EPILOBIUM HIRSUTUM L. EKSTRESİNİN PROSTAT KANSERİ HÜCRE HATLARINDAKİ SİTOTOKSİK ETKİSİNİN MOLEKÜLER DÜZEYDE İNCELENMESİ Buse VATANSEVER T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ EPILOBIUM HIRSUTUM L. EKSTRESİNİN PROSTAT KANSERİ HÜCRE HATLARINDAKİ SİTOTOKSİK ETKİSİNİN MOLEKÜLER DÜZEYDE İNCELENMESİ Buse VATANSEVER 0000-0002-2873-3885 Prof. Dr. Hulusi MALYER Prof. Dr. Hale ŞAMLI (Danışman) (İkinci Danışman) (Bursa Uludağ Üniversitesi) DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI BURSA – 2020 Her Hakkı Saklıdır Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında;  tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi,  görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu,  başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu,  atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi,  kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı,  ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 20/10/2020 Buse VATANSEVER ÖZET Doktora Tezi EPILOBIUM HIRSUTUM L. EKSTRESİNİN PROSTAT KANSERİ HÜCRE HATLARINDAKİ SİTOTOKSİK ETKİSİNİN MOLEKÜLER DÜZEYDE İNCELENMESİ Buse VATANSEVER Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Hulusi MALYER İkinci Danışman: Prof. Dr. Hale ŞAMLI (Bursa Uludağ Üniversitesi) Bu çalışmada; halk tıbbında birçok prostat hastalığının tedavisinde kullanılan ve ülkemizde doğal olarak yetişen Epilobium hirsutum L. (tüylü yakı otu) bitkisinin, DU 145 ve PC-3 insan androjen bağımsız prostat kanseri hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkisinin moleküler düzeyde araştırılması amaçlanmıştır. Bu kapsamda, ham ekstrelerin ve kaba fraksiyonların hazırlanmasında ʽbiyolojik aktivite rehberli fraksiyonlamaʼ yaklaşımı temel alınmıştır. Bitkinin toprak üstü kısımlarından, maserasyon yöntemiyle A (n-hekzan), B (diklorometan), C (%100 metanol), D (%80 metanol) ve E (su); Soxhlet ekstraksiyonuyla F (n-hekzan); Soxhlet ekstraksiyonu sonrası maserasyon ve geri soğutucu yöntemleriyle G (%80 metanol) ve H (%80 metanol); infüzyon yöntemiyle K (su) kodlu ekstreler elde edilmiştir. Aktif ekstreden ise kaba fraksiyonlama yapılmıştır. Ekstrelerin ve fraksiyonların sitotoksik aktiviteleri, SRB ve XTT hücre canlılık testleriyle taranmıştır. Sitotoksik ekstre/fraksiyon dozlarının neden olduğu ölüm şekli, M30 ELISA ve ikili boyama (Hoechst 33342/propidyum iyodür) yöntemleriyle analiz edilmiştir. Hücre ölüm yolaklarında görevli gen ve protein ekspresyonları ise, kantitatif gerçek zamanlı PZR ve western blot analizleri ile belirlenmiştir. Elde edilen bulgulara göre; en güçlü sitotoksik etkiyi E kodlu ekstrenin gösterdiği ve bu ekstreden hazırlanan E1 (kloroform), E2 (etil asetat), E3 (n-butanol) ve E4 (su) kodlu fraksiyonların ekstre kadar etkili olmadıkları tespit edilmiştir. Bu sonuç, ekstredeki etken maddelerin birlikte bulunmaları durumunda sinerjik etki göstermeleriyle açıklanmıştır. Sitotoksik (>IC50) ve sitotoksik olmayan (IC50) and non-cytotoxic(99,0 Fluka 19430 n-Hekzan, ≥%95 Sigma-Aldrich 208752 Nonidet P-40 (NP-40) Sigma-Aldrich 74385-1L Oenothein B analytical standard Sigma-Aldrich 03805 Paclitaxel from Taxus brevifolia, Sigma-Aldrich T7402- 1MG ≥%95 Penisilin (10 000 U/ml) - streptomisin Biological Industries 03-031-1B (10 mg/ml) TM Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23227 TM Pierce dimetilsülfoksit (DMSO), Thermo Scientific 85190 LC-MS grade Propidium iodide, 1 mg/ml BioVision 1056-1 Protease/phosphatase inhibitor Cell Signaling 5872 cocktail, 100X Technology RIPA lysis and extraction buffer Thermo Scientific 89901 Roswell Park Memorial Institute Sigma-Aldrich R8758 (RPMI) 1640 Sample buffer, Laemmli 2X Sigma-Aldrich S3401-10VL Concentrate Sığır serum albümini, proteaz-free Capricorn Scientific BSAPF Sodyum azid Sigma-Aldrich 71289 Sulfhorodamine B sodium salt (SRB) Sigma-Aldrich S1402 Transfer buffer, methanol-free, 10X Thermo Scientific 35040 Trikloroasetik asit Merck Millipore 100807.0250 Tripsin-EDTA, %0,25 Biological Industries 03-052-1B Tris Amresco 0826 Tris buffered saline with tween 20 Cell Signaling 9997S (TBS-T), 10X Technology Tris/glycine/SDS running buffer, 10X BioRad 161-0772 Triton X-100 Biobasic TB0198 Trypan blue solution, %0,5 Biological Industries 03-102-1B Yağsız kuru süt tozu (Nonfat dry Cell Signaling 9999S milk) Technology 39 3.1.4. Primerler ve problar Tez çalışmasının kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) analizinde kullanılan primerler ve problar Çizelge 3.2ʼde verildi. Çizelge 3.2. Kantitatif gerçek zamanlı PZR analizinde incelenen genlere ait primerler ve problar Üretici Katalog Gen Adı Primerler ve Problar Firma Numarası β-Actin (ACTB) Universal ProbeLibrary probe #63 Roche 4688627001 ATG5 Universal ProbeLibrary probe #39 Roche 4687973001 Beclin 1 (BECN1) Universal ProbeLibrary probe #55 Roche 4688520001 Caspase 3 (CASP3) Universal ProbeLibrary probe #92 Roche 4692098001 Caspase 8 (CASP8) Universal ProbeLibrary probe #40 Roche 4687990001 Caspase 9 (CASP9) Universal ProbeLibrary probe #42 Roche 4688015001 Caspase 10 (CASP10) Universal ProbeLibrary probe #21 Roche 4686942001 Cytochrome C (CYCS) Universal ProbeLibrary probe #55 Roche 4688520001 FADD Universal ProbeLibrary probe #64 Roche 4688635001 PARP1 Universal ProbeLibrary probe #41 Roche 4688007001 RIPK1 Universal ProbeLibrary probe #9 Roche 4685075001 3.1.5. Antikorlar Tez çalışmasının western blot analizinde kullanılan antikorlar Çizelge 3.3ʼde verildi. Çizelge 3.3. Deneysel çalışmalarda kullanılan antikorlar Katalog Antikorlar Üretici Firma Numarası β-Actin (13E5) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 4970T Atg5 (D5F5U) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 12994 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7074S Caspase-3 (8G10) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 9665T Caspase-8 (D35G2) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 4790T Caspase-9 Antibody (Human Specific) Cell Signaling Technology 9502T Cytochrome c (D18C7) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 11940T Rabbit Caspase-10 Polyclonal Antibody YL Biont YID0803 40 3.1.6. Sarf malzemeler Tez çalışması boyunca deneylerde kullanılan sarf malzemeler Çizelge 3.4ʼde verildi. Çizelge 3.4. Deneysel çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler Sarf Malzemeler Üretici Firma Ayırma hunisi Teknik cam Buharlaşma balonu (armudi tip) İldam Blotlama kağıdı Macherey-Nagel Cam, rodajlı lam, 26 mm x 76 mm Isolab Cam lamel, 24 mm x 24 mm Isolab Cam pastör pipet (2 ml) Isolab Cam şişeler (farklı hacimlerde) Isolab ve Schott Duran Falkon tüpler (15 ve 50 ml) Corning Filtreli steril pipet uçları (10, 200 ve 1000 μl) ATS ve Corning 2 Flasklar (25 ve 75 cm ) Corning Immobilon-P PVDF transfer membranı (0,45 μm) Millipore Jel yükleme pipet uçları (200 μl, 0,57 mm) SSIbio Kriyoviyal tüpler (2 ml) Corning ve Nest Mikroplakalar (6 ve 96 kuyucuklu) Nest Mini protean TGX precast protein gels (% 4-15, 30 μl) 4561083, BioRad 2 Neubauer hemositometresi (0,1 mm 0,0025 mm ) Isoterm PZR tüpleri (0,2 μl) Thermo Scientific Santrifüj tüpleri (0,5, 1,5 ve 2 ml) Eppendorf Serolojik pipetler (5 ve 10 ml) LP Italiana Spa Steril enjektörler (5, 10 ve 20 ml) Hayat Steril filtre (0,2 μm) Corning Steril küvet (50 ml) Corning Şilifli cam kaynama balonları İldam Şilifli cam erlenler İldam 41 3.1.7. Cihazlar ve ekipmanlar Tez çalışması kapsamında kullanılan cihazlar ve ekipmanlar Çizelge 3.5ʼde verildi. Çizelge 3.5. Deneysel çalışmalarda kullanılan cihazlar ve ekipmanlar Cihazlar ve Ekipmanlar Model ve Üretici Firma Mini-protean tetra cell (2-gel) and tetra 1660827EDU, BioRad blotting module Analitik terazi AUX 320, Shimadzu Balon ısıtıcı MX 425, Elektro-mag Buzdolabı (4 °C) Arçelik Buz üretme cihazı AF80-AS, Scotsman Çalkalamalı inkübatör SSI3, Shel Lab Çok kanallı pipet (20-200 μl) Axypet, Axygen Derin dondurucu (-20 °C) Arçelik Dijital kamera ataçmanlı inverted mikroskop 3032, AccuScope Floresan ataçmanlı inverted mikroskop N-800M, Novel TM Görüntüleme cihazı 1708280, ChemiDoc MP, BioRad Güç kaynağı (elektroforez için) PS300B, Hoefer Isıtıcılı manyetik karıştırıcı MSH-300, Biosan Kuru ısı bloğu TS-100, Biosan ® LightCycler 480 II 05015278001, Roche Manyetik karıştırıcılı balon ısıtıcı E-104, Mtops Mikroplaka çalkalayıcı PST-60HL-4, Biosan Hassas terazi EMB 2000-2, Kern Inverted mikroskop CKX41, Olympus Kaba terazi BP3100S, Sartorius Karbondioksit (CO2)ʼli etüv BB15, Thermo Scientific Liyofilizatör Labconco Freeze Dry System Mekanik karıştırıcı RZR 2021, Heidolph Mikroplaka okuyucu iMark, BioRad Mikrosantrifüj D-78532, Labogene ScanSpeed Mini karıştırıcı MR-1, Biosan Minisantrifüj Sprout IKA, KS 260 basic ve Orbital çalkalayıcılar Model 1000, VWR International Otoklav OT4060V, Nüve Otomatik pipetler (1-10 μl, 10-100 μl, Rainin 20-200 μl ve 100-1000 μl) Rotary evaporatör Hei-VAP Advantage, Heidolph Rotary evaporatör, büyük ölçekli R-151, Buchi Simplicity® Water Purification Saf su cihazı System, Merck Millipore Soğutmalı santrifüj 5500, Kubota Soxhlet ekstraktörü İldam Spektrofotometre NanoDrop 2000C, Thermo Scientific 42 Çizelge 3.5. Deneysel çalışmalarda kullanılan cihazlar ve ekipmanlar (devam) Cihazlar ve Ekipmanlar Model ve Üretici Firma Steril kabin Labculture Class II BSC, Esco Su banyosu GFL 1086, Thermolab Şarjlı pipet pompası Motopet, Axygen GCI-96, Corbett Reseach Palm Thermal Cycler (termal çevrim cihazı) Cycler Tıbbi soğutma cihazı (-80 °C) MDF-U7386S, Sanyo Elmasonic S 100 H, Elma Ultrasonik banyo Schmidbauer Vakum Pompası V100, Buchi Vorteks