KESTANE SÜTÜ İLE ZENGİNLEŞTİRİLMİŞ KEFİR ÜRETİMİ Buse USTA GÖRGÜN T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KESTANE SÜTÜ İLE ZENGİNLEŞTİRİLMİŞ KEFİR ÜRETİMİ Buse USTA GÖRGÜN 0000-0002-6597-7651 Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ-ERSAN (Danışman) DOKTORA TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI BURSA – 2022 Her Hakkı Saklıdır TEZ ONAYI Buse USTA GÖRGÜN tarafından hazırlanan “KESTANE SÜTÜ İLE ZENGİNLEŞTİRİLMİŞ KEFİR ÜRETİMİ” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı’nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman : Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ-ERSAN Başkan : Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ-ERSAN 0000-0001-9588-6200 Bursa Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı İmza Üye : Prof. Dr. Tülay ÖZCAN 0000-0002-0223-3807 Bursa Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı İmza Üye : Prof. Dr. Cevriye MERT 0000-0003-3092-5023 Bursa Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı İmza Üye : Doç. Dr. İlyas ATALAR 0000-0001-8560-0010 Eskişehir Osmangazi Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı İmza Üye : Dr. Öğr. Üyesi Gökhan AKARCA 0000-0002-5055-2722 Afyon Kocatepe Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı İmza Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Hüseyin Aksel EREN Enstitü Müdürü ../../…. B.U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; − tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, − görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, − başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, − atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, − kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, − ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 28/02/2022 Buse USTA GÖRGÜN TEZ YAYINLANMA FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezin/raporun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kâğıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma izni Bursa Uludağ Üniversitesi’ne aittir. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet hakları ile tezin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları tarafımıza ait olacaktır. Tezde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanılması zorunlu metinlerin yazılı izin alınarak kullandığını ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederiz. Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” kapsamında, yönerge tarafından belirtilen kısıtlamalar olmadığı takdirde tezin YÖK Ulusal Tez Merkezi / B.U.Ü. Kütüphanesi Açık Erişim Sistemi ve üye olunan diğer veri tabanlarının (Proquest veri tabanı gibi) erişimine açılması uygundur. Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ-ERSAN 28.02.2022 Buse USTA GÖRGÜN 28.02.2022 İmza Bu bölüme kişinin kendi el yazısı ile okudum anladım yazmalı ve imzalanmalıdır. İmza Bu bölüme kişinin kendi el yazısı ile okudum anladım yazmalı ve imzalanmalıdır. i ÖZET Doktora Tezi KESTANE SÜTÜ İLE ZENGİNLEŞTİRİLMİŞ KEFİR ÜRETİMİ Buse USTA GÖRGÜN Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ-ERSAN Bu çalışmada, kestane (Castanea sativa Mill.) sütü ve rekonstitüe süt karışımı ile starter olarak ticari kültür ve dane kullanılarak üretilen kefirlerin mikrobiyolojik, fiziko- kimyasal, tekstürel, antioksidatif ve duyusal özellikleri araştırılmıştır. Kestane sütü üretimi optimizasyonu, yüzey yanıt yöntemi (RSM)’ne göre, sulandırma oranı (𝑥1), sulandırma sıcaklığı (𝑥2), pastörizasyon süresi (𝑥3) ve pastörizasyon sıcaklığı (𝑥4) değişkenleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Optimizasyon sonuçlarına göre, kestane sütü üretiminde sulandırma oranı 1/4, sulandırma sıcaklığı 37,562°C, pastörizasyon süresi 24,996 dk ve pastörizasyon sıcaklığı 84,433°C olarak kullanılmıştır. Kestane sütü konsantrasyonları % 0, 10, 20, 30, 40, 50 ve 100 olacak şekilde rekonstitüe süte ilave edilerek kefir üretimi gerçekleştirilmiştir. Kefir örneklerinde Lactobacillus sayısı 7,24- 9,51 kob/mL; Lactococcus sayısı 7,27-10,33 kob/mL; asetik asit bakteri sayısı 5,08-8,75 kob/mL; maya sayısı 1,48-7,90 kob/mL; titrasyon asitliği % 0,20-1,16; serum ayrılması 0-14,50 mL/25 g; kurumadde % 9,02-14,29; kül % 0,53-0,92; protein % 2,20-4,40; yağ % 0,13-0,47; asetaldehit 0,82-3,66 mg/100 mL; diasetil değeri 1,11-117,28 mg/100 mL; etil alkol 26,61-146,51 mg/100 mL; karbondioksit 92,40-507,10 mg/100 mL; ABTS 8,62- 37,05 mg/100 mL; FRAP 5,31-25,84 mg/100 mL; DPPH 8,67-24,26 mg/100 mL ve toplam fenolik madde 77,67-341,47 mg/100 mL değerleri arasında değişmiştir. Kefir örneklerinde arjinin, lösin ve alanin amino asitleri; oleik, palmitik ve linoleik yağ asitleri; sitrik, formik ve okzalik organik asitleri; K, Ca ve P elementleri ile C, A ve E vitamini değerlerinin yüksek olduğu gözlenmiştir. Kefir örneklerinde renk değerleri ve tekstürel parametreler arasındaki farklılıkların istatistiksel olarak önemli (p<0,01) olduğu belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre kestane sütünün fonksiyonel bileşim ve teknolojik anlamda kefirin özelliklerini geliştirdiği ve tüketici açısından kabul edilebilirliğinin yüksek olduğu saptanmıştır. Anahtar Kelimeler: Kefir, kestane sütü, optimizasyon, rekonstitüe süt 2022, xiii + 246 sayfa. ii ABSTRACT PhD Thesis KEFIR PRODUCTION FORTIFIED WITH CHESTNUT MILK Buse USTA GÖRGÜN Bursa Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ-ERSAN In the present study, microbiological, physico-chemical, textural, sensory and antioxidative properties of kefir produced with chestnut milk and reconstituted milk mixture as well as with commercial culture and grain were investigated. Optimization of chestnut milk production was performed using the dilution rate (𝑥1), dilution temperature (𝑥2), pasteurization time (𝑥3) and pasteurization temperature (𝑥4) variables according to response surface method (RSM). According to the optimization results, the dilution rate of 1/4, dilution temperature of 37,562°C, pasteurization time of 24,996 minutes and pasteurization temperature of 84,433°C were used in chestnut milk production. Kefir production was carried out by adding chestnut milk at the rate of 0, 10, 20, 30, 40, 50 and 100 % to reconstituted milk. Lactobacillus cell counts in kefir samples determined between 7,24-9,51 cfu/mL; whilst Lactococcus counts varied between 7,27-10,33 cfu/mL; acetic acid bacteria counts 5,08-8,75 cfu/mL; yeast population 1,48-7,90 cfu/mL; titratable acidity 0,20-1,16 %; serum separation 0-14,50 mL/25 g; dry matter 9,02- 14,29%; ash 0,53-0,92 %; protein 2,20-4,40 %; fat 0,13-0,47 %; acetaldehyde 0,82-3,66 mg/100 mL; diacetyl value 1,11-117,28 mg/100 mL; ethyl alcohol 26,61-146,51 mg/100 mL; carbon dioxide 92,40-507,10 mg/100 mL; ABTS 8,62-37,05 mg/100 mL; FRAP 5,31-25,84 mg/100 mL; DPPH 8,67-24,26 mg/100 mL; and total phenolic compounds 77,67- 341,47 mg/100 mL. It has been observed that arginine, leucine and alanine amino acids; oleic, palmitic and linoleic fatty acids; citric, formic and oxalic organic acids; K, Ca and P elements and the vitamin C, A and E values were high in kefir samples. The differences between color values and textural parameters in samples were found as statistically significant (p<0,01). Depending upon the obtained outcomes, one could state that chestnut milk has improved the properties of kefir in terms of functional nutrients and technology, and its use with reconstituted milk has high/significant consumer acceptability. Key words: Kefir, chestnut milk, optimization, reconstituted milk 2022, xiii + 246 pages. iii TEŞEKKÜR Doktora eğitimim süresince, tüm desteğiyle yanımda olan, değerli bilgi ve tecrübeleri ile yol göstericim, kıymetli danışman hocam, Sayın Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ-ERSAN ’a Eğitimim süresince desteğini her zaman hissettiğim, bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen değerli hocalarım, Sayın Prof. Dr. Tülay ÖZCAN ve Sayın Doç.Dr. Arzu AKPINAR- BAYİZİT’e Tez çalışmamda yer alan çoklu yanıt yüzey optimizasyonu konusunda bilgi ve tecrübelerine başvurduğum değerli hocam, Sayın Prof. Dr. Saliha ŞAHİN’e Tez izleme komitemde yer alarak, benimle bilgi ve tecrübelerini paylaşan değerli hocam, Sayın Prof. Dr. Cevriye MERT’e Laboratuvar çalışmalarım sırasında manevi destekleri ve yardımları için Melike CİNİVİZ, Gökçe KESER, Merve DEMİRAY TEYMUROĞLU, Şengül TEKSOY ‘a Tez projeme maddi destek sağlayan Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu’na (TÜBİTAK; 118O428) ve Bursa Uludağ Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi’ne (DDP(Z)-2019/8) Bana hayatta önce saygı ve sevgi dolu bir insan olmayı, aldığım kararların arkasında durmayı, zorluklarla baş etmeyi öğreten, bana güvenen ve her zaman destekleyen biricik kızları olduğum canım babam Aygün USTA ve canım annem Sema USTA‘ya Bu süreçte sonsuz sevgisi, desteği, güzel enerjisi ve sabrı ile yanımda olan en büyük şansım, sevgili eşim Erman GÖRGÜN’e Sonsuz minnet ve teşekkürlerimi sunarım. Buse USTA GÖRGÜN 28/02/2022 iv İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET………………………………………………………………………….. i ABSTRACT…………………………………………………………………… ii TEŞEKKÜR…………………………………………………………………… iii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ……………………………………. vi ŞEKİLLER DİZİNİ……………………………………………………………. ix ÇİZELGELER DİZİNİ………………………………………………………... xi 1.GİRİŞ………………………………………………………………………... 1 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI……………….. 7 2.1. Fonksiyonel Gıdalar………………………………………………...…….. 7 2.2. Probiyotikler………………………………………………………………. 11 2.2.1. Probiyotik mikroorganizmaların sağlık üzerine etkileri………………… 16 2.2.2. Probiyotiklerin güvenilirliği…………………………………………….. 17 2.2.3. Postbiyotikler …………………………………………………………... 18 2.3. Bitkisel Sütler……………………………………………………………... 19 2.4. Kestane……………………………………………………………………. 25 2.4.1. Kestanenin besinsel bileşimi ve fonksiyonel özellikleri………………… 28 2.4.2. Kestanenin kullanım alanları……………………………………………. 31 2.5. Deneysel Tasarım ve Optimizasyon…………………………..…………... 31 2.5.1. Yanıt yüzey deney tasarımları…………………………………………... 32 2.5.2. Merkezi kompozit dizayn (CCD) ……………………………………… 34 2.6. Tez Çalışmasına Benzer Araştırmalar……………………………………. 36 3. MATERYAL ve YÖNTEM………………………………………………… 46 3.1. Kestane Sütü Üretimi ve Optimizasyonu………………………………….. 46 3.1.1.Materyal……………………………………………….………………… 46 3.1.2. Deney tasarımı…………………………………………………………... 46 3.1.3. Kestane sütü üretimi…………………………………………………….. 48 3.1.4. Kestane sütü örneklerine uygulanan analizler…………………...……… 49 3.2. Kestane Sütü ile Zenginleştirilmiş Kefir Üretimi……………………...….. 56 3.2.1.Materyal…………………………………………………………………. 56 3.2.2. Yöntem………………………………………………………………….. 57 3.2.3. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinde yapılan mikrobiyolojik analizler……………………………………………………….. 60 3.2.4. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinde yapılan fizikokimyasal analizler……………………………………………….............. 61 3.2.5. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinde yapılan duyusal analiz…………………………………………………………………………... 71 3.2.6. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinde yapılan istatistiksel analizler………………………………………………………………………... 72 4. BULGULAR ve TARTIŞMA ........................................................................ 73 4.1. Kestane Sütü Örneklerine ait Analiz Sonuçları…………………………… 73 4.2. Kestane Sütünün Optimizasyonu…………………………………………. 86 4.3. Kestane Sütü ile Zenginleştirilmiş Kefir Örneklerine ait Analiz Sonuçları.. 108 4.3.1. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin mikrobiyolojik özellikleri. ………………………………………………………………...…... 108 v 4.3.2. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin fizikokimyasal özellikleri. …………………………………...………………………………... 117 4.3.3. