MİYOGLOBİN TAYİNİNE YÖNELİK MOLEKÜLER BASKILANMIŞ YÜZEY PLAZMON REZONANS BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI BİLGEN OSMAN TEZ ONAYI Bilgen Osman tarafından hazırlanan “ Miyoglobin tayinine yönelik moleküler baskılanmış yüzey plazmon rezonans biyosensör hazırlanması” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü tarafından Kimya Anabilim Dalın’da DOKTORA TEZİ olarak kabül edilmiştir. Danışman : Prof.Dr.Necati Beşirli İkinci Danışman : Prof.Dr.Adil Denizli Başkan: Prof.Dr.Necati Beşirli İmza U.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye: Prof.Dr.Rıdvan Say İmza A.Ü. Fen Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye: Prof.Dr.Gazi İrez İmza U.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye: Prof.Dr.Veysel Turan Yılmaz İmza U.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye: Prof.Dr.Rahmi Bilaloğlu İmza U.Ü. Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof.Dr.Kadri ARSLAN Enstitü Müdürü …./…./….. T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MİYOGLOBİN TAYİNİNE YÖNELİK MOLEKÜLER BASKILANMIŞ YÜZEY PLAZMON REZONANS BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI BİLGEN OSMAN Prof.Dr.Necati BEŞİRLİ (Danışman) DOKTORA TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI BURSA 2011 Her hakkı saklıdır U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında ; - tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, - görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, - başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfa bulunduğumu, - atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, - kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, - ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 31/05/2011 İmza Bilgen OSMAN ÖZET Doktora tezi MİYOGLOBİN TAYİNİNE YÖNELİK MOLEKÜLER BASKILANMIŞ YÜZEY PLAZMON REZONANS BİYOSENSÖR HAZIRLANMASI Bilgen OSMAN Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof.Dr. Necati Beşirli 2. Danışman: Prof.Dr.Adil Denizli Bu çalışmada, moleküler baskılama tekniğinin yeni bir yaklaşımı olan mikro-temas baskılama yöntemi kullanılarak yüzey plazmon rezonans (SPR) miyoglobin sensör hazırlandı. Bu amaçla SPR çip yüzeyinde miyoglobin tanıma bölgelerine sahip poli( hidroksietil metakrilat- metakriloil-amidotriptofan metil ester) [poli(HEMA-MATrp)] polimeri ince bir film halinde sentezlendi. Fonksiyonel monomer olarak metakriloil- amidotriptofan metil ester (MATrp) kullanıldı ve metakriloil klorür ile L-triptofan metil esterin reaksiyonu ile sentezlendi. MATrp monomerinin karakterizasyonunda FTIR ve NMR teknikleri kullanıldı. Baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film miyoglobinin varlığında MATrp, hidroksietil metakrilat (HEMA) ve etilen glikol dimetakrilatın (EGDMA) polimerizasyonu ile hazırlandı. Kontrol deneyleri için baskılanmamış poli(HEMA-MATrp), kalıp molekül miyoglobin olmadan sentezlendi. Poli(HEMA- MATrp) filmin hazırlanmasında kullanılan modifye altın ve cam yüzeyleri ile miyoglobin baskılanmış film; FTIR, temas açısı ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) teknikleri kullanılarak karakterize edildi. Ayrıca hazırlanan filmin kalınlığı elipsometri yöntemiyle ölçüldü. Hazırlanan sensörün etkinliği SPR sistemi kullanılarak araştırıldı. Optimum polimerizasyon koşullarının belirlenmesinden sonra baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensörün miyoglobin tayin duyarlılığı, miyoglobin çözeltileri (pH 7,4 fosfat tamponunda) ve kalp krizi geçiren hasta plazması kullanılarak araştırıldı. Plazma örneklerindeki miyoglobin derişimi ELISA yöntemi ile kıyaslandığında % 66 doğrulukla belirlendi. Farklı derişimdeki miyoglobin çözeltileri ile elde edilen veriler adsorpsiyon kinetiğinin belirlenmesinde kullanıldı. Langmuir adsorpsiyon modelinin, bu afinite sistemi için en uygun model olarak bulundu. Tayin limiti 87,6 ng/mL olarak belirlendi. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün seçiciliğini göstermek için miyoglobin, lizozim, sitokrom c ve sığır serum albumininin (BSA) yarışmalı adsorpsiyonu araştırıldı. Elde edilen sonuçlar, baskılanmış sensörün miyoglobin için yüksek seçiciliğe ve duyarlılığa sahip olduğunu gösterdi. Anahtar Kelimeler: Moleküler baskılama, yüzey plazmon rezonans, miyoglobin, biyosensör 2011, xiii + 210 sayfa i ABSTRACT PhD Thesis DEVELOPMENT OF MOLECULAR IMPRINTED SURFACE PLASMON RESONANCE BIOSENSOR FOR MYOGLOBIN DETERMINATION Bilgen OSMAN Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof.Dr. Necati Beşirli 2nd Supervisor: Prof.Dr.Adil Denizli In this study, surface plasmon resonance (SPR) myoglobin sensor was prepared by using micro-contact imprinting method, a new approach of molecular imprinting. For this purpose, poly(hyroxyethyl methacrylate- methacryloyl-amidotryptophane methyl ester) [poly(HEMA-MATrp)] was synthesized on surface of SPR chip as a thin film. Methacryloyl-amidotryptophane methyl ester (MATrp) was used as functional monomer and synthesized with reaction between methacryoyl chloride and L- tryptophane methyl ester. Characterization of MATrp was made by FTIR and NMR techniques. Imprinted film was prepared with polymerization of MATrp, hydroxyethyl methacrylate (HEMA) and ethyleneglycol dimethacrylate (EGDMA) in the presence of myoglobin. Non-imprinted poly(HEMA-MATrp) was also synthesized without miyoglobin for control experiments. Modified gold and glass surfaces which were used in the preparation of poly (HEMA-MATrp) film and myoglobin imprinted film were characterized with FTIR, contact angle, atomic force microscopy (AFM) and scanning electron microscopy (SEM). In addition, the thickness of the film was measured with ellipsometry. The effectiveness of sensor was investigated by using SPR system. After the determination of optimal polymerization conditions, myoglobin sensing ability of imprinted and non-imprinted sensors were determined with myoglobin solutions (in pH 7,4 phosphate buffer) and in the plasma taken from a patient with myocardial infarction. Compared with the ELISA method, myoglobin concentration in the sample was determined 66% accuracy. Myoglobin solutions with different concentrations were used to determine the adsorption kinetics. Langmuir adsorption model was found as the most suitable model for this affinity system. The detection limit was found as 87,6 ng/mL. In order to show the selectivity of the myoglobin imprinted poly(HEMA-MATrp) sensor, competitive adsorption of myoglobin, lysozyme, cytochrome c and bovine serum albumin (BSA) was investigated. The results show that the imprinted sensor has high selectivity and sensitivity for myoglobin. Key words: Molecular imprinting, surface plasmon resonance, myoglobin, biosensor 2011, xiii + 210 pages ii ÖNSÖZ VE TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca bana her türlü imkanı sağlayan, hiçbir desteğini esirgemeyen ve en önemlisi bana güvenen danışman hocam Sayın Prof.Dr. Necati Beşirli’ye teşekkür ederim. Her zaman ve her konuda beni destekleyen ve ufkumu açan yardımcı danışman hocam Sayın Prof.Dr.Adil Denizli’ye en içten teşekkürlerimi sunarım. Araş.Gör.Dr.Hasene Mutlu, Araş.Gör Yeliz Faturacı ve Araş.Gör.Dr.Elif Tümay ÖZER başta olmak üzere tüm araştırma görevlisi arkadaşlarıma bana verdikleri bilimsel destek ve güzel dostlukları için teşekkürü borç bilirim. Hacettepe Üniversitesi Kimya Bölümü Biyokimya Anabilim Dalı Araştırma Görevlileri Erkut Yılmaz ve Gülsu Şener’e yardımları için teşekkürler. Beni her zaman anlayışla karşılayan eşim Dr. Erdinç Osman’a, her zaman ayakta durmamı sağlayan en değerli varlığım annem Melahat Civan’a, ve zamanlarını çaldığım biricik yavrularım Beril ve Orkun Osman’a sonsuz sevgilerimi sunuyorum. Bilgen OSMAN 30.05.2011 iii SİMGELER ve KISALTMALAR Kısaltmalar MIP Moleküler Baskılanmış Polimerler QCM Quartz Kristal Mikroterazi SPR Yüzey Plazmon Rezonans CK Kreatin Kinaz CK-MB Kreatin Kinaz İzoenzim Miyokardial Band MATrp Metakriloil-Amidotriptofan Metil Ester AAm Akrilamid BisA Bisakrilamid MAA Metakrilik Asit BSA Sığır Serum Albumini SDS Sodyum Dodesil Sülfat APTES 3-Aminopropil-trietoksisilan HEMA Hidroksietil Metakrilat EGDMA Etilen Glikol Dimetakrilat VBIDA N-(4-vinil-benzil) İminodiasetik Asit RNAase Ribonükleaz A ABPA 3-Aminofenil Boronik Asit CD Sirküler Dikroizm HSA İnsan Serum Albumini TEGDMA Tetraetilen Glikol Dimetakrilat MMA Metil Metakrilat RIA Radyoimmünoassay ELISA Enzim Bağlı İmmunosorbent Assay IAA İmmünoaglutinasyon Assay FIA Flüoresans İmmünoassay ATR Toplam İç Yansıma GM1 Gangliozid GM1 NAD+ β-nikotinamid Adenin Dinükleotid NADP+ β-nikotinamid Adenin Dinükleotid Fosfat T-SPR Transmisyon Yüzey Plazmon Rezonans Spektroskopisi DPDPE δ-Opiod G-Protein Bağlı Reseptör Anagonisti MI Miyokardiyal İnfarktüs ACE Anjiyotensin-Dönüştürücü Enzim WHO Dünya Sağlık Örgütü AFM Atomik Kuvvet Mikroskobu SAM Self-Assembled Monolayer SEM Taramalı Elektron Mikroskobu iv ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1.1.2.1. Antibadi-antijen arasında gerçekleşen tanıma 8 Şekil 2.1.1.2.2. Antijenlerin antibadilerin bağlanma bölgesindeki uygun (a) boşluklara (b) yarıklara ya da (c) yüzeylere bağlanması 9 Şekil 2.1.2.1. Moleküler baskılama metodunun şematik gösterimi 11 Şekil 2.1.3.1. (a) Kovalent olmayan (b) Kovalent moleküler baskılama yönteminin şematik gösterimi 13 Şekil 2.1.3.2. Kovalent olmayan baskılamada kullanılan bazı fonksiyonel monomerler 17 Şekil 2.1.3.3. Yaygın olarak kullanılan çapraz bağlayıcılar 19 Şekil 2.1.3.4. Moleküler baskılamada kullanılan başlatıcılar 21 Şekil 2.1.4.1.2.1. Epitop yaklaşımının şematik gösterimi 31 Şekil 2.1.4.1.2.2. Protein baskılanmış film kullanarak epitop baskılama (a) Cam modifikasyon ve peptid bağlama metodu (b) MIP oluşumunun gösterimi (c) C-terminal peptid sekansı baskılanmış yüzeyde için öngörülen tanıma mekanizması 32 Şekil 2.1.4.1.3.1. Yüzey baskılanmış nanotellerin hazırlanmasına ait şematik gösterim 35 Şekil 2.1.4.1.3.2. Protein immobilizasyonunun şematik gösterimi 36 Şekil 2.1.4.1.3.3. Kristal lizozim kullanılarak yüzey plazmon rezonans çip yüzeyinde baskılanmış polimer hazırlanması 40 Şekil 2.1.4.1.3.4. Mikrotemas baskılama yönteminin şematik gösterimi 41 Şekil 2.1.5.1. Bir biyosensörün yapısı ve bileşenleri 44 Şekil 2.5.1.2.1. (A) Antibadi temelli sensör (B) MIP temelli biyomimetik sensörün çalışma prensibi 48 Şekil 2.2.1. Yüzey plazmonlarının uyarılması 52 Şekil 2.2.2. Sensogram: zamana karşı SPR açısının değişimi 53 Şekil 2.2.1.1.1. α geliş açısına sahip ışığın kırılma indisleri n1 ve n2 olan iki materyalin arayüzeyindeki kırınımı 55 Şekil 2.2.1.3.1. Yüzey plazmonlarının dağılım eğrileri 58 Şekil 2.1.3.2. Farklı uyarılma dalga boyları için 46 nm kalınlığındaki gümüş (kesikli) ve altın (kesiksiz) tabaka ile düşük refraktif indeksli taraf su olmak üzere SPR minimumları 59 Şekil 2.2.2.1. SPR sisteminteki 3 ana bölümün şematik gösterimi: (1) SPR optik, (2) sıvı sistem, (3) sensör çip 60 Şekil 2.2.2.2. Yüzey plazmonlarının uyarılmasında kullanılan Kretschmann konfigürasyonu 61 Şekil 2.4.1. Damardaki aterosklerozun zaman içinde ilerlemesi: (A ve B), önemli darlık oluşturması (C), ve sonunda tıkanarak (D) kalp krizine yol açması 76 Şekil 2.5.1. Kalp krizinin teşhisinde kullanılan biyomarker proteinler ve serum düzeylerinin zamana göre değişimi 84 Şekil 2.6.1. İspermeçet Balinası (Physeter catodon) miyoglobininin yapısı 87 v Şekil 2.6.2. Miyoglobinin hidrofobik ve hidrofilik yönlenmelerini gösteren yapı. Hem grubu (turuncu,sarı), proksimal ve distal (sarı) histidinler ve miyogloin ana yapısı. Hidrofobik rezdüler (beyaz) , polar ve yüklü rezidüler (mavi) 87 Şekil 2.6.3. (a) Hem grubu ve (b) miyoglobin molekülündeki bağlanma 88 Şekil 3.2.3.1.1.1. Cam slaytların temizlenmesi 91 Şekil 3.2.3.1.2. (a) Cam yüzeyin APTES ve glutaraldehid ile modifikasyonu (b) Cam yüzeyine miyoglobin bağlanması 94 Şekil 3.2.3.2.1. GWC SPRimager II sisteminde kullanılan SPRchipTM altın çip 96 Şekil 3.2.3.2.2. (a) Altın yüzeyinin modifikasyonu (b) Allil gruplarının yönlenmesi 96 Şekil 3.2.4.1. Yüzey plazmon rezonans çip yüzeyinde polimerik film hazırlanması 97 Şekil 3.2.6.1.1 SPRimager II (GWC Technologies, Madison, ABD) yüzey plazmon rezonans sistemi 100 Şekil 3.2.6.1.2. SPRimager II sisteminin (a) çalışma ve (b) sensogram oluşturma prensibi 101 Şekil 3.2.6.1.3. GWC SPRimager II cihazının temel ekipmanları 102 Şekil 3.2.6.1.4. Örnek hücresinin hazırlanması (a) yüzey plazmon rezonans çipin örnek tutucuya yerleştirilmesi (b) akış hücresinin takılması (c) giriş ve çıkış uçlarının yerleştirilmesi (d) prizma ve akış hücresinin bir araya getirilmesiyle örnek hücresinin hazırlanması 103 Şekil 4.1.1. MATrp monomerinin sentez reaksiyonu 106 Şekil 4.2.1.1. Altın yüzeyinde SAM oluşumunun şematik gösterimi 107 Şekil 4.1.2. MATrp’nin 1H-NMR spektrumu 108 Şekil 4.1.3. MATrp monomerinin FT-IR spektrumu 109 Şekil 4.2.1.2. Oktadekantiyol kullanılarak hazırlanan altın yüzeye ait IR spektrumu (C-H gerilme bölgesi) 110 Şekil 4.2.1.3. Allil merkaptan kaplanmış altın çipe ait speküler reflektans FTIR spektrumu (sıyırma açısı 800) (a) spektrum (b) 2650-3100 cm-1 aralığının yakından görünüşü 112 Şekil 4.3.1. (a) Cam yüzeyin APTES ile modifikasyonu (b) APTES modifiye camın glutaraldehid aktivasyonu (c) Miyoglobinin modifiye cam yüzeyine kovalent olarak bağlanması 116 Şekil 4.3.2.1. Cam slaytların su ile temas açısı ölçümleri; (a) Asidik pirana ile temizlenmiş cam yüzeyi, (b) APTES ile modifiye edilmiş cam yüzeyi (c) APTES + glutaraldehid ile modifiye edilmiş cam yüzeyi (d) Miyoglobin bağlanmış cam (protein damgası) 120 Şekil 4.3.2.2. APTES ve glutaraldehid ile modifiye edilmiş cam yüzeyin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (1 x 1 µm2) 121 Şekil 4.3.2.3. Miyoglobin bağlanmış modifiye cam yüzeyin (protein damgası) yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (1 x 1 µm2) 122 vi Şekil 4.4.1.1. Farklı oranlarda MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımları ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP) ve baskılanmamış (NIP) poli(HEMA-MATrp) sensörler ile elde edilen %∆R ve baskılama faktörü (%∆RMIP/%∆RNIP) değerleri 124 Şekil 4.4.1.2. 1:1:1 mol oranında MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımları ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) poli(HEMA-MATrp) sensör ile 10 000 ng/mL derişimindeki miyoglobin çözeltilerinin etkileştirilmesi sonucu elde edilen sensogramlar 125 Şekil 4.4.1.3. 1:1:3 mol oranında MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımları ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) poli(HEMA-MATrp) sensör ile 10 000 ng/mL derişimindeki miyoglobin çözeltilerinin etkileştirilmesi sonucu elde edilen sensogramlar 125 Şekil 4.4.1.4. 1:1:5 mol oranında MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımları ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) poli(HEMA-MATrp) sensör ile 10 000 ng/mL derişimindeki miyoglobin çözeltilerinin etkileştirilmesi sonucu elde edilen sensogramlar 126 Şekil 4.4.1.5. 1:1:6 mol oranında MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımları ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) poli(HEMA-MATrp) sensör ile 10 000 ng/mL derişimindeki miyoglobin çözeltilerinin etkileştirilmesi sonucu elde edilen sensogramlar 126 Şekil 4.4.2.1. Poli(HEMA-MATrp) filmin kimyasal yapısı 127 Şekil 4.4.2.2. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR spektrumu 129 Şekil 4.4.2.3. Poli(MATrp) ve poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR spektrumu 130 Şekil 4.4.2.4. Poli(HEMA) ve poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR spektrumu 131 Şekil 4.4.2.5. Poli(EGDMA) ve poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR spektrumu 132 Şekil 4.4.3.1. Katı yüzeyinde temas açısının oluşumu 133 Şekil 4.4.3.2. Su ile temas açısı ölçümleri; (a) altın yüzey, (b) allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey, (c) miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulan altın yüzey (d) miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulan altın yüzey 135 vii Şekil 4.4.3.3. Etilen glikol ile temas açısı ölçümleri; (a) altın yüzey, (b) allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey, (c) miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulan altın yüzey, (d) miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulan altın yüzey 136 Şekil 4.4.4.1. Modifiye edilmemiş altın çipin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (2 x 2 µm2) 139 Şekil 4.4.4.2. Allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın çipin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (2 x 2 µm2) 140 Şekil 4.4.4.3. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulmuş altın çipin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (5 x 5 µm2) 141 Şekil 4.4.4.4. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulmuş altın çipin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (2 x 2 µm2) 142 Şekil 4.5.1. Miyoglobin çözeltileri ile poli(HEMA-MATrp) sensör arasındaki etkileşimlere ait sensogramlar 144 Şekil 4.4.6.1. (a) Altın yüzeyi (b) miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) yüzeye ait SEM görüntüleri (c) kesit görüntüsü 145 Şekil 4.5.2. Miyoglobin derişimi ile % ∆R arasındaki ilişki 146 Şekil 4.5.3. 100-1000 ng/mL aralığında miyoglobin derişimi ile % ∆R arasındaki ilişki 147 Şekil 4.6.1. Kinetik hız sabitlerinin belirlenmesi. (a) Denge analiz yaklaşımı; (b) Bağlanma kinetik yaklaşımı 151 Şekil 4.7.1. Adsorpsiyon modelleri. (a) Langmuir; (b) Freundlich; (c) Langmuir-Freundlich 153 Şekil 4.8.1 1000 ng/mL derişiminde miyoglobin, lizozim, sitokrom c ve sığır serum albumini (BSA) proteinlerinin kullanılmasıyla oluşturulan çözeltiler ile miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör arasındaki etkileşimlere ait sensorgramlar: (a) Miyoglobin, (b) Lizozim, (c) Sitokrom c, (d) BSA, (e) BSA-Sitokrom c, (f) BSA-Lizozim, (g) BSA- Miyoglobin, (h) Sitokrom c-Miyoglobin, (i) Lizozim-Sitokrom c, (j) Miyoglobin-Lizozim, (k) BSA-Sitokrom c, (l) BSA-Sitokrom c-Miyoglobin, (m) Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c, (n) BSA-Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c 157 viii Şekil 4.9.1. 1000 ng/mL derişiminde miyoglobin, lizozim, sitokrom c ve sığır serum albumini (BSA) proteinlerinin kullanılmasıyla oluşturulan çözeltiler ile miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensör arasındaki etkileşimlere ait sensorgramlar: (a) Miyoglobin, (b) Lizozim, (c) Sitokrom c, (d) BSA, (e) BSA-Sitokrom c, (f) BSA-Lizozim, (g) BSA- Miyoglobin, (h) Sitokrom c-Miyoglobin, (ı) Lizozim-Sitokrom c, (j) Miyoglobin-Lizozim, (k) BSA-Sitokrom c, (l) BSA-Sitokrom c-Miyoglobin, (m) Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c, (n) BSA-Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c 165 Şekil 4.10.1. 1000 ng/mL derişimde miyoglobin ile yapılan kinetik analiz ve rejenerasyon 175 Şekil 4.10.2. Poli(HEMA-MATrp) sensörün tekrar kullanımı 176 Şekil 4.11.1. Kör örnek ve 300, 500, 700, 900, 1000 ng/mL miyoglobin derişimindeki kan örneklerinin poli(HEMA-MATrp) ile etkileştirilmesi ile elde edilen sensogram 178 Şekil 4.11.2. Standart katma metodu ile elde edilen miyoglobin derişimi sinyal grafigi 178 Şekil 4.11.3. Standart katma metodu ile elde edilen miyoglobin derişimi/ %∆R grafigi 179 ix ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1. Sensörlerde kullanılan doğal biyomoleküller ile moleküler baskılanmış polimerlerin kıyaslanması 3 Çizelge 2.1.3.1. Kovalent olmayan baskılamadaki etkileşim türleri ve tahmin edilen bağ enerjileri 14 Çizelge 2.1.5.2.1. Farklı transdüser prensiplerini kullanan MIP temelli sensör örnekleri 50 Çizelge 2.3.1.1. MIP temelli SPR sensörlerin analitik karakteristikleri 68 Çizelge 2.5.1. Miyokardiyal infarktüs tanısında kullanılan biyolojik belirteçler 85 Çizelge 3.2.5.2.1. Yüzey enerjilerini hesaplamada kullanılan sabitler 98 Çizelge 4.3.1.1. Cam yüzeylerine ait temas açısı değerleri 117 Çizelge 4.4.1.1. Farklı oranlarda MATrp:HEMA:EGDMA oranları ile hazırlanan baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensör için elde edilen baskılama faktörü değerleri 124 Çizelge 4.4.3.1. Altın yüzey, allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey, miyoglobin baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film hazırlanmış altın yüzeylerin su ve etilen glikol ile elde edilen temas açıları ve birim alandaki yüzey enerjileri 142 Çizelge 4.6.1. Kinetik hız sabitleri 152 Çizelge 4.7.1. Langmuir, Freundlich ve Langmuir-Freundlich parametreleri 154 Çizelge 4.8.1. Kalıp ve yarışmacı proteinlerin molekül ağırlığı, izoelektrik nokta ve moleküler boyutları 156 Çizelge 4.9.1. Miyoglobine göre BSA, sitokrom c ve lizozim için seçicilik ve bağıl seçicilik kat sayıları 173 x İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET i ABSTRACT ii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ iv ŞEKİLLER DİZİNİ v ÇİZELGELER DİZİNİ x 1.GİRİŞ 1 2.KAYNAK ÖZETLERİ 6 2.1. Moleküler Tanıma 7 2.1.1. Doğal tanıma sistemleri 7 2.1.1.1. Proteinlerde moleküler tanıma 7 2.1.1.2. Bağışıklık sistemde moleküler tanıma 8 2.1.1.3. Sentetik polimerik matrikslerde moleküler tanıma 10 2.1.2. Moleküler baskılama 10 2.1.3. Moleküler baskılanmış polimer hazırlamada kullanılan yaklaşımlar 12 2.1.4. Protein baskılama 22 2.1.4.1. Protein baskılamada kullanılan yaklaşımlar 22 2.1.4.1.1. Kütle (Yığın) polimerizasyonu ile protein baskılama 23 2.1.4.1.1.1. Akrilatlar 23 2.1.4.1.1.2. Hidrojeller 27 2.1.4.1.1.3. Sol-jeller 29 2.1.4.1.2. Epitop yaklaşımı 30 2.1.4.1.3. Yüzey baskılama 32 2.1.5. Biyosensörler 43 2.1.5.1. Moleküler tanıma katmanı 45 2.1.5.1.1. Antibadiler 45 2.1.5.1.2. İmmünosensörlerde kullanılan alternatif tanıma elementleri 46 2.1.5.2. Biyosensörlerde kullanılan transdüserler 49 2.2. Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) 51 2.2.1. Yüzey plazmon rezonans olayının teorisi 53 2.2.1.1. Kaybolan dalga 54 2.2.1.2. Yüzey plazmonları 56 2.2.1.3. Yüzey plazmonlarının uyarılması 57 2.2.2. Yüzey plazmon rezonans sistemi 60 2.2.3. Yüzey plazmon rezonans tekniğinin klinik tanı amaçlı kullanımı 62 2.3. Moleküler Baskılanmış Polimerler ve Optik Sensör Uygulamaları 63 2.3.1. MIP temelli yüzey plazmon rezonans sensörler 67 2.4. Kalp Krizi 76 2.4.1. Kalp krizinin nedeni ve belirtileri 77 2.4.2. Kalp krizinin teşhisi ve tedavisi 79 2.4.3. Hastalığın seyri ve önlenmesi 82 2.5. Kalp Krizinin Teşhisinde Kullanılan Biyolojik Belirteçler 82 2.6. Miyoglobin 86 3. MATERYAL ve YÖNTEM 89 3.1. Materyal 89 3.2. Yöntem 90 xi 3.2.1. Metakriloil-amidotriptofan metil ester (MATrp) monomerinin sentezi 90 3.2.2. MATrp monomerinin karakterizasyonu 90 3.2.2.1. FTIR analizi 90 3.2.2.2. NMR analizi 90 3.2.3. Miyoglobin baskılanmış yüzey plazmon rezonans sensörün hazırlanması 91 3.2.3.1. Cam slaytların yüzey modifikasyonu 91 3.2.3.1.1. Cam slaytların temizlenmesi 91 3.2.3.1.2. Protein kalıbının hazırlanması 92 3.2.3.1.3. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) analizi 92 3.2.3.1.4. Temas açısı analizi 95 3.2.3.2. SPR altın çip yüzeylerinin modifikasyonu 95 3.2.3.2.1. Speküler reflektans FTIR analizi 95 3.2.4. SPR çip yüzeyinde poli(HEMA-MATrp) filmin sentezi 96 3.2.5. Poli(HEMA-MATrp) SPR çiplerin yüzey karakterizasyonu 98 3.2.5.1. FTIR-ATR analizi 98 3.2.5.2. Temas açısı analizi 98 3.2.5.3. AFM analizi 99 3.2.5.4. Elipsometre 99 3.2.6. Yüzey plazmon rezonans sistemi ile ölçümler 99 3.2.6.1. SPR sisteminin analiz için hazırlanması 99 3.2.6.2. Yüzey plazmon rezonans sistemi ile sensogram alınması 101 3.2.7. Yüzey plazmon rezonans sistemi ile kinetik analizler 104 3.2.7.1. Yarışmalı kinetik analizler 104 3.2.7.2. Poli(HEMA-MATrp) sensörün baskılama seçiciliğinin belirlenmesi 104 3.2.8. Kan örneği ile analizler 104 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 106 4.1. MATrp Monomerinin Sentezi ve Karakterizasyonu 106 4.2. Altın Yüzey Modifikasyonunun Karakterizasyonu 107 4.2.1. FTIR analizi 107 4.3. Cam Yüzey Modifikasyonunun Karakterizasyonu 111 4.3.1. Temas açısı analizi 115 4.3.2. AFM analizi 117 4.4. Miyoglobin Baskılanmış Poli(HEMA-MATrp) Sensörün Hazırlanması ve Karakterizasyonu 118 4.4.1. Polimerizasyon karışımının optimizasyonu 123 4.4.2. Poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR analizi 127 4.4.3. Temas açısı analizi 128 4.4.4. AFM analizi 138 4.4.5. Elipsometri analizi 143 4.4.6. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizi 143 4.5. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) SPR sensör ile kinetik analizler 144 4.6. Denge ve Bağlanma Kinetik Analizleri 148 4.7. Denge İzoterm modelleri 152 4.8. Yarışmalı Kinetik Analizler 155 4.9. Poli(HEMA-MATrp) Sensörün Baskılama Seçiciliği 164 4.10. Poli(HEMA-MATrp) SPR Sensörün Tekrar Kullanımı 174 4.11. Kan Örneği ile Kinetik Analizler 176 5. SONUÇ 180 xii KAYNAKLAR 185 EKLER 202 EK 1 203 EK 2 208 ÖZGEÇMİŞ 210 xiii 1.GİRİŞ Günümüzde tedavisi olmayan, ölümcül ya da nedeni anlaşılamamış bir çok hastalık vardır. Bu hastalıkların çoğunda (alzheimer, diabet, kanser vb.) temel sebep genellikle bilinmemekte veya hastalığın tedavisinin yapılabileceği süre içerisinde belirlenememektedir. Günümüzde hastalıklara neden olan kimyasal mekanizmayı anlamak için erken teşhise olanak verecek olan ve “biomarker” olarak adlandırılan protein ve/veya hormonları belirlemek, tedavi ve aşılar geliştirmek amacıyla yoğun çaba harcanmaktadır. Canlı organizmada 20 000 kadar gen bulunmakta ve bu genler yaklaşık 150 000 farklı proteini kodlamaktadır. Sağlıklı bireyler ile karşılaştırıldığında vücut sıvıları ya da dokularda bazı proteinlerin varlığı, yokluğu veya farklı modifikasyonlarının ortaya çıkması hastalıkların teşhisi açısından büyük önem taşımaktadır. Bu amaçla düşük tayin sınırları olan, biyomolekülleri kompleks karışımlardan (kan, tükrük, idrar vb.) ucuz ve seçici olarak analiz edebilen, ve aynı anda fazla sayıda örneği inceleyebilecek yöntemlere ihtiyaç vardır. Günümüz laboratuvarlarında biyolojik sıvılarda bulunan bir çok analitin kantitatif tayini antibadi-antijen etkileşimine dayanan immunolojik testler ile yapılmaktadır. Hibridoma hücre teknolojisinin gelişmesiyle monoklonal antibadilerin üretimindeki ilerlemeler ve tayin sistemlerindeki gelişmeler sayesinde yüksek hassasiyete ve seçiciliğe sahip immunolojik testler geliştirilmiştir. Fakat antibadi üretiminde hayvanların kullanılması bazı alanlarda endişe ile karşılanmakta alternatif yöntemlerin geliştirilmesi için çaba harcanmaktadır. Antibadilere dayanan testler kullanılan biyolojik tanıma elementleri nedeniyle bazı temel sınırlamalara sahiptir. Kimyasal ve fiziksel olarak dayanıksız olmaları nedeniyle antibadilerin depolanma süreleri sınırlıdır. Daha da ötesi küçük molekül olması durumunda bağışıklık cevabın alınabilmesi için antijen kendisi immunojenik olmadığından taşıyıcı hapten bir kalıntının eklenmesi gerekmektedir. Seçilen hapten türevine göre immunizasyon işlemi farklı özellik ve afinitede antibadilerin oluşmasına neden olmaktadır. Daha kararlı antibadilerin geliştirilmesi için bir çok çalışma (antibadi 1 fragmentleri, rekombinant antibadiler v.b) yapılmasına rağmen mevcut teknikler zaman ve maliyet açısından yeterli değildir (Nathalie ve ark. 2004). Son yıllarda yapılan çalışmalar ile hedef moleküllere biyolojik karşılığı olan moleküller ile aynı afinite ve seçicilikle bağlanabilen moleküler baskılanmış polimerler (MIP) hazırlanabilmektedir. Moleküler baskılanmış polimerler kararlı ve sağlamdır. Hedef molekülü tanıma kapasiteleri asitler, bazlar, organik çözücüler ile muameleden ya da sıcaklık değişimlerinden etkilenmemektedir. Bu benzersiz fiziksel ve kimyasal kararlılıkları moleküler baskılanmış polimerlerin, antibadilerin kullanılamadığı bir çok durumda kullanımına olanak sağlamaktadır. Moleküler baskılanmış polimerlerin immuno tayinlerde kullanılan biyolojik antibadilere göre birçok avantajı vardır: 1) Küçük moleküller için antibadi seçmek ve üretmek zordur. (Antibadiler inokülasyondan önce taşıyıcı bir protein üzerine bağlanmalıdır). Ancak bu tür moleküller moleküler baskılama için en uygun bileşiklerdir. 2) Yüksek toksisiteye sahip bileşikler ya da immunolojik baskılayıcılar için doğal bir antibadinin elde edilmesi çok zordur. Fakat moleküler baskılamada bu tür analitler için herhangi bir sorun yoktur. 3) Bazı durumlarda su yerine organik çözücülerde çalışmak gerekebilir. Antibadiler böyle durumlarda kullanılamaz, fakat moleküler baskılanmış polimerler genellikle sulu çözeltiden çok organik çözücülerde çok daha iyi sonuçlar verir. 4) Moleküler baskılanmış polimerler biyolojik moleküller olan antibadiler ile karşılaştırıldığında çok daha kararlıdır. 5) Moleküler baskılanmış polimerlerin hazırlanması sırasında hayvan kullanmaya gerek yoktur. Kütle polimerizasyonu ile monolitik malzemelerin hazırlanması küçük moleküllerin baskılanmasında temel dayanak noktası olmasına rağmen büyük makromoleküller için uygun değildir. Bu durumda en çok kullanılan yaklaşım baskılanmış filmleri doğrudan quartz kristal mikroterazi (QCM) ya da yüzey plazmon rezonans (SPR) gibi sensör yüzeylerinde oluşturmaktır. Baskılanmış ince film doğası gereği yüksek spesifik yüzey 2 alanına sahiptir. Bu nedenle kütle aktarımı veya protein kalıbın polimerik yapıda hapsedilmesi gibi sorunları ortadan kalkmaktadır. Sensör yüzeyinde moleküler tanıma bölgelerine sahip ince moleküler baskılanmış polimerler sensörlerde kullanılan kararsız biyolojik tanıma elementleri ile karşılaştırıldığında pek çok avantaja sahiptir. Çizelge 1.1‘de sensörlerde kullanılan doğal biyomoleküller ile moleküler baskılanmış polimerler karşılaştırılmıştır (Piletsky ve ark. 2006). Çizelge 1.1. Sensörlerde kullanılan doğal biyomoleküller ile moleküler baskılanmış polimerlerin karşılaştırılması Doğal biyomoleküller MIP Kararsızdır Yüksek ve düşük pH’lara, basınca ve sıcaklığa dayanıklıdır Enzim ve reseptörler pahalıdır Ucuz ve kolayca hazırlanabilir Sulu ortamlar dışında performansı kötüdür Organik çözücülerde de kullanılabilir Her biyomolekülün kullanım şartları Kullanım sınırları daha geniş olduğundan farklıdır (pH, iyonik şiddet, sıcaklık ve MIP temelli sensörlerin hazırlanması daha substrat) kolaydır Doğal reseptör ve enzimler sadece sınırlı Prensipte her bileşik için MIP sayıdaki bileşik için mevcuttur hazırlanabilir Mikroeşleşme teknolojisi ve Polimerler mikroeşleşme teknolojisi için minyatürizasyon için çok uygun değildir. çok uygundur ve tekrar tekrar kullanılabilir. Kalp-damar hastalıkları, tüm dünyadaki ölümlerin birinci derecede nedenidir. Günümüzde dünya nüfusunun % 25’i kalp damar hastalıklarından etkilenmektedir. Kalp hastalığı, kanserlerden (meme, akciğer, prostat, bağırsak) ve diğer bulaşıcı hastalıkların tümünden daha fazla insanın hayatını kaybetmesine neden olmaktadır. Kalp krizi kalp kasının kansız ve oksijensiz kalması durumunda ortaya çıkmaktadır. Eğer hemen tedavi edilmezse kalp kasının etkilenmiş olan bölgesi ölmeye başlar ve bu da insan vücudunda ciddi komplikasyonlara ve hatta ölüme neden olabilmektedir. Kalp krizi geçiren bir kişi hayatta kalırsa kalp kasının zarar gören bölgesi skar dokusu ile yer 3 değiştirir ve bu da kalbin pompalama kapasitesini azaltır ve sonuç olarak kalp yetmezliği ve diğer komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Kalp krizi için etkili tedavi yöntemleri mevcuttur ve bu yöntemler ani ölümleri ve uzun süreli komplikasyonları önlemeye yöneliktir. En fazla yararı sağlayabilmek için bu tedaviler kalp krizi semptomlarının başlamasını takip eden 1 saat içinde uygulanmalıdır. Hızlı hareket etmek hayat kurtarır ve kalbin göreceği hasarı azaltır. Kalp hücreleri hasar görmeye başladığı zaman kan dolaşımına farklı enzimler ve moleküller bırakırlar. Bu tür maddelerin kandaki ve idrardaki düzeylerinin artması ciddi göğüs ağrısı olan hastalarda kalp krizi olup olmadığının belirlenmesini sağlayarak tedavi startejisinin belirlenmesine yardımcı olur. Kalp krizinin teşhisinde kullanılan markerler troponinler, kreatin kinaz (CK), kreatin kinaz izoenzim miyokardial band (CK-MB) ve miyoglobindir. Miyoglobin hemen hemen bütün memelilerde, başlıca kas dokusunda bulunan nispeten basit bir oksijen bağlayan proteindir. Bir molekül hem ve 153 aminoasit kalıntısı içeren tek bir polipeptidtir. Küçük boyutları nedeniyle (17,6 kDa) miyokardiyal infarktüsün gerçekleştiği ilk 1 saat içerisinde kandaki düzeyi artar ve 3-15 saat arası bu düzeyini korur (Christenson ve Azzazy 1998). 24 saat içerisinde serum miyoglobin düzeyi normal düzeye döner (Brogan ve ark. 1994). Gögüs ağrısı başladığında ve ağrı başladıktan sonraki birkaç saat içerisinde miyoglobinin hassasiyeti CK, CK-MB ve troponinlerden (T ve I) daha yüksektir (Kilpatrick ve ark. 1993). Miyoglobin düzeyi aynı zamanda iskelet kası harabiyetleri ve kas erimesi (masküler distrofi) ve polimyositis gibi kas hastalıklarında da yükselir. Miyoglobinin fazla miktarda bulunması böbrekler için toksik etki yapar. Kanda çok fazla miktarda miyoglobini bulunan bir kişide böbrek yetmezliği nedeniyle miyoglobinin tam olarak uzaklaştırılamaması sözkonusudur. Bu nedenle kandaki miyoglobin düzeyinin izlenmesi böbrek fonksiyonlarının değerlendirilmesi açısından da önemlidir. Bu tezde, moleküler baskılama tekniğinin yeni bir yaklaşımı olan mikrotemas baskılama yöntemi kullanılarak mevcut yöntemlere alternatif kanda miyoglobin tayinine olanak sağlayacak moleküler baskılanmış poli(hidroksietil metakrilat-metakriloil- amidotriptofan metil ester) [poli(HEMA-MATrp)] yüzey plazmon rezonans sensörü hazırlanmıştır. Fonksiyonel monomer olarak metakriloil-amidotriptofan metil ester 4 (MATrp) kullanılarak SPR çiplerin yüzeyinde miyoglobin tanıma bölgeleri oluşturulmuş ve polimerik film FT-IR, AFM, SEM ve temas açısı analizleri ile karakterize edilmiştir. Hazırlanan sensörün etkinliği GWC SPRImagerII yüzey plazmon rezonans sistemi kullanılarak hem sulu çözeltiler ile hem de kardiyak hastalardan alınan plazma örneği ile yapılan kinetik analizler ile araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar , günümüz laboratuarlarında kullanılan enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) tayin kitleri ile karşılaştırılmıştır. 5 2. KAYNAK ÖZETLERİ Doğada moleküler tanıma iki farklı molekül üzerinde yer alan fonksiyonel gruplar arasındaki spesifik etkileşimler ile gerçekleşmektedir. Moleküler tanımada hedef molekül liganda, yapı olarak hedef moleküle benzeyen yüzlerce molekül arasından seçici olarak bağlanabilmektedir. Örneğin, enzimlerin ligand moleküllerine bağlanması spesifik amino asitler ile gerçekleşir. Ligand bağlanma bölgesindeki amino asit dizilişi hedef molekül ile hem kimyasal fonksiyonellik hem de üç boyutlu yapı olarak tam bir uyum içerisindedir. Doğadan alınan ipuçları ile doğada gerçekleşen bu moleküler tanıma olayı sentetik polimerler kullanılarak taklit edilebilir. Çünkü fonsiyonel yapılar polimer yapısına dahil edilebilir ve doğada gerçekleşen bir ligand hedef molekül etkileşimi gerçekleştirilebilir. Aynı zamanda bu etkileşimler polimer yapısında çapraz bağlanma ile sabitleştirilerek üç boyutlu bir tanıma bölgesi elde edilebilir. Bu sayede hedef moleküle yüksek seçicilikle bağlanabilen biyomimetik bir polimer yapısı elde edilebilir. Belirlenen hedef moleküleri tanıyabilen tamamen sentetik bir sistem birçok uygulamada güçlü bir tayin aracı olarak kullanılabilir. Örneğin, böyle bir sistem kanda istenmeyen analitler olan kolesterol ya da virüsleri hedef alabilir. Bu sentetik yapı istenmeyen moleküllere spesifik olarak bağlanarak kan dolaşımından uzaklaştırabilir ve yapay bir ilaç gibi hareket ederek hastalığı tedavi edebilir. İlave olarak biyomimetik polimer, tanıma elementi olarak tedavi edici bir aletin yapısına ilave edilebilir. Bu teknolojinin kullanılabileceği diğer bir alan ise ilaç salınım sistemleridir. Bunun yanında analit düzeylerini izlemek ya da hastalık teşhisinde hassas testler geliştirerek biyosensör hazırlamada kullanılabilir. Biyomimetik tanıyıcı sistemler tasarlanırken dikkat edilmesi gereken en önemli hususlar şöyle sıralanabilir: 1) Polimer yapısında yer alan momomer ve hedef molekül arasında oluşan etkileşim kararlı olmalıdır ve polimer hedef molekülü benzer yapıdaki moleküller arasından seçici olarak tanımalıdır. 6 2) Biyomimetik sistem biyolojik ortamlarda kullanılacağından polimerik yapı kompleks çözeltilerde tanıma yeteneğini sürdürebilmelidir. 3) Hedef molekül polimerik yapıya hızlı bir şekilde difüze olabilmelidir. 4) Tanıma özelliğine sahip polimerlerin kullanılabileceği uygun platformlar belirlenmelidir. 2.1. Moleküler Tanıma Bir molekülün hedef molekülü benzer yapıdaki moleküller arasından seçici olarak tanıyıp bağlanmasında biyolojik ve kimyasal süreçler esastır. Moleküler tanıma ancak iki molekülün geometrik ve kimyasal olarak uyumlu olduğu yani üç boyutlu yapı olarak birbirini tamamladığı, hidrojen bağları, elektrostatik etkileşimler ve zayıf metal koordinasyonu gibi kovalent olmayan etkileşimler ile bağlandığı zaman gerçekleşir (Chen ve ark. 2002). Bu sürece örnek olarak enzimin substrata bağlanması (Tulinsky 1996 ), ilacın biyolojik bir hedefe bağlanması (Cudic ve ark. 2002, Britschgi ve ark. 2003), bağışıklık sistemindeki antijen-antikor bağlanması (Jimenez ve ark. 2003, Sundberg ve Mariuzza 2003) ve DNA kalıplarından mRNA oluşması verilebilir (Gitlin ve ark. 1988). Moleküler tanıma tüm yaşam olaylarında gerçekleşen temel süreçtir. 2.1.1. Doğal tanıma sistemleri 2.1.1.1. Proteinlerde moleküler tanıma Proteinler uzun ve dallanmamış aminoasit zincirleri içeren heteropolimerlerdir. İnsan vücudunda yer alan birçok protein 200-300 civarında aminoasit içerir. Canlı yapısında bulunan tüm sistemin çalışmasında proteinler ve proteinlerin bu sistemleri entegre etmek amacıyla diğer molekülleri nasıl tanıdığı esastır. Kas-iskelet hareketleri, sindirimde enzim katalizi, hücre ve dokulara tedavi edici ilaçların alınması, proteinin moleküler tanımasının esas olduğu olaylara örnek olarak verilebilir. En iyi karakterize edilmiş protein moleküler tanıma olayı avidin-biyotin arasında gerçekleşir. Avidin dört adet alt birime sahip tetramerik bir glikoprotein olup molekül ağırlığı yaklaşık 66 000 daltondur. Aynı zamanda H vitamini olarak bilinen biyotin ise her hücrede bulunan bir 7 moleküldür. Avidin yapısındaki bulunan dört tetramerik bölgenin her biri spesifik olarak bir biyotin molekülüne bağlanır. Bu bağlanma doğada gerçekleşen en güçlü non- kovalent etkileşimdir (K =1015M-1A ), (Pugliese ve ark. 1993). Avidin yapısında yer alan lizin ve triptofan kalıntılarının (özellikle Trp70, Trp 110, Lys 46 ve Lys 94) biyotin yapısında bulunan karboksil grupları ile güçlü bir etkileşime girdiği düşünülmektedir (Gitlin ve ark. 1987). Avidin-biyotin kompleksini kovalent olmayan etkileşimlere dayanan tanıma sistemlerinde en çok çalışılan etkileşim haline getiren de bu moleküllerin birbirine olan yüksek afinitesi, yapısal ve kimyasal uyumudur. 2.1.1.2. Bağışıklık sisteminde moleküler tanıma Moleküler tanımanın gerçekleştiği diğer bir olay da bağışıklık sisteminde gerçekleşen antijen-antikor etkileşimidir. Antibadiler kan dolaşımındaki yabancı maddeleri tanıyıp bağlayabilen spesifik bağlanma bölgeleri içeren globüler proteinlerdir. Antijen olarak adlandırılan yabancı maddeler basit bir protein ya da büyük bir bakteri, virüs olabilir. Şekil 2.1.1.2.1. Antibadi-antijen arasında gerçekleşen tanıma Antibadiler ağır zincir (55 kDa) olarak adlandırılan iki eş polipeptid içeren lineer amino asit sarmalları ve hafif zincir olarak adlandırılan, “Y” yapısını oluşturmak üzere disülfid bağlarıyla bağlanmış olan iki eş polipeptid zincirinden (25 kDa) oluşur. Zincirlerin N- terminal ucunda, antijenlerin epitop olarak adlandırılan özel bir bölgesini tanıyabilen 8 değişken bir amino asit dizisi yer alır. Tanımayı sağlayan sadece aminoasit dizisi değil, ağır ve hafif zincirler tarafından oluşturulmuş olan bağlanma bölgesinin oryantasyonudur (Şekil 2.1.1.2.1). Şekil 2.1.1.2.2. Antijenlerin antibadilerin bağlanma bölgesindeki uygun (a) boşluklara (b) yarıklara ya da (c) yüzeylere bağlanması (Bergman 2005) Bir antijenin epitopu ile antibadinin değişken bölgesi arasındaki etkileşim (Şekil 2.1.1.2.2) elektrostatik kuvvetler, hidrojen bağları, Van der Waals kuvvetleri, hidrofobik kuvvetler ya da tüm bu kovalent olmayan etkileşimlerin ortak etkisi ile gerçekleşir. Bağışıklık sisteminin çalışabilmesi için antibadiler çok fazla sayıda farklı molekülü tanımak zorundadır. Amino asit dizilişlerindeki farklılık ve esneklik sayesinde çok fazla sayıda olası kimyasal hedef molekül tanınabilmektedir. Bazı araştırmacılar, insan bağışıklık sisteminin 107 ile 109 farklı antibadi yapısına sahip olduğunu tahmin etmektedir. Birçok araştırmacı epitop bağlanmasını örnek alarak hastalıkların tedavisi için yapay antibadilerin hazırlanması için çaba harcamaktadır (Rachkov ve Minoura 2001). Haupt ve Mosbach (1998), Vlatakis ve ark. (1993) yaptıkları çalışmalarda bu yapay antibadileri, enzim inhibitörleri olarak potansiyel yeni ilaçlar için kütüphane oluşturulmasında ve protein bağlanmasında hedef moleküllerin belirlenmesinde kullanmaktadırlar. 