T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ KADIN HASTALIKLARI VE DOĞUM ANABİLİM DALI TAMOKSİFENİN FARE OVERİNDEKİ FOLİKÜL SAYISI VE SERUM ANTİ- MÜLLERİAN HORMON DÜZEYİNE OLAN ETKİSİ Dr. Ayşe TOPCU AKDUMAN UZMANLIK TEZİ Bursa-2013 T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ KADIN HASTALIKLARI VE DOĞUM ANABİLİM DALI TAMOKSİFENİN FARE OVERİNDEKİ FOLİKÜL SAYISI VE SERUM ANTİ- MÜLLERİAN HORMON DÜZEYİNE OLAN ETKİSİ Dr. Ayşe TOPCU AKDUMAN UZMANLIK TEZİ Danışman: Doç. Dr. Kemal ÖZERKAN Bursa-2013 İÇİNDEKİLER Sayfa İçindekiler ………………………………………………………….………….. i Türkçe Özet …………………………………………………………...………. iii İngilizce özet ………………………………………………………….……….. iv Giriş …………………………………………………………………………..... 1 Over Gelişimi ……………………………………………………………..… 2 Germ Hücre Gelişimi ………………………………………………...…… 2 Overde Foliküler Gelişim ……………………………………….…….. 3 Folikülogenez …………………………………………………….…...… 5 Primordial Folikül Oluşumu ……………………………….…..…. 5 Folikül Gelişiminin Başlaması ……………………………….…… 5 Folikül Gelişiminde Preantral ve Antral Aşamalar ………..…… 7 Antral Aşamadan Sonra Folikül Gelişimi …………….………… 8 Ovulasyon Oluşumu ……………………………………………..……….. 10 Korpus Luteum ………..…………………………………………………... 12 Over Rezerv Testleri ……………..……………………………………….. 12 Folikül Stimülan Hormon (FSH) ………..………………………………. 12 Serum Östrodiol Seviyesi (E2) …………...…………………………….. 13 Antral Folikül Sayımı ……………..………………………………............ 13 Anti Müllerian Hormon (AMH) …………...…………………………..… 14 Selektif Estrojen Reseptör Modülatörleri (SERM’ler) ………………….. 15 Tamoksifen ………………………………………..……………………….. 15 Etki Mekanizması ………………………………………………………. 16 Yan Etkileri ………………………………………………………………. 17 Gereç ve Yöntem ………………………………………………..................... 19 ELİSA ile AMH Ölçümü ……………………………………..……………. 20 i Over Dokusunun Histolojik İncelenmesi ………………….................. 20 Folliküllerin Morfolojik Sınıflandırması …………………………….. 21 İstatistiksel Yöntem ………………………………………………........... 22 Bulgular ……………………………………………………………………….. 23 Tamoksifen ve Kontrol Grubu AMH Değerleri Karşılaştırılması …. 23 Tamoksifen ve Kontrol Grubu Folikül Sayıları Karşılaştırılması …. 25 Tartışma …...………………………………………………………………….. 30 Kaynaklar …….……………………………………………………………….. 36 Ekler ……………………………………………………………………………. 45 EK-1: Kısaltmalar …………………………………………………………. 45 Teşekkür ………..…………………………………………………….………. 46 Özgeçmiş .………………………………..…………………………………… 47 ii ÖZET Bir antikanser ilacı olan tamoksifenin, over rezervi üzerine olan etkisini araştırmayı amaçladık. Bu çalışmada 30 adet, 25-30 gr ağırlığında, 8-12 haftalık BALB/c dişi fare üzerinde çalışıldı. Fareler iki gruba ayrıldı: kontrol ve deney. Vajinal smear ile östrus siklusları takip edildi. Deney grubuna 100 l i.p. tamoksifen enjekte edildi. Kontrol grubuna tamoksifenin eritildiği taşıyıcı solüsyon enjekte edildi. İki östrus siklusu sonunda, fareler öldürüldü, overleri çıkarıldı ve ışık mikroskobunda folikül sayımı yapıldı. Aynı zamanda ~2cc kan alındı ve serum AMH düzeyine bakıldı. Grup-1: Tamoksifenin enjekte edildiği grup. (toplam 15 fare). Her bir fareye intraperitoneal tek doz 100 l tamoksifen etanol:mısır yağında eritilerek enjekte edildi. Grup-2: Kontrol grubu. (toplam 11 fare). Her bir fareye intraperitoneal etanol:mısır yağı enjekte edildi. Tamoksifen grubu ve kontrol grubu karşılaştırıldığında, gruplar arasında AMH değerleri bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık saptanmadı (p>0.05). Histolojik değerlendirmede iki grup arasında primordiyal, primer, antral ve sınıflandırılmayan foliküllerin sayısı açısından anlamlı farklılık saptanmadı (p>0.05). Her iki grup arasında sekonder ve preantral foliküller açısından anlamlı fark saptandı (p<0.05). Çalışmamızda, tamoksifenin geç safhadaki folikülleri baskıladığı, ancak over rezervinin göstergesi olan primordial folikülleri etkilemediği sonucuna ulaşılmıştır. Anahtar kelimeler: Tamoksifen, anti mülleryan hormon, over rezervi, folikülogenezis, fare. iii SUMMARY Investigating the Effects of Tamoxifen, Anticancer Drug on Ovarian, Experimental Study In our study we aimed to investigate the effects of tamoxifen, an anticancer drug, on ovarian reserve. Thirty adult BALB/c female mice were used in the present study. The female mice were divided into two groups: control and experimental. The observation of a vaginal plug was estrus cycle, the mice received 100 l tamoxifen by i.p. injection. At the end of two estrus cycle mice were killed and their ovaries were fixed and prepared for light microscopic studies. Follicles were counted and classified. Also, a blood sample of ~2cc was obtained from heart of mice for evaluating the level of Anti Müllerian Hormone. Grup-1: Tamoxifen injected group (15 mice) A single dose of 100 l tamoxifen, resolved in 1cc corn oil, was injected intraperitoneally to each mouse. Grup-2: 1cc ethanol:corn oil injected intraperitoneally to each mouse (11 mice) When two the groups were compared, AMH levels did not show any significant difference (p=0,097). Microscopic studies revealed that the number of secondary and pre-antral follicles were significantly (p<0.05) reduced in the experimental group compared to the control group. However, the numbers of primordial and primary, antral, unknown follicles in experimental and controls groups were not significantly different (p>0.05). The result of our study indicate that tamoxifen suppresses follicular differentiation at late stages but does not affect the development of already differentiated follicles. Key words: Tamoxifen, anti müllerian hormon, ovarian reserve, folliculogenesis, mouse. iv GİRİŞ Over, kadın hayatı boyunca, yapısında ve fonksiyonunda değişikliklerin olduğu dinamik bir ogandır. Folikül ise, overin en önemli reprodüktif ve endokrin kompartımanıdır. Foliküllerin kalitesi ve sayısı, kadının üreme potansiyelini ve üreme ömrünü belirler ve yenilenemez (1, 2). Kanser tedavisinde kullanılan bazı ilaçlar, gonadal tahribata neden olmaktadır. Bu negatif etkinin boyutu tedavinin sitotoksik potansiyeli, dozu, süresi ve hastanın yaşına bağlı olarak değişebilmektedir. Primordial foliküller, foliküllerin en erken ovaryan formunu temsil ederler ve dormant fazda oldukları düşünülür. Over rezervi, primordial foliküllerin sayısı tarafından belirlenir. Özellikle primordial foliküller üzerine olan toksik bir etki, reprodüktif yaşam aralığını kısaltabilir ve prematür over yetmezliğine neden olabilir. Oosit doğrudan ya da dolaylı olarak etkilenebilir. Oositi çevreleyen steroid üreten somatik hücre katmanlarına (granüloza ve teka hücreleri) toksik etki de bunlara neden olabilir (3). Tamoksifen, meme kanserinde yaygın olarak kullanılan selektif östrojen modülatörü (SERM) olan bir kemoterapötiktir (4). Kemirgenler de dahil olmak üzere yapılan hayvan çalışmaları, insan ve hayvan overleri arasında farklılıklar olmasına rağmen, çeşitli kanser tedavilerinin gonadotoksisitesini göstermekte bize önemli bilgiler sağlamaktadır. 1. Over Gelişimi 1.1. Germ Hücre Gelişimi Fetal dönemde, insan overinin gelişim süreci dört evrede incelenebilir(2). 1. Farklılaşmamış gonad evresi 2. Farklılaşma evresi 3. Oogonal çoğalma ve oosit formasyonu dönemi 1 4. Folikül oluşma evresi Fetal gelişimin yaklaşık 5. haftasında, gonad çifti yapısal olarak gonadal çıkıntıları oluşturmak üzere, mezonefroz üzerinde çölomik çıkıntı şeklinde yoğunlaşır. Bu noktada, gonadın morfolojik olarak over ya da testis olduğu ayırt edilememektedir. Gonad, dışta çölomik yüzey epitel hücreleri ile iç içe olan ilkel germ hücreleri ve içte merkezde bulunan medüller mezenşimal dokudan oluşmaktadır. Bu farklılaşmamış dönem yaklaşık 7-10 gün sürmektedir (1). Primordiyal germ hücreleri (PGH), ilkel ektodermden gelişmektedir. Germ hücreleri ilk olarak, fertilizasyondan sonraki üçüncü haftanın sonunda kaudal uçtaki ilkel endodermde ve yolk kesesine komşu olan bölgede tespit edilir ve ayrıca arka barsaktaki (hindgut) splanknik mezodermde de kısa bir süre sonra belirir (5, 6). Gonadal çıkıntı, germ hücrelerinin hayatta kalabileceği tek yerdir. Germ hücreleri gebeliğin 4. ve 6. haftaları arasında gonadal bölgeye ameboid haraketlerle göç ederler. Gebeliğin 7. haftasında, gonadal dokunun germ hücreleriyle kolonizasyonu tamamlanır (3). PGH gonada ulaşır ulaşmaz, büyük bir hızla çoğalırlar. Gebeliğin 6. haftasında 10 bin, 8. haftasında 600 bin sayısına ulaşırlar. Bu hızdaki mitozla, gebeliğin yirminci haftasında sayıları 6 milyona ulaşır (5, 7, 8). Bu gonadın ulaşabileceği maksimum kapasitedir. Bu dönemden sonra, atrezi başlar, germ hücre sayısı giderek azalır ve doğumda 1 milyon, pubertede sadece 300-400 bin kalır. Germ hücrelerinin büyük çoğunluğu atrezi geçirerek, yaklaşık 300 tanesi, menopozdan önce ovulasyona girebilir ve menopozda overde sadece 1000 folikül kalır (3, 9). PGH, gonadlara ulaştığında oogonyum olarak adlandırılır. Oogonyumların PGH’den daha fazla mitotik aktiviteleri vardır. Mayoza girmeden önce birkaç defa mitoz geçirirler. Oogonyumun mitotik aktivitesi, oosit havuzunun önemli belirleyicisidir. Oogonyumlarda mitoz, atrezinin arttığı gebeliğin 28. haftasında sona erer. Bu nedenle over rezervinin oluşmasında sadece mitoz değil, aynı zamanda atrezide önemlidir (3). Oogonyumlar ilk mayoz bölünmeye girip profaz evresinde durdukları dönemde oositlere dönüşürler. Bu süreç 11-12. haftalarda başlar (10). 2 Mayozun diploten evresine ilerlemesi ancak gebeliğin geri kalanında olmakta ve doğumda tamamlanmaktadır. Mayozun durdurulması, büyük bir olasılıkla granüloza hücreleri tarafından üretilen engelleyici maddeler ile sağlanır. Bir ovum, oositin iki kez mayotik bölünmesinden oluşur; bu bölünmelerin birincisi tam ovulasyon öncesinde, ikincisi (haploid ovumun oluşması) ise sperm girişi zamanındadır. Fazla genetik materyal ise, her mayotik bölünmede oluşan kutup cisimciği (polar body) ile atılmaktadır (5). 