OKSALAT ENZİMATİK ELEKTRODUNUN HAZIRLANMASI VE OKSALİK ASİT GİRİŞİMİNE KARŞI VOLTAMETRİK ANALİZ KOŞULLARININ OPTİMİZE EDİLMESİ ŞENER ŞENOL T.C. ULUDAĞ ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ OKSALAT ENZİMATİK ELEKTRODUNUN HAZIRLANMASI VE OKSALİK ASİT GİRİŞİMİNE KARŞI VOLTAMETRİK ANALİZ KOŞULLARININ OPTİMİZE EDİLMESİ Şener ŞENOL Doç. Dr. M. Haluk TÜRKDEMĠR YÜKSEK LĠSANS TEZĠ KĠMYA ANABĠLĠM DALI BURSA–2011 Her Hakkı Saklıdır TEZ ONAYI ġener ġENOL tarafından hazırlanan “Oksalat enzimatik elektrodunun hazırlanması ve oksalik asit giriĢimine karĢı voltametrik analiz koĢullarının optimize edilmesi” adlı tez çalıĢması aĢağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiĢtir. Danışman : Doç. Dr. M. Haluk TÜRKDEMĠR Başkan : Prof. Dr. ġeref GÜÇER Ġmza U.Ü. Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. M. Haluk TÜRKDEMĠR Ġmza U.Ü. Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Yrd. Doç. Dr. Ozan GÜRBÜZ Ġmza U.Ü Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Belgin ĠZGĠ (Yedek Üye) Ġmza U.Ü Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Özgür Akgün KARABULUT (Yedek Üye) Ġmza U.Ü. Ziraat Fakültesi, Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Kadri ARSLAN Enstitü Müdürü …. / …./ …... U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında;  tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi,  görsel, iĢitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu,  baĢkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu,  atıfta bulunduğum tüm eserleri kaynak olarak gösterdiğimi,  kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı,  ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya baĢka bir üniversitede baĢka bir tez çalıĢması olarak sunmadığımı beyan ederim. …./…./…… Şener Şenol ÖZET Yüksek Lisans Tezi OKSALAT ENZİMATİK ELEKTRODUNUN HAZIRLANMASI VE OKSALİK ASİT GİRİŞİMİNE KARŞI VOLTAMETRİK ANALİZ KOŞULLARININ OPTİMİZE EDİLMESİ Şener ŞENOL Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr M. Haluk TÜRKDEMİR Yeni kimyasal ve biyokimyasal sensörler hazırlanması, var olanların geliştirilmesi son yıllarda analitik kimyanın temel araştırma konuları arasında yer almaktadır. Elektrokimyasal biyosensörler arasında sayılan enzimatik oksalat elektrotu, hazırlanma zorluğunun azaltılması, seçicilik ve duyarlılığının arttırılması için çalışmaların sürdürüldüğü bir sensördür. Bu çalışmada, oksalat tayini için oksalat oksidaz enzimi ile hazırlanan elektrotun, oksalik asit girişimine karşı optimizasyon çalışmaları yapılmıştır. Oksidaz yapısındaki enzimatik elektrotların ölçüm ilkesi oluşan hidrojen peroksit ölçümüne dayalı olduğundan, hidrojen peroksit ve oksalik asidin geniş bir pH bölgesinde farklı çalışma elektrotları ve tampon çözelti bileşimine olan duyarlılığını belirleme çalışmalarına öncelik verildi. Yapılan optimizasyon çalışmaları ile, anodik bölgedeki yükseltgenme pikinin duyarlık ve tekrarlanırlık açısından daha uygun olduğu, platin elektrot ve Britton–Robinson tamponunda en iyi duyarlılığın elde edildiği, oksalik asit eklemelerinin önceden tamponlanmış olmaması halinde ölçüm ortamının pH’si üzerinde etkili olduğu, pH ≤ 4 olan bölgede oksalik asit ile hidrojen peroksit piklerinin tamamen girişim yaptığı ve bu iki maddenin piklerinin ancak pH 6,5’de ayrıştığı, dolayısıyla bu koşullarda bir enzimatik sensör hazırlanabileceği belirlendi. Uygunluğu belirlenen ölçüm koşullarında farklı enzim immobilizasyon yöntemlerinin denenerek, duyarlılık ve kullanım ömrü açısından karşılaştırmalar yapıldı. Başarılı şekilde hazırlanan glutaraldehit ile çapraz bağlı ve nafyon kaplı enzimatik elektrotlarda 0,025-1,000 mM derişim aralığında doğrusal çalışma aralığı elde edildi. Sensör duyarlılığının zamanla değişimi, nafyon yüzdesinin sensör duyarlılığı üzerindeki etkisi çalışmaları yapıldı, gerçek örneklerde başarılı ölçüm ve denemeler gerçekleştirildi. Anahtar Kelimeler: Oksalat sensörü, biyosensör, oksalat oksidaz, oksalik asit, enzimatik sensör 2011, xii + 106 sayfa i ABSTRACT MSc Thesis PREPERATION OF OXALATE ENZYMATIC ELECTRODE AND OPTIMIZATION OF THE VOLTAMMETRIC ANALYSIS CONDITIONS AGAINST OXALIC ACID INTERFERENCE Şener ŞENOL Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Science Department of Chemistry Supervisor: Assoc. Prof. Dr M. Haluk TÜRKDEMİR In recent years, preparation of new chemical and biochemical sensors and development of existing ones is among the main research topics of analytical chemistry. Enzymatic oxalate sensor, is regarded as a electrochemical biosensor, which optimization studies still proceed for minimization of difficulties in preparation process and improve selectivity and sensitivity. In this study, optimization studies of the oxalate electrode, prepared with immobilization of oxalate oxidase, have been done against the interference effect of oxalic acid. Measurement principle of oxidase enzyme type electrodes are based on the measurement of produced hydrogen peroxide, the investigation of working electrode type and pH effect in a wide range with using different buffer solution on sensitivity of hydrogen peroxide and oxalic acid analysis was given priority. After optimization studies, the oxidation peak in the anodic region which is much proper in terms of sensibility and reproducibility, the best sensitivity was obtained with platinum electrode and in Britton-Robinson buffer, the effect of non-buffered oxalic acid additions on the pH of solution were determined. And also observed that, the anodic peaks of oxalic acid and hydrogen peroxide was completely coincided at the pH ≤ 4 and the peaks of these two substances became different at only 6,5 pH, and therefore possibility of an enzymatic sensor preparation in these conditions was determined. Several immobilization techniques were tested in the determined conditions and comparisons were performed in terms of sensibility and life time of enzymatic electrode. A linear working range between 0,025-1,000 mM concentration were obtained which using successfully prepared with cross–linking of glutaraldehyde and encapsulated with nafion. Some of characteristic determinations like variation of sensibility as a function of time and the effect of % nafion to the sensibility are carried out and also successful studies are performed with real samples. Key words: Oxalate sensor, biosensor, oxalate oxidase, oxalic acid, enzymatic sensor 2011, xii + 106 pages ii TEŞEKKÜR Bu çalışma Uludağ Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Öğretim Üyelerinden Doç. Dr M. Haluk TÜRKDEMİR yönetiminde hazırlanarak, Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsüne Yüksek Lisans Tezi olarak sunulmuştur. Yüksek lisans tezimi yöneten ve çalışmalarım esnasında yakın ilgi ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen, her zaman bana destek olup, yol gösteren sayın hocam Doç. Dr M. Haluk TÜRKDEMİR’e sonsuz saygı ve şükranlarımı sunarım. Tez çalışmamda yararlandığım cihaz ve sarf malzemelerinin temininin sağlandığı, aynı zamanda yardımcı araştırıcı olarak görev yapmakta olduğum F2008/58 nolu projeye verilen destek dolayısıyla Uludağ Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimine ve bu olanağı sağlayan yetkililere teşekkürlerimi sunarım. Laboratuvar çalışmalarımda katkısı bulunan Bilecik Üniversitesi Kimya Bölümü Araştırma Görevlisi arkadaşım Adem SARIHAN’a ve yüksek lisans eğitimim süresince çalışmalarıma katkıda bulunan tüm Uludağ Üniversitesi Kimya Bölümü Araştırma Görevlilerine teşekkür ederim. Tüm tahsil hayatım boyunca benim için her türlü fedakarlığı gösteren anneme, babama ve kardeşime sonsuz saygı ve şükranlarımı sunarım. Yüksek lisans öğrenimim boyunca manevi desteklerini bir an olsun üzerimden ayırmayan nişanlım Elvan ER ve ailesine teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca arkadaşlarım Gökhan KAPLAN, Emel DEMİRBEL, Nurettin YANNİ ve Derviş KARABULUT’a manevi desteklerinden dolayı teşekkür ederim. Şener Şenol …../…./….. iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET……………………………………………………………………………. i ABSTRACT…………………………………………………………………….. ii TEŞEKKÜR…………………………………………………………………….. iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ…………………………………………... vi ŞEKİLLER DİZİNİ……………………………………………………………... v ii ÇİZELGELER DİZİNİ………………………………………………………….. x ii 1. GİRİŞ………………………………………………………………………..... 1 2. KURAMSAL TEMELLER…………………………………………………... 3 2.1. Biyosensörler……………………………………………………………….. 3 2.2. Biyosensörlerin Kullanım Alanları…………………………………………. 5 2.2.1. Endüstriyel işlem kontrolü……………………………………………….. 5 2.2.2. Klinik analizler…………………………………………………………… 5 2.2.3. Yiyecek örnekleri analizleri……………………………………………… 6 2.2.4. Çevresel örnek analizleri…………………………………………………. 6 2.2.5. Savunma–güvenlik alanı………………………………………………..... 6 2.3. Biyosensör Çeşitleri………………………………………………………… 7 2.3.1. Biyolojik ajanın etki mekanizmasına göre biyosensörler………………… 7 2.3.1.1. Biyo – katalitik tanımlama ajanları ile biyosensörler…………………... 7 2.3.1.2. Biyo – afinite tanımlama ajanları ile biyosensörler…………………….. 7 2.3.2. Dönüştürücü sistemin çeşidine göre biyosensörler………………………. 7 2.3.2.1. Optik biyosensörler…………………………………………………….. 7 2.3.2.2. Kalorimetrik biyosensörler……………………………………………... 8 2.3.2.3. Piezoelektrik biyosensörler…………………………………………….. 8 2.3.2.4. Elektrokimyasal biyosensörler…………………………………………. 9 2.4. Enzimler……………………………………………………………………. 12 2.4.1. Enzimlerin yapısı………………………………………………………..... 13 2.4.2. Enzim reaksiyonlarının kinetik yönden incelenmesi……………………... 13 2.5. Enzim İmmobilizasyonu…………………………………………………..... 16 2.5.1. Enzim immobilizasyon yöntemleri……………………………………….. 17 2.5.1.1. Bağlama ile immobilizasyon yöntemleri……………………………….. 17 2.5.1.2. Çapraz bağlama ile immobilizasyon yöntemi………………………….. 19 2.5.1.3. Hapsetme ile immobilizasyon yöntemi………………………………… 19 2.6. Biyosensör Yapımında Yararlanılan Voltametrik Teknikler……………..... 21 2.6.1. Doğrusal taramalı voltametri tekniği……………………………………... 23 2.6.2. Çevrimsel voltametri tekniği……………………………………………... 24 2.6.3. Time–Base (akım–zaman) tekniği……………………………………....... 25 2.6.4. Puls teknikleri…………………………………………………………...... 26 2.6.4.1. Normal puls voltametrisi……………………………………………...... 27 2.6.4.2. Diferansiyel puls voltametrisi…………………………………………... 28 2.6.4.3. Kare dalga voltametrisi…………………………………………………. 29 2.7. Literatürde Oksalat Tayini İçin Yapılan Çalışmalar……………………….. 31 2.7.1. Biyosensörler ile yapılan çalışmalar……………………………………… 31 2.7.2. Diğer teknikler ile yapılan çalışmalar…………………………………….. 34 iv 3. MATERYAL ve YÖNTEM…………………………………………………. 37 3.1. Kullanılan Cihazlar…………………………………………………………. 37 3.2.Kullanılan Çözeltiler………………………………………………………... 37 3.3. Kullanılan Yöntemler……………………………………………………..... 40 4. BULGULAR…………………………………………………………………. 41 4.1. Voltametrik Çalışmalar…………………………………………………….. 41 4.1.1. H2O2 ile ilgili çalışmalar………………………………………………….. 42 4.1.1.1. H2O2 için PtE ile yapılan çalışmalar……………………………………. 43 4.1.1.2. H2O2 için GCE ile yapılan çalışmalar………………………………….. 47 4.1.2. Oksalik asit ile ilgili çalışmalar…………………………………………... 48 4.1.2.1. Oksalik asit için HDME ile yapılan çalışmalar………………………… 48 4.1.2.2. Oksalik asit için PtE ile yapılan çalışmalar…………………………….. 51 4.2. UV-VIS Spektrofotometrik Çalışmalar……………………………………. 71 4.3. Biyosensör Hazırlama Çalışmaları…………………………………………. 73 4.3.1. Elektrokimyasal polimerleşme ile biyosensör hazırlama çalışmaları……. 73 4.3.2. Çapraz bağlama ile biyosensör hazırlama çalışmaları……………………. 78 4.3.3. Polimer matriks altına hapsetme ile biyosensör hazırlama çalışmaları…... 83 4.3.4. Gerçek örnek ile oksalat tayini çalışması………………………………… 90 5. TARTIŞMA ve SONUÇ……………………………………………………. 96 KAYNAKLAR…………………………………………………………………. 100 ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………………………….. 106 v SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Kısaltmalar Açıklamalar FET Alan Etki Transistörü HMDE Askıda Civa Damla Elektrot BSA Bovin Serum Albumin BRT Britton–Robinson Tamponu GCE Camsı Karbon Elektrot CV Çevrimsel Voltametri DNA Deoksiribo Nükleik Asit DPV Diferansiyel Puls Voltametrisi LSV Doğrusal Taramalı Voltametri ENFET Enzim Modifiyeli Alan Etki Transistörü FT Fosfat Tamponu ISFET İyon Duyarlı Alan Etki Transistörü ISE İyon Seçici Elektrot SWV Kare Dalga Voltametrisi MOSFET Metal Oksit Alan Etki Transistörü NAD Nikotinamid Adenin Dinükleotit NPV Normal Puls Voltametrisi PtE Platin Elektrot Time–Base Sabit Potansiyelde Akımın Zamanla Değişimi SIRE Tanımlama Ajanını Direkt Enjeksiyonuna Dayanan Sensör vi ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Biyosensörün şematik görünümü……………………………………… 3 Şekil 2.2. Enzim aktivitesine pH’nin etkisi……………………………………..... 1 5 Şekil 2.3. Enzim aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisi…………………………….... 1 6 Şekil 2.4. İmmobilizasyon yöntemleri……………………………………………. 1 7 Şekil 2.5. IUPAC sistemine göre akım–potansiyel yönleri ve işaretleri………..... 22 Şekil 2.6. LSV’de potansiyel uygulama programı……………………………….. 23 Şekil 2.7. LSV eğrisi………..…………………………………………….............. 2 3 Şekil 2.8. CV’de potansiyel uygulama programı…………………………………. 2 4 Şekil 2.9. CV eğrisi………..…………………………………………………….... 2 5 Şekil 2.10. Time–Base eğrisi……………………………………………………... 2 6 Şekil 2.11. NPV’de uygulanan potansiyel programı……………………………... 2 7 Şekil 2.12. DPV’de potansiyel uygulama programı……………………………… 2 8 Şekil 2.13. DPV eğrisi……………………………………………………………. 2 9 Şekil 2.14. NPV eğrisi……………………………………………………………. 2 9 Şekil 2.15. SWV’de potansiyel uygulama programı……………………………... 3 0 Şekil 2.16. SWV’de ileri okuma, geri okuma ve ikisi arasındaki fark sonucu elde edilmiş akım–potansiyel eğrileri..……………..................................... 30 Şekil 4.1. 6 mM K3Fe(CN)6 içerisinde -200 ile +800 mV gerilim aralığında yapılan CV çalışması………………………………………………... 42 Şekil 4.2. PtE ile pH 3 BRT’de 1 mM H2O2’ye ait anodik bölgedeki LSV’ler…... 4 3 Şekil 4.3. PtE ile pH 10 BRT’de 1 mM H2O2’ye ait anodik bölgedeki LSV’ler…. 4 3 Şekil 4.4. PtE ile pH 4,5 FT’de 1 mM H2O2’ye ait anodik bölgedeki LSV’ler…... 4 4 Şekil 4.5. PtE ile pH 9,5 FT’de 1 mM H2O2’ye ait anodik bölgedeki LSV’ler…... 4 4 vii Şekil 4.6. 1 mM H2O2 içeren pH 3 BRT içerisinde PtE ile çözünmüş oksijen gideriminin LSV pikleri üzerine etkisi………………………………. 44 Şekil 4.7. PtE ile BRT içerisinde 1 mM H2O2’ye ait katodik bölgedeki LSV’ler... 45 Şekil 4.8. PtE ile FT içerisinde 1 mM H2O2’ye ait katodik bölgedeki LSV’ler….. 45 Şekil 4.9. pH 3 BRT içerisinde 1, 2, 3, 5 mM H2O2 için PtE ile elde edilen CV’ler .………………………………………………………………… 46 Şekil 4.10. GCE ile farklı pH’lerde H2O2 için elde edilen CV’ler……………….. 47 Şekil 4.11. pH 3 BRT içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen LSV’ler………………………………………………………... 49 Şekil 4.12 pH 6 BRT içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen LSV’ler………………………………………………………... 49 Şekil 4.13. pH 9 BRT içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen LSV’ler………………………………………………………... 49 Şekil 4.14. 0,2 M KNO3 içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen LSV’ler…………………………………………………... 50 Şekil 4.15. 0,2 M KNO3 içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen DPV’ler…………………………………………………... 51 Şekil 4.16. PtE ile pH 3 BRT içerisinde µM derişim düzeyindeki oksalik asite ait CV’ler……………………………………………………………....... 52 Şekil 4.17. PtE ile 50 µM oksalik asit içeren pH 3 BRT içerisinde farklı derişimdeki H2O2’ye ait CV’ler…………………………………….... 53 Şekil 4.18. PtE ile µM derişim düzeyindeki oksalik asit ve mM derişim düzeyindeki H2O2’ye ait Time–Base grafiği………………................ 54 Şekil 4.19. PtE ile pH 3 BRT içerisinde farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler……………………………………………………………....... 55 Şekil 4.20. PtE ile pH 3 BRT içerisinde oksalik asit ve H2O2’ye ait CV’ler……... 55 Şekil 4.21. PtE ile mM düzeydeki oksalik asit ve H2O2’ye ait Time–Base grafiği………………………………………………………………… 56 Şekil 4.22. PtE ile pH 6,5 BRT içerisinde farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler………………………………………………………………... 57 viii Şekil 4.23. PtE ile pH 7,6 BRT içerisinde farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler………………………………………………………………... 58 Şekil 4.24. PtE ile pH 8,2 BRT içerisinde farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler………………………………………………………………... 59 Şekil 4.25. PtE ile aynı derişime sahip farklı pH’lerdeki oksalik asit çözeltilerinden elde edilen CV’ler…………………………………… 59 Şekil 4.26. PtE ile pH 8,2 BRT + 10 mM oksalik asit içerisinde farklı derişimlerdeki H2O2’ye ait CV’ler…………………………………… 60 Şekil 4.27. PtE ile pH 8,2 BRT içerisinde farklı derişimde oksalik asit ve H2O2’ye ait CV’ler…………………………………………………… 61 Şekil 4.28. PtE ile pH 6 BRT’de farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler….. 63 Şekil 4.29. PtE ile pH 6 BRT’de farklı derişimlerdeki oksalik asit ve H2O2’ye ait CV’ler………………………………………………………………... 63 Şekil 4.30. PtE ile pH 6,5 BRT’de farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler………………………………………………………………... 64 Şekil 4.31. PtE ile pH 6,5 BRT’de farklı derişimlerdeki oksalik asit ve H2O2’ye ait CV’ler…………………………………………………………….. 65 Şekil 4.32. PtE ile pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit çözeltisi içerisinde H2O2 ve oksalik asite ait akım basamaklarını gösteren Time–Base grafiği………………………………………………………………… 66 Şekil 4.33. PtE ile pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit çözeltisi içerisinde µM derişim düzeylerindeki H2O2 için elde edilen akım basamaklarını gösteren Time–Base grafiği………………………………………….. 67 Şekil 4.34. PtE ile yapılan amplitude seçimini gösteren DPV eğrisi……………... 68 Şekil 4.35. PtE ile yapılan step seçimini gösteren DPV eğrisi…………………… 68 Şekil 4.36. PtE ile pH 6,5 BRT’de H2O2 için küçük derişim bölgesi kalibrasyon grafiği hazırlama çalışması…………………………………………... 69 Şekil 4.37. PtE ile pH 6,5 BRT’de H2O2 için büyük derişim bölgesi kalibrasyon grafiği hazırlama çalışması…………………………………………... 69 Şekil 4.38. PtE ile pH 6,5 BRT’de H2O2’ye ait 0,1–10,0 mM derişim aralığındaki kalibrasyon grafiği……………………………………… 70 ix Şekil 4.39. Farklı pH’lerdeki BRT içerisinde 0,1 mM oksalik asit çözeltilerine ait soğurum pikleri…………………………………………………… 71 Şekil 4.40. pH 4 BRT ve 196 nm’de oksalik asit için yapılan kalibrasyon grafiği hazırlama çalışması…………………………………………………... 72 Şekil 4.41. Oksalik asit için pH 4 BRT’de ve 196 nm’de 5–100 µM derişim aralığında hazırlanmış kalibrasyon grafiği…………………………… 73 Şekil 4.42. PtE yüzeyinde 1 µm kalınlıktaki polipirol kaplaması, büyütme oranı x100……………………………………………………………. 74 Şekil 4.43. PtE yüzeyinde 1 µm kalınlıktaki polipirol kaplaması, büyütme oranı x200……………………………………………………………. 74 Şekil 4.44. PtE yüzeyinde 1 µm kalınlıktaki polipirol kaplaması, büyütme oranı x500………………………………………………………………….. 74 Şekil 4.45. pH 6,5 BRT’de polipirol kaplı PtE yüzeyinde H2O2 eklemelerine ait Time–Base grafiği…………………………………………………..... 75 Şekil 4.46. pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit içerisinde polipirol kaplı PtE yüzeyinde H2O2 ve oksalik asit eklemelerine ait Time–Base grafiği………………………………………………………………… 76 Şekil 4.47. Elektrokimyasal polimerleşme ile hazırlanan sensörün oksalik asit ve H2O2’ye olan duyarlılığını gösteren Time–Base grafiği………….. 77 Şekil 4.48. Glutaraldehit ile çapraz bağlanarak hazırlanmış enzim sensörünün 25 µM, 50 µM ve 100 µM’lık oksalik aside karşı duyarlılığı……….. 78 Şekil 4.49. Kütlece % 2,5’lik glutaraldehit ile hazırlanmış enzimatik sensörün 50 µM’lık oksalik aside karşı duyarlılığının günden güne değişimi… 79 Şekil 4.50. Glutaraldehit ile hazırlanmış sensörle kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmasında 0,025 mM, 0,050 mM, 0,100 mM oksalik asit eklemelerine karşı elde edilen akım basamak büyüklükleri…………. 80 Şekil 4.51. Glutaraldehit ile hazırlanmış sensörle kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmasında 0,250 mM, 0,500 mM ve 1,000 mM oksalik asit eklemelerine karşı elde edilen akım basamak büyüklükleri…………. 80 Şekil 4.52. Kütlece % 2,5’lik glutaraldehit ile hazırlanmış sensöre ait 0,025–1,000 derişim bölgesindeki kalibrasyon grafiği……………..... 81 Şekil 4.53. Tamponlu ve tamponsuz çözeltiler kullanılarak 1 mM oksalik asite karşı elde edilen akım basamağı büyüklükleri……………………….. 82 x Şekil 4.54. Kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 0,025 mM, 0,050 mM ve 0,100 mM oksalik asite karşı gösterdiği duyarlılık……………………………………………………………... 84 Şekil 4.55. Kütlece % 1’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 0,025 mM, 0,050 mM ve 0,100 mM oksalik asite karşı gösterdiği duyarlılık……………………………………………………………... 84 Şekil 4.56. Kütlece % 3’lük nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 0,025 mM, 0,050 mM ve 0,100 mM oksalik aside karşı gösterdiği duyarlılık……………………………………………………………... 85 Şekil 4.57. Kütlece % 5’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 0,025 mM, 0,050 mM ve 0,100 mM oksalik asite karşı gösterdiği duyarlılık……....................................................................................... 85 Şekil 4.58. Nafyon film hazırlanmasında kullanılan nafyon çözeltisi derişiminin sensör duyarlılığına etkisi……………………………………………. 86 Şekil 4.59. Kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 50 µM’lık oksalik asite karşı duyarlılığının günden güne değişimi…….. 87 Şekil 4.60. Kütlece % 1’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 50 µM’lık oksalik asite karşı duyarlılığının günden güne değişimi……………... 87 Şekil 4.61. Kütlece % 0,5’lik nafyonlu sensör ile kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmasında 0,025 mM, 0,050 mM, 0,100 mM oksalik asit eklemelerine karşı elde edilen akım basamak büyüklükleri…………. 