9 2.1.1.3. Sentetik polimerik matrikslerde moleküler tanıma Protein kimyasındaki ilerlemeler ve protein tanıma olayının aydınlatılması ile araştırmacılar hedef moleküle spesifik olarak bağlanan tamamen sentetik polimer malzemeler hazırlamak amacıyla çalışmalar yapmışlardır. Bu tür malzemeler katı faz ekstraksiyonundan kromatografik kolon dolgu maddesine ve kontrollü ilaç salınımına kadar birçok farklı potansiyel kullanım alanına sahiptir. Günümüzde bu polimerlerin çoğu hedef molekülün varlığında hazırlanmaktadır. Bunun amacı hedef molekülün tanınabilmesi ve dolayısıyla biyolojik tanımanın taklit edilebilmesi için hedef molekülün kimyasal fonksiyonelliğinin ve üç boyutlu yapısının sentetik matriksin hafızasına alınmasını sağlamaktır. Sentetik yapılarda çok sayıda farklı fonsiyonel özelliği yapıya kazandırmak ve mekanik kararlılığı sağlamak mümkündür. 2.1.2. Moleküler baskılama Moleküler baskılama fikri Nobel ödülü sahibi olan Linus Pauling’in antibadi oluşumuna ilişkin teorilerinden ilham alınarak ortaya çıkmıştır. (Ansell ve ark. 1996, Mosbach ve Ramstrom 1996). Pauling antibadilerin denatüre protein gibi davrandığını, hidrojen bağı içermediğini ve zincirlerinin serbestçe hareket edebildiğini varsaymıştır. Antijen ile karşılaştığında “moleküler tamamlama” adını verdiği olay gerçekleşmekte ve antijenin kimyasal yapısında yer alan fonsiyonel gruplar antibadideki aminoasitler ile etkileşmektedir. Bu sayede antibadi antijenin yapısını hafızasına almaktadır (Pauling 1940). Daha sonra bu hipotezin yanlış olduğu kanıtlanmış fakat serbest halde hareket eden polimer zincirlerinin bir molekül etrafında tamamlayıcı bir şekilde organize olabileceği fikri moleküler baskılama olayı için ilham kaynağı olmuştur. Doğada gerçekleşen bağışıklık yanıt, ligand-reseptör etkileşimi ve enzim katalizi gibi bir çok biyolojik olaydaki moleküler tanıma olayını temel alan araştırmacılar daha iyi, daha seçici ve hassas analitik çalışmalar yapabilmek için doğada gerçekleşen bu spesifik tanıma olayını sentetik reseptörler hazırlamak için kullanarak “moleküler baskılama” olarak bilinen yeni bir alanın doğmasına neden olmuştur. 10 Moleküler baskılama kalıp molekül etrafında fonksiyonel monomerlerin organize olması ve çapraz bağlayıcı ilavesiyle polimerizasyonun gerçekleştirilmesi sonucunda, şekil ve boyut olarak kalıp moleküle özgü bağlanma bölgeleri içeren yeni bir malzemenin elde edilmesi esasına dayanmaktadır (Şekil 2.1.2.1). Şekil 2.1.2.1. Moleküler baskılama yönteminin şematik gösterimi Moleküler baskılama yöntemi temel olarak üç basamaktan oluşmaktadır: (1) Ön kompleksleşme (2) Polimerizasyon (3) Kalıp (hedef) molekülün uzaklaştırılması Ön kompleksleşme aşamasında kalıp molekül (küçük bir molekül, biyolojik bir makromolekül ya da bir mikroorganizma) tamamlayıcı fonksiyonel gruplar içeren ve polimerleşebilen bir monomer ile tersinir kovalent bağ(lar), elektrostatik etkileşimler, hidrojen bağları, Van der Waals etkileşimleri, hidrofobik etkileşimler ya da bir metal ile koordinasyon bağı oluşturmak suretiyle etkileşir. Ön polimerizasyon karışımına (kalıp molekül-monomer kompleksi) bir çapraz bağlayıcı, bir başlatıcı ve analitin spesifik 11 bağlanma bölgelerine kolayca ulaşmasını sağlayacak olan gözenekleri oluşturacak bir gözenek yapıcı (porojen) ilave edilir. Polimerizasyon aşamasında monomer kalıp kompleksi, kullanılan kalıp molekülün karakteristik özelliklerine de bağlı olarak ısıl ya da düşük sıcaklıkta fotokimyasal olarak polimerleştirilir. Monomer ve çapraz bağlayıcı molekülleri arasında kimyasal bağların oluşmasından dolayı polimerizasyon gerçekleştirildiğinde kalıp molekül etrafında fonksiyonel monomerlerin pozisyonu sabitlenir. Son aşamada kalıp molekülün uzaklaştırılması ile şekil, boyut ve fonksiyonel grup bakımından kalıp moleküle özgü bağlanma bölgeleri içeren üç boyutlu bir polimerik yapı hazırlanmış oluşur. Diğer bir değişle baskılanmış molekülün sterik ve kimyasal bilgisi polimer yapısına aktarılır. Bu teknik basit ve ucuz olup, elde edilen moleküler baskılanmış polimerler yüksek seçicilikte, mükemmel mekanik kuvvette, sıcaklık, asidik ve bazik koşullar ile organik çözücülere dayanıklıdır. Bu yöntem katı faz ekstraksiyonu (Tamayo ve ark. 2007), sıvı kromatografisi (Sellergren 2001) , ilaç salınım sistemleri (Cunliffe ve ark. 2005), kapiler elektroforez ve elektrokromatografi (Turiel ve Martin-Esteban 2005), enzim benzeri kataliz (Hall va ark. 2005) veya sensör geliştirilmesi (Ye ve Haupt 2004a) gibi alanlarda geniş çapta kullanılmaktadır. 2.1.3. Moleküler baskılanmış polimer hazırlamada kullanılan yaklaşımlar Bugüne kadar moleküler baskılamada geliştirilmiş olan iki farklı yaklaşım kovalent ve kovalent olmayan baskılamadır (Şekil 2.1.3.1). Kovalent yaklaşım 1972 yılında Günter Wulff ve arkadaşları tarafından tanımlanmıştır (Wulff ve Sahran 1972). Kovalent baskılamada kalıp molekül polimerleşebilen bir fonksiyonel monomere (boronat ester, ketal ve asetal ya da schiff bazları) kovalent olarak bağlanır. Bir çapraz bağlayıcı kullanılarak gerçekleştirilen kopolimerizasyonun ardından kalıp molekül yüksek derecede çapraz bağlı polimer içerisinden kovalent bağı 12 kırmak suretiyle uzaklaştırılır ve kalıp molekülü spesifik olarak tanıyan moleküler boşluklar elde edilir. Şekil 2.1.3.1. (a) Kovalent olmayan (b) Kovalent moleküler baskılama yönteminin şematik gösterimi Kovalent olmayan baskılama ise 1981 yılında Klaus Mosbach ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiş bir yaklaşımdır (Arshady ve Mosbach 1981, Andresson ve ark. 1984). Bu yaklaşımda spesifik bağlanma bölgeleri kalıp molekül ve fonksiyonel monomer arasındaki ön organizasyon ve ardından gelen çapraz bağlanma ile oluşmaktadır. Kalıp molekül gerek ön organizasyon gerekse geri bağlanma sırasında bağlanma bölgelerine hidrojen bağları, hidrofobik etkileşimler, van der Waals etkileşimleri ve iyonik gruplar arasında gerçekleşen Coulomb etkileşimleri gibi kovalent olmayan etkileşimler ile bağlanmaktadır. Çizelge 2.1.3.1‘de kovalent olmayan baskılamadaki etkileşim türleri ve bağ enerjileri verilmiştir (O’Mahony ve ark. 2006, Wei ve ark. 2007). 13 Çizelge 2.1.3.1. Kovalent olmayan baskılamadaki etkileşim türleri ve tahmin edilen bağ enerjileri Bağ türü Bağ enerjisi (kj/mol) Relatif kuvvet 208 Hidrojen bağı 4-609 Zayıf/orta 2-510 Hidrofobik etkileşim 1-36 Zayıf İyon-İyon (1/r) 2508 Güçlü 100-3509 Dipol-İyon (1/r2) 158 Zayıf Dipol-Dipol (1/r3) 28 Zayıf/orta 5-509 π-π etkileşimi 0-509 Zayıf/orta Dağılma (London) (1/r6) 28 Zayıf <59 Katyon- π 5-809 Orta Kovalent olmayan baskılama yöntemin basitliği nedeniyle moleküler baskılanmış polimerlerin hazırlanmasında daha sık kullanılan bir yaklaşım olup kovalent baskılamaya göre birçok avantajı vardır. En önemli üstünlükleri ön kompleksleşmenin kalıp molekül ve fonksiyonel monomeri basitçe karıştırmakla hazırlanabilmesi ve etkileşimin kovalent olmamasından dolayı kalıp molekülün yapıdan kolayca uzaklaştırılabilmesidir. Biyolojik molekülleri de içine alan çok sayıda molekülün fonksiyonel monomerler ile kovalent olmayan etkileşimlere girme kapasitesine sahip olması nedeniyle, kovalent olmayan baskılama çok daha fazla gelecek vaadeden bir yaklaşımdır. Kovalent olmayan moleküler baskılamada en büyük sınırlama çalışılan moleküle özgü bağlanma koşullarıdır. Çoğu durumda monomer ve kalıp molekül arasında oluşan etkileşim hidrofobiktir ve polar ortam bu etkileşimleri bozar. Diğer sınırlayıcı durum ise etkileşim için birden fazla bölgenin bulunmasına duyulan gereksinimdir. Tek bir etkileşim bölgesine sahip olan moleküller, örneğin sadece bir karbonil grubu, genellikle sınırlı miktarda moleküler tanıma yeteneğine sahip moleküler baskılanmış polimerler elde edilmesine neden olur. 14 Moleküler tanıma olayı üç boyutlu yapı ve fonksiyonel uyum gibi bir çok faktöre bağlıdır. Fonksiyonel tamamlayıcılık dikkate alındığında kalıp molekül ile moleküler bağlanma bölgesi arasında gerçekleşecek moleküler tanıma için tüm kovalent olmayan etkileşimler oluşsa bile oluşan moleküler baskılanmış ürünün kalite ve performansını belirleyen, kalıp molekül, monomerler ve polimerizasyon reaksiyonunun kendisidir. Daha da ötesi moleküler tanıma bölgelerinin sayısı ve kalitesi, monomer ile kalıp arasında oluşan ön kompleksin özellikleri ve oluşum mekanizmasıyla yakından ilişkilidir. Moleküler baskılanmış polimerlerin hazırlanmasında kullanılan (1) kalıp molekül, (2) monomer, (3) çapraz bağlayıcı, (4) çözücü, (5) başlatıcı ve başlama yöntemi ve (6) polimerizasyon yönteminin kendisi hazırlanan polimerin kimyasal, morfolojik ve moleküler tanıma özelliklerini etkilemektedir (Yan ve Row 2006, Cormack ve Elorza 2004). (1) Kalıp molekül Kalıp molekül fonksiyonel monomer ile etkileşerek moleküler tanıma bölgelerinin sayısı ve kalitesini etkilediğinden bütün moleküler baskılama yöntemlerinde merkezi bir öneme sahiptir. Bir çok nedenden dolayı tüm moleküllerin kalıp olarak kullanılması mümkün değildir. Moleküler baskılanmış polimerler çoğunlukla serbest radikal polimerizasyonu ile sentezlendiğinden polimerizasyonun gerçekleştirilebilmesi açısından, kalıp moleküller polimerizasyon koşullarında kimyasal olarak inert olmalıdır. Eğer kalıp molekül radikalik reaksiyonlara katılıyorsa ve polimerizasyon koşullarında dayanıklı değil ise alternatif baskılama stratejileri belirlenmelidir. Bir kalıp molekülde aranan özellikler şöyle sıralanabilir: (a) Kalıp molekül polimerleşebilir gruplar taşımamalıdır. (b) Kalıp molekülde serbest radikal polimerizasyonunu önleyebilecek ya da yavaşlatabilecek gruplar ya da kalıntılar (tiyol, hidrokinon kalıntıları gibi) bulunmamalıdır. 15 (c) Kalıp molekül polimerizasyonun gerçekleştirileceği sıcaklıklarda ya da UV ışığa karşı dayanıklı olmalıdır. Baskılanacak molekül olarak ilaçlar, amino asitler, karbonhidratlar, proteinler, nükleotid bazlar, hormonlar, pestisidler, koenzimler ve iyonlar kullanılabilir. Baskılanan molekül olarak iyon kullanıldığında polimerik malzemenin seçiciliği, baskılanmış iyonun yüküne, boyutuna , koordinasyon sayısına ve geometrisine bağlıdır. (2) Fonksiyonel Monomer Fonksiyonel monomerler baskılanmış bağlanma bölgesindeki bağlanma etkileşiminden sorumludur ve genellikle kovalent olmayan baskılama yönteminde kalıp molekül ile monomer arasındaki ön kompleksin oluşumunda reaksiyonu kompleks oluşumu yönüne kaydırmak için monomer, kalıp moleküle göre daha fazla miktarda kullanılır. Kompleks oluşumunu ve baskılama etkisini arttırmak için kalıp molekülün fonksiyonelliği ile monomerin fonksiyonelliği uyumlu olmalıdır. Örneğin biri H-bağı donörü ise diğeri H- bağı akseptörü olmalıdır. Fakat bununla birlikte iki ya da daha fazla monomer aynı anda kullanılarak polimerizasyon gerçekleştirilecekse monomerlerin reaktifliklerinin oranı uygun olmalıdır. Kalıp molekül ile monomer arasında gerçekleşecek olan ön kompleksleşme monomerin elektronik ve sterik yapısını etkileyerek monomerin reaktivitesini değiştirecektir. Farklı kimyasal yapıya ve polariteye sahip fonksiyonel monomerler ticari olarak mevcuttur ya da sentezlenebilmektedir. Şekil 2.1.3.2‘de kovalent olmayan baskılamada kullanılan bazı önemli fonksiyonel monomerlerin yapıları görülmektedir. (3) Çapraz Bağlaycı Baskılanmış bir polimerde çapraz bağlayıcı polimer matriksin morfolojisinin (jel tipi, makrogözenekli ya da mikrojel toz) belirlenmesi, baskılanmış bağlanma bölgesinin kararlılığının sağlanması ve polimer matrikse mekanik dayanıklılık kazandırılması gibi 16 Asidik ( a ) O CH O3 H3C OH O OH OH F3C OH NH S OH HO CH O3 H2C O H2C OH H2C O H C O H2C O2 H2C O aI aII aIII aIV aV aVI Bazik ( b ) CH3 N N N NH2 N N N H3C O H2C H2C H2C NH H2C H2C H3C H2C O bI bII bIII bIV bV bVI CH3 CH3 H + NH2 N CH N 3 O O H3C NH N H3C O CH3 N N H C O H C NH H C O H2C O 2 2 2 H3C CH3 bVII bVIII bIX bX bXI Nötral ( n ) OH NH2 H3C NH2 H3C O O N H2C O H2C O H2C O HO nI nII nIII nIV H3C O CN CH3 CH3 H2C H2C O H2C H2C nV nVI nVII nVIII Şekil 2.1.3.2. Kovalent olmayan baskılamada kullanılan bazı fonksiyonel monomerler Asidik; aI: metakrilik asit (MAA); aII: p-vinilbenzoik asit; aIII: akrilik asit (AA); aIV: itakonik asit; aV: 2 (triflorometil)-akrilik asit (TFMAA); aVI: akrilamido-(2-metil)-propan sulfonik asit (AMPSA). Bazik; bI: 4-vinilpiridin (4-VP); bII: 2-vinilpiridin (2-VP); bIII: 4- (5)-vinil imidazol; bIV: 1-vinil imidazol; bV: allilamin; bVI: N,N-dietil aminoetil metakrilamid (DEAEM), bVII: N-(2-aminetil)-metakrilamid; bVIII: N,N-dietil-4-stirilamidin; bIX: N,N,N,- trimetil aminoetilmetakrilat; bX: N-vinilpirrolidon (NVP); bXI: urokanik etil ester. Nötral; nI: akrilamid; nII: metakrilamid; nIII: 2-hidroksietil metakrilat (2-HEMA); nIV: trans-3-(3- piridil)-akrilik asit; nV: akrilonitril (AN); nVI: metil metakrilat (MMA); nVII: stiren; nVIII: etilstiren. 17 üç temel görev üstlenir. Kullanılan çapraz bağlayıcı miktarının moleküler tanıma kapasitesine olan etkisi ile ilgili birçok çalışma yapılmasına rağmen olaya polimerizasyon açısından bakıldığında yeterli mekanik dayanıklılığa sahip makro gözenekli malzemeler elde etmek için genellikle yüksek çapraz bağlanma oranları kullanılmakta ve hazırlanan polimerlerde çapraz bağlanma oranları %80’i aşmaktadır. Yüksek oranda çapraz bağlama polimerin çözünmesini önleyerek kolayca kullanılmasını sağlar. Polimerizasyonda çapraz bağlayıcının reaktifliği ile fonksiyonel monomerin reaktiflikleri uygun olmalıdır. Fonksiyonel monomer ya da çapraz bağlayıcı fazla olursa kopolimerizasyon etkin şekilde gerçekleşmez. Çapraz bağlayıcı ajanın fonksiyonel monomere oranı da önemlidir. Eğer mol oranları çok küçükse, kalıp moleküllerin bağlanma bölgeleri birbirlerine çok yaklaşır, hedef molekülün bağlanma bölgeleri komşu bölgeler tarafından kapatılır ve etkin bir sonuç elde edilemez. Çok büyük mol oranlarında da, çapraz bağlayıcının fonksiyonel monomerlerle ya da kalıp molekülle kovalent olmayan etkileşimlere girmesi sonucu baskılamanın etkinliği yine azalmaktadır. Moleküler baskılama için yaygın olarak kullanılan bir çok çapraz bağlayıcı vardır. Bunlardan çoğu ticari olarak üretilmektedir ve bunlardan çok azı kalıp molekül ile etkileşime girerek fonksiyonel monomer olarak hareket ederler. Organik çözücülerde moleküler baskılama için etilen glikol dimetakrilat (EGDMA) ve divinil benzen (DVB), suda ise N,N’ metilen bisakrilamit yaygın olarak kullanılan çapraz bağlayıcılardır. Şekil 2.1.3.3 ‘te yaygın olarak kullanılan çapraz bağlayıcılar görülmektedir. (4) Çözücü Moleküler baskılamada kullanılan çözücü, kullanılan tüm bileşenlerin (kalıp molekül, fonksiyonel monomer, çapraz bağlaycı ve başlatıcı) tek faz içerisinde olmasını sağlayan bileşendir. Diğer önemli bir fonksiyonu da makro gözenekli polimerdeki gözeneklerin oluşumudur. Bu nedenle çözücü genellikle porojen olarak da adlandırılır. 18 H3C CH2 O CH H C CH O CH2 3 3 3 O CH O CH22 O OH H CH C H 2C 2 2 2C O OCH CH33 xI xII xIII xIV O CH NH N NH NH2 H C NH H2C CH2 H2C O2 O O O CH2 O NH xV xVI xVII O CH3 CH3 NH NHH2C CH2 CH NH NH 2N H2C CH2 O O N NH NH O O H2C CHH C 22 HO O O OO xVIII xIX xX xXI CH O CH3 3 O CH3 O NH CH2 NH CH2 NH CH2 H C NH H2C NH H2C NH2 O CH O CH O CH3 3 3 xXII xXIII xXIV CH CH H 3 3 O O O O O O O H3C CH2 O O H2C CH2 H2C CH3 O H3C CH O O 2 H2C CH3 O O OH H3C CH3 xXV xXVI xXVII H2C H2C H2C O CH O O3 O O O CH3 O CH3 O OH O O H2C H2C H2C CH2 O O O O O O O CH3 O O O CH2 CH2 CH2 xXVIII xXIX xXX Şekil 2.1.3.3 Yaygın olarak kullanılan çapraz bağlayıcılar xI: p-divinilbenzen (DVB); xII: 1,3-diizopropenil benzen (DIP); xIII: etilen glikol dimetakrilat (EGDMA); xIV: tetrametilen dimetakrilat (TDMA); xV: N,O-bisakriloil-l-fenilalaninol; xVI: 2,6 bisakriloilamidopiridin; xVII: 1,4-fenilen diakrilamid; xVIII: N,N-1,3-fenilenbis(2-metil-2- propenamid) (PDBMP); xIX: 3,5-bisakrilamido benzoik asit; xX: 1,4-diakriloil piperazin (DAP); xXI: N,N-metilen bisakrilamid (MDAA); xXII: N,N etilen bismetakrilamid; xXIII: N,N-tetrametilen bismetakrilamid; xXIV: N,N-hekzametilen bismetakrilamid; xXV: anhidroeritiritol dimetakrilat; xXVI: 1,4;3,6-dianhidro-d-sorbitol-2,5-dimetakrilat; xXVII: izopropilenbis(1,4-fenilen) dimetakrilat; xXVIII: trimetilpropan trimetakrilat (TRIM); xXIX: pentaeritiritol triakrilat (PETRA); xXX: pentaeritiritol tetraakrilat (PETEA). 19 Makro gözenekli polimerler hazırlanırken kullanılan gözenek yapıcının özellikleri ve miktarı polimerin morfolojisini ve toplam gözenek hacmini belirleyen en önemli etmendir. Termodinamik açıdan uygun bir gözenek yapıcı kullanıldığında elde edilen polimerler genellikle hem iyi bir gözenek yapısına hem de yüksek bir spesifik yüzey alanına sahip olmaktadır. Kullanılan gözenek yapıcının miktarını arttırmak, gözenek hacmini de arttırmaktadır. Çözücünün diğer bir rolü ise polimerizasyon reaksiyonu oluşurken sıcaklığı dağıtmasıdır. Aksi taktirde, reaksiyon karışımının sıcaklığı bölgesel olarak çok yüksek olur ve istenmeyen yan reaksiyonlar oluşabilir. Çözücünün seçimi baskılamanın türüne de bağlıdır. Kovalent baskılamada tüm bileşenleri iyi bir şekilde çözdüğü taktirde bir çok çözücü kullanılabilir. Kovalent olmayan baskılamada ise kullanılan çözücü kalıp molekül ile fonksiyonel monomer arasındaki etkileşimi ve baskılama etkisini arttıracak nitelikte olmalıdır. Toluen gibi apolar, aprotik çözücüler hidrojen bağlarının oluşumunu stabilize ederken, kompleksleşme için hidrofobik etkileşimden yararlanılacaksa su iyi bir seçenek olarak karşımıza çıkmaktadır. (5) Başlatıcı Prensip olarak serbest radikal polimerizasyonunu başlatmak için kullanılan tüm başlatma yöntemleri kalıp molekülün varlığında da kullanılabilir. Fakat başlatıcının seçimi kalıp olarak kullanılan molekül için farklı olacaktır. Eğer kalıp molekül fotokimyasal ya da termal olarak kararsız ise uygun başlatıcının seçiminde göz önünde bulundurulmalıdır. Bunun yanı sıra, ön kompleks oluşumunda hidrojen bağları etkin ise daha düşük polimerizasyon sıcaklıkları tercih edilecektir ve bu durumda da düşük sıcaklıklarda kullanılabilecek fotokimyasal olarak aktif başlatıcılar tercih edilmelidir. Şekil 2.1.3.4 ‘de bazı polimerizasyon başlatıcıları görülmektedir. Kalıp molekülün yüksek seçicilikle tanınması ve baskılanmış polimerler tarafından bağlanması, malzemenin fiziksel ve kimyasal (esneklik, bağlanma bölgerinin sayısı ve malzemenin yapısı gibi) özelliklerine bağlıdır. 20 CN CH3 CH3 OMe O H3C N N CH H3C CN CH3 3 N N OMe CH3 CN CH3 CN CH3 H3C iI iII iIII O O CN CH3 O O HO N N O CH3 CN O OH iV iIV Şekil 2.1.3.4. Moleküler baskılamada kullanılan başlatıcılar iI: azobisizobutironitril (AIBN); iII: azobisdimetilvaleronitril (ABDV); iIII: benzil dimetilasetal ; iIV: benzoilperoksid (BPO); iV: 4,4-azo(4-siyanovalerik asit). Moleküler baskılanmış polimerlerin daha kullanışlı olmaları için, seçiciliğin yanında, uygun koşullar altında desorpsiyon ve geri bağlanma kinetiğinin de hızlı olması gerekir. Bu yüzden moleküler baskılanmış malzemelerin tasarımı yapılırken uygun bağlanma etkileşimlerinin seçimi oldukça önemlidir. Birden fazla bağlanma bölgesinin olması, monomerin bağlanma bölgeleri ile kalıp molekül arasındaki etkileşimlerin daha iyi olması, dolayısıyla moleküler tanımanın daha seçici olmasını sağlar. Moleküler etkileşimlerin farklılığı, seçiciliğin ve tersinirliğin derecesini etkiler. Örneğin, kovalent bağlarla oluşturulan etkileşimler oldukça spesifiktir ancak geri bağlanma kinetiği yavaştır. Bununla beraber, hidrofobik etkileşimlerin kinetiği daha hızlıdır fakat seçiciliğinde azalma gösterir. Genel olarak kovalent olmayan etkileşimler, birçok bileşiğe uygulanabilir olmaları, hızlı kinetiği ve daha uygun koşullarda bağ oluşumu ve kırılması özellikleri göstermeleri nedeniyle daha geniş uygulama alanlarına sahiptir. Dahası, π-π etkileşimleri, hidrojen bağları ve hidrofobik etkileşimler gibi belirli kovalent olmayan etkileşimler yeni moleküler baskılanmış fonksiyonel polimerlerin tasarımı için gelecek vaad etmektedir. 21 2.1.4. Protein baskılama 1990’lı yıllardan bu yana çok sayıda farklı molekül, moleküler baskılama teknolojisi ile spesifik tanıma bölgelerinin elde edilmesi için kullanılmıştır. Bunlardan bazıları polipeptidler (Kempe ve Mosbach 1995, Anderson ve ark. 1995), bakteriler (Dickert ve Hayden 2002), düşük moleküler ağırlıklı bileşikler (Katz ve Davis 2000, Pampi ve Kofinas 2004, Yılmaz ve ark. 2000) ve proteinlerdir (Burow ve Minoura 1996, Bossi ve ark. 2001, Guo ve ark. 2004). Moleküler baskılama teknolojisi 20 yılı aşkın süreden beri kullanılmasına rağmen, proteinler gibi yüksek molekül ağırlığına sahip moleküllerin ve hatta hücrelerin kalıp molekül olarak kullanıldığı çalışma sayısı oldukça azdır. Bunun sebebi baskılanmak istenen protein moleküllerinin özellikleridir. Proteinler suda çözünen bileşiklerdir ve bu da polimer hazırlanması için organik çözücülerin kullanılmasını gerektiren moleküler baskılama tekniği ile tamamen uyumsuzdur. İkincisi ise proteinlerin sıcaklık ve pH gibi değişimlerden kolayca etkilenen esnek bir yapı ve konformasyona sahip olmasıdır. Termodinamik ve pratik açılardan bakıldığında da bu özelliklere sahip bir molekül için moleküler baskılama işlemini gerçekleştirmek zordur. Üçüncüsü de proteinlerin, fonksiyonel monomerler ile etkileşebilecek çok sayıda fonksiyonel grup içermesidir. Baskılama işleminin belirlenmesinde baskılanması istenen proteinlere uygun koşulların seçilmesi gerekmektedir. 2.1.4.1. Protein baskılamada kullanılan yaklaşımlar Proteinlerin baskılanmasına ilişkin yaklaşımlar proteinin baskılamaya dahil edilen kısmına göre (protein molekülünün tamamı, belli bir bölgesi ya da protein üzerindeki belli bir epitop) genel olarak üç başlık altında incelenebilir; (1) Kütle (Yığın) polimerizasyonu ile baskılama (2) Epitop yaklaşımı (3) Yüzey baskılama Üç boyutlu (3D) baskılama metodu olarak adlandırılan kütle polimerizasyonu ile baskılama metodunda protein bir bütün olarak üç boyutlu yapısıyla polimer matriksin içerisinde baskılanmakta ve fonksiyonel monomerler ile bir bütün olarak etkileşmektedir. Proteinin geri bağlanması da bu şekilde gerçekleşmektedir. Yüzey 22 baskılamada ise baskılama ve tanıma üç boyutlu yapının tamamı ile değil proteinin belli bir bölgesi ile kısmen gerçekleşmekte ve tanıma bölgeleri moleküler baskılanmış polimerin yüzeyinde ya da yüzeyine yakın bölgede yer almaktadır. Yüzey baskılama yöntemi iki boyutlu (2D) baskılama yöntemi olarak adlandırılan baskılama yöntemleri arasında yer almaktadır. Proteinin küçük bir epitopunun baskılanmasıyla gerçekleşen yaklaşım ise epitop yaklaşımıdır ve elde edilen moleküler baskılanmış polimer proteini baskılanan bu epitop sayesinde tanıyabilmektedir. Bu yaklaşım da yine 2D baskılama metodları arasında yer almaktadır. Protein baskılama alanında yapılmış olan önemli çalışmalar Ek-1 ‘de , protein baskılamanın tarihsel gelişimi Ek-2’de özetlenmiştir. 2.1.4.1.1. Kütle (Yığın) polimerizasyonu ile protein baskılama 2.1.4.1.1.1 Akrilatlar Protein baskılamadaki en basit ve bilinen yaklaşım küçük moleküller için de sıklıkla kullanılan yaklaşım olan kütle polimerizasyonu ile monolitlerin hazırlanmasıdır (Wulff 1995). Bu yöntem ile oluşturulan bağlanma bölgeleri proteinin tümünü tanımaya elverişli olduğundan, yıkama ya da ekstraksiyon yapılarak proteinin bir bütün olarak polimer yapısından uzaklaştırılabilmesi ve oluşan bağlanma bölgesine tekrar bağlanabilmesi bu yöntemin en önemli avantajlarıdır. Proteinlerin boyutlarının büyük olması nedeniyle etkin bir MIP hazırlayabilmek için polimerizasyon sırasında oluşan gözeneklerin sayısı, boyutu ve hazırlanan polimerin yoğunluğunun kontrol edilmesi, dikkat edilmesi gereken en önemli noktalardır. Protein baskılanmış polimerleri hazırlamak için geleneksel (met)akrilat kimyasını kullanan çok sayıda çalışma vardır. Fakat bu yaklaşımdaki temel sınırlama, proteinlerin bu yöntemde kullanılan çözücülerdeki çözünürlüğünün düşük olmasıdır. Bunun yanısıra proteinler organik çözücüler içerisinde çözündüğünde suda sahip olduğu konformasyondan çok farklı bir konformasyona dönüşürler. Bu durumun elde edilen moleküler baskılanmış polimerin sulu çözeltideki etkinliğine bir fayda sağlayacağı 23 düşünülerek, bazı araştırmacılar içerik olarak elektroforetik jellere benzeyen moleküler baskılanmış polimerlerin hazırlanmasında suda çözünebilen akrilik monomerleri kullanmışlardır. Hjerten ve ark. (1997) protein molekülünün varlığında akrilamid (AAm) ve N,N’- metilenbisakrilamidi polimerleştirerek bir jel hazırlamışlardır. Jel elenerek elde edilen partiküller bir kromatografi kolonuna doldurulmuş ve hazırlanan baskılanmış polimerin etkinliği incelenmiştir. Proteinin jelden uzaklaştırılması için asetik asit-SDS karışımı kullanılmıştır. Kalıp proteini içeren protein karışımı kolondan geçirildiğinde kalıp proteinin seçici olarak bağlandığı belirlenmiştir. Bu teknik sığır serum albumini, sitokrom c, ve transferin (Liao ve ark. 1996) ve daha sonra insan büyüme hormonu, RNaz, ve miyoglobin (Tong ve ark 2001) için başarıyla kullanılmıştır. Bu çalışmada protein ile jel arasında çok sayıda zayıf elektrostatik etkileşimin oluştuğu ve bunun da güçlü bir etkileşim oluşturarak baskılamayı gerçekleştirdiği ileri sürülmüştür. Bu da az sayıda kuvvetli bağ ile bağlanmanın çok sayıda zayıf bağlanmaya göre daha avantajlı olduğu görüşünün tam tersidir. Hjerten’in teorisi küçük proteinlerin tanıma bölgelerine spesifik olarak bağlanması, aynı jelde büyük proteinlere göre daha düşük adsorpsiyon hacimleri gerektirmesi ile kanıtlanmıştır. Çünkü protein büyüdükçe yüzey alanı artmakta ve bu yüzden jel ile daha fazla etkileşime girebilmektedir. Vaidya ve ark. (2001) tripsini baskılamak için AAm ve bisakrilamid (BisA) kullanmışlardır. Tripsin ve onun polimerleşebilen inhibitörü N-akriloil p- aminobenzamidin (spesifik monomer olarak) kullanılmıştır. Dimetilformamid-su karışımında polimerleştirilmiş ve kalıp molekülün yapıdan uzaklaştırılmasında aseton kullanılmıştır. Hem polimerin yapısal bütünlüğü sağlanmış hem de proteinin yapıya kolayca girip çıkmasına olanak sağlayacak çapraz bağlayıcı oranı optimize edilmiştir. Kalıp protein tripsin ile yapılan bağlanma deneyleri ve kimotripsin ile gerçekleştirilen yarışmalı bağlanma deneyleri ile hazırlanan reseptörün etkinliği araştırılmıştır. Hirayama ve ark. (2001) akrilik asit, akrilamid ve N,N-dimetilaminopropil-akrilamidi beraberce kullanarak lizozim baskılanmış polimer hazırlamışlardır. Silika küreler lizozim baskılanmış polimer tabakası ile kaplanmış ve hazırlanan bu baskılanmış 24 polimerin lizozimi yarışmacı protein sığır serum albumini (BSA) yanında seçici olarak bağladığı belirlenmiştir. Lizozim baskılanması için diğer bir çalışma Ou ve arkadaşları (2004) tarafından yapılmıştır. Çalışmada metakrilik asit (MAA) ve AAm fonksiyonel monomerler olarak, 2-(dietilamino) etil metakrilat ise çapraz bağlayıcı olarak kullanılmıştır. Elde edilen polimer yaş iken süzülmüş ve deiyonize su, NaCl çözeltisi ve kalıp molekülü uzaklaştırmak için tekrar deiyonize su ile yıkanmıştır. Jel liyofilize edilmiş ve spesifitesi araştırılmıştır. Baskılama faktörü (baskılanmış polimere bağlanma/baskılanmamış polimere bağlanma) 1,83 ile 3,38 arasında bulunmuştur. Fakat bununla birlikte sığır serum albumini (BSA) ile yapılan geri bağlanma deneyleri, hazırlanan polimerin kalıp proteine karşı spesifitesinin düşük olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda orijinal kalıp molekülün % 25‘inden fazlası da polimerin içinde kalmıştır. Akrilamid jel, Guo ve arkadaşları (2004) tarafından hemoglobin baskılanması için bir hapsetme malzemesi olarak kullanılmıştır. Makrogözenekli çapraz bağlı kitosan küreler polimerizasyondan önce akrilamid ve proteinin difüze olması için bir destek maddesi olarak kullanılmıştır. Protein daha sonra asetik asit/sodyum dodesil sülfat (SDS) karışımı kullanılarak uzaklaştırılmıştır. Baskılanmış kitosan küreler, kalıp proteini hem baskılanmamış kitosan akrilamid kürelerden hem de sadece poliakrilamidten hazırlanan baskılanmamış kürelerden çok daha seçici bir şekilde bağlamıştır. Bu çalışma ile hazırlanan kürelerin daha sonra kromatografi malzemesi olarak kullanılması ve hazırlanan baskılanmış polimerin hemoglobin ve BSA‘e karşı olan seçiciliği kanıtlanmıştır (Guo ve ark. 2005). Bu çalışma ile kitosanın oluşturulacak bağlanma bölgelerini desteklemek üzere yüzeye eklenmesinin, kürelerin mekanik kararlılığını arttırdığı kanıtlanmıştır. Huang ve ark. (2005) proteinlerin ayrılması için amfoterik baskılanmış polimer hazırlamışlardır. Bu çalışmada, iki fonksiyonel monomer (MAA ve N-[3- (dimetilamino)propil] metakrilamid), çapraz bağlayıcı (BisA), ve gözenek yapıcı, CaCO3‘ın fosfat tamponu içerisinde hazırlanan süspansiyonunda lizozim ve BSA baskılanmıştır. Elde edilen jel CaCO3‘ı uzaklaştırmak için asitle yıkanmış kalıp molekül 25 ise proteaz kullanılarak uzaklaştırılmıştır. Hazırlanan jel kromatografi kolonunda denendiğinde lizozimin seçici olarak bağlandığı ancak, BSA nın seçici olarak bağlanmadığı belirlenmiştir. Bu durum ortak çoklu etkileşimlerle açıklanmıştır. Pang ve ark. (2006a) metakrilik asit temelli jel kürelere BSA baskılamıştır. Çalışmada kaliteli ve proteinin jel içerisindeki hareketini kolaylaştıracak makrogözenekli küreler hazırlanmıştır. Baskılanmamış ve baskılanmış kürelerin adsorpsiyon kapasiteleri karşılaştırıldığında bağlanmanın yüksek olduğu belirlenmiş ve daha da önemlisi BSA (MA; 67 kDa, pI 4,8) ve yarışmacı protein ovalbumin (MA; 44 kDa, pI 4,5) ile karşılaştırıldığında 4,71 gibi yüksek bir seçicilik değeri elde edilmiştir. Bu çalışmada etkin bir materyalin hazırlanabilmesinin Hjerten ve ark. (1997) tarafından önerildiği gibi sterik faktörler ve çoklu elektrostatik etkileşimlerden kaynaklandığı ileri sürülmüştür. Son yıllarda akrilatlar ile yapılan çalışmalarda lizozim (Lu ve ark. 2006) ve sığır serum albumini (Pang ve ark. 2005, Pang ve ark. 2006b) kütle polimerizasyonu tekniği ile baskılanmış fakat yine proteinin polimerik yapı içerisine giriş çıkışını kolaylaştırmak için çapraz bağ oranı düşük tutulmuştur. Takeuchi ve ark. (2007) akrilik asit ve 2-dimetilaminoetil metakrilat (DMA) monomerlerini kullanarak sitokrom c, ribonükleaz ve alfa-laktalbumini baskılamışlardır. Yapılan çalışmada asidik bir protein olan laktalbuminin bazik monomer DMA ile bazik proteinler olan sitokrom c ve ribonükleazın asidik bir monomer olan akrilik asit ile kuvvetli bir şekilde etkileşebileceği öngörülmüş ancak elde edilen sonuçlar böyle düzenli bir değişimin olmadığını göstermiştir. Kütle polimerizasyonunda hazırlanan monolitin parçalanmasını gerektiğinden, küçük moleküllerin baskılanması için genellikle süspansiyon polimerizasyonu kullanılmaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda farklı bir yaklaşım ile ribonükleaz A baskılanmış manyetik kapsüllenmiş (Tan ve Tong 2007) mikroküreler hazırlamışlardır. Bu çalışmalarda, poli(vinil alkol) gibi bir yüzey aktif madde kullanarak monomer içeren oleik asit yağ fazı ve protein içeren sulu faz, polimerizasyondan önce 26 emülsiyon haline getirilmiştir. İşlem proteinin doğal yapısını koruyacak şekilde optimize edilse de geri bağlanma deneylerinde elde edilen seçicilik değerleri düşüktür. Proteinlerin sulu çözeltide akrilat kimyası ile baskılanması, büyük moleküllerin hareketini sağlamak amacıyla düşük derecede çapraz bağ oranına sahip jellerin hazırlanması temeline dayanmaktadır. Yukarıda sözü edilen yöntemler kullanılarak bazı başarılı çalışmalar yapılmıştır. Ancak çapraz bağ derecesi düşük malzemeler baskılanma ile kazandırılmış özelliklerini çok çabuk kaybederler ve çevresel değişimlere karşı dayanıksızdırlar. Akrilat ile gerçekleştirilen baskılama işlemleri uygun monomerlerin bulunması açısından da sınırlıdır ve bu nedenle de daha farklı ve etkili malzemelere ihtiyaç vardır. 2.1.4.1.1.2. Hidrojeller Son yıllarda hidrojel adı verilen şişme özelliğine sahip malzemeler hazırlanabilmektedir. Dış uyarılara cevap veren polimerler, sıcaklık, çözücü bileşimi, pH, iyonik şiddet, ışık ve spesifik kimyasallar ile muamele edildiğinde tersinir bir dönüşüme girerek şişme davranışı göstermektedir. Bu jeller akıllı jeller olarak adlandırılmakta ve genellikle kontrollü ilaç salınımı, sensörler ve yapay kas geliştirilmesi gibi alanlarda kullanılmaktadırlar. Bu malzemelerin, proteinleri spesifik olarak bağlamasıyla bir cevap oluşturabileceği düşüncesinden yola çıkılarak hidrojel ve moleküler baskılama teknikleri bir araya getirilmiş ve enzim benzeri özellikler gösteren hidrojeller hazırlanmaya çalışılmıştır. Karmalkar ve ark. (1996) metal-ligand etkileşimli bir yöntem kullanarak imidazol, karboksil ve hidroksil gruplarını hidrojel matriks içerisinde yönlendirerek serin proteaz sınıfı bir enzim olan alfa-kemotripsinini taklit etmeye çalışmıştır. Kalıp molekül, 2- ([(izobutirilamino) kaproil]-L-fenilalanil) 2-aminopiridinin uzaklaştırılması ile polimerin katalitik aktivitesi, nitrofenil esterlerin katalizinin izlenmesi ile belirlenmiştir. Baskılanmış polimer alfa–kemotripsin ile kıyaslanabilir büyüklükte bir hızda hidrolizi gerçekleştirirken baskılanmamış polimer kötü bir katalitik aktivite sergilemiştir. 27 Watanabe ve ark. (1998) N-izopropilakrilamid (NIPAM) ve akrilik asidi bir çapraz bağlayıcı ve çeşitli kalıp moleküllerin varlığında polimerleştirerek sıcaklığa duyarlı hidrojeller hazırlamışlardır. Kalıp molekülün uzaklaştırılmasından sonra hidrojelin kritik sıcaklıkta karakteristik şişme davranışı gösterirken daha yüksek sıcaklıklarda tamemen çökmüş durumda olduğu belirlenmiştir. Düşük bir sıcaklıkta şişmiş olan jelin kalıp molekül ile etkileşmesi sonucu şişme davranışında herhangi bir değişim olmaz iken yüksek sıcaklıkta çökmüş olan jelin kalıp molekül derişiminin artmasıyla artan bir şişme davranışı sergilediği görülmüştür. Bu da çökmüş durumdaki jelin kalıp molekülü tanıdığını, ancak şişmiş durumda tanımadığını göstermiştir. Norefedrin spesifitesi artan efedrin derişimi ile şişmenin artması ancak adrenalin ile şişmenin olmamasının gözlenmesi ile kanıtlanmıştır. Parmpi ve Kofinas (2004) ve Wizeman ve ark. (2001) kovalent olmayan baskılama tekniğini kullanarak glukoz fosfat ile baskılanmış poli(allilamin hidroklorür) hidrojel hazırlamışlardır. Hazırlanan moleküler baskılanmış hidrojel ile kantitatif olarak izomer spesifik glukoz ayrımı gerçekleştirilmiştir. Polimerin hazırlanmasında ilk olarak iyonik etkileşimlere dayanan ön polimerleşme kompleksi oluşturulmuş ardından epiklorhidrin ile çapraz bağlanma gerçekleştirilmiştir. Moleküler baskılanmış hidrojellerin seçiciliği fruktoz ile denenmiş ve başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Baskılanabilen hidrojeller sadece küçük moleküller için hazırlanabilmelerine rağmen, şişme özellikleri sayesinde kalıp molekülün kolayca hareketine olanak sağlayan kafesleme özellikleri ile protein baskılama ile ilgili problemlere bir çözüm önerisinde bulunmaları açısından önemlidirler. Bu düşünce bu malzemelerin protein salınım araçları olarak kullanımını rapor eden çalışmalar ile desteklenmiştir (Peppas ve ark. 2000, Peppas 2002). Proteinin biyolojik aktivitesini koruyarak bir malzeme içine hapsedilmesine ilişkin çok sayıda çalışma yapılmıştır (Gill ve Ballesteros 2000a,b). Bu tür katkılanmış polimerlerin hazırlanmasında sol-jel kimyasının kullanılmasının ideal bir çözüm olacağı kanıtlanmıştır (Gill 2001). Zhang ve ark. (2006a) tarafından yapılan bir çalışmada BSA baskılanmış Ca-alginat kürelerin BSA adsorplama kapasitesinin hidrofilik bir selüloz türevi olan hidroksietil 28 selüloz ilavesiyle arttığını gösterilmiştir. Bu sistem daha yoğun bir polimer ağ yapısına sahip olup çapraz bağların sağlamlığının artmasına neden olmuştur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar ile hemoglobin (Xia ve ark. 2005, Hawkins ve ark. 2006) ve lizozim (Odabaşı ve ark. 2007) baskılanmış hidrojeller hazırlanmıştır. 2.1.4.1.1.3. Sol-jeller Sol jeller kütle polimerizasyonu ile proteinlerin baskılanmasında kullanılabilen diğer bir polimer grubudur. Sol jeller katı bir malzeme oluşturmak üzere jelleştirilen silika partiküllerinin kolloidal bir süspansiyonudur. Sol jel prosesinde su bulunması ve ılıman çalışma koşulları (pH ve iyonik şiddet gibi) bu polimerleri moleküler baskılama için kullanılabilir hale getirmektedir. Venton ve ark. (1995a,b) polisiloksan kimyasını keşfetmişler ve silanol monomerleri üzerindeki organo-fonksiyonel yan zincirlerin polimerizasyon prosesinde protein yüzeyindeki tamamlayıcı kalıntılar ile assosiye olduğunu ve böylece polimer içerisinde proteine özgü bağlanma bölgeleri oluşturabildiklerini kanıtlamışlardır. 3-Aminopropiltrietoksisilan (APTES) ve tetraetilortosilikatın (mol oranı 1:3) protein varlığında (BSA ve üreaz) polimerleştirilmesi ile hazırlanan polimerin kalıp moleküle seçici olarak bağlanma özelliğine sahip olduğu belirlenmiştir. Fakat bununla birlikte çapraz bağ oranının yüksek olması nedeniyle yüksek oranda kalıp molekül polimerik yapının içinde kalmıştır. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda farklı protokoller kullanılarak yüksek dayanıklılığa ve farklı fizikokimyasal özelliklere sahip değiştirilebilen bir sol-jel türevi olan xero-jel kullanılarak ovalbumin baskılanmış polimer hazırlanmıştır (Tao ve ark. 2006). Analitin bağlanması bağlanma bölgesinin luminesans özelliğe sahip molekül ile işaretlenmesiyle takip edilmiştir. Elde edilen baskılanmış polimer ile iki farklı kaynaktan elde edilen aynı protein bile birbirinden ayrılabilmiştir. (Örn. insan ve domuz interlökin-1α proteini gibi) 29 Sol-jel reaksiyonu ılıman reaksiyon koşulları, sulu ortama uyumluluğu gibi özellikleri nedeniyle proteinlerin baskılanması için oldukça uygundur. Fakat proteinlerin kütle polimerizasyonu ile baskılanması yukarıda verilen örnekler ile sınırlıdır. Bunun nedeni sol jel yapısının çok yoğun olması ve bağlanma bölgelerine ulaşımı sağlamak için polimerin parçalanmasına olan gereksinimdir. Büyük moleküllerin bağlanma bölgeleri küçük moleküllerin bağlanma bölgelerinden farklı olarak mekanik parçalamadan zarar görmektedir ve bu da bağlanma bölgelerinin spesifitesini azaltmaktadır. 2.1.4.1.2. Epitop yaklaşımı Doğada gerçekleşen antijen-antikor etkileşimi antikor ile proteinin üzerinde epitop adı verilen bölge arasında gerçekleşen antijenik tanımaya bağlıdır. Epitop antikorun tanıma bölgesini tamamlayan kısa aminoasit parçalarıdır. Moleküler baskılama alanında Rachkov ve Minoura (2000, 2001) bu olguyu protein tanıyan polimerlerin hazırlanmasında yeni bir prosedür geliştirmek için kullanmışlardır. MIP hazırlanmasında bütün bir protein yerine protein yüzeyinde yer alan kısa bir peptid sekansı kullanılmıştır (Şekil 2.1.4.1.2.1). Matriks bir kez polimerleştirildiğinde oluşan baskılanmış malzeme tüm proteini tanıyıp bağlanabilmektedir. Rachkov ve Minoura (2001) yaptıkları çalışmada monomer olarak hidroksietil metakrilat (HEMA) , çapraz bağlayıcı olarak da etilen glikol dimetakrilat (EGDMA) kullanarak bir nörohipofizal hormon ve nonapeptid olan oksitosin için baskılama işlemini gerçekleştirmişlerdir. Üç aminoasitlik bir oksitosin sekansının baskılanması ile tüm proteinin tanınması sağlanmıştır. Daha sonra epitop yaklaşımı bir oktapeptid olan anjiotensin II hormonunun tanınması için başarıyla kullanılmıştır (Rachkov ve ark. 2004). Ardından bu yaklaşım, ds-DNA kalıp molekül olarak kullanılarak silika temelli malzemelerde de uygulanmıştır (Slinchenko ve ark. 2004). 30 Şekil 2.1.4.1.2.1. Epitop yaklaşımının şematik gösterimi Nishino ve ark. (2006) epitop yaklaşımını sitokrom c, BSA ve alkoldehidrojenaz tanımaya yönelik polimerlerin hazırlanmasında kullanmışlardır. Bunun için ilk olarak, proteinlerin peptid epitopları cam ya da silikon yüzeye kovalent olarak bağlanmış ve ardından akrilamid, N,N’-etilenbisakrilamid ve polietilen glikol 200-diakrilat MIP oluşturulması amacıyla yüzeyde polimerleştirilmiştir (Şekil 2.1.4.1.2.2). Yakalama bölgeleri olarak sitokrom c için yine bu proteinin küçük peptid fragmentini kullanmışlardır. Hazırlanan baskılanmış filmin baskılanmamış filme göre 7 kata daha seçici bir afinite ve bağlanma kapasitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Doğru peptid epitop olarak seçildiğinde BSA içinde yine seçiciliği yüksek bir polimerik film başarıyla hazırlanmıştır. Özellikle dikkat etmek gerekir ki mutant bir peptid kullanıldığında (sadece bir aminoasidi farklı) seçicilik düşmüştür. Bu çalışmada ayrıca potansiyel bağlanma bölgelerinin sayısı azaltıldığından spesifik olmayan bağlanma da azaltılmış ve hidrojen bağları ve hidrofobik etkileşimler gibi ortak ve çoklu etkileşimlerle spesifik bağlanma sağlanmıştır. Sitokrom c nin tanınması ve ayrılmasına yönelik sıra dışı bir yaklaşım metal şelat oluşturma yeteneğine sahip monomer olan N-metakriloil-L-histidin-Cu2 ile metal koordinasyon etkileşimine giren L-histidinin epitop kalıp olarak kullanılması ile gerçekleştirilmiştir (Özcan ve ark. 2006). Metal koordinasyonu bağlanma afinitesini ve seçiciliği arttırmaktadır. Baskılanmış sistem kararlıdır ve adsorbsiyondan sonra bağlanma kapasitesinde bir azalma olmadan kullanılmıştır. Ancak bu sistem sadece monomer ile koordinasyon bağı oluşturabilecek aminoasitleri yüzeyinde taşıyan bazı proteinler (hemoglobin, miyoglobin vb.) için kullanılabilir. 31 Şekil 2.1.4.1.2.2. Protein baskılanmış film kullanarak epitop baskılama (a) Cam modifikasyon ve peptid bağlama metodu (b) MIP oluşumunun gösterimi (c) C-terminal peptid sekansı baskılanmış yüzeyde için öngörülen tanıma mekanizması(Nishino ve ark. 2006) Epitop yaklaşımında baskılama işlemi epitop ile polimer arasındaki etkileşime bağlı olduğu için küçük bir bölgeden gerçekleşecek etkileşim tüm protein ile polimer arasında yeterince güçlü bir afinite sağlamayabilir. Bu nedenle epitop yaklaşımının başarısı seçilen epitopun üç boyutlu yapısı ile yakından ilişkilidir. Fonksiyonel ya da modifiye peptidlerin ise sentezi ve saflaştırılması oldukça zordur. 