Vortex-Genie 2, Scientific Industries 3.2. Yöntem 3.2.1. Epilobium hirsutum L. bitkisinin toplanması, tanımlanması ve kurutulması Çalışma materyalini oluşturan Epilobium hirsutum L. bitkisine ait örneklerin toplanması amacıyla ilk olarak, Flora of Turkey and East Aegan Islands (Davis 1972) adlı eserde ve Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Herbaryumu (BULU) örneklerinde bildirilen flora kayıtları incelendi. Lokaliteyi tespit etmek için bitkinin çiçeklenme zamanı, habitatı, yüksekliği ve yayılış alanları ile ilgili bilgilerden faydalanarak arazide keşif çalışmaları planlandı. Arazi çalışmalarında, bitkinin A2 Bursa: Orhaneli, Sadağı Kanyonuʼnda dere yatağı kenarlarındaki nemli topraklarda doğal yayılış gösteren popülasyonlarının varlığı tespit edildi. 23.06.2017 tarihinde, çiçek açma periyodundaki bitkinin; gövde, yaprak ve çiçekten oluşan toprak üstü kısımlarından (herba), örnek olarak ve ekstraksiyona yetecek miktarda toplandı. E. hirsutum bitki türünün tanımlanması ve Orhaneli, Sadağı Kanyonuʼndaki yayılış alanlarından toplanması, Prof. Dr. Hulusi Malyer tarafından gerçekleştirildi. Bitki örnekleri çevresel kirlilik bulunmayan temiz alandan toplandı. Bitki materyalinin toplanması sırasında ekosistemdeki hassas dengenin bozulmamasına ve türün neslinin sürdürülebilir olmasına özen gösterildi. Bitkinin tespit edildiği lokalitede geniş yayılış alanına sahip olması ve yoğun popülasyonlarının bulunması, küçük ölçekteki toplama için bir sakınca oluşturmadı. Bitkinin usulüne uygun şekilde ve morfolojisini kaybetmeden hazırlanmış herbiye örneği, BULU herbaryum 43 koleksiyonunda (BULU numarası: 4236) saklanmaktadır. E. hirsutum bitki türünün toplandığı lokalitedeki fotoğrafları Şekil 3.2ʼde verildi. Şekil 3.2. Doğal yayılış alanındaki Epilobium hirsutum L. bitkisi 44 Bitkinin taze toprak üstü kısımları yabancı maddelerden temizlenerek gölgede kurumaya bırakıldı. Kurutulmuş bitkinin yaprakları ve çiçekleri gövdeden ayrıldı ve elde edilen kuru ağırlık kaba terazide tartıldı. Bitkisel drog (Epilobii herba, tüylü yakı otu herbası), ekstraksiyon çalışmalarına kadar nem ve ışık almayan, serin, havadar ve karanlık oda koşullarında saklandı (Şekil 3.3). Şekil 3.3. Epilobium hirsutum L. bitkisinin kurutulması 3.2.2. Epilobium hirsutum L. bitkisinin ekstraksiyon çalışmaları E. hirsutum bitkisindeki potansiyel biyoaktif bileşenleri izole edebilmek amacıyla bitkisel drogdan, farklı çözücüler ve yöntemler ile ham ekstreler hazırlandı. Ekstraksiyon yöntemlerinin ve organik çözücülerin seçiminde literatür bilgileri ve geleneksel kullanım şekilleri dikkate alındı. Bitki materyali etnobotanik bir bakış açısıyla seçildiğinden dolayı, etken maddelerin izole edilme şansını artırmak için genel ekstraksiyon protokolüne alternatif yöntemler ve farklı polaritelerdeki organik çözücüler dâhil edildi. Böylece, kapsamlı bir ön ekstraksiyon çalışmasıyla tüm ham ekstrelerin sitotoksik aktivitelerinin taranması ve en iyi sonuçları veren yöntem ve çözücü türü ile çalışmaya devam edilmesi amaçlandı. Ekstraksiyon işlemlerinde, çözücü tabanlı katı-sıvı ekstraksiyon prosedürleri uygulandı. Ekstraksiyon çalışmalarından önce, kurutulmuş ham drog kaba toz haline getirilerek ön işlemden geçirildi (Şekil 3.4). Parçacık boyutunun küçültülmesiyle drog ile çözücü arasındaki temas yüzeyi artırıldı. Böylelikle, çözücünün droğa daha iyi düzeyde nüfuz 45 etmesi, drogda bulunan etken maddelerin çözücü içine daha çok difüze olması ve nihai olarak da ekstraksiyon veriminin artması sağlandı. Şekil 3.4. Kaba toz haline getirilmiş drog Maserasyon yöntemiyle ekstraksiyon Maserasyon, droğun kapalı bir ortam içinde uygun çözücü ile belli bir süre temasta bırakıldığı ve tercihen çalkalama veya sonikasyon işleminin uygulandığı ekstraksiyon tekniğidir. Maserasyon süresi sonunda, elde edilen ekstrenin (maserat) süzme işlemi ile drogdan ayrılması sağlanmaktadır (Sarker ve ark. 2006, Demirci ve ark. 2010b). Maserasyon yöntemiyle ham ekstreler elde etmek için, 5 g olarak tartılmış kaba toz haldeki droglar, 200 ml hacimlerindeki n-hekzan, diklorometan, %100 metanol, %80 metanol ve su çözücüleri ile ayrı ayrı çalkalamalı ekstraksiyona tabi tutuldu. Maserasyon, oda sıcaklığında ve 200 rpmʼdeki orbital çalkalayıcıda ışıktan izole olarak 24 saat boyunca gerçekleştirildi. Maserasyon boyunca, ekstredeki ve drogdaki etken maddelerin konsantrasyonları arasında denge sağlandığında ekstraksiyon durmaktadır. Maserasyona devam edebilmek için bitki materyalinin, etken madde bakımından doygunluğa ulaşmış çözücüden ayrılması ve çözücünün yenilenmesi gerekmektedir. Bu sebeple, 24 saat sonra karışımlar bir filtre kâğıdı aracılığıyla süzüldü ve süzüntüler kullanılan çözücülerin türüne bağlı olarak ayrı cam şişelere aktarıldı. Kalan drogların üzerine