T. C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI GIDALARDAN İZOLE EDİLEN STAPHYLOCOCCUS AUREUS’ LARIN ENTEROTOKSİJENİK ÖZELLİKLERİ VE FARKLI ANTİBİYOTİKLERE DUYARLILIKLARININ SAPTANMASI Özlem ASLAN Doç. Dr. Mihriban KORUKLUOĞLU (Danışman) YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI BURSA- 2012 T. C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAZI GIDALARDAN İZOLE EDİLEN STAPHYLOCOCCUS AUREUS’ LARIN ENTEROTOKSİJENİK ÖZELLİKLERİ VE FARKLI ANTİBİYOTİKLERE DUYARLILIKLARININ SAPTANMASI Özlem ASLAN YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 27/06/2012 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/ oy çokluğu ile kabul edilmiştir. Doç. Dr. Mihriban KORUKLUOĞLU Doç. Dr. Ramazan DOĞAN Danışman Yrd. Doç. Dr. Ayşegül KUMRAL TEZ ONAYI Özlem Aslan tarafından hazırlanan “ Bazı gıdalardan izole edilen Staphylococcus aureus’ ların enterotoksijenik özellikleri ve farklı antibiyotiklere duyarlılıklarının saptanması” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/ oy çokluğu ile Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ/DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Doç. Dr. Mihriban Korukluoğlu Başkan: Doç. Dr. Mihriban Korukluoğlu Uludağ Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Üye: Doç. Dr. Ramazan Doğan Uludağ Üniversitesi Tarla Bitkileri Anabilim Dalı Üye: Yrd. Doç. Dr. Ayşegül Kumral Uludağ Üniversitesi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof. Dr. Kadri ARSLAN Enstitü Müdürü 27/07/2012 Bilimsel Etik Bildirim Uludağ Üniversitesi Fen bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; -tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, -görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, -başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, -atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, -kullanılan verilerde herhangi bir tahfirat yapmadığımı, -ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 23/ 07/ 2012 Özlem Aslan ÖZET Yüksek Lisans Tezi BAZI GIDALARDAN İZOLE EDİLEN STAPHYLOCOCCUS AUREUS’ LARIN ENTEROTOKSİJENİK ÖZELLİKLERİ VE FARKLI ANTİBİYOTİKLERE DUYARLILIKLARININ SAPTANMASI Özlem ASLAN Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Mihriban KORUKLUOĞLU Micrococcaceae familyasında yer alan Staphylococus cinsinin üyesi olan Staphylococcus aureus insanlarda gıda zehirlenmelerinde önemli mikroorganizmalardan biridir. Gıda işletmeleri ile kurumlara ait büyük mutfaklarda hijyen eksikliğinin göstergesi olarak kabul edilir. Materyal olarak; 31 adet şarküteri ürünü, 10 adet dondurulmuş hazır köfte, 5 adet dondurulmuş et döner, 30 adet hazır yemek, 25 adet yaş pasta, 45 adet peynir, 28 adet dondurma ve 16 adet sütlü tatlı olmak üzere toplam 190 örnek kullanılmıştır. S.aureus analizi için Baird Parker (Oxoid CM0275) Agar kullanılmıştır. Sayısı 10³ kob/g’ın üzerinde olan örneklerin enterotoksin analizi, VİDAS Staph enterotoksin II (SET2; Biomerieux. REF 30 705 enzim bağlantılı floresans tekniği kullanılarak yapılmıştır. Ayrıca toksin varlığı saptanan gıdalardan izole edilen S. aureus suşunun vancomycin ve cefsulodin’e karşı duyarlılığı incelenmiştir. S. aureus açısından incelenen 190 adet gıda örneğinin 47’si (%24,7) pozitif olarak 3 saptanmıştır. Düzeyi 1,0x10 kob/g’dan fazla olan 11 adet (%5,78) örnek enterotoksin içeriği açısından incelenmiş ve sadece 6’sında pozitif sonuç elde edilmiştir. İzole edilen 6 farklı S. aureus suşunun antibiyotik duyarlılık testi sonucunda da cefsulodin’e karşı duyarlılığın, vancomycin’e karşı olan duyarlılıktan daha fazla olduğu saptanmıştır. Anahtar kelimeler: Staphylococcus aureus, gıda intoksikasyonu, gıda zehirlenmeleri, enterotoksin, mikrobiyoloji, hazır yemek, Vidas elfa, vancomycin, cefsulodin 2012, vii + 34 sayfa i ABSTRACT MSC Thesis IDENTIFICATION OF ENTEROTOXIGENIC PROPERTIES and ANTIBIOTIC SENSITIVITY OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS ISOLATED FROM SOME FOODS Özlem ASLAN Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Doç. Dr. Mihriban KORUKLUOĞLU Staphylococcus aureus, which is the member of Staphylococcus geneus in the family of micrococcaceae, is the important causitive agent in food poisoning. Occurance of S. aureus in foods is an indicator of deficieny of hygen in food processing factory and big kitchens. Total 190 samples, which were 31 delicatessen product, 10 frozen ready meatballs, 5 roasted rolling meat, 30 ready to eat food, 25 cake with cream, 45 cheese, 28 ice cream and 16 desert with milk, were used. Baird parker agar (Oxoid CM0275) was used for S. aureus analysis. Samples, which has the S. aureus higher than 10³ cfu/g, were studied for enterotoxins analysis with VİDAS Staph enterotoxin II (SET2; Biomerieux. REF 30 705) enzyme linked fluorescence analysis technique (AOAC 070404/2007:06). In addition; the sensitivity of S. aureus, which was isolated from enterotoxin positive foods, was stated against to vancomycin and cefsulodin. Finally, 47 (24,7%) of 190 samples were found as S. aureus positive. 11 Samples 3 (5,78%) has S. aureus higher than 1,0x10 cfu/g,was analysed for enterotoxins and only 6 of them were found positive. The sensitivity of 6 different S. aureus, isolated from different foods, aganist to cefsulodin was found much higher than sensitivity to vancomycin. Key words: Staphylococcus aureus, food intoxications, food poisoning, enterotoxin, microbiology, ready to eat foods, Vidas elfa, vancomycin, cefsulodin 2012, vii + 34 page ii TEŞEKKÜR Tezimin tüm aşamalarında büyük yardımlarını ve desteğini gördüğüm, değerli bilgilerinden yararlandığım Danışman Hocam Sayın Doç. Dr. Mihriban KORUKLUOĞLU’na, çalışmalarım sırasında yardımlarını esirgemeyen takım arkadaşım Ziraat Mühendisi Duygu BEKTAŞ’ a, bölümümüzün değerli öğretim üye ve elemanlarına ve bugünlere gelmemde her türlü desteği sağlayan aileme teşekkür, saygı ve sevgilerimi sunarım. Özlem Aslan 23/ 07/ 2012 iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET………………………………………………………………………….... i ABSTRACT……………………………………………………………………. ii TEŞEKKÜR……………………………………………………………………. iii SİMGE ve KISALTMALAR DİZİNİ………………………………………….. v ŞEKİLLER DİZİNİ…………………………………………………………….. vi ÇİZELGELER DİZİNİ…………………………………………………………. vii 1. GİRİŞ………………………………………………………………………... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ…………………………………………………….. 4 3. MATERYAL ve YÖNTEM………………………………………………. 10 3.1. Materyal………………………………………………………………......... 10 3.2. Yöntem…………………………………………………………………….. 11 3.2.1.Staphylococcus aureus saptanması……………………………………… 11 3.2.2. Staphylococcus aureus enterotoksinlerinin saptanması…………………. 11 3.2.3. Antibiyotik duyarlılığının saptanması…………………………………… 12 4.BULGULAR ve TARTIŞMA……………………………………………… 13 4.1. Staphylococcus aureus Saptanmasıyla İlgili Bulgular…………………….. 13 4.2. Staphylococcus aureus Enterotoksinlerinin Saptanmasıyla İlgili 17 Bulgular…………………………………………………………………..... 4.3. Antibiyotik Duyarlılığının Saptanmasıyla İlgili Bulgular…………………. 22 5. SONUÇ ve ÖNERİLER……………………………………………………. 27 KAYNAKLAR…………………………………………………………………. 28 ÖZGEÇMİŞ…………………………………………………………………….. 33 iv SİMGE ve KISALTMALAR Kısaltmalar Açıklama BPA Baird Parker Agar BHI Brain Heart Infussion E. coli Esherichia coli Kob Koloni oluşturan birim MRSA Metsilin dirençli Staphylococcus aureus MSSA Metsilin duyarlı Staphylococcus aureus NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standarts S. aureus Staphylococcus aureus SEA Staphylococcus aureus enterotoksin A SEB Staphylococcus aureus enterotoksin B SEC Staphylococcus aureus enterotoksin C SED Staphylococcus aureus enterotoksin D QS Quorium sensing v ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 4.1. Cefsulodin uygulanan petrilerde zon oluşumu………………... 25 Şekil 4.2.Vancomycin uygulanan petrilerde zon oluşumu……………... 26 vi ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa 10 Çizelge 3.1. Örnek gruplarının dağılımı……………………………………... 13 Çizelge 4.1. Örnek gruplarında S. aureus varlığı…………………………….. Çizelge 4.2. Örnek gruplarında S. aureus saptanma oranları ve sayım değerleri………………………………………………….. 14 3 Çizelge 4.3. S. aureus içeriği 1,0x10 kob/g’ dan fazla olan gıda örnekleri………………………………………………………… 15 Çizelge 4.4. Örneklerdeki S. aureus sayısı değerleri ve enterotoksin varlığı…………………………………………………………... 18 3 Çizelge 4.5. S. aureus sayısı 1,0x10 kob/g’ dan fazla olan örneklerdeki enterotoksin saptanma oranı…………………………………… 19 Çizelge 4.6. İzole edilen S. aureus suşlarının cefsulodin ve vancomycin’ e karşı İnhibisyon etkinliğinin değerlendirilmesi………………… 23 vii 1.GİRİŞ İnsanların en temel gereksinimlerinden biri beslenmedir. Sağlıklı, yeterli ve dengeli beslenme; bireylerin büyümeleri ve hayatlarının idamesi için, hammaddeden başlayarak sağlıklı olarak elde edilen gıda maddelerinin tüketilmesi ile olur. Gıdalar önceleri evlerde hazırlanmakta ve bunun dışında yemek tüketim alışkanlığı pek gözlenmemekteydi. Ancak günümüz koşullarında kentleşme, artan sanayileşme, çalışan kadın nüfusundaki yoğunluk beraberinde ev dışı ortamlarda gıda tüketimi artışını da getirmiştir. Gıdaların hijyenik olmayan ortam ve koşullarda bekletilerek servise sunulma olasılığının insanlar için önemli bir hastalık riski oluşturabileceği göz ardı edilmemelidir. Dünyada hastalık yükünün önemli bir bölümünü gıda kaynaklı mikrobiyal hastalıklar oluşturmaktadır. Tüm dünya nüfusu içinde her yıl büyük çoğunluğu çocuklar olmak üzere yaklaşık 2,2 milyon kişi gıda ve su kaynaklı hastalıklar nedeniyle yaşamını yitirmektedir (http://www.phd.org.tr/ 14 kongresunum, 2009). CDC’nin (Central for Disease Control and Prevention) verilerine göre 2008 yılında eyaletlerden toplam 1034 gıda kaynaklı hastalık salgını bildirilmiş; bu salgınlarda 23152 hastalık vakası görülmüş, 1276’sı hastaneye yatırılmış ve 22 ölüm meydana gelmiştir (CDC, 2011). Gıda kaynaklı hastalıkların sonuçları sadece sağlık sorunları olmayıp, bunun yanında ciddi işgücü kaybı oluşturmakta ve mali bilançosu da yüksek bir biçimde kendini göstermektedir. Amerika’da 1995 yılında 7 farklı patojenin neden olduğu gıda kaynaklı enfeksiyon maliyetinin 6,5- 35 milyon dolar arasında olduğu tahmin edilmektedir. 