2.1.4.1.3. Yüzey baskılama Kütle polimerizasyonu ile baskılama tekniğinin büyük moleküller olan proteinler için kullanımı sınırlıdır. Alternatif yaklaşımlardan biri polimerleri ince filmler şeklinde hazırlamak ya da bir destek yüzeyine tutturmaktır (Nicholls ve Rosengren 2002). Yüzey baskılamada temel strateji bağlanma bölgelerinin yüzeyde ya da yüzeye yakın 32 bölgelerde oluşturulmasıdır. Bu sayede protein moleküllerinin kolayca bağlanma bölgelerine ulaşması sağlanmaktadır. Fakat bununla birlikte bu yaklaşım ile hazırlanan moleküler baskılanmış polimerlerde protein yüzeyinin belli bir bölümü baskılandığından seçicilik düşük olabilir. Aynı zamanda heterojen bağlanma bölgelerinin oluşma olasılığı yüksektir. Yüksek kütle transferi, sensör platformları ile entegrasyon ve sağlamlık gibi avantajlar ise bu yaklaşımı protein baskılamada klasik kütle polimerizasyonuna göre daha fazla tercih edilen bir metod haline getirmiştir. Bu avantajlar ve son zamanlarda yüzey kimyasına olan artan ilgi nedeniyle yüzey baskılama metodu ile protein baskılanmasına ilişkin araştırma sayısı artmaktadır. Protein baskılama alanında rapor edilen ilk çalışma Glad ve ark. (1985) tarafından yapılmıştır. Bu çalışmada baskılanmış polimerin silanlanmış silika kürelerin yüzeyine kaplanmasına dayanan bir metod geliştirilmiştir. Glikoprotein Tf in baskılanması için organik silan karışımı, silika partiküllerinin yüzeyinde Tf in karbonhidrat bölümü ile etkileşim için dizayn edilen yeni bir boronat-silan monomeri içeren sulu çözeltide polimerleştirilmiştir. HPLC deneyleri ile baskılanmış partiküllerin kalıp proteini bağlama kapasitesi kontrol partiküller ile karşılaştırıldığında baskılanmış partiküllerin üstün enzimatik özelliklere sahip olduğu belirlenmiştir. Bu partiküller aynı zamanda kalıp moleküle yarışmacı molekül BSA ya göre çok daha yüksek bir afinite ile bağlanabilmektedir. Bu sonuçlar silan kalıpların proteinleri üç boyutlu yapıları ile tanıyabildiğini göstermiştir. Bu metod ile protein baskılamaya yönelik önemli çalışmalardan birisi de Kempe ve ark. (1995) tarafından yapılmıştır. Bu çalışma ile proteinin belli bir bölümü baskılanarak belli bir oryantasyondaki proteinin tanınması sağlanmıştır. Baskılamadaki etkileşimler Mallik ve ark. (1994a,b) tarafından önerildiği gibi metal koordinasyonu ile sağlanmıştır. Silika yüzeyleri 3-(trimetoksisilil)propilmetakrilat ile türevlendirilmiş ve böylece yüzeyde çift bağlar oluşturularak polimer yüzeye bağlanmıştır. Kalıp protein ribonükleaz A, metal iyonları ve fonksiyonel monomer N-(4-vinyl-benzyl) iminodiasetik asit (VBIDA) ile karıştırılmıştır. Proteinin yüzeyinde bulunan imidazol grupları, metal bağlanmış fonksiyonel monomer ile kompleksleştirilerek proteinin tanınmasını sağlayacak boşluklar oluşturulmuştur. Hazırlanan moleküler baskılanmış 33 partiküllerin seçiciliği kromatografi kolonu kullanılarak test edilmiştir. Seçicilik faktörü lizozim için 2,46 iken, kalıp molekül olan ribonükleaz için 5,79 olarak bulunmuştur. Elde edilen bu olumlu sonuçlara rağmen metal-şelat yaklaşımı çok kullanılan bir yaklaşım değildir. Bunun ana sebebi bu yaklaşımın sadece yüzeyinde histidin aminoasit kalıntıları taşıyan proteinlere uygulanabilmesidir. İlaveten , metal-şelat oluşturucu grup spesifik olmayan bağlanmalara da uygundur. Bu da gerçek örneklerde bağlanmayı zorlaştıracaktır. Burow ve Minoura (1996) ve ardından Hirayama ve ark. (1998) glukoz oksidaz proteinini, akrilatları kullanarak türevlendirilmiş silika küreler üzerine baskılamıştır. İki çapraz bağlayıcı (metilen bisakrilamid ve N,N’-1,2-dihidroksietilenbisakrilamid) ve iki fonksiyonel monomerden (akrilamid ve akrilik asit ) oluşan polimerizasyon karışımı protein ve yüzeyi modifiye edilmiş silika kürelerin varlığında polimerleştirilmiştir. Böylece silika küreleri saran ince bir polimerik film tabakası elde edilmiştir. Hazırlanan moleküler baskılanmış polimerin glukoz oksidaza olan seçiciliği BSA ya karşı denenmiştir. Tanıma özelliğinin elektrostatik etkileşimler ve kalıp ile protein arasındaki şekilsel konformasyon uyumundan kaynaklandığı düşünülmüştür. Hirayama ve arkadaşları (2001) aynı tekniği kullanarak lizozim baskılanmış polimer hazırlamışlardır. Seçicilik deneyleri için lizozim ve hemoglobin kullanılmış ve her iki protein için de spesifik olmayan bağlanma olmasına karşın hazırlanan MIP hemoglobine göre orta derecede bir seçicilik göstermiştir. Yılmaz ve ark. (2000) gözenekli silika üzerine kalıp molekül teofilini immobilize ettikleri bir çalışma ile yüzey baskılamaya yeni bir yöntem kazandırmışlardır. Polimerizasyondan sonra , silika destek çözülmüş ve kalıp molekül ile birlikte uzaklaştırılmıştır. Bu teknik MIP hazırlandıktan sonra kalıbın uzaklaştırıldığı klasik yüzey baskılama tekniğinden farklıdır. Sonrasında aminoasitler ve peptidler de bu yöntem kullanılarak baskılanmıştır (Titirici ve ark. 2002, Titirici ve ark. 2003 ). Bu zekice yaklaşımdan ilham alarak Li ve ark. (2006a) yüzey baskılanmış nanotellerin hazırlanması için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bu yöntemde kalıp molekül (hemoglobin, sitokrom c ve BSA), akrilamid ve metilen bisakrilamid ile 34 polimerizasyondan önce gözenekli alumina üzerine immobilize edilmiştir. Alumina membran polimerizasyondan sonra çözülerek yüzeyinde bağlanma bölgeleri içeren baskılanmış polimer nanoteller hazırlanmıştır (Şekil 2.1.4.1.3.1). Baskılanmış nanotellerin bağlanma kapasitesinin yüksek olduğu belirlenmiştir. Ayrıca baskılanmış nanoteller ile 547 aminoasidin sadece % 15’ inde farklılık gösteren sığır albumini ile insan albuminini bile birbirinden ayrılabilmiştir. Bağlanma kapasitesinin bu kadar yüksek olmasının monodispers nanotellerin oldukça yüksek bir baskılanmış alan sağlamasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Şekil 2.1.4.1.3.1. Yüzey baskılanmış nanotellerin hazırlanmasına ait şematik gösterim Shiomi ve ark. (2005) tarafından yapılan çalışmada ise kalıp proteini silika küreler üzerine immobilize etmede başka bir yaklaşım kullanılmıştır. Bu çalışma silika monomerlerinin kalıp molekül varlığında silika küreler üzerine bağlandığı Şekil 2.1.4.1.3.2 de gösterilen yöntem ile, yukarıda bahsedilen çalışmalarla temelleri atılan metodu ileriye taşıyacak niteliktedir (Glad ve ark. 1985, Venton ve Gudipati 1995 a,b). Bu çalışmada kalıp molekül hemoglobin polimerizasyon sırasında serbest halde bırakılmak yerine türevlendirilmiş silika yüzeyine kovalent olarak immobilize edilmiştir. İmmobilize edilmiş ve edilmemiş hemoglobin ile hazırlanan moleküler baskılanmış polimerler karşılaştırıldığında immobilize durumda bağlanma kapasitesinin diğerine göre çok yüksek olmadığı ancak yarışmalı bağlanma deneylerinde performansının daha iyi olduğu görülmüştür. Moleküler baskılanmış polimerler kalıp 35 moleküle spesifik olarak bağlanırken, yarışmacı proteinler olan transferin ve kimotripsinogen pratik olarak hiç bağlanmamıştır. Bu da küreler üzerinde homojen bağlanma bölgelerinin oluştuğunu göstermektedir. Fakat aynı zamanda miyoglobin gibi kalıp moleküle benzer yükte ve neredeyse hemoglobine eşit pI değerine sahip bir protein polimere bağlanmakta ve uzun inkübasyon sürelerinden sonra ayrılmaktadır. Şekil 2.1.4.1.3.2. Protein immobilizasyonunun şematik gösterimi Diğer bir yüzey baskılama yöntemi de kalıp molekülün katı bir destek üzerine yönlendirilerek immobilize edilmesidir. Büyüyen polimer zinciri, kalıp molekülü taşıyan yüzeye çok yakın polimerleştirilir. Polimerizasyondan sonra , destek maddesi sert kimyasal koşullarda parçalanır. Kalıp molekülü yüzeye bağlamanın çok sayıda avantajı vardır. Örneğin , polimerizasyon karışımında çözünmeyen bir kalıp molekülle kolayca çalışmak mümkündür. Daha da ötesi kalıp molekül immobilizasyonu protein agregasyonunu minimize eder ve bağlanma yüzeyinin daha homojen olmasını sağlar. Shi ve ark. (1999) tarafından yapılan bir çalışmada kalıp molekül mika gibi hidrofilik ve negatif yüklü bir destek maddesi üzerine tutturulmuştur. Bu, adsorbe edilmiş proteinlerin denaturasyonunu önlemek açısından çok önemlidir. Protein kalıp mika üzerine tutturulmuş, disakkarit tabakası ile kaplanmış ve ardından tekrar 10-30 nm kalınlığında hekza-floropropilen ince film tabakası ile kaplanmıştır. Elde edilen film epoksi reçine kullanılarak kalıplamada kullanılacak cam yüzeye tutturulmuş ve fırınlanmıştır. Ardından sert kimyasal koşullar kullanılarak mika baskılanmış filmden uzaklaştırılarak kalıp moleküle özgü boşluklar oluşturulmuştur. Hazırlanan moleküler 36 baskılanmış polimerin kalıp moleküle olan seçiciliği yarışmalı bağlanma deneyleri ile kanıtlanmıştır. Seçiciliği araştırmak için çok yakın fizikokimyasal özelliklere ve izoelektrik noktaya sahip iki protein olan ribonükleaz A (RNAase) ve lizozim kullanılmıştır. RNAase ‘ın kalıp molekül olarak kullanıldığı durumda lizozim ve RNAase karışımından RNAase 20 kat seçicilikle tanınmıştır. Bu, kalıp molekülün yüksek seçilikle bağlandığını göstermektedir. İki boyutta gerçekleştirilen baskılama işleminin üç boyutlu polimerik matrikslerde karşılaşılan difüzyon kontrollü dengeyi ortadan kaldırarak daha etkin bir bağlanma kinetiğinin elde edilmesini sağlayacağı (Mirsky ve ark. 1999) düşüncesindenden yola çıkarak ilk olarak Piletsky ve ark. (2001) polistiren mikroplaklar üzerine 3- aminofenilboronik asit (ABPA) den yapılmış ince filmler hazırlamışlardır. Bu teknik hem atrazin ve epinefrin gibi küçük moleküller hem de proteinler için uygulanmıştır. Protein baskılanması sırasında, yıkama ve tekrar bağlanma koşullarının optimizasyonundan sonra, moleküler baskılanmış plakların bağlanma seçicilikleri denenmiştir. Çalışmada boyut ve izoelektrik noktaları değişen laktoperoksidaz, hemoglobin, horseradish peroksidaz, sitokrom c ve mikoperoksidaz proteinleri kalıp molekül olarak kullanılmıştır. Geri bağlanma çalışmaları yük ve boyutun geri bağlanmada çok önemli olduğunu göstermiştir. Bu sonuç, küçük proteinlerin μM düzeyinde KD dissosiasyon sabitlerine sahip olduğu; laktoperoksidaz, hemoglobin ya da horseradish peroksidaz gibi büyük proteinlerin dissosiasyon sabitlerinin ise küçük proteinlerden bin kat daha küçük olduğunu göstermiştir. Uygulanan bu yaklaşımı ile hemoglobin ve glikozillenmiş izoformu birbirinden ayrılabilmiştir. Bossi ve ark. (2001) 3-aminofenilboronik asidi amonyum persülfat ile yükseltgeyerek horse radish peroksidaz, hemoglobin, mikoperoksidaz, laktoperoksidaz gibi proteinlerin baskılanmasında kullanmıştır. Polimerizasyon prosesi süresince oluşan polimer mikrotabaka, polistiren yüzeyine aşılanmıştır. Bu aşılama işleminin baskılamaya ve dolayısıyla proteinin bağlanma bölgelerince kolayca tanınmasına yardımcı olduğu kanıtlanmıştır. Kullanılan tüm proteinler için oldukça iyi baskılama faktörleri ve oldukça yüksek seçicilik değerleri elde edilmiştir. 37 Ardından bu yaklaşım QCM çip yüzeyinde protein sensörün hazırlanmasında kullanılmıştır. QCM piezzoelektrik etkiyi temel alan basit, düşük maliyetli, ayırma gücü yüksek bir kütle hassas tekniktir. Metodoloji olarak bakıldığında , geniş çözelti-yüzey arayüzeyi ve ölçüm yeteneğine sahip olması nedeniyle analitik kimyadaki kütle ölçümleri için değerlidir ve geniş bir dedeksiyon aralığına sahiptir. Rick ve Chou (2005) QCM in MIP uygulamasında kullanıldığı yeni bir çalışmayı literatüre kazandırmışlardır. Bu çalışmada kalıp molekül olarak lizozim ve sitokrom c kullanılarak poli-APBA, QCM çip üzerinde hazırlanmış ve her iki protein için de yüksek seçicilik değerleri elde edilmiştir. Albumin ve miyoglobin gibi yarışmacı proteinler için elde edilen geri bağlanma değerleri ihmal edilebilecek kadar düşüktür. Çalışmanın en büyük başarısı ise lizozim ve sitokrom c’ nin aynı anda kalıp molekül olarak kullanıldığı durumda bile iki proteini birbirinden ayırabilmesidir. Son zamanlarda quartz kristal mikrobalans çip yüzeyinde MIP hazırlanmasına ilişkin çalışmalar ön plandadır (Turner ve ark. 2007a, Rick and Chou 2006). Zhang ve ark. (2006b) sol- jel ve SAM (self-assembled monolayer) teknolojisinin birleştirildiği yeni bir metod geliştirmişlerdir. Bu çalışmada QCM çip üzerinde insan serum albumini baskılanmış polimer hazırlanmıştır. Hazırlanan sensör BSA ve hemoglobin proteinleri ile karşılaştırıldığında kalıp molekül insan serum albuminine karşı büyük bir seçicilik göstermiş ve bu seçiciliğin, yük, moleküler tanıma ve hazırlanan filmin şişme derecesinin toplam etkisinden kaynaklandığı düşünülmüştür. Son zamanlarda yapılan başarılı çalışmalardan bir diğeri de Baltus ve ark. (2007) tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada QCM sensör yüzeyine immobilize edilen alfa-östrojen reseptörün genetik mühendislik ile hazırlanan hormon bağlanma bölgesi için bir ligand geliştirilmiştir. Genetik olarak değiştirilmiş reseptörün QCM altın çipi üzerine bağlanması için iki farklı yaklaşım kullanılmıştır: (1) tek çözücü ile muamele sistein içeren mutant reseptörün kükürt altın kimyasından yararlanarak QCM yüzeyine direkt olarak bağlanması (2) N-terminal histidin kuyruğu nikel ile kompleksleştirilmiş 3,3- ditiyobis-[N-(5-amino-5-karboksipentil) propiyonamid-N,N'-diasetik asit] aracılığı ile reseptörün bağlanması. Bu sonuçlar reseptörü sensör yüzeyine bağlamak için kullanılan yöntemin istenen sensör cevabın alınmasında temel oluşturduğunu 38 göstermiştir. Bu çalışma protein reseptörleri kullanılarak QCM temelli sensörlerin hazırlanmasında önemli bir aşama sağlamıştır. QCM kullanarak gerçekleştirilen yeni bir uygulama protein baskılama alanında iyi sonuçlar vermiştir (Turner ve ark. 2007b). Çalışmada APBA model protein olarak kullanılan sığır alfa-laktoglobilinin doğal, termal ya da çözücü ile indüklenmiş konformasyonlarının ayrılmasında protein baskılama matriksi olarak kullanılmıştır. Proteinin konformasyonel değişimleri sirküler dikroizm (CD) kullanılarak izlenmiştir. Baskılanmış ve kontrol poli(APBA) filmlere protein bağlanması ise QCM ile izlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre , her bir izoformun kendi yapısına ait moleküler boşluklara büyük bir afinite gösterdikleri belirlenmiştir. Bu da protein baskılanmış boşlukların hazırlanmasında sterik özelliklerin ne kadar önemli olduğunu kanıtlamıştır. Bu çalışma aynı zamanda moleküler baskılama tekniğinin aynı proteinin farklı konformasyonlarını ayırmada da etkin olduğunu göstermiştir. Bu sayede farklı proteinleri birbirinden ayırt etmekten bir adım öteye gidilmiş , orta seviyedeki seçicilik değerlerine rağmen, moleküler baskılama tekniğinin esnek bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Çalışmayı gerçekleştiren bilim adamlarına göre elde edilen sonuçlar literatürde ilk ve iyi sonuçlardır. Kütle polimerizasyonu ile monolitik malzemelerin hazırlanması küçük moleküller için baskılanmış polimerlerin hazırlanmasında temel dayanak noktası olmasına karşın, bu şekilde hazırlanan malzemeler sensörler ile entegre edilememektedir. Bu nedenle, moleküler baskılanmış filmlerin direkt olarak sensör yüzeylerinde hazırlanması son yıllarda popüler bir araştırma alanı haline gelmiştir. Daha da ötesi moleküler baskılanmış ince filmler doğası gereği kütle transferini arttıran ve kalıp proteinin hapsedilmesini engelleyen yüksek bir yüzey alanına sahiptir. Matsunaga ve Takeuchi (2006) direkt olarak SPR sensör yüzeyinde protein baskılanmış film hazırlamışlardır. Kalıp olarak protein molekülünü kristalize halde kullanmışlardır. Kristalin halde proteinler, sulu çözeltide olduklarından çok daha kararlı bir yapıda olup denatürasyona karşı daha dayanıklıdırlar. Buna karşın her iki durumda da konformasyon aynıdır. Şekil 2.1.4.1.3.3 de gösterildiği gibi, lizozim selüloz membran üzerinde kristallendirilmiş ve ardından akrilik asidin sulu çözeltisi ile inkübe edilmiştir. Poli(etilen glikol) de 39 çözeltiye proteinin çözünmesini engellemek için ilave edilmiştir. Membran daha sonra polimerizasyon karışımının tamamı ile ve daha önceden N,N’-bis(akriloil)sistamin ile modiye edilmiş SPR çip ile temas ettirilmiştir. N,N’-bis(akriloil)sistamin kullanılmasının nedeni baskılanmış polimerin adhezyonunu sağlamaktır. Polimerizasyon 36 0 C’de gerçekleştirilmiş ve selüloz membranın çözünmesi için çip aseton ile muamele edilmiştir. Daha sonra kalıp protein lizozim yapıdan uzaklaştırılmıştır. Hazırlanan SPR çipler lizozim, sitokrom c, kimotripsin ve tripsin ile test edilmiştir. Kalıp molekül lizozim yüksek bir sinyal değeri verirken diğer üç kontrol protein sinyal vermemiştir. Kullanılan proteinlerin hepsi baziktir ve lizozim boyut olarak bu proteinlerin ne en büyüğü ne de en küçüğüdür. Hidrofobisitesi en az olandır. Bu bilgiler lizozimin SPR çip üzerinde oluşturulan bağlanma bölgelerine spesifik olarak bağlandığını göstermektedir. Baskılanmamış polimeri içeren SPR çip lizozimi baskılanmış SPR çipe göre çok daha düşük seçicilikle bağlamıştır. Bu sonuçlar kalıp olarak protein kristalleri kullanmanın proteinlerin baskılanmasında yararlı olabileceğini göstermiştir. Şekil 2.1.4.1.3.3. Kristal lizozim kullanılarak yüzey plazmon rezonans çip yüzeyinde baskılanmış polimer hazırlanması Son zamanlarda geliştirilen yöntemlerden birisi de mikro-temas baskılamadır (Şekil 2.1.4.1.3.4). Bu yöntem Chou ve ark. (2005) tarafından geliştirilmiş ve ilk kez cam yüzeyinde spesifik bağlanma bölgelerinin hazırlanması için kullanılmıştır. O-(4- nitrofenilfosfaril) kolin (4-NPPC) fonksiyonel monomer, polietilen glikol 400 40 dimetakrilat çapraz bağlayıcı olarak kullanılarak mikroskop camı yüzeyinde her biri 206 amino asitten oluşan beş adet eş alt birimden oluşan bir protein olan C-reaktif protein (CRP) için tanıma bölgeleri içeren tek tabaka hazırlanmıştır. Bağlanma deneyleri sonucu kalıp molekül için yüksek bağlanma değerleri elde edilmiş, CRP için bağlanma değeri 1 μg/cm2 iken, insan serum albumini (HSA) ve lizozim için bu değer sırasıyla 0,3 μg/cm2 ve 0,1 μg/cm2 olarak bulunmuştur. Şekil 2.1.4.1.3.4. Mikrotemas baskılama yönteminin şematik gösterimi Aynı yaklaşım ile daha sonra miyoglobin, lizozim ve ribonuclease A için moleküler baskılanmış polimerler hazırlanmış ve bu çalışmada monomer ve çapraz bağlayıcının önemi vurgulanmıştır (Lin ve ark. 2006). 41 Aynı bilim adamları miyoglobini tanımaya yönelik ince bir polimerik film hazırlamışlar ve daha önce hazırladıkları polimerlerin tanıma kapasitesini arttırmaya çalışmışlardır (Lin ve ark. 2007). Miyoglobine özgü farklı özellikteki farklı polimerler hazırladılar. Örneğin tetraetilen glikol dimetakrilat (TEGDMA) kalıp moleküle en az afinite gösteren çapraz bağlayıcı olarak belirlenmiştir. Metil metakrilat (MMA) fonksiyonel monomer olarak seçilmiş, TEGDMA ile birlikte kullanıldığında ve diğer fonksiyonel monomerler ile hazırlanan polimerler ile karşılaştırıldığında çok daha yüksek seçicilik değerleri elde edilmiştir. Doğal biyolojik matriksler olan idrar ve kan ile çalışıldığında moleküler baskılanmış film baskılanmamış filme göre çok daha yüksek afinite ile kalıp moleküle bağlanmıştır. Seyreltilmemiş idrar ile yapılan analizlerde 37,4 değerinde bir baskılama kapasitesine ulaşılmıştır. Bağlanma ve yarışmalı bağlanma deneyleri ile elde edilen sonuçlarla bu tekniğin ileride yapılacak uygulamalar için etkin olduğu kanıtlanmıştır. Bu sonuçlar, mikrotemas baskılama yönteminin proteinler için yüksek bağlanma kapasiteli ve seçicilikte moleküler baskılanmış polimerler hazırlanmasında kullanılabileceğini göstermektedir. Kütle polimerizasyonu ile gerçekleştirilen protein baskılama metodlarının dezavantajlarını ortadan kaldıran yüzey baskılama tekniği bu alanın gelişmesini sağlayan bir metod olarak karşımıza çıkmaktadır. Proteinin spesifik bölgelerinin baskılanması 3D polimer matikslerdeki difüzyon kontrollü dengenin sağlanması için gerekli süreyi azaltarak bağlanma kinetiğini değiştirmektedir (Rick ve Chou 2005). Daha da ötesi baskılanmış polimerler sensörler ile entegre edilebilirler. Yüzey baskılama ile hazırlanmış moleküler baskılanmış polimerlerde toplam protein bağlama kapasitesi azalmaktadır ve her protein için geçerli bir protokol yoktur. Daha da ötesi proteinin yalnızca belli bir bölümü baskılandığından heterojenite ve spesifitede azalma kaçınılmazdır. Ancak son zamanlarda yapılan çalışmalar ile kalıp molekül bir yüzeye immobilize edilerek baskılanmıştır. Kalıp molekülün immobilizasyonu ile hazırlanan MIP ler ile yapılan tüm deneyler daha homojen bağlanma bölgelerinin oluştuğunu göstermektedir. Daha da ötesi bu yöntem ile polimerizasyon karışımında çözünmeyen kalıp moleküller ile de çalışılabilmekte ve protein agregasyonu minimize edilebilmektedir. 42 2.1.5. Biyosensörler Yaşam bilimleri alanındaki gelişmeler sayesinde (genomiks, proteomiks, moleküler mühendislik) birçok hastalığın tedavisi için yeni yötemler geliştirilmiş , halk sağlığı daha üst düzeye taşınmış ve yaşam süresi beklentisi artmıştır. Gelişmiş ülkelerde yaşam tarzından kaynaklanan kardiyovasküler hastalıklar gibi hastalıklar temel halk sağlığı problemi olmaya başlamış ve en önemli ölüm sebeplerinden biri haline gelmiştir. Bu nedenle sağlık alanında hastalıkların teşhisine olanak verecek hatta hastalıkları semptomları ortaya çıkmadan teşhis etmeye olanak sağlayacak biyolojik belirteçler bulmaya ve bunlar için tayin yöntemleri geliştirmeye yönelik çalışmalar hız kazanmıştır. İlaveten, vücut sıvılarında yer alan bu maddelerin miktarındaki değişimi izlemek hastalığın gelişiminin izlenmesine de olanak sağlamaktadır. Bazı hastalıklar için biyomarker proteinler belirlenmiş olup klinik olarak kullanılmaktadır. Ancak bazı hastalıklar için halen güvenilir biyolojik belirteçler bulunmaya çalışılmaktadır. Günümüzde vücut sıvılarında bulunan biyolojik belirteçlerin tayini için hastane ve özel laboratuarlarda farklı teknikler kullanılmaktadır. Bunlar radyoimmünoassay (RIA), enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), immünoaglutinasyon essay (IAA) ve floresans immünoassay (FIA) gibi geleneksel immünoassay temelli teknikler olup, bu testler yüksek hassasiyet, düşük tayin sınırı ve geniş tayin aralığı gibi avantajlara sahiptir. İmmünoassaylerde biyolojik tanıma elementi olarak antibadiler kullanılır ve antibadi mühendisliğindeki gelişmeler nedeniyle en hızlı büyüyen tayin metodlarından biridir. Fakat sözü edilen bu metodlar oldukça uğraştırıcı ve zaman alıcıdır. Ayrıca otomasyon ve operasyonel aşamalar arasında bağlantı kurma şansı sınırlıdır (McGlennen 2001). Tanıma için genellikle işaretlemeye ve analit ile reseptör arasındaki bağlanmayı gösterecek ilave maddelere ihtiyaç vardır (Peter ve ark. 2001). İşaretleme testin süresini uzatır, maliyeti arttırır, ve reseptör bağlanma bölgesini bozarak yanlış negatif sonuçların alınmasına neden olabilir. Daha da ötesi floresans bileşikler çoğunlukla hidrofobiktir ve birçok metodta gürültü bir problemdir ve yanlış pozitif sonuçların elde edilmesine neden olmaktadır. İdeal bir görüntüleme platformu hızlı, hassas, spesifik, güvenilir ve kullanımı kolay olmalıdır. İlaveten analit tayini için kan, idrar, plazma, tükrük , serebrospinal sıvı gibi örnekler; örnek hazırlama basamağına ihityaç duyulmaksızın direkt olarak 43 kullanılabilmelidir. Kullanılan cihazlar klasik homojen ya da heterojen immunoessaylerde mümkün olmayan analit konsantrasyonunun sürekli takibine olanak sağlayacak nitelikte olmalıdır. Biyosensörler mevcut tanı yöntemlerine karşı uygun bir alternatif olabilecek nitelikte olup , gereksinimleri karşılayabilecek potansiyele sahiptir. Biyosensör moleküler tanıma aracı olarak biyomoleküllerin yüksek seçiciliğini kullanan ve kompleks bir karışım içerisinden hedef analiti tayin eden analitik bir alettir. Genel olarak bir biyosensör örnek içerisinde analizi yapılmak istenen hedef moleküle seçici olarak bağlanan biyomoleküllerden oluşan bir moleküler tanıma katmanı ve burada gerçekleşen biyokimyasal olayı kantitatif bir elektrik sinyaline dönüştüren bir çevirici sistemden oluşur (Şekil 2.1.5.1). Moleküler tanıma için kullanılan biyomateryalin türüne göre biyosensörler katalitik biyosensörler ve afinite biyosensörleri olarak ikiye ayrılır. (Ramanavieius ve ark. 2005). Katalitik biyosensörlerde tanıma elementi (enzim , hücre , doku ) substrat moleküllerini ürüne dönüştürür ve bu sayede sinyal amplifikasyonunu olanaklı kılar. Afinite biyosensörlerine tanıma molekülü (antibadi, nükleik asit, peptid, hücre reseptörü ve protein) analite bağlanır. Bu iki tür biyosensörde elektrot, transistör, termistör ve optik araçlar gibi çeviriciler (transduserler) ile birlikte kullanılır. Şekil 2.1.5.1. Bir biyosensörün yapısı ve bileşenleri Katalitik bir biyosensör türü olan elektrokimyasal sensörler insülin, glukoz, hCG, teofilin, α1-glikoprotein, apolipoprotein E, FSH, LH gibi maddelerin kanda ya da idrardaki düzeylerinin belirlenmesinde kullanılan bir biyosensördür (Morgan ve ark. 44 1996). Bu elektrokimyasal sensörler basitlik ve yüksek hassasiyet gibi avantajlara sahiptir. Bu güne kadar geliştirilmiş olan elektrokimyasal sensörler vücut sıvılarında interferans yapan maddelerin varlığında düşük seçicilik gibi dezavantajlara sahiptirler. Fakat bununla birlikte bugüne kadar geliştirlmiş olan en başarılı biyosensör türü, enzim temelli amperometrik sensörlerdir ve ticari olarak glukoz, laktat, üre v.b. maddelerin tayininde kullanıp atılabilen sensörler olarak kullanılmaktadırlar. 2.1.5.1. Moleküler tanıma katmanı 2.1.5.1.1. Antibadiler Biyosensensörlerde genellikle moleküler tanıma aracı olarak antibadi ya da antijen kullanılır ve hazırlanan sensörler immunosensör olarak adlandırılır. Bu bölümün görevi antijen antibadi arasında oluşan kompleks ile sensörün seçicilik ve hassasiyetini sağlamaktadır. İmmunosensörlerde poliklonal ya da monoklonal antibadiler kullanılmaktadır. Poliklonal antibadiler halen geniş çapta özellikle yarışmalı immunoassaylerde primer antibadi olarak kullanılmaktadır. En büyük avantajı göreceli basitliği ve hazırlama prosedürünün düşük maliyetidir. İki antibadili sandwich immunoassayler tek tip poliklonal antibadi ile hazırlanabilir ve iki tür monoklonal antibadinin ya da monoklonal-poliklonal antibadi karışımlarının kullanıldığı sistemlerle kıyaslandığında çok daha basittir. Genellikle kullanım amaçlarına uygun spesifikliktedirler ve büyük bir hayvanın immunizasyonu ile uzun süreli temini mümkündür. Fakat bununla birlikte poliklonal antibadiler bağlanma afinitesi, izotip ve özgülleri açısından çok sayıda farklı B-lenfositten elde edilen heterojen antibadiler karışımıdır. Sonuç olarak, her hayvandan her farklı seferde elde edilen antibadiler kendine has özelliklere sahiptir. Bu durumda, düzgün bir sinyal/derişim oranı sadece tek bir hayvandan tek seferde elde dilen antibadiler ile sağlanır. Farklı zamanlarda elde edilen antibadiler immunoassaylerde sinyal oranının değişmesine neden olacaktır. Bu da bir immunoassayde tek tip bir deney tasarlanabilmesi için kullanılacak anibadi miktarının belirlenmesi aşamasında zorluk yaratmaktadır. Daha da ötesi poliklonal antibadiler hem immunojendeki hem de onunla birlikte enjekte edilen safsızlıklardaki epitopları da tanımaktadır. Bu da spesifik olmayan bağlanmaya neden olarak 45 immunosensörün tayin sınırının artmasına neden olur. İlk geliştirilen immunoassaylerde hayvan serumlarından elde edilen poliklonal antibadiler kullanılsa da günümüzde immunoassay endüstrisi füzyon (kaynaştırma) teknolojisi ile üretilen monoklonal antibadileri tercih etmektedir. Hibridoma hücreleri tek tip antibadi üretebilirler (monoklonal antibadiler). Monoklonal ya da poliklonal, yeni antibadilerin üretimi daima yeni aşılama işlemini gerektir. Bu proses her zaman başarı garantisi olmayan, uzun ve yorucu bir prosestir. 2.1.5.1.2. İmmunosensörlerde kullanılan alternatif tanıma elementleri İmmunoessaylerde poliklonal ya da monoklonal antibadilerin yaygın olarak kullanılmasına rağmen bu proteinlerin kullanılmasının immunoreaksiyonlar için bazı dezavantajları vardır. Bunlar şöyle sıralanabilir: (1) Eğer çalışma koşulları vücut özelliklerinden ya da koşullarından farklıysa , molekülün yapısı değişebilir ve immunoreaksiyonlar için uygunsuz bir hale gelebilir. (2) Rejenerasyon işlemi sırasında immobilize antibadi zarar görebilir ya da yüzeyden ayrılabilir. Yeterli bir analitik hassasiyet ancak yüksek afiniteli (>1010 M-1) antibadilerin elde edilmesi ile sağlanabilir (Hock 1997). Bu yüzden yüksek bir afinite sabiti ve labil bir immobilize antibadi pratik uygulamalarda yüzeyin rejenerasyonunu sınırlar ve bu da immunosensörlerin tek kullanımlık cihazlarda kullanımlarını sınırlar (Morgan ve ark. 1996). (3) Antibadi ve antijen arasındaki reaksiyon süresi transdüserin dedeksiyon zamanından daha kısadır ve bu da analiz zamanını uzatmaktadır. Bu sözü edilen problemlerin çözümü için biyosensörün moleküler tanıma bölgesi olarak yeni yaklaşımlar geliştirilmiştir. Bunlar şöyle sıralanabilr: (1) Aptamerler Aptamerler; nükleotid, ilaç, protein gibi hedef molekülleri yüksek afinite ve spesifite ile tanıyabilen, sentetik, tek sarmal DNA ya da RNA oligonükleotid parçalarıdır (Luppa ve ark. 2001). Aptamerler immunosensörün yüzeyine bağlanma açısından antibadiler ile kıyaslandığında üstün özelliklere sahiptirler ve sentetik yaklaşımlar ile tekrarlanabilir bir şekilde ve istenilen miktarda hazırlanabilirler. Fakat bununla birlikte, aptamerlerin 46 yüksek maliyetleri ve kararsızlıkları bu moleküllerin immunoafinite biyosensörlerde kullanılabilmesi için çözülmesi gereken problemlerdir. (2) Antikalin Rekombinant antibadi fragmentlerine alternatif olabilecek gelecek vaadeden bir teknik olarak lipokalin, çeşitli aminoasitlerin rastgele mutajenezi ile antikalinlerin hazırlanmasında kullanılabilir. Retinol bağlayıcı proteinler gibi lipokalinler de hidrofobik ve/veya kimyasal olarak duyarlı organik bileşiklerin depolanması ve taşınmasında rol alan bir protein ailesidir. Bu bağlayıcı proteinler sekiz antiparalel β– tabakadan oluşan ve merkez çekirdek etrafında sarılmış olan ortak bir β–barel yapıya sahiptir. Örneğin bilin-bağlayıcı protein, digoksigenin gibi potansiyel antijenler ile spesifik olarak kompleks oluşturacak şekilde yapısal olarak tekrar şekillendirilebilir. (Schlehuber et al., 2000). Fakat bununla birlikte, antikalinlerin sentezi ve kararlılığı, afinite sabitinin büyüklüğü gibi çözülmesi gereken problemler mevcuttur. (3) Moleküler baskılanmış polimer (MIP) Biyolojik reseptörler spesifik moleküler afiniteye sahiptir ve tanı amaçlı sensörlerde geniş çapta kullanılmalarına rağmen yüksek maliyetli karmaşık protokoller ile üretilmekte düşük kararlılıkları nedeniyle uygun koşullar gerektirmekte ve birçok analit için doğal reseptör bulunmamaktadır. (Whitcombe ve ark. 2000, Wulff 2002, Haupt ve ark. 2000, Ye ve Haupt 2004a). Bu nedenle yapay tanıma elementlerinin sentezlenmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Moleküler baskılama yapay tanıma elementlerinin hazırlanmasında kullanılabilecek en etkili metodlardan biridir (Guan ve ark. 2008). Bu sentetik teknik basit ve ucuz olup , elde edilen moleküler baskılanmış polimer yüksek seçicilikte, mükemmel mekanik kuvvette, sıcaklık, asidik ve bazik koşullar, organik çözücüler ile muameleye dayanıklı ve biyolojik reseptörler ile karşılaştırıldığında daha iyi mühendislik özelliklerine sahiptir (Wulff 2002, Haupt ve Mosbach 2000, Ye ve Haupt 2004a). Daha da ötesi bu yaklaşım doğal reseptörü bulunmayan analitler için de sensör geliştirme olanağı sağlar. 47 Bu karakteristikler nedeniyle MIP malzemeler yaşam, farmasötik ve çevre bilimleri gibi birçok alanda tanıma elementi olarak geniş çapta kullanılabilirler (Andersson ve ark. 1990, Ramstrom ve ark. 1996, Spivak 2005). Temel kullanım alanı seçici ayırma olmasına rağmen , aktif moleküllerin tayini, farmasötikler ve kirleticiler için MIP temelli sensörlerin geliştirilmesi en iddialı konulardan biri olup son yıllarda dikkate değer ölçüde ilgi çekmektedir (Piletsky ve Turner 2002, Holthoff ve Bright 2007, Hillberg ve ark. 2005. Stephenson ve Shimizu 2007). Biyosensörlerde sinyal, analitin moleküler tanıma katmanında bulunan tanıma elementine bağlanması ile oluşturulmaktadır. Ardından transdüser bu sinyali ölçülebilir bir büyüklüğe dönüştürerek sonuç bir verinin elde edilmesini sağlamaktadır. Tanıma elementi olarak biyomoleküller yerine moleküler baskılanmış polimerler kullanıldığında da aynı prensip kullanılabilmektedir (Şekil 2.5.1.2.1). Şekil 2.5.1.2.1. (A) Antibadi temelli sensör (B) MIP temelli biyomimetik sensörün çalışma prensibi Dedeksiyon için analitin bazı genel özellikleri ya da analit bağlanması ile sistemin fizikokimyasal özelliklerinde meydana gelen değişmeler kullanılır. Bu prensip geniş çapta kullanılabilme özelliğine sahiptir ve analitin özelliğinden büyük ölçüde bağımsızdır. Alternatif olarak bazı moleküller işaretleme ya da sensör cevabını 48 arttırmak için kullanılabilir. Analitin spesifik özelliklere sahip olduğu bazı durumlarda bu özellik MIP temelli sensörlerin hazırlanmasında kullanılabilmektedir. Çizelge 2.5.1.2.1’ de farklı transdüser prensipleri ile çalışan ve tanıma elementi olarak moleküler baskılanmış polimerleri kullanan sensörlere örnekler verilmiştir. 2.1.5.2. Biyosensörlerde kullanılan transdüserler Biyosensörlerde kullanılan transdüserler sinyal oluşturma türlerine göre dört ana gruba ayrılabilirler; elektrokimyasal transdüserler (amperometrik, potansiyometrik, kondüktometrik, kapasitatif), optik transdüserler (floresans, luminesans, kırılma indisi, elipsometrik, yüzey plazmon rezonans) kütle değişimine duyarlı transdüserler (piezoelektrik , akustik dalga ) ya da termal transdüserler (kalorimetrik). Bir biyosensör dedeksiyon metoduna göre iki gruba ayrılabilir: (1) Doğrudan dedeksiyon (2) antijen antibadi etkileşimi için işaretlemenin kullanıldığı yada kullanılmadığı dolaylı dedeksiyon. Doğrudan sensörde, bağlanma olayı kırılma indisi (SPR transdüser), kütle değişimi (QCM transdüser) ve dielektrik sabiti (elektrokimyasal transdüser) gibi farklı fiziksel özelliklerin değişmesine neden olur. Dolaylı sensörler immün kompleksteki moleküllerden birinin üzerinde sinyal üreten bir etiketin bulunmasını gerektirir. Bu etiketin özellikte bir değişim oluşturabilmesi için ayrı bir aşamaya daha ihtiyaç vardır. Bu sensörlerde genellikle immunoassaylerde kullanılan çok farklı etiketler bulunmaktadır (Morgan ve ark. 1996, Luppa ve ark. 2001, D’Orazio 2003). Doğrudan sensörler analiz süresini kısaltır ve eş zamanlı olarak bağlanan analitin tayinine olanak verir. Etiket kullanılmadığında bu sensörler daha da ucuza üretilebilmektedir. Son yıllardaki ilerlemeler sayesinde doğrudan sensörlerin hazırlanması gelişmiş ve son zamanlarda bu sensörler tıbbi uygulamalarda tercih edilen immunosensörler haline gelmiştir. Optik immunosensörler hızlı sinyal oluşumu ve okuma gibi avantajları ile biyoanaliz için günümüzdeki en popüler immunosensörlerdir. Optik immunosensörler arasında SPR transdüser gibi direkt bir optik transdüser klinik kimyada immunoreaksiyonların izlenmesinde en popüler olanıdır (Luppa ve ark. 2001). 49 Çizelge 2.1.5.2.1. Farklı transdüser prensiplerini kullanan MIP temelli sensör örnekleri Transdüser Analit Tayin aralığı (μM) Referans Elipsometri Vitamin K1 Kalitatif Anderson ve ark. 1988 Yüzey Plazmon Rezonans Teofilin 5 000-33 000 Lai ve ark. 1998 Fenilalanin anilid Kalitatif Hedborg ve ark. 1993 Kapasitans Fenil alanin 6 000 Panasyuk ve ark. 1999 Kondüktimetri Atrazin 0,005-0,05 Sergeyava ve ark. 1999 Yüzey Akustik Dlaga Çözücü buharları 0,1 (μL/L) Dickert ve ark. 1998 Çözücü buharları 4 (μL/L) Dickert ve ark. 1998 Kuartz Kristal Mikroterazi Glukoz 1 000-20 000 Maleista ve ark. 1999 S-propanolol 50- 1300 Haupt ve ark. 1999a Lizozim 0,2-1500 mu g/mL Sener ve ark. 2010 Infrared Kaybolan Dalga 2-metoksi 3-metilpirazin 4,5-1 000 Jakusch ve ark. 1999 Floresans Dansil fenilalanin 25-250 Kriz ve ark. 1995 PAH (piren) 0,00015-0,2 Dickert ve ark. 1999 Amperometri Morfin 3,5-35 Kriz ve Moscbah 1995 Kolorimetri Kloramfenikol 10-3 000 Levi ve ark. 1997 Voltametri 2,4 D 0,1-100 Kroger ve ark. 1999 pH Glukoz 1 000-25 000 Chen ve ark. 1997 Floresans cAMP 0,1-100 Turkewitsch ve ark. 1998 50 P o l i m e r i n Y a r ı ş m a l ı A n a l i t i n s i n y a l G e n e l Y ö n t e m l e r s i n y a l b a ğ l a n m a o l u ş t u r d u ğ u o l u ş t u r d u ğ u m e t o d l a r ı y ö n t e m l e r m e t o d l a r Direkt optik transdüserin ana avantajı dedeksiyon için işaretlemeye ihtiyaç duyulmaması ve böylece bağlı türün serbest türden ayrılması için gerekli ayırma aşamasının ortadan kalkmasıdır. Daha da ötesi, ışığın manyetik alan bileşeninin sadece yüzeyin çok yakınındaki bölgeyi etkilemesi nedeniyle örnekte bulunan diğer maddeler ile girişimin engellenmesidir (D’Orazio 2003). QCM, sensörde transdüser olarak kullanılır ve yüksek sensitiviteye sahiptir. QCM optik özelliğin değil kütlenin değişimini ölçmesine rağmen , SPR ve QCM dalga-dağılım olgusuna dayanır ve rezonans yapısı gösterir. QCM direkt immunosensör olarak geniş çapta kullanılmaktadır. SPR tekniği yüzeyin çok yakınındaki bölgede gerçekleşen kırılma inidisi değişimini, QCM ise yüzeye bağlanan kütlenin miktarındaki değişme ile ilgili frekans değişimlerini ölçer. SPR biosensörler protein adsorbsiyonu ya da antijen antibadi tanıması açısından QCM sensörler ile kıyaslandığında; hassasiyet, monoklonal antibadi ve serum tayin sınırları açısından çok yakın özelliklere sahiptirler (Koesslinger ve ark. 1995). QCM cihazı daha ucuz, daha kolay kullanılabilir olsa da SPR sensörler QCM ile karşılaştırıldığında birçok avantaja sahiptirler. SPR sensörlerde yanıt süresi daha kısadır ve SPR tekniği daha ucuzdur (Laricchia-Robbio ve Revoltella 2004). Daha da ötesi SPR sisteminde tanımanın gerçekleştiği alan QCM sensörlere göre daha küçüktür. Dolayısıyla QCM sensörler ile karşılaştırıldığında aynı yüzey yoğunluğunu sağlamak için daha az sayıda molekül yeterlidir ve daha küçük akış hücreleri ile daha düşük örnek hacimleri ile çalışılabilir. Sonuç olarak SPR transdüserler “lab on a chip” olarak adlandırılan ve örnek hazırlama, kimyasal analiz ve veri değerlendirme özelliklerini aynı anda taşıyan total bir analiz sistemi geliştirmek için mikroakışkanlar ile daha kolay entegre edilebilir. 2.2. Yüzey Plasmon Rezonans (SPR) Polarize ışık, yüzeyi ince bir metal film ile kaplı sensör yüzeyine gönderildiğinde ışık bir ayna gibi hareket eden bu yüzeyden yansıtılacaktır. Geliş açısını değiştirerek, yansıyan ışığın şiddeti izlendiğinde ışığın yansıma şiddetinin bir minimumdan geçtiği görülecektir (Şekil 2.2.1). 51 Şekil 2.2.1. Yüzey plazmonlarının uyarılması Belli bir geliş açısında ışık, metal yüzeyindeki plazmonları uyarır ve yüzey plazmon rezonans olayı gerçekleşir. p-Polarize ışığın fotonları metal yüzeyindeki serbest elektronlar ile etkileşir ve serbest elektronların dalga benzeri titreşimine neden olarak (rezonans) yansıyan ışığın şiddetinde bir azalmaya neden olur. Yansıyan ışığın şiddetine maksimum kaybın gerçekleştiği açı, rezonans açısı ya da SPR açısı olarak adlandırılır. SPR açısı sistemin optik karakteristiklerine yani metalin (genellikle altın) her iki tarafındaki kırılma indislerine bağlıdır. Prizma tarafındaki kırılma indisi değişmez iken, metal yüzeyinin hemen yakınında bulunan kırılma indisi, üzerinde toplanan kütle nedeniyle (örn protein) değişecektir. Kırılma indisi değiştiğinde, yansıyan ışık şiddetinin minimuma düştüğü açıda Şekil 2.2.1 de gösterildiği gibi bir kayma olacaktır. (A) geliş açısına karşı yansıyan ışık şiddetini gösterirken, (B) kırılma indisinde gerçekleşen değişimden sonrasını göstermektedir. Yüzey plazmon rezonans olayı sadece bu iki basamak arasındaki farkı değil, aynı zamanda minimumun gözlendiği rezonans açısındaki kayma izlenirse zamanla gerçekleşen değişimi de gösterebilir. Şekil 2.2.2 SPR açısındaki kaymaları gösterir ve sensogram olarak adlandırılır. Eğer bu değişim bir biyomoleküler etkileşimden kaynaklanıyorsa etkileşimin kinetiği eş zamanlı olarak incelenebilir. SPR sensörler metal yüzeyindeki oldukça sınırlı bir alanı ya da sabit bir hacmi tayin edebilirler. Sinyalin alınabildiği elekromanyetik alanın (kaybolan alan) penetrasyon derinliği genellikle birkaç yüz nanometreyi aşmaz ve sensör yüzeyindeki metalden uzaklaştıkça eksponansiyel olarak azalır. Kaybolan alanın penetrasyon derinliği gelen ışığın dalga boyunun bir fonksiyonudur. 52 Şekil 2.2.2. Sensogram: zamana karşı SPR açısının değişimi SPR sensörlerin intrinsik bir seçicilikleri yoktur. Tüm kırılma indisi değişimleri sinyal değişimi olarak yansır. Bu değişimler ortamların farklı kırılma indisine sahip olmasından kaynaklanabilir. Örneğin, tampon bileşimindeki ya da derişimindeki değişim, aynı zamanda sensör yüzeyine farklı materyallerin adsorpsiyonu kırılma indisi değişimine neden olabilir. Adsorplanan türlerin miktarı Şekil 2.2.2’de gösterildiği gibi denge tamponun injeksiyonundan sonra belirlenebilir. SPR sensör yüzeyinde seçici bir tanıma için, sensörün yüzeyi, hedef molekülü seçici olarak yakalayabilecek, ancak örnekteki ya da tampon bileşimindeki diğer herhangi bir bileşene bağlanma eğilimi olmayan bir ligand ile modifiye edilmelidir. 2.2.1. Yüzey plazmon rezonans olayının teorisi Yüzey plazmonlarının oluşması için esas olan, iki materyalin ara yüzeyinde serbest elektronların bulunmasıdır. Burada kastedilen materyallerden biri bol miktarda serbest elektron içeren metallerdir. Bu koşullarda metal-dielektrik arayüzeyi Maxwell eşitliği ile analiz edilebilir. Bu analize göre yüzey plazmonları metal ve dielektrik ara yüzeyinde yayılmış olan elektron yoğunluk dalgaları olarak tanımlanabilir. Alternatif olarak yüzey plazmonları bu ara yüzeye kuvvetlice bağlanan elektromanyetik dalgalar olarak da düşünülebilir. Yüzey plazmonları ile ilgili çalışmalar 1968 yılında elektron demeti uyarılması ile başlamış , optik uyarılma Otto (1968) ve Kretschmann ve Raether (1968) tarafından kanıtlanmıştır. İkinci yaklaşım daha çok uygulanabilir hale gelmiştir. 