Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 45 (3) 263-270, 2019 DOI: https://doi.org/10.32708/uutfd.613912 ÖZGÜN ARAŞTIRMA Rosmarinik Asidin Cisplatine Karşı Antisitotoksik ve Antigenotoksik Etkisinin A549 ve Beas-2B Hücre Hatlarında Araştırılması Özgür VATAN Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Bursa. ÖZET Rosmarinik Asit (RA) birçok bitki türünde bulunan önemli bir fenolik bileşiktir. Çalışmada RA’nın, A549 (İnsan Akciğer Kanser Hücre Hattı) ve Beas-2B (İnsan Sağlıklı Bronşial Epitel Hücre Hattı) hücrelerinde, Cisplatin tarafından oluşturulan sitotoksik, genotoksik etki ve oksidatif strese karşın etkinliğinin in vitro olarak belirlenmesi ve böylelikle Cisplatin kemoterapisi sırasında hastalar tarafından kullanılabile- cek RA içerikli bitkisel ürünlerin Cisplatin tedavisi üzerindeki olası etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak sitotok- site belirlenmesinde XTT, genotoksite belirlenmesinde Komet ve oksidatif stres değerlerinin belirlenmesinde ise DCFH-DA yöntemleri kullanılmıştır. Yöntemlerde hücreler Cisplatin’in iki farklı dozuna (11, 22 µM) 24 saat süre ile maruz bırakılmıştır. Hücreler RA’nın üç farklı konsantrasyonuna (50, 100, 200 µM) hem tek başına hem de Cisplatin’in iki farklı dozu ile beraber uygulanarak 24 saat süre ile maruz bırakılmıştır. Sonuç olarak Cisplatin dozları tarafından arttırılan; sitotoksik etkiye karşın RA’nın kullanılan konsantrasyonlarının antisitotok- sik aktivite, genotoksik etkiye karşın ise antigenotoksik aktivite gösterme potansiyeli olduğu belirlenmiştir. RA’nın bu aktivitelerinin teme- linde de Cisplatin tarafından arttırılan oksidatif stres parametrelerini azaltıcı antioksidan özellik göstermesi olduğu belirlenmiştir. Sonuç olarak RA içeren bitkisel ürünlerin, özellikle Cisplatin kemoterapisi alan hastalarda bilinçsizce tüketiminin önlenmesi gerekliliği gösterilmiş- tir. Anahtar Kelimeler: Rosmarinik asit. Cisplatin. Antisitotoksite. Antigenotoksite. Investigation of Anticytotoxic and Antigenotoxic Effect of Rosmarinic Acid Against Cisplatın In A549 and Beas-2B Cell Lines ABSTRACT Rosmarinic Acid (RA) is an important phenolic compound found in many plant species. The aim of this study was to determine the efficacy of RA against Cisplatin-induced cytotoxic, genotoxic effects and oxidative stress in A549 (Human Lung Cancer Cell Line) and Beas-2B (Human Healthy Bronchial Epithelial Cell Line) cells. In this way, it was aimed to determine the possible effects of RA-containing herbal products that can be used by patients, on Cisplatin treatment during Cisplatin chemotherapy. For this purpose, XTT assay was used to deter- mine cytotoxicity, Comet assay was used to determine genotoxicity and, DCFH-DA assay was used to determine oxidative stress values. Cells were exposed to two different doses of Cisplatin (11, 22 µM) for 24 hours. Cells were exposed to three different concentrations of RA (50, 100, 200 µM) both alone and in combination with two different doses of Cisplatin for 24 hours. As a result, it was determined, used RA concentrations have anti cytotoxic activity potential, against the cytotoxic effect increased by Cisplatin and antigenotoxic activity potential, against the genotoxic effect increased by Cisplatin. It was found that these activities of RA were based on antioxidant properties which reduced oxidative stress parameters increased by Cisplatin. In conclusion, the necessity to prevent the unconscious consumption of herbal products containing RA, especially in patients receiving Cisplatin chemotherapy has been shown. Key Words: Rosmarinic acid. Cisplatin. Anticytotoxicity. Antigenotoxicity. Kozmetikten gıda sanayisine kadar pek çok alanda nus officinalis (Biberiye) bitkisinden izole edilmiş kullanımı bulunan Rosmarinik asit (RA), kafeik asit olan RA’nın kimyasal yapısı şekil 1 de gösterilmiştir2. ve 3,4 dihidroksifenillaktikasit’in esteridir1. İlk olarak 1958 yılında Scarpati ve Oriente tarafından Rosmari- Geliş Tarihi: 01 Eylül 2019 Kabul Tarihi: 25 Eylül 2019 Dr. Özgür VATAN Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Şekil 1. Biyoloji Bölümü, Bursa. Rosmarinik asidin kimyasal yapısı Tel.: 0535 359 70 62 / 0224 294 18 65 (3 nolu kaynaktan alınmıştır). E-posta: ovatan@uludag.edu.tr 263 Ö. Vatan Daha sonra gerçekleştirilen çalışmalarla pek çok bitki Pürivat (PAN Biotech, Aidenbach, Germany).1 mM familyasına ait farklı türlerin de RA içerdiği belirlen- L- Glutamin (Sigma Aldrich, Darmstadt, Germany), miştir. Lamiaceae ve Boraginaceae dışında RA içeren 100U/ml Penisilin- 100 µg/ml Streptomisin (Bioch- belli başlı familyalara; Apiaceae4, Araliaceae5, Cucur- rom AG, Berlin, Germany) ile oluşturulmuştur. Hüc- bitaceae6, Tiliaceae7, Rubiaceae8, Sterculiaceae9, Zos- reler T75 flaskların %80’ini kapladıktan sonra tripsi- teraceae10, Blechnaceae11, Anthocerotaceae12 familya- nize edilerek süspanse hale getirilmiştir. Trypan Blue ları örnek verilebilir. (Sigma Aldrich, Darmstadt, Germany) solüsyonu ile Chu ve