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin duyusal özellikleri……………………………………………………………………… 193 5.SONUÇ……………………………………………………………………… 208 KAYNAKLAR………………………………………………………………... 214 ÖZGEÇMİŞ…………………….……………………………………………... 245 vi SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama L* Açıklık veya koyuluğu ifade eden renk değeri a* kırmızılık veya yeşilliği ifade eden renk değeri b* sarılık veya maviliği ifade eden renk değeri BaCI2 Baryum klorür Ca Kalsiyum cm santimetre cm3 santimetre küp CO2 Karbondioksit Cu Bakır dk dakika Fe Demir g gram gs gram*saniye ha hektar alan HCI Hidroklorik asit HNO3 Nitrik asit H2O2 Hidrojen peroksit H2SO4 Sülfirik asit K Potasyum kcal kilokalori kg kiogram KOH Potasyum hidroksit lt litre mg miligram Mg Magnezyum mL mililitre mm milimetre nm nanometre mPa megapaskal N normal Na Sodyum NaHCO5 Sodyum bikarbonat NaOH Sodyum hidroksit P Fosfor ppm Milyonda bir psi (He) libre rpm dakikadaki devir sayısı s saniye Zn Çinko µmol mikromol % yüzde °C Santigrat derece vii Kısaltmalar Açıklama ABD Amerika Birleşil Devletleri ABTS 2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) ANOVA Varyans analizi ANVISA Brezilya Sağlık Düzenleme Ajansı APM Acetobacter Peroxydans Medium CCD Central Composite Design / Merkezi Kompozit Dizayn CFS Hücre içermeyen süpernatanlar CVD Kardiyovasküler Hastalık DNA Deoksiribo nükleik asit DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil E.coli Escherichia coli EFSA Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi EPS Ekzopolisakkarit FAO Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü FDA Gıda ve İlaç İdaresi FFC Fonksiyonel Gıda Merkezi FOSHU Spesifik Sağlık Faydaları Bulunan Gıdalar FRAP Demir-indirgeme Antioksidan Gücü FUFOSE Avrupa ‘da Fonksiyonel Besin Bilimleri F-Testi Fisher testi GABA Gama aminobütirik asit GAE Gallik asit eşdeğeri GC-MS Gaz Kromatografi – Kütle Spektrometre GPx Glutatyon Peroksidaz HPLC Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi ICP-OES İndüktif Eşleşmiş Plazma Optik Emisyon Spektrometre IDF Uluslararası Sütçülük Federasyonu IFT Gıda Teknolojisi Uzmanları Enstitüsü ILSI Uluslararası Yaşam Bilimleri Enstitüsü KM Kurumadde Kob Koloni oluşturan birim LA Laktik asit LAB Laktik asit bakterileri LSD Least Significant Difference / Çoklu Karşılaştırma Testi Log Logaritmik MÖ Milattan Önce MRS De Man Regosa and Sharp RDI Referans Günlük Alım RSM Response Surface Model / Yüzey Yanıt Yöntemi rRNA Ribozomal Ribonükleik Asit R2 Regresyon Kaysayısı SCFA/KZYA Kısa Zincirli Yağ Asitleri SOD Süperoksit Peroksidaz Spp Türler TE Troloks eşdeğeri TFM Toplam Fenolik Madde viii TPA Tekstür Profil Analizi TPTZ Fe (III) Tripiridiltriazin TÜİK Türkiye İstatistik Kurumu UHT Ultra High Temperature / Ultra Yüksek Sıcaklık YGCA Yeast Glucose Chloramphenicol Agar / Maya Glukoz Klorampenikol Besiyeri WHO Dünya Sağlık Örgütü ix ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Fonksiyonel gıda kavramının tarihsel gelişim süreci 8 Şekil 2.2. Fonksiyonel gıda tanımları 10 Şekil 2.3. Bitkisel sütlerin genel üretim aşamaları 23 Şekil 2.4. Hammaddelerine göre bitkisel sütlerin sınıflandırılması 24 Şekil 2.5. Merkezi kompozit tasarım grafiksel gösterimi 34 Şekil 3.1. Kestane sütü üretimi 48 Şekil 3.2. ABTS, FRAP ve FOLIN yöntemlerinde elde edilen kalibrasyon grafikleri 53 Şekil 3.3. L*, a* ve b* parametrelerinin renk skalası 53 Şekil 3.4. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir üretimi 58 Şekil 3.5. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş ticari starter kültür ve kefir danesi kullanılarak üretilen kefirlere ait fotoğraflar 59 Şekil 3.6. Asetaldehit kalibrasyon grafiği 65 Şekil 3.7. Diasetil kalibrasyon grafiği 66 Şekil 3.8. Etil alkol kalibrasyon grafiği 66 Şekil 3.9. A vitamini standartlarına ait kromatogram, b) A vitamini örnek kromatogramı 69 Şekil 3.10. A vitaminine ait kalibrasyon grafiği 69 Şekil 3.11. E vitamini standartlarına ait kromatogram, b) E vitamini örnek kromatogramı 70 Şekil 3.12. E vitamini kalibrasyon grafiği 70 Şekil 3.13. Back ekstrüzyon tekniğine göre güç-zaman grafiklerinden elde edilen tekstür parametreleri 71 Şekil 4.1. ABTS metodu ile toplam antioksidan kapasite miktarının, sulandırma oranı ve sulandırma sıcaklığı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 97 Şekil 4.2. ABTS metodu ile toplam antioksidan kapasite miktarının, pastörizasyon süresi ve sulandırma oranı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 98 Şekil 4.3. ABTS metodu ile toplam antioksidan kapasite miktarının, sulandırma oranı ve pastörizasyon sıcaklığı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 99 Şekil 4.4. ABTS metodu ile toplam antioksidan kapasite miktarının, pastörizasyon süresi ve sulandırma sıcaklığı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 100 Şekil 4.5. ABTS metodu ile toplam antioksidan kapasite miktarının, pastörizasyon sıcaklığı ve sulandırma sıcaklığı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 101 Şekil.4.6. FRAP metodu ile toplam antioksidan kapasite miktarının, pastörizasyon süresi ve sulandırma oranı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 102 Şekil 4.7. FRAP metodu ile toplam antioksidan kapasite miktarının, pastörizasyon sıcaklığı ve sulandırma oranı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 103 x Şekil 4.8. FRAP metodu ile toplam antioksidan kapasite miktarının, pastörizasyon sıcaklığı ve sulandırma sıcaklığı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 104 Şekil 4.9. Toplam fenolik madde miktarının, sulandırma oranı ve sulandırma sıcaklığı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 105 Şekil 4.10. Toplam fenolik madde miktarının, pastörizasyon sıcaklığı ve sulandırma oranı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 106 Şekil 4.11. Toplam fenolik madde miktarının, pastörizasyon sıcaklığı ve sulandırma sıcaklığı ile değişimini gösteren yanıt yüzey grafiği 107 Şekil 4.12. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir üretimine ait duyusal özelliklerin örnekler arasında değerlendirilmesi 207 xi ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1.1. Fonksiyonel Gıdaların Sınıflandırılması 1 Çizelge 2.1. Kestanenin taksonomik sınıflandırılması 26 Çizelge 2.2. Kestane ağacının botanik özellikleri 27 Çizelge 3.1. Merkezi kompozit dizaynda kestane sütü üretimi için deneysel değerler 47 Çizelge 3.2. Merkezi tümleşik desen için bağımsız değişkenler 47 Çizelge 3.3. Rekonstitüe süt üretiminde kullanılan süttozunun bileşimi 56 Çizelge 3.4. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir üretimine ilişkin deneme deseni 57 Çizelge 4.1 Kestane sütü örneklerine ait pH, titrasyon asitliği, briks, kurumadde, kül, KM’de protein ve yağ değerleri 74 Çizelge 4.2. Kestane sütü örneklerinin tekstürel ve enstrümental renk özellikleri 80 Çizelge 4.3. Kestane sütü örneklerinin ABTS (mg Troloks/kg örnek), FRAP (mg Troloks/kg örnek) ve TFM (mg Gallik asit/kg örnek) değerleri 82 Çizelge 4.4. Kestane sütü örneklerinin tamamlayıcı duyusal değerlendirme sonuçları 88 Çizelge 4.5. Kestane sütü optimizasyonu sonucu elde edilen deneysel değerler ile tahmini değerler 93 Çizelge 4.6. Kestane sütü üretimi optimizasyonu ANOVA sonuçları 95 Çizelge 4.7. Cevap değişkenler için ikinci dereceden polinomial eşitlikler 95 Çizelge 4.8. Kestane sütü üretimi için optimizayon sonuçları 96 Çizelge 4.9. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince Lactobacillus cinsi bakteri sayısının (log10 kob/mL) değişimi 108 Çizelge 4.10. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince Lactococcus cinsi bakteri sayısının (log10 kob/mL) değişimi 112 Çizelge 4.11. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince asetik asit cinsi bakteri sayısının (log10 kob/mL) değişimi 113 Çizelge 4.12. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince maya sayısının (log10 kob/mL) değişimi 115 Çizelge 4.13. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin mikrobiyolojik özelliklerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 116 Çizelge 4.14. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince titrasyon asitliği değerlerindeki değişim (% laktik asit) 118 Çizelge 4.15. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince serum ayrılması (mL/25 g) değerlerinin değişimi 120 xii Çizelge 4.16. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin titrasyon asitliği, serum ayrılması ve su tutma kapasitesi değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 121 Çizelge 4.17. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince su tutma kapasitesi (%) değerlerinin değişimi 123 Çizelge 4.18. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin depolama süresince kurumadde (%), kül (%), protein (%) ve yağ (%) değerlerinin değişimi 124 Çizelge 4.19. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin kurumadde, kül, protein ve yağ değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 129 Çizelge 4.20. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin depolamanın 1. ve 21. gününde belirlenen serbest amino asit değerlerinin (mg/100 g) değişimi 140 Çizelge 4.21. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin amino asit değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 143 Çizelge 4.22. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin depolamanın 1. ve 21. gününde belirlenen serbest yağ asidi değerlerinin (%) değişimi 150 Çizelge 4.23. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin yağ asidi değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 152 Çizelge 4.24. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin depolamanın 1. ve 21. gününde belirlenen organik asit değerlerinin (mg/100 g) değişimi 158 Çizelge 4.25. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin organik asit değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 160 Çizelge 4.26. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin depolamanın 1. ve 21. günlerinde belirlenen asetaldehit, diasetil, etil alkol ve karbondioksit değerlerinin değişimi 163 Çizelge 4.27. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin asetaldehit, diasetil, etil alkol ve karbondioksit parametrelerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 168 Çizelge 4.28. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince ABTS, FRAP, DPPH ve TFM değerlerinin değişimi 171 Çizelge 4.29. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin ABTS, FRAP, DPPH ve TFM parametrelerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 174 Çizelge 4.30. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin mineral madde değerlerinin (mg/100 g) değişimi 176 Çizelge 4.31. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin Vitamin C, A ve E değerlerinin (mg/100 g) değişimi 177 Çizelge 4.32. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince L* değerlerinin değişimi 179 Çizelge 4.33. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince a* değerlerinin değişimi 181 xiii Çizelge 4.34. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince b* değerlerinin değişimi 182 Çizelge 4.35. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin renk (L*, a*, b*) değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 184 Çizelge 4.36. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince sıkılık (g) değerlerinin değişimi 185 Çizelge 4.37. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince konsistens (gs) değerlerinin değişimi 187 Çizelge 4.38. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince iç yapışkanlık (g) değerlerinin değişimi 189 Çizelge 4.39. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin 21 gün depolama süresince viskozite indeksi (gs) değerlerinin değişimi 191 Çizelge 4.40. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin tekstür analiz parametrelerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 192 Çizelge 4.41. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin duyusal özelliklerinden renk kriteri değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 194 Çizelge 4.42. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin duyusal özelliklerinden görünüş kriteri değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 198 Çizelge 4.43. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin duyusal özelliklerinden kıvam kriteri değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 199 Çizelge 4.44. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin duyusal özelliklerinden tat kriteri değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 201 Çizelge 4.45. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin duyusal özelliklerinden aroma kriteri değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 204 Çizelge 4.46. Kestane sütü ile zenginleştirilmiş kefir örneklerinin duyusal özelliklerinden koku kriteri değerlerine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları 206 1 1. GİRİŞ Günümüzde insanların yaşamlarındaki farklılaşma; (küreselleşme, hızlı nüfus artışı ve kentleşme, günlük hayatta stresin artması, çeşitli hastalıkların ortaya çıkması, sağlık harcamalarındaki artış) çeşitli gıdaların sağlığa olan olumlu etkileri, tüketici beklentileri ve beslenme alışkanlıklarında değişime neden olmuştur. Bununla birlikte, ülkelerin ulusal gelirleri ya da yaşam standartları yükseldikçe, tüketicilerin sağlıklı beslenme bilinci ve kaliteli yaş alma farkındalığının artışı; beslenme değerlerinin yanı sıra sağlık üzerine olumlu etkiler gösteren fonksiyonel gıda ya da gıda bileşenleri üzerine yapılan bilimsel çalışmaların sayısını da arttırmaktadır. Bu gıda ya da gıda bileşenleri “bilinen besin değerlerinin yanı sıra, bileşimlerine bağlı olarak insan vücudunda olumlu fizyolojik etkiler gösteren maddeler” olarak tanımlanmaktadır (Bech-Larsen & Grunert, 2003; Niva, 2007; Scrinis, 2008; Lobo vd., 2010; Betoret vd., 2011; Dayısoylu vd., 2014; Kandirali, 2014; De Toledo Guimarães vd., 2018). Fonksiyonel gıdalar bazı çalışmalara göre; “takviye edilmiş”, “zenginleştirilmiş”, “değiştirilmiş / istenmeyen bir bileşiği çıkartılan” ve “bir bileşeni arttırılmış” gıda olmak üzere 4 grupta sınıflandırılmaktadır (Çizelge 1). Gıdalar içerisindeki bazı bileşikler fermantasyon ile değişikliğe uğratılarak, pişirme ile biyoyararlığı artırılarak veya farklı gıda kombinasyonlarının aynı matrikste birleştirilmesi ile fonksiyonel gıdalar üretilmektedir. Bunun yanı sıra probiyotikler, prebiyotikler, fenolik maddeler, antioksidanlar, besinsel lifler, oligosakkaritler, vitaminler, mineraller, çoklu doymamış yağ asitleri, sülfür içeren bileşenler ve fitokimyasallar gıdalara eklenerek yeni fizyolojik özellikte fonksiyonel ürünler tasarlanmaktadır (Bech-Larsen & Grunert, 2003; Niva, 2007; Scrinis, 2008; Lobo vd., 2010; Betoret vd., 2011; Bigliardi & Galati, 2013; Dayısoylu vd., 2014; Kandirali, 2014; De Toledo Guimarães vd., 2018). Çizelge 1.1. Fonksiyonel gıdaların sınıflandırılması Fonksiyonel Gıda Belirleyici Özellik Takviye edilmiş gıda Belirli bir gıda bileşeni ile zenginleştirilen gıdalar Zenginleştirilmiş gıda Normalde belirli bir gıdada bulunmayan ilave besin maddeleri veya bileşenleri bulunan gıdalar Değiştirilmiş gıda Zararlı bir bileşeni kaldırılmış veya sağlıklı bir bileşen ile değiştirilmiş gıdalar Bir bileşeni arttırılmış gıda Gıdadaki bir bileşeninin arttırılması 2 Probiyotik kelimesi ilk kez 1965 yılında Lilly ve Stillvell tarafından kullanılmış olup Yunanca’ da “yaşam için olan” anlamına gelmektedir. Literatürde birlikte kültürü yapılan iki organizmadan birinin ürettiği ve diğerinin gelişimini uyaran bir madde olarak tanımlanmış, mikroorganizma gelişimini arttıran bir doku ekstraktının tanımlanmasında probiyotik terimi kullanılmıştır. Bugün kullanıldığı anlamıyla probiyotik tanımı ilk kez 1974 yılında Parker tarafından, “hayvan yemlerinde yer alan ve konakçının intestinal mikrobiyota dengesinin gelişmesini arttıran maddeler ve organizmalar” olarak kullanılmıştır. Fuller, probiyotikleri 1989 yılında “konakçının intestinal mikrobiyotasının gelişimini destekleyen canlı mikrobiyal katkı maddeleri” olarak tanımlamıştır. Bu terim; intestinal sistemin mikrobiyal dengesini geliştirerek konakçı hayvanın sağlığı üzerinde yararlı etkileri olan canlı mikrobiyal yem destekleyici maddeyi ifade etmektedir. 2002 yılında Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü (FAO) ile Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından probiyotikler, “yeterli miktarda alındığında konakçı sağlığı üzerine olumlu etkiler gösteren canlı mikroorganizmalar” olarak tanımlanmıştır. Probiyotiklerin bu tanımı, Uluslararası Probiyotik ve Prebiyotik Bilim Derneği tarafından onaylanmış olup halen kullanılmaktadır. Probiyotik bakteriler arasında Lactobacillus ve Bifidobacterium türleri en fazla kullanılan türlerdir. Escherichia coli ve Bacillus türleri, mayalardan Saccharomyces boulardii probiyotik mikroorganizmalar arasında yer almaktadır. Clostridium butyricum’un da bu mikroorganizmalar arasında yer alabileceği, yakın zamanda, Avrupa Birliği'nde yapılan çalışmalarda bildirilmiştir. Probiyotik ürün ise “içerisinde konakçı sağlığı üzerinde olumlu etkileri olan mikroorganizmaları içeren gıdalar veya çeşitli enzim, vitamin ve aroma bileşenleri ile geliştirilmiş direkt kapsül / tablet haline getirilmiş diyet destekleyicisi ürünler” olarak tanımlanmaktadır (Gatlin & Peredo, 2012; Hill vd., 2014; Markowiak & Śliżewska, 2017) İlaçların yan etkileri nedeniyle ilaç kullanımına karşı olan ön yargılar, bu formda hazırlanmış probiyotik ürünlerin kullanımını sınırlamakta; fonksiyonel gıdaların uygun dozda ve şartlarda alındığı takdirde herhangi bir yan etki durumuyla karşılaşılmaması da tüketicilerin dünya genelinde probiyotik mikroorganizmaları içeren gıdalara olan talebini hızla arttırmaktadır. Sağlıklı yaşamın destekleyicisi olarak nitelendirilen bu tip ürünlere olan talebin gün geçtikçe artması; starter kültür üreticilerini, probiyotik mikroorganizmaları içeren kültürlerin, sağlıklı beslenme konusunda bilinçli üreticilere ve tüketicilere güvenle sağlanması konusunda cesaretlendirmektedir. Fermente süt 3 ürünlerinin, bu mikroorganizmaları tüketicilere en iyi taşıyabilecek besinlerin arasında olduğu bildirilmektedir. Fermente süt ürünlerinde olduğu gibi probiyotiklerin kullanımı, bir gıdanın bileşimine starter kültürün yanında bu mikroorganizmaların da eklenerek ürüne probiyotik özelliklerin kazandırılması şeklinde olmaktadır. Piyasada yer alan fermente süt ürünleri; fermente süt içeceği, yoğurt, kefir, dondurma, dondurulmuş tatlı ve ekşitilmiş krema olarak çeşitlendirilmektedir. Fermente süt ürünlerinde, fermantasyon ile birlikte gelen doğal fonksiyonel özellikler, probiyotik etkili mikroorganizmaların kullanımıyla artmaktadır (Taibi & Comelli, 2014; Reid, 2016; Rakib vd., 2017; Taibi & Tan, 2021). Yoğurt ve benzeri fermente süt ürünleri farklı kuruluşlar tarafından çeşitli şekillerde tanımlanmıştır. Uluslararası Sütçülük Federasyonu (IDF), fermente süt ürünlerini “tam yağlı, yarım yağlı, az yağlı, yağsız süt, konsantre süt, süt tozuyla kuru maddesi artırılmış süt, homojenize ya da homojenize edilmemiş, pastörize ya da sterilizasyon işleminden sonra soğutulup özel laktik asit bakterilerini içeren starter kültürleriyle tek başlarına ya da karışımları kullanılarak fermente edilmiş, içerisinde tüketimden önce canlı laktik asit bakterileri içeren bir ürün” olarak tanımlamaktadır (Shiby & Mishra, 2013; Gasmalla vd., 2017). Günümüz tüketici profilinin sağlıklı beslenme konusunda bilinçlenmesi, fonksiyonel özellikleri arttırılmış gıdalara yönelim ile sağlıklı yaşam tarzını benimsemesi, pek çok gıdada olduğu gibi süt ve ürünlerinde de zenginleştirme çalışmaları yapılmasına olanak sağlamıştır. Dünyada fonksiyonel gıda pazarı gün geçtikçe büyümektedir. İngiliz Araştırma Şirketi (Leatherhead Food International) verilerine göre küresel fonksiyonel gıda pazarı 2009 –2013 yılları arasında % 26,7’lik bir büyüme göstermiş ve bu büyümenin % 70’ini süt ve ürünlerinin oluşturmaktadır. 2018 yılında fonksiyonel gıda pazar hacminin yaklaşık 161 ABD doları olduğu bildirilmekte, 2019 – 2025 yılları arasında % 7 büyümesi öngörülmektedir. Türkiye’de fonksiyonel gıda pazarı, büyüme oranındaki artışa rağmen, gelişim aşamasında olup yapılan çalışmalarda tüketicilerin bu gıdalara yönelik farkındalık ve bilgi düzeylerinin oldukça düşük olduğu bildirilmektedir. Tüketicilerin kalorisi düşük ürünlerle başlayan sağlıklı beslenme eğilimi, piyasada yer alan laktozsuz süt, probiyotik ve prebiyotik süt ürünleri, özellikle çocuklar için hazırlanmış kalsiyum açısından zengin süt ürünleri vb. ile hızla gelişmektedir. Ulusal pazarda fonksiyonel ürünler, i) probiyotik, prebiyotik ve sinbiyotik, ii) zenginleştirilmiş ve iii) kalorisi (enerji içeriği) azaltılmış süt ürünleri olarak çeşitlendirilmektedir. Son 4 yıllarda, hayvansal süt ürünlerinin besin içeriğinin arttırılması ve antioksidan/ antimikrobiyal özelliklerinin geliştirilmesine yönelik; biyoaktif bileşenler, fitokimyasallar (fenolik asitler, flavonoidler, stilbenler, lignanlar, hidrolizlenebilir tanenler, kondanse tanenler veya proantosiyanidinler, karotenoidler, alkoloidler, fitatlar, terpenler, fitoöstrojenler gibi) ve diyet lifler gibi bileşenlerce zengin bitkisel ürünler ile fonksiyonel süt ürünlerinin birlikte kullanıldığı ürün kombinasyonlarında artış görülmektedir. Tüketicilerin fonksiyonel gıdalarda farklı çeşit ürün arayışı eğilimleri, soya sütü, yulaf sütü, Hindistan cevizi sütü, badem sütü, pirinç sütü gibi bitkisel sütlerin üretimi ya da bu sütler ile zenginleştirilmiş hayvansal süt ürünleri üzerine yapılan araştırmaları arttırmaktadır (Stone, 2011; Cui vd., 2013; Bernat vd., 2014; Do Amaral Santos vd., 2014; Okyere & Odamtten, 2014; Krusche, 2015; Bastıoğlu vd., 2016; Singhal vd., 2017; Stall & Adams, 2017; Yadav vd., 2017; Chambers, 2018; Topcuoglu & Yilmaz-Ersan, 2020; Çelik vd., 2021; Yilmaz-Ersan & Topcuoglu, 2022). Baklagiller, yağlı tohumlar ve tahıllardan bitkisel süt üretiminin ortaya çıkışı XIII. yüzyıla dayanan eski bir teknolojiye uzanmaktadır. Son yıllarda gelişen teknoloji ve artan tüketici talebi ile birlikte, baklagiller (soya fasulyesi), yağlı tohumlar (ayçiçek), sert kabuklu meyveler (badem, Hindistan cevizi), tahıllar (yulaf, pirinç) bitkisel süt üretiminde kullanılmaktadır. Özellikle badem, Hindistan cevizi, fındık, kestane gibi sert kabuklu meyvelerin esansiyel yağ asitleri, proteinler, diyet lifleri, fitosteroller, polifenoller, vitaminler ve mineraller bakımından zengin besinsel içeriği sahip olmaları, bitkisel sütlerin hazırlanmasında tercih edilme nedenlerindendir (Sethi vd., 2016; Jeske vd., 2017; Röös vd., 2018). Kestane; gövdesi dik, kırmızımtırak kabuklu ve sert yapraklı ağacın Kuzey Yarımküre’nin tüm ılıman bölgelerinde yetiştiği, yenilebilen tohumları olarak tanımlanmaktadır. Taksonomik sınıflandırmada kestane; bitkiler aleminde, Fagales takımının kayıngiller (Fagaceae) familyasının Castanea cinsini oluşturmaktadır. Kestanenin çeşitli bölgelerde yetişen on üç türü olduğu tespit edilmiştir ve bu türler; Castanea sativa (Avrupa), C. mollissima (Çin), C. crenata (Japon), C. dentata (Amerika), C. seguinii, C. davidii, C. pumila, C. ashei, C. alnifolia, C. floridana, C. pauscipina, C. ozarkensis, C. henry’den oluşmaktadır. Kestane ağacı, orman ağacı karakterinde bir meyve türü olup meyvesinden, çiçeklerinden, yapraklarından, sağlam ve neme dayanıklı 5 olan odunundan yararlanılmaktadır. Boyu 30 metreye ulaşabilen kestane ağacının 500 ila 1 000 yıl arasında ömrü olduğu bildirilmektedir. Sert