88 Şekil 4.62. Kütlece % 0,5’lik nafyonlu sensör ile kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmasında 0,250 mM, 0,500 mM, 1,000 mM oksalik eklemelerine karşı elde edilen akım basamak büyüklükleri………………………... 89 Şekil 4.63. Kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış sensöre ait 0,025–1,000 derişim bölgesindeki kalibrasyon grafiği…………………………….. 90 Şekil 4.64. Standart ekleme metodu kullanılarak yapılan gerçek örnek çalışmasına ait Time–Base grafiği………………………………….. 91 Şekil 4.65. pH 6,5 BRT’de 207 nm dalga boyunda farklı derişimlerdeki oksalik asite ait soğurum eğrileri……………………………………………... 93 Şekil 4.66. pH 6,5 BRT ve 207 nm’de oksalik asite ait kalibrasyon grafiği……... 94 Şekil 4.67. 207 nm’de örnek ve derişimi bilinen oksalik asite ait soğurum pikleri………………………………………………………………… 94 xi ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Biyosensörlerle tayin edilebilen maddeler………………………….. 44 Çizelge 4.1. Tampon çözelti derişiminin pH değişimi üzerine etkisi…………….. 61 Çizelge 4.2. pH 6,5 BRT’de yapılan kalibrasyon grafiği çalışmasında derişimlere karşı elde edilen akım değerleri………………………...................... 70 Çizelge 4.3. pH 4 BRT’de ve 196 nm’de farklı derişimlerdeki oksalik asite ait soğurum değerleri…………………………………………………... 72 Çizelge 4.4. 0,025–1,000 mM derişim aralığında glutaraldehit ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı oluşturduğu akım basamağı büyüklükleri………………………………………………………… 81 Çizelge 4.5. 0,025–1,000 mM derişim aralığında % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı oluşturduğu akım basamağı büyüklükleri…………………………………………………………. 8 9 Çizelge 4.6. Örnek ve derişimi belinen oksalik asit eklemelerine karşı elde edilen akım basamağı büyüklükleri………………………………… 92 Çizelge 4.7. 100 mL’lik örneğe ait hesaplanan derişim ve miktar değerleri……... 92 Çizelge 4.8. 0,1–0,75 mM derişim aralığında oksalik asite karşı elde edilen soğurum değerleri…………………………………………………... 93 Çizelge 4.9. Örnek ve derişimi bilinen oksalik asite ait soğurum değerleri……… 95 Çizelge 4.10. 100 mL’lik örneğe ait hesaplanan derişim ve miktar değerleri……. 956 xii 1. GİRİŞ Sanayileşmenin gün geçtikçe arttığı dünyamızda çevre kirliliği, tarımsal kirlilik, temiz ve güvenilir su ve yiyecek bulabilme sorunları gittikçe artmaktadır. Bundan dolayı bu analizlerin de sürekli arttığı ve önem kazandığı görülmektedir. Ayrıca artan hastalıklar klinik analizlerin artışına neden olmaktadır. Bu sebeplerden dolayı bu sektörlerde yapılan analizlerin güvenilir, fazla zaman tüketmeyen ve ucuz teknikler olmaları gerekmektedir. Günümüzde bu işlemler için yaygın olarak kullanılan analiz teknikleri güvenilir fakat fazla zaman harcayan ve genelde ucuz olmayan tekniklerdir. Bu yüzden hala gelişmekte olan biyosensörler bu analizlerin yapılmasında önem teşkil etmektedir. Bu biyosensörler birçok alanda başarılı şekilde uygulama alanı bulmuştur. Fazla zaman tüketmeyen ve ucuz bir teknik oluşunun yanı sıra analitik düzeydeki güvenilirliği ile kolaylıkla uygulanabilir bir teknik oluşu biyosensörlerin önemini daha da arttırmaktadır. Oksalat, klinik ve gıda analizlerinde önem teşkil etmektedir. Ispanak, mantar, pancar yaprağı, zencefil, horozibiği çiçeği, pazı otu gibi sebzelerde, çikolata gibi gıda maddelerinde ve bira gibi içeceklerde bulunan oksalat, fizyolojik öneme sahip bir maddedir. Ayrıca içme suyunun ozonlama ile dezenfeksiyonu sırasında ve vücuttaki protein yıkımı sonucu oluştuğu bildirilmektedir. Vücuda alınan fazla oksalat böbrek taşı 2+ 2+ oluşumu, Ca ve Mg emiliminde azalma gibi sorunlara yol açabilmektedir. Vücut sıvılarındaki oksalat miktarı ise böbrek ve karaciğer rahatsızlıklarının bir belirtisi olduğu için çabuk, etkili, düşük maliyetli ve yüksek analitik duyarlılığa sahip bir yöntem ile analizlenmesi önem taşımaktadır. Oksalat tayini için günümüzde; spektroskopik ve kromatografik tekniklerin yanı sıra, nispeten daha ucuz donanım ve analiz maliyeti ile yeterince duyarlı ve hızlı bir analiz tekniği olarak enzimatik biyosensörler de giderek daha çok kullanılmaktadır. Biyolojik sıvılarda ve gıda örneklerinde oksalat ve oksalik asit ölçümü için pek çok biyosensör hazırlama çalışması yapıldığı bilinmektedir. Oksalat oksidaz enzimi aracılığıyla parçalanan oksalik asitin oluşturacağı hidrojen peroksit (H2O2) ölçümüne dayalı bu biyosensörlerde, oksalik asitin girişim etkisi göz ardı edilmekte veya elektrot üzerinde bu girişimi engelleyici modifikasyonlar öngörülmektedir. Oksalik asitin 1 voltametrik davranışının ortam ve ölçüm koşullarına bağlılığının çok iyi bilinmiyor olması bu konudaki çalışmaları zorlaştırmakta ve belirsizleştirmektedir. Bu sebeple oksalat biyosensörü hazırlama çalışmalarında öncelikle oksalik asidin elektro aktif olduğu koşulların belirlenmesi ve bu sonuca göre enzim aktivitesini de göz önünde bulundurarak biyosensörün çalışma pH ve potansiyelinin seçilmesi en önemli basamağı oluşturmaktadır. Daha sonrasında ise çeşitli parametreler için optimizasyonlar yapılarak biyosensör için optimal koşullar belirlenmelidir. Bu tez çalışmasında; literatürde var olan çeşitli oksalat sensörleri hazırlama çalışmalarının eksik olduğu düşünülen kısımları göz önünde bulundurularak, bu eksik noktaları aydınlatmaya yönelik çalışmalar gerçekleştirildi ve literatürdeki çalışmalara farklı ölçüm ilkesine sahip bir enzimatik sensör kazandırılması amaçlandı. Bu sebeple, oksalik asit ve H2O2 için pH optimizasyon çalışmaları yapılıp enzimatik sensörler hazırlandı. Bu iki maddenin voltametrik olarak analizlenebilirliğini ve oksalik asitin spektrofotometrik analizinin de yapılabileceği hazırlanan kalibrasyon grafikleri ile gösterildi. Hazırlanan enzimatik oksalat sensörü ile gerçek örneklerde de oksalat tayini yapıldı ve elde edilen sonuç spektrofotometrik yöntemle kıyaslandı. 2 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1. Biyosensörler Biyosensörler, bir dönüştürücü sistem ve bu sisteme eşlik eden biyolojik algılama ajanından oluşan cihazlar olarak veya başka bir değişle, üzerlerinde immobilize halde bulunan bir veya birkaç biyolojik ajan vasıtasıyla analit maddenin ortamdaki miktarı ile orantılı olarak sinyal üreten, analitin kantitatif olarak analizlenebilmesini ve sürekli olarak izlenmesini sağlayabilen cihazlardır (Gerard 2002). Biyosensörleri sadece analiz yapan cihazlar olarak tanımlamak biyosensör tanımının kısıtlanmasına neden olmaktadır. İnsan ve diğer canlı vücutlarında bulunan işitme, görme, koku alma, dokunma, tat alma gibi sistemlerde biyosensör olarak ele alınmalıdır. Bir biyosensör, istenilen analiti kataliz eden veya istenilen analite afinite gösteren bir biyolojik ajanın bulunduğu biyo–algılayıcı tabaka, kataliz işleminden sonra oluşan yeni ürünleri ölçülebilir büyüklüklere dönüştürüp ölçümün yapılmasını sağlayan dönüştürücü (transduser) sistemlerden oluşmaktadır (Telefoncu 1999). Şekil 2.1. Biyosensörün şematik görünümü Biyosensör teknolojisi özellikle son on yıl içerisinde oldukça hız kazanmış, çok geniş uygulama alanı bulmuştur. Bu durum gerçekleşmesinde, biyosensörlerin analitik duyarlılığının en az diğer analiz teknikleri kadar iyi, zaman tüketmeyen ve düşük maliyetli bir teknik oluşu başı çekmektedir. Diğer avantajları ise aşağıdaki şekilde sıralanabilir. 3  İn-vivo çalışmalarına olanak sağlamaktadır (potansiyometrik olanlar).  Örnekler herhangi bir ön işleme tabi tutulmadan analizlenebilir.  Diğer analiz tekniklerine göre analiz süresi çok kısadır.  Potansiyometrik olan sensörler analitin yapısına zarar vermediğinden, örnekler analizden sonra tekrar kullanılabilir.  Çok küçük cihazlar olduklarından dolayı portatif olarak taşınabilirler, böylece örnekleri kendi doğal ortamlarında analizleme olanağı doğar.  Türlendirme çalışmalarına olanak sağlamaktadırlar. Biyosensörler ile birçok madde analiz edilebileceği gibi başlıca analiz edilebilenler Çizelge 2.1’de verilmiştir (Çınar 2006). Çizelge 2.1. Biyosensörlerle tayin edilebilen maddeler Alanin, arginin, asparagin, aspartik asit, sistin, glutamin, glutamik asit,histidin, Aminoasitler leusin, fenil alenin, sarkosin, v.b. Gazlar NH3, H2, CH4, SO2, NO Kofaktörler AMP, ATP, NAD (P) H, H2O2 Aminopirin, alinin, aromatik aminler, asetilkolin, kreatinin, kreatin, guanosin, Amitler ve Aminler penisilin, spermin, ürik asit, üre, zantin Asetik asit, formik asit, glukonik asit, izositrik asit, askorbik asit, laktik asit, Karboksilik Asitler malik asit, oksalik asit, purivik asit Kompleks Maddeler Antibiyotikler, kullanılır karbonhidratlar, vitaminler, mutajenler Asetaldehit, bilirubin, kolesterol ve esteri, etanol, gliserol ve esterleri, metanol Karbonhidratlar ve fenol Anorganik İyonlar F-, NO -2 , NO - -2 - -2 +2 +2 3 , PO3 , SO3 , SO4 , Hg , Zn 4 2.2. Biyosensörlerin Kullanım Alanları Biyosensörler birçok alanda kullanılmakla birlikte en yaygın olarak kullanıldığı alanlar şunlardır; 2.2.1. Endüstriyel işlem kontrolü Biyosensörler endüstri işlemlerinde, çeşitli maddeleri analizlemek için kullanılırlar. Genellikle şekerler, oksijen, karbondioksit, maltlar, alkoller, fenolik bileşiklerin analizinde kullanılmaktadır. Ayrıca kimyasal reaksiyonlar sonucu istenmeyen yan ürünlerin oluşup oluşmadığını takip etmek için de kullanılmaktadırlar. Böylece oluşturulan ürünlerin kalitesini ve verimini artırmakta, dolayısıyla hem ham maddeden hem de enerjiden tasarruf edilmesini sağlamaktadırlar (Eggins 2002). Santos ve ark. (2007) fenolik bileşiklerin analizi için, Jiang ve ark. (2009) etanol analizi için sensörler geliştirmişlerdir. 2.2.2. Klinik analizler Klinik analizler biyosensörlerin temel uygulama alanını oluşturmaktadır. Biyosensörler klinik analizlerde genellikle monitoring işlemlerinde uygulama alanı bulmuştur. Kandaki glukoz ve idrardaki üre tayini, kandaki gazlar, iyonlar ve metabolitler için biyosensörler sıkça kullanılmaktadır (Eggins 2002). Salimi ve ark. (2009) kolesterol tayini için, Yang ve ark. (2005) asetilkolin ve kolin tayini için, Romero ve ark. (2010) kanda laktat tayini için, Pizzariello ve ark. (2000) penisilin ve üre tayini için, Kim ve ark. (2006) glikoz tayini için biyosensörler geliştirmişlerdir. 5 2.2.3. Yiyecek örnekleri analizleri Biyosensörler yiyecek ürünlerinin genellikle kalite ve güvenlik açısından analizlerini yapmak üzere kullanılmaktadır. Süt örneklerinde; laktoz, glukoz, bira ve şarap örneklerinde; alkol, fermentasyon işlemi sırasında ise; etanol, glukoz, sukroz, galaktoz, laktoz, laktat tayini için kullanılır. Sarkar ve ark. (1999) peynir, bira, yoğurt gibi fermente olmuş yiyeceklerde yiyeceklerin bakteriyel kirliliğinin bir ölçütü olan L ve D–amino asitlerin tayini için biyosensör geliştirmişlerdir. Günümüzde birkaç ticari biyosensör çeşidi bulunmaktadır. Tek tek örneklerin analizlendiği laboratuvar cihazları veya taşınabilir tipte olanların yanı sıra otoanalizörlerde de kullanılabilmektedir. Bunlar, Apec Glikoz Analiz Sistemi, ESAT Glikoz Analiz Sistemi, Glucoprocesseur, Amperometrik Biyosensor Detektör, ISI Analiz Sistemi ve Oriental Tazelik Ölçer gibi ya oksijen elektrotu ya da hidrojenperoksit elektrotuna bağlanmış oksidaz sistemleri içeren benzer teknolojilere sahiptirler (Aykut ve Temiz 2006). 2.2.4. Çevresel örnek analizleri Biyosensörler çevresel ve tarımsal örnekler içerindeki kirletici maddelerin monitoring uygulamalarında ve örneklerdeki kirletici maddelerin konsantrasyon tayininde kullanılmaktadır. Bu amaçla kullanılmak üzere geliştirilmiş fenol ve türevleri, ağır metalleri ve fosforlu pestisitleri analizlemek üzere geliştirilmiş biyosensörler bulunmaktadır. Rodriguez ve ark. (2004) su ve katı örneklerde ağır metallerin takibi için, Arvinte ve ark. (2006) pestisit analizi için biyosensörler geliştirmişlerdir. 2.2.5. Savunma–güvenlik alanı Biyolojik saldırı amacıyla kullanılan maddeler biyolojik yapıdaki toksin, hasta yapıcı veya vücut dengesini bozucu maddeler olup son yılların savaş ve terörist saldırılarında sıklıkla kullanılmaktadır. Bu biyolojik maddelerin tanı ve teşhisinde biyosensörlerden yararlanılmaktadır. Bu amaçla özellikle organofosfor ve siyanür türevleri için 6 biyosensörler geliştirilmiştir. Keusgen ve ark. (2004) siyanür bileşiklerini analizlemek için, Mulchandani ve ark. (1999) organofosfor türevlerini analizlemek için biyosensörler geliştirmişlerdir. 2.3. Biyosensör Çeşitleri Biyosensörleri içerdikleri biyolojik ajanın etki mekanizmasına göre iki, dönüştürücü sistemine göre (transduser çeşidine göre) dört farklı grupta incelemek mümkündür (Thevenot ve ark. 2001) 2.3.1. Biyolojik ajanın etki mekanizmasına göre biyosensörler 2.3.1.1. Biyo–katalitik tanımlama ajanları ile biyosensörler Hazırlanacak biyosensörde kullanılacak biyolojik ajan eğer istenilen analite karşı katalitik etki gösteriyor ise biyosensör bu sınıf içerisinde yer almaktadır. Bu amaçla kullanılan biyolojik ajanlar; enzimler, mikroorganizmalar, hücre organelleri ve hayvan veya bitki dokularıdır (Thevenot ve ark. 2001). 2.3.1.2. Biyo–afinite tanımlama ajanları ile biyosensörler Bu biyosensörlerdeki ajanlar biyo–katalitik tanımlama ajanlarından farklı olarak istenilen analite karşı afinite özelliği gösteren ajanlardır. Antijen–antikor, reseptör ve DNA biyosensörleri bu sınıf içerisinde yer almaktadır (Thevenot ve ark. 2001). 2.3.2. Dönüştürücü sistemin çeşidine göre biyosensörler 2.3.2.1. Optik biyosensörler Optik biyosensörler dönüştürücü sistem olarak ışınım ölçümüne dayalı yapısında immobilize biyolojik ajan bulunduran aygıttır. Ölçümü yapılan ışık sinyali ışık yansıması, saçılımı ya da yayımı sonucu oluşmakta, yani bu tip biyosensörler 7 absorbsiyon, fluoresans, biolüminesans ölçümü yaparak istenilen analitin analizini yapmaktadır. Bu biyosensörlerde ışık yansıması, yayılımı ya da saçılımı sonucu oluşan sinyaller fiber optik kablolarla uygun dedektörlere iletilerek ölçülür. Bu biyosensörler ile üre, penisilin, etanol, kreatin, laktat vb. tayinler yapılabilmektedir (Telefoncu 1999). 2.3.2.2. Kalorimetrik biyosensörler Kalorimetrik biyosensörler bir biyolojik ajanın reaksiyonunda entalpi ölçümüne dayalı olarak istenilen analitin analizini yapan cihazlardır. Bu biyosensörlerrin yapımında en çok kullanılan biyolojik ajan enzimlerdir. Enzimlerin katalitik reaksiyonu sonucu oluşan ısı değişiminden reaksiyona ait entalpi değeri ve analit miktarı belirlenir (Telefoncu 1999). Bu tip biyosensörler portatif olarak bulunabilmektedir. Uygulanması gayet kolay bir tekniktir ve eğer reaksiyonun bittiğini gösteren bir renk değiştiricisi kullanıldıysa tayin çıplak gözle bile yapılabilmektedir (Lee ve ark. 2006). 2.3.2.3. Piezoelektrik biyosensörler Piezoelektrik etki, bir dielektrik özellikteki kristal üzerine etki uygulandığında moleküldeki karşıt yük merkezlerinin birbirinden ayrılması, moleküle dipol özellik kazandırması ile ortaya çıkan etkidir. Piezoelektrik özellikler molekülün kristal yapısına bakarak öngörülebilir (Bunde ve ark. 1998). Piezoelektrik özellikteki bir kristal üzerine immobilize edilen biyomolekül ile analitin reaksiyonu sonucu piezoelektrik kristalin rezonans frekansındaki değişiklikten analit miktarı tayin edilmektedir (Telefoncu 1999). İnsan vücudundaki alyuvar, herpes virüsü, ürede protein analizleri için piezoelektrik immunosensörler mevcuttur (Wang 1995). Ayrıca çevre örneklerinde bakteriyel kirliliği tayin etmek amacıyla da piezoelektrik sensörler geliştirilmiştir (Tombelli ve ark. 2000). 8 2.3.2.4. Elektrokimyasal biyosensörler Elektrokimyasal biyosensörler adında anlaşılacağı gibi biyosensörün analit derişimine bağlı olarak oluşturduğu sinyallerin elektrik sinyalleri olarak okunduğu biyosensörlerdir. Elektrokimyasal biyosensörler de kendi aralarında; amperometrik biyosensörler, potansiyometrik biyosensörler ve yarı iletken alan etki biyosensörleri olmak üzere üç grupta incelenmektedir. Elektrokimyasal biyosensörler, biyosensör sınıfı içerisinde, elektrokimyasal enzimatik biyosensörler de elektrokimyasal biyosensörler sınıfı içerisinde en büyük bölümü oluşturmakta ve genellikle bu tip biyosensörlerden elektrokimyasal enzimatik biyosensörler olarak bahsedilmektedir. Elektrokimyasal biyosensörleri üç alt başlıkta incelemek mümkündür. a-) Amperometrik biyosensörler Amperometrik sistemler, sıvı veya gaz formundaki elektro aktif maddelerin sabit potansiyel altında geçirdikleri akımı ölçmeye dayalı üç elektrotlu sistemlerdir. Uygulanan gerilim, çözeltideki elektrokimyasal dengenin indirgenmeden yükseltgenmeye veya yükseltgenmeden indirgenmeye doğru bozulmasına neden olur. Bu durumda elektrot çözelti ara yüzeyindeki yük transferi elektriksel akım olarak gözlenir. Bu akım piklerinden yararlanılarak elektro aktif maddeye ait indirgenme ve yükseltgenme potansiyelleri ve elektro aktif maddenin derişimi belirlenebilmektedir (Wang ve ark. 2008). Amperometrik biyosensörler bir immobilize tabaka, dönüştürücü sistem (çalışma elektrodu) ve ölçüm sistemi olmak üzere üç parçadan oluşmaktadır. Bu sensörlerin çalışma prensibi şu şekildedir; çözelti ortamında öncelikle analit ile immobilize biyomolekül arasındaki reaksiyon sonucu indirgenebilen veya yükseltgenebilen (redoks) bir ürün oluşur. Oluşan ürün elektrot yüzeyi üzerinde indirgenip yükseltgenerek elektrik sinyalleri oluşturur. Sinyaller ölçüm sistemi tarafından ölçülür. 9 Prodromidis ve Karayannis’e (2002) göre amperometrik biyosensörlerin immobilize enzim tabakasında ve dönüştürücü sisteminde şu reaksiyonlar gerçekleşmektedir; Enzim Analit + O2(gaz) m Ürün + H2O (2.1) Enzim Analit + O2(gaz) m Ürün + H2O2(suda) (2.2) Enzim + + Analit + NAD m Ürün + NADH + H (2.3) -0.6 V (vs. Ag/AgCl) - - O2(gaz) + 2 H2O + 4 e 4 OH (2.4) 0.65 V (vs. Ag/AgCl) + - H2O2(suda) O2(gaz) + 2 H + 2 e (2.5) -e- -H+ -e- + NADH NADH+ NAD NAD (2.6) +H+ +e- Amperometrik biyosensörlerde en yaygın olarak platin, altın, gümüş, bakır, camsı karbon elektrotları dönüştürücü sistem olarak kullanılırlar (Zhang ve ark. 2000). Amperometrik biyosensörler yüksek duyarlılık ve seçiciliği, düşük maliyeti, güvenilirliği ve kolay uygulanabilir oluşu ile klinik, çevre ve gıda analizlerinde oldukça sık kullanılmaktadır (Gülce 2002a). Gülce ve ark. (2002b) alkol tayini için, Kafi ve Chen (2009) nitrofenol tayini için, Wang ve ark. (2000) H2O2 tayini için, Zhu ve ark. (2002) glikoz tayini için amperometrik biyosensörler geliştirmişlerdir. b-) Potansiyometrik biyosensörler Potansiyometri, akımsız koşullarda bir çalışma ve referans elektrot arasındaki potansiyel farkının ölçümünü esas alır. Elektrot potansiyelinin belirlenmesi doğrudan analit derişimini tanımlar. Potansiyometrik biyosensörlerde kullanılan temel sensörler, pH ya da tek değerlikli iyonlara duyarlı olan cam elektrotlar, anyon ya da katyonlara 10 duyarlı olan iyon seçimli elektrotlar (ISE) ve karbondioksit ya da amonyağa yönelik gaz duyarlı elektrotlardır (Türkdemir 2008). Potansiyometrik bir biyosensörün çalışma mekanizması şu şekildedir; analizlenecek analit öncelikle seçici geçirgen membrandan geçerek enzim immobilize tabakaya gelir ve burada ölçülebilen bir türe dönüşür, ölçülebilen tür diğer bir seçici geçirgen membrandan geçerek iç çözeltiye ulaşır, iç çözeltide bulunan iki elektrotlu ölçüm sistemi; bir referans elektrot bir tane de çalışma elektrotundan oluşmaktadır. Referans elektrot çok bilinen Ag/AgCl, kalomel elektrot veya iç çözeltisi jel olan Ag/AgCl referans elektrotlardan olabilmektedir. - - - Çalışma elektrotu ise ölçülecek maddeye göre pH duyarlı, iyon duyarlı (ISE; F ,I , CN , + + +2 + Na , K , Ca , NH4 gibi iyonlara duyarlı) veya CO2, NH3 gibi gaz moleküllerine duyarlı olabilmekte ve bu elektrotlar ticari olarak bulunabilmektedirler (Koncki 2007). İç çözeltiye geçen ölçülebilen tür uygun çalışma elektrotu kullanıldığında iki elektrotlu hücre içinde bir potansiyel fark oluşturur. En yaygın olarak kullanılan potansiyometrik biyosensörler; üre sensörü, laktat sensörü, kreatinin sensörü ve glukoz sensörüdür (Shin ve ark. 1998). Ercole ve ark. (2003) yiyeceklerde E.coli tayini için, Reddy ve ark. (2001) trigliserit tayini için, Santini ve ark. (2008) çeşitli yiyecek örneklerindeki sakarin miktarını tayin etmek için potansiyometrik sensörler geliştirmişlerdir. c-) Yarı iletken alan etki biyosensörleri Alan etki transistörler (FET; field effect transistor) birçok elektronik devrede kullanılan devredeki akım akışını kontrol eden bir katı-hal yarı iletken devre elemanıdır. Elektrot malzemesi olarak kullanılmaya başlandıktan sonra metal oksit alan etki transistörler (MOSFET) ve iyon seçici alan etki transistörler (ISFET) geliştirilmiştir. MOSFET bir FET tabanlı üzeri birbirine çok yakın metal oksit tabakaları ile kaplı elektrottur. ISFET 11 de yine FET tabanlı üzeri yarı iletken tabaka ile kaplı iyon seçici bir elektrottur (Skoog ve ark 1996). Bu elektrotların yüzeyleri üzerine enzim immobilize edilmesiyle ENFET’ler geliştirilmiştir (Wan ve ark. 2000). Benzer şekilde bu elektrotların yüzeylerine istenilen analite duyarlı bir biyomolekül immobilize edilerek yarı iletken alan etki biyosensörleri hazırlanmıştır. Kharitonov ve ark. (2001) laktat tayini için ENFET, Gonçalves ve ark. (2008) DNA ve protein analizleri için ISFET sensörleri geliştirmişlerdir. 2.4. Enzimler Enzimler biyolojik sistemlerdeki canlı organizmalar tarafından sentezlenen ve yine organizmalardaki canlı hücrelerde gerçekleşen kimyasal reaksiyonları katalizleyen (hızını arttıran) biyolojik aktiviteye sahip moleküllerdir. İnsanlar farkında olmadan binlerce yıldır enzimlerden faydalanmışlardır. Örnek vermek gerekirse; bira yapımı, şarap yapımı, sirke oluşumu, ekmek yapımı, peynir yapımı gibi işlemler hep enzimler vasıtasıyla oluşan ürünlerdir. Fakat enzimlerle ilgili yapılan ilk bilimsel çalışmalar sadece geçtiğimiz birkaç yüzyıl önce yapılmıştır. “1783 yılında; Spallanzani’nin atmaca mide suyunun eti eritebildiğini bulması, 1811 yılında; Kirchoff’un buğday nişastasını zamanla dekstrin ve şekere dönüştüğünü belirlemesi, 1830 yılında; Robiquet, Boutron ve Chalan’ nın amigdalinin acı badem tarafından hidrolizlenebildiğini keşfetmesi enzimoloji konusundaki ilk çalışmalar olarak gösterilebilir” (Telefoncu 1997). Enzim terimi ilk defa 1878 yılında W. Künhe tarafından kullanılmış olup maya anlamına gelmektedir. Enzimler ile ilgili çalışmalar 1900’lü yıllardan sonra hız kazanmıştır. İlk enzim izole edilmesi çalışması 1920’li yıllarda yapılmış ve üreaz izole edilmiştir. İlk enzim yapısı 12 aydınlatma çalışmaları ise 1963 yılında yapılmıştır. Günümüzde, hala enzimler ile ilgili tüm ayrıntılar bilinmemektedir. Ancak bu kapsamda yapılan çalışmalar tüm hızı ile devam etmektedir (Telefoncu 1997). 