢullarına dirençli olmasını sağlamak için istenilen bir özellik haline gelebilmektedir. Birçok LAB suĢunun EPS üretebildiği bilinmektedir (Erginkaya ve ark. 2011, Salas-Jara ve ark. 2016). Ayrıca çoğu LAB türü probiyotik olarak gıdalarda kullanılmakta ve biyofilm üretme kabiliyetleri nedeni ile patojen mikroorganizmalarla yarıĢabilmektedir. LAB suĢlarının ürettiği biyofilm tabakasının patojen mikroorganizmalara karĢı koruyucu bir kalkan görevi gördüğü bildirilmektedir. Bu sayede özellikle et ve süt endüstrisinde biyofilm üretebilen LAB suĢlarının kullanımı ön plana çıkmaktadır. Yapılan çalıĢmalar, LAB suĢlarının antilisterial etkiye sahip olduklarını göstermektedir. Bu özelliğin de LAB suĢlarının biyofilm üretebilme yetenekleri ile doğrudan iliĢkili olduğu sonucuna varılmıĢtır. LAB suĢlarının ürettiği biyofilm tabakasının küfler üzerine de inhibe edici 29 etkilerinin olduğu bildirilmekte olup, doğal gıda koruyucusu olarak LAB biyofilmlerinin kullanım koĢulları üzerine çalıĢmalar devam etmektedir (Erginkaya ve ark. 2011, Furukawa 2015, Gómez ve ark. 2016, Cruciata ve ark. 2018). Biyofilm oluĢumunda QS mekanizmasının önemli role sahip olduğu bilinmektedir. Çoğunluk algılanması mekanizmasının patojen mikroorganizmalarda görülmesinin istenmeyen sonuçlar doğurduğu bilinmektedir. Ancak, gıda endüstrisinde kullanım alanı bulan insan sağlığına faydalı mikroorganizmalarda aktif QS mekanizmasının pozitif etkileri olabileceği bildirilmektedir. Yapılan bir çalıĢmada L. sakei suĢunun Al-2 sinyal molekülü ile diğer LAB suĢları arasında haberleĢme sağlayabildiği ve bu sinyal molekülünün ise E.coli O157:H7‟nin virülens etkisini inhibe edebildiği tespit edilmiĢtir (Park ve ark. 2014). Yun ve ark. (2014) tarafından yapılan bir baĢka çalıĢmada da LAB türleri arasında özellikle fermente süt ürünlerinden izole edilen L. acidophilus suĢunun salgıladığı sinyal molekülünün Clostridium difficale geliĢimini engellediği ve toksin üretimini de durdurduğu belirtilmektedir. Gıda sanayiinde özellikle Akdeniz ülkelerinde önemli bir kaynak olan zeytinin hasat edildikten sonra ön iĢlemlerden geçirilmesi gerekmektedir. Hasat sonrasında zeytine acı tat veren oleuropeinin meyveden uzaklaĢtırılması ve ürünün yenilebilir hale getirilmesi için bazı ön iĢlemler yapılmaktadır. Alkali oksidasyonu, salamurada bekletme gibi iĢlemler sayesinde sofralık zeytinler tüketime sunulmaktadır. Meyvenin olgunlaĢma aĢamasına bağlı olarak yağ, karbonhidrat ve oleuropein miktarlarının oranları değiĢkenlik gösterebilmektedir. Ön iĢlemler esnasında, meyvenin doğal florasında bulunan LAB ve bazı maya suĢları, zeytin ve salamuranın birleĢimi sayesinde uygun bir geliĢme ortamı bulmakta ve yeterli besin maddesi de salamuraya geçmektedir. Ortamda hakim duruma geçen LAB suĢları ve mayalar sayesinde fermentasyon gerçekleĢmekte ve zeytinin kendine özgü tat ve aroma kazanması sağlanmaktadır. Özellikle LAB suĢlarının zeytindeki mezokarp tabakasına tutunarak biyofilm oluĢturması sayesinde hasat sırasında ortamda bulunan patojen mikroorganizmalar, LAB suĢları ile 30 yarıĢamamakta ve fermentasyon esnasında da tamamen inhibe olmaktadır (Berlanga ve Guerrero 2016). Laktik asit bakterileri özellikle fermente gıdaların üretiminde kullanılan starter kültür olarak gıda endüstrisinde ön planda olup, metabolitlerinin doğal gıda koruyucuları oldukları bilinmektedir. Ayrıca patojenlerin gıda ürünlerinde geliĢip, insan sağlığını tehdit etme riskleri bulunması nedeni ile ortamda LAB suĢlarının da bulunması patojenlerin zararlı etkilerini azaltabilmekte ya da tamamen durdurabilmektedir. Biyofilm yapısı, mikroorganizmayı özellikle stres koĢullarına, olumsuz çevre Ģartlarına daha dayanıklı hale getirmektedir. Planktonik hücrelerin ise olumsuz koĢullardan daha kolay etkilendikleri bilinmektedir. Bu durumda LAB suĢlarının daha dirençli hale gelebilmeleri açısından biyofilm oluĢturabilmeleri, gıda sanayiinde istenilen bir özellik haline gelmektedir (Jalilsood ve ark. 2015, Salas-Jara ve ark. 2016). LAB suĢlarının ürettiği EPS‟ ler homo (HoPS) ve heteropolisakkaritler (HePS) olmak üzere iki gruba ayrılmaktadır. Her iki grubun da gıda endüstrisinde kullanım alanları bulunmaktadır. Bunlardan α-D-glukan, β-D-glukan ve β-D-fruktanlar HoPS‟ lerden bazıları olup, özellikle gıda endüstrisinde reolojik-tekstürel özelliklerin düzenlenmesi için hidrokolloidlerin yerine kullanılmaktadır. HoPS‟ ler ayrıca donmuĢ gıdaların stabilizasyonu amacı ile kullanılmaktadır. DonmuĢ et ve balık gibi ürünlerin ve ayrıca peynir çeĢitlerinin üzerinin HoPS‟ ler ile film Ģeklinde kaplanması sonucunda ürünler oksidasyon ve diğer kimyasal reaksiyonlardan korunmaktadır. Ksantan gibi biyopolimerler ise bakteriler tarafından üretilebilen ve kıvam artırıcı olarak gıdalarda kullanım alanı bulan HePS‟ lerden bazıları olarak bilinmektedir. Bu nedenle LAB suĢlarında EPS üretimi ve biyofilm oluĢumu, gıdaların endüstriyel olarak stabilizasyonunda da rol oynamaktadır. Aynı zamanda biyofilm üretebilen LAB suĢları bağırsak mukozasına tutunma ve kolonize olabilme özelliğine de sahip olabilmekte ve bu suĢlardan probiyotik gıda üretiminde de faydalanılabilmektedir (Sanlibaba ve Çakmak 2016, Bassi ve ark. 2017, Zarour ve ark. 2017). 31 Abdellah ve ark. (2015) yaptıkları çalıĢma sonuçlarına göre probiyotik olduğu bilinen bazı LAB suĢlarının biyofilm oluĢturma kabiliyetinin de olduğunu belirtmektedir. Ayrıca yaptıkları çalıĢmada deve sütünden izole edilen L. bulgaricus, S. thermophilus, E. feacium ve P. acidilactici suĢlarının biyofilm oluĢturma kinetiklerinin birbirleri ile aynı olduğunu, ancak ürettikleri EPS miktarlarının birbirlerinden farklılık gösterdiği rapor edilmiĢtir. Bu nedenle araĢtırma sonucunda, EPS üretimi ile biyofilm oluĢturma kapasitesi arasında bir korelasyonun tespit edilemediği belirtilmektedir. Gıda endüstrisinde, patojen mikroorganizmalar ile mücadelede ve gıdaların raf ömrünün uzatılabilmesi açısından doğal gıda koruyucuları olarak görev yapan LAB türlerinin biyofilm oluĢturabilen suĢları seçilerek, özellikle fermente gıdalarda starter olarak kullanımının uygun olabileceği düĢünülmektedir. Biyofilm oluĢturan türlerin, ortam koĢullarına daha hızlı adapte olabileceği ve aktif QS mekanizması sayesinde istenmeyen mikroorganizmaları daha kolay ve hızlı inhibe edebileceği ve bu sayede son ürünü daha uzun süre koruyabileceği düĢünülmektedir. Ayrıca biyofilm oluĢturma kabiliyetleri nedeni ile yüzeylere kolaylıkla tutunabildikleri bilinmektedir. Bu nedenle sindirim sistemi boyunca da hızlı kolonize olabilecekleri göz önünde bulundurulduğunda, probiyotik özellik gösterme potansiyellerinin de söz konusu olabileceği düĢünülmektedir. 2.5. Laktik Asit Bakterilerinde Antibiyotik Direnci Mikroorganizmaların endüstride güvenli olarak kullanılabilmeleri açısından her bir suĢun antibiyotik dirençliliklerinin araĢtırılması gerekmektedir. Antibiyotik direnç mekanizması; mikroorganizma türleri, antibiyotik cinsi, insan ve çevrenin etkileĢimi ile Ģekillenen karmaĢık bir olgudur. Mikroorganizmaların probiyotik özelliklerinin araĢtırılmasında antibiyotik direnci aranan bir özellik olmasına rağmen, patojen mikroorganizmalara genlerle aktarılabilme riskinin olduğu da bilinmektedir. Bu nedenle LAB suĢlarında doğal (fenotipik) ya da sonradan kazanılmıĢ antibiyotik direncinin göz önüne alınması gerekmektedir. Bağırsak mukozasında kolonizasyonun sağlanması açısından antibiyotik direnci probiyotik suĢlarda avantaj sağlayan bir özellik olarak 32 bilinmektedir. Bunun nedeni ise dirençli LAB suĢlarının antibiyotik varlığında bile patojenlerle yarıĢabilme gücüne sahip olması ve dolayısı ile mikrobiyotada dominant hale gelerek, ortamda hızla çoğalabilmesidir. Enfeksiyon tedavisinde kullanılan antibiyotikler, genellikle bağırsak mukozasında kolonize olmuĢ LAB suĢlarının inhibisyonuna neden olmakta ve bağırsak yüzeyi patojenlerin çoğalmasına uygun hale gelebilmektedir. Bu nedenle antibiyotik direnci LAB suĢlarından özellikle probiyotik olanlarda aranan bir özellik haline gelmiĢtir (Gerritsen ve ark. 2011, Gad ve ark. 2014) LAB türlerinde doğal (fenotipik) antibiyotik direncin kalıtsal karakterlerinden kaynaklandığı ve horizontal olarak bir baĢka bakteriye aktarılamadığı bilinmektedir. Antibiyotik ajanın hedef aldığı yapının mikroorganizmada bulunmaması ya da mikrobiyel hücrenin etken maddeden etkilenmemesi gibi nedenler ile doğal direnç oluĢumu gözlenmektedir. Bazı dirençli bakterilerde antibiyotiklerin bağlandığı hedef bölge değiĢime uğratılarak, bakterinin zarar görmesi engellenebilmektedir. Antibiyotikler genellikle bakteri yüzeyindeki protein bölgelere bağlanarak inhibisyon gerçekleĢtirmektedirler. Bazı direnç mekanizmalarında antibiyotiğin hedef metabolik yolunda değiĢim ve modifikasyon gerçekleĢerek, fenotipik direnç oluĢumu gözlemlenmekte ve bu sayede antibiyotiğin inhibisyon etkisi de yok edilebilmektedir. Ayrıca, antibiyotiğin bakteri yüzeyindeki geçirgenliği azaltılarak ya da aktif pompa özelliği ile antibiyotik bakteriden uzaklaĢtırılarak ve antibiyotik konsantrasyonu düĢürülerek bakterinin zarar görmesi engellenmektedir. (Meral ve Korukluoğlu 2014, Demirel ve Gürler 2016). Doğal direnç genlerinin varlığı özellikle LAB suĢlarında istenen bir özellik iken, sonradan kazanılmıĢ direnç risk teĢkil edebilmektedir. Doğal antibiyotik direnci, hem antibiyotik tedavilerinde LAB suĢlarının gastro intestinal sistemde inhibe olmadan geliĢmelerine izin vermekte, hem de patojen mikroorganizmalara genetik olarak aktarılamamaktadır. Ancak sonradan kazanılan direnç mekanizmaları, baĢka mikroorganizmalardan horizontal olarak gen aktarımı ile elde edilen bir özellik olarak bilinmektedir. Bakteri genom mutasyonunda veya direnç oluĢumunu kodlayan genlerin oluĢması durumunda kazanılmıĢ dirençten söz edilmektedir. Mikroorganizmalarda 33 horizontal gen aktarımı bakteriyofajlar ile ya da konjugasyon yolu ile meydana gelmektedir. Plazmidler LAB türleri arasından en çok Bifidobacteria, Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus ve Pediococcus cinslerine ait suĢlarda gözlemlenmektedir. Özellikle sindirim sisteminde LAB suĢları ile patojen bakteriler arasında gen aktarımının gerçekleĢebildiği bilinmektedir. Bu nedenle, patojen bakteriler zamanla birçok antibiyotiğe dirençli hale gelerek, tedavisi zor olan veya mümkün olmayan salgınlara yol açabilmektedir. Gen aktarımının gerçekleĢmesi için uygun olan ortamlardan biri ise gıda ürünleri olarak bilinmektedir. Özellikle vankomisine dirençli Enterococcus türlerinin gıda yolu ile insanlara geçerek, bağırsak mukozasından izole edildiği yapılan çalıĢmalar ile belirlenmiĢtir (Kushiro 2009, Demirel ve Gürler 2016). Ayrıca LAB suĢlarında sonradan kazanılmıĢ antibiyotik direnç genlerinin Gram negatif bakterilere de aktarılabildiği belirtilmektedir. Ancak özellikle fermente gıdaların üretiminde kullanılan birçok LAB suĢunun (L. plantarum, L. casei, L. acidophilus vb.) vankomisin, ampisilin gibi bazı antibiyotiklere karĢı doğal dirence sahip olduğu da bilinmektedir (Mathur ve Singh 2005, Tatlı 2009). Bir baĢka direnç mekanizması ise “çapraz direnç” olarak adlandırılmakta olup, benzer mekanizma ile bakterilere etki eden farklı antibiyotik türlerine karĢı gösterilen direnç olarak tanımlanmaktadır. Bu durumun genel olarak, etki mekanizmaları ve yapıları aynı olan eritromisin, neomisin, kanamisin vb. antibiyotiklerde gözlendiği belirtilmektedir (Tatlı 2009). Birçok Lactobacillus türünün vankomisin ve streptomisine karĢı doğal dirençli olduğu bilinmektedir. Ayrıca çoğu Leuconostoc türünün de vankomisine karĢı doğal dirence sahip olduğu belirtilmektedir (Mathur ve Singh 2005). Gıda endüstrisinde kullanılacak olan LAB suĢlarının antibiyotik dirençliliklerinin moleküler düzeyde incelenerek, kazanılmıĢ dirence sahip olan suĢların starter olarak kullanılmaması gerektiği düĢünülmektedir. Ancak, doğal direncin genetik olarak tespitinin yapılması sonucunda suĢların gıda endüstrisinde kullanılmasının, yeni ürün 34 geliĢtirilmesinde ve fonksiyonel ürünlerin üretiminde önemli rol oynayacağı ifade edilmektedir. 2.6. Laktik Asit Bakterilerinde Biyofilm Oluşumu ile Antibiyotik Direnci Arasındaki İlişki Laktik asit bakterilerinde EPS üretimi ile biyofilm oluĢumu arasında korelasyon olduğu bazı çalıĢmalar ile belirlenmiĢ olsa da, bazı LAB suĢlarında EPS üretim miktarı ile biyofilm oluĢturma düzeyi benzer nitelikte bulunmamıĢtır (Patel ve ark. 2012, Abdellah ve ark. 2015). Ancak hem EPS üretiminin, hem de biyofilm tabakasının LAB suĢlarını daha dayanıklı hale getirdiği konusunda araĢtırmacılar benzer sonuçlara ulaĢmıĢlardır. Bunun nedeni ise biyofilm tabakasında yer alan bileĢenler arasında EPS‟ nin de bulunması ve mikroorganizmaları bir arada tutmada önemli rol oynamasıdır. EPS‟ lerin mikroorganizmalar tarafından katabolize edilemediği ve dolayısıyla enerji kaynağı olarak kullanılamadığı bilinmektedir (Barçın-Öztürk ve ark. 2008). Ancak EPS‟ lerin, bulundukları ortamda koruyuculuk görevi yaptığı ve mikroorganizma kolonizasyonu ile yüzeye tutunma kabiliyetinin de artmasını sağladığı bildirilmektedir. Enfeksiyon durumlarında kullanılan antibiyotiklerin bağırsak mikrobiyotasını bozduğu ve zararlı mikroorganizmalar tarafından rekabetçi biyotanın yeniden oluĢturulduğu bildirilmektedir. Probiyotik LAB suĢlarının antibiyotiklere karĢı patojen mikroorganizmalara kıyasla daha duyarlı oldukları bilinmektedir. Bu nedenle bağırsak doğal mikrobiyotasının bozulmaması ve epitel yüzey üzerinde LAB suĢlarının zarar görmeden hâkimiyetlerine devam edebilmesi için antibiyotiklere karĢı geliĢtirdikleri direnç mekanizmalarının önemli olduğu düĢünülmektedir. Biyofilm içindeki mikroorganizmaların, besin yoksunluğu, pH değiĢliklikleri, oksijen radikalleri, dezenfektanlar, fagositoz ve antibiyotiklere karĢı planktonik hücrelerden daha dirençli oldukları bildirilmektedir (Barçın-Öztürk ve ark. 2008, Gerritsen ve ark. 2011, Gad ve ark. 2014). Biyofilmin büyük bir bölümünü oluĢturan EPS‟ lerin savunmada önemli rol oynayan moleküller olduğu bilinmektedir. EPS‟lerin bakteriyi diğer çekim alanlarından (elektrik 35 çekimi) uzaklaĢtırarak, farklı hücrelerin fagositozundan ve antimikrobiyel etkisinden de koruduğu bildirilmektedir. Ortamda bulunan diğer mikroorganizmaların salgılamıĢ olduğu sinyal moleküllerini alarak, tehlikede olduğunu algılayan bakteri, savunma mekanizmasını ön plana çıkartmakta ve dolayısı ile biyofilm oluĢturmaktadır. Biyofilm oluĢumu, bakterinin kendini koruma altına alması olarak tanımlanmaktadır (Barçın- Öztürk ve ark. 2008). Olumsuz koĢulların ortaya çıkması halinde, QS mekanizmasının aktif hale geçmesi sağlanmaktadır. Savunma haline geçen bakterinin biyofilm üreterek metal iyonlarına ve bakteriyofaja karĢı da direnç gösterebildiği belirtilmektedir (Milci ve Yangın 2005, Ciszek-Lenda 2011). LAB kültürlerinin planktonik halde iken, sahip olmadıkları özelliklerin biyofilm oluĢumu ile ortaya çıkması ile antibiyotik benzeri maddeler üretebildikleri ve ayrıca antimikrobiyel ajanlara karĢı da direnç kazandıkları rapor edilmiĢtir (Jones ve Versalovic 2009, Guinta 2010, Ġçten 2013, Sudağıdan ve Aydın 2013, Zhang ve ark. 2013, Khosravi ve ark. 2014). Antimikrobiyel ajanlara gösterilen direncin ve bağırsak mukozasına tutunma kabiliyetinin biyofilm oluĢumu ile desteklenmesinden dolayı patojen mikroorganizmalarda biyofilm engellenilmeye çalıĢılırken, sağlığa faydalı mikroorganzimalarda ise desteklenebilmektedir. Yapılan bir çalıĢmada Kore‟ ye özgü fermente soya hamurundan izole edilen LAB suĢlarının P. acidilactici SDL 1402, P. acidilactici SDL 1405, P. acidilactici SDL 1406, W. cibaria SCCB 2306, S. thermophilus SCML 337, S. thermophilus SCML 300 ve E. faecium SC 54 olduğu moleküler yöntemler ile tanılanmıĢ ve probiyotik özellikleri incelenmiĢtir. SuĢların tamamının penisilin, tetrasiklin, kanamisin, gentamisin, eritromisin, klindamisin ve kloramfenikole karĢı duyarlı oldukları, ancak streptomisin ve ampisiline karĢı dirençli oldukları belirtilmektedir. Ayrıca agregasyon kabiliyetlerinin E. coli O157:H7, L. monocytogenes ATCC 15313 suĢlarına göre daha iyi olduğu belirtilmektedir (Oh ve ark. 2018). 36 Tez kapsamında farklı gıdalardan izole edilerek biyokimyasal ve moleküler tekniklerle tanımlanan LAB suĢlarının biyofilm oluĢturma yetenekleri ile antibiyotik dirençleri incelenmiĢ ve biyofilm oluĢumunun antibiyotik direnci üzerine etkisi anlaĢılmaya çalıĢılmıĢtır. 37 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Araştırma örnekleri Laktik asit bakterilerinin izolasyonu, identifikasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi amacı ile Bursa ilindeki farklı pazarlardan temin edilen toplam 17 örnek [çiğ süt (3 adet), köy peyniri (4 adet), yeĢil ve siyah ham zeytin (10 adet)] toplanmıĢ, Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü Mikrobiyoloji Laboratuvarı‟ na uygun koĢullarda getirilerek numaralandırılmıĢ ve etiketlenmiĢtir (Çizelge 3.1). Örnekler açıkta tüketiciye satıldığı ambalaj ile temin edilmiĢtir. Çizelge 3.1. Örneklere iliĢkin bilgiler Örnek kodu Örnek alım tarihi Örnek tipi Örnek miktarı ĠĢlenmemiĢ yeĢil YZA-1 12.10.2014 1000 g zeytin- Aydın ĠĢlenmemiĢ yeĢil YZA-2 12.10.2014 1000 g zeytin- Aydın ĠĢlenmemiĢ yeĢil YZA-3 12.10.2014 1000 g zeytin- Aydın ĠĢlenmemiĢ yeĢil- YSZG-1 23.11.2014 500 g siyah zeytin- Gemlik ĠĢlenmemiĢ yeĢil YZG-1 13.10.2014 500 g zeytin- Gemlik ĠĢlenmemiĢ yeĢil YZG-2 15.10.2014 500 g zeytin- Gemlik ĠĢlenmemiĢ yeĢil YZG-3 25.10.2015 500 g zeytin- Gemlik ĠĢlenmemiĢ yeĢil YZG-4 25.10.2015 500 g zeytin- Gemlik ĠĢlenmemiĢ yeĢil- YSZĠ-1 17.11.2015 1000 g siyah zeytin- Ġznik ĠĢlenmemiĢ yeĢil- YSZĠ-2 17.11.2015 1000 g siyah zeytin- Ġznik 38 Bitkisel ürünler Çizelge 3.1. Örneklere iliĢkin bilgiler (devam) Örnek kodu Örnek alım tarihi Örnek tipi Örnek miktarı ÇS-1 15.05.2014 Çiğ süt 100 mL ÇS-2 22.05.2014 Çiğ süt 100 mL ÇS-3 09.08.2015 Çiğ süt 100 mL KP-1 07.08.2015 Köy peyniri 700 g KP-2 14.09.2015 Köy peyniri 550 g KP-3 16.09.2015 Köy peyniri 550 g KP-4 16.09.2015 Köy peyniri 700 g 3.1.2. Kullanılan besiyerleri ve çözeltiler De man-rogosa-sharpe (MRS) broth ve agar (Merck) MRS broth granül halde bulunan dehidre besiyerinden 52,2 g/L, MRS agar ise granül halde bulunan dehidre besiyerinden 66,2 g/L olacak Ģekilde tartılarak, damıtık su içinde homojen Ģekilde eritilmiĢ ve 121°C‟de 15 d otoklavlanarak, kullanıma hazır hale getirilmiĢtir. MRS broth laktik asit bakterilerinin aktifleĢtirilmesinde ve diğer analizlerde, MRS agar ise laktik asit bakterilerinin saflaĢtırılması, mikrobiyel sayım ve antimikrobiyel direnç analizlerinde kullanılmıĢtır. %30’ luk H2O2 çözeltisi (Sigma-Aldrich) Konsantrasyonu hazır olan çözelti gıda örneklerinden izole edilen ve saflaĢtırılan bakterilerin katalaz reaksiyonlarını gözlemlemek amacı ile kullanılmıĢtır (Kaban ve Kaya 2008, Bağder-Elmacı ve ark. 2015). 10X tris borat EDTA (TBE) tamponu (Merck) TBE tamponu kullanıma hazır olarak alınmıĢ olup, jel elektroforezi amacı ile kullanılmıĢtır (Aymerich ve ark. 2003). 39 Süt ve ürünleri %0,7’ lik agaroz jel (Bioshop) 0,84 g agaroz (Bioshop) tartılarak 120 mL 1X TBE (Merck) tamponu eklenmiĢtir. Mikrodalga fırında çözündürüldükten sonra son deriĢim 0,5 µg/mL olacak Ģekilde Etidyum Bromür (EtBr) (Applichem) eklenip hafifçe çalkalanarak karıĢtırılmıĢ ve elektroforez tankına dökülmüĢtür (Aymerich ve ark. 2003). 6X jel yükleme boyası (Thermo Fisher Scientific) Agaroz jel elektroforezinde DNA ve PZR ürünlerinin jele yüklenmesi ve izlenmesi amacı ile kullanılmıĢtır (Lee ve ark. 2012). Etidyum bromür (EtBr) (Applichem) 10 mg/mL distile su içinde çözündürülerek, hazırlanan çözelti agaroz jel içerisinde son deriĢimi 0,5 µg/mL olacak Ģekilde hazırlanmıĢtır. EtBr, elektroforez sonrası DNA bantlarının UV ıĢık altında sarı/turuncu renk vermesini sağlamaktadır (Aymerich ve ark. 2003). DNA merdiveni (SolisBioDyne) Farklı boylarda hazırlanmıĢ DNA parçalarını içeren bir çözelti olup, jeldeki görüntü ile karĢılaĢtırma yapılarak, analiz edilen DNA örneklerinden elde edilen bantların yaklaĢık boy ve miktarlarının belirlenmesinde kullanılmıĢtır (Aymerich ve ark. 2003). Liziz solüsyonu Liziz solüsyonu (20 mM Tris-HCl (Merck), pH:8,3; 50 mM KCl (Merck); 1,5 mM MgCl2 (Merck) ; % 0,5 Tween 20 (Applichem); % 0,45 Triton X-100 (Sigma), % 0,01 jelatin (Bioshop)) Caro ve ark. (2015)‟ nın kullandığı yönteme göre 5 mL‟lik stok çözelti halinde hazırlanmıĢ ve DNA izolasyonunda kullanılmıĢtır. 