53 2.2.1.1. Kaybolan dalga Eğer prizma son derece yüksek kırma indisine sahip bir materyal ile kaplanırsa, yüzeye gönderilen ışığın neredeyse tamamı yansır. Buna karşılık ışığın çoğunluğu prizma içinde geri yansır, bir kısmı da geri yansımadan yüzeyden diğer ortama geçer. Doğrudan yansımadan geçen bu ışığa "kaybolan dalga (evanescent wave)" adı verilir. Kırılma indisi n olan bir yüzeyde bulunan elektromanyetik yüzey dalgası matematiksel olarak elektrik alan ile ifade edilir. E  E0 exp jt  jk  r  E0 exp jt  jk x x  jk y y  jk z z (2.2.1.1.1) E0 elektrik alanın genliği ,  açısal frekans, k dalga vektörü, rx, y, z vektörün konumudur. Bu eşitlikte yönü dalga dağılımına paralel olan dalga vektörü k ‘dır (Şekil 2.2.1.1.1). Büyüklüğü aşağıdaki formül ile verilir. k 2  k 2 2 2x  k y  kz  n  n (2.2.1.1.2)  c  ve c sırasıyla dalga boyu ve vakumdaki dağılım hızıdır. Böyle bir dalganın kırılma indisi n1 ve n2 olan 1 ve 2 nolu iki yüzey arasında kırıldığında genelliği kaybetmeden ışık demetinin yönünü seçilebilir kz  0 olduğunda problem iki boyutta düşünülebilir. n1 sin  n2 sin  (2.2.1.1.3a) kx1  kx2  kx (2.2.1.1.3b) 54 Şekil 2.2.1.1.1. α geliş açısına sahip ışığın kırılma indisleri n1 ve n2 olan iki materyalin arayüzeyindeki kırınımı Eşitlik 2.2.1.1.2 ve 2.2.1.1.3b yi kullanarak ara yüzeye dik konumda olan k y dalga vektörü için aşağıdaki ifade elde edilir. 2  2  k 2 n2  2    n2 y2 1   sin 2  2  (2.2.1.1.4)     n1  Şimdi n1n2 olduğunu varsayalım. Eşitlik 2.2.1.1.4’te görüldüğü gibi sinn2 / n1 olduğunda eşitliğin sağ tarafı negatif olacak ve sonuç olarak k y yalın sanal bir sayı olacaktır. Bu durumu 2. ortam için değerlendirirsek ve Eşitlik 2.2.1.1.1’e dönecek olursak, sadece elektrik alanının büyüklüğü y doğrultusunca 1/ k y2  1/ jk y2 karakteristik uzaklığında exponansiyel olarak azalan ara yüzeye paralel hareket eden bir dalganın oluştuğunu görürüz. E2  E e k y 2 y 0 exp jt  jk x x (2.2.1.1.5) Açıklanmaya çalışılan bu nedenlerden dolayı 2. ortamda oluşan bu alan kaybolan alan olarak adlandırılır. Elektromanyetik alan sadece arayüzeye yakın bölgede oluşmaktadır. 55 Bu nedenle de arayüzeye çok yakın bölgedeki dielektrik özelliği değiştirmek (yani kırılma indisini değiştirmek) bu alanı etkileyecektir. 2.2.1.2. Yüzey plazmonları İki farklı ortam arasında oluşan arayüzeyde p-polarize gelen ışık elektrik alan için kompleks yansıma katsayısı rp Fresnel eşitliği ile ifade edilir. E r  i  r e j tan    e jp p   (2.2.1.2.1) Er tan    Ei ve Er sırasıyla gelen ve yansıyan elektrik alandır. Açılar Şekil 2.2.1.1.1’de gösterildiği gibidir. Yansıyan alanın, gelen alana göre faz değişimi j kullanılan materyallerin kırılma indislerine bağlı olarak değişir. Yansıma yoğunluklarının oranı olarak tanımlanan yansıtıcılık aşağıdaki eşitlik ile ifade edilir: 2 Rp  rp (2.2.1.2.2) Eğer      2 ise; Eşitlik 2.2.1.2.1 payda büyür ve Rp sıfıra gider. Bu durum p- polarize ışık için hiç yansımanın olmadığı Brewster açısını tanımlar. Diğer durum ise      2 olduğu durumdur. Bu durumda Rp sonsuz olur. Çok küçük Ei değerleri için sonlu Er değerleri vardır. Bu durum rezonans ile ilgilidir.  ve  arasındaki bu ilişkiden şu sonucu çıkarabiliriz. Eğer      2 ise cos  sin  ve tan  k1x k1y   n2 n1 . Dalga vektörünün k  kx ,k y  bileşenleri için aşağıdaki eşitlikler yazılabilir. k 2  k 2  k 2  k 2 2 1x 1 y1 1  kx (2.2.1.2.3)  2  2 k  1 2 ve k x  yi  i (2.2.1.2.4) c 1   2 c 1   2 56 1 ve  2 sırasıyla 1. ve 2. materyalin dielektrik sabitleri ve i  1 ya da 2 dir. Eşitlik 2.2.1.2.4 arayüzeydeki SPR dağılım eşitliği olarak ifade edilir. Dielektrik sabiti ve kırılma indisi arasında   n2 eşitliği vardır. 2. ortamın metal olduğu durumu düşünelim. Bu ortam çok sayıda serbest elektron içermektedir ve beli bir açısal frekansta  p olacağından bu ortamın dielektrik sabiti  2 negatif olacaktır.  2  2   1 p2 (2.2.1.2.5)   p  4n 2 ee me (2.2.1.2.6)  p plazma frekansı , ne serbest elektron yoğunluğu, e ve me sırasıyla elektron yükü ve yoğunluğudur. Genel olarak  p olması elektromanyetik alanın metal içerisinde dağılmayacağı anlamına gelir. Daha spesifik olarak bakıldığında  2   1 koşulu sağlandığında k yi yalın sanal bir sayı iken kx gerçek bir sayıdır. Bu durumda elektromanyetik dalga mevcuttur ve arayüzeyde belirgin bir şekilde oluşmaktadır. Yüzeyin her iki tarafında da dağılmış kaybolan kuyruğa sahiptir. 2.2.1.3. Yüzey plazmonlarının uyarılması Yüzey plazmonlarının uyarılması ışığın kaybolan dalga olarak adlandırılan bileşeni ile serbest metal elektronlarının rezonansa gelmesi ile gerçekleşir. Eşitlik 2.2.1.2.5 ve 2.2.1.2.6 , Eşitlik 2.2.1.2.4 ‘de yerine koyulursa Şekil 2.2.1.3.1’ de I ile gösterilen SPR dağılımına ilişkin grafik elde edilir. Aynı şekilde “normal” ışığın dağılımına ilişkin eğri de (a) ile gösterilmiştir. Eğride hemen dikkat çeken durum orjin dışında SPR eğrisi ile ışığın eğrisinin kesiştiği bir noktanın olmadığıdır. Bunun anlamı, bu geometride normal 57 ışığın yüzey plazmonlarını uyarmak için doğru dalga vektörü ve açısal frekans sağlayamayacağıdır. Şekil 2.2.1.3.1. Yüzey plazmonlarının dağılım eğrileri. I ve II nolu eğri sırasıyla  3  m ve 1  m arayüzeylerinde yüzey plazmonlarının dağılımını göstermektedir. a ve b sırasıyla çalışılan deneysel koşullar altında geliş açısına α bağlı olarak değişen “normal” ışığın 1 ve  3 ortamındaki dağılım eğrileridir.  açısını değiştirerek a ve b arasındaki herhangi bir b çizgisi elde edilebilir Bu problemi çözmenin bir yolu Şekil 2.2.1.3.1‘de gösterildiği gibi ikinci bir arayüzeyi kullanmaktır. Burada ince bir metal tabaka (dielektrik sabiti  m ) dielektrik sabitleri 1 ve  3 olan iki ortam arasına yerleştirilir. İki ayrı arayüzeye Fresnel eşitliklerini uygulayarak Eşitlik 2.2.1.2.4’den daha kompleks dağılım eşitlikleri elde edilir. Fakat temel fizik kuralları değişmez. Bu durumda kx için her biri farklı iki arayüzeyi ifade eden iki dağılım eşitliği yazılabilir. Şekilde görüldüğü gibi 1. ortamda “normal” ışığın dağılım ilişkisini gösteren eğri (b), metal/3.ortam arayüzeyinde yüzey plazmon dağılım çizgisini keser. Bu geliş açısı α nın ayarlanması ile 1. ortamdan gelen ışığın yüzey plazmonlarını uyarabileceğini gösterir. Gelen dalga vektörünü kx  kn1 sin yüzey plazmonlarını uyarmak için gerekli dalga vektörüne eşitleyebiliriz. Bu yolla Şekil 2.2.1.3.1‘de a ve b olarak işaretlenen iki eğri arasındaki herhangi bir kx değeri 58 ayarlanabilir. Örnek olarak böyle bir eğri (c) ile gösterilmiştir. Bu Kretschman ve Raether tarafından geliştirilen ve daha sonra yüzey plazmonlarının uyarılması için kullanılan standart bir teknik haline gelen toplam iç yansıma (ATR) olayıdır. Şekil 2.1.3.2. Farklı uyarılma dalga boyları için 46 nm kalınlığındaki gümüş (kesikli) ve altın (kesiksiz) tabaka ile düşük kırılma indisli taraf su olmak üzere SPR minimumları SPR için uygun bir metal, ışık ile uygun dalga boyunda rezonansa girebilecek iletim bandı elektronlarına sahip olmalıdır. Genelde en çok kullanılan metaller altın, gümüş, bakır, alüminyum, sodyum ve indiyumdur. Metal seçimi sırasında iki kritik kısıtlama söz konusudur. i) Metal yüzeyi oldukça saf olmalıdır; atmosferik nedenlerle oluşabilecek oksitler, sülfitler ve diğer film tabakaları rezonansı engeller. ii) Metal, analiz edilecek maddelerle uyumlu olmalıdır. Seçilebilecek metaller arasında en yaygın kullanılanı altındır (Şekil 2.1.3.2). Altın metali, yakın IR spektrum bölgesinde oldukça güçlü ve kolay ölçülebilen rezonans 59 sinyali verir. Ayrıca oksidasyona ve diğer atmosferik kirlenmelere karşı oldukça dirençlidir. Üzerinde çeşitli türde bağlı molekülleri barındıracak kadar reaktiftir. Diğer metaller altın kadar kullanışlı değildir. İndiyum çok pahalı olduğu için, Na oldukça reaktif olduğu için, Ag ise oksidasyana karşı dirençli olmadığı için pek tercih edilmezler. 2.2.2. Yüzey plazmon rezonans sistemi SPR cihazları bir sistem içerisinde entegre edilmiş üç temel bölümden oluşur: optik, sıvı sistem ve sensör çip. Cihazlar performanslarını etkileyen optik , sıvı sistem ve otomasyon derecesi açısından farklılaşırlar. İlave olarak , sensör çiplerin kalitesi ve özellikleri biyomoleküllerin etkileşimleri ile ilgili ölçümleri etkiler. Şekil 2.2.2.1’de optik, sıvı sistem ve sensör çipin entegre edildiği SPR cihazı şematize edilmeye çalışılmıştır. Belirtildiği gibi sensör çip optik sistem ile (kuru bölüm) sıvı sistem, akış hücresi (sıvı bölüm) arasında fiziksel bir bariyer olarak yer almaktadır. Şekil 2.2.2.1. SPR sisteminteki 3 ana bölümün şematik gösterimi.: (1) SPR optik, (2) sıvı sistem, (3) sensör çip 60 SPR cihazları SPR açısındaki kaymayı belirlemek için farklı yollarla konfigüre edilirler. Yüzey plazmonlarını uyarmak için genellikle 3 farklı optik sistem kullanılır: prizmalar, gratingler ve optik dalgalar. Ancak cihazlarda en yaygın olarak kullanılan, Kretschmann konfigürasyonunda hazırlanan prizmalardır. Bu konfigürasyonda , Şekil 2.2.2.2’ de gösterildiği gibi , bir prizma p-polarize ışığı ince altın metalle kaplanmış sensör yüzeyiyle eşleştirir. Işık fotodiot ya da bir kamera kullanılarak onun şiddetini ölçecek olan dedektöre yansıtılır. Şekil 2.2.2.2 Yüzey plazmonlarının uyarılmasında kullanılan Kretschmann konfigürasyonu Grating coupler içeren cihazlarda ışık daha düşük kırlma indisli substrat üzerine yansıtılır. Pratikte bunun anlamı, elipsometrik cihazlarda olduğu gibi fotonların yüzey plazmon dalgalarını oluşturmasından önce ışığın sıvı içerisinde yol aldığıdır. Bunun yanında bazı cihazlar kaymayı ölçmek için optik dalgaları kullanırlar. Tüm konfigürasyonlarda ortak olan olgu; sensör yüzeyindeki kırılma indisi değişimlerini ölçmek, direkt, işaretleme olmaksızın ve eş zamanlı ölçüm alabilmektir. SPR sensörler sensör yüzeyi yakınındaki kimyasal ve biyolojik bileşiklerin çok düşük miktarlarını ölçebilme kapasitesine sahiptir. Biyomoleküler bağlanma olayının dedekte edilebilmesi biyomoleküllerin sensör yüzeyinde toplanmasıyla gerçekleşir. Çünkü bu durumda biyomoleküller dengeleme çözeltisi olarak kullanılan elektrolit ile yer değiştirerek kırılma indisinin değişimine neden olmaktadır. Protein molekülleri su 61 moleküllerinden daha yüksek bir kırılma indisine sahiptir (Δn ~ 10 -1). Bir çok SPR cihazının hassasiyeti Δn ~ 10 -5 ya da 1pg protein/mm2 aralığındadır. 2.2.3. Yüzey plazmon rezonans tekniğinin klinik tanı amaçlı kullanımı Son yıllarda klinik uygulamalarda yüzey plazmon rezonans temelli tayin metodlarının kullanılması ilgi çekmektedir. Yapılan çalışmalar ile çok sayıda hastalığa ait biyomarker, hormon ve ilaçlar için SPR temelli sensörler geliştirilmiştir. Bu tayin deneylerinin çoğu minimal ya da hiç matriks etkisinin olmadığı saf örneklerde gerçekleştirilmiş ancak klinik örnekler ile çalışılmamıştır. SPR sistemleri üreten firmalar geniş bir yelpaze oluşturmaktadır (Biacore, IBIS, GWC Technologies, GenOptics, Biosensing Instruments, K-Mac ve Lumera gibi). Ancak bu cihazlar araştırma alanında kullanıma yöneliktir. Günümüzde klinik tanımayı kolaylaştıran, insan örneklerinde aynı anda çok sayıda ölçüm yapabilen, az sayıda eğitimli insana ihtiyaç duyan taşınabilir SPR tayin platformları yoktur. Klinik örneklerde SPR ile tayin yapmak birkaç nedenden dolayı çok uygundur. 1. Dedeksiyon hızlıdır. Dedeksiyon yüzeye yakın bölgedeki refraktif indeks değişimine dayandığından spesifik bağlanma olayı gerçekleştiği anda izlenebilir. Bağlanmamış reagentin uzaklaştırılması için zaman alıcı yıkama işlemlerine gerek yoktur. Bu floresans gibi metodlar ile karşılaştırıldığında süreyi oldukça kısaltır. 2. Dedeksiyon için hedef molekülü işaretlemeye gerek yoktur. Molekülü işaretlemek onun bağlanma kinetiğini ve afinitesini etkileyebilir. Aynı zamanda metodun kompleksliğini ve reagentlerden kaynaklanan maliyeti arttırır. 3. SPR temelli immunoassayler klinik kullanımı olan bir çok maddenin tayininde kullanılabilmesi açısından yeterlidir. Hassasiyet ya da tayin sınırının yetersiz olduğu durumlarda bu iki parametreyi en iyi şekilde ayarlamak için sinyal artırımını sağlayacak metodlar kullanılabilir. 62 4. SPR klinik uygulamalarda verimli bir şekilde kullanılabilecek kadar minyatürize edilebilecek basit bir optik sistem gerektirmektedir. 5. SPR sistemi çok sayıda bağlanma olayını ayrı ayrı tanımlanmış bölgelerde aynı anda dedekte edebilir. Aynı anda yapılacak ölçüm sayısı cihazın ayırma kabiliyetine ve yakalama yapılan platformdaki bileşenlerin yoğunluğuna bağlıdır. 6. Kompleks örneklerde var olan interferans yapabilecek maddelerin SPR yüzeyine spesifik olmayan bir şekilde bağlanması çok sayıda referans yüzey kullanılarak azalatılabilir. 7. Mikroakışkanlardaki son gelişmeler düşük hacimli örneklerin SPR yüzeyindeki akışının ön koşullanmasına olanak sağlamaktadır. Bu sayede non-spesifik bağlanmalar ile yüzeyin kirlenmesini minimize etmek mümkün olabilmektedir. İlaveten, kompleks örneklerin ön koşullandırılması beklenen tayin aralıklarını belirgin derecede azaltabilir, bu yüzden örnek analizi daha da basitleştirilir. Klinik kullanımı olan SPR temelli tanıma sisteminin geliştirilebilmesi için temel gereksinimler şöyle sıralanabilir: (1) Minyatürizasyon ve düşük maliyet için mekanik ve optik basitlik (2) Analizi yapılmak istenen maddenin dedekte edilebilmesi için yeterli bir performans. (3) Sıcaklık ve kırılma indisi değişikliklerinde dayanıklı bir şekilde kullanılabilme (4) Kompleks örneklerden aynı anda, hızlı ve kantitatif analit ölçümleri yapabilecek biyoassayler geliştirilebilmesi 2.3. Moleküler Baskılanmış Polimerler ve Optik Sensör Uygulamaları Moleküler baskılama, kalıp molekül varlığına spesifik tanıma bölgelerinin oluşması ile gerçekleşen bir olaydır. Bu tekniği kullanarak hazırlanan sentetik reseptörler, biyosensörlerde kullanılan doğal reseptörler, enzimler ve antibadiler ile kıyaslandığında 63 sahip oldukları yüksek afinite, spesifite, düşük maliyet ve dayanıklılık nedeniyle oldukça ilgi çeken malzemelerdir. Biyolojik karşılıkları ile kıyaslandığında moleküler baslıkanmış polimerlerin sensörlerde tanıma elementi olarak kullanılmasının bazı avantajları vardır: (Kandimalla ve Ju 2004) - Prensipte , her tür bileşik için moleküler baskılanmış polimer hazırlanabilir ve üretim için antibadilerde olduğu gibi hayvanların kullanılmasına gerek yoktur. - Yüksek derecede çapraz bağlı yapısı nedeniyle moleküler baskılanmış polimerler antibadilerden daha kararlıdır. Bu nedenle asidik ya da bazik koşullarda, organik çözücülerin varlığında ya da yüksek sıcaklık ve basınçlarda rahatlıkla kullanılabilirler. - Moleküler baskılanmış polimerler ucuz ve kolay bir şekilde hazırlanabilirler ve oda sıcaklığında kuru bir ortamda tanıma kapasitelerini kaybetmeden depolanabilirler. - Genellikle MIP üretimi hızlı ve ucuzdur. Ayrıca hazırlanan materyal çok kez tekrar tekrar kullanılabilir. - Bu polimerlerin sentezi lab-on-a-chip ve nanoteknoloji ile tamamen uyumludur. Son zamanlarda protein baskılanmış polimerlerin hazırlanması için yoğun çaba harcanmaktadır. Proteinlerin organik çözücülerdeki çözünürlüğünün düşük olması, çözünme esnasında üç boyutlu yapılarının bozulması ve diğer bazı problemler nedeniyle protein seçici moleküler baskılanmış polimerlerin hazırlanmasını sınırlamaktadır. Fakat protein baskılanmış polimerlerin hazırlanması sadece sensör hazırlanmasında değil aynı zamanda tıp, tanı, proteomiks, çevresel analizler ve ilaç salınımı açısından da ilgi çekici ve iddialı bir alandır. Moleküler baskılanmış polimerlerin optik sensörlerde tanıma elementi olarak kullanılmasının bazı dezavantajları da vardır: 64 - Transdüser ile entegrasyonun ve bağlanma olayının ölçülebilir optik bir sinyale dönüştürülmesindeki zorluklar. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için farklı fonksiyonellikteki yeni monomerler ya da işaretlenmiş kalıp moleküller geliştirilmekte ve sensör cevabın alınmasında kullanılmaktadır. - Monoklonal antibadiler gibi seçici ve belirgin bağlanma bölgelerine sahip biyolojik reseptörlerin aksine moleküler baskılanmış polimerler genellikle hetorejen bağlanma bölgelerine sahiptirler. - Çoğu durumda biyolojik reseptörler ile kıyaslandığında afinite sabitleri daha düşük ve bağlanma kinetikleri biyolojik reseptörlere göre daha yavaştır. - Biyomoleküllerin mükemmel performans gösterebildiği sulu çözeltide seçici tanıma sınırlıdır. - MIP sentezi genellikle fazla miktarda kalıp molekül kullanılmasını gerektirir. Bu durum pahalı ya da toksik bir kalıp molekül kullanılması durumunda bir sınırlamaya neden olabilmektedir. Fakat prensipte bu moleküllerin polimerizasyondan sonra geri kazanılması ya da kalıpların sentetik analoglarının kullanılması mümkün olmaktadır. Bu materyallerin optik sensör hazırlamadaki kullanımları, uygun fonksiyonellikte yeni monomerlerin ve işaretli analit türevlerinin varlığına ve transdüser ile etkin bir entegrasyona olanak sağlayan polimer hazırlama prosedürlerinin optimizasyonuna paralel olarak yavaş bir şekilde artmaktadır. Sentetik malzemeler olması nedeniyle , baskılanmış polimerlerin enzim ya da reseptörlerden daha kararlı olması doğal bir sonuçtur. Bu yüksek derecede kararlılığın altında yatan esas neden, baskılama ile hazırlanan polimer içerisinde oluşturulan bağlanma bölgelerinin rijit olmasını sağlayan yüksek çapraz bağlanma oranıdır. Baskılanmış polimerler asidik ve bazik koşulara ve organik çözücüler ile muameleye dayanıklıdırlar. Aynı zamanda yüksek ve düşük basınç ya da ekstrem sıcaklık değerlerinde kararlıdırlar. Baskılama polimerizasyonu ile yapay reseptörlerin hazırlanması için oldukça ucuz bir prosestir. Çoğu durumda bir baskılama prosedürünün maliyeti sadece kullanılan kalıp 65 moleküle bağlıdır. Daha da ötesi eğer kalıp molekül pahalı ise kalıp molekülü geri kazanıp tekrar kullanmak mümkündür. Alternatif olarak ucuz kalıp molekül analogları MIP hazırlamada kullanılabilir. Genel olarak şunu söyleyebiliriz ki; MIP hazırlama işleminin maliyeti doğal reseptörlerin üretilmesi prosesinden 3-4 kat kadar daha ucuzdur ve bu da MIP teknolojisini diğer yöntemler ile yarışabilir duruma getirmektedir. Moleküler baskılanmış polimerlerin organik çözücüler ile kullanılabilmesi biyomimetik sensörler ve kimyasal ve farmasötik üretiminde kullanım gibi yeni uygulama alanları açmaktadır. Kalite kontrol ve üretim prosesinin online görüntülenmesi gibi alanlar oldukça ilgi çekicidir. Multisensör hazırlama ile ilgili en önemli problemlerden biri doğal reseptör ve enzimlerin performanslarındaki önemli farklılıklardır. Bu moleküllerin her biri farklı kararlılık, aktivite ve hassasiyete sahiptirler ve çoğu durumda da farklı substratlar ve iyonik şiddetleri farklı olan değişik tampon sistemlerine ihtiyaç duyarlar. Bu gibi faktörler nedeniyle doğal biyomoleküllerin tek bir donanım üzerine entegrasyonu problemlidir. MIP hazırlanması ise esnek koşullarda yapıldığından ve farklı monomerler kullanılanabileceğinden çok sayıda kalıp molekül için neredeyse tamamen eşit operasyonel koşullara (pH, çözücü, sıcaklık v.b) sahip polimerler hazırlanabilir. Moleküler baskılanmış polimerleri geleneksel fotorezist materyaller gibi kullanmak da ilave avantajlar getirir. Moleküler baskılanmış polimerler, maskeler ve fotopolimerizasyon yöntemi kullanılarak dedektör yüzeyine spotlar şeklinde immobilize edilebilir. Moleküler baskılanmış polimerlerin çok küçük boyuttaki sensörler ile uyumu MIP temelli multi-sensörlerde bu materyalleri kullanma olasılığını arttırmaktadır. Moleküler baskılanmış polimerlerin sonuncu fakat bir o kadar da önemli özelliklerinden birisi de pratik olarak her tür bileşik için hazırlanabilmeleridir. İnorganik iyonlar, ilaçlar, nükleik asitler, proteinler ve hatta hücreler MIP hazırlanması mümkün olan kalıp moleküllerdir. Antibadiler de çok sayıda bileşik için üretilebilirler ancak moleküler baskılanmış polimerler ile kıyaslandığında bu moleküllerin iki temel dezavantajı vardır. 66 Birincisi, küçük moleküller için antibadi üretilebilmesi için bu küçük moleküllerin türevlendirilmesi gerekmektedir. Bu gereksinim bir çok basamağın ilave edilmesini gerektirir ve bu ilave işlemler çoğu zaman tanıma özelliklerini önemli ölçüde değiştirmektedir. İkincisi, antibadi hazırlanmasındaki esneklik 20 doğal aminoasit ile sınırlıdır. Ancak MIP hazırlanmasında doğal bileşikler ile kıyaslanamayacak esneklik ve çeşitlilikte bağlanma bölgesi tasarlanmasını olanaklı kılan çok sayıda monomer mevcuttur. 2.3.1. MIP temelli yüzey plazmon rezonans sensörler Moleküler baskılanmış polimerler SPR sensörlerin hazırlanmasında seçici tanıma elementleri olarak kullanılabilirler. Bu amaçla polimer metal filmin üzerinde hazırlanır ve SPR analit varlığında polimer yüzeyinde meydana gelen kırılma indisi değişimlerini belirlemede kullanılır. SPR yüksek hassasiyete sahip bir sistem olmasına karşın moleküler baskılanmış polimerlerin SPR ile uygulamaları sınırlıdır. Temel sebep baskılanan moleküllerin küçük olması nedeniyle meydana getirdikleri kırılma indisi değişimlerinin dedeksiyonunun güç olması ve bunun da analitik performansı düşürmesinden kaynaklanmaktadır. Tüm bu sınırlamalara rağmen bu materyallerin SPR sistemlerinde tanıma elementi olarak kullanım potansiyelini gösteren çalışmalar yapılmıştır (Çizelge 2.3.1.1). MIP temelli SPR sensörler ile ilgili ilk çalışmalardan biri sulu çözeltide teofilin, kafein ve ksantini tayin etmeye yönelik olarak Lai ve ark. (1998) tarafından gerçekleştirilmiştir. Parçalanıp elenmiş moleküler baskılanmış polimerler gümüş film üzerine tutturulmuş ve buharlaştırmadan sonra tanımayı gerçekleştirecek olan tabakalar 60 dakika süre ile örnek çözeltisine daldırılmıştır. Filmler kurutulmuş ve SPR açısındaki kaymalar analit konsantrasyonu ile korele edilmiştir. Lineer dinamik aralık 6 mg/mL ’ye kadar ulaşmakta olup teofilin için tayin limiti 0,4 mg/mL olarak belirlenmiştir. Ölçümlerin kesinliğinin, tanıma tabakasının hazırlanmasındaki tekrarlanabilirlik ile sınırlı olduğu ve kararlılığın da depolanma koşullarına bağlı olarak 3 ila 5 gün olduğu belirlenmiştir. Seçicilik çalışmalarında teofilin, kafein ve ksantine benzeyen sekiz farklı bileşik kullanılmış ve yüksek seçicilik değerleri elde edilmiştir. 67 Çizelge 2.3.1.1. MIP temelli SPR sensörlerin analitik karakteristikleri Kalıp molekül Fonksiyonel monomerler Çapraz bağlayıcı/porojen Dinamik aralık Dedeksiyon Örnek Referans limitleri Teofilin Kafein Metakrilik asit EGDMA/kloroform 1-6 mg/mL 0,4 mg/mL - Lai ve ark. 1998 Ksantin Teofilin N-(N-propil) akrilamid-metakrilik asit N,N’-metilen - 10-6 M - Lavine ve ark. bisakrilamid/asetonitril 2007 Sialik asit p-vinilbenzen boronik asit-N,N,N- EGDMA/DMF 0,1-0,5 mM - - Kugimiya ve trimetilaminoetil metakrilat - HEMA Takeuchi 2001 NAD(P)H Akrilamid-akrilamidofenilboronik asit N,N’- metilenbisakrilamid 10-6-10-3M 10-7 M - Raitman ve ark. NADP+ 2004 Domoik asit 2-(dietilamino) etil metakrilat EGDMA/su 5-100 μg/L 5 μg/L - Lotierzo ve ark. 2004 Dopamin Akrilik asit-N-izopropilakrilamid N,N’-metilen bisakrilamid/DMSO 10-9-10-3 M - - Matsui ve ark. 2005 DPDPE n-vinil pirolidon , 3-(akriloksipropil) Etilenglikol diakrilat /n-bütanol-su 5-350 pM - - Devanathan ve ark. δ-opioid reseptör trimetoksisilan 2005 Glukoz Poliallilamin Epiklorhidrin/su 0,1-20 mg/mL - idrar Banerji ve ark. 2006 N,N’-didansil-L- 2-vinil piridin EGDMA/asetonitril 0,1-1 mg(mL - - Li ve ark. 2006a,b sistin 0,01-0,3 mg/mL Didansil-L-lizin Okratoksin A Pirol - / etanal:su(1:9) 0,05-0,5 mg/L - Beyaz şarap Yu ve Lai 2005 68 Son zamanlarda Lavine ve ark. (2007) tarafından yapılan çalışmada ise poli N-(N- propil) akrilamid polimerinin sulu çözeltide analit konsantrasyonuna bağlı olarak şişme özelliklerinden yararlanarak yine bir teofilin sensörü hazırlanmıştır. Bu amaçla teofilin baskılanmış nanoküreler (300 nm çapında) süspansiyon polimerizasyonu ile hazırlanmış, altın film üzerine kaplanarak elektrostatik etkileşimler ile yüzeyde tutulmuştur. 10-6 M kadar düşük konsantrasyonda bile teofilini dedekte edilebilen bir partikül şişmesine neden olmuştur. Bu davranış polimer ağının hidrofilisitesinin artması yani polimer içerisindeki su yüzdesinin artması nedeniyle polimerin geçiş sıcaklığının artması ile açıklanmıştır. Partiküllerin şişmesi iyonik şiddetten etkilenmemiştir ve cevap süresi 10 dakikadır. Fakat partiküllerin altın yüzeyinde tutunmasında problemler yaşanmıştır. Ayrıca tekrar eden şişme ve büzülme olayları sensörün dayanıklılığını ve tekrar kullanımını azaltmıştır. Kugimiya ve Takeuchi (2001) sulu çözeltide gangliozid GM1(GM1) içeren sialik asid tayinine yönelik sialik asit baskılanmış SPR sensör hazırlamışlardır. Rezonans açısı 0,1- 1 mg/mL GM1 derişim aralığında lineer olarak değişmiştir. Düşük molekül ağırlığı nedeniyle referans şeker olarak kullanılan galakturonik asit ya da sialik asit varlığında sinyal alınamamıştır. Sialik asit ancak sabit konsantrasyonda, GM1 varlığında (1 mg/mL) yarışmalı adsorbsiyon ile tayin edilebilmiştir. Yapılan çalışma ile hazırlanan MIP temelli SPR sensörün selektif lektinler ile hazırlanan SRP biyosensörlere göre 200 kat daha ucuz olduğu belirlenmiştir. Li ve ark. (2002) in situ bağlanma ve elüsyonu izlemek için L-fenilalanin metil ester için MIP temelli SPR sensör hazırlamışlardır. Fakat bu çalışmada SPR sinyalinde gözlenebilir bir değişim için oldukça yüksek derişimde örneklere (1 g/L) ihtiyaç duyulmuştur. Taniwaki ve ark. (2003) polisülfonu glutoamil kalıntısı türevi bir oligopeptid ile birlikte baskılama materyali olarak kullanarak, SPR tekniğinin moleküler etkileşimleri incelemek için ne kadar uygun ve kolay bir yöntem olduğunu göstermişlerdir. 9- Etiladenini kalıp molekül olarak kullanarak afinite sabiti baskılama faktörüne bağlı 70 olarak 1,3x104 ile 1,6x104 L/mol aralığında değişen bir SPR sensörü başarıyla hazırlamışlardır. Raitman ve ark. (2003, 2004) poliakrilamid-poliakrilamidofenilboronik asit kopolimerini kullanarak β-nikotinamid adenin dinükleotid (NAD+), β-nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADP+) ve bu moleküllerin indirgen hali olan NAD(P)H nin analizi için MIP temelli SPR sensör hazırlamışlardır. Moleküler baskılanmış polimerik filmin adhezyonunu arttırmak için ilk olarak altın yüzeyinde sistamin tek tabaka oluşturulmuş ve akrilik asit kovalent olarak bağlanmıştır. Fonksiyonel monomerler ile sağlanan kovalent ve kovalent olmayan etkileşimler ile oldukça seçici bağlanma bölgeleri elde edilmiştir. İlginç bir şekilde artan analit konsantrasyonu ile rezonans açısı azalmıştır. Bu davranışın substratın bağlanmasına eşlik eden şişmeden kaynaklandığı düşünülmüştür. NAD(P)+ ve NAD(P)H kofaktörleri 10-6 ile 10-3 aralığında tayin edilebilmiştir. Hazırlanan sensörlerin günlük operasyona bağlı olarak 2 ila 10 gün arasında değişen bir süre kararlı olduğu belirlenmiştir. Seçicilik mükemmeldir ve sensör NAD(P)+ ve NAP+ moleküllerini birbirinden ayırabilmektedir. Lotierzo ve ark. (2004) marin toksini domoik asit için MIP temelli SPR sensör hazırlamışlardır. Domoik asit dedekte edilebilir bir kırılma indisi değişimine neden olamayacak kadar küçük bir molekül olduğundan horse radish peroksidaz işaretli- domoik asit kullanılmıştır. Domoik asit için tayin sınırı 5 μg/L olarak belirlenmiştir ki bu değer monoklonal antibadiler ile hazırlanan sensör ile elde edilenden 3 kat daha iyidir. Ayrıca monoklonal antibadiler beş kez tekrar kullanımdan sonra aktivitelerini kaybederken , MIP sensörlerin rejenere edilebildiği , en az 30 kez tekrar kullanılabildiği ve 4 0C ‘da depolandığında 3 ay boyunca dayanıklı olduğu belirlenmiştir. Matsui ve ark. (2005) altın nanopartiküller gömülü MIP-temelli SPR sensör hazırlamışlardır. Yapılan çalışmada sinyal yoğunluğunun, altın nanopartikül gömülmemiş MIP-SPR sensöre göre çok daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Analit bağlanması sırasında MIP şişmekte ve altın nanopartiküller ile sensör yüzeyindeki film arasındaki uzaklık artmaktadır. Bu da SPR açısındaki kayma şiddetinin artmasına neden olmaktadır. Bu çalışmada dopamin sensörü hazırlanmış ve nanomolar analit 71 konsantrasyonlarında bile sinyal alınabilmiştir. Ancak baskılanmamış polimer ile benzer bir çalışma ve kıyaslama yapılmamıştır. Benzer şekilde Tokavera ve ark. (2006) altın nanopartikülleri kullanarak kolesterol analizi için ultra ince MIP/SPR nanosensör hazırlamışlardır. Lokalize yüzey plazmon rezonans olarak adlandırılan metal nanopartikülleri saran yük yoğunluk titreşimleri, etraftaki değişimlere karşı oldukça hassastır. Bu prensipten yararlanarak geliştirilen spektroskopik metod ise transmisyon yüzey plazmon rezonans spektroskopisidir (T- SPR). MIP in tanıma bölgelerine kolesterol bağlanması yüzeydeki tüm sensör katmanlarının yansımasında değişmeye yol açmış ve T-SPR absorbsiyon maksimumu 56 nm kaymıştır. Benzer bileşikler olan stigmasterol (14 nm), digitoksigenin (26 nm) ve progesteron (30 nm) için ise daha düşük değerler elde edilmiştir. Fakat ne yazık ki yine diğer çalışmada olduğu gibi baskılanmamış polimer ile ilgili herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Devanathan ve ark. (2005) sentetik siklik enkefalin analogu spesifik bir afyon ilacı olan δ-opiod G-protein bağlı reseptör anagonistinin (DPDPE) pikomoların altındaki düzeylerini belirleyebilen bir sensör hazırlamışlardır. Dedeksiyon bağlanmanın hem s- hem de p-polarize ışıkta kırılma indisinde artışın ve film kalınlığının arttığını işaret eden daha büyük açılara kayma presibini esas alan plazmon-dalga güdümlü rezonans spektroskopisi ile gerçekleştirilmiştir. DPDPE bağlanmasına bağlı olarak s- polarizasyonunu kullanarak elde edilen spektral kaymalar p-polarizasyonu kullanılarak elde edilen kaymalardan daha düşük değerdedir. Bu durum polimer matriks içerisinde yapısal bir anizotropinin olduğunu yani bağlanma bölgelerinin rastgele yönlenmediğini göstermiştir. Elde edilen afinite değerleri MIP ve kalıp molekül arasında gerçekleşen hidrojen bağı, elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler gibi kooperatif multivalent etkileşimler sayesinde doğal reseptörlerin afinite değerlerinden çok daha iyidir. Baskılanmamış polimer ile hiçbir sinyal alınmamıştır. Bağlanma 3 dakika gibi kısa bir süre içerisinde gerçekleşmiştir ancak rejeneresyon süresi oldukça uzundur (birkaç saat). Fakat polimerik film yalnızca bir kez kullanılabilmektedir. Rejenerasyondan sonra fonksiyonelliğin kaybolması ince filmdeki moleküler boşlukların tanıma ile bozulması ve spesifik ligandın salınması ile açıklanmıştır. 72 Huang ve ark. (2006) çok az örnek hacmi ile güvenilir bir analiz gerçekleştirilebilen SPR sensör hazırlamışlardır. Çalışmada mikroakışkan bir sistem kullanılmıştır. μM konsantrasyon aralığında progesteron, kolesterol ve testesteron, hem klasik SPR hem de mikroakışkan SPR sistemi ile analiz edilmiş ve bu iki sistemin performansı karşılaştırılmıştır. Özellikle kolesterol ve progesteron, gerçek örneklerde ve herhangi bir deriştirme yapmaksızın analiz edilmiştir. Mikroakışkan SPR/MIP sistem kullanıldığında, analitler ile tanıma bölgelerini içeren yüzeyin daha iyi etkileşmesi nedeniyle daha yüksek assosiasyon hızlarına ulaşılmıştır. Ayrıca geleneksel SPR sistemi ile kıyaslanabilir bir hassasiyet elde edilmiş ve daha az örnek hacimleri ile çalışılabilmiştir. Ancak ne yazık ki baskılanmamış polimer ile çalışılmamıştır. Aynı bilim adamları array-MIP film oluşturulan çok kanallı mikroakışkanlı sistem ile de bir çalışma yapmışlar ve bu sayede çok sayıda örneğin yüksek bir ayırma gücü ile aynı anda analiz edilebileceğini göstermişlerdir (Lee ve ark. 2006). Banerji ve ark. (2006) idrarda glukoz tayini için glukoz fosfat varlığında poliallilaminin çapraz bağlanmasıyla hazırlanan bir polimer ile MIP temelli bir SPR sensör hazırlamışlardır. Hazırlanan sensörün cevap aralığı fizyolojik açıdan önemli düzeyi kapsamakta ve bu sayede ön bir işleme gerek kalmamaktadır (1-20 mg/mL). Fakat sensörün farklı bölgelerinde, farklı analit bağlama özellikleri gözlenmiştir. Farklı bir yaklaşımda da , MIP içerisine altın nanopartiküller gömülmüş ve SPR sinyalinde 10 katlık bir artış sağlanmıştır. Nanopartiküllerin varlığı daha homojen bir yüzeyin oluşmasını sağlamış ancak rejenerasyon süresinin 5 dakikadan 50 dakikaya uzamasına neden olmuştur. Li ve Husson (2006a) atom transfer radikal polimerizasyonunu kullanarak MIP temelli bir SPR sensör hazırlamışlar ve bu sensör ile dansillenmiş amino asitlerin adsorbsiyon kinetikleri ve bağlanma izotermlerini incelemişlerdir. Polimerin direkt olarak altın yüzeyinde graftlama ile hazırlanması kalınlığı ayarlanabilen oldukça homojen bir film oluşumunu ve dolayısıyla SPR çalışmalarında ortaya çıkabilecek tabakalar arası difüzyonel kütle sınırlamasını ortadan kaldırmıştır. MIP yüzeylerin bağlanma kapasitesinin baskılanmamış yüzeylere göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Benzer kalıp moleküller kullanıldığında seçiciliğin azaldığı ve de pH ‘a bağımlı olduğu 73 görülmüştür. Bu çalışma ile iyonlaşabilen analitler ve/veya monomerler içeren sulu MIP sistemlerinde, pH değişiminin seçiciliği ayarlamada etkili olduğu sonucuna varılmıştır. Aynı bilim adamları bağlanma bölgelerinin yüzeydeki yoğunluğunu kontrol etmeye olanak sağlayan moleküler baskılanmış tek tabakaların hazırlanması ile ilgili iki yeni prosedür geliştirmişlerdir (Li ve Husson 2006 b). Bu yeni yaklaşım ile altın yüzeyinde, düşük bağlanma enerjisine sahip kalıp moleküller baskılanabilmekte ve cevap süresi bir kat daha kısaltılabilmektedir. Bu metodlarda ortadan kaldırılması gereken sınırlamalar şöyle sıralanmıştır: (a) Tanıma mekanizması sadece boyut ve şekle dayanmaktadır. Kalıba özgü fonksiyonel bağlanma bölgeleri yoktur. Bu nedenle spesifik olmayan bağlanma yüksek düzeyde olabilir, (b) Depolanma süresi oldukça kısadır. Yüzeyin hazırlanmasından sonraki 10 gün içerisinde büyük olasılıkla şekle özgü bağlanma bölgelerinin yapısının bozulması nedeniyle bağlanma kapasitesinin %30-40‘ı azalmaktadır. Slinchenko ve ark. (2004) ilk kez DNA ‘nın doğal yapısını bozmaya gerek kalmadan ds-DNA ‘nın bağlanma kinetiğini ve etkileşimini incelemeye olanak sağlayan MIP temelli SPR sensör hazırlamışlardır. Baskılanmış polimerin hazırlanmasında DNA ‘nın A-T baz çiftiyle hidrojen bağı yapabilen 2-vinil-4,6-diamino-1,3,5-triazin fonsiyonel monomer, kalıp molekülün yapıdan kolayca uzaklaştırılabilmesi için düşük konsantrasyonda, N,N’-metilenbisakrilamid ise çapraz bağlayıcı olarak kullanılmıştır. Verotoksin gen sekansına eş olan sentetik ds-DNA ‘nın baskılanmış polimere bağlanması FTIC-işaretli dsDNA kullanılarak floresans spektroskopi ile, bağlanma kinetiği ise SPR ile analiz edilmiştir. Sensör 1-10 nM konsantrasyon aralığındaki verotoksin ds-DNA analizi için kullanılmıştır. Tanıma deneyleri oligo(dG)-oligo(dC) DNA ‘lar ile gerçekleştirilmiş ve rezonans açısında çok düşük bir kayma değeri gözlendiğinden hazırlanan moleküler baskılanmış polimerin seçiciliğinin yüksek olduğu belirlenmiştir. MIP sentezi için orijinal moleküler tanıma materyalleri olan poli[(2-okso-1,3-dioksolan- 4-il)metilmetakrilat-ko-akrilonitril ve ticari bir sentetik poliamid-imid polimeri (Torlon 4000T) SPR sensör yüzeyinde film oluşturmasında kullanılmıştır (Yoshikawa ve ark. 2005 a,b ). İlk metaryal Ac-T-trp ve Ac-L-trp kalıp molekül olarak kullanılarak 74 kiral ayırma yapabilen MIP hazırlanmasında kullanılmıştır. Torlon 4000T, 9- etiladeninin kalıp molekül olduğu bir çalışmada kullanılmıştır. Elde edilen yüksek afinite sabitleri, seçicilik ve düşük spesifik olmayan bağlanma değerleri ile bu yeni materyallerin MIP hazırlanmasında uygun olduğu belirlenmiştir. Yu ve Lai (2005) elektropolimerizasyon yöntemini kullanarak tahıl ve şarap ekstraktlarında mikotoksin okratoksin A analizine yönelik MIP temelli bir SPR sensör hazırlamıştır. Hazırlanan sensör 0,05-0,5 mg/L konsantrasyon aralığında lineer bir korelasyon göstermiştir. Tayin sınırı ise 0,01 mg/L olarak belirlenmiştir. Son zamanlarda Matsunaga ve ark. (2007) lizozime seçici MIP temelli bir SPR sensör hazırlamışlardır. Çalışma ön polimerizasyon karışımında (40 mM) ve geri bağlanma tamponunda (20 mM) NaCl bulunmasının spesifik olmayan bağlamayı önemli derecede azalttığını göstermiştir. NaCl varlığında lizozimle etkileşime giren fonksiyonel monomerin kararlı konformasyonları oluşmakta ve bu sayede sadece lizozime özgü bağlanma bölgelerine sahip homojen MIP hazırlanabilmektedir. Fakat geri bağlanma tamponunda NaCl konsantrasyonunun 20 mM ‘ın üzerine çıkması sadece zayıf ve non- spesifik bağlanmayı değil aynı zamanda spesifik bağlanma bölgelerinin de lizozime olan afinitesini azaltmaktadır. Son olarak çalışmada NaCl ‘nin benzer molekül ağırlığına sahip sitokrom c gibi proteinlerin varlığında da seçiciliği arttırdığı belirlenmiştir. Uzun ve ark. (2009) insan kanında antibadi tayinine yönelik sensör geliştirmek için SPR çip yüzeyinde Hepatit B yüzey antibadi baskılanmış poli(hidroksietil metakrilat- N-metakriloilklorür-L-tirozin metilester) (PHEMAT) film hazırlamışlardır. Maksimum tayin sınırı 208,2 mIU/mL, KA ve KD değerleri sırasıyla 0,015mIU/mL ve 66 mL/mIU olarak hesaplanmıştır. SPR çipin kontrol deneyleri immünize edilmemiş antibadi negatif serum kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Deney sonuçları antibadi negatif seruma karşı dikkate değer bir sensör cevabının olmadığını göstermiştir. 75 2.4. Kalp Krizi Kalp krizi tüm dünyada başlıca ölüm nedenidir. Kalp krizlerinin çoğu aslında birçok insan için önlenmesi mümkün olan koroner arter hastalığın yıllarca süren sessiz ancak sürekli ilerleyişinin bir sonucudur. Kalp krizi sıklıkla koroner arter hastalığın ilk semptomudur. Amerikan Kalp Birliği ’nin elde ettiği verilere göre kadınların % 63 ‘ü erkeklerin de % 48‘i herhangi bir belirti oluşmadan, aniden koroner kalp hastalığından ölmektedir. Kalp krizinin diğer bir adı miyokardiyal infarktüstür (MI) . Kalp krizi kalbe kan taşıyan bir veya daha fazla koroner arterin tamamen tıkanması ya da kalp kasına taşınan kanın azalması durumunda ortaya çıkmaktadır. Tıkanma genellikle ateroskleroz nedeniyle olmaktadır. Ateroskleroz plakların ya da kan pıhtılarının koroner arterlerde birikmesidir. Bazen de nedeni bilinmeyen bir şekilde sağlıklı ya da aterosklerotik koroner arterde spazm olmakta ve kalbe giden kan azaldığından kalp krizi meydana gelebilmektedir (Şekil 2.4.1). Kalp krizi geçiren hastaların yaklaşık yarısı yardım almadan önce en az iki saat beklemektedir. Bu da hastaların ani ölüm ya da kalp yetersizliği şansını arttırmaktadır. Kalp krizi süresince arterin tıkalı kalma süresi uzadıkça, kalbin göreceği hasar da o kadar fazla olmaktadır. Şekil 2.4.1. Damardaki aterosklerozun zaman içinde ilerlemesi: (A ve B), önemli darlık oluşturması (C), ve sonunda tıkanarak (D) kalp krizine yol açması 76 Eğer kalbe taşınana kan miktarı ciddi şekilde azalırsa ve bu süre uzarsa, kas hücreleri geri dönüşümsüz bir şekilde yaralanabilir, ölebilir ve hatta hasta ölebilir. Bu nedenle kalp krizinin belirtilerinin erkenden anlaşılması çok önemlidir. Kalp krizlerinin yaklaşık % 20 ‘si belirtisizdir ve kişi olup bitenden habersizdir. Hasta acı hissetmemesine karşın, belirti göstermeyen kalp krizi bu süre içerisinde kalp kasına zarar vermeye devam etmektedir. Kalp krizinin meydana getirdiği hasar aynı zamanda tıkanmanın nerede olduğuna, kalp ritminin bozulup bozulmadığına ve başka bir arterin bu bölgeye kan taşıyıp taşımadığına da bağlıdır. Sol koroner arterdeki tıkanmalar genellikle sağ arterdeki tıkanmadan daha ciddidir. Tıkanmalar kalp atım düzensizliğine ve ani ölüme neden olabilmektedir. 2.4.1. Kalp krizinin nedeni ve belirtileri Kalp krizleri genellikle ciddi koroner arter hastalığından kaynaklanmaktadır. Bir çok kalp krizinin nedeni aterosklerotik plaklar üzerinde oluşan kan pıhtılarıdır. Bu da kalbe oksijen bakımından zengin kanın ulaşmasını engellemektedir. Koroner arter hastalık oluşum riskini arttıran çok sayıda ana ve yardımcı nedenler vardır. Bu nedenlerden bazıları değiştirilebilir iken bazıları değiştirilemez. Ana risk faktörleri koroner arter hastalık riskini büyük ölçüde etkilemektedir. Değiştirilemeyen ana risk faktörlerini şöyle sıralayabiliriz: •Kalıtsal özellikler : Anne babasında koroner kalp hastalığı olan kişilerin bu hastalığa yakalanma riski daha yüksektir • Cinsiyet: 60 yaşın altındaki erkeklerin kalp krizi geçirme şansı aynı yaştaki kadınlara göre daha fazladır. • Yaş: 45 yaşın üzerindeki erkekler ve 55 yaşın üzerindeki kadınlar riskli grupta yer almaktadırlar. Daha yaşlı insanların (65 üzeri) kalp krizi geçirme olasılıkları daha fazladır. Yaşlı kadınların kalp krizinden sonraki bir hafta içerisinde hayatını kaybetmesi olasılığı erkeklere göre 2 kat daha fazladır. Değiştirilebilen ana risk faktörlerini ise şöyle sıralayabiliriz: 77 • Sigara kullanımı: Sigara içmek hem koroner kalp hastalığına yakalanma hem de bu hastalıktan ölme riskini çok büyük ölçüde arttırmaktadır. Sigara kullanan insanların ani kardiyak ölüm olasılığı kullanmayan insanlara göre 4 kat , kalp krizi geçirme riski ise 2 kat daha fazladır. Aynı zamanda sigara kullananların kalp krizinden sonraki bir saat içerisinde hayatını kaybetme olasılığı çok daha yüksektir. • Yüksek kolesterol: Kolesterol vücut tarafından üretilen, aynı zamanda et, yumurta , ve diğer hayvansal ürünlerden alınabilen yumuşak yağımsı bir maddedir. Kolesterol düzeyi yaş, cinsiyet, kalıtsal özellikler ve diyetten etkilenmektedir. Kandaki kolesterol düzeyi arttıkça koroner kalp hastalığına yakalanma riski artmaktadır. Diğer faktörler ile biraraya geldiğinde risk daha da artmaktadır. 