1996 yılında İngiltere’de 5 farklı gıda salgınının maliyeti ise 300- 700 milyon sterlin olarak kayıtlara geçmiştir (http://www.phd.org.tr/ 14 kongresunum, 2009). Gıda kaynaklı hastalıkların sebebi genellikle patojenik mikroorganizmalar veya toksinleri ile kontamine olmuş gıdaların tüketilmesidir. Çoğunlukla gastrointestinal semptomlarla kendini gösterirler. Gıda enfeksiyonu ve intoksikasyonu olmak üzere iki ana koldan incelenmektedir. Gıda enfeksiyonlarında hastalık etmeni; gıda ile alınan patojen hücrenin kendisi, intoksikasyonda ise patojen hücrenin salgıladığı toksindir. Bu nedenle gıda zehirlenmelerinin oluşumunda enterotoksin ihtiva eden besinlerin tüketilmesi önemli rol oynamaktadır (Jay 1992, Rosec ve ark.1997). Salmonella türleri, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, enterovirulent E.coli, Campylobacter jejuni ve Listeria monocytogenes gıda kaynaklı rahatsızlığa neden olan mikroorganizmaların başında 1 gelmektedir. Bununla birlikte bu patojenler, gıda kaynaklı hastalıkların toplam tahmini sayısının ancak %19’dan sorumlu bulunmuştur (Ünlütürk ve Turantaş 2003). S. aureus ’un neden olduğu intoksikasyon tipi gıda zehirlenmeleri dünya çapında en yaygın olarak görülen gastroenteritislerden birisi olup; zehirlenmelerde 2. yada 3. sırayı almaktadır (Zhang ve ark. 1998). Gıda kaynaklı mikrobiyolojik hastalıklar içinde stafilokokal gıda zehirlenmeleri payının Amerika’da %14, Macaristan’da % 40 ve Japonya’da %20-25 olduğu tahmin edilmektedir (Tükel ve Doğan 2000) . S. aureus sıcaklığa ve birçok inhibitör etkene dirençli egzotoksinler üretmektedir. Gıdalarda yüksek S. aureus sayısı hem işletmedeki yetersiz sanitasyon koşullarının göstergesi olması sebebiyle hem de enterotoksin içerme ihtimalinin fazlalığı sebebiyle çok büyük önem arz eder. Bunun yanında gıdada düşük S. aureus sayısının saptanmış olması enterotoksin açısından oluşabilecek riski azaltmaz. Gıdaya kontemine olmuş S. aureus’un sentezleyeceği toksinlerin ısıl işlem, inhibitör madde ilavesi ya da su aktivitesini düşürmeye yönelik işlemler vb. ile inaktif olamayacağı ancak mevcut S. aureus’ların sayısında azalma meydana geleceği bilinmektedir. Bu durumda gıdanın tüketimi öncesi yapılacak analizler sonrası temiz olarak değerlendirilen gıda, tüketildiğinde ciddi intoksikasyonlara sebep olabilir (Ünlütürk ve Turantaş 2003). Dolayısı ile bir gıdanın S. aureus açısından incelenmesi durumunda olası koşullar nedeni (ısıl işlem, soğukta saklanma vb.) ile mutlaka toksin mevcudiyeti de aranmalıdır. S. aureus, değişik antibiyotiklere karşı farklı yollardan direnç göstermektedir. Genetik olarak çok yönlü olmaları bu direncin altyapısının oluşumunda çok önemli rol oynamaktadır (Lina ve ark. 1999). Penisilinin tedavi amaçlı kulanılmaya başlandığı 1945 yılından itibaren S. aureus suşlarında beta-laktamaza bağlı penisilin direnci hızla artmıştır. 1960 yılında penisilinaza dayanıklı yarı sentetik bir penisilin olan metisilinin kullanıma girmesiyle birlikte bir yıl içinde metisiline dirençli S. aureus (MRSA) suşları Avrupa’da saptanmaya başlanmıştır. İlk “epidemik MRSA” suşu 1980’de İngiltere’de tanımlanmış ve ardından farklı coğrafik bölgelerden de dirençli suşlar bildirilmeye başlanmıştır. Günümüzde MRSA tüm dünyada hastane infeksiyonu etkenleri arasında önemli bir sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. S. aureus suşlarının farklı antibiyotiklere karşı direnci ve antibiyotik varlığının toksin sentezi üzerine etkileri ile ilgili çalışmalar halen devam etmektedir ( Şengöz ve ark. 2004). 2 Bu çalışmada gıda intoksikasyonları yönünden büyük önem arz eden S. aureus ve enterotoksinlerinin farklı gıdalardaki varlığı araştırılarak tüketici sağlığı yönünden güvenilirliğin saptanması amaçlanmıştır. Aynı zamanda, S. aureus’un cefsulodin ve vancomycin’e karşı antibiyotik duyarlığı belirlenerek literatüre veri sağlanması planlanmıştır. 3 2. KAYNAK ÖZETLERİ İnsanlarda gıda zehirlenmelerinde Micrococcaceae familyasında yer alan Staphylococus cinsinin üyesi olan S. aureus önemli mikroorganizmalardan biridir (Tunail 2000). Bu bakteri, insanlarda besin zehirlenmelerinin yanısıra septisemi, toksik şok sendromu (TSS), otoimmün hastalıklar ve süt ineklerinde mastitise neden olur (Omoe ve ark. 2004, Stevens ve ark. 2007). S. aureus suşları yüksek toksisiteli ve bağırsaklarda etkili olan enterotoksinleri oluşturarak intoksikasyonlara neden olmaktadır. Gıda ve işletmelerinde, kurumlara ait büyük mutfaklarda bu bakteriye rastlanılması hijyen eksikliğinin göstergesi olarak kabul edilmektedir (Tunail 2000). Staphylococcus aureus; Gr-pozitif, kok, sporsuz, hareketsiz, aerobik ya da fakültatif aerobik, katalaz (+), koagulaz (+), lesitinaz (+) bir bakteridir. Oksijenli ortamı, üreme ve toksin üretme açısından tercih etmektedir. Belay ve Rasooly (2002)’nün çalışmasında aerobik koşullarda 9- 17 kat daha hızlı bir üreme ve toksin sentezi gerçekleştirdiği saptanmıştır. Sporsuz bakteriler arasında dış etkenlere ve dezenfektanlara en fazla dayanan bakteridir. Patojen S. aureus, dört temel özelliği ile tanımlanmaktadır. Bunlar, lesitinaz ve koagulaz aktivitesi, termonükleaz enzimi salgılaması ile enterotoksin oluşturmasıdır. S. aureus salgıladığı lesitinaz enzimi ile yumurta sarısının emülsiyon halinde katıldığı besiyerlerinde lesitini hidrolize ederek koloni etrafında oluşturduğu berrak zon ile tanımlanır (Ünlütürk ve Turantaş, 2003). Koagulaz aktivitesi patojen S. aureus için pozitiftir ve anahtar test niteliğindedir. Koagulaz enzimi ile kandaki fibrinojen, fibrine dönüşerek koagulasyona sebep olur ve tavşan kanı plazması ile tespit yapılabilmektedir. Koagulaz üretimi ile enterotoksin oluşturma arasında yüksek bir korelasyon olup, toksin varlığının gösterilemediği durumlarda koagulaz pozitif S..aureus sayısı önemlidir (Ünlütürk ve Turantaş 2003). Gıdada saptanacak termonükleaz, stafilokok varlığını kanıtlamaktadır. Ancak, enterotoksin varlığının bir göstergesi olmadığı ifade edilmektedir. Termonükleaz ile enterotoksin oluşumu arasında bir ilişkinin olmadığı da bildirilmektedir (Tunail 2000). S. aureus’larda antibiyotik direnci ilk kez 1930’lu yıllarda klinik kullanıma giren sulfonamid grubu antibiyotiklerle başlamış ve günümüzde linezolid, daptomisin gibi yeni antibiyotiklere kadar uzanmaktadır. 1941 yılında kullanılmaya başlayan penisilin G ile S..aureus enfeksiyonlarında oldukça dramatik bir azalma görülmüştür (Stefani ve ark. 2010). 1948’lerde 4 klortetrasiklin, penisiline dirençli S. aureus’lar üzerinde etkili görülmüş ve uzun süre bu antibiyotiğe dirençli suşların sayısında artış gözlenmemiştir (Shanson 1982). Ancak bu durum uzun sürmemiş ve çok kısa bir sure sonra penisilinaz (beta-laktamaz) enzimi sentezleyen izolatların ortaya çıkması sonucunda penisilin direnci görülmeye başlanmıştır (Stefani ve ark. 2010). Penisilinaz varlığı nedeniyle ortaya çıkan direnç sorunu, 1959 yılında beta-laktamaz enzimine dayanıklı yarısentetik bir penisilin olan metisilin ile çözülmüştür. Ancak bu durum uzun sürmemiş ve 1961 yılında İngiltere’de COL izolatı olarak adlandırılan ilk MRSA izolatı tanımlanmıştır. Metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA), ilk kez 1961 yılında tanımlandıktan sonra tüm dünyada önemli bir problem haline gelmiştir. Günümüzde MRSA izolatları hem hastane kaynaklı hem de toplum kaynaklı enfeksiyonlara yol açmaktadır (Culos ve ark. 2011). MRSA enfeksiyonlarının epidemiyolojisinde son yıllarda önemli değişiklikler meydana gelmiştir. Bunlardan birincisi, S. aureus izolatlarında görülen metisilin direnç oranlarındaki artıştır. Yapılan bazı çalışmalarda, yoğun bakım ünitelerinden izole edilen S..aureus izolatlarının yaklaşık %80’i metisiline dirençli saptanmıştır (Ippolito ve ark. 2010). İkinci önemli değişiklik ise MRSA izolatlarında görülen vankomisin duyarlılığındaki azalmadır. Elde edilen izolatların vankomisin MIK değerleri ≤ 2 μg/mL olmak üzere duyarlı sınırlarında olmasına rağmen, bu antibiyotik ile başarısız klinik sonuçlar elde edilmektedir (Stefani ve ark. 2010). Günümüzde MRSA enfeksiyonlarının tedavisinde en sık kullanılan ilaçlar vankomisin ve teikoplanin olmak üzere glikopeptid grubu antibiyotiklerdir. Glikopeptidlerin yanı sıra linezolid, daptomisin ve tigesiklin gibi yeni antibiyotikler de kullanılmaktadır (Stefani ve ark. 2010). Çoklu ilaç direnci gösteren bir patojen olması nedeniyle MRSA’nın önemi büyüktür. Tüm beta-laktam grubu antibiyotiklerin yanı sıra linkozamidler, makrolidler ve aminoglikozidlere karşı da direnç gösterir (Lentino ve ark. 2008). Klinikte en sık kullanılan glikopeptit antibiyotik vankomisindir. Vankomisin ilk kez 1956 yılında Borneo adasında bulunan Streptomyces orientalis’ten izole edilen dar spektrumlu bakterisidal bir antibiyotiktir. İzolasyonundan çok kısa bir süre sonra 1956 yılında saflaştırılarak klinik kullanıma girmiştir. İlk yıllarda kullanılan preparatların saf olmaması ve yan etkilerin sıklığı nedeniyle metisilin kullanıma girdikten sonra önemini yitirmiş, ancak ilk kez 1961’de metisiline dirençli bir Staphylococcus aureus izolatının bildirilmesi ve 1982 yılından beri giderek artan MRSA enfeksiyonlarının ortaya çıkmasıyla birlikte yeniden önem 5 kazanmıştır. Ayrıca vankomisin oral yolla verildiğinde, Clostridium difficile tarafından oluşturulan antibiyotikle ilişkili ishalin tedavisinde de hayli etkilidir. Ancak ülkemizde vankomisinin oral preparatı yoktur. 