40 Proteinaz-K (Calbiochem) Proteinaz-K, DNA izolasyonunda, liziz solüsyonu ile birlikte kullanılmıĢtır (Caro ve ark. 2015). Fenol:kloroform:isoamil alkol (FKI); pH:8,0 çözeltisi (Bioshop) Yüksek ağırlıkta genomik DNA elde edilebilmesi için pH‟sı 8,0 olan Tris EDTA tamponu ile doyurulmuĢ FKI çözeltisi kullanılmıĢtır (Caro ve ark. 2015). 3.2. Yöntem 3.2.1. Laktik asit bakterilerinin izolasyonu Bursa ilindeki pazarlardan toplanan ham zeytin meyveleri (Ġznik ve Gemlik) ile köy peyniri numuneleri 10 g olacak Ģekilde tartılarak 90 mL %0,85 NaCl içeren fizyolojik tuzlu su içinde homojenize edilmiĢtir. Çiğ süt örneğinden ise seri dilüsyon yapılmıĢtır. Her örnekten MRS agara dökme yöntemi ile ekim yapılmıĢ ve 28°C'de 48 saatlik inkübasyon sonunda farklı morfolojik yapıya sahip koloniler steril öze yardımı ile alınarak MRS agara sürme yöntemi ile ekilmiĢtir. GeliĢen kolonilerin steril öze yardımı ile alınarak MRS agara sürülmesi iĢlemi 3 defa tekrarlanarak saflaĢtırma iĢlemi gerçekleĢtirilmiĢtir (Bağder-Elmacı ve ark. 2015). 3.2.2. Laktik asit bakterilerinin morfolojik özelliklerinin belirlenmesi SaflaĢtırılan kolonilerden basit preparat hazırlanarak mikroskopta incelenmiĢtir. Mikroskobik incelemede, koloninin saflığı kontrol edilmiĢ ve morfolojik özellikleri hakkında genel bilgi kayıt altına alınmıĢtır. 41 Gram boyama Saf kültürler MRS broth besiyerine aĢılanarak 28-30°C'de 18-24 saatlik inkübasyona bırakılmıĢtır. 18-24 saatlik taze kültürlerin Gram özelliklerinin belirlenmesi için, Kristal viyole (Merck) ile Lugol çözeltisi (Merck) kullanılmıĢtır. Ġzolatların Gram boyanma özellikleri belirlenmiĢ ve Gram pozitif olan izolatlar seçilmiĢtir (Goh ve Philip 2015). 3.2.3. Laktik asit bakterilerinin biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi Katalaz testi Gram pozitif izolatlara ve katalaz testi yapılmıĢtır. Katalaz testinde %30' luk H2O2 kullanılmıĢtır. Saf kültürler lam üzerine steril koĢullarda alınarak, üzerlerine %30' luk H2O2 çözeltisi damlatılmıĢ ve gaz kabarcıkları oluĢturan izolatlar katalaz pozitif olarak değerlendirilirken, gaz kabarcığı oluĢturmayan izolatlar katalaz negatif olarak değerlendirilmiĢtir (Villani ve ark. 1997). Morfolojik ve biyokimyasal özellikleri belirlenen izolatlardan Gram pozitif ve katalaz negatif olan izolatlar seçilmiĢ ve tanılama iĢlemleri için %30 oranında gliserin içeren sıvı besiyeri içinde -80°C‟ de saklanmıĢtır (Shukla ve Goyal 2011). 3.2.4. Laktik asit bakterilerinin genotipik yöntem ile tanılanması Ġzolatların elde edildikleri köken ve koloni morfolojileri ile mikroskopta gözlemlenen hücre morfolojileri göz önüne alınarak, farklı cins ve türe ait olabilecekleri tahmin edilen izolatlar seçilerek dizi analizleri yapılmıĢtır (Adesulu-Dahunsi ve ark. 2017). Laktik asit bakterilerinden DNA izolasyonu DNA izolasyonu ve polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) Caro ve ark. (2015) tarafından önerilen yöntem modifiye edilerek gerçekleĢtirilmiĢtir. Dizi analizi öncesinde -80°C'de 42 depolanan izolatlar MRS broth içeren 2 mL'lik cryo tüplerde aktifleĢtirilmiĢtir. 18-24 saatlik aktif kültürlerden 1‟er mL alınarak, 2 paralelli olacak Ģekilde tüplere aktarılmıĢ ve 12,000 g hızında 3 d santrifüj (Spectrafuge™ 24D) edilmiĢtir. Supernatant uzaklaĢtırılarak, 100‟er µL steril ve nükleaz içermeyen saf su ile pelet yıkama iĢlemi yapılmıĢtır. Yıkanan peletler vorteksle karıĢtırıldıktan sonra yeniden 12,000 g‟de 3 d santrifüj edilmiĢ ve yıkama suyu pipetlenerek uzaklaĢtırılmıĢtır. Liziz solüsyonu (20 mM Tris-HCl, pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5 mM MgCl2; %0,5 Tween 20; %0,45 Triton X-100; %0,01 jelatin) stok çözelti olarak hazırlanmıĢtır. Peletlerin üzerine 100 µL liziz solüsyonu ve 5 µL Proteinaz-K eklenmiĢtir. Tüpler, blok ısıtıcı (Labnet Accublock, ABD) içinde Proteinaz-K‟nın optimum aktivite gösterdiği 55°C‟de 1 saat boyunca inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyonun sonunda Proteinaz-K‟nın inaktive edilmesi için tüpler 98°C‟de 10 d bekletilmiĢ ve 12,000 g‟de 1 d santrifüj edilerek, DNA içeren supernatant (~100µL) baĢka bir Eppendorf tüpe alınmıĢtır. Supernatant miktarı kadar FKI pH:8,0 çözeltisi de oda sıcaklığında eklenmiĢtir. FKI çözeltisinin özellikle solunum yolları üzerine toksik etkilerinden dolayı, supernatant içeren tüplere ilavesi esnasında çeker ocak kullanılmıĢtır. Beyaz renkli emülsiyon oluĢuncaya kadar vorteks ile karıĢtırılmıĢtır. DNA‟nın kırılmasını engellemek için, tüplerin çok kısa süreli karıĢtırılmasına özen gösterilmiĢtir. Yüksek ağırlıkta DNA gerektiğinde vorteks ile karıĢtırma yerine, tüpler hafifçe çevrilerek, iĢlem gerçekleĢtirilebilmektedir. 12,000 g‟de 5 d santrifüjlendikten sonra üst fazda DNA‟nın bulunduğu su, alt fazda organik çözeltiler, ara fazda ise opak disk Ģeklinde denatüre proteinler ve hücre parçaları bulunmaktadır. Üst faz, ara faza dokunulmadan pipetle baĢka tüpe alınmıĢ, organik faz ve ara faz atılmıĢtır. YaklaĢık olarak 25µL hacminde elde edilen üst fazın üzerine aynı miktarda kloroform eklenmiĢtir. Yeniden 12,000 g‟ de 5 d santrifüj edilerek, üst faz alınmıĢtır. Bu sayede alt fazda bulunan fenol kalıntısı da uzaklaĢtırılmıĢtır. En son tüpte bulunan sıvının hacminin 3 katı hacminde, soğuk %100 etanol eklenmiĢ ve -20°C‟ de bir gece bekletilmiĢtir. -20 ya da -80°C‟ de bir gece bekletme ile DNA miktarının yoğunlaĢması sağlanabilmektedir. DNA içeren tüpler -20°C‟ den alınarak en yüksek devirde 15 d santrifüjlenmiĢ ve etanol dökülerek, uzaklaĢtırılmıĢtır. Tuzların da uzaklaĢtırılması için 30 µL %70‟ lik etanol çözeltisi tüplere eklendikten sonra 5 d 43 boyunca en yüksek devirde santrifüjlenmiĢtir. Bu iĢlem iki kez tekrarlanmıĢtır. Tüpler bir peçete üzerine ters çevrilerek dizilmiĢ ve tamamen kuruyana kadar beklenmiĢtir. Tamamen kuruyan DNA‟ ların üzerine 30 µL steril, nükleaz içermeyen saf su eklenmiĢtir ve kullanılıncaya kadar +4°C‟ de saklanmıĢtır (Caro ve ark. 2015). DNA miktar ve kalitesinin belirlenmesi DNA ve diğer nükleik asitler, sıvı çözeltiler içinde ultraviyole ıĢığını absorbe etmektedirler. Absorbans değerlerinin ölçülmesi ile DNA miktar ve kalitesi hakkında bilgi veren grafikler elde edilebilmektedir. Nükleik asitler 260 nm dalga boyundaki ıĢığı; karbonhidrat, peptit, fenol ve aromatik bileĢen kalıntıları ise 230 nm dalga boyundaki ıĢığı absorbe etmektedirler. Proteinler ise 280 nm dalga boyundaki ıĢığı absorbe etmektedirler. Bu nedenle ekstrakte edilen DNA‟nın saflığını ve miktarını kontrol edebilmek için 230, 260 ve 280 nm dalga boylarındaki absorbans değerleri ölçülmüĢtür (Adesulu-Dahunsi ve ark. 2017). Bu ölçümler Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Laboratuvarı‟ nda bulunan Nano Spektrofotometresi ile gerçekleĢtirilmiĢtir. DNA çözeltisinden 1 µL NanoDrop cihazının gözüne damlatılarak 230, 260 ve 280 nm‟de absorbans ölçümleri ve oluĢturdukları grafikler görüntülenmiĢtir. Ölçüm sonuçlarına göre DNA konsantrasyonları aĢağıdaki formüle göre hesaplanmıĢtır (Olson ve Morrow 2012, Nayak ve ark. 2013, Adesulu-Dahunsi ve ark. 2017); “DNA konsantrasyonu (µg/mL) = A260 x 50 µg/mL x seyreltme faktörü” Ġzole edilen DNA saflığı yeterli ise A260/A280 oranı 1,6-2,0 arasında ve A260/A230 oranı 2,0-2,2 arasında olmalıdır. A260/A280 < 1,6 ise protein kirliliği, A260/A280 > 2,0 ise kloroform/fenol kirliliği, A260/A230 < 2,0 ise karbonhidrat, peptit, fenol ve aromatik bileĢik kirliliği Ģeklinde yorumlanmıĢtır. 44 Agaroz jelin hazırlanması Laboratuvarda kullanılan 120 mL hacmindeki elektroforez tankına dökmek için agaroz jel hazırlanmıĢtır. Agaroz jel hazırlanırken hem mikroorganizmalardan ekstrakte edilen DNA‟ ların (nano-drop ölçüm sonuçları uygun olanlar), hem de polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ürünlerinin agaroz jelde yürütülmesi için % 0,7 (w/v) oranında agaroz 250 mL‟lik erlen içine tartılarak eklenmiĢ ve 1xTBE tamponu ile 120 mL‟ ye tamamlanmıĢtır. Çalkalanarak karıĢım sağlanmıĢ ve sıvının seviyesi erlen üzerinde iĢaretlenmiĢtir. Mikrodalga fırın içinde agaroz tamamen homojen olarak dağılıncaya kadar ısıtılmıĢ ve buharlaĢma olmuĢ ise iĢaretlenen seviyeye kadar distile su ilave edilmiĢtir. Çözeltinin biraz soğuması beklenmiĢ ve 60°C civarına gelince 0,5 µg/mL etidyum bromür (EtBr) eklenerek hazırlanan jel elektroforez tankına dökülmüĢtür. Kullanılacak tarak jel içine yerleĢtirildikten sonra jelin katılaĢması beklenmiĢ ve tarak jelden çıkarılmıĢtır. KatılaĢan jelin yüzeyini örtecek Ģekilde tampon dökülerek, jelin kuruması engellenmiĢtir (Aymerich ve ark. 2003). Laktik asit bakterilerinin 16S rRNA yöntemi ile tanılanması Laktik asit bakterilerinden genomik DNA ekstrakte ve izole edildikten sonra 27F (5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3') ve 1492R (5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3') ileri ve geri primerleri ile bakterilerin evrensel primerler ile uyum sağlayan genetik bölgelerinin çoğaltılarak tanılanması amaçlanmıĢtır. Ġleri ve geri primerler kullanılarak PZR ile çoğaltılan bölge yaklaĢık olarak 1500 bç olarak belirlenmiĢtir (Doi ve ark. 2013, Bağder-Elmacı ve ark. 2015). Stok PZR karıĢımı hazırlanmıĢ ve tüplere dağıtılmıĢtır. Reaktiflerin hacimleri ve her bir tüpte 25 µL olacak Ģekilde hazırlanan stok çözeltinin son kansantrasyonu Çizelge 3.2‟de belirtilmektedir. 45 Çizelge 3.2. PZR için hazırlanan stok çözeltide bulunan reaktifler ve konsantrasyonları (Taq DNA Polymerase, New England, Biolabs Protokol, 2017) Son Reaktifler (Konsantrasyon) Hacim (1 tüp için) konsantrasyon ThermoPol Reaksiyon Tamponu - PZR Tamponu 2,5 µL 1x (10x + MgCl2) dNTP (5mM) 1 µL 0,2 mM Primer F (5µM) 1 µL 0,2 µM Primer R (5µM) 1 µL 0,2 µM Taq (5U/µL) 0,25 µL 1 U DNA (20-200 ng/ µL) 1 µL 25-70 ng Nükleaz içermeyen steril saf su 18,25 µL - TOPLAM 25 µL - PZR koĢulları Caro ve ark. (2015)‟nın kullandığı yöntem biraz modifiye edilerek, kullanılan primer özellikleri ve Taq polimeraz enziminde geçerli olan protokole göre oluĢturulmuĢtur. Her bir bakteri örneği için PZR tüpleri 2 paralelli olacak Ģekilde hazırlanmıĢ ve agaroz jelde aynı anda yürütülecek örnek sayısı ve paralelleri dikkate alınarak master miks miktarı hesaplanmıĢtır. Master miks tüpü buz içinde hazırlanmıĢ (Taq polimeraz en son eklenmiĢtir) ve 24‟ er µL olacak Ģekilde tüplere dağıtılmıĢtır. Her bir bakteri örneğine ait DNA‟ ların nano-drop ölçümleri PZR öncesi tamamlanmıĢtır, PZR tüplerinde son hacim 25 µL olarak belirlendiği için her bir DNA örneğinden kendi tüpüne aktarılmak üzere 1‟ er µL alınarak, 2 paralelli olacak Ģekilde tüplere dağıtılmıĢ ve toplam DNA konsantrasyonları 20-200 ng arasında olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır. ÇalıĢmada kullanılan PZR koĢulları Çizelge 3.3‟te belirtildiği gibidir. 46 Çizelge 3.3. Laktik asit bakterileri için uygulanan PZR koĢulları Aşama Sıcaklık Zaman Ön denatürasyon 95°C 5 d 95°C 30 s 35 döngü 50°C 1,5 d 68°C 1,5 d Primer uzaması 68°C 10 d Bekletme 10°C ∞ PZR bittikten sonra tüpler cihazdan çıkarılmıĢ, her birine 5‟ er µL yükleme boyası eklenmiĢ, karıĢtırılmıĢ ve agaroz jeldeki kuyucuklara yüklenerek 90 voltta, 1 saat yürütülmüĢtür. Baz büyüklüğü tespiti için 1 kb‟lık marker (SolisBioDyne) kullanılmıĢtır. Jelde yürütme sonucunda oluĢan bantlar, UV ıĢık altında görüntüleme cihazında (Illuminyx-Transilluminators) görüntülenmiĢ ve gözlemlenen bantlar kesilmiĢtir. Kesilen bantlar, bant temizleme iĢlemi için DNaz ve RNaz içermeyen Eppendorf tüpler içine alınmıĢtır. Bant gözlemlenemeyen örneklerin PZR master miks karıĢımlarındaki miktarları değiĢtirilmiĢtir. DNA örneklerinden 2 ve 5 µL konularak, master miks içindeki nükleaz içermeyen steril saf su miktarı aynı oranda azaltılmıĢ ve tüplerdeki son miktar yine 25 µL olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır. Bu durumda kullanılan DNA miktarı arttığı için PZR çalıĢmıĢ ve agaroz jelde yürütme sonucunda, bant oluĢumları gözlemlenmiĢtir. Kesilen bantlar, bant temizleme kiti (NucleoSpin) ile temizlenerek sekans analizi için REFGEN- Gen AraĢtırmaları ve Biyoteknoloji (Ankara) ve IONTEK (Ġstanbul) firmalarına gönderilmiĢtir. Sekans sonuçları gen bankası olan ve https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi adresindeki “Nucleotid BLAST” programı kullanılarak taranmıĢtır. Biyokimyasal analizler ile tanımlanan olası laktik asit bakterileri 16S rRNA dizilimi baz alınarak, 27F ve 1492R primerleri ile PZR gerçekleĢtirilmiĢ ve sekans sonuçları göz önüne alınarak, tür bazında tanılanması da yapılabilmiĢtir. 47 3.2.5. Tanılanan laktik asit bakterilerinin biyofilm oluşturma yeteneklerinin belirlenmesi Tanılanan izolatların biyofilm oluĢturma yetenekleri iki farklı yöntem ile belirlenmiĢtir. Her iki yönteme göre sonuçlar karĢılaĢtırılmıĢtır. “Tüp yöntemi” ile biyofilm oluşumunun incelenmesi Tüp yöntemi ile biyofilm oluĢumunun incelenmesinde Hassan ve ark. (2011)‟ nın çalıĢmalarındaki yöntem kullanılmıĢtır. Laktik asit bakterilerinin geliĢmeleri için optimum koĢullar ile bazı stres koĢulları oluĢturulmuĢ ve farklı geliĢme ortamlarında biyofilm oluĢturma düzeyleri incelenmiĢtir. 30 ve 37°C‟ de 24 ve 48 saatlik inkübasyon koĢulları ile 4 ayrı deneme grubu oluĢturulmuĢtır. Test mikroorganizmaları aktifleĢtirilmiĢ ve 10 mL steril MRS broth bulunan falkon tüplerine 18-24 saatlik kültürlerden 100‟er µL aĢılama yapılmıĢtır. Tüpler 30 ve 37°C‟ de 24 ve 48 saat süre ile aerobik koĢullarda inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon sonunda tüplerdeki besiyeri boĢaltılmıĢ, fosfat salin tamponu (pH:7,3) ile yıkanmıĢ ve oda sıcaklığında ters Ģekilde kurumaya bırakılmıĢtır. Tüpler tamamen kuruyunca %0,1‟ lik kristal viyole ile 10 d boyunca boyama iĢlemi gerçekleĢtirilmiĢtir. Biyofilm tabakaya bağlanmayan fazla boya deiyonize su ile yıkanmıĢ ve tüpler ters Ģekilde oda sıcaklığında yeniden kurumaya bırakılmıĢtır. Kurutmanın ardından tüplerin iç çeperlerinde ve tabanında görünür boyalı biyofilm tabakası var ise pozitif olarak değerlendirilmiĢ ve boyalı tabakanın yoğunluğuna göre “biyofilm üretmeyen, zayıf, orta ve güçlü biyofilm üreten bakteri suĢları” Ģeklinde derecelendirme yapılmıĢtır. “96 kuyucuklu plaka yöntemi” ile biyofilm oluşumunun incelenmesi Laktik asit bakterilerinde biyofilm oluĢumu Zhang ve ark. (2013)‟nin uyguladığı spektroskobik yöntem olan 96 kuyucuklu plakalar ile belirlenmiĢtir. ÇalıĢmada kullanılan yöntem, 96-kuyucuklu plakalarda hücre yoğunluklarının ölçülmesi ve sonrasında %0,1‟ lik kristal viyole ile kuyucukların boyanması sonucunda 48 spektroskobik ölçümlerinin alınması ve hücre yoğunluğuna göre oluĢan biyofilmin absorbans değerlerinin belirlenmesi temeline dayanmaktadır. Bu yönteme göre 18-24 saatlik taze kültür, steril MRS sıvı besiyeri ile 1:100 oranında seyreltilmiĢ ve toplamda 100 µL olacak Ģekilde mikroplakada bulunan kuyucuklara pipetlenmiĢtir. Negatif kontrol kuyucuklarına ise steril MRS sıvı besiyeri aktarılmıĢtır. Deneme grupları iki ayrı inkübasyon süresi ve sıcaklığı baz alınarak düzenlenmiĢ olup, her bir test organizmasının biyofilm oluĢturma yeteneği üç paralelli olacak Ģekilde, 30 ve 37°C‟ de 24 ve 48 saat süre ile aerobik koĢullar altında belirlenmiĢtir. Ġnkübasyon süreleri sonunda laktik asit bakterisi kültürleri kuyucuklarda geliĢmiĢ ve toplam hücre yoğunlukları 630 nm dalga boyunda ölçülmüĢtür. Ardından kuyucuklardaki besiyeri ve kültür boĢaltılmıĢ olup, kuyucuklardaki serbest halde bulunan bakteri hücrelerinin ortamdan uzaklaĢtırılması için deiyonize su içerisine mikroplakalar 7-8 defa daldırılarak, yıkanma iĢlemleri gerçekleĢtirilmiĢtir. Yıkama iĢleminin ardından mikroplakalar 37°C‟ lik inkübatörde 45 d boyunca ters Ģekilde kurumaya bırakılmıĢtır. Kuyucuklar tamamen kuruduktan sonra, her bir kuyucuğa %0,1‟ lik kristal viyole pipetlenerek biyofilm tabakasının 20 d boyunca oda sıcaklığında boyanması sağlanmıĢtır. Ġnkübasyon süresi sonunda serbest haldeki boya tamamen uzaklaĢana kadar mikroplakalar deiyonize su içerisinde yıkanmıĢ ve ardından 37°C‟ de 45 d boyunca kurumaya bırakılmıĢtır. Kuyucuklar tamamen kuruduktan sonra her bir kuyucuğa 100 µL %95‟ lik etil alkol ilave edilmiĢ ve 30 d boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek, biyofilm tabakaya bağlanmıĢ boyanın etil alkol içinde çözünmesi sağlanmıĢtır. Süre sonunda her bir kuyucuktaki “kristal viyole-etil alkol” çözeltisi, baĢka bir mikroplakaya aynı sıra ile aktarılarak, spektrofotometrede 492 nm‟de absorbans ölçümü yapılmıĢtır. Her bir suĢun biyofilm oluĢturma kapasitesi aĢağıdaki formüle göre hesaplanmıĢtır. “B= A492 / A630” Ġzolatların biyofilm oluĢturma kapasiteleri B skalasına göre sınıflandırılmıĢtır (Tahmourespour ve Kermanshahi 2011, Zhang ve ark. 2013). 49 B< 0,1 ise "biyofilm üretmeyen", 0,1≤ B< 0,5 ise "zayıf ", 0,5≤ B< 1,0 ise "orta düzeyde", B≥ 1,0 ise "güçlü biyofilm üreten” olarak adlandırılmıĢtır. 3.2.6. Tanılanan laktik asit bakterilerinin antibiyotik dirençlerinin belirlenmesi Ġzolatların antibiyotik dirençlerinin belirlenmesinde Halkman (2005) ve Landeta ve ark. (2013)‟nın kullandığı yöntem kullanılmıĢ olup, tanılanmıĢ laktik asit bakterilerinin 18- 24 saatlik taze kültürlerinden MRS katı besiyerine yayma plak yöntemi ile ekim yapılmıĢtır. Ġzolatların belirli konsantrasyonlardaki bazı antibiyotiklere [ampisilin (25µg), streptomisin (25µg ve 300µg), vankomisin (30µg), tetrasiklin (50µg)] karĢı dirençlerinin belirlenmesi için disk difüzyon yöntemi (Akoğlu 2006, Karankı 2013) uygulanmıĢtır. Antibiyotik emdirilmiĢ disklerin (6 mm) tamamı Oxoid firmasından temin edilmiĢtir. Test mikroorganizması inoküle edilmiĢ agar üzerine steril koĢullarda antibiyotik emdirilmiĢ diskler yerleĢtirilmiĢ ve aerobik koĢullarda 30°C‟ de 48 saat inkübasyona bırakılmıĢtır. Ġnkübasyon sonunda antibiyotik aktivitesine bağlı olarak, disk çevresinde oluĢan zon çapları ölçülerek, mikroorganizmanın antibiyotik dirençliliği tespit edilmiĢtir. Deneme üç paralelli olacak Ģekilde yapılmıĢtır (Akoğlu 2006, Karankı 2013). Ġnkübasyon sonunda antibiyotik disklerin çevresinde zon oluĢumu gözlenmeyen suĢlar, antibiyotiğe dirençli olarak kabul edilmiĢtir. Antibiyotik disk etrafında oluĢan zon çapı büyüklüğüne göre suĢların antibiyotiklere duyarlılıkları birbiri ile kıyaslanabilmiĢtir. 50 Çoklu antibiyotik direnci (MAR) indeksi SuĢların antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesinde MAR indeksi kullanılmıĢtır. Bu indeks, test organizmalarının dirençli olduğu antibiyotik sayısının toplam denenen antibiyotik sayısına oranı bulunarak, hesaplanmaktadır (Yalanca 2009, Alp ve Öner 2014). “MAR indeksi = a / b” a: Test organizmasnın dirençli olduğu antibiyotik sayısı b: Test edilen toplam antibiyotik sayısı Denemede, streptomisin (25 ve 300µg), vankomisin (30µg), tetrasiklin (50µg) ve ampisilin (25µg) olmak üzere dört ayrı antibiyotik kullanılmıĢtır. ÇalıĢmada kullanılan iki ayrı dozdaki streptomisinin yüksek dozu (300µg), MAR indeksinin hesaplanmasında tercih edilmiĢtir. Çünkü yüksek doza dirençli olan suĢların, aynı antibiyotiğin daha düĢük dozlarına da dirençlilik göstereceği düĢünülmektedir. Bu nedenle, direnç indeksinin belirlenmesi amacı ile denemede kullanılan farklı dozlardaki antibiyotiklerin yüksek dozlu olanı seçilerek, indeks çizelgesi oluĢturulmuĢtur. Çoklu antibiyotik direnci indeksinin 0,20‟ den büyük çıkması durumunda, suĢun yoğun antibiyotik kullanılan bir kaynaktan izole edildiği anlaĢılmaktadır. Yoğun antibiyotik kullanımının olduğu ortamlardan izole edilen mikroorganizmalar, “yüksek riskli” mikroorganizmalar olarak tanımlanmaktadır. Hesaplanan indeks değerinin 0,20‟ ye eĢit ya da altında bir değer olması ise elde edilen suĢun nadiren antibiyotik kullanılan ya da antibiyotik kullanılmayan bir ortamdan izole edildiği anlamını taĢıdığı belirtilmektedir (Yalanca 2009, Alp ve Öner 2014). 3.2.7. İstatistiksel analiz Üç paralelli olarak elde edilen analiz sonuçlarının ortalamaları alınarak, standart hataları ile birlikte verilmiĢtir. Analizler sonucunda elde edilen verilerin istatistiksel değerlendirmeleri JMP 7.0 programı ile one-way (ANOVA) analizi kullanılarak 51 yapılmıĢtır. Değerlerin birbirinden farklılıkları ve istatistiksel karĢılaĢtırılması Tukey HSD testi ile %5 anlamlılık düzeyinde belirlenmiĢtir. 52 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonu Ġzole edilen bakterilerin saflaĢtırılması için MRS agara sürme iĢlemleri birkaç kez tekrarlanarak mikroskobik incelemeler sonucunda bitkisel ve süt kökenli 62 adet bakteri izolatı elde edilmiĢtir. Ancak, biyokimyasal testler ve tanılama iĢlemlerinin ardından bazı izolatlar elenmiĢ ve 43 adet olası laktik asit bakterisi elde edilmiĢtir. Uygun koĢullarda (-80 ºC) saklanan izolatlar, süt ve ürünlerine ait 7 ve bitkisel ürünlere ait 10 olmak üzere toplam 17 örnekten elde edilmiĢtir. 