1.2. Overde Foliküler Gelişim Gestasyonun 18-20. haftalarında, hücreden oldukça zengin olan korteks daha derindeki medullar bölgeden kaynaklanan vasküler kanallar tarafından yavaş yavaş delinir ve bu folikül oluşmasının başlangıcını belirtir (11). Parmak şeklindeki vasküler çıkıntıların kortekse girmesiyle korteks sekonder seks kordlarının görüntüsünü alır. Kan damarları invaze oldukça, yoğun kortikal hücre kütlelerini gittikçe daha küçük kısımlara ayırır. Mezenşimal ya da epitelyal kaynaklı perivasküler hücreler de damar ile birlikte sürüklenir ve bu hücreler mayozun birinci evresinde olan oositleri çevreler. Sonuç olarak oluşan birim, primordial folikül olarak adlandırılır. Primordial folikül; mayozun profaz evresinde duraklamış olan bir oosit (30–60 µm) ve onun etrafında bazal membran tarafından çevrelenen tek katlı ağ şeklinde öncül granüloza hücreleridir. Sonunda bütün oositler bu şekilde kaplanır. Primordial folikül oluşumunda kullanılmayan mezenşim kalıntıları folikül aralarındaki ilkel ovaryum stromasını oluşturmakta kullanılır. Henüz netlik kazanmasa da, granüloza hücreleri çölemik epitelyum veya mezenşim öncülerinin farklılaşmasından oluşur. Primordial foliküler gelişim süreci, diploten evresindeki bütün oositlerin foliküllerin içine alınmasına kadar sürer, bu süreç gebeliğin 15. haftasında başlar ve doğumdan altı ay sonrasına kadar uzayabilir (5). İnsan ve hayvanlarda yapılan transkriptomik çalışmalarda, primordial folikül gelişiminde rol alan birçok transkripsiyon faktörü (Fig I alpha), zona proteinleri, mayoz-spesifik enzimler ve sinir büyüme faktörleri tanımlanmıştır. 3 Ancak günümüzde, over rezervini belirlemede kullanılacak, primordial foliküllerin hormonal ya da başka bir belirteci tanımlanamamıştır (3). Oositin öncül granüloza hücreleri tarafından çevrelenmesinden hemen sonra, folikülün tamamı değişik derecelerde olgunlaşmaya başlar. Öncül granüloza hücrelerinden oluşan tabakanın kübik granüloza hücre tabakasına dönüşmesi ile primer folikülün oluşumu belirlenir. Daha ileri bir farklılaşma ile gebeliğin 6. ayında daha tamamlanmış bir granüloza hücre çoğalması ile preantral folikül belirir. Gebeliğin sonunda ise antral foliküller belirir. Teka hücrelerinin folikülleri çevrelemesi ancak son trimesterde olur (8) (Şekil-1). Şekil-1: Over folikülleri. A: primordial foliküller B: Sekonder foliküller C: Preantral foliküller D: Antral foliküller (40). 4 1.2.1. Folikülogenez Folikülogenez over korteksinde meydana gelmektedir. 1.2.1.1. Primordial Folikül Oluşumu Primordial foliküller, overin temel reprodüktif birimleridir. Çünkü tüm dominant foliküllerin, dolayısıyla da menstruel siklusun kaynağını oluştururlar. Histolojik olarak primordial folikül, mayozun profaz evresinde bekleyen, küçük bir primer oosit (~25 µm çaplı), tek katlı yassı veya kollumnar dizilim gösteren granüloza hücresi ve bazal lamina içermektedir. Bazal lamina sayesinde granüloza hücresi ve oosit, mikroçevrede bulunan diğer hücrelerle direkt temasta değildir. Primordial foliküllerin bağımsız bir kanlanması yoktur, dolayısıyla endokrin sistemden daha sınırlı olarak etkilenirler. Granüloza hücrelerinin mitotik potansiyel kazanması ve şekillerinde yassıdan kübik epitele dönüşüm, folikül seçiminin histolojik göstergeleri olarak değerlendirilmektedir (3). Bunu gen aktivasyonu ve oosit gelişimi takip eder. Hayvanlarda, granüloza–orijinli kit ligant (12), teka-orijinli kemik morfogenetik protein (BMP)-7 (13) ve yüksek hipofiz FSH düzeyi gibi aktivatörler ve müllerian inhibe edici madde (MIS) gibi inhibitörler, bu gelişimi (recruitment) pozitif veya negatif yönde kontrol eden faktörlerdir (14). Klinik önemine rağmen insanda, folikül seçiminin nasıl kontrol edildiği hakkında henüz yeterli bilgi yoktur (3). 1.2.1.2. Folikül Gelişiminin Başlaması (Primordial Folikülün Primer Foliküle Geçişi) Primer folikül; oosit etrafında tek kat olarak dizilen bir veya daha fazla kübik granüloza hücresinin görülmesi ile tanımlanır. Primer folikülde izlenen en önemli gelişmeler; FSH reseptörü ekspresyonu, oosit büyümesi ve oosit farklılaşmasıdır. Primordial foliküller, primer foliküle geçene kadar uyku fazında (dormant faz) bekler. Bekleyen primordial folikülden, büyüyen primer foliküle geçiş, recruitment olarak adlandırılmaktadır. Bu geçişin tek bir yol ile değilde, oositler ve somatik hücreler (granuloza hücreleri ve teka hücreleri), 5 ekstraselüler matriks komponentleri, büyüme faktörleri, otokrin ve parakrin faktörlerin olduğu multi-faktöriyel yolla olduğuna inanılır (15-18). Bununla birlikte son zamanlarda farelerde yapılan çalışmalar, primordial folikülleri uyku fazında tutan bazı inhibitörlerin olduğunu kanıtlamıştır. Bunlar tumor suppressor tuberous sclerosis complex 1 (Tsc-1), phosphatase ve tensin homolog deleted on chromosome 10 (PTEN), Foxo3a, p27 ve Foxl2 kapsamaktadır. Foliküler aktivasyon için, bu inhibitör moleküllerin fonksiyon kaybı, primordial folikül havuzunun erken aktivasyonuna yol açar (19-22). Primordial foliküllerin tamamının aktive olması, kaçınılmaz olarak folikül havuzunun erken tükenmesine ve prematür ovaryan yetmezliğe neden olur (POF). Ancak, insanlarda, incelenen genlerden sadece Foxl2 mutasyonunun, POF’la bağlantılı olduğu gösterilmiştir (23). Primordial folikülün yassı granüloza hücreleri, kübik hücrelere dönüşürken buna oositte meydana gelen dikkat çekici değişiklikler eşlik etmektedir. Preantral dönem boyunca oosit, ~25 µm’den ~120 µm’ye ulaşmaktadır. Bu devasa büyüme, oosit genomunun reaktivasyonu sonucu oluşmaktadır (24). Growth diferansiyasyon-faktörü-9 (GDF-9) ve transforming growth factor beta (TGF-B) ailesinin bazı üyeleri (BMP-4,BMP-7,BMP-6,BMP-15) büyüyen oositte eksprese olan diğer önemli proteinlerdir (25-28). Çalışmalardan ortaya çıkan genel konsept, oosit tarafından üretilen yeni bazı büyüme faktörlerinin preantral folikülogenezisin regülasyonunda önemli rol alabileceği yönündedir (29). İnvitro olarak GDF-9’un insan preantral foliküllerinin gelişimi üzerinde sitümüle edici etkisinin olduğu gösterilmiştir (25-27). Primordial foliküllerin gelişiminde, parakrin etkili büyüme foktörleri ve sitokinler de rol almaktadır. Örneğin kit-ligand (KL) ve leukemia inhibiting factor (LIF: granüloza hüclerinde sentezlenir). LIF aynı zamanda PGC’lerin proliferasyonunu, oosit ve teka hücrelerinin gelişmesini stimüle eder (29,30). Bütün bu bulgular ışığında, preantral folikülogenezis oosit büyüme faktörleri ile yönetiliyor gibi görünmektedir. Ayrıca, primordial foliküller FSH 6 reseptörü eksprese etmezler ve primordial folikülün primer foliküle geçiş aşamasında FSH gerekli değildir (15). 1.2.1.3. Folikül Gelişiminde Preantral ve Antral Aşamalar Granüloza hücrelerinin mitotik ekspansiyonuyla, tek tabakalı primer folikül, çok katlı sekonder foliküle dönüşür. Oosit çapının artması, bazal lamina oluşması, zona pellusida ve teka hücre tabakasının oluşumu gelişimin diğer bileşenleridir (31). Preantral evrede folikül çapı 40-60 µm den, 120-150 µm ulaşmaktadır. Folikül daha fazla büyüyerek antral evrenin başında 200 µm ulaşır. Bu aşama sırasında aynı zamanda, granüloza hücreleri arasında daha sonra antral kaviteyi oluşturacak olan sıvı boşluklar oluşmaya başlar, teka hücre tabakasının damarlanması artar, teka ve granüloza hücrelerinin çoğalması ve oositin büyümesi devam eder. İnsanlarda tek tabakalı primer folikülün, çok tabakalı sekonder foliküle gelişmesi aylar alır. Preantral foliküllerde FSH reseptörleri ekspre edilse bile, bu yavaş gelişim aşamasında gonodotropinlerin rolü yok gibi görünmektedir (15). Preantral folikül gelişiminde FSH’ ın tartışmalı rolüne rağmen, granüloza hücrelerinden (aktivinler) ve teka hücrelerinden (BMP-4 ve BMP-7) lokal olarak salınan TGF β ailesinin, yada oosit kaynaklı GDF-9 ve BMP-15’in kritik rolü vardır (3). Teka hücrelerinin folikül gelişiminde pek çok açıdan önemli rolü vardır. İlk olarak, granüloza hücrelerinde sentezlenen östrojen prekürsörlerinin kaynağı olan androjenleri sentezlerler. İkinci olarak BMP-4 ve BMP-7 teka orijinlidir. Üçüncü olarak teka hücreleri ile granüloza hücreleri arasındaki iki yönlü iletişimi sağlayan, hepatocyte growth factor (HGF) ve keratinocyte- growth factor (KGF) teka hücre kaynaklıdır (32). Dördüncü olarak preantral- antral folikül hızlı büyüme döneminde, BMP-4 ve BMP-7 FSH regülasyonunda rol alır, LH’ı inhibe ederek, progesteron sentezini azaltır ve E2 sentezini artırır (33). Preantral ve antral folikül gelişiminde pek çok aktivasyon faktörü tanımlanmıştır. Bunlardan en önemlileri granüloza hücre kaynaklı aktivinler 7 ve teka hücre kaynaklı TGF-β’dır. Aktivinin değişik formları (aktivin A, AB, B) olsa bile folikülogeneziste aktivin A önemlidir. Aktivin A lokal ve parakrin etkiyle preantral folikül gelişimini ve granüloza hücre proliferasyonunu uyarır (16, 34, 35). TGF-β’nın 3 değişik izoformu (TGF-β1, β2, β3) vardır. TGF- β, granüloza hücrelerinin çoğalmasını arttırır, progesteron ve östrojen üretimini uyarır (36). AMH’nın preantral folikül gelişiminde negatif etkisi olduğu düşünülmektedir. Primordial foliküller AMH sentezlemezler. İlk defa primer folikül evresinde sekresyonları başlar ve mid-antral döneme kadar devam eder. AMH; sekonder, preantral ve antral folikülün çapı 4mm altında olduğu dönemde en yüksek düzeye ulaşır. Bu bulgular primordial-primer geçişin dışında, preantral folikül gelişiminde AMH’nın negatif etkisi olduğunu göstermektedir (37, 38). 1.2.1.4. Antral Aşamadan Sonra Folikül Gelişimi ve Dominant Folikül Seçimi Antral aşamadan sonra folikül gelişimi granüloza ve teka hücrelerinin proliferasyonu, vaskülarizasyonun artması, oosit gelişimi, folikül içinde antral boşluğun oluşumu ile karakterizedir. FSH bu aşamada kritik rol oynar. Çeşitli foliküler sınıflamalar olmakla beraber Gougeon (39), granüloza hücrelerinin sayısına ve folikülün büyüklüğüne göre sınıflama yapmıştır (Şekil 2). Bu şemaya göre primordial folikülden dominant folikül gelişimi yaklaşık 1 yıl sürer. Bu uzun periyod boyunca (tahminen 300 gün) foliküller, gonadotropinlerden bağımsız olarak gelişir. Gonadotropinlerin etkisi son 50 günde olur. Normal siklusları olan bir kadında, dominant folikül menstrüel siklusta luteal fazın sonunda klas 5 foliküllerden seçilmektedir (39). Mid-luteal faz sonrasında granüloza hücrelerinde mitoz oranında artış görülmektedir. Bu da luteolizisin, bir şekilde graaf foliküllerin granüloza hücrelerindeki mitozu arttırdığını düşündürmektedir. 8 Şekil 2: İnsan overinde folikülerin gelişim aşamaları (40). Bir kohortdaki folikülde granüloza hücrelerinde mitoz oranı rölatif olarak artarken, aynı kohortdaki diğer foliküllerde granüloza hücrelerinde proliferasyon yavaşlamaktadır. Bu durum, seleksiyonun meydana geldiğinin ilk göstergesi olup, yaklaşık olarak menstrüasyon zamanına denk gelmektedir. Graaf folikül gelişim sürecinin geriye kalan kısmında, granüloza ve teka hücrelerinin mitoz hızı yüksek olarak kalır. Foliküler faz ilerledikçe dominant folikül büyümesi hızlanır: 1-5. günlerde 6,9 ± 0,5 mm iken, 6.-10. günlerde 13,7 ±1,2 mm ve 11.