240 mg/dL ve üzeri kolesterol yüksek risk, 200-239 mg/dL kolesterol ise sınır risk değeridir. LDL kolesterol içinde diğer faktörlere de bağlı olarak yüksek risk 130-159 mg/dL düzeyinde başlamaktadır. • Yüksek kan basıncı: Kan basıncının yüksek olması kalbin daha çok çalışmasına ve zaman içerisinde gücünü kaybetmesine neden olmaktadır. Bu da kalp krizi, böbrek yetmezliği ve konjestif kalp yetmezliği (kalbin vücuda yeterince kan pompalayamaması) riskini arttırmaktadır. Obezite, sigara kullanımı, yüksek kolesterol ya da diyabet ile birlikte bulunduğunda kalp krizi riski birkaç kat daha artmaktadır. • Yetersiz fiziksel aktivite: Fiziksel aktivitenin yetersiz olması koroner arter hastalığı riskini arttırır. Düzenli yapıldığında orta derecede bir fiziksel aktivite bile yararlıdır. Koroner arter hastalığı yardımcı risk faktörleri ile yakından ilişkilidir ancak bu etkenlerin önem derecesi ve prevalansı henüz bilinmemektedir. Yardımcı risk faktörlerini şöyle sıralayabiliriz: • Diabetes mellitus: Bu hastalığı olan insanlarda koroner arter hastalığı oluşması riski ciddi bir şekilde artmaktadır. Diyabet hastalarının % 80 ‘inden fazlası farklı türlerdeki kalp ya da damar hastalıklarından hayatını kaybetmektedir. • Obezite: Vücut ağırlığının fazla olması kalp üzerinde baskı oluşturduğundan diğer risk faktörlerinin hiçbiri olmadığı durumda bile koroner arter hastalığının oluşma ihtimalini arttırmaktadır. Obezite hem kan basıncını hem de kandaki kolesterol düzeyini arttırmakta ve diabet oluşumuna neden olabilmektedir. 78 • Stress ve öfke: Bazı bilim adamları stres ve öfkenin de koroner arter hastalığın oluşmasında rol aldığını düşünmektedirler. Hayatın zorluklarına karşı verilen mental ve fiziksel reaksiyon olan stres kalp atım hızı ve kan basıncını arttırarak arterlerin iç duvarlarında yaralanmaya neden olabilir. Kanıtlar göstermektedir ki; öfke, kalp hastalığından ölme riskini arttırmakta ve bir öfke krizinden hemen sonra hayatını kaybetme riski iki kattan fazla artmaktadır. Kalp krizi geçiren kişilerin % 60 ‘ından fazlası kalp krizinden önce ortaya çıkan belirtileri yaşar. Bazen bu belirtiler kalp krizinin gerçekleşmesinden günler ya da haftalar önce başlar. Fakat kişiler zaman zaman bu belirtileri tanımlayamaz ya da kabullenemezler. Belirtiler şöyle sıralanabilir: • Göğsün merkezinde birkaç dakika süren ve aralıklarla tekrar eden raharsız edici bir baskı, dolgunluk, sıkışma ya da ağrı, • Omuzlar, boyun ve kollara doğru yayılan ağrı, • Bayılma hissi, fenalık, terleme, mide bulantısı ya da kısa kısa nefes almanın eşlik ettiği gögüste rahatsızlık hissi. Sözü edilen bu belirtiler her kalp krizinde ortaya çıkmaz. Zaman zaman belirtiler kaybolup tekrar ortaya çıkabilir. Bu semptomlardan herhangi birinin varlığını hisseden kişiler mümkün olan en kısa sürede hastanelerin kardiyoloji kliniğine başvurmalıdır. 2.4.2. Kalp krizinin teşhisi ve tedavisi Kalp krizinin teşhisi için tek bir kriter bulunmamaktadır. Hastanın kalp atım hızı ve kan basıncı kontrol edilir, elektrokardiyogram ve kan örnekleri alınır. Elektrokardiyogram hangi koroner arterin tıkalı olduğunu gösterir. Kan testleri ile kalp kasında hasara uğramış hücrelerden kan dolaşımına verilen enzim ve diğer biyomarker proteinlerin miktarı tayin edilir. Kalp krizinin tedavisi, hastanın nefes almasının başlatılması, devamı ya da kalp atımının sağlanması gerektiğinde kardiyopulmaner canlandırma (kalp masajı) ile yapılmaktadır. İlave tedavi olarak; yakından görüntüleme, elektrik şoku, ilaç tedavisi, yeniden 79 damarlandırma (revaskülarizasyon), deri üzerinden girerek damarı onarma (perkutan transluminal koroner anjioplasti), koroner arter bypass cerrahisi kullanılabilir. Hastaneye gelir gelmez hasta yakından görüntülenir. Eğer kalp atışları kontrolsüz çırpınmalar şeklinde ise kalbin normal ritmini sağlamak için bir defibrilatör (elektrik şoku cihazı) kullanılabilir. Kalbin yükünü azaltmak ve hastanın daha kolay nefes almasını sağlamak amacıyla genellikle dışarıdan oksijen takviyesi yapılır. Eğer oksijen kalp krizinin ilk saatlerinde kullanılırsa kalbin göreceği hasarı azaltır. Hastanın durumunu kontrol altına alan ve kalbin göreceği hasarı azaltan ilaçlar trombolitikler, aspirin, anti-koagülantlar, ağrı kesiciler ve trankilizanlar, beta- bloklayıcılar, ace inhibitörleri, nitratlar, ritim düzenliyici ilaçlar ve diüretiklerdir. Hasarı azaltan ilaçlar ancak kalp krizini izleyen ilk bir iki saat içerisinde verilmesi durumunda etkilidir. Kan pıhtılarını parçalayan ve tıkalı arterden oksijence zengin kanın akmasını sağlayan trombolitik ilaçların mümkün olan en kısa zamanda verilmesi, kalp krizi geçiren hastanın hayatta kalma şansını arttırmaktadır. Kalp krizinden sonraki 1-2 saat içerisinde verilen trombolitikler en etkili ilaçlardır. İlave kalp krizlerini önlemek için trombolitik ilacı takiben aspirin ve antikoagülant ilaç verilir. Bu ilave ilaçlar yeni pıhtıların oluşmasını ve var olanların büyümesini engellemektedir. En iyi bilinen antikoagülantlar heparin ve warfarindir. Heparin hasta hastaneye ulaşır ulaşmaz damar yoluyla, warfarin ise daha sonra oral olarak verilir. Aspirin parçalanmış kan pıhtılarının tekrar oluşmasını engellemektedir. Ağrıyı hafifletmek için dil altına nitogliserin tablet verilebilir. Eğer ağrı devam ederse morfin sülfat kullanılabilir. Diazepam (Valium), vealprazolam (Ativan) gibi sakinleştiriciler de kalp krizinin oluşturduğu travmanın etkisini hafifletmek için kullanılabilir. Kalbin hızını azaltmak ve kalbe iyileşmesi için bir şans vermek amacıyla kalp krizinden hemen sonra beta-bloklayıcı ilaçlar damar yoluyla verilir. Bu, aynı zamanda ölümcül karıncık fibrilasyonunun önlenmesine yardımcı olmaktadır. Kalp krizinden hemen sonra kanın kalbe ulaşmasını kolaylaştırması ve kalp yetmezliği belirtilerini azaltmaya yardımcı olması için damar açıcı ilaçlar olan nitratlar da kullanılabilir. Kalp krizi anormal bir kalp atışına neden olabilir. Bu durumda aritmi ilaçları kalbin normal ritmini tekrar sağlamak için kullanılabilir. Anjiyotensin-dönüştürücü enzim (ACE) kalbin atmasını engelleyen 80 direnci azaltması nedeniyle kalp yetersizliğini engellemek ve kontrol altına almak için kullanılır. Bu ilaç, kalbi pompalama işlemini etkin bir şekilde yapamayan ve kalp yetersizliği belirtileri olan kalp krizi hastaları için kullanılır. Diüretikler ise kalbin etkin pompalama yapmadığı durumda biriken fazla miktarda suyun atılmasına yardım etmek için kullanılmaktadır. Genellikle oral olarak alınmakta ve vücudun sıvıları idrar olarak dışarı atmasını sağlamaktadır. Perkütan transluminal anjioplasti ve koroner arter bypass cerrahisi tıkalı koroner arterleri açmaya ve kan akışını düzeltmeye yönelik invazif yeniden damarlandırma prosedürleridir. Bu yöntemler genellikle pıhtı çözücü ilaçların işe yaramadığı, performans testi kötü olan, sol ventiküler fonksiyonu kötü olan yada dokuları yeterince kan alamayan (ischemia) hastalar için kullanılmaktadır. Genellikle anjioplasti, koroner arter bypasstan önce gerçekleştirilir. Koroner anjioplasti cerrahi bir yöntem değildir. Bu yöntemde ucunda balon bulunan bir kateter ile kasık ya da koldaki bir damardan girilmekte ve tıkalı artere baskı yapılıp damar genişletilerek tıkalı damar açılmaktadır. İşlem sonunda balonun havası boşaltılır ve kateter çıkartılır. Koroner anjioplasti bir hastenede kardiyolojist tarafından gerçekleştirilir ve iki gün hastenede yatmayı gerektirir. Hastaların üçte birinde koroner anjioplastinin uygulanmasından sonraki altı ay içinde arter daralması tekrar eder. Bu durumda prosedür tekrar uygulanabilir. Anjioplasti, arter bypass cerrahiden daha az invazif ve daha ucuz bir yöntemdir. Bypass işleminde sağlıklı bir bacak ya da gögüs duvarı damarı kullanılarak alternatif varyant bir damar tıkalı arterin etrafından dolaştırılır. Bundan sonra kalbe oksijence zengin kanı taşıma görevi bu sağlıklı damar tarafından gerçekleştirilmektedir. Bypass ameliyatı iki ya da üç ana arterinde tıkanma olan ya da sol ana arteri ciddi şekilde tıkanmış hastalar ile, diğer tedavilere cevap vermeyen hastalar için uygulanabilecek en uygun cerrahi yöntemdir. Hastanede ve genel anestezi altında koroner artere sağlıklı damar eklenirken hastayı desteklemek için kalp-akciğer cihazı kullanılarak gerçekleştirilir. Bypass ameliyatı geçiren hastaların % 70‘i kalbe yeterince kan gitmemesi nedeniyle ortaya çıkan göğüs ağrısından tamamen kurtulur. % 20‘si ise kısmen rahatlar. Bypass ameliyatından beş yıl sonra hayatta kalma beklentisi % 90, 10 yıl sonra % 80, 15 yıl sonra % 55 , 20 yıl sonra ise % 40‘tır. 81 Arterlerin tekrar tıkanmasını önlemek için üç cerrahi yaklaşım vardır. Birincisi, cerahi bıçaklar ile plakların arterden çıkarılması (aterektomi), ikincisi , laser uç içeren bir kateter ile plakların parçalanması veya yakılması (lazer anjioplasti) ve üçüncüsü de tıkanmış arteri açık tutmayı sağlayacak olan metal bir stendin takılmasıdır. 2.4.3. Hastalığın seyri ve önlenmesi Kalp krizinden sonraki dönem genellikle zordur. Kalp krizi geçiren hastaların üçte ikisi hiçbir zaman tam anlamıyla iyileşemez. Erkeklerin % 27’si, kadınların ise % 44‘ü kalp krizi geçirdikten sonraki bir yıl içinde hayatını kaybetmektedirler. Altı yıl içerisinde erkeklerin % 23’ü, kadınlarınsa % 31’i yeniden kalp krizi geçirirken, erkeklerin %13‘ü, kadınların ise % 6’sı ani ölüm sonucu hayatlarını kaybetmektedirler. Kalp krizi geçirip hayatta kalan insanların ani ölüm riski diğer insanlardan dört ila sekiz kat , hastalanıp hayatını kaybetme şansı ise iki ila dokuz kat daha fazladır. Bir çok kalp krizi, koroner arter hastalığını önleyecek şekilde sağlıklı bir yaşam sürdürerek önlenebilir. Kalp krizi geçirmiş olan kişilerde de sağlıklı bir yaşam şeklinin benimsenmesi ve doktorun önerilerine uyulması bir kez daha kalp krizi geçirmeyi engelleyebilir. Kalbi koruyan bir yaşam şeklinde; doğru besinler tüketilmeli, düzenli egzersiz yapılmalı, vücut ağırlığı belli bir değerde olmalı, sigaradan uzak durulmalı, alkol alımı dengeli olmalı, yasa dışı ilaçlar kullanılmamalı , hipertansiyon kontrol edilmeli ve stresle baş edilmelidir. 2.5. Kalp Krizinin Teşhisinde Kullanılan Biyolojik Belirteçler Amerikan Kalp Birliği tarafından yapılan araştırmalara göre 2004 yılında Amerika Birleşik Devletleri ‘nde meydana gelen ölümlerin üçte birinden fazlası kardiyovasküler hastalıklar ve bunun sonucunda meyana gelen miyokardiyal infarktüsten (MI) kaynaklanmaktadır. Amerika ‘da her yıl yaklaşık 1,1 milyon MI gerçekleşmekte ve bunlardan yaklaşık olarak 515 000‘i ölümle sonuçlanmaktadır. Bu ölümlerin çoğu da belirtilerin ortaya çıkmasından sonraki birkaç saat içerisinde gerçekleşmekte ve bu hastaların bakımı ve tedavisi için her yıl milyon dolarlar harcanmaktadır. Bu nedenle 82 ölüm oranlarının azaltılmasında hızlı teşhis ve erken tedavi büyük önem taşımaktadır (Straface ve ark. 2008). Dünya Sağlık Örgütü ‘nün (WHO) belirlediği kriterlere göre kalp krizi tanısı için aşağıdaki üç kriterden ikisi sağlanmalıdır: 1) Genellikle 20 dakikadan fazla süren karakteristik gögüs ağrısı, 2) tanısal ECG (elektrokardiyogram) değişiklikleri, 3) kandaki kardiyak biyolojik belirteç düzeylerinin artışı ve ardından düşüşü (Keffer 1996). Kalp krizinde etkili bir müdahale süphesiz ki erken tanıyla mümkündür. Fazla miktarda kardiyak yaralanmanın oluştuğu durumlarda yukarıda sözü edilen kriterler kolayca sağlanmaktadır. Fakat , küçük koroner dallarda tıkanma olduğunda tipik klinik ya da ECG bulguları oluşmayabilmektedir. Miyokardiyal infarktüsten muzdarip hastaların tahminen % 5’i acil servisten herhangi bir müdahale yapılmaksızın gönderilmektedir. Çünkü bu hastaların yaklaşık olarak 1/4‘ü atipik semptomlar göstermekte, 1/3‘ünde ise elektrokardiyagramda tanıya olanak sağlayacak herhangi bir değişiklik (ST elevasyonu) gözlenmemektedir (Char ve ark. 1998). Miyokardiyal infarktüs tanısını koymak zor olduğu için acil servise gögüs ağrısı ile gelip alıkonan hastaların sayısı da fazla olmaktadır. Lee ve arkadaşları (1991) göğüs ağrısı ile hastaneye başvuranların yaklaşık % 60-70‘inin başka bir teşhis konarak gönderildiğini rapor etmişlerdir. Acil servisteki esas problem atipik semptomların belirlenmesi ve kişinin kalp krizi geçirip geçirmediğinden emin olunabilmesidir. Dünya Sağlık Örgütü’nün akut MI için belirlediği kriterlere göre kardiyak belirteçler tanıyı kolaylaştırmaktadır. Biyokimyasal belirteçler uzun zamandan beri tanıda önemli bir rol oynamakta ve özellikle düşük ve orta risk grubunda yer alan hastalar için büyük önem taşımaktadır. Gögüs ağrısı ile gelen hastalara kalp krizi tanısını koyabilmek ya da risk durumlarını belirleyebilmek için rutin olarak kullanılan kardiyak biyomarkerlar miyoglobin, kreatin kinaz (CK)- miyokardiyal band (MB), ve kardiyak troponinler T (cTnT) ve I (cTnI) dir. Bu biyolojik belirteçler tersinmez miyokardiyal nekrozu takiben kan dolaşımına salınırlar (Şekil 2.5.1 ve Çizelge 2.5.1). Bu belirteçlerin kan dolaşımına salınmalarına ait karakteristikler ve kinetikler şöyle sıralanabilir (Califf ve Ohman 1992). 1) Miyoglobin düzeyi belirtilerin ortaya çıkmasından sonraki 1-2 saat içerisinde artar. Bu belirtecin düzeyinin ölçülmesi gögüs ağrısının başlamasından hemen sonra acil servise 83 başvuran hastaların izlenmesi için uygundur (erken göğüs ağrısı). 2) Kardiyak troponinler bu belirtilerin ortaya çıkmasından sonraki 3-4 saat içerisinde dedekte edilebilirler. Bu nedenle bu biyomaker semptomların ortaya çıkmasının üzerinden uzunca bir zaman geçmesinden sonra gelen hastalar için önem taşımaktadır (orta ya da geç gögüş ağrısı). 3) Kandaki CK-MB düzeyi ise belirtilerin ortaya çıkmasından epey uzun bir zaman sonra acil servise gelen hastalar için yararlıdır (geç göğüs ağrısı) (Storrow ve ark. 2006 a,b). Şekil 2.5.1. Kalp krizinin teşhisinde kullanılan biyomarker proteinler ve serum düzeylerinin zamana göre değişimi İdeal bir kardiyak biyomarkerın sahip olması gereken özellikler şöyle sıralanmıştır (Char ve ark. 1998, Storrow ve ark. 2006a): 1. İskelet kası harabiyetinin varlığında bile miyokardiyal hasarın tespitine olanak verecek özgüllükte olmalı 2. Yüksek hassasiyette ve orta derecedeki miyokardiyal hasarı bile tespit edebilecek hassasiyette olmalı 3. Boyutları küçük olmalı ve miyokardiyal yaralanmayı takiben hızla salınmalı 4. Harabiyetle orantılı miktarlarda ortaya çıkmalı 5. Plazmada analizine izin verecek kadar uzun süre kalmalı 6. Fizyolojik koşullar altında kan dolaşımında eser miktarda varlığı ya da yokluğu ve minimum düzeydeki artışı bile tespit edilebilmeli 84 7. Teknik olarak ölçümü kolay ve ucuz olmalı Fakat, ne yazık ki günümüzde rutin olarak kullanılan biyolojik belirteçlerden hiçbirisi tek başına acil servise belirtilerin başlamasından sonra farklı zamanlarda başvuran tüm hastalara MI tanısı koyabilmek için ideal bir belirteç özelliği taşımamaktadır. Çizelge 2.5.1. Miyokardiyal infarktüs tanısında kullanılan biyolojik belirteçler Belirteç Molekül Başlangıç Pik yapma Normale dönme ağırlığı artışı zamanı zamanı (kDa) (saat) (saat) (saat) Miyoglobin 17,6 1-3 5-8 16-24 cTnI 22,5 3-6 14-18 5-10 gün cTnT 33 3-6 10 -2 gün 10-15 gün CK-MB 86 3-8 9-24 48-72 CK-MB izoformları 86 1-4 4-8 12-24 MI kalp kasında geri dönüşümü olmayan hasara yol açan biyokimyasal bir olay olduğundan , sözü edilen biyolojik belirteçlerin kandaki düzeylerinin belirlenmesi ve klinik olarak anlamlandırılabilmesi için planlanmış bir test protokolü uygulanmalıdır. Hastaların acil servise başvurma zamanlarının farklılığı ve sözü edilen bu üç biyolojik belirtecin ortaya çıkış zamanlarındaki çeşitlilik MI’ün hızlı tanısında çok sayıda örneğin hızlı ve eş zamanlı takibini kaçınılmaz hale getirmektedir (Storrow ve ark. 2006a, McCullough ve ark. 2002). Bu gerçeklerin ışığında, Amerikan Kardiyoloji Birliği/Amerikan Kalp Birliği olası bir MI’ün tanısı için kullanılacak testlerin 60 dakika ya da tercihen 30 dakika içerisinde sonuçlanması gerektiği konusu üzerine vurgu yapmaktadır. Diğer bir deyişle, kardiyak testler için gerekli devir zamanı acil servis hekimlerinin karar vermede kullandıkları göğüs ağrısı protokolleri ile eş olmalıdır. Gögüs ağrısı başladığında ve ağrı başladıktan sonraki birkaç saat içerisinde miyoglobinin hassasiyeti CK, CK-MB ve troponinlerden (T ve I) daha yüksektir 85 (Kilpatrick ve ark. 1993). Kalp krizinin teşhisinde kullanılabilecek ilk biyomarker olması nedeniyle miyoglobin düzeyinin hızlı ve güvenilir bir şekilde tayini büyük önem taşımaktadır. 2.6. Miyoglobin Miyoglobin solunum ile ilgili bir protein olup kaslarda bulunmakta ve oksijen depolanmasında görev almaktadır. Omurgalıların iskelet kaslarında bol miktarda bulunur ve kas dokusunun karakteristik kırmızı renginden sorumludur. Miyoglobin 153 aminoasitten oluşan ve suda çözünen globüler bir protein olup tersiyer yapısı kısa, sarmal olmayan bölgelerle birleştirilmiş 8 adet α-heliksden oluşmaktadır (Şekil 2.6.1). 25x34x42 A0 boyutlarında olup izoelektrik pH değeri 7,3 ‘tür (Singh-Zocchi 2002). Globüler proteinler, yuvarlak ya da globüler olarak adlandırılabilen şekle katlanan ve farklı tipte ikincil yapılar içeren polipeptid zinciri ile karakterize edilmektedirler. Bu proteinlerin diğer bir önemli özelliği aminoasit yan zincirlerinin pozisyonudur. Bu spesifik yönlenmeler yapısal kararlılığın büyük bir kısmının hidrofobik etkileşimlerden kaynaklandığının bir göstergesidir. Şekil 2.6.2‘de görüldüğü gibi yapıda yer alan hidrofobik yan zincirlerin çoğu su moleküllerinden uzak olacak şekilde, molekülün iç kısmında hidrofilik R gruplarının çoğunluğu ise molekülün dış yüzeyinde yer almaktadır. Solumun olayında yer alan proteinler olan hemoglobin ve miyoglobin yapılarında bulundurdukları polar olmayan hem grubu sayesinde moleküler oksijen ile tersinir bir reaksiyona girebilirler. Yapılarında proto-porfirin olarak adlandırılan ve Fe atomu bulunduran organik bir grup içerirler. Protoporfirin birbirine metan köprüleri (α, β, γ, δ) ile bağlı dört adet pirol halkasından (I, II, III, IV) oluşur (Şekil 2.6.3.a). Yapıda farklı aminoasitlerin yer alması ile farklı çözünürlük, spektrum ve reaktivitede farklı türde porfirinler oluşur. Demir, protoporfirinin dört azot atomu ile birlikte hidrofobik kısımdaki hem molekülünü bağlayan miyoglobinin histidin yan zincirine bağlanmaktadır. Bu da histidinden uzak, oksijen bağlamak için uygun olan hem kısmı üzerinde altı bağlanma bölgesi sağlar (Şekil 2.6.3.b). Oksijen bağlanma bölgesi yanındaki kalıntılarla olan etkileşimler oksijen bağını stabilize eder. 86 Şekil 2.6.1. İspermeçet Balinası (Physeter catodon) miyoglobininin yapısı Hem grubu Fe atomunun 6. koordinasyon bölgesinin pozisyonuna göre dört farklı oksidasyon basamağında bulunur: 6. koordinasyon bölgesi boş ise, deoksi ; O2 bağlanmış ise, oksi; H2O ile doldurulmuş ise, met yada ferri; CO bağlanmış ise, karboksi miyoglobin olarak adlandırılır. Diğer biyolojik moleküller gibi, hemproteinleri çevresel değişimler ve kimyasal maddeler ile muamele edildiğinde biyolojik aktivitelerini kaybedebilirler. Şekil 2.6.2. Miyoglobinin hidrofobik ve hidrofilik yönlenmelerini gösteren yapı. Hem grubu (turuncu,sarı), proksimal ve distal (sarı) histidinler ve miyogloin ana yapısı. Hidrofobik rezdüler (beyaz) , polar ve yüklü rezidüler (mavi) 87 Şekil 2.6.3. (a) Hem grubu ve (b) miyoglobin molekülündeki bağlanma 88 3.MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal L-Triptofan metil ester (C12H14N2O2) Sigma-Aldrich 364517 Hidrokinon (C6H6O2) Merck 8.22333 Diklormetan (CH2Cl2) Riedel-de Haen 24333 Metakriloil klorür (C4H5ClO) Fluka 64120 Trietilamin (C6H15N) Across Organics 157910010 Sodyum Hidroksit (NaOH) Merck 1.06462 Etil Alkol (C2H5OH) Merck 1.00986 Sodosil  02 Riedel-de Haen 16167 2-Propanol Riedel-de Haen 24137 3-Aminopropil-trietoksisilan (H2N(CH2)3Si (OCH3)3 Sigma-Aldrich 28,177-8 Sülfürik asit (H2SO4) Fluka 84721 Hidrojen peroksit (H2O2) Merck 1.08597 Glutaraldehit Merck 1.04239 Sodyum klorür (NaCl) Fluka 71376 Aseton ((CH3)2CO) J.T.Baker 8003 2-Propen-1-tiyol (C3H6S) Fluka 06030 Amonyak (NH3) Merck 1.05422 Miyoglobin Sigma M0630 Hidroksietil metakrilat (C6H10O3) Merck 8.00588 Etilenglikol dimetakrilat ([H2C=C(CH3)CO2CH2]2) Sigma-Aldrich 33,568-1 Azoizobutironitril (C8H12N4) Merck 8.01595 Hidroklorik asit (HCl) Riedel-de Haen 07102 Metanol (CH3OH) Merck 1.13351 Lizozim (yumurta beyazından saflaştırılmış) Sigma L6876 Sitokrom c (sığır kalbinden saflaştırılmış) Sigma C2037 Etilen glikol (HOCH2CH2OH) Merck 1.00949 89 3.2. Yöntem 3.2.1. Metakriloil-amidotriptofan metil ester (MATrp) monomerinin sentezi Metakriloil-amidotriptofan metil ester (MATrp) monomerinin sentezi için uygulanan yöntem kısaca şöyledir: 5 g L-triptofan metil ester ve 0,2 g hidrokinon, 100 mL diklorometan (CH2Cl2) içerisinde çözüldü. Çözelti 0ºC'a soğutuldu. 12,74 g trietilamin bu çözeltiye ilave edildi. 5 mL metakriloil klorür yavaşça bu çözeltinin üzerine döküldü. Bu reaksiyon karışımı azot atmosferi altında manyetik karıştırıcı ile 2 saat oda sıcaklığında karıştırıldı. Kimyasal reaksiyonun sonunda, reaksiyona girmeyen metakroil klorür, % 10'luk NaOH çözeltisi ile ekstrakte edildi. Metakriloil-amidotriptofan metil esteri içeren kısmın çözücüsü döner buharlaştırıcıda uzaklaştırıldı ve kalan katı etanolde çözüldü (Yılmaz ve ark. 2009). 3.2.2. MATrp monomerinin karakterizasyonu 3.2.2.1. FTIR analizi MATrp monomerinin FTIR spektrumu, FTIR spektrofotometresi (Perkin Elmer, Spektrum 100 ,Waltham, MA, ABD) kullanılarak elde edildi. MATrp monomerinin etil alkol ile hazırlanan çözeltisinden 100 μL alınarak temizlenmiş cam slayt üzerine damlatıldı. 40oC’da 2 saat vakum etüvünde kurutuldu ve ATR aparatı kullanılarak FTIR spektrumu alındı. 3.2.2.2. NMR analizi MATrp monomerinin 1H NMR spektrumu, DMSO-d6 içerisinde Varian Mercury Plus 400 MHz NMR cihazı kullanılarak alındı. Kimyasal kaymalar (δ) ppm cinsinden DMSO-d6 referans alınarak rapor edildi. 90 3.2.3. Miyoglobin baskılanmış yüzey plazmon rezonans sensörün hazırlanması 3.2.3.1. Cam slaytların yüzey modifikasyonu 3.2.3.1.1. Cam slaytların temizlenmesi Poli(HEMA-MATrp) yüzey plazmon rezonans sensörün hazırlanmasında kalıp molekül olan miyoglobinin immobilizasyonu için kalınlığı 1 mm olan 2,5 cm x 2,5 cm boyutlarındaki mikroskop camı kullanıldı. Cam slaytlar önce sırasıyla 30 dakika süre ile kullanılan sıvı hacimleri 10 mL/slayt olacak şekilde % 2 lik nötr temizleyici (SoDosil 02), deiyonize su, izopropanol, deiyonize su, etanol ve son olarak deiyonize su ile 55 0C de ultrasonik banyoda bekletilerek temizlendi ve vakum etüvünde 1000C‘da 1 gece bekletildikten sonra kullanıldı (Şekil 3.2.3.1.1.1). Şekil 3.2.3.1.1.1. Cam slaytların temizlenmesi 91 3.2.3.1.2. Protein kalıbının hazırlanması Protein kalıbının hazırlanması için miyoglobin cam yüzeyine kovalent olarak immobilize edildi. Bu amaçla ilk olarak temizlenmiş olan cam slaytlar oda sıcaklığında 30 dakika süre ile H2SO4:H2O2 (70:30) (v/v) karışımında bekletildi. Ardından saf su ile 5 kez yıkanarak 800C‘da vakum etüvünde 2 saat kurutuldu. Kurutulan cam slaytlar aseton ile hazırlanmış % 5 (v/v) APTES (3-aminopropil-trietoksisilan) çözeltisine daldırılarak oda sıcaklılığında 30 dakika bekletildi. Bu süre sonunda aseton ve damıtık su ile 5’er kez yıkanarak 80oC‘da vakum etüvünde 2 saat kurutuldu. APTES ile modifiye edilmiş cam slaytlar pH 7,4 fosfat tamponu ile hazırlanmış % 2,5 (v/v) glutaraldehit çözeltisine daldırılarak oda sıcaklığında 2 saat bekletildi. pH 7,4 tamponu ile yıkanarak yine oda sıcaklığında kurutuldu (Şekil 3.2.3.1.2a). Elde edilen modifiye camlar 10 mL 0,01 mg/mL miyoglobin çözeltisine daldırılarak 24 saat süre ile +4oC‘de bekletildi. (Şekil 3.2.3.1.2b). Elde edilen miyoglobin kalıbı cam slaytlar pH 7,4 tamponu ile 5 kez yıkanarak reaksiyona girmeyen miyoglobin uzaklaştırıldı. Hazırlanan slaytlar oda sıcaklığında kurutularak miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) filmin hazırlanmasında protein kalıbı olarak kullanıldı. Baskılanmamış poli(HEMA- MATrp) filmin hazırlanmasında ise APTES ve glutaraldehid ile modifiye edilen cam slaytlar sadece pH 7,4 fosfat tamponu içerisinde bekletildi ve kurultulduktan sonra kullanıldı. 3.2.3.1.3. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) analizi Protein kalıbının hazırlanmasında kullanılan APTES ve glutaraldehid ile modifiye edilmiş cam yüzeyi ile protein immobilize edilmiş modifiye cam yüzeyin karakterizasyonu için yarı değen modda atomik kuvvet mikroskobu (Nanomagnetics Instruments, Oxford, İngiltere) kullanıldı. Atomik kuvvet mikroskobu, serbest kantileverli interferometre özelliği ile 4096 x 4096 piksel gibi çok yüksek çözünürlükte ölçüm alabilmektedir. Görüntüleme çalışmaları hava ortamında, yarı değen modda gerçekleştirildi. Salınım rezonans frekansı, 341,30 Hz olarak uygulandı. Titreşim genliği, 1 VRMS ve boş titreşim genliği ise 2 VRMS’dir. Örneklerden 2 µm/s tarama 92 hızında, 256 x 256 piksel çözünürlükte, 1 x 1 µm2, 2 x 2 µm2, 5 x 5 µm2 ‘ lik alanların görüntüsü alındı. 93 (a) (b) Şekil 3.2.3.1.2. (a) Cam yüzeyin APTES ve glutaraldehid ile modifikasyonu (b) Cam yüzeyine miyoglobin bağlanması 94 3.2.3.1.4. Temas açısı analizi Cam yüzeye ait her bir modifikasyon aşamasında (cam, APTES modifiye cam, glutaraldehid modifiye cam, protein immobilize cam) cam yüzeyin su ile yaptığı temas açısı belirlendi. Temas açısı ölçümlerinde Phoenix 300 (Kore) cihazı kullanıldı. Temas açısı ölçümünde yapışık damla (Sessile Drop) yönteminden yararlanıldı. Bu yöntemle analizi yapılmak istenen yüzeyler üzerine 1 damla su damlatılarak her birinin temas açısı ölçüdü. Ölçümlerde yüzeylerin farklı bölgelerine su damlatmak suretiyle 40 ayrı fotoğraf çekildi ve her biri için ayrı temas açısı belirlendi. Temas açısı ölçümlerinde Phoenix cihazı ile birlikte verilen ImageXP yazılımı kullanıldı. Bu yazılımda temas açı değerleri damlacığın katı ile sol temas noktasından alınan soldan temas açısı; sağ temas noktasından alınan sağdan temas açısı dikkate alınarak belirlenmektedir. Her bir yüzey için belirlenen temas açısı 40 ölçümün ortalama değeridir. 3.2.3.2. SPR altın çip yüzeylerinin modifikasyonu Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) yüzey plazmon rezonans sensörünün hazırlanmasında Şekil 3.2.3.2.1‘de gösterilen GWC SPRimager II sistemine uygun 2,5 cm x 2,5 cm boyutlarındaki altın kaplı çip (SPRchipTM) kullanıldı. Bu çipler SF10 cam üzerine 2 nm titanyum ve 42,5 nm altın kaplama içermekte ve firmadan hazır olarak temin edilebilmektedir. Altın kaplı çip yüzeyleri allil merkaptan (CH2=CH-CH2SH) kullanılarak modifiye edildi. Modifikasyon öncesi altın yüzey bazik pirana çözeltisi (3:1 (v/v) NH3:H2O2) ile temizlendi. Yüzeyi temizlenen altın çipler -180C‘da 24 saat 3 mM allil merkaptan içeren 5 mL etanol:su (4:1) çözeltisine daldırılarak polimerizasyonun altın yüzeyinde gerçekleşmesi için gerekli doymamış bağlar oluşturuldu (Şekil 3.2.3.2.2). 3.2.3.2.1. Speküler reflektans FTIR analizi Allil merkaptan ile kaplanan altın yüzeyin karakterizasyonu Perkin Elmer (Spektrum 100 Waltham, MA, ABD) FTIR cihazı ile cihaza ait speküler reflektans aparatı kullanılarak gerçekleştirildi. Spektrum, 80 derecelik bir sıyırma açısı ile 4 cm-1 çözünürlükte örnek başına 256 adet tarama yapılarak alındı. 95 Şekil 3.2.3.2.1. GWC SPRimager II sisteminde kullanılan SPRchipTM altın çip (a) (b) Şekil 3.2.3.2.2. (a) Altın yüzeyinin modifikasyonu (b) Allil gruplarının yönlenmesi 3.2.4. SPR çip yüzeyinde poli (HEMA-MATrp) filmin sentezi Allil merkaptan ile modifiye edilmiş yüzey plazmon rezonans altın çip yüzeyinde miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) polimerinin hazırlanması için ilk olarak HEMA, MATrp ve EGDMA ultrasonik banyoda 2 saat süre ile karıştırılarak stok polimerizasyon karışımı hazırlandı. Daha sonra bu karışımdan 0,5 mL alınarak içerisine 5 mg azobisizobütironitril (AIBN) eklenerek polimerizasyon karışımı hazırlandı. Reaksiyon karışımından azot gazı geçirilerek çözünmüş haldeki oksijen ortamdan uzaklaştırıldı. Daha sonra reaksiyon karışımından 5 µL numune alınarak daha önceden hazırlanmış olan protein kalıbı üzerine damlatıldı ve kalıp molekül ile monomerler arasında ön organizasyonun gerçekleşmesi için 30 dakika süre ile + 4oC‘da beklendi. Ardından allil merkaptan ile modifiye edilmiş yüzey plazmon rezonans çip bu karışım üzerine ters çevrilerek polimerizasyon UV ışığı (100 W, 356 nm, UVP B100-AP High Intensity UV-lamp) altında 4 dakika bekletmek suretiyle gerçekleştirildi. Polimerizasyon işleminden sonra protein kalıbı yüzey plazmon rezonans çip yüzeyinden 96 ayrıldı. Polimer kaplanmış yüzey plazmon rezonans çipler önce 0,1M HCl/metanol ardından saf su ve etil alkol ile yıkandı ve vakum etüvünde kurutuldu. Polimerizasyon yöntemi Şekil 3.2.4.1‘de görülmektedir. Baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) filmin hazırlanmasında ise APTES ve glutaraldehit ile modifiye edilmiş cam slayt miyoglobin çözeltisi yerine pH 7,4 fosfat tamponunda bekletildi ve kurutulduktan sonra yukarıda anlatıldığı şekilde kullanıldı. Uygun polimerizasyon karışımının belirlenmesi için MATrp:HEMA:EGDMA oranı 1:1:1, 1:1:3, 1:1:5, 1:1:6 şeklinde değiştirilerek miyoglobin baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) poli(HEMA-MATrp) filmler hazırlandı ve 10 000 ng/mL myoglobin çözeltisi kullanılarak her biri için baskılama faktörü (%∆RMIP-myo/ %∆RNIP) hesaplandı. Şekil 3.2.4.1. Yüzey plazmon rezonans çip yüzeyinde polimerik film hazırlanması. (a) Allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın çip (b) Protein kalıbının üzerine polimerizasyon karışımının damlatılması (5 µL) (c) Protein kalıbı yüzey plazmon rezonans çip üzerine ters çevrilmesi (d) UV-ışık uygulanması ile polimerizasyonun gerçekleştirilmesi (e) Protein kalıbının polimerik film oluşmuş yüzey plazmon rezonans çip yüzeyinden ayrılması ve polimer üzerinde miyoglobine özgü boşlukların hazırlanması 97 3.2.5. Poli (HEMA-MATrp) SPR çiplerin yüzey karakterizasyonu 3.2.5.1. FTIR-ATR analizi Miyoglobin baskılanmış yüzey plazmon rezonans çiplerin yüzeylerinin karakterizasyonu için FTIR-ATR spektrofotometresi (Peklin Elmer, Spectrum 100, Waltham, MA, ABD) kullanıldı. Poli(HEMA-MATrp) kaplanmış altın çip, cihazın örnek yuvasına yerleştirildi ve 400-4000 cm-1 dalga sayısı aralığında yüzeyde gerçekleşen toplam yansıma miktarı ölçüldü. 3.2.5.2. Temas açısı analizi Altın yüzey, allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey, yüzeyinde miyoglobin baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film hazırlanmış altın yüzeylerin ıslanabilirlik özelliklerinin incelenmesi amacıyla bu yüzeylerin su ve etilen glikol ile yaptıkları temas açıları ölçülmüş ve yüzey serbest enerjileri Owens, Wendt, Rabel ve Kaelble yaklaşımı kullanılarak hesaplandı. Bu amaçla Phonenix 300 cihazının Image XP yazılımı kullanıldı. Yüzey enerjilerinin hesaplanmasında kullanılan sabitler Çizelge 3.2.5.2.1’de verilmiştir. Çizelge 3.2.5.2.1. Yüzey enerjilerini hesaplamada kullanılan sabitler Su Etilen glikol Arayüzey Gerilimi (IFT), mN/m 72,8 48,3 Yayılma Bileşeni Gerilimi, mN/m 22,5 39,3 Kutupsal Bileşen Gerilimi, mN/m 50,3 19 Yoğunluk, g/mL 0,998 1,109 Viskozite, mP 1,002 21,81 Sıcaklık, °C 25 25 98 3.2.5.3. AFM analizi Altın yüzey, allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey ve miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) altın çiplerin yüzeylerinin karakterizasyonu için yarı değen modda atomik kuvvet mikroskobu (Nanomagnetics Instruments, Oxford, İngiltere) kullanıldı. Atomik kuvvet mikroskobu, serbest kantileverli interferometre özelliği ile 4096 x 4096 piksel gibi çok yüksek çözünürlükte ölçüm alabilmektedir. Görüntüleme çalışmaları hava ortamında, yarı değen modda gerçekleştirildi. Salınım rezonans frekansı, 341.30 Hz olarak uygulandı. Titreşim genliği, 1 VRMS ve boş titreşim genliği ise 2 VRMS’dir. Örneklerden 2 µm/s tarama hızında, 256 x 256 piksel çözünürlükte, 2 x 2 µm2 ‘ lik alanların görüntüsü alındı. 3.2.5.4. Elipsometre Hazırlanan poli(HEMA-MATrp) sensörün yüzeyindeki kalınlık ölçümleri Nanofilm EP3-Nulling Elipsometre (Göttingen, Almanya) cihazı ile yapıldı. Kalınlık ölçümleri 532 nm dalga boyunda, 62 derecelik bir geliş açısında gerçekleştirildi. Yüzeyinde polimerik film içeren altın çip lazer ışık kaynağı altına yerleştirildi. Yüzey kalınlığı hesaplama programı için SF10 cam + 2 nm titanyum katmanı + 42,5 nm altın katmanı veri olarak öngörüldü. Ölçümler sensör yüzeyinde 6 farklı noktada 3 kere tekrarlandı ve sonuçlar bu değerlerin ortalaması alınarak rapor edildi. 3.2.6. Yüzey plazmon rezonans sistemi ile ölçümler 3.2.6.1. SPR sisteminin analiz için hazırlanması Hazırlanan miyoglobin baskılanmış çipler ile kinetik analizler Şekil 3.2.6.1.1‘de gösterilen yüzey plazmon rezonans sistemi SPRimager II (GWC Technologies, Madison, ABD) ile gerçekleştirildi. Sensogramların elde edilmesinde sistem ile birlikte sağlanan Digital Optics V++ görüntüleme yazılımı ve bu yazılımla birlikte çalışan Microsoft Excel programı kullanıldı. 99 Şekil 3.2.6.1.1 SPRimager II (GWC Technologies, Madison, ABD) yüzey plazmon rezonans sistemi GWC SPRimager II cihazında yüzey plazmon rezonans etkisi yüzey plazmon rezonans açısına yakın sabit bir açıda uyarılmış olan örnekten yansıyan ışığın ölçülmesi prensibine göre çalışmaktadır (Şekil 3.2.6.1.2 (b)). SPRimager II sisteminde ışığın dalga boyu (800 nm) ve geliş açısı (40o – 70o) sabittir. Cihaz ışık kaynağı, kutuplayıcı, örnek hücresi, dar band filtresi, çip yüzeyindeki tüm optik alanı yakalayabilen CCD kameradan oluşan bir dedektör ve sıcaklık değişimini önlemek için bir sıcaklık sensörü içermektedir (Şekil 3.2.6.1.3). Cihazın çalışma prensibi Şekil 3.2.6.1.2 (a)‘da özetlenmiştir. Koşutlamış polikromatik bir kaynaktan gelen ışık yüzey plazmon rezonans açısına yakın bir bölgedeki açıda bir polarizörden (kutuplayıcı) geçerek prizma/ince altın film/örnek üçlüsünün beraberce oluşturduğu örnek hücresine çarpmaktadır. Işık, prizma/altın arayüzeyi ile etkileşerek yansıyan ışığın şiddetindeki azalmaya neden olan yüzey plazmonlarını oluşturur. Örnekten yansıyan ışık sadece dedektörün algılayabileceği aralığa denk gelen dar bir band aralığındaki ışığın geçişine izin veren bir filtreden geçer ve bu sayede yansıyan ışığın şiddeti ölçülür. 100 (a) (b) Şekil 3.2.6.1.2. SPRimager II sisteminin (a) çalışma ve (b) sensogram oluşturma prensibi Miyoglobin baskılanmış yüzey plazmon rezonans çip ile kinetik analizler yapılabilmesi için hazırlanan çip polimerik film kaplı yüzeyi akış hücresi yönünde olacak şekilde örnek tutucuya yerleştirildi ve üzerine kırılma indisi eşitleyici sıvı (kırılma indisi: 1,720 ± 0,0005 , Cargille Laboratuaries series M fluid) damlatılarak üzerine prizma yerleştirildi. Bu sayede SF-10 cam prizma ile altın çip arasındaki bağlantı sağlanmış oldu (Şekil 3.2.6.1.4). Ardından akış hücresi, giriş ve çıkış uçlarıda örnek tutucuya eklenerek örnek hücresi hazırlandı ve kinetik analizlerin gerçekleştirlmesi için cihaza yerleştirildi. Sıcaklık sensörü kullanılarak sıcaklık 25oC‘a sabitlendi ve tüm sensogramlar bu sıcaklıkta alındı. 3.2.6.2 Yüzey plazmon rezonans sistemi ile sensogram alınması Örnek hücresi hazırlanarak cihaza yerleştirildi. İlk olarak sisteme pH 7,4 fosfat tamponu gönderilerek çip üzerindeki polimer yüzeyinin ıslanması sağlandı ve yüzeyden 150 µL/dakika hızında 30 dakika süre ile pH 7,4 tamponu geçirilmeye devam edildi. Daha sonra geliş açısı yüzey plazmon rezonans açısına yakın bir açıya sabitlenerek sensogram alınmaya başlandı. Sistemden ilk olarak pH 7,4 tamponu geçirildi ve ardından analizi 101 Şekil 3.2.6.1.3. GWC SPRimager II cihazının temel ekipmanları 102 (a) (b) (c) (d) Şekil 3.2.6.1.4. Örnek hücresinin hazırlanması (a) yüzey plazmon rezonans çipin örnek tutucuya yerleştirilmesi (b) akış hücresinin takılması (c) giriş ve çıkış uçlarının yerleştirilmesi (d) prizma ve akış hücresinin bir araya getirilmesiyle örnek hücresinin hazırlanması yapılacak olan çözelti (miyoglobin içeren sulu çözelti, yarışmacı protein çözeltileri ya da plazma örnekleri) çip yüzeyine gönderilerek yansıyan ışığın şiddetindeki değişim farkı değerleri anlık olarak gözlenerek denge durumuna geldiğinde (yaklaşık 25 dakika) sisteme tekrar pH 7,4 tamponu verilerek spesifik olarak bağlanmayan analit molekülleri yüzeyden uzaklaştırıldı. Ardından yüzeye 10 dakika 1 M etilen glikol karışımı verilerek desorpsiyon işlemi gerçekleştirildi. Desorpsiyon işleminden sonra, yüzey plazmon rezonans sensör yüzeyi 10 dakika su ve tekrar dengeye gelene kadar (yaklaşık 10 dakika) pH 7,4 tamponu ile yıkanarak rejenere edildi. Ardından cihazla birlikte verilen yazılımlar kullanılarak sensogram elde edildi. 103 3.2.7. Yüzey plazmon rezonans sistemi ile kinetik analizler Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör için kalibrasyon eğrisinin hazırlanması amacıyla farklı derişimlerdeki miyoglobin çözeltileri sensör yüzeyine gönderildi. Bu çözeltiler 100-10 000 ng/mL derişim aralığında pH 7,4 fosfat tamponuyla hazırlandı ve her bir derişim değerine ait sensogram alınarak % ∆R değerleri belirlendi. 3.2.7.1. Yarışmalı kinetik analizler Miyoglobin baskılanmış yüzey plazmon rezonans sensörün seçiciliğini göstermek için lizozim, BSA ve sitokrom c proteinlerinin kullanılmasıyla oluşturulan karışımlar (tekli, ikili, üçlü, dörtlü) yüzey plazmon sistemine gönderilerek yarışmalı adsorpsiyon çalışmaları gerçekleştirildi. Bu çözeltiler, pH 7,4 tamponunda 1000 ng/mL derişiminde hazırlandı ve çip yüzeyine gönderilerek sensogramlar alındı. 3.2.7.2. Poli(HEMA-MATrp) sensörün baskılama seçiciliğinin belirlenmesi Baskılama seçiciliğinin belirlenmesi için pH 7,4 fosfat tamponunda 1000 ng/mL derişiminde hazırlanan miyoglobin, lizozim, sığır serum albumini (BSA) ve sitokrom c proteinleri ve bu proteinlerin kullanılmasıyla oluşturulan karışımlar (tekli, ikili, üçlü, dörtlü) baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensör yüzeyine gönderilerek sensogramlar alındı. 3.2.8. Kan örneği ile analizler Hazırlanan miyoglobin baskılanmış yüzey plazmon rezonans sensörün gerçek örnekler ile kullanılabilirliğinin ve mevcut yöntemler ile uyumluluğunun araştırılabilmesi için kan örnekleri kullanıldı. Kan örnekleri Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Kardiyoloji Anabilimdalı yoğun bakım bölümüne kalp krizi şikayeti ile gelen hastalardan alındı (Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulu Karar No: 2008-19/30). Kanlar etilendiamin tetraasetikasit (EDTA) içeren vakumlu tüpler ile toplandı ve kırmızı kan hücrelerinin uzaklaştırılması için oda sıcaklığında 30 dakika 4000 g’de santrifüjlendi. 104 Daha sonra plazma kısmı 3 µm’lik filtreden geçirildi ve -20°C’da dondurularak saklandı. Kullanmadan önce plazma 37°C’da 1 saat bekletilerek tavlandı. Uygulamadan önce, plazma örneklerinin seyreltilmesinde % 0,95 NaCl içeren izotonik çözelti kullanılmıştır. Hazırlanan sensörün etkinliğini göstermek için kan örnekleri ELISA testi (Myoglobin EIA test kit, BioChek, Inc. Foster City, USA) ile analiz edildi. Analizde test ile birlikte verilen yöntem kullanıldı. Kan örneğinin analizinde kanın kırılma indisi değişiminden gelebilecek hataları azaltmak için standart katma metodu kullanıldı. Kan örneğindeki toplam seyrelme miktarı 1:15 olacak şekilde önce kör örnek, ardındanda aynı seyrelme oranında, miyoglobin derişimi 300; 500; 700; 900 ve 1000 ng/mL olan çözeltiler % 0,95 NaCl içeren izotonik çözelti kullanılarak hazırlandı. Hazırlanan bu çözeltiler miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör yüzeyine gönderilerek % ∆R/zaman değişiminden oluşan sensogramlar alındı. 105 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. MATrp Monomerinin Sentezi ve Karakterizasyonu MATrp monomeri, L-triptofan metil esterin metakriloil klorür ile reaksiyonu sonucu elde edildi (Şekil 4.1.1). Elde edilen monomerin karakterizasyonu NMR ve FTIR çalışmaları ile yapıldı. Şekil 4.1.1. MATrp monomerinin sentez reaksiyonu MATrp monomerinin kimyasal yapısının belirlenebilmesi için 1H-NMR kullanılmıştır. Şekil 4.1.2 MATrp’nin 1H-NMR spektrumunu göstermektedir. MATrp monomerinin yapısında bulunan ilgili protonlara ait pikler spektrum üzerinde işaretlenmiştir. MATrp monomerine ait karakteristik pikler şunlardır:  8,22 (1H s, br, N-H), (2) 7,54-7,09 (4H aromatikler), (3) 6,98 (1H d, amid NH J=5,58), (4) 5,64 (1H, t CH2) , (5) 5,32 (1H, t, CH2), (6) 4,99 (1H, m, CH) (7) 3,38(2H, dd, CH2), (8) 6,34 (1H,d, 5’li halka , J=7,6), (9) 3.71 (3H, s, OCH3), (10) 1,24 (3H ,t, CH3), (400 MHz, DMSO-d6). MATrp monomerinin yapısının belirlenmesi için FTIR tekniği de kullanılmıştır. Şekil 4.1.3’de MATrp monomerinin FTIR spektrumu verilmiştir. Spektrum üzerinde bileşiğe ait olan karakteristik bandlar gösterilmiştir. 3100-3000 cm-1 aralığında aromatik C-H , 2952 ve 2853 cm-1’de alifatik C-H gerilmelerinden kaynaklanan absorpsiyon bandları gözlenmektedir. 1734 cm-1 ‘de ester karbonil (C=O) grubuna ait gerilme bandı, 106 1659 cm-1’de ise amid karbonil grubuna ait gerilme bandı yer almaktadır. N-H gerilme titreşiminden kaynaklanan absorpsiyon bandıda 3500 cm-1 civarında ortaya çıkmıştır. 