43 adet izolatın elde edildiği kaynaklar ġekil 4.1‟ de verilmiĢtir. Çiğ Süt 5% ĠĢlenmemiĢ YeĢil Zeytin (Aydın) 25% Köy Peyniri 35% ĠĢlenmemiĢ YeĢil Zeytin (Gemlik) ĠĢlenmemiĢ YeĢil- ĠĢlenmemiĢ YeĢil- 25% Siyah Zeytin Siyah Zeytin (Ġznik) (Gemlik) 5% 5% Şekil 4.1. Ġzolatların elde edildikleri kaynaklar 53 4.2. Laktik Asit Bakterilerinin Tanılanması 4.2.1. Fenotipik yöntem Bu aĢamada izolatlara gram boyama ve katalaz testleri uygulanmıĢtır. Süt ve bitkisel kökenli 62 adet bakteri izole edilmiĢ ve 43 adet bakteri kültürünün Gram pozitif ve katalaz negatif oldukları tespit edilmiĢtir. Olası laktik asit bakterisi olan 43 izolatın, 17‟ sinin bitkisel kökenli, 26‟ sının ise süt kökenli olduğu anlaĢılmıĢtır. SaflaĢtırılan izolatlar -80 °C' de %30 oranında gliserin içeren MRS broth besiyerinde muhafaza edilmiĢtir. Çizelge 4.1‟ de saf izolatlara ait fenotipik özellikler belirtilmiĢtir. Çizelge 4.1. Bakteri izolatlarının fenotipik özellikleri Gram Katalaz İzolat kodu Örnek kodu Morfoloji özelliği reaksiyonu FE5 YZA-1 kokoid + - FE6 YZA-1 kok/kokoid + - FE7 YZA-1 kısa çubuk + - FE46 YZA-1 kok + + FE8 YZA-2 kok + - FE9 YZA-2 kok/kokoid + - FE45 YZA-2 kok + + FE10 YZA-3 kok + - FE44 YZA-3 kısa, ince çubuk - + FE11 YSZG-1 kok + - FE12 YZG-1 kok + - FE13 YZG-2 kok + - FE14 YZG-2 kokoid + - FE15 YZG-2 kok + - FE16 YZG-2 kokoid/kısa çubuk + - FE17 YZG-3 kok + - FE18 YZG-3 kok + - FE50 YZG-4 kokoid + + FE51 YZG-4 kokoid + + FE20 YSZĠ-1 kısa çubuk + - FE21 YSZĠ-1 kokoid + - FE 19 YSZĠ-2 kokoid + - 54 Bitkisel kökenli izolatlar Çizelge 4.1. Bakteri izolatlarının fenotipik özellikleri (devam) İzolat Gram Katalaz Örnek kodu Morfoloji kodu özelliği reaksiyonu FE1 ÇS-1 çubuk + - FE2 ÇS-1 çubuk + - FE3 ÇS-2 çubuk + - FE4 ÇS-2 çubuk + - FE62 ÇS-2 çubuk + + FE47 ÇS-3 kısa, ince çubuk - + FE48 ÇS-3 kısa, ince çubuk - + FE49 ÇS-3 çubuk + + FE60 ÇS-3 çubuk + + FE61 ÇS-3 kısa çubuk - + FE22 KP-1 kok + - FE23 KP-1 kokoid/kısa çubuk + - FE24 KP-1 kok + - FE25 KP-1 çubuk + - FE26 KP-1 kısa çubuk + - FE27 KP-1 kısa çubuk + - FE28 KP-1 kokoid zincir + - FE53 KP-1 kısa çubuk + + FE54 KP-1 çubuk + + FE55 KP-1 çubuk + + FE59 KP-1 çubuk + + FE29 KP-2 kısa çubuk + - FE30 KP-2 kokoid zincir + - FE31 KP-2 kısa çubuk + - FE32 KP-2 streptokok + - FE33 KP-2 kısa çubuk + - FE34 KP-2 çubuk + - FE35 KP-2 kısa çubuk + - FE36 KP-2 kısa çubuk + - FE37 KP-2 kısa çubuk (zincir) + - FE38 KP-3 kokoid + - FE39 KP-3 kok + - FE40 KP-3 kok + - FE56 KP-3 kısa, ince çubuk - + FE58 KP-3 kısa çubuk - + FE41 KP-4 uzun çubuk + - FE42 KP-4 kısa çubuk + - FE43 KP-4 kok/streptokok + - FE52 KP-4 kok + + FE57 KP-4 kokoid + + 55 Süt kökenli izolatlar SaflaĢtırılan bitkisel kökenli 22 adet bakteri izolatının %77‟ sinin (17 adet), süt kökenli 40 adet bakteri izolatının ise %65‟ inin (26 adet) Gram pozitif ve katalaz negatif bakteriler olduğu tespit edilmiĢtir. 4.2.2. Genotipik yöntem Laktik asit bakterilerinden elde edilen DNA’ ların miktar ve kalitesinin belirlenmesi Nano-drop cihazı ile DNA absorbans grafikleri ve konsantrasyonları belirlenmiĢtir. Absorbans değerlerine göre DNA miktar ve kalitesi belirlenmiĢ ve izolasyon iĢlemlerinde kirlilik varsa ya da miktar yetersiz ise DNA izolasyon iĢlemleri tekrarlanmıĢtır. Bazı örneklerin nano-drop cihazı ile belirlenen absorbans grafikleri ġekil 4.2‟ de gösterilmiĢtir. Şekil 4.2. [Lactobacillus spp. FE26 (a)], [Leuconostoc lactis FE5, Leuconostoc garlicum FE5 (b)], [Leuconostoc pseudomesenteroides FE14, Leuconostoc mesenteroides FE14 (c)] ve [Lactobacillus curvatus FE41 (d)] suĢlarından izole edilen DNA‟ların absorbans grafikleri ve konsantrasyonları 56 DNA ve PZR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi Nano-drop sonuçları alınan ve absorbans değerleri uygun aralıkta çıkan DNA izolatları agaroz jelde 90 voltta 1 saat yürütülmüĢ, ancak bant görüntüleri elde edilememiĢtir. PZR ile çoğaltılan DNA moleküllerine yeniden agaroz jel elektroforezi uygulandığında, 43 örnekte bant görüntüleri elde edilmiĢtir. Ġzolatlara ait PZR bant görüntüleri ġekil 4.3 ve ġekil 4.4' te verilmiĢtir. Şekil 4.3. FE1-FE23 arası kod numaralı izolatların agaroz jel elektroforezi sonucunda oluĢturduğu bantlar 57 Şekil 4.4. FE24-FE43 arası kod numaralı izolatların agaroz jel elektroforezi sonucunda oluĢturduğu bantlar ġekil 4.3' teki PZR görüntüsünde 1. kulvar 17. kuyudan baĢlayarak sırasıyla FE1 - FE23 arası örnekler, ġekil 4.4' teki PZR görüntüsünde ise sırasıyla FE24 - FE43 numaralı örnekler mevcut olup, 2. kulvar 2. kuyuda negatif kontrolün bandı görülmektedir. Laktik asit bakterilerinin 16S rRNA yöntemi ile tanılanması Saf kültürlerden izole edilen genomik DNA moleküllerinin 16S rRNA bölgesi çoğaltılarak yapılan PZR sonuçları göz önüne alınarak, izolatlar sekanslama için REFGEN- Gen AraĢtırmaları ve Biyoteknoloji (Ankara) ve IONTEK (Ġstanbul) firmalarına gönderilmiĢtir. 40 adet izolatın sekanslama sonuçları tamamlanmıĢ, 3 adet izolatın tanılanması ise baĢarısız sonuçlanmıĢtır. Sekans sonuçları BioEdit (Version 5.0.6) programı yardımı ile okunmuĢ ve diziler “https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi“ adresindeki “Nucleotid BLAST” programı kullanılarak taranmıĢtır. Sekans sonuçları göz önüne alınarak gen bankasından taranan dizileme ile izole edilen laktik asit bakterilerinin cins ve türleri belirlenmiĢtir. 58 Örneklerden bazılarının ileri ve geri primerlerin bağlanması ile verdikleri sekans sonuçları ġekil 4.5, ġekil 4.6, ġekil 4.7 ve ġekil 4.8‟ de verilmiĢtir. Şekil 4.5. Lactobacillus rhamnosus FE1 suĢunun ileri primer ile sekans okuma grafiği Şekil 4.6. Lactobacillus rhamnosus FE1 suĢunun geri primer ile sekans okuma grafiği 59 Şekil 4.7. Leuconostoc pseudomesenteroides FE10 suĢunun ileri primer ile sekans okuma grafiği Şekil 4.8. Leuconostoc pseudomesenteroides FE10 suĢunun geri primer ile sekans okuma grafiği 60 Ġzolatların kod numaraları, elde edildikleri gıda materyali, morfolojik özellikleri ve tanılama sonuçları Çizelge 4.2‟ de belirtilmiĢtir. Çizelge 4.2. SaflaĢtırılan izolatların özellikleri İzolat numarası (elde edildiği Morfoloji Tanılanan Tür kaynak) FE1 (çiğ süt) çubuk Lactobacillus rhamnosus FE2 (çiğ süt) çubuk Lactobacillus rhamnosus FE3 (çiğ süt) çubuk Lactobacillus rhamnosus FE4 (çiğ süt) çubuk Lactobacillus rhamnosus spp. FE5 (işlenmemiş yeşil zeytin-Aydın) kokoid Leuconostoc lactis, Leuconostoc garlicum FE6 (işlenmemiş yeşil zeytin-Aydın) kok/kokoid Leuconostoc citreum FE7 (işlenmemiş yeşil zeytin-Aydın) kısa çubuk Weissella spp. FE8 (işlenmemiş yeşil zeytin-Aydın) kok Lactococcus lactis FE9 (işlenmemiş yeşil zeytin-Aydın) kok/kokoid Leuconostoc citreum FE10 (işlenmemiş yeşil zeytin-Aydın) kok Leuconostoc pseudomesenteroides FE11 (işlenmemiş yeşil-siyah zeytin- kok Leuconostoc mesenteroides Gemlik) FE12 (işlenmemiş yeşil zeytin-Gemlik) kok Leuconostoc lactis, Leuconostoc garlicum FE13 (işlenmemiş yeşil zeytin-Gemlik) kok Leuconostoc spp. Leuconostoc pseudomesenteroides, FE14 (işlenmemiş yeşil zeytin-Gemlik) kokoid Leuconostoc mesenteroides FE15 (işlenmemiş yeşil zeytin-Gemlik) kok Leuconostoc spp. kokoid/kısa FE16 (işlenmemiş yeşil zeytin-Gemlik) Weissella cibaria çubuk FE17 (işlenmemiş yeşil zeytin-Gemlik) kok Leuconostoc spp. FE18 (işlenmemiş yeşil zeytin-Gemlik) kok Leuconostoc mesenteroides FE20 (işlenmemiş yeşil-siyah zeytin - kısa çubuk Lactobacillus plantarum İznik) FE22 (köy peyniri-1) kok Lactococcus lactis kokoid/kısa FE23 (köy peyniri-1) Weissella cibaria çubuk FE24 (köy peyniri-1) kok Lactococcus lactis FE25 (köy peyniri-1) çubuk Lactobacillus curvatus FE26 (köy peyniri-1) kısa çubuk Lactobacillus spp. Lactobacillus curvatus, Lactobacillus FE27 (köy peyniri-1) kısa çubuk graminis, Lactobacillus sakei FE28 (köy peyniri-1) kokoid zincir Enterococcus faecalis FE29 (köy peyniri-2) kısa çubuk Lactobacillus plantarum FE30 (köy peyniri-2) kokoid zincir Lactococcus lactis FE31 (köy peyniri-2) kısa çubuk Lactobacillus plantarum FE32 (köy peyniri-2) streptokok Lactococcus lactis FE34 (köy peyniri-2) çubuk Lactobacillus plantarum FE35 (köy peyniri-2) kısa çubuk Lactobacillus plantarum FE36 (köy peyniri-2) kısa çubuk Lactobacillus plantarum 61 Çizelge 4.2. SaflaĢtırılan izolatların özellikleri (devam) İzolat numarası (elde edildiği Morfoloji Tanılanan Tür kaynak) kısa çubuk FE37 (köy peyniri-2) Lactobacillus plantarum (zincir) FE38 (köy peyniri-3) kokoid Lactococcus lactis FE39 (köy peyniri-3) kok Lactococcus lactis FE40 (köy peyniri-3) kok Lactococcus lactis FE41 (köy peyniri-4) uzun çubuk Lactobacillus curvatus Lactobacillus curvatus, Lactobacillus FE42 (köy peyniri-4) kısa çubuk graminis, Lactobacillus sakei FE43 (köy peyniri-4) kok/streptokok Leuconostoc mesenteroides Sekanslama sonucunda, analizi tamamlanan 40 izolat içinde 5 farklı cinse ait LAB türlerinin izole edildiği anlaĢılmıĢtır. Çiğ süt, zeytin ve köy peynirlerinden izole edilmiĢ olan laktik asit bakterileri Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rhamnosus spp., Leuconostoc lactis, Leuconostoc garlicum, Leuconostoc citreum, Weissella spp., Weisella cibaria, Leuconostoc spp., Lactococcus lactis, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus graminis, Lactobacillus sakei, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecalis ve Lactobacillus plantarum olarak belirlenmiĢtir. 40 adet izolat içindeki mikrobiyel dağılım ġekil 4.9‟ da verilmiĢtir. Tanılanan LAB suĢlarının süt, zeytin ve peynir örneklerinin doğal mikrobiyotasında bulunabilecek türler olduğu tespit edilmiĢtir. Zeytin örneklerinden daha çok Leuconostoc spp., süt örneklerinden Lactobacillus ve peynir örneklerinden de genel olarak Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Lactococcus spp. izole edilmiĢtir. 62 Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus spp. Leuconostoc lactis, Leuconostoc garlicum Leuconostoc citreum 7,5% 17,5% 2,5% Weissella spp. 5,0% Weissella cibaria 5,0% 2,5% Leuconostoc pseumesenteroides, 2,5% 2,5% Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus curvatus, Lactobacillus 5,0% 5,0% graminis, Lactobacillus sakei 2,5% Leuconostoc spp. 7,5% 5,0% Lactococcus lactis 2,5% 7,5% Leuconostoc pseudomesenteroides 20,0% Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus curvatus Lactobacillus spp. Enterococcus faecalis Lactobacillus plantarum Şekil 4.9. Ġzole edilen mikroorganizmaların tür bazında dağılımı (%) Ġzolatların tür bazında dağılımları incelendiğinde en çok farklı türün izole edildiği gıdalar iĢlenmemiĢ yeĢil zeytin ve köy peyniri olarak belirlenmiĢ olup, çiğ süt ve iĢlenmemiĢ yeĢil-siyah zeytinlerden izole edilen laktik asit bakterilerinin ise daha az çeĢitlilik gösterdiği belirlenmiĢtir. Ġzolatların cins ve tür bazında tanıları, BLAST algoritması kullanılarak belirlenmiĢ olup, tanılanan türlerin benzerlik yüzdeleri ve eriĢim kod numaraları Çizelge 4.3‟ te verilmiĢtir. 63 Çizelge 4.3. Ġzolatların cins ve tür bazında tanımlanma sonuçlarına ait bilgiler İzolat numarası (elde Benzerlik Erişim Tanılanan Tür edildiği kaynak) oranı (%) kodu FE1 (çiğ süt) Lactobacillus rhamnosus 96 KY041760.1 FE2 (çiğ süt) Lactobacillus rhamnosus 97 KY780506.1 FE3 (çiğ süt) Lactobacillus rhamnosus 97 MF369976.1 FE4 (çiğ süt) Lactobacillus rhamnosus spp. 96 MF348222.1 FE5 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc lactis, Leuconostoc 97 EU794734.1 zeytin-Aydın) garlicum FE6 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc citreum 98 KT968364.1 zeytin-Aydın) FE7 (işlenmemiş yeşil Weissella spp. 92 LC071832.1 zeytin-Aydın) FE8 (işlenmemiş yeşil Lactococcus lactis 98 KU315069.1 zeytin-Aydın) FE9 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc citreum 95 LC269258.1 zeytin-Aydın) FE10 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc pseudomesenteroides 95 KC417008.1 zeytin-Aydın) FE11 (işlenmemiş yeşil- Leuconostoc mesenteroides 96 MG754625.1 siyah zeytin-Gemlik) FE12 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc lactis, Leuconostoc 95 MG462066.1 zeytin-Gemlik) garlicum FE13 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc spp. 94 HQ450732.1 zeytin-Gemlik) FE14 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc pseudomesenteroides, 98 KF263165.1 zeytin-Gemlik) Leuconostoc mesenteroides FE15 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc spp. 96 LT853601.1 zeytin-Gemlik) FE16 (işlenmemiş yeşil Weissella cibaria 98 KP889227.1 zeytin-Gemlik) FE17 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc spp. 94 EU177643.1 zeytin-Gemlik) FE18 (işlenmemiş yeşil Leuconostoc mesenteroides 98 HF562948.1 zeytin-Gemlik) FE20 (işlenmemiş yeşil- Lactobacillus plantarum 95 KR858841.1 siyah zeytin -İznik) FE22 (köy peyniri-1) Lactococcus lactis 99 KU899030.1 FE23 (köy peyniri-1) Weissella cibaria 99 CP022606.1 FE24 (köy peyniri-1) Lactococcus lactis 97 KT124596.1 FE25 (köy peyniri-1) Lactobacillus curvatus 95 KX156239.1 FE26 (köy peyniri-1) Lactobacillus spp. 97 MF784248.1 Lactobacillus curvatus, Lactobacillus FE27 (köy peyniri-1) 97 MG430196.1 graminis, Lactobacillus sakei FE28 (köy peyniri-1) Enterococcus faecalis 97 MF498498.1 FE29 (köy peyniri-2) Lactobacillus plantarum 92 KX129818.1 FE30 (köy peyniri-2) Lactococcus lactis 98 KC692209.1 FE31 (köy peyniri-2) Lactobacillus plantarum 94 MF369878.1 FE32 (köy peyniri-2) Lactococcus lactis 98 HG798459.1 FE34 (köy peyniri-2) Lactobacillus plantarum 98 JN573608.1 FE35 (köy peyniri-2) Lactobacillus plantarum 95 LC164742.1 FE36 (köy peyniri-2) Lactobacillus plantarum 97 JN573608.1 64 Çizelge 4.3. Ġzolatların cins ve tür bazında tanımlanma sonuçlarına ait bilgiler (devam) İzolat numarası (elde Benzerlik Erişim Tanılanan Tür edildiği kaynak) oranı (%) kodu FE37 (köy peyniri-2) Lactobacillus plantarum 97 FJ751793.1 FE38 (köy peyniri-3) Lactococcus lactis 98 KU899006.1 FE39 (köy peyniri-3) Lactococcus lactis 97 KC692209.1 FE40 (köy peyniri-3) Lactococcus lactis 96 MF185375.1 FE41 (köy peyniri-4) Lactobacillus curvatus 99 MF540548.1 Lactobacillus curvatus, Lactobacillus 97 KT351722.1 FE42 (köy peyniri-4) graminis, Lactobacillus sakei FE43 (köy peyniri-4) Leuconostoc mesenteroides 97 HM058639.1 Ġzolatların sekans analizi sonuçlarına göre; en çok L. lactis (% 20) ve L. plantarum (% 17,5) türlerine, çok düĢük oranlarda da L. rhamnosus spp. (% 2,5) Weissella spp. (% 2,5), Leu. pseudomesenteroides (% 2,5) ve E. faecalis (% 2,5) cins ve türlerine rastlanmıĢtır. Yapılan baĢka bir çalıĢma kapsamında 30 farklı çiğ süt örneğinden 74 adet LAB suĢu izole edilmiĢ olup, tanılanan türler arasında L. rhamnosus, L. mesenteroides, L. lactis gibi türlerin olduğu belirtilmekte ve L. rhamnosus türünün dağılımının ise %8 oranında olduğu belirtilmektedir. (Orhan 2013). Bir baĢka çalıĢmada ise çiğ ve pastörize sütlerde laktik asit bakterisi dağılımı incelenmiĢ ve L. rhamnosus suĢlarının çiğ süt örneklerinde tespit edildiği, pastörize sütlerde ise rastlanmadığı belirtilmiĢtir (Bluma ve Ciprovica 2015). Ayrıca Baumgartner ve ark. (1998) ile Pogacic ve ark. (2013) tarafından yapılan çalıĢmada, L. rhamnosus suĢuna çiğ süt örneklerinde oldukça az rastlandığı (% 1,6), ancak çiğ sütten elde edlilen sert ve yumuĢak peynirlerde daha sık rastlandığı (%25-30) belirtilmektedir. Bu durumda L. rhamnosus türünün çiğ sütün doğal biyotasında diğer Lactobacillus spp. türlerine göre daha az miktarda bulunduğu ve elde edilen sonuçların baĢka çalıĢmalar ile benzer nitelikte olduğu anlaĢılmaktadır. Köy peynirlerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin %33‟ ünü L. lactis suĢlarının oluĢturduğu belirlenmiĢtir. Yapılan benzer çalıĢmalarda (Ruggirello ve ark. 2014, Vahabzadeh ve ark. 2017) peynir üretimi sırasında uygulanan ısıl iĢlem ve olgunlaĢtırma aĢamalarının ardından en çok rastlanılan LAB türlerinden birinin L. lactis 65 olduğu belirtilmektedir. Ayrıca starter olarak peynir üretiminde kullanılabildiği ve son ürünün aromasında etkili olduğu belirtilmektedir (Ruggirello ve ark. 2014, Vahabzadeh ve ark. 2017). Hayaloğlu ve ark. (2002) ile BaĢyiğit Kılıç ve ark. (2009)‟ nın yaptıkları çalıĢmalarda Türk beyaz peynirlerinin doğal biyotasında yer alan LAB suĢlarından dominant türün L. lactis olduğu ve bunu E. faecalis, E. faecium, L. casei, L. plantarum, L. fermentum, L. brevis, Leu. lactis ve Leu. mesenteroides türleri ile diğer türlerin takip ettiği belirtilmektedir. Tez kapsamında L. lactis‟ in dominant flora olarak tespit edilmesi, diğer çalıĢmalar ile uyum göstermektedir. Ancak, peynirlerden izole edilen bakteri suĢları arasından ikinci baskın türün benzer çalıĢmalardan farklı olarak L. plantarum olduğu ve bunu L. curvatus, Leu. mesenteroides, W. cibaria, E. feacalis ve Lactobacillus spp. türlerinin takip ettiği belirlenmiĢtir. Peynirin olgunlaĢma aĢamalarına göre laktik asit bakterilerinin ortamdaki oranları değiĢkenlik gösterebildiği (Hayaloğlu ve ark. 2002) için çalıĢmada tanılanan suĢların peynirin doğal mikrobiyotasında bulunanan LAB suĢları ile uyumlu olduğu sonucuna varılmıĢtır. YeĢil ve siyah ham zeytinlerin sofralık zeytine iĢlenmesi aĢamalarında izole edilen LAB suĢlarından en çok Lactobacillus cinsine rastlandığı ve bunu takiben Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc ve Lactococcus cinslerinin gözlemlendiği Hurtado ve ark. (2012) ile Bonatsou ve ark. (2017) tarafından belirtilmektedir. Bu çalıĢmada ise ham zeytinden izole edilerek tanılanan suĢlar arasında en çok görülen LAB cinsinin Leuconostoc olduğu ve diğer cinslerin genel olarak birbiri ile yakın oranlarda izole edildiği gözlemlenmiĢtir. Ayrıca diğer çalıĢma sonuçlarından farklı olarak, Weissella cibaria türü ham zeytin örneklerinden izole edilmiĢtir. Önceden yapılan çalıĢmalarda zeytinden izole edilen LAB cinsleri içinde Weissella spp.‟ ye rastlanmadığı, ancak; zeytin ağaçlarının kök kısmındaki rizosfer tabakasından Weissella cinsine ait bazı türlerin izole edildiği belirtilmektedir (Fhoula ve ark. 2013). Weissella cinsi, toprak örneklerinden de izole edilebilmektedir. Elde edilen sonuçlar göz önüne alındığında, ham zeytinin toplanması aĢamasında, meyvelerin toprak ile temasının söz konusu olabileceği ve bu nedenle W. cibaria suĢuna zeytin mikrobiyotasında rastlanmıĢ olabileceği düĢünülmektedir. W. cibaria türüne daha çok süt ve ürünlerinde rastlandığı önceki çalıĢmalarda bildirilmektedir. Keçi ve inek sütlerinden, ayrıca klinik örneklerden 66 Weissella cinsine ait türlerin izole edildiği, ancak çiğ sütlerden izole edilen W. cibaria‟ nın probiyotik özellik gösterdiği, bakteriyosin ürettiği ve gıdaların doğal fermentasyonunda yer alan önemli LAB suĢlarından biri olduğu vurgulanmıĢtır (Elavarasi ve ark. 2014). Bu özellikleri göz önüne alındığında, zeytin fermentasyonunda da rol oynayabileceği ve son ürünün raf ömrünün uzamasında diğer LAB suĢları gibi önemli olabileceği düĢünülmektedir. 4.3. Tanılanan Laktik Asit Bakterilerinin Biyofilm Oluşturma Yeteneklerinin Belirlenmesi 4.3.1. “Tüp yöntemi” ile biyofilm oluşumunun incelenmesi Laktik asit bakterilerinin biyofilm oluĢturma özellikleri Tüp Yöntemine göre belirlenmiĢ ve sonuçlar EK 1‟de verilmiĢtir. Tüp yöntemine göre yapılan analiz sonuçları değerlendirildiğinde denemede kullanılan laktik asit bakterilerinin bir kısmında biyofilm oluĢumu gözlemlenirken, bazılarının ise biyofilm oluĢturamadığı sonucuna varılmıĢtır. Deneme planında tüm izolatların biyofilm oluĢturma kapasiteleri iki ayrı sıcaklık (30°C ve 37°C) ve inkübasyon süresi (24 ve 48 saat) sonunda test edilmiĢtir. Laktik asit bakterilerinin normal Ģartlarda geliĢmeleri için inkübasyon koĢulları 28-30°C‟ de 18-24 saat olup, deneme planına diğer sıcaklık ve sürelerin de dâhil edilmesi ile kültürlerin stres koĢullarında ve bunun belirli süre devam etmesi sonucunda göstermiĢ olduğu tepki ve biyofilm oluĢturma dereceleri de gözlemlenebilmiĢtir. Sıcaklık ve süre koĢulları normal geliĢim koĢullarından farklılaĢtıkça, bazı izolatlarda biyofilm oluĢturma kapasitesinin arttığı, bazı izolatların ise normal geliĢim koĢullarında daha yoğun biyofilm tabakası oluĢturdukları gözlemlenmiĢtir. Bu durum, izolatların stres koĢullarındaki dayanıklılıkları hakkında da bilgi vermektedir. 