-14. günlerde 18,8 ± 0,5 mm olarak ölçülmektedir. Aksine, kohortdaki diğer graaf foliküllerinde büyüme daha yavaş ilerler (41). Ovulasyondan 5-6 gün önce folikül, granüloza hücre proliferasyonuna ve antral sıvı toplanmasına bağlı olarak hızlıca büyür ve overin yüzeyine doğru ilerler. Folikülün hızlı büyümesi mittelschmerz olarak da adlandırılan pelvik ağrıya neden olur. Cyclin D2, ekspansiyondan sorumlu gendir. Bu 9 büyüme evresinin tamamlanmasından sonra folikül, graaf folikülü olarak adlandırılır ve ovulasyon için hazırdır (41). Seleksiyonun altında yatan mekanizma, plasma FSH düzeyinde görülen sekonder artıştır. Menstrüel siklus boyunca, luteal fazın sonunda plasma progesteron düzeyinin bazal seviyeye düşmesinden birkaç gün önce sekonder FSH artışı başlamaktadır. FSH seviyeleri siklusun foliküler fazının ilk haftası boyunca yüksek kalır. Korpus luteumda üretilen östriol ve inhibin-A miktarının azalmasının, sekonder FSH düzeyinin artışı ve dominant folikül seçimi için en önemli nedenler olduğuna inanılmaktadır. FSH’daki sekonder artış, dominant folikül mikroçevresindeki foliküler sıvı içeriğindeki FSH düzeyini artırır. Aksine, dominant olmayan foliküllerde, foliküler sıvıdaki FSH seviyeleri düşüktür. Foliküler sıvı içerisine FSH’nın girmesi seleksiyon için gerekli stimülasyonu başlatır. Kohortdaki foliküllerden sadece birinin mikroçevresindeki FSH’yı konsantre edebilme kapasitesini nasıl kazandığı, henüz bilinmemektedir (41). 1.2.2.Ovulasyon Oluşumu Ovulasyonu tetikleyen ana olay, over ile hipotalamo-hipofizer sistem arasındaki hormonal etkileşimdir. Bu dönemde salgılanan günlük östrojenin %80’i dominant folikülden, kalan kısmı ise immatür foliküllerden, periferal testesteron, androstenedion ve östriol’un dönüşümünden oluşmaktadır. Serumda yeterli (50 saat süreyle, 200 pg/ml’nin üzerinde) östrojen eşik değerine ulaşınca, östrojen tepe noktasından yaklaşık 12-24 saat sonra pozitif feedback etki ile LH sekresyonu stimüle olur. LH artımı ile dominant folikül sıvısında bulunan ve primer oositinin mayoz bölünmenin 1.fazında duraklamasını sağlayan oosit mayoz inhibitörü (OIM) devre dışı bırakılarak, mayoz bölünme tekrar başlatılır. Ovulasyon sırasında overden salınan oosit, 1.mayoz bölünmesi tamamlanmış, kromozom sayısı yarıya düşmüş olan 23 kromozomlu sekonder oosittir. Ovulasyon anı, LH artışının başlangıcından 34-36 saat, LH pikinden 10-12 saat sonrasına denk gelir. LH yüksekliği, dominant folikülde granüloza hücre LH reseptörleri üzerinden progesteron yapımını artırır. Progesterondaki az fakat önemli olan kısa süreli yükseliş, pozitif feedback etki ile LH pikinin ortaya çıkışını ve mid-siklus FSH pikinin 10 oluşumunu hızlandırır. LH artışı, oositte durmuş olan mayozun yeniden başlamasını, granüloza hücrelerinin luteinizasyonunu, oosit ile çevresindeki kümulus tabasının serbestleşmesini ve folikül rüptürü için gerekli olan prostaglandinlerin ve diğer eikozanoidlerin sentezini sağlamaktadır (1). FSH, LH ve progesterondaki bu fizyolojik değişimlerin, folikül duvar kollajeninin dejenerasyonuna, folikül duvarının ince ve gergin hale gelmesine ve sonuçta da rüptürüne neden olduğu üzerinde durulmaktadır. LH‘ın ovulasyon tetiğini çekebilmek için progesteron reseptörlerinin otokrin etkisine ihtiyaç duyduğu belirtilmektedir. Gonadotropinlerin etkisi altında foliküler sıvıda plazminojen aktivitörlerinin sentezi artar. Ovulasyon yaklaştıkça granüloza hücre plazminojen aktivitörleri sekresyonu çoğalır ve plazminojenden oluşan plazmin etkisi ile de folikül duvarının gerilim gücü zayıflar. Prostaglandinler, folikül duvarından proteolitik enzimlerin serbestleştirilmesine, histamin ve bradikinin oluşturulmasına ve anjiyogenezis ile hiperemik, inflamatuar bir ortam oluşturulmasına neden olur. Diğer yandan prostaglandinlerin bir diğer etkisi, folikül çevresindeki teka tabakasındaki düz kasların kasılmasını sağlayarak ovulasyona yardımcı olmalarıdır (Şekil-3)(1). Şekil-3: Normal menstrüel siklus (42). 11 1.2.3. Korpus Luteum Oosit salınması ile luteal faz başlar. Korpus luteum luteinize olmuş granüloza hücreleri ile teka interna ve teka eksterna tabakalarından oluşur. Korpus luteumun asıl görevi, salınmış oositi desteklemek ve endometriumu implantasyona hazırlamak için progesteron salgılamaktır. Progesteron salgısı LH salgısından 6-8 gün sonra en yüksek noktaya ulaşır (1, 43). Granüloza hücrelerine endositoz yoluyla alınan LDL-kolesterol, serbest kolesterol ve aminoasitlere hidroliz olur. Serbest kolesterol mitokondride pregnanolon, progesteron ve az miktarda androjene dönüşür. Östrojen ve inhibinin de katkısı ile korpus luteumdan salgılanan progesteron, lokal ve santral etki ile yeni folikülün gelişimini durdurur. Gebelik olmazsa ovulasyondan 9-11 gün sonra korpus luteum hızla küçülmeye başlar ve progesteron, östrojen ve inhibin seviyeleri düşer. Menstruel kanama olur. Ayrıca, inhibinin etkisinden kurtulan FSH artmaya başlar, böylelikle yeni menstrüel siklus başlar. Gebelik oluştuğu takdirde korpus luteumun gelişimi, ilk 3 ay gebelikte artan human chorionic gonadotropin(HCG) tarafından desteklenmektedir (1). 2. Over Rezerv Testleri 2.1. Folikül Stimülan Hormon (FSH) FSH, over rezervini değerlendirmede en yaygın kullanılan testtir. 1980’li yıllardaki IVF deneyimlerinde, erken foliküler fazdaki FSH seviyesinin reprodüktif sonuçlarla ilişkili olduğu saptanmıştır (44). Over rezervi iyi olan kadınlarda, siklusun erken döneminde küçük foliküllerden salınan, ovaryan hormonlar sayesinde FSH düşük seviyede kalır. Aksine, zayıf over rezervi olan kadınlarda, oosit sayısının azalması ve ovaryan hormon üretimindeki (östradiol) azalma hipotalamik/hipofizer FSH sekresyonu üzerindeki negatif feedback etkisini kaldırarak FSH yükselmesine neden olur (44). 12 Normal FSH değeri, fertiliteyi değerlendirmede yararlı değildir. Fakat yüksek anormal değerler (FSH >20 mIU/mL) ile spontan gebelik şansı çok azdır (45). Bu bulgular ışığında, 3.gün FSH düzeyi, düşük maliyeti ve basit olması nedeniyle over rezervini değerlendirmede en yaygın kullanılan testtir. FSH değeri, 10 mIU/mL altında olduğunda over rezervinin yeterli olduğu düşünülmektedir. 10 ile 15 mIU/ml arası ise ara değerler olarak kabul edilmektedir. FSH’ın normal değerinin üst eşiği çalışılan laboratuvara göre değişmektedir. Kullanılan laboratuvar metoduna ve kitine göre, cut off 10- 25 mIU/mL olarak kabul edilmektedir (46). 2.2. Serum Östradiol Seviyesi (E2) Fizyolojik olarak kadın östradiolünün önemli bir kısmı ovaryan granüloza hücrelerinden kaynaklanır. Adipoz dokuda testesteronun östradiola çevrilmesi diğer nongonadal kaynak olarak gösterilmiştir. Ayrıca E2 sınırlı miktarda adrenal korteks, beyin ve endotel hücrelerinde de üretilir. Bazal E2 seviyesinin, overin gonadotropine olan cevabıyla ters bir korrelasyonu olduğu gösterilmiştir (1) IVF programındaki kadınlarda yapılan bir prospektif çalışmada, bazal 3.gün E2 seviyeleri yüksek olan (>80 pg/mI) hastaların daha yüksek siklus iptali ve daha düşük gebelik oranları bulunmuştur (47). Bu çalışma, östradiol ile tedavi sonuçları arasında açık bir ilişki olmadığını söyleyen çalışmalar ile zıtlık oluşturmaktadır. IVF hastalarında bazal östradiolün tanısal değerini araştıran 10 adet çalışmayı değerlendiren meta-analizde, kötü gebelik sonuçları açısından E2 testinin tanısal değerinin düşük olduğu saptanmıştır (48). Over rezervini belirlemede, çelişkili veriler olmasına rağmen, siklusun 3. günü E2 seviyesi bakılmaya devam edilmektedir (48, 49). Genelde <80 pg/mL değerler, yeterli over rezervi olarak düşünülürken, değişik cut-off değerlerde kullanılmaktadır. Yüksek östradiol değerleri, FSH’yı baskılayabilir ve perimenopozal kadınlarda düşük over rezervini maskeleyebilir. Bundan dolayı FSH ve E2 yanlış negatif sonuçları önlemek için birlikte bakılmalıdır. 13 2.3. Antral Folikül Sayımı (AFS) Yaşlanma ile ovaryan rezerv kaybı, antral folikül sayısının azalması ile ilişkili olduğundan dolayı infertilite tedavisi öncesi, transvajinal ultrasonografi ile over yapısı ve aktivitesi görüntülenmektedir. Siklusun 2.-4. günlerinde, AFS 2-10’dan az olduğu zaman düşük over rezervi olarak düşünülür (50). AFS over rezervini ve cevabını dğerlendirmede iyi bir prediktör olmasına rağmen, oositin kalitesi, IVF ile gebelik şansı ve gebelik sonuçlarını belirleme açısından, over rezervini değerlendirmesine göre daha zayıf bir prediktördür (51). 2.4. Anti Müllerian Hormon (AMH) Antimüllerian hormon, transforming growth faktör B ailesine ait, homodimerik disulfit bağla bağlı, molekül ağırlığı 140 kDa olan bir glikoproteindir (52). İnsanlarda 19. kromozomun kısa koluna yerleşmiştir (53). AMH geni 2750 Bp uzunluğunda ve 5 econ parçasından oluşmaktadır. Üçüncü econ parçası molekülün aktif kısmını oluşturmakta olup, guanin ve sitozinden zengindir. AMH, erkeklerde testiküler sertoli hücrelerinden puberteye kadar fazla miktarda salınırken, kadınlarda granüloza hücrelerinden ve doğumdan menopoza kadar salınır (53, 54). Sadece reprodüktif organlara spesifik gibi görünen AMH, kadın internal reprodüktif organların öncüsü olan müllerian duktusun regresyonuna neden olur. AMH yokluğunda ise her iki seks organları gelişir (54-56). AMH, 8 mm’den küçük, preantral ve erken antral foliküllerden sentezlenir. AMH seviyesi primordial folikül havuzunun boyutunu yansıtır. Yetişkin kadınlarda, yaşla birlikte primordial folikül sayısı azalırken, AMH seviyesi de düşer (57). Menopozda ise ölçülemeyecek seviyelere iner (58). AMH seviyesi, azalan over fonksiyonlarının erken, güvenilir, doğrudan bir göstergesidir. Bununla birlikte, uygun eşik değeri üzerinde fikir birliği yoktur (58-61). 0.5 ng/ml üzerinde serum AMH seviyesi, iyi bir over rezervini gösterirken daha düşük seviyeler tükenmiş over rezervine işaret eder. IVF başarısı, 0.15 ng/ml’den daha az AMH düzeylerinde çok azalmaktadır (59). 14 AMH ölçümü, kanser hastaları gibi bazı hastalarda, azalmış over rezervini belirlemede faydalı rol oynayabilir (60). Ayrıca preantral foliküllerden siklik olarak değil de, sürekli olarak eksprese edildiğinden, minimal değişkenlik gösterir ve AMH ölçümü için menstrüel siklusta belirli bir güne gerek yoktur. 3. Selektif Östrojen Reseptör Modülatörleri (Serm’ler) Östrojenlerin, hedef hücrelerde en az iki tip reseptörünün (ER alfa ve ER beta) bulunması, bunların organlar arasında dağılımının ve farklılığının gösterilmesi, doku veya organa selektif östrojen agonist ve antagonistlerinin geliştirilmesine yol açmıştır (4). Selektif östrojen modülatörü (SERM) olan, başlıca 3 ilaç tanımlanmıştır: Tamoksifen, Toremifen, Raloksifen (4). Bu üç ilaç östrojen reseptörlerine (ER) bağlanan, östrojenenin kompetetif inhibitörüdür. Hepsinin hedef dokularında, mikst agonist ve antagonist aktivitesi vardır (62). Bu özelliklere sahip ve uzun zamandır kullanılan tamoksifen, SERM’lerin birinci kuşağının üyesidir. 