1989’da ABD’de vankomisine dirençli enterokoklar önemli nozokomiyal patojenler olarak ortaya çıkmışlardır. Vankomisine orta düzeyde dirençli S..aureus (VISA) suşlarına 1996-1997 yıllarında Japonya ve ABD’de saptanmıştır (Lentino ve ark. 2008). S. aureus uygun koşullar altında çoğalmakta ve suşa bağlı olarak toksin oluşturarak intoksikasyon tipi hastalıklara yol açmaktadır Stafilokokal intoksikasyon enterotoksijenik 5 stafilokokların gıdalarda en az 10 kob /g-mL bakteri sayısına ulaşmasından sonra oluştuğu bilinmektedir (Bergdoll 1991). S. aureus enterotoksinleri, basit protein yapısındaki egzotoksinlerdir, yani hücre zarına toksin salınır. S. aureus’un ürettiği toksinler; A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H’den bir veya bir kaçıdır (Halpin-Donhalek ve Marth 1989). Ayrıca, “Toksik şok sendromu toksini” olarak bilinen F toksini de bulunmaktadır (Hobbs 1960). Staphylococcus aureus enterotoksin C1 (SEC1) ve Staphylococcus aureus enterotoksin C2 (SEC2) aynı antikor ile reaksiyona girdiğinden Staphylococcus aureus enterotoksin C (SEC) olarak tanımlanabilirler. Toksinler su ve tuz çözeltilerinde iyi çözünür. Papain, rennin, tripsin, kimotripsin gibi enzimlere ve ısıya karşı dayanıklıdırlar. Termal dayanıklılıkta önemli kriterler toksinin saflığı, serolojik tipi, yaklaşık toksin miktarı, ortam pH’sıdır. Tibana ve ark. (1987) tarafından yapılan bir çalışmada, Staphylococcus aureus enterotoksin A (SEA) ve Staphylococcus aureus enterotoksin B (SEB) toksinlerinin 100˚ C’de 90 dak. yada 120˚ C’de 30 dakikalık ısıl işlemle, SEC toksininin de 100˚ C’de 180′ ya da 120˚ C’de 60′ tamamen inaktif olduğu belirlenmiştir (Tibana ve ark.1987). Sonuç olarak, normal pişirme ve pastorizasyon normları toksin inaktivasyonuna yeterli gelmediği ve pişirme öncesi toksin oluşumu önlenememiş ise gıda zehirlenmesinin kaçınılmaz olduğudur. Tatini (1973), tarafından yapılan çalışmaya göre; ısıl işlem uygulanmış toksinlerin, uygulanmamış olanlara göre daha yüksek biyolojik aktiviteye sahip olduğunu belirlemiştir. Bazı çalışmalarda; laktik asit bakterilerinin; gıdada SEA’nın bulunması durumunda bile üreyebildiği ve laktik asitlerin metabolitlerinin toksinler üstünde inhibe edici özelliğinin olduğu belirtilmiştir (Chordash ve Potter 1976). SEB ve SEC’in sentezi inkübasyon koşullarına bağlıdır ve uygun koşullarda bol miktarda sentezlenir. SEA, SED ve SEE’nin, sentezi ise inkübasyon koşullarına bağlı olmayıp, S..aureus suşunun üremesi ile yakından ilişkilidir ve diğer iki toksine göre daha az 6 sentezlenmektedir (Ünlütürk ve Turantaş 2003). S. aureus’un kremalı pastalardaki gelişme 3 4 5 ve enterotoksin oluşturma özelliklerinin araştırıldığı bir çalışmada; kremalar 10 - 10 - 10 kob/g düzeyinde S. aureus ile kontamine edilmiş ve bundan üretilen pastalar 4, 10, 18, 25 ve 30˚ C sıcaklıklarda muhafaza edilmiş ve 2, 6, 12, 24 ve 48 saat aralıklarla mikrobiyolojik, serolojik ile fiziko-kimyasal analize alınmıştır. 4 ve 10˚C’de muhafaza edilen numunelerde 48 4 5 saat sonunda toksin oluşumunun gözlenmediği, 18˚C’de 10 - 10 kob/g’lık inokülasyonların olduğu numunelerde 24 saat sonunda SEA oluşumunun gözlendiği ve 25 - 30˚C’deki numunelerde ise toksin oluşumunun 12. saatte başladığı rapor edilmiştir (Alişarlı ve ark. 2 2001). Benzer bir çalışmada da; puding türü bir tatlıya 5,0x10 kob/g düzeyinde enterotoksin A oluşturan S. aureus inoküle edilerek, 5⁰C’de 24 saat muhafaza edilmiş, sonuçta toksin oluşumu gözlenmediği rapor edilmiştir (Koseyan ve Bennet 1972). Toksinler kurutma işlemine ve gamma ışınlarına yüksek direnç göstermektedirler. Rose ve ark. (1988) tampon çözelti içindeki SEA toksinlerinin 8 kgy gamma ışını uygulamasında yıkımlandığını, bununla beraber kıyma örneklerine uygulanan aynı düzey ışının % 27- 34’lik kısma etki etmediğini gözlemlemişlerdir (Rose ve ark. 1988). Süt ve ürünleri S. aureus intoksikasyonu açısından riskli grubu oluşturmaktadır (Gilmour 1990). Normanno ve ark. (2007)’nın yaptığı bir çalışmada; 993’ü et ve 641’i süt ürünü olacak şekilde toplam 1634 örnek ile çalışılmış, 100 adet et ve 109 adet süt ürünü örneğinde koagulaz–pozitif S. aureus izole edilmiştir. Kontaminasyon düzeyinin, süt örneklerinde daha fazla olduğu bildirilmektedir. S. aureus gelişimi pozitif olan toplam 209 numunenin, 1252’inin enterotoksin içerdiği saptanmış ve toksin dağılımlarının çoğunluğunun %33,6 SED, %18,4 SEA, %15,2 SEC, % 6,4 SEB olduğu; % 30 luk kısmında ise iki toksini bir arada içerdiği saptanmıştır (Normanno ve ark. 2007). Gıda zehirlenmelerine en çok (%90) SEA neden olmakta ve en fazla toksik özellik gösterdiği ifade edilmektedir (Evenson ve ark 1988). Sokari (1991) tarafından yapılan bir çalışmada; kırmızı et, balık ve sebzeden oluşan 880 gıda örneğinden, 552 (%62)’sinde koagulaz pozitif S. aureus suşu saptanmış, bunların 269’unun (%48) enterotoksijenik olduğu ve bunlar içinde SEA oluşturanların en sıklıkla bulunduğu belirlenmiştir (Sokari 1991). Yapılan bir çalışmaya göre insanda hastalık semptomlarını oluşturacak düzeydeki enterotoksin miktarı 0,015-0357 µg/kg olduğu saptanmıştır (Gilbert 1974). Staphylococcus türlerine insanların ağız, burun, el ve derilerinde (özellikle sivilce ve yaralarda) normal veya geçici flora üyeleri olarak sıkça rastlanır. Staphylococcus suşlarının 7 en önemli kaynağı hijyen ve sanitasyon koşullarına uymayan gıda işçileridir. Bunun yanında; çiğ hayvansal ürünler de sorun yaratmaktadır. Yapılan bir çalışmada; et ve süt ürünlerinde S..aureus varlığı ve enterotoksin oluşturma karakteri incelenmiş 1634 örnekten, 209 adedinin kontamine olduğu belirlenmiştir. Her bir örnekden izole edilen 209 suşun 125 tanesinin bir ya da daha fazla enterotoksin oluşturma yeteneğinde olduğu saptanmıştır. Bu suşların; % 50,4’ünün insan, % 23.2’sinin koyun, %17,6’sının konakçı olmayan spesifik, %7.2’sinin büyükbaş ve %1,6 sının da kümes havyanları orjinli olduğunu bulmuşlardır. Ayrıca; insan kaynaklı tüm suşların bir ya da daha fazla toksini üretebildiklerini saptamışlar ve bu tip kontaminasyonların S. aureus zehirlenmelerinde en önemli sebep olduğunu belirtmişlerdir. Yetersiz temizlenmiş alet ve ekipmanlar da diğer kontaminasyon kaynaklarıdır. Mastitisli hayvanlardan izole edilen suşların büyük oranda enterotoksijenik olduğu bildirilmiştir (Normanno ve ark. 2007). El ile teması fazla olan, pişirilmiş ve tüketime dek bekleme süresi olan gıdalar S..aureus açısından risk teşkil etmektedir. Wieneke (1974)’nin çalışmasında; pişirilmiş gıdada enterotoksijenik suşların bulunma sıklığının, çiğ olanlara kıyasla daha fazla olduğu ispatlanmıştır ve bunun nedeninin de; pişirme işlemi sonrası gıdaya insan kaynaklı bir kontaminasyonun olduğu, bu suşların hayvan ve çevresel kaynaklara nazaran daha enterotoksijenik özellikte olduğu belirtilmiştir (Wieneke 1974). Zehirlenmeye neden olan aracı gıdaların ortak özelliği, çoğunlukla pişirilmiş ya da az pişirilmiş, elle hazırlanmış gıdalar olmalarıdır (Orwin ve ark. 2003, Adwan ve ark. 2005, Rall ve ark. 2008). Gıda, 4˚ C’nin altında ya da 46˚ C’nin üzerindeki sıcaklıklarda muhafaza edilmelidir. Pişirilmiş gıdanın uygun sıcaklığa dek soğutulması en fazla 3 saat içinde gerçekleştirilmelidir. Gıda zehirlenme bulgularının genellikle yaz aylarında daha fazla olması, sıcaklığın mikrobiyal artışa etkisini vurgulamaktadır (Bilge ve Karaboz 2005). S. aureus açısından riskli gıda grupları tüketime hazır hale getirilmiş yemekler, tavuk, jambon, dil, salam ve tütsülenmiş et, yumurta ve yumurta ile hazırlanmış ürünler, süt ve ürünleri, dondurma ve pastacılık kremaları, sütlü tatlılar, mayonezli salatalar, soğuk sandviç, meze, ordövr ve ezme olarak isimlendirilebilir. Pişirilmiş gıdalar hijyen eksikliği nedeniyle, S. aureus’un sonradan bulaşma ihtimali olan durumlarda, gıdadaki rekabetçi floranın ısıl işlem ile ortadan kalkmasıyla; S. aureus’un çoğalıp, toksin üretmesi için uygun ortam bulması nedeniyle risklidir. Yapılan bir çalışmada; sebze, rus salatası, pişmiş köfte, ciğer, lahmacun, hamburger, pizza ve döner gibi ürünleri içeren 512 numunenin S. aureus içerikleri incelenmiş 8 ve toplamda 48 adedinin (%9,4) Türk Gıda Kodeksi, Mikrobiyolojik Kriterler Tebliği’ne göre uygun olmadığı belirtilmiştir (Resmi Gazete 2001). Ayrıca; rus salatası, sebze salatası ve köftenin tüm numuneler içinde en fazla kontamine gıda grubunu oluşturduğunu da saptamışlardır (Ayçiçek ve ark. 2004). Peynir, kremalı