RESEARCH ARTICLES J Res Vet Med. 2020: 39(2) 101-105 DOI:10.30782/jrvm.702196 Kollajenin Saanen Teke Spermasının Dondurulabilirliği Üzerine Etkisi Burcu ÜSTÜNER1* Ahmet AKTAR1 Mehmet Melih Yılmaz1 Emine MÜLKPINAR1 Elif GÖKÇE2 Ezgi BOZ3 Selim ALÇAY1 Şenay UÇAR4 1 Bursa Uludağ Üniversitesi,Veteriner Fakültesi, Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı, Görükle, Bursa, Türkiye 2Tekirdağ Namık Kemal Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Dölerme ve Suni Tohumlama Anabilim Dalı, Tekirdağ 3Ahmet Erdem Anadolu Lisesi, Nilüfer, Bursa 4BTSO Kamil Tolon Bilim ve Sanat Merkezi Received 12-03-2020 Accepted 12-10-2020 Özet Bu çalışmada, Sazan Balığı (Cyprinus carpio) pullu derisinden elde edilen kollajen içerikli sıvı özütün teke spermasının dondurulabilirliği üzerine etkisinin belirlenmesi amaçlandı. Çalışmada, toplam 36 ejakülat altı baş tekeden gün aşırı elektro-ejakülatör ile alındı. En az +++ mass aktivite, %70 motilite ve 2x109 spermatozoon/mL özelliğe sahip sperma örnekleri birleştirilerek her grup için 4 eşit kısma bölündü. Sperma iki aşamalı sulandırma methodu ile final konsantrasyonu 1/5 (sperma/sulandırıcı) olacak şekilde; kollajen içermeyen kontrol grubu (K) ve farklı konsantrasyonda kollajen içeren (%1, %5 ve %10; sırasıyla K1, K5 ve K10) Tris-Na sitrat sulandırıcısı ile sulandırıldı. Payetler programlanabilir dondurma makinasında donduruldu ve daha sonra sıvı azot içine aktarıldı. Her gruptan en az 3 payet 37ºC/30sn’de eritile- rek eritme sonrası değerlendirmeler yapıldı. Sperma taze ve dondurma sonrası aşamalarda; motilite, plazma membran bütünlüğü Hypo-Os- motic Swelling Test (HOST) ve akrozom hasarı yönünden FITC-Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) boyama ile değerlendirildi. Eritme sonrası deney gruplarının motilite değerleri karşılaştırıldığında, kollajen içeren grupların motilitelerinin kollajen içermeyen kontrol grubu- na göre daha yüksek olduğu gözlemlendi (P<0.05). Plazma membran bütünlüğünün, kollajen ilave edilen gruplarda kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu tespit edildi (P<0.05). Akrozom hasarının sayısal olarak en yüksek kontrol grubunda olduğu gözlemlenmesine rağmen gruplar arasında istatistiksel bir fark tespit edilmedi (P>0.05). Sonuç olarak; teke spermasının dondurulmasında kullanılan sulandırıcılara %1, %5 ve %10 oranında kollajenin katılmasının motilite ve plazma membran bütünlüğü üzerine olumlu etkisi gözlemlendi. Anahtar kelimeler: Kollajen, teke, dondurma, Sazan balığı The Effect of Collagen on Cryopreservation of Saanen Buck Semen Abstract In this study, it was aimed to determine collagen-containing liquid extract obtained from scaly-skin of Carp (Cyprinus carpio) affect on cryopreservation of Saanen goat semen. In the study, a total of 36 semen samples were collected from 6 goats with one-day interval among each collections with an electroejaculator. Semen samples with at least +++ mass activity, 70% motility and 2x109 spermatozoa/mL were pooled and divided into 4 equal specimens for each group. Semen were diluted in a two-step dilution method to a final concentration of 1/5 (semen/extender) in Tris-Na citrate extender containing no collagen (C; control group) and different collagen concentrations (1%, 