2.4.1. Enzimlerin yapısı Enzimler genel olarak protein yapısında biyolojik aktiviteye sahip moleküllerdir. Enzim proteinleri çok özgül (spesifik) proteinlerdir. Enzim proteinlerinin özgül oluşundan dolayı, enzimler sadece belirli maddeler (substratlar) arasındaki kimyasal reaksiyonları kataliz ederler. Enzimlerin bir kısmı basit protein yapısındadır. Bazı enzimler ise enzimin protein kısmına protein olmayan daha küçük molekül büyüklüğüne sahip organik veya anorganik moleküller bağlanarak proteid yapısında bulunurlar. Bu durumda, enzimin protein olan kısmına apoenzim protein olmayan organik veya anorganik bir molekül olan diğer kısmına ise kofaktör adı verilir. Eğer organik molekül enzim kısmı ile iyi birleşmişse ve kolay kolay protein kısmından ayrılmıyorsa prostetik grup, çok iyi birleşmemiş ve kolay ayrılabiliyorsa koenzim adını alır. Sağlığımız için düzenli olarak vücudumuza almamız gerek vitaminlerde koenzim olarak görev alan bileşiklerdir (İnal 1996). Koenzimi ile birlikte bulunan apoenzim–koenzim çiftine haloenzim denir. Haloenzimin sadece protein kısmı değil kofaktörü ile birlikte katalitik etki gösterir. Protein yapıları farklı olup da aynı kimyasal reaksiyon üzerinde katalitik etki gösteren enzimlere ise izoenzim denmektedir. 2.4.2. Enzim reaksiyonlarının kinetik yönden incelenmesi Enzimler de reaksiyon kinetiği bakımından kimyasal katalizatörlere benzemektedirler. Enzimler söz konusu kimyasal reaksiyona ait aktivasyon enerjisinin bir kısmını karşılayarak reaksiyon hızını arttıran moleküllerdir. 13 Örnek vermek gerekirse, H2O2 yavaş bir reaksiyon ile su ve oksijene parçalanmaktadır ve 1 mol H2O2’nin parçalanması için 18 kcal/mol enerjiye gereksinim vardır. Bu +2 reaksiyonda katalizör olarak Fe kullanıldığında aynı reaksiyona 13 kcal/mol enerji gerekmektedir. Katalizör olarak platin kullanıldığında 11,7 kcal/mol enerji gerekirken, aynı reaksiyonda bir karaciğer enzimi olan katalaz kullanıldığında ise 2 kcal/mol enerji yeterli olmaktadır (Özata ve Kutlu 2000). Enzim reaksiyonlarında öncelikle substrat ile enzim arasında bir ara bileşik (kompleks) oluşmaktadır. Enzim ile substrat birleşmesinden sonra substrat molekülünde bazı kimyasal değişiklikler (bağ kopması gibi vs.) olur ve böylece substrat molekülü kimyasal reaksiyona hazır hale gelir. Ara bileşiğin oluşma hızı enzim ve substrat moleküllerinin derişimine bağlıdır. Daha sonra reaksiyon gerçekleşerek ürün oluşur (Atasağungil 1965). Bu reaksiyona ait reaksiyon denklemi şu şekildedir; k1 k3 E + S ES E + P (2.7) k2 k4 Burada E; enzimi, S; substratı, ES; enzim – substrat ara bileşiğini, P; ürünü, k1–k2–k3– k4; ilgili reaksiyonlara ait hız sabitlerini ifade etmektedir. Enzim reaksiyonlarına ait hız ifadesi Michaelis–Menten eşitliği ile ifade edilir (Telefoncu 1997). V V = max . S (Michaelis–Menten eşitliği) (2.8) Km + S Eşitlik 9.’daki Km değeri Michaelis–Menten sabiti olarak bilinmektedir. Km bir enzimin substratına olan ilgisini göstermektedir. Eğer enzimin substrata olan ilgisi fazla ise Km değeri küçüktür, bunun anlamı; düşük substrat derişimlerinde bile enzim ile substrat [ES] ara kompleksini oluşturmasıdır. Enzimin substratına ilgisi zayıf ise Km büyüktür. Michaelis–Menten eşitliğinden faydalanarak bir enzimatik reaksiyona ait hızı belirlemek için; Michaelis–Menten eşitliği ters çevrilir ve uygun biçimde düzenlenirse; 14 1 K = m 1 1 . + (2.9) V Vmax S Vmax elde edilir. 1/V’ye karşı 1/[S] değerleri grafiğe geçirildiğinde elde edilen doğrunun y = mx + b şeklinde bir doğru denklemi oluşturduğu görülmektedir. Buradan hareketle, doğru denklemine ait b değerinden Vmax, doğrunun eğiminden yararlanarak ise Km değerleri bulunabilir. Gerçekleşen bu reaksiyonun hızına bağlı olarak enzim aktivitesi kavramı oluşmaktadır. 0 Bu kavram enzim ünitesi ile tanımlanmaktadır. 1 ünite enzim; 25 C’de, 1 µmol substratı, 1dk’da ürüne çeviren enzim miktarı olarak tanımlanmaktadır. Enzim aktivitesi değişen bazı ortam koşullarına göre değişmektedir. Enzim aktivitesini etkileyen en önemli etmenler ortam pH’si ve sıcaklığıdır. Enzim aktivitesi pH’ye duyarlı olarak değişmektedir. Enzimlerin aktiviteleri pH ile normal dağılım göstermektedir. Enzimler belli bir pH değerinde maksimum aktivite gösterirlerken bu pH değerinden uzaklaşılınca aktiviteleri kaybolmaktadır. Enzimlerle yapılan çalışmalarda, enzimin aktivitesinin yüksek olduğu pH çalışma bölgesinde çalışılmalı ve enzim aktivitesini sabit bir değerde tutabilmek için tampon Şekil 2.2. Enzim aktivitesine pH’nin etkisi sistemler kullanılarak pH değeri sürekli sabit tutulmalıdır. 15 Enzimatik reaksiyonların hızı sıcaklık ile belli bir sıcaklığa kadar artmaktadır. Ortamın sıcaklığı artınca ortamdaki moleküllerin kinetik enerjileri artmakta, böylece reaksiyona giren moleküllerin arasındaki çarpışma hızı ve buna bağlı olarak da aktivasyon enerjisini aşabilecek çarpışmaların sayısı artmaktadır. Belli bir sıcaklık değerine gelindiğinde enzimatik reaksiyon maksimum aktivite değerine ulaşır. Sıcaklığın biraz daha artması sonucunda ise reaksiyon ortamındaki enzim molekülleri protein yapısında olduklarından dolayı yapısal bozukluklara Şekil 2.3. Enzim aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisi uğrarlar. 2.5. Enzim İmmobilizasyonu Günümüzde, enzimler substratına karşı çok yüksek seçiciliğe sahip olduğu, sulu çözeltilerde kolaylıkla çözülebildiği ve tekrar tekrar aynı reaksiyonlarda kullanılabildiği için kimya ve biyoteknoloji alanlarında çok yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, enzimler bu üstün özelliklerinin yanında kullanım açısından dezavantaj yaratan bazı özelliklere de sahiplerdir (Telefoncu 1997). Endüstride kapalı ve sürekli sistemlerde gerçekleştirilen reaksiyon ortamlarında enzimatik reaksiyonların kontrolü oldukça güçtür. Ayrıca reaksiyonda kullanılan enzimlerin istenilen anda aktivitelerinde bir kayıp olmadan geri kazanımı da söz konusu değildir. Enzimlerin reaksiyon ortamından geri kazanımının yapılamaması her defasında yeni enzim kullanımını gerektirir, enzim izolasyon ve saflaştırma işlemleri de çok maliyetli işlemlerdir. Bu nedenle, enzimlerin hem kullanım maliyetini düşürmek hem de daha kullanışlı hale getirmek için immobilize (tutuklanmış) enzim tekniği geliştirilmiştir (Sheldon 2007). 16 Geliştirilen bu teknik ile sulu ortamda çözünebilen ve serbest halde bulunan enzim molekülleri, katı bir yüzeyde tutuklanarak veya hapsedilerek, sulu çözeltide çözünemez ve serbest halde bulunamaz duruma getirildi. Böylece hem enzimatik reaksiyonlar kontrollü duruma hem de enzim geri kazanımı yapılarak enzimler tekrar kullanılabilir hale getirildi (Telefoncu 1997). 2.5.1. Enzim immobilizasyon yöntemleri Literatürde çok fazla ve farklı immobilizasyon çalışmaları olmakla birlikte, bu çalışmaları genel olarak üç ana başlık altında incelemek mümkündür. Şekil 2.4 immobilizasyon yöntemlerini göstermektedir. Şekil 2.4. İmmobilizasyon yöntemleri 2.5.1.1. Bağlama ile immobilizasyon yöntemleri Bu bağlama yönteminde enzim suda çözünmeyen katı bir yüzey üzerine bağlanmaktadır. Bu yüzey yapay, sentetik, organik veya anorganik özelliklere sahip bir yüzeydir. Enzim molekülleri protein yapısında amino asit zincirlerindeki aktif uçlar vasıtasıyla yüzey ile kolaylıkla kovalent veya iyonik bağ ve moleküller arası etkileşim oluşturabilir. Yüzey seçilirken; hidrofilik karakter, suda çözünmeme, gözenekli olma, partikül büyüklüğü gibi bazı özelliklere dikkat edilmelidir. En yaygın olarak kullanılan 17 yüzeyler; selüloz, cam, silikajel, aktif karbon, iyon değiştirici reçineler, metal ve metal oksitler, kitin ve kitozan, poliakrilamit, naylon’dur (Telefoncu 1997). a-) Kovalent bağlanma ile immobilizasyon Bu immobilizasyon yönteminde enzim kovalent bağlar oluşturabilen yüzeylere doğrudan veya yüzey modifiye edilerek kovalent bağlarla bağlanarak immobilize edilir. Bu yöntemde enzimlerin yüzeyden kopması zordur, bu nedenle yapı sağlamdır. Difüzyon problemi en az olan yöntemdir. Kovalent bağlanmanın en önemli dezavantajı enzimin yüzeye aktif uçlarından bağlanarak aktivite kaybı oluşmasıdır (Söylemez ve Fadıloğlu 1996). b-) İyonik bağlanma ile immobilizasyon “Bu yöntemde kullanılan taşıyıcı sistemi iyon değiştirme yeteneğine sahip, suda çözünmeyen bir taşıyıcı olmalıdır. İyonik bağlanma çok yumuşak koşullarda gerçekleştiğinden enzimin konformasyonunda ve aktif merkezde değişikliğe neden olmaz. Ancak enzim ile taşıyıcı arasındaki bağ kovalent bağ kadar güçlü olmadığından enzim kaçışı söz konusu olabilmektedir” (Telefoncu 1997). c-) Adsorbsiyon ile immobilizasyon Bu bağlama türü, en basit immobilizasyon yöntemleridir. Buradaki adsorpsiyonu sağlayan kuvvetler elektrostatik kuvvetler, hidrojen bağları, Wan der Waals kuvvetleridir. Adsorpsiyon çok zayıf elektrostatik etkileşmeler ile oluştuğundan enzimin desorpsiyonu kolaydır. Enzim denatürasyonu (yapısının zarar görmesi) azdır. Fakat enzim desorbsiyonu; pH, çözücü türü, sıcaklık gibi parametrelere fazlasıyla bağımlıdır. Bu parametrelerin birinin değişimi bile enzimi kolaylıkla desorbe olabilmektedir (Teles ve Fonseca 2008). 18 2.5.1.2. Çapraz bağlama ile immobilizasyon yöntemi Çapraz bağlama diğer immobilizasyon tekniklerine göre daha yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu yöntemde biyomolekül az miktarda çapraz bağlayıcı ile karıştırılarak immobilize edilmektedir. Difüzyon kontrollü olan bir yöntemdir. Enzim denatürasyonu diğer tekniklere göre oldukça düşüktür ve kullanım ömrünü uzatmaktadır. Ancak çapraz bağlama sırasında enzim aktif uçlarıyla çapraz bağlanmışsa aktivitede kayıplar olabilmektedir (Sheldon 2007). “En çok kullanılan çapraz bağlama reaktifleri, glutaraldehit, kloroformat ve karbonildiimidazol, heterosiklik halojenürler, bioksiranlar, divinil sülfonlar, p–benzokinon, transizyon metal iyonları ve epiklorhidrinlerdir” (Telefoncu 1997). 2.5.1.3. Hapsetme ile immobilizasyon yöntemleri Hapsetme enzim molekülünü belli bir alanda tutmaya zorlamaktır. Bu yöntemi bağlanma yöntemlerinden ayıran en önemli fark enzimin herhangi bir taşıyıcıya bağlı olmayışıdır. Bu yöntemde enzim polimer bir matriks içerisinde, jel bir matriks içerisinde veya bir yarı geçirgen membran içerisinde hapsedilebilir. Bu yöntemin en büyük dezavantajı enzimatik reaksiyonun difüzyon tarafından kısıtlanmasıdır. a-) Membran içine hapsederek immobilizasyon Bu immobilizasyon yönteminde enzim yarı geçirgen bir membran içerisine hapsedilerek immobilize edilir. Fazla miktarda enzim kullanılmaktadır ve enzim denatürasyonu azdır. Bu yüzden enzim aktivitesinde neredeyse hiç kayıp olmamaktadır. Enzim yarı geçirgen bir membran içerisine hapsedildiğinden gerçekleşecek enzimatik reaksiyon difüzyona bağlı kalmaktadır. Difüzyon hızı membran gözeneklerinin çapına ve substrat moleküllerinin molekül büyüklüğüne bağlı olarak değişmektedir (Söylemez ve Fadıloğlu 1996). 19 En yaygın olarak kullanılan membranlar selüloz asetat membranlar, sol–jel türevi kompozit membranlar ve poliüretan membranlardır. b-) Polimer matriks içerisinde hapsederek immobilizasyon Polimerik membranlar enzim immobilizasyonu için yaygın olarak kullanılan matrikslerdir. Çeşitli polimerik filmler biyosensör yapımında kullanılmaktadır. Bu polimerler iletken veya iletken olmayan polimerler olabilmektedirler. İmmobilizasyonda kullanılan polimerik filmler hem başlatıcı madde kullanılarak polimerleşme, hem de elektrokimyasal polimerleşme ile hazırlanabilmektedir (Prodromidis ve Karayannis 2002). Başlatıcı kullanılarak yapılan polimerleşmede en çok kullanılan polimer ı N-N –metilenbisakrilamit ile çapraz bağlanmış poliakrilamittir. Bu yöntemde polimer zincirlerinin çapraz bağ yüzdesi çok iyi ayarlanmalıdır. Çapraz bağ yüzdesinin çok fazla oluşu hem substratın enzim molekülüne erişimini kısıtlamakta hem de enzimin zincir yapısını zorlayıp aktivite kaybına neden olabilmektedir. Bu olumsuzluğa rağmen, bu tekniğin en büyük avantajı enzimin rastgele yönlenmediği bir teknik oluşudur. Bu yüzden enzim molekülünde konformasyonel değişimler yüzünden herhangi bir aktivite kaybı olmaz (Teles ve Fonseca 2008). Elektrokimyasal polimerleşme ise, elektrokimyasal olarak polimerleşebilen bir monomer ile enzim içeren sulu çözeltiye daldırılmış çalışma elektrotuna uygun potansiyel uygulanarak gerçekleştirilir. Elektrokimyasal olarak enzim hapsedilmiş polimerik filmler, hapsedilen biyomolekülün aktivitesini etkileyen kimyasal reaksiyonlar olmadan, kolay ve hızlı olarak tek basamaklı bir prosedürle üretilir. Ayrıca bu metot polimer tabakasının kalınlığını kontrol etmeyi olanaklı kılar. Film tabakasının kalınlığı elektrokimyasal polimerleşme işlemi süresince devreden geçen yük miktarı hesaplanarak kontrol edilebilir. Bu yöntemin önemli avantajlarından bir tanesi polimerleşme işlemini çok küçük bir yüzeyde kontrollü biçimde yapabilmesidir. Bu yöntemle hazırlanmış polimer filmlerin çoğu poliasetilen, polianilin, polipirol gibi iletken polimerlerdir. İletken olmalarından dolayı polimer filmler farklı kalınlıklarda 20 olabilmektedir, iletken olmayanların aksine filmler ince olmak zorunda değildirler (Teles ve Fonseca 2008). 2.6. Biyosensör Yapımında Yararlanılan Voltametrik Teknikler Voltametri üç elektrolu hücreler kullanılarak istenilen türlerin nitel ve nicel analizini yapmaya yarayan elektrokimyasal bir tekniktir. Ayrıca elektrot yüzeylerini modifiye etme, biyosensör hazırlama gibi çalışmalarda da voltametrik tekniklerden yararlanılır. Voltametri diğer analiz tekniklerine göre oldukça hızlı bir tekniktir ve çok yüksek analitik duyarlılığa sahiptir. Voltametrik teknikler ile çalışma elektrotlarının potansiyel sınır değerleri içerisinde elektro aktif olan tüm bileşikler analizlenebildiği gibi türlendirme çalışmalarına da çok yatkın bir tekniktir. Son yıllarda özellikle biyosensör teknolojisinin ivmeli bir şekilde gelişmesi nedeniyle voltametrik tekniklerin kullanımının da önemli derecede artış gösterdiği düşünülmektedir. Voltametrik çalışmalar; çalışma elektrotu, referans elektrot ve yardımcı elektrot olmak üzere üç elektrotlu hücre içerisinde ve düzenli bir şekilde değiştirilen potansiyel tarama işlemi ile yapılır. Üç elektrotlu hücrede çalışma elektrotunun potansiyel kontrolü için potansiyostat adı verilen cihazdan yararlanılır. Çalışma elektrotunun potansiyelinin bir temel karşılaştırma elektrotuna (referans elektrot) istenilen değere ulaşması için çalışma elektrotu üzerinden, yardımcı bir elektrot aracılığıyla gerektiği kadar akım geçirilir, geçirilen bu akım büyüklüğü, çalışma elektrotunun potansiyeline karşı grafiğe geçirilerek voltamogram denilen akım–potansiyel eğrisi elde edilir. Bu eğri yardımıyla, hem istenilen türün indirgenme veya yükseltgenme potansiyeli belirlenirken hem de oluşan pikin büyüklüğü (pik akımı) vasıtasıyla o türün kantitatif analizi yapılabilmektedir. Şekil 2.5 IUPAC tarafından benimsenmiş akım–potansiyel gösterim yönleri ve kabul edilen işaretlerini göstermektedir. 21 Şekil 2.5. IUPAC sistemine göre akım–potansiyel yönleri ve işaretleri Voltametrik çalışmalarda genellikle çalışma elektrotu olarak platin, altın, camsı karbon, grafit, bor içeren elmas, askıda civa damla elektrot gibi çalışılan ortama inert davranan elektrotlar, referans elektrot olarak ise Ag/AgCl, kalomel elektrotlar gibi temel karşılaştırma elektrotları kullanılmaktadır. HF gibi cam elektrot gövdelerinin zarar görebileceği koşullar için plastik gövdelerle hazırlanmış, ölçüm ortamı bileşiminden etkilenmemesi için sulu elektrolit yerine elektrolitik jel içeren gibi özel amaçlı referans elektrotlar da hazırlanabilmektedir (Şenol ve ark. 2009). Biyosensör hazırlanması çalışmalarında, çevrimsel voltametri (CV), doğrusal taramalı voltametri (LSV), sabit potansiyelde akımın zamanla değişimi (Time–Base) ve puls teknikleri yaygın olarak kullanılan voltametrik teknikleridir. 22 2.6.1. Doğrusal taramalı voltametri tekniği Doğrusal taramalı voltametri adından da anlaşılacağı gibi potansiyel tarama programının sadece bir yöne doğru uygulandığı voltametrik tekniktir. Burada potansiyel V1 gibi bir başlangıç potansiyelinden V2 gibi bir bitiş potansiyeline sabit hız ile değiştirilir (Şekil 2.6). Değişen potansiyele karşı akımlar ölçülerek Şekil 2.7’de görülen grafik elde edilir. Şekil 2.6. LSV’de potansiyel uygulama programı Potansiyel tarama işlemi, analizi yapılacak türün tepkime vermesi düşünülen potansiyelinden (V0) en az 220/n mV öncesinden başlatılarak (V1), tepkimenin gerçekleştiği potansiyel yeterince aşılıncaya kadar (V2) sürdürülür (Bard ve Faulkner 2001). Şekil 2.7, LSV voltamogramı üzerinde V1, V2 ve V0 noktalarını göstermektedir. Şekil 2.7. LSV eğrisi 23 2.6.2. Çevrimsel voltametri tekniği Çevrimsel voltametri (CV) bir kimyasal türün elektroaktivitesinin belirlenmesinde ve elektrokimyasal reaksiyonların aydınlatılmasında en yaygın olarak kullanılan tekniktir. Elektrokimyasal reaksiyonların kinetiği, heterojen elektron transfer reaksiyonları, kimyasal reaksiyonları, kimyasal reaksiyonlar ve adsorbsiyon işlemlerini aydınlatmada -4 yararlanılır. Çevrimsel voltametri, 10 M ile sınırlı olduğundan çoğunlukla nicel analiz amaçlarıyla kullanılmaz. Bu yöntem genellikle istenilen türün redoks potansiyelini belirlemek için kullanılır (Wang 2006). Çevrimsel voltametride uygulanan potansiyel programı LSV’den farklı olarak iki kademede uygulanır. İlk kademede V1 gibi bir başlangıç potansiyelinden başlanarak V2 potansiyeli kadar tarama yapılır, ikinci kademe potansiyel uygulama yönü tersine çevrilir ve V2’den aynı tarama hızı ile tekrar V1 (veya farklı bir V3) potansiyeline kadar potansiyel düzgün hızla değiştirilir ve çalışma elektrotunun potansiyeline karşı okunan akımlar okunarak grafiğe geçirilir. Şekil 2.8 çevrimsel voltametriye ait potansiyel uygulama programını göstermektedir. Potansiyel uygulama programı Şekil 2.8’de görüldüğü gibi çok çevrimli olarak gerçekleştirilebilir. Şekil 2.8. CV’de potansiyel uygulama programı 24 Şekil 2.9, 6 mM K3[Fe(CN)6]’ya ait çevrimsel voltamogramı göstermektedir. 3+ Voltamogram incelendiğinde, çözelti ara yüzeyinde bulunan Fe iyonlarının indirgeyici 3+ 2+ potansiyel bölgesine doğru yapılan tarama ile Fe ’ün Fe ’ya indirgendiği, potansiyelin 2+ ters tarafa değiştirilmesi sırasında oluşan Fe iyonlarının uygun potansiyelde tekrar 3+ Fe ’e yükseltgendiği görülmektedir. Şekil 2.9. CV eğrisi 2.6.3. Time–Base (akım–zaman) tekniği Bu teknikte CV ve LSV’deki gibi potansiyel tarama işlemi yapılmamakta analiz süresince potansiyel sabit tutulmaktadır. Time–Base tekniği ile analiz yapabilmek için öncelikle CV veya LSV gibi teknikler kullanıp analiz edilmek istenen türün indirgenme veya yükseltgenme potansiyeli bulunmalıdır. Uygulanan potansiyel gerekli minimum potansiyelden biraz daha büyük olarak seçilebilir. Bu teknikte, eğer çözeltide var olan bir türü indirgemek istiyor ve ona ait indirgenme potansiyeli uyguluyorsak ortamda bu uygulanan potansiyelden daha düşük potansiyellerde indirgenen başka türlerin girişim etkileri dikkat edilmesi gereken en önemli husustur. Time–Base tekniği, hazırlanan sensörün duyarlılığının ve olası interferentlerin etkisizliğinin gösterilmesi açısından çok kullanışlıdır. Bu teknikte çözelti ortamına 25 yapılan analiz edilmek istenilen türe ait hacim eklemeleri sonucunda akım basamakları oluşmakta oluşan basamak büyüklükleri de türün değişimi ile orantılı olmaktadır. Bu şekilde akım basamağı büyüklükleri okunarak kantitatif analiz yapılabilmektedir. Şekil 2.10 Time–Base tekniğine ait bir eğriyi göstermektedir. Şekil 2.10. Time–Base eğrisi 2.6.4. Puls teknikleri Puls teknikleri daha düşük miktarlarda madde analizi yapmak için geliştirilmiş -8 tekniklerdir. 10 M derişim gibi iyi bir tayin sınırları vardır. Puls tekniklerinin ortaya çıkışı ile elektroanalitik kimyacıların çok yaygın olarak kullandığı polorografi tekniğinin yerini almaya başlamıştır. Bu tekniklerde faradayik ve kapasitif akımların oranı çok fazla derecede arttırılmış ve bu sayede yüksek duyarlılık sağlanmıştır. Puls tekniklerini normal puls (NPV), diferansiyel puls (DPV) ve kare dalga voltametrisi (SWV) olmak üzere üç kısımda incelemek mümkündür. Bu tekniklerde çalışma elektrotunun üzerine 50 ms’lik sürelerde potasiyel basamağı dizisi uygulanır ve bu basamağın son kısımda akım okunur. Bunun nedeni, potansiyel basamağı uygulandıktan sonra kapasitif akımlar hızla düşerken faradayik akımlar daha yavaş düşmekte, dolayısıyla potansiyel basamağın sonunda okunan akım içerisinde derişimle doğru orantılı olan faradayik akımların payı büyümektedir (Wang 2006). 26 Bu tekniklerde dikkat edilmesi gereken en önemli husus her ölçümden önce elektrot yüzey alanının aynı olup olmadığıdır. Puls teknikleri hem katı elektrotlar (platin, camsı karbon v.b.) ile hem de askıda civa damla elektrot (HMDE) ile yapılabilmektedir. Damlayan civa damla elektrot ile yapılan voltametrik çalışmalarda puls tekniklerinin kullanılması ile puls polarografisi gelişmiştir. 2.6.4.1. Normal puls voltametrisi Normal puls voltametrisinde, uygulanan potansiyel puls yüksekliği düzenli olarak arttırılmak suretiyle çalışmalar gerçekleştirilir. 