3.1. Tamoksifen 1950 lerin sonlarında, ilaç firmaları kontraseptif olarak kullanılabilecek anti-östrojen bileşikleri araştırmaya başladılar. 1966 da Dora Richardson, o zaman ICI-46,474 olarak adlandırılan tamoksifeni sentezlemeyi başardı (63). 1980 sonunda tamoksifen infertilite ilacı olarak onay almasına rağmen bu bileşikler hiç bir zaman kontraseptif olarak kullanılamadı (64). Östrojen ve meme kanseri arasındaki ilişki yıllardır bilinmekteydi (63). Bu konuda ilk klinik çalışma, 1971 de Christie Hospital da yapıldı ve ileri evre meme kanserindeki etkisi gösterildi (66). Fakat o zamanlarda kanser tedavileri öncelikli değildi ve 1972 de ICI (Imperial Chemical Industries -şimdi AstraZeneca-) Alderley Park Araştırma Laboratuvarları’nın ilaç geliştirme programı fesih edildi. Tamoksifenin geliştirmesi 2. klinik çalışmayla, Harold W.C. Ward tarafından Queen Elizabeth Hospital, Birmingham’da yapıldı. 15 Ward’ın çalışması, daha yüksek dozda daha etkin cevabı gösterdi.1973’de, ileri evre meme kanserinde kullanılmasını sağlayan yine de Walpole oldu (64). Ardından ABD’de 1977 yılında onaylandı. Fakat ilaç nispeten küçük bir piyasada diğer hormonal ilaçlarla yarışıyordu ve klinik ya da mali olarak olağanüstü değildi. 1980’lerde henüz Östrojen reseptörleri (ER) tanımlanmamıştı ve klinik deneyler tamoksifenin etkinliğini tam olarak ortaya çıkaramıyordu. Fakat 1998 yılında Oxford based Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group tam olarak tamoksifenin etkinliğini ortaya koydu ve erken evre meme kanserinde hayat kurtardığını kanıtladı (67). 3.1.1. Etki Mekanizması Tamoksifen, hedef dokularda östrojen reseptörlerine (ER) kompetitif olarak bağlanan, DNA sentezini azaltan, östrojen etkilerini inhibe eden, triphenylethylene türevi, nonsteroid anti-inflamatuar ajandır. Hücre siklusunu G0 fazından G1 fazına geçişi aşamasında bloke eden, sitostatik bir ilaçtır (68). Tamoksifenin kendisi ön ilaçtır, hedef proteine düşük afinite gösterir. Karaciğerde cytochrome P450 ile metabolize olur ve aktif metaboliti olan 4- hidroksitamoksifene döner. 4-OH metaboliti, ana bileşiğe gore 50-100 kez daha aktiftir (68). Meme dokusunda östrojen reseptörlerine antagonist olarak bağlanır, östrojen reseptörlerini kodlayan genleri inhibe eder. Tamoksifen östrojen reseptörlerine bağlandığında DNA da değişiklikler yapmaya başlar. ER/tamoksifen kompleksi östrojen sentezleyen genleri durdurmak için koreseptörleri kuvvetlendirir. Bu proteinlerden bazıları, NCoR and SMRT’dir(69). Tamoksifenin fonksiyonu, ErbB2/HER2 gibi değişik growth factor proteinleriyle düzenlenir. Yüksek ErbB2 düzeyleri tamoksifene dirençli kanserlerde gösterilmiştir (70). Tamoksifenin tam olarak antikanser etkisini gösterebilmesi için PAX2 proteinine ihtiyacı vardır (70-72). Yüksek PAX2 varlığında ER/Tamoksifen komleksi ErbB2 proteinini baskılayabilir. Tersine AIB-1expresyonu PAX2 den fazla olursa ER/Tamoksifen kompleksi, meme 16 kanserinin ilerlemesine neden olacak ERBB2’nin expresyonuna neden olur. (70-73). Tamoksifen, meme dokusunda, östrojen reseptör antagonistidir. Agonistik etkinliği zayıf da olsa vardır, diğer dokularda örneğin endometriumda agonist gibi davranır bu nedenle gerçekde parsiyel agonisttir. Premenopozal veya postmenopozal dönemdeki östrojen bağımlı (östrojen reseptörü-pozitif) meme kanseri olgularının palyatif tedavisi için ve adjuvan olarak kullanılır (74). Ayrıca erkek meme kanserinin hormonal tedavisinde kullanılır (75). Aynı zamanda, meme kanseri için yüksek risk taşıyanlarda kullanımı, FDA tarafından onaylanmıştır (76). Tamoksifenin diğer kullanım alanları, McCune-Albright sendromunda prematür puberte tedavisi için (77-79), Amenore veya anovulatuvar menstrüel siklus nedeniyle infertil olan kadınların tedavisi için klomifen ile olduğu gibi kullanılır (80), jinekomasti (81), bipolar hastalık (82, 83), kanser tedavisinde anti-anjiogenezis faktör olarak (84, 85), gen ekspresyonu çalışmalarında (86), Riedel’s tiroidit’inde (87)’de kullanılmaktadır. 3.1.2. Yan Etkileri Kemik: Tamoksifenin yararlı yan etkilerinden biri, kemik hücrelerinde östrojen reseptör agonisti olarak etki göstererek, kemik kaybını önlemesidir. Osteoklastları inhibe ederek, osteoporozu önler (88). Endometrial kanser: Endometrium üzerine parsiyel agonist olarak etki göstererek bazı kadınlarda endometrium kanserine neden olabilir. Beş yıldan fazla kullanımda endometrium kanseri riskini 2-4 kat artırır (89). Kardiyovasküler ve metabolik etkiler: Tamoksifenin, lipoprotein metabolizması üzerinde, parsiyel agonist olmasından ileri gelen östrojenik olumlu etkileri gösterilmiştir. Ancak kronik kullanılışta kardiyoprotektif etkisi ortaya konulamamıştır (90). Bazı kadınlarda serum trigliseridinde artışa neden olabilir. Major cerrahiden sonra ya da immobiliteden sonra tromboemboli riskini artırır (90). Aynı zamanda karaciğerde yağlanmaya neden olur (91). Santral sinir sistemi: Tamoksifenle tedavi edilen meme kanserli hastalarda, en önemli yan etkilerden biri kognitif fonksiyonlarda azalmadır. 17 Şematik hafıza skoru düşer (92). Bu durum meme kanseri tedavisinde kullanılan bir aromataz inhibitörü olan anastrozolle karşılaştırıldığında daha az ciddidir (93). Diğer etkiler: En sık görülen akut yan etkisi sıcak basması, bulantı ve kusmadır. Olguların %25’inde ortaya çıktığı bulunmuştur. Menstrüasyon bozukluğu, vajinal kanama, akıntı ve ciltte döküntü yapabilir. Tümörün ağrısını artırabilir. Lökopeni ve trombositopeni oluşturabilir. Yüksek dozda seyrekde olsa retinopati yapabilir. Kemik metastazı olan hastalarda hiperkalsemi yapabildiği bildirilmiştir. Tamoksifenle tedavi edilen hastalarda ortaya çıkan diğer önemli yan etki ise libido azalmasıdır (94, 95) Çalışmamızın amacı, bir antikanser ilacı olan tamoksifenin, over rezervi üzerine olan etkisini araştırmaktır. 18 GEREÇ VE YÖNTEM Çalışma projesi Uludağ Üniversitesi Bilimsel Çalışma Etik Kurulu’na sunuldu ve onay alındıktan sonra çalışma süreci başlatıldı (etik kurul onay tarihi: 27.03.2012 ve no:2012-04/08). Çalışmada, Uludağ Üniversitesi Deney Hayvanları Yetiştirme ve Araştırma Merkezi’nden alınan, ergin 30 adet BALB/c fare kullanıldı. BALB/c fareler, dünya genelinde en çok kullanılan inbred soylardır. İnbred soylar, erkek ve dişi kardeşlerin çiftleşmesiyle oluşan ardışık 20 veya daha fazla jenerasyonunun sonucudur. Erkek-dişi kardeşlerin eşleşmesiyle koloni içinde bireyler arasındaki tüm genetik varyasyon ortadan kalkar. Kolonideki tüm hayvanlar genetik olarak aynıdır (94). Fareler için önerilen uygun çevresel koşullar aynı merkez tarafından sağlandı ve fareler ışıklandırılması 12 saat karanlık-12 saat aydınlık, havalandırılması (%60-70 nem), oda ısısı (20-240C) kontrol edilen bir odaya yerleştirildi. Fareler çalışma boyunca, tabanı ve yanları plastik, üstü demir tel örgü ile kapalı olan, fare veya sıçanlar için özel üretilmiş standart kafeslerde yaşatıldı. Her kafese en fazla beş fare konuldu. Kafesin tabanı daima kuru ağaç talaşı ile kaplıydı. Bu talaş iki günde bir kez değiştirildi. Hayvanların beslenmesinde, standart pellet yemi ve şehir suyu kullanıldı. Östrus döngüsü göstermeyen deneklerin dahil edilmesini engellemek amacıyla, iki günlük adaptasyon süresinin ardından, bir siklusu tamamlayana kadar vajinal smear takibi yapıldı, bu sürenin sonunda 4-5 günlük östrus siklusu gösterip, fazları düzenli devam eden denekler çalışmaya dahil edildi. Hayvanlar üzerine test ve kontrol muamelelerinin etkileri karşılaştırılmak istendiğinde ve bireysel tepkinin bilinmediği durumlarda, mevcut hayvanlar kontrol ve test gruplarına rastgele dağıtılır (randomizasyon). Bu işlem, bireyler arası varyasyonun deney ve kontrol gruplarına eşit olarak dağılmasını sağlar. Bu çalışmada da hayvanlar rastgele 2 gruba ayrıldı. Kafeslerin üzerine, grupları ve enjeksiyonun tarihini belirtecek plakalar yerleştirildi. 19 Tamoksifen enjekte edilen (deney grubu), ve tamoksifen’in salt etkisini görebilmek için tamoksifen’in eritildiği taşıyıcı solüsyonun enjekte edildiği (kontrol grubu) olmak üzere 2 grup oluşturuldu. Her bir grupta tamoksifen enjeksiyonu için 15; kontrol grubu için 15 fare olmak üzere toplam 30 hayvan kullanıldı. Tamoksifen etanol: mısır yağında (%10 etanol:% 90 mısır yağı) eritildi ve 100l dozda, intraperitoneal yolla, tek doz halinde deney grubundaki farelere, proöstrus döneminde enjekte edildi. Östrus siklusundaki değişimleri gözleyebilmek amacıyla vajinal smear yönteminden yararlanıldı. Deney süresince her gün, bir kez smear alınmak suretiyle, östrus fazları takip edildi. Vajinal smear yöntemi; farelerin vajinasına distile su verildi ve bu sıvı geri alınarak lama yayıldı, ışık mikroskobunda değerlendirildi. Enjeksiyon sonunda iki östrus siklusu geçiren ve vajinal smear ile proöstrus döneminde olduğu tesbit edilen hayvanlar eter inhalasyonu ile uyutuldu. Uygulamayı takiben hayvanların göğüs kafesi açılarak Anti- Müllerian Hormon seviyesini belirlemek için kalpten 5 cc’lik vakumlu tüplerle (venojet) ~ 2 cc kan örnekleri ependorf tüplere alındı. Örnekler 3000 devir/dk da 15 dakika santrifüje edildi ve serumları ayrıştırıldı. Biyokimyasal tetkik yapılana kadar -20 C’de saklandı. 1. ELISA ile AMH Ölçümü Farelerden elde edilen serum örneklerinde AMH düzeyleri Mouse Anti- Mullerian Hormone (AMH) (Hangzhou Eastbiopharm Co. Ltd. Hangzhoui, CHINA) kiti ile ELISA yöntemi kullanılarak çalışıldı. Prospektüste kitin analitik duyarlılığı 0,05 ng/mL ve analiz sınırları 0.1-40 ng/mL olarak bildirilmekteydi. 2. Over Dokusunun Histolojik İncelenmesi Kan alınımını takiben farelerin karın bölgeleri açıldı ve ovaryumları alındı. Alınan ovaryumlar numaralandırılmış kasetler içerisinde %10’luk tamponlanmış nötür formol solusyonuna alınarak 24 saat tespit edildi. Tespit solüsyonunda bulunan ovaryumlar değişik derecelerde (%50, 70, 80, 90, absolü) alkol, ksilol ve parafin serisinden geçirilerek, granüllü, 58-60oC’de eriyen parafinde bloklandı. 20 Parafine gömülen dokulardan, mikrotom ile 5 µm kalınlığında kesitler alındı. Kontrol ve deneme grubuna ait ovaryumların merkezinden geçen en büyük kesitler, Crossmonn’un üçlü boyama yöntemi ile boyandı. Kontrol ve deney grubuna ait ovaryum dokularında yer alan primordial, gelişme aşamasındaki folliküller (Tablo-1) ve atretik folliküller belirlenerek, folliküllerin sayımı yapıldı. Gruplar arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak değerlendirildi. 