5%, and 10%; C1, C5 and C10 respectively). The straws were frozen by programmable-freezer and then transferred into liquid nitrogen. At least 3 straws from each group were thawed at 37ºC / 30sec and post-thaw evaluations were done. Semen in the fresh stage and in the post-thaw stage; motility, plasma membrane integrity were evaluated by Hypo-Osmotic Swelling Test (HOST) and FITC-Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) staining for acrosome damage. When the post-thaw motility values of experimental groups were compared, it was observed that the motility of the collagen-containing groups was higher than the control group (P <0.05). Plasma membrane integrity was found to be higher in collagen added groups compared to the control group (P <0.05). Although the numerically highest acrosome damage was observed in the control group, no statistical difference was found among implementation groups (P> 0.05). The results of the current study clearly demonstrated that enrichment with C1, C5 and C10 in freezing of goat semen extenders has positive effect on post-thaw motility and plasma membrane integrity. Keywords: Collagen, goat, freezing, Carp (Cyprinus carpio) * Corresponding author: Burcu ÜSTÜNER , Tel: (+90 224) 294 12 45, Fax: (+90 224) 294 12 02, E-posta: bbaspinar@uludag.edu.tr 101 Ustuner et al. 2020 GİRİŞ da kollajen varlığının tespit edilmesinden dolayı; kollajenli özütün, sulandırıcı içine katılmasıyla dondurma-eritme Keçilerde suni tohumlama yönteminden yararlanarak sonrası spermatozoa membran dayanıklığının artırılması üstün özellikteki tekelerin dondurulmuş spermalarının ve teke spermasının daha başarılı dondurulabileceği hi- kullanımı, yetiştirme programlarında hızlı bir genetik iy- potezi düşünüldü. Bu çalışmada, Sazan Balığı (Cyprinus ileşme elde edilmesi bakımından büyük önem taşımak- carpio) pullu derisinden elde edilen kollajen içerikli sıvı tadır. Öte yandan, teke spermasının dondurulup suni özütün teke spermasının dondurulabilirliği üzerine etkisi- tohumlama yöntemiyle tohumlamada kullanılması üze- nin belirlenmesi amaçlandı. rindeki çalışmalar 1950’li yıllarda başlayarak günümüze kadar süregelmiştir.1 Materyal ve Metot Suni tohumlama uygulamalarının yaygınlaştırılması ile Çalışmada, Bursa Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakülte- genetik ilerlemenin hızlandırılması, damızlık değeri yük- si Araştırma ve Uygulama Merkezi’nde aynı bakım ve sek tekelerden daha fazla yararlanılması, yetiştirmeye bağlı besleme koşullarında barındırılan toplam 6 baş Saanen ırkı gereksiz uğraş ve masrafların azaltılması, çiftleşme ile bu- teke kullanıldı (Etik Kurul No:2019-10/08). laşabilecek reprodüktif hastalıkların kontrolü ve döl ver- Bu çalışmada kollajenin elde edilmesi amacıyla, Cuprin- iminin arttırılabilmesi sağlanabilecektir. Keçilerde suni idae/familyasının en yaygın üyesi olan Sazan balığının tohumlamanın yaygınlaştırılması ancak teke spermasının (Cyprinus carpio) derisinden elde edilen özüt kullanıldı. başarılı bir şekilde dondurulmasıyla mümkün olacaktır.2 Bu özütün yapılan proteomik analizinde; kollajen α Teke spermasının dondurulmasında yaygın olarak yağsız prekürsörü’nün (77903,39) diğer proteinlere göre oldukça süt tozu ve Tris temelli sulandırıcılar kullanılmaktadır.2 yüksek olduğu saptandı. 