50 ms boyunca puls uygulanır ve bu pulsun son 16,7 ms’sinde akım okuması yapılarak eğri oluşturulur. Okunan akımlar içerisinde faradayik akımların belirgin olması nedeniyle diğer lineer potansiyel tarama tekniklerine oranla 5 ile 10 kat daha iyi duyarlılık elde edilebilir (Bard ve Faulkner 2001). Şekil 2.11 NPV’ye ait potansiyel uygulama programını göstermektedir. Şekil 2.11. NPV’de uygulanan potansiyel programı 27 2.6.4.2. Diferansiyel puls voltametrisi Diferansiyel puls voltametrisinde uygulanan puls şekli, doğrusal olarak artan bir potansiyel uygulama programı (RAMP) üzerine puls uygulama programının yerleştirilmesi ile oluşmaktadır. Bu teknikte NPV’den farklı olarak iki kez akım okuması yapılır. İlk akım okuması puls uygulanmaya başlamadan 16,7 ms önce, ikici okuma ise puls uygulanıp kapasitif akımların minimum değere ulaştığı anda okunur ve bu iki okuma arasındaki fark potansiyele karşı grafiğe geçirilerek eğri elde edilir (Wang 2006). DPV tekniğinde uygulanan pulsun potansiyel büyüklüğü genelde 10–100 mV potansiyel arasındadır (Bard ve Faulkner 2001). DPV, NPV’den 5 veya 6 kat daha duyarlı bir teknik olduğu için 2–10 ppb tayin sınırlarında çalışma yapma imkanı sağlamaktadır (Türkdemir 2008). Şekil 2.12 DPV’de uygulanan potansiyel programını göstermektedir. Şekil 2.12. DPV’de potansiyel uygulama programı Bard ve Faulkner (2001) tarafından civa damla elektrot ile 0,01 M HCl içerisinde -6 2+ 10 M Cd ’ye ait DPV ve NPV teknikleri ile elde edilmiş eğriler Şekil 2.13 ve Şekil 2+ 2.14 göstermektedir. İki şekil incelendiğinde NPV ile Cd ’ye karşı düzgün bir pik oluşumu gözlenmezken, DPV ile yapılan çalışmada oldukça iyi ve gözlenebilirliği yüksek bir pik elde edilmiştir. 28 Şekil 2.13. DPV eğrisi Şekil 2.14. NPV eğrisi 2.6.4.3. Kare dalga voltametrisi Kare dalga voltametrisinde, çalışma elektrotuna hem ileri yönde hem de geri yönde simetrik bir şekilde kare dalgaları şeklinde potansiyel uygulaması yapılır. Bu teknikte de akım ölçümü için iki okuma yapılır. Okumalar ileri ve geri yöndeki pulsların son zaman dilimlerinde yapılarak kapasitif akımlardan kaçınılmış olunur (Wang 2006). Kare dalga voltametrisinde uygulanan potansiyel basamak yüksekliği ve genişliği ayarlanarak çok yüksek tarama hızlarına çıkılabilindiği için elde edilen piklerin yükseklikleri yani tekniğin duyarlılığı diğer puls tekniklerine göre daha iyidir. -8 Nitekim bu teknik ile 10 M derişimlere kadar çalışmalar yapmak mümkündür (Wang 2006). Şekil 2.15 kare dalga voltametrisinde uygulanan potansiyel programını göstermektedir. 29 Şekil 2.15. SWV’de potansiyel uygulama programı Bu teknikte, ileri yönde yapılan akım okumalarından, geri yönde akım okumaları çıkarılarak eğri elde edilir (Bard ve Faulkner 2001). Şekil 2.16 yapılan ileri ve geri yönlerdeki okumalar ile elde edilen eğrileri ve sonuç olarak elde edilen eğriyi göstermektedir. Şekil 2.16. SWV’de ileri okuma, geri okuma ve ikisi arasındaki fark sonucu elde edilmiş akım–potansiyel eğrileri 30 2.7. Literatürde Oksalat Tayini İçin Yapılan Çalışmalar Oksalatın, ıspanak, mantar, pancar yaprağı, zencefil, horozibiği çiçeği, pazı otu gibi sebzelerde, çikolata gibi gıda maddelerinde, bira gibi içeceklerde olduğu ve ayrıca içme suyunun ozonlama ile dezenfekte edilmesi esnasında ve vücuttaki protein yıkımı sonucu 2+ 2+ oluştuğu bildirilmektedir. Vücuda alınan fazla miktarda oksalat Ca ve Mg iyonlarla 2+ 2+ çözünmeyen bileşikler oluşturarak vücudun gereksinim duyduğu Ca ve Mg emiliminde azalma gibi sorunlara yol açabilmektedir. Oksalatın oluşturduğu bu çözünmeyen bileşikler böbrek ve organlarda çökerek bazı fonksiyonel bozukluklara ve böbrek taşlarına neden olduğu bilinmektedir. Oksalat ayrıca endüstriyel sistemlerde de sorunlara neden olan bir maddedir. Fazla oksalat bira yapımının ilk aşamalarında biranın rengini bozucu etki gösterirken, ilerleyen aşamalarında ise sistemin içerisinde çökerek tıkanıklıklara neden olmaktadır. Benzer şekilde ozonlanma sonucu suda oluşan oksalat da sistemlerde çökerek tıkanıklık ve hasarlara neden olabilmektedir. Ozonlanma sonucu oluşan oksalatın ayrıca sudaki bakteriyel gelişmeye (kirliliğe) katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Oksalat bu tip sorunlara neden olduğu için rutin yöntemlerle sürekli takip edilmesi ve analizlenmesi büyük önem teşkil etmektedir. 2.7.1. Biyosensörler ile yapılan çalışmalar Oksalat biyosensörleri genel olarak üç farklı tiptedir; bir oksijenmetre ve oksalat oksidaz (OXO) enzimi ile modifiye edilmiş oksijen sensöründen oluşan oksalat biyosensöründe aşağıdaki reaksiyona bağlı olarak çözünmüş oksijen derişimindeki azalma ölçülürken, amperometrik oksalat sensöründe aynı tepkime ile açığa çıkan H2O2’nin indirgenme tepkimesi sonucu oksalat miktarı belirlenir. Oksalat tayini için bienzimatik (iki enzimli) amperometrik biyosensörler de mevcuttur. Bienzimatik sensörlerde oksalat oksidaz ve horseradish peroxidase enzimleri birlikte kullanılarak genellikle bir mediatörün yükseltgenerek değişen derişimi ölçülmektedir. Potansiyometrik oksalat sensörü ise aşağıdaki reaksiyon sonucu oluşan CO2’nin biyosensörün iç çözeltisi içinde karbonat – bikarbonat dengesini oluşturması sonucu ortamın değişen pH’si ölçümü ilkesine dayanmaktadır (Yablotskii ve Shekhovtsova 2010). 31 Enzim (COOH)2 + O2 2 CO2 + H2O2 (2.10) - + CO2 + H2O HCO3 + H (2.11) Oksalat tayini için ayrıca kalorimetrik ölçüm ilkesine dayalı ve SIRE teknolojisi diye adlandırılan, enzimatik reaksiyon sonucu oluşan türün elektrot yüzeyindeki reaksiyonuna değil de enzimatik reaksiyonun kendisinden kaynaklanan elektriksel sinyallerin ölçümüne dayalı biyosensörlerde mevcuttur (Pundir ve Sharma 2010). Ancak bu tip biyosensörlerin sayısı çok azdır. En yaygın olarak bulunan sensörler H2O2’nin indirgenmesi esasına dayanan sensörlerdir. Bradley ve Rechnitz (1986), idrarda oksalat tayini için hem potansiyometrik hem de amperometrik oksalat sensörleri geliştirmişlerdir. Potansiyometrik sensör oksalat oksidazın gaz geçirgen membran yüzeyine immobilize edilip CO2 elektrotunun yüzeyine yerleştirilmesi ile, Amperometrik sensör ise oksalat oksidazın Gor–Tex membran ile diyaliz membranı arasına immobilize edilmesiyle oluşturulmuştur. -5 -6 Potansiyometrik sensör ile tayin sınırı 3,4.10 M, amperometrik sensör ile 2.10 M olarak bulunmuştur. Dinçkaya ve Telefoncu (1994), oksalat tayini için çözünmüş oksijen elektrotu ile oksalat oksidaz kullanılarak bir biyosensör hazırlamışlardır. Önce oksijen elektrot üzerine selüloz asetat membran tutturmuşlar, bu selüloz asetat membran, oksalat oksidazın birleşebileceği fonksiyonel grupların sayısını arttırmak için BSA ile birleştirilmiş ve aktive edilmiştir. Oksalat oksidaz selüloz asetat–BSA membranına -5 -4 glutaraldehit ile bağlanmıştır. Doğrusal çalışma aralığı 1.10 –3,5.10 M olarak belirlenmiştir. Reddy ve ark. (1997), idrarda oksalat tayini için oksalat oksidazı glutaraldehit ve BSA ile polikarbonat veya dializ membranı ile selüloz asetat membran arasına immobilize ederek bir biyosensör oluşturmuşlardır. Doğrusal çalışma aralığı seyreltilmiş idrarda 2–200 µM, seyreltilmemişte ise 80–800 µM olarak belirlenmiştir. 32 Milardovic ve ark. (2000a), rutenyum, nikel ve demir hegzasiyanometalat (Ru–FeNiHCM) ile modifiye edilmiş grafit elektrot yüzeyine glutaraldehit ve BSA ile oksalat oksidaz immobilize ederek biyosensör hazırlanmıştır. Doğrusal çalışma aralığının alt sınırı 20 µL olarak elde edilmiştir. Milardovic ve ark (2000b), krom (III) hegzasiyano ferrat (II) ile grafit elektrotu modifiye ederek yeni bir yüzey oluşturmuşlar oluşan yeni yüzeye de oksalat oksidazı BSA ve glutaraldehit ile immobilize ederek gerçek yiyecek örnekleri ve idrar örneklerinde oksalat tayini için bir biyosensör geliştirmişlerdir. Doğrusal çalışma aralığı 2,5–400 µM olarak bulunmuştur. Perez ve ark. (2001), hem oksalat oksidaz hem de horseradish peroksidaz içeren çift enzim sistemli bir elektrot hazırlanmıştır. Oksalat oksidaz, titanyum dioksit ile modifiye edilmiş olan silika jele glutaraldehit ile çapraz bağlanarak immobilize edilmiştir. HRP karbon di–imit ile grafit tozuna kovalent bağlanarak immobilize edilmiştir. Doğrusal çalışma aralığı 0,1–2 mmol/L olarak belirlenmiştir. Sezgintürk ve Dinçkaya (2003), idrardaki oksalat tayini için ıspanak dokularının immobilizasyonuna dayalı bir biyosensör geliştirilmişlerdir. Biyosensör çözünmüş oksijen elektrodu üzerine yüksek seçiciliğe sahip teflon membran entegre edilerek, bu membrana ıspanak dokularının immobilize edilmesiyle yapılmıştır. Enzim immobilizasyonu jelatin–glutaraldehit çifti ile çapraz bağlama yöntemi kullanılarak -5 -5 yapılmıştır. Doğrusal çalışma aralığı 1.10 –10.10 M olarak belirlenmiştir. Hong ve ark. (2003), yaptıkları çalışmada oksalat tayini için SIRE teknolojisini kullanarak kolorimetrik yöntemle idrarda oksalat tayini için bir biyosensör geliştirmişlerdir. Tayin sınırını 20 µM, dorusal çalışma aralığını 0–5 mM olarak belirlemişlerdir. 33 Fiorito ve Torresi ark. (2004), oksalat tayini için purusya mavisi ve dop edilmiş analin ile modifiye edilmiş camsı karbon elektrot yüzeyine oksalat oksidazı glutaraldehit ile immobilize ederek bir biyosensör geliştirmişlerdir. Doğrusal çalışma aralığı 0,08–0,45 mM olarak bulunmuştur. Capra ve ark. (2005), idrarda oksalat tayini için oksalat oksidazı glutaraldehit–müsin–karbopol matrikse çapraz bağlayarak bir biyosensör oluşturmuşlardır. Ayrıca glutaraldehit–müsin–enzim ve glutaraldehit– albumin–enzim bileşimlerini kıyaslamışlardır. Doğrusal çalışma aralığı 2–400 µM olarak belirlemişlerdir. Milardovic ve ark. (2008), idrarda oksalat tayini için altın elektrot yüzeyine oksalat oksidaz ve peroksidaz enzimlerini BSA (bovin serum albumin) ve glutaraldehit ile immobilize ederek biyosensör geliştirmişlerdir. Ölçümler hem standart oksalik asit için (doğrusal çalışma aralığı 50 µM–10 mM) hem de idrar örneği için (doğrusal çalışma aralığı 5 µM–10 mM) akış hücresinde doğrudan enjeksiyon yapılarak yapılmıştır. Mishra ve ark. (2010), idrar ve birada oksalat tayini için karbon tozu, parafin yağı oksalat oksidaz, BSA ve glutaraldehiti karıştırarak bir enzimatik elektrot oluşturmuşlardır. Sensör 20 mg/mL’ye kadar doğrusal olarak çalışmaktadır. 2.7.2. Diğer tekniklerle yapılan çalışmalar Masar ve ark. (2003), alan elektroforez sistemi ile biradaki oksalat tayini için polimetilmetakrilat kapiler elektroforez ciplerini kullanmışlardır. Bu sayede yüksek örnek yükleme kapasiteli bir ayırma sistemi (500 nL örnek enjeksiyon kanalı ile birleştirilmiş 8500 nL ayırma kanalı) elde etmişler, ayrıca çipte ayırma bölümündeki çözeltinin hidrodinamik ve elektro–osmatik taşımaları engellenmiş ve elektroforez çipteki ayırmalarda baskın taşıma işlemi haline getirilmiştir. Doğrusal çalışma aralığı 2–25 mM olarak bulunmuştur. Uygulama için altı farklı bira örneği ile çalışılmıştır. 34 Suzuki ve ark. (2005), serumda oksalat tayini için 190 nm’de direkt absorbans tayinine dayanan alan elektroforez sistemini elektrik alan–büyütmeli ön deriştirme tekniği ile birleştirilip bir analiz sistemi oluşturmuşlardır. Tayin sınırı (S/N = 3 iken) 1,14 nM, 2 doğrusal çalışma aralığı ise 5,68 nM–11,36 µM, R = 0,9999 olarak belirlenmiştir. Daha sonra dört farklı serum örneğinde uygulama yapılmıştır. Sljukic ve ark. (2007), oksalik asit tayini için ikisi polipirolitik karbon, diğer ikisi sadece karbon tabanlı elektrotlar ile oksalik asitin yükseltgenmesine dayanan bir tayin yöntemi geliştirmeyi amaçlamışlardır. Polipirolitik elektrotların oksalik asite karşı oldukça duyarlı olduğunu gözlemlemişler ve yapılan çalışmalar sonucunda tayin sınırını 0,7 µM olarak belirlemişlerdir. Kumar ve ark. (2008), idrarda oksalat tayini için aktifleştirilmiş polistiren küvetler kullanarak bir metot geliştirmişlerdir. Polistiren küvet ışık altında yüzeye bağlanabilen çift aktif uçlu olan 1–floro–2–nitro–4–azidobenzen ile modifiye edildikten sonra bu bileşiğe oksalat oksidazın takılması ile aktive edilmektedir. Oksalat tayini absorbansa dayalı olarak yapılmıştır. Doğrusal çalışma aralığı 20–200 µM olarak belirlenmiştir. Şenol ve ark. (2009), oksalik asit analizi için öncelikle Britton–Robinson tamponunda oksalik asitin pH ile duyarlılığındaki değişmeyi belirlemişler, ardından optimize ettikleri çalışma koşullarında kalibrasyon grafiği hazırlamışlardır. Doğrusal çalışma aralığını 0,5–5 mM olarak belirlemişlerdir. Zheng ve ark. (2009), ıspanakta oksalik asit tayini için camsı karbon elektrotu karbon nano tüp ile modifiye edip bir elektrot hazırlamışlardır. Oksalik asitin yükseltgenmesi -5 -2 vasıtasıyla tayin etmişlerdir. Doğrusal çalışma aralığı 5.10 –1,2.10 M olarak belirlenmiştir. 35 Chamjangali ve ark. (2009) tarafından, sebze ve su örneklerinde eser miktarlarda oksalat tayini için yeni, basit, seçici ve duyarlı katalitik–kinetik spektrofotometrik bir metot geliştirilmiştir. Metot sülfürik asit ortamında dikromat ile oksalatın rengi mora dönene kadar titre edilerek yükseltgenmesine dayanır. Sonrasında mor renkli çözelti 630 nm’de ölçülerek okslat tayin edilir. Doğrusal çalışma aralığı 0,2–5,5 mg/mL ve tayin sınırı 0,05 mg/mL olarak belirlenmiştir. Pundir ve ark. (2009), yumurta kabuğu üzerine oksalat oksidaz immobilize ederek oksalat için yeni bir tayin yöntemi geliştirmişlerdir. Tayin sınırını 1,5 µM olarak belirlemişlerdir. Sikora ve ark. (2009), vücudunda kalsiyum oksalat olduklarından şüphe duyulan ve duyulmayan 59 kişideki oksalat miktarını belirlemek ve bu sonuçları yaşlara ve göre kategorilendirmek amacıyla, infrared spektroskopisini kullanarak plazmada oksalat tayini çalışmaları yapmışlardır. Yamazaki ve ark. (2010), rodyum ftalosiyanin ile camsı karbon elektrot yüzeyini modifiye ederek oksalik asit tayini için yeni bir modifiye elektrot yapmışlardır. Tayin sınırını da 1 µM olarak belirlemişlerdir. 36 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Kullanılan Cihazlar Voltametrik çalışmalar; bilgisayar kontrollü BASİ Epsilon marka potansiyostat ile C3 Cell Stand ve Civa Damla Elektrot (HMDE) kullanılarak, spektrofotometrik çalışmalar; Hitachi U–3900H marka çift ışın yollu UV–VIS spektrofotometre kullanılarak yapıldı. pH ayarlama ve ölçümleri için Termo–Orion 4 Star Plus marka pH metre ve 8102BNUWP kodlu Orion cam pH elektrottan, tartım işlemleri için Shimadzu AUW220D marka 0,01 mg duyarlılıktaki hassas teraziden yararlanıldı. Çözelti hazırlama işlemlerinde kullanılan ısı kontrollü manyetik karıştırıcı Wisestir MSH–20D markadır. Çeşitli işlemlerde Branson 1510 model ultrasonik banyo ve ölçüm çözeltilerinden çözünmüş O2 uzaklaştırılmasında yararlanılan yüksek saflıkta (%99,9) Ar gazının temizlenmesi için VCl3 absorbsiyon cam düzeneğinden yararlanıldı. Ayrıca elektrot yüzeylerini kontrol ve kaplama işlemleri sonucu elde edilen yeni yüzeyleri fotoğraflamak amacıyla, x500 kata kadar büyütmeli 122Cu Dijital Görüntüleme Sistemine sahip NIM 100 Ters Tip Metalürjik Mikroskop’tan yararlanıldı. Voltametrik çalışmalarda, çalışma elektrotu olarak; Basi marka, MF–2013 kodlu 1,6 mm çapında platin elektrot (PtE), MF–2012 kodlu 3 mm çapında camsı karbon elektrot (GCE), yardımcı elektrot olarak; Basi marka MV–1032 kodlu 7,5 cm uzunluğunda platin tel elektrot ve spiral şekilde bükülerek paralel düz yüzey haline getirilmiş platin elektrot, referans elektrot olarak; Basi marka MF–2052 kodlu RE -5B Ag/AgCl referans elektrot; voltametrik ölçüm hücresi olarak; 50 mm çapında yaklaşık 25 mL örnek alabilen Basi marka MR–1208 kodlu hücreler kullanıldı. 3.2. Kullanılan Çözeltiler Kullanılacak çözeltiler, temin edilebilen yüksek saflık derecesindeki kimyasallar ve Zeeman 1 model tersozmoz ultrasafsu cihazından alınan çok yüksek saflıktaki (18,2 Mohm) su kullanılarak hazırlandı. Çözeltiler aynı titizlik ve özenle, 2-3 haftadan daha eski tarihli olmalarına izin verilmeksizin sık sık tazelendi. 37 a-) 0,04 M Britton–Robinson tampon (BRT) çözeltisi Borik asit (Merck, GR for analysis), % 85’lik fosforik asit ( Sigma – Aldrich, puriss ) ve % 100’lük glasiyel asetik asidin (Merck, anhydrous GR for analysis) her birinden 0,04 M içerecek şekilde arzu edilen hacimlerde hazırlanan karışımım pH si 2–10 arasında istenilen değere tamponlanarak hazırlandı. b-) 0,4 M hidrojen peroksit (H2O2) çözeltisi % 35’lik H2O2 (Merck) çözeltisinden yararlanılarak arzu edilen hacimlerde 0,4 M H2O2 sık periyotlarla hazırlandı. Bu çözeltinin seri seyreltmeleri ile kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmalarında kullanılan 0,04 M, 0,004 M, 0,0004 M gibi seyreltik H2O2 çözeltileri “A“ tipi balon jojeler kullanılarak hazırlandı. c-) 0,4 M oksalik asit (C2H2O4) çözeltisi Oksalik asit dihidrat (Merck, GR for analysis) arzu edilen hacimde 0,4 M oksalik asit içerecek şekilde hazırlandı. Kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmalarında kullanılan daha düşük derişimlerdeki oksalik asit çözeltileri (0,04 M, 0,004 M, 0,0004 M) seyreltme işlemi ile 0,4 M oksalik asit çözeltisinden hazırlandı. d-) BRT ile tamponlanmış 0,1 M oksalik asit çözeltisi Oksalik asit dihidrat arzu edilen hacim içerisinde 0,1 M oksalik asit içerecek şekilde hazırlanıp 0,04 M BRT çözeltisi ile istenilen pH’ye tamponlanarak hazırlandı. Kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmalarında kullanılan daha düşük derişimlerdeki oksalik asit çözeltileri (0,01 M, 0,001 M, 0,0001 M) seyreltme işlemi ile 0,1 M oksalik asit çözeltisinden hazırlandı. 38 f-) 0,1 M fosfat (NaH2PO4) tampon çözeltisi o Sodyum dihidrojen fosfat dihidrat (Sigma–Aldrich, puriss) öncelikle 120 C’de etüvde kurutuldu. Ardından arzu edilen hacim içerisinde 0,1 M fosfat içerecek şekilde pH 3–10 arasında istenilen pH’ye tamponlanarak hazırlandı. g-) 6 mM potasyum hegzasiyanoferrit [K3(Fe (CN)6)] çözeltisi Potasyum hegzasiyanoferrit (Merck, GR for analysis) arzu edilen hacim içerisinde 6 mM potasyum hegzasiyanoferrit ve destek elektrolit olarak 1 M potasyum nitrat (KNO3, Merck, GR for analysis) içerecek şekilde hazırlandı. h-) 0,1 M sülfürik asit ( H2SO4 ) çözeltisi Sülfürik asit çözeltisi, % 95–98’lik sülfirik asitten (Merck) arzu edilen hacim içerisinde 0,1 M sülfirik asit içerecek şekilde hazırlandı. ı -) 10 mM potasyum klorür (KCl) içerisinde 0,125 M Pirol içeren çözelti Pirol çözeltileri, ≥ % 97’lik pirolden (Merck, for synthesis) toplam hacim 10 mL olmak koşuluyla 10 mM KCl destek elektroliti içerisinde 0,125 M pirol içerecek şekilde hazırlandı. i-) Enzim çözeltisinin hazırlanışı pH 3,8 süksinat tampon çözeltisi içerisinde 0,008 mg/µL’lik oksalat oksidaz (Sigma–Aldrich, from barley seedlings) içeren enzim çözeltileri hazırlandı. j-) Nafyon çözeltilerinin hazırlanışı Kütlece % 0,5, % 1, % 3 nafyon çözeltileri, kütlece % 5’lik nafyon (Sigma–Aldrich) çözeltisinden % 100’lük etanol ile seyreltilerek hazırlandı. 39 k-) Kütlece % 2,5’lik glutaraldehit çözeltisi hazırlanışı Kütlece % 2,5’lik glutaraldehit, kütlece % 50’lik glutaraldehitten (Sigma–Aldrich) saf su ile seyreltilerek hazırlandı. 3.3. Kullanılan Yöntemler Voltametrik tekniklerden CV ve LSV, H2O2 ve oksalik asitin duyarlılığının pH ile değişimini ve elektrot yüzey aktifliğini belirleme çalışmalarında, DPV ise daha iyi duyarlılık dolayısıyla daha iyi tayin sınırlarında analiz yapabilmek için kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmalarında kullanıldı. Time–Base tekniğinden ise sabit potansiyelde H2O2 ve oksalik asite ait akım basamağı oluşumunu belirleme, elektrokimyasal polimerleşme ve hazırlanan enzimatik sensörlerin oksalata olan duyarlılıklarının belirlenmesi çalışmalarında yararlanıldı. Spektrofotometrik teknikle genellikle dalga boyu tarama çalışmaları yapılarak oksalik asitin analizlenebilirliği çizilen kalibrasyon grafikleri ile gösterilmeye çalışıldı. Voltametrik ve spektrofotometrik çalışmaların tümü klima kontrollü laboratuvar o koşullarında ve 25 C oda sıcaklığında gerçekleştirildi. 40 4.BULGULAR Bu tez çalışmasında oksalat molekülünün enzimatik reaksiyonu sonucu oluşan H2O2 ölçümüne dayalı bir amperometrik oksalat sensörü hazırlanması amaçlanmıştır. Tez kapsamında yapılan çalışmaları voltametrik, spektrofotometrik ve biyosensörün hazırlanması ve karakterize edilmesi çalışmaları olmak üzere üç başlıkta ele almak mümkündür. Voltametrik çalışmaları; H2O2’nin voltametrik davranışının incelenmesi, oksalik asitin H2O2 pikleri ile olası girişim etkisinin, voltametrik davranışının ve analizlenebilirliğinin incelenmesi olmak üzere üç alt başlıkta incelemek mümkündür. Spektrofotometrik çalışmalarda ise oksalik asitin analizlenebilirliği incelenmiş ve voltametrik çalışmalara ek olarak sunulmuştur. Biyosensörün hazırlanması ve karakterize edilmesi çalışmaları ise elektrokimyasal polimerleşme ile immobilizasyon, çapraz bağlama ile immobilizasyon ve polimer matriks altına immobilizasyon çalışmaları olmak üzere üç alt başlıkta incelenebilir. -2 + C2O4 + O2(g) + 2H 2CO2(g) + H2O2 (4.1) + - H2O2 O2(g) + 2 H + 2 e (4.2) 4.1. Voltametrik Çalışmalar Voltametrik çalışmalar 10 ve 20 mL örnek hacimleri kullanılarak; referans elektrot, yardımcı elektrot ve çalışma elektrotunun birlikte bulunduğu üç elektrotlu hücre içerisinde gerçekleştirildi. Çevrimsel voltametri (CV) ve doğrusal taramalı voltametri (LSV) çalışmaları genellikle potansiyostat üzerinden okunan rest potansiyel (denge potansiyeli) değerinden başlatılmış ve yine aynı potansiyelde sonlandırılarak tek çevrim üzerinden tamamlanmıştır. Voltametrik çalışmalarda x eksenindeki potansiyel değerleri Ag/AgCl/3M NaCl referans elektroda karşı verilmiş, voltamogram gösteriminde IUPAC gösterimleri benimsenmiştir. Çalışma elektrodu, referans elektrot ve çalışma sisteminin kontrolü, belli aralıklarda ve kuşkulanılan durumlarda 6 mM K3[Fe(CN)6] içerisinde -200 ile +800 mV gerilim aralığında CV çalışması yapılarak karşılaştırma yapılmıştır (Şekil 4.1). 41 Şekil 4.1. 