2.1. Folliküllerin Morfolojik Sınıflandırması Çalışmada, foliküller klasik folikül sınıflandırması ve daha önceki yayınlar göz önüne alınarak sınıflandırıldı (97-99). Bu sınıflandırmada, granüloza hücre şekli ve hücre katman sayısı göz önüne alınmaktadır. Buna göre; oositi çevreleyen yassı tek sıralı granüloza hücreleri içeren folikül, Primordial folikül (A), tek sıralı kübik granülosa hücreleri ile çevrili folikül, primer folikül (B), iki ya da daha fazla sıralı kübik granüloza hücreleri ile çevrili folikül, sekonder folikül (C), çapı diğer foliküllere göre oldukca geniş, granüloza hücreleri arasında küçük boşlukların oluştuğu ve granüloza hücre sırasının 3’den fazla olduğu folikül preantral folikül (D), çapı en geniş olan ve antral boşluğun ileri derecede geliştiği follikül, antral folikül (E), granüloza hücrelerinin teka hücreleriyle çevrildiği, açıkça oositin görülmediği foliküller bilinmeyen folikül (F) olarak adlandırıldı (Tablo-1). Tablo-1. Foliküllerin sınıflandırılması (99). Adlandırma Tanım A Primordial Tek katlı yassı granüloza hücre (GH) katmanı B Primer Tek katlı kübik (GH) katmanı C Sekonder 2-3 sıralı kübik (GH) katmanı D Preantral 3≤ sıralı GH’li geniş antral boşluk, belirgin teka tabakalı E Antral Kumulus-oosit kompleksi, antral boşluk ve belirgin teka tabakalı F Bilinmeyen Granüloza hücreleri teka hücreleri ile çevrili ancak oosit yok GH: granüloza hücre. 21 3. İstatistiksel Yöntem Çalışmada; sürekli ve kesikli değişkenler, betimleyici istatistik olarak medyan (minimum-maksimum) değerleriyle; kategorik değişkenler, frekans ve ilgili yüzde değerleriyle ifade edilmiştir. Gruplar arasında yapılan istatistiksel karşılaştırmalarda, Mann Whitney U testi kullanılmıştır. Çalışmanın analizleri SPSS 20.0 programında yapılmış olup p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. 22 BULGULAR Çalışmaya dahil edilen deney hayvanlarında, her 2 grupta deney başarı ile tamamlandı. Kontrol grubuna, tamoksifen’in eritildiği taşıyıcı solüsyon (etanol:mısır yağı) enjekte edildikten 2 gün sonra 4 fare öldü. Ölen farelerin batını açıldı, olası barsak perforasyonu açısından değerlendirildi. Ancak ölüm sebebini açıklayabilecek herhangi bir patolojik bulgu saptanamadı. 1. Tamoksifen ve Kontrol Grubu AMH Değerleri Karşılaştırılması [Gösterim: Medyan (Minimum-Maksimum)]; Kontrol grubunda odds ratio (OD) değeri 1450 (635-1596) olarak bulunmuştu. Tamoksifen grubunda OD değeri 1401 (1304-1503) olarak bulunmuştu. Gruplar arasında AMH değerleri bakımından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık saptanmadı (p=0.097)(Tablo-2, Şekil-3, 4, 5). Tablo-2: Tamoksifen ve Kontrol grubu arasında, AMH(ng/ml) seviyelerinin karşılaştırılması. Tamoksifen (n,15) Kontrol (n,11) P Medyan min.-max. Medyan min.-max. 6,1374 5,47-6,84 6,4725 5,21-7,47 0,097 Mann Whitney U testi kullanıldı. *: p< 0.05 anlamlı 23 Şekil-4: Kontrol grubu AMH değerleri (ng/ml). Şekil-5: Tamoksifen grubu AMH değerleri (ng/ml). 24 Şekil-6: Tamoksifen ve kontrol grubu AMH (ng/ml) değerlerinin karşılaştırılması. 2. Tamoksifen ve Kontrol Grubu Folikül Sayıları Karşılaştırılması Kontrol ve deney gruplarına ait ovaryum kesitleri, Crossmann’ın üçlü boyama yöntemi ile boyanıp incelendi. Hazırlanan preparatlarda primordial, primer, sekonder, preantral, antral ve sınıflandırılamayan folikül sayımı yapıldı (Şekil-7, 8, 9, 10, 11, 12). Şekil-7: Tamoksifen grubunda ovaryumun genel görünümü, Crossmann’ın üçlü boyama yöntemi ile stereo mikroskop görüntüsü (X4’lük büyütme). 25 Şekil-8: Tamoksifen grubunda preantral ve sekonder foliküllerin görünümü, Crossmann’ın üçlü boyama yöntemi ile stereo mikroskop görüntüsü (X10’lük büyütme). Şekil-9: Tamoksifen grubunda primordial folikülün görünümü, Crossmann’ın üçlü boyama yöntemi ile stereo mikroskop görüntüsü (X40’lük büyütme). 26 Şekil-10: Kontrol grubunda ovaryumun genel görünümü, Crossmann’ın üçlü boyama yöntemi ile stereo mikroskop görüntüsü (X4’lük büyütme). Şekil-11: Kontrol grubunda foliküllerin genel görünümü, Crossmann’ın üçlü boyama yöntemi ile stereo mikroskop görüntüsü (X20’lük büyütme). 27 Şekil-12: Kontrol grubunda primer folikülün görünümü, Crossmann’ın üçlü boyama yöntemi ile stereo mikroskop görüntüsü (X60’lük büyütme). İstatistiksel değerlendirmede Mann Whitney U testi kullanıldı ve p<0.05 anlamlı olarak kabul edildi. Tüm gruplarda bakılan parametrelerin, medyan (minimum-maksium) değerleri Tablo-2’de verilmiştir. Tamoksifen grubuna ait 15 farenin ovaryumlarının mikroskobik incelemesinde, medyan primordial folikül sayısının 4(0-12), kontrol grubuna ait 11 farenin ovaryumlarının mikroskobik incelemesinde medyan primordial folikül sayısı 3(2-11) olarak saptandı. İki grup arasında istatistik olarak fark saptanmadı (p=0,878). Tamoksifen grubu medyan primer folikül sayısı 4(1-8), kontrol grubu primer folikül sayısı 3(1-6) olarak bulunmuştur. İki grup arasında istatistik olarak fark saptanmadı (p=0,507). Tamoksifen grubu medyan sekonder folikül sayısı 3(1-5), kontrol grubu sekonder folikül sayısı 6(1-11) olarak saptandı. İki grup arasında istatistiksel olarak fark saptandı (p=0,011). 28 Tamoksifen grubu medyan pre-antral folikül sayısı 5(0-7), kontrol grubu pre-antral folikül sayısı 8(1-15) olarak saptandı. İki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı (p=0,002). Tamoksifen grubu medyan antral folikül sayısı 3(1-6), kontrol grubu antral folikül sayısı 2(0-7) olarak saptandı. İki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı (p=0,799). Tamoksifen grubu medyan sınıflandırılamayan folikül sayısı 5(0-7), kontrol grubu sınıflandırılamayan folikül sayısı 5(0-13) olarak saptandı. İki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı (p=0,330) (Tablo- 3). Tablo-3: Tamoksifen ve Kontrol grubu arasında folikül sayılarının karşılaştırılması. Tamoksifen (n,15) Kontrol (n,11) P Ortalama (min.-max.) Ortalama (min.-max.) Pirimordial 4 (0-12) 3 (2-11) 0.878 Primer 4 (1-8) 3 (1-6) 0.507 Sekonder 3 (1-5) 6 (1-11) 0.011* Pre-antral 5 (0-7) 8 (1-15) 0.002* Antral 3 (1-6) 2 (0-7) 0.799 Sınıflanamayan 5 (0-7) 5 (0-13) 0.330 Mann Whitney U testi kullanıldı. *: p< 0.05 anlamlı 29 TARTIŞMA Meme kanseri, kadınlarda görülen kanserlerin dörtte birini oluşturur. Kadınlarda, kansere bağlı ölümlerde, akciğer kanseri ve kolorektal kanserden sonra üçüncü sırayı alır. 1985 yılına kadar kansere bağlı ölümlerde, ilk sırayı alan meme kanserinin bugün üçüncü sıraya düşmesinin temel nedeni, erken evre olguların artması ve cerrahi sonrası uygulanan adjuvan tedavi protokollerindeki gelişmelerdir (100). Bu gelişmelerden en ilgi çekici olanı 1973 yılında klinik kullanıma sunulan tamoksifendir (101). Meme kanseri tedavisinin 3 amacı vardır (102). 1-Primer tümörü kontrol altına almak 2-Metastatik hastalık risklerini azaltmak 3-Hastanın hayat kalitesini artırmak Bizde, meme kanseri tedavisinde en çok satılan ve kullanılan ilaç olan tamoksifenin, folikül gelişimi ve farklılaşmasına olan etkisini değerlendirmek amacı ile yaptığımız çalışmanın sonuçlarını, literatür bulguları ışığında tartışmak istedik. Tamoksifen oral olarak iyi tolere edilen, sentetik nonsteroid yapıda, ER’yi kompetitif olarak bloke eden, antiöstrojen ajandır. Fakat aynı zamanda agonistik özelliğinden dolayı östrojenik etkileri de vardır. Bu değişik etkileri, doza, organa, türe ve hücre tipine bağlıdır. Bu ikiliğin kesin mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Fakat belirli hücrelerin ER çeşitliliğine bağlı olduğu düşünülmektedir (103). Meme kanserli hastalarda, tamoksifenin over rezervi ya da folikül havuzuna olan etkisini net olarak değerlendirmek mümkün değildir. Hastaların yaşı, genetik yapısı, tümörün evresi, lenf nodu tulumunun varlığı, BMI farklılığı ya da aldıkları değişik kemoterapi rejimi gibi faktörler, net bir değerlendirme yapmayı mümkün kılamamaktadır. Biz çalışmamızı deneysel çalışma olarak düzenlerken, aynı genetik yapıya sahip, aynı ağırlıkta kardeş fareler seçerek bireysel farklılığı en aza indirmeyi hedefledik. 30 Günümüzde Tamoksifen, ovulasyonu stimüle etmek ya da antikanser ilaç olarak, iki farklı endikasyonda kullanılmaktadır. Tamoksifen, GnRH ve gonadotropinleri kontrol eden, santral sinir sisteminde ve hipofizde anti- östrojendir. Normal ovulatuar premenopozal kadınlar tamoksifenle tedavi edildiğinde, gonadotropin düzeyinin artması, multifoliküler gelişime, multipl ovulasyonun olmasına ve östrojen ve progesteronun artmasına neden olmaktadır. Kanser tedavisinde ise, meme dokusundaki östrojen hormonu reseptörlerini durdurarak kanserin yayılmasını önlemektedir (68). Kırk yaşın altındaki genç kadınlarda meme kanseri insidansının artması ve çocuk sahibi olma yaşının giderek ertelenmesi, meme kanseri tedavilerinde fertilite koruyucu rejimlerin ön plana çıkmasına neden olmuştur (1101). Meme kanseri tanısı alan kadınların %25’i 40 yaşın altındadır. Genç meme kanserli hastalar, sistematik tedavinin neticesinde fertilitelerinin azalması konusunda korku içindedir. Son yapılan anketlerde, bu hastaların yarıdan fazlasının, infertilite hakında bilgi sahibi olmak istedikleri, bu konuyla ilgili sorular sordukları ve en az %30’unun tedavi tecihlerinde, infertilitenin belirleyici olduğu gösterilmiştir (104). Premenopozal meme kanserli hastalarda, primer tümörün asıl tedavisi olan cerrahi ya da radyasyon gibi lokal tedaviler, hastaların üreme fonksiyonunu etkilememektedir (104). İnfertilite, uzun kombine kemoterapi rejimlerinden sonra görülmektedir. Hatta kemoterapi esnasında, hala adet gören hastalarda bile infertilite geliştiği gözlenmiştir (105). Cyclophosphamide, methotrexate ve 5-fluorouracil gibi ya da daha sıklıkla anthracycline temelli kemoterapiyle ilişkili amenore insidansı hastaların %68’inde raporlanmıştır (106). Tedavi esnasındaki hastanın yaşı ve ilacın toplam dozu, bu sınıf ilaçların etkisini değiştiren önemli faktörlerdir. Over yetmezliğine neden olan bu ilaçlar üç sınıfa ayrılabilir: Cyclophosphamide gibi kesinlikle gonadal toksisiteye neden olanlar, methotrexate, ve 5- fluorouracil ve 6-mercaptopurine gibi gonadal toksisiteye neden olma ihtimali olanlar ve doxorubicin, bleomycin, vinka alkaloidleri (vincristine ve vinblastin), cisplatin, nitrosoureas, cytosine, ve arabinoside gibi gonadal toksisite etkisi bilinmeyenler (106). 31 Sukumvanich ve ark.(107) yaptıkları bir çalışmada, meme kanseri tedavisinde kullanılan standart kemoterapi rejimleri, amenore yapmaları açısından karşılaştırılmış. Çalışmanın sonucunda, cyclophosphamide, methotrexate, ve 5-fluorouracil (CMF); doxorubicin and cyclophosphamide (AC); doxorubicin, cyclophosphamide, and paclitaxel (ACT)’den oluşan bu üç protokol arasında, amenore oranı benzer olarak bulunmuştur. Goodwin ve ark.