taze çözücüler ilave edildi ve 24 saat boyunca aynı şartlar altında tekrar 46 maserasyon gerçekleştirildi. Bu prosedür, literatürde ifade edildiği gibi üç kez tekrarlandı (Sarker ve ark. 2006). Birinci ve ikinci ekstraksiyon adımlarında 200 ml hacminde, son adımda ise 100 ml hacminde organik çözücü kullanıldı. Ekstraksiyon süresi sonunda elde edilen toplam 500 ml hacmindeki maseratlar, yoğunlaştırılıncaya kadar oda sıcaklığında ve ışık almayan ortamda saklandı. Maserasyon yöntemiyle gerçekleştirilen ekstraksiyonun aşamaları Şekil 3.5ʼde gösterildi. Şekil 3.5. Maserasyon yöntemiyle ekstraksiyon İnfüzyon yöntemiyle ekstraksiyon İnfüzyon, drog üzerine kaynar su eklenmesiyle hazırlanan kısa süreli maserasyon işlemidir (Sarker ve ark. 2006, Demirci ve ark. 2010b). Geleneksel tıpta bazı ilaçlar infüzyonlar şeklinde hazırlanmaktadır (Sarker ve ark. 2006). Çalışma kapsamında araştırılan E. hirsutum bitkisi, daha önce belirtildiği üzere halk tıbbında yaygın olarak infüzyon/çay şeklinde kullanılmaktadır. Bu nedenle, sitotoksik aktivitesini çalışmak üzere drogdan %5ʼlik infüzyon ekstresinin hazırlanması planlandı. %5ʼlik infüzyon ekstresi hazırlamak için, 5 g olarak tartılmış kaba toz haldeki drog ° üzerine kaynatılıp dinlendirilmiş 100 ml distile su eklendi. Ardından, karışım 80 C'lik su banyosunda 5 dakika boyunca bekletildi. Süre sonunda, infüzyon ekstresi su banyosundan alınıp oda sıcaklığında soğumaya bırakıldı. Soğuyan ekstre süzüldü ve çözücü kalan drogdan ayrıldı. Elde edilen %5ʼlik infüzyon ekstresi, yoğunlaştırılıncaya kadar oda sıcaklığında ve ışık almayan ortamda saklandı. 47 Soxhlet ekstraksiyonu Soxhlet ekstraksiyonu, küçük ve orta ölçekli bitki materyallerinin ekstre edilmesinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Soxhlet ekstraksiyonu, 1879 yılında Franz von Soxhlet tarafından geliştirilen ve en basit şekliyle şilifli cam kaynama balonu, soxhlet ekstraktörü, geri çeviren soğutucu ve balon ısıtıcı olmak üzere dört bölümden oluşan bir düzenekte gerçekleştirilmektedir (Sarker ve ark. 2006, Kırımer ve ark. 2010). Bu çalışmada, çözücü sıcaklığının ekstraksiyondaki etkisini araştırmak amacıyla Soxhlet ekstraktörü kullanılarak devamlı ekstraksiyon gerçekleştirildi. Ekstraksiyon için ilk olarak, 5 g olarak tartılmış kaba toz haldeki drog, filtre kâğıdından yapılmış özel kartuş içerisinde küçük ölçekli Soxhlet ekstraktörüne yerleştirildi. Daha sonra, çözücü olarak kullanılan n-hekzan, kaynama balonuna ve Soxhlet ekstraktörüne yeterli miktarda (1 sifon yapacak kadar) eklendi. Kaynama balonu, Soxhlet ekstraktörü ve geri çeviren soğutucu birbirine bağlanarak balon ısıtıcı üzerine yerleştirildi. Çözücünün ° kaynayabilmesi için sıcaklık 100 Cʼye (n-hekzanın kaynama noktasının üzerindeki sıcaklığa) ayarlandı ve Soxhlet ekstraktöründe 6 saat süreyle devamlı ekstraksiyon gerçekleştirildi. Ekstraksiyon boyunca, kaynama balonunda ısıtıcı sayesinde kaynayan n-hekzan buharlaştı. Sıcak n-hekzan buharı ekstraksiyon kolundan geçerek geri çeviren soğutucuya ulaştı. Burada yoğunlaşan n-hekzan, damlalar halinde kartuş içerisindeki drog üzerine düşmeye başladı. Soxhlet ekstraktöründeki drog, yoğunlaşan n-hekzan çözücüsü ile tam dolduğunda sifon seviyesine ulaşıldı. Çözücü, sifon yaparak drogda çözdüğü etken maddeler ile birlikte kaynama balonuna boşaldı. Ekstraksiyon süresince, sıcak n-hekzan çözücüsünün drog içerisindeki döngüsü sürekli tekrar etti. Her döngü esnasında, drogdan ekstre edilen etken maddeler kaynama balonu içinde kalırken sadece saf çözücü ile ekstraksiyon devam etti. 6 saat süren devamlı ekstraksiyondan sonra, kaynama balonunda toplanan ekstre soğutulup yoğunlaştırılıncaya kadar oda sıcaklığında ve ışık almayan ortamda saklandı. Soxhlet ekstraksiyonu Şekil 3.6ʼda gösterildi. 48 Şekil 3.6. Soxhlet ekstraksiyonu Soxhlet ekstraksiyonunu takiben yürütülen ikinci ekstraksiyon çalışmaları Bitkisel drogların yapısında bulunan apolar bileşikler, lipofilik maddeler vb. bileşikler, etkinlik açısından daha az öneme sahip oldukları için bazı durumlarda ekstrelerin biyolojik aktivitelerinde beklenen sonuçları engelleyebilmektedir. Böyle durumlarda, bu bileşiklerin drogdan uzaklaştırılması ve ardından elde edilecek ekstrelerin biyolojik aktivitelerinin değerlendirilmesi daha doğru ve güvenilir sonuçlar vermektedir. Bu bağlamda, yürütülen çalışmada Soxhlet ekstraktöründe sürekli sıcak ekstraksiyonuna tabi tutulan drogdan, iki farklı yöntemle ikinci ekstraksiyon çalışmaları gerçekleştirildi. Böylece, apolar bileşiklerin ve lipofilik maddelerin bitkisel droğun aktivitesi üzerinde etkili olup olmadığı değerlendirildi. Soxhlet ekstraksiyonu sonrası kartuştan alınan kaba toz haldeki droglar; havadar, ışık almayan ve oda sıcaklığındaki ortamda kurumaya bırakıldı. Kuruyan droglardan hem maserasyon yöntemiyle hem de geri çeviren soğutucu düzeneği aracılığıyla ayrı ekstreler hazırlandı. 