6 mM K3[Fe(CN)6] içerisinde -200 ile +800 mV gerilim aralığında yapılan CV çalışması 4.1.1. H2O2 ile yapılan çalışmalar Hazırlanmak istenen sensörünün ölçüm ilkesi enzimatik reaksiyon sonucu oluşan H2O2 molekülünün çalışma elektrotu üzerinde indirgenmesi veya yükseltgenmesi ilkesine dayalı olduğundan, öncelikle çalışma ortamında H2O2 molekülünün elektrokimyasal olarak aktif olduğu çalışma bölgesi ve sınırlarını belirlemeye yönelik bir seri voltametrik çalışma gerçekleştirilerek H2O2’ye ait indirgenme ve yükseltgenme piklerinin optimizasyonu çalışmaları yapıldı. Bu çalışmalar kapsamında, platin elektrot (PtE) ve camsı karbon elektrot (GCE) olmak üzere iki tip çalışma elektrotu ile farklı tampon çözeltiler ve pH değerlerinde, 1 mM, 2 mM ve 3 mM, 5 mM H2O2 içerisinde LSV ve CV çalışmaları yapıldı. H2O2’nin elektrokimyasal olarak yükseltgenme ve indirgenme potansiyellerine pH ve çalışma elektrodunun cinsi, pik akımlarının derişimle değişimleri incelenmeye çalışıldı. 42 4.1.1.1. H2O2 için PtE ile yapılan çalışmalar Enzimatik reaksiyon sonucu oluşan H2O2’nin duyarlılığının pH’ye olan bağımlılığını belirlemek amacıyla geniş bir çalışma aralığı sunan Britton–Robinson tamponu (BRT) ile pH 2–10 ve fosfat tamponu ile pH 2–9 (FT) aralığında hem anodik hem de katodik bölgelerde LSV çalışmaları yapıldı. Yapılan çalışmalar argon atmosferi altında tekrarlanarak çözünmüş oksijenin uzaklaştırılmasının pik potansiyelleri ve pik akımları üzerindeki etkisi incelendi. H2O2 için anodik bölgede LSV tekniği ile elde edilen voltamogramlar incelendiğinde (Şekil 4.2, Şekil 4.3, Şekil 4.4, Şekil 4.5), H2O2’ye ait +360 ve +925 mV potansiyel değerleri arasında değişen, tampon çözelti ile elde edilen zemin eğrisinde bulunmayan, yalnızca H2O2 eklemeleri sonucu ortaya çıkan bir pik gözlendi. Bu pikin potansiyelinin ve pik akım büyüklüğünün çalışılan tampon çözeltinin pH’sine bağlı olduğu görüldü. H2O2 için BRT ve FT ile yapılan anodik bölgedeki LSV çalışmalarında en iyi duyarlılık pH 3 BRT içerisinde elde edildi (Şekil 4.2). H2O2 için anodik bölgede en iyi duyarlılığın elde edildiği bu çalışma koşullarında bir enzimatik sensör hazırlanabileceği öngörüldü. Şekil 4.2. PtE ile pH 3 BRT’de 1 mM Şekil 4.3. PtE ile pH 10 BRT’de 1 mM H 2O2’ye ait anodik bölgedeki LSV’ler, H2O2’ye ait anodik bölgedeki LSV’ler, 1 mM H2O2 ve zemine ait LSV’ler 1 mM H2O2 ve zemine ait LSV’ler 43 Ş ekil 4.4. PtE ile pH 4,5 FT’de 1 mM Şekil 4.5. PtE ile pH 9,5 FT’de 1 mM H 2O2’ye ait anodik bölgedeki LSV’ler, H2O2’ye ait anodik bölgedeki LSV’ler, 1 mM H2O2 ve zemine ait LSV’ler 1 mM H2O2 ve zemine ait LSV’ler Anodik bölgede H2O2 için en iyi duyarlılığın elde edildiği koşullar belirlendikten sonra çözünmüş oksijen giderme işleminin H2O2 pikleri üzerinde olumlu bir etkisinin olup olmadığı incelendi. Şekil 4.6’da, pH 3 BRT çözeltisinde oksijen giderme işlemi yapılarak ve yapılmadan elde edilen doğrusal taramalı voltametri eğrileri (LSV) gösterilmiştir. LSV eğrileri incelendiğinde, çözünmüş oksijen giderme işleminin H2O2 yükseltgenme piki üzerinde herhangi bir iyileştirici etki yapmadığı görüldü. Bu nedenle ileriki çalışmalarda argon gazı ile çözünmüş oksijen giderme işlemi yapılmasına gerek duyulmadı. Şekil 4.6. 1 mM H2O2 içeren pH 3 BRT içerisinde PtE ile çözünmüş oksijen gideriminin LSV pikleri üzerine etkisi, çözünmüş oksijen giderme işlemi yapılarak ve oksijen giderme işlemi yapılmadan, zemine ait LSV’ler 44 H2O2’nin anodik bölgedeki elektrokimyasal davranışı belirlendikten sonra, H2O2 için LSV ile katodik bölgede potansiyel tarama çalışmaları yapıldı. Bu çalışmalara ait LSV voltamogramları Şekil 4.7’de ve Şekil 4.8’de gösterilmiştir. Şekil 4.7. PtE ile BRT içerisinde 1 mM H2O2’ye ait katodik bölgedeki LSV’ler, pH 10; zemine ve 1 mM H2O2’ye ait, pH 2; zemine ve 1mM H2O2’ye ait LSV’ler Şekil 4.8. PtE ile FT içerisinde 1 mM H2O2’ye ait katodik bölgedeki LSV’ler, pH 2.5; zemine ve 1 mM H2O2’ye ait, pH 9.5; zemine ve 1 mM H2O2’ye ait LSV’ler Katodik bölgedeki potansiyel taramaları sonucu elde edilen Şekil 4.7’deki ve Şekil 4.8’deki LSV voltamogramları incelendiğinde, zeminde var olan bir pikin H2O2 eklenmesi ile arttığı gözlendi. Katodik bölgede zeminde var olan bu pikin, çözeltinin bileşimi ve pH’sine bağımlı olarak, pH‘nin 2’den 10’a çıkarılması ile +280 mV 45 potansiyelden -240 mV potansiyele kadar kaydığı gözlendi. Katodik bölgede yapılan çalışmalarda elde edilen indirgenme piklerinin, anodik bölgedeki yükseltgenme piklerinden daha büyük olduğu belirlendi. Ancak katodik bölgede elde edilen pikin zeminde var olup H2O2 eklemeleri ile büyüyen bir pik olması ve zeminde var olan pikin tekrarlanırlığının çok iyi olmaması nedeniyle, ayrıca katodik potansiyellerde O2 uzaklaştırması gerekebileceği, bu işlemin ise uçucu H2O2 bileşiğinin eksilmesine neden olabileceği gibi çekincelerle, katodik bölgede çalışan bir oksalat sensörü yerine anodik bölgede H2O2 yükseltgenmesi esasıyla çalışan bir sensörün hazırlanmasının daha uygulanabilir olacağı öngörüldü. PtE ile yapılan çalışmalarda en duyarlı çalışma koşulu olan pH 3 BRT’de anodik bölgede artan derişim ile H2O2 piklerinin nasıl değiştiğini belirlemek amacıyla CV çalışması yapıldı. Şekil 4.9’da PtE ile H2O2 için en iyi duyarlılığın elde edildiği pH 3 BRT çözeltisi içerisindeki CV voltamogramları gösterilmiştir. Elde edilen eğriler incelendiğinde, anodik bölgede +925 mV potansiyel değerinde zeminde var olmayıp H2O2 eklenmesiyle oluşan ve artan H2O2 derişimi ile düzenli şekilde büyüyen bir yükseltgenme piki gözlendi. Şekil 4.9. pH 3 BRT içerisinde 1, 2, 3, 5 mM H2O2 için PtE ile elde edilen CV’ler, zemine ait, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 5 mM H2O2’ye ait CV eğrileri 46 H2O2 için PtE ile yapılan çalışmaların ardından aynı çözelti koşullarında GCE ile H2O2’ye ait akım değişimlerinin gözlenip gözlenemeyeceği araştırıldı. 4.1.1.2. H2O2 için GCE ile yapılan çalışmalar GCE ile H2O2’nin elektrokimyasal davranışını ve en duyarlı olduğu koşulları belirlemek amacıyla geniş bir pH bölgesinde (pH 3 ile pH 9) BRT ile CV çalışmaları yapıldı. Şekil 4.10. GCE ile farklı pH’lerde H2O2 için elde edilen CV’ler, pH 3; zemine ait, 1 mM H2O2’ye ait, pH 6; zemine ait, 1 mM H2O2’ye ait, pH 9; zemine ait, 1 mM H2O2’ye ait CV’ler GCE ile farklı pH’lerde H2O2 varlığında elde edilen eğriler (Şekil 4.10) incelendiğinde, zemin eğrilerinde pH’ye bağımlı olarak -730 ile -990 mV potansiyelleri arasında ortaya çıkan katodik akım bölgelerinin H2O2 eklenmesinden sonra da değişmediği, dolayısıyla GCE ile H2O2’ye karşı duyarlılık elde edilemeyeceği görüldü. H2O2 tayini için farklı elektrolit ve çalışma elektrotlarıyla LSV ve CV yöntemleri ile yapılan optimizasyon çalışmalarında H2O2’ye ait en duyarlı ve kullanışlı pikler, PtE ile anodik bölgede pH 3 BRT içerisinde elde edildi ve bu koşullarda bir enzim sensörü hazırlanabileceği öngörüldü. Ancak olası oksalik asit girişimi incelenmeden enzimatik sensörün çalışma pH’si direk bu pH olarak benimsenmedi. 47 4.1.2. Oksalik asit ile yapılan çalışmalar Zayıf bir asit olan oksalik asit sulu çözeltilerinde, oksalik asit/bioksalat/oksalat dengesini oluşturmaktadır (4.3, 4.4). Oluşan oksalat, oksalat oksidaz enzimi ile parçalanarak H2O2 oluşumuna neden olmaktadır. H2O2’nin çalışma elektrotunun yüzeyindeki elektrokimyasal reaksiyonu sonucu oksalat miktarı tayin edilebilmektedir. - + -2 H2C2O4 + H2O HC2O4 + H3O Ka: 5,6.10 (4.3) - -2 + -5 HC2O4 + H2O C2O4 + H3O Ka: 5,42.10 (4.4) Buradaki temel endişe, oksalik asit–oksalat dengesi sonucu sulu çözeltide dengedeki oksalat türlerinin, H2O2 yükseltgenme piki ile girişim yapıp yapmadığıdır. Bu amaçla geniş bir pH aralığında ve farklı çalışma elektrotları kullanılarak oksalik asitin elektrokimyasal davranışı incelenmiştir. Bu amaçla çalışmalarda, oksalik asitin yükseltgenme ve indirgenme davranışını incelemek için farklı pH’lerdeki BRT çözeltileri ile PtE ve Civa Damla Elektrot (HDME) çalışma elektrotları denenmiştir. 4.1.2.1. Oksalik asit için HDME ile yapılan çalışmalar Platin elektrot ile incelenme imkanının bulunmadığı geniş katodik potansiyel bölgelerinde (-500 ile -2000 mV), HDME ile pH 3, pH 6 ve pH 9 BRT içerisinde 25 mM, 50 mM ve 100 mM oksalik asit içeren çözeltilerde, 50 mV/s ve 100 mV/s tarama hızları ile LSV tekniği kullanılarak oksalik asitin katodik bölgedeki elektro aktifliği incelendi. Şekil 4.11, Şekil 4.12, Şekil 4.13; pH 3, pH 6 ve pH 9 BRT’de 100 mM oksalik aside ait LSV eğrilerini göstermektedir. 48 Şekil 4.11. pH 3 BRT içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen LSV’ler, 100 mV/s tarama hızında; zemine ait, 100 mM oksalik asite ait, 50 mV/s tarama hızında; zemine ait, 100 mM oksalik asite ait LSV’ler Şekil 4.12 pH 6 BRT içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen LSV’ler, 100 mV/s tarama hızında; zemine ait, 100 mM oksalik asite ait, 50 mV/s tarama hızında; zemine ait, 100 mM oksalik asite ait LSV’ler Şekil 4.13. pH 9 BRT içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen LSV’ler, 100 mV/s tarama hızında; zemine ait, 100 mM oksalik asite ait, 50 mV/s tarama hızında; zemine ait, 100 mM oksalik asite ait LSV’ler 49 Yapılan LSV çalışmalarından elde edilen eğriler incelendiğinde (Şekil 4.11, Şekil 4.12, Şekil 4.13), çözeltide 100 mM oksalik asidin bulunduğu koşullarda bile BRT’de pH 3 ile pH 9 arasında oksalik asidin indirgenmesine ait bir pik gözlenmedi. BRT’de pH 3 ile pH 9 arasında yapılan çalışmaların ardından, nötral koşullarda (0,2 M KNO3) oksalik asidin LSV ve DPV teknikleri kullanılarak elektro aktif olup olmadığı incelendi. KNO3 içerisinde LSV ve DPV teknikleri kullanılarak 1 mM, 2 mM ve 4 mM oksalik asit ile yapılan çalışmalarda, katodik bölgede -1520 mV potansiyelde, zeminde var olmayıp oksalik asit eklemeleri sonucu oluşan, bir indirgenme piki oluştuğu ve oluşan pikin artan oksalik asit derişimi ile düzenli bir şekilde büyüdüğü gözlendi (Şekil 4.14). Şekil 4.14. 0,2 M KNO3 içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen LSV’ler, zemine ait, 1 mM, 2 mM, 4 mM oksalik asite ait LSV’ler Oksalik asitin 0,2 M KNO3 içerisinde -1520 mV potansiyelde indirgenme piki gözlemlendikten sonra oksalik asitin bu koşullarda gözlenebileceği minimum derişim değeri, yapılan DPV çalışmaları ile belirlendi (Şekil 4.15). 50 Şekil 4.15. 0,2 M KNO3 içerisinde HDME ile oksalik asit için katodik bölgede elde edilen DPV’ler, zemine ait, 0,2 mM, 0,4 mM, 0,7 mM, 1 mM, 2 mM, 4 mM oksalik asite ait DPV eğrileri Şekil 4.15’deki DPV eğrileri incelendiğinde, LSV çalışmalarına benzer şekilde, katodik bölgede -1520 mV’ta yayvan olarak büyüyen bir indirgenme piki elde edildiği görülmektedir. Yapılan çalışmalarda KNO3 içerisinde oksalik asite ait en küçük gözlenebilir pik akım değeri, 0,2 mM oksalik asit derişimi için belirlendi. HDME ile yapılan çalışmalar sonucunda elde edilen eğriler incelendiğinde, oksalik asitin sadece nötral koşullarda indirgenme eğilimi gösterdiği ve artan derişim değeri ile oksalik asitin katodik bölgedeki indirgenme pikinin düzenli olarak büyüdüğü belirlendi. Diğer pH değerlerinde (pH 3, pH 6, pH 9) ise oksalik asitin indirgenmediği belirlendi. 4.1.2.2. Oksalik asit için PtE ile yapılan çalışmalar PtE ile oksalik asitin anodik bölgedeki elektro aktifliğini ve H2O2 pikleri ile girişimini incelemek amacıyla hem tamponlanmamış oksalik asit çözeltileri hem de oksalik asit eklemeleri sonucu pH değişiminden kuşkulanıldığı için tamponlu oksalik asit çözeltileri ile çalışmalar yapıldı. 51 a-) Tamponlanmamış oksalik asit ile yapılan çalışmalar Tamponlanmamış oksalik asit ile ilgili çalışmalar hem µM hem de mM düzeyde oksalik asit içeren çözeltilerde oksalik asitin elektro aktifliğinin ve H2O2 ile olan girişiminin incelenmesine dayanmaktadır. Bu nedenle, öncelikle H2O2 için en iyi piklerin elde edildiği pH 3 BRT’de CV ve Time–Base (sabit potansiyelde akımın zamanla değişimi) teknikleri kullanılarak çalışmalar yapıldı. Şekil 4.16’da elde edilen CV eğrileri incelendiğinde, pH 3 BRT’de µM derişim düzeylerindeki oksalik asit çözeltileri için herhangi bir pik oluşumu gözlenmemiş, oluşan eğrilerin zemin eğrisi ile birebir örtüştüğü gözlenmiştir. Bu nedenle, oksalik asitin µM derişim düzeylerinde pH 3 BRT’de elektro aktif davranmadığına karar verilmiş, ancak yine de H2O2 ile girişim yapıp yapmadığı CV ve Time–Base çalışmaları ile incelenmiştir. Şekil 4.16. PtE ile pH 3 BRT içerisinde µM derişim düzeyindeki oksalik asite ait CV’ler, zemine ait, 5 µM, 10 µM, 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM oksalik asite ait CV eğrileri 52 Şekil 4.17. PtE ile 50 µM oksalik asit içeren pH 3 BRT içerisinde farklı derişimdeki H2O2’ye ait CV’ler, zemine ait, 1 mM, 2 mM, 3 mM H2O2’ye ait CV eğrileri Şekil 4.17’deki CV eğrileri incelendiğinde, zemin elektrolitinde var olan 50 µM oksalik asite ait herhangi bir pik oluşumu gözlenmedi. Daha sonra seri eklemeler yapılarak ölçümleri alınan 1 mM, 2 mM ve 3 mM H2O2 için, daha önce de +925 mV potansiyel değerinde gözlenen anodik bölgedeki yükseltgenme pikinin, derişimin artmasıyla düzenli bir şekilde arttığı belirlendi. Sonuç olarak, oksalik asidin H2O2 piki ile girişim veya herhangi bir bozucu etki yapmadığı gözlendi. Yapılan Time–Base çalışmasında (Şekil 4.18), pH 3 BRT’de H2O2’ye ait anodik bölgedeki yükseltgenme pik potansiyeli +925 mV olduğundan, çalışma hücresine uygulanan potansiyel değeri de +925 mV olarak benimsendi. Yapılan çalışmada, sabit potansiyelde akımın zamanla değişimi incelenirken, ilk 500 sn de çözeltinin başlangıç akımının dengelenmesi beklendi. Daha sonra 500 s’lik periyotlar ile art arda üç defa 10’ar µM oksalik asit eklendi, ardından 500 s’lik periyotlarla art arda iki kez 1’er mM H2O2 ve son olarak yine 500 s’lik periyotlar ile üç defa 10’ar µM oksalik asit eklenerek sabit potansiyelde akımın zamanla değişimi gözlendi. Şekil 4.18’de elde edilen Time–Base grafiği incelendiğinde, pH 3 BRT’de, µM derişim düzeyindeki oksalik 53 asitin, H2O2’nin yükseltgendiği potansiyel değeri olan +925 mV potansiyel değerinde, yükseltgendiğini gösteren bir basamak oluşumu (akım artışı) gözlenmezken, mM derişim düzeylerindeki H2O2 eklemeleri ile H2O2’nin yükseltgendiğini gösteren basamak oluşumu gözlendi. Sonuç olarak, µM derişim düzeyindeki oksalik asitin mM derişim düzeyindeki H2O2’ye bir girişim etkisinin olmadığı belirlendi. 10 µM oksalik asit 1 mM H2O2 1 mM H2O2 10 µM oksalik asit Şekil 4.18. PtE ile µM derişim düzeyindeki oksalik asit ve mM derişim düzeyindeki H2O2’ye ait Time–Base grafiği, Euyg : +925 mV µM derişimli oksalik asitin çözeltide var oluşunun H2O2 pikleri üzerine herhangi bir bozucu etkisinin olmadığı belirlendikten sonra, H2O2 için en duyarlı akım yanıtlarının elde edildiği pH 3 BRT’de, mM düzeyde oksalik asit içeren ve mM düzeyde hem oksalik asit hem de H2O2 içeren çözeltilerle, oksalik asitin H2O2 pikleri üzerine girişim etkisi yapılan CV çalışmaları ile incelendi. Şekil 4.19, pH 3 BRT’de mM derişim düzeyindeki oksalik asit çözeltilerine ait CV eğrilerini göstermektedir. 54 Şekil 4.19. PtE ile pH 3 BRT içerisinde farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler, zemine ait, 1 mM, 2 mM, 3 mM oksalik asite ait CV eğrileri Şekil 4.19 incelendiğinde, mM düzeylerdeki oksalik asitin pH 3 BRT içerisinde, katodik bölgede herhangi bir pik oluşumu gözlenmezken anodik bölgede ise H2O2’nin yükseltgendiği potansiyel değeri olan +925 mV potansiyel değerinde artan derişimle birlikte düzenli olarak büyüyen bir yükseltgenme piki oluşturduğu gözlendi. Bunun üzerine yapılan CV çalışmasında oksalik asit ile H2O2 piklerinin girişimleri gözlenmeye çalışıldı. Şekil 4.20. PtE ile pH 3 BRT içerisinde oksalik asit ve H2O2’ye ait CV’ler, zemine ait, 3 mM oksalik asite ait, 3 mM oksalik asit + 1 mM H2O2 ye ait CV eğrileri 55 Şekil 4.20 incelendiğinde, bu iki maddeye ait anodik bölgedeki yükseltgenme piklerinin +925 mV potansiyel değerinde girişim yaptıkları gözlendi. H2O2’nin ve oksalik asitin piklerinin girişim etkileri, yapılan Time–Base çalışması ile de gösterilmeye çalışıldı (Şekil 4.21). Bu amaçla yapılan Time–Base çalışmasında, pH 3 BRT’de H2O2’ye ait anodik bölgedeki yükseltgenme pik potansiyeli +925 mV olduğundan, çalışma hücresine uygulanan potansiyel değeri de +925 mV olarak benimsendi. İlk 500 sn akımın dengelenmesi beklenildikten sonra 500 s’lik periyotlarla üç defa 1 mM oksalik asit, iki defa da 1 mM H2O2 eklenerek çalışma tamamlandı. 1 mM oksalik 1 mM asit H2O2 1 mM oksalik 1 mM asit H2O2 1 mM oksalik asit Şekil 4.21. PtE ile mM düzeydeki oksalik asit ve H2O2’ye ait Time–Base grafiği, Euyg: + 925 mV Şekil 4.21 incelendiğinde, pH 3 BRT’de +925 mV sabit potansiyelde hem oksalik asit hem de H2O2 eklemelerine karşı duyarlılık elde edildi. Yapılan CV ve Time–Base çalışmaları sonucunda, H2O2 için uygunluğu belirlenmiş bu çalışma koşullarında µM derişim düzeylerinde oksalik asitin mM derişim düzeylerindeki H2O2 pikleri üzerine herhangi bir girişimi gözlenmezken, mM derişim 56 düzeylerindeki oksalik asit ile mM derişim düzeylerindeki H2O2’nin yükseltgenme piklerinin pH 3 BRT’de girişim yaptığı gözlendi. pH 3 BRT çalışma koşullarında hazırlanacak olan bir enzimatik sensör üzerinde hem H2O2 hem de oksalik asitin akım değişimine yol açacağı ve dolayısıyla ölçümlerin hatalı olabileceği düşünülerek bu koşullarda hazırlanacak bir enzimatik sensörün seçiciliğinin arttırılması, oksalik asit ve oksalat türlerinden etkilenmeyecek çalışma koşullarının belirlenmesi hedeflendi. Elde edilen bu sonucun ardından, oksalik asitin PtE elektrot üzerinde duyarlılık göstermediği pH’yi belirlemek amacıyla CV tekniği kullanılarak pH tarama çalışmaları yapıldı. Tamponlanmamış oksalik asit çözeltileri PtE ile BRT çözeltisinde pH 3 ile pH 9 arasında, H2O2 ile olan girişim etkilerini incelemek amacıyla 1 mM, 2 mM, 3 mM, 6 mM ve 10 mM oksalik asit çözeltileri ile CV çalışmaları yapıldı. Şekil 4.22. PtE ile pH 6,5 BRT içerisinde farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler, zemine ait, 3 mM, 6 mM, 10 mM oksalik asite ait CV eğrileri Şekil 4.19 ve Şekil 4.22 incelendiğinde, oksalik asit için her iki grafikte de katodik bölgede herhangi bir pik oluşumu gözlenmezken, anodik bölgede hem pH 3 hem de pH 6,5’te oksalik asite ait yükseltgenme pikleri gözlenmiştir. Bu pikler ve akım büyüklükleri incelendiğinde, pH 3’te +925 mV potansiyel değerinde olan oksalik asitin anodik bölgedeki yükseltgenme piki pH 6,5’e çıkarıldığında pik potansiyelinin +830 mV potansiyel değerine kaydığı görülmüştür. Ayrıca pH 3’te 3 mM oksalik asite karşı 57 elde edilen akım büyüklüğünün, pH 6,5’te neredeyse 10 mM oksalik asite karşılık geldiği gözlenmiştir. pH değerinin pH 3’ten pH 6,5’e çıkarılması sonucu oksalik asite ait anodik bölgedeki yükseltgenme piki potansiyelinin indirgen potansiyel bölgesine doğru bir miktar kaydığı ve artan pH değeriyle oksalik asitin duyarlılığının azaldığı belirlenmiştir. Elde edilen bu bilgiler doğrultusunda oksalik asidin duyarlılık göstermediği pH’yi belirlemek için nötral pH bölgesinde (Şekil 4.23) ve hafif bazik pH bölgesinde (Şekil 4.24) çalışmalar sürdürülmüştür. Şekil 4.23. PtE ile pH 7,6 BRT içerisinde farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler, zemine ait, 3 mM, 6 mM, 10 mM oksalik asite ait CV eğrileri Şekil 4.23 ve Şekil 4.24’deki eğriler incelendiğinde, Şekil 4.19 ve Şekil 4.22’den elde edilen sonuçlara benzer şekilde, oksalik asitin pik potansiyelinde indirgen potansiyel bölgesine doğru bir miktar kayma ve artan pH ile duyarlılığında azalma gözlenmiştir. pH 6,5’te oksalik asitin anodik bölgedeki yükseltgenme pik potansiyeli +830 mV iken pH’nin pH 7,6’ya çıkarılmasıyla aynı pikin pik potansiyeli +800 mV’a kaymıştır. pH’nin 8,2’ye getirilmesi ise oksalik asitin PtE yüzeyindeki duyarlılığını tamamen kaybetmesine neden olmuş ve oksalik asite ait bir yükseltgenme piki gözlenmemiştir. 58 Şekil 4.24. PtE ile pH 8,2 BRT içerisinde farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler, zemine ait, 3 mM, 6 mM, 10 mM oksalik asite ait CV eğrileri Şekil 4.25, 10’ar mM oksalik asit içeren pH 6,5, pH 7,6 ve pH 8,2 BRT’da oksalik asitin pik potansiyelinin ve duyarlılığının değişimini göstermektedir. Şekil 4.25. PtE ile aynı derişime sahip farklı pH’lerdeki oksalik asit çözeltilerinden elde edilen CV’ler, pH 6,5; 10 mM oksalik asite ait, pH 7,6; 10 mM oksalik asite ait, pH 8,2; 10 mM oksalik asite ait CV eğrileri Oksalik asitin duyarlılık göstermediği pH belirlendikten sonra, oksalik asitin bu pH’de H2O2 ile olan girişim etkisi incelendi. Bunun için, önce zemin çözeltisi üzerine 10 mM 59 oksalik asit ardından 1 mM, 2 mM, 3 mM H2O2 eklenerek bir CV çalışması (Şekil 4.26) , sonra 3 mM H2O2 üzerine 10 mM oksalik asit eklenerek bir başka CV çalışması (Şekil 4.27) yapıldı. Şekil 4.26. PtE ile pH 8,2 BRT + 10 mM oksalik asit içerisinde farklı derişimlerdeki H2O2’ye ait CV’ler, zemine ait, 1 mM, 2 mM, 3 mM H2O2’ye ait CV eğrileri Şekil 4.26 incelendiğinde, pH 8,2’de 10 mM oksalik asit içeren çözelti içerisinde oksalik asitin H2O2 piklerini bozucu veya arttırıcı bir etkisinin olmadığı, H2O2 piklerinin +525 mV potansiyelde gözlendiği ve artan derişim ile piklerin düzenli bir şekilde büyüdüğü görülmektedir. Şekil 4.27 incelendiğinde, çözelti içerisine oksalik asit ilavesi sonucu pH’de bir değişme olduğu (pH 8,2’den pH 6,3’e), pH 8,2’de H2O2 yükseltgenme pikinin aslında +400 mV değerinde iken oksalik asit ilavesi sonucu bu pikin +525 mV potansiyele kaydığı görülmüştür. Oksalik asit ilavesi sonucu yükseltgenme pikinin büyüklüğünde ve yapısında bir değişim oluşmadığı, iki pikin de sadece H2O2 yükseltgenme piki olduğu, oksalik asitin H2O2 piklerini bozucu veya arttırıcı bir etkisinin olmadığı yapılan çalışmalar ile belirlenmiştir. 