(108)’nın yaptığı ve diğer pek çok çalışmada, kemoterapiye bağlı menopoz riskinde en önemli faktörün, hastanın teşhisdeki yaşı olduğu gösterilmiştir. Otuz beş yaşının altında menopoz riski yaklaşık olarak %15 olarak bildirilmişken, 40 yaşın üstünde risk %40’dan fazla bulunmuştur. Hormon reseptörü pozitif olan meme kanserli hastalarda, kemoterapi yalnız başına tedavide yetersiz kalmaktadır. Bu hastalara endokrin tedavi önerilmektedir (109). Geleneksel tedavi tamoksifendir. Ancak LHRH anologları, ooferektomi, over radyasyonu alternatif tedavi olarak ya da tamoksifenle kombine olarak kullanılmaktadır. Premenopozal kadınlarda, kemoterapiden sonra, tamoksifenin yalnız başına kullanılmasımı, yoksa ovaryan supresyonla birlikte kullanılmasımı daha iyi olduğu konusu henüz netlik kazanmamıştır (110-114). Bunun ötesinde tamoksifenle optimal tedavi süresi 5 yıldır, teratojenitesi nedeniyle tedavi tamamlanana kadar hastalar gebeliği ertelemek zorunda kalmakta ve yaşla birlikte fertilite doğal olarak azalmaktadır (115). Günümüzde henüz folikülogenezisin mekanizması, net olarak aydınlatılamamıştır. Ancak, dişi üreme sisteminin gelişim basamaklarının herhangi bir döneminde, maruz kalınan östrojenin, kadınların ve çeşitli hayvan türlerinin üreme fonksiyonuyla ilişkisi olduğu kesindir (116, 117). Germ hücreleri parakrin ya da endokrin yolla kendi gelişimlerini doğrudan etkileyen östrojenleri sentezleyebilirler (118). E2 eksikliği olan sıçanlarda primordial ve primer folikül havuzunun azaldığı yapılan çalışmalarda gösterilmiştir (119, 120). Sonuç olarak E2, primordial folikül havuzu üzerinde rol oynar (121). Söz konusu kanıtlara göre kuvvetle önerilmektedir ki, tamoksifenle folikülogenezis arasında bir ilişki olmalıdır (122). 32 Pamela ve ark.(108) yaptıkları, yaş ortalaması 43.7 olan (tümör, nod, evre sınıflamasına göre T1-3 N0-1 M0) 183 premenopozal kadını değerlendikleri çalışmalarında, hastaların %45.4’ine CMF, %13.7’sine FEC ve %25’ine cerrahi sonrası adjuvan tamoksifen kullandılar. Bu çalışmada, menopoz riskinin yaşla, herhangi bir kemoterapi rejimiyle veya yalnız tamoksifenle artmış olduğu saptanmıştır. Fornier ve ark.(123) 2005’de yayınladıkları retrospektif analizde, Memorial Sloan-Kettering Cancer Merkezi’nde yaş ortalaması 36 olan (27-40 yaş), 166 premenopozal meme kanseli hastayı değerlendirdiler. Olguların tamamı düzenli siklusları olan hastalardan oluşmaktaydı. Adjuvan anthracycline ve taxane tedavisinin sonunda, 25 hastada (15%) uzun dönem amenore gelişti ve 141 hastanın (85%) düzenli siklusları devam etti. 82 hasta kemoterapiden sonra tamoksifen aldı. Bunların arasında amenore, hastaların %17’inde saptandı. Swain ve ark.(124)’nın 2009 yılında yaptıkları, NSABP B-30 çalışmasında, AC-Taxotere alan 708 hasta, aynı zamanda amenore açısından da değerlendirildi. Bu hastaların tedavilerine tamoksifen eklendiğinde amenore oranının anlamlı olarak arttığı gösterildi. Roshangar ve ark.(125) çalışmalarında, tamoksifenin, oosit ve foliküler gelişim ve diferansiyasyonu üzerindeki etkisini araştırmak için gebe farelere, tamoksifen verip, yavru farelerin overlerini histolojik olarak değerlendirdiler. Yaptıkları morfometrik çalışmalarda, oosit nestlerinin sayı ve çaplarının çalışma grubunda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, anlamlı şekilde azaldığı, bununla birlikte primordiyal ve primer foliküllerin sayı ve çapları arasında anlamlı farklılık bulunmadığını saptadılar. Sonuç olarak tamoksifenin, foliküler diferansiyasyonu erken fazlarda süprese ettiğini fakat farklılaşmış folikülleri etkilemediğini, tamoksifenin üreme sistemini negatif yönde etkilediğini vurguladılar. Balasinor ve ark.(126, 127) yaptıkları 2 ayrı çalışmada, uzun süre oral tamoksifen tedavisi verilen yetişkin erkek farelerin, testis, aksesuar bez ve hipotalamo hipofizer akslarında östrojenik etkileri gösterdiler. Ayrıca erkek farelerin yavrularında implantasyondan önce ve sonra artmış düşük oranları 33 saptadılar. Tamoksifenin embriyo gelişimini etkilediğini ve fertiliteyi azalttığını gösterdiler. Birçok kanser ilacı çoğalan hücrelere etki eder. Bu nedenle folikülde çoğalmayan oositlerden daha çok, granüloza ve teka hücrelerinin etkilenmesi beklenir. Tipik olarak, kemoterapiye maruz kalmış overlerde primordial foliküller çok az etkilenirken, matür foliküller çok daha büyük oranda azalmaktadırlar (128, 129). Bu histolojik bulguların klinik yansımaları pek çok kadında gözlenir. Özellikle 40 yaşın altında, kemoterapi sırasında amenore görülür, serum FSH düzeyi artar, kemoterapinin kesilmesinden sonrada pek çok hastada menstrüel sikluslar ve fertilite geri döner (130-132). Literatürde taranan çalışmaların hepsinde menopoz belirleyicisi olarak amenore insidansının değerlendirildiği gözlendi. Ancak amenore ile over rezervini değerlendirmek yanlış olacaktır. Muhtelemen amenore, tamoksifenin hipotalomo-hipofizer aksa yaptığı hormonal supresyon sonucu gözlenmektedir. Hastaların büyük bir kısmında tedavi kesildikden sonra menstrüel sikluslarının başlaması ve 35 yaş altında istatistiksel anlamlılık olmaması bu görüşü desteklemektedir. Fertilitenin asıl belirleyicisi, over rezervinin en doğru göstergesi olan primordial folikül sayısının azaldığı ya da AMH’nın azaldığı hiç bir çalışmada gösterilememiştir. Bizim yaptığımız çalışmada, tamoksifenin foliküler gelişimi bazı aşamalarda inhibe ettiği, overde sekonder ve preantral folikül sayısını azalttığı gösterildi. Bununla birlikte, primordial folikül sayısında ve AMH düzeyinde, deney ve kontrol grubu arasında anlamlı fark saptanmadı. Östrojen antagonisti olan tamoksifenin oluşturduğu hipoöstrojenik çevrede preantral aşamadaki foliküllerin etkilenmesinin doğal olduğu düşünüldü. Ancak sayısı sabit olan primordial foliküller üzerine etkisinin olmaması, tamoksifenin over rezervini etkilemediği kanısını destekledi. 34 Sonuç olarak; ‒ Düzenli östrus siklusu gösteren BALB/c soyu dişi fareler kullanıldı. ‒ Tamoksifen 100 µl dozunda intraperitoneal olarak uygulandı. ‒ Tamoksifen grubu ve kontrol grubu arasında AMH değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı. ‒ Histolojik değerlendirmede her iki grup arasında, a) Primordial, primer, antral ve sınıflandırılamayan foliküllerin sayısı açısından, anlamlı farklılık saptanmadı. b) Sekonder ve preantral foliküller açısından, anlamlı fark saptandı. Sonuç olarak, tamoksifenin geç safhadaki folikülleri baskıladığı, ancak over rezervinin göstergesi olan primordial folikülleri etkilemediği gösterilmiştir. Premenopozal meme kanserli hastalar, kanser tedavisi sırasında erken menopoza girmekte, doğurganlık kapasitelerinin yanında, menopozun pek çok etkisine genç yaşta maruz kalmaktadırlar. Adjuvan tedavilerin menopoza katkıları olduğu düşünülse de, bunu kanıtlamak için daha çok çalışmaya ihtiyaç vardır. 35 KAYNAKLAR 1. Seperoff L, Glass R.H, Kase. Clinical. Endocrinology and Infertility.In: N.G,eds.Clinical Gynocologic Endocrinology and Infertility.6th edition. Baltimore:Lippincott Williams & Wilkins,1999. 2. Rabinovici J, Jaffe RB. Development and regulation of growth and differentiated function in human and subhuman primate fetal gonads. Endocr Rev 1990;11:532-57. 3. Oktem O, Urman B. Understanding follicle growth in vivo. Hum Reprod 2010;25:2944-54. 4. Cosman F, Lindsay R. Selective estrogen receptor modulators: clinical spectrum. Endocr Rev 1999;20:418-34. 5. Baker TG. A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proc R Soc Lond B Biol Sci 1963;158:417-33. 6. Wylie C. Germ cells. Cell 1999;96:165-74. 7. Motta PM, Makabe S, Nottola SA. The ultrastructure of human reproduction. I. The natural history of the female germ cell: origin, migration and differentiation inside the developing ovary. Hum Reprod Update 1997;3:281-95. 8. Gondos B, Bhiraleus P, Hobel CJ. Ultrastructural observations on germ cells in human fetal ovaries. Am J Obstet Gynecol 1971;110:644-52. 9. Oktem O, Oktay K. The ovary: anatomy and function throughout human life. Ann NY Acad Sci 2008;1127:1–9. 10. Gondos B, Westergaard L, Byskov A. Initiation of oogenesis in the human fetal ovary: ultrastructural and squash preparation study. Am J Obstet Gynecol 1986; 155:189-95. 11. Ammini AC, Pandey J, Vijyaraghavan M, Sabherwal U. Human female phenotypic development: role of fetal ovaries. J Clin Endocrinol Metab 1994;79:604-8. 12. Parrott JA, Skinner MK. Kit-ligand/stem cell factor induces primordial follicle development and initiates folliculogenesis. Endocrinology 1999;140:4262-71. 13. Lee WS, Otsuka F, Moore RK, Shimasaki S. Effect of bone morphogenetic protein-7 on folliculogenesis and ovulation in the rat. Biol Reprod 2001;65:994-9. 14. Findlay JK, Drummond AE, Dyson ML, et al. Recruitment and development of the follicle; the roles of the transforming growth factor- beta superfamily. Mol Cell Endocrinol 2002;191:35-43. 15. Oktay K, Briggs D, Gosden RG. Ontogeny of follicle-stimulating hormone receptor gene expression in isolated human ovarian follicles. J Clin Endocrinol Metab 1997;82:3748-51. 16. Oktay K, Karlikaya G, Akman O, Ojakian GK, Oktay M. Interaction of extracellular matrix and activin-A in the initiation of follicle growth in the mouse ovary. Biol Reprod 2000;2:457–61. 36 17. Eppig JJ. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction 2001;6:829–38. 18. Skinner MK. Regulation of primordial follicle assembly and development. Hum Reprod Update 2005;5:461–71. 19. Castrillon DH, Miao L, Kollipara R, Horner JW, DePinho RA. Suppression of ovarian follicle activation in mice by the transcription factor Foxo3a. Science 2003;5630:215–8. 20. Rajareddy S, Reddy P, Du C, et al. p27kip1 (cyclin-dependent kinase inhibitor 1B) controls ovarian development by suppressing follicle endowment and activation and promoting follicle atresia in mice. Mol Endocrinol 2007;9:2189–202. 21. Reddy P, Liu L, Adhikari D, et al. Oocyte-specific deletion of Pten causes premature activation of the primordial follicle pool. Science 2008;5863:611–3. 22. Adhikari D, Zheng W, Shen Y, et al. Tsc/mTORC1 signaling in oocytes governs the quiescence and activation of primordial follicles. Hum Mol Genet 2010;3:397–410. 23. De Baere E, Beysen D, Oley C, et al. FOXL2 and BPES: mutational hotspots, phenotypic variability, and revision of the genotype- phenotype correlation. Am J Hum Genet 2003;2:478–87. 