100 mL saf su içerisine 100 gr Günümüzde teke sperması ile yoğun çalışmalar yapılması- Sazan Balığı (Cyprinus carpio) pullu derisi konularak 5 dk na, çeşitli sulandırıcılar, soğutma hızları, farklı gliserol boyunca kaynatıldı. Sık örgülü süzgeçten 5 kez geçirilerek konsantrasyonları ve kriyoprotektif maddeler denenme- atık pul ve partiküllerden arındırılarak saf haline en yakın sine rağmen çözüm sonrası elde edilen başarılar sınırlı özüt elde edildi. düzeyde kalmıştır.3-6 Dondurma ve eritme işlemi teke Her tekeden sperma gün aşırı elektro-ejakülatör yöntemi- spermasının morfolojisini, biyokimyasını ve fonksiyonunu yle toplam 6 kez alındı. En az +++ mass aktivite, %70 mo- olumsuz yönde etkiler. Bu olumsuz değişiklikler motilit- tilite ve 2x109 spermatozoon/mL özelliğe sahip sperma enin düşmesine, spermanın dişi genital kanalda ilerleme örnekleri birleştirilerek 4 eşit gruba bölündü. Aisen ve yeteneğinin azalmasına ve servikal tohumlama sonrası fer- ark.11 ’nın araştırmalarında kullandıkları % 20 yumurta tilite oranının düşmesine neden olur.7 sarısı içeren temel Tris-sitrat sulandırıcısı (Tris 27.1 g/L, Birincil öneme sahip suni tohumlama başarısını etkileyen sitrik asit 14.0 g/L, fruktoz 10.0 g/L); kollajen içeremey- donmuş spermanın kalitesini artırmak için; spermanın en (kontrol; K) ve farklı oranlarda kollajen (%1, %5 ve dondurulması amacıyla kullanılan sulandırıcıların içine %10; K1, K5 ve K10 ) katılan toplam 4 sulandırıcı grubu birçok katkı maddesi eklenmiştir. Bu anlamda birçok an- olarak hazırlandı. Sperma grupları iki aşamalı sulandırma tioksidan, kriyoprotektif madde ve seminal plazma katkısı methodu ile final yoğunluğu 1/5 (sperma/sulandırıcı) ola- spermanın dondurulması amacıyla kullanılmış ve olumlu cak şekilde; K, K1, K5 ve K10 sulandırıcıları (sulandırıcı A) sonuçlar alınmıştır.8,9 ile yarı hacimde sulandırıldı. Kollajen omurgalıların birincil yapısal malzemesidir ve to- Sulandırılmış sperma içinde 30°C su bulunan bir kaba yer- plam vücut proteinlerinin yaklaşık % 20-30'unu oluşturan leştirilerek 5°C’a ayarlı soğuk vitrine yerleştirildi. Kaptaki en bol memeli proteinidir. Esas olarak mekanik fonksiyona suya buz kalıpları atarak suyun ısısı aşamalı olarak 1 saat sahip dokularda bulunur. Toplam vücut kollajeninin yak- içinde 5°C’ye indirildi. Ardından soğutulmuş sperma fi- laşık yarısı deridedir ve derm ve tendonun dermisinde bu- nalde %6 gliserol ihtiva eden K, K1, K5 ve K10 içeren su- lunan su dışındaki materyalin yaklaşık % 70'i kollajendir. landırıcı B (temel Tris-sitrat sulandırıcısına 76 g/L trehaloz Kollajen, doku ve organların oluşumunda ve hücrelerin ve 1.5 g/L EDTA ilave edilmiş) ile tekrar 1:1 oranında su- çeşitli fonksiyonel ifadelerinde önemli rol oynar.10 landırıldı. Eklenen sulandırıcı B miktarı 5 eşit hacme bölü- Kollajenin biyouyumluluk göstermesinin başlıca sebebi; nerek her 10 dakikada bir hacim eklendi. İkinci sulandır- kendi kendini birleştirme ve çapraz bağlama yoluyla eks- ma 50 dakikada tamamlandı. Ekilibrasyon sonrası sperma tra güç ve stabiliteye sahip lifler oluşturabilmesidir.10 Teke 0.25 mL’lik payetlere çekilerek, Nicool Plus PC program- spermasının dondurma-eritme sonrası sperm kalitesinin lanabilir