ark. gerçekleştirdikleri çalışmada RA’nın canlılıkları belirlenen hücrelerden 96 kuyucuklu plak- antiinflamatuar etkinliğini farelerde lipopolisakkarit- lara 8000 canlı hücre / kuyucuk şeklinde ekim yapıl- lerle indükledikleri akut akciğer yaralanmalarında in mış ve 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Süre sonun- vivo olarak göstermişlerdir13. Sanchez-Campillo ve da hücreler deney setlerini oluşturacak şekilde RA ve ark ise RA’nın UV ışınlarından koruyucu bir ajan Cisplatin’in farklı konsantrasyonlarına 24 saat süre ile olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir14. Bunların maruz bırakılmıştır. Öncelikle RA’nın sitotoksik et- dışında RA’nın antioksidan özelliklerinin gösterildiği kinliğinin belirlenmesi için hücreler RA’nın 6 farklı birçok çalışma bulunmaktadır15. Bununla birlikte konsantrasyonuna maruz bırakılmıştır (12,5; 25; 50; farklı ülkelerde olduğu gibi ülkemizde de RA açısın- 100; 200; 400 µM). Buradan seçilen üç farklı RA dan zengin Rosmarinus officinalis (biberiye) gibi konsantrasyonu (50; 100; 200 µM) Cisplatin’in daha bitkilerin halk arasında farklı semptomlara karşı gele- önceki çalışmalarımızda etkinliğini belirlemiş oldu- neksel olarak kullanımı da oldukça yaygındır16,17. ğumuz 22 µM ve 11µM dozları ile birlikte hücrelere 18 Çalışmada özellikle Cisplatin kemoterapisi alan hasta- uygulanmıştır . Süre sonunda hücrelerin canlılıkları larda, RA kullanımının oluşturabileceği etkilerin in XTT Cell proliferation Kit (BI; Biological Industries, vitro olarak gösterilmesi amaçlanmıştır. Bu amaç Kibbutz Beit Haemek, Israel) kullanılarak belirlenmiş- doğrultusunda Cisplatin’in sitotoksik ve genotoksik tir. Yöntem sarı renkli bir tetrazolium tuzu olan etkilerine karşı RA’nın olası antisitotoksik ve antige- XTT’nin canlı hücrelerin mitokondrial suksinat de- notoksik özellikleri in vitro olarak araştırılmıştır. hidrogenaz enzim aktiviesi ile elektron eşleştirici reaktif varlığında portakal renkli formazan kristalleri- ne dönüşmesi esasına dayanmaktadır19. XTT uygula- ması muamele süreleri sonrasında üreticinin önerdiği Gereç ve Yöntem şekilde gerçekleştirilmiştir. Ardından her bir kuyucuk- taki 450 nm de absorbans değerleri mikroplaka oku- Çalışmada RA’nın (Sigma Aldrich, Darmstadt, Ger- yucu (Biotek ELx800, Biotek Instruments Inc. VT. many, CAS: 20283-92-5) Cisplatin (Sigma Aldrich USA) kullanılarak belirlenmiştir. Absorbans değerle- Darmstadt, Germany, CAS: 15663-27-1) tarafından rinden aşağıdaki formül kullanılarak hücrelerin % oluşturulan sitotoksik ve genotoksik etkiye karşı anti- canlılık değerleri belirlenmiştir18. sitotoksik ve antigenotoksik etkinliği A549 (ATCC® CRM-CCL-185™) insan akciğer kanser hücre hattı ve Beas-2B (ATCC® CRL-9609™) insan sağlıklı Absorbans muamele grubu / Absorbans kontrol grubu X 100 bronşial epitel hücre hatlarında in vitro olarak araştı- rılmıştır. Bununla birlikte Cisplatin etki mekanizma- Komet Yöntemi sında önemli rol oynayan Hücre içi Reaktif Oksijen Yöntem DNA da meydana gelmiş tek zincir kırıkları- Türleri (ROS; “Reactive Oxygen Species”) üzerinde nın ve yüksek alkali çözelti içerisinde kırıklara dönü- Cisplatin’in etkisine karşın RA’nın etkinliği de aynı şen alkalilenebilecek noktaların belirlenmesinde yay- hücre hatları kullanılarak araştırılmıştır. Sitotoksite- gın bir şekilde kullanılan önemli bir genotoksite yön- antisitotoksite belirlenmesinde XTT ((2,3-bis[2- temidir20. Temel prensibi tek hücre DNA’sının lam metoksi- 4-nitro- 5-sulfofenil]- 2H-tetrazolyum- 5- üzerine kaplanmış agaroz jel içerinde elektroforetik karboksianilit iç tuzu), genotoksite - antigenotoksite alanda göç etmesine dayanmaktadır o nedenle tek belirlenmesinde Komet, Hücre içi, ROS miktarı belir- hücre jel elektroforezi (Single Cell Gel Electrophore- lenmesinde ise 2’, 7’ Diklorohidrofloresein diasetat sis SCGE) olarak ta isimlendirilmektedir, mikroskop- (DCFH-DA, Sigma Aldrich, Darmstadt, Germany, taki görüntü kuyruklu yıldız benzeri olduğu için Ko- CAS: 4091-99-0) yöntemleri kullanılmıştır. met (comet) ismi daha yaygın kullanılmaktadır. Hücreler havalandırmalı kapaklı T25 flasklar içerisine XTT Yöntemi 50000 canlı hücre/flask olacak şekilde ekilmiştir ve 24 A549 ve Beas-2B hücreleri 37 oC ve %5 CO2 içeren saat inkübasyona bırakılmıştır. Süre sonunda hücreler ortama sahip inkübatörlerde havalandırmalı T75 flask- deney setlerini oluşturacak şekilde RA ve Cisplatin’in lar içerisinde kültüre edilmiştir. Kültür ortamı olarak farklı konsantrasyonlarına 24 saat süre ile maruz bıra- kullanılan besiyeri içeriği; RPMI 1640 medyum (PAN kılmıştır. Öncelikle RA’nın genotoksik etkinliğinin Biotech, Aidenbach, Germany), %10 Fetal Calf serum belirlenmesi için hücreler RA’nın 3 farklı konsantras- (PAN Biotech, Aidenbach, Germany) 1mM Sodyum yonuna maruz bırakılmıştır (50; 100; 200 µM). Bunun 264 Cisplatin’e Karşı Rosmarinik Asit dışında aynı üç RA konsantrasyonu Cisplatin’in iki lorofloresein (DCF) miktarının, flourometrik mikrop- farklı dozu (11 µM ve 22 µM) ile beraber de uygu- laka