kabuklu meyveler grubunda yer alan kestane; genellikle kuzey yarımkürede Çin, Kore, Japonya, Türkiye, Güney Avrupa ve Kuzey Amerika gibi farklı bölgelerde yetiştirilmektedir. Kestane türleri açısından değerlendirildiğinde, birinci sıradaki bölge C. mollissima’nın yetiştirildiği Asya, ikinci sırada C. sativa’nın yaygın olarak yetiştirildiği Güney Avrupa ve Türkiye, üçüncü sırada ise C. dentata’nın yaygın olarak yetiştirildiği Kuzey Amerika’dır. Türkiye, iklim ve toprak özellikleri bakımından kestanenin ana yurdu olup, Akdeniz ülkeleri arasında özellikle Castanea sativa Mill. türünün yetiştirildiği en eski bölgedir (Atasoy & Altıngöz, 2011). Kestanenin besinsel içeriği, kestane türü, yetiştiği iklim, toprak yapısı ve bakım koşulları, meyvenin olgunluk düzeyi ve ağacın gelişme özellikleri ile yetiştiği çevresel şartlara göre değişirken aynı zamanda uygulanan işleme teknolojilerine göre de değişmektedir. Kestane diğer sert kabuklu meyve türlerine kıyasla, karbonhidrat içeriği bakımından oldukça zengindir. Hasat olgunluğuna ulaşmış kestane meyvesi, ortalama % 40 – 45 su, % 40 – 45 karbonhidrat, % 3 – 6 protein, % 3 – 5 yağ ve % 1,3 kül içermektedir. Kestane’nin içerdiği karbonhidrat miktarı, kadın ve erkeklerde önerilen günlük karbonhidrat alım miktarının (RDI değeri) % 34’üne eşdeğerdir. Kestane bileşimindeki toplam karbonhidrat miktarının önemli bir kısmını nişasta oluşturmaktadır. Protein açısından inek sütü ile aynı seviyede protein içeren kestane, kadınlar için protein RDI değerinin yaklaşık % 9,2’sine, erkekler için RDI değerinin % 2,6’sına eşdeğerdir. Kestane düşük yağ içeriğine rağmen yağ asitleri yüzde bileşenleri açısından değerlendirildiğinde, linoleik ve linolenik yağ asitlerini % 28,2 ve % 2,6 oranında içermektedir. Mineral içeriği bakımından kestane, başta potasyum olmak üzere kalsiyum, fosfor, magnezyum ve kükürt gibi önemli makro elementler ve demir, bakır, çinko ve manganez gibi önemli mikro elementlerden oluşmaktadır. Vitamin içeriği bakımından kestane A, C, E, B1, B2, B6 ve B9 vitaminleri açısından oldukça zengindir. Kestanedeki E vitamini kadınlar ve erkekler için günlük alım değerinin % 12,7’sine ve C vitamini ise kadınlar için günlük alım miktarının % 20,8’ine; erkekler için günlük alım miktarının % 17,3’üne eşdeğerdir. Kestanenin bileşimde; sistein, prolin, L-alanin, L-aspartik asit, glisin, L-glutamik asit, arginin ve esansiyel aminoasitlerden izolösin, lösin, lisin, L-histidin, L-metiyonin, L- treonin, L-fenilalanin, L-tirozin, L-serin, L-valin aminoasitleri yer almaktadır. 100 g 6 kestane, yaklaşık 8–10 g diyet lifi içermektedir (Barreira vd., 2008; Yurdakul, 2008; De Vasconcelos vd., 2009; Gonçalves vd., 2010; Neri vd., 2010; Barros vd., 2011; Candemir, 2011; Selek, 2011; Otles & Selek, 2012; Poljak vd., 2016). Kestane meyvesinin tüketimi, halk arasında genellikle su ya da süt içinde kaynatılması ya da közde kavrulması şeklinde gerçekleşmektedir. Endüstriyel olarak kestane meyvesi; son tüketiciye sunulmak üzere hazırlanan kestane şekeri, kestane püresi, kestene pulpu, kestane ezmesi ile yarı mamül olarak hazırlanan derin dondurulmuş vakum ambalajlı temiz bütün kestane, kısmen şekerlendirilmiş derin dondurulmuş temiz bütün kestane, kurutulmuş kestane, kestane unu üretiminde kullanılmaktadır (Yurdakul, 2008; De Vasconcelos vd., 2009). Yukarıdaki açıklamaların ışığı altında önemli fermente süt ürünlerinden biri olan kefir üretiminde kestane meyvesinin kullanılabilirliğini incelediğimiz bu çalışmanın öncelikli hedefleri: 1- Kestane sütü üretimi ve optimizasyonunu sağlamak, 2- Üretilen kestane sütünün besinsel içeriği, fiziko-kimyasal, antioksidatif, tekstürel ve duyusal özelliklerini belirlemek, 3- Farklı kombinasyonlarda kestane sütü ve rekonstititüe süt ile starter olarak kefir danesi ve ticari kefir kültürü kullanılarak üretilen kefirlerin depolama süresince mikrobiyolojik, fiziko-kimyasal, besinsel, tekstürel özellikleri, toplam antioksidan kapasiteleri ve duyusal kabul edilebilirliklerini incelemek, 4- Ürünlerin standardizasyonu açısından rekonstitüe süt kullanılan proje sonucunda ürün optimizasyonunun sağlanması ile kestane sütünün gelecek çalışmalarda inek, koyun, keçi gibi farklı hayvan sütleri ile birlikte kullanımı ve bu sayede geliştirilen ürünlerin ticarileşme olanağını sağlamaktır. 7 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Fonksiyonel Gıdalar Dünya nüfusunun her geçen gün artış göstermesi, insanların beslenmesinde yer alan gıda ve bileşenlerinin daha verimli kullanılmasını zorunlu hale getirmektedir. Bununla birlikte, tüketicilerin eğitim ve gelir düzeyindeki iyileşmeye paralel olarak sağlıklı beslenme konusunda farkındalıklarının artması, bütünsel sağlık üzerine olumlu etkiler gösteren, insanın yaşam kalitesini arttıran ve kronik hastalıkları önlemeyi amaçlayan ürünlere olan talebi arttırmaktadır. Bu talep; gıda endüstrisinde “duyusallık ve zevk”, “sağlık ve zindelik”, “rahatlık ve pratiklik”, “kalite ve güvenilirlik”, “sürdürülebilirlik ve etik” olmak üzere beş ana başlık altında sınıflandırılan modern eğilimleri oluşturmaktadır. İnovatif gıda ürünlerinin geliştirilmesi sürecinde, bu beş kategorinin yer alması gerekliliği, fonksiyonel gıda kavramını ortaya çıkarmaktadır. Milattan önceki dönemlerde Hipokrat’ın “besinler ilacınız, ilacınız besinler olsun” sözü ile başlayan gıdaların metabolizma üzerine olumlu etkilerine ilişkin çalışmalar günümüzde de devam etmektedir. Şekil 2.1’de M.Ö 460 yılından itibaren gıda ve sağlık ilişkisi üzerine yapılan çalışmalar sonucu oluşturulan fonksiyonel gıda kavramına ait tanımlamaların tarihsel gelişimine yer verilmektedir (Martirosyan & Singh, 2015; Randazzo vd., 2016; Ejike vd., 2017; Ray & Montet, 2017; El-Sayed & Youssef, 2019; Xiong vd., 2020). İlk kez 1980'lerde Japonya'da kullanılan fonksiyonel gıdalar terimi, birçok ülkede yasal bir tanıma sahip olmadığı için çoğu zaman yanlış ifade edilmektedir (Ye vd., 2018). Son yıllarda Granato vd. (2017)’ne göre fonksiyonel gıdalar; “etkili bir şekilde çeşitli diyetlerde düzenli olarak tüketildiğinde, temel beslenmenin ötesinde sağlık üzerine potansiyel olarak olumlu etkilere sahip olan endüstriyel olarak işlenmiş veya doğal gıdalar” olarak tanımlamıştır. Geleneksel gıdaların besin değerlerine ek olarak, fonksiyonel gıdalar optimum sağlık koşullarının geliştirilmesine yardımcı olmakta, bununla birlikte dislipidemi, kanser, tip-2 diyabet, felç ve kardiyovasküler hastalık gibi bir veya daha fazla bulaşıcı olmayan hastalığın riskini azaltabilmektedir. Bir gıdanın fonksiyonel olarak nitelendirilmesinde, ülkeler bazında değişiklik gösteren Brezilya'da Brezilya Sağlık Düzenleme Ajansı (ANVISA), Avrupa Birliği'nde Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi (EFSA) ve ABD'de Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) gibi otoriteler tarafından oluşturulan farklı yönetmelikler ile yasal düzenlemeler kullanılmaktadır. 8 Şekil 2.1. Fonksiyonel gıda kavramının tarihsel gelişim süreci (Hobbs vd., 2014; Martirosyan & Singh, 2015; Ejike vd., 2017; Ray & Montet, 2017; El-Sayed & Youssef, 2019; Xiong vd., 2020). 9 Türkiye'de ise fonksiyonel gıdalar, 2000' li yılların başlarında “5179 sayılı gıdaların üretimi, tüketimi ve denetlenmesine dair kanun hükmünde kararnamenin değiştirilerek kabulü hakkında kanun” ile resmi metine girmiştir. 5179 sayılı kanuna göre “Besleyici etkilerinin yanı sıra bir ya da daha fazla etkili bileşene bağlı olarak sağlığı koruyucu, düzeltici veya hastalık riskini azaltıcı etkiye sahip olup, bu etkileri bilimsel ve klinik olarak ispatlanmış gıdalar” olarak tanımlanmıştır (Gök & Ulu, 2018). Farklı yasal otoriteler tarafından fonksiyonel gıdaların tanımları Şekil 2.2’de verilmektedir. Fonksiyonel gıda, “nütrasötikler”, “terapötikler” “destekleyici gıda”, “medikal gıda”, “zenginleştirilmiş gıda”, “diyet gıda” gibi benzeri isimler ile de adlandırılmaktadır. Fonksiyonel gıdalar bazı çalışmalara göre; “takviye edilmiş”, “zenginleştirilmiş”, “değiştirilmiş / istenmeyen bir bileşiği çıkartılan” ve “bir bileşeni arttırılmış” gıda olmak üzere dört grupta sınıflandırılmaktadır. Fermantasyon ile gıdalar içerisindeki bazı bileşikler değişikliğe uğratılarak (sütün fermantasyonu-biyoaktif peptitler), pişirme ile biyoyararlığı artırılarak (işlenmiş domates likopen) ya da farklı gıda kombinasyonlarını aynı matrikste birleştirerek (hayvansal gıdalar ve bitkisel gıdalar aynı formülasyonda) fonksiyonel gıdalar üretilmektedir. Yeung vd. (2018), çalışmalarında Ocak 1990'dan Haziran 2018'e kadar en çok çalışılan fonksiyonel gıdalar ve bileşenleri değerlendirmeleri sonucunda literatürde en çok atıf yapılan ve en çok aranan bileşenlerin prebiyotikler, probiyotikler ve antioksidanlar olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca mikroalgler, çoklu doymamış yağ asitleri, fenolik maddeler, besinsel lifler, vitaminler, mineraller, sülfür içeren bileşenler ve fitokimyasallar gıdalara eklenerek fizyolojik özellikte yeni fonksiyonel ürünler geliştirilmektedir (Scrinis, 2008; Lobo vd., 2010; Betoret vd., 2011; Dayısoylu vd., 2014; De Toledo Guimarães vd., 2018; Granato vd., 2020). 10 Şekil 2.2. Fonksiyonel gıda tanımları (Doyon & Labrecque, 2008; Gur vd., 2018). Fonksiyonel gıda ürünlerinden yoğurt (sindirim sağlığı), tahıllar (kalp sağlığı), margarin/tereyağ (kolesterol metabolizması), protein barlar ve içecekler (açlık azaltma) piyasadaki en yaygın ürünlerdir. Tüketime sunulan fonksiyonel gıdaların % 60-70’ini ise probiyotik mikroorganizma içeren gıdalar oluşturmaktadır (Tripathi & Giri, 2014; Granato vd., 2020). Dünyadaki fonksiyonel gıda tüketimine baktığımızda; fonksiyonel gıda pazarına en hakim ülke, Japonya’dan başlayarak yaklaşık iki yüz elli iki ABD dolarlık hacime sahip Asya Pasifik’ten sonra Kuzey Amerika’dır ve küresel olarak her geçen yıl büyümektedir. Türkiye’de ise henüz gelişim aşamasında olsa da oldukça hızlı bir şekilde büyümektedir. 2012 – 2017 yılları arasında Türkiye, fonksiyonel gıda satışları hacminde % 52’lik artışla üç yüz üç milyon ABD dolarından, dört yüz altmış dört milyon ABD dolarına ulaşarak, dünya pazarı içerisinde en yüksek büyüme oranlarını yakalayan ülke konumuna yükselmiştir. 2020 yılı dünya fonksiyonel gıda satışları yüz altmış iki milyar ABD doları olarak gerçekleşmiştir. 2021 yılında % 5,7’lik bir artışla yüz yetmiş bir milyar ABD doları bulması beklenen fonksiyonel gıda pazarı pastasından daha büyük bir pay alma potansiyeline sahip olacağı da bildirilmektedir. Türkiye’de artan büyüme hızı tüketicilerin tutumlarında pozitif anlamda bir değişim olduğunu göstermektedir. Sonuç olarak, global ölçekte fonksiyonel gıdalara yüksek bütçelerin ayrılmasının temel 11 hedefi Tip-2 diyabet, obezite, Alzheimer gibi kronik hastalıkları önlemeye yardımcı olan yeni nesil gıda ürünlerinin geliştirilmesidir. Özellikle devam etmekte olan Covid-19 pandemi sürecinde bağışıklık sistemini desteklemek amacıyla tüketicilerin fonksiyonel gıdaları daha fazla tercih ettiği; Amerika’da yetişkin tüketicilerin % 29’unun fonksiyonel ve işlenmemiş gıda tüketimlerini arttırdığı bildirilmektedir (Vicentini vd., 2016; Euromonitor International, 2017; O’Connor, 2017; Gök & Ulu, 2018; Gökmen, 2019; Arslan, 2020; Decker, 2020; Sezgin, 2020; Anonim, 2021). 