pasta, kıyma, et ürünleri ile İzmir’de yapılmış bir çalışmada, 45 gıda örneğinden Türk Gıda Kodeksine göre 34 örneğin (%75,6) Staphylococ ve S.aureus içeriği bakımından uygunsuz olduğu bildirilmiştir. Bu 2 6 numunelerdeki S. aureus sayısı 1,0x10 - 3,0x10 kob/g arasında olduğu, ancak enterotoksin varlığının da tespit edilemediği raporlanmıştır. Gıdalar içinden S. aureus içeriği bakımından en fazla kontaminasyon düzeyinin de et grubuna ait olduğu bildirilmiştir (Bilge ve Karaboz 2005). Yapılan başka bir çalışmada ise; 225 adet örnek (95 adet ızgara et, 30 adet salata, 100 adet meze) mezofilik aerob bakteri, sülfit indirgeyen anaerob, koliform, Salmonella spp. , E.coli ve S. aureus açısından incelenmiştir. Izgara et’in %40’ının koliform, %11’inin E.coli ve %8’inin S. aureus ile kontamine olduğu saptanmıştır. Buna ilaveten, salatanın %100 koliform, %2 E.coli, %20 S. aureus ile mezenin de % 57 koliform, %16 E.coli, %25 oranında S. aureus ile kontamine olduğu da saptanmıştır. Adı geçen çalışmadaki örneklerde 2 adet çiğ köfte dışında, Salmonella spp. izole edilememesine rağmen, değişik düzeylerde E.coli, koagülaz (+) S. aureus ve sülfit indirgeyen anaeropların bulunması, halk sağlığı açısından bir risk olarak değerlendirilmiştir (Hampikyan ve ark. 2008). Çorba ve etli sebze yemeği içeren 152 gıda numunesinin mikrobiyolojik kalitesini belirlemek 5 amacıyla yapılan bir başka çalışmada; % 54’inde koliform (10²-10 kob/g), %17’sinde E.coli 5 (10-10³ kob/g), %22’sinde S. aureus (10²-10 kob/g) ve % 4’ünde sülfit indirgeyen anaerob (10-10² kob/g)saptandığı raporlanmıştır. Salmonella spp. örneklerin hiçbirinde pozitif olarak bulunamamıştır (Çolak ve ark 2007). S. aureus zehirlenmesinde inkübasyon süresi 30 dakika ile 8 saat arasında değişmekte olup, genel belirtiler gıdanın tüketilmesinden 1- 6 saat arası ortaya çıktığı ve hastalık belirtilerinin bulantı, kusma, karın ağrısı ve ishal olduğu ifade edilmektedir. Şüpheli gıdayı tüketen popülasyonun tümü hasta olmayabilir ya da aynı şiddette ve benzer semptomları göstermeyebilir. Semptomların yoğunluğu enterotoksin konsantrasyonuna, tüketilen gıda miktarına ve bireysel dirence bağlıdır. Hasta birkaç gün sıvı dengesi sağlanarak ilave tedaviye gerek kalmadan iyileşir. Ancak şok geçiren ve yoğun kusma sonucu susuz kalan hastalar için tıbbi yardım gerekebilir. Holmberg ve Blake’in (1984) araştırmalarına göre hastaların % 10’unun tıbbi yardım aldıkları saptanmış olup ölüm çok enderdir. 9 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal Çalışmada; materyal olarak S. aureus açısından risk teşkil edecek ürün grupları göz önünde bulundurularak toplam 190 örnek seçilmiş ve örnek dağılımları Çizelge 3.1’de sunulmuştur. Çizelge3.1. Örnek gruplarının dağılımı Örnek grubu Örnek adı Sayı(adet) Toplam(adet) Sucuk 10 Şarküteri Pastırma 5 Sosis 6 31 Tavuk burger 10 Donmuş et ürünü Donmuş köfte 10 Donmuş et döner 5 15 Etli yemek 10 Sebzeli yemek 10 Hazır yemek Pilav 5 30 Köfte 5 Dil peyniri 10 Beyaz peynir 10 Peynir Kaşar peyniri 10 45 Tulum peyniri 10 Kelle peyniri 5 Puding 5 Kazandibi 5 Sütlü tatlı Sütlaç 3 16 Keşkül 3 Yaş pasta Yaş pasta 25 25 Dondurma Dondurma 28 28 Çalışmada mevsimsel sıcaklık farklılıklarının ürün kalitesi üzerindeki etkisini gözlemlemek amacıyla 1 yıllık periyod (Nisan 2011- Nisan 2012) seçilmiştir. Hazır yemek grubu haricinde 10 tüm örnekler perakende satış noktalarından temin edilerek, soğuk zincir koşullarında laboratuvara transferini takiben analizi yapılmıştır. Hazır yemek grubundaki örnekler ise 3 farklı firmadan ve yemeklerin toplu tüketim yerlerine gönderilmesi öncesi alınmıştır. 3.2. Yöntem Alınan örneklerin tümü S. aureus tespiti için analize tabi tutulmuştur. S. aureus sayısı bakımından 10³ kob/g’ın üzerinde olan örnekler enterotoksinleri açısından incelenmiştir. 3.2.1. S. aureus saptanması 2 3 10 g örnek 10 - 10 adet/mL olacak şekilde dilüsyonları hazırlanmış ve egg yolk tellurite suplementli Baird Parker Agar (BPA, Oxoid CM0275) besiyerine ekim yapılmıştır. Drigalski spatülü ile yayılan petriler 35-37ºC’de 48 saat inkübasyona (Thermo Hereaus UB20) bırakılmıştır (Halkman 2005). İnkübasyon süresinin sonunda tipik koloniler sayılmış ve bunlardan gram boyama yapılmıştır. Ayrıca mikroskobik görünüm ile doğrulama yapılmıştır (Halkman 2005). Koagulaz–pozitif S..aureus tespiti için tavşan plazma serum testi yapılmıştır. Bu amaçla; 0,3 ml Brainheart infusion broth (Oxoid CM0225) içeren tüplere şüpheli S. aureus kolonileri inoküle edilip ve 35˚C’de 18-24 saat inkübe edilmiştir. İnkübasyon sonrası elde edilen kültürden 0,1 mL alınarak içerisinde 0,3 mL tavşan plazması (Merck Bactident Coagulase 111306) bulunan küçük test tüpüne aktarılmıştır. Steril Brainheart infusion broth’dan 0,1 mL alınarak aynı işlem negatif kontrol amacıyla uygulanmıştır. Bu tüpler 35-37˚C’de 4-6 saat inkübasyon sonrası pıhtılaşma olup olmadığı yönünden kontrol edilmiştir (FDA, BAM, 2001). Biyokimyasal tanımlama için Api (Biomerieux REF20) ya da ViteckII (Biomerieux, 21342) cihazı kullanılmıştır. 3.2.2. S. aureus enterotoksinlerinin saptanması: Toksinlerin saptanması için VİDAS Staph enterotoksin II (SET2; Biomerieux. REF 30 705) enzim bağlantılı floresans analiz tekniği (AOAC 070404/2007:06) kullanılmıştır. Mevcut toksinlerin saptanması için örneklerin cihaza verilmesinden önce ekstraksiyon işlemi yapılmıştır. Gıda ekstraksiyonunda kullanılan tampon, kit içinde verilmiş olan çözeltinin steril su ile seyreltilmesiyle hazırlanmıştır. 11 Ekstraksiyon işleminde 25 g örnek stomacher torbası içine alınmış, 25 mL ektraksiyon tamponu ile seyreltilmiş ve homojen bir süspansiyon elde etmek için bagmikser (Interscience B6) kullanılarak 3 dakika yüksek hızda karıştırılmıştır. Homojenize hale getirilen gıda süspansiyonu, 15 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra 3000-5000 g’de 15 dakika santrifüjlenmiştir (Sigma 2-16). Üst faz, şırınga içine yerleştirilmiş pamuktan geçirilerek süzülmüştür. Filtrat cihaza verilmeden önce, pH değeri 1N NaOH kullanılarak pH metrede (WTW pH330i) 7,5-8,0 arasına ayarlanmıştır. Filtratın 500 μL’si alınarak VIDAS SET2 Reaktif stribinin (10 kuyucuktan oluşmakta ve test için gerekli reaktifleri içermektedir) numune kuyucuğuna pipetlenmiştir. Gıda ekstraktının pipetlendiği strib ve katı faz sağayıcı (SPR) cihaza yerleştirilmiştir. Testin tüm aşamaları cihaz tarafından otomatik olarak gerçekleştirilmiş ve 80 dakika sonra test sonuçları toksin var-yok şeklinde raporlanmıştır. 3.2.3. Antibiyotik duyarlılığının saptanması: Staphylococcus aureus enterotoksinleri saptanmış örneklerden (3 tavuk burger, 2 yaş pasta, 1 pilav) izole edilen 5 farklı suşun antibiyotik duyarlılığının saptanması amacıyla vancomycin (6mg/L -Oxoid SR0186E) ve cefsulodin sodium salt hydrate (50mg/mL-Sigma Aldrich C8145) kullanılmıştır. Metod olarak Kirby-Bauer disk difüzyon metodu seçilmiştir (Bauer ve ark. 1959). Antibiyotik stok solüsyonları kullanım talimatlarına uygun olacak şekilde 2 mL steril distile su ile sulandırılarak hazırlanmıştır. Enterotoksin saptanmış örneklerden izole edilen suşlar öze ile (BHI) Brainheart infusion broth (Oxoid CM0225)’a alınarak 37°C’de 24 saat inkübe edilmiştir. Elde edilen taze kültür solüsyonu 0,5 McFarland’a ayarlanarak steril petrilere paralelli olacak şekilde ekim yapılmış, ardından 45°C’ye soğutulmuş egg yolk tellurite katkılı Baird Parker Agar (Oxoid CM0275) ilave edilmiş ve uygun şekilde karışması sağlanmıştır. Besiyeri katılaştıktan sonra, petrinin ortasına steril antibiyotik emdirilmemiş disk yerleştirilmiştir. Önceden hazırlanmış olan vancomycin ve cefsulodin sodium salt hydrate solüsyonlarından 50µl/petri olacak şekilde alınarak diske emdirilmiştir. İnokülasyon sonrası petriler 37°C’de 24 saat inkübasyona bırakılmış ve süre sonunda disk etrafında oluşan zon çapı ölçülerek kaydedilmiştir (Bauer ve ark. 1959). 12 4.BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. S. aureus Saptanması S. aureus açısından incelenen 190 adet gıda örneğinin 47’si (% 24,7) pozitif olarak saptanmıştır (Çizelge 4.1). Ürün grupları bazında S. aureus analizi yapılan pozitif örnek sayısı ve bunların yüzde (%) değerleri Çizelge 4.1’de sunulmuştur. Çizelge 4.1 incelendiğinde, örnek grupları içinde; en yüksek S. aureus kontaminasyonu %36’lık oran ile yaş pastada tespit edilmiştir. Diğer örnek gruplarında pozitif S. aureus yüzdesinin % 21,7- 26,6 arasında değiştiği (hazır yemek ve dondurulmuş et ürünü %26,6, şarküteri %25, peynir %22, dondurma % 21,4) belirlenmiştir. En düşük S. aureus kontaminasyon oranı ise % 12, 5 ile sütlü tatlılarda saptanmıştır. Çizelge 4. 1. Örnek gruplarında S. aureus varlığı Örnek Grubu Örnek Pozitif S. aureus Pozitif S. aureus Sayısı(adet) örnek sayısı örnek yüzdesi (%) (adet) Yaş pasta 25 9 36 Hazır yemek 30 8 26,6 Donmuş et ürünü 15 4 26,6 Şarküteri 31 8 25 Peynir 45 10 22 Dondurma 28 6 21,4 Sütlü tatlı 16 2 12,5 Toplam 190 47 1 6 Örneklerdeki S. aureus değerleri 1,0x10 - 4,2x10 kob/g aralığında saptanmış ve Çizelge 4.2’de verilmiştir. Çalışılan örneklerde en fazla S. aureus kontaminasyon düzeyi tavuk burger 4 6 1 örneklerinde (3,7x10 - 4,2x10 kob/g) saptanmış ve bunu sırasıyla yaş pasta (5,8x10 - 4 2 4 1 3 6,2x10 kob/g), beyaz peynir (1,6x10 - 3,0x10 kob/g), pilav (<1,0x10 - 3,6x10 kob/g), 2 3 donmuş et döner (3,0x10 - 1,3x10 kob/g) takip etmiştir (Çizelge 4.2). Sonuç olarak; çalışılan 3 toplam 190 adet gıda örneğinin % 5,78’sinde S. aureus kontaminasyon düzeyi 1,0x10 kob/g değerinin üstünde bulunmuştur. 