67 Biyofilm oluĢturma koĢulları her bir mikroorganizma için farklılık gösterebilmektedir. Sıcaklık ve inkübasyon süresi değiĢimi ya da mikroorganizmanın özelliklerine göre farklı stres koĢullarının oluĢturulması, biyofilm oluĢturma kapasitesini etkileyebilmektedir. ÇalıĢmada planlana dört farklı inkübasyon koĢulunda gözlemlenen biyofilm oluĢum değerleri birbirinden farklılık göstermektedir. Dört ayrı deneme grubu birlikte değerlendirildiğinde, LAB suĢlarının yarıdan fazlasının (%55-82,5) farklı inkübasyon koĢullarında zayıf biyofilm oluĢturduğu, çok az suĢun (%2,2-10) orta düzeyde biyofilm oluĢturduğu ve yine çok az suĢun da (%2,2-10) güçlü biyofilm oluĢturduğu gözlenmiĢtir. Literatürde tüp yöntemi patojen mikroorganizmaların biyofilm oluĢturma kapasitelerinin belirlenmesinde kullanılmıĢ olup, laktik asit bakterilerinin biyofilm oluĢturma kapasiteleri moleküler yöntemler ile, SEM mikroskobu ile ya da mikroplaka yöntemi ile belirlenmiĢtir (Cengiz ve ark. 2006, Hassan ve ark. 2011, Abebe 2013, Demirhan 2013, Tanrıbuyurdu 2014). 4.3.2. “96 kuyucuklu plaka yöntemi” ile biyofilm oluşumunun incelenmesi Laktik asit bakterilerinin biyofilm oluĢturma özellikleri 96 kuyucuklu plaka yöntemine göre belirlenmiĢ ve sonuçlar EK 2‟ de verilmiĢtir. 96 kuyucuklu plaka yöntemine göre dört ayrı inkübasyon koĢulu sonucunda suĢların oluĢturduğu biyofilm düzeyleri belirlenmiĢ olup, LAB suĢlarının büyük çoğunluğunun biyofilm oluĢturamadığı anlaĢılmıĢtır. Ġzole edilerek tanılanan LAB suĢlarının %22,5- 27,5‟ inin zayıf biyofilm oluĢturdukları, daha az sayıda suĢun (%10-20) orta düzeyde biyofilm oluĢturabildiği, sadece bir LAB suĢunun (Lactococcus lactis FE30) ise “24 saat-37ºC” inkübasyon koĢulunda güçlü biyofilm oluĢturabildiği anlaĢılmıĢtır. Biyofilm oluĢumu gözlenen laktik asit bakterileri arasında ise daha çok “zayıf biyofilm üreten” suĢların olduğu sonucuna varılmıĢtır. Arena ve ark. (2017) tarafından yapılan bir çalıĢmada laktik asit bakterilerinin genetik olarak özellikle bağırsak yüzeylerine tutunma kabiliyetinin pili varlığı ile karakterize edildiği belirtilmekte olup, L. lactis suĢlarında da spaFED operonunun mukus bağlama ve yüzey lokalizasyonunda görev aldığı belirlenmiĢtir. Bu durum L. lactis suĢlarının biyofilm oluĢturabileceğini 68 moleküler olarak açıklamaktadır. L. lactis‟ te pili olmasını sağlayan gen kümesi plazmid üzerine kodlandığı için, biyofilm oluĢturabilme özelliğinin Lactococcus spp. arasında gen transferi ile birbirine aktarılabileceği de belirtilmektedir. Mikroplaka ile biyofilm ölçümü yapılan bir baĢka çalıĢmada ise L. lactis 368 suĢunun 30ºC‟ de 48 saatlik inkübasyon sonunda güçlü düzeyde biyofilm oluĢturduğu belirtilmektedir (Gómez ve ark. 2016). SuĢların izole edildiği ortam ve genetik özellikleri farklı olabileceğinden farklı koĢullarda biyofilm oluĢturabilecekleri düĢünülmektedir. Stres koĢulları oluĢturulduğunda, bazı mikroorganizmalar yaĢamlarını sürdürebilirken, bazıları canlılığını koruyamamaktadır. Optimum geliĢme koĢulları dıĢına çıkıldığında yaĢamlarını devam ettirebilen mikroorganizmalardan bazıları ise biyofilm oluĢturma yeteneğini kaybedebilirken, bazıları da stres koĢullarında daha yoğun biyofilm oluĢturabilmektedir. ÇalıĢmada kullanılan LAB suĢları göz önüne alındığında, bazılarında optimum geliĢme koĢulları (30°C de 24 saat) dıĢına çıkıldığında biyofilm oluĢturma kapasitesinin arttığı, bazılarında ise azaldığı gözlemlenmiĢtir. Bu nedenle stres koĢullarının biyofilm oluĢumu üzerine olumlu/olumsuz etkisi ile ilgili kesin kanıya varmak olanaklı olmamıĢtır. L. plantarum FE29 suĢunun 96 kuyucuklu plaka yöntemi ile analizi sonucunda 24 saatlik inkübasyon koĢullarında 37°C‟ de biyofilm oluĢturma kapasitesi “zayıf” olarak belirlenmiĢtir. Ancak 30°C‟ de aynı süre sonundaki biyofilm oluĢturma düzeyi ile karĢılaĢtırıldığında, 37°C‟ de B değerinde artıĢ olduğu gözlenmektedir. Bu sonuç, L. plantarum FE29 suĢunun stres koĢullarında biyofilm oluĢturma kapasitesinin artabildiğini göstermektedir. Ayrıca inkübasyon süresi uzatıldığında 48 saatlik inkübasyon sonucunda 30°C‟ de gözlemlenen biyofilm değeri (zayıf), 37°C‟ lik inkübasyon koĢulunda artarak, “orta düzey” biyofilm değerine ulaĢmıĢtır. 37°C‟ de 48 saatlik inkübasyon sonunda B değeri 0,9 olarak hesaplanmıĢtır. 1,0 ve üzeri değerler ise “güçlü biyofilm oluĢumu” aralığında bulunmaktadır. L. plantarum FE29 suĢunun güçlü biyofilm oluĢturma değeri sınırına da yaklaĢmıĢ olması, stres koĢulları altında iken biyofilm oluĢturma kapasitesinin artabileceği konusunda fikir vermektedir. Jalilsood ve ark. (2015) tarafından yapılan çalıĢmada inkübasyon sıcaklığı 30ºC‟ den 35ºC‟ ye 69 çıkarıldığında L. plantarum suĢunun biyofilm oluĢturma kapasitesinin de arttığı belirtilmektedir. Stres koĢullarının oluĢması ile biyofilm oluĢumunun da arttığı, bu çalıĢmada elde edilen bulgular ile uyumluluk göstermektedir. Aoudia ve ark. (2016) tarafından yapılan bir çalıĢmada ise 30°C‟ de 24 saat inkübasyon sonunda mikroplaka ile ölçülen biyofilm değerlerinin L. plantarum WCFS1 ve L. plantarum NA7 suĢlarında L. fermentum suĢlarına göre daha yüksek düzeyde olduğu belirlenmiĢtir. Denemede tek sıcaklık ve süre koĢulu kullanılmıĢ olup, tez kapsamında elde edilen veriler ile karĢılaĢtırıldığında L. plantarum suĢlarının farklı koĢullarda farklı düzeylerde biyofilm oluĢturabildiği anlaĢılmaktadır. Kumar ve ark. (2017) tarafından yapılan bir baĢka çalıĢmada ise biyofilm oluĢturan LAB suĢlarının metisiline dirençli Staphylococcus aureus S547 suĢu üzerine inhibisyon etkisi incelenmiĢtir. Kefirden izole edilen L. plantarum KF suĢunun biyofilm oluĢturma kapasitesi mikroplaka yöntemi ile 37°C‟ de 48 saatlik inkübasyon sonunda belirlenmiĢ olup, denemede kullanılan koĢullarda iyi derecede biyofilm üreticisi olduğu rapor edilmiĢtir. Ayrıca biyofilm oluĢturan L. plantarum KF suĢunun S. aureus S547 geliĢimini 36 saatlik inkübasyon sonunda 2,64 log azalttığı belirtilmektedir. Kumar ve ark. (2017) tarafından belirlenen değerler, bu çalıĢmada kullanılan inkübasyon sıcaklığı ve süresi ile benzer olup, L. plantarum suĢlarının biyofilm oluĢturma kapasiteleri de birbiri ile uyumludur. Stres koĢullarında B değerindeki artıĢ L. lactis FE30 ve L. lactis FE40 suĢlarında da gözlenmiĢtir. L. lactis FE30 suĢunun biyofilm oluĢturma kapasitesi 37°C ‟de artmaktadır. Denemede 24 saatlik inkübasyon süresi sonunda biyofilm oluĢumları incelenmiĢ ve 30°C‟ de 0,1 olan B değeri, 37°C‟ de 1,1 olarak kaydedilmiĢtir. L. curvatus FE25 suĢunun biyofilm oluĢturma kapasitesi 37°C‟ de 24 saatlik inkübasyon sonunda 0,7 (orta düzey) olarak belirlenmiĢtir. Ancak 37°C‟ de inkübasyon süresi 48 saat olduğunda biyofilm oluĢum düzeyinin azaldığı ve B değerinin 0,3 olduğu gözlenmiĢtir. Bu sonuca göre, L. curvatus FE25 suĢunun biyofilm tabakasının zamanla azaldığı anlaĢılmaktadır. Laktik asit bakterileri karbon kaynaklarını kullanarak baĢta laktik asit olmak üzere bazı organik asitleri üretmektedirler. Laktik asit fermentasyonu olarak adlandırılan reaksiyon sonucunda ortaya çıkan organik asitler sayesinde 70 ortamdaki asit düzeyi artmaktadır. Yapılan çalıĢmalarda, ortamda organik asitlerin, özellikle laktik asit miktarının artması ile biyofilm tabakasının zarar görebildiği ve laktik asit fermentasyonu sonucunda inkübasyon süresi uzadıkça, biyofilm tabakasının azaldığı belirtilmektedir. Biyofilm tabakasının zarar görmesi ve azalması, ortamın pH‟sının düĢmesi ile doğrudan iliĢkilidir. Mikroorganizmalar tarafından üretilen sitrik, gallik ve laktik asit gibi tüm organik asitler yüzeylerde oluĢan biyofilm tabakasının uzaklaĢtırılmasında rol oynamaktadırlar (Kolari 2003, YeĢilçimen AkbaĢ ve Çağ 2016). Gómez ve ark. (2016) yaptıkları çalıĢmada L. curvatus suĢunun agregasyon kabiliyeti ve güçlü biyofilm oluĢturma yeteneği olduğunu belirlemiĢlerdir. Ayrıca L. curvatus suĢu, patojen mikroorganizmalar ile aynı oranda ortama aĢılanmıĢ ve ortamdaki biyofilm tabakasının hangi mikroorganizmaya ait olduğu 30°C‟de 24, 48 ve 72 saatlik inkübasyon koĢulları sonunda belirlenmiĢtir. LAB suĢlarının tutunacak yüzey konusunda da yarıĢmacı kabiliyete sahip olduğu düĢünülerek planlanan çalıĢmada L. curvatus tarafından üretilen güçlü biyofilm tabakası sayesinde ortamdaki L. monocytogenes suĢunun %69 oranında, E. coli O157:H7 suĢunun ise %74,6 oranında azaldığı tespit edilmiĢtir. ÇalıĢmada elde edilen veriler de L. curvatus suĢunun biyofilm üreticisi olduğunu göstermekte olup, yapılan çalıĢmalar ile benzer nitelikte sonuçların elde edildiği anlaĢılmaktadır. ÇalıĢmada biyofilm oluĢturma özellikleri incelenen laktik asit bakterilerinden bazıları 30°C‟de biyofilm oluĢturabilirken, 37°C‟de biyofilm oluĢumu ya daha az gözlenmiĢ ya da hiç gözlenmemiĢtir. Bazı laktik asit bakterilerinde ise biyofilm oluĢumu 37°C‟lik inkübasyon sonunda daha yoğun gözlemlenmiĢtir. Benzer durum ile 24 ve 48 saatlik inkübasyon sonucunda da karĢılaĢılmıĢtır. ÇalıĢmada tanılanan laktik asit bakterilerinin biyofilm oluĢturma kapasiteleri göz önüne alındığında, biyofilm oluĢumu için gereken koĢulların değiĢkenlik gösterdiği ve her mikroorganizma suĢu için farklı olduğu sonucuna varılmıĢtır (Gün ve Ekinci 2009, Akan ve Kınık 2014, Fonteini 2015). 71 4.3.3. Biyofilm oluşumunun belirlenmesinde kullanılan tüp ve 96 kuyucuklu plaka yöntemlerinin karşılaştırılması Biyofilm oluĢumunun incelenmesinde, “tüp yöntemi” daha çok gözleme dayalı bir yöntem olup, kalitatif sonuçlar vermektedir. Spektrofotometrik ölçüme dayalı 96 kuyucuklu plaka yönteminde ise biyofilm tabakasının yoğunluğu sayısal değerler ile belirlenebilmiĢ ve kantitatif sonuçlar elde edilebilmiĢtir. Böylece yöntemler arasında karĢılaĢtırma ve doğrulama da yapılabilmiĢtir. Tüp ve 96 kuyucuklu plaka yöntemlerinde elde edilen sonuçlar göz önüne alındığında, bazı laktik asit bakterisi suĢlarının biyofilm oluĢturma kapasiteleri her iki yöntemde de benzer bulunmuĢ ancak bazılarında sonuçların birbiri ile uyumsuz olduğu gözlenmiĢtir. L. rhamnosus FE1 suĢunun tüp yöntemine göre 30 ve 37°C‟ lik sıcaklıklarda 24 ve 48 saatlik inkübasyon süreleri sonunda biyofilm oluĢturma kapasitesi “zayıf” olarak belirlenmiĢtir. Ancak, aynı koĢullarda 96 kuyucuklu plaka ile belirlenen sonuçlara göre L. rhamnosus FE1 suĢunda biyofilm oluĢumu gözlenmemiĢtir. ÇalıĢma sonucunda bulduğumuz sonuçtan farklı olarak Gómez ve ark. (2016) yaptıkları çalıĢmada L. rhamnosus suĢunun güçlü biyofilm üreticisi olduğunu tespit etmiĢtir. Ayrıca bir baĢka çalıĢmada probiyotik L. rhamnosus GG (ATCC 53103) suĢunun biyofilm oluĢturma değeri “güçlü düzey” olarak tespit edilmiĢtir (Lebeer ve ark. 2007). L. lactis FE32 suĢunun biyofilm oluĢturma kapasitesi incelendiğinde ise tüp ve 96 kuyucuklu plaka yöntemi ile belirlenen sonuçlar birbiri ile tutarlı bulunmuĢtur. Her iki yönteme göre de 30 ve 37°C‟ lik sıcaklıklarda 24 saatlik inkübasyon ve 30°C‟ de 48 saatlik inkübasyon sonucunda L. lactis FE32 suĢunun zayıf düzeyde, 37°C‟ de 48 saatlik inkübasyon sonunda ise orta düzeyde biyofilm oluĢturduğu belirlenmiĢtir. Tüp ve 96 kuyucuklu plaka yöntemi sonuçları bazı suĢlarda birbirinden önemli derece farklılık göstermiĢtir. L. plantarum FE36 suĢunun biyofilm oluĢturma derecesi 37°C‟ de 24 ve 48 saatlik inkübasyon süreleri sonunda tüp yöntemine göre “güçlü” olarak belirlenirken, 96 kuyucuklu plaka yönteminde ise biyofilm oluĢumu gözlenmemiĢtir. 72 Benzer durum W. cibaria FE16 suĢunda da gözlenmiĢtir. Tüp yöntemi sonucuna göre 37°C‟ de 24 saatlik inkübasyon sonunda orta düzeyde biyofilm oluĢumu gözlenirken, 96 kuyucuklu plaka yönteminde zayıf biyofilm oluĢumu gözlenmiĢtir. Yapılan bir baĢka çalıĢmada (Jang ve ark. 2016) W. cibaria suĢları ile ağız sağlığı için önemli olan probiyotik bakterilerinin karakteristik özellikleri karĢılaĢtırılmıĢtır. W. cibaria CMU suĢunun yüzeye tutunma yeteneği olduğu belirlenmiĢ ve biyofilm oluĢturma kapasitesinin varlığı anlaĢılmıĢtır. Jang ve ark. (2016) tarafından belirlenen sonuçlar ile tez kapsamında 96 kuyucuklu plaka yöntemi ile elde edilen sonuçlar birbiri ile benzer niteliktedir. Ġki yöntem arasında farklılıkların olması, yöntemlerin birbiri ile kıyaslanmasını sağlamıĢtır. Tüp yönteminde, inkübasyon sonunda oluĢan biyofilm tabakasının yoğunluğu ile doğru orantılı olacak Ģekilde tüplerin iç çeperlerinde ve tabanında boyanmıĢ biyofilm tabakası gözlenmiĢtir. Yoğun biyofilm tabakasının olduğu örneklerde kristal viyole ile boyanmıĢ tabakanın daha koyu renkli ve kalın olması, beklenen bir sonuçtur. Ancak tüp yöntemine göre yapılan analizde “orta düzey/yoğun biyofilm oluĢumu” olarak değerlendirilen bazı sonuçlar, ikinci yöntemde farklı çıkmıĢtır. Tüp yönteminde, inkübasyon sonunda mikrobiyel sayım iĢlemi yapılmamaktadır. Bu nedenle görünür Ģekilde boyanmıĢ biyofilm tabakası, “orta düzeyde” ya da “güçlü biyofilm düzeyi” olarak belirlenebilmektedir. Ancak, yoğun Ģekilde boyanmıĢ tabakanın varlığı, test mikroorganizmasının güçlü biyofilm üreten bir suĢ olarak kabul edilebileceği anlamına gelmeyebilir. Çünkü biyofilm oluĢturma düzeyi, ortamdaki hücre yoğunluğu ve yüzeye tutunmuĢ biyofilm tabakası ile doğrudan iliĢkilidir. Yüzeye tutunabilme kabiliyeti az olan bir suĢun hücre yoğunluğu arttıkça yüzeye tutunan ve biyofilm tabakası oluĢturabilen hücre sayısı da artmaktadır. Bu durumda tüp yöntemi ile biyofilm oluĢumu incelendiğinde biyofilm oluĢturma yeteneği az ya da yetersiz de olsa, hücre yoğunluğunun fazla olması nedeniyle, boyanmıĢ biyofilm tabakası da yoğun ve kalın olmaktadır. Gözlemlenen boyanmıĢ tabaka, suĢun güçlü biyofilm üreticisi olduğu Ģeklinde yorumlanırsa hatalı bir sonuca varılabilir. Biyofilm oluĢum düzeyinin daha net anlaĢılabilmesi için, mutlaka ortamdaki hücre yoğunluğu ile beraber değerlendirilmesi gerektiği görüĢüne varılmıĢtır. Sonuçta hücre 73 yoğunluğu ile karĢılaĢtırma yapılmadığında analiz sonuçları hatalı yorumlanabilmektedir. Biyofilm oluĢturma yeteneği olan bir bakteri kültürü, belirli inkübasyon süresi sonunda biyofilm oluĢturma kapasitesi daha düĢük düzeyde olan bir bakteri kültürüne göre daha az hücre yoğunluğuna ulaĢabilmektedir (EK 2). Bu durumda ortamda meydana gelen biyofilm tabakası da hücre yoğunluğu ile doğru orantılı olarak ince bir katman halinde gözlemlenebilmektedir. OluĢan biyofilm tabakası yoğunluğuna göre değerlendirme yapıldığında, suĢun biyofilm oluĢturma yeteneğinin zayıf olduğu kanısına varılabilmektedir. Daha fazla hücre yoğunluğuna ulaĢan kültürün biyofilm oluĢturma düzeyi ise ortamda fazla sayıda yüzeye tutunan hücre bulunduğu için, daha güçlü olarak gözlemlenebilmektedir. Ayrıca, inkübasyon süresi sonunda besiyeri içerisinde hücre yoğunluğu az olan kültürün, biyofilm oluĢturma yeteneği olsa bile, tüp çeperi ve tabanına tutunan hücre sayısı da az olacağı için, kristal viyole ile boyanan tabaka açık renkli ve az yoğunlukta olmaktadır. Bu durumda tüp yöntemine göre yapılan analiz sonucunda suĢun biyofilm oluĢturma düzeyi, “zayıf” olarak belirlenmektedir. Ancak, biyofilm oluĢturma kabiliyeti daha zayıf olan ve aynı inkübasyon süresinde daha fazla hücre yoğunluğuna ulaĢabilen bir baĢka kültürün tüp yöntemi ile biyofilm oluĢturma yeteneği diğer kültür ile aynı ya da daha yoğun olarak belirlenmektedir. Bu nedenle tüp çeperi ve tabanında gözlenen boyanmıĢ tabakanın yoğun ya da zayıf olması, doğrudan biyofilm oluĢturma derecesi ile bağdaĢtırıldığında, yanlıĢ sonuçlara ulaĢılabilmektedir. Ġnkübasyon sonrasında hücre yoğunluğu belirlenmediği için, tüp yönteminin çok hassas bir yöntem olmadığı (EK 1, EK 2) sonucu ortaya çıkmaktadır (Oliveira ve Cunha 2010, Hassan ve ark. 2011, Devaraj ve Sajjan 2015). 96 kuyucuklu plaka ile gerçekleĢtirilen denemelerde ise biyofilm tabakası boyanmadan önce, spektrofotometrik yöntemler ile hücre yoğunluğu ölçülmüĢ, sonrasında ise biyofilm tabakası boyanmıĢtır. Biyofilm tabakası ne kadar kalın ise tutulan boya da o kadar yoğun olmaktadır. Tutulan boyanın alkol ile serbest hale getirilmesinden sonra boyanın yoğunluğu da spektrofotometrik olarak ölçülmüĢ ve biyofilm tabakasına bağlanan boyanın absorbansı, hücre yoğunluğu absorbansına bölünerek biyofilm 74 oluĢturma kapasiteleri değerlendirilmiĢtir. Bağlı boyanın absorbans değerinin hücre yoğunluğu absorbansına bölünmesi ile suĢların hücre yoğunlukları eĢitlenmekte ve her bir suĢun biyofilm oluĢturma dereceleri, hücre yoğunluklarından bağımsız olacak Ģekilde değerlendirilebilmektedir. Her iki yöntem sonucunda ulaĢılan değerler gözlemlenmiĢ ve 96 kuyucuklu plaka ile yapılan denemelerin daha güvenilir ve hassas sonuçlar verdiği anlaĢılmıĢtır. Hassan ve ark. (2011) yaptıkları çalıĢmalarda biyofilm oluĢumunun belirlenmesinde kullanılan yöntemleri birbiri ile kıyaslamıĢlardır. Yaptıkları çalıĢmada tüp yönteminde buldukları bazı sonuçların 96 kuyucuklu plaka yönteminde buldukları sonuçlara benzer olduğunu, ancak genel olarak yalancı pozitif sonuçların tüp yönteminde çok daha sık gözlemlendiğini belirtmektedirler. Mikroplaka ile yapılan spektroskopik yöntemin tüp yöntemine göre çok daha hassas ve doğru sonuçlar verdiği belirtilmektedir (Hassan ve ark. 2011). Bir baĢka çalıĢmada da, koagulaz negatif Staphylococcus spp.‟ nin biyofilm oluĢturma düzeyi farklı yöntemlere göre belirlenmiĢtir. Biyofilm oluĢumu ile ilgili genler PZR ile tespit edilmiĢ olup, aynı zamanda da tüp yöntemi ve mikroplata yöntemi kullanılmıĢtır. Hem tüp yönteminde, hem de mikroplaka yönteminde alınan sonuçların PZR ile elde edilen sonuçlara yakın olduğu belirtilmektedir. Bu çalıĢmada tüp yönteminde sadece tüp tabanında meydana gelen boyanmıĢ tabaka varlığı pozitif olarak kabul edilmiĢ, besiyeri ile havanın birleĢtiği yerde meydana gelen boyanmıĢ halka Ģeklindeki tabaka, biyofilm oluĢumu ile bağdaĢtırılmamıĢtır (Oliveira ve Cunha 2010). Devaraj ve Sajjan (2015) tarafından yapılan çalıĢmada da biyofilm belirleme yöntemleri birbiri ile karĢılaĢtırılarak, yöntemler arasındaki hassasiyet farkları bulunmaya çalıĢılmıĢtır. Sonuçlardaki hassasiyet, mikroplaka yönteminde %98,08 oranında, tüp yönteminde ise %71,88 oranında bulunmuĢtur. Tez kapsamında, güvenilir ve hassas sonuçların 96 kuyucuklu plaka yöntemi ile elde edildiği, tüp yönteminin hassasiyetinin ise daha düĢük olduğu belirlenmiĢ olup, elde edilen sonuçların benzer çalıĢmalardaki sonuçlar ile uyumluluk gösterdiği anlaĢılmıĢtır. Tüp yöntemi kalitatif bir yöntem olduğu için, biyofilm oluĢturma derecesinin bu yönteme göre belirlenmesi yerine, biyofilm oluĢumu açısından “var/yok testi” olarak ön denemelerde kullanılmasının daha doğru olacağı sonucuna varılmıĢtır. Biyofilm 75 oluĢturma kapasitelerinin derecelendirilmesi için ise tüp yöntemi ile yapılan ön denemeler sonucunda biyofilm oluĢturabildiği belirlenen suĢların 96 kuyucuklu plaka yöntemi ile analiz edilmesi ve sonuçlara göre biyofilm oluĢturma seviyelerinin belirlenmesinin daha doğru olduğu düĢünülmektedir. L. plantarum FE29 suĢunun 30°C‟ de 24 saatlik inkübasyonu sonucunda belirlenen biyofilm oluĢturma düzeyi tüp ve 96 kuyucuklu plaka yöntemi ile belirlenmiĢ ve karĢılaĢtırmalı olarak ġekil 4.10.‟da verilmiĢtir. Şekil 4.10. L. plantarum FE29 suĢunun 30°C ve 37°C‟ de 24 saat inkübasyonu sonunda biyofilm oluĢturma kapasitesi; “a”, “c”: Tüp yöntemi; “b”, “d”: 96 kuyucuklu plaka yöntemi ġekil 4.10‟ da 30 ve 37°C‟ lik inkübasyon koĢulları sonucunda oluĢan biyofilm düzeyi kristal viyolenin bağlanma miktarına göre görsel olarak incelendiğinde, yoğun ve koyu renkli boyanın varlığı gözlenmektedir. Tüp yönteminde gözden kaçan ve hatalı değerlendirmelere neden olan bu durum, spektrofotometrik ölçüm yapılmadığı takdirde 96 kuyucuklu plaka yönteminde de aynı Ģekilde ortaya çıkmaktadır. 30°C‟ de 24 saat 76 inkübasyon, laktik asit bakterilerinin bir çoğu için optimum geliĢme koĢulu olarak bilinmektedir. Bu nedenle aynı süre sonunda 37°C‟ de inkübe edilen kültürün, 30°C‟ de inkübe edilene göre daha az hücre sayısına ulaĢmıĢ olması beklenilen bir sonuçtur. Tüp yöntemi sonuçları incelendiğinde, 37°C‟ de inkübasyon sonucunda tüp çeperlerinde ve tabanında boyanmıĢ biyofilm tabakasının 30°C‟ lik inkübasyonun ardından gözlemlenen biyofilm tabakasına göre daha az olduğu sonucuna varılmıĢ ve bu nedenle oluĢum “zayıf düzeyde” olarak nitelendirilmiĢtir. Ancak 96 kuyucuklu plaka yöntemine göre hücre yoğunluğu absorbansı ile biyofilm tabakasının bağladığı kristal viyole çözeltisinin absorbansının birbirine oranı, biyofilm oluĢturma kapasitesini belirlemektedir. Bu nedenle 30°C‟ de daha yoğun ve koyu renkli olarak gözlenen boya ile bağlanmıĢ biyofilm tabakasının nedeninin, ortamdaki hücre yoğunluğunun fazla olması ve dolayısı ile yüzeye tutunan hücre sayısının da fazla olmasından kaynaklandığı anlaĢılmaktadır. Oransal değerlere bakıldığında ise B değerinin 37°C‟ de 24 saat inkübe edilen kültürde daha yüksek olduğu gözlenmiĢtir. Ancak her iki inkübasyon sıcaklığındaki biyofilm oluĢturma kapasitesi de “zayıf düzey” aralığındadır (EK 2). L. lactis FE40 suĢunun 30 ve 37°C‟ de 48 saat süre ile inkübasyonu sonucunda oluĢturduğu biyofilm tabakası da hem tüp, hem de 96 kuyucuklu plaka yöntemi ile belirlenmiĢ ve ġekil 4.11‟ de her iki yönteme göre karĢılaĢtırmalı olarak verilmiĢtir. 