2.2. Probiyotikler Probiyotik kelimesi ilk kez 1965 yılında Lilly ve Stillvell tarafından kullanılmış olup Yunanca’ da “yaşam için olan” anlamına gelmektedir. Literatürde birlikte kültürü yapılan iki organizmadan birinin ürettiği ve diğerinin gelişimini uyaran bir madde olarak tanımlanmış, mikroorganizma gelişimini arttıran bir doku ekstraktının tanımlanmasında probiyotik terimi kullanılmıştır. Probiyotik tanımı ilk kez 1974 yılında Parker tarafından, “hayvan yemlerinde yer alan ve konakçının intestinal mikrobiyota dengesinin gelişmesini arttıran maddeler ve organizmalar” olarak kullanılmıştır. Fuller, probiyotikleri 1989 yılında “konakçının intestinal mikrobiyotasının gelişimini destekleyen canlı mikrobiyal katkı maddeleri” olarak; 2002 yılında FAO ile WHO tarafından probiyotikler, “yeterli miktarda alındığında konakçı sağlığı üzerine olumlu etkiler gösteren canlı mikroorganizmalar” olarak tanımlanmıştır. Bu tanım, Uluslararası Probiyotik ve Prebiyotik Bilim Derneği tarafından onaylanmış olup halen kullanılmaktadır. Probiyotik bakteriler arasında Lactobacillus ve Bifidobacterium türleri en fazla kullanılan türlerdir. E. coli ve Bacillus türleri, mayalardan Saccharomyces boulardii probiyotik mikroorganizmalar arasında yer almaktadır. Clostridium butyricum’un da bu mikroorganizmalar arasında yer alabileceği, Avrupa Birliği'nde yapılan çalışmalarda bildirilmiştir. Probiyotik ürün ise “içerisinde konakçı sağlığı üzerinde olumlu etkileri olan mikroorganizmaları içeren gıdalar veya çeşitli enzim, vitamin ve aroma bileşenleri ile geliştirilmiş direkt kapsül / tablet haline getirilmiş diyet destekleyicisi ürünler” olarak tanımlanmaktadır (FAO/WHO, 2002; Gatlin III & Peredo, 2012; Hill vd., 2014; Gülbandılar vd., 2017; Markowiak & Śliżewska, 2017; Mohanty & Ray, 2017; Lebaka vd., 2018; Shu vd., 2018; Kamarlı, 2019; Rolim vd., 2020; Ranjha vd., 2021; Siciliano vd., 2021) 12 Fonksiyonel gıdalar, uygun dozda ve şartlarda alındığında herhangi bir yan etki göstermediğinden tüketicilerin dünya genelinde probiyotik mikroorganizmaları içeren fermente süt ürünlerine olan talebi hızla artmaktadır. Piyasada fermente süt içeceği, yoğurt, kefir, dondurma, dondurulmuş tatlı, ekşitilmiş krema gibi probiyotik bakteri içeren çeşitli fermente süt ürünleri yer almaktadır. Fermente süt ürünlerinde doğal olarak bulunan fonksiyonel özellikler, probiyotik mikroorganizmaların kullanımıyla daha da artmaktadır (Reid, 2016; Rakib vd., 2017; Wang vd., 2020; Banerjee, 2021). İnsanlığın en eski saklama yöntemlerinden biri olan sütün fermantasyonu, karakteristik tat, aroma ve kıvama sahip, işlem görmemiş çiğ süte göre daha uzun süre bozulmadan saklanabilen ürünler üretmeyi amaçlamaktadır. Bu ürünler yoğurt, kefir ve benzeri fermente süt ürünleri, sindirilebilirlikleri yüksek, zararlı mikroorganizmaların gelişmesine engel olan bağırsak mikrobiyotasını koruma ve düzeltme özelliğine sahip antitümör, antikarsinojenik ve antikolesterol özellikler gösteren starter kültürleri içeren ve laktoza duyarlılığı olan kişilerce güvenli bir şekilde tüketilebilen gıda ürünleridir. Ayrıca beslenme fizyolojisi açısından, hayvansal protein kaynağı olarak önemli fonksiyonlara sahip olan fermente süt ürünleri, karbonhidrat, yağ ve proteini dengeli oranda ve kemik yapısı için gerekli olan kalsiyumu yüksek miktarda içermekte olup, düşük kalorisi, ferahlatıcı özellikleri, üstün besin değeri ve her çeşit sütten yapılabilmesi nedeniyle hazır gıda olarak tüketime uygun olan önemli bir besin grubunu oluşturmaktadır. Yoğurt ve benzeri fermente süt ürünleri temelde aynı olmak üzere çeşitli şekillerde tanımlanmıştır. IDF’nin yaptığı tanıma göre; fermente süt ürünleri “tam yağlı, yarım yağlı, az yağlı, yağsız süt, konsantre süt, süt tozuyla kuru maddesi artırılmış süt, homojenize ya da homojenize edilmemiş, pastörize ya da sterilizasyon işleminden sonra soğutulup özel laktik asit bakterilerini içeren starter kültürleriyle tek başlarına ya da karışımları kullanılarak fermente edilmiş, içerisinde tüketimden önce canlı laktik asit bakterileri içeren bir ürün” olarak tanımlanmaktadır (Parmjit, 2011; Shiby & Mishra, 2013; De los Reyes-Gavilán vd., 2015; Kandylis vd., 2016; Koçak vd., 2016; Gasmalla vd., 2017; Kerry vd., 2018). Yoğurt, kefir ve benzeri fermente süt ürünlerinin insan sağlığı ve beslenme üzerindeki yararlı etkisi uzun süredir bilinmektedir. Önceleri oldukça ilkel yöntemlerle ve az miktarda üretilen bu ürünler, zaman içinde gelişen teknolojiye ayak uydurarak gerek 13 kalite açısından iyileşmiş ve gerekse çeşit yönünden zenginleşmiştir. Bugün ise dünyada üretilen tüm fermente süt ürünlerinin isimleri tam olarak bilinmemekte, fakat sayılarının birkaç yüz civarında olduğu tahmin edilmektedir. Fermente süt ürünlerinin incelendiği çalışmaların çoğunda üzerinde durulan en önemli nokta üretimde kullanılan mikroorganizmalardır. Son zamanlarda bu ürünlerin besleyici, diyetetik ve terapötik özelliklerini iyileştirmek amacıyla probiyotik mikroorganizmaların kullanılması daha da artış göstermektedir (Smith & Hui, 2008; Yilmaz-Ersan & Kurdal, 2014; Smith & Hui, 2015; Walsh vd., 2016; Yilmaz-Ersan vd., 2016; Rosa vd., 2017). XXI. yüzyılın yoğurdu olarak tanımlanan kefir, ilk olarak Kafkasya’da üretilen ve buradan Dünya’ya yayılan sindirimi kolay, serinletici, çok az alkol içeren ve hafif gazlı fermente bir süt ürünüdür. Türk Gıda Kodeksi Fermente Süt Ürünleri Tebliği’ nde (Tebliğ No: 2009/25) “fermantasyonda spesifik olarak Lactobacillus kefiri, Leuconostoc, Lactococcus ve Acetobacter cinslerinin değişik suşları ile laktozu fermente eden (Kluyveromyces marxianus) ve etmeyen mayaları (Saccharomyces unisporus, Saccharomyces cerevisiae ve Saccharomyces exiguous) içeren starter kültürler ya da kefir tanelerinin kullanıldığı fermente süt ürünü” olarak tanımlanmaktadır. Kefir; kefir danesinde bulunan bakteri (homofermentatif ve heterofermentatif Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Streptococcus ve Acetobacter spp.) ve mayalar (Torula, Candida ve Saccharomyces spp.) ile birlikte bu mikroorganizmaların metabolitlerini de içeren doğal bir “probiyotik süt ürünü” olarak kabul edilmektedir (Yilmaz-Ersan vd., 2016; 2018; Ozcan vd., 2018; 2019; Van Wyk, 2019). Kefir danesinde bulunan bakteri ve maya türlerinin simbiyotik aktivitesi sonucu bu üründe laktik asit ve alkol fermantasyonunun bir arada gerçekleşmesi sonucu; kefirde laktik asit, asetik asit, az miktarda karbondioksit (CO2), etil alkol ve yoğurda kıyasla farklı duyusal özelliklerin oluşmasını sağlayan aromatik bileşikler ortaya çıkmaktadır. Kefirin köpüklü olması, ağızda pürüzsüz bir his oluşmasını sağlar; mayanın içerisinde korunduğu kendine has mayamsı bir tadı vardır. Düşük miktarda etil alkol içerir, amacı köpüklü olmasını sağlamak ve tadı artırmak olan kontrollü ikinci bir fermentasyon barındırmaktadır. En önemlisi, fermantasyon sırasında kendine has tadı oluşturan diasetil, asetaldehit ve asetoin gibi uçucu tat ve aroma bileşenlerinin oluşmasıdır. Günümüzde kefir daneleri kullanılarak üretilen geleneksel kefirin yanı sıra ticari starter kültür 14 kullanılarak üretilen endüstriyel kefirler ile birlikte aromalı kefirler de tüketime hazır olarak satışa sunulmaktadır. Kefirin endüstriyel üretimi genellikle inek sütünden yapılmakla birlikte keçi, koyun, deve ve manda sütlerinin yanısıra soya, hindistan cevizi ve pirinç sütü gibi bitkisel sütler de kefir üretiminde kullanılmaktadır (Yilmaz-Ersan vd., 2016; 2018; Ozcan vd., 2018; 2019; Van Wyk, 2019). Kefir daneleri fiziksel özellikleri bakımından 1 – 2 mm’den 3 – 6 mm’ye kadar değişen çapta, minyatür karnabahar ya da patlamış mısıra benzeyen görünümde, yuvarlak, yumuşak, jelatinimsi yapıda, beyaz ya da sarımtırak renkte, düzensiz şekilli partiküllerden oluşmaktadır. Kefir mikrobiyotası, bakteri (homofermentatif ve heterofermentatif Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Streptococcus ve Acetobacter türleri) ve mayalardan (Torula, Candida ve Saccharomyces spp.) oluşmakta ve bu mikroorganizmaların etrafında glukoz ve galaktozdan oluşan polisakkarit bir yapı bulunmaktadır. Bu polisakkarit yapı Kefiran olarak bilinmekte, Lactobacillus kefiranofaciens tarafından üretilmekte ve soğuk suda yavaş, sıcak suda hızlı erime özelliğine sahiptir. Kefir daneleri pasajlandıkça gelişip çoğalmakta ve özelliklerini bir sonraki jenerasyona aktarmaktadır. Kefir mikrobiyotasını etkileyen faktörler; kefir danesi nin orijini, kefir danesinde bulunan mikroorganizmaların miktarı, mikroorganizma türlerinin birbirine oranı, üretimde uygulanan inkübasyon sıcaklığı, süresi ve kefir danelerinin muhafaza süresi olarak sıralanabilir. Kefirin bileşimi üzerine ise; kullanılan sütün kalitesi, kuru madde miktarı, kefir kültürünü oluşturan mikroorganizmaların çeşitliliği, kefir üretim teknolojisi, üretim sırasında sütün mayalanma sıcaklığı, fermantasyon süresi ve üretimden tüketime kadar geçen süre etkili olmaktadır (Yilmaz vd., 2006; Rattray & O’connell, 2011; Ozcan vd., 2018). Geleneksel kefir üretimi, kefir danesinin süte doğrudan ilave edilmesi ile yapılmaktadır. Geleneksel kefir üretimi; çiğ süt 85 – 90 °C’de 20 dakika ısıtıldıktan sonra, 20 – 25 °C’ye soğutulması ve % 2 – 10 (genellikle % 5) oranında kefir danesi ilave edilerek, 20 –25 °C’de 18 – 24 saat fermentasyona bırakılarak, bu sürenin sonunda bir süzgeç yardımıyla kefir danelerinin sütten ayrılması ile elde edilmektedir. Elde edilen kefir 4°C’de depolanarak tüketime sunulmaktadır. Sütten ayrılan kefir daneleri ise bir sonraki inokülasyona kadar soğukta (+4°C’de) muhafaza edilmekte daha uzun süre saklanacaksa liyofilize edilmekte ya da dondurulmaktadır. Endüstriyel kefir üretiminde farklı 15 yöntemler kullanılmakla beraber temelde prensip geleneksel yöntem ile aynıdır. Endüstriyel üretimde üç farklı kültür kullanılabilmektedir. Bunlar; kefir danesi, kefir danesinden elde edilen kefir kültürünün ve ticari liyofilize kefir kültürünün kullanılmasıdır. Kefir üretiminde kullanılacak olan sütün öncelikle mikrobiyolojik, duyusal ve kimyasal özellikleri kontrol edilmektedir. İlk aşamada; süt homojenize edildikten sonra kuru madde miktarı % 8’e ayarlanmakta ve 90 – 95°C’de 5 – 10 dakika ısıl işlem uygulanmaktadır. Sonra 18 – 24°C’ye soğutularak % 2 – 10 oranında kefir kültürü ilave edilmekte, 18 – 24 saat fermentasyonun ardından, kefir ambalajlanarak 4°C’de depolanmaktadır. Plastik ya da cam şişe ambalajlarda depolanan kefirin, CO2 kaybını engelleyecek şekilde ambalajlanması ürün kalitesini arttırmaktadır. Olgunlaştırma işlemi ise aroma ve kıvam oluşumunu arttırmaktadır (Schawn vd., 2015; Yilmaz-Ersan vd., 2016; 2018; Ozcan vd., 2019; Van Wyk, 2019). Kefir, sütün bileşiminde bulunan yağ, laktoz, B1, B12, ve K vitaminleri, esansiyel mineraller gibi tüm besin öğelerini içermesi nedeniyle insan vücudunda güçlü bir bağışıklık sisteminin oluşmasında önemli rol oynamaktadır. Kefir danesinin yapısında bulunan mikroorganizmaların etkisiyle; proteinler sindirilebilir forma geçmekte, çeşitli mineral maddeler ve esansiyel aminoasitler gibi bileşikler ortaya çıkarak kefirin besleyici değerinin artmasını ve sindiriminin kolay olmasını sağlamaktadır. Tane bileşimindeki mikroorganizmaların etkisi ile laktoz ve proteinlerin bir kısmı parçalanmakta; bu durum laktoz intoleransı olan kişiler için süte alternatif bir gıda olması ve vücut tarafından daha iyi absorbe edilebilmesi, kefiri önemli bir fonksiyonel gıda kılmaktadır. Laktik asit (yaklaşık % 50’ sinin L (+) tipte), asetaldehit, asetoin, diasetil, etanol ve karbondioksit fermantasyonun en önemli son ürünleridir. Karbondioksit, kefirin eşsiz ferahlatıcı özelliğine katkıda bulunurken, kefirin hafif ekşimsi tadından sorumlu olan laktik asidin, etanol ve diğer aroma bileşenleri ile etkileşimi, tat ve aroması üzerinde etkili olmakla birlikte kefirin biyolojik, diyetetik ve beslenme açısından değerini de arttırmaktadır. Kefirin hafif asidik tadı ve karakteristik mikrobiyotası mide ve pankreasta enzim salgılanmasını, organizmada ürünlerin sindirilmesini kolaylaştırmakta ve besinlerin mideden bağırsaklara geçişini hızlandırmaktadır. Buna bağlı olarak düzenli kefir tüketimi ile bağırsak rahatsızlıklarının azalması, bağırsak hareketlerinin artması, şişkinliğin azalması ve daha sağlıklı bir sindirim sistemi sağlanması söz konusu olmaktadır. Kefirin antibakteriyel, immunolojik, antitümoral ve hipokolestromik etkileri ise son çalışmalarla 16 araştırılmaktadır. Kefirin kanser üzerindeki etkilerine yönelik yapılan çalışmalarda kefir tüketimiyle tümör boyutlarında küçülmelerin olduğu ve antitümör aktivitesinde artışların belirlendiği vurgulanmaktadır (Ahmed vd., 2013; John & Deeseenthum, 2015; Rosa vd., 2017; Sharifi vd., 2017; Tomar vd., 2017; Demir vd., 2019; Rajoka vd., 2019; Bulut- Solak, 2020; Farag vd., 2020; Lazda vd., 2020; Azizi vd., 2021; Güven vd., 2021). 