49 Maserasyon yöntemiyle E. hirsutum ekstresinin hazırlanması, daha önce açıklanan prosedür takip edilerek yapıldı. Özetlemek gerekirse, Soxhlet ekstraksiyonu sonrası kurumaya bırakılmış 5 g drog, %80 metanol çözücüsü ile 24 saat boyunca maserasyona bırakıldı. Maserasyon, 200 rpmʼdeki orbital çalkalayıcıda, oda sıcaklığında ve ışıktan izole olarak yürütüldü. 24 saat sonunda, doygunluğa ulaşan çözücü süzme işlemiyle katı drogdan ayrıldı. Doygun çözücünün üç kez tazelenmesinin ardından, bitki materyalinin etkili bileşikleri neredeyse tamamen ekstre edilmiş oldu. Her maserasyon periyodunun sonunda süzülerek drogdan ayrılan maseratlar, en son hacim 500 ml olacak şekilde aynı cam şişede toplandı ve yoğunlaştırma aşamasına dek oda sıcaklığında ve ışık almayan ortamda saklandı. Geri çeviren soğutucu düzeneğindeki ekstraksiyon yönteminin esası, çözücünün; drog ile birlikte kaynaması, buharlaşması ve soğutucuda yoğunlaşması ile droğun devamlı ekstraksiyonuna olanak tanımasıdır. Soxhlet ekstraksiyonu sonrası kurumaya bırakılmış 5 g drog, 300 ml hacmindeki %80 metanol çözücüsü ile geri çeviren soğutucu düzeneğinde 4 saat süreyle devamlı ekstraksiyona tabi tutuldu. Karışım süzüldükten sonra kalan droğun taze çözücü ile 4 saat süren ikinci ekstraksiyonu gerçekleştirildi. Geri çeviren soğutucu düzeneğindeki ekstraksiyon boyunca drog, %80 metanol çözücüsü ile birlikte temastaydı ve sıcaklık etkisiyle çözücü ile birlikte kaynadı. Bu sayede çözücü, drogdaki etken maddeleri çözdü. Drogdan ekstre edilen etken maddeler kaynama balonunda birikirken, kaynama etkisiyle buharlaşan çözücü geri çeviren soğutucuya ulaşıp burada yoğunlaştı ve damlalar halinde tekrar kaynama balonuna boşaldı. Bu şekilde, çözücü kaybı olmaksızın toplam 8 saat boyunca devamlı ekstraksiyon gerçekleştirildi (Şekil 3.7). Ekstraksiyon tamamlandıktan sonra ekstre süzülerek drogdan ayrıldı. Elde edilen ekstre, yoğunlaştırma aşamasına dek oda sıcaklığında ve ışık almayan ortamda saklandı. 50 Şekil 3.7. Geri çeviren soğutucu düzeneğinde ekstraksiyon Bitkisel drogdan çeşitli ekstrelerin hazırlanmasında kullanılan farklı polarite aralığındaki çözücülerin fizikokimyasal özellikleri Çizelge 3.6ʼte verildi. Çizelge 3.6. Ekstrelerin hazırlanmasında kullanılan çözücülerin fizikokimyasal özellikleri (Seidel 2006) Molekül Kaynama Polarite Çözücü Formül Ağırlığı (g/mol) Noktası (°C) İndeksi n-Hekzan C6H14 86,18 69 0,0 Diklorometan CH2Cl2 84,93 41 3,1 Metanol CH3OH 32,04 65 5,1 Su H2O 18,01 100 9,0 51 3.2.3. Ekstrelerin yoğunlaştırılması Ekstraksiyon işlemleri tamamlandıktan sonra, ekstrelerdeki organik çözücülerin uzaklaştırılması ve kuru toz haldeki ham ekstrelerin elde edilmesi gereklidir. Bu çalışmada, ekstrelerdeki stabil olmayan etken maddelerin kaybını engellemek için ekstraksiyon işlemlerinin tamamlanmasının hemen ardından ekstreler yoğunlaştırıldı. Ekstraksiyon işlemleri için kullanılan organik çözücü türüne uygun yöntemler seçilerek konsantre ekstreler elde edildi. Ekstrelerin rotary evaporatör (döner buharlaştırıcı) cihazında yoğunlaştırılması Rotary evaporatör (döner buharlaştırıcı), düşük kaynama noktasına sahip çözücülerin buharlaştırılmasını ve ısıya duyarlı maddelerin bu çözücülerden hızlı ve etkin bir şekilde ayrılmalarını sağlayan cihazdır. Uçucu bileşenlerin, uçucu olmayan bileşenlerden uzaklaştırılması temeline dayanan cihaz, 1950 yılında Lyman C. Craig tarafından icat edilmiştir. Rotary evaporatör sistemi; düşük buhar basıncı, mekanik rotasyon ve ısıtma olaylarıyla çözücülerin buharlaşma oranlarını artıracak şekilde tasarlanmıştır. Bu sistemde, vakum altında buhar basıncının azaltılması çözücünün; kaynama noktasının düşmesine, normalden daha düşük bir sıcaklıkta kaynayıp buharlaşmasına neden olmaktadır. Cam balon içindeki solüsyonun sıcak su banyosundaki mekanik rotasyonu ise, uzaklaştırılacak çözücünün yüzey alanını artırmaktadır. Böylece, çözücünün buharlaşma oranı artarken düzensiz kaynama riski azalmaktadır (Craig ve ark. 1950). Bu çalışmada, farklı yöntemlerle n-hekzan, diklorometan ve %100 metanol çözücüleri kullanılarak hazırlanmış bitki ekstreleri, rotary evaporatör cihazında yoğunlaştırıldı. Farklı yöntemler kullanılarak hazırlanan %80 metanol ekstreleri ise, önce rotary evaporatörde buharlaştırıldı ve metanol çözücüsü ekstreden kaldırıldı. Daha sonra, kalan sulu kısmı uzaklaştırmak için, sonraki bölümde açıklandığı gibi liyofilizasyon (dondurarak kurutma) yapıldı. Rotary evaporatör cihazında buharlaştırma işlemi için, armudi tip buharlaşma balonunun yarısı ekstre ile dolduruldu. Daha sonra, buharlaşma balonu klips kullanılarak rotary evaporatör cihazındaki şilifli desteğe bağlandı ve su banyosu içerisine