77 Şekil 4.11. L. lactis FE40 suĢunun 30°C ve 37°C‟ de 48 saat inkübasyonu sonunda biyofilm oluĢturma kapasitesi; “a”, “c”: Tüp yöntemi; “b”, “d”: 96 kuyucuklu plaka yöntemi L. lactis FE40 suĢunun 30 ve 37°C‟ de 48 saatlik inkübasyonu sonucunda biyofilm oluĢturma kapasiteleri belirlenmiĢtir. Tüp ve 96 kuyucuklu plaka yöntemine ait sonuçlar karĢılaĢtırılmıĢtır. ġekil 4.11‟ de görüldüğü gibi bağlanan boya miktarı tüp çeperlerinde ve plaka kuyucuklarında benzer görünmektedir. Ancak hücre yoğunluklarının birbiririnden farklı olduğu, 96 kuyucuklu plaka yönteminde inkübasyon sonunda ölçülen absorbans değerleri ile anlaĢılmıĢtır. Hücre yoğunlukları ve bağlanan boya miktarları birbirinden farklı olan iki ayrı inkübasyon koĢulu sonucu göz önüne alındığında, 37°C‟ lik inkübasyon koĢulunda daha az hücre geliĢimi gözlenmesine rağmen, biyofilm oluĢturma kapasitesinin arttığı anlaĢılmıĢtır. 96 kuyucuklu plaka yönteminde alınan sonuçlara göre 30°C‟ de 48 saat inkübasyon sonucunda “zayıf düzey” biyofilm oluĢumu gözlenirken, 37°C‟ de 48 saat inkübasyon sonucunda “orta düzey” biyofilm oluĢumu gözlemlenmiĢtir (EK 2). 78 Biyofilm oluĢumunun daha çok patojen mikroorganizmalarda gözlenen bir özellik olduğu ve patojenlerin virülens özelliklerinin artması, daha dirençli hale gelmeleri gibi insan sağlığını olumsuz yönde etkileyen sonuçlara yol açtığı da bilinmektedir. Ancak biyofilm, sağlığı olumsuz yönde etkileyen mikroorganizmalarda engellenilmeye çalıĢılan bir özellik olmasına rağmen, insan sağlığına faydalı mikroorganizmalarda ise istenilen bir özellik haline gelebilmektedir. Yararlı mikroorganizmaların daha dayanıklı olmaları ve patojen mikroorganizmalar ile savaĢmaları açısından biyofilm oluĢturan suĢların belirlenmesi gerektiği düĢünülmektedir (Gün ve Ekinci 2009, Erginkaya ve ark. 2011). Tez kapsamında analiz edilen laktik asit bakterilerinin biyofilm oluĢturma özellikleri belirli geliĢme koĢulları altında belirlenmiĢtir. Ġnsan sağlığına faydalı olan mikroorganzimaların kullanımı söz konusu olduğunda gıdanın tüketimi ile vücuda alınan LAB suĢlarının sindirim sisteminde uzun süre canlılığını koruması ve biyofilm oluĢturma kapasitesinin devamlılık göstermesi önemlidir. Ayrıca fermente bir gıda üretiminde starter olarak kullanıldığında, doğal koruyucu özellik göstererek, gıdanın tazeliğini uzun süre muhafaza edebilmesi için biyofilm oluĢturma kapasitesinin saklama koĢullarında azalmaması ya da kaybolmaması gerekmektedir. Yapılan in vitro analiz sonuçlarına göre, 24 saatlik inkübasyon sonunda biyofilm oluĢturabildiği gözlemlenen bazı laktik asit bakterilerinin 48 saatlik inkübasyon sonunda biyofilm oluĢturma derecelerinin azaldığı ya da biyofilm oluĢturma özelliklerinin tamamen engellendiği belirlenmiĢtir. Bu nedenle 48 saatlik inkübasyon sonunda gözlemlenen biyofilm oluĢturma kapasiteleri, suĢların gıda endüstrisinde kullanımı açısından önemli bir faktör haline gelmektedir. Ayrıca, insan sindirim sisteminde 48 saat sonunda bile biyofilm oluĢturabilme ihtimali yüksek olan suĢların seçilmesi gerekliliği de dikkat çekmektedir. 48 saatlik inkübasyon sonucunda laktik asit bakterilerinin hem 30, hem de 37°C‟ de biyofilm oluĢturma kapasiteleri ġekil 4.12‟ de verilmiĢtir. 79 Şekil 4.12. Laktik asit bakterilerinin 30 ve 37°C‟ de 48 saat inkübasyonu sonucunda belirlenen biyofilm oluĢturma kapasiteleri 80 48 saatlik inkübasyon sonunda en yoğun biyofilm oluĢumu L. curvatus FE41 suĢunda 37°C‟ de gözlemlenmiĢtir. Aynı inkübasyon koĢullarında biyofilm oluĢum yoğunluğu açısından, L. curvatus FE41 suĢunu, L. lactis FE32 ve L. plantarum FE29 takip etmektedir. Ġnkübasyon sıcaklığının 30°C olduğu koĢullarda ise 48 saat sonunda L. plantarum FE29 suĢunun en yoğun biyofilm oluĢturan kültür olduğu anlaĢılmıĢtır. ÇalıĢmada elde edilen biyofilm oluĢturma değerleri Gómez ve ark. (2016) ve Kumar ve ark. (2017)‟ nin yaptıkları çalıĢma sonuçları ile uyumluluk göstermektedir. Köy peynirinden izole edilen E. faecalis FE28 suĢunun biyofilm oluĢturma kapasitesi tüp ve mikroplaka yöntemlerinde birbirinden farklı bulunmuĢtur. Tüp yönteminde farklı inkübasyon koĢullarında zayıf ve orta derecede biyofilm üreticisi olarak belirlenen E. faecalis FE28 suĢunun, mikroplaka ile belirlenen spektroskobik yöntemde dört ayrı inkübasyon koĢulunda da biyofilm oluĢturamadığı sonucuna varılmıĢtır. 96 kuyucuklu plaka ile alınan sonuçlar daha hassas ve güvenilir oldukları için, E. faecalis FE28 suĢunun biyofilm üreticisi olmadığı belirlenmiĢtir. Necidová ve ark. (2009) tarafından yapılan bir çalıĢmada, E. faecalis ve E. faecium suĢları çiğ süt ve süt ürünlerinden izole edilerek biyofilm oluĢturma kapasiteleri araĢtırılmıĢtır. E. feacalis suĢlarının %28‟ inin biyofilm oluĢturabildiği, %72‟ sinin ise oluĢturamadığı belirlenmiĢtir. Ayrıca bir baĢka çalıĢmada ortamdaki ozmotik basıncın artması ile E. faecalis suĢlarının biyofilm oluĢturma kapasitelerinin azaldığı, ancak bakterilerin geliĢme eğrilerinde değiĢiklik olmadığı belirtilmektedir (Mohamed ve Huang 2007). Önceden yapılan çalıĢma sonuçları dikkate alındığında, E. faecalis suĢlarının farklı stres koĢullarında farklı düzeyde biyofilm oluĢturdukları ve bazılarının da biyofilm oluĢturamadığı anlaĢılmaktadır. Tez kapsamında elde edilen sonuçlar da, önceki çalıĢmalar ile uyum göstermektedir. Tanılanan 40 adet laktik asit bakterisi kültürleri arasında 21 tanesi, çalıĢmada belirlenen koĢullarda zayıf, orta ve güçlü düzeyde biyofilm oluĢturabilmiĢ, ancak diğer suĢlar biyofilm oluĢturamamıĢlardır. Her suĢun kendine özgü biyofilm oluĢturma koĢullarının olabileceği göz önünde bulundurularak, çalıĢmada biyofilm oluĢturmayan suĢların, hiçbir koĢulda biyofilm oluĢturamadığı kanısına varmanın hatalı olacağı 81 düĢünülmektedir. SuĢların farklı inkübasyon koĢullarında biyofilm oluĢturabilecekleri göz önünde bulundurulmalıdır (Jalilsood ve ark. 2015). ÇalıĢmada izole edilerek tanılanan LAB suĢlarının biyofilm oluĢturma kapasitelerinin belirlenmesi için seçilen stres koĢulları uzun inkübasyon süresi (48 saat) ve iki ayrı inkübasyon sıcaklığı (30 ve 37ºC) olacak Ģekilde planlanmıĢtır. Antimikrobiyel bir ajanın da ortamda bulunması, mikroorganizma için farklı bir stres ortamı yaratmaktadır. Mikroorganizmaların biyofilm tabakası içinde iken planktonik formlarına göre zor koĢullara karĢı daha dirençli oldukları bilinmektedir. Bu bağlamda, mikroorganizmalarda antibiyotik dirençliliğin de biyofilm oluĢumunun bir sonucu olabileceği düĢüncesi ortaya çıkmaktadır. Ancak tetrasiklin gibi geniĢ spektrumlu antibiyotiklerin biyofilm tabakasını aĢarak mikroorganizmalara ulaĢabileceği ve mikrobiyel inhibisyonu sağlayabileceği (Oliveira ve Cunha 2010) de bilinmektedir. 4.4. Tanılanan Laktik Asit Bakterilerinin Antibiyotik Dirençlerinin Belirlenmesi Laktik asit bakterilerinin antibiyotik dirençleri disk difüzyon yöntemine göre belirlenmiĢ ve zon çapı ölçümlerine ait sonuçlar EK 3‟ te verilmiĢtir. ÇalıĢmada kullanılan laktik asit bakterilerinin antibiyotiklere karĢı dirençlerinin belirlenmesi açısından yapılan disk difüzyon metodu ile zon çapı ölçümü sonuçlarına göre; izolatların çoğunun analizlerde kullanılan konsantrasyondaki (30µg) Vankomisin‟e karĢı dirençli oldukları belirlenmiĢtir. En büyük zon oluĢumları ise Tetrasiklin (50µg) ve Ampisilin (25µg) emdirilmiĢ disklerin bulunduğu petrilerde gözlemlenmiĢtir. Streptomisin emdirilmiĢ disklerin bulunduğu petri kutularında ise konsantrasyon arttıkça zon çapının arttığı, dolayısı ile antimikrobiyel etkinin de arttığı gözlenmiĢtir. 25 µg Streptomisin emdirilmiĢ disklerin ve 30 µg Vankomisin emdirilmiĢ disklerin etrafında zon oluĢumu genel olarak gözlenmemiĢtir. Zon oluĢumu gözlenen petri kutularında ise antibiyotik disk etrafındaki zon çaplarının, denemede kullanılan diğer antibiyotik disklere oranla daha küçük olduğu tespit edilmiĢtir. 82 Tanılanan LAB suĢlarının antbiyotik dirençlilik durumları Çizelge 4.4‟ te verilmiĢtir. Çizelge 4.4. Tanılanan LAB suĢlarının antibiyotik dirençlilikleri Antibiyotik (µg) Bakteri İzolat No ST(300) AM(25) TS(50) VA(30) Lactobacillus spp. FE26 R --- --- R FE25 --- --- --- R Lactobacillus curvatus FE41 --- --- --- R FE20 --- --- --- --- FE29 --- --- --- R FE31 R --- --- R Lactobacillus plantarum FE34 --- --- --- R FE35 --- --- --- R FE36 --- --- --- R FE37 --- --- R R FE1 --- --- --- R FE2 --- --- --- R Lactobacillus rhamnosus FE3 --- --- --- R FE4 --- --- --- R Lactobacillus curvatus, FE27 --- --- --- R Lactobacillus graminis, FE42 --- --- --- R Lactobacillus sakei FE8 R --- --- R FE22 --- --- --- --- FE24 --- --- --- --- FE30 --- --- --- --- Lactococcus lactis FE32 --- --- --- --- FE38 --- R --- --- FE39 --- --- R --- FE40 --- R --- --- FE13 --- --- --- --- Leuconostoc spp. FE15 --- R --- R FE17 --- --- --- --- FE6 R R --- R Leuconostoc citreum FE9 --- R --- R FE11 --- --- --- --- Leuconostoc mesenteroides FE18 --- --- --- --- FE43 --- --- --- R Leuconostoc pseudomesenteroides FE10 --- R --- R Leuconostoc lactis, FE5 --- --- --- R Leuconostoc garlicum FE12 --- --- --- R Leuconostoc pseudomesenteroides, FE14 --- R --- --- Leuconostoc mesenteroides Weissella spp. FE7 R R --- R FE16 --- R --- --- Weissella cibaria FE23 --- --- --- R Enterococcus faecalis FE28 --- --- --- R ST: streptomisin, AM: ampisilin, TS: tetrasiklin, VA: vankomisin R: Resistant (dirençli) ---: antibiyotik dirençlilik durumu belirlenemedi 83 SuĢların antibiyotik dirençlerinin belirlenmesinde, NCCLS standartlarında (Yalanca 2009, Alp ve Öner 2014, Ünal Turhan ve Erginkaya 2016) belirtilen koĢullarından (besiyeri, antibiyotik konsantrasyonu ve inkübasyon sıcaklık-süresi) farklı bir deneme planı kullanılmıĢtır. Bu nedenle, NCCLS standardında belirlenen zon çapı büyüklüğüne göre suĢlar; dirençli (R), orta dirençli (I) ve duyarlı (S) olarak belirlenememiĢtir. Ancak, zon çapı oluĢumunun gözlenmediği petrilerde, denemede kullanılan konsantrasyondaki antibiyotiğe direnç olduğu sonucuna varılmıĢtır. Dirençli (R) oldukları belirlenen suĢlar dıĢında, gözlemlenen inhibisyon zonları ise çap boyutuna göre karĢılaĢtırılmıĢ ve suĢların duyarlılıkları birbirleri ile kıyaslanabilmiĢtir. Gözlemlenen zon çapı büyüklükleri, önceki çalıĢmalar ile de karĢılaĢtırılmıĢtır. SuĢların antibiyotiklere dirençleri MAR indeks değerleri belirlenerek yorumlanmıĢtır. Tanılanan LAB suĢlarının çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) indeksi Çizelge 4.5‟ te verilmiĢtir. Çizelge 4.5. LAB suĢlarının MAR indeksi değerleri Bakteri İzolat No MAR indeksi Lactobacillus spp. FE26 0,50 FE25 0,25 Lactobacillus curvatus FE41 0,25 FE20 0,00 FE29 0,25 FE31 0,50 Lactobacillus plantarum FE34 0,25 FE35 0,25 FE36 0,25 FE37 0,50 FE1 0,25 FE2 0,25 Lactobacillus rhamnosus FE3 0,25 FE4 0,25 Lactobacillus curvatus, FE27 0,25 Lactobacillus graminis, FE42 0,25 Lactobacillus sakei FE8 0,50 FE22 0,00 FE24 0,00 FE30 0,00 Lactococcus lactis FE32 0,00 FE38 0,25 FE39 0,25 FE40 0,25 FE13 0,00 Leuconostoc spp. FE15 0,50 FE17 0,00 84 Çizelge 4.5. LAB suĢlarının MAR indeksi değerleri (devam) Bakteri İzolat No MAR indeksi FE6 0,75 Leuconostoc citreum FE9 0,50 FE11 0,00 Leuconostoc mesenteroides FE18 0,00 FE43 0,25 Leuconostoc pseudomesenteroides FE10 0,50 Leuconostoc lactis, FE5 0,25 Leuconostoc garlicum FE12 0,25 Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc FE14 0,25 mesenteroides Weissella spp. FE7 0,75 FE16 0,25 Weissella cibaria FE23 0,25 Enterococcus faecalis FE28 0,25 SuĢların çoğunluğunun MAR indeks değerinin 0,25-0,75 arasında olduğu belirlenmiĢ olup, yoğun antibiyotik kullanımının olduğu ortamlardan izole edildikleri anlaĢılmıĢtır. Antibiyotik kullanımının çok az olduğu ya da hiç olmadığı ortamlardan izole edilen kültürlerde MAR indeks değeri 0,20‟ nin altında çıkmaktadır. Tanılanan LAB suĢlarının %22,5 „inin (9 adet) antibiyotik kullanımının olmadığı ortamlardan izole edildiği anlaĢılmıĢtır. Özellikle L. lactis ve Leu. mesenteroides suĢlarının antibiyotik kullanımının olmadığı ortamlardan izole edildiği belirlenmiĢtir. Özellikle süt ürünlerinden izole edilen suĢlarda MAR indeksi değerinin yüksek çıkması, ham madde olarak kullanılan sütte antibiyotik varlığı ihtimalini ortaya çıkarmaktadır. Halk pazarlarında paketli ya da paketsiz olarak satıĢa sunulan bu ürünlerin sağlığı tehdit edebilecek antibiyotik dirence sahip suĢlar içerebildiği anlaĢılmıĢtır. Antibiyotik direnç mekanizmasının belirlenmesi, suĢların gıda endüstrisinde güvenli Ģekilde kullanılabilmesi açısından önem taĢımaktadır. Zeytinden izole edilen suĢlarda MAR indeksinin yüksek çıkması ise yanlıĢ zirai uygulamaların (pestisit kullanımı vb.) yapılmıĢ olabileceği ihtimalini ortaya çıkarmaktadır. Streptomisinin 25 µg dozunda zon oluĢumu gözlemlenen suĢlar arasında en duyarlı bakterinin Leu. mesenteroides FE43 olduğu saptanmıĢtır. Flórez ve ark. (2016) tarafından yapılan bir çalıĢmada süt ve ürünlerinden izole edilen Leuconostoc cinsine ait türlerin antibiyotiklere karĢı duyarlılıkları araĢtırılmıĢ olup, Leuconostos spp.‟ nin 85 streptomisine duyarlılıklarının 2-128 µg/mL konsantrasyon aralığında olduğu, ancak Leuconostoc cinsine ait bir suĢun (LbE16) 128 µg/mL konsantrasyonda canlı kalabildiği bildirilmektedir. Streptomisin dozu arttıkça, tez kapsamında kullanılan birçok laktik asit bakterisinin de inhibe olduğu anlaĢılmıĢtır. Elde edilen bulguların Flórez ve ark. (2016) tarafından yapılan çalıĢma sonuçları ile uyumlu olduğu anlaĢılmaktadır. Flórez ve ark. (2016) çalıĢmalarında Leuconostoc spp. suĢlarını süt ve ürünlerinden izole etmiĢlerdir. Bu çalıĢmada ise 300 µg Streptomisin‟e dirençli Leu. citreum suĢu ham zeytin örneğinden izole edilmiĢtir. Flórez ve ark.‟ nın (2016) buldukları sonuçlardan farklı olarak, çalıĢmada izole edilen Leu. citreum suĢunun streptomisinin yüksek konsantrasyonlarına dahi dirençli olduğu belirlenmiĢtir. Denemede kullanılan 300µg Streptomisin emdirilmiĢ disklerin çevresinde zon oluĢumu Leu. citreum FE6, Weissella spp. FE7, L. lactis FE8, Lactobacillus spp. FE26 ve L. plantarum FE31 suĢları hariç, diğer laktik asit bakterilerinin tamamında gözlemlenmiĢtir. Gad ve ark. (2014) tarafından yapılan çalıĢmada süt ürünleri ve probiyotik ilaçlardan izole edilen Lactobacillus cinsine ait türlerin çoğunluğunun streptomisin (%17,4) ve vankomisine (%40,6) karĢı dirençli oldukları belirtilmektedir. ÇalıĢmada Vankomisin (30µg)‟e en duyarlı suĢların 11 mm‟lik zon çapı ile L. lactis FE24 ve L. lactis FE30 oldukları belirlenmiĢtir. Laktik asit bakterilerinde doğal ve kazanılmıĢ antibiyotik direncinin olduğu bilinmekte olup (Mathur ve Singh 2005, Tatlı 2009), özellikle Lactobacillus ve Leuconostoc cinsine ait türlerde Vankomisin‟ e karĢı doğal direncin olduğu önceki çalıĢmalarda belirtilmektedir (Özteber 2013). Antibiyotik direnci denemesi sonuçları göz önüne alındığında, çalıĢmada tanılanan laktik asit bakterilerinden Lactobacillus spp. ve Leuconostoc spp. türlerinin genel olarak Vankomisin‟ e dirençli oldukları gözlemlenmiĢtir. Jose ve ark. (2015) yaptıkları çalıĢmada yoğurt, peynir örnekleri ile rumenden izole ettikleri LAB suĢlarının antibiyotik dirençliliklerini incelemiĢlerdir. Denemede kullanılan tüm laktik asit bakterilerinin (L. reuteri, L. rhamnosus ve L. plantarum suĢları) Streptomisin (10 µg) ve Vankomisin (30 µg) antibiyotiklerine dirençli oldukları belirtilmektedir. L. rhamnosus suĢlarının Tetrasiklin (30 µg) ve Ampisiline (10 µg) duyarlı oldukları, L. plantarum suĢlarının Ampisilin‟ e (10 µg) duyarlı, Tetrasiklin‟ e (30 µg) ise orta seviyede dirençli oldukları belirtilmektedir. Tez kapsamında L. plantarum suĢlarının antibiyotik dirençlilikleri ile ilgili elde edilen 86 sonuçların da benzer nitelikte olduğu anlaĢılmaktadır. Zhang ve ark. (2013) ile Ünal Turhan ve Erginkaya (2016) tarafından yapılan çalıĢmada da benzer sonuçların elde edildiği belirtilmektedir. Ayrıca L. rhamnosus ve L. casei de dâhil olmak üzere birçok Lactobacillus spp. türünün Vankomisin‟ e karĢı doğal dirençli olduğu belirtilmektedir (Ashraf ve Shah 2011). ÇalıĢmada tanılanan laktik asit bakterilerinin Ampisilin (25µg) ve Tetrasiklin‟ e (50µg) karĢı oldukça duyarlı oldukları anlaĢılmıĢtır. Denemede kullanılan tüm antibiyotikler dikkate alındığında, direnci en yüksek olan suĢların, Leu. citreum FE6 ve Weissella spp. FE7 olduğu tespit edilmiĢtir. Her iki suĢ da sadece Tetrasiklin‟ e (50µg) duyarlılık göstermiĢtir, ancak disk çevresinde oluĢan zon çapları diğer suĢlarda gözlemlenenlerden daha küçük bulunmuĢtur. Flórez ve ark. (2016) tarafından yapılan çalıĢmada ise izole edilen Leuconostoc spp. suĢlarının Ampisilin gibi β-laktam antibiyotiklere karĢı duyarlı oldukları bildirilmektedir. Tez kapsamında elde edilen verilere göre genel olarak antibiyotik dirençliliği en yüksek suĢların Leu. citreum FE6 ve Weissella spp. FE7 olduğu ve bunları Leu. pseudomesenteroides FE10 suĢunun takip ettiği gözlemlenmiĢtir. Denemede kullanılan antibiyotik disklerin etrafında oluĢan zon çapları dikkate alındığında, antibiyotik duyarlılığı en yüksek olan suĢun L. lactis FE30 olduğu belirlenmiĢtir. Laktik asit bakterilerinde antibiyotik direnci ile ilgili çalıĢmalarda bazı tutarsızlıklar söz konusudur. Özellikle besiyeri seçiminde, kullanılan antibiyotik ile etkileĢime girmeyecek besiyeri ile çalıĢılması, sonuçların doğruluğu açısından önem taĢımaktadır. Kullanılan besi ortamının test mikroorganizmasının geliĢimini desteklediği ve kullanılan antibiyotik ile etkileĢiminin olmadığı konusunda emin olunmalıdır (Özteber 2013). Laktik asit bakterilerinde antibiyotiklere karĢı duyarlılık testleri önemli olup, kullanılabilecek en yüksek antibiyotik konsantrasyonunun belirlenebilmesi açısından minimum inhibisyon değerlerinin (MĠK) belirlenmesi önem taĢımaktadır. Ayrıca, laktik asit bakterilerinin antibiyotiklere duyarlılık göstermelerinin haricinde, antibiyotik direnç genlerini taĢıdıkları ve bu genleri aktarabilecekleri de bilinmektedir. Direnç genlerinin aktarılabilir/aktarılamaz olması, bakteriyel suĢa göre farklılık göstermektedir. Özellikle 87 günümüzde gıda endüstrisinde fermente gıdalar sıklıkla tüketilmekte ve sorumlu mikroorganizmalar insan vücuduna girmektedir. Böylece antibiyotik direnç genleri patojen ya da kommensal diğer mikroorganizmalara aktarılabilmektedir. Özellikle Lactobacillus spp. türlerinde antibiyotik direnç geni bulunduğu bilinmektedir. Bazı antibiyotiklere karĢı direnç genleri bulunmasına rağmen, laktik asit bakterilerinde antibiyotiklere karĢı doğal duyarlılık da mevcuttur. Protein sentezini engelleyerek inhibisyon sağlayan tetrasiklin, eritromisin gibi antibiyotiklere karĢı birçok laktik asit bakterisi suĢunun duyarlı olduğu bilinmektedir (Özteber 2013). Tez kapsamında izole edilerek tanısı yapılan laktik asit bakterileri arasında L. plantarum FE37 ve L. lactis FE39 suĢları hariç, diğer laktik asit bakterilerinin tetrasikline karĢı duyarlı oldukları tespit edilmiĢtir. ÇalıĢma kapsamında biyofilm oluĢumu ile antibiyotik dirençliliği arasında bir korelasyon tespit edilememiĢtir. Oliveira ve Cunha (2010) yaptıkları çalıĢmada Enterococcus spp. suĢlarının antibiyotik dirençliliklerini ve biyofilm oluĢturma kapasitelerini incelemiĢlerdir. SuĢların gentamisin ve streptomisin dirençliliği ile biyofilm oluĢumu arasında korelasyon olduğu, ancak oksitetrasiklin dirençliliği ile biyofilm oluĢumu arasında korelasyon olmadığı belirtilmektedir. Bu çalıĢma sonuçları göz önüne alındığında Oliveira ve Cunha (2010) ile benzer nitelikte veriler elde edildiği tespit edilmiĢtir. BaĢka çalıĢmalarda ise tez kapsamında belirlenen sonuçlardan farklı olarak antibiyotik dirençliliği olan LAB suĢlarının genellikle biyofilm tabakası da oluĢturabildiği belirtilmektedir (Zhang ve ark. 2013, Devaraj ve Sajjan 2015, Gómez ve ark. 2016). 88 5. SONUÇ ÇalıĢmada elde edilen sonuçlar, maddeler halinde özetlenmiĢtir; 1. Farklı pazarlardan temin edilen ham zeytin, çiğ süt ve köy peyniri örneklerinden izole edilen bakterilerin biyokimyasal ve moleküler yöntemler ile tanılanması sonucunda 40 izolatın LAB suĢu olduğu belirlenmiĢtir. 