2.2.1. Probiyotik mikroorganizmaların sağlık üzerine etkileri Probiyotiklerin insan sağlığı üzerine olumlu etkisine dair yapılan bilimsel çalışmalarda; gastrointestinal enfeksiyonlar, antimikrobiyal aktivite, laktoz metabolizmasında düzelme, serum kolesterolünde azalma, bağışıklık sistemini stimüle etme, antimutajenik, antikarsinojenik, antidiyaretik özellikler, inflamatuar bağırsak hastalığında iyileşme (ülseratif kolit ve crohn hastalığı), Helicobacter pylori bakterisinin eliminasyonu, alerjik rahatsızlıklar, obezite, insülin direnci sendromu, Tip-2 diyabet, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı, bağırsak mikrobiyotasını patojenlere karşı koruma, bebek ishalleri, idrar yolları iltihabı, osteoporoz, hiperkolesterolemi gibi bir çok hastalığı önleyici ya da tedavi edici özellikleri ispatlanmıştır. Probiyotiklerin konakçı sağlığı üzerine olumlu etki gösterebilmesi için sindirim enzimleri, mide asitleri ve safra tuzları en düşük seviyede iken tüketilmesi önerilmektedir. Sert sindirim koşullarına maruz kalmayı en aza indirmek amacıyla, midenin asitliğini tamponlayan içerikteki yiyeceklerden önce aç karnına alındığında probiyotiklerden en iyi fayda sağlanmaktadır. Lactobacillus, Bifidobacterium ve Saccharomyces’in yemekten önce, sırasında ve sonrasında canlılığını inceleyen bir çalışmada; yemekten 30 dakika önce probiyotik ve sonrasında hafif yağlı bir öğün tüketimi, probiyotiklerin canlılığını olumlu yönde etkilerken, yemekten 30 dakika sonra alındığında ise canlılık üzerine olumsuz etkide bulunduğu saptanmıştır (Chávarri vd., 2012; Akan & Kınık, 2015; Ouwehand & Röytiö, 2015; Amil-Dias vd., 2017; Guarner vd., 2017; Hossain vd., 2017; Markowiak & Śliżewska, 2017; Kerry vd., 2018; Demir vd., 2019; Galdeano vd., 2019; Kamarlı, 2019; Wan vd., 2019; Rossoni vd., 2020; Pulido vd., 2021). Probiyotik mikroorganizmalar gerek tablet olarak kullanıldığında gerekse süt ürünleri gibi gıda olarak tüketildiklerinde, sağlık üzerine beklenen olumlu etkiyi gösterebilmeleri için dikkat edilmesi gereken bazı kriterler bulunmaktadır. 17 Bu kriterler; i) Mikroorganizmanın türü (Lactobacillus, Bifidobacterium türleri ya da mayalar), ii) Günlük alınan mikrooganizma sayısı (107 – 1010 kob/g ya da mL), iii) Günlük tüketilme sıklığı (bir ya da daha fazla), iv) Tüketildiği zaman dilimi (yemek öncesi, yemekle birlikte ya da sonrası), v) Tüketme süresi (bir günden bir kaç aya kadar), vi) Tüketilme şekli (kapsül, toz ya da gıdalar ile) ve vii) Gastrointestinal sistemde canlılığını devam ettirebilme kabiliyeti (Tompkins vd., 2011). Türkiye’de probiyotik gıdalar hakkında yasal düzenlemeler “Türk Gıda Kodeksi Beslenme ve Sağlık Beyanları Yönetmeliği Ek 6” da belirtilmiş olup, probiyotik gıdanın içerisinde raf ömrü sonuna kadar yeterli miktarda canlı mikroorganizma (1x106 kob/g ya da mL) içermesi gerektiği ifade edilmiştir (Anonim, 2017). Türk Gıda Kodeksi Fermente Süt Ürünleri Tebliği’nde ise toplam spesifik mikroorganizmanın en az 107 kob/g, etikette belirtilen toplam ilave mikroorganizma 106 kob/g olması gerektiği belirtilmektedir (Anonim, 2009). FDA probiyotik gıdalarda bakteri sayısının tüketim anında en az 106 kob/g ya da mL olmasını tavsiye etmektedir. Bazı araştırmacılar ürünlerin raf ömrü dikkate alındığında probiyotik etkinin görülebilmesi için gerekli miktarın en az 108-109 kob /g olması gerektiğini belirtirken, bu sayıya ulaşabilmek için günlük 100 g probiyotik ürün tüketilmesini tavsiye etmektedirler (FAO/WHO, 2002; Karimi vd., 2011; Tripathi & Giri, 2014; Akan & Kınık, 2015; Randazzo vd., 2016; Sidira vd., 2017; Rezac vd., 2018; Ekici & Arslan, 2021). 2.2.2. Probiyotiklerin güvenilirliği WHO ve FAO tarafından ortak yayınlanan rapora göre, probiyotikler sistemik enfeksiyonlar, zararlı metabolik faaliyetler, duyarlı bireylerde aşırı bağışıklık stimülasyonu, bakteriyel translokasyon ve antibiyotik direnci gibi farklı yan etkilere neden olabilmektedir. WHO / FAO çalışma grubu, i) antibiyotik direnci, toksin üretimi ve hemolitik potansiyelin test edilmesi gerektiğini, ii) D-laktat üretimi ve safra tuzunun dekonjugasyonu gibi metabolik aktivitelerin değerlendirilmesini, iii) yan etkilerin dikkate alınarak insan çalışmalarını yürütmek için yeni probiyotik suşların güvenlik açısından değerlendirilmesini, iv) ticari üreticilerin pazarda gözetim altında tutulmasını ve v) 18 konakçıda probiyotik organizmanın etkisini belirlemek için immün sistemi baskılanmış hayvanlarda kullanımlarının incelenmesini önermiştir. Bu amaçla günümüzde DNA- DNA hibridizasyon 16 teknikleri ya da 16S rRNA dizi analiz teknikleri kullanılması gerektiği belirtilmektedir. Gelişmiş yöntemler kullanılarak taksonomik analizler sonucu tanıları doğru bir şekilde yapılmayan suşlar probiyotik olarak kesinlikle sınıflandırılmamalıdır (Doron & Snydman, 2015; Guarner vd., 2017). 2.2.3. Postbiyotikler Probiyotiklere ek olarak, günümüzde postbiyotikler, psikobiyotikler, para-probiyotikler, gerobiyotikler, biyoterapötikler, yeni nesil probiyotikler ve tasarımcı probiyotikler şeklinde yeni kavramlar literatürde karşımıza çıkmaktadır. Bu bağlamda, “paraprobiyotik” ve “postbiyotik” terimleri, inaktive edilmiş organizmalar ve bunların metabolitleri olarak tanımlanmıştır. "Canlı olmayan probiyotikler" olarak da bilinen paraprobiyotikler, inaktive edilmiş hücreleri ifade etmekte, postbiyotikler ise canlı bakteriler tarafından salgılanan ürünleri (veya metabolik yan ürünler) veya bunların parçalanmasından sonra açığa çıkan çözünür bileşenleri ifade etmektedir. Para probiyotikler literatürde “canlı olmayan probiyotikler”, “inaktive edilmiş probiyotikler” ve “hayalet probiyotikler” olarak adlandırılırken, postbiyotikler “metabiyotikler”, “biyojenikler”, “basit metabolitler/CFS (hücresiz süpernatanlar)” olarak adlandırılmaktadır (Paton vd., 2006; Tsilingiri vd., 2012; Tsilingiri & Rescigno, 2013; O’Toole vd., 2017; Akter vd., 2020; Batista vd., 2020; Cuevas-González vd., 2020; Marx vd., 2020; Nataraj vd., 2020; Tsai vd., 2020; Gökırmaklı vd., 2021). Postbiyotikler arasında hücre yüzeyi proteinleri (yüzey tabakası proteinleri), hücre içermeyen süpernatanlar (CFS), hücre lizatları, bakteriyosinler (asidofilin, bifidin, reuterin), glutatyon peroksidaz (GPx) ve süperoksit dismutaz (SOD) gibi enzimler, peptitler, teikoik asitler, ekzopolisakkaritler, B-grubu vitaminleri, salgılanan polisakkaritler, organik asitler (laktik asit) ve kısa zincirli yağ asitleri (SCFA/KZYA; asetik asit, propiyonik asit ve bütirik asit), plasmalojenler yer almaktadır. Postbiyotik etki mekanizmaları tam olarak aydınlatılamamıştır; bununla birlikte, antioksidan ve anti- proliferatif etkileri ile antipatojenik, immünomodülatör ve anti-enflamatuarları teşvik ettiklerine dair kanıtlar vardır. Karbonhidrat içeren fraksiyonların da tümör baskılayıcı aktiviteler gösterdiği bildirilmiştir Bunun yanısıra gıdalarda biyokoruyucu özellik 19 gösterdikleri de saptanmıştır (Xu vd., 2011; Escamilla vd., 2012; Tsilingiri & Rescigno, 2013; Xing vd., 2015; Sharma & Shukla, 2016; Aguilar-Toalá vd., 2018; Wang vd., 2018; Chuah vd., 2019; Gao vd., 2019; Malashree vd., 2019; Akter vd., 2020; Batista vd., 2020; Siciliano vd., 2021). Paraprobiyotiklerin bağışıklık sistemini modüle ettiği iyi bilinmektedir (hücre duvarının bileşikleri bağışıklık sistemini güçlendirebilir) ve bağırsak hücrelerine yapışmaları sonucu patojenlerin inhibisyonu gerçekleşir. Paraprobiyotikler, ölü hücrelerin metabolitlerini salgılayarak konakçı sağlığını iyileştirici etki gösterebilir. Paraprobiyotiklerinin ısıl işlem, yüksek basınçlı işleme, sonikasyon, ışınlama ve ultraviyole ışınları gibi çeşitli yöntemlerle ve diğer yöntemlerle elde edilebileceği bazı çalışmalarda bildirilmiştir (Kamiya vd., 2006; Ananta & Knorr, 2009; Awad vd., 2010; Shin vd., 2010; Ou vd., 2011; Fujiki vd., 2012; Patewar vd., 2019; Siciliano vd., 2021). 2.3. Bitkisel Sütler Evcil hayvanlardan sütün eldesi ve tüketimi, milattan yedi bin yıl önce Kuzeybatı Anadolu’da başlamış olup, bu tarihten itibaren süt ve ürünleri her yaş grubundan bireylerin beslenmesinde en önemli gıda grubunu oluşturmuştur. Süt, sağlıklı memeli hayvanların yeni doğan yavrularını beslemek amacıyla meme bezleri tarafından salgılanan ve temel besin bileşenlerini içeren bir gıda maddesidir. Yeni doğan memelilerin temel besin gereksinimlerini karşılamanın yanısıra yavrunun gelişmesi ve büyümesi için ihtiyaç duyulan tüm besin elementlerini yeterli ve dengeli oranda içeren “besin yoğun içecek” olarak da tanımlanmaktadır. Süt birçok besin bileşeni içermesinin yanı sıra bunların biyoyararlılığını arttırıcı özelliğe sahiptir. Glikoz, maltoz, nişasta vb. şekerlerin aksine süt şekeri olarak adlandırılan laktoz, kalsiyum ve diğer mineral maddelerin biyoyararlığını arttırmaktadır. Süt proteinlerinin esansiyel amino asitlerce zenginliği hem biyoyararlılığı hem de hayvansal protein ihtiyacının karşılanması açısından önem taşımaktadırlar. Ayrıca süt proteinlerinden kazein, midenin asidik ortamında jelleşmekte, bu ortamda sütteki bileşenlerin daha yavaş ve etkili sindiriminin gerçekleşmesi ile doygunluk sağlamaktadır. Kalsiyum ve fosfor, bireylerin kemik yapısının oluşmasında ve sinir iletiminde en önemli minerallerdir. Özellikle kadınlarda ileriki yaşlarda ortaya çıkan osteoporozun önlenmesi açısından büyüme çağında süt ve ürünleri tüketilmesi sonucu alınan kalsiyum önem taşımaktadır. Süt içerdiği D vitamini 20 ile çocuklarda raşitizmin, iyot içermesi nedeni ile de özellikle yetişkinlerde tiroide bağlı rahatsızlıkların önlenmesi ve ayrıca vitamin A, B2 ve B12 ihtiyacının karşılanması açısından çok önemli bir gıda maddesidir. İmmonuglobulin, laktoperoksidaz ve laktotransferrin gibi antimikrobiyal maddeleri içermesi süte biyokoruyucu gıda özelliğini kazandırmaktadır (Pereira, 2014; Sethi vd., 2016; Chalupa-Krebzdak vd., 2018; Mauro & Garcia, 2019; Tangyu vd., 2019; Aydar vd., 2020; Pandey & Poonia, 2020; Fadly vd., 2021; Karimidastjerd & Konuskan, 2021). Dünyanın bazı bölgelerinde süte kısıtlı erişim, bazı minerallerin (demir), vitaminlerin (folat) ve diğer biyomoleküllerin (fenolik bileşikler) sütün bileşiminde iz miktarda yer alması, süt proteini alerjisi ve laktoz intoleransı gibi nedenlerden dolayı süt benzeri bitki bazlı içeceklerin üretimi ve tüketiminde artış görülmektedir. İlk olarak soya fasulyesi içeceği üretimi ile başlayan bu ürün segmenti, yulaf içeceği, badem içeceği, hindistan cevizi içeceği, kenevir tohumu içeceği, kakao içeceği gibi farklı hammaddeler ile çeşitlendirilerek tüketiciye alternatif ürünler sunabilmektedir. Bu içeceklerin, üretilen ürün birimi başına enerji girdisinin hayvansal süte kıyasla çok daha az olması ve talebe göre bileşimlerinin değiştirilebilmesi üretim ve tüketimlerini avantajlı duruma getirmektedir. Özellikle vejetaryenlik, lakto-vejetaryenlik ve ovo-vejetaryenlik gibi popüler eğilimler, gıda blogları ile sosyal medyaya yansıyan hayvan ve çevre refahına duyulan ilgi, süt benzeri bitki bazlı içecek pazarının büyüme hızına ivme kazandırmaktadır. Bu ürünler, gelişmekte olan ülkelerdeki yetersiz hizmet alan ve inek sütü arzının yeterli olmadığı yerlerde yaşayan popülasyon için pahalı olmayan bir