dondurma makinasında (Air Liquide, Marne-la- düşmesinin sebebi sperm plazma membran hasarının Vallée Cedex 3, Fransa) +5°C’den -8°C’ye 3°C/dak. hızda artışıdır.7 Balık derisinden elde edilen özütte yüksek oran- ve -8°C’den -120°C’ye 25°C/dak hızda donduruldu ve sıvı 102 Ustuner et al. 2020 azot içine aktarıldı. Her gruptan en az 3 payet 37ºC/30sn’de ardından Tukey kullanılarak, akrozomal bozukluk (PSA) eritilerek eritme sonrası değerlendirmeler yapıldı. Sper- parametresi Kruskal Wallis kullanılarak analiz edildi. P ma taze aşamada ve eritme sonrası aşamalarda; motilite, <0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. plazma membran bütünlüğü Hypo-Osmotic Swelling Test Tablo 1. Farklı konsantrasyonda kollajen içeren (%1, %5 ve (HOST) ile ve akrozom hasarı yönünden FITC-Pisum sa- %10) sulandırıcıların eritme sonrası sperm parametreleri üzer- tivum agglutinin (FITC-PSA) boyama ile değerlendirildi. ine etkisi (x±Sx). Motilite: ıstıcı tablalı faz kontrast mikroskopta (Olympus BX 51, Japonya) (400x) sperma değerlendirilerek motil hücre sayısı % olarak belirlendi.7 Bulgular Çalışmada elde edilen taze spermaya ait ortalama motili- Grafik 1. Eritme sonrası motilite, plazma membran bütünlüğü te, plazma membran bütünlüğü ve akrozomal hasar oranı ve akrozom hasar oranının sulandırıcı gruplarına göre değişimi sırasıyla; %72 %76 ve %17 olarak belirlendi. Taze sperma değerleri eritme sonrası değerler ile karşılaştırıldığında HOST: Sperma numunesinden 20 µl alındı ve içinde vücut teke spermasının dondurma işleminden olumsuz yönde ısısında 1 mL 100 mOsm HOST medyumu bulunan tüplere etkilendiği tespit edildi (P<0.05). aktarılarak 37°C’ye ayarlı su banyosunda 1 saat bekletildik- Farklı sulandırıcılarla dondurulan teke spermasının eritme ten sonra HOST incelemeleri yapıldı. İnkübasyon sonrası sonrası motilite, plazma membran bütünlüğü ve akrozom- lam üzerine bir damla örnek aktarılarak üzeri lamel ile al hasar oranlarını Tablo 1’de sunulmuştur. kapatıldı. Hazırlanan preparat faz kontrast mikroskopta Eritme sonrası sulandırıcı gruplarının motilite değerleri (Olympus BX 51, Japonya) (x1000) büyütmede incelen- karşılaştırıldığında, kollajen içeren grupların motiliteleri- di. İncelemelerde kuyruk kısmı şişmiş ve kıvrık kuyruğa nin kollajen içermeyen kontrol grubuna göre daha yüksek sahip olan hücreler, plazma membran bütünlüğüne sahip olduğu gözlemlendi (P<0.05). K1, K5 ve K10 grupları ken- olarak değerlendirildi. Her preparattan toplam 200 hücre di içinde karşılaştırıldığında gruplar arasında istatistiksel sayılarak yüzde değerleri kaydedildi.7 fark görülmedi (P>0.05). Motilite ile paralellik gösteren (FITC-PSA): Akrozomal yapının belirlenmesi Kawakami plazma membran bütünlüğünün, kollajen ilave edilen gru- ve ark.12 tarafından bildirildiği gibi yapıldı. Kısaca metod plarda kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu tespit açıklanacak olursa; spermadan frotiler hazırlanarak ha- edildi (P<0.05). vada kurutuldu. Daha sonra kurutulan frotiler, 4ºC ısıda Eritme sonrası akrozom hasar oranları değerlendi- aseton ile 10 dakika tespit edildikten sonra karanlıkta 30 rildiğinde; akrozom hasarının sayısal olarak en yüksek dakika FITC-PSA (50 µg/mL fosfat buffer solüsyonu) ile kontrol grubunda olduğu