okuıyucuda (Fluoroskan Ascent FL 2.6 Thermo lanmıştır. Süre sonunda hücreler tripsinize edilerek Fisher Scientific Oy, Vantaa, Finland) 480 nm Excita- süspansiyon haline getirilmiştir. Hücrelere Sing ve ark. tion / 530 nm Emission dalga boylarında oluşan Rela- tarafından geliştirilen alkali komet yöntemi küçük tif Floresans Ünite (RFU) cinsinden belirlenmesiyle modifikasyonlar ile uygulanmıştır21. Yöntemde kulla- araştırılmıştır. nılan tüm kimyasallar Sigma Aldrich, (Darmstadt, Germany)’ten tedarik edilmiştir. Yöntemin uygulan- İstatistiksel Analizler masında; muamele sonrası hücreler PBS ile yıkanmış Tüm deneyler üç tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. ve %0,65 (w/v) lik ‘Low Melting Agaroz’ ile süspanse Bulgularda verilen değerler ortalama değerler ± Stan- edilmiştir. Ardından hücreler önceden agaroz ile kap- dart Sapma değerleri şeklindedir. İstatistiksel analizler lanmış lamlara yayılmıştır ve liziz çözeltisi (2,5 M SPSS 22.0 programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir NaCl, 10 mM Na2EDTA, 10mM Tris, %1 (w/v) Tri- (SPSS Inc. Chicago, IL, USA). Verilerin normallik tonX100, %10 (w/v) DMSO, pH=10) içerisinde 4 oC analizleri Kolmogorov-Simirnov Z testi ile gerçekleş- bir gece inkübasyon ile liziz edilmiştir. Liziz sonrası tirilmiştir. Karşılaştırmalarda One Way ANOVA testi, alkali çözelti içerisinde (1 mM Na2EDTA, 300mM varyansların homojenliğine göre de Tukey veya Tam- NaOH; pH=13) 30 dakika DNA açılması sağlandıktan hane testleri kullanılmıştır. Tüm testlerde istatistiksel sonra aynı alkali çözelti içerisinde 30 dakika süre ile anlamlılık değeri p< 0,05 olarak kabul edilmiştir. 25V, 350 mA akım ile elektroforez işlemi gerçekleşti- rilmiştir. Elektroforez sonrasında lamlar 2 dakika süre ile 20 µg/ml etidyum bromür ile boyanarak floresan mikroskop da (Nikon Eclipse 80i, Nikon Inc, Tokyo, Bulgular Japan) uygun filtre küpü (518 Excitation- 605 Emis- sion; Nikon CY3(G-2A), Nikon Inc, Tokyo, Japan) XTT Bulguları kullanılarak incelenmiştir. Her bir grup için en az 100 XTT testi sonucunda elde edilen % Canlılık değerleri komet görüntüsünün fotoğrafları çekilmiştir (Kame- A549 hücreleri için Şekil 2 de, Beas-2B hücreleri için ram 21, Argenit Tic.Ltd,Şti. İstanbul Türkiye). Komet ise Şekil 3’te grafik olarak verilmiştir. 12,5 µM, 25 görüntülerinin analizlerinde Komet yazılımı (Mikro- µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM ve 400 µM RA uygu- sistem, Argenit Tic.Ltd,Şti. İstanbul, Türkiye) kullanı- lamaları her iki hücre hattında da sitotoksik etki gös- larak Kuyruk uzunluğu, kuyruk %DNA içeriği ve termemiştir. Her bir uygulama, kendi hücre hattındaki ‘Olive Tail Moment (OTM)’ parametreleri değerlen- kontrol grubu olan büyüme kontrol grubu ile % hücre dirmeye alınmıştır. canlılığı açısından karşılaştırılmış ve istatistiksel ola- rak anlamlı bir farklılık belirlenmemiştir (p>0,05). İki DCFH-DA Yöntemi hücre hattında da iki farklı Cisplatin (11 µM ve 22 Hücre içi ROS miktarı 2’, 7’ Diklorohidrofloresein µM) dozlarıyla birlikte uygulanan RA konsantrasyon- diasetat (DCFH-DA) yöntemi kullanılarak araştırıl- ları (50, 100 ve 200 µM) ile oluşturulan grupların % mıştır. Yöntemin temeli, 2’, 7’ Diklorohidrofloresein hücre canlılık değerleri, ilgili Cisplatin dozunun tek diasetat’ın (DCFH-DA) hücre içerisine girebilmesine başına uygulanması ile oluşturulan grup ile karşılaştı- dayanmaktadır. Hücre içerisine difüze olan DCFH-DA rılmıştır. A549 hücrelerinde 11 µM Cisplatin dozu % hücresel esterazlar tarafından deasetillenerek 2’, 7’ hücre canlılık değerini 67,5 ± 2,081’e indirerek istatis- Diklorohidrofloresein’e dönüştürülür. 2’, 7’ Dikloro- tiksel olarak anlamlı düzeyde sitotoksik etki göster- hidrofloresein ise hücre içindeki Reaktif Oksijen Tür- miştir (Kontrol grubu olan Büyüme kontrol grubu ile leri (ROS) tarafından floresan özellikteki, okside ol- karşılaştırılmıştır; p= 0,008). 11 µM Cisplatin dozu ile muş 2’, 7’ Diklorohidrofloresein’e (DCF) dönüştürü- beraber uygulanan 100 ve 200 µM RA konsantrasyon- lür. Hücre içerisindeki floresan özellikteki DCF mik- ları Cisplatin’in oluşturduğu sitotoksik etkiyi azaltarak tarı ROS miktarı ile orantılıdır22. istatistiksel olarak anlamlı düzeyde antisitotoksik etki göstermiştir (sırasıyla p=0,029; p=0,02). Benzer şekil- Kültürdeki hücreler. 8000 canlı hücre/ kuyucuk olacak de 22 µM Cisplatin dozu da istatistiksel olarak anlamlı şekilde 96 kuyucuklu siyah plakalara ekilmiştir ve 24 düzeyde sitotoksik etki göstermiştir (p= 0,002). 22 µM saat inkübasyona bırakılmıştır. Süre sonunda hücreler Cisplatin dozu ile birlikte uygulanan 50 µM, 100 µM RPMI 1640 medyum içerisinde 50 µM DCFH-DA ile ve 200 µM RA konsantrasyonları Cisplatin’in oluştur- 37 °C ve %5 CO2 ortama sahip inkübatörde 4 saat duğu sitotoksik etkiyi azaltarak istatistiksel olarak inkübe edilmişlerdir. Ardından hücre içerisine gire- anlamlı düzeyde antisitotoksik etki göstermiştir (sıra- memiş DCFH-DA’nın fazlası seri PBS yıkamaları ile sıyla; p= 0,003; p=0,001; p< 0,001). uzaklaştırılmıştır. DCFH-DA yüklenmiş hücrelerde, komet yönteminde belirtilen deney grupları oluştu- rulmuştur. 