gıda alternatifi olarak tüketilmesine karşın, Türkiye’de daha çok gelir düzeyi yüksek olan popülasyon tarafından tercih edilmektedir (Pereira, 2014; Ismail, 2015; Sethi vd., 2016; Chalupa-Krebzdak vd., 2018; Mauro & Garcia, 2019; Tangyu vd., 2019; Aydar vd., 2020; Pandey & Poonia, 2020; Paul vd., 2020; Yiğit, 2020; Fadly vd., 2021; Karimidastjerd & Konuskan, 2021). Literatürde süt benzeri bitki bazlı içeceklerin bir tanımı ve sınıflandırılması bulunmamakla birlikte, görünüş ve kıvam bakımından hayvansal süte benzeyen, temelde suda çözünmüş ve parçalanmış bitki materyali (baklagil, yağlı tohumlar, tahıl ve tahıl benzeri gıdalar vb.) ve ekstraktlarının süspansiyonları şeklinde tanımlanmaktadırlar. Bu sütlerin üretimi, XIII. yüzyıla dayanan eski bir teknolojidir. Bitkisel bazlı kaynakların 21 işlenmesi sırasında hedef; inek sütüne benzer bir yapıya, homojen ve stabil kolloidal dispersiyonlara veya 1 nm ile yaklaşık 1 mm aralığında partiküllere sahip emülsiyonları elde etmektir. Genel olarak bu ürünlerin endüstriyel ölçekte üretiminde, bitkisel materyal işlenmeden önce birkaç saat suda (sıcak veya soğuk) ıslatılır. Ekstrakt daha sonra kalan çözünmeyen kalıntıların süzülerek elimine edilmesi için yıkanır ya da kurutulup un haline getirildikten sonra su ilave edilmektedir. Elde edilen sulu karışım, öğütme sonrası çözünmeyen bitki materyallerinin uzaklaştırılması amacı ile filtre edilmektedir. Sade üretilebildiği gibi, ürün özelliklerine göre yağ, aroma maddeleri, şeker, vitamin, mineral, stabilizatör ya da emülgatör maddeler de ilave edilebilmektedir. Üründe serum ayrılmasını engellemek, mikrobiyal stabiliteyi sağlamak ve raf ömrünü arttırmak amacıyla homojenizasyon ve ısıl işlem (pastörizasyon/UHT) uygulanarak inek sütü görünümünde bitkisel süt elde edilmektedir (Şekil 2.3) (Dickinson, 1992; Salmerón vd., 2015; Sethi vd., 2016; Jeske vd., 2018; Röös vd., 2018; McClements, 2020; Rincon vd., 2020; Scholz-Ahrens vd., 2020). Bitkisel süt, hammadde ve üretim aşamalarına göre kolloidal süspansiyon ya da emülsiyon özellik göstermektedir. Sade olarak tüketilmesinin yanı sıra farmasötik endüstrisinde, besin takviyelerinde, bebek besinlerinde, krema ürünlerinde ve meyveli karşımlarda da ingredient olarak kullanılabilmektedir. Ulusal gıda etiketleme mevzuatları ülkeden ülkeye değiştiğinden, tüketicileri doğru bilgilendirmek amacıyla bitkisel bazlı süt alternatiflerinin kategorize edilmesinde temel terminoloji uluslararası düzeyde tartışılmaktadır. Codex Süt Ürünleri Terimlerinin Kullanımına İlişkin Genel Standartında (GSUDT), "soya sütü" terimi yerine "soya bazlı içecekler" teriminin kullanılmasını önermektedir. FDA bitkisel sütleri, lezzet, aroma, yapı, tekstür ve görünüş itibari ile süte benzer fiziksel özelliklere sahip fakat beslenme açısından yetersiz “imitasyon süt” ya da “imitasyon süt ürünleri” başlığı altında değerlendirmektedir. Avrupa Birliği’nde sadece “Hindistan cevizi sütü” ve “badem sütü” süt olarak etiketlenmesine izin verilen ürünlerdir. Bu ürünler bilimsel literatürde ise “drink/beverage-içecek”, “vegetal milk- bitkisel süt”, “milk-süt”, “milk substitute-süt ikamesi”, “milk-alternative- süt alternatifi”, “imitation milk-imitasyon süt”, “plant-based milk- bitki bazlı süt”, “milk analogue- süt analogu” ve “milk-like beverage-süt benzeri içecek” gibi isimler ile adlandırılmaktadırlar (Dickinson, 1992; Salmerón vd., 2015; Sethi vd., 2016; Jeske vd., 2018; Röös vd., 2018; McClements, 2020; Rincon vd., 2020; Scholz-Ahrens vd., 2020). 22 Bitkisel sütler, hayvansal sütler ile karşılaştırıldığında önemli miktarda fitokimyasal (fenolik asitler, flavonoidler, stilbenler, lignanlar, hidrolizlenebilir tanenler, kondanse tanenler, proantosiyanidinler, karotenoidler, alkoloidler, fitatlar, terpenler, fitoöstrojenler) ve diyet lifi içermelerinin yanı sıra düşük glisemik indekse de sahiptirler. Hayvansal sütlere göre protein içerikleri ile bazı besin bileşenlerinin miktarı ve biyoyararlılıkları daha düşüktür. Örneğin, sütün bileşiminde yer alan esansiyel amino asitler, vitamin D, kalsiyum, iyot ve demir gibi mineraller bitkisel sütlerde yeterli miktarda bulunmamaktadır. Yapılan çalışmalarda uzun süre bu sütlerin tüketilmesinin vücudun elektrolit dengesinin bozulması nedeni ile böbrek sorunlarına, protein yetersizliğine, iyot eksikliği nedeni ile tiroit bezi rahatsızlıklarına ve özellikle çocuklarda boy uzamasının yavaşlamasına neden olabilecekleri belirtilmektedir. Bu kapsamda çalışmanın da konusu olan hayvansal sütlerin bitkisel sütler ile zenginleştirilmesi ile her iki ürün grubunun zengin besinsel içeriği tek bir gıda matriksinde birleştirilerek tüketicilere alternatif fonksiyonel süt ürünleri sunulabilmektedir (Chalupa-Krebzdak vd., 2018; Dubey & Patel, 2018; Röös vd., 2018; Vanga & Raghavan, 2018; Tangyu vd., 2019; Aydar vd., 2020; Yiğit, 2020). 23 Şekil 2.3. Bitkisel sütlerin genel üretim aşamaları (Jeske vd., 2018; Tangyu vd., 2019; Aydar vd., 2020; Kehinde vd., 2020; McClements, 2020). 24 Bitkisel sütler, hammaddeleri ve beslenme ile sağlık üzerine olumlu etkileri dikkate alındığında genellikle, tahılllar (pirinç, yulaf, darı), sert kabuklu meyveler (badem, fındık, fıstık, hindistan cevizi, ceviz), yağlı tohumlar (susam, keten tohumu, kenevir, ayçiçeği), baklagiller (soya, yer fıstığı, börülce, nohut, acı bakla, maş fasulyesi) ve sahte tahıllardan (kinoa, teff, amaranth) elde edilen sütler olarak sınıflandırılmaktadır (Şekil 2.4). Son yıllarda bu sütler az yağlı/yağsız, şekerli/şekersiz ve aromalı şekilde ticari olarak satışa da sunulmaktadır (Akubor, 2003; Phillips, 2005; Tarantola & Wujastyk, 2009; Stone, 2011; Ceylan, 2013; Bernat vd., 2014; Do Amaral Santos vd., 2014; Okyere & Odamtten, 2014; Krusche, 2015; Bastıoğlu vd., 2016; Jeske vd., 2017; Stall & Adams, 2017; Yadav vd., 2017; Chambers, 2018; Röös vd., 2018; Tangyu vd., 2019; McClements, 2020). Şekil 2.4. Hammaddelerine göre bitkisel sütlerin sınıflandırılması (Stone, 2011; Sethi vd., 2016) Bitkisel sütler içerisinde hammaddelerin, beslenme ve sağlık üzerine olumlu etkileri göz önüne alındığında sert kabuklu meyve sütleri son yıllarda en fazla talep edilen ürün grubunu oluşturmaktadır. Özellikle badem, Hindistan cevizi, fındık, kestane gibi sert 25 kabuklu meyveler; esansiyel yağ asitleri, proteinler, diyet lifleri, fitosteroller, polifenoller, vitaminler ve mineraller bakımından zengin besinsel içerikleri nedeniyle bitkisel sütlerin hazırlanmasında kullanılmaktadırlar. Son yıllarda özellikle satış rakamları incelendiğinde % 64 ile badem sütünü, % 13 ile soya sütü, % 12 ile Hindistan cevizi sütü ve % 11 ile diğer bitkisel sütlerin takip ettiği belirtilmektedir (Cortés vd., 2005; Borges vd., 2008; Prado vd., 2008; Tarantola & Wujastyk, 2009; Kim vd., 2012; Bernat vd., 2014; Mäkinen vd., 2016; Kundu vd., 2018; Willett vd., 2019; Vogelsang-O’Dwyer vd., 2021). 2.4. Kestane Sert kabuklu meyveler grubunda yer alan Kestane (Castanea) taksonomik sınıflandırmada Fagales takımının, Fagaceae (kayıngiller) familyasında yer almaktadır (Çizelge 2.1). Kestane ağacının botanik özellikleri Çizelge 2.2’ de belirtilmiştir. Meyve ticareti için bilinen on üç kestane türünden dördü kullanılmaktadır. Bunlar, Amerikan kestaneleri (Castanea dentata Borkh), Avrupa kestaneleri (Castanea sativa Mill), Çin kestaneleri (Castanea mollisima Bl.) ve Japon kestaneleri (Castanea crenata Sieb. & Zucc.) türleridir. Anadolu kestanesinin (tatlı kestane) içinde bulunduğu Castanea sativa Mill. türü ilk defa 1768 yılında Miller tarafından isimlendirilmiş olup, iri yaprakları, sarı renkli çekici çiçekleriyle dikkat çeken, güzel görünüşe sahiptir (Soylu, 2004; Ketenoglu vd., 2010; Atasoy & Altıngöz, 2011; Karadeniz, 2013; Saraçoğlu vd., 2015; Dönmez vd., 2016; Pinto vd., 2017; Avşar, 2019; Aydemir, 2019; Toprak, 2019; Çalışkan, 2020; Yüksel vd., 2020; Yadav vd., 2022). Kestanenin bilinen on üç türünün Çin, Kore, Japonya, Türkiye, Güney Avrupa ve ABD’nin de dahil olduğu kuzey yarım küre ülkelerinde yetiştiği belirtilmektedir. Dünyada kestane üretim alanları (ha) ve üretim miktarları (ton) dikkate alındığında Çin, (340 597 ha; 1 939 719 ton), Bolivya (57 781 ha; 85 047 ton) ve Türkiye (39 080 ha; 62 904 ton) ilk üç sırada yer almaktadır. Bu ülkeleri üretim alanı olarak Portekiz, İspanya, Kore, İtalya ve Japonya, üretim miktarları olarak da Kore, İtalya, Portekiz, Japonya ve İspanya izlemektedir (Gounga vd., 2008; Yurdakul, 2008; FAO, 2018). 26 Çizelge 2.1. Kestanenin taksonomik sınıflandırılması Bölüm Spermatophyta (Tohumlu bitkiler) Alt bölüm Angiospermae (Kapalı tohumlu bitkiler) Sınıf Dicotyledoneae (Çift benekli bitkiler) Takım Fagales Familya Fagaceae (Kayıngiller) Cins Castanea Tür Castanea sativa (Avrupa), C. molissima (Çin), C. crenata (Japon), C. dentata (ABD), C. seguinii, C. davidii, C. pumila, C. ashei, C. alnifolia, C. floridana, C. pauscipina, C. ozarkensis, C. henri FAO istatistik veritabanına göre, dünyada kestane üretimi 2 327 500 ton olup, kestane meyvesi Avrupa, Amerika ve Asya’da büyük ilgi görmekte, yaygın olarak tüketilmektedir. 2020 verilerine göre Türkiye’de kestane üretimi 76 045 ton, 2021 verilerine göre 77 792 ton olarak gerçekleşmiştir (FAO, 2019; TÜİK, 2020). Türkiye’ de tarihi çağlardan beri kültüre alınan bir meyve olan kestane Ege, Marmara ve Karadeniz bölgelerinde yetişmekte olup, yetiştiği mevsim nedeniyle "hüznün meyvesi" ve “dağların ekmeği” olarak da adlandırılmaktadır. Ülkemizde kestane ağaç sayıları ve üretim miktarları dikkate alındığında, Aydın, İzmir ve Bartın illeri ilk sıralarda yer almaktadır. Kestane dış ticaretimiz on bin tonun üzerinde olup, ihracaatın % 80’i İtalya’ya gerçekleştirilmektedir (Soylu, 2004; Ketenoglu vd., 2010; Atasoy & Altıngöz, 2011; Karadeniz, 2013; Saraçoğlu vd., 2015; Dönmez vd., 2016; Pinto vd., 2017; Aydemir, 2019; Toprak, 2019; Çalışkan, 2020; Yüksel vd., 2020; Yadav vd., 2022). 27 Çizelge 2.2. Kestane ağacının botanik özellikleri Rakım 500 – 1200 metre Ortalama boy 15 – 25 metre Tozlaşma Rüzgar ve böcek Çiçeklenme Haziran Kök Kazık köklü olup derin kök yapmakta Vejetasyon süresi Çiçek açımından hasat zamanına kadar yaklaşık 150 – 170 gün Tohum (meyve) olgunlaşma zamanı (Hasat) Eylül ortası-Kasım (kestane meyvesinin dışını saran dikenli kirpilerin az miktarda açılarak, içinde kendi doğal rengini almış meyvelerin görünmeye başlaması Işık isteği Yarı gölge Toprak isteği Kuru, iyi drene olmuş, derin, verimli, potasyumca zengin İklim isteiği - Sıcak, ılıman, nisbi nemi yüksek, - Yıllık yağı miktarı optimum 1000 – 2000 mm/yıl Kabuk Genç gövdelerde düzgün, yaşlılarda çatlak Yapraklar -0 – 25 cm uzunluğunda, kenarları sivri dişli, sert yapılı, üst yüzü koyu, alt yüzü ise soluk yeşil renkte -Kışın dökülür Çiçekler Sarı renkli Yaşam süresi 500 – 1000 yıl Olgunlaştırma koşulları 12 – 18 °C’de (nişasta, şekere dönüşür) İriliklerine göre sınıflandırılması 1 kilogramda 56 – 65 adet iri; 66 – 85 adet orta; 86 – 100 adet küçük; 101 – 125 adet çok küçük 28 2.4.1. Kestanenin besinsel bileşimi ve fonksiyonel özellikleri Kestane meyvesinin besinsel bileşimi genetik faktörler, ekolojik şartlar, hasat zamanı ve işleme yöntemine göre değişkenlik göstermektedir. Kestanenin nem içeriği % 41 – 64,4 toplam kurumadde içerisinde karbonhidrat içeriğinin % 42 – 94,2, protein içeriğinin % 2,2 – 12,4 ve yağ içeriğinin ise % 0,7 – 5,37 değerleri arasında değiştiği belirtilmektedir (Rosa vd., 2017). ➢ Karbonhidrat içeriği yüksek bir meyve olan kestane yüksek oranda (25 g/100 g kurumadde) nişasta içermektedir. Diğer karbonhidrat bileşenleri arasında sakkaroz (3,71 – 24,17 g/100 g kurumadde), glikoz (0,96 – 6,81 g/100 g kurumadde), fruktoz (0,57 – 5,32 g/100 g kurumadde) ve maltoz yer almaktadır. Karbonhidrat bileşimi nedeni ile 100 g