13 Çizelge 4. 2. Örnek gruplarında S. aureus saptanma oranları ve sayım değerleri Örnek Örnek Pozitif S. aureus sayısı Pozitif Grubu sayısı S. aureus (kob/g) S. aureus örnek (adet) örnek sayısı yüzdesi (%) (adet) 4 6 Tavuk burger 10 4 3,7x10 - 4,2x10 40 1 4 Yaş pasta 25 9 5,8x10 - 6,2x10 36 2 4 Beyaz peynir 10 4 1,6x10 - 3,0x10 40 1 3 Pilav 5 1 <1,0x10 - 3,6x10 20 2 3 Donmuşet döner 5 2 3,0x10 - 1,3x10 40 1 2 Pastırma 5 3 1,2x10 - 5,2x10 60 1 2 Kaşar peyniri 10 3 3,0x10 - 3,2x10 30 1 2 Sucuk 10 1 <1,0x10 - 2,6x10 10 1 1 Etli yemek 10 3 2,0x10 - 7,2x10 30 1 1 Köfte 5 3 1,0x10 - 5,8x10 60 1 1 Donmuş hazır köfte 10 2 4,2x10 - 5,2x10 20 1 1 Dil peyniri 10 1 <1,0x10 - 3,5x10 10 1 1 Sebzeli yemek 10 1 <1,0x10 - 2,0x10 10 1 Sosis 6 --- <1,0x10 --- 5 Gıdalarda bulunan S. aureus’un en az 10 kob /g bakteri sayısına ulaşması sonrasında gıda intoksikasyonu oluşturabileceği bilinmektedir (Bergdoll 1991). Çalışmada güvenilir sonuç 3 elde etmek ve hata payını azaltmak için S. aureus sayısı 1,0x10 kob/g’ın üstünde saptanmış tüm gıdalar riskli olarak değerlendirilmiş ve enterotoksin açısından incelenmiştir. S. aureus 3 sayısı 1,0x10 kob/g’ın değerinin üzerinde olan gıdalara ait sonuçlar Çizelge 4.3’de sunulmuştur. Çizelge 4.2 ve 4.3 incelendiğinde 10 adet tavuk burger ve 25 yaş pasta örneğinin 4’er adedinde ve 5 pilav, 10 beyaz peynir, 5 et döner örneklerinin de sadece birinde S. aureus 3 değerinin 1,0x10 kob/g’ı aştığı görülmektedir. Veriler incelendiğinde en yüksek 4 6 kontaminasyon düzeyinin 3,7x10 - 4,2x10 kob/g değerleri ile tavuk burger gruplarında; en 3 düşük düzeyin ise 1,3x10 kob/g ile donmuş et döner örneklerinde olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.3). Bunların dışındaki gıda örneklerinin S. aureus kontaminasyon düzeyleri 3 1,0x10 kob/g’ın altında olduğu tespit edilmiş ve toksin açısından incelenmeyeceğinden bunlara ait değerler Çizelge 4.3’ de verilmemiştir. Ancak peynir gruplarında yapılan analizler sonucunda beyaz peynir örneklerindeki S. aureus saptanma oranı (%40) ile sayım 14 2 4 1 2 sonuçlarının (1,6x10 - 3,0x10 kob/g), kaşar peynirine oranla (%30- (3,0x10 - 3,3x10 kob/g) daha fazla olduğu saptanmıştır. 3 Çizelge 4.3. S. aureus içeriği 1,0x10 kob/g’dan fazla olan gıda örnekleri S. aureus sayısı S. aureus sayısı Örnek Adı Örnek Adı (kob/g) (kob/g) 6 3 Tavuk burger-1 4,2x10 Yaş pasta-3 5,2x10 6 3 Tavuk burger-2 3,2x10 Yaş pasta-4 1,7x10 5 4 Tavuk burger-3 8,8x10 Pilav 3,7x10 4 4 Tavuk burger-4 3,8x10 Beyaz peynir 3,0x10 4 3 Yaş pasta-1 6,2x10 Donmuş et döner 1,3x10 4 Yaş pasta-2 5,2x10 Kısa ve ark. (1996)’nın yaş pastalarda yapmış oldukları bir çalışmada, koagulaz (+) stafilokok varlığı ve enterotoksin üretme yeteneği araştırılmıştır. Çalışmada 100 adet örnek (15 adet sade kremalı, 53 adet kakaolu, 32 adet meyveli-kremalı) incelenmiş ve sade kremalı örneklerin 2 %73,3’ünde ortalama 6,3x10 kob/g, kakaolu ve meyveli kremalı örneklerin ise tamamında 3 3 sırasıyla ortalama 1,7x10 ve 1,3x10 kob/g düzeyinde koagulaz (+) stafilokok saptanmıştır. Ayrıca sade kremalı örneklerin %6,7’sinde, kakaolu kremalı örneklerin % 5,7’sinde ve meyveli kremalı pasta örneklerinin de %3,1’inde koagulaz (+) stafilokok sayısı enterotoksin 5 riski oluşturabilecek 10 kob/g düzeyinde saptandığı belirtilmiştir. Çizelge 4.1, 4.2 ve 4.3’de verilen yaş pasta değerleri incelendiğinde; 25 örneğin % 8’inde S. aureus sayısının ortalama 4 3 2 5,6x10 , diğer %8’inde 4,0x10 ve %20’ sinde 2,2x10 kob/g olarak saptandığı görülmektedir. Buna ilave olarak; yaş pasta grubunun %64’ünde S. aureus’un negatif olarak bulunması ve 5 örneklerde 1,0x10 kob/g’dan fazla saptanmaması sebebiyle, Kısa ve ark. (1996)’nın sonuçlarıyla farklılık göstermektedir. Belçika’da yapılan bir başka çalışmada toplam 156 5 kremalı pasta örneğinin %24,4’ünün S. aureus ile kontamine olduğu, %1,3’ünün de 1,0x10 kob/g’dan fazla olduğu belirtilmiştir (Yde 1982). Yaş pastalardaki % 36’lık S. aureus kontaminasyon oranının Çizelge 4.2’deki veriler incelendiğinde Yde (1982)’nin saptadıkları orandan (%24,4) fazla olmasına rağmen, tüm yaş pasta örneklerinde kontaminasyon düzeyleri 5 1,0x10 kob/g’ın altında gözlemlenmektedir. Özer ve ark. (1968)’nın gerçekleştirdiği bir başka çalışmada ise kremalı pastaların % 51’inin koagulaz (+) stafilokok içerdiğini belirtmişlerdir. Buna sebep olarak; farklı üretim hijyen koşullarının varlığı ve mevsimsel sıcaklık değişiminin son ürün üzerine etkisi olduğu düşünülmektedir. 15 Bilge ve Karaboz (2005) tarafından yapılan; 45 farklı gıdanın (8 adet peynir, 23 adet dana kıyma, 10 adet kremalı pasta, 4 adet tavuk but) S. aureus açısından incelendiği bir çalışmada, 2 6 örneklerin 38 adedi (%84) pozitif olarak saptanmış ve sayının <1,0x10 - 3,0x10 kob/g arasında olduğu raporlanmıştır. Kremalı pasta örneklerinde saptanan S..aureus düzeyi 2 5 (6,8x10 -4,8x10 kob/g) Çizelge 4.2 ve 4.3’de belirtilen değerlerle uyumludur. Bilge ve 1 Karaboz (2005)’un peynir örneklerinde saptadıkları S. aureus değerleri (%62’sinde <1,0X10 , 2 1 %38’inde 5,0x10 kob/g), çalışma sonucu elde edilen sonuçlara kıyasla (%81’inde <1,0X10 2 4 kob/g, %17’sinde 2,4x10 kob/g, %22’sinde 3,0x10 kob/g) daha fazla bulunmuştur. Peynir çeşitlerinin ve üretim aşamalarındaki değişik işleme koşullarının S. aureus sayısındaki farklılığın nedeni olabileceğini düşündürmektedir. Peynir yapımında kullanılan keçi sütünün, üründeki S. aureus içeriğine etkisiyle ilgili Akineden ve ark. (2008) nın yaptığı bir çalışmada 181 adet keçi peyniri örneğinden 14 (%7,7) 1 5 adedinin koagulaz- pozitif stafilokok ile 3,0x10 ile 8,6x10 kob/g düzeylerinde kontamine olduğu raporlanmışlardır. Ayrıca keçi sütünden elde edilen peynirlerdeki S. aureus saptanma oranının da, inek sütünden elde edilen peynirlere oranla daha düşük seviyede olduğunu da belirtmişlerdir (Akineden ve ark. 2008). Çalışmada; keçi sütünden üretilen peynirler analize alınmadığı için sonuçları arasında herhangi bir değerlendirme yapılamamıştır. Normanno ve ark. (2007)’nın bir araştırmasında 993 adet et ve 641 adet süt numunesi incelenmiş; sırasıyla 100 (%10) ve 109 adedinde (%17) S. aureus pozitif olarak saptanmıştır. Süt ürünlerindeki S. aureus kontaminasyon oranının, et grubundan daha fazla olduğu belirtilmiştir. Çizelge 4.1’deki veriler incelendiğinde çalışma sonuçlarında donmuş et ürünlerinin (%26,6) ve şarküteri grubunun (%25) peynir örneklerine (%22) kıyasla daha fazla S. aureus kontaminasyonla karşı karşıya kaldığı görülmektedir. Bu da Normanno ve ark. (2007)’nın çalışmasıyla farklılık göstermektedir. Çalışmaların değişik coğrafyalarda yürütülmesi dolayısıyla hayvansal orjin, kesim teknikleri ve mikrobiyal flora farklılıklarının sonuçlardaki uyumsuzluğun sebebi olacağı düşünülmektedir. 2 3 Çolak ve ark. (2007) tarafından incelenen 60 çorba örneğinin 3 (%5) adedinde 10 -10 kob/g 2 5 düzeyinde, 92 yemek örneğinin 16’sında (% 17,4) 10 -10 kob/g düzeyinde S. aureus tespit edilmiştir. Hazır yemek grubu içinde ise 25 etli yemeğin 6 adedinde (%24), 20 adet pilavın 2’sinde (%10), 15 sebze yemeğinin de 2’sinde (%13) S. aureus pozitif olarak saptanmıştır. 4 Ortalama kontaminasyon düzeyleri ise; en fazla etli yemeklerde 4,3x10 kob/g olarak sırasıyla 16 3 2 pilavda 2,2x10 ve sebze yemeğinde ise 5,0x10 şeklinde raporlanmıştır. Çizelge 4.2 3 incelendiğinde; çalışılan 5 adet pilav örneğinin %20’sinde 3,6x10 kob/g, 10 sebzeli yemeğin 1 1 de %10’unda 2,0x10 kob/g ve 10 et yemeğin de %30’ unda 7,0x10 kob/g olarak saptanan maksimum S..aureus oranları Çolak ve ark. (2007)’nın sonuçlarıyla uyum sergilemektedir. Çizelge 4.2 incelendiğinde etli yemek örneklerinde S. aureus saptanma oranı (%30), Çolak ve ark. (2007)’nın bulgularıyla benzerlik göstermektedir. Buna rağmen, kontaminasyon 1 düzeyleri açısından çalışmada elde edilen sonuçlar (maksimum 7,0x10 kob/g) Çolak ve ark. 4 (2007)’nın sonuçlarından (4,3x10 kob/g) daha düşük düzeylerde saptanmıştır. Bunun kullanılan hammadde kalitesi, etin pişirme işlemi öncesi bekletme koşulları ve işlem koşullarındaki farklılıklardan kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Bu çalışmalardan farklı olarak Ildız ve Çiftçioğlu (1997) inceledikleri 52 çorba ve 53 adet etli yemek örneğinin hiçbirinde koagulaz (+) S..aureus izole edilememiştir. Benzer şekilde Ayçiçek ve ark.(2004) 2 3 inceledikleri çorba örneklerinin % 2,1’inde 10 - 10 kob/g seviyelerinde koagulaz (+) S.. aureus bulmuşlardır. Bir başka çalışmada; 3293 adet tüketime hazır dondurulmuş gıdanın (suşi ve deniz yosununa sarılmış pilav) 197 adedinde (%5,98) S. aureus pozitif olarak saptanmış ve bu suşların da %49,75’inin toksijenik özellikte olduğu belirtilmiştir. Çalışmada mevsimsel sıcaklık farklılığının etkisinin gözlemlemesi amacıyla örnek alma zamanı genişletilerek, S..aureus saptanma oranının mevsimsel sıcaklık artışına paralel artış göstereceği beklenmiştir. Ancak sonuçlar doğrultusunda çalışılan örneklerde S. aureus saptanma oranına sıcaklık farkının etkisinin olmadığı raporlanmıştır (Kim ve ark. 2011). 