alındı. Ekstrelerde bulunan ısıya karşı dayanaksız bileşenlerin bozunmasını önlemek için, buharlaştırma işlemleri boyunca su banyosunun sıcaklığı 52 40 °Cʼnin altında (genellikle 35-36 °Cʼde) tutuldu. Vakum sistemi çalıştırılarak buharlaşma balonu içindeki atmosfer basıncının kademeli olarak azalması sağlandı. Ardından, balonun 130 rpmʼde rotasyonu başlatıldı ve ekstrelerdeki çözücülerin buharlaşmasına izin verildi. Bu işlem boyunca, buharlaşma balonundaki basıncın azalmasıyla çözücülerin kaynama noktası düştü ve böylece çözücülerin düşük sıcaklıkta kaynayıp buharlaşması sağlandı. Çözücü buharları, kondansatöre (soğutucuya) ulaşıp burada yoğunlaşarak damlalar halinde çözücü toplama balonunda toplandı. Çözücülerin tamamı buharlaşıp toplama balonuna çözücü akışı durana kadar rotary evaporatörde buharlaştırma yapıldı (Şekil 3.8). Şekil 3.8. Ekstrelerin rotary evaporatörde yoğunlaştırılması Çözücülerin buharlaşması sona erdiğinde, buharlaşma balonunun iç çeperinde bir film oluşturan kuru ham ekstreler, ilgili çözücülerden küçük hacimlerde kullanılarak ultrasonik banyoda çözündürüldü ve flakonlara aktarıldı. Flakonlardaki çözücüler ise, yüksek saflıktaki azot gazı (N2) akımı altında buharlaştırıldı. Elde edilen kuru ham ekstreler, çalışma süreci boyunca ışıktan korunarak 4 °Cʼde muhafaza edildi. 53 Ekstrelerin liyofilizasyon (dondurarak kurutma) yöntemiyle kurutulması Suyun yüksek kaynama noktasına ve yüzey gerilimine sahip olması nedeniyle, su ekstrelerinin ya da su ve organik çözücü karışımlarından oluşan ekstrelerin rotary evaporatör cihazında yoğunlaştırılması zordur. Bundan dolayı, bu tür ekstrelerdeki su çözücüsü, dondurarak kurutma olarak da bilinen liyofilizasyon yöntemiyle uzaklaştırılmaktadır (Sarker ve ark. 2006). Liyofilizasyon, dondurulmuş bir örnekteki buz kristallerinin vakum altında süblimleştirilmesi yoluyla suyun örnekten uzaklaştırılması işlemidir (Jennings 1999). Bu çalışmada, su içinde hazırlanan ekstreler ile %80 metanol ekstrelerinin kalan sulu kısımları liyofilizasyon yöntemiyle kurutuldu. Özetlemek gerekirse; ilk olarak, su ekstreleri -20 °Cʼde donduruldu ve böylece suyun buz kristalleri oluşturarak çözünen maddelerden ayrılması sağlandı. Daha sonra, düşük sıcaklıkta ve vakum altında buz kristallerinin süblimleştirilmesi sağlandı. Liyofilizasyon işlemi sonunda elde edilen kuru ham ekstreler, çalışma süreci boyunca ışıktan korunarak 4 °Cʼde muhafaza edildi. Bu çalışmada, ham ekstrelerden aktif bileşikleri izole edebilmek amacıyla ‘biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yaklaşımı’ temel alındı. Bu bağlamda, ham ekstrelerin androjen bağımsız prostat kanseri hücre hatlarındaki olası sitotoksik etkileri in vitro olarak değerlendirildi. Elde edilen sonuçlar ışığında, aktiviteden sorumlu bileşikleri tayin edebilmek için en güçlü sitotoksik etkiye sahip ekstreden fraksiyonlama yapıldı. 3.2.4. Kaba fraksiyonların hazırlanması Sitotoksisite sonuçları, tüm ekstreler arasında en iyi sitotoksik aktiviteyi sergileyen ekstrenin, maserasyon yöntemiyle hazırlanan su ekstresi olduğunu gösterdi. Su ekstresinde bulunan farklı polaritedeki fitokimyasalların ayrılabilmesi için sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemiyle fraksiyonlama yapılmasına karar verildi. Sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi, ayırma hunisinde birbirine karışmayarak ayrı fazlar oluşturan iki çözücünün kullanılmasını ve bitkisel droglardaki bileşiklerin çözücülerdeki çözünürlük özelliklerine göre ayrılmalarını sağlayan bir yöntemdir (Otsuka 2006). Bu yöntemle su ekstresinden fraksiyonlama yapabilmek için öncelikle ham ekstre hazırlandı. Bu 54 doğrultuda, kaba toz halindeki 400 g drog, 8 litre distile su ile büyük ölçekli maserasyona tabi tutuldu (Şekil 3.9). Şekil 3.9. Büyük ölçekli maserasyon Süre sonunda, karışımın süzülmesiyle drogdan ayrılan sıvı haldeki su ekstresinin 3 litresine, artan polaritelerdeki kloroform, etil asetat ve n-butanol çözücüleri sırasıyla uygulanarak fraksiyonlama işlemi yürütüldü. Bu çözücülerin fizikokimyasal özellikleri Çizelge 3.7ʼde verildi. Çizelge 3.7. Fraksiyonların hazırlanmasında kullanılan çözücülerin fizikokimyasal özellikleri (Seidel 2006) Molekül Kaynama Polarite Çözücü Formül Ağırlığı (g/mol) Noktası (°C) İndeksi n-Butanol C4H9OH 74,12 118 3,9 Kloroform CHCl3 119,38 61 4,1 Etil asetat CH3COOC2H5 88,11 77 4,4 55 Fraksiyonlama işlemi için ilk olarak ham su ekstresi ayırma hunisine alındı, üzerine eşit hacimde kloroform eklendi ve karışım iyice çalkalandı. Böylece, iki çözücü moleküllerinin birbiri ile temas etmesi ve ekstredeki etken maddelerin çözücü fazına transfer olması sağlandı. Karışım, ayırma hunisinde iki ayrı faz oluşana kadar bekletildi. Kloroform fazı, sulu fazdan ayrıldı ve kloroform fraksiyonu elde