gözlemlenmesine rağmen gru- boyandı. Boyama işleminden sonra fosfat buffer solüsyonu plar arasında istatistiksel bir fark tespit edilmedi (P>0.05). ile yıkanıp gliserol ile kaplanarak floresan mikroskop altın- da incelendi. Akrozomunun tamamı yeşil görünen sper- Sonuç ve Tartışma matozoitler sağlam olarak kabul edildi. Her bir preparattan Teke sperması diğer evcil hayvanların sperması gibi don- 200 spermatozoa incelenerek sağlam akrozoma sahip sper- durma prosedüründen olumsuz yönde etkilenmektedir.13,14 matozoa oranı (%) olarak belirlendi. Spermatozoa yapısı üzerine çalışmalar göstermektedir İstatistiksel Analiz ki; dondurma işlemi spermatozoanın plazma membran Sonuçlar SPSS (Windows için SPSS 23.0; SPSS, Chicago, bütünlüğüne, akrozom, mitokondri ve kuyruk yapısına IL, ABD) kullanılarak analiz edildi ve ortalama ± standart geri dönüşümü olmayan zarar vermektedir.15 Çalışmamız- sapma olarak sunuldu. Normallik testi olarak Shapiro Wilk da, taze spermaya göre eritme sonrası sperma motilitesinin testi kullanıldı. Semen parametrelerinden motilite ve pla- ve plazma membran bütünlüğünün azalması ve akrozom zma membran bütünlüğü (HOST) tek yönlü ANOVA ve hasarının artışı daha önce yapılan çalışmalarla uyumluluk 103 Ustuner et al. 2020 göstermektedir.5,16 değerlerinin daha düşük fakat plazma membran bütünlük Motilite spermatozoonun fonksiyonelliğini belirlemede oranının yüksek olması, kollajenin sperm plazma mem- kullanılan en önemli muayenedir. Motil olan spermato- bran yapısının korunmasında pozitif etkisi olduğu sonu- zoon, dişi genital kanalda doğrusal olarak ileri giderek cunu göstermektedir. oositi fertilize edebilir. Çalışmamızda elde edilen K, K1, Spermatozoanın ayrıntılı yapısının incelenmesi, dondu- K5 ve K10 gruplarına ait eritme sonrası sperm motilitel- rma prosedürünün akrozom, mitokondri ve kuyruk gibi eri sırasıyla %33,06, %43,06, %42,50 ve %41,67 olarak be- çeşitli sperm organellerine zarar verdiğini göstermekte- lirlendi. Kontrol grubu’nun motilitesi istatistiksel olarak dir.2 Çalışmanın akrozomal hasara ait veriler değerlendi- kollajen içeren gruplara göre oldukça düşük tespit edil- rildiğinde gruplar arasında istatistiksel bir fark olmaması- di (P<0.05). Bezerra ve ark.’nın17 eritme sonrası motilite na rağmen kontrol grubunun kollajen içeren gruplara göre değeri, çalışmamızın kontrol grubunun motilitesi ile ben- sayısal olarak daha yüksek olduğu gözlemlendi. Sun ve zerlik gösterirken, kollajen gruplarından oldukça düşük ark’nın18 eritme sonrası elde ettikleri akrozom hasarının olduğu gözlemlendi. Elde edilen sonuçlar Kulaksız ve (%46) kontrol grubumuzla (%42.5) benzer olduğu fakat K1 ark.’nın3 %5 ve %7 gliserol içeren yağsız süt ile dondurulan (%34.3), K5 (%32.0) ve K10 (%33.1) gruplarından yüksek Saanen ırkı teke spermasının eritme sonrası değerlerinden olduğu gözlemlendi. Benzer şekilde çalışmamızın kollajen düşük olduğu belirlendi. Aynı zamanda Büyükleblebici ve içeren gruplarının, Üstüner ve ark.’nın (2015) sonuçları ile ark.’nın4 Ankara keçilerinde %6 gliseol kullanarak dondu- kıyaslandığında akrozom hasar oranın çalışmamızda daha rdukları spermanın eritme sonrası motilite değerlerinin düşük olduğu tespit edildi. Kollajenin esnek film yapısını çalışmamızdaki değerlerden daha