kurumaddesi yaklaşık 401 – 428kcal enerji sağlamaktadır. Nişasta kestane pişirildiğinde karakteristik tat ve aromayı sağlamakta, diğer şeker bileşenleri de lezzetin oluşmasına katkıda bulunmaktadır. Yapılan çalışmalarda nişastanın bileşiminde yer alan amiloz ve amilopektinin enerji sağlamalarının yanı sıra, amilopektinin bakteriyel fermantasyonu sonucu oluşan kısa zincirli yağ asitleri nedeni ile sağlık üzerine olumlu etki de gösterdiği belirtilmektedir (Yurdakul, 2008; Aydemir, 2019; Yüksel vd., 2020). ➢ Fıstık (25,8 g/100 g kurumadde), badem (21,3 g/100 g kurumadde) ve fındık (15,0 g/100 g kurumadde) ile karşılaştırıldığında kestanenin daha düşük oranda (2,0 – 8,6 g/100 g kurumadde) protein içermesine rağmen, önemli aminoasit kompozisyonu nedeni ile yüksek kaliteli protein içerdiği belirtilmektedir. Globulinler ana depo proteinleri olup ve yüksek oranda albumin içermektedir. Aspartik asit (~1,0 g/100 g kurumadde) ve glutamik asit (~0,8 g/100 g kurumadde) en önemli aminoasitlerdir. Ayrıca esansiyel aminoasitlerden izolösin, lösin, lisin, L-histidin, L- metiyonin, L-treonin, L-fenilalanin, L-tirozin, L-serin, L-valin ve sistein ile prolin, L- alanin, L-aspartik asit, glisin ve arginin amino asitlerini içermektedir. Proteinojenik olmayan bir aminoasit olan, γ-aminobütirik asit (GABA) kestanenin bileşiminde doğal olarak (50 – 236 mg /100 g kurumadde) bulunmaktadır. Memelilerin merkezi sinir sisteminde önemli bir inhibitor nörotransmiter olup, nörotransmisyon, bağışıklık sistemini uyarma, kan basınıcını düşürme, bazı nörolojik hastalıkların tedavisi gibi 29 terapötik özelliklere sahiptir (De Vasconcelos vd., 2009; Gonçalves vd., 2012; Rosa vd., 2017). ➢ Kestane diğer sert kabuklu meyvelere göre düşük oranda yağ (0,7 – 10 g/100 g) içermektedir. Yağ asitlerinin yüzde bileşenleri incelendiğinde % 83 civarında oleik (C18:1), linoleik (C18:2) ve linolenik (C18:3) asit gibi doymamış yağ asitlerini içermesi nedeniyle kalp ve damar hastalıklarının ve obezitenin önlenmesi ile çocuklarda retinanın gelişmesinde önemli fonksiyonel etkiler gösterebilmektedir (Mert & Ertürk, 2017; Rosa vd., 2017; Aydemir, 2019). ➢ Kestane özellikle antioksidan ve antimikrobiyal özelliklere sahip vitaminler olan vitamin C ve E (γ-tokoferol, γ-tokotrienol, δ-tokoferol, α-tokoferol, α-tokotrienol) açısından zengin bir meyvedir. Vitamin E kardiyovasküler rahatsızlıkların ve kanser riskinin önelenmesinde de olumlu etkiye sahiptir. İnsan vücudunda birçok fonksiyonel etkiye sahip vitamin A, tiamin, ribofilavin ve folik asit gibi B grubu vitaminleri de kestanenin bileşiminde yer almaktadır. Özellikle B grubu vitaminleri içermesi nedeni ile beyin sağlığı ve nörolojik hastalıklar üzerine önemli etki gösterebilmektedir. Diğer sert kabuklu meyvelere göre folik asit içeriği açısından daha zengindir. Folik asit özellikle vücutta kırmızı kan hücrelerinin oluşumu ve hamilelikte bebeğin gelişimi açısından önemli bir vitamindir (De Vasconcelos vd., 2009; Rosa vd., 2017; Şenel & Eltan, 2019; Roland, 2020; Yadav vd., 2022). ➢ Kestanenin mineral madde içeriği; potasyum (K, 473 – 974 mg/100 g kurumadde), fosfor (P, 104 – 148 mg/100 g kurumadde), magnezyum (Mg, 63 – 93 mg/100 g kurumadde), kalsiyum (Ca, 41–51 mg/100 g kurumadde), demir (Fe, 5,3 – 10,9 mg/100 g kurumadde), manganez (Mn, 3,1 – 8,0 mg/100 g kurumadde), sodyum (Na, 0,9 – 3,9 mg/100 g kurumadde), çinko (Zn, 1,4 – 3,1 mg/100 g kurumadde) ve bakır (Cu, 1,3 – 2,7 mg/100 g kurumadde) elementleri ile karakterize edilmektedir. Potasyum özellikle karbonhidrat metabolizması, protein sentezi ve sinir uyarıları ile ilişkili, fosfor kemik ve dişlerin mineralizasyonu, enerji metaboliması ve besin elementlerinin taşınması ve emilimi ile ilişkili, magnezyum ise sinir sistemi, enzimatik aktivite ve kas yoğunluğu ile ilişkili özellikler gösterdiğinden kestanenin 30 mineral madde içeriği beslenme açısından önemlidir (Borges vd., 2008; De Vasconcelos vd., 2009; Yüksel vd., 2020). ➢ Kestane bileşiminde yer alan diyet lifi miktarı (8 – 10 g/100g taze meyve) ile günlük lif alımını da destekleyici bir meyve olarak düşünülmektedir. Diyet lifleri, kardiyoprotektif, antidiyabetik, antikolesterol, antikarsinojen, insülin ve kan lipitlerini düzenleyici ve prebiyotik özellikleri nedeni ile sağlık üzerine olumlu etkileri bulunan gıda bileşenleridir (Yurdakul, 2008; Blaiotta vd., 2012; Mete, 2016; Ozcan vd., 2017). ➢ Polifenolik bileşenler (fenolik asitler, flavonoidler ve tanninler) kestanenin sekonder metabolitlerini oluşturmaktadır. Gallik asit, ellajik asit, rutin, kuersetin, apigenin ve tanninler kestanenin bileşiminde yer alan önemli fenolik bileşiklerdir. Kestanenin içermiş olduğu fenolik bileşenlerin antioksidan özelliklerinin yanısıra kalp damar hastalıklarını önleme, antikarsinojen ve anti-enflamatuar özelliklerinin de olduğu belirtilmektedir (Carocho vd., 2014; Rosa vd., 2017). ➢ Kestane okzalik, sitrik, askorbik, malik, kuinik, fumarik, glutamik, tartarik, pirüvik, ve sitrik asit gibi organik asitleri de içermektedir. Bu organik asitler antioksidan aktivitelerinin yanısıra bazı terapötik özelliklere de sahiptirler. Fumarik asit sedef hastalığı ve inflamasyona karşı etkili olup, nöro ve kemoprotektör olarak kullanılabilmektedir. Malik asit bakterisidal etki göstermektedir (Rosa vd., 2017; Delgado vd., 2018). ➢ Gluten içermemesi nedeniyle çölyak hastalığına yakalanmış kişiler için iyi bir besin kaynağı olarak tek başına ya da birçok fonksiyonel ürünün geliştirilmesinde kullanılmaktadır. Çölyak hastalığı, bağırsaklardaki sindirimi sağlayan "villus" denilen yapıların bozulması sonucu yiyeceklerdeki besin bileşenlerinin emilmesini engelleyen ve ince bağırsakta hasarlar oluşturan otoimmün bir hastalıktır. Çölyak hastası olan kişiler buğday, arpa, çavdar ve yulafta bulunan ve "gluten" olarak adlandırılan bir proteine karşı hassassiyet göstermektedirler. Bu nedenle, çölyak hastaları için gluten içeren gıdalar toksik olarak kabul edilmektedir (De Vasconcelos vd., 2009) 31 2.4.2. Kestanenin kullanım alanları Kestane ağacı kereste üretiminde, kayık, yat, gemi ile iskele yapımında, pencere doğramalarında, cephe kaplamalarında, bahçe masaları ve sandalyeleri, çit kazığı, parke, oyun parkları, ev ve ofis dekorasyonunda ve yüksek oranda prosiyanidinler (kondanse tanen) ve ellajitaninler (hidrolizlenebilir tanenler) ile tanin yönünden zengin olduğundan şarap fıçıları için tahta yapımında ya da direkt olarak şarabın içine tahta parçaları şeklinde (tanenlerin süzülmesi, olgunlaşmış şarap ve brendiler için kendine has organoleptik bir özellik sağlar) kullanılmaktadır. Kestanenin soyulma işleminden sonra kalan kabuklar bazı ülkelerde yakıt olarak, boya maddesi olarak değerlendirilirken kabuğu ve yaprağı antioksidanca zengin bileşenler içerdiğinden hayvan beslemede ve insan gıdalarına katkı maddesi olarak kullanılabilmektedir. Yaprak ve kabuklarının çay olarak tüketilmesinin kabızlık, yüksek tansiyon, boğaz ağrısı ve bronşit tedavisinde olumlu etkili olduğu bildirilmektedir. Özellikle yapraklarının Alman Komisyon E Monografları arasında yer aldığı ve solunum sistemi hastalıklarına karşı ve bacaklardaki dolaşım bozukluklarında kullanıldığı bildirilmektedir (Baytop, 1984; Blumenthal, 1999; Passalacqua vd., 2007; De Vasconcelos vd., 2009; Selek, 2011). Kestane meyvesi taze, kavrulmuş, kaynatılmış, kızartılmış ve püre halinde tüketilebilmektedir. Ayrıca, reçel, şekerleme, şurup, puding, dondurma, salata, tatlı, çorba, unlu mamüller, alkollü içeceklerin üretiminde de kullanılabilmektedir. Son yıllarda besinsel zenginliği, glüten ve kolesterol içermemesi nedeni ile kestane bazlı ürünlerin geliştirilmesinde artış gözlenmektedir (Blaiotta vd., 2012; Dall’Asta vd., 2013; Mert & Ertürk, 2017; Ozcan vd., 2017; Rosa vd., 2017; Aydemir & Atalar, 2019; Ghosh & Amit, 2019). 2.5. Deneysel Tasarım ve Optimizasyon Optimizasyon, daha iyi bir sonuç bulununcaya kadar olası tüm çözümlerin amaç fonksiyonuna göre aranması ve karşılaştırılması işlemi olarak tanımlanmaktadır (Shadkam & Bijari, 2015). Optimizasyon, bir sistemin, prosesin ya da üretim sürecinin hedeflenen çıktılar (yanıtlar) doğrultusunda, süreçle ilişkili bağımsız değişkenlerin birbirleri arasındaki etkileşimleri ve bağımsız değişkenlerin çıktıya (yanıta) olan etkilerinin, süreçten maksimum fayda ve performans sağlamak amacıyla birlikte 32 uygulandığı bir çalışmadır (Bezerra vd., 2008; Balcıoğlu, 2015; Akdeniz, 2019; Özonur vd., 2019). Optimizasyonda eş zamanlı çalışan yanıtların çalışma süresince, maksimum seviyede, minimum seviyede veya belirlenen hedef değer aralığında olması istenir. Çoklu yanıtların birlikte optimize edilmesindeki amaç, ürün kalitesinin arttırılması, maliyetin düşürülmesi ya da parametrelerin optimizasyonunu sağlamaktır (Saguy vd., 1984; Bezerra vd., 2008; Balcıoğlu, 2015; Shadkam & Bijari, 2015; Akdeniz, 2019; Özonur vd., 2019). 2.5.1. Yanıt yüzey deney tasarımları 1951 yılında Box and Wilson tarafından geliştirilmiş olan yanıt yüzey yöntemi (Response Surface Methodology – RSM), “denemelerin optimum koşullara ulaşması” olarak tanımlanmıştır. Yanıt yüzey yöntemi, istatistiksel ve matematiksel yöntemler ile proseslerin geliştirilmesi ve proses koşullarının optimize edilerek ulaşılmaya çalışılan hedefin maksimum seviyeye çıkarılması amacıyla yapılan, bir deneysel modelleme yöntemidir (Box & Wilson, 1992; Baş & Boyacı, 2007; Myers vd., 2016). Yanıt yüzey yönteminin hedefleri; ➢ Yanıt değişkeninin proses optimize edildikten sonra elde edilecek değerlerinin doğru olarak tahmin edilmesi, ➢ Bağımlı (yanıt) değişkeni ile bağımsız (faktör) değişkenler arasındaki ilişkiyi belirleyecek uygun bir modelin tespit edilmesi, ➢ Probleme bağlı olarak en büyük, hedef ya da en küçük yanıt değerinin araştırılması ve bu değeri sağlayabilecek bağımsız (faktör) değişkenlerin değerlerinin tespit edilmesidir (Bayrak vd., 2010; Özonur vd., 2019). RSM’de model çoklu regresyon analizi yardımıyla oluşturulur. Bir faktörün ana etkisinin veya diğer faktörler ile etkileşimi sonucunda, yanıt değişkenin değerlerinde ne derece önemli bir etkiye sahip olduğuna regresyon katsayıları yardımıyla karar verilmektedir. RSM’de öncelikle amaç, yanıt değişkeni üzerinde etkisi olduğu düşünülen faktörleri ve sahip oldukları düzeyleri belirlemektir. Bu adımdan sonra, deney tasarımı, regresyon ve optimizasyon teknikleri iç içe kullanılır (Thompson, 1982; Baş & Boyacı, 2007). RSM ile optimizasyonda aşağıdaki işlem basamakları uygulanmaktadır: 33 1‐ Bağımsız değişkenlerin ve limit değerlerin belirlenmesi, 2- Deney tasarımının seçilmesi ve yanıtlar doğrultusunda deneylerin yapılması, 3- Elde edilen verilerin matematiksel olarak ifade edilmesi, 4- Modelin uygunluğunun değerlendirilmesi, 5- Sonuçların doğrulanması (Brereton, 2007; Bezerra vd., 2008; Yolmeh & Jafari, 2017; Malekjani & Jafari, 2020). Bağımlı değişkenler (y) ile bağımlı değişkenleri etkileyen bağımsız değişkenlerin (xi) birbiri arasındaki ilişkinin düşük dereceli bir polinomiyal denklem ile ifade edilebileceği belirtilmiştir (Myers vd., 2016; Akdeniz, 2019). Sistemin yanıtı, bağımsız değişkenin bir lineer fonksiyonu olarak yeterli ölçüde uyumlu ise birinci dereceden polinomiyal denklem kullanılabilir. Eğer sistemin yanıt yüzeyinde bir eğrilik varsa, bağımsız değişkenlerin lineer fonksiyonları yeterli ölçüde uyumlu değilse; ikinci dereceden (quadratik) polinomiyal denklemler gibi daha yüksek dereceli polinomiyal denklemler kullanılmalıdır Birçok fonksiyon içerebildiğinden quadratik modeller, gerçek yanıt fonksiyonunun tahmin edilmesinde tercih edilmektedir. Polinomiyal denklemin katsayıları en küçük kareler yöntemi yardımıyla hesaplanabilmekte ve optimum noktanın belirlenmesi matematiksel olarak kolayca yapılabilmektedir (Thompson, 1982; Baş & Boy