60 Şekil 4.27. PtE ile pH 8,2 BRT içerisinde farklı derişimde oksalik asit ve H2O2’ye ait CV’ler, 3 mM H2O2’ye ait, 3 mM H2O2 + 10 mM oksalik asite ait, pH’si düzeltilmiş 3 mM H2O2 + 10 mM oksalik asite ait CV eğrileri Yapılan çalışmalar sonucunda, oksalik asitin anodik bölgede PtE üzerindeki duyarlılığının artan pH ile azaldığı belli bir pH değerine gelindiğinde (pH 8,2) ise duyarlılık göstermediği gözlendi. Ayrıca, oksalik asit ilaveleri ile pH değiştiğinden enzimatik süreçte H2O2 oluşumu için çözeltiye eklenen her oksalik asit ilavesi ile pH, dolayısıyla H2O2’ye ait pik potansiyeli ve duyarlılık değişeceğinden tampon çözelti derişimi arttırılarak pH değişimi önlenmeye çalışıldı. Çizelge 4.1. Tampon çözelti derişiminin pH değişimi üzerine etkisi Tampon çözelti derişimi İlk pH değeri Eklenen miktar Son pH değeri (Molar) 10 mM oksalik 0,04 8,20 6,30 asit 10 mM oksalik 0,08 8,20 7,10 asit 10 mM oksalik 0,2 8,20 7,50 asit 61 Çizelge 4.1 BRT derişiminin pH değişimi üzerine etkisini göstermektedir. Çizelge 4.1 incelendiğinde, BRT derişiminin iki katına ardından da beş katına çıkarılmasıyla pH değişiminin azaldığı ancak yine de kayda değer bir değişim olduğunu görülmektedir. Elde edilen bu sonuç ile pH değişimin olmaması için daha derişik BRT ile çalışılması gerektiği belirlenmiştir. Ancak tampon derişimi arttırılsa bile artan oksalik asit derişimi ile (> 10 mM) pH değişimi olacağı açıkça görülmektedir. Elde edilen bu bilgiler doğrultusunda, oksalik asit eklemeleri sonucu pH’nin değişiminden kaynaklanacak hataları engellemek için tamponlanmış oksalik asit çözeltileri ile pH tarama çalışmaları yapılmasının daha uygun olacağı ön görüldü. b-) Tamponlanmış oksalik asit ile yapılan çalışmalar Tamponlanmamış oksalik asit için pH 8,2 BRT’de 10 mM oksalik asit ilavesi ile pH’nin 6,3’e düştüğü belirlendi. Bu bilgi vasıtasıyla, tamponlanmış oksalik asit çözeltisinde oksalik asitin pH 6,3 veya civarlarında duyarlılık göstermeyeceği öngörüldü. Bu yüzden, pH 6 ve pH 6,5 arasında oksalik asitin PtE üzerindeki duyarlılığını belirlemek ve H2O2 girişim etkisini incelemek amacıyla CV çalışmaları gerçekleştirildi. Şekil 4.28, pH 6’da oksalik asitin elektro aktifliğini belirleme çalışmalarını göstermektedir. Şekil 3.28 incelendiğinde, pH 6’da oksalik asite ait +800 mV potansiyel değerinde bir yükseltgenme piki elde edilmiş ve artan oksalik asit derişimi ile yükseltgenme pikinin büyüdüğü görülmüştür. Oksalik asitin bu pH’de 10 mM ve üzerindeki derişim değerlerinde PtE üzerinde duyarlı olduğu belirlenmiştir. Çalışılan pH değerinde oksalik asite karşı duyarlılık elde edilmesine rağmen oksalik asit ve H2O2’nin girişim etkileri yapılan CV çalışmaları ile incelendi (Şekil 4.29). 62 Şekil 4.28. PtE ile pH 6 BRT’de farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler, zemine ait, 10 mM ve 11 mM oksalik asite ait CV eğrileri Şekil 4.29. PtE ile pH 6 BRT’de farklı derişimlerdeki oksalik asit ve H2O2’ye ait CV’ler, zemine ait, 11 mM oksalik asite ait, 11 mM oksalik asit + 1 mM H2O2’ ye ait, 12 mM oksalik asit + 1 mM H2O2’ye ait, 12 mM oksalik asit + 2 mM H2O2’ye ait CV eğrileri Şekil 4.29 incelendiğinde, oksalik asit üzerine H2O2 eklenmesiyle iki bileşiğe ait yükseltgenme pikinin de +730 ile +800 mV potansiyel değerleri arasında bir pikin üzerindeki iki ayrı yükseltgenme bölgesi şeklinde oluştuğu gözlendi. Bu iki bileşikten 63 herhangi birinin artan derişimi ile derişimi artan bileşiğin yükseltgenme pikinin sivrilip daha belirgin hale gelirken diğer pikin gözlenebilirliğinin azaldığı ve piklerin birbirinden tam olarak ayrışmadığı görüldü. Bu yüzden oksalik asitin daha yüksek derişimlerde bile elektro aktif olmayacağı düşünülen pH 6,5 BRT’de CV çalışmaları yapıldı. Tamponlanmış oksalik asit ile pH 6,5 BR tamponunda yapılan çalışmalarda ise oksalik asite karşı 40 mM derişime kadar duyarlılık gözlenmediği, 50 mM derişime çıkıldığında ise +750 mV potansiyelde oksalik asite ait bir yükseltgenme piki oluştuğu gözlendi. Şekil 4.30’da, pH 6,5 BRT’de 10–50 mM derişim aralığında oksalik asit için elde edilmiş CV eğrileri görünmektedir. Şekil 4.30. PtE ile pH 6,5 BRT’de farklı derişimlerdeki oksalik asite ait CV’ler, zemine ait, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM oksalik asit çözeltilerine ait CV eğrileri Oksalik asitin pH 6,5’teki duyarlılığı belirlendikten sonra H2O2 ile olan girişim etkisini belirlemek için CV çalışmaları yapıldı. Şekil 4.31, pH 6,5 BRT’de oksalik asit ile H2O2’nin girişim etkisini göstermektedir. 64 Şekil 4.31. PtE ile pH 6,5 BRT’de farklı derişimlerdeki oksalik asit ve H2O2’ye ait CV’ler, zemine ait, 50 mM oksalik asite ait, 50 mM oksalik asit + 1 mM H2O2’ye ait, 50 mM oksalik asit + 2 mM H2O2’ye ait, 50 mM oksalik asit + 3 mM H2O2’ye ait CV eğrileri Şekil 4.31 incelendiğinde, oksalik asit üzerine H2O2 eklenmesiyle iki bileşiğe ait yükseltgenme pikinin +530 ile +750 mV potansiyel değerleri arasında bir pikin üzerindeki iki ayrı yükseltgenme bölgesi şeklinde oluştuğu gözlendi. Oksalik aside ait yükseltgenme pikinin +750 mV, H2O2’ye ait yükseltgenme pikinin ise +530 mV potansiyelde ortaya çıktığı belirlendi. pH 6,5 BRT’de oksalik asit ile H2O2 girişim etkisini daha detaylı incelemek ve pH 6,5’te iki bileşiği sabit potansiyel uygulanarak birbirinden farklandırmanın mümkün olup olmadığını incelemek amacıyla Time–Base çalışmaları yapıldı. Yapılan ilk Time–Base çalışmasında zemin çözeltisi olarak pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit olarak seçildi ve bu çözeltinin üzerine belli derişimlerde oksalik asit ve H2O2 eklemeleri her bir ekleme arası 100 s olacak şekilde yapıldı. Uygulanan potansiyel pH 6,5 BRT’de H2O2’nin yükseltgenme potansiyeli olan +530 mV olarak seçildi. 65 2 mM oksalik asit 2 mM oksalik asit 1 mM H2O2 1 mM H2O2 1 mM H2O2 2 mM H2O2 Şekil 4.32. PtE ile pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit çözeltisi içerisinde H2O2 ve oksalik asite ait akım basamaklarını gösteren Time–Base grafiği, Euyg: +530 mV Şekil 4.32 incelendiğinde, zemin çözeltisi olan pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit çözeltisinde ilk 100 s boyunca sabit potansiyelde zemin çözeltisine ait akım değerinin sabitlenmesi beklendi. Zemin akımının µA seviyesinden çok daha düşük oluşu (4 nA) zemin çözeltisindeki herhangi bir bileşenin yükseltgenmediğini göstermektedir. Daha sonra yapılan H2O2 eklemelerinde ise akım basamağı oluşumu ve basamak büyüklüklerinin derişimle orantılı olarak büyüdüğü gözlenmiştir. Yapılan oksalik asit eklemeleri ile herhangi bir akım basamağı oluşumu gözlenmemiştir. Elde edilen bu sonuçlar vasıtasıyla, oksalik asit ile H2O2’nin pH 6,5 BRT’de +530 mV sabit potansiyelde herhangi bir girişim yapmadığı belirlenmiştir. Ancak yine de mM derişim düzeyindeki oksalik asitin µM derişim düzeylerindeki H2O2’ye etkisi olup olmadığı yapılan ikinci bir Time–Base çalışması ile incelenmiştir (Şekil 4.33). Yapılan çalışmada bir öncekine benzer şekilde, zemin çözeltisi olarak pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit olarak seçildi ve bu çözeltinin üzerine µM derişim düzeylerinde H2O2 eklemeleri her bir ekleme arası 100 s olacak şekilde yapıldı. Uygulanan potansiyel, pH 6,5 BRT’de H2O2’nin yükseltgenme potansiyeli olan +530 mV olarak seçildi. 66 1 µM H2O2 1 µM 1 µM H2O2 H2O2 2 µM H2O2 2 µM H2O2 Şekil 4.33. PtE ile pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit çözeltisi içerisinde µM derişim düzeylerindeki H2O2 için elde edilen akım basamaklarını gösteren Time–Base grafiği, Euyg: +530 mV Şekil 4.33 incelendiğinde, Şekil 4.32’dekine benzer şekilde pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit çözeltisinde ilk 100 s boyunca sabit potansiyelde zemin çözeltisine ait akım değerinin sabitlenmesi beklendi. Zemin akımının 4 nA değerinde oluşu zemin çözeltisindeki herhangi bir bileşenin yükseltgenmediğini göstermektedir. Daha sonra eklemeleri yapılan H2O2’nin akım basamakları oluşturduğu ve basamak büyüklüklerinin derişim ile doğru orantılı olarak büyüdüğü görülmektedir. pH 6,5 BRT’de yapılan 4 Time–Base çalışmaları H2O2’nin çözeltide oksalik asite göre 1:5.10 derişim oranında olduğu durumlarda bile oksalik asit girişiminden etkilenmediğini ve pH 6,5’de kolaylıkla analizlenebileceğini göstermektedir. Sonuç olarak, pH 6,5’te enzimatik sensörün hazırlanabileceği ve oksalik asit girişiminin pH optimizasyonu ile engellendiği yapılan çalışmalar ile belirlenmiştir. H2O2 için uygunluğu gösterilmiş olan bu pH koşullarında H2O2’ye ait bir kalibrasyon grafiği oluşturulması amaçlandı ve DPV tekniği ile daha yüksek duyarlık elde edileceği öngörülerek H2O2 için DPV tekniği kullanılarak bir kalibrasyon grafiği hazırlama 67 çalışmaları yapıldı. Öncelikle DPV tekniğinde, potansiyel uygulama işleminde duyarlılığı belirleyen, puls yüksekliği (amplitude) ve potansiyel basamak büyüklüğü (step) parametreleri optimize etme çalışmaları yapıldı. Önce puls yüksekliği (amplitude) default değeri olan 25 mV değerindeyken 4, 7, 10 mV (basamak) step büyüklüğü değerleriyle 2 mM H2O2 çözeltisi ile çalışıldı. Çalışılan step değerlerinden en iyi sonuç step 7 mV ve 10 mV’ta gözlendi, ancak step 10 mV iken tarama hızı çok yükseldiğinden tekrarlanır sonuçlar elde edilemedi ve step değeri 7 mV olarak seçildi. Puls yüksekliği (amplitude) için 25, 50, 75 mV ile denemeler yapıldı, bu değerin büyümesi ile pik akımının da büyüdüğü ve 75 mV değerinde en iyi pik yüksekliğinin elde edildiği belirlendi. Yapılan çalışmalar sonucu puls yüksekliği olarak 75 mV, basamak büyüklüğü olarak ise 7 mV seçildi. Şekil 4.34 ve Şekil 4.35 step ve amplitude değerlerini belirleme çalışmaları ile ilgili DPV eğrilerini göstermektedir. Şekil 4.34. PtE ile yapılan amplitude Şekil 4.35. PtE ile yapılan step seçimini seçimini gösteren DPV eğrisi, amplitude gösteren DPV eğrisi, step 7 mV 5 0 mV default değerindeyken, zemine ait; değerindeyken zemine ait; amplitude step 4 mV, step 7 mV, step 10 mV ve 25 mV, amplitude 50 mV, amplitude 2 mM H2O2’ye ait; step 4 mV, step 7 75 mV ve 2 mM H2O2’ye ait; m V, step 10 mV DPV eğrileri amplitude 25 mV, amplitude 50 mV, amplitude 75 mV DPV eğrileri 68 DPV tekniği ile belirlenen çalışma koşullarında kalibrasyon grafiği hazırlamak amacıyla elde edilen eğrilerin derişimle değişimi, küçük derişim bölgesi için 0,1–0,9 μM aralığında H2O2 çözeltileri ile çalışılırken, yüksek derişim bölgesindeki doğrusallığı göstermek amacıyla 1,0–10,0 mM derişim aralığında üç tekrarlı olarak çalışılmıştır. Şekil 4.36 pH 6,5 BRT’de küçük derişim bölgesi için 0,1–0,9 µM derişim aralığında H2O2 çözeltilerine ait DPV eğrilerini göstermektedir. Elde edilen eğriler incelendiğinde artan H2O2 derişimi ile DPV eğrilerinin pik büyüklüklerinin de düzenli bir şekilde büyüdüğü görülmektedir. Şekil 4.36. PtE ile pH 6,5 BRT’de Şekil 4.37. PtE ile pH 6,5 BRT’de H2O2 için küçük derişim bölgesi H2O2 için büyük derişim bölgesi kalibrasyon grafiği hazırlama kalibrasyon grafiği hazırlama çalışması, zemine ait, 100 µM, 200 çalışması, zemine ait, 1 mM, 2 mM, 3 µM, 300 µM, 500 µM, 700 µM, 900 mM, 5 mM, 7 mM, 10 µM H2O2’ye µM H2O2’ye ait DPV eğrileri ait, DPV eğrileri Şekil 4.37 pH 6,5 BRT’de yüksek derişim bölgesi için 1,0–10,0 mM derişim aralığında H2O2 çözeltilerine ait DPV eğrilerini göstermektedir. Elde edilen eğriler incelendiğinde, artan H2O2 derişimi ile DPV eğrilerinin pik büyüklüklerinin de düzenli bir şekilde büyüdüğü görülmektedir. 69 Şekil 4.36 ve Şekil 4.37’den elde edilen eğriler vasıtasıyla hesaplanan pH 6,5 BRT’de H2O2’ye ait anodik bölgedeki yükseltgenme pik akımları derişime karşı grafiğe geçirildiğinde, elde edilen kalibrasyon grafiğinin çalışılan konsantrasyon bölgesinde yeterince doğrusal olduğu Şekil 4.38’deki kalibrasyon grafiğinden anlaşılmaktadır. Elde 2 edilen grafiğin korelasyon katsayısı, R = 0,984 olarak bulunmuştur. Çizelge 4.2 pH 6,5 BRT’de DPV tekniği ile yapılan kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmalarında derişimlere karşılık ölçülen akım değerlerini göstermektedir. Çizelge 4.2. pH 6,5 BRT’de yapılan kalibrasyon grafiği çalışmasında derişimlere karşı elde edilen akım değerleri Konsantrasyon 1. Ölçüm 2.Ölçüm 3.Ölçüm Ortalama Standart Sapma (mM) (µA) (µA) (µA) (µA) (µA) 0 -1,750 -1,755 -1,740 -1,748 0,008 0,1 -1,861 -1,875 -1,837 -1,858 0,019 0,2 -2,060 -1,938 -1,920 -1,973 0,076 0,3 -2,550 -2,467 -2,418 -2,478 0,067 0,5 -3,330 -3,152 -3,152 -3,211 0,103 0,7 -3,950 -3,920 -3,814 -3,895 0,071 0,9 -4,584 -4,584 -4,584 -4,584 0,000 1 -5,116 -5,028 -4,939 -5,028 0,089 2 -7,910 -7,650 -7,600 -7,720 0,166 3 -11,240 -11,780 -11,670 -11,563 0,285 5 -18,650 -17,930 -17,660 -18,080 0,512 7 -23,480 -23,080 -23,350 -23,303 0,204 10 -28,480 -27,630 -27,630 -27,913 0,491 pH 6,5 BRT'de H2O2 için kalibrasyon grafiği 0,000 -5,000 0 2 4 6 8 10 12 -10,000 -15,000 y = -2,807x - 2,117 R² = 0,984 -20,000 -25,000 -30,000 -35,000 Derişim ( mM ) Şekil 4.38. PtE ile pH 6,5 BRT’de H2O2’ye ait 0,1–10,0 mM derişim aralığındaki kalibrasyon grafiği 70 Akım ( µA ) Sonuç olarak enzimatik sensör hazırlanabilirliği belirlenmiş olan pH 6,5 BRT koşullarında H2O2 analizinin de yapılabileceği 0,1–10,0 mM derişim aralığında doğrusallığı belirlenen kalibrasyon grafiği ile gösterilmiştir. 4.2. UV–VIS Spektrofotometrik Çalışmalar Oksalik asit molekülünün UV-VIS spektrofotometrik özelliğini incelemek amacıyla UV–VIS bölgede spektrofotometrik çalışmalar gerçekleştirildi. Görünür bölgede herhangi bir ışın soğurumu yapmayan oksalik asitin vakum UV bölge yakınlarında oldukça yüksek bir soğuruma neden olduğu gözlenmiştir. Bu soğurumun pH ile değişimini görebilmek açısından 0,1 mM oksalik asit çözeltisinin pH 2–9 aralığında Britton-Robinson ile tamponlanmış koşullardaki spektrumları alınmıştır (Şekil 4.39). Şekil 4.39’dan da görüldüğü gibi, yapılan dalga boyu tarama çalışmalarında (190–500 nm) oksalik asite ait soğurum pikinin pH 2 ve pH 3’de 190 nm’nin de altına kaydığı, pH yükseldikçe pikin küçülerek 200 nm’nin üzerine taşındığı belirlenmiştir. Gözlenebilir olarak en iyi absorbans değeri pH 4’de ve 196 nm dalga boyunda elde edilmiştir. Bu bölgede çalışma zorluğuna karşın oksalik asit için UV bölgede soğuruma dayalı bir kalibrasyon grafiği hazırlama çalışması gerçekleştirilmiştir. Abs 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1 nm 190 200 210 220 230 240 Şekil 4.39. Farklı pH’lerdeki BRT içerisinde 0,1 mM oksalik asit çözeltilerine ait soğurum pikleri, pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9’da oksalik asite ait soğurum pikleri 71 200 nm’nin altında kullanılan kuartz küvetlerin sınırlayıcı etkisi nedeniyle tekrarlanma sorunu yaşanan çalışmada, üç tekrarlı olarak 196 nm’deki soğurum değerleri ölçülerek ortalamaları alınmış ve kalibrasyon grafiği aşağıdaki şekilde hazırlanabilmiştir. Şekil 4.40, pH 4 BRT’de farklı derişimlerdeki oksalik asite ait soğurum piklerini göstermektedir. Abs 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 nm 190 200 210 220 230 240 Şekil 4.40. pH 4 BRT ve 196 nm’de oksalik asit için yapılan kalibrasyon grafiği hazırlama çalışması, 0,1 mM, 0,07 mM, 0,05 mM, 0,03 mM, 0,01 mM, 0,007 mM, 0,005 mM oksalik asite ait soğurum pikleri Çizelge 4.3, yapılan kalibrasyon grafiği oluşturma çalışmasında derişimlere karşılık gelen soğurum değerlerini, Şekil 4.41 ise elde edilen kalibrasyon grafiğini 2 göstermektedir. Elde edilen kalibrasyon grafiği için korelasyon katsayısı, R : 0,993 olarak bulunmuştur. Çizelge 4.3. pH 4 BRT’de ve 196 nm’de farklı derişimlerdeki oksalik asite ait soğurum değerleri Ortalama Standart Derişim (µM) Ölçüm 1 (A) Ölçüm 2 (A) Ölçüm 3 (A) (A) Sapma (A) 5 0,079 0,091 0,102 0,091 0,012 7 0,090 0,105 0,116 0,104 0,013 10 0,120 0,116 0,114 0,117 0,003 30 0,166 0,180 0,185 0,177 0,010 50 0,253 0,263 0,277 0,264 0,012 70 0,340 0,325 0,332 0,332 0,008 100 0,396 0,413 0,419 0,409 0,012 72 pH 4 oksalik asit için kalibrasyon grafiği 0,450 0,400 0,350 0,300 0,250 y = 0,003x + 0,080 0,200 R² = 0,993 0,150 0,100 0,050 0,000 0 20 40 60 80 100 120 Derişim ( µM ) Şekil 4.41. Oksalik asit için pH 4 BRT’de ve 196 nm’de 5–100 µM derişim aralığında hazırlanmış kalibrasyon grafiği Oksalik asit için yapılan spektrofotometrik çalışmalar sonucunda oksalik asitin spektrofotometrik yöntemle de analizinin yapılabileceği gösterilmiş ve çizilen kalibrasyon grafiği ile tekniğin doğrusal çalışma aralığı belirlenmiştir. 4.3. Biyosensör Hazırlama Çalışmaları Enzimatik sensörün çalışma koşulları optimize edildikten sonra sensörü hazırlama çalışmalarına başlandı. Üç farklı enzim immobilizasyon yöntemi (elektrokimyasal polimerleşme, çapraz bağlama ve polimer matriks altına hapsetme) kullanılarak sensör hazırlama çalışmaları ve ardından gerçek örnek çalışması yapıldı. 4.3.1. Elektrokimyasal polimerleşme ile biyosensör hazırlama çalışmaları Elektrokimyasal polimerleşme işlemi için PtE yüzeyinde uygun potansiyel uygulandığında kolayca polimerleştiği bilinen, iyi bir iletken polimer olan ve bu işlem için çok yaygın olarak kullanılan C4H5N formül yapısında heterosiklik bir organik bileşik olan pirol düşünüldü. 73 Absorbans Elektrokimyasal polimerleşme için elde edilecek polimerik kaplamanın H2O2 ve oksalik asite olan duyarlılıklarını incelemek amacıyla öncelikle enzimsiz koşullarda çalışmalar yapıldı. 2 Yapılan çalışmada PtE (2 mm ) yüzeyinde biriken polipirol kalınlığı devreden geçen toplam yük hesaplamaları ile tespit edildi. PtE yüzeyinde 1 µm kalınlıkta polipirol 2 -3 birikimi elde etmek için devreden geçen toplam yük 450 mC/cm (9.10 C) olarak benimsendi (Ekinci ve ark. 1995). Elektrokimyasal polimerleşme için öncelikle PtE yüzeyi 0,05 µm Al2O3 ile parlatıldı. Ardından 0,1 M H2SO4 içerisinde tekrarlanır akım–potansiyel eğrileri elde edilene kadar -1 H2 ve O2 gaz çıkış sınırları arasında (-250 ile +1000 mV) 20 mVs tarama hızı ile CV çalışması yapılarak PtE yüzeyi elektrokimyasal polimerleşme işlemi için hazır hale getirildi. Daha sonra üç elektrotlu hücrede toplam hacim 10 mL olacak şekilde 0,125 M o pirol + 10 mM KCl çözeltisi içerisinde, argon atmosferi varlığında ve 25 C’de, +800 mV sabit potansiyel uygulanarak elektrokimyasal polimerleşme işlemi gerçekleştirildi. -3 Toplam yük 9.10 C değerine geldiğinde potansiyel uygulama işlemi bitirildi. Daha sonra hazırlanan polipirol kaplı PtE 12 saat boyunca pH 6,5 BRT’de bekletildi. Biriktirme işleminden önce metalik gri olan PtE yüzeyinin biriktirme işlemi sonrasında siyah bir renge dönüştüğü gözlendi. Elde edilen polipirol kaplamaları mikroskop vasıtasıyla farklı büyütme seçenekleri ile incelenip fotoğrafları çekildi. Şekil 4.42. PtE yüzeyinde Şekil 4.43. PtE yüzeyinde Şekil 4.44. PtE yüzeyinde 1 µm kalınlıktaki polipirol 1 µm kalınlıktaki polipirol 1 µm kalınlıktaki polipirol kaplaması, büyütme oranı kaplaması, büyütme oranı kaplaması, büyütme oranı x100 x200 x500 74 Şekil 4.42 PtE yüzeyini 100 kat büyütülerek, Şekil 4.43 PtE yüzeyini 200 kat büyütülerek ve Şekil 4.44 ise PtE yüzeyini 500 kat büyüterek çekilmiş fotoğrafları göstermektedir. Üç şekil de incelendiğinde yüzeyin tamamen polipirol ile kaplandığı görülmektedir. Özel olarak Şekil 4.43 incelendiğinde PtE yüzeyinde sadece metalik kısımların kaplandığı daha iyi bir şekilde görülmektedir. PtE yüzeyi 1 µm polipirol ile kaplandıktan sonra elde edilen yeni yüzeyde H2O2’nin belirlenen çalışma koşullarındaki duyarlılığını incelemek amacıyla +530 mV sabit potansiyelde pH 6,5 BRT’de Time–Base çalışması yapıldı (Şekil 4.45). Time–Base çalışmalarına başlamadan önce, elektrokimyasal polimerleşme işlemi tamamlandıktan sonra yüzeyde tam olarak polimerleşmeden kalmış dimerler, trimerler, oligomerler gibi küçük molekül kütlesine sahip moleküllerin polimer zincirine katılmaları için zemin akımı 12 nA’e düşene kadar, pH 6,5 BR tamponunda, +800 mV sabit potansiyel uygulandı. Time–Base çalışmasında zemin akımının sabitlenmesinden sonra, her bir ekleme arası 60 s olacak şekilde ayarlanarak altı kez 1 µM ve iki kez 2 µM’lık eklemeler yapılarak çalışma gerçekleştirildi. 2 µM H2O2 1 µM H2O2 1 µM H2O2 Şekil 4.45. pH 6,5 BRT’de polipirol kaplı PtE yüzeyinde H2O2 eklemelerine ait Time–Base grafiği, Euyg: +530 mV 75 Şekil 4.45 incelendiğinde, polipirol kaplı PtE elektrot yüzeyinin önceden belirlenmiş koşullarda H2O2 için oldukça duyarlı olduğu, çalışılan µM düzeydeki H2O2 çözeltilerine karşı oldukça iyi yükseltgenme basamakları oluşturduğu ve artan derişimle basamaklarında düzenli bir şekilde büyüdüğü görülmektedir. Yapılan diğer bir Time–Base çalışmasıyla, elde edilen yeni polipirol kaplı PtE elektrot yüzeyinin pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit çözeltisinde +530 mV sabit potansiyelde oksalik asitin duyarlılığını arttırıcı yönde bir katkısının olup olmadığı ve oksalik asit ile H2O2’nin olası girişim etkisi incelendi. Deney sırasında zemin akımının dengelenmesinden sonra her bir ekleme arası 60 s olacak şekilde ayarlandı ve dört kez 1 µM H2O2, iki kez 2 µM H2O2 ve üç kez 2 mM oksalik asit eklemeleri yapılarak çalışma gerçekleştirildi. 2 mM oksalik asit 1 µM H2O2 1 µM H2O2 2 µM H2O2 Şekil 4.46. pH 6,5 BRT + 50 mM oksalik asit içerisinde polipirol kaplı PtE yüzeyinde H2O2 ve oksalik asit eklemelerine ait Time–Base grafiği, Euyg: + 530 mV Şekil 4.46 incelendiğinde, ilk 60 sn zemin çözeltisinin akım değerinin sabitlenmesi (13 nA’de) için beklendi, bu süre zarfında zemin çözeltisinde bulunan oksalik aside ait 76 bir akım büyümesi gözlenmedi ve ardından yapılan H2O2 eklemelerinde H2O2’ye ait akım büyümesi gözlenirken oksalik asit eklemelerinde yine bir akım büyümesi gözlenmedi. Toplamda 56 mM oksalik asit bulunduğu pH 6,5 BRT’de +530 mV sabit potansiyelde oksalik asite karşı herhangi bir duyarlılık göstermediği gözlendi. Polipirol kaplı PtE ile yapılan Time–Base çalışmaları sonucu, hazırlanan elektrotun istenen seçicilik ve duyarlık özelliğini taşıdığı ve enzimatik sensörün bu polimerleştirme süreci ile hazırlanabileceği öngörüldü. Aynı işlem basamakları kullanılarak 1 mg, 2 mg ve 3 mg enzim içeren çözeltiler kullanılarak çalışmalar yapılıp bir enzimatik sensör oluşturulmaya çalışıldı. Aynı elektrokimyasal polimerleştirme prosedürü ile yapılan enzimatik sensör oluşturma çalışmaları sonrasında, sensörün oksalik asit ve H2O2 eklemelerine karşı duyarlılığı yapılan Time–Base çalışması ile belirlenmiş ve Şekil 4.47’de gösterilmiştir. Şekil 4.47 incelendiğinde, art arda yapılan sekiz kez 1 mM’lık oksalik asit eklemeleri sonucu bir duyarlılık elde edilemediği, art arda yapılan üç kez 1 µM’lık H2O2 eklemelerine karşı ise oldukça iyi duyarlılık elde edildiği görülmektedir. 