4.2. S. aureus Enterotoksinlerinin Saptanmasıyla İlgili Bulgular: 1 6 Analize alınan 190 örneğin pozitif olan 47’sinde (%24,7) S. aureus sayısı 1,2x10 - 4,2x10 3 kob/g arasında saptanmıştır (Çizelge 4.2). Sayının 1,0x10 kob/g’dan fazla olan 11 (%5,78) örneğinde enterotoksin oluşturma potansiyeli incelenmiş ve yalnızca 6 adedinde (%3,6) pozitif olarak bulunmuştur. Enterotoksin içeriği araştırılan 11 adet örneğe ait S. aureus sayım sonuçları ile enterotoksin 3 saptanma ilişkileri Çizelge 4.4’de sunulmuştur. S. aureus sayısı 1,0x10 kob/g’ dan fazla olan 11 adet örneğin sadece 6 adedinde enterotoksin varlığı saptanmıştır ve çalışmada enterotoksin 4 sentezlenme alt sınırın 3,7x10 kob/g olduğu tespit edilmiştir. 17 Çizelge 4. 4. Örneklerdeki S. aureus sayısı değerleri ve enterotoksin varlığı No Örnek Adı S. aureus sayısı (kob/g) 6 1 Tavuk burger-1 * 4,2x10 6 2 Tavuk burger-2 * 3,2x10 5 3 Tavuk burger-3 * 8,8x10 4 4 Yaş pasta-1 * 6,2x10 4 5 Yaş pasta-2 * 5,2x10 4 6 Tavuk burger-4 3,8x10 4 7 Pilav * 3,7x10 4 8 Beyaz peynir 3,0x10 3 9 Yaş pasta-3 5,2x10 3 10 Yaş pasta-4 1,7x10 3 11 Donmuş et döner 1,3x10 * Enterotoksin varlığı 3 4 Çizelge 4.4’den de görüldüğü üzere; S. aureus düzeyi 1,0x10 - 3,0x10 kob/g aralığında olan örneklerde enterotoksin saptanamamıştır. Bu değerlerin üzerinde S. aureus saptanmış gıdalar 4 içerisinde tavuk burger (3,8x10 kob/g) hariç, tümünde enterotoksin saptanmıştır. Enterotoksin saptanma oranı, toplam 190 örnek içinde en fazla şarküteri grubunda tanımlanan tavuk burgerde %1,57 (3 adet), ardından yaş pastada %1,05 (2 adet) ve son olarak hazır 3 yemek grubunda % 0,52 (1 adet) olarak bulunmuştur. S. aureus sayısı 1,0x10 kob/g’dan fazla olan örneklere ait enterotoksin saptanma oranları ile içeriklerine dair % değerlendirmeler Çizelge 4.5’de görülmektedir. Bilge ve Karaboz (2005) tarafından yapılan bir çalışmada 45 adet örnek (8 adet peynir, 23 adet dana kıyma, 10 adet kremalı pasta, 4 adet tavuk but) incelenmiş ve S. aureus saptanma oranının % 84 düzeyinde olduğu belirtilmiştir. S. aureus açısından pozitif olan ve sayıları 5 6 3,3x10 - >3,0x10 kob/g arasında 12 örnek seçilerek enterotoksin A, B, C, D açısından incelenmiş ve örneklerin hiçbirinde toksin varlığı saptanamamıştır. Çizelge 4.5 incelendiğinde; yapılan her iki çalışmada da peynir örneklerinde toksin saptanamaması dolayısıyla uyum gözlenmektedir. Ancak, yaş pasta örneklerinin (25 adet) %8’inde enterotoksin saptanması, açısından sonuçlar Bilge ve Karaboz (2005)’un çalışmasıyla uyumlu değildir. 18 3 Çizelge 4.5. S. aureus sayısı 1,0x10 kob/g’dan fazla olan örneklerdeki enterotoksin saptanma oranı Örnek Grubu Örnek S. aureus Pozitif S. aureus Pozitif Sayısı içeriği Enterotoksin Sayısı S. aureus 3 (adet) (>10 kob/g) (adet) Enterotoksin (adet) yüzdesi(%) Şarküteri 31 4 3 9,6 Donmuş et ürünü 15 1 ---- ---- Yaş pasta 25 4 2 8 Hazır yemek 30 1 1 3,3 Peynir 45 1 --- --- Dondurma 28 ---- --- --- Sütlü tatlı 16 --- --- --- Son yıllarda S. aureus’un toksin oluşturması koşullarının “Quorum Sensing” (QS) denilen bakterilerin yeterli hücre yoğunluğuna ulaşması ile bağlantılı olduğu ve bakteriler arası sosyal davranış biçimlerinden kaynaklandığı belirlenmiştir (Kievit ve Inglevski 2000, Karaboz ve 5 Sukatar 2004). S. aureus’ların gıdada toksin oluşumuna imkan verecek sayıya (>10 kob/g) ulaşması sonrası gıdaya uygulanabilecek ısıl işlem, inhibitör madde ilavesi ya da su aktivitesini düşürmeye yönelik vb. işlemler etkisi ile sayının azalabileceği, buna rağmen bu tür uygulamaların mevcut toksinlerin varlığı üzerinde hiçbir etkinin olmayacağı bilinmektedir(Ünlütürk ve Turantaş 2003). Bilge ve Karaboz (2005)’un yaptıkları 6 çalışmalarında S. aureus düzeyinin 3,0x10 kob/g’dan daha yüksek olmasına rağmen 4 enterotoksin saptanamadığı bildirilmiştir. Çizelge 4.4’de görüldüğü üzere 10 kob/g S. aureus düzeylerinde enterotoksin saptanmış olması düşük sayılarda bile enterotoksin saptanabileceğini doğrular niteliktedir. Bunun tersi bir görüşte ise; Tatini ve ark.(1975) peynir 6 suyunda 1,0x10 kob/mL olan S. aureus varlığında enterotoksin saptayamamışlar ve oluşum 7 için 1,0x10 kob/mL sayısına ulaşması gerektiğini belirtmişlerdir . Enterotoksijenik stafilokoklar sıklıkla restaurantlardan tüketilen gıdalarda saptanmaktadır. Bunun sebebi ise; pişmiş gıdalara, S. aureus’un sonradan bulaşma ihtimalidir. Ortamdaki rekabetçi flora, ısıl işlem ile ortadan kalktığı için S. aureus’un çoğalıp, toksin üretmesi için uygun ortam oluşmaktadır. Ferrer ve ark. (1992) kafe ve restaurantlardan temin edilen et, sebze, salata ve omlet örneklerinin %1,1’inde enterotoksijenik stafilokok saptamışlardır. 19 Başka bir çalışmada da; 2013 adet gıda örneğinin 11’inde enterotoksijenik S..aureus suşunun izole edildiği bildirilmektedir. Suşların birer tanesinde A ve D, 7’sinde B, 1’inde D ve diğer suşlarda da (A+D) ve (C+D) oluşturma yeteneğinde olduğu raporlanmışdır (Guillen ve ark. 1994). Moreno ve ark. (1996)’nın yaptığı çalışmada ise restaurantlardan temin edilen 345 gıda örneğinde enterotoksijenik stafilokok tespit edememişlerdir. Kısa ve ark. (1996)’nın 96 adet yaş pastayı inceledikleri bir çalışmada 25’inden (%26) izole edilen koagulaz (+) stafilokokların enterotoksin oluşturma yeteneğinde olduğunu saptamışlardır. Bir başka araştırmada ise; yaş pastalaların S. aureus ile kontaminasyon düzeyi ve toksin oluşturma yeteneği incelenmiş ve sonuç olarak 214 pastacılık ürününün 21’inden (% 9,8) S. aureus izole edilmiş, 7’sininin (%23) enterotoksin oluşturma yeteneğinde olduğu belirtilmiştir. Ayrıca; bu ürünler içerisinde özellikle 40 adet kremalı çörek örneğinin 12’sinden (%30) izole edilen S. aureus suşunun 5’inin (%41,7) enterotoksin oluşturma yeteneğinde olduğu da belirtilmiştir (Summer ve ark. 1993). Khafalla ve ark. (1991) inceledikleri kremalı pasta örneklerinin %30- 50’ sinin koagulaz (+) stafilokok içerdiğini ve bunların da yaklaşık % 12’sinin A tipi enterotoksin oluşturduğunu saptamışlardır. Ayrıca, stafilokokların kaynağının kullanılan krema olduğunu belirtmişleridir. Kremalı pastaların kontaminasyonunda pastörize edilmemiş, hijyenik kalitesi düşük krema kullanılmasının yanı sıra, bu ürünlerin uygun olmayan sıcaklıklarda uzun süre muhafaza edilmeleri stafilokokların üreme ve toksin oluşturmalarına sebep olmaktadır. Dolayısıyla; kremalı pastaların en önemli bileşeni olan kremanın; mikrobiyolojik kalitesi, üretim ve muhafaza aşamalarındaki farklı hijyen uygulamaları, çalışma sonuçlarında saptanmış olan farklı S. aureus kontaminasyon oranlarını açıklamaktadır. Yapılan bir araştırmada 181 adet keçi peyniri örneğinin, 14’ünde S. aureus tespit edilmiş ve pozitif numunelerden izole edilen 64 izolatın 19’unun enterotoksijenik özellikte olduğu saptanmıştır. Bu izolatların pastörize sütten üretilen 5 farklı peynir tipine ait olduğu belirlenmiş ve SEA (Staphylococcus aureus enterotoksin A) sentezleme özelliğindeki S.. aureus suşunun en fazla yarı-sert tip peynirden izole edildiği belirtilmiştir (Akineden ve ark. 2008). SEA’nın en çok insan kaynaklı S. aureus tarafından sentezlendiği göz önüne alınırsa, peynire kontaminasyonun proses sonrasında gerçekleşebileceği düşünülmektedir. Çizelge 4.2’ye bakıldığında 45 peynir örneğinin 10 adedinde (%22) S. aureus saptanmış olup 4 sadece bir örnekteki sayının 1,0x10 kob/g’dan fazla olmasına rağmen enterotoksin saptanamadığı görülmektedir (Çizelge 4.4). Ancak; çalışmada uygulanan analiz yönteminin 20 sadece sentezlenmiş toksinin varlığını tespit amacına yönelik olması nedeniyle, S. aureus suşlarının enterotoksijenik yeteneklerinin belirlenmesine dair bir veri bulunamamakta ve dolayısıyla Akineden ve ark. (2008)’nın çalışmasının sonuçlarıyla karşılaştırma yapılamamaktadır. Normanno ve ark (2005)’ın yaptığı bir çalışmada ise 3097 süt ürününden 641 adedinin (%20,7) koagulaz (+) stafilokok ile kontamine olduğu, seçilen 364 izolatın 362’sinin S..aureus olarak tanımlandığı ve bunun da 217 adedinin (%59,9) enterotoksijenik özellikde olduğu raporlanmıştır. Gene aynı çalışmada 5369 adet et mamülünün 1245’inin (%23,1) koagulaz (+) stafilokok ile kontamine olduğu, seçilen 148 izolatın 146’ sının S. aureus olarak tanımlandığı ve bunun da 66 adedinin (%45,2) enterotoksijenik özellikde olduğu belirtilmiştir. Normanno ve ark.(2007) yaptıkları bir başka çalışmada ise, 1634 örnekden izole edilen 209 adet S. aureus suşunun 125’inin (%59,8) bir ya da daha fazla enterotoksin oluşturabilir karakterde olduğunu raporlamışlardır. Saptanan 125 suşun oluşturdukları enteroksin oranları da sırasıyla SED (42/125 adet - % 33,6), SEA (23/125- %18,4), SEC (19/125- %15,2), SEB (8/125- %6,4) olarak verilmiştir. Ayrıca süt ürünlerinden izole edilen enterotoksijenik özellikteki S. aureus içeren örnek oranının (%54), et ürünlerindeki orandan (%50) daha fazla olarak saptanmıştır. Her iki çalışmanın sonuçları dikkate alındığında süt ürünlerinde S. aureus kontaminasyon oranı ve düzeyi, et ürünlerine oranla daha fazla olduğuı görülmektedir. Buna ilave olarak Normanno ve ark. (2007)’nın çalışma sonuçlarına göre, enterotoksin üretme yeteneğindeki S. aureus suşunun gelişimi ve toksin sentezlemesi açısından da süt ürünlerinin et ürünlerine kıyasla daha uygun ortam olduğu belirtilmiştir. Çiğ sütün S. aureus ile kontaminasyonu hammadede olarak kullanıldığı peynir, krema vb. gıdalarda toksin gelişimi açısından önem arz etmektedir. Çiğ sütlerdeki S. aureus ve enteroksinlerini saptamak amacıyla yapılmış bir çalışmada; 60 adet örneğin 37’sinin enterotoksin mevcudiyeti bakımından Türk Gıda Kodeksi, “Gıda maddelerindeki bulaşanlar maksimum limitleri” hakkındaki 2008/26 nolu tebliğe uygun olmadığı, 30 adet ürünün de S..aureus sayısı bakımından kodeksin 2000/6 “Çiğ süt ve ısıl işlem görmüş içme sütleri” tebliğine uygun olmadığını saptamışlardır. Stafilokokal enterotoksinlerin gıdalarda 6 sentezlenmesi için 10 kob/g seviyesinde S. aureus bulunması gerekirken çalışmada incelenen örneklerde bu değerin altında toksin tespit edilebildiği de belirtilmiştir (Yılmaz ve Gönülalan 2010). 