24. Rankin T, Familari M, Lee E, et al. Mice homozygous for an insertional mutation in the Zp3 gene lack a zona pellucida and are infertile. Development 1996;9:2903–10. 25. Dong J, Albertini DF, Nishimori K, et al. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature 1996;6600:531–5. 26. Carabatsos MJ, Elvin J, Matzuk MM, Albertini DF. Characterization of oocyte and follicle development in growth differentiation factor-9- deficient mice. Dev Biol 1998;2:373–84. 27. Vitt UA, McGee EA, Hayashi M, Hsueh AJ. In vivo treatment with GDF-9 stimulates primordial and primary follicle progression and theca cell marker CYP17 in ovaries of immature rats. Endocrinology 2000; 10:3814–20. 28. Nilsson EE, Skinner MK. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod 2003;4:1265–72. 29. Nilsson EE, Skinner MK. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol 2004;1–2:19–25. 30. Nilsson EE, Skinner MK. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod 2002;3:1018–24. 31. Knight PG, Glister C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction 2006;2:191–206. 32. Kezele P, Nilsson EE, Skinner MK. Keratinocyte growth factor acts as a mesenchymal factor that promotes ovarian primordial to primary follicle transition. Biol Reprod 2005;5:967–73. 37 33. Shimasaki S, Zachow RJ, Li D, et al. A functional bone morphogenetic protein system in the ovary. Proc Natl Acad Sci USA 1999;13:7282–7. 34. Smitz J, Cortvrindt R, Hu Y, Vanderstichele H. Effects of recombinant activin A on in vitro culture of mouse preantral follicles. Mol Reprod Dev 1998;3:294–304. 35. Oktem O, Oktay K. The role of extracellular matrix and activin-A in in vitro growth and survival of murine preantral follicles. Reprod Sci 2007;4:358–66. 36. Liu X, Andoh K, Abe Y, et al. A comparative study on transforming growth factor-beta and activin A for preantral follicles from adult, immature, and diethylstilbestrol-primed immature mice. Endocrinology 1999;6:2480–5. 37. Weenen C, Laven JS, Von Bergh AR, et al. Anti-Mullerian hormone expression pattern in the human ovary: potential implications for initial and cyclic follicle recruitment. Mol Hum Reprod 2004;2:77-83. 38. Visser JA, Themmen AP. Anti-Mullerian hormone and folliculogenesis. Mol Cell Endocrinol 2005;1-2:81-6. 39. Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human: a model from preliminary results. Hum Reprod 1986;1:81-7. 40. Jerome F. Strauss III and Carmen J. Williams. The ovarian life cycle. In: Strauss JF, Barbieri RL (eds). Yen and Jaffe’s reproductive endocrinology: physiology, pathophysiology, and clinical management. 6th edition. Saunders and Elsevier Inc. Philadelphia,2009. 41. Erickson GF. The graafian follicle: A functional definition. In: Adashi EY (ed). Ovulation: Evolving scientific and clinical concepts. Springer- Verlaag, New York, 2000. 42. Janet E. Hall. Neuroendocrine control of the menstrual cycle. In: Strauss JF, Barbieri RL (eds). Yen and Jaffe’s reproductive endocrinology: physiology, pathophysiology, and clinical management, 6th edition. Saunders and Elsevier Inc. Philadelphia,2009. 43. Cevrioğlu SA. Ovaryan fizyoloji. In: Çiçek N, Akyürek C, Çelik Ç, Haberal A (eds). Kadın hastalıkları ve doğum bilgisi. Ankara: Güneş Kitabevi,2004. 44. Abdalla H, Thum MY. An elevated basal FSH reflects a quantitative rather than qualitative decline of the ovarian reserve. Hum Reprod 2004;19:893-8. 45. Jain T, Soules MR, Collins JA. Comparison of basal follicle-stimulating hormone versus the clomiphene citrate challenge test for ovarian reserve screening. Fertil Steril 2004;82:180-5. 46. Kuohung W, Hornstein MD, Evaluation of female infertility. [Internet] Uptodate [cited 2013 April 21] Available from: http://www.uptodate.com/contents/evaluation-of-female-infertility 47. Smotrich DB, Widra EA, Gindoff PR, et al. Prognostic value of day 3 östradiol on in vitro fertilization outcome. Fertil Steril 1995;64:1136–40. 48. Broekmans FJ, Kwee J, Hendriks DJ, Mol BW, Lambalk CB. A systematic review of tests predicting ovarian reserve and IVF outcome. Hum Reprod Update 2006;12:685–718. 38 49. Licciardi FL, Liu HC, Rosenwaks Z. Day 3 östradiol serum concentrations as prognosticators of ovarian stimulation response and pregnancy outcome in patients undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril 1995;64:991-4. 50. Rombauts L, Onwude JL, Chew HW, Vollenhoven BJ. The predictive value of antral follicle count remains unchanged across the menstrual cycle. Fertil Steril 2011;96:1514-8. 51. Hsu A, Arny M, Knee AB, et al. Antral follicle count in clinical practice: analyzing clinical relevance. Fertil Steril 2011;95:474-9. 52. Cate RL, Mattaliano RJ, Hession C, et al. Isolation of the bovine and human genes for Müllerian inhibiting substance and expression of the human gene in animal cells. Cell 1986;45:685-98. 53. Cohen-Haguenauer O, Picard JY, Mattéi MG, et al. Mapping of the gene for anti-müllerian hormone to the short arm of human chromosome 19. Cytogenet Cell Genet 1987;44:2-6. 54. Rey R, Lukas-Croisier C, Lasala C, Bedecarrás P. AMH/MIS: what we know already about the gene, the protein and its regulation. Mol Cell Endocrinol 2003;211:21-31. 55. Teixeira J, Maheswaran S, Donahoe PK. Müllerian inhibiting substance: an instructive developmental hormone with diagnostic and possible therapeutic applications. Endocr Rev 2001;22:657-74. 56. Knebelmann B, Boussin L, Guerrier D, et al. Anti-Müllerian hormone Bruxelles: a nonsense mutation associated with the persistent Müllerian duct syndrome. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88:3767-71. 57. Seifer DB, Baker VL, Leader B. Age-specific serum anti-Müllerian hormone values for 17,120 women presenting to fertility centers within the United States. Fertil Steril 2011;95:747-50. 58. de Vet A, Laven JS, de Jong FH, Themmen AP, Fauser BC. Antimüllerian hormone serum levels: a putative marker for ovarian aging. Fertil Steril 2002;77:357-62. 59. Gnoth C, Schuring AN, Friol K, et al. Relevance of anti-Mullerian hormone measurement in a routine IVF program. Hum Reprod 2008;23:1359-65. 60. Lutchman Singh K, Muttukrishna S, Stein RC, et al. Predictors of ovarian reserve in young women with breast cancer. Br J Cancer 2007;96:1808-16. 61. Weghofer A, Dietrich W, Barad DH, Gleicher N. Live birth chances in women with extremely low-serum anti-Mullerian hormone levels. Hum Reprod 2011;26:1905-9. 62. Conzen SD, Ellis M. Mechanisms of action of selective estrogen receptor modulators [Internet] Uptodate [cited 2013 April 21] Available from: http://www.uptodate.com/contents/mechanisms-of-action-of- selective-estrogen-receptor-modulators 63. Sneader W. Tamoxifen, hormone analogues (ch 18). In: Sneader W (ed). Drug discovery: a history. 1st edition. New York: Wiley;2005. 64. Jordan VC. Tamoxifen: a most unlikely pioneering medicine. Nat Rev Drug Discov 2003;2:205-13. 39 65. Jordan VC. Tamoxifen (ICI46,474) as a targeted therapy to treat and prevent breast cancer. Br J Pharmacol 2006;147:S269-76. 66. Cole MP, Jones CT, Todd ID. A new anti-oestrogenic agent in late breast cancer. An early clinical appraisal of ICI46474. Br J Cancer 1971;25:270-5. 67. Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomised trials. Early breast cancer trialists' collaborative group. Lancet 1998;351:1451-67. 68. Kayaalp SO. Androjenler, anabolik steroidler ve antiandrojenik ilaçlar(Bölüm:8,Konu:81) In: Kayaalp SO (ed). Tıbbi farmakoloji. 10. Baskı. Ankara: Hacettepe-TAŞ; 2002. 69. Derman O, Kanbur NO, Kutluk T. Tamoxifen treatment for pubertal gynecomastia. Int J Adolesc Med Health 2003;15:359-63. 70. Osborne CK, Bardou V, Hopp TA, et al. Role of the estrogen receptor coactivator AIB1 (SRC-3) and HER-2/neu in tamoxifen resistance in breast cancer. J Natl Cancer Inst 2003;95:353-61. 71. Hurtado A, Holmes KA, Geistlinger TR, et al. Regulation of ERBB2 by oestrogen receptor-PAX2 determines response to tamoxifen. Nature 2008;456:663-6. 72. 72 Alkner S, Bendahl P, Grabau D, et al. The role of AIB1 and PAX2 in primary breast cancer: validation of AIB1 as a negative prognostic factor. Ann Oncol 2013;24:1244-52. 73. Nakamura T, Imai Y, Matsumoto T, et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell 2007;130:811-23. 74. BIG 1-98 Collaborative Group, Mouridsen H, Giobbie-Hurder A, et al. Letrozole therapy alone or in sequence with tamoxifen in women with breast cancer. N Engl J Med 2009;361:766-76. 75. Eggemann H, Ignatov A, Smith BJ, et al. Adjuvan therapy with tamoxifen compared to aromatase inhibitors for 257 male breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 2013;137:465-70. 76. U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research [Internet] Tamoxifen [cited 2013 April 21] Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Testimony/ucm115118.htm 77. Eugster EA, Shankar R, Feezle LK, Pescovitz OH. Tamoxifen treatment of progressive precocious puberty in a patient with McCune- Albright syndrome. J Pediatr Endocrinol Metab 1999;12:681-6. 78. Arnheim N. Preimplantation genetic diagnosis--a rolling stone gathers no moss! Hum Reprod 1992;7:1481. 79. Sawathiparnich P, Osuwanaratana P, Santiprabhob J, Likitmaskul S. Tamoxifen improved final height prediction in a girl with McCune- Albright syndrome: patient report and literature review. J Pediatr Endocrinol Metab 2006;19:81-6. 80. Steiner AZ, Terplan M, Paulson RJ. Comparison of tamoxifen and clomiphene citrate for ovulation induction: a meta-analysis. Hum Reprod 2005;20:1511-5. 40 81. Akgül S, Kanbur N, Güçer S, Safak T, Derman O. The histopathological effects of tamoxifen in the treatment of pubertal gynecomastia. J Pediatr Endocrinol Metab 2012;25:753-5. 82. Zarate CA Jr, Singh JB, Carlson PJ, et al. Efficacy of a protein kinase C inhibitor (tamoxifen) in the treatment of acute mania: a pilot study. Bipolar Disord 2007;9:561-70. 83. Yildiz A, Güleryüz S, Ankerst DP, Ongür D, Renshaw PF. Protein kinase C inhibition in the treatment of mania: a double-blind, placebo- controlled trial of tamoxifen. Arch Gen Psychiatry 2008;65:255-63. 84. Mele T, Generali D, Fox S, et al. Anti-angiogenic effect of tamoxifen combined with epirubicin in breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat. 2010 Oct;123(3):795-804. 85. Blackwell KL, Haroon ZA, Shan S, et al. Tamoxifen inhibits angiogenesis in estrogen receptor-negative animal models. Clin Cancer Res 2000;6:4359-64. 86. Feil R, Brocard J, Mascrez B, et al. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:10887-90. 