edildi. Bu süreç, her aşamada taze kloroform kullanılarak 3 kez tekrarlandı. Sonra, kalan sulu kısma kloroformdan daha polar özellikte olan etil asetat çözücüsü eklendi ve aynı şekilde ekstre edilerek etil asetat fraksiyonu hazırlandı. Son olarak, sulu kısma daha polar özellikteki n-butanol çözücüsü eklendi ve aynı ekstraksiyon yöntemi uygulanarak n- butanol fraksiyonu elde edildi. Kalan sulu kısım ise su fraksiyonu olarak adlandırıldı (Şekil 3.10). Kloroform, etil asetat ve n-butanol fraksiyonları rotary evaporatör ile yoğunlaştırıldı, su fraksiyonu ise liyofilizatörde kurutuldu. Elde edilen tüm fraksiyonlar, çalışma süreci boyunca ışıktan korunarak 4 °Cʼde muhafaza edildi. Şekil 3.10. Kaba fraksiyonların hazırlanması 56 Biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yaklaşımı temel alınarak en güçlü sitotoksik etkiyi gösteren ham ekstreden sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi aracılığıyla kaba fraksiyonlama yapıldı. Ekstraksiyon ve fraksiyonlama prosedürleri için planlanan tez çalışması Şekil 3.11ʼde şematize edildi. Şekil 3.11. Biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yaklaşımı ile gerçekleştirilen çalışma planı (Sarker ve ark. 2006ʼdan değiştirilerek alınmıştır) 57 3.2.5. Hücre Kültürü İnsan androjen bağımsız prostat kanseri hücre hatlarının (DU 145 ve PC-3) deneysel çalışmalarda kullanılmak üzere çoğaltılmasında hücre kültürü tekniklerinden yararlanıldı. DU 145 ve PC-3 hücreleri, %10 fetal sığır serumu (fetal bovine serum, FBS; ısı ile inaktive edilmiş), %1 L-glutamin solüsyonu (200 mM) ve %1 penisilin (10 000 U/ml) - streptomisin (10 mg/ml) solüsyonu içeren fenol kırmızısı ilaveli Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 besiyerinde kültüre edildi. Bu hücre hatları, aynı büyüme şartları sağlanarak 37 °Cʼde, %95 nem ve %5 karbondioksit (CO2) içeren etüvde çoğaltıldı. Hücre proliferasyonu, morfolojisi ve kontaminasyon durumu inverted mikroskop aracılığıyla günlük olarak takip edildi. Besiyerindeki nutrientlerin büyük ölçüde tüketilmesi, hücrelerden toksik atık maddelerinin birikmesi ve besiyerinin pH seviyesinin değişmesine bağlı olarak hücrelerin canlılıklarını kaybetmelerini engellemek için büyüme ortamı, her 48-72 saatte bir taze besiyeri ile değiştirildi. Hücre hatlarının kültüre edilmesi, in vitro koşullarda gerçekleştirildiğinden dolayı tez çalışması için etik kurul onayına ihtiyaç duyulmamıştır ve söz konusu çalışma etik açıdan hiçbir sakınca doğurmamıştır. Hücre hatlarının stoktan çıkarılması ve çözdürülmesi Kriyovial tüpler içerisinde dondurma ortamı (9:1 (h/h) oranında FBS:DMSO karışımından oluşan) ile dondurulmuş olan DU 145 ve PC-3 hücreleri, -80 °Cʼlik tıbbi soğutma cihazından alınarak sıcak su banyosunda çözdürüldü. 4 °Cʼnin üzerindeki dimetilsülfoksit (DMSO) hücrelere toksik olduğundan, hücreleri çözdürürken seri bir şekilde çalışıldı. Çözünmüş hücre süspansiyonları, 8-10 ml RPMI 1640 besiyerini (%10 FBS, %1 L-glutamin ve %1 penisilin-streptomisin solüsyonları ile desteklenmiş) içeren 15 mlʼlik falkon tüplerin içerisine alındı. Hücre süspansiyonlarındaki dondurma ortamından kaynaklı DMSOʼi uzaklaştırmak için falkon tüpler 2000 rpm devirde 5 dakika boyunca santrifüj edildi. Santrifüj sonrası, falkon tüplerin üstünde toplanan süpernatant kısımlar aspire edildi. Falkon tüplerin tabanına çöken her bir hücre peletinin üzerine 1 ml besiyeri eklenerek hücrelerin süspansiyon hale gelmesi sağlandı. Ardından, 2 hücrelerin üzerine 7-9 ml besiyeri daha ilave edildi ve tüm hücreler 75 cm ʼlik flasklara 58 aktarıldı. Flasklar, 37 °Cʼye ayarlı, %95 nem ve %5 CO2 içeren etüve alındı ve hücrelerin flask tabanında monolayer (tek tabaka) olarak büyümeleri sağlandı. Hücre hatlarının pasajlanması ve alt kültürlerin oluşturulması Hücre hatları %80-90 oranında konfluent olduklarında (başka bir deyişle, hücreler flask yüzeyini %80-90 oranında kapladıklarında), canlılıklarını ve çoğalma yeteneklerini korumaları için tripsinizasyon işlemi ile pasajlandı. Pasajlama işlemi için, ilk olarak besiyeri aspire edilerek flasklardan uzaklaştırıldı. Flask içerisinde besiyeri kaynaklı serum (FBS) kalıntılarının bulunması, tripsinin aktivitesini engelleyebilmektedir. Bu nedenle, hücreleri serumdan arındırmak için flaskların içerisine 2 ml 1X fosfat tamponlu tuz solüsyonu (phosphate buffered saline, PBS, pH: 7,4) ilave edildi ve hücre yüzeylerinin hafifçe yıkanması sağlandı. PBS aspire edildikten sonra, hücrelerin flask yüzeyinden ayrılmaları için 1-1,5 ml %0,25 tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) solüsyonu ilave edildi ve inkübasyon için 5 dakika 37 °Cʼde, %5 CO2ʼli etüvde tutuldu. Süre sonunda, inverted mikroskopla flask yüzeyinden ayrıldığı kontrol edilen hücrelerin üzerine, tripsin-EDTA aktivitesini durdurmak için 10 