21 Gıdalarda S. aureus’un enterotoksin oluşturmasında bazı engelleyici faktörlerin etkisinin tespiti ile ilgili bir çalışmada; farklı pişirme yöntemlerinin uygulandığı [(haşlamış, sıcak tütsülemiş, havada kürlemiş (Serrano)] domuz etleri ile karabiberli domuz salamı S..aureus ile kontamine edilmiştir. 7 gün boyunca S. aureus’un gelişimi ve SEA sentezi gözlemlenmiştir. Haşlanmış domuz etinde SEA sentezinin 3. gün sonunda maksimum düzeye ulaştığı, ardından beklenmeyen bir şekilde azaldığı görülmüş ve bu durumun enterotoksinlerin stabil, ısıya, pH değişimlerine ve dehidrasyona dirençli olması ile ters bir durum oluşturduğu belirtilmiştir. Bunun yanında 3 günlük inkübasyon sonunda tütsülenmiş domuz etinde sentezlenen SEA’nın haşlanmış domuz etindeki oranından 6 kat daha az olduğu görülmüştür. Serrano tip domuz etinin yüksek tuz ve yağ içeriğinin S. aureus için kısıtlayıcı ortam oluşturduğu, SEA sentezinin ancak 5. gün sonunda ve çok düşük düzeylerde tespit edildiği raporlanmışdır. Karabiberli domuz salamında ise düşük pH ve su aktivitesi, yüksek yağ içeriği, rekabetçi mikroflora ve karabiberin antimikrobiyal etkisi dolayıyla örnekte SEA tespit edilemediği ve S..aureus düzeyinin de ilk inokülasyon düzeyinde seyrettiği belirlenmiştir (Carlquist ve ark. 2010). 4.3 Antibiyotik Duyarlılığının Saptanmasıyla İlgili Bulgular: Çalışmada 6 farklı gıdadan izole edilen (3 tavuk burger, 2 yaş pasta, 1 pilav) S. aureus suşunun antibiyotik duyarlılığının saptanması amacıyla 50µL/petri olacak şekilde vancomycin (6mg/L -Oxoid SR0186E) ve cefsulodin sodium salt hydrate (50mg/mL-Sigma Aldrich C8145) kullanılmıştır. Metod olarak Kirby-Bauer disk difüzyon metoduna göre yapılan çalışma sonunda petrilerde oluşan inhibisyon zon çapları (mm) Çizelge 4.6’de sunulmuştur. Çizelge 4.6’da görüldüğü üzere 5 farklı S. aureus suşunun da cefsulodin’e karşı duyarlılığı, vancomycin’den daha fazla olarak saptanmıştır. Tavuk burger-1’den izole edilen S. aureus suşunun cefsulodin (57 mm) ve vancomycin (37 mm)’e karşı gösterdiği direncin en az düzeyde olduğu saptanmıştır. Vancomycin’ e karşı en az duyarlılık pilav örneğinden izole edilen suşda (24 mm) gözlenirken, cefsulodin’e karşı en az duyarlılığın da yaş pasta-1 (49mm) örneğinde olduğu görülmektedir (Çizelge 4.6). Cefsulodin ve vancomycin uygulamasında oluşan petrideki zon görünümleri Şekil 4.1’de ve Şekil 4.2’de sunulmuştur. 22 Çizelge 4.6. İzole edilen S. aureus suşlarının cefsulodin ve vancomycin’e karşı inhibisyon etkinliğinin değerlendirilmesi Suşun izole edildiği Vancomycin Kontrol Cefsulodin Kontrol örnek (mm) (mm) (mm) (mm) Tavuk burger-1 37 0 57 0 Tavuk burger-2 32 0 56 0 Tavuk burger-3 34 0 54 0 Yaş pasta-1 27 0 49 0 Yaş pasta-2 26 0 52 0 Pilav 24 0 56 0 Yaman ve ark.’nın (2010) 50 adet metisiline duyarlı (MSSA) ve 50 adet dirençli (MRSA) S..aureus suşunun antibiyotik direncinin saptanmasıyla ilgili çalışmasında suşlarda vankomisin ve teikoplanine karşı direnç görülmediği raporlanmıştır. Sonuçta; S. aureus suşlarının hepsinin vankomisin ve teikoplanine duyarlı olduğu, ancak metisilin direnci ile birlikte diğer antibiyotiklere karşı da direnç gelişiminde artış olduğunu belirtmişlerdir. Çizelge 4.6’da oluşan inhibisyon zon çapları incelendiğinde çalışma verilerinin Yaman ve ark. (2010)’nın sonuçlarını destekler nitelikte olduğu görülmektedir. Yapılan bir başka çalışmada; çeşitli klinik örneklerden izole edilen 814 adet S. aureus suşunun metisilin, vankomisin, teikoplanin, eritromisin, gentamisin, klindamisin, siprofloksasin, ripampin ve trimetoprim- sulfametaksazole (TMP/ SMX) duyarlılıkları incelenmiştir. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standarts) standartlarına uygun olarak disk difüzyon yöntemi kullanılarak yapılan çalışmada izole edilen 814 S. aureus suşunun 264’ü (%32,4) metisiline dirençli (MRSA), 550’si duyarlı (MSSA) olarak saptanmıştır. İncelenen MRSA ve MSSA suşlarından sırasıyla; eritromisine % 59,5 ve %14,2, tetrasikline %57,6 ve %23,5, gentamisine % 28,4 ve %8,4, klindamisine %28,4 ve %10,2, siprofloksasine %34,1 ve %14,7,rifampine %31,4 ve %16 oranlarında direnç saptanırken, vankomisin ve teikoplanine dirençli suş bulunmadığı rapor edilmiştir (Kurutepe ve ark. 2007). Yakupoğulları ve ark. (2006) tarafından 137 S..aureus suşunun siprofloksasin, ofloksasin, levofloksasin ve moksifloksasin’e karşı duyarlılıkları incelenmiş ve %49 metsilin direnç oranı saptanırken, siprofloksasin, ofloksasin, 23 levofloksasin ve moksifloksasin duyarlıkları sırasıyla %52, 55, 56, 60 olarak bulunmuştur. S. aureus suşunun cefsulodin’e karşı duyarlılığıyla ilgili sonuçlar, benzer başka bir çalışma bulunamadığından değerlendirilememiştir. 24 25 26 5. SONUÇ ve ÖNERİLER Bu çalışmada S. aureus açısından risk oluşturan gıdalar göz önüne alınarak şarküteri, donmuş et ürünü, hazır yemek, peynir, sütlü tatlı, yaş pasta ve dondurmayı içeren toplam 190 adet örnekle çalışılmıştır. Örneklerin 45’inin (% 24,7) S. aureus açısından bulaşık olduğu ve 1 6 kontaminasyon düzeyinin 1.2x10 - 4.2x10 kob/g olduğu görülmüştür. S. aureus sayısı 3 1,0x10 kob/g’dan fazla olan 11 adet örnek enterotoksin açısından incelenmiş ve 6’sının (% 3,6) pozitif olduğu saptanmıştır. Elde edilen verilere göre en riskli hazır gıdaların; tavuk burger, şarküteri ürünleri, yaş pasta, hazır yemek ve peynir olduğu belirlenmiştir. S. aureus açısından oluşabilecek riskleri en aza indirmek için uygulanması gereken genel önlemlere aşağıda değinilmiştir. -Gıdaların hazırlama, pişirme ve servisinde kişisel hijyen kurallarına uyulması, -Çapraz kontaminasyonun önlenmesi, -Gıda ile temas halindeki personelin yeterli hijyen eğitimine sahip olması, -Mikroorganizma gelişimine olanak sağlayacak 5-65˚ C sıcaklık aralığının gıdalar açısından riski göz önüne alınarak; uygun sıcaklıklarda muhafazanın sağlanmasıdır. 27 KAYNAKLAR Adwan, G., Abu-Shanab, B., Adwan, K. 2005. Enterotoxigenic Staphylococcus aureus in raw milk in the North of Palestina. Türk J. Biol., 29: 229-232. Akineden, Ö., Hassan, A. A., Schneider, E., Usleber, E. 2008. Enterotoxigenic properties of Staphylococcus aureus isolated from goats milk cheese. Int. J. Food Microbiol. 124: 211- 218. Alişarlı, M., Sağun, E., Alemdar, S., Akkaya, L. 2001. Kremalı pastalarda Staphylococcus aureus suşlarının gelişme ve enterotoksin oluşturma özellikleri üzerine etki yapan faktörler. Turk J. Vet. Anim. Sci., 26(3): 535-542. Ayçiçek, H., Cakıroğlu, S., Stevenson, H. T. 2004. Incidense of Staphylococcus aureus in ready-to-eat meals from military cafetarias in Ankara,Turkey. Bacteriological Analytical Manuel (BAM), Bennett, R. W., Lancette, G. A. 2001. Food and Drug Administration (FDA), Staphylococcus aureus, Chapter: 12 Belay, N., Rasooly, A. 2002. Staphylococcus aureus growth and enterotoxin A production in anaerobic environment. J. Food Prot., 65: 199-204. Bergdoll, M. S. 1991. Staphylococcus aureus. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 74: 706-710. Bilge, F., Karaboz, İ. 2005. İzmir’de piyasada açıkta satışa sunulan bazı gıdaların Staphylococcus aureus ve enterotoksinleri bakımından incelenmesi.Orlab On –Line. 3(6):6-7 Bauer, A. W., Perry, D. M., Kirby, W. M. M. 1959. Single disc antibiotic sensitivity testing of Staphylococci. A.M A. Arch. Intern. Med. 104:208–216. Carlquist, N. W., Marta, D.,Borch, E., Radström, P. 2010. Prolonged expression and production of Staphylococcus aureus enterotoksin A in processed pork meat. Int. J. Food Microbiol, 141: 69–74. CDC, Central Desease Control, 2011. EID Journal, Vol: 17, Number 9. Chordash, R.A., Potter, N.N.1976. Stability of Staphylococcal enterotoxin a to selected conditions encountered in foods. Journal of Food Science, 4:906-909 Culos, K.A., Cannon, J.P., Grim, S.A. 2011. Alternative agents to vancomycin for the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections. American J. Therapeutics, 24(6): 571-6. Çolak, H., Ulusoy, B., Bingöl, B., Hampikyan, H., Muratoğlu, K. 2007. Tüketime sunulan bazı hazır yemeklerin mikrobiyolojik kalitesinin incelenmesi. Türk Mikrobiyoloji Cem. Derg., 37 (4): 225-233. 28 Evenson, M. L., Hind, M. V., Berstein, R. S., Bergdoll, M. S. 1988. Estimation of human dose of staphylococcal enterotoksin A from a large outbreaks of Satphylococcal food poisoning involving chocolate milk. Int. J. Food Microbiol., 23: 311-316. Ferrer, M. D., De simon, D., Tarrago, C. 1992. Presence of microorganisms in prepared cooked foods. Alimentaria. 