4.2. Altın Yüzey Modifikasyonunun Karakterizasyonu 4.2.1. FTIR analizi Tiyoller (R-SH) Au(111) substratlar üzerinde mükemmel SAM (Self-Assembled Monolayer) oluştururlar. Uç grup altın yüzeyinde kuvvetli ve istemli bir şekilde adsorbe olur. Daha sonra moleküller zincir-zincir etkileşimleri ile tekrar kendi aralarında organize olarak yüzeyde yoğun ve düzenli bir tabaka oluştururlar. Bu düzenlenmede kuyruk kısmında yer alan grup dışa doğru yönlenmektedir. Şekil 4.2.1.1 katı yüzey üzerinde SAM oluşumunu şematik olarak göstermektedir. Şekil 4.2.1.1. Altın yüzeyinde SAM oluşumunun şematik gösterimi Farklı fonksiyonel gruplara (kuyruk) sahip tiyol molekülleri kullanılarak çalışılan yüzeyin kimyasal özelliği ve fonksiyonelliği çok geniş bir aralıkta değiştirilebilir. Hatta SAM oluşumundan sonra kuyruk kısmında yer alan fonksiyonel grup kimyasal olarak modifiye edilebilir. Altının göreceli inertliği, kolay temizlenmesi ve hazırlanmasına olanak sağlayan mikrokristalin yapısı nedeniyle Au (111) üzerine tiyol bağlanması en çok çalışılan model sistemdir. Tiyollerin kolayca SAM oluşturabildiği diğer metaller gümüş, platin, bakır, demir, nikel, civa iken GaS (galyum sülfür), indiyum fosfor (InP) gibi yarı iletken yüzeylerinde bu oluşum kolayca gerçekleşebilmektedir. 107 Şekil 4.1.2. MATrp’nin 1H-NMR spektrumunu 108 Şekil 4.1.3. MATrp monomerinin FT-IR spektrumu 109 SAM karakterizasyonu için IR ve fotoelektron spektroskopisi (XPS) gibi spektroskopik teknikleride kapsayan çok sayıda farklı deneysel ve mikroskopik yöntem bulunmaktadır. Ayrıca temas açısı gibi daha dolaylı yöntemler de karakterizasyon için kullanılmaktadır. SAMlerin karakterizasyonu için su yada başka çözücüler kullanılarak temas açısının ölçülmesi fizikokimyasal özelliklerin ayrıntılı olarak belirlenmesi için tek başına yeterli olmamaktadır. Daha ayrıntılı bir analiz için oluşan tabakanın kimyasal bileşimi ve moleküler yönlenmesi belirlenmelidir. Fakat tabaka kalınlığının çok düşük olması bir dezavantajdır ve oldukça hassas tekniklere ihtiyaç duyulmaktadır. IR spektroskopisi SAM karakterizasyonunda sıklıkla kullanılan bir tekniktir. Rutin IR analizlerinden farklı olarak metal yüzeyinde oluşan SAM analizleri, IR ışığın örnek yüzeyinden yansıtıldığı sıyırma açısında alınan spektrum ile yapılmaktadır. Tabaka kalınlığının çok düşük olması ve absorpsiyon yapan moleküllerin bulunduğu bölgede ışığın aldığı yol kısa olduğundan absorbans değerleri oldukça düşüktür. Bu nedenle sıkça kullanılan detero-triglisinsülfat (DTGS) piroelektrik dedektör yerine, civa-kadmiyum-tellür fotodiyot (MCT) dedektörler kullanılmaktadır. Şekil 4.2.1.2’de onsekiz karbonlu bir alkanotiyolat için C-H gerilme bölgesinde elde edilen absorbans değerleri görülmektedir (Kind ve Wöll 2009) Şekil 4.2.1.2. Oktadekantiyol kullanılarak hazırlanan altın yüzeye ait IR spektrumu (C- H gerilme bölgesi) 110 Metal yüzeyinde SAM oluşumunun IR spektroskopisi ile analizinde kimyasal yapının ve moleküler yönlenmenin belirlenmesinde çok sayıda absorpsiyon bandına ait değişimden yararlanılmaktadır. Bunlardan en önemlileri, 2800-3000 cm-1 frekans aralığındaki C-H gerilme bandlarının oluşması ve serbest tiyollerde 2560 cm-1 civarında gözlenen S-H gerilme titreşimine ait bandın kaybolmasıdır. SPR altın çip yüzeyinde poli(HEMA-MATrp) filmin hazırlanabilmesi için ilk olarak yüzey doymamış bağlar içeren allil merkaptan (CH2=CH-CH2-SH) ile kaplanmıştır. Şekil 4.2.1.3’de allil merkaptan kaplanmış altın çip yüzeyine ait IR spektrumu görülmektedir. Tabaka kalınlığının düşük olması nedeniyle spektrum oldukça gürültülüdür. Ancak C-H gerilme bölgesine bakıldığında 2930 cm-1 ve 2857cm-1 de simetrik ve asimetrik C-H gerilme titreşimlerine ait bandlar açıkça görülmektedir. Üç karbonlu bir alkanotiyolat olan propantiyolat için de simetrik ve asimetrik C-H gerilme titreşim bandları 2928 cm-1 ve 2856 cm-1’de gözlenmiştir (Hostetler ve ark. 1996). Altı karbon ve üzeri alkil zincirine sahip alkanotiyolatlar için ise bu değerler simetrik gerilmeler için 2848-2850 cm-1, asimetrik gerilmeler için 2918-2920 cm-1 aralığında değişmektedir. Bu açıdan bakıldığında allil merkaptan kaplı altın yüzey için bulunan C- H gerilme titreşim bandlarına ait frekans değerleri literatür ile uyumludur. Ayrıca serbest alkanotiyolatlarda 2560 cm-1 civarında gözlenen S-H gerilme titreşim bandı spektrumda gözlenememiştir. Bu sonuç allil merkaptanın altın yüzeyine bağlanması nedeniyle S-H bağının kırıldığını düşündürmüştür. 4.3. Cam Yüzey Modifikasyonunun Karakterizasyonu Bu çalışmada, miyoglobinin poli(HEMA-MATrp) film yüzeyine baskılanmasında mikrotemas baskılama yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntemde kalıp protein molekülü cam yüzeyine immobilize edilmekte ve bu sayede proteinin polimerizasyon karışımında çözünme problemi ortadan kalkmaktadır (Chou ve ark.2005). Bu güne kadar bu yöntem ile yapılan bütün çalışmalarda, protein damgası olarak kullanılacak cam yüzeyi hekzametilendisilazan (HMDS) ile hidrofobik hale getirilerek protein molekülleri yüzeye hidrofobik etkileşimler ile immobilize edilmiştir (Lin ve ark. 2006). 111 81.0 80 78 2857.08 2930.28 76 74 72 70 68 66 %T 64 62 60 58 56 54 52 50.0 3400.0 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700 650.0 cm-1 (a) 112 80.60 80.5 80.4 80.3 80.2 80.1 80.0 79.9 79.8 79.7 %T 2857.76 79.6 2928.36 79.5 79.4 79.3 79.2 79.1 79.0 78.9 78.80 3100.0 3080 3040 3000 2960 2920 2880 2840 2800 2760 2720 2680 2650.0 cm-1 (b) Şekil 4.2.1.3. Allil merkaptan kaplanmış altın çipe ait speküler reflektans FTIR spektrumu (a) spektrum (b) 2650-3100 cm-1 aralığının yakından görünüşü 113 Protein molekülleri yüzeye temel olarak iyonik etkileşimler, hidrofobik ve polar etkileşimler aracılığı ile adsorbe olabilirler. Hangi tür moleküller arası etkileşimin etkin şekilde yer aldığı ise yüzeye ve proteine göre değişmektedir. Oluşan tabaka heterojen ve rastgele yönlenmiş protein moleküllerinden oluşmaktadır. Çünkü her molekül, substrat ve daha önce adsorplanmış protein molekülleri ile arasındaki itme kuvvetlerini en aza indirecek şekilde farklı yönlenmelerde çok sayıda temasta bulunabilir. Ayrıca adsorpsiyon ile immobilizasyonda iyonik şiddet, pH ya da sıcaklık gibi çevresel koşulların değişmesi durumunda adsorplanmış moleküller desorbe olurlar (Sun ve ark. 2006, Frederix ve ark. 2004). Chou ve ark. (2007) lizozimi kalıp molekül olarak kullandıkları bir çalışmada, kalıp molekülü içeren camın yüzeyden ayrılması sırasında kalıp molekül lizozimin polimerik film yüzeyine transfer olduğunu rapor etmişlerdir. Proteini yüzeyden uzaklaştırmak için NaOH ile yıkanmış, her bir aşamada temas açısı ölçülmüş ve kalıp molekül lizozimin uzaklaşmasına bağlı olarak temas açısının azaldığı belirlenmiştir. Lin ve ark. (2006) mikrotemas baskılama yöntemi ile miyoglobin, lizozim ve ribonükleaz A için moleküler baskılanmış polimerlerik filmler hazırlamış ve polimerizasyondan sonra kalıp molekülün uzaklaştırılması için % 0,8 NaOH ve % 2 SDS ile 800C‘da 30 dakika yıkama yapıldığını rapor etmiştir. Proteinler yüzeylere protein yapısında yer alan ulaşılabilir konumdaki aminoasit yan zincirlerindeki fonksiyonel gruplar aracılığı ile kovalent olarak da immobilize edilebilir. Kovalent bağ genellikle yan zincirdeki fonksiyonel grup ile uygun şekilde modifiye edilmiş substrat arasında gerçekleştirilir. Sonuç olarak bağlanmanın tersinmez olduğu ve yüzeyin büyük ölçüde kaplandığı substratlar elde edilir. Kovalent bağlama tekniği bağlanma kararlılığı ve dayanıklılık düşünüldüğünde adsorpsiyona göre çok daha uygun bir tekniktir (Lu ve ark. 2007). Biyosensör yüzeylerine proteinlerin bağlanmasında da sıklıkla tercih edilen yaklaşım kovalent bağlamadır (Duan ve ark. 2007, Zhang ve ark. 2004b, Christiaens ve ark. 2006, Cooper 2002). Kovalent bağlamada en çok kullanılan yaklaşım protein molekülünde yer alan –NH2 grupları ve aldehid grupları ile türevlendirilmiş substrat arasında Schiff bazı 114 oluşumudur (D’Souza ve Godbole 2002, Choi 2005, Betancor ve ark. 2006). Aldehit- amin kimyası farklı yüzeylere protein immobilizasyonunda yıllardır yaygın bir şekilde kullanılmaktadır (Avseenko ve ark. 2001, Zhang ve ark. 2004b). Cam yüzeyinde fonksiyonel grup oluşturmak için genellikle protein yüzeyinde yer alan gruplar ile elektrostatik ya da kovalent etkileşimi sağlayacak fonksiyonel gruplar içeren silan bileşikleri kullanılır. Yüzey modifikasyonunda en sık kullanılan iki madde aminopropil trietoksi silan (APTES) ve glutaraldehittir (Gan ve ark. 2009, Graf ve ark. 2008). APTES kovalent olarak cam yüzeyine bağlanır. –NH2 uçları her iki ucuda aldehid grubu içeren glutaraldehid ile kovalent olarak bağlananarak yüzeyde serbest aldehid grupları oluşturulur (Şekil 4.3.1). Bu aldehid gruplarıda proteinleri Schiff bazı oluşumu ile kovalent olarak bağlar (Qin ve ark. 2007). Bu çalışmada, cam yüzeyi ilk olarak APTES ve glutaraldehid ile modifiye edilmiş ve ardından miyoglobin yüzeye kovalent olarak immobilize edilmiştir. Bu sayede proteinin yüzeyden desorpsiyonu engellenmiştir. Bu yöntem ile NaOH/SDS gibi bağlanma bölgelerinin yapısını bozabilecek kimyasallar ile yıkama aşaması da ortadan kaldırılmıştır. 4.3.1. Temas açısı analizi Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) filmin hazırlanmasında ilk olarak cam slaytlar temizlenmekte ve daha sonra modifiye edilerek protein kalıbının hazırlanmasında kullanılmaktadır. Bu aşama da cam yüzeyinde bir çok değişim olmaktadır ve bu değişimleri temas açılarındaki farklılıkları izlemek suretiyle belirlemek mümkündür. Bu değişimleri karakterize etmek amacıyla temizlenmiş cam, APTES ile modifiye edilmiş cam, APTES ve ardından glutaraldehit ile modifiye edilmiş cam ve miyoglobin immobilize edilmiş camın (protein kalıbı) su ile yaptıkları temas açıları belirlenmiştir. Çizelge 4.3.1.1‘de suyun cam yüzeyler ile yaptığı temas açısı değerleri, Şekil 4.3.1.1‘de ise yine bu yüzeylere ait temas açısı görüntüleri yer almaktadır. 115 Şekil 4.3.1. (a) Cam yüzeyin APTES ile modifikasyonu (b) APTES modifiye camın glutaraldehid aktivasyonu (c) Miyoglobinin modifiye cam yüzeyine kovalent olarak bağlanması 116 Çizelge 4.3.1.1. Cam yüzeylerine ait temas açısı değerleri Temas Açısı, ° Yüzey (H2O) Asidik pirana çözeltisi ile temizlenmiş cam 44,7 ± 3,5 APTES ile modifye edilmiş cam 54,3 ± 3,2 APTES + glutaraldehid ile modifiye edilmiş cam 61,8 ± 4,2 Miyoglobin bağlanmış cam (Protein kalıbı) 67,3 ± 2,1 Asidik pirana çözeltisi ile temizlenmiş cam için temas açısı 44,7o ± 3,5 iken APTES ile modife edilmiş cam için bu değer 54,3o ± 3,2 ‘ye yükselmiştir. Bu değişim APTES ile muamele sonucunda cam yüzeyinin daha hidrofobik bir karakter kazandığını göstermektedir. Bu değişim büyük olasılıkla cam yüzeyindeki -OH gruplarının aminopropil segmentleri ile kovalent olarak bağlanmasından kaynaklanmaktadır. APTES ile kaplanmış cam yüzey daha sonra glutaraldehid ile modifiye edilmiş ve temas açısı 65,8o ± 5,2 olarak belirlenmiştir. Bu sonuca göre yüzey biraz daha hidrofobik hale gelmiştir. Çünkü glutaraldehid, APTES den gelen amin uçlarını imin oluşumuyla kapatmış ve içerdiği hidrokarbon zincirinden dolayı da hidrofobik özellik kazandırmıştır. Miyoglobinin kovalent olarak bağlandığı cam yüzeyinde ise temas açısı 67,3o ± 2,1 olarak elde edilmiştir. Bu sayede hidrofobisitede az da olsa bir artış olmuştur. 4.3.2. AFM analizi Cam yüzeyinin morfolojisindeki değişimin ayrıntılı bir şekilde incelenebilmesi için APTES ve glutaraldehid ile modifye edilmiş cam yüzeyin ve miyoglobin immobilize edilmiş cam yüzeyin AFM görüntüleri alınmıştır. Şekil 4.3.2.1 ve Şekil 4.3.2.2’de bu modifikasyonlardan sonra cam yüzeye ait AFM görüntüleri görülmektedir. Görüldüğü gibi APTES ve glutaraldehid modifikasyonu ile cam yüzeyinde oluşan kalınlık yaklaşık 1,5-2 nm’dır. Miyoglobinin cam yüzeyine immobilizasyonundan sonra yüzey morfolojisi tamamen değişmiş ve kalınlık 6-6,5 nm değerlerine yükselmiştir. Bu sonuç miyoglobinin cam yüzeyine başarıyla immobilize edildiğini göstermektedir. 117 4.4. Miyoglobin Baskılanmış Poli(HEMA-MATrp) Sensörün Hazırlanması ve Karakterizasyonu Afinitesi ve seçiciliği yüksek MIPlerin hazırlanmasında en önemli parametreler; monomer ve çapraz bağlayıcının seçimi ve polimerizasyon koşullarının optimizasyonudur. Ne yazık ki, MIP hazırlanması için genel bir işlem yoktur. Bu nedenle uygulamaya bağlı olarak işlemlerin ayrıntılı bir şekilde incelenmesi gerekmektedir. Uygun yöntemin belirlenmesinden sonra değişkenlerin sürece etkisi optimize edilmelidir. Bununda birlikte polimerizasyondan sonra spesifik olmayan bağlanmanın yüksek olması ve heterojen bağlanma bölgelerinin oluşması önlenmelidir. Eğer polimerizasyondan sonra polimer içerisinde hala uzaklaştırılamayan kalıp molekül kalıyorsa bağlanma kapasitesi azalacaktır. Bu yüzden kalıbın tamamen uzaklaştırılması için de ilave bir çabaya ihtiyaç duyulmaktadır (Uludağ ve ark. 2007). Altın yüzeyinde sensör oluşturacak moleküler baskılanmış polimerlerin hazırlamasında iki temel yaklaşım vardır. Birincisi tiyol içeren bir molekül ile sensör yüzeyinde aktif bir uç oluşturmak ve polimerik filmin adhezyonunu arttırmaktır. Allil merkaptan (Kugimiya ve Takeuchi 2001, Wu ve Syu 2006, Uzun ve ark. 2009), merkaptoetanol (Ling ve ark. 2005), tiyotik asit modifiye glisidil metakrilat (Liu ve ark. 2006a) ve merkaptoundekanoik asit (Piacham ve ark. 2005) bu amaçla kullanılmaktadır. İkincisi sensör yüzeyinde herhangi bir aktivasyon yapmaksızın polimer sentezini doğrudan altın yüzeyinde gerçekleştirmektir. Bu iki temel yaklaşım dikkate alındığında moleküler baskılanmış polimerler sensör yüzeyine yüzey aşılama (Piacham ve ark. 2005), sıkıştırma (sandwich casting), dönel kaplama (Ling ve ark. 2005) ya da elektropolimerizasyon (Sallacan ve ark. 2002) ile kaplanabilmektedir. Sıkıştırma yöntemi hem altın yüzeyinin aktivasyonundan sonra (Kugimiya ve Takeuchi 2001, Cao ve ark. 2001, Liu ve ark. 2006b) hem de yüzeyi aktive etmeden doğrudan sensör yüzeyinde (Percivalve ark. 2002, Kugimiya ve Takeuchi 2001, Haupt ve ark. 1999b, Percival ve ark. 2001) polimerizasyona olanak vermektedir. Bu açıdan bakıldığında mikrotemas baskılama yöntemine de ilham vermektedir. Çünkü mikrotemas baskılama yönteminde protein molekülleri cam substrat üzerine immobilize edilmekte ve kalıp 118 molekül olarak kullanılmaktadır. Bu durumda hem kalıp molekül proteinin polmerizasyon karışımında çözünme problemi ortadan kalkmakta hem de kalıp molekül varlığında MIP sensör altın yüzeyinde başarıyla sentezlenebilmektedir. Bu çalışmada; ilk olarak maksimum sensör cevabını oluşturacak, seçiciliği yüksek miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) filmin hazırlanması için gerekli optimizasyon yapılmış ve ardından hazırlanan sensör FT-IR, temas açısı, AFM ve SEM analizleri ile karakterize edilmiştir. 119 (a) (b) (c) (d) Şekil 4.3.2.1. Cam slaytların su ile temas açısı ölçümleri; (a) Asidik pirana ile temizlenmiş cam yüzeyi, (b) APTES ile modifye edilmiş cam yüzeyi (c) APTES + glutaraldehid ile modifiye edilmiş cam yüzeyi (d) Miyoglobin bağlanmış cam (protein kalıbı) 120 Şekil 4.3.2.2. APTES ve glutaraldehid ile modifiye edilmiş cam yüzeyin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (1 x 1 µm2) 121 Şekil 4.3.2.3. Miyoglobin bağlanmış modifiye cam yüzeyin (protein kalıbı) yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (1 x 1 µm2) 122 4.4.1. Polimerizasyon karışımının optimizasyonu Kovalent olmayan baskılama tekniği ile moleküler baskılanmış polimerlerin hazırlanmasında çapraz bağlayıcı/monomer oranının optimizasyonu monomer/kalıp molekül oranının optimizasyonu ile daha da karmaşık bir hal almaktadır (Sellergen 1989). Çalışmada kalıp molekül miyoglobin cam yüzeyine kovalent olarak bağlanmıştır ve miktarı sabittir. Çünkü hazırlanan cam yüzeyin çalışılan deneysel koşullarda kovalent olarak bağlayacağı miyoglobin miktarı belirlidir. Protein kalıbı hazırlandıktan sonra cam yüzeyine immobilize olan miyoglobin miktarı değiştirilemeyeceği için polimerizasyon karışımının optimizasyonu amacıyla fonksiyonel monomer (MATrp), komonomer (HEMA) ve çapraz bağlayıcı (EGDMA) miktarları değiştirilerek hazırlanan baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) poli(HEMA-MATRp) sensörün 10 000 ng/mL derişimindeki miyoglobin ile SPR sensogramları alınmış ve %∆R değerleri belirlenmiştir. Karışımda yer alan fonksiyonel monomer, komonomer, çapraz bağlayıcı miktarlarının belirlenmesinde, kullanılan her bir bileşenin reaksiyona girme hızı, polimerizasyon karışımının allil merkaptan kaplı altın yüzeyine adhezyonu göz önünde bulundurulmuştur. Yapılan deneylerde HEMA ve EGDMA nın MATrp monomerine göre çok daha reaktif olduğu ve bu bileşenlerin ortamda fazla bulunması durumunda hem polimerizasyon karışımının allil merkaptan kaplı altın yüzeye adhezyonunun azaldığı hem de oluşan polimerik film kalınlığının arttığı belirlenmiştir. Tüm bu bilgiler dikkate alınarak sabit miktarda kalıp molekül varlığında fonksiyonel monomer ve çapraz bağlayıcı miktarı optimize edilmiştir. MATrp:HEMA:EGDMA için mol oranları 1:1:1; 1:1:3; 1:1:5; 1:1:6 şeklinde değiştirilerek hazırlanan baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensörlerin 10 000 ng/mL miyoglobin ile etkileşimine ait sensogramlar Şekil 4.4.1.1’de, baskılama faktörü (% ∆RMIP-myo / % ∆RNIP) değerleri de Çizelge 4.4.1.1‘de özetlenmiştir. Sabit miktarda MATrp ve HEMA varlığında çapraz bağlayıcı (EGDMA) miktarının değiştirilmesi (1:1:1; 1:1:3; 1:1:5; 1:1:6) ile MIP-myo ve NIP için elde edilen sinyal değerlerinde değişim gözlenmiştir. Baskılanmış poli(HEMA-MATrp) filmler için baskılanmamış filmlere göre daha yüksek % ∆R değerlerinin elde edilmesi miyoglobine özgü bağlanma bölgelerinin oluştuğunun bir göstergesidir. Baskılanmamış poli(HEMA- MATrp) filmin yapısında da aynı miktarda fonksiyonel monomer yer almasına karşın 123 kalıp moleküle özgü bağlanma bölgeleri oluşmadığından elde edilen %∆R değerleri daha düşüktür. Çapraz bağlayıcı miktarı değiştirilerek baskılama faktörünün en yüksek olduğu bileşim belirlenmiştir. 6 6 MIP-myo 5 NIP 5 Baskılama faktörü 4 4 3 3 2 2 1 1 0 0 1:1:1 1:1:3 1:1:5 1:1:6 mol oranı (MATrp:HEMA:EGDMA) Şekil 4.4.1.1. Farklı oranlarda MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımları ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP) ve baskılanmamış (NIP) poli(HEMA-MATrp) sensörler ile elde edilen % ∆R ve baskılama faktörü (% ∆RMIP- myo/ % ∆RNIP) değerleri 1:1:5 oranı 5,57 değerindeki baskılama faktörü ile en uygun polimerizasyon karışımı olarak belirlenmiştir. Bundan sonraki çalışmalarda bu kompozisyon kullanılmıştır. 1:1:6 oranında baskılama faktörü değeri 2,18 ‘e düşmüştür. NIP için elde edilen %∆R değeri diğerleri ile aynı kalırken MIP için elde edilen değer azalmıştır. Bu durumda artan çapraz bağ miktarının miyoglobinin bağlanma bölgelerine ulaşmasını engellediği düşünülebilir. Çizelge 4.4.1.1. Farklı oranlarda MATrp:HEMA:EGDMA oranları ile hazırlanan baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATRp) sensör için elde edilen baskılama faktörü değerleri Mol oranı Baskılama faktörü (MATrp:HEMA:EGDMA) (%∆RMIP-myo/%∆RNIP) 1:1:1 2,95 1:1:3 3,45 1:1:5 5,57 1:1:6 2,18 124 %∆R Baskılama Faktörü SPRimager Normalized 8 7 6 5 4 1:1:1 MIP 3 1:1:1 NIP 2 1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -1 Time (sec) Şekil 4.4.1.2. 1:1:1 mol oranında MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımı ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) sensör ile 10 000 ng/mL derişimindeki miyoglobin çözeltisinin etkileştirilmesi sonucu elde edilen sensogramlar SPRimager Normalized 8 7 6 5 4 1:1:3 MIP 3 1:1:3 NIP 2 1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 -1 Time (sec) Şekil 4.4.1.3. 1:1:3 mol oranında MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımı ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) sensör ile 10 000 ng/mL derişimindeki miyoglobin çözeltisinin etkileştirilmesi sonucu elde edilen sensogramlar 125 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 8 7 6 5 4 1:1:5 MIP 3 1:1:5 NIP 2 1 0 -1 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 Time (sec) Şekil 4.4.1.4. 1:1:5 mol oranında MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımı ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) sensör ile 10 000 ng/mL derişimindeki miyoglobin çözeltisinin etkileştirilmesi sonucu elde edilen sensogramlar SPRimager Normalized 8 7 6 5 4 1:1:6 MIP 3 1:1:6 NIP 2 1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -1 Time (sec) Şekil 4.4.1.5. 1:1:6 mol oranında MATrp:HEMA:EGDMA içeren polimerizasyon karışımı ile hazırlanan miyoglobin baskılanmış (MIP-myo) ve baskılanmamış (NIP) sensör ile 10 000 ng/mL derişimindeki miyoglobin çözeltisinin etkileştirilmesi sonucu elde edilen sensogramlar 126 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity 4.4.2. Poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR analizi Allil merkaptan ile kaplanmış altın çipler kullanılarak yüzeyde miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) polimerik film sentezlenmiştir. Hazırlanan polimerik filmin yapısı Şekil 4.4.2.1’de gösterilmiştir. Şekil 4.4.2.1. Poli(HEMA-MATrp) filmin kimyasal yapısı Hazırlanan poli(HEMA-MATrp) polimerik filmin karakterizasyonu içinde FTIR-ATR tekniğinden yararlanılmıştır. Şekil 4.4.2.2‘de yüzey plazmon rezonans çip yüzeyinde oluşan miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) polimerik filme ait FTIR-ATR spektrumu görülmektedir. Polimerik film sentezlendikten sonra altın yüzeyinde poli(HEMA-MATrp) polimerine ait absorpsiyon bandları oluşmuştur. 1715 cm-1‘de ester karbonil grubu (C=O) gerilmesine, 1662 cm-1 de amid karbonil grubu (C=O) gerilmesine ait absorpsiyon bandları görülmektedir. 3400 cm-1 bölgesinde, MATRp monomerinden gelen N-H ve yapıdaki O-H gruplarından kaynaklanan absorpsiyon bandı beraberce görülmektedir. 2955 cm -1’de gözlenen absorpsiyon bandı ise polimerik yapı içerisinde tekrar eden alifatik C-H bağlarına ait gerilmelerden kaynaklanmaktadır. Poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR spekturumu, sadece MATrp, HEMA ve EGDMA ın başlatıcı varlığında tek başına polimerizasyonu ile hazırlanan poli(MATrp), poli(HEMA) ve poli(EGDMA) polimerlerinin FTIR-ATR spektrumları ile 127 karşılaştırılmıştır (Şekil 4.4.2.3-4.4.2.5). Poli(HEMA-MATrp) filme ait spektrum, poli(MATrp), poli(HEMA) ve poli(EGDMA) için elde edilen spektrumlardan farklıdır ve MATrp monomerine ait karakteristik bandlar göstermektedir. Bu sonuç fonksiyonel monomer olan MATrp’ın HEMA ve EGDMA varlığında yapıya başarıyla dahil edildiğinin bir kanıtıdır. 4.4.3. Temas açısı analizi Herhangi bir ürünün hazırlanmasında dikkat edilmesi gereken en önemli noktalardan biri kullanılacak olan malzemenin uygun şekilde seçilmesidir. Bu seçim sadece elde edilecek ürünün özelliklerini değil aynı zamanda ilgili teknolojik sürecin doğasını ve işleyişini de etkilemektedir. Polimerik malzemelerin kullanım alanlarının artması nedeniyle ürün hazırlanmasında kullanılacak malzemelerin fizikokimyasal özellikleri ve fonksiyonel niteliklerinin tanınmasına olan ihtiyaçda hızlı bir şekilde artmaktadır. Islanabilirlik (wettability) ve bununla ilgili olan yüzey serbest enerjisi (SFE) sözü edilen bu nitelikler arasında yer almakta ve kimya, fizik, biyomühendislik ve biyoloji gibi bir çok bilim dalında büyük bir ilgi görmektedir. Biyomalzemelerin ıslanabilirliğinin ölçülmesi ve yorumlanması günümüzde arayüzey kimyasında kullanılan en modern yaklaşımdır. Hazırlanan polimerik malzemeleri biyomedikal amaçla kullanabilmek için yığın (bulk) ve yüzeyin özelliklerinin ve özellikle de sulu ortamdaki arayüzey özelliklerinin bilinmesi önemlidir. Suyun yüzey ile oluşturduğu temas açısı hazırlanan malzemenin canlı organizma ile biyouyumunun değerlendirilmesi için de yararlı bilgiler vermektedir. Malzemenin yüzey serbest enerjisi γ, doğrudan ıslanabilirlik ve diğer fizikokimyasal özellikler ile ilgilidir (Zenkiewicz 2007). 128 102.1 100 95 3403.44 90 2993.00 1514.512955.57 1381.76 85 880.221636.41 1320.29 814.08 1662.93 80 1448.00 1296.93 943.27 75 1235.88 1049.42 745.51 %T 70 65 60 55 50 45 1715.73 1146.58 40.4 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650.0 cm-1 Şekil 4.4.2.2. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR spektrumu 129 poly MATrp 2849.65 878.78 3053.39 2952.14 3381.82 2993.00 1030.46 1010.28 1343.00 1127.07 1096.75 1621.02 1457.11 1512.40 1715.321655.10 1436.18 %T 1727.99 1199.97 poly HEMA MATrp 741.40 3387.06 1343.331517.32 1621.02 1380.39 29932.90504.26 1636.88 879.74 1319.65 813.58 1009.76 1661.19 1446.82 1297.12 1233.21 941.74 1048.18 745.06 1146.87 1715.32 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650.0 cm-1 Şekil 4.4.2.3. Poli(MATrp) ve poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR spektrumu 130 poly HEMA 1560.00 2942.50 3402.50 1389.57 1451.13 945.36 849.43 899.40 749.67 1245.91 1022.77 1719.30 %T 1073.33 poly HEMA MATRp 1153.47 3387.06 1517.32 1380.39 2954.26 1636.88 879.74 1319.65 813.58 1662.92 1446.82 1297.12 1233.21 941.74 745.06 1146.87 1714.64 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600.0 cm-1 Şekil 4.4.2.4. Poli(HEMA) ve poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR spektrumu 131 poly EGDMA 2930.00 2960.00 1246.27 1404.80 853.72 1370.18 1005.58 885.78 1637.50 1452.45 1042.50 650.89 1315.32 813.23 940.30 1293.36 %T 1718.21 poly HEMA MATrp 1145.00 3387.06 1517.32 2989.28 1380.39 2954.26 1636.88 879.74 1319.65 813.58 1008.40 1664.71 1446.82 1297.12 1233.21 941.74 1044.07 745.06 1146.87 1712.86 4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600.0 cm-1 Şekil 4.4.2.5. Poli(EGDMA) ve poli(HEMA-MATrp) filmin FTIR-ATR spektrumu 132 Üç fazın (katı-sıvı-gaz) etkileşimde olduğu durumdaki arayüzey gerilimleri arasındaki ilişki Şekil 4.4.3.1‘de gösterilmiştir. Şekil 4.4.3.1. Katı yüzeyinde temas açısının oluşumu Burada s ve l sırasıyla katı ve sıvı fazı ifade etmektedir. s ve  l , her iki fazın yüzey gerilimlerini, sl iki faz arasındaki arayüzey gerilimini ve  l ile  sl vektörleri arasındaki  açısı da, temas açısını göstermektedir. Young bu büyüklükler arasındaki ilişkiyi Eşitlik 4.4.3.1 ile ifade etmiştir :  s   sl  l .cos 4.4.3.1 Owens, Wendt, Rabel ve Kaelble yaklaşımına göre her bir fazın yüzey gerilimi kutupsal (polar) ve yayılma (dispersive) bileşenlerine ayrılabilir:    Pl l  D l 4.4.3.2  s   P S  D S 4.4.3.3 Owen ve Wendt, yüzey gerilimi için Eşitlik 4.4.3.4‘ü temel alarak bu eşitliği Young eşitliği ile birleştirmiş ve bu eşitliği yüzey enerjilerinin yayılma ve kutupsal bileşenleri bilinen iki ayrı sıvının temas açılarını kullanarak çözmüşlerdir.      2  D  D Psl s l s l   s  Pl  4.4.3.4 133 Kaelbe, eşitliği iki sıvının bileşimi için çözmüş ve yüzey enerjisi için elde ettiği değerlerin ortalamasını hesaplamıştır. Rabel ise bu eşitliği çeşitli sıvıların temas açısı değerlerinden yararlanarak hazırladığı tekli lineer regresyon yardımıyla yüzey enerjisinin kutupsal ve yayılma bileşenlerinin hesaplanmasında kullanılabilir hale getirmiştir. 4.4.3.1 ve 4.4.3.4 nolu eşitliklerin birleştirilmesi ile elde edilen eşitliği doğru denklemi olarak ifade etmiştir. Elde edilen bu ifade Eşitlik 4.4.3.5‘te gösterildiği gibidir. 1 cos  p l   P  l s D   s D 4.4.3.5 2  D l l Bu denklemde m, eğim değerinin karesi  P s değerini, doğrunun y ekseninin kestiği nokta olan b değerinin karesi ise  D s değerini vermektedir. Altın yüzey, allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey, yüzeyinde miyoglobin baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film hazırlanmış altın yüzeylerin ıslanabilirlik özelliklerinin incelenmesi amacıyla bu yüzeylerin su ve etilen glikol ile yaptıkları temas açıları ölçülmüş ve yüzey serbest enerjileri Owens, Wendt, Rabel ve Kaelble yaklaşımı kullanılarak hesaplanmış ve Çizelge 4.4.2.1’de özetlenmiştir. Şekil 4.4.3.2 ve Şekil 4.4.3.3’de ise sırasıyla su ve etilen glikol ile alınan temas açısı görüntüleri verilmiştir. 134 (a) (b) (c) (d) Şekil 4.4.3.2. Su ile temas açısı ölçümleri; (a) altın yüzey, (b) allil merkaptan ile modifiye edilmş altın yüzey, (c) miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulan altın yüzey (d) miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulan altın yüzey 135 (a) (b) (c) (d) Şekil 4.4.3.3. Etilen glikol ile temas açısı ölçümleri; (a) altın yüzey, (b) allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey, (c) miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulan altın yüzey , (d) miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulan altın yüzey 136 Çizelge 4.4.3.1. Altın yüzey, allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey, miyoglobin baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film hazırlanmış altın yüzeylerin su ve etilen glikol ile elde edilen temas açıları ve birim alandaki yüzey enerjileri. Yüzey Temas Temas Açısı, ° Yüzey Serbest Açısı,° (Etilen Glikol) Enerjisi, (H2O) (mN/m) Altın yüzey 85,3±4,9 75,7±3,6 30,17 Allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey 71,1±3,4 56,3±3,2 43,69 Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film 75,0±4,8 59,3±2,1 38,08 oluşturulan altın yüzey Miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film 73,2±5,7 57,1±2,6 40,22 oluşturulan altın yüzey Su ile yapılan temas açısı ölçümlerinden görüldüğü gibi altın yüzeyin temas açısı değeri (85,3o ± 4,9), allil merkaptan modifikasyonu ile 71,1°±3,4’e düşmüştür. Yüzeyin temas açısının önemli miktarda azalması, yüzeyin hidrofilik özelliğinin arttığını ve altın kaplı yüzey plazmon rezonans çip yüzeyinin allil merkaptan ile kaplandığını göstermektedir. Temas açısının azalması ile birlikte yüzey serbest enerjisi 30,17 mN/m ‘den 43,69 mN/m‘ye yükselmiştir. Allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzeyde gerçekleştirilen polimerizasyon sonucu temas açısı değeri 75,0o ± 4,8 ‘e yükselmiş ve yüzey serbest enerjisi 38,08 mN/m‘ye düşmüştür. Bu sonuç, allil merkaptan kaplı yüzeyde poli(HEMA-MATrp) film oluştuğunu ve hidrofobisitenin arttığını göstermektedir. Hidrofobisitedeki bu artış bir ölçüde metakriloil-amidotriptofan metil ester (MATrp) monomerinin hidrofobisitesinden kaynaklanmaktadır. Altın yüzeyin temas açısı (85,3o ± 4,9) ile karşılaştırıldığında polimerik film oluşumuyla temas açısında bir azalma (75,0o ± 4,8) gözlenmiştir. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA- 142 MATrp) film durumunda temas açısının (75,0o ± 4,8), miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film durumunda (73,2±5,7) değerine sahip olması, poli(HEMA- MATrp) yapısı içerisinde miyoglobin kalmadığının göstergesidir. 4.4.4. AFM analizi Altın yüzey, allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey ve miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) polimerik film hazırlanmış altın yüzeyin morfolojik karakterizasyonu için AFM görüntüleri alınmıştır. Yüzeylere ait atomik kuvvet mikroskobu görüntüleri Şekil 4.4.4.1-3.4.4.4’de gösterilmiştir. Şekil 4.4.4.1‘de modifiye edilmemiş altın yüzeyin , Şekil 4.4.4.2 ‘de allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzeyin 2 x 2 μm2 yüzey morfolojisi görülmektedir. Görüldüğü gibi kalınlık değeri artmış ve yüzey homojen bir şekilde allil merkaptan ile kaplanmıştır. Şekil 4.4.4.3‘de ise miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) kaplı altın yüzeyin 5 x 5µm2‘lik alanına ait AFM görüntüsü verilmiştir. Görüldüğü gibi polimerik film altın yüzeyinde başarıyla hazırlanmıştır. Yüzey morfolojisindeki değişimin daha yakından görülebilmesi için poli(HEMA-MATrp) kaplı altın yüzeyinde 2 x 2 μm2 ‘lik bir alanına ait AFM görüntüsü alınmış ve Şekil 4.4.4.4‘te gösterilmiştir. Allil merkaptan ile kaplanmış altın yüzey ile karşılaştırıldığında polimerik filmin altın yüzeyinde homojen bir şekilde hazırlandığı görülmektedir. 138 (a) (b) Şekil 4.4.4.1. Modifiye edilmemiş altın çipin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (2 x 2 µm2) 139 (a) (b) Şekil 4.4.4.2. Alil merkaptan ile modifiye edilmiş altın çipin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (2 x 2 µm2) 140 (a) (b) Şekil 4.4.4.3. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulmuş altın çipin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (5 x 5 µm2) 141 (a) (b) Şekil 4.4.4.4. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film oluşturulmuş altın çipin yarı değen modda alınan AFM görüntüleri (a) yüzey görüntüsü (b) 3D görüntüsü (2 x 2 µm2) 142 4.4.5. Elipsometri Geleneksel olarak moleküler baskılanmış polimerler yığın polimer monolitler olarak hazırlanır ve mikrometre boyutlarındaki partiküller elde etmek için parçalanarak elenir. Bu yöntem ile MIP hazırlama birçok uygulama için halen yararlı iken diğer bazı uygulamalar (özellikle sensörler) için hazırlanacak moleküler baskılanmış polimerlerin film yada nanopartiküller gibi belirli bir fiziksel formda hazırlanması gerekmektedir. Bu durumda özel olarak adapte edilmiş sentez metodlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca difüzyonun hızlandırılması ve cevap süresinin kısaltılması için baskılama bölgelerinin yüzeyde yada yüzeye çok yakın bölgede oluşturulması gerekmektedir (Haupt ve Belmont 2007). Dolayısıyla sensör olarak kullanılacak moleküler baskılanmış film yada membranın kalınlığının 100 nm den kalın olmaması ve hatta 50 nm den küçük olması istenir (Piacham ve ark. 2005). Özellikle kaybolan dalga prensibini kullanan optik transdüserlerde bu durum daha da büyük önem kazanmaktadır. Hazırlanan miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) filmin kalınlık ölçümleri için Nanofilm EP3-Nulling Elipsometre (Göttingen, Almanya) cihazı kullanıldı. Ölçümler 532 nm dalga boyunda, 60,5°’lik bir geliş açısında gerçekleştirildi. SPR sensör lazer ışık kaynağı altına yerleştirildi. Yüzey kalınlığı hesaplama programı için SF10 cam + 2 nm titanyum tabaka ve 42,5 nm altın tabaka olarak öngörüldü. Ölçümler sensör yüzeyinde 6 farklı noktada 3 kere tekrarlandı ve sonuçlar bu değerlerin ortalaması alınarak rapor edildi. Elde edilen sonuçlara göre hazırlanan film 12,85 ± 1,5 nm kalınlıktadır. Bu sonuç AFM sonuçları ile de örtüşmekte olup polimerik filmin altın yüzeyinde başarıyla hazırlandığını göstermektedir. Ayrıca hazırlanan sensör 50 nm’den daha düşük bir kalınlık değerine sahip olduğundan optik transdüser prensibi ile çalışan SPR sistemi ile büyük bir uyum göstereceği öngörülmektedir. 4.4.6. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizi Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) filmin yüzey morfolojisi taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak incelendi. Analiz edilecek örnekler ilk olarak vakum altında çok ince bir altın tabaka (100 Å) ile kaplandı ve ardından taramalı elektron mikroskop kullanılarak (Carl Zeiss Evo 40, Cambridge, İngiltere) görüntüleri 143 alındı. Altın ve miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) filme ait yüzey görüntüleri Şekil 4.4.6.1‘de verilmiştir. SEM görüntüleri altın yüzeyin polimerik film ile kaplandığının kanıtıdır. Şekil 4.4.6.2’de ise poli(HEMA-MATrp) film kaplanmış altın çipin kesit görüntüsü 50 000 kat büyütme yapılarak alınmıştır. Görüldüğü gibi polimerik film altın çip yüzeyinde başaryla sentezlenmiştir. 4.5. Miyoglobin baskılanmış poli (HEMA-MATrp) SPR sensör ile kinetik analizler Bu çalışmada miyoglobin baskılanmış SPR sensör hazırlanmıştır. Miyoglobin derişimi ile SPR sinyali arasındaki ilişkinin değerlendirilebilmesi için farklı derişimlerde (100-10 000 ng/mL) miyoglobin çözeltileri hazırlandı. Çözeltiler peristaltik pompa aracılığıyla poli(HEMA-MATrp) sensörle etkileştirilerek sensogramlar alındı. Şekil 4.5.1’de farklı derişimlerde miyoglobin çözeltileri ile etkileşimden elde edilen sensogramlar toplu halde görülmektedir. SPRimager Normalized 6 5 100 ng/mL 4 300 ng/mL 500 ng/mL 3 700 ng/mL 1000 ng/mL 2500 ng/mL 2 4000 ng/mL 7500 ng/mL 10000 ng/mL 1 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) Şekil 4.5.1. Miyoglobin çözeltileri ile poli(HEMA-MATrp) sensör arasındaki etkileşimlere ait sensorgramlar 144 % Change in Reflectivity (a) (b) (c) Şekil 4.4.6.1. (a) Altın yüzeyi (b) miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATRp) yüzeye ait SEM görüntüleri (c) kesit görüntüsü 145 Şekil 4.5.1 de görüldüğü gibi yüzeye miyoglobin gönderilmesi ile birlikte birlikte % ∆R değeri artmaktadır. Standart bir ölçümde; sistemden öncelikle denge tamponu, daha sonra, sistem yeniden dengeye ulaşana kadar miyoglobin çözeltisi geçirilmiş ve son aşamada tekrar denge tamponu kullanılmıştır. Bütün ölçümlerde sistemin dengeye ulaşması için yaklaşık 25 dakika beklenmiştir. 5 4 3 2 1 0 0 2000 4000 6000 8000 10000 Miyoglobin derişimi (ng/mL) Şekil 4.5.2. Miyoglobin derişimi ile % ∆R arasındaki ilişki Şekil 4.5.2’de görüldüğü gibi % ∆R değeri, derişim arttıkça artmaktadır. Bu değer yaklaşık 7500 ng/mL civarında dengeye ulaşmış ve denge değeri 4,33 olarak belirlenmiştir. Şekil 4.5.3’de görüldüğü gibi SPR sensör, 100-1000 ng/mL derişim aralığında derişim-sinyal doğrusallığı göstermektedir. Bu aralıktaki veriler değerlendirildiğinde elde edilen doğrunun denklemi (y=0,0025x+0,2402) ve doğrusallığı 0,9741 olarak hesaplanmıştır. 146 %∆R 5 4 3 y = 0,0025x + 0,2402 R2 = 0,9741 2 1 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Miyoglobin derişimi (ng/mL) Şekil 4.5.3. 100-1000 ng/mL aralığında miyoglobin derişimi ile % ∆R arasındaki ilişki Hazırlanan poli(HEMA-MATrp) sensör için elde edilen veriler kullanılarak tayin sınırı (LOD) ve tayin limiti (LOQ) değerleri de belirlendi. Tayin sınırının (LOD) hesaplanması için 3s/m denklemi kullanıldı. Bu eşitlikte, s değeri sensör yüzeyinden en denge çözeltisi (kör çözelti) geçerken alınan sinyal değeri (∆R) ölçümlerine ait standart sapma değeri ve m de kalibrasyon grafiğinin eğimidir. Kör çözelti için ∆R değeri 10 ölçümün ortalaması alınarak, ölçümlere ait standart sapma değeri ile birlikte 0,030896 ± 0,0219 olarak belirlenmiştir. Buna göre kalibrasyon grafiğine ait yukarıdaki denklem kullanılarak tayin sınırı (LOD) 26,3 ng/mL olarak hesaplanmıştır. Tayin limitinin (LOQ) hesaplanması için ise 10s/m eşitliğinden yararlanıldı ve tayin limiti 87,6 ng/mL olarak belirlendi. Sağlıklı bir insanda kandaki miyoglobin düzeyi 12-100 ng/mL aralığında değişmektedir. Kalp krizi durumunda bu değer hızla yükselmektedir (Wong 1996). Miyoglobin derişiminin belirlenmesinde kullanılacak bir tayin yöntemi için en yararlı klinik aralık ise 80-800 ng/mL olarak rapor edilmiştir (O’Regan 2002). Hazırlanan poli(HEMA- MATrp) sensörün tayin limiti 87,6 ng/mL olarak belirlenmiştir. Ayrıca 100-1000 ng/mL miyoglobin derişim aralığında derişim-sinyal doğrusallığı göstermektedir. Bu sonuçlara 147 % ∆R göre poli(HEMA-MATrp) kalp krizi durumunda miyoglobin tayinini başarıyla gerçekleştirebilecek sensör özelliklerine sahiptir. 4.6. Denge ve Bağlanma Kinetik Analizleri SPR biyosensörlerde, rezonans sinyalindeki değişimler % kırınma, %ΔR, rezonans birimi (RU) gibi farklı şekillerde ifade edilebilir. Bu değişimler zamanın fonksiyonu olarak izlenir ve sensogramlar ile gösterilir. Bu verilerden, çip ile analit arasındaki bağlanma kinetik sabitleri hesaplanabilir. Analit (A) ve SPR çip (B) arasında akış hücresinde oluşan AB kompleksinin oluşumu basit olarak şu şekilde gösterilebilir, km ka Açözelti Ayüzey + B AB km kd 4.6.1 Burada; km analitin yüzeye ve yüzeyden kütle aktarım hız sabiti (her iki yönde de aynıdır); ka ve kd kompleks oluşum hız sabitleridir. İdeal koşullar altında, ne analitin sensör yüzeyine aktarımı ne de yüzeyden çözeltiye aktarımı bağlanma kinetiğini etkilememektedir. Bu durum, aktarımın bağlanmaya göre daha hızlı gerçekleştiği durumlarda gerçekleşmektedir. Böylelikle analit derişimi çözeltide sabit kalmakta, ve ayrıca başlangıç derişimi B0  etkilenmemektedir (Glaser, 1993). Bu koşullar altında kompleks oluşum hızı şu şekilde tanımlanır: dAB/ dt  ka AB0  AB kd AB 4.6.2 Burada; AB bağlanan analit miktarı; A , serbest analit miktarı; B0 , sensörün toplam ligand yoğunluğudur. Bu durumda bağlanma ileri ve geri yöndeki hız sabitleri ve bağlanma sabitleri aşağıda anlatılan iki yaklaşım kullanılarak hesaplanmaktadır. 148 - Denge Analizi Toplam ligand miktarı B0 , yüzeyin maksimum analit bağlama kapasitesi olarak tanımlanırsa; diğer tüm derişim değerleri SPR sinyali olarak ifade edilebilir. Böylelikle kütlenin derişime dönüştürülme işleminin yapılmasına gerek kalmayacaktır. Serbest analit derişiminin akış hücresinde sabit kaldığı yalancı-birinci derece koşulları altında bağlanma şu şekilde ifade edilir: dR / dt  kaCRmaks  R kdR 4.6.3 Burada; dR / dt , SPR sinyalinin değişim hızı; R ve Rmaks , bağlanma ile ölçülen ve maksimum sinyal; C , analit derişimi (µg/ml), ka , bağlanma hız sabiti (ml/µg.s) ve kd , ayrılma hız sabiti (1/s)’dir. Bağlanma sabiti K A (ml/ µg), ka ve kd sabitlerinin oranından hesaplanır K A  ka / kd . Denge durumunda, dR / dt  0 alınarak eşitlik basitleştirilir: Rdenge / C  K ARmaks  K ARdenge 4.6.4 Bundan dolayı, bağlanma sabiti K A , Rdenge / C ’ye karşı Rdenge grafiğinden hesaplanır. Ayrılma sabiti K D ise; 1/ K A eşitliği ile hesaplanabilir. -Bağlanma Kinetik Analizi Eşitlik 4.6.3 tekrar düzenlendiğinde; dR / dt  kaCRmaks  kaC  kd R 4.6.5 eşitliği elde edilir. Buradan, etkileşim kontrollü kinetikler için çizilen dR / dt ’ye karşı R grafiğinin, eğimi  kaC  kd  olan bir doğru verdiği görülmektedir. Başlangıç bağlanma hızı analit derişimiyle doğrusal bir ilişki içerisindedir ve kantitatif olarak 149 derişim belirlenmesinde kullanılır. Eğer Rmaks değeri biliniyorsa, tek bir sensorgram kullanılarak ka ve kd değerleri hesaplanabilir. Yüzeyi tamamen doygunluğa eriştirmek için çok yüksek analit derişimleri gerekli olduğu için Rmaks ’un deneysel olarak belirlenmesi zordur. Tercih edilen yaklaşım, birçok farklı analit derişimlerinde bağlanma sensogramlarının alınmasıdır. İleri ve geri yöndeki hızların analizi için çizilen dR / dt ’ye karşı R grafikleri, ileri ve geri yöndeki hız sabitleri ile ilişkili bir eğim değeri S  vermektedir: S  kaC  kd 4.6.6 S ’ye karşı C grafiği, eğimi ka olan bir doğru vermektedir. Teorik olarak kesim noktası kd değerini vermektedir. Fakat, kaCkd olduğu durumlarda kd hesaplaması için bu yöntem çok güvenilir değildir. Daha güvenilir yöntem, ayrılma kinetiğinin incelenmesidir. lnR0 /Rt   kd t  t0  4.6.7 Burada; R0 ve Rt , ayrılma eğrisindeki t0 ve t anlarındaki SPR sinyal değerleridir (Lin ve ark. 2005). Şekil 4.6.1’de denge analizi ve bağlanma kinetik analizi için çizilen doğrular verilmiştir. Bu doğrulara ait denklemlerden hesaplanan Rmaks , ka , kd , K A ve K D değerleri Çizelge 4.6.1’de özetlenmiştir. 