24. saatte hücre içerisindeki ROS miktarı, hücre içerisinde oluşan floresan özellikteki 2’, 7’ Dik- 265 Ö. Vatan belirlenmiştir (her biri için p< 0,001). A549 ve Beas- 2B hücrelerinde 11 µM ve 22 µM’lık Cisplatin dozları ile arttırılmış olan komet parametrelerinin, ilgili Cisp- latin dozu ile beraber uygulanan 50 µM, 100 µM ve 200 µM’lık RA tarafından istatiksel olarak anlamlı bir şekilde azaltıldığı belirlenmiştir (p<0,001) Şekil 2. A549 hücrelerinde % canlılık değerleri. (RA: rosmarinik asit, Cis: cisplatin). Şekil 4. Komet görüntü örnekleri. A: A549 hücrelerinde BK Beas-2B hücrelerinde de 11 ve 22 µM Cisplatin dozu (büyüme kontrol) grubundan elde edilen mikroskobik istatistiksel olarak anlamlı düzeyde sitotoksik etki (20X) komet görüntüsü örneği. B; A549 hücrelerinde göstermiştir (sırasıyla; p= 0,011; p<0,001). 11 µM 22 µM Cisplatin grubundan elde edilen mikroskobik Cisplatin dozu ile beraber uygulanan 100 ve 200 µM (20X) komet görüntüsü örneği C; A549 hücrelerinde RA konsantrasyonları Cisplatin’in oluşturduğu sito- 200 µM RA (rosmarinik asit) + 22 µM Cisplatin gru- toksik etkiyi azaltarak istatistiksel olarak anlamlı dü- bundan elde edilen mikroskobik (20X) komet zeyde antisitotoksik etki göstermiştir (sırasıyla görüntüsü örneği p=0,01; p=0,009). 22 µM Cisplatin dozu ile birlikte uygulanan 50,100 ve 200 µM RA konsantrasyonları Tablo I. A549 Hücrelerinden Elde Edilen Komet da Cisplatin’in oluşturduğu sitotoksik etkiyi azaltarak Bulguları istatistiksel olarak anlamlı düzeyde antisitotoksik etki göstermiştir (üç konsantrasyon için de; p<0,001). Ortalama ± SS Kuyruk uzunluğu (µm) Kuyruk %DNA OTM BK 13,140 ± 2,605 5,204 ± 1,556 0,242 ± 0,111 50 µM RA 13,400 ± 2,874 5,336 ± 2,155 0,240 ± 0,142 100 µM RA 13,230 ± 3,393 4,809 ± 1,818 0,212 ± 0,121 200 µM RA 13,860 ± 3,207 5,219 ± 2,002 0,230 ± 0,131 11 µM Cis 47,520 ± 7,639 37,766 ± 6,689 12,706 ± 3,120 50 µM RA + 11 µM Cis 32,320 ± 2,069 a*** 21,795 ± 1,766a*** 4,791 ± 0,681a*** 100 µM RA + 11 µM Cis 14,700 ± 2,661 a*** 5,370 ± 1,862a*** 0,302 ± 0,429a*** 200 µM RA + Şekil 3. a*** a*** a***11 µM Cis 15,250 ± 1,641 6,312 ± 1,081 0,298 ± 0,088 Beas-2B hücrelerinde % canlılık değerleri. 22 µM Cis 68,880 ± 3,201 53,740 ± 6,683 20,474 ± 3,98 (RA: rosmarinik asit, Cis: cisplatin). 50 µM RA+ 22 µM Cis 43,300 ± 6,144 b*** 32,402 ± 2,084b*** 10,274 ± 1,366b*** Komet Bulguları 100 µM RA + b*** b*** b*** Elde edilen mikroskobik komet görüntü örnekleri 22 µM Cis 32,480 ± 1,010 22,132 ± 2,073 4,637 ± 0,664 Şekil 4’te gösterilmiştir. 200 µM RA + 36,790 ± 5,200b*** 32,311 ± 4,219b*** 11,227 ± 2,128b*** A549 hücrelerinde elde edilen Komet bulguları Tablo 22 µM Cis I’de Beas -2B Hücrelerinden elde edilen komet bulgu- SS; Standart Sapma, OTM; “Olive Tail Moment”, BK; ları ise Tablo II’de gösterilmiştir. Uygulanan 50 µM, Büyüme Kontrol, RA; Rosmarinik Asit, Cis; Cisplatin. (a; 100 µM ve 200 µM RA konsantrasyonlarının, hem aynı parametrenin 11 µM Cis grubu ile karşılaştırılmıştır, b; A549 hem de Beas-2B hücrelerinde değerlendirilen üç aynı parametrenin 22 µM Cis grubu ile karşılaştırılmıştır, *** komet parametresi olan kuyruk uzunluğu, kuyruk % ; p < 0,001) DNA ve OTM değerlerini kendi kontrol gruplarına göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde değiştirme- dikleri belirlenmiştir (p> 0,05). A549 ve Beas-2B hücrelerinde Cisplatin’in 11 µM ve 22 µM’lık dozla- rının, değerlendirilen komet parametrelerinin her üçü- nü de istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttırdığı 266 Cisplatin’e Karşı Rosmarinik Asit Tablo II. Beas-2B Hücrelerinden Elde Edilen Komet Bulguları Ortalama ± SS Kuyruk Kuyruk uzunluğu (µm) %DNA OTM BK 10,520 ± 2,642 4,761 ± 0,982 0,157 ± 0,075 50 µM RA 9,703 ± 2,984 4,940 ± 0,981 0,178 ± 0,082 100 µM RA 8,860 ± 3,638 4,768 ± 1,044 0,132 ± 0,070 200 µM RA 9,820 ± 3,937 5,031 ± 0,895 0,134 ± 0049 11 µM Cis 44,300 ± 6,597 33,789 ± 2,618 10,544 ± 1,229 Şekil 6. 50 µM RA + a*** a*** 11 µM Cis 28,870 ± 4,640 17,918 ± 3,802 2,470 ± 0,980 a*** Beas-2B Hücrelerinde Hücre içi ROS miktarı. (ROS: “reactive oxygen species” reaktif oksijen türleri, 100 µM RA + 11 µM Cis 14,570 ± 1,305 a*** 5,742 ± 1,312a*** 0,235 ± 0,071a*** RFU: relatif floresan ünite, RA: rosmarinik asit, Cis: cisplatin). 200 µM RA + 12,410 ± 2,590a*** 4,952 ± 1,224a*** 0,186 ± 0,065a***11 µM Cis 22 µM Cis 67,850 ± 3,937 54,183 ± 7,303 20,928 ± 3,937 Hem A549 hem de Beas-2B hücrelerinde Büyüme Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, 50 µM, 100 µM 50 µM RA+ 22 µM Cis 48,000 ± 7,517 b*** 37,103 ± 6,211b*** 12,663 ± 3,081b*** ve 200 µM’lık RA uygulamalarının hücre içi ROS miktarını istatiksel olarak anlamlı bir şekilde değiştir- 100 µM RA + 22 µM Cis 32,730 ± 2,382 b*** 21,680 ± 3,501b*** 4,483 ± 0,759b*** mediği belirlenmiştir (p>0,05). 