229:69-70. Gilbert, R. J. 1974. Staphylococcal food poisoning and botulism. Postrgrad. Med. J., 50: 603-611. Gilmour, A., Harve, J., 1990. Staphylococci in milk and milk product. J.Appl. Bacteriol. Symposium supp. 7:147-166. Guillen, I. J., Bermejo, G. D., Fombuena, E. R., Echave, M. I. 1994. Enterotoxigenic Staphylococcus aureus identification in food samples from restaurants. Alimentaria 231: 35- 37. Halkman, K. 2005. Merck Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları 1.Baskı.Başak Matb., Ankara, s. 181-182 ve s. 281-282. Hampikyan, H., Ulusoy, B., Bingöl, B., Çolak, H., Akha, M., 2008. İstanbul’da tüketime sunulan bazı ızgara tipi gıdalar ile salata ve mezelerin mikrobiyolojik kalitelerinin belirlenmesi. Türk Mikrobiyoloji Cem. Derg , 38 (2): 87-94. Halpin-Dohnalek, M., Marth, E. 1989. S. Aureus: Product of excompounds and behaviors in food . J.Food.Pro., 54(4): 267-282. Hobbs, B.C. 1960. Staphylococal and Clostridium welchi food poisoning. Roy.Soc.Health J. 267-271. Holmberg, S. D., Blake, P. A. 1984. Staphylococcal food poisoning in the United States, New facts and old misconceptions. J. Amer. Med. Assoc., 251: 487-489. Ildız, F., Çiftçioğlu, G. 1997. Toplu tüketim amacıyla üretilen bazı gıdaların patojen mikroorganizmalar yönünden incelenmesi. İ.Ü. Vet. Fak. Derg., 23(2): 405-412. Ippolito, G., Leone, S., Lauria, F. N., Nicastri, E., Wenzel, R.P. 2010. Methicillin- resistant Staphylococcus aureus: the superbug. Int. J. Infect Dis., 4: 7-11. Jay, J. M. 1992 Staphylococcal gasteroenteritis, In: Modern Food Microbiology. 4th Edition, New York: Avi Book, pp: 455- 471. Karaboz, İ., Sukatar, A. 2004. Bakterilerde sosyal davranışlar (Bakterilerde iletişim mekanizmaları), Orlab On-Line Mikrobiyoloji Derg., 2:5, 23-32. Khalafalla, G. M., Zahra, M. K., El-Shenawy, M. 1991. Enterotoxin producing staphylococci in some bakery products. Annals Agricultural Sci. 36,2:347-353 In: FSTA, 1993). 25.4 M 72 29 Kısa, Ö., Albay, A., Erol, İ., Sırıken, B., Esin, N., Gün, H., Yurtyeri, A. 1996. Kremalı pastalardan izole edilen koagulaz pozitif stafilokokların enterotoksin oluşturma özelliklerinin Vidas yöntemiyle belirlenmesi. Ankara Üniv. Vet. Fak. Derg.43: 405-411. Kievit, T. R., Inglevski, B. H. 2000. Bacterial quorum sensing in pathogenic relationship. Infection and ımmunity, 68(9): 4839-4849. Kim, N. H., Yun, A. R., Rhee, M. S. 2011. Prevalence and classfication of toxigenic Staphylococcus aureus isolated from refrigerated ready-to-eat foods (sushi, kimbab and California rolls) in Korea. Journal of applied Microbiology Derg.111:1456- 1464. Koseyan, S. A., Bennet, R. W. 1972. The effect of growth conditions of production of enterotoxin A by Staphylococcus aureus in custard. Abs.of the annual meeting of the American society for micribiol. pp: 72:22. Kurutepe, S., Sürücüoğlı, S., Gazi, H., Teker, A.,Özbakkaloğlu, B. 2007.Metisiline – dirençli ve duyarlı Staphylococcus aureus suşlarının antibiyotiklere direnç oranları. Celal Bayar Ünv. İnfeksiyon Derg. 21(4):187-191. Lentino, J. R., Narita, M., Yu, V.L. 2008. New antimicrobial agents as therapy for resistant gram-positive cocci. Eur. J. Clin. Microbiol Infect Dis., 27(1): 3-15. Lina, G., Quaglia, A., Reverdy, M. E., Leclercq, R., Vandenesch, F., Etienne, J. 1999. Distribution of genes encoding resistance to macrolides,lincosamides and streptogramins among Staphylococci. American Society for micr., Antimicrob Agents Chemotherapy, 43:1062-1066. Moreno, P., Pla, S., Fagoaga, F., Torregrosa, A., Garcia, M. 1996. Microbiological analysis of dishes served in collective restaurants. Alimentaria. 133:19-22. National Comittee for Clinical Laboratory Standarts, 1988. “Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically”. Second Edition, Tentative Standarts M7-T2. Normanno, G., Firinu, A., Virgilio, S., Mula, G., Dambrosio, A., Poggiu, A., Decastelli, L., Mioni, R., Scuota, S., Bolzoni, G., Di Gianatale, E., Salinetti, A.P., La Salandra, G., Bartoli, M., Zuccon, F., Pirino, T., Sias, S., Parisi, A., Quaglia, N.C., Celano, G.V. 2005. Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy. J. Food Microbiol., 98: 73-79. Normanno, G., LaSalandra, G., Dambrosio, A., Quaglia, C.N., Corrente, M., Parisi, A., Santagada, G., Firinu, A., Crisetti, E., Celano, G. V. 2007. Occurance characterization and antimicrobial resistance of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from meat and dairy products. J. Food Microbiol., 115: 290–296. Omoe, K., Imanishi, K., Hu, D.L., Kato, H., Omoe, H.T., Nakane, A., Uchiyama, T., Shinagawa, K. 2004. Biological properties of Staphylococcal enterotoxin-like toxin type R. American society for microbiol. Infection and Immunity .72(6): 3664-3667. 30 Orwin, P. M., Fitzgerald, J. R., Leung, D. Y. M., Guiertez, J. A., Bohach, G. A., Schlievert, P. M. 2003. Characterization of Staphylococcus aureus enterotoxin L. American society for microbiol. Infection and Immunity ,71(5): 2916-2919. Özer, Ö., Özalp, E., Açıkgöz, M., Aytac, H., Ünal, T., Gran, A., Burgu, İ. 1968. Ankara pastanelerinde satılan pastaların bakteriyolojik nitelikleri üzerine araştırmalar. A.Ü. Vet.Fak. Derg. 40; 22-31. Rall, V. L. M., Vieira, F.P., Rall, R.,Vieitis, R.L., Fernandes, A., Candeias, J.M.G., Cardoso, K.F.G., Araujo, J.P. 2008. PCR detection of Staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus aureus strains isolated from raw and pasteurized milk. Vet Microbiol ,132: 408-413. Resmi Gazete. 2001. Türk gıda kodeksi- Mikrobiyolojik kriterler tebliği. No:24511/ 19. Rose, S. A., Modi, N. K., Tranter, H. S., Bailey, N. E., Stringer, M. F., Hambleton, P. 1988. Studies on the irradiation of Clostridium botulinum and Staphylococcus aureus. J. Appl. Bacteriol, 65: 223-229. Rosec, J. P., Guiraud, J. P., Dalet, J., Richard, N. 1997. Enterotoxin production by Staphylococci isolated from foods in France. J. Food Microbiol., 35: 213-221. Shanson, D. C. 1982. Multiple antibiotic resistanst staphylacocci: Hospital Infection and ıts control surrey :Sabri S. Titterson JR ,: Barker Publ Ltd,:52-61. Sokari, T. 1991. Distribution of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in ready-to-eat foods in eastern Nigeria. Int. J. Food Microbiol., 12(2-3):275-9. Stefani, S., Goglio, A. 2010. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: related infections and antibiotic resistance. Int J Infect Dis., 4: 19-22. Stevens, D. L., Ma, Y., Salmi, D. B., Mclndoo, E., Wallace, R. J., Bryant, A. E. 2007. Impact of antibiotics on expression of virulence- associated exotoxin genes in methicillin- sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Infec. Dis., 195(2): 202-11. Summer, S., Albrecht, A. J., Peters, D. L. 1993. Occurance of enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus and enterotoxin production in bakery products. J. Food. Prot. 56: 722- 724. Şengöz, G., Yıldırım, F., Kart, K. Y., Şengöz, A., Nazlıcan, Ö. 2004. Stafilokok suşlarının fusidik asit ve çeşitli antibiyotiklere direnci, Ankem Derg.,18(2):105-8. Tatini, S.R. 1973. Influence of food environments on growth of Staphylococcus aueus and production of various enterotoxins. J. Milk Food Technol., 36: 559-563. Tibana A, Rayman K, Akhtar M, Szabo R. 1987. Thermal stability of enterotoxins A, B, and C in a buffered system. J Food Prot., 50: 239-242. Tunail, N. 2000. Staphylococcus aureus: Gıda mikrobiyolojisi ve uygulamaları (2. Baskı), Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Ankara, 522-526s. 31 Tükel, Ç., Doğan, H. 2000. Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları. Ankara Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Bölümü, Ankara, 143-150s. Ünlütürk, A., Turantaş, F. 2003. Staphylococcus aureus intoksikasyonu: Gıda Mikrobiyolojisi,Beta Matbaacılık hizmetleri, Bornova, İzmir, 141-145s. Vidas Staph enterotoxin II(SET2) test kiti kullanma kitapcığı, 2008. Bieoumerieux, Ref:30705. Wieneke, A. A. 1974. Enterotoxin production by strains of Staphylococcus aureus isolated from foods and human beings. J. Hyg. Camb., 73: 255-261. Yakupoğulları, Y., Gündüz, A., Özcan, M., Doğukan, M., Seyrek,, A., Yılmaz, M. 2006. Staphylococcus aureus suşlarının Siprofloksasin, Ofloksasin, Levofloksasin ve Moksifloksasin duyarlılıkları, Fırat tıp Dergisi, 11(1):45-47. Yaman, G., Çıkman, a., Berktaş, M., Parlak, M., Güdücüoğlu, H., Karahocagil, M. K. 2010. Hastane kökenli Staphylococcus aureus izolatlarında MLSb, fusidik asit ve diğer antibiyotiklere direnç.Ankem derğisi, 24(3): 130-135. Yde, M. 1982. Mikrobiologishe kwaliteit van gebak metbanketbakkersroom Een steekproefonderzoek. Belg Arch Soc. Gen, Arbeidsg &Ger Gen. 40: 455-466. Yılmaz, S., Gönülalan, Z. 2010. Kayseri bölğesinde tüketime sunulan çiğ sütlerde Staphylococcus aureus ve enterotoksin varlığının araştırılması, Sağlık Bilimleri Dergisi ,19(1) 26-33. Zhang, S., Jandolo, J., Stewart, C. 1998. The enterotoxin D plasmid of Staphylococcus aureus ancodes a second enterotoxin determinant(sej). FEMS Microbiol.Lett.168: 227-233. 32 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Özlem Aslan Doğum Yeri ve Tarihi : Bursa-1978 Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Mustafakemalpaşa Lisesi- (1993-1995) Lisans : Ege Üniversitesi- Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü (1995-2000) Yüksek Lisans : ---------------- Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl : Bursa Gıda ve Yem Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü (2004-----) Tartaş Dondurulmuş Gıda AŞ.( 2000-2002) İletişim (e-posta) : ozaslan78@hotmail.com Yayınları : ------ 33