yüksek olduğu fakat oluşturarak membran hasarını düşürmüş olabilme ihtimali aynı araştırmacıların etilen glikol ve dimethil sulfoksid daha sonra yapılacak çalışmalara temel teşkil etmektedir. gruplarında ise aynı başarının elde edilemediği kollajen Sonuç olarak; teke spermasının dondurulmasında kul- gruplarındaki motilite değerlerimizin daha yüksek olduğu lanılan sulandırıcılara %1, %5 ve %10 oranında kollajen tespit edildi. Tür, ırk, bireysel farklılıklar, coğrafi konum, içeren özütün ilave edilmesi motilite ve plazma membran kullanılan sperma sulandırıcısı içeriği, soğutma hızı ve bütünlüğü üzerine olumlu etkisi gözlemlendi. Sperma don- dondurma tekniği gibi faktörler spermanın dondurulma durmak amacıyla sulandırıcıya %10 oranından daha fazla başarısını etkileyen ve bu konuda yapılan çalışmalarda elde özütün ilave edilmesi durumunda spermatolojik para- edilen sonuçlar arasındaki varyasyonun ana sebepleridir. metrelerin ne yönde etkileyeceği ve hangi oranda katıl- Plazma membran bütünlüğü spermatozoanın dişi geni- masının toksik etki yaratacağı, ileride yapılacak çalışma- tal kanalda fonksiyonelliğini sürdürebilmesi için gerek- larda ele alınacaktır. Bu çalışmanın Dünyada ve Türkiye’de lidir. Dondurma işlemi sperm plazma ve akrozom mem- ilk defa yapılıyor olması ve kontrol grubuna göre kollajen branının yapısını değiştirmektedir. Bu değişiklik membran içeren gruplarda eritme sonrası motilite ve plazma mem- yapısını temelden etkileyerek hasarlı ve apoptotik hücre bran bütünlüğünün daha üstün olması sonuçları daha da sayısının artmasına neden olarak spermatozoonun dondu- anlamlı kılmaktadır. rma sonrası fertilizasyon yeteneğinin azalmasına neden ol- maktadır.18 Ayrıca koç ve teke sperması, diğer evcil memeli Kaynaklar hayvanların spermasına göre membran yapıları daha has- 1. Özkoca A. Çiftlik hayvanlarında reprodüksiyon ve sas olup donma prosedüründen daha çok etkilenmektedir.7 suni tohumlama: İstanbul ÜniversitesiVeteriner Fa- Balık derisinden elde edilen kollajen içeriği olan jelatinin kültesi Yayınları. 1984. oldukça esnek film oluşturma özelliği çalışmanın hipo- 2. Lebouf B, Restall B, Salamon S. Production and sto- tezini oluşturmaktaydı.19,20 Sunulan çalışmada da kollajen rage of goat semen for artificial insemination. Anim gruplarında elde edilen plazma membran bütünlüğü kon- Reprod Sci. 2000; 62: 113-141. trol grubuna göre oldukça yüksek tespit edildi (P<0.05). 3. Kulaksız R, Arı UÇ, Daşkın A, et al. The effect of dif- Kollajenin dondurma amaçlı sperma sulandırıcılarında ilk ferent glycerol concentrations on freezability of semen defa sunulan çalışmada kullanılıyor olması; çalışmanın bu from Angora, Kilis and Saanen goats. Slovak J Anim kategoride mevcut araştırmalarla karşılaştırılmasını sınır- Sci. 2013; 46(2): 39-44. landırmaktadır. Çalışmamızda kollajen gruplarında elde 4. Büyükleblebici S, Tuncer PB, Taşdemir U, et al. The edilen plazma membran bütünlük oranlarının (%) Sharma comparison of three different cryoprotectants in cr- ve Sood’un21 bulgularından oldukça yüksek olduğu, kon- yopreservation of Angora goat semen. Kafkas Üniver- trol grubumuzun sadece benzerlik gösterdiği tespit edildi. sitesi Veteriner Fakültesi Dergisi. 