2. Tanılama sonuçlarına göre, Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Weissella ve Enterococcus cinslerine ait türlerin izole edildiği belirlenmiĢ olup, genel olarak L. rhamnosus, L. plantarum, L. curvatus, L. graminis, L. sakei, Leu. lactis, Leu. garlicum, Leu. citreum, Leu. pseudomesenteroides, Leu. mesenteroides, W. cibaria, L. lactis ve E. faecalis türlerine rastlanmıĢtır. 3. Ġzolatların sekans analizi sonuçlarına göre en çok L. lactis (% 20) ve L. plantarum (% 17,5) türlerine, çok düĢük oranlarda da L. rhamnosus spp. (% 2,5) Weissella spp. (% 2,5), Leu. pseudomesenteroides (% 2,5) ve E. faecalis (% 2,5) cins ve türlerine rastlanmıĢtır. Ham zeytin örneklerinden en çok Leuconostoc spp., çiğ süt örneklerinden Lactobacillus spp. ve köy peyniri örneklerinden de genel olarak Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Lactococcus spp. izole edilmiĢtir. 4. Çiğ süt örneklerinden sadece L. rhamnosus suĢları, köy peyniri örneklerinden ise baskın tür olarak L. lactis suĢları izole edilmiĢtir. 5. ĠĢlenmemiĢ yeĢil zeytin örneklerinden Aydın çeĢidi olanlar arasında en çok Leu. citreum, Gemlik çeĢidi olanlar arasında ise en çok Leu. mesenteroides suĢlarına rastlanmıĢtır. ĠĢlenmemiĢ yeĢil-siyah zeytin numuneleri 2 adet olup, Gemlik çeĢidi olandan Leu. mesenteroides, Ġznik çeĢidi olandan ise L. plantarum suĢu izole edilmiĢtir. 89 6. Tanılanan suĢların biyofilm oluĢturma kapasiteleri iki yöntem ile belirlenmiĢtir. a. Tüp yöntemi ile elde edilen sonuçlara göre, LAB suĢlarının yarıdan fazlasının (%55-82,5) farklı inkübasyon koĢullarında zayıf biyofilm oluĢturduğu, az sayıda suĢun (%2,2-10) orta düzeyde ve yine çok az sayıda suĢun da (%2,2-10) güçlü biyofilm oluĢturduğu belirlenmiĢtir. b. Mikroplaka yöntemi ile elde edilen sonuçlara göre ise suĢların yarısının biyofilm oluĢturamadığı belirlenmiĢtir. Biyofilm oluĢturabilen suĢların çoğunun “zayıf biyofilm üreticisi” oldukları belirlenmiĢ olup, sadece bir suĢun (L. lactis FE30) “24 saat-37ºC” inkübasyon koĢulunda güçlü biyofilm oluĢturabildiği belirlenmiĢtir. 7. Tüp ve mikroplaka yöntemleri ile belirlenen biyofilm oluĢturma kapasiteleri karĢılaĢtırıldığında, spektroskobik ölçüme dayalı yöntem olan 96 kuyucuklu plaka ile elde edilen sonuçların daha güvenilir olduğu belirlenmiĢtir. 8. Mikroplaka yöntemi sonuçlarına göre, bitkisel kökenli izolatların (15 adet) %40 „ının (6 adet), süt kökenli izolatların (25 adet) ise %60‟ ının (15 adet) farklı koĢullarda biyofilm oluĢturabildiği anlaĢılmıĢtır. 9. Çoklu antibiyotik direnci indeksi sonuçlarına göre izolatların %22,5‟ inin (9 adet) antibiyotik bulunmayan ortamlardan izole edildiği anlaĢılmıĢtır. Bu suĢlardan %55,5‟ inin (5 adet) bitkisel, %44,5‟ inin (4 adet) ise süt kökenli olduğu belirlenmiĢtir. 10. MAR indeksi 0,00 olarak hesaplanan süt kökenli L. lactis FE 30 ve L. lactis FE32 suĢlarının “orta” ve “güçlü” düzeyde biyofilm üreticisi oldukları belirlenmiĢtir. 90 11. Lactobacillus cinsine ait 16 suĢtan onbeĢ tanesinin 30µg-vankomisine karĢı dirençli olduğu, ancak tamamının 25µg-ampisiline duyarlı olduğu belirlenmiĢtir. 12. Leuconostos cinsine ait 12 suĢun tamamının 300µg-streptomisin ve 50µg- tetrasikline duyarlı oldukları, ancak yedi tanesinin 30µg-vankomisine karĢı dirençli oldukları tespit edilmiĢtir. 13. Tanılanan 3 adet Weissella spp. suĢlarından bir tanesinin denemede kullanılan tüm antibiyotiklere karĢı direnç gösterdiği belirlenmiĢtir. 14. L. lactis suĢlarının denemede kullanılan antibiyotiklere karĢı genel olarak duyarlı oldukları, E. faecalis suĢunun ise 30µg-vankomisine karĢı dirençli olduğu belirlenmiĢtir. 15. 30°C‟ de 48 saatlik inkübasyon sonunda biyofilm oluĢturabilen 12 adet laktik asit bakterisi suĢlarının tamamının “zayıf düzeyde” biyofilm oluĢturabildikleri anlaĢılmıĢtır. Bu suĢların ise Lactobacillus spp., Weissella spp., Lactococcus spp. ve Leuconostoc spp. olduğu belirlenmiĢtir. Zayıf biyofilm üreticisi oldukları belirlenen suĢların çoğunluğunun 30µg-vankomisine dirençli oldukları, bazılarının tüm antibiyotiklere duyarlı olduğu, genel olarak da 50µg-tetrasiklin ve 25µg-ampisiline duyarlı oldukları belirlenmiĢtir. 16. Ġzole edilerek tanılanan LAB suĢlarının 30°C‟ de 48 saatlik inkübasyon koĢulları sonunda belirlenen antibiyotik direçlilikleri ile biyofilm oluĢturma kapasiteleri arasında korelasyon tespit edilememiĢtir. 17. Antibiyotik direnci denemesi sonuçları göz önüne alındığında, çalıĢmada tanılanan laktik asit bakterilerinden Lactobacillus spp. ve Leuconostoc spp. türlerinin genel olarak vankomisine dirençli oldukları gözlemlenmiĢtir. Bu direnç mekanizması moleküler düzeyde de araĢtırılarak, tanısı yapılan LAB 91 suĢlarında doğal ya da sonradan kazanılmıĢ direnç mekanizmalarının varlığının tespit edilmesi gerektiği düĢünülmektedir. Biyofilm oluĢumu ile mikroorganizmaların daha dirençli hale geldikleri bilinmektedir. Bu nedenle özellikle gıda sanayiinde kullanılan starterin uzun ömürlü olabilmesi açısından biyofilm oluĢturabilen suĢların seçilmesinin avantaj sağlayabileceği düĢünülmektedir. Ayrıca fonksiyonel gıdalar da günümüzde araĢtırılan alanlar arasında bulunmaktadır. Fermente gıdalarda, laktik asit fermentasyonu özellikle süt ürünlerinde (yoğurt, kefir, peynir vb.) en önemli aĢama olarak kabul edilmektedir. Bu ürünlerde kullanılan starter laktik asit bakteri kültürlerinin ayrıca probiyotik özellik de taĢımaları, o gıda ürününü fonksiyonel bir gıda haline getirmektedir. Birden fazla özelliğin tek bir üründe toplanması ile fonksiyonel gıda ortaya çıkmaktadır. Probiyotik mikroorganizmalar, ürettikleri metabolitleri sayesinde ortamda bulunan patojen mikroorganizmalar ile de yarıĢabilmekte ve özellikle sindirim sisteminde hâkim mikrobiyota haline gelebilmektedir. Bu mikroorganizmaların biyofilm oluĢturabilmelerinin, olumsuz koĢullarda ve özellikle patojenler ile savaĢmada onlara dayanıklılık sağlayacağı düĢünülmektedir. Özellikle probiyotik suĢlarda aranan özelliklerden biri olan sindirim sisteminde tutunabilme ve hızlı kolonize olabilme yeteneğinin de biyofilm oluĢumu ile desteklenebileceği düĢünülmektedir. Özellikle LAB üyeleri arasında sıklıkla rastlanan probiyotik bakterilerden biyofilm oluĢturabilen suĢların bağırsak mukozasına kolay bir Ģekilde tutunabileceği ve zamanla biyofilm oluĢturarak dıĢ koĢullara karĢı daha dirençli hale geleceği düĢünülmektedir. Ġnsan sağlığına faydalı birden fazla özelliğin starterde bulunması ile de sağlıklı fermente gıdaların üretilebileceği sonucuna varılmaktadır. Bu nedenle biyofilm oluĢturabilen LAB suĢlarının gıda üretiminde yeni starterler olabileceği ve dolayısı ile insan sağlığını da olumlu etkileyebileceği düĢünülmektedir. Bundan sonraki çalıĢmalarda ise, antibiyotik dirençliliği tespit edilen suĢlarda antibiyotik direnç genlerinin tespit edilmesi ile direnç mekanizmaslarının belirlenmesi 92 ve LAB suĢlarının ticari ve probiyotik özelliklerinin de belirlenerek, yeni ürün geliĢtirmede kullanılabilecek suĢların ortaya konulması gerektiği düĢünülmektedir. 93 KAYNAKLAR Abdellah, M., Ahcène, H., Benalia, Y., Saad, B., Abdelmale, B. 2015. Evaluation of biofilm formation by exopolysaccharide producer strains of thermophilic lactic acid bacteria isolated from Algerian camel milk. Emirates Journal of Food and Agriculture, 27(6): 513-521. Abebe, G.M. 2013. ÇeĢitli gıda örneklerinden izole edilen Enterobacter sakazakii‟nin biyofilm oluĢumunun araĢtırılması. Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, Ankara. Adesulu-Dahunsi, A.T., Sanni, A.I., Jeyaram, K. 2017. Rapid differentiation among Lactobacillus, Pediococcus and Weissella species from some Nigerian indigenous fermented foods. LWT - Food Science and Technology, 77(2017): 39-44. Ahi, S. 2011. Bazı laktik asit bakterilerinin ekzopolisakkarit (EPS) üretimi ile antibiyotik dirençliliklerinin araĢtırılması. Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, Ankara. Akan, E., Kınık, Ö. 2014. Biyofilm oluĢum mekanizması ve biyofilmlerin gıda güvenliğine etkisi. Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi, 14: 42-51. Akoğlu, A. 2006. Çiğ sütte Pseudomonas aeruginosa Sayılması için yöntem modifikasyonları üzerine çalıĢmalar. Yüksek Lisans Tezi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı, Ankara. Akoğlu, A., Yaman, H., Coşkun, H., Sarı, K. 2017. Mengen peynirinden laktik asit bakterilerinin izolasyonu, moleküler tanımlanması ve bazı starter kültür özelliklerinin belirlenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 21(2): 453-459. Alexandraki, V., Kazou, M., Blom, J., Pot, B., Tsakalidou, E., Papadimitriou, K. 2017. The complete genome sequence of the yogurt isolate Streptococcus thermophilus ACA-DC 2. Standards in Genomic Sciences, 12(18): 1-10. Alp, D., Öner, Z. 2014. Bazı laktik asit bakterilerinin antibiyotik dirençlilikleri ve aroma maddeleri oluĢturma özelliklerinin belirlenmesi. GIDA, 39(6): 331-337. Annous, B.A., Fratamico, P.M., Smith, J.L. 2009. Quorum sensing in biofilms: why bacteria behave the way they do. Journal of Food Science, 74: 24-37. Aoudia, N., Rieu, A., Briandet, B., Deschamps, J., Chluba, J., Jego, G., Garrido, C., Guzzo, J. 2016. Biofilms of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum: Effect on stress responses, antagonistic effects on pathogen growth and immunomodulatory properties. Food Microbiology, 53(2016): 51-59. Araújo, P., Lemos, M., Mergulhão, F., Melo, L., Simões, M. 2011. Antimicrobial resistance to disinfectants in biofilms: Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances, Ed.: Méndez-Vilas, A., Formatex, Badajoz, Spain, pp: 826-834. Arena, M.P., Capozzi, V., Spano, G., Fiocco, D. 2017. The potential of lactic acid bacteria to colonize biotic and abiotic surfaces and the investigation of their interactions and mechanisms. Applied Microbiology and Biotechnology, 101: 2641-2657. Arroyo-López, F.N., Bautista-Gallego, J., Domínguez-Manzano, J., Romero-Gil, V., Rodriguez-Gómez, F., García-García, P., Garrido-Fernández, A., Jiménez- Díaz, R. 2012. Formation of lactic acid bacteriaeyeasts communities on the olive 94 surface during Spanish-style manzanilla fermentations. Food Microbiology, 32: 295- 301. Ashraf, R., Shah, N.P. 2011. Antibiotic resistance of probiotic organisms and safety of probiotic dairy products. International Food Research Journal, 18(3): 837-853. Attar, M.A., Yavarmanesh, M., Mortazavi, A., Dovom, M.R.E., Najafi, M.B.H. 2018. Antibacterial effects of Lactococcus lactis isolated from lighvan cheese regarding the recognition of nisin, lacticin and lactococcin structural genes. LWT - Food Science and Technology, 89(2018): 186–191. Aymerich, T., Martin, B., Garriga, M., Hugas, M. 2003. Microbial quality and direct PCR identification of lactic acid bacteria and nonpathogenic Stapylococci from artisanal low-acid sausages. Applied and Environmental Microbiology, 69(8): 4583-4594. Azadnia, P., Khan-Nazer, A.H. 2009. Identification of lactic acid bacteria isolated from traditional drinking yoghurt in tribes of fars province. Iranian Journal of Veterinary Research, 10(3): 235-240. Bağder-Elmacı, S., Tokatlı, M., Dursun, D., Özçelik, F., Şanlıbaba, P. 2015. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from traditional pickles of the Çubuk region in Turkey. Folia Microbiologica, 60: 241-251. Barçın-Öztürk, Ş., Sakarya, S., Öncü, S., Ertuğrul, M.B. 2008. Biyofilmler ve yabancı cisim infeksiyonları. Klimik Dergisi, 21(3): 79-86. Baruah, R., Das, D., Goyal, A. 2016. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria: current trends and applications. Journal of Probiotics and Health, 4(2): 1-6. Bassi, D., Cappa, F., Gazzola, S., Orrù, L., Cocconcelli, P.S. 2017. Biofilm formation on stainless steel by Streptococcus thermophilus UC8547 in milk environments is mediated by the proteinase PrtS. Applied and Environmental Microbiology, 83(8): 1-12. Başyiğit-Kılıç, G., Kuleaşan, H., Eralp, İ., Karahan, A.G. 2009. Manufacture of Turkish beyaz cheese added with probiotic strains. LWT - Food Science and Technology, 42(2009): 1003–1008. Baumgartner, A., Kueffer, M., Simmen, A., Grand, M. 1998. Relatedness of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from clinical specimens and such from food- stuffs, humans and technology. LWT - Food Science and Technology, 31(5): 489-494. Berlanga, M., Guerrero, R. 2016. Living together in biofilms: the microbial cell factory and its biotechnological implications. Microbial Cell Factories, 15(165): 1-11. Bjarnsholt, T., Alhede, M., Alhede, M., Eickhardt-Sørensen, S.R., Moser, C., Kühl, M., Jensen, P. Ø., Høiby, N. 2013. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21(9): 466-474. Bluma, A., Ciprovica, I. 2015. Diversity of lactic acid bacteria in raw milk. Research For Rural Development, 1: 157-161. Bonatsou, S., Tassou, C.C., Panagou E.Z., Nychas G.J.E. 2017. Table olive fermentation using starter cultures with multifunctional potantial. Microorganisms, 5(30): 1-16. Campana, R., Casettari, L., Fagioli, L., Cespi, M., Bonacucina, G., Baffone, W. 2017. Activity of essential oil-based microemulsions against Staphylococcus aureus biofilms developed on stainless steel surface in different culture media and growth conditions. International Journal of Food Microbiology, 241(2017): 132–140. Cardamone, L., Quiberoni, A., Mercanti, D.J., Fornasari, M.E., Reinheimer, J.A., Guglielmotti, D.M. 2011. Adventitious dairy Leuconostoc strains with interesting 95 technological and biological properties useful for adjunct starters. Dairy Science & Technology 91: 457–470. Caro, I., Bécares, G., Fuentes, L., Garcia-Armesto, M.R., Rúa, J., Castro, J.M., Quinto, E.J., Mateo, J. 2015. Evaluation of three PCR primers based on the 16S rRNA gene for the identification of lactic acid bacteria from dairy origin. CyTA – Journal of Food, 13(2): 181-187. Cebirbay, M.A. 2014. Fermente ve ısıl iĢlem uygulanmıĢ sucuklarda bazı Lactobacillus ve patojen bakterilerin antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi. Doktora Tezi, Selçuk Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Besin Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı, Konya. Cengiz, S.A., Us, E., Cengiz, A.T. 2006. Slime faktörünün klinikteki yeri ve önemi. İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 13(3): 193-197. Chapot-Chartier, M.P., Kulakauskas, S. 2014. Cell wall structure and function in lactic acid bacteria. 11th International Symposium on Lactic Acid Bacteria, 31 Ağustos- 4 Eylül 2014, Egmond aan Zee, Netherlands. Ciszek-Lenda, M. 2011. Biological functions of exopolysaccharides from probiotic bacteria. Central European Journal of Immunology, 36(1): 51-55. Claisse, O., Renouf, V., Lonvaud-Funel, A. 2007. Differentiation of wine lactic acid bacteria species based on RFLP analysis of a partial sequence of rpoB gene. Journal of Microbiological Methods, 69(2007): 387–390. Coeuret, V., Dubernet, S., Bernardeau, M., Gueguen, M., Vernoux, J. 2003. Isolation, characterisation and identification of lactobacilli focusing mainly on cheeses and other dairy products. Lait, 83(2003): 269-306. Cruciata, M., Gaglio, R., Scatassa, M.L., Sala, G., Cardamone, C., Palmeri, M., Moschetti, G., La Mantia, T., Settanni, L. 2018. Formation and characterization of early bacterial biofilms on different wood typologies applied in dairy production. Applied and Environmental Microbiology, 84(4): 1-13. Çetinkaya, E., Ayhan, K. 2012. Mikrobiyolojide kullanılan bazı moleküler teknikler. Karaelmas Fen ve Mühendislik Dergisi, 2(1): 53-62. Deatraksa, J., Sunthornthummas, S., Rangsiruji, A., Sarawaneeyaruk, S., Suwannasai, N., Pringsulaka, O. 2018. Isolation of folate-producing Weissella spp. from Thai fermented fish (plaa som fug). LWT - Food Science and Technology, 89(2018): 388-391. Delavenne, E., Mounier, J., Déniel, F., Barbier, G., Le Blay, G. 2012. Biodiversity of antifungal lactic acid bacteria isolated from raw milk samples from cow, ewe and goat over one-year period. International Journal of Food Microbiology, 155(2012): 185-190. Demir, E. 2014. Fermente süt ürünlerinden izole edilen laktik asit bakterilerinde bakteriyosin üretiminin karakterizasyonu. Yüksek Lisans Tezi, Adnan Menderes Üniversitesi Fen Bilimler Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, Aydın. Demiray, E., Yılmaz, Ö. 2005. Helicobacter pylori‟de antibiyotik direnci ve direncin saptanmasında kullanılan moleküler yöntemler. Mikrobiyoloji Bülteni, 39: 399-408. Demirel, S. 2012. Molecular techniques for determining microbial diversity in treatment systems. Sigma Mühendislik ve Fen Bilimleri Dergisi, 30: 179-192. Demirel, Y.N., Gürler, Z. 2016. Hayvansal gıdalardan izole edilen laktik asit bakterilerinin antibiyotik direnç profilleri. Kocatepe Veterinary Journal, 9(4): 372-378. 96 Demirhan, F. 2013. Çoklu dirençli Pseudomonas aeruginosa klinik suĢlarında biyofilm formasyonu. Yüksek Lisans Tezi, Erciyes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Kayseri. Devaraj, C., Sajjan, A.G. 2015. Comparision of three different methods for the detection of biofilm in gram positive cocci and gram negative bacilli isolated from clinical specimens. Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 7(11): 952-955. Diani, M., Ariafar, M.N., Akçelik, N. 2016. Ġnsan ve hayvan sağlığı açısından risk oluĢturan enterokokal biyofilm yapısının doğası. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi, 73(1): 71-80. Dimic, G.R., 2006. Characteristics of the Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides strains from fresh vegetables. Acta periodica technologica, 37: 3-11. Dinçer, E., Kıvanç, M., Karaca, H. 2009. Biyokoruyucu olarak laktik asit bakterileri ve bakteriyosinler. GIDA / The Journal of Food, 35(1): 55-62. Doğan, M., Özpınar, H. 2017. Investigation of probiotic features of bacteria isolated from some food products. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 23(4): 555- 562. Doi, K., Phuong, O.T.A., Kawatou, F., Nagayoshi, Y., Fujino, Y., Ohshima, T. 2013. Identification and characterization of lactic acid bacteria isolated from fermented rice bran product. Advances in Microbiology, 3: 265-272. Donelli, G., Vuotto, C., Mastromarino, P. 2013. Phenotyping and genotyping are both essential to identify and classify a probiotic microorganism. Microbial Ecology in Health & Disease, 24: (1-8). Donlan, R.M., Costerton, J.W. 2002. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, 15(2): 167–193. Durlu-Özkaya, F., Xanthopoulos, V., Tunail, N., Lıtopouloutzanetakı, E. 2001. Technology ımportant properties of lactic acid bacteria ısolates from beyaz cheese made from raw ewe‟s milk. Journal of Applied Microbiology, 91, 861-870. Elavarasi, V., Pugazhendhi, A., Poornima-Priyadharsani, T.K., Valsala, H., Thamaraiselvi, K. 2014. Screening and characterization of Weissella cibaria isolated from food source for probiotic properties. National Conference cum Workshop on Bioinformatics and Computational Biology, Mayıs 2014, NCWBCB. Engelhardt, T., Szakmár, K., Kiskó, G., Mohácsi-Farkas, C., Reichart, O. 2018. Combined effect of NaCl and low temperature on antilisterial bacteriocin production of Lactobacillus plantarum ST202Ch. LWT - Food Science and Technology, 8 (2018): 104–109. Ergene, E. 2015. Bazı Bacillus suĢları ile melastan ekzopolisakkarit üretim koĢullarının optimizasyonu. Yüksek Lisans Tezi, Sakarya Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı, Sakarya. Erginkaya, Z., Ünal, E., Kalkan, S. 2011. Importance of microbial antagonisms about food attribution: Science against microbial pathogens: communicating current research and technological advances. Ed.: Méndez-Vilas, A., Formatex, Badajoz, Spain, pp: 1342-1348. Ertekin, Ö. 2007. Farklı gıdalardan izole edilen laktik asit bakterilerinin nümerik taksonomisi. Yüksek Lisans Tezi, Pamukkale Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı, Denizli. 97 Ertürkmen, P., Öner, Z. 2015. Beyaz peynir örneklerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin baĢlatıcı (starter) kültür özelliklerinin biyokimyasal yöntemlerle belirlenmesi. Süleyman Demirel üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 19(3): 9- 16. Evren, M., Apan, M., Tutkun, E., Evren, S. 2011. Geleneksel fermente gıdalarda bulunan laktik asit bakterileri. Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi, 9(1): 11-17. Fagerlund, A., Møretrø, T., Heir, E., Briandet, R., Langsrud, S. 2017. Cleaning and disinfection of biofilms composed of Listeria monocytogenes and background microbiota from meat processing surfaces. Applied and Environmental Microbiology, 83(17): 1-21. Fessard, A., Remize, F. 2017. Why are Weissella spp. not used as commercial starter cultures for food fermentation?. Fermentation, 3(38): 1-31. Fguiri, I., Atigui, M., Ziadi, M., Arroum, S., Khorchani, T. 2015. Biochemical and molecular identification of lactic acid bacteria isolated from camel milk in Tunisia. Emirates Journal of Food and Agriculture, 27(9): 716-720. Fhoula, I., Najjari, A., Turki, Y., Jaballah, S., Boudabous, A., Ouzari, H. 2013. Diversity and antimicrobial properties of lactic acid bacteria isolated from rhizosphere of olive trees and desert truffles of Tunisia. BioMed Research International, 405708: 1- 14. Flórez, A.B., Campedelli, I., Delgado, S., Alegría, A., Salvetti, E., Felis, G.E., Mayo, B., Torriani, S. 2016. Antibiotic susceptibility profiles of dairy Leuconostoc, analysis of the genetic basis of atypical resistances and transfer of genes in vitro and in a food matrix. Plos One, 11(1): 1-20. Foteini, K.M. 2015. Biofilms in water industry: case study of Salmonella enterica serovar Typhimurium – biofilm formation and control in vitro and in situ. MSc Thesis, Agricultural University of Athens, Athens, Greece. Gad, G.F.M., Abdel-Hamid, A.M., Farag, Z.S.H. 2014. Antibiotic resistance in lactic acid bacteria isolated from some pharmaceutical and dairy products. Brazilian Journal of Microbiology, 45(1): 25-33. Garrett, T.R., Bhakoo, M., Zhang, Z. 2008. Bacterial adhesion and biofilms on surfaces. Progress in Natural Science, 18(2008): 1049–1056. Gerritsen, J., Smidt, H., Rijkers, G.T., de Vos, W.M. 2011. Intestinal microbiota in human health and disease: the impact of probiotics. Genes & Nutrition, 6: 209–240. Goh, H.F., Philip, K. 2015. Purification and characterization of bacteriocin produced by Weissella confusa A3 of dairy origin. Plos One, 10(10): 1-17. Gómez, N.C., Ramiro, J.M.P., Quecan, B.X.V., de Melo Franco, B.D.G. 2016. Use of potential probiotic lactic acid bacteria (LAB) biofilms for the control of Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, and Escherichia coli O157:H7 biofilms formation. Frontiers in Microbiology, 7(863): 1-16. Gotcheva, V., Hristozova, E., Hristozova, T., Guo, M., Roshkova, Z., Angelov, A. 2002. Assessment of potential probiotic properties of lactic acid bacteria and yeast strains. Food Biotechnology, 16(3): 211-225. Guinta, A. R. 2010. New approaches for controlling biofilm formation. MSc Thesis, The State University of New Jersey Graduate Program in Microbiology and Molecular Genetics and the Graduate School of Biomedical Sciences, New Jersey. 98 Gün, İ., Ekinci, F.Y. 2009. Biyofilmler: yüzeylerdeki mikrobiyal yaĢam. Gıda, 34(3): 165-173. Güneş Altuntaş, E., Ayhan, K., Okcu, G., Erkanlı, K., Balcı, M.H., Sonakın, Ş.S. 2010. Çiğ süt ve peynir örneklerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin antimikrobiyel aktiviteleri. Gıda, 35(3): 197-203. Gürsoy, N.C., Otlu, B. 2017. Mikrobiyota çalıĢmalarında moleküler tanı yöntemleri. Journal of Biotechnol and Strategic Health Research, 1(Special Issue): 56-67. Halkman, A.K. 2005. Merck Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları. BaĢak Matbaacılık Ltd. ġti., Ankara, 358 s. Hassan, A.N. 2008. ADSA foundation scholar award: possibilities and challenges of exopolysaccharide-producing lactic cultures in dairy foods. Journal of Dairy Science, 91(4): 1282-1298. Hassan, A., Usman, J., Omair, M., Khalid, A., Iqbal, M. 2011. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases, 15(4): 305-311. Hayaloğlu, A.A., Guven, M., Fox, P.F. 2002. Microbiological, biochemical and technological properties of Turkish white cheese „beyaz peynir‟. International Dairy Journal, 12(2002): 635-648. Ho, V.T.T., Lo, R., Bansal, N., Turner, M.S. 2018. Characterisation of Lactococcus lactis isolates from herbs, fruits and vegetables for use as biopreservatives against Listeria monocytogenes in cheese. Food Control, 85(2018): 472-483. Hurtado, A., Reguant, C., Bordons, A., Rozès, N. 2012. Lactic acid bacteria from fermented table olives. Food Microbiology, 31(2012): 1-8. İç, E., Özçelik, F. 1995. Hıyar turĢusu fermantasyonunda görülen mikroorganizmalar. Gıda, 20(3): 173-178. İçten, B.İ. 2013. Zihinsel engelli bireylerde klinik periodontal durum ve supragingival plakta beta hemolitik streptokok varlığının incelenmesi. Bitirme Tezi, Ege Üniversitesi DiĢ Hekimliği Fakültesi Periodontoloji Anabilim Dalı, Ġzmir. İşleroğlu, H., Yıldırım, Z., Yıldırım, M. 2008. Yöresel peynirden antimikrobiyal aktiviteye sahip laktik asit bakterisinin izolasyonu ve tanısı. Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 25(1): 1-6. Jalilsood, T., Baradaran, A., Song, A.A.L., Foo, H.L., Mustafa, S., Saad, W.Z., Yusoff, K., Rahim, R.A. 2015. Inhibition of pathogenic and spoilage bacteria by a novel biofilm‑forming Lactobacillus isolate: a potential host for the expression of heterologous proteins. Microbial Cell Factories, 14(96): 1-14. Jang, H.J., Kang, M.S., Yi, S.H., Hong, J.Y., Hong, S.P. 2016. Comparative study on the characteristics of Weissella cibaria CMU and probiotic strains for oral care. Molecules, 21(12): 1-11. Jeong, D., Kim, D.H., Kang, I.B., Kim, H., Song, K.Y., Kim, H.S., Seo, K.H. 2017. Characterization and antibacterial activity of a novel exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens DN1 isolated from kefir. Food Control, 78(2017): 436- 442. Jeong, D.W., Lee, J.H. 2015. Antibiotic resistance, hemolysis and biogenic amine production assessments of Leuconostoc and Weissella isolates for kimchi starter development. LWT - Food Science and Technology, 64(2015): 1078-1084. 99 Jimenez, E., Yepez, A., Perez-Cataluna, A., Vasquez, E.R., Davila, D.Z., Vignolo, G., Aznar, R. 2018. Exploring diversity and biotechnological potential of lactic acid bacteria from tocosh - traditional Peruvian fermented potatoes - by high throughput sequencing (HTS) and culturing. LWT - Food Science and Technology, 87(2018): 567- 574. Johansson, P., Paulin, L., Sade, E., Salovuori, N., Alatalo, E.R., Bjorkroth, K.J., Auvinen, P. 2011. Genome sequence of a food spoilage lactic acid bacterium, T Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811 , in association with specific spoilage reactions. Applied and Environmental Microbiology, 77(13): 4344–4351. Jones, A.E., Versalovic, J. 2009. Probiotic Lactobacillus reuteri biofilms produce antimicrobial and anti-inflammatory factors. BMC Microbiology, 9(35): 1-9. Jose, N.M., Bunt, C.R., Hussain, M.A. 2015. Comparison of microbiological and probiotic characteristics of Lactobacilli isolates from dairy food products and animal rumen contents. Microorganisms, 3: 198-212. Kaban, G., Kaya, M. 2008. Identification of lactic acid bacteria and gram-positive catalase-positive cocci isolated from naturally fermented sausage (sucuk). Journal of Food Science, 73(8): 385-388. Kam Hepdeniz, Ö,. Seçkin, Ö. 2017. Dinamik mikrobiyal bir yaĢam: oral biyofilm. Sdü Sağlık Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 8(3): 47-55. Karakuş, M. 1994. Beyaz peynirden izole edilen laktik asit bakterilerinin asit oluĢturma ve proteolitik aktiviteleri. Gıda, 19(4): 237-241. Karankı, E. 2013. Ülkemizde yaygın olarak kullanılan bazı baharatların antimikrobiyal aktivitesinin belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Niğde Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Ana Bilim Dalı, Niğde. Kavaz Yüksel, A., Şat, I.G., Yüksel, M. 2015. The effect of terebinth (Pistacia terebinthus L.) coffee addition on the chemical and physical characteristics, colour values, organic acid profiles, mineral compositions and sensory properties of ice creams. Journal of Food Science and Technology, 52(12): 8023-8031. Kavitake, D., Kandasamy, S., Devi, P.B., Shetty, P.H. 2018. Recent developments on encapsulation of lactic acid bacteria as potential starter culture in fermented foods – A review. Food Bioscience, 21(2018): 34–44. Kerekes, E.B., Deak, E., Tako, M., Tserennadmid, R., Petkovits, T., Vagvölgyi, C., Krisch, J. 2013. Anti-biofilm forming and anti-quorum sensing activity of selected essential oils and their main components on food-related micro-organisms. Journal of Applied Microbiology, 115: 933-942. Khemariya, P., Singh, S., Nath, G., Gulati, A.K. 2017. Probiotic Lactococcus lactis: A Review. Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, 5(6): 556- 562. Khosravi, Y., Ling, L.C., Loke, M.F., Shailendra, S., Prepageran, N., Vadivelu, J. 2014. Determination of the biofilm formation capacity of bacterial pathogens associated with otorhinolaryngologic diseases in the Malaysian population. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology, 271: 1227-1233. Kılıç, A., Yapar, M., Saraçlı, M.A., Baysallar, M., Doğancı, L. 2003. Spinal kord yaralanmalı hastalardan izole edilen Escherichia coli suĢlarının random amplifiye polimorfik DNA-PCR (RAPD) yöntemi ile genetik analizi. Gülhane Tıp Dergisi, 45(2): 143-146. 100 Kim, M.J., Kim, K.S. 2014. Tyramine production among lactic acid bacteria and other species isolated from kimchi. LWT - Food Science and Technology, 56(2014): 406-413. Kim, Y.J., Lee, S.H. 2016. Inhibitory effect of Lactococcus lactis HY 449 on cariogenic biofilm. Journal of Microbiology Biotechnology, 26(11): 1829-1835. Kiskó, G., Szabó-Szabó, O. 2011. Biofilm removal of Pseudomonas strains using hot water sanitation. Acta Universitatis Sapientiae Alimentaria, 4: 69-79. Kocková, M., Gereková, P., Petruláková, Z., Hybenová, E., Šturdík, E., Valík, L. 2011. Evaluation of fermentation properties of lactic acid bacteria isolated from sourdough. Acta Chimica Slovaca, 4(2): 78-87. Kolari, M., 2003. Attachment mechanisms and properties of bacterial biofilms on non- living surfaces. Academic Dissertation in Microbiology, University of Helsinki Department of Applied Chemistry and Microbiology, Helsinki, Finland. Korukluoğlu, M., Gürbüz, O., Şahin, İ. 2002. Taze zeytin mikroflorasında bulunan laktik asit bakterilerinin belirlenmesi. A.Ü. Zir. Fak. Tarım Bilimleri Dergisi, 8(2): 109- 113. Kostaki, M., Chorianopoulos, N., Braxou, E., Nychas, G.J., Giaouris, E. 2012. Differential biofilm formation and chemical disinfection resistance of sessile cells of Listeria monocytogenes strains under monospecies and dual-species (with Salmonella enterica) conditions. Applied and Environmental Microbiology, 78(8): 2586–2595. Koukkidis, G., Haigh, R., Allcock, N., Jordan, S., Freestonea, P. 2017. Salad leaf juices enhance Salmonella growth, colonization of fresh produce, and virulence. Applied and Environmental Microbiology, 83(1): 1-13. Kubota, H., Senda, S., Nomura, N., Tokuda, H., Uchiyama, H. 2008. Biofilm formation by lactic acid bacteria and resistance to environmental stress. Journal Of Bioscience And Bioengineering, 106(4): 381-386. Kubota, H., Senda, S., Tokuda, H., Uchiyama, H., Nomura, N. 2009. Stress resistance of biofilm and planktonic Lactobacillus plantarum subsp. plantarum JCM 1149. Food Microbiology, 26(2009): 592-597. Kumar, L.M., Saad, W.Z., Mohamad, R., Rahim, R.A. 2017. Influence of biofilm forming lactic acid bacteria against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA S547). Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 7(12): 1107–1115. Kumari, S., Sarkar, P.K. 2016. Bacillus cereus hazard and control in industrial dairy processing environment. Food Control, 69(2016): 20-29. Kushiro, A., Chervaux, C., Cool-Portier, S., Perony, A., Legrainraspaud, S., Obis, D., Onoune, M., Moer, A. 2009. Antimicrobial susceptibility testing of lactic acid bacteria and Bifidobacteria by broth microdilution method and etest. International Journal of Microbiology, 132(2009):54-58. Landeta, G., Curiel, J.A., Carrascosa, A.V., Muñoz, R., de las Rivas, B. 2013. Technological and safety properties of lactic acid bacteria isolated from Spanish dry- cured sausages. Meat Science, 95(2013): 272–280. Lebeer, S., Verhoeven, T.L.A., Velez, M.P., Vanderleyden, J., De Keersmaecker, S.C.J. 2007. Impact of environmental and genetic factors on biofilm formation by the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus GG. Applied and Environmental Microbiology, 73(21): 6768-6775. Lee, P.Y., Costumbrado, J., Hsu, C.Y., Kim, Y.H. 2012. Agarose gel electrophoresis for the separation of dna fragments. Journal of Visualized Experiments, 62: 1-5. 101 Leite, A.M.O., Miguel, M.A.L. Peixoto, R.S., Ruas-Madiedo, P., Paschoalin, V.M.F., Mayo, B., Delgado, S. 2015. Probiotic potential of selected lactic acid bacteria strains isolated from Brazilian kefir grains. Journal of Dairy Science, 98: 3622-3632. Li, S.W., Chen, Y.S., Lee, Y.S., Yang, C.H., Srionnual, S., Wu, H.C., Chang, C.H. 2017. Comparative genomic analysis of bacteriocin-producing Weissella cibaria 110. Applied Microbiology and Biotechnology, 101: 1227–1237. Lukasova, J., Sustackova, A. 2003. Enterococci and antibiotic resistance , Acta Veterinary Brno, 72: 315-323. Ma, Q., Wood, T.K. 2009. OmpA influences Escherichia coli biofilm formation by repressing cellulose production through the CpxRA two-component system. Environmental Microbiology, 11(10): 2735-2746. Mahony, J., Bottacini, F., van Sinderen, D., Fitzgerald, G.F. 2014. Progress in lactic acid bacterial phage research. Microbial Cell Factories, 13(Suppl 1): 1-12. Mäkelä, P.M., Korkeala, H.J., Laine, J.J. 1992. Ropy slime-producing lactic acid bacteria contamination at meat processing plants. International Journal of Food Microbiology, 17(1): 27-35. Maksimovic, A.Z., Zunabovic-Pichler, M., Kos, I., Mayrhofer, S., Hulak, N., Domig, K.J., Fuka, M.M. 2018. Microbiological hazards and potential of spontaneously fermented game meat sausages: a focus on lactic acid bacteria diversity. LWT - Food Science and Technology, 89(2018): 418–426. Masak, J., Cejkova, A., Schreiberova, O., Rezanka, T. 2014. Pseudomonas biofilms: possibilities of their control. FEMS Microbiology Ecology, 89(2014): 1–14. Mathur, S., Singh, R. 2005. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria-a review. International Journal of Food Microbiology, 105(2005): 281-295. Matsuki, T., Watanabe, K., Fujimoto, J., Kado, Y., Takada, T., Matsumoto, K., Tanaka, R. 2004. Quantitative PCR with 16S rRNA-gene-targeted species-specific primers for analysis of human intestinal bifidobacteria. Applied and Environmental Microbiology, 70(1): 167–173. Meral, H., Korukluoğlu, M. 2014. Laktik asit bakterilerinin antibiyotik direnç mekanizmaları. U. Ü. Ziraat Fakültesi Dergisi, 28(2): 71-82. Michalak, M., Gustaw, K., Waśko, A., Polak-Berecka, M. 2018. Composition of lactic acid bacteria during spontaneous curly kale (Brassica oleracea var. sabellica) fermentation. Microbiological Research, 206(2018): 121–130. Milci, S., Yaygın, H. 2005. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen ekzopolisakkaritler ve süt ürünlerindeki fonksiyonları. Gıda, 30 (2): 123-129. Minervini, F., Lattanzi, A., Dinardo, F.R., De Angelis, M., Gobbetti, M. 2018. Wheat endophytic Lactobacilli drive the microbial and biochemical features of sourdoughs. Food Microbiology, 70(2018): 162-171. Mohamed, J.A., Huang, D.B. 2007. Biofilm formation by Enterococci. Journal of Medical Microbiology, 56: 1581–1588. Moon, S.H., Kim, C.R., Chang, H.C. 2018. Heterofermentative lactic acid bacteria as a starter culture to control kimchi fermentation. LWT - Food Science and Technology, 88(2018): 181–188. Mostefaoui, A., Hakem, A., Yabrir, B., Boutaiba, S., Badis, A. 2014. Screening for exopolysaccharide-producing strains of thermophilic lactic acid bacteria isolated from Algerian raw camel milk. African Journal of Microbiology Research, 8(22): 2208-2214. 102 Munoz-Atienza, E., Araújo, C., del Campo, R., Hernandez, P.E., Herranz, C., Cintas, L.M. 2016. Safety assessment and molecular genetic profiling by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and PCR-based techniques of Enterococcus faecium strains of food origin. LWT - Food Science and Technology, 65(2016): 357-362. Nayak, M., Kotigadde, S., Pushpanathan, N., Shetty, H. 2013. Quality control using Nano Drop 1000 in PCR molecular diagnostic method to measure Enterococcus faecalis from secondary endodontic infections. Endodontology, 25(1): 100-106. Necidová, L., Janštová, B., Karpíšková, S., Cupáková, Š., Dušková, M., Karpíšková, R. 2009. Importance of Enterococcus spp. for forming a biofilm. Czech Journal of Food Sciences, 27(Special Issue): 354-356. Nostro, A., Guerrini, A., Marino, A., Tacchini, M., Di Giulio, M., Grandini, A., Akin, M., Cellini, L., Bisignano, G., Saraçoğlu, H.T. 2016. In vitro activity of plant extracts against biofilm-producing food-related bacteria. International Journal of Food Microbiology, 238(2016): 33–39. Oh, A., Daliri, E.B.M., Oh, D.H. 2018. Screening for potential probiotic bacteria from Korean fermented soybean paste: in vitro and Caenorhabditis elegans model testing. LWT - Food Science and Technology, 88(2018): 132–138. Oliveira, A., Cunha, M.L.R.S. 2010. Comparison of methods for the detection of biofilm production in coagulase-negative staphylococci. BMC Research Notes, 3(260): 1-8. Olson, N.D., Morrow, J.B. 2012. DNA extract characterization process for microbial detection methods development and validation. BMC Research Notes, 5(668): 1-14. Orhan, E. 2013. Sütten izole edilen laktik bakteriler ve streptokokların enzim aktiviteleri. Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı, Ankara. Özteber, M. 2013. Fermente süt ürünlerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin antibiyotik dirençliliklerinin fenotipik ve genotipik yöntemlerle belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Adnan Menderes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, Aydın. Özyurt, V.H., Ötleş, S. 2014. Prebiyotikler: metabolizma için önemli bir gıda bileseni. Akademik Gıda, 12(1): 115-123. Palamutoğlu, R., Kasnak, C. 2014. Fermente et ürünleri üretiminde probiyotik kullanımı. Türk Tarım – Gıda Bilim ve Teknoloji Dergisi, 2(5): 208-213. Panghal, A., Janghu, S., Virkar, K., Gat, Y., Kumar, V., Chhikara, N. 2018. Potential non-dairy probiotic products – a healthy approach. Food Bioscience, 21(2018): 80–89. Park, H., Yeo, S., Ji, Y., Lee, J., Yang, J., Park, S., Shin, H., Holzapfel, W. 2014. Autoinducer-2 associated inhibition by Lactobacillus sakei NR28 reduces virulence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Food Control, 45: 62-69. Park, S.H., Jung, J.H., Seo, D.H., Lee, H.L., Kim, G.W., Park, S.Y., Shin, W.C., Hong, S., Park, C.S. 2012. Differentiation of lactic acid bacteria based on RFLP analysis of the tuf gene. Food Science and Biotechnology, 21(3): 911-915. Patel, A., Shah, N., Prajapati, J.B. 2013. Biosynthesis of vitamins and enzymes in fermented foods by lactic acid bacteria and related genera - a promising approach. Croatian Journal of Food Science and Technology, 5(2): 85-91. 