11 µM ve 22 µM’lık Cisplatin dozlarının büyüme kontrol grubu ile karşı- 200 µM RA + 22 µM Cis 16,930 ± 1,492 b*** 6,387 ± 1,224b*** 0,337 ± 0,097b*** laştırıldığında her iki hücre hattında da hücre içi ROS miktarını anlamlı bir şekilde arttırdığı belirlenmiştir SS; Standart Sapma, OTM; “Olive Tail Moment”, BK; (p<0,001 her biri için). Bununla birlikte yine her iki Büyüme Kontrol, RA; Rosmarinik Asit, Cis; Cisplatin. (a; hücre hattında iki farklı Cisplatin uygulaması tarafın- aynı parametrenin 11 µM Cis grubu ile karşılaştırılmıştır, b; dan arttırılmış olan hücre içi ROS miktarının RA’nın aynı parametrenin 22 µM Cis grubu ile karşılaştırılmıştır, üç konsantrasyonu tarafından da anlamlı bir şekilde ***; p < 0,001) düşürüldüğü belirlenmiştir (p<0,001). DCFH-DA Bulguları A549 hücrelerindeki ROS miktarı RFU (Relatif Flore- Tartışma ve Sonuç san Unit) cinsinden grafik olarak Şekil 5’te Beas-2B Hücrelerindeki ise yine RFU cinsinden grafik olarak Eukaryotik hücrelerde, kusursuz çalışan mitokondrial Şekil 6’da gösterilmiştir. solunum zinciri ve düzenli mitokondrial membran bütünlüğü hücre canlılığı için temel oluşturmaktadır. Mosmann gerçekleştirdiği çalışmalar ile hücre canlılı- ğı ve hücre proliferasyonunu belirlemede mitokondrial solunum zinciri ve düzenli mitokondrial membran bütünlüğüne dayanan kantitatif kolorimetrik MTT yöntemini geliştirmiştir23. Yöntem mitokondrial de- hidrogenez enzimlerinin bir tetrazolium tuzu olan MTT (3-(4,5-dimetiltazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromit)nin canlı hücre mitokondrial dehidrogenazları tarafından mavi renkli formazan ürünlerine dönüştür- mesi esasına dayanmaktadır. Oluşan formazan miktarı kolorimetrik olarak ölçülebilmektedir ve mitokondrial faaliyetlerini yerine getirebilen, yani kültürdeki canlı Şekil 5. hücre sayısı ile orantılıdır 23,24. Bu çalışmada kullanılan A549 hücrelerinde hücre içi ROS miktarı. (ROS: XTT yöntemi benzer temele dayanan, yine bir tetrazo- “reactive oxygen species” reaktif oksijen türleri, lium tuzu olan XTT ((2,3-bis[2-metoksi-4-nitro-5- RFU: relatif floresan ünite, RA: rosmarinik asit, sulfofenil]-2H-tetrazolium-5-carboksianilit iç tu- Cis: cisplatin). zu)’nin kullanıldığı yöntemdir. XTT’nin canlı hücreler tarafından dönüştürüldüğü formazan ürünlerinin çözü- nürlüğü MTT den daha iyi olduğu için uygulamada canlı hücreleri belirlemek daha hızlı şekilde gerçekle- 267 Ö. Vatan şebilmektedir19,25. Bu nedenle çalışmada, sitotoksik - tin’in sitotoksik etkisine karşın bir antisitotoksik etkin- antisitotoksik etkinin belirlenmesinde sıklıkla kullanı- liğe sahip olduğunu göstermektedir. lan bir yöntem olan XTT yöntemi tercih edilmiştir. Cisplatin akciğer kanserlerini de içermekte olan pek Çalışmada kullanılan kemoterapötik ilaç olan Cispla- çok kanser türüne karşın kullanılan bir kemoterapötik tin akciğer kanserinin de aralarında bulunduğu pek ilaçtır. Hücre içerisine girince aktive olan Cisplatin’in çok kanser türünün tedavisinde kullanılan bir ilaçtır26. sahip olduğu klor atomları sitoplazmada hidroliz edilir. Manojkumar ve ark gerçekleştirdikleri çalışmada Oluşan bu hidrolize ürün, kazandığı elektrofil özelliği A549 hücrelerinde, 24 saatlik uygulama sonrasında ile hücresel proteinlerin sülfidril gruplarına ve Cisplatin’in IC50 (“Half maximal inhibitory concentra- DNA’daki azot atomlarına saldırarak hücre bölünme- tion”) değerini 61±1,5 µM olarak belirlemişlerdir27. sini durdurarak apoptotik hücre ölümünü tetikler. Bu Liu ve ark ise gerçekleştirdikleri çalışmada aynı para- nedenle Cisplatin, temelde DNA hasarına yol açarak metreyi 13,56±0,88 olarak belirlemiştir28. Beas-2B sitotoksik etkinliğini göstermektedir26. Çalışmada hücrelerinde Cisplatin’in IC50 değerini Zi ve ark A549 ve Beas 2B hücrelerinde Cisplatin’in neden (2018) 12,86±0,25 µM olarak belirlerken29, Apohan olduğu DNA hasarı komet yöntemi ile değerlendiril- ve ark. tarafından ise 10,56 µM olarak belirlemiştir30. miştir. Elde edilen komet parametreleri değerlendiril- Escola ve ark. ise 72 saatlik Cisplatin uygulaması diğinde Cisplatin’in her iki dozu ile de DNA hasarını sonrasında Beas-2B hücrelerindeki IC50 değerini anlamlı düzeyde arttırdığı belirlenmiştir. RA’nın Cisp- 11.7±0,5 olarak belirlemiştir31. Çeşitli çalışmalarda latin ile birlikte uygulandığı gruplarda uygulama kon- A549 ve Beas-2B hücrelerinde Cisplatin’in belirlenen santrasyonlarının her üçü de (50 µM, 100 µM, 200 IC50 değerleri arasındaki farklılıklar göze çarpmakta- µM) Cisplatin tarafından arttırılmış olan DNA hasarını dır. Aynı hücre hatları kullanılsa da farklı laboratuvar- anlamlı düzeyde azaltmıştır. Dolayısıyla RA Cispla- larda gerçekleştirilen çalışmalarda elde edilen IC50 tin’in genotoksik etkinliğine karşın antigenotoksik değerleri arasında deneysel koşullar nedeniyle farklı- aktivite sergilemiştir. lıklar görülmektedir. Bu çalışmada kullanılan Cispla- Oksidatif stres, Cisplatin toksisitesinin temel meka- tin konsantrasyonları olan 11 µM ve 22 µM’lık dozlar nizmasını oluşturmaktadır. Mitokondriler Cisplatin önceki çalışmalarımızdan elde ettiğimiz IC50 değerle- kaynaklı oksidatif stresin önemli hedeflerindendir ve rini yansıtan