150 4 y = -0,666x + 3,4433 R2 = 0,9575 3 2 1 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 ∆R (a) 0,004 y = 0,0002x + 0,0026 R2 = 0,9565 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Cmiyoglobin (b) Şekil 4.6.1. Kinetik hız sabitlerinin belirlenmesi. (a) Denge analiz yaklaşımı; (b) Bağlanma kinetik yaklaşımı 151 S ∆R/Cmiyoglobin Çizelge 4.6.1. Kinetik hız sabitleri Denge Analiz (Scatchard) Bağlanma Kinetik Analizi Rmaks 5,19 ka , µg/ml.s 2.10 -4 K A , µg/ml 0,667 kd , 1/s 2,6.10 -3 K D , ml/µg 1,499 R 2 0,9565 R 2 0,9575 4.7. Denge izoterm modelleri Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör ile miyoglobin arasındaki etkileşim modelini belirlemek amacıyla üç farklı izoterm modeli uygulanmıştır: Langmuir; Freundlich ve Langmuir-Freundlich (LF) modelleri. Langmuir R  Rmaks C/ K D  C Freundlich R  R C1 nmaks Langmuir-Freundlich R  R 1 n 1 nmaks C / K D  C  Burada; Rmaks , maksimum SPR sinyal kayması; R , denge halindeki SPR sinyal kayması; C, analit derişimi (µg/ml); K A (µg/ml), bağlanma denge sabiti; K D (ml/µg), ayrılma denge sabiti; 1 n , Freundlich yüzey heterojenite indeksidir. Homojen bağlanma bölgeleri modeli olan Langmuir modeli moleküler baskılanmış polimerlerin kullanıldığı bağlanma izotermlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Li ve Husson, 2006). Fakat, son dönemlerde artan raporlara göre MIP’ler bir miktar heterojen bağlanma bölgelerine de sahiptirler (Umpleby ve ark., 2001; Wei ve ark., 2005). 152 Freundlich modeli heterojen bir modeldir (Umpleby ve ark., 2004). Langmuir- Freundlich modeli (LF), doygunluğa kadar geniş derişim aralığında heterojenite ile bilgi sağlamakta ve adsorpsiyon davranışı daha tutarlı tanımlamaktadır. Şekil 4.7.1’de Langmuir, Freundlich ve Langmuir-Freundlich modellerine ait grafikler verilmiştir. Bu grafiklerin çizilmesinde daha önce belirtildiği gibi kütle-derişim dönüşümlerini önlemek amacıyla bazı parametre değişimleri yapılmıştır Qmaks  Rmaks ,Q  R gibi. 5 4 3 2 1 y = 0,2669x + 0,1544 R2 = 0,9971 0 -2 0 2 4 6 8 10 -1 1/[C]miyoglobin, (1/μg/mL) (a) 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 y = 0,5619x + 0,6656 0,2 R 2 = 0,9118 0 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 lnCMiyoglobin (b) 153 ln∆R 1/∆R 1,2 1 0,8 0,6 0,4 y = 0,4555x + 0,0232 0,2 R2 = 0,9151 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 1/[C]1/n (c) Şekil 4.7.1. Adsorpsiyon modelleri. (a) Langmuir; (b) Freundlich; (c) Langmuir- Freundlich Çizelge 4.7.1. Langmuir, Freundlich ve Langmuir-Freundlich parametreleri Langmuir Freundlich Langmuir-Freundlich Rmaks ,µg/ml 6,31 Rmaks , µg/ml 1,95 Rmaks , µg/ml 39,68 K D , ml/µg 1,681 1 n 0,5619 1 n 0,5619 K , µg/ml 0,594 R 2A 0,9118 K D , ml/µg 8,154 R 2 0,9971 K A , µg/ml 0,1174 R 2 0,9256 Şekil 4.7.1(a)’ya göre deneysel olarak elde edilen veriler Langmuir modeli ile en uyumludur (R2=0.9971). Bu sonuç; hazırlanan baskılanmış sensör yüzeyindeki miyoglobin bağlanma bölgelerinin homojen dağılımlı, tek tabakalı, eş enerjili ve minimum yanal etkileşimli olduğunu göstermektedir. Her üç izoterm modelinden elde edilen sonuçlar Çizelge 4.7.1’de verilmiştir. Buradan hesaplanan Rmaks değeri deneysel 154 1/∆R değere (4,33 µg/ml) yakındır. Langmuir denkleminden hesaplanan K A ve K D değerleri sırasıyla 0,594 µg/mL ve 1,681 mL/µg olarak hesaplanmıştır. 4.8. Yarışmalı kinetik analizler Sığır serum albumini (BSA), sitokrom c ve lizozim için miyoglobin molekülerine göre dağılma ve seçicilik katsayıları aşağıdaki eşitliğe göre belirlenmiştir: K d  Ci C f / C f V m 4.8.1 Eşitlikte K d , dağılma katsayısını (ml/g); Ci ve C f , biyomoleküllerin başlangıç ve sonuç derişimlerini (µg/ml); V , kullanılan çözelti hacmini (ml) ve m , polimerin ağırlığını (g) ifade etmektedir. SPR sensör uygulamalarında, derişim ve kütle parametrelerinin dönüştürülmesi gerçekleştirilmektedir (Lin ve ark., 2005). Bu yaklaşımdaki temel sebepler; başlangıç ve son derişimleri arasında önemli bir fark gözlenememesi; polimerin kütlesinin kesin olarak belirlenememesi ve derişimin R ile doğrusal ilişkide olmasıdır. Bu durumda; seçicilik katsayısı k, k= ΔRkalıp/ΔRgirişimci 4.8.2 şeklinde kullanılabilir. Baskılama seçiciliğinin belirlenmesi için ise; k´= kbaskılanmış/k kontrol 4.8.3 şeklinde ifade edilebilir. Hazırlanan miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün miyoglobine karşı seçiciliğinin belirlenmesi için yarışmalı adsorpsiyon deneyleri 1000 ng/mL derişimindeki BSA, sitokrom c, lizozim ve miyoglobin proteinlerinin tekli, ikili, üçlü ve dörtlü karışım çözeltileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sensörün bu karışımlara gösterdiği tepki, Şekil 3.8.1’de %ΔR/zaman ilişkilerine ait sensorgramlarda görülmektedir. Sitokrom c ve lizozim; miyoglobine yakın molekül ağırlığı olmasından, BSA ise boyut, molekül ağırlığı ve yük 155 bakımından miyoglobinden oldukça farklı olmasından dolayı yarışmacı proteinler olarak seçilmişlerdir. Yarışmalı kinetik analizlerde kullanılan proteinler ve özellikleri Çizelge 4.8.1 de özetlenmiştir (Zhang ve ark. 2010). Çizelge 4.8.1. Kalıp ve yarışmacı proteinlerin molekül ağırlığı , izoelektrik nokta ve moleküler boyutları Protein Molekül Ağırlığı İzoelektrik Moleküler boyut nokta Miyoglobin 17.600 7,3 2,5 nm x 3,4 nm x 4,2nm BSA 66.430 4,7 5 nm x 7 nm x 7 nm Sitokrom c 12.327 10,2 2,6 nm x 3,2 nm x 3nm Lizozim 14.307 11,3 3 nm x 3 nm x 4,5 nm Şekil 4.8.1 incelendiğinde; miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün BSA ile herhangi bir etkileşime girmediği ve anlamlı bir sinyal vermediği (%∆R= 0,06) belirlenmiştir. BSA molekül ağırlığı büyük (≈ 67000 Da) ve izoelektrik noktası (pI) 4,7 değerinde olan bir proteindir. Proteinlerin sulu çözeltiden maksimum adsorpsiyonları izolelektrik noktalarında gerçekleşir. Çünkü elektrostatik açıdan pozitif ve negatif yük sayısı dengededir. Çalışma pH değeri olan 7,4 ‘te BSA molekülü negatif yüklüdür. Elektrostatik yük dengesinin bozulması, albumin moleküllerinin yüzeye bağlanmasını zorlaştırmaktadır. Ayrıca moleküler büyüklük açısından bakıldığında BSA için elde edilen bu düşük sinyal değeri, poli(HEMA-MATrp) sensör yüzeyinde hazırlanan moleküler boşlukların kalıp molekül miyoglobine özgü olduğu sonucunu desteklemektedir. Çünkü hazırlanan sensör moleküler ağırlığı ve moleküler boyut açısından kalıp molekül miyoglobinden büyük olan bir proteine karşı herhangi bir sinyal oluşturmamaktadır. Sitokrom C ve lizozimin molekül ağırlığı hem de izoelektrik noktası miyoglobine benzerlik göstermektedir. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün sitokrom c’ye verdiği sensorgram sinyal değeri (%ΔR); 0,22, lizozime verdiği sinyal değeri (%ΔR); 0,35’tir. Aynı derişimdeki miyoglobin için elde edilen sinyal değeri (%ΔR) ise 2,35’tir. Bir başka deyişle; baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör 156 miyoglobini; sitokrom c’ye göre 10,68 kat, lizozime göre 6,71 kat daha duyarlı tayin edebilmektedir. İkili, üçlü ve dörtlü karışımların sinyal değerleri incelendiğinde; poli(HEMA-MATrp) sensörün sinerjik bir etki ile cevap verdiği görülmüştür. Karışımların SPR sinyallerinin, bileşenlerin tekli çözeltilerindeki sinyallerinin toplamından daha yüksek olduğu belirlenmiştir. SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (a) Miyoglobin SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) 157 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity (b) Lizozim SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Time (sec) (c) Sitokrom c SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) (d) BSA 158 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) (e) BSA-Sitokrom c SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) (f) BSA- Lizozim 159 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) (g) BSA-Miyoglobin SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Time (sec) (h)Sitokrom c-Miyoglobin 160 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Time (sec) (ı) Lizozim-Sitokrom c SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (j) Miyoglobin-Lizozim 161 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (k) BSA- Sitokrom c-Lizozim SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) (l) BSA-Sitokrom c-Miyoglobin 162 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) (m) Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Time (sec) (n) BSA-Miyoglobin-Lizozim 163 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Time (sec) (o) BSA-Miyoglobin-sitokrom c-Lizozim Şekil 4.8.1 1000 ng/ml derişiminde miyoglobin, lizozim, sitokrom c ve sığır serum albumini (BSA) proteinlerinin kullanılmasıyla oluşturulan çözeltiler ile miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör arasındaki etkileşimlere ait sensorgramlar: (a) Miyoglobin, (b) Lizozim, (c) Sitokrom c, (d) BSA, (e) BSA-Sitokrom c, (f) BSA- Lizozim, (g) BSA-Miyoglobin, (h) Sitokrom c-Miyoglobin, (ı) Lizozim-Sitokrom c, (j) Miyoglobin-Lizozim, (k) BSA-Sitokrom c, (l) BSA-Sitokrom c-Miyoglobin, (m) Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c, (n) BSA-Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c. 4.9. Poli(HEMA-MATrp) Sensörün Baskılama Seçiciliği Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün baskılama seçiciliğini göstermek için miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensörde hazırlanmıştır. Miyoglobin, BSA, sitokrom c ve lizozim ile hazırlanan karışımlar SPR sistemine gönderilmiştir. Bu çözeltiler fosfat tamponunda (pH: 7.4) 1000 ng/ml derişiminde hazırlanmıştır. Baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensörün bu karışımlara gösterdiği tepki, Şekil 4.9.1’de % ∆R/Zaman fonksiyonu olarak verilmiştir. 164 % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) (a) Miyoglobin SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 0 200 400 600 800 1000 1200 Time (sec) (b) Lizozim 165 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) (c) Sitokrom c SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time (sec) (d) BSA 166 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (e) BSA- Sitokrom c SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (f) BSA-Lizozim 167 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Time (sec) (g) BSA-Miyoglobin SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (h) Sitokrom c- Miyoglobin 168 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Time (sec) (ı) Lizozim-Sitokrom c SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Time (sec) (j) Myoglobin-Lizozim 169 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Time (sec) (k) BSA-Sitokrom c-Lizozim SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (l) BSA-Sitokrom c-Miyoglobin 170 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (m) Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (n) BSA-Miyoglobin-Lizozim 171 % Change in Reflectivity % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Time (sec) (o) BSA-Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c Şekil 4.9.1. 1000 ng/mL derişiminde miyoglobin, lizozim, sitokrom c ve sığır serum albumini (BSA) proteinlerinin kullanılmasıyla oluşturulan çözeltiler ile miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensör arasındaki etkileşimlere ait sensorgramlar: (a) Miyoglobin, (b) Lizozim, (c) Sitokrom c, (d) BSA, (e) BSA-Sitokrom c, (f) BSA- Lizozim, (g) BSA-Miyoglobin, (h) Sitokrom c-Miyoglobin, (ı) Lizozim-Sitokrom c, (j) Miyoglobin-Lizozim, (k) BSA-Sitokrom c, (l) BSA-Sitokrom c-Miyoglobin, (m) Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c, (n) BSA-Miyoglobin-Lizozim-Sitokrom c. Şekil 4.9.1. incelendiğinde; miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensörün BSA ile herhangi bir etkileşime girmediği ve sinyal vermediği belirlenmiştir (∆Rmaks= 0,04). Sitokrom c ve lizozim sinyal değerlerinin ise miyoglobin için alınan sinyal değerine yakın olduğu (ΔRsitokrom c= 0,15; ΔRlizozim= 0,20 ve ΔRmiyoglobin= 0,42) belirlenmiştir. İkili ve üçlü karışımlarda; baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör ile elde edilen sonuçlara benzer sonuçlar elde edildiği ve karışımların sinyal değerlerinde sinerjik bir etki olduğu görülmektedir. Baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA- MATrp) sensörler karşılaştırıldığında; miyoglobin sinyalinin duyarlılığının düştüğü görülmektedir. Eşitlik 4.8.2 ve 4.8.3 kullanılarak hesaplanan seçicilik katsayıları 172 % Change in Reflectivity Çizelge 4.9.1’de özetlenmiştir. Baskılama seçiciliğini gösteren bağıl seçicilik katsayısı ise 3,81 (miyoglobin/sitokrom c) ve 3,19 (miyoglobin/lizozim) olarak hesaplanmıştır. Bir başka tanımla; miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör, miyoglobini sitokrom c’ye göre 3,81 kat , lizozime göre 3,19 kat seçicilikte tanımaktadır. Bağıl seçicilik değeri, 1’in ne kadar üzerinde ise baskılama işleminin o kadar etkin olduğu bilinmektedir (Zhang ve ark. 2002). Hem molekül ağırlığı ve boyutu hem de izoelektrik noktası birbirine çok yakın olan iki molekül arasında 3,81 ve 3,19 katlık ayırma faktörünün oldukça başarılı bir sonuç olduğu belirtilmelidir. Tirozin amino asidinin baskılandığı bir çalışmada; tirozin ile fenilalanin amino asitleri arasındaki bağıl seçiclik katsayısının 1.82 olduğu rapor edilmiştir (Zhang ve ark. 2002). Bereli ve ark 2008 yılında yaptıkları bir çalışmada lizozim baskılanmış kriyojeller hazırlamışlar ve lizozimin BSA ve sitokrom c’ye göre bağıl seçicilik katsayılarını 4.6 (lizozim/BSA) ve 3.2 (lizozim/sitokrom c) olarak rapor etmişlerdir. Hemoglobin baskılanmış kriyollerin hazırlandığı bir çalışmada ise hemoglobinin miyoglobin ve BSA e göre bağıl seçicilik katsayıları 38 (hemoglobin/miyoglobin) ve 12 (hemoglobin/BSA) olarak belirlenmiştir. (Derazshamsir ve ark. 2010) Çizelge 4.9.1. Miyoglobine göre BSA, sitokrom c ve lizozim için seçicilik ve bağıl seçicilik kat sayıları MIP NIP Protein ΔR k ΔR k k’ Miyoglobin 2,35 - 0,42 - BSA 0,06 ≈∞ 0,06 ≈∞ ≈∞ Sitokrom c 0,22 10,68 0,15 2,8 3,81 Lizozim 0,35 6,71 0,20 2,1 3,19 173 4.10. Poli(HEMA-MATrp) SPR Sensörün Tekrar Kullanımı SPR temelli biyosensörlerin kullanımda sağladığı en büyük avantajlardan biri tekrar kullanımdır. Tanıma elementi olarak biyolojik moleküllerin kullanılması durumunda tekrar kullanım sınırlıdır. Çünkü rejenerasyon için kullanılan çözeltiler biyolojik molekülün üç boyutlu yapısını bozarak sensörün tanıma kapasitesini değiştirmekte ve sensör zamanla kullanılamaz hale gelmektedir. Moleküler baskılanmış polimerler ile hazırlanan sensörler ise polimerik yapının sağlamlığı ve çevresel koşullara karşı dayanıklılığı nedeniyle biyomoleküller ile hazırlanan sensörlere göre çok daha uzun süre tekrar kullanılabilme kapasitesine sahiptir. Poli(HEMA-MATrp) sensörün tekrar kullanımı için yüzey analizden sonra rejenere edilmiştir. MATrp monomeri ve miyoglobin arasındaki etkileşim, hidrofobik etkileşimler, elektrostatik etkileşimler ve hidrojen bağlarının ortak etkisi temeline dayanmaktadır. Ancak temel etkileşim triptofan amino asidinde bulunan aromatik halka ve protein yapısındaki hidrofobik amino asitler arasındaki hidrofobik etkileşimlerdir. Hidrojen bağlarının da bu kompleks oluşumuna önemli bir katkısı olduğu düşünülmektedir. Bu amaçla miyoglobinin polimerik yapıdan uzaklaştırılması için polar ve hidrofobik etkileşimleri kırabilecek bir desorpsiyon ajanı kullanılmalıdır. Bu amaçla desorpsiyon ajanı olarak 1 M etilen glikol kullanılmıştır. Şekil 4.10.1’de 1000 ng/mL derişimindeki miyoglobin çözeltisi poli(HEMA-MATrp) sensör yüzeyiden geçirilerek kinetik analiz tamamlanmış ve ardından yüzeye onar dakikalık süreler ile sırasıya 1M etilen glikol, saf su ve denge tamponu (pH 7,4) gönderilmiştir. Görüldüğü gibi 30 dakikalık bir süre içerisinde rejenerasyon gerçekleşmiştir. Şekil 4.10.2‘de de poli(HEMA-MATrp) sensör üzerine sırasıyla 100, 300, 700 ve tekrar 100 ng/mL derişimde miyoglobin çözeltileri gönderilmesi ile elde edilen sensogram görülmektedir. Görüldüğü gibi rejenerasyon çözeltisi olarak 1 M etilen glikol çözeltisinin kullanılması ile bağlanma bölgelerinde herhangi bir bozulmaya neden olmaksızın yüzey dört kez tekrar kullanılabilmektedir. Ayrıca hazırlanan sensörün 4 ay 174 süre ile oda sıcaklığında bekletilmesi sonrasında tekrarlanabilir olarak kullanıldığı belirlenmiştir. SPRimager Normalized 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -20 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 Time (sec) Şekil 4.10.1. 1000 ng/mL derişimde miyoglobin ile yapılan kinetik analiz ve rejenerasyon 175 % Change in Reflectivity SPRimager Normalized 6 4 2 0 -2 -4 -6 -8 -10 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 Time (sec) Şekil 4.10.2. Poli (HEMA-MATrp) sensörün tekrar kullanımı 4.11. Kan Örneği ile Kinetik Analizler Klinikte tanı amaçlı kullanılacak SPR sistemlerinin operasyonel bir dayanıklılığa ve sağlamlığa sahip olması gerekir. Sistem değişen koşullar altında kan, idrar ve tükrük gibi kompleks örneklerde kullanılabilmelidir. SPR temelli sistemlerde sıcaklık değişimleri ve örneğin kırılma indeksindeki değişmeler en önemli noktalardır. SPR temelli sistemlerde sıcaklık etkisi birkaç farklı şekilde görülebilir. İlk olarak, metal/örnek ara yüzeyine bitişik olarak bulunan hacimdeki etkin kırılma indisine duyarlı olan yüzey plazmonları örneğin sıcaklığa bağlı kırılma indisi değişiminden etkilenir. Örneğin çözücü kısmı en büyük sıcaklık bağımlılığı olan kısmıdır. Örneğin sudaki 0,1oC lik sıcaklık değişimi 10-5 RIU lik değişime neden olur ki bu değer bugüne kadar SPR temelli cihazlar için rapor edilen tayin sınırına yakın ya da ondan daha büyüktür (Homola ve ark. 1999). İkincisi , metal tabakasında meydana gelecek sıcaklık değişimleri yüzey plazmonlarının oluşumunu büyük ölçüde etkiler. Yüksek sıcaklıklarda yüzey plazmonları metaldeki 176 % Change in Reflectivity artan fonon-elektron saçılımı nedeniyle sönümlenebilir (Chiang ve ark. 2001). Sonuç genişlemiş bir SPR eğrisi ve dR/dn değerinde artan sıcaklık ile gözlenen azalmadır. Üçüncüsü, sıcaklıktaki değişmeler sistemin ışık kaynağı, dedektör cevabı ve sensör geometrisi gibi kritik bileşenleri de etkileyebilir. Son olarak ortam sıcaklığının değişmesi ilgilenilen bağlanma olayının hızını ve/veya etkinliğini etkileyebilir. Örneğin Zeder-Lutz ve arkadaşları (1997) antijen-antikor bağlanma olayında sıcaklığın 5-300C olarak değişmesi ile assosiasyon hızının dissosiasyon hızına oranının 10 kat değiştiğini rapor etmişlerdir. Çalışmada kullanılan GWC SPRImager II sistemi sıcaklık kontrol ünitesine sahiptir. Bu nedenle hem sulu çözelti hem de kan örneği ile yapılan tüm analizler sabit sıcaklıkta (25 oC) gerçekleştirilmiştir. Sıcaklık değişiminin yanı sıra örnek bileşimindeki değişim kırılma indeksi değişimine neden olan diğer bir etmendir. Klinik bir tanı sistemi söz konusu olduğunda kompleks insan örneklerinin kırılma indisinde olabilecek doğal değişimler özellikle dikkat edilmesi gereken bir konudur. Kanın kırılma indisi 10 mg/dL glukoz durumunda 1,4x10-5 RIU’dur. Kontrol edilemeyen diabet durumunda glukoz derişimi 100 mg/dL’ye ulaşabilmektedir. İdrar örneklerinin kırılma indeksi değerleride değişken olup 6,4x10-3 RIU olarak rapor edilmiştir (Wolf ve Pillay 1969). Klinik uygulamaya bağlı olarak ,analizi yapılan örneğin ön şartlandırılması ya da görüntüleme koşullarının ayarlanması ile örnekten gelen kırılma indeksi değişimleri dengelenebilir. Bu çalışmada kalp krizi şikayetiyle acil servise başvuran bir hastadan alınan kan örneğindeki miyoglobin derişimi hazırlanan poli(HEMA-MATrp) sensör ile tayin edildi. Kan örneğindeki miyoglobin miktarının tayininde standart katma yöntemi kullanıldı. Standart katma yönteminin kullanılması ile kan örneğinin içeriğinden kaynaklanan kırılma indisi etkisi ortadan kaldırılmıştır. Kan örneğindeki toplam seyrelme miktarı 1:15 olacak şekilde önce kör örnek, ardından da aynı seyrelme oranında, ilave miyoglobin derişimi 300; 500; 700; 900 ve 1000 ng/mL olacak şekilde kalibrasyon çözeltileri hazırlandı. Hazırlanan örnekler poli(HEMA-MATrp) sensör 177 yüzeyine gönderilerek sensogramlar alındı. Elde edilen %∆R/zaman değişimleri Şekil 4.11.1 ve ’de görülmektedir. SPRimager Normalized 6 5 4 KÖR 300 ng/mL 3 500 ng/mL 700 ng/mL 2 900 ng/mL 1000 ngmL 1 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 -1 Time (sec) Şekil 4.11.1. Kör örnek ve 300, 500, 700, 900, 1000 ng/mL miyoglobin derişimindeki kan örneklerinin poli(HEMA-MATrp) ile etkileştirilmesi ile elde edilen sensogram 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Miyoglobin derişimi (ng/mL) Şekil 4.11.2. Standart katma yöntemi ile elde edilen miyoglobin derişimi-sinyal grafigi 178 %∆Rmak % Change in Reflectivity 3 2,5 2 1,5 1 0,5 y = 0,0027x + 0,115 R2 = 0,9821 0 0 200 400 600 800 1000 Miyoglobin derişimi (ng/mL) Şekil 4.11.3. Standart katma yöntemi ile elde edilen miyoglobin derişimi / % ∆R grafiği Şekil 4.11.2 ve 4.11.3’de miyoglobin derişimi ile %∆R değerleri arasındaki ilişki gösterilmiştir. Görüldüğü gibi poli(HEMA-MATrp) sensör 100-900 ng/mL ilave miyoglobin derişim aralığında derişim-sinyal doğrusallığı göstermektedir. Bu aralıktaki veriler değerlendirildiğinde elde edilen doğrunun denklemi (y=0,0027x+0,115) ve doğrusallığı 0,9821 olarak hesaplanmıştır. Bu denklemden 1/15 oranında seyreltilmiş örnekteki miyoglobin derişimi 42,6 ng/mL, seyrelme yapılmamış başlangıç kan örneğindeki miyoglobin derişimi ise 639 ng/mL olarak belirlenmiştir. Aynı kan örneği için ELISA testi ile belirlenen miyoglobin derişimi ise 964,16 ± 81,73 ng/mL dir. Bu sonuç göstermektedir ki hazırlanan miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör kan örneği içerisindeki miyoglobin derişimini ELISA yöntemi ile karşılaştırıldığında % 66 doğrulukla tayin edebilmektedir. 179 %∆Rmak 5. SONUÇ  MATrp monomeri, L-triptofan metil esterinin metakroil klorür ile reaksiyonu sonucu elde edilmiştir. Elde edilen monomer NMR ve FTIR çalışmaları ile karakterize edilmiştir  MATrp monomerinin kimyasal yapısının belirlenebilmesi için 1H-NMR kullanılmıştır. MATrp monomerine ait karakteristik pikler şunlardır:  8,22 (1H s, br, N-H), (2) 7,54-7,09 (4H aromatikler), (3) 6,98 (1H d, amid NH J=5,58), (4) 5,64 (1H, t, CH2), (5) 5,32 (1H, t, CH2) (6) 4,99 (1H, m, CH), (7) 3,38 (2H, dd, CH2) (8) 6,34 (1H, d, 5’li halka, J=7,6), (9) 3,71 (3H, s, OCH3), (10) 1,24 (3H, t, CH3), (400 MHz, DMSO-d6).  MATrp monomerinin yapısının belirlenmesi için FTIR tekniği de kullanılmıştır. 3100-3000 cm-1 aralığında aromatik C-H , 2952 ve 2853 cm-1’de alifatik C-H gerilmelerinden kaynaklanan absorpsiyon bandları gözlenmektedir. 1734 cm-1‘de ester karbonil grubuna ait gerilme bandı, 1659 cm-1’de ise amid karbonil grubuna ait gerilme bandı yer almaktadır. N-H gerilme titreşiminden kaynaklanan absorpsiyon bandı ise 3500 cm-1 civarında ortaya çıkmıştır. FTIR ve NMR sonuçları monomerin başarıyla sentezlendiğini göstermiştir.  SPR altın çip yüzeyinde poli(HEMA-MATrp) filmin hazırlanabilmesi için ilk olarak yüzey doymamış bağlar içeren allil merkaptan (CH2=CH-CH2-SH) ile kaplanmıştır. Yüzeye ait speküler reflektans IR spektrumunda C-H gerilme bölgesinde, 2930 cm-1 ve 2857 cm-1 de simetrik ve asimetrik C-H gerilme titreşimlerine ait bandlar açıkça görülmektedir. Ayrıca serbest alkanotiyolatlarda 2560 cm-1 civarında gözlenen S-H gerilme titreşim bandı spektrumda gözlenememiştir. Bu sonuç allil merkaptanın altın yüzeyine bağlandığını göstermektedir.  Protein kalıbının hazırlanmasında kullanılacak cam yüzey temas açısı analizleri ile karakterize edilmiştir. Asidik pirana çözeltisi ile temizlenmiş cam için temas açısı 44,7o ± 3,5 iken APTES ile modife edilmiş cam için bu değer 54,3o ± 3,2‘ye yükselmiştir. Bu değişim APTES ile muamele sonucunda cam yüzeyinin daha hidrofobik bir karakter kazandığını göstremektedir. APTES ile kaplanmış 180 cam yüzey daha sonra glutaraldehid ile modifiye edilmiş ve temas açısı 65,8o ± 5,2 olarak belirlenmiştir. Bu sonuca göre yüzey biraz daha hidrofobik hale gelmiştir. Çünkü glutaraldehid, APTES den gelen amin uçlarını imin oluşumuyla kapatmış ve içerdiği hidrokarbon zincirinden dolayı da hidrofobik özellik kazandırmıştır. Miyoglobinin kovalent olarak bağlandığı cam yüzeyinde ise temas açısı 67,3o ± 2,1 olarak elde edilmiştir. Bu değişimler miyoglobin proteinin cam yüzeyine bağlandığını gösteren sonuçlardan biridir.  Miyoglobinin cam yüzeyine immobilize edilmesi ile cam yüzeyinin morfolojisindeki değişimin ayrıntılı bir şekilde incelenebilmesi için APTES ve glutaraldehid ile modifye edilmiş cam yüzeyin ve miyoglobin immobilize edilmiş cam yüzeyin AFM görüntüleri alınmıştır. APTES ve glutaraldehid modifikasyonu ile cam yüzeyinde oluşan kalınlık 1,5-2 nm iken, miyoglobinin cam yüzeyine immobilizasyonundan sonra yüzey morfolojisi tamamen değişmiş ve kalınlık 6-6,5 nm değerlerine yükselmiştir. Bu sonuç miyoglobinin cam yüzeyine başarıyla immobilize edildiğini göstermektedir.  Hazırlanan poli(HEMA-MATrp) filmin karakterizasyonu için de FTIR-ATR tekniğinden yararlanılmıştır. Polimerik film sentezlendikten sonra altın yüzeyinde poli(HEMA-MATrp) polimerine ait absorpsiyon bandları oluşmuştur. 1715 cm-1 ‘de ester karbonil grubu gerilmesine , 1662 cm-1 de amid karbonil grubu gerilmesine ait absorpsiyon bandları spektrumda açık şekilde görülmüştür. 3400 cm-1 bölgesinde, MATRp monomerinden gelen N-H ve yapıdaki O-H gruplarından kaynaklanan absorpsiyon bandı beraberce görülmektedir. 2955 cm -1’de gözlenen absorpsiyon bandı ise polimerik yapı içerisinde tekrar eden alifatik C-H bağlarına ait gerilmelerden kaynaklanmaktadır.  Poli(HEMA-MATRp) filmin başarıyla sentezlendiğni göstermek için ayrıca poli(HEMA-MATRp) filmin FTIR-ATR spekturumu, sadece MATrp , HEMA ve EGDMA’ın başlatıcı varlığında tek başına polimerizasyonu ile hazırlanan poli(MATrp), poli(HEMA) ve poli(EGDMA) polimerlerlerinin FTIR-ATR spektrumları ile karşılaştırılmıştır. Poli(HEMA-MATrp) filme ait spektrum, poli(MATrp), poli(HEMA) ve poli(EGDMA) için elde edilen spektrumlardan farklıdır ve MATrp monomerine ait karakteristik bandlar göstermektedir. Bu 181 sonuç fonksiyonel monomer olan MATrp’ ın HEMA ve EGDMA varlığında yapıya başarıyla dahil edildiğinin bir kanıtıdır.  Sabit miktarda MATrp ve HEMA varlığında çapraz bağlayıcı (EGDMA) miktarının değiştirilmesi (1:1:1; 1:1:3; 1:1:5; 1:1:6) ile MIP ve NIP için elde edilen sinyal değerlerinde değişim gözlenmiştir. Baskılanmış poli(HEMA- MATrp) filmler için baskılanmamış filmlere göre daha yüksek %∆R değerlerinin elde edilmesi miyoglobine özgü bağlanma bölgelerinin oluştuğunun bir göstergesidir. 1:1:5 karışım oranının 5,57 değerinde baskılama faktörü ile en uygun en uygun oran olduğu belirlenmiştir.  Altın yüzey, allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey, yüzeyinde miyoglobin baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) film hazırlanmış altın yüzeylerin ıslanabilirlik özelliklerinin incelenmesi amacıyla bu yüzeylerin su ve etilen glikol ile yaptıkları temas açıları ölçülmüş ve yüzey serbest enerjileri Owens, Wendt, Rabel ve Kaelble yaklaşımı kullanılarak hesaplanmıştır.  Su ile yapılan temas açısı ölçümlerinden görüldüğü gibi altın yüzeyin temas açısı değeri (85,3o ± 4,9), allil merkaptan modifikasyonu ile 71,1°±3,4’e düşmüştür. Yüzeyin temas açısının önemli miktarda azalması, yüzeyin hidrofilik özelliğinin arttığını ve altın kaplı yüzey plazmon rezonans çip yüzeyinin allil merkaptan ile kaplandığını göstermektedir. Allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzeyde gerçekleştirilen polimerizasyon sonucu temas açısı değeri 75,0o ± 4,8 ‘e yükselmiş ve yüzey serbest enerjisi 38,08 mN/m‘ye düşmüştür. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) film durumunda temas açısının 75,0o ± 4,8 değerine yükselmesi altın yüzeyinde poli(HEMA-MATrp) filmin başarıyla sentezlendiğini göstermiştir. Altın yüzey, allil merkaptan ile modifiye edilmiş altın yüzey ve miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) altın yüzeyin morfolojik karakterizasyonu için AFM görüntüleri alınmıştır. Her bir yüzey için morfolojik değişimler incelendiğinde polimerizasyonun altın yüzeyinde başarıyla gerçekleştiğini göstermektedir.  Elipsometri sonuçlarına göre hazırlanan film 12,85 ± 1,5 nm kalınlıktadır. Bu sonuç AFM sonuçları ile de örtüşmekte olup polimerik filmin altın yüzeyinde başarıyla hazırlandığını göstermektedir. Ayrıca hazırlanan sensör 50 nm’den 182 daha düşük bir kalınlık değerine sahip olduğundan optik transdüser prensibi ile çalışan SPR sistemi ile büyük bir uyum göstereceği açıktır.  SEM görüntüleri ile altın yüzeyin polimerik film ile kaplandığı kanıtlanmış ve polimerik filmin yüzey morfolojisi belirlenmiştir.  Miyoglobin derişimi ile % ∆R arasındaki ilişki incelenmiştir. Görüldüğü gibi miyoglobin derişimi arttıkça % ∆R değerleri artmaktadır. Yaklaşık 2500 ng/ml derişim değerinden sonra yüzeydeki aktif bölgelerin dolmasına bağlı olarak bu artış hızı azalmakta ve yaklaşık 7500 ng/mL değerinde dengeye ulaşılmaktadır. Bu derişimde elde edilen % ∆R değeri 4,33‘tür.  Hazırlanan poli(HEMA-MATrp) SPR sensör, 100-1000 ng/mL derişim aralığında derişim-sinyal doğrusallığı göstermektedir. Bu aralıktaki veriler değerlendirildiğinde elde edilen doğrunun denklemi, y=0,0025x+0,2402 ve doğrusallığı 0,9741 olarak hesaplanmıştır. Hazırlanan poli(HEMA-MATrp) sensör için elde edilen veriler kullanılarak tayin sınırı (LOD) 26,28 ng/mL ve tayin limiti (LOQ) 87,6 ng/mL olarak belirlenmiştir.  Elde edilen verilerin Langmuir, Freundlich ve Langmuir-Freundlich absorpsiyon modellerine uygunluğu araştırıldı. R2 = 0,9971 değeri ile en uygun adsorbsiyon modelinin Langmuir absorpsiyon modeli olduğu belirlendi. Bu sonuç; hazırlanan baskılanmış sensör yüzeyindeki miyoglobin bağlanma bölgelerinin homojen dağılımlı, tek tabakalı, eş enerjili ve minimum yanal etkileşimli olduğunu göstermiştir. Buradan hesaplanan Rmaks değeri deneysel değere (4,33 µg/ml) yakındır. Langmuir denkleminden hesaplanan K A ve K D değerleri sırasıyla 0,594 µg/mL ve 1,681 mL/µg olarak belirlenmiştir.  Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün miyoglobine karşı seçiciliğinin belirlenmesi için yarışmalı adsorpsiyon deneyleri 1000 ng/mL derişimindeki BSA, sitokrom c, lizozim ve miyoglobinin tekli, ikili, üçlü ve dörtlü karışım çözeltileri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün BSA ile herhangi bir etkileşime girmediği ve anlamlı bir sinyal vermediği (%∆R= 0,06) belirlenmiştir.  Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün sitokrom c’ye verdiği sensorgram sinyal değeri (%ΔR); 0,22, lizozime verdiği sinyal değeri (%ΔR); 0,35’tir. Aynı derişimdeki miyoglobin için elde edilen sinyal değeri (%ΔR) ise 183 2,35’tir. Bir başka deyişle; baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensör miyoglobini; sitokrom c’ye göre 10,68 kat, lizozime göre 6,71 kat daha duyarlı tayin edebilmektedir.  Miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün baskılama seçiciliğini göstermek için miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensör de hazırlanmıştır. Miyoglobin, BSA, sitokrom c ve lizozimin kullanılmasıyla oluşturulan karışımlar SPR sistemine gönderilmiştir. Miyoglobin baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensörün BSA ile herhangi bir etkileşime girmediği ve sinyal vermediği belirlenmiştir (∆Rmaks= 0,04). Sitokrom c ve lizozim sinyal değerlerinin ise miyoglobin için alınan sinyal değerine yakın olduğu (ΔRsitokrom c= 0,15; ΔRlizozim= 0,20 ve ΔRmiyoglobin= 0,42) belirlenmiştir. Baskılanmış ve baskılanmamış poli(HEMA-MATrp) sensörler karşılaştırıldığında; miyoglobin baskılanmış poli(HEMA-MATrp) sensörün, miyoglobini sitokrom c’ye göre 3,81 kat, lizozime göre 3,19 kat seçicilikte tanıdığı belirlenmiştir.  Sensör yüzeyinin rejenerasyonu için 1M etilen glikol kullanılmış ve yaklaşık 30 dakika içerisinde tüm rejenerasyon işlemleri başarıyla tamamlanmıştır. Ayrıca yüzey tekrarlanabilir bir şekilde tekrar tekrar kullanılmıştır. Hazırlanan poli(HEMA-MATrp) sensörün etkinliği miyoglobin düzeyi yüksek hasta kanı kullanılarak araştırılmıştır. 1:15 seyrelme oranındaki kan kullanılarak standart katma metodu ile kandaki miyoglobin düzeyi belirlenmiştir. ELISA yöntemi standart referans kabul edildiğinde hazırlanan sensör kandaki miyoglobin derişimini %66 doğrulukla tayin etmiştir.  Dört kez tekrar kullanımda yüzey başarıyla rejenere edilebilmiş ve bağlanma kapasitesinde bir kayıp olmamıştır. Hazırlanan sensörün 4 ay süreyle oda sıcaklığında bekletilmesinin ardından miyoglobin bağlama kapasitesinde herhangi bir değişim gözlenmemiştir. 184 KAYNAKLAR Andresson, L., Sellergren, B., Mosbach, K. 1984. Imprinting of amino acid derivates in macroporous polymer.Tetrahedron Lett., 25: 5211-5214. Andersson, L., Mandenius, C. F., Mosbach, K. 1988. Studies on guest selective molecular recognition on an octadecyl silylated silicon surface using ellipsometry. Tetrahedron Lett., 29:5437-5440. Andersson, L.I., Miyabayashi, A., O´Shannessy, D.J., Mosbach, K. 1990. Enantiomeric resolution of amino acid derivatives on molecularly imprinted polymers as monitored by potentiometric measurements. J. Chromatogr. A, 516: 323-331. Anderson, L., Muller, R., Vlatakis, G., Mosbach, K. 1995. Mimics of the binding sites of opioid receptors obtained by molecular imprinting of enkephalin and morphine. Proc. Natl. Acad.Sci USA ,92(11):4788-4792. Ansell, R.J., Ramstrom, O., Mosbach, K. 1996. Towards Artificial Antibodies Prepared by Molecular Imprinting. Clin. Chem., 42(9): 1506-1512. Arshady, R., Mosbach, K. 1981. Synthesis of substrate-selective polymers by host– guest polymerization. Makromol. Chem.-Rapid., 182: 687-692. Avseenko, N.V., Morozova, T.Y., Ataullakhanov, F.I. 2001. Immobilization of proteins in immunochemical microarrays fabricated by electrospray deposition. Anal. Chem., 73: 6047-6052. Baltus, R.E., Carmon, K.S., Luck, L.A. 2007. Quartz Crystal Microbalance (QCM) with immobilised protein receptors: comparison of response to ligand binding for direct protein immobilisation and protein attachment via disulfide linker. Langmuir, 23:3880- 3883. Banerji, S., Peng, W., Kim, Y.C., Booksh, K.S. 2006. In Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. Boston, MA; p: 6380. Bereli, N., Andaç, M., Baydemir G., Say, R, Galaev, I.Y., Denizli A. 2008. Protein recognition via ion-coordinated molecularly imprinted supermacroporous cryogels. J. Chromatogr. A., 1190: 18-26. Bergman, M.N.2005. Molecularly imprinted polyacrylamide polymers and coplymers with specific recognition for serum proteins.Ph.D.Thesis. Faculty of the graduate school of the university of Texas,Austin, USA. Betancor, L., Lopez-Gallego, F., Hidalgo, A., Alonso-Morales, N., Mateo, C., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J. M. 2006. Different mechanisms of protein immobilization on glutaraldehyde activated supports: Effect of support activation and immobilization conditions.Enzyme Microb. Technol., 39: 877-882. 185 Britschgi, M., Von Greyerz, S., Burkhart, C., Pichler, W. J. 2003. Molecular Aspects of Drug Recognition by Specific T Cells. Current Drug Targets, 4 (1): 1-11. Brogan, G.X., Frıedman, S., McCuskey C., Coolıng D.S., Berrutti, L., Thode, H.C., Bock, J.L., 1994. Evaluation of a New Rapid Quantitative Immunoassay for Serum Myoglobin Versus CK-MB for Ruling Out Acute Myocardial Infarction in the Emergency Department.,Ann.Emerg. Med., 24: 665-671. Bossi, A., Piletsky, S.A., Piletska, E.V., Righetti, P.G, Turner, A.P.F . 2001. Surface- grafted molecularly imprinted polymers for protein recognition. Anal. Chem., 73(21): 5281-5286. Burow, N., Minoura, N. 1996. Molecular imprinting: synthesis of polymer particles with antibody-like binding characteristics for glucose oxidase. Biochem. Biophys. Res.Commun., 227(2): 419-422. Califf, R.M., Ohman, E.M. 1992. The diagnosis of acute myocardial infarction. Chest.,101(4 suppl):106-115. Cao, L., Zhou, X.C., Li, S.F.Y.2001. Enantioselective sensor based on microgravimetric quartz crystal microbalance with molecularly imprinted polymer film. Analyst. 126: 184–188. Char, D.M., Israel, E., Ladenson, J. 1998. Early laboratory indicators of acute myocardial infarction. Emerg. Med. Clinics. North. Am., 16: 519-539. Chen, G. H., Guan, Z. B., Chen, C. T., Fu, L.T., Sundaresan, V., Arnold, F. H. 1997. A glucose sensing polymer. Nat. Biotechnol., 15: 354-357. Chen, B. N., Piletsky, S., Turner, A. P. F. 2002. Molecular Recognition: Design of "Keys". Comb. Chem. High Throughput Screen., 5 (6): 409-427. Chiang, H., Wang, Y., Leung, P., Tse, W. 2001. A theoretical model for the temperature-dependent sensitivity of the optical sensor based on surface plasmon resonanceOpt. Commun., 188: 283-289. Choi, H. J., Kimb, N. H., Chung, B. H., Seong, G. H. 2005. Micropatterning of biomolecules on glass surfaces modified with various functional groups using photoactivatable biotin. Anal. Biochem., 347: 60-66. Chou, P.C., Rick, J., Chou, T.C. 2005. C-reative protein thin-film molecularly imprinted polymers formed using a micro-contact approach. Analytica Chimica Acta, 542: 20-25. Chou, T.C., John Rick, J., Yu-Ching Weng, Y.C. 2007. Nanocavity Protein Biosensor - Fabricated by Molecular Imprinting. Proceedings of the 7th IEEE International Conference on Nanotechnology, 2 – 5 August, 2005, Hong Kong, Japan. 186 Christenson, R.H., Azzazy, H.M., 1998. Biochemical markers of the acute coronary syndromes.Clin. Chem., 44(8): 1855-1864. Christiaens, P., Vermeeren, V., Wenmackers, S., Daenen, M., Haenen, K., Nesladek, M., vandeVen, M., Ameloot, M., Michiels, L., Wagner, P. 2006. EDC- mediated DNA attachment to nanocrystalline CVD diamond films. Biosens. Bioelectron., 22: 170-177. Cooper, M. 2002. Optical biosensors in drug discovery. Nature Rev., 1: 515-528. Cormack, PAG., Elorza, A.Z. 2004. Molecularly imprinted polymers:Synthesis and characterization. J Chromatogr. B, 804:174-182. Cudic, P., Behenna, D.C., Kranz, J. K., Kruger, R.G., Wand, A.J., Veklich, Y.I., Weisel, J.W., McCafferty, D.G. 2002. Functional Analysis of the Lipoglycodepsipeptide Antibiotic Ramoplanin. Chem. Biol., 9(8): 897-906. Cunliffe, D., Kirby, A., Alexander, C. 2005. Molecularly imprinted drug delivery systems. Adv. Drug Deliv. Rev., 57: 1836-1853. D’Orazio, P. 2003. Biosensors in clinical chemistry. Clin. Chim. Acta., 334: 41-69. D’Souza, S.F., Godbole, S.S. 2002. Immobilization of invertase on rice husks using polyethyleneimine. J. Biochem. Biophys. Methods, 52: 59-62. Derazshamshir, A., Baydemir, G., Andac, M., Say, R., Galaev, I.Y., Denizli, A. 2010. Molecularly imprinted pHEMA-based cryogel for depletion of hemoglobin from human blood. Macromol. Chem. Phys., 211: 657–668. Devanathan, S., Salamon, Z., Nagar, A., Narang, S., Schleich, D., Darman, P., Hruby, V., Tollin, G. 2005. Subpicomolar sensing of delta-opioid receptor ligands by molecular-imprinted polymers usin. Anal. Chem., 77: 2569-2574 Dickert, F. L., Forth, P., Lieberzeit, P., Tortschanoff, M. 1998. Molecular imprinting in chemical sensing-Detection of aromatic and halogenated hydrocarbons as well as polar solvent vapors. Fresenius’J. Anal. Chem., 360: 759-762. Dickert, F. L., Tortschanoff, M., Bulst, W. E., Fischerauer, G. 1999. Molecularly Imprinted Sensor Layers for the Detection of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Water. Anal. Chem., 71:4559-4563. Dickert, F.L., Hayden, O. 2002. Bioimprinting of Polymers and Sol-Gel Phases “Selective Detection of Yeasts with Imprinted Polymers”. Anal. Chem., 74(6):1302- 1306. 