2014; 20(4): 613-619. Aynı şekilde Büyükleblebici ve ark.’nın4 eritme sonuçları- 5. Ustuner B, Nur Z, Alcay S, et al. Effect of freezing rate na göre sunduğumuz çalışmanın eritme sonrası motilite on goat sperm morphology and DNA integrity. Tur- 104 Ustuner et al. 2020 kish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 2015; reservation. Cryobiology. 2020; 92: 146-150. 39: 110-114. 19. Go´mez-Guille´n MC. Role of lignosulphonate in pro- 6. Gororo E, Prince TZ, Fungayi P, et al. Effects of diffe- perties of fish gelatin films. Food Hydrocolloid. 2012; rent extenders and storage temperatures on longevity 27(1):60–71. of small East African goat (Capra hircus) semen. Small 20. Hosseini FS, Rezaei M, Zandi M, et al. Preparation and Rumin Research. 2019; 175: 83-89. functional properties of fish gelatin–chitosan blend 7. Hafez ESE. Semen evaluation, Reproduction in farm edible films. Food Chem. 2013; 136(3–4):1490–1495. animals. 6th ed. Lea and Fabiger, Philadelphia; 1993. 21. Sharma A, Sood P. Cryopreservation and fertility of 8. Toker MB, Alcay S, Gokce E, et al. Cryopreservation frozen thawed Chegu goat semen Indian J. Anim. Res. of ram semen with antioxidant supplemented soybean 2019; 53(11): 1414-1419. lecithin-based extenders and impacts on incubation resilience. Cryobiology. 2106; 72: 205-209. 9. Ustuner B, Gokce E, Toker MB, et al. Effect of sperm pooling with seminal plasma collected in breeding or nonbreeding season on Saanen goat sperm cryosurvi- val. Andrologia.2018; 50(4) DOI: 10.1111/and.12968. 10. Alfaro A da T, Balbinot E, Weber CI, et al. Fish gelatin: characteristics, functional properties, applications and future potentials. Food Eng Rev. 2015; 7:33–44 11. Aisen EG, Alvarez HL, Venturino A, et al. Effect of tre- halose and EDTA on cryoprotective action of ram se- men diluents. Theriogenology. 2000; 53(5): 1053-1061. 12. Kawakami E, Morita Y, Hori T, et al. Lectin-binding characteristics and capacitation of canine epididymal spermatozoa. J Vet. Med. Sci. 2002; 64: 543-549. 13. Roth T, Bush LM, Wildt DE, et al. ScimitarHorned Oryx (Oryx dammah) spermatozoa are functionally competent in a heterologous bovine in vitro fertili- zation system after cryopreservation on dry ice, in a dry shipper, or over liquid nitrogen vapour. Biology of Reproduction. 1999; 60: 493– 498. 14. Ustuner B, Günay U, Nur Z. Effect of seminal plasma, egg yolk, and season on the freezability of Saanen buck semen. Bulletin of The Veterinary Instıtute In Pulawy. 2009; 53: 369-374. 15. Watson PF. The causes of reduced fertility with cryop- reserved semen. Animal Reproduction Science. 2000; 60: 481– 492. 16. Ritar AJ, Salamon S. Effects of seminal plasma and its removal and of egg yolk in the diluent on the survival of fresh and frozenthawed spermatozoa of the An- gora goat. Australian Journal of Biological Sciences. 1982; 35: 305– 312. 17. Bezerra F, Brilhante S, Castelo T de S, et al. Assessment of the interaction between straw size and thawing rate and its impact on in vitro quality of post-thaw goat semen. R. Bras. Zootec. 2012; 41(3), http://dx.doi. org/10.1590/S1516-35982012000300016. 18. Sun L,Wenhua F, Caifeng W, et al. Effect of substitu- ting different concentrations of soybean lecithin and egg yolk in tris-based extender on goat semen cryop- 105