konsantrasyonlar olduğu için tercih edil- 18 Mitokondrial proteinlerin sülfidril grubu kaybı, kalsi-miştir . Bunun sonucunda da XTT testi sonrasında yum alımının inhibisyonu ve midokondrial memran beklenildiği üzere Cisplatin’in iki dozu da her iki potansiyelinin azalmasına neden olarak hücreleri ölü- hücre hattında da anlamlı düzeyde sitotoksik etki me sürüklemektedir35. Cisplatin maruziyeti ile hücre göstermiştir. %100 olan hücre canlılığı Cisplatin’in 11 içerisinde oluşan oksidatif stres ile artan Reaktif Oksi- µM ve 22 µM’lık dozları tarafından A549 hücrelerin- jen Türleri de DNA’ya saldırarak DNA hasarına yol de sırasıyla; %67,5 ve %48,25 değerlerine indirilirken açmakta ve hücreleri ölüme sürüklemektedir35-38. aynı değerler Beas-2B hücrelerinde %65,75 ve %46,25 olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada Cisplatin’in neden olduğu oksidatif stres her iki hücre hattında da DCFH-DA yöntemi kullanı- RA’nın çalışmada kullanılan konsantrasyonları (12,5 – larak değerlendirilmiştir. Cisplatin uygulamasının her 400 µM) her iki hücre hattında da sitotoksik etki gös- iki dozu da hücre içi ROS miktarını anlamlı düzeyde termemiştir. Bahri ve ark.. farklı hücre hatlarında RA arttırmış buna karşın Cisplatin ile birlikte uygulanan ve karnosik asit’in apoptotik etkilerini araştırdıkları RA konsantrasyonlarının üçü de (50 µM, 100 µM, 200 çalışmalarında A549 hücrelerinde WST-1 [2- (4- µM) Cisplatin tarafından indüklenmiş olan ROS mik- iodofenil)- 3- (4-nitrofenil)- 5 -(2, 4-disülfofenil)- 2H- tarını anlamlı düzeyde azaltmıştır. De Oliveira ve ark. tterazolyum] yöntemi ile RA sitotoksitesini değerlen- Gerçekleştirdikleri çalışmada etanolün neden olduğu dirmişler ancak kullandıkları en yüksek konsantrasyon ROS artışı üzerine RA’nın etkilerini fare periferal kan olan 100 µM’lık konsantrasyonda dahi her hangi bir hücrelerinde DCFH-DA yöntemini kullanarak araş- sitotoksik etki gözlemlememişlerdir32. Fialova ve ark. tırmışlar ancak RA’nın etanolün neden olduğu ROS gerçekleştirdikleri çalışmada A549 hücrelerinde artışını anlamlı bir şekilde düşürmediğini belirtmişler- RA’nın IC50 değerini >300 µM olarak belirlemişler- dir39. Söz konusu çalışmanın aksine, bu çalışmada dir33. Benzer şekilde Junming ve ark. Beas-2B hücre- RA’nın, Cisplatin’in neden olduğu ROS artışını an- lerinde RA’nın sitotoksik etki göstermeye başladığı lamlı düzeyde azalttığı belirlenmiştir. Bu indirgemeye değerin 330 µM’ın üzerinde olduğunu belirtmişlerdir34. RA’nın sahip olduğu güçlü antioksidan etkinin neden Bu çalışmada da hem A549 hem de Beas-2B hücrele- olduğu düşünülmektedir. Kim ve Lee., gerçekleştir- rinde 24 saatlik RA uygulaması 400 µM’lık konsant- dikleri çalışmalarında Perilla frutescens bitkisinden rasyonda dahi sitotoksik etki göstermemiştir. Yine bu izole ettikleri RA’nın sahip olduğu güçlü antioksidan çalışmada RA’nın 100 ve 200 µM’lık konsantrasyon- etkiyi DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidazil) ve ABTS ları, her iki hücre hattında da Cisplatin’in her iki dozu (2,2′-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfonik asit) tarafından arttırılmış olan sitotoksik etkiyi anlamlı radikal süpürücü aktiviteleri üzerinden göstermişler- düzeyde indirgemiştir. Bu indirgeme; RA’nın, Cispla- dir40. Benzer yöntemleri kullanarak Vergine ve ark. 268 Cisplatin’e Karşı Rosmarinik Asit Salvia türlerinden izole ettikleri RA’nın güçlü antiok- 4. Hiller K. Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe einiger Saniculoidae. 1. sidan etkinliğini göstermeşlerdir41. Erkan ve ark. ger- Mitteilung: Sanicula europaea L.—Isolierung und quantitative Erfassung von Chlorogen-und Rosmarinsaure. Pharmazie çekleştirdikleri çalışma ile RA’nın antioksidan özelli- 1965;20, 574–579. ğini ortaya koymuşlardır42. Bunların dışında pek çok 5. Trute A, Nahrstedt A. Separation of rosmarinic acid enantio- çalışmada da RA’nın güçlü bir antioksidan olduğu mers by three different chromatographic methods (HPLC, CE, vurgulanmaktadır1,15. GC) and the determination of rosmarinic acid in Hedera helix L. RA sahip olduğu güçlü antioksidan etki ile Cisplatin Phytochem. Anal. 1986; 7, 204–208. toksisitesinin temel mekanizmasını oluşturan oksidatif 6. De Tommasi N, De Simone, F, De Feo V, Pizza C. Phenylpro-panoid Glycosides and Rosmarinic Acid from Momordica bal- stres sonucu hücre içerisinde oluşan aşırı ROS biriki- samina. Planta Med. 1991; 57, 201. mini engellemiştir. Çalışmada elde edilen DCFH-DA 7. Lasure A, Van Poel B, Pieters L, Claeys M, Gupta M, Vanden bulguları bu engellemeyi açıkça ortaya koymaktadır. Berghe D, Vlietinck, AJ. Complement-inhibiting properties of Bu engelleme sonucunda RA yine Cisplatin’in neden Apeiba tibourbou. Planta Med. 1994; 60, 276–277. olduğu DNA hasarlarını ve dolaysıyla da hücre ölüm- 8. Aquino R, Ciavatta ML, De Simone F, Pizza C. A flavanone lerini azaltarak antigenotoksik ve antisitotoksik özellik glycoside from Hamelia patens. Phytochemistry 1990; 29, 2358–2360. göstermiştir. Bu özellikleri ile RA Kimyasal