187 Duan, L., He, Q., Yan, X., Cui, Y., Wang, K., Li, J. 2007. Hemoglobin protein hollow shells fabricated through covalent layer-by-layer technique. Biochem. Biophys. Res. Commun., 354: 357-362. Frederix, F., Bonroy, K., Reekmans, G., Laureyn, W., Campitelli, A., Abramov, M.A., Dehaen, W., Maes, G. 2004. Reduced nonspecific adsorption on covalently immobilized protein surfaces using poly(ethylene oxide) containing blocking agents. J. Biochem. Biophys. Methods, 58: 67-74. Gan, S.H., Yang, P., Yang, W.T. 2009. Photoactivation of alkyl C-H and silanization: a simple and general route to prepare high-density primary amines on inert polymer surfaces for protein immobilization. Biomacromolecules, 10: 1238–1243. Gill, I., Ballesteros, A. 2000a. Bioencapsulation within synthetic polymers (Part 2): Non sol-gel protein-polymer biocomposites. Trends Biotechnol., 18: 469-479. Gill, I., Ballesteros, A. 2000b.Bioencapsulation within synthetic polymers (Part 1): sol- gel encapsulation biologicals. Trends Biotechnol., 18: 282-296. Gill, I. 2001. Bio-doped nanocomposite polymers: Sol-gel bioencapsulates. Chem. Mater., 13: 3404-3421. Gitlin, G., Bayer, E.A., Wilchek, M. 1987. Studies on the Biotin-Binding Site of Avidin - Lysine Residues Involved in the Active-Site. Biochem. J., 242 (3): 923-926. Gitlin, G., Bayer, E. A., Wilchek, M.1988. Studies on the Biotin-Binding Site of Avidin - Tryptophan Residues Involved in the Active-Site. Biochem. J., 250(1): 291- 294. Glad, M., Norrlow, O., Sellergren, B., Siegbahn, N., and Mosbach, K. 1985. Use of silane monomers for molecular imprinting and enzyme entrapment in polysiloxane- coated porous silica. J. Chromatogr., 347(1): 11-23. Glaser, R.W. 1993. Antigen-antibody binding and mass transport by convection and diffusion to a surface: a two-dimensional computer model of binding and dissociation kinetics. Analyt. Biochem., 213 (1):152-161. Graf, N., Yegen, E., Lippitz, A., Treu, D., Wirth, T., Unger, W.E.S. 2008. Optimization of cleaning and amino-silanization protocols for Si wafers to be used as platforms for biochip microarrays by surface analysis (XPS, ToF-SIMS and NEXAFS spectroscopy). Surf. Interface Anal., 40: 180–183. Guan, G., Liu, B., Wang, Z., Zhang, Z. 2008. Imprinting of molecular recognition sites on nanostructures and its applications in chemosensors. Sensors, 8:8291-8320. Guo, T. Y., Xia, Y. Q., Hao, G. J., Song, M. D., Zhang, B.H. 2004. Adsorptive seperation of hemoglobin by molecularly imprinted polymers. Biomaterials, 25: 5905- 5912. 188 Guo, T.Y., Xia, Y.Q., Wang, J., Song, M.D., Zhang, B.H. 2005. Chitosan beads as molecularly imprinted polymer matrix for selective seperation of proteins. Biomaterials, 26: 5737-5745. Hall, A.J., Emgenbroich, M., Sellergren, B. 2005. Imprinted polymers. Top. Curr. Chem., 249: 317-349. Haupt, K., Mosbach, K. 1998. Plastic Antibodies: Developments and Applications. Trends. Biotechnol., 16:(11), 468-475. Haupt, K., Noworyta, K., Kutner, W. 1999a. Imprinted polymers in chemical and biological sensing. Anal. Commun., 36: 391-393. Haupt, K., Noworyta, K., Kutner, W. 1999b. Imprinted polymer-based enantioselective acoustic sensor using a quartz crystal microbalance. Anal Commun., 36: 391–393. Haupt, K., Mosbach, K. 2000. Molecularly imprinted polymers and their use in biomimetic sensors. Chem. Rev., 100, 2495-2504. Haupt, K., Belmont, A.S. 2007. Handbook of Biosensors and biochips: Molecularly imprinted polymers as recognition elements in sensors. Ed.: John Wiley and Sons,Ltd. Chapter 14 , pp: 8-9. Hawkins, D.M., Trache, A., Ellis, E.A., Stevenson, A., Holzenburg, A., Meininger, G.A., Reddy, S.M. 2006. Quantification and confocal imaging of protein specific molecularly imprinted polymers. Biomacromolecules 7, 2560–2564. Hedborg, E., Winquist, F., Lundstrom, I., Andersson, L.I., Mosbach, K. 1993. Sens. Actuators A, 796: 36-38. Hillberg, A.L., Brain, K.R., Allender, C.J. 2005. Molecular imprinted polymer sensors: implications for therapeutics. Adv. Drug. Deliv. Rev., 57: 1875-1889. Hirayama, K., Burow, M., Morikawa, Y., Minoura, N. 1998. Synthesis of polymer- coated silica particles with specific recognition sites for glucose oxidase by the molecular imprinting technique. Chem. Lett., 27(8): 731-732. Hirayama, K., Sakai, Y., Kameoka, K. 2001. Synthesis of polymer particles with specific lysozyme recognition sites by a molecular imprinting technique. J. Appl. Polym. Sci., 81(14):3378-3387. Hjerten, S., Liao, J.L., Nakazato, K., Wang, Y., Zamaratskaia, G., Zhang, H.X. 1997. Gels mimicking antibodies in their selective recognition of proteins. Chromatographia, 44:227-234. Hock , B. 1997. Antibodies for immunosensors:a review. Anal. Chim. Acta. 347:177- 186. 189 Holthoff, E.L., Bright, F.V. 2007. Molecularly templated materials in chemical sensing. Anal. Chim. Acta., 594: 147-161. Homola, J., Yee, S., Gauglitz, G. 1999. Surface plasmon resonance sensors: review. Sens. Actuators B, 54: 3-15. Hostetler, M.J., Stokes, J.J., Murray, R.W. 1996. Infrared spectroscopy of three- dimensional self-assembled monolayers: N-alkanethiolate monolayers on gold cluster compounds. Langmuir., 12:3604-3612. Huang, J., Zhang, J., Zheng, S. 2005. Template imprinting amphoteric polymer for the recognition of proteins. J. Appl. Polym.Sci., 95: 358-361. Huang, S.C., Lee, G.B., Chien, F.C., Chen, S.J., Chen, W.J., Yang, M.C. 2006. A microfluidic system with integrated molecular imprinting polymer films for surface plasmon resonance detection. J. Micromech. Microeng., 16: 1251-1257. Jakusch, M., Janotta, M., Mizaikoff, B., Mosbach, K., Haupt, K. 1999. Molecularly imprinted polymers and infrared evanescent wave spectroscopy. A chemical sensors approach. Anal. Chem., 71: 4786-4791. Jimenez, R., Salazar, G., Baldridge, K.K., Romesberg, F.E. 2003. Flexibility and Molecular Recognition in the Immune System. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100(1): 92-97. Kandimalla, V.B., Ju, H. 2004. Molecular imprinting: a dynamic technique for diverse applications in analytical chemistry. Anal.Bioanal.Chem., 380: 587-605. Karmalkar, R.N., Kulkarni, M.G., Mashelkar, R.A. 1996. Molecularly imprinted hydrogels exhibit chymotrypsin-like activity. Macromolecules, 29: 1366-1368. Katz, A., Davis, M.E. 2000. Molecular imprinting of bulk, microporous silica, Nature, 403 (6767), 286-289. Keffer, J.H. 1996. Myocardial markers of injuriy. Evolution and insights. Am. J. Clin. Pathol., 105:305-320. Kempe, M., Glad, M., Mosbach, K. 1995. An approach towards surface imprinting using the enzyme ribonuclease A. Journal of Molecular Recognition, 8: 35-39. Kempe, M., Mosbach, K. 1995. Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins on Molecularly Imprinted Stationary Phases. J Chrom. A, 691(1/2): 317-323. Kilpatrick, W.S., Wosornu, J.B., McGuines, J.B., Glen, A.C.A. 1993. Early diagnosis of acute myocardial infarction: CK-MB and myoglobin compared. Ann.Clin.Chem., 30: 435-438. 190 Kind, M., Woll, C. 2009. Organic surfaces exposed by self-assembled organothiol monolayers: Preparation, characterization, and application. Progress in Surface Science.,84:230-278. Koesslinger, C., Uttenthaler, E., Drost, S., Aberi, F., Wolf, H., Brink, K., Stanglmaier, A., Sackman, E. 1995. Comparison of the QCM and the SPR method for surface studies and immunological applications. Sens. Actuators B Chem., 24/25: 107-112. Kretschmann, E., Raether, H. 1968. Radiative decay of non-radiative surface plasmons excited by light. Z. Naturforsch., 23A: 2135–2136. Kriz, D., Mosbach, K. 1995. Competitive Amperometric Morphine Sensor Based on an Agarose Immobilised Molecularly Imprinted Polymer. Anal. Chim. Acta, 300: 71-75. Kroger, S., Turner, A.P.F., Mosbach, K., Haupt, K. 1999. Imprinted polymer-based sensor system for herbicides using differential-pulse voltammetry on screen-printed electrodes. Anal. Chem., 71: 3698-3702. Kugimiya, A., Takeuchi, T. 2001. Surface plasmon resonance sensor using molecularly imprinted polymer for detection of sialic acid. Biosens. Bioelectron., 16: 1059-1062. Laricchia-Robbio, L., Revoltella, R.P. 2004. Comparison between the surfac plasmon resonance (SPR) and the quartz crystal microbalance (QCM) method in a structural analysis of human endothelin-1. Biosens. Bioelectron., 19:1753-1758. Lai, E.P.C., Fafara, A., Vandernoot, V.A., Kono, M., Polsky, B. 1998. Surface Plasmon Resonance Sensors using Molecularly Imprinted Polymers for Sorbent Assay of Theophylline, Caffeine and Xanthine. Can. J. Chem., 76: 265-273. Lavine, B.K., Westover, D.J., Kaval, N., Mirjankar, N., Oxenford, L., Mwangi, G.K. 2007. Swellable molecularly imprinted polyN-(N-propyl)acrylamide particles for detection of emerging organic contaminants using surface plasmon resonance spectroscopy. Talanta, 72:1042-1048. Lee, T.H., Juarez, G., Cook, E.F. 1991. Ruling out acute myocardial infarction. A prospective multicenter validation of a 12-hour strategy for patiens at low risk. N. Engl. J. Med., 324: 1239-1246. Lee, K.H., Su, Y.D., Chen, S.J., Lee, G.B. 2006. In Proceedings of the 19th IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS) Istanbul, p 430. Levi, R., McNiven, S., Piletsky, S. A., Cheong, S. H., Yano, K., Karube, I. 1997. Optical Detection of Chloramphenicol Using Molecularly Imprinted Polymers Anal. Chem., 69: 2017-2021. 191 Li, P., Huang, Y., Hu, J., Yuan, C., Lin, B. 2002. Surface Plasmon Resonance Studies on Molecular Imprinting. Sensors, 2(1): 35-40. Li, X. Husson, S.M. 2006a. Adsorption of dansylated amino acids on molecularly imprinted surfaces: A surface plasmon resonance study Biosens. Bioelectron., 22, 336- 348. Li, X., Husson, S.M. 2006b. Two-Dimensional Molecular Imprinting Approach to Produce Optical Biosensor Recognition Elements. Langmuir, 22, 9658-9663. Li, Y., Yang, H.H., You, Q.H., Zhuang, Z.X., and Wang, X.R. 2006c. Protein recognition via surface molecularly imprinted polymer nanowires. Anal. Chem., 78 (1): 317. Liao, J.L., Wang, Y., Hjerten, S. 1996. Novel support with artificially created recognition for the selective removal of proteins and for affinity chromatography. Chromatographia, 42:259-262. Lin, L.P., Huang, L.S., Lin, C.W., Lee, C.K., Chen, J.L., Hsu, S.M., Lin, S. 2005. Determination of binding constant of DNA-binding drug to target DNA by surface plasmon resonance biosensor technology. Current Drug Target, 5: 61-72. Lin, H.Y., Hsu, C.Y., Thomas, J.L., Wang, S.E., Chen, H.C., Chou, T.C. 2006. The micro-contact imprinting of proteins: the effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin. Biosensensors & Bioelectronics, 15: 534- 543. Lin, H.Y., Rick, J., Chou, T.C. 2007. Optimising the formulation of a myoglobin molecularly imprinted thin-film polymer-formed using a micro-contact imprinting method. Biosensensors & Bioelectronics, 22: 3293-3301. Ling, T.R, Yau, Z.S., Tasi, Y.C., Chou, T.C., Liu, C.C. 2005. Size-selective recognition of catecholamines by molecular imprinting on silica–alumina gel. Biosens Bioelectron., 21: 901–907. Liu, K., Wei, W.Z., Zeng, J.X., Liu, X.Y., Gao, Y.P. 2006a. Application of a novel electrosynthesized polydopamine-imprinted film to the capacitive sensing of nicotine. Anal Bioanalyt Chem., 385: 724–729. Liu, F., Liu, X., Ng, S.C., Chan, H.S.O. 2006b. Enantioselective molecular imprinting polymer coated QCM for the recognition of L-tryptophan. Sens Actuators B Chem., 113: 234–240. Lotierzo, M., Henry, O.Y.F., Piletsky, S., Tothill, I., Cullen, D., Kania, M., Hock, B., Turner, A.P.F. 2004. Surface plasmon resonance sensor for domoic acid based on grafted imprinted polymer. Biosens. Bioelectron., 20: 145-152. 192 Luppa, P.B., Sokloll, L.J., Chan, D.W. 2001. Immunosensors-principles and applications to clinical chemistry. Clin. Chim. Acta., 314: 1-26. Lu, S., Cheng, G., Pang, X. 2006. Protein-imprinted soft-wet gel composite microspheres with magnetic susceptibility II. Characteristics. J. Appl. Polym. Sci., 99: 2401–2407 Lu, Z., Li, C.M., Z, Q., Bao, Q., Cui, X. 2007. Covalently linked DNA/protein multilayered film for controlled DNA release. J. Coll. Inter. Sci., 314: 80-88. Malitesta, C., Losito, I., Zambonin, P.G. 1999. Molecularly imprinted electrosynthesized polymers: new materials for biomimetic sensors. Anal. Chem., 71, 1366-1370. Mallik, S., Jhonson, R.D., Arnold, F.H. 1994a. Synthetic bismetal ion receptors for bis-imidazole protein analogs. Journal of The American Chemical Society 116: 8902- 8911. Mallik, S., Plunkett, S.D., Dhal, P.K., Johnson, R.D., Pack, D., Shnek, D., Arnold, F.H. 1994b. Towards materials for the specific recognition and separation of proteins. New Journal of Chemistry 18: 299-304. Matsui, J., Akamatsu, K., Hara, N., Miyoshi, D., Nawafune, H., Tamaki, K., Sugimoto, N. 2005. SPR Sensor Chip for Detection of Small Molecules Using Molecularly Imprinted Polymer with Embedded Gold Nanoparticles Anal. Chem., 77: 4282-4285. Matsunaga, T., Takeuchi, T. 2006. Crystallized protein-imprinted polymer chips. Chem Lett;35:1030–1031. Matsunaga, T., Hishiya, T., Takeuchi, T. 2007. Surface plasmon resonance sensor for lysozyme based on molecularly imprinted thin films. Anal. Chim. Acta, 591: 63-67. McCullough PA, Nowak RM, Foreback C. 2002. Performance of multiple cardiac biomarkers measured in the emergency department in patients with chronic kidney disease and chest pain. Acad Emerg Med., 9:1389-1396. McGlennen, R.C. 2001. Miniaturization technologies for molecular diagnostics.Clin. Chem., 47:393-402. Mirsky, V.M., Hirsch, T., Piletsky, S.A., Wolfbeis, O.S. 1999. Spreader-bar approach to molecular architecture: formation of artificial chemo-receptors. Angewandte Chemie (International ed. İn English) Links, 38: 1108-1110. Morgan, C.L., Newman, D.J., Price, C.P. 1996. Immunosensors: technology and opportunities in laboratory medicine, Clin. Chem., 42: 193-209. Mosbach, K., Ramstrom, O. 1996. The Emerging Technique of Molecular Imprinting and Its Future Impact on Biotechnology. Bio/Technology, 14(2): 163-170. 193 Nathalie, L., Christopher, J.A., Keith, R.B. 2004. Current status of molecularly imprinted polymers as alternatives to antibodies in sorbent assays. Anal. Chim. Acta, 510: 139-145. Nicholls, I.A., Rosengren, J.P. 2002. Molecular imprinting of surfaces. Bioseperations, 10: 301-305. Nishino, H., Huang, C.S., Shea, K.J. 2006. Selective protein capture by epitope imprinting. Angew. Chem. Int. Ed., 45(15): 2392-2396. O’Mahony, J., Molinelli,A., Nolan,K., Smyth, M.R., Mizaikoff, B. 2004. Anatomy of a successful imprint: analysing the recognition mechanisms of a molecularly imprinted polymer for quercetin. Biosen. Bioelectron., 2:1383–1392 O’Regan, T.M., O’Riordan, L.J., Pravda, M., O’Sullivan, C.K., Guilbault, G.G. 2002. Direct dedection of myoglobin in whole blood using a disposeable aprerometric immonosensor. Anal. Chim.Acta., 460: 141-150. Odabaşı, M., Say, R., Denizli, A. 2007. Molecular imprinted particles for lysozyme purification. Mater. Sci. & Engin. C, 27: 90–99. Otto, A. 1968. Exitation of nonradiative surface plasma waves in silver by the method of frustrated total reflection. Z. Phys., 216: 398-410. Ou, S.H., Wu, M.C., Chou, T.C., Liu, C.C. 2004. Polyacrylamide gels with electrostatic functional groups for the molecular imprinting of lysozyme. Anal. Chim. Acta, 504:163-166. Özcan, A.A., Say, R., Denizli, A., Ersöz, A. 2006. L-histidine imprinted synthetic receptor for biochromatography applications. Anal. Chem. 78: 7253–7258. Panasyuk, T. L., Mirsky, V. M., Piletsky, S. A., Wolfbeis, O. S. 1999. Electropolymerized molecularly imprinted polymers as receptor layers in capacitive chemical sensor. Anal. Chem., 71: 4609-4613. Pang, X.,Cheng, G., Li, R., Lu, S., Zhang, Y. 2005. Bovine serum albumin-imprinted polyacrylamide gel beads prepared via inverse-phase seed suspension polymerization. Anal. Chim. Acta, 550: 13–17 Pang, X., Cheng, G., Lu, S., Lang, E. 2006a. Synthesis of polyacrylamide gel beads with electrostatic functional groups for the molecular imprinting of bovine serum albumin. Anal. Bioanal. Chem., 384: 225–230 Pang, X., Cheng, G., Zhanga, Y., Lu, S. 2006b. Soft-wet polyacrylamide gel beads with the imprinting of bovine serum albumin. React. & Func. Polym., 66: 1182–1188 194 Parmpi, P., Kofinas, P. 2004. Biomimetic glucose recognition using molecularly imprinted polymer hydrogels. Biomaterials , 25(10):1969-1973. Pauling, L. 1940. A Theory of the Structure and Process of Formation of Antibodies. J. Am. Chem. Soc., 62: 2645-2655. Peppas, N.A., Huang, Y., Torres-Lugo, M., Ward, J.H., Zhang, J. 2000. Physiocochemical foundations and structural design of hydrogels in medicine and biology. Annu. Rev. Biomed. Eng., 2: 9-29. Peppas, N. A. 2002. Intelligent biomaterials in protein delivery, molecular imprinting and micropatterning. Proc. Controlled Release Soc., 29: 162-163. Percival, C.J., Stanley, S., Galle, M., Braithwaite, A., Newton, M.I., McHale, G., Hayes, W. 2001. Molecular-imprinted, polymer-coated quartz crystal microbalances for the detection of terpenes. Anal Chem., 73: 4225–4228. Percival, C.J., Stanley, S., Braithwaite, A., Newton, M.I., McHale, G. 2002. Molecular imprinted polymer coated QCM for the detection of nandrolone. Analyst, 127: 1024–1026. Peter, C., Meusel, M., Grawe, F., Katerkamp, A., Cammann, K., Borchers, T. 2001. Optical DNA-sensor chip for real-time detection of hybridisation events. Fresenius J Anal Chem., 371:120-127. Piacham, T., Josell, A., Arwin, H., Prachayasittikul, V., Ye, L. 2005. Molecularly imprinted polymer thin films on quartz crystal microbalance using a surface bound photo-radical initiator. Anal Chim Acta., 536: 191–196. Piletsky, S.A., Piletska, E.V., Bossi, A., Karim, K., Lowe, P., Turner, A.P.F. 2001. Substitution of antibodies and receptors with molecularly imprinted polymers in enzyme-linked and fluorescent assays. Biosensensors & Bioelectronics, 16: 701-707. Piletsky, S.A., Turner, A.P.F. 2002. Electrochemical sensors based on molecularly imprinted polymers. Electroanalysis, 14: 317-323. Piletsky, S.A., Turner W.N., Laitenberger, P. 2006. Molecularly imprinted polymers in clinical diagnostics-Future potential and existing problems. Medical Engineering & Physics., 28: 971-977. Pugliese, L., Coda, A., Malcovati, M., Bolognesi, M. 1993. 3-Dimensional Structure of the Tetragonal Crystal Form of Egg-White Avidin in Its Functional Complex with Biotin at 2.7-Angstrom Resolution. J. Mol. Biol., 231(3): 698-710. Qin, M., Hou, S., Wang, L.K., Feng, X.Z., Wang, R., Yang, Y.B., Wang, C., Yu, L., Shao, B., Qiao, M.Q. 2007. Two methods for glass surface modification and their application in protein immobilization. Colloids Surf. B., 60: 243–249. 195 Rachkov, A., Minoura, N. 2000. Recognition of oxytocin and oxytocin-related peptides in aqueous media using a molecularly imprinted polymer synthesised by the epitope approach. Journal of Chromatography A, 889: 111-118. Rachkov, A., Minoura, N. 2001. Towards molecularly imprinted polymers selective to peptides and proteins. The epitope approach. Biochimica and Biophysica Acta. Protein Structure and Molecular Enzimology, 1544: 255-266. Rachkov, A., Hu, M.J., Bulgarevich, E. 2004. Molecularly imprinted polymers prepared in aqueous solution selective for [Sar(1),Ala(8)]angiotensin II. Analytica Chimica Acta, 504: 191-197. Raitman, O.A., Arslanov, V.V., Pogorelova, S.P., Kharitonov, A.B. 2003. Molecularly imprinted polymer matrices for analysis of the cofactor NADH: a surface plasmon resonance study. Dokl. Phys. Chem., 392: 256-258. Raitman, O.A., Chegel, V.I., Kharitonov, A.B., Zayats, M., Katz, E., Willner, I. 2004. Analysis of NAD(P)+ and NAD(P)H cofactors by means of imprinted polymers associated with Au surfaces: A surface plasmon resonance study. Anal. Chim. Acta, 504: 101-111. Ramanavieius, A., Herberf, F.W., Hutschenreiter, S., Zimmermann, B., Lapenaite, I., Kausaite, A., Finkelsteinas, A. 2005. Biomedical application of surface plasmon resonance biosensor. Acta Medica Lituanica, 12:1-9. Ramstrom, O., Ye, L., Mosbach, K. 1996. Artificial antibodies to corticosteroids prepared by molecular imprinting. Chem. Biol., 3: 471-477. Rick, J., Chou, T.C. 2005. Imprinting unique motifs formed from protein-protein associations. Analytica Chimica Acta, 542: 26-31. Rick, J., and Chou, T.C. 2006. Using protein templates to direct the formation of thin- film polymer surfaces. Biosens. Bioelectron., 22: 544–549. Sallacan, N., Zayats, M., Bourenko, T., Kharitonov, A.B., Willner, I. 2002. Imprinting of nucleotide and monosaccharide recognition sites in acrylamidephenylboronic acid–acrylamide copolymer membranes associated with electronic transducers. Anal Chem., 74: 702–712. Schlehuber, S., Beste, G., Skerra, A. 2000. A novel type of receptor protein, based on the lipocalin scaffold, with specifity for digohigenin. J. Mol. Biol., 297:1105-1120. Sellergren, B. 1989. Molecular imprinting by noncovalent interactions. Enantioselectivity and binding capacity of polymers prepared under conditions favoring the formation of template complexes. Makromol. Chem., 190: 2703– 2711. Sellergren, B. 2001. Imprinted chiral stationary phases in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A, 906: 227-252. 196 Sener, G., Özgür, E., Yılmaz, E., Uzun, L., Say, R., Denizli, A. 2010. Quartz crystal microbalance based nanosensor for lysozyme detection with lysozyme imprinted nanoparticles. Biosensensors & Bioelectronics 26(2): 815-821. Sergeyeva, T. A., Piletsky, S. A., Brovko, A. A., Slinchenko, E. A., Sergeeva, L. M., Panasyuk, T. L., Elskaya, A. V. 1999. Conductimetric sensor for atrazine detection based on molecularly imprinted polymer membranes.Analyst, 124: 331-334. Shi, H.Q., Tsa, W.B.I., Garrison, M.D., Ferrari, S., Ratner, B.D. 1999. Template imprinted nano-structured surface for protein recognition. Nature, 398:593-597. Shiomi, T., Matsui, M., Mizukami, F., Sakaguchi, K. 2005. A method for the molecular imprinting of hemoglobin on silica surfaces using silanes. Biomaterials, 26 (27): 5564-5571. Singh-Zocchi, M., Hanne, J., Zocchi, G. 2002. Plastic Deformation of Protein Monolayers. Biophys. J., 83: 2211-2218. Slinchenko, O., Rachkov, A., Miyachi, H., Ogiso, M., Minoura, N. 2004. Imprinted polymer layer for recognising double-stranded DNA. Biosensensors & Bioelectronics 20: 1091-1097. Spivak, D.A. 2005. Optimization, evaluation, and characterization of molecularly imprinted polymers. Adv. Drug. Deliv. Rev., 57: 1779-1794. Stephenson, C.J., Shimizu, K.D. 2007.Colorimetric and fluorometric molecularly imprinted polymer sensors and binding assays. Polym. Int., 56: 482-488. Storrow, A.B., Lindsell, C.J., Collins, S.P., Ferman, G.J., Blomkalns, A.L, Williams, J.M, Goldsmith, B., Gibler, W.B. 2006a. Emergency department multimarker point-of-care testing reduces time to cardiac marker results without loss of diagnostic accuracy. Point of Care., 5:132-136. Storrow, A.B., Lindsell, C.J., Han, J.H. 2006b. Discordant cardiac biomarkers: frequency and outcomes in emergency department patients with chest pain. Ann Emerg Med.,48:660-665. Straface, A.L., ,1 John, M.D., Myers, H., 2 Howard, M.D.,, Kirchick, J.,Blick, K.E. 2008. A Rapid Point-of-Care Cardiac Marker Testing Strategy Facilitates the Rapid Diagnosis and Management of Chest Pain Patients in the Emergency Department. Clin. Chem., 129: 788-795. Sun, Y., Yan, F., Yang, W., Sun, C. 2006. Multilayered construction of glucose oxidase and silica nanoparticles on Au electrodes based on layer-by-layer covalent attachment. Biomaterials,27:4042-4049. Sundberg, E.J., Mariuzza, R.A. 2003. Molecular Recognition in Anti Body- Antigen Complexes. Protein Modules and Protein-Protein Interactions, 61: 119-160. 197 Takeuchi, T., Goto, D., Shinmori, H. 2007. Protein profiling by protein imprinted polymer array. Analyst,132: 101–103. Tamayo, F.G., Turiel, E., Martín-Esteban, A. 2007. Molecularly imprinted polymers for solid-phase extraction and solid-phase microextraction: Recent developments and future trends. J. Chromatogr. A, 1152: 32-40. Tan, C.J., Tong, Y.W. 2007. Preparation of superparamagnetic ribonuclease A surface- imprinted submicrometer particles for protein recognition in aqueous media. Anal Chem.,79:299–306. Taniwaki, K., Hyakutake, A., Aoki, T., Yoshikawa, M., Guiver, M.D., Robertson, G.P. 2003. Evaluation of the recognition ability of molecularly imprinted materials by surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. Anal. Chim. Acta, 489: 191-198. Tao, Z.Y., Tehan, E.C., Bukowski, R.M., Tang, Y., Shughart, E.L., Holthoff, W.G., Cartwright, A.N., Titus, A.H., Bright F.V. 2006. Templated xerogels as platforms for biomolecule-less biomolecule sensors. Anal. Chim. Acta., 564: 59–65. Tietz, N.W. 1995. Clinical Guide to Laboratory Tests., Ed., 3rdEdition, W.B. Saunders, Co., 482. Titirici, M.M., Hall, A.J., Sellergren, B. 2002. Hierarchically imprinted stationary phases: Mesoporous polymer beads containing surface-confined binding sites for adenine. Chem. Mater. 14: 21–23. Titirici, M. M., Hall, A. H., Sellergren, B. 2003. Hierarchical imprinting using crude solid phase peptide synthesis products as templates. Chem. Mater. 15: 822–824. Tokareva, I., Tokarev, I., Minko, S., Hutter, E., Fendler, J.H. 2006. Ultrathin molecularly imprinted polymer sensors employing enhanced transmission surface plasmon resonance spectroscopy.Chem. Commun., 31: 3343-3345. Tong, D., Hetenyi, C., Bikadi, Z., Gao, J. P., Hjerten, S. 2001. Some studies of the chromatographic properties of gels (‘artificial antibodies/ receptors’) for selective adsorption of proteins. Chromatographia, 54:7-14. Tulinsky, A. 1996. Molecular Interactions of Thrombin. Semin. Thromb. Hemost., 22 (2): 117-124. Turiel, E., Martin-Esteban, A. 2005. Molecular imprinting technology in capillary electrochromatography. J. Sep. Sci., 28: 719-728. Turkewitsch, P., Wandelt, B., Darling, G. D., Powell, W.S. 1998. Fluorescent Functional Recognition Sites Through Molecular Imprinting. A Polymer-Based Fluorescent Chemosensor for Aqueous cAMP. Anal. Chem., 70(10): 2025-2030. 198 Turner, N.W, Wright, B.E., Hlady, V., Britt, D.W. 2007a. Formation of protein molecular imprints within Langmuir monolayers: A quartz crystal microbalance study. J. Colloid Interface Sci., 308: 71–80. Turner, N.W., Liu, X., Piletsky, S., Hlady, V., Britt, D. 2007b. Recognition of conformational changes in α-lactoglobulin by molecularly imprinted thin films. Biomacromolecules, 8: 2781-2787. Uludag, Y., Piletsky, A.S., Turner, A.P.F., and Matthew A. Cooper, A.M. 2007. Piezoelektrik sensors based on molecular imprinted polymers for dedection of low molecular mass analytes. FEBS Journal, 274: 5471-5480. Umpleby, R.J., Baxter, S.C., Chen,Y., Shah, R.N., Shimizu, K.D., 2001. Characterization of molecularly imprinted polymers with the Langmuir–Freundlich isotherm. Anal. Chem., 73: 4584–4591. Uzun, L., Say, R., Ünal, S., Denizli, A. 2009. Production of surface plasmon resonance based assay kit for hepatitis diagnosis. Biosensors and Bioelectronics, 24 (9): 2878– 2884. Vaidya, A.A., Lele, B.S., Kulkarni, M.G., Mashelkar, R.A. 2001. Creating a macromolecular receptor by affinity imprinting. J. Appl. Polym. Sci., 81:1075-1083. Venton, D.L., Gudipati, E. 1995a. Influence of protein on polysiloxane polymer formation: evidence for induction of complementary protein-polymer interactions. Biochim. Biophys. Acta, 1250(2): 126-136. Venton, D.L., Gudipati, E. 1995b. Entrapment of enzymes using organo- functionalized polysiloxane copolymers. Biochim. Biophys. Acta, 1250 (2): 117-125. Vlatakis, G., Andersson, L.I., Muller, R., Mosbach, K. 1993. Drug Assay Using Antibody Mimics Made by Molecular Imprinting. Nature, 361:(6413), 645-647. Watanabe, M., Akahoshi, T., Tabata, Y., Nakayama, D. 1998. Molecular specific swelling change of hydrogels in accordance with the concentration of guest molecules. J. Am. Chem. Soc., 120: 5577-5578. Wei, X., Samadi, A., Husson, S.M., 2005. Synthesis and characterization of molecularly imprinted polymers for chromatographic separations. Sep. Sci.Technol., 40: 109–129. Wei, S., Molinelli, A., Mizaikoff, B. 2007. Imprinted micro- and nanospheres for β- estradiol. Anal. Chem., Biosens. and Bioelectron., 23:201–209. Whitcombe, M.J., Alexander, C., Vulfson, E.N. 2000. Imprinted polymers: Versatile new tools in synthesis. Synlett, 911-923. 199 Wizeman, W. J.; Kofinas, P. 2001. Molecularly imprinted polymer hydrogels displaying isomerically resolved glucose binding. Biomaterials, 22: 1485-1491. Wolf, A., Pillay, V. 1969. Renal concentration tests; osmotic pressure, specific gravity, refraction and electrical conductivity compared. Am. J. Med., 46: 837-843. Wong, S.S. 1996. Strategic utilization of cardiac markers for diagnosis of acute myocardial infarction. Ann. Clin. Lab. Sci., 26:301-312,. Wu, A.H., Syu, M.J. 2006. Synthesis of bilirubin imprinted polymer thin film for the continuous detection of bilirubin in an MIP⁄QCM⁄ FIA system. Biosens Bioelectron., 21: 2345–2353. Wulff, G., Sarhan, A. 1972. Über die Anwendung von enzymanalog gebauten Polymeren zur Racemattrennung. Angew. Chem., 84(8): 364. Wulff, G. 1995. Molecular imprinting in cross-linked materials with the aid of molecular templates-a way towards artificial antibodies. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34:1812-1832 Wulff, G. 2002. Enzyme-like catalysis by molecularly imprinted polymers. Chem. Rev., 102: 1-27. Xia, Y.Q., Guo, T.Y., Song, M.D., Zhang, B.H., Zhang, B.L. 2005. Hemoglobin recognition by imprinting in semi-interpenetrating polymer network hydrogel based on polyacrylamide and chitosan. Biomacromolecules, 6: 2601–2606. Yan, H., Row, H.K. 2006. Characteristic and synthetic approach of molecularly imprinted polymer. Int. Jour. Mol. Sci., 7: 155-178 Ye, L., Haupt, K. 2004a. Molecularly imprinted polymers as antibody and receptor mimics for assays, sensors and drug discovery. Anal. Bioanal. Chem., 378, 1887-1897. Ye, L., Haupt, K. 2004b. Molecularly imprinted polymers as recognition elements in sensors. Anal. Bioanal. Chem., 378: 1887-1897. Yılmaz, E., Haupt, K., Mosbach, K. 2000. The use of immobilized templates-a new approach in molecular imprinting. Angew. Chem. Int. Ed., 39(12): 2115-2118. Yılmaz, F., Bereli, N., Yavuz, H., Denizli, A. 2009. Supermacroporous hydrophobic affinity cryogels for protein chromatography. Biochemical Engineering Journal, 43(3):272-279. Yoshikawa, M., Guiver, M.D., Robertson, G.P. 2005a. Molecularly imprinted films derived from Torlon® polyamide–imide. J. Mol. Struct., 739, 41-46. 200 Yoshikawa, M., Hotta, N., Kyoumura, J., Osagawa, Y., Aoki, T. 2005b. Chiral recognition sites from carbonyl-dioxyglyceryl moiety by an alternative molecular imprinting. Sens. Actuat. B Chem., 104: 282-288. Yu, J.C.C., Lai, E.P.C. 2005. Interaction of ochratoxin A with molecularly imprinted polypyrrole film on surface plasmon resonance sensor React. Funct. Polym., 63: 171- 176. Zeder-Lutz, G., Zuber, E., Witz, J., Van Regenmortel, M. 1997. Thermodynamic analysis of antigen-antibody binding using biosensor measurements at different temperatures Anal. Biochem., 246: 123-132. Zenkiewicz, M. 2007. Methos for the calculation of surface free energy of solids. Journal of Achievements in Materials and manufacturing Engineering, 24(1): 137-145. Zhang, L., Cheng, G., Fu, C. 2002. Molecular selectivity of tyrosine-imprinted polymers prepared by seed swelling and suspension polymerization. Polym. Int., 51(8): 687-692. Zhang, S., Yang, W., Niu, Y., Sun, C. 2004a. Multilayered construction of glucose oxidase on gold electrodes based on layer-by-layer covalent attachment. Anal. Chim. Acta, 523: 209-217. Zhang, Q.Y., Tao, M.L., Shen, W.D., Zhou, Y.Z., Ding, Y., Ma, Y., Zhou, W.L. 2004b. Immobilization of L- asparaginase on the microparticles of the natural silk sericin protein and its characters. Biomaterials, 25: 3751-3759. Zhang, F.J., Cheng, G.X., Ying, X.G. 2006a. Emulsion and macromolecules templated alginate based polymer microspheres. React. & Func. Polym., 66: 712–719. Zhang, Z.H., Long, Y.M., Nie, L.H., Yao. S.Z. 2006b. Molecularly imprinted thin film self-assembled on piezoelectric quartz crystal surface by the sol-gel process for protein recognition. Biosens. Bioelectron., 21, 1244–1251. Zhang, M.,Wu, Y., Feng, X., He, X.,Chen, L.Zhang, Y. 2010. Fabrication of mesoporous silica-coated CNTs and application in size-selective protein separation. J. Mater. Chem.,20: 5835–5842. 201 EKLER Ek-1: Protein baskılama alanında yapılmış çalışmalar Ek:2: Protein baskılamanın tarihsel gelişimi 202 Ek-1. Protein baskılama alanında yapılmış çalışmalar Tür Referans Protein Polimer bileşimi Fonksiyonel Baskılama Ayırma/ Tayin Afinite Seçicilik etkileşim yöntemi yöntemi Hemoglobin Lizozim Sitokrom c Akrilamid, N,N’- Çok sayıda Poliakrilamid Hjerten ve ark. İnsan büyüme metilenbisakrilamid zayıf jel temelli Kromatografi Değişken Değişken 1997, hormonu elektrostatik polimerler Liao ve ark. 1996 Transferin bağ miyoglobin Burow ve Minoura N,N’-1,2 dihidroksi- Silika 1996, Hirayama ve Glukoz oksidaz etieln-bis(akrilamid), Yoğun kürelerin Kesikli bağlanma 0,577 mg glukoz Glukoz oksidaz için ark. 1998, Hirayama Lizozim N,N’-metilen elektrostatik akrilat temelli Enzim aktivitesi testi oksidaz/g polimer; denenmemiştir. Lizozimin ve ark. 2001 bisakrilamid,akrilami etkileşim polimer ile QCM 0,8 mg/mL lizozim seçiciliği hemoglobin ile d,akrilik asid modifikasyonu (QCM) denenmiştir Akrilamid,metakrilik Elektrostatik Poliakrilamid Ou ve ark. 2004 Lizozim asit,2-(dimetilamino) etkileşim jel temelli Çözelti deplesyonu %12,5-43,8 1,34-3,38 etil metakrilat polimerler Enzim ligand Afinite ayırma Tripsin Akrilamid,N,N’- etkileşimleri ve moleküler Vaidya ve ark. 2001 Kimotripsin metilenbisakrilamid, ve çok sayıda baskılamanın Çözelti deplesyonu 0,7 mg /g polimer Tripsin için 2,92 N-akriloil para- zayıf birleşimi aminobenzamidin elektrostatik etkileşim 203 A k r i l a t k i m y a s ı Sığır serum Metakrilik asit, N-[3- Ortak HPLC ile Kalıp molekülün albumini (dimetil amino) elektrostatik doğrudan Kromatografi geri bağlanma Düşük oranda bile çapraz Huang ve ark. 2005 Lizozim propil] metakrilamid etkileşimler ayırma için oranı yüksektir reaksiyon gözlenmiştir. amfoterik polimer Akrilamid Guo ve ark.2004, Elektrostatik matriks içeren HPLC, çözelti Adsorbsiyon 42,7 (hemoglobin) Muzzarelli ve ark. Hemoglobin Akrilamid etkileşim makrogözenek azalması kapasitesi 12 mg/g 1,41 (sığır serum albumini) 1998, Guo ve ark. li kitosan 2005 küreler Direkt olarak silan kaplı Sığır albumini ile Glad ve ark. 1985 Transferrin Borat-silan Çoklu hidrojen silika Kromatografi Gösterilmemiş karşılaştırıldığında kompleksi bağları partiküller baskılama faktörü 2,16 üzerine protein baskılama Geleneksel Üreaz 3-aminopropil Çoklu hidrojen baskılanmış % 60-90 geri Bağlanma faktörü 1,5 Venton ve Gudipati Sığır serum trietoksisilan, bağları monolit Çözelti azalması bağlanma 1995a albumini tetraetilortosilikat 3-aminopropil Hemoglobin trietoksisilan, Çoklu hidrojen Modifiye Çözelti deplesyonu Doğrudan Hemoglobin ile bir çok Shiomi ve ark. 2005 propiltri-metoksi bağları silika yüzeyi ölçülmemiştir yarışmacı protein silan denenmiştir 204 S o l - j e l Metal-şelat Silika Ribonükleaz A, oluşturucu monomer, pariküllerin Kapasite faktörü Ribonikleaz A ve lizozim Kempe ve ark. 1995 Lizozim N-(4-vinil)-benzil Metal-şelat spesifik Kromatografi 5,79 arasında 2,35 iminodiasetikasit monomer ile kaplanması Hemoglobin Moleküler Horse radish Tersinir baskılanmış peroksidaz 3-aminofenil boronik kovalent ve polimerler Çözelti azalması Değişken Değişken Piletsky ve ark. 2001 Mikoperoksidaz asit elektrostatik polistiren Bossi ve ark. 2001 Laktoperoksidaz etkileşimler plaklar üzerine graft edilmesi Tersinir QCM sensör kovalent ve yüzeyine QCM Rick and Chou 2005 Lizozim 3-aminofenil boronik elektrostatik graftlama mikrokalorimetri Değişken Değişken Sitokrom c asit etkileşimler 205 M i k r o p l a k y ü z e y i n e M i k r o p l a k y ü z e y i n e M e t a l ş e l a t a ş ı l a m a a ş ı l a m a y a k l a ş ı m ı C-Reactive protein, Lizozim, O-(4-nitrofenil- Enzim ligand Disakkarit İnsan serum posforil) kolin/ etkileşimi, tabakalrı ile Chou ve ark. 2005 albumini, PEG400dimetakrilat hidrojen bağı, kaplı ELISA ve radio 3,78 ng/cm2 CRP 0,08 ng/cm2 HSA Shi ve ark. 1999 Sığır serum disakkarit kaplanmış hidrofobik proteinler ile işaretleme 2,66 μg/ cm2 HSA 0,27 μg/ cm2 CRP Shi ve ark. 2000 albumini, hekzafloropropilen etkileşimler ve mikro-temas Lizozim, Van der Waals yaklaşımı Ribonükleaz A, kuvvetleri IgG, Fibrinogen Sığır serum albumini Yüzey Hemoglobin Akrilamid , N,N’- Elektrostatik baskılama Baskılanmış % 50 Sığır albumini ile insan Li ve ark. 2006 Sitokrom C metilenbisakrilamid etkileşimler metoduyla Çözelti azalması hemoglobin albuminini ayırabilmektedir Horse radish nanotellerinm Kontrol % 6,8 peroksidaz hazırlanması N-metakriloil-(L)- Metal-şelat Yüzey Çözelti azalması Sitokrom c- Ribonükleaz Özcan ve ark. 2006 Sitokrom c histidin, etilenglikol etkileşimi baskılama Ribonükleaz kullanılmıştır dimetakrilat (FPLC) ayırma faktörü 1,39 206 N a n o t e k n i k l e r v e e p i t t p o y a k l a ş ı m ı Anjiyotensinin Rachkov ve Minoura Anjitensin Sodyum Antijen peptid zincir Ortam koşullarına bağlı 2000, Rachkov ve oktapeptid akrilat/poli(etien antibadi seçiciliği ve Kromatografi 0,4 μg /mL olarak 19,2-2,10 Minoura 2001, glikol) diakrilat etkileşimi epitop Rachkov ve ark. yaklaşımı 2004 Sitokrom c Akrilamid, N,N’- Peptid epitop Sığır serum metilenbisakrilamid, Kolektif ile SDS-PAGE, kütle 22,4 pmol/cm2 Hedef protein ve protein Nishino ve ark. 2006 albumini polietilen glikol 200- hidrojen baskılanarak spektromertesi sitokromc, karışımı için gösterilmiştir Alkol diakrilat bağları hazırlanmış diğerleri için dehidrojenaz ince film gösterilmemiştir 207 Ek-2. Protein baskılamanın tarihsel gelişimi Yıl Ülke Baskılama metodu Sonuç Referans 1985 İsveç 2D Sol jel Protein baskılamaya yönelik ilk çalışma olup silan modifiye silika partiküller yüzeyine Glad ve ark. 1985 doğrudan baskılama işlemi yapılmıştır. 1994 USA 2D Metal-Şelat Metal iyonları taşıyan fonksiyonel kollardan hazırlanan sentetik reseptörlerin Malik ve ark. 1994 proteinlerin fonksiyonel gruplarına seçici olarak bağlandığı kanıtlanmıştır. 1995 İsveç 2D Metal-Şelat Silika partiküller metal-şelat oluşturma yeteneğine sahip monomerler ile kaplandı. Kempe ve ark. 1995 1995 USA 3D Sol-jel Organik silan monomerleri kullanılarak geleneksel metodla baskılanmış monolit Venton ve Gudipati 1995b hazırlanmıştır. 1996 İsveç 3D Akrilat kimyası Poliakrilamid jel temelli polimerler hazırlanmıştır. Liao ve ark. 1996 1996 Japonya 2D Akrilat Kimyası Silika kürelerin akrilat temelli polimer ile modifikasyonu yapılmıştır. Burow ve Minoura 1996 1999 USA Nanoyapılı ince Disakkarit tabakası ile kaplı protein varlığında nanofilm hazırlanmıştır. Shi ve ark. 1996 filmler 2000 İngiltere 2D APBA kimyası Moleküler baskılanmış polimerler polistiren mikroplaklara graft edilmiştir. Piletsky ve ark. 2000 2000 Japonya 2D Epitop yaklaşımı Proteinin yüzeyinde yer alan peptid kalıp olarak kullanılmıştır. Rachkov ve Minoura 2000 2001 Hindistan 3D Akrilat kimyası Seçiciliği arttırmak için çapraz bağlayıcı konsantrasyonunun optimizasyonu Vaidya ve ark. 2001 2001 İsveç 3D Akrilat kimyası Potansiyel monomerler/jeller ile protein etkileşimlerin UV ile hızlı bir şekilde Tong ve ark. 2001 izlenmesine ilişkin öncü çalışmalar yapılmıştır. 2002 Çin 3D Akrilat kimyası Yüklü fonksiyonel monomerler bir araya getirilmiştir. Ou ve ark. 2004 (Tayvan) 208 2004 Çin 3D Akrilat kimyası Düşük kararlılık ve düşük yoğunluklu polimerin elde edilmesi gibi problemleri ortadan kaldırmak için poliakrilamid jel ile modifiye edilmiş gözenekli kitosan küreler Guo ve ark. 2004 kullanılmıştır. 2005 İngiltere 3D Akrilat kimyası Protein kalıbı yapıdan uzaklaştırmadaki zorlukları ortadan kaldırmak için yıkama Hawkins ve ark. 2005 işleminin optimizasyonu yapılmıştır. 2005 Çin 3D Akrilat kimyası Seçiciliği arttırmak için gözenek yapıcı maddeler kullanılmıştır Huang ve ark. 2005 2005 Çin 2D APBA kimyası İki protein aynı anda baskılanmıştır. Rick ve Chou 2005 (Tayvan) 2005 Çin 2D APBA kimyası İnce polimerik filmlerin hazırlanmasında mikrotemas baskılama yöntemi Chou ve ark. 2005 (Tayvan) geliştirilmiştir. 2005 Japonya 2D sol-jel Yüzey baskılama yöntemi kalıp molekülün sabit bir yüzeye immobilizasyonu yöntemi Shiomi ve ark. 2005 ile birleştirilmiştir. 2006 Çin 3D Akrilat kimyası Seçiciliği arttırmak için ters faz süspansiyon polimerizasyonu proteinlerin baskılamaya Pang ve ark. 2005 uyarlanmıştır. 2006 Çin Polimerik nanoteller Yüzey baskılama tekniği kullanılarak polimer nanoteller hazırlanmıştır. Li ve ark. 2006 2006 Çin 2D Akrilat kimyası Proteinlerin baskılanmasında uygun çapraz bağlayıcının seçilmesi için izotermal Hsu ve ark. 2006 (Tayvan) titrimetrik kalorimetri kullanılmıştır. 209 ÖZGEÇMİŞ Adı ve Soyadı Bilgen OSMAN Doğum Yeri ve Tarihi Bursa, 1978 Yabancı Dili İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise Yıldırım Beyazıt Lisesi, 1994 Lisans U.Ü. Fen-Edebiyat Fak. Kimya Bölümü,1998 Yüksek Lisans U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, 2004 Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl U.Ü. Fen-Edebiyat Fak. Kimya Bölümü, 2000- Devam ediyor İletişim (e-posta) bilgeno@uludag.edu.tr 210 Form No: D-10 ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ TEZ ÇOĞALTMA VE ELEKTRONİK YAYIMLAMA İZİN FORMU Yazar Adı Soyadı Bilgen OSMAN Tez Adı Miyoglobin Tayinine Yönelik Moleküler Baskılanmış Yüzey Plazmon Rezonans Biyosensör Hazırlanması Enstitü Fen Bilimleri Anabilim Dalı Kimya Tez Türü Doktora Tez Danışman(lar)ı Prof.Dr.Necati Beşirli , Prof.Dr.Adil Denizli (2.Danışman) Çoğaltma (Fotokopi Çekim) izni Tezimden fotokopi çekilmesine izin veriyorum Tezimin sadece içindekiler, özet, kaynakça ve içeriğinin % 10 bölümünün fotokopi çekilmesine izin veriyorum Tezimden fotokopi çekilmesine izin vermiyorum Yayımlama izni Tezimin elektronik ortamda yayımlanmasına izin Veriyorum Tezimin elektronik ortamda yayımlanmasının ertelenmesini istiyorum 1 yıl 2 yıl 3 yıl Tezimin elektronik ortamda yayımlanmasına izin vermiyorum Hazırlamış olduğum tezimin belirttiğim hususlar dikkate alınarak, fikri mülkiyet haklarım saklı kalmak üzere Uludağ Üniversitesi Kütüphane ve Dokümantasyon Daire Başkanlığı tarafından hizmete sunulmasına izin verdiğimi beyan ederim. Tarih : İmza : 211 212