103 Patel, I., Patel, V., Thakkar, A., Kothari, V. 2014. Microbial biofilms: microbes in social mode. International Journal of Agricultural and Food Research, 3(2): 34-49. Patel, S., Majumder, A., Goyal, A. 2012. Potentials of exopolysaccharides from lactic acid bacteria. Indian Journal of Microbiology, 52(1): 3–12. Paveljšek, D., Trmčić, A., Hacin, B., Rogelj, I. 2014. PCR verification of microplate phenotypic system identification for LAB from traditional Western Balkan raw milk cheeses. Mljekarstvo, 64(4): 245-253. Peñas, E., Frias, J., Sidro, B., Vidal-Valverde, C. 2010. Impact of fermentation conditions and refrigerated storage on microbial quality and biogenic amine content of sauerkraut. Food Chemistry, 123(2010): 143–150. Pogacic, T., Mancini, A., Santarelli, M., Bottari, B., Lazzi, C., Neviani, E., Gatti, M. 2013. Diversity and dynamic of lactic acid bacteria strains during aging of a long ripened hard cheese produced from raw milk and undefined natural starter. Food Microbiology, 36(2013): 207-215. Prasanna, P.H.P., Charalampopoulos, D. 2018. Encapsulation of Bifidobacterium longum in alginate-dairy matrices and survival in simulated gastrointestinal conditions, refrigeration, cow milk and goat milk. Food Bioscience, 21(2018): 72–79. Pulaj, B., Mustafa, B., Nelson, K., Quave, C.L., Hajdari, A. 2016. Chemical composition and in vitro antibacterial activity of Pistacia terebinthus essential oils derived from wild populations in Kosovo. BMC Complementary and Alternative Medicine, 16(147): 1-9. Quijada, N.M., De Filippis, F., Sanz, J.J., García-Fernandez, M.D.C., Rodríguez- Lazaro, D., Ercolini, D., Hernandez, M. 2018. Different Lactobacillus populations dominate in “Chorizo de Leon” manufacturing performed in different production plants. Food Microbiology, 70(2018): 94-102. Rao, T.S., Kumar, R., Balamurugan, P., Vithal, G.K. 2017. Microbial fouling in a water treatment plant and its control using biocides. Biocontrol Science, 22(2): 105-119. Reis, N.A., Saraiva, M.A.F., Duarte, E.A.A., de Carvalho, E.A., Vieira, B.B., Evangelista-Barreto, N.S. 2016. Probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from human milk, Journal of Applied Microbiology, 121: 811-820. Ruggirello, M., Dolci, P., Cocolin, L. 2014. Detection and viability of Lactococcus lactis throughout cheese ripening. Plos One, 9(12): 1-14. Salas-Jara, M.J., Ilabaca, A., Vega, M., García, A. 2016. Biofilm forming Lactobacillus: new challenges for the development of probiotics. Microorganisms, 4(35): 1-14. Samaržija, D., Antunac, N., Havranek, J.L. 2001. Taxonomy, physiology and growth of Lactococcus lactis: a review. Mljekarstvo, 51(1): 35-48. Sanlibaba, P., Çakmak, G.A. 2016. Exopolysaccharides production by lactic acid bacteria. Applied Microbiology: Open Access, 2(2): 1-5. Saranraj, P., Naidu, M.A., Sivasakthivelan, P. 2013. Lactic acid bacteria and its antimicrobial properties: a review. International Journal of Pharmaceutical&Biological Archives, 4(6): 1124-1133. Schoina, V., Terpou, A., Bosnea, L., Kanellaki, M., Nigam, P.S. 2018. Entrapment of Lactobacillus casei ATCC393 in the viscus matrix of Pistacia terebinthus resin for functional myzithra cheese manufacture. LWT - Food Science and Technology, 89(2018): 441–448. 104 Shin, S.Y., Han, N.S. 2015. Leuconostoc spp. as starters and their beneficial roles in fermented foods: Beneficial microorganisms in food and nutraceuticals. microbiology monographs, Ed.: Liong, M.T., Springer, Cham, Switzerland, pp: 111-132. Shukla, S., Goyal, A. 2011. 16S rRNA-based identification of a glucan- hyperproducing Weissella confusa. Enzyme Research, 2011: 1-10. Singh, H., Kongo, J.M., Borges, A., Ponte, D.J.B., Griffiths, M.W. 2015. Lactic acid bacteria ısolated from raw milk cheeses: ribotyping, antimicrobial activity against selected food pathogens and resistance to common antibiotics. Journal of Food Processing and Technology, 6(9): 1-5. Spoering, A.L., Lewis, K. 2001. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. Journal of Bacteriology, 183(23): 6746-6751. Srionnual, S., Yanagida, F., Lin, L.H., Hsiao, K.N., Chen, Y.S. 2007. Weissellicin 110, a newly discovered bacteriocin from Weissella cibaria 110, isolated from plaa- som, a fermented fish product from Thailand. Applied And Environmental Microbiology, 73(7): 2247-2250. Stiles, M.E., Holzapfel, W.H. 1997. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International Journal of Food Microbiology, 36(1997): 1-29. Stoyanova, L.G., Ustyugova, E.A., Netrusov, A.I. 2012. Antibacterial metabolites of lactic acid bacteria: their diversity and properties. Applied Biochemistry and Microbiology, 48(3): 229-243. Sudağıdan, M., Aydın, A. 2013. Lizozim ve nisinin gıda kaynaklı Staphylococcus aureus suĢlarında geliĢim ve biyofilm oluĢumu üzerine etkileri. The Journal of the Faculty of Veterinary Medicine, 39(2): 254-263. Sun, Z., Yu, J., Dan, T., Zhang, W., Zhang, H. 2014. Phylogenesis and Evolution of Lactic Acid Bacteria: Lactic Acid Bacteria Fundamentals and Practice, Ed.: Zhang, H., Cai, Y., Springer, Netherlands, pp: 1-101. Şimşek, Ö., Kördikanlıoğlu, B., Yazıcı, G., Kaya, H.İ. 2014. Beyaz peynirde nisini tolere eden laktik asit bakteri miktarı ve çeĢitliliği. Akademik Gıda, 12(4): 36-40. Tahmourespour, A., Kermanshahi, R.K. 2011. The effect of a probiotic strain (Lactobacillus acidophilus) on the plaque formation of oral Streptococci. Bosnian Journal of Basic Medical Sciences, 11(1): 37-40. Tatlı, D. 2009. Geleneksel süt ürünlerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin antibyotik dirençlerinin belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Adana. Tanrıbuyurdu, E., 2014. Sığır mastitislerinden izole edilen Staphylococcus aureus suĢlarında biofilm oluĢumu ve antibiyotiklere dirençliliğinin belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Adnan Menderes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Aydın. Temmerman, R., Huys, G., Swings, J. 2004. Identification of lactic acid bacteria: culture-dependent and culture independent methods. Trends in Food Science & Technology, 15(2004): 348–359. Tokatlı, M. 2013. Ankara Çubuk yöresi turĢularından izole edilen laktik asit bakterilerinin tanımlanmaları, teknolojik ve fonksiyonel özelliklerinin belirlenmesi ve starter olarak kullanılma olanaklarının değerlendirilmesi. Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı, Ankara. 105 Tokatlı, M., Dursun, D., Arslankoz, N., Şanlıbaba P., Özçelik, F. 2012. Tursu üretiminde laktik asit bakterilerinin önemi. Akademik Gıda, 10(1): 70-76. Tokatlı, M., Gülgör, G., Bağder-Elmacı, S., Arslankoz-İşleyen, N., Özçelik, F. 2015. In vitro properties of potential probiotic indigenous lactic acid bacteria originating from traditional pickles. BioMed Research International, 2015: 1-8. Tokatlı, M., Bağder-Elmacı, S., Arslankoz-İşleyen, N., Özçelik, F. 2017. Technological properties of lactic acid bacteria isolated from traditional pickles. Gıda, 42(6): 693-707. Tunail, N. 2009. Mikrobiyoloji. Pelin Ofset, Ankara, 448 s. Ünal, D., Tayfur, M. 2017. Biyofilm. Güncel Gastroenteroloji, 21(2): 108-114. Ünal-Turhan, E., Erginkaya, Z. 2016. Probiyotik gıdalardan izole edilen laktik asit bakterilerinin antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi. Pamukkale Üniversitesi Mühendislik Bilimleri Dergisi, 22(7): 620-624. Vakevainen, K., Valderrama, A., Espinosa, J., Centurion, D., Rizo, J., Reyes- Duarte, D., Díaz-Ruiz, G., von Wright, A., Elizaquível, P., Esquivel, K., Simontaival, A.I., Aznar, R., Wacher, C., Plumed-Ferrer, C. 2018. Characterization of lactic acid bacteria recovered from atole agrio, a traditional Mexican fermented beverage. LWT - Food Science and Technology, 88(2018): 109-118. Vahabzadeh, S., Özpınar, H., Kalkan, I., Andaç-Öztürk, S. 2017. Identification and characterization of Lactococcus lactis ssp. lactis isolated from raw milk and milk products of Turkey and Iran. Asian Journal of Agriculture and Food Sciences, 5(4): 159-168. Valenzuela, J.F., Pinuer, L.A., Cancino, A.G., Yáñez, R.B. 2015. Metabolic fluxes in lactic acid bacteria-a review. Food Biotechnology, 29: 185–217. Villani, F., Moschetti, G., Blaiotta, G., Coppola, S. 1997. Characterization of strains of Leuconostoc mesenteroides by analysis of soluble whole-cell protein pattern, DNA fingerprinting and restriction of ribosomal DNA. Journal of Applied Microbiology, 102: 578-588. Vu, B., Chen, M., Crawford, R.J., Ivanova, E.P. 2009. Bacterial extracellular polysaccharides involved in biofilm formation. Molecules, 14: 2535-2554. Ward, P., Roy, D. 2005. Review of molecular methods for identification, characterization and detection of bifidobacteria. Lait, 85(2005): 23-32. Wassie, M., Wassie, T. 2016. Isolation and identification of lactic acid bacteria from raw cow milk. International Journal of Advanced Research in Biological Sciences, 3(8): 44-49. Winkelstroter, L.K. 2015. Microbial biofilms: the challenge of food industry. Biochemistry & Molecular Biology Journal, 1(5): 1-3. Xiong, T., Peng, F., Liu, Y., Deng, Y., Wang, X., Xie, M. 2014. Fermentation of Chinese sauerkraut in pure culture and binary co-culture with Leuconostoc mesenteroides and Lactobacillus plantarum. LWT-Food Science and Technology, 59(2014): 713-717. Yalanca, İ. 2009. Geleneksel et ürünlerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin antibiyotik direncinin belirlenmesi. Yüksek Lisans Tezi, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoteknoloji Anabilim Dalı, Adana. Yerlikaya, O. 2014. Laktik asit bakterilerinin tanılanmasında kullanılan baĢlıca fenotipik ve moleküler yöntemler. Gıda ve Yem Bilimi - Teknolojisi Dergisi, 14: 8-22. 106 Yeşilçimen-Akbaş, M. 2015. Bacterial biofilms and their new control strategies in food industry: The Battle Against Microbial Pathogens: Basic Science, Technological Advances and Educational Programs, Ed.: Méndez-Vilas, A., Formatex, Badajoz, Spain, pp: 383-394. Yesilcimen Akbas, M., Cag, S. 2016. Use of organic acids for prevention and removal of Bacillus subtilis biofilms on food contact surfaces. Food Science and Technology International, 22(7):587–597. Yun, B., Oh, S., Griffiths, M.W. 2014. Lactobacillus acidophilus modulates the virulence of Clostridium difficile. Journal of Dairy Science, 97: 4745–4758. Yüksekdağ, Z.N., Zeydanlı, M.N. 2013. Folat eksikliği ve probiyotikler. Nevşehir Bilim ve Teknoloji Dergisi, 2(2): 21-36. Zarour, K., Llamas, M.G., Prieto, A., Ruas-Madiedo, P., Duenas, M.T., de Palencia, P.F., Aznar, R., Kihal, M., Lopez, P. 2017. Rheology and bioactivity of high molecular weight dextrans synthesised by lactic acid bacteria. Carbohydrate Polymers, 174(2017): 646–657. Zhang, H., Xie, L., Zhang, W., Zhou, W., Su, J., Liu, J. 2013. The association of biofilm formation with antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented foods. Journal of Food Safety, 33: 114-120. 107 EKLER EK 1 Ġzolatların “Tüp Yöntemi” ile biyofilm oluĢturma kapasiteleri EK 2 Ġzolatların “96 Kuyucuklu Plaka Yöntemi” ile biyofilm oluĢturma kapasiteleri EK 3 Tanısı yapılan laktik asit bakterilerinin bazı antibiyotiklere karĢı dirençleri ve zon çapı (mm) ölçüm sonuçları 108 Ek 1- İzolatların “Tüp Yöntemi” ile belirlenen biyofilm oluşturma kapasiteleri 109 Ek 1- İzolatların “Tüp Yöntemi” ile belirlenen biyofilm oluşturma kapasiteleri (devam) 110 Ek 2- İzolatların “96 Kuyucuklu Plaka Yöntemi” ile belirlenen biyofilm oluşturma kapasiteleri 111 Ek 2- İzolatların “96 Kuyucuklu Plaka Yöntemi” ile belirlenen biyofilm oluşturma kapasiteleri (devam) 112 Ek 3- Tanısı yapılan laktik asit bakterilerinin bazı antibiyotiklere karşı dirençleri ve zon çapı (mm) ölçüm sonuçları 113 Ek 3- Tanısı yapılan laktik asit bakterilerinin bazı antibiyotiklere karşı dirençleri ve zon çapı (mm) ölçüm sonuçları (devam) 114 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : GökĢen ARIK Doğum Yeri ve Tarihi : Kayseri - 02.01.1987 Yabancı Dili : Ġngilizce Eğitim Durumu Lise : Sami Yangın Anadolu Lisesi Lisans : Erciyes Üniversitesi Gıda Mühendisliği Yüksek Lisans : Uludağ Üniversitesi Gıda Mühendisliği Çalıştığı Kurum : Uludağ Üniversitesi (2011-2018) İletişim : goksengulgor@gmail.com Yayınları : Gulgor, G., Korukluoglu, M. 2018. Production of extracellular polymeric substances (EPS) from lactic acid bacteria (LAB): their antimicrobial effect and potential application in food industry: Bioprocessing technology in food and health, Ed.: Kumar Verma, D., Patel, A., Srivastav, P.P., Apple Academic Press, USA. Gulgor, G., Korukluoğlu, M. 2017. Biofilms and their advantages/disadvantages in food industry: Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs (Microbiology Book Series #6), Ed.: Méndez-Vilas, A., Formatex Research Center, Badajoz, Spain, pp: 308-314. Korukluoglu, M., Gulgor, G. 2017. Anti-quorum sensing activity of plants: Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs (Microbiology Book Series - Volume #6), Ed.: Méndez-Vilas, A., Formatex Research Center, Badajoz, Spain, pp: 529-535. Bagder-Elmacı, S., Gulgor, G., Tokatlı, M., Erten, H., İşçi, A., Ozcelık, F. 2015. Effectiveness of chitosan against wine-related microorganisms. Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology, 107 (3):675-686. Doi: 10.1007/s10482-014- 0362-6. Tokatli, M., Gulgor, G., Bagder-Elmacı, S., A r s l a n k o z -Isleyen, N., Ozcelik, F. 2015. In vitro properties of potential probiotic ındigenous lactic acid bacteria originating from traditional pickles. BioMed Research International, Volume 2015, Article ID 315819, 8 pages, Doi: 10.1155/2015/315819 http://dx.doi.org/10.1155/2015/315819. Arik, G., Korukluoglu, M. 2017. Comparison of methods for the detection of biofilm formation in yeast and lactic acid bacteria species ısolated from dairy products. 115 International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering, 11 (4): 306-310. (http://waset.org/publications/10006896/comparison-of-methods-for-the-detection-of- biofilm-formation-in-yeast-and-lactic-acid-bacteria-species-isolated-from-dairy- products) Korukluoglu, M., Arik, G., Erdogan, C., Kocakoglu, S. 2017. Screening of antagonistic/synergistic effect between lactic acid bacteria (LAB) and yeast strains ısolated from kefir”, International Journal of Biological, Biomolecular, Agricultural, Food and Biotechnological Engineering, 11 (4): 282-288. (http://waset.org/publications/10006770/screening-of-antagonistic-synergistic-effect- between-lactic-acid-bacteria-lab-and-yeast-strains-isolated-from-kefir) Gulgor, G., Korukluoglu, M. 2016. Biogenic amine degradation by lactic acid bacteria during wine processing, The Journal of Agricultural Faculty of Uludag University. 30 (Special Issue): 487-492. Korukluoglu, M., Gulgor, G. 2016. Resistance of microbial biofilms to disinfectants and its importance in food industry, The Journal of Agricultural Faculty of Uludag University. 30 (Special Issue): 518-524. Gülgör, G., Korukluoğlu, M. 2015. ġarap kalitesinin geliĢtirilmesinde Brettanomyces türlerinin killer toksinler ile engellenmesi (Properties and importance of killer toxins for wine quality improvement), Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 29(2): 183- 192. Gülgör, G., Korukluoğlu, M. 2014. Mikroorganizmalar arasında çoğunluk algılanması (Quorum sensing), Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 28(2): 83- 92. Gülgör, G., Özçelik, F. 2014. Bakteriyosin üreten laktik asit bakterilerinin probiyotik amaçlı kullanımı, Akademik Gıda, 12 (1): 63-68. Gülgör, G., Korukluoğlu, M. 2014. Mikotoksinlerin sağlık üzerine etkileri ve moleküler tanı yöntemleri, Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı Dergisi Türktarım, 215: 66-70. Korukluoglu M., Gulgor G. 2016. The correlation between biofilm formation and antibiotic resistance of some microorganisms isolated from "Kefir”. European Biotechnology Congress, 5-7 Mayıs 2016, Riga, Latvia. Korukluoglu, M., Gulgor, G. 2016. Honey related microorganisms and antimicrobial compounds. International Congress on Food of Animal Origin, 10-13 Kasım 2016. Turkish Republic of North Cyprus. Gulgor, G., Korukluoglu, M. 2016. Production of biocolours by microorganisms and their importance in food industry. European Biotechnology Congress, 5-7 Mayıs 2016, Riga, Latvia. Gulgor, G., Korukluoglu, M. 2016. Biogenic amine degradation by lactic acid bacteria th during wine processing. 27 International Scientific-Expert Congress of Agriculture and Food Industry, 26-28 Eylül 2016, Bursa, Turkey. Korukluoglu M., Gulgor G. 2016. Resistance of microbial biofilms to disinfectants th and its importance in food industry. 27 International Scientific-Expert Congress of Agriculture and Food Industry, 26-28 Eylül 2016, Bursa, Turkey. Korukluoglu M., Gulgor G. 2016. Resistance of microbial biofilms to disinfectants th and its importance in food industry. 27 International Scientific-Expert Congress of Agriculture and Food Industry, 26-28 Eylül 2016, Bursa, Turkey. 116 Bagder-Elmacı, S., Gulgor, G. Tokatlı, M., Ozcelık, F. 2014. The inhibitory effect of chitosan against microorganisms involved the different stages of wine nd production. Proceedings of 2 International Congress on Food Technology, 5-7 Kasım 2014, KuĢadası, Turkey. Korukluoglu, M., Gulgor, G. 2014. The antifungal activity of organic acids produced nd by lactic acid bacteria. 2 International Congress on Food Technology, 5-7 Kasım 2014, KuĢadası, Turkey. Gulgor, G., Korukluoglu, M. 2014. The risk of biofilm formation in the food industry nd and prevention methods. 2 International Congress on Food Technology, 5-7 Kasım 2014, KuĢadası, Turkey. Bagder-Elmacı, S., Tokatlı, M., Gulgor, G. Sanlıbaba, P., Ozcelık, F. 2013. Probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from traditional Cubuk pickles. The nd 2 International Symposium on Traditional Foods from Adriatic to Caucasus, 24-26 October 2013, Struga-Ohrid, Macedonia. Gulgor, G., Tamer, C. E., 2013. Application possibilities for propolis as food nd preservative. The 2 International Symposium on Traditional Foods from Adriatic to Caucasus, 24-26 October 2013, Struga-Ohrid/ Macedonia. Korukluoglu, M., Gulgor, G. 2013. The antimicrobial effect of locust bean extract nd which is a traditional food. The 2 International Symposium on Traditional Foods from Adriatic to Caucasus, 24-26 October 2013, Struga-Ohrid/ Macedonia. Gulgor, G., Korukluoglu, M. 2013. Preservation of traditional sweeties by hurdle nd technology. The 2 International Symposium on Traditional Foods from Adriatic to Caucasus, 24-26 October 2013, Struga-Ohrid/ Macedonia. Arık, G., Korukluoğlu, M. 2017. Mikroorganizmalarda enkapsülasyon uygulamaları, avantajları ve karĢılaĢılan sorunlar. 6. Ulusal Moleküler Biyoloji ve Biyoteknoloji Kongresi, 05-07 Ekim 2017, Adana, Türkiye. Korukluoğlu, M., Arık, G. 2017. Bazı tıbbi bitkilerin fitokimyasal bileĢenleri ve farmakolojik özellikleri. 6. Ulusal Moleküler Biyoloji ve Biyoteknoloji Kongresi, 05-07 Ekim 2017. Gülgör, G. Korukluoğlu, M. 2016. ġarap fabrikası atıklarının mikrobiyel yolla kompostlanması. Türkiye 12. Gıda Kongresi, 5-7 Ekim 2016. Edirne, Türkiye. Korukluoğlu, M., Gülgör, G. 2016. Zeytinyağı fabrikası atığı olan prinanın biyodönüĢümünde küflerin kullanım olanakları. Türkiye 12. Gıda Kongresi, 5-7 Ekim 2016. Edirne, Türkiye. Ataş, M., Gülgör, G. 2016. Ağır metallerin mikroorganizmalar üzerine etkisi. Türkiye 12. Gıda Kongresi, 5-7 Ekim 2016, Edirne, Türkiye. Küçükata, Y., Gülgör, G. 2016. Balda bulunan potansiyel probiyotik bakteriler. Türkiye 12. Gıda Kongresi, 5-7 Ekim 2016, Edirne, Türkiye. Korukluoglu, M., Gulgor, G. 2014. Lactobacillus helveticus‟un gıdalardaki önemi ve rd sağlık üzerine etkileri. Bursa 3 International Food Congress, 26-27 Eylül 2014, Bursa, Turkey. Gulgor, G., Korukluoglu, M. 2014. Mikrobiyel metabolomiklerin önemi ve gıda rd mikrobiyolojisinde uygulama alanları. Bursa 3 International Food Congress, 26-27 Eylül 2014, Bursa, Turkey. 117 Korukluoğlu, M., Gülgör, G. 2013. Taze meyvelerin ozon uygulaması ile E.coli 0157:H7'den arındırılması. 4. Gıda Güvenliği Kongresi, 14-15 Mayıs 2013, Ġstanbul, Türkiye. Korukluoğlu, M., Gülgör, G. 2013. Mikotoksinlerin sağlık üzerine etkileri ve moleküler tanı yöntemleri. 8. Gıda Mühendisliği Kongresi, 7-9 Kasım 2013, Ankara, Türkiye. Gülgör, G., Korukluoğlu, M. 2013. Midye dolmanın gıda güvenliği açısından değerlendirimesi. 4. Gıda Güvenliği Kongresi, 14-15 Mayıs 2013, Ġstanbul, Türkiye. Gülgör, G., Korukluoğlu, M. 2013. Likopenin üretim yolları ve nutrasötik özellikleri. 8. Gıda Mühendisliği Kongresi, 7-9 Kasım 2013, Ankara, Türkiye. Gülgör, G., Korukluoğlu, M. 2013. Gıda bileĢenlerinin meme kanserine neden olan genler ile etkileĢimi. 8. Gıda Mühendisliği Kongresi, 7-9 Kasım 2013, Ankara, Türkiye. Gülgör, G., Korukluoğlu, M. 2013. Gıda konveyörlerinde mikrobiyel sorunlar ve çözüm önerileri. 8. Gıda Mühendisliği Kongresi, 7-9 Kasım 2013, Ankara, Türkiye. Gülgör, G. 2013. Soğuk zincirin gıda güvenliğindeki yeri ve önemi. 4. Gıda Güvenliği Kongresi, 14-15 Mayıs 2013, Ġstanbul, Türkiye. Gülgör, G., Bektaş, D., Korukluoğlu, M., Kumral, A. 2012. Bisfenol A içerikli gıda ambalajlarına güncel yaklaĢım. 11. Gıda Kongresi, 10-12 Ekim 2012, Hatay, Türkiye. Korukluoğlu, M., Gülgör, G. 2012. Meyve sularında bozulma etmeni A.acidoterrestris‟in bazı katkı maddeleri ile inhibisyonu. 11. Gıda Kongresi, 10-12 Ekim 2012, Hatay, Türkiye. Kumral, A., Bektaş, D., Gülgör, G., Korukluoğlu, M. 2012. Gemlik çeĢidi olarak satıĢa sunulan sofralık zeytinlerin bazı özellikleri. Ulusal Zeytin Öğrenci Kongresi, 16- 18 Mayıs 2012, Aydın, Türkiye. Bektaş, D., Gülgör, G., Korukluoğlu, M. 2012. Akıllı etiketleme teknolojisi ve kullanılabilirliği. 3. Gıda Güvenliği Kongresi, 3-4 Mayıs 2012, Ġstanbul, Türkiye. Gülgör, G., Bektaş, D., Korukluoğlu, M. 2012. Nutrigenetik, 3. Gıda Güvenliği Kongresi, 3-4 Mayıs 2012, Ġstanbul, Türkiye. 118