87. Dabelic N, Jukic T, Labar Z, et al. Riedel's thyroiditis treated with tamoxifen. Croat Med J 2003;44:239-41. 88. Krum SA, Miranda-Carboni GA, Hauschka PV, et al. Estrogen protects bone by inducing Fas ligand in osteoblasts to regulate osteoclast survival. EMBO J 2008;27:535-45. 89. Jones ME, van Leeuwen FE, Hoogendoorn WE, et al. Endometrial cancer survival after breast cancer in relation to tamoxifen treatment: pooled results from three countries. Breast Cancer Res 2012;14:R91. 90. Esteva FJ, Hortobagyi GN. Comparative assessment of lipid effects of endocrine therapy for breast cancer: implications for cardiovascular disease prevention in postmenopausal women. Breast 2006;15:301- 12. 91. Decensi A, Maisonneuve P, Rotmensz N, et al. Effect of tamoxifen on venous thromboembolic events in a breast cancer prevention trial. Circulation 2005;111:650-6. 92. Eberling JL, Wu C, Tong-Turnbeaugh R, Jagust WJ. Estrogen- and tamoxifen-associated effects on brain structure and function. Neuroimage 2004;21:364-71. 93. Bender CM, Sereika SM, Brufsky AM, et al. Memory impairments with adjuvan anastrozole versus tamoxifen in women with early-stage breast cancer. Menopause 2007;14:995-8. 94. Mortimer JE, Boucher L, Baty J, et al. Effect of tamoxifen on sexual functioning in patients with breast cancer. J Clin Oncol 1999;17:1488- 92. 95. Cella D, Fallowfield L, Barker P, et al. Quality of life of postmenopausal women in the ATAC ("Arimidex", tamoxifen, alone or in combination) trial after completion of 5 years' adjuvan treatment for early breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2006;100:273-84. 96. Broman KW. The genomes of recombinant inbred lines. Genetics 2005;169:1133-46. 41 97. Pedersen T, Peters H. Proposal for a classification of oocytes and follicles in the mouse ovary. J Reprod Fertil 1968;17:555-7. 98. Parrott JA, Skinner MK. Kit-ligand/stem cell factor induces primordial follicle development and initiates folliculogenesis. Endocrinology 1999;140:4262-71. 99. Oktay K, Schenken RS, Nelson JF. Proliferating cell nuclear antigen marks the initiation of follicular growth in the rat. Biol Reprod 1995;53:295-301. 100. Siegel R, Ward E, Brawley O, Jemal A. Cancer statistics, 2011: the impact of eliminating socioeconomic and racial disparities on premature cancer deaths. CA Cancer J Clin 2011;61:212-36 101. Lawrenz B, Neunhoeffer E, Henes M, et al. Management of fertility preservation in young breast cancer patients in a large breast cancer centre. Arch Gynecol Obstet 2010;282:547-51. 102. Barbieri RL. The Breast. in: Jerome F. Strauss, Robert L. Barbieri. (eds)Yen & Jaffe's Reproductive Endocrinology. 6th edition Philadelphia: Saunders, an imprint of Elsevier Inc.; 2009. 103. Clemons M, Danson S, Howell A. Tamoxifen ("Nolvadex"): a review. Cancer Treat Rev 2002;28:165-80. 104. Lee MC, Gray J, Han HS, Plosker S. Fertility and reproductive considerations in premenopausal patients with breast cancer. Cancer Control 2010;17:162-72. 105. Poniatowski BC, Grimm P, Cohen G. Chemotherapy-induced menopause: a literature review. Cancer Invest 2001;19:641–8. 106. Badawy A, Elnashar A, El-Ashry M, Shahat M. Gonadotropin- releasing hormone agonists for prevention of chemotherapy-induced ovarian damage: prospective randomized study. Fertil Steril 2009;91:694–7. 107. Sukumvanich P, Case LD, Van Zee K, et al. Incidence and time course of bleeding after longterm amenorrhea after breast cancer treatment: a prospective study. Cancer 2010;116:3102-11. 108. Goodwin PJ, Ennis M, Pritchard KI, Trudeau M, Hood N. Risk of menopause during the first year after breast cancer diagnosis. J Clin Oncol 1999;17:2365-70. 109. Aebi S, Gelber S, Castiglione-Gertsch M, et al. Is chemotherapy alone adequate for young women with oestrogen-receptor-positive breast cancer? Lancet 2000;355:1869-74. 110. International Breast Cancer Study Group (IBCSG), Castiglione- Gertsch M, O'Neill A, Price KN, et al. Adjuvan chemotherapy followed by goserelin versus either modality alone for premenopausal lymph node-negative breast cancer: a randomized trial. J Natl Cancer Inst 2003;95:1833-46. 111. Ovarian ablation in early breast cancer: overview of the randomised trials. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group. Lancet 1996;348:1189-96. 112. Kaufmann M, Jonat W, Blamey R, et al. Survival analyses from the ZEBRA study. Goserelin (Zoladex) versus CMF in premenopausal 42 women with node-positive breast cancer. Eur J Cancer 2003;39:1711- 7. 113. De Placido S, De Laurentiis M, De Lena M, et al. A randomised factorial trial of sequential doxorubicin and CMF vs CMF and chemotherapy alone vs chemotherapy followed by goserelin plus tamoxifen as adjuvan treatment of node-positive breast cancer. Br J Cancer 2005;92:467-74. 114. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365:1687-717. 115. Gabriel CA, Domchek SM. Breast cancer in young women. Breast Cancer Res 2010;12:212. 116. Susiarjo M. Identification and characterization of estrogen mediated effect on female meiosis: Studies of bisphenolA and estrogen receptors. [internet] [cited 2013 April 21] Available from: http://etd.ohiolink.edu/send- pdf.cgi/Susiarjo%20Martha.pdf?case1158685403 117. Britt KL, Saunders PK, McPherson SJ, et al. Estrogen actions on follicle formation and early follicle development. Biol Reprod 2004;71:1712-23. 118. Solakidi S, Psarra AM, Nikolaropoulos S, Sekeris CE. Estrogen receptors alpha and beta (ERalpha and ERbeta) and androgen receptor (AR) in human sperm: localization of ERbeta and AR in mitochondria of the midpiece. Hum Reprod 2005;20:3481-7. 119. Zachos NC, Billiar RB, Albrecht ED, Pepe GJ. Developmental regulation of baboon fetal ovarian maturation by estrogen. Biol Reprod. 2002;67:1148-56. 120. Vitt UA, McGee EA, Hayashi M, Hsueh AJ. In vivo treatment with GDF-9 stimulates primordial and primary follicle progression and theca cell marker CYP17 in ovaries of immature rats. Endocrinology 2000;141:3814-20. 121. Couse JF, Korach KS. Estrogen receptor null mice: what have we learned and where will they lead us? Endocr Rev 1999;20:358-417. 122. De Vos FY, van Laarhoven HW, Laven JS, et al. Menopausal status and adjuvan hormonal therapy for breast cancer patients: a practical guideline. Crit Rev Oncol Hematol 2012;84:252-60. 123. Fornier MN, Modi S, Panageas KS, Norton L, Hudis C. Incidence of chemotherapy-induced, long-term amenorrhea in patients with breast carcinoma age 40 years and younger after adjuvan anthracycline and taxane. Cancer 2005;104:1575-9. 124. Swain SM, Land SR, Ritter MW, et al. Amenorrhea in premenopausal women on the doxorubicin-and-cyclophosphamide- followed-by-docetaxel arm of NSABP B-30 trial. Breast Cancer Res Treat. 2009;113:315-20. 125. Roshangar L, Rad JS, Afsordeh K. Maternal tamoxifen treatment alters oocyte differentiation in the neonatal mice: inhibition of oocyte 43 development and decreased folliculogenesis. J Obstet Gynaecol Res 2010;36:224-31. 126. Balasinor N, Gill-Sharma MK. Effect of paternal administration of an antiestrogen, tamoxifen on embryo development in rats. Mol Cell Endocrinol 2002;190:159-66. 127. Balasinor N, Parte P. Effect of tamoxifen on sperm fertilising ability and preimplantation embryo development. Mol Cell Endocrinol 2001;178:199-206. 128. Warne GL, Fairley KF, Hobbs JB, Martin FI. Cyclophosphamide- induced ovarian failure. N Engl J Med 1973 Nov;289:1159-62. 129. Nicosia SV, Matus-Ridley M, Meadows AT. Gonadal effects of cancer therapy in girls. Cancer 1985 May;55:2364-72. 130. Siris ES, Leventhal BG, Vaitukaitis JL. Effects of childhood leukemia and chemotherapy on puberty and reproductive function in girls. N Engl J Med 1976;294:1143-6. 131. Bakri YN, Pedersen P, Nassar M. Normal pregnancy after curative multiagent chemotherapy for choriocarcinoma with brain metastases. Acta Obstet GynecolScand 1991;70:611-3. 132. Hershlag A, Schuster MW. Return of fertility after autologous stem cell transplantation. Fertil Steril 2002;77:419-21. 44 Ekler Ek-1: Kısaltmalar AMH: Antimülleriyan hormon PGH: Primordiyal germ hücresi FSH: Folikül stimülan hormon LH: Luteinizan hormon MIS: Müller inhibe edici madde OIM: oosit mayoz inhibitörü POF: Prematüre ovarian failure AFS: Antral folikül sayımı HCG: human chorionic gonadotropin TGF-B: transforming growth faktör B ER: östrojen reseptörü 45 TEŞEKKÜR Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı’nda aldığım uzmanlık eğitimim süresince yardımlarını esirgemeyen, tez danışmanım ve değerli hocam Doç. Dr. Kemal ÖZERKAN’a en içten teşekkür ve saygılarımı sunarım. Araştırma süresince büyük yardımlarını gördüğüm, bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım, Histoloji-Embriyoloji ABD öğretim üyesi Sayın Prof. Dr. Berrin ZIK'a araştırma boyunca anlayış ve rehberliği için en derin teşekkürlerimi sunarım. Farmakoloji ABD öğretim üyesi Doç. Dr. Mehmet CANSEV'e, Histoloji-Embriyoloji ABD Arş. Gör. Sabire PEKER'e yardımlarından dolayı ayrıca teşekkür ederim. Tez projemi destekleyerek bana maddi olanak sağlayan U.Ü Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne; Uzmanlık eğitimim boyunca bilgi ve tecrübelerinden yararlandığım, Prof. Dr. Şakir KÜÇÜKKÖMÜRCÜ, Prof. Dr. Candan CENGİZ, Prof. Dr. Mehpare TÜFEKÇİ, Prof. Dr. Ahmet ESMER, Prof. Dr. Hakan OZAN, Prof. Dr. Gürkan UNCU, Prof. Dr. Osman DEVELİOĞLU, Prof. Dr. Tufan BİLGİN, Prof. Dr. Yalçın KİMYA, Doç. Dr. M. Barış ATA, Yrd. Doç. Dr. Bilge ÇETİNKAYA DEMİR ve Yrd. Doç. Dr. M. Aral ATALAY’a; birlikte çalışmaktan zevk aldığım asistan arkadaşlarıma, klinik-poliklinik hemşire ve çalışanlarına; Sevgili eşime, canım kızıma, bugünlere gelmemde emeği olan tüm hocalarıma ve bana her türlü eğitim ve öğrenim olanağı sunan aileme sonsuz teşekkür ederim. Dr Ayşe TOPCU AKDUMAN Bursa-2013 46 ÖZGEÇMİŞ 12 Aralık 1977 tarihli, Kayseri doğumluyum. İlk, Orta ve Liseyi Sivas’da tamamladıktan sonra İnönü Üniversitesi, Tıp Fakültesi’ne kaydoldum. 2003 yılında mezun olduktan sonra, İstanbul Büyükşehir Belediyesi Kayışdağı Darülaceze, Kocaeli 2 nolu F Tipi Yüksek Güvenlikli Kapalı Ceza İnfaz Kurumu, Üsküdar Paşakapısı Kadın Kapalı Ceza İnfaz Kurumu’nda doktor olarak görev yaptım. 2005-2008 yılında Haydarpaşa Numune Eğitim Ve Araştırma Hastanesinde İç Hastalıkları AD’da araştırma görevlisi olarak çalıştım. 2008 yılından beri, Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum AD’da araştırma görevlisi olarak çalışmaktayım. Yabancı dilim İngilizce olup, evli ve bir çocuk annesiyim. 47