1 µM H2O2 1 mM oksalik asit Şekil 4.47. Elektrokimyasal polimerleşme ile hazırlanan sensörün oksalik asit ve H2O2’ye olan duyarlılığını gösteren Time–Base grafiği, Euyg: +530 mV 77 Sonuç olarak, elektrokimyasal polimerleşme ile yapılan enzimatik sensör hazırlama çalışmalarında başarılı olunamamıştır. Bunun olası nedenleri; elektrokimyasal polimerleşme sırasında enzimin, molekül büyüklüğüne bağlı olarak, polimer matrik içerisine giremiyor veya girse bile aktivite göstereceği aktif uçlarını kaybediyor, yani polimer yapısına aktif uçlarından bağlanarak girdiği düşünülebilir. 4.3.2. Çapraz bağlama ile biyosensör hazırlama çalışmaları Oksalat oksidaz enziminin elektrot yüzeyine çapraz bağlama ile immobilizasyonu çalışmalarında, bu işlem için çok sık olarak kullanılan bir çapraz bağlayıcı olan H2C5O2 molekül formülüne sahip glutaraldehit ile çalışıldı. Oksalat oksidazın çapraz bağlama ile immobilizasyonu için; öncelikle pH 3,8 süksinat tamponu içerisinde 0,008 mg/µL’lik enzim çözeltisi hazırlandı. Enzim çözeltisinin 15 µL’si ile 15 µL kütlece % 2,5’luk glutaraldehit çözeltisi karıştırıldı. Hazırlanan 2 karışımdan 2 mm ’lik PtE yüzeyine 2 µL eklendi ve oda sıcaklığında kurutuldu. Sensör o kullanılmadığı zamanlarda +4 C’de ve pH 3,8 süksinat tamponunda bekletildi. Hazırlanan sensörün daha önceden belirlenmiş çalışma koşullarında (pH 6,5 BRT ve +530 mV’ta) oksalik asit eklemelerine karşı nasıl duyarlılık göstereceğinin belirlemek için Time–Base çalışması yapıldı (Şekil 4.48). 100 µM Oksalik asit 25 µM oksalik 50 µM Oksalik asit asit Şekil 4.48. Glutaraldehit ile çapraz bağlanarak hazırlanmış enzim sensörünün 25 µM, 50 µM ve 100 µM’lık oksalik aside karşı duyarlılığı 78 Şekil 4.48 incelendiğinde, hazırlanmış olan enzimatik sensörün beklendiği gibi oksalata karşı duyarlı olduğu ve artan derişim ile oluşturduğu akım basamağı büyüklerinin düzenli olarak büyüdüğü görülmektedir. Çapraz bağlama ile immobilizasyon vasıtasıyla daha önceden belirlenen koşullarda oksalat ölçümü için bir enzimatik sensör hazırlanabileceği belirlendikten sonra, hazırlanan sensörün aynı derişimdeki oksalik asit eklemelerine karşı gösterdiği duyarlılığın günden güne değişimini belirlemeye yönelik çalışmalar yapıldı. Oksalik asidin 21 gün boyunca belli aralıklar ile ölçümleri alındı ve grafiğe geçirilerek 21 günlük periyot boyunca duyarlılığının nasıl değiştiği gösterildi (Şekil 4.49). % 2,5'lik glutaraldehit ile hazırlanan sensör Zaman ( gün ) 0 5 10 15 20 25 -0,200 -0,180 -0,160 -0,140 -0,120 -0,118 -0,110 -0,120 -0,113 -0,100 -0,117 -0,080 -0,095 -0,100 -0,060 -0,060 -0,040 -0,020 0,000 Şekil 4.49. Kütlece % 2,5’lik glutaraldehit ile hazırlanmış enzimatik sensörün 50 µM’lık oksalik asite karşı duyarlılığının günden güne değişimi Şekil 4.49 incelendiğinde sensörün duyarlılığının ilk 14 gün boyunca neredeyse değişmediğini, ancak 14. ve 21. günler arasında ise sensör duyarlılığının önemli düzeyde azalma gösterdiği görülmektedir. Enzimatik sensörün duyarlılığının günden güne değişimi belirlendikten sonra, 21. gündeki duyarlılık değerinde bir kalibrasyon grafiği hazırlanarak sensörün doğrusal çalışma aralığı belirlenmeye çalışıldı. 79 Akım ( nA ) Şekil 4.50, küçük derişim bölgesi için (0,025–0,100 mM) beş tekrarlı olarak ölçüm alınmış akım basamağı oluşumlarına ait Time–Base grafiğini, Şekil 4.51 ise yüksek derişim bölgesi için (0,250–1,000 mM) beş tekrarlı olarak ölçüm alınmış akım basamağı oluşumlarına ait Time–Base grafiğini göstermektedir. 100 µM oksalik asit 25 µM oksalik asit 50 µM oksalik asit Şekil 4.50. Glutaraldehit ile hazırlanmış sensörle kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmasında 0,025 mM, 0,050 mM, 0,100 mM oksalik asit eklemelerine karşı elde edilen akım basamak büyüklükleri 1000 µM oksalik asit 250 µM oksalik asit 500 µM oksalik asit Şekil 4.51. Glutaraldehit ile hazırlanmış sensörle kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmasında 0,250 mM, 0,500 mM ve 1,000 mM oksalik asit eklemelerine karşı elde edilen akım basamak büyüklükleri 80 Çizelge 4.4, 0,025–1,000 mM derişim bölgesinde farklı derişimde oksalik asit eklemeleri sonucu oluşan akım basamağı büyüklüklerini göstermektedir. Çizelge 4.4. 0,025–1,000 mM derişim aralığında glutaraldehit ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı oluşturduğu akım basamağı büyüklükleri Derişim 1.Ölçüm 2.Ölçüm 3.Ölçüm 4.Ölçüm 5.Ölçüm Ortalama Standart (mM) (nA) (nA) (nA) (nA) (nA) (nA) Sapma (nA) 0,025 -0,030 -0,037 -0,032 -0,035 -0,029 -0,033 0,003 0,050 -0,070 -0,061 -0,064 -0,067 -0,066 -0,066 0,003 0,100 -0,116 -0,118 -0,128 -0,118 -0,113 -0,119 0,006 0,250 -0,280 -0,290 -0,270 -0,230 -0,290 -0,272 0,025 0,500 -0,520 -0,490 -0,470 -0,480 -0,460 -0,484 0,023 1,000 -0,860 -0,820 -0,810 -0,800 -0,880 -0,834 0,034 Çizelge 4.4’deki derişimlere karşılık gelen akım basamağı büyüklükleri grafiğe geçirildiğinde elde edilen kalibrasyon eğrisinden (Şekil 4.52), hazırlanmış olan enzimatik sensörün 0,025–1,00 mM derişim aralığında yeterince doğrusal yanıtlar verdiği görülmektedir. glutaraldehit ile hazırlanmış sensör 0,000 -0,100 -0,200 -0,300 y = -0,819x - 0,038 -0,400 R² = 0,992 -0,500 -0,600 -0,700 -0,800 -0,900 -1,000 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 Derişim ( mM ) Şekil 4.52. Kütlece % 2,5’lik glutaraldehit ile hazırlanmış sensöre ait 0,025–1,000 derişim bölgesindeki kalibrasyon grafiği Glutaraldehit ile yapılan çalışmalar sonucunda enzimatik oksalat sensörü hazırlanabildi ve sensörün doğrusal çalışma aralığı belirlendi. Ayrıca çizilmiş olan kalibrasyon grafiği 81 Akım ( nA ) 21. güne ait olduğundan duyarlılığı değişse bile doğrusallığın değişmediği böylece hazırlanmış sensör ile standart ekleme yöntemi kullanılarak gerçek örneklerle de çalışılabileceği belirlendi. Oksalik asit ile yapılan önceki çalışmalarda, tamponsuz oksalik asit ile çalışıldığında oksalik asit eklemeleri sonucu pH’nin düştüğü ve düşen pH ile oksalik asitin PtE elektrot üzerindeki duyarlılığının arttığı belirlenmişti. Tamponlu oksalik asit ile çalışılmasının önemini bir kez daha göstermek adına, kütlece % 2,5’lik glutaraldehit ile hazırlanmış sensör ile hem tamponlu hem de tamponsuz oksalik asit ile Time–Base çalışması yapıldı. Şekil 4.53 yapılan Time–Base çalışmasını göstermektedir. 1 mM tamponlanmamış oksalik asit 1 mM tamponlu oksalik asit 1 mM tamponlanmamış oksalik asit Şekil 4.53. Tamponlu ve tamponsuz çözeltiler kullanılarak 1 mM oksalik asite karşı elde edilen akım basamağı büyüklükleri Şekil 4.53 incelendiğinde, tamponlu oksalik asit çözeltisinden yapılan 1 mM’lık eklemelerde duyarlılığın değişmediği, tamponsuz oksalik asit çözeltisinden yapılan 1 mM’lık eklemelerde ise duyarlılığın değiştiği görülmektedir. Tamponsuz oksalik asit çözeltisinden yapılan eklemelerde duyarlılığın değişmesinin iki nedeni bulunmaktadır; oksalik asitin düşen pH değeri vasıtasıyla kendisinin PtE yüzeyinde yükseltgenmesi ile duyarlılığı arttırması ve düşen pH değeriyle enzim aktivitesinin artmasıdır. Bu iki faktör 82 aynı anda değişim gösterdiği ve duyarlılığın her ekleme sonrası değiştiği için tamponsuz oksalik asit ile yapılan çalışmaların sağlıklı olmadığı bir kez daha gösterilmiştir. 4.3.3. Polimer matriks altına hapsetme ile biyosensör hazırlama çalışmaları Oksalat oksidazın polimer matrik altına hapsedilerek immobilize edilmesi ile enzimatik sensör hazırlama çalışmalarında, bu işlem için yaygın olarak kullanılan, polimerik film tabakaları oluşturarak yüzeyde çözücüsü uçarken polimerleştiği bilinen Nafyon kullanıldı. Yüzeyde enzimin adsorbsiyonu için; öncelikle pH 3,8 süksinat tamponu içerisinde 2 0,008 mg/µL’lik enzim çözeltisi hazırlandı. Hazırlanan enzim çözeltisinden 2 mm ’lik PtE yüzeyine 2 µL eklendi ve oda sıcaklığında kurutuldu, ardından tekrar 2 µL eklendi ve oda sıcaklığında kurutuldu. Farklı nafyon yüzdelerinde enzimatik sensörler hazırlamak için kurutulan enzim çözeltisi üzerine farklı nafyon yüzdelerinde (kütlece % 0,5, % 1, % 3, % 5) 2 µL nafyon eklendi ve oda sıcaklığında kurutularak dört farklı nafyon yüzdelerine sahip enzimatik sensörler hazırlandı. İmmobilizasyon işleminden sonra hazırlanan dört farklı sensörün oksalik asit eklemelerine duyarlılık gösterip göstermeyeceğini belirlemek için Time–Base çalışmaları yapıldı. Şekil 4.54, kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı duyarlılığını göstermektedir. Şekil 4.54 incelendiğinde, kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı duyarlılık gösterdiği ve artan derişim miktarına göre oluşan akım basamağı büyüklüklerinin de düzenli olarak büyüdüğü görülmektedir. Şekil 4.55, kütlece % 1’lik nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı gösterdiği duyarlılığı göstermektedir. 83 100 µM oksalik asit 25 µM oksalik asit 50 µM oksalik asit Şekil 4.54. Kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 0,025 mM, 0,050 mM ve 0,100 mM oksalik asite karşı gösterdiği duyarlılık Şekil 4.55 incelendiğinde, kütlece % 1’lik nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı duyarlılık gösterdiği ve artan derişim miktarına göre oluşan akım basamağı büyüklüklerinin de düzenli olarak büyüdüğü görülmektedir. Şekil 4.56, kütlece % 3’lük nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı duyarlılığını göstermektedir. 100 µM oksalik asit 25 µM oksalik asit 50 µM oksalik asit Şekil 4.55. Kütlece % 1’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 0,025 mM, 0,050 mM ve 0,100 mM oksalik asite karşı gösterdiği duyarlılık 84 Şekil 4.56 incelendiğinde, kütlece % 3’lik nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı duyarlılık gösterdiği ve artan derişim miktarına göre oluşan akım basamağı büyüklüklerinin de düzenli olarak büyüdüğü görülmektedir. 100 µM oksalik asit 25 µM oksalik asit 50 µM oksalik asit Şekil 4.56. Kütlece % 3’lük nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 0,025 mM, 0,050 mM ve 0,100 mM oksalik aside karşı gösterdiği duyarlılık Şekil 4.57, kütlece % 5’lik nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı duyarlılığını göstermektedir. 100 µM oksalik asit 25 µM oksalik asit 50 µM oksalik asit Şekil 4.57. Kütlece % 5’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 0,025 mM, 0,050 mM ve 0,100 mM oksalik asite karşı gösterdiği duyarlılık 85 Şekil 4.57 incelendiğinde, kütlece % 5’lik nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı duyarlılık gösterdiği ve artan derişim miktarına göre oluşan akım basamağı büyüklüklerinin de düzenli olarak büyüdüğü görülmektedir. Farklı nafyon yüzdeleri ile hazırlanmış enzimatik sensörlerin duyarlılıkları karşılaştırıldığında, artan nafyon yüzdesi ile duyarlılığın azaldığı en iyi duyarlılığın kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanan enzimatik sensör ile elde edildiği belirlendi. Şekil 4.58, hazırlanan sensörlerin ilk günkü yanıtlarına göre duyarlılıklarının karşılaştırılmasını göstermektedir. Nafyon yüzdesinin sensör yanıtına etkisi kütlece % nafyon 0 1 2 3 4 5 6 -0,35 -0,3 -0,278 -0,25 -0,2 -0,179 -0,15 -0,1 -0,102 -0,05 -0,063 0 Şekil 4.58. Nafyon film hazırlanmasında kullanılan nafyon çözeltisi derişiminin sensör duyarlılığına etkisi Polimer matriks altına immobilize etme ile daha önceden belirlenen koşullarda oksalat ölçümü için bir enzimatik sensör hazırlanabileceği belirlendikten sonra, en iyi duyarlılıkların elde edildiği kütlece % 1’lik ve % 0,5’lik sensörlerin aynı derişimdeki oksalik asit eklemelerine karşı gösterdiği duyarlılığın günden güne değişimini belirlemeye yönelik çalışmalar yapıldı. Şekil 4.59, kütlece % 0,5’lik nafyonun 0,05 mM oksalik aside olan duyarlılığının günden güne değişimini göstermektedir. 86 Akım ( nA ) % 0,5'lik nafyon ile hazırlanan sensör Zaman (gün) 0 5 10 15 -0,35 -0,278 -0,3 -0,25 -0,2 -0,15 -0,114 -0,1 -0,057 -0,048 -0,029 -0,05 0 Şekil 4.59. Kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 50 µM’lık oksalik asite karşı duyarlılığının günden güne değişimi Şekil 4.59 incelendiğinde, kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün oksalik asite karşı duyarlılığının ilk dört gün içerinde çok hızlı bir şekilde azaldığı, dördüncü günden sonra ise duyarlılığının azalmaya devam ettiği, ancak ilk dört güne nazaran azalmaların daha düşük olduğu görülmektedir. Şekil 4.60, kütlece % 1’lik nafyonun 0,05 mM oksalik asite olan duyarlılığının günden güne değişimini göstermektedir. %1'lik nafyon ile hazırlanan sensör Zaman (gün) 0 2 4 6 8 10 12 14 -0,300 -0,250 -0,200 -0,150 -0,100 -0,050 0,000 Şekil 4.60. Kütlece % 1’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün 50 µM’lık oksalik asite karşı duyarlılığının günden güne değişimi 87 Akım ( nA ) Akım ( nA ) Şekil 4.60 incelendiğinde, kütlece % 1’lik nafyon ile hazırlanmış enzimatik sensörün oksalik asite olan duyarlılığının ilk dört gün içerisinde neredeyse aynı olduğu, dördüncü günden sonra ise duyarlılığın azaldığı görülmektedir. Enzimatik sensörlerin duyarlılığının günden güne değişimi belirlendikten sonra, en iyi duyarlılığın elde edildiği kütlece %0,5’lik nafyon ile hazırlanan sensör ile 14. gündeki duyarlılık değerinde bir kalibrasyon grafiği hazırlanarak sensörün doğrusal çalışma aralığı belirlenmeye çalışıldı. Şekil 4.61, küçük derişim bölgesi için (0,025–0,1 mM) beş tekrarlı olarak ölçüm alınmış akım basamağı oluşumlarına ait Time–Base grafiğini, Şekil 4.62 ise yüksek derişim bölgesi için (0,250–1,000 mM) beş tekrarlı olarak ölçüm alınmış akım basamağı oluşumlarına ait Time–Base grafiğini göstermektedir. 100 µM oksalik asit 25 µM oksalik asit 50 µM oksalik asit Şekil 4.61. Kütlece % 0,5’lik nafyonlu sensör ile kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmasında 0,025 mM, 0,050 mM, 0,100 mM oksalik asit eklemelerine karşı elde edilen akım basamak büyüklükleri 88 1000 µM oksalik asit 250 µM oksalik asit 500 µM oksalik asit Şekil 4.62. Kütlece % 0,5’lik nafyonlu sensör ile kalibrasyon grafiği hazırlama çalışmasında 0,250 mM, 0,500 mM, 1,000 mM oksalik eklemelerine karşı elde edilen akım basamak büyüklükleri Çizelge 4.5, 0,025–1,000 mM derişim bölgesinde farklı derişimde oksalik asit eklemeleri sonucu oluşan akım basamağı büyüklüklerini göstermektedir. Çizelge 4.5. 0,025–1,000 mM derişim aralığında % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış sensörün oksalik asit eklemelerine karşı oluşturduğu akım basamağı büyüklükleri Derişim 1. Ölçüm 2.Ölçüm 3.Ölçüm 4.Ölçüm 5.Ölçüm Ortalama Standart (mM) (nA) (nA) (nA) (nA) (nA) (nA) Sapma (nA) 0,025 -0,020 -0,022 -0,018 -0,016 -0,012 -0,018 0,004 0,050 -0,030 -0,032 -0,028 -0,031 -0,025 -0,029 0,003 0,100 -0,060 -0,070 -0,061 -0,056 -0,054 -0,060 0,006 0,250 -0,149 -0,156 -0,164 -0,141 -0,133 -0,149 0,012 0,500 -0,315 -0,321 -0,318 -0,300 -0,303 -0,311 0,009 1,000 -0,500 -0,518 -0,532 -0,516 -0,454 -0,504 0,030 Çizelge 4.5’deki derişimlere karşılık gelen akım basamağı büyüklükleri grafiğe geçirildiğinde elde edilen kalibrasyon eğrisinden (Şekil 4.63), hazırlanmış olan 89 enzimatik sensörün 0,025–1,00 mM derişim aralığında yeterince doğrusal yanıtlar verdiği görülmektedir. % 0,5 nafyon ile hazırlanmış sensöre ait kalibrasyon grafiği 0,000 -0,100 y = -0,510x - 0,014 -0,200 R² = 0,986 -0,300 -0,400 -0,500 -0,600 0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 Derişim ( mM ) Şekil 4.63. Kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanmış sensöre ait 0,025–1,000 derişim bölgesindeki kalibrasyon grafiği Nafyon ile yapılan çalışmalar sonucunda enzimatik oksalat sensörleri hazırlanabildi ve sensörün doğrusal çalışma aralığı belirlendi. Ayrıca çizilmiş olan kalibrasyon grafiği 14. güne ait olduğundan duyarlılık değişse bile doğrusallığın değişmediği böylece hazırlanmış sensör ile standart ekleme yöntemi kullanılarak gerçek örneklerle de çalışılabileceği belirlendi. Ayrıca farklı nafyon yüzdelerinde hazırlanan sensörlerde artan nafyon yüzdesi ile sensör duyarlılığının ve duyarlılığın günden güne değişime miktarının azaldığı belirlenmiştir. 4.3.4. Gerçek örnek ile oksalat tayini çalışması Hazırlanan tüm enzimatik sensörler içinden oksalata karşı en iyi duyarlılığın elde edildiği kütlece % 0,5’lik nafyonla hazırlanmış sensör ile ıspanak örneğinde gerçek örnek çalışması yapıldı. 90 Akım ( nA ) Önceden yıkanarak kök ve gövde kısımları ayrılmış, sadece yaprak kısımları etüvde o 105 C’de kurutulup ardından plastik havan içerisinde dövülerek toz haline getirilmiş ve bu sırada 5/6 oranında kütle kaybına uğramış toz ıspanak örneği temin edildi. Örnekten o 1 g tartıldı ve 50 mL saf su içerisinde 40 C sıcaklıkta 30 dk boyunca manyetik karıştırıcı ile karıştırıldı. Ardından 0,45 µm gözenekli teflon membran (millipore type HA) ile süzüldü ve 100 mL’ye tamamlandı. Yapılan Time–Base çalışması ile standart ekleme metodu kullanılarak gerçek örnekteki oksalat miktarı belirlendi. Dört tekrarlı ve toplam hacim 10 mL olacak şekilde yapılan çalışmada, 100 µL örnek ölçüm çözeltisine (pH 6,5 BRT) eklendi ve eklenen örneğin akım basamağı oluşturduğu gözlendi. Ardından derişimi bilinen oksalik asit çözeltisinden ölçüm çözeltisine, çözelti içerisinde 1 mM oksalik asit olacak şekilde eklemeler yapıldı ve çalışma tamamlandı. Şekil 4.64, yapılan Time–Base çalışmasında örnek ve derişimi bilinen oksalik asitin oluşturduğu akım basamaklarını göstermektedir. 1 mM oksalik asit 100 µL örnek Şekil 4.64. Standart ekleme metodu kullanılarak yapılan gerçek örnek çalışmasına ait Time–Base grafiği 91 Çizelge 4.6. Örnek ve derişimi bilinen oksalik asit eklemelerine karşı elde edilen akım basamağı büyüklükleri Ölçüm 1 Ölçüm 2 Ölçüm 3 Ölçüm 4 Ortalama S . Sapma (nA) (nA) (nA) (nA) (nA) (nA) Örnek -0,310 -0,330 -0,306 -0,297 -0,311 0,014 Oksalat -0,749 -0,721 -0,730 -0,667 -0,717 0,035 (1 mM) Çizelge 4.6, örnek ve derişimi bilinen oksalik asit eklemelerine karşı elde edilen akım basamağı büyüklüklerini göstermektedir. Çizelge 4.6’dan elde edilen veriler vasıtasıyla, gerekli hesaplamalar yapıldığında, 100 mL’lik örneğe ait derişim ve miktar değerleri Çizelge 4.7’den görülmektedir. Enzimatik sensör ile yapılan gerçek örnek çalışmasında 100 mL’deki oksalat miktarı; 0,382 ± 0,017 g olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.7. 100 mL’lik örneğe ait hesaplanan derişim ve miktar değerleri Ölçüm 1 Ölçüm 2 Ölçüm 3 Ölçüm 4 Ortalama Std. Sapma Derişim (mM) 43, 236 46,025 42,680 41, 423 44,353 2,365 Miktar (g) 0,380 0,405 0,376 0,365 0,382 0,017 Literatürde oksalat sensörleri ile gerçek örneklerde oksalat tayini için yapılan çalışmalar, UV–VIS spektrofotometrik çalışmalar ile doğrulanabilmekte ve kesinlikleri kıyaslanabilmektedir. Bu amaçla, öncelikle pH 6,5 BRT’de oksalik asitin maksimum soğurum yaptığı 207 nm dalga boyunda 0,1–0,75 mM derişim aralığında doğrusal çalışmalar yapılabileceğini göstermek için bir kalibrasyon grafiği çalışması gerçekleştirildi. Yapılan çalışma toplam hacim 3 mL olacak şekilde kuvartz küvetler içerisinde ve dört tekrarlı olarak yapıldı. Şekil 4.65, yapılan kalibrasyon grafiği çalışmasında derişimlere karşı elde edilen absorbans eğrilerini, Çizelge 4.8 ise derişimlere karşı elde edilen absorbans değerlerini göstermektedir. 92 Abs 0.5 0.0 nm 200 250 300 Şekil 4.65. pH 6,5 BRT’de 207 nm dalga boyunda farklı derişimlerdeki oksalik asite ait soğurum eğrileri, 0,10 mM, 0,25 mM, 0,50 mM, 0,75 mM oksalik asite ait soğurum eğrileri Şekil 4.65 incelendiğinde, pH 6,5 BRT’de oksalik asitin 207 nm dalga boyunda soğurum yaptığı ve artan derişimle piklerin düzenli bir şekilde büyüdüğü görülmektedir. Çizelge 4.8. 0,1–0,75 mM derişim aralığında oksalik asite karşı elde edilen soğurum değerleri Derişim Ölçüm 1 Ölçüm 2 Ölçüm 3 Ölçüm 4 S.Sapma Ort (A) (mM) (A) (A) (A) (A) (A) 0,10 0,080 0,089 0,080 0,122 0,093 0,0200 0,25 0,206 0,189 0,204 0,191 0,198 0,0087 0,50 0,562 0,565 0,566 0,552 0,561 0,0064 0,75 0,812 0,820 0,820 0,832 0,821 0,0082 Çizelge 4.8’deki derişimlere karşı gelen absorbans değerleri grafiğe geçirildiğinde 0,10–0,75 mM değerleri arasında oldukça iyi bir doğrusal çalışma aralığı elde edildiği Şekil 4.66’daki kalibrasyon grafiğinden görülmektedir. Elde edilen eğrinin korelasyon 2 katsayısı, R : 0,989 olarak elde edilmiştir. 93 pH 6,5 BRT'de oksalik asite ait kalibrasyon grafiği 0,900 0,800 0,700 y = 0,001x - 0,048 0,600 R² = 0,989 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 200 400 600 800 Derişim ( µM ) Şekil 4.66. pH 6,5 BRT ve 207 nm’de oksalik asite ait kalibrasyon grafiği pH 6,5 BRT koşullarında 0,10–0,75 mM derişim aralığında doğrusal çalışmalar yapılabileceği belirlendikten sonra standart ekleme metodu ile gerçek örnekle çalışmalar yapıldı. Dört tekrarlı ve toplam hacim 3 mL olacak şekilde yapılan çalışmada, 25 µL örnek ölçüm çözeltisine (pH 6,5 BRT) eklendi. Ardından derişimi bilinen oksalik asit çözeltisinden ölçüm çözeltisine, çözelti içerisinde 0,5 mM oksalik asit olacak şekilde ekleme yapılarak çalışma tamamlandı. Şekil 4.67, pH 6,5 BRT’de örnek ve derişimi belli oksalik asite ait soğurum eğrilerini göstermektedir. Şekil 4.67. 