engelle- me43 stratejisi çerçevesinde genotoksik ajanların etki- 9. Satake T, Kamiya K., Saiki Y, Hama T, Fujimoto Y, Kitanaka S, Kimura Y, Uzawa J, Endang H, Umar M. Studies on the lerini indirgemede kullanılabilecek önemli bir antige- constituents of fruits of Helicteres isora L. Chem. Pharm. Bull. notoksik ajan olarak görülmektedir. Bu bağlamda 1999; 47, 1444–1447. Venkatachalam ve ark. gerçekleştirdikleri çalışmada 10. Ravn H, Pedersen MF, Andary J, Borum C, Anthoni U, Chris- sıçanlarda 1,2-dimetilhidrazin ile indüklenen kolon tophersen C, Nielsen PH. Seasonal variation and distribution of karsinogenezine karşın RA’nın iyi bir kimyasal engel- two phenolic compounds, rosmarinic acid and caffeic acid, in 44 leaves and roots-rhizomes of eelgrass (Zostera marina L.). Op-leme ajanı olduğunu ortaya koymuşlardır . Bu özel- helia 1994; 40, 51–61. likleri ile Ülkemizde de çeşitli medya organlarında RA 11. Hausler E, Petersen M, Alfermann AW. Rosmarinsaure in veya RA içeren bitkisel ürünlerle ilgili kansere iyi Blechnum-Spezies. In: Haschke, H.P., Schnarrenberger, C. geldiği yönünde haberler zaman zaman yer almakta- (Eds.), Botanikertagung. Berlin. Akademie Verlag, Berlin, p. dır45. Bu gibi haberler, çeşitli bitkisel ürünlerin halk 507. 1992. arasında bilinçsizce tüketilmesine neden olmaktadır. 12. Takeda R, Hasegawa J, Sinozaki M. The first isolation of lignans, megacerotonic acid and anthocerotonic acid, from Pek çok çalışma RA ve veya RA içeren; Rosmarinus nonvascular plants, Anthocerotae (hornworts). Tetrahedron Lett. officinalis (Biberiye), Calendula officinalis (Sarıpat) 1990; 31, 4159–4162. Salvia officinalis (Adaçayı), Melissa officinalis (Oğu- 13. Chu X, Ci X, He J, Jiang L, Wei M, Cao Q, et al. Effects of a lotu)39 gibi bitkilerden elde edilen çeşitli ürünler kim- natural prolyl oligopeptidase inhibitor, rosmarinic acid, on li- yasal engelleme stratejisi çerçevesinde genotoksik popolysaccharide-induced acute lung injury in mice. Molecules. ajanların etkilerinden korunmak amaçlı kullanılabile- 2012;17:3586-98. ceğine yönelik bulgular sunmaktadır. Bu çalışma da 14. Sánchez-Campillo M, Gabaldon JA, Castillo J, Benavente- García O, Del Baño MJ, Alcaraz M, et al. Rosmarinic acid, a RA’nın sahip olduğu antigenotoksik aktivite nedeniyle photo-protective agent against UV and other ionizing radiations. kimyasal engelleme stratejisi çerçevesinde özellikle Food Chem Toxicol. 2009; 47:386-92. DNA hasarlarına karşı korunmak amacı ile kullanıla- 15. Al-Dhabi N A, Arasu M V, Park CH, Park SU. Recent studies bileceğini göstermektedir. Ancak bu çalışmamız özel- on rosmarinic acid and its biological and pharmacological acti- likle Cisplatin kemoterapisi sırasında RA’nın bilinç- vities.Excli Journal 2014;13:1192-1195. sizce tüketiminin Cisplatin’in etkinliğinde indirgen- 16. Moreno S, Scheyer T, Romano CS, Vojnov AA. Antioxidant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their meye neden olabileceğini göstermiştir. Bu nedenle polyphenol composition. Free Radical Research 2006. 40(2): özellikle kemoterapi uygulamalarında hastaların bu 223-231. konularda bilinçlendirilmesine yönelik yaklaşımların 17. Saltan FZ, Canbay HS. Eskişehir’de Halk Arasında Kullanılan arttırılması gerektiğini düşünmekteyiz. Bazı Bitkilerdeki Ağır Metal ve Besin Elementlerinin Belir- lenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitü- sü Dergisi. 2015. 19(1); 83-90 18. İnci ve ark. New water-soluble copper (II) complexes including Kaynaklar 4,7-dimethyl-1,10-phenanthroline and L-tyrosine: Synthesis, characterization, DNA interactions and cytotoxicities. Spectro- 1. Petersen M, Simmonds MSJ. Rosmarinic acid. Phytochemistry chimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectrosco- 2003; 62: 121–125. py 2015; 136 ; 761–770. 2. Scarpati ML, Oriente G. Isolamento e costituzione dell’acido 19. Roehm NW, Rodgers GH, Hatfield SM, Glasebrook AL. An rosmarinico (dal rosmarinus off.). La Ricerca Scientifica 1958; improved colorimetric assay for cell proliferation and viability 28, 2329–2333. utilizing the tetrazolium salt XTT. J Immunol Methods 3. Rosmarinic acid, 1991;13:142(2):257-65. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich /53 20. Piperakis SM. Comet assay: A brief history. Cell Biol. Toxicol. 6954?lan 2009; 25:1–3. g=en®ion=TR&gclid=EAIaIQobChMIzNGusaXF3wIVz5I 21. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple YCh3OWgwFEAAYASAAEgLBD_D_BwE (Erişim Tarihi technique for quantitation of low levels of DNA damage in in- 29.12.2018) dividual cells. Exp Cell Res. 1988; 175(1):184-91. 269 Ö. Vatan 22. Bass DA, Parce JW, Dechatelet LR, Szejda P, Seeds MC, 34. Juming L, Li Z, Xinyi Z, Yingying L, Fang Z, Chunsong Y, Thomas M. Flow cytometric studies of oxidative product for- Wei Z. Protective effects and active ingredients of Salvia milti- mation by neutrophils: A graded response to membrane stimu- orrhiza Bunge extractson airway responsiveness, inflammation lation. J Immunol. 1983; 130:1910-1917. and remodeling in mice withovalbumin-induced allergic asthma. 23. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and Phytomedicine. 2019. 52; 168-177. survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. 35. Saad SY, Najjar TA, Alashari M. Role of non-selective adeno- Immunol. Methods 1983; 65: 55-63. sine receptor blockade and phosphodiesterase inhibition in cisp- 24. Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Re-examination and further latin-induced nephrogonadal toxicity in rats.Clin. Exp. Pharma- development of a precise and rapid dye method for measuring col.Physiol. 2004; 31, 862-867. cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 1989; 12;119(2): 36. Dehne N, Lautermann J, Petrat F, Rauen U, de Groot H. Cispla- 203-210. tin Ototoxicity: Involvement of Iron and Enhanced Formation 25. Jost LM, Kirkwood JM, Whiteside TL. Improved short- and of Superoxide Anion Radicals. Toxicol Appl Pharmacol. 2001; long-term XTT-based colorimetric cellular cytotoxicity assay 174, 27-34. for melanoma and other tumor cells. J Immunol Methods. 1992; 37. Santos NA, Catão CS, Martins NM, Curti C, Bianchi ML, 4;147(2):153-65. Santos AC. Cisplatin-induced nephrotoxicity is associated with 26. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatin in cancer therapy: molecu- oxidative stress, redox state unbalance, impairment of energetic lar mechanisms of action. Eur J Pharmacol. 2014; 5, 0: 364– metabolism and apoptosis in rat kidney mitochondria. Arch 378. Toxicol. 2007; 81, 495-504. 27. Manojkumar Y, Ambika S, Arulkumar R, Gowdhami B, Balaji 38. Jiang Y, Guo C, Vasko MR, Kelley MR. Implications of Apu- P, Vignesh G, Arunachalam S, Marullo R, Werner E, Degtya- rinic/ Apyrimidinic Endonuclease in Reactive Oxygen Signa- reva N, Moore B, Altavilla G, Ramalingam SS, Doetsch PW. ling Response after Cisplatin Treatment of Dorsal Root Gang- Cisplatin Induces a Mitochondrial-ROS Response That Contri- lion Neurons. Cancer Res 2008; 68, 6425-6434. butes to Cytotoxicity Depending on Mitochondrial Redox Sta- 39. De Oliveira NCD, Sarmento MS, Nunes EA, Porto CM, Rosa tus and Bioenergetic Functions. Plos One 2013; 8(11), e81162. DP, Bona SR, Rodrigues G, Marroni NP, Pereira P, Picada JN, 28. Liu Y, Song XQ, Li X, Liu X, Tian JL, Xu JY, Yan SP. Three Ferraz ABF, Thiesen FV, Da Silva J. Rosmarinic acit as a pro- pairs of enantiomers bearing mitochondria‐targetedTPP+groups tective agents against genotoxicity of ethanol in mice. Food and as potential anti‐cancer agents. Appl. Organometal Chem. Chemical Toxicology 2012; 50, 1208-1214. 2019; 33;e4920 40. Kim DH, Lee JH. Comparative evaluation of phenolic phytoc- 29. Zi CT, Yang L, Xu FQ, Dong FW, Yang D, Li Y, Ding ZT, hemicals from perilla seedsof diverse species and screening for Zhou J, Jiang ZH, Hu JM. Synthesis and anticancer activity of their tyrosinase inhibitory andantioxidant properties. South Af- dimeric podophyllotoxin derivatives.Drug Desig, Development rican Journal of Botany 2019; 123, 341-350. and Therapy. 2018; 12, 3393-3406. 41. Vergine M, Nicoli F, Negro C, Luvisi A, Nutricati E, Accogli 30. Apohan E, Yilmaz U, Yilmaz, Serindag A, Küçükbay H, Yesi- RA, Sabena E, Miceli A. Phytochemical Profiles and Antioxi- lada O, Baran Y. Synthesis, cytotoxic and antimicrobial activi- dant Activity of Salvia species from Southern Italy. Records of ties of novel cobalt and zinc complexes of benzimidazole deri- Natural Products 2019; 13(3), 205-215. vatives. Journal of Organometalic Chemistry.2017; 828, 52-58. 42. Erkan N, Ayranci G, Ayranc, E. Antioxidant activities of 31. Escola A, Crespo M, Lopez C, Quirante J, Jayaraman A, Polat rosemary (Rosmarinus Officinalis L.) extract, blackseed (Nigel- IH, Badia J, Baldoma L, Cascante M. On teh stability and bio- la sativa L.) essential oil, carnosic acid, rosmarinic acid and se- logical behavior of cyclometallated Pt(IV) complexes with hli- samol. Food Chemistry 2008; 110, 76-82. do and aryl ligands in the axial positions. Bioorganic & Medi- 43. Ferguson LR, bronzetti G, De Flora S. Mechanistic approaches cinal Chemistry. 2016; 24, 5804-5815. to chemoprevention of mutation and cancer. Mutat. Res. 2005; 32. Bahri S, Miles F, Ali BR, Mlika M, Jameleddine S, Mc Entee K, 591, 3-7. Shlyonsky V. Rosmarinic acid potentiates carnosic acid indu- 44. Venkatachalam K, Gunasekaran S, Jesudoss VAS, Namasiva- ced apoptosis in lung fibroblasts. Plos ONE. 2017; 12(9); yam N. The Effect of rosmarinic acid on 1,2- dimethylhydrazi- e0184368. ne induced colon carcinogenesis. Experimental and Toxicologic 33. Fialova SB, kello M, Coma M, Slobodnikova L, Drobna E, Pathology 2013; 65, 409-418. Holkova I, Garajova M, Mrva M, Zachar V, Lukac M. Deriva- 45. https://www.sabah.com.tr/webtv/sifali-bitkiler/biberiye- tization of Rosmarinic Acid Enhances its in vitro Antitumor, rosmarinus-officinalis-nelere iyi-gelir-biberiyenin-rosmarinus- Antimicrobial and Antiprotozoal Properties. Molecules 2019; officinalis-faydalari-nelerdir (Erişim Tarihi; 05.05.2018) 24(6), 1078. 270