207 nm’de örnek ve derişimi bilinen oksalik asite ait soğurum pikleri 94 Absorbans Şekil 4.67’deki soğurum eğrileri incelendiğinde, örnek eklemeleri sonucu elde edilen soğurum pikinin oksalik asite ait soğurum piki ile aynı dalga boyunda olduğu dolayısıyla elde edilen pikin oksalata ait olduğu görülmektedir. Yapılan çalışma sonucu elde edilen soğurum değerleri Çizelge 4.9’de gösterilmektedir. Çizelge 4.9. Örnek ve derişimi bilinen oksalik asite ait soğurum değerleri Ölçüm 1 Ölçüm 2 Ölçüm 3 Ölçüm 4 Ort S.Sapma (A) (A) (A) (A) (A) (A) Örnek 0,394 0,398 0,409 0,415 0,404 0,010 Oksalat 0,514 0,519 0,506 0,509 0,512 0,006 (0,50 mM) Çizelge 4.9’den elde edilen veriler vasıtasıyla, gerekli hesaplamalar yapıldığında 100 mL’lik örneğe ait derişim ve miktar değerleri Çizelge 4.10’da görülmektedir. Spektrofotometrik yöntem ile yapılan gerçek örnek çalışmasında 100 mL’deki oksalat miktarı; 0,417 ± 0,010 g olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.10. 100 mL’lik örneğe ait hesaplanan derişim ve miktar değerleri Ölçüm 1 Ölçüm 2 Ölçüm 3 Ölçüm 4 Ortalama Std. Sapma Derişim (mM) 46,172 46,641 47,930 48,633 47,344 1,136 Miktar (g) 0,406 0,410 0,422 0,428 0,417 0,010 İki yöntemle de bulunan sonuçların ortalaması kıyaslandığında, enzimatik sensör ile elde edilen miktar, spektrofotometrik yöntemle elde edilen miktarın % 93,765 kadarı olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak yapılan enzimatik sensör ile gerçek örnekle de kıyaslamalı olarak çalışmalar yapılabileceği gösterilmiş ve oksalat ölçümü için H2O2’nin yükseltgenmesine dayanan bu yeni yöntemin uygulanabilirliği belirlenmiştir. 95 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Oksalat enzimatik sensörlerinin hazırlanması ile ilgili literatürde pek çok çalışma bulunmaktadır. Ancak yapılan araştırmalar sonucunda amperometrik ölçüm ilkesine (H2O2’nin indirgenmesi veya yükseltgenmesi ilkesi) dayanan oksalat sensörü hazırlanması çalışmalarında bazı eksik noktalar görülmüş ve bu eksikler üzerine gidilerek yeni bir oksalat sensörü geliştirilmesi amaçlanmıştır. Literatürde var olan çalışmalarda genellikle H2O2’nin indirgenmesi ölçüm ilkesine dayanan sensörler hazırlanmıştır. Ancak katodik potansiyellerde çalışma elektrotu olarak platin elektrotlar kullanıldığında, platin elektrot yüzeyinde çözünmüş O2 gazının da H2O2’nin indirgendiği potansiyellerde indirgenmesi nedeniyle tekrarlanmazlıklar olabilmektedir. Tekrarlanmazlıklardan gelecek hataları engellemek amacıyla çözünmüş oksijen giderme işlemi yapılabilmekte ancak bu durumda da uçucu H2O2 bileşiğinin çözelti içerisinde eksilmesi söz konusu olabilmektedir. Bu tür hatalardan kaçınmak için katodik potansiyellerde H2O2 için daha az duyarlılık gösteren GC, karbon pasta, grafit gibi elektrotlar ile çalışmalar yapılmıştır. Duyarlılığı arttırmak için ise daha büyük yüzeyli elektrotlar kullanılmış ve genellikle elektrot yüzeyleri modifiye edilmiştir. Modifiye edilen elektrot yüzeyleri ile hem H2O2’nin indirgenmesine karşı daha iyi duyarlılık elde edilmiş hem de çözünmüş O2’den gelebilecek hatalar engellenmiştir. -2 Bazı çalışmalarda doğrusal çalışma aralığının üst sınırları 10 M mertebesine ulaşabilmektedir. Ancak çözelti ortamında oksalik asit derişiminin yüksek olduğu durumlarda (mM mertebesinde) ortam pH’sinde değişmeler olduğundan H2O2’ye ait pik potansiyelinin dolayısıyla H2O2’nin duyarlılığında değişmelere neden olabilmekte ve literatürdeki çalışmalarda bu etki göz ardı edilmektedir. Yapılan araştırmada literatürde H2O2’nin yükseltgenmesi ölçüm ilkesine dayanan bir oksalat sensörü hazırlanması çalışılmasına rastlanmamıştır. Bu durumun olası nedeni; oksalat oksidaz enzimin yüksek aktivite gösterdiği çalışma koşullarında (pH 2–4), oksalik asitin enzimatik süreçte oluşan H2O2 ile girişim yapıyor ve oksalik asit ile H2O2’nin anodik bölgedeki analiz koşullarının çok iyi bilinmiyor oluşudur. 96 Bu tez çalışmasında, çalışma elektrotu yüzeyinde herhangi bir modifiye işlemi yapılmadan sadece pH ayarlaması yapılarak anodik potansiyellerde H2O2 ölçümüne dayalı bir enzimatik oksalat sensörü hazırlanması amaçlanmıştır. Bu kapsamda yapılan çalışmalar sonucunda ise H2O2 ve oksalik asitin elektrokimyasal davranışlarının pH, elektrolit bileşimi ve çalışma elektrotuna olan bağımlılığı incelenmiş ve farklı immobilizasyon yöntemleri ile anodik potansiyellerde H2O2 ölçüm ilkesine dayalı birkaç enzimatik sensör hazırlanmıştır. Yapılan çalışmada elde edilen sonuçlardan vurgulanmak istenilenler aşağıda belirtilmiştir.  Önlem alınmaması halinde H2O2 ve H2C2O4 bileşenlerinin aynı potansiyellerde yükseltgenme piki vererek birbirinin analizini etkilediği, oksalik asidin anodik ve katodik bölgelerdeki elektro aktifliklerinin çalışma elektrotu, tampon çözelti bileşimi ve pH’sine olan bağımlılıkları belirlendi.  Katodik bölgede yapılan çalışmalarda anodik bölgedekilere nazaran daha iyi duyarlılık elde edilmesine rağmen, çözünmüş oksijenden kaynaklanan tekrarlanmazlıklar yüzünden katodik bölge potansiyellerinde çalışan bir sensör hazırlanmasının bazı olumsuzluklar taşıyacağı belirlendi.  Ölçüm ortamına ardı ardına oksalik asit eklemeleri ile gerçekleştirilen voltametrik analiz çalışmalarında, eklenen oksalik asitin ölçüm ortamının pH’si üzerinde etkili olduğu, ölçüm ortamının tamponlama kapasitesi yüksek olsa bile pH’nin önemli ölçüde değişimine yol açtığı ve bunun sonucu olarak da, yükseltgenme pikinin potansiyelinin kaydığı, pik akımı gözlemlerinde düzensizliklerin ortaya çıkabildiği belirlendi. Ardı ardına eklemelerde kullanılacak oksalik asit çözeltisinin önceden tamponlanmış şekilde hazırlanması halinde söz konusu pH değişimlerinden kaçınılabileceği belirlendi.  pH ≤ 4 olan pH bölgesinde oksalik asit ile H2O2’nin yükseltgenme piklerinin tamamen girişim yaptığı ve bu iki maddenin yükseltgenme piklerinin birbirinden ayrılabildiği minimum pH’nin pH 6,5 olduğu belirlendi. 97  Optimize edilen koşullarda (pH 6,5 BRT ve + 530 mV potansiyelde) H2O2 analizinin gerçekleştirilebileceği çizilen kalibrasyon grafiği ile gösterildi.  Optimize edilen koşullarda iki farklı immobilizasyon yöntemleri ile de oksalata duyarlı enzimatik sensörler hazırlandı.  Hazırlanan sensörlerden kütlece % 2,5’lik glutaraldehit ile hazırlanan sensörün duyarlılığının hazırlanan diğer sensörlere göre daha uzun süre stabil kaldığı, en iyi duyarlılığı kütlece % 0,5’lik nafyon ile hazırlanan sensörün gösterdiği, nafyon ile hazırlanan sensörlerde, nafyon yüzdesinin artmasıyla sensör duyarlılığının azaldığı, ancak buna bağlı olarak da duyarlılığın günden güne değişiminin daha stabil kaldığı belirlendi.  Hazırlanan sensörlerin duyarlılıklarının günden güne değişmesine rağmen doğrusallıklarının değişmediği, böylece standart ekleme metotu kullanılarak gerçek örnekler ile çalışılabileceği belirlendi. Toz haline getirilmiş ıspanak örneklerinde oksalat analizi başarı ile gerçekleştirilmiş, çalışmada 1 g ıspanak tozunda 382 ±17 mg oksalat bulunmuş, literatürdeki değerler ile kıyaslandığında (Perez ve ark. 2001, 100 g ıspanakta 798 ± 42 mg oksalat) miktarın oldukça fazla olduğu görülmüştür. Bu durum çalışılan ıspanak tozu numunesinin oksalatın en bol olarak bulunduğu yaprak kısmından elde edilmiş ve kurutma işleminde kütlesinde 5/6 oranında kayıp olmuş olması ile açıklanabilmektedir.  Ayrıca idrar gibi biyolojik örneklerde de hazırlanan sensörlerin aktifliklerini korudukları, sistematik incelemelerde kullanılabileceği belirlendi.  Gerçek örnekle de çalışmalar yapılmış ve elde edilen sonuçlar spetrofotometrik yöntemle de kıyaslanmıştır. Enzimatik elektrot ile elde edilen miktarın spektrofotometrik yöntemle elde edilen miktarın % 93,765 olduğu belirlenmiştir. 98  Literatürdeki diğer oksalat sensörü çalışmalarına göre, olanakların yeterli olmamasından dolayı daha az miktarda enzim kullanılmasına, oksalat oksidaz enziminin en yüksek aktivite gösterdiği pH ve sıcaklık değerlerinde çalışmalar yapılamamasına ve oksalat oksidaz enziminin aktivitesini arttıran bovin serum albumin (BSA) kullanılmamasına rağmen yine de oldukça geniş bir çalışma aralığında çalışma yapma imkanı yakalanmıştır.  Çalışma elektrotunun yüzeyinde herhangi bir modifiye işlemi yapılmadan sadece pH optimizasyonu yapılarak, H2O2’nin anodik pik akımlarının ölçüm ilkesine dayalı bir enzimatik sensör geliştirilmiştir.  Ayrıca, UV-VIS spektrofotometrik çalışmalar ile oksalik asit analizi yapılabileceği çizilen kalibrasyon grafiği ile gösterilmiştir. 99 KAYNAKLAR Arvinte, A., Rotariu, L., Bala C. 2006. Development a pesticides biosensor using carbon based electrode systems. Chemicals as Intentional and Accidental Global Environmental Threats, 337 – 343. Atasağungil, M. 1965. Enzimler. Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Yayınları, Ankara, 140 s. Aykut, U., Temiz, H. 2006. Biyosensörler ve gıdalarda kullanımı. Gıda Teknolojileri Elektronik Dergisi, 3: 51 – 59. Bard, A.J., Faulkner, L.R. 2001. Electrochemical methods, John Wiley and Sons Inc., New York, USA, 833 pp. Bradley, C.R., Rechnitz, G.A. 1986. Comparison of oxalate oxidase enzyme electrodes for urinary oxalate determinations. Analytical Lettters, 19 (1 & 2): 151 – 162. Bunde, R.L., Jarvi, E.J., Rosentreter, J.J. 1998. Piezoelectric quartz crystal biosensors. Talanta, 46: 1223 – 1236. Capra, R.H., Strumia, M., Vadgama, P.M., Baruzzi, A.M. 2005. Musin / carbopol matrix to immobilize oxalate oxidase in a urine oxalate amperometric biosensor. Analytica Chimica Acta, 530: 49 – 54. Chamjangali, M.A., Sharif – Razavian, L., Yousefi, M., Amin, A.H. 2009. Determination of trace amounts of oxalate in vegetable and water samples using a new kinetic – catalytic reaction system. Spectrochimica Acta Part A, 73: 112 – 116. Çınar, M. 2006. Pt biriktirilmiş polivinil ferrosen modifiye Pt elektrotunu temel alan yeni bir kolin biyosensörünün geliştirlmesi. Yüksek Lisans Tezi, Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı, Konya. Dimeski, G., Badrick, T., John, A. 2010. Ion sellective electrodes (ISEs) and interferences. Clinica Chimica Acta, 411: 309 – 317. Dinçkaya, E., Telefoncu, A. 1994. Development of a biosensor by covalent oxalate oxidase coupling on cellulose acetate membranes for oxalate determination. Tr. J. of Chemistry, 18: 1 – 8. Eggins, B.R. 2002. Chemical Sensors and Biosensors, John Wiley and Sons Ltd, West Sussex, England, 273 pp. Ekinci, E., Özden, M., Karagözler, A.A., Türkdemir, M.H., Karagözler, A.E. 1995. Preperation and optimization of conducting polymer (polypyrrole) as a glucose sensor. Tr. J. of Chemistry, 19: 170 – 178. 100 Ercole, C., Gallo, M.D., Mosiello, L., Baccella, S., Lepidi, A. 2003. Escherichia coli detection in vegetable food by a potentiometric biosensor. Sensors and Actuators B, 91: 163 – 168. Fiorito, P.A., Torresi, S.C. 2004. Optimized multilayer oxalate biosensor. Talanta, 62: 649 – 654. Gerard, M., Chaubey, A., Malhotra, B.D. 2002. Aplication of conducting polymers to biosensors. Biosensor and Bioelectronics, 17: 345 – 359. Gonçalvez, D., Prazeres, D.M.F., Chu, V., Conde J.P. 2008. Detection of DNA and proteins using amorphous silicon ion- sensitive thin - film field effect transistors. Biosensors and Bioelectronics, 24: 545 – 551. Gülce, H., Ataman, İ., Gülce, A., Yıldız, A. 2002. A new amperometric enzyme electrode for galactose determination. Enzyme and Microbial Technology, 30: 41 – 44. Gülce, H., Gülce, A., Kavanoz, M., Coşkun, H., Yıldız, A. 2002. A new amperometric enzyme electrode for alcohol determination. Biosensors and Bioelectronics, 17: 517 – 521. Hong, F., Nilvebrant, N.O., Jönsson, L.J. 2003. Rapid and convenient determination of oxalic acid employing a novel oxalate biosensor based on oxalate oxidase and SIRE technology. Biosensors and Bioelectronics, 18: 1173 – 1181. İnal, M.E. 1996. Biyokimya: 9. Ünite, Anadolu Üniversitesi Yayınları No: 489, Eskişehir, s 91 – 104. Jiang, X., Zhu, L.,Yang, D., Mao, X., Wu, Y. 2009. Amperometric ethanol biosensor based on integration of alcohol dehydogenase with meldola’s blue / ordered mesoporous carbon electrode. Electroanalysis, 21 (14): 1617 – 1623. Kafi, A.K.M., Chen, A. 2009. A novel amperometric biosensor for the detection of nitrophenol. Talanta, 79: 97 – 102. Keusgen, M., Kloock, J.P., Knobbe, D.T., Jünger, M., Krest, I., Goldbach, M., Klein, W., Schöning, M.J. 2004. Direct determination of cyanides by potentiometric biosensors. Sensors and Actuators B, 103: 380 – 385. Kharitonov, A.B., Zayats, M., Alfonta, L., Katz, E.,Willner, I. 2001. A novel + ISFET – based NAD - dependent enzyme sensor for lactate. Sensors and Actuators B, 76: 203 – 210. Kim, H.,Yoon, S.H., Choi, H.N., Lyu, Y., Lee, W. 2006. Amperometric glucose biosensor based on sol – gel – derived zirconia / nafion composite film as encapsulation matrix. Bull Korean Chem. Soc., 27 (1): 65 – 70. 101 Koncki, R. 2007. Recent development in potentiometric biosensors for biomedical analysis. Analytica Chimica Acta, 599: 7 – 15. Kumar, S., Chauhan, V.S., Nahar, P. 2008. Preperation of biomolecule – ligated polystyrene cuvets and their applications in diagnostics. Microchemical Journal, 89: 148 – 152. Lee, N.Y., Jung, Y.K., Park, H.G. 2006. On – chip colorimetric biosensor based on polydiacetylene embedded in photopolymerized poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogel. Biochemical Engineering Journal, 29: 103 – 108. Masar, M., Zuborova, M., Kaniansky, D., Stanislawski, B. 2003. Determination of oxalate in beer by zone electrophoresis on a chip with conductivity detection. J. Sep. Sci., 26: 647 – 652. Milardovic, S., Kerekovic, I., Nodilo, M. 2008. A novel biamperometric biosensor for urinary oxalate determination using flow – injection analysis. Talanta, 77: 222 – 228. Milardovic, S., Grabaric, Z., Rumenjak, V., Jukic, M. 2000. Rapid determination of oxalate by amperometric oxalate oxidase – based electrode. Electroanalysis, 12 (13): 1051 – 1058. Milardovic, S., Grabaric, Z., Grabaric, B.S. 2000. Sensetive amperometric oxalate biosensor for food analysis. Food Technol. Biotechnol., 38 (3): 203 – 210. Mishra, R., Yadav, H., Pundir, C.S. 2010. An amperometric oxalate biosensor based on sorghum leaf oxalate oxidase immobilized on carbon paste electrode. Analytical Letters, 43: 151 – 160. Mulchandani, P., Mulchandani, A., Kaneva, I., Chen, W. 1999. Biosensor for direct determination of organophosphate nevre agents . 1. Potantiometric enzyme electrode. Biosensors and Bioelectronics, 14: 77 – 85. Özata, A., Kutlu, M. 2000. Enzimoloji Ders Notları, Anadolu Üniversitesi Yayınları; No. 1254, Eskişehir, 117 s. Perez, E.F., Neto, G.O., Kubota, L.T. 2001. Bi – enzymatic amperometric biosensor for oxalate. Sensors and Actuators B, 72: 80 – 85. Prodromidis, M.I., Karayannis, M.I. 2002. Enzyme based amperometric biosensors for food analysis. Electroanalysis, 14 (4): 241 – 261. Pundir, C.S., Bhambi, M., Chauhan, N.S. 2009. Chemical activation of egg shell membrane for covalent immobilization of enzymes and its evaluation as inert support in urinary oxalate determination. Talanta, 77: 1688 – 1693. Pundir, C.S., Sharma, M. 2010. Oxalate biosensor: a review. Journal of Scientific and Industrial Research, 69: 489 – 494. 102 Reddy, S.M., Higson, S.P., Vadgama, P.M. 1997. Amperometric enzyme electrode for the determination of urine oxalate. Analytica Chimica Acta, 343: 59 – 68. Reddy, R.R.K., Chadha, A., Bhattacharya, E. 2001. Porous silicon based potentiometric trigliseride biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 16: 313 – 317. Rodriguez, B.B., Bolbot, J.A., Tothill, I.E. 2004. Urease – glutamic dehydrogenase biosensor for screening heavy metals in water and soil samples. Anal Bioanal Chem, 380 : 284 – 292. Romero, M.R., Ahumada, F., Garay, F., Baruzzi, A.M. 2010. Amperometric biosensor for direct blood lactate detection. Anal. Chem., 82: 5568 – 5572. Salimi, A., Hallaj, R., Soltanian, S. 2009. Fabrication of a sensitive cholesterol biosensor based on cobalt – oxide nanostructures electrodeposited onto glassy carbon electrode. Electroanalysis, 21 (24): 2693 – 2700. Santini, A.O., Lemos, S.C., Pezza, H.R., Carloni – Filho, J., Pezza, L. 2008. Development of a potentiometric sensor fort he determination of saccharin in instant tea powders, diet soft drinks and strawberry dietetic jam. Microchemical Journal, 90: 124 – 128. Santos, A.S., Pereira, A.C., Sotomayor, M.D.P.T., Tarley, C.R.T., Duran, N., Kubota, L.T. 2007. Determination of phenolic compounds based on co – immobilization of methylene blue and HRP on multi – wall carbon nanotubes. Electroanalysis, 19 (5): 549 – 554 Sarkar, P., Tothill, I.E., Setford, S.J., Turner, A.P.F. 1999. Screen – printed amperometric biosensors for the rapid measurement of L and D – amino acids. The Analyst, 124: 865 – 870. Serra, B., Gamella, M., Reviejo, A.J., Pingarron, J.M. 2008. Lectin – modified piezoelectric biosensors for bacteria recognition and qualification. Anal Bioanal Chem, 391: 1853 – 1860. Sezgintürk, M.K., Dinçkaya, E. 2003. A novel amperometric biosensor based on spinach tissue homogenate for urinary oxalate determination. Talanta, 59: 545 – 551. Sheldon, R.A. 2007. Enzyme immobilization: The quest for optimum performance. Adv. Synth. Catal., 349: 1289 – 1307. Shin, J.H., Yoon, S.Y., Yoon, I.J., Choi, S.H., Lee, S.D., Nam, H., Cha, S.G. 1998. Potentiometric biosensors using immobilized enzyme layers mixed with hydrophilic polyurethane. Sensors and Actuators B, 50: 19 – 26. 103 Sikora, P., Beck, B., Zajaczkowska, M., Hoppe, B. 2009. Plasma oxalate level in pediatric calcium stone formers with or witout secondary hyperoxaluria. Urol Res, 37: 101 – 105. Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J. 1996. Analitik Kimya Temelleri, Saunders College Publishing, Orlando, USA, 496 pp. Sljukic, B.,Baron, R., Compton, R.G. 2007. Electrochemical determination of oxalate at pyrolytic graphite electrodes. Electroanalysis, 19 (9): 918 – 922. Söylemez, Z., Fadıloğlu, S. 1996. Laboratory Manuel Enzyme Purification and İmmobilization: Experiment 10, Gaziantep University, Faculty of Engineering, Department of Food Engineering, pp 47 – 54. Pizzariello, A., Stredansky, M., Stredanska, S., Miertus, S. 2000. Amperometric pH–sensing biosensors for urea penicilin and oxalacetate. Analytica Chimica Acta, 415: 151 – 157. Suzuki, H., Nagata, M., Ohzono, S., Fujimoto, C. 2005. Determination of oxalate in human serum in the nM range by on – column sample preconcentration – capillary zone electrophoresis with direct absorbance detection. Chromatographia, 61: 333 – 337. Şenol, Ş., Sarıhan, A., Türkdemir, M.H. 2009. Preparation a leakproof voltammetric th Ag/AgCl reference electrode for aqueous HF solutions. 8. International Electrochemistry Meeting, 8 – 11 October 2009, Side, Turkey Şenol, Ş., Sarıhan, A., Türkdemir, M.H. 2010. Oksalik asitin voltametrik davranışının incelenmesi. 5. Ulusal Analitik Kimya Kongresi, 21 – 25 Haziran 2010, Erzurum. Telefoncu, A. 1997. Enzimoloji, Lisansüstü Yaz Okulu Ders Notları, Kuşadası, 446 pp. Telefoncu, A. 1999. Biyosensörler, Biyokimya Lisansüstü Yaz Okulu Ders Notları, Kuşadası, 280 s. Teles, F.R.R., Fonseca, L.P. 2008. Aplications of polymers for biomolecule immobilization in electrochemical biosensors. Meterials Science and Engineering C, 28: 1530 – 1543. Thevenot, D.R., Toth, K., Durst, R.A., Wilson, S.G. 2001. Electrochemical biosensors: recommended definations and classification. Analytical Letters, 34 (5): 635 – 659. Tombelli, S., Mascini, M., Sacco, C., Turner A.P.F. 2000. A DNA Piezoelectric biosensor assay coupled with a polymerase chain reaction for bacterial toxicity determination in environmental samples. Analytica Chimica Acta, 418: 1 – 9. 104 Türkdemir, M.H. 2008. Enstrümantal Analiz – II, Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Ders Notları, Bursa, 138 pp. Yablotskii, K.V., Shekhovtsova, T.N. 2010. Enzymatic determinations of anions. Journal of Analytical Chemistry, 65 (7): 660 – 673. Yamazaki, S., Fujiwara, N. Yasuda, K. 2010. A catalyst that uses a rhodium phtalocyanin for oxalic acid oxidation and its application to an oxalic acid sensor. Electrochimica Acta, 55: 753 – 758. Yang, M., Yang, Y., Yang, Y., Shen, G., Yu, R. 2005. Microbiosensor for acetylcholine and choline based on electropolymerization / sol – gel derived composite membrane. Analytica Chimica Acta, 530: 205 – 211. Wan, K., Chovelon, J.M., Jaffrezic – Renault, N. 2000. Enzyme – octadecylamine Langmuir – Blodgett membrans for ENFET biosensors. Talanta, 52: 663 – 670. Wang, J. 1995. Electroanalysis and biosensors. Anal. Chem., 67 (12): 487 – 492. Wang, B., Zhang, J., Cheng, G., Dong, S. 2000. Amperometric enzyme electrode for the determination of hydrojen peroxide based on sol – gel / hydrogel composite film. Analytica Chimica Acta, 407: 111 – 118. Wang, J. 2006. Analitical Electrochemistry, John Wiley and Sons Inc., New Jersey, USA, 250 pp. Wang, Y., Xu, H., Zhang, J., Li, G. 2008. Electrochemical sensors for clinic anaysis. Sensors, 8: 2043 – 2081. Zhang, S., Wright, G., Yang, Y. 2000. Materials and techniques for electrochemical biosensor design and construction. Biosensors and Bioelectronics, 15: 273 – 282 Zheng, Y., Yang, C., Pu, W., Zhang, J. 2009. Determination of oxalic acid in spinach with carbon nanotubes – modified electrode. Food Chemistry, 114: 1523 – 1528. Zhu, J., Zhu, Z., Lai, Z., Wang, R., Guo, X., Wu, X., Zhang, G., Zhang, Z., Wang, Y., Chen,Z. 2002. Planar amperometric glucose sensor based on glucose oxidase immobilized by chitosan film on prussian blue layer. Sensors, 2: 127 – 136 105 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Şener ŞENOL Doğum Yeri ve Tarihi : Malkara/23.11.1985 Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Malkara Süper Lisesi ( Y.D.A.L.) Lisans : U.Ü. Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Yüksek Lisans : U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Bölümü Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl : İletişim (e – posta) : ssenersenol@hotmail.com Yayınları : 106