ml besiyeri ilave edildi. FBS, tripsin-EDTA aktivitesi üzerinde inhibe edici etki gösterdiği için, tripsinizasyon işlemini durdurmak amacıyla kullanılan besiyerinde mutlaka FBS bulunmalıdır. Flaskların içerisindeki hücreleri birbirinden ayırmak ve kümelenmelerini önlemek için, hücreler pipet yardımıyla homojenize edildi. Homojenize hücre süspansiyonları, daha sonra 15 mlʼlik falkon tüplere alındı ve 2000 rpmʼde 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüjden sonra, süpernatant kısımlar uzaklaştırıldı ve peletler, hücre yoğunluğuna uygun miktardaki taze besiyerleriyle homojenize edildi. Hücre süspansiyonları, 2 oluşturulacak alt kültür sayısına göre her biri 8-10 ml besiyeri içeren yeni 75 cm ʼlik flasklara bölündü. Alt kültürler, çoğalmaya devam edebilmeleri için 37 °Cʼye ayarlı, %95 nem ve %5 CO2 içeren etüve kaldırılarak inkübasyona bırakıldı. Hücre hatlarının dondurulması ve saklanması Çalışmayı güvence altına almak ve ihtiyaç duyulduğunda geriye dönebilmek için hücrelerin dondurularak yedeklenmesi ve uzun vadeli saklanması gerekmektedir. Bu amaçla, hücre hatları DMSO gibi bir kriyoprotektan madde içeren ortam kullanılarak 59 donduruldu ve stoklandı. Hücre hatları %80-90 oranında konfluent oldukları zaman, hücreler dondurulmak üzere standart protokol takip edilerek tripsinize edildi. Özetle; flasktaki besiyeri aspire edildi, hücreler 1X PBS ile yıkandı ve 37 °Cʼye ayarlı etüvde 5 dakika boyunca %0,25 tripsin-EDTA solüsyonu ile inkübe edildi. Yüzeyden ayrılan hücrelerin üzerlerine besiyeri eklendikten sonra 2000 rpmʼde 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası süpernatantın uzaklaştırılmasıyla elde edilen pelet üzerine, hücre yoğunluğu dikkate alınarak FBS:DMSO (9:1, h/h) karışımından oluşan dondurma ortamı eklendi. Pipetajla homojenize edilen hücre süspansiyonu, her bir kriyoviyal 6 başına 800 μl hacimde 1-2×10 hücre olacak şekilde buz üzerinde bekletilen soğuk kriyoviyal tüplere bölündü. Hemen ardından, kriyoviyal tüpler uzun dönemli saklama için -80 °Cʼlik tıbbi soğutma cihazına kaldırıldı. Dondurma süreci, hücrelere zarar vermemek adına optimum hızda (ne çok yavaş ne de çok hızlı) gerçekleştirildi. DMSO, ışığa duyarlı olduğu için hücrelerin dondurulması işlemi karanlıkta yürütüldü. 3.2.6. Tripan mavisi boyası ile canlı hücrelerin sayılması Bu çalışma kapsamında, rutin olarak hücre canlılıklarının tayin edilmesi ve hücre süspansiyonundaki canlı ve/veya ölü hücre sayılarının tespit edilmesi için tripan mavisi boyası kullanıldı. Tripan mavisi ile boyama, hücre membran bütünlüğü prensibine dayanmaktadır. İntakt (hasar görmemiş) hücre membranlarına sahip canlı hücrelerde, tripan mavisi boyası hücre membranına nüfuz edemez ve sitoplazmaya giremez. Tripan mavisi boyası, hasar görmüş ve bundan dolayı hücre membranı geçirgenliği olan ölü hücrelerde ise porlu hücre membranından geçer, sitoplazmaya girer ve intraselüler proteinlere bağlanır. Bu nedenle, mikroskop altında incelendiğinde ölü hücreler büyük, şişmiş ve mavi renkli olarak, canlı hücreler ise küçük, yuvarlak ve refraktil olarak (boyayı almadıklarından dolayı) görülmektedir (Doyle ve ark. 1995, Strober 2001, Jain ve ark. 2017). Bu çalışmada planlanan tüm testlerde, tripan mavisi boyası kullanılarak hemositometre ile hücre sayımı yürütüldü. Bu amaçla, ilk olarak DU 145 ve PC-3 hücreleri tripsinizasyon protokolü takip edilerek flask yüzeyinden kaldırıldı. Santrifüjden sonra, peletler RPMI 1640 besiyeri ile sulandırıldı ve pipetaj yapılarak homojen bir hücre süspansiyonu elde edildi. Bu hücre süspansiyonundan 20 μl alınarak bir eppendorf tüpe 60 aktarıldı ve üzerine 20 μl %0,5 (a/h) tripan mavisi solüsyonu (‘Trypan blue solution’) eklendi. Birkaç kez pipetaj yapılarak hücre süspansiyonunun boya ile iyice karışması sağlandı. Daha sonra, bu karışımdan 10 μl alınıp Neubauer tip hemositometrenin sayım bölmelerinden birine yüklendi. Ardından, inverted mikrokopta x10 objektif kullanılarak iki köşe karede canlı hücre sayımı gerçekleştirildi. Tripan mavisi boyasını içine alıp mavi renkte görünen hücreler ölü, boyayı almadığı için parlak renkte görünen hücreler ise canlı olarak değerlendirildi. Sayım tamamlandıktan sonra, 1 ml besiyerindeki toplam canlı hücre sayısı aşağıdaki formüle göre hesaplandı. 4 Canlı hücre sayısı = (iki karede sayılan toplam hücre sayısı / 2) x dilüsyon faktörü x 10 3.2.7. Sitotoksik etkiyi belirlemek üzere hücrelerin ekimi Hücre ekiminden önce, optimizasyon çalışması yapılarak sitotoksisite deneylerinde kullanılacak standart hücre sayısı tespit edildi. Ayrıca, bu çalışma sayesinde uygulanacak sitotoksisite testleri de standardize edildi. Standart hücre sayısı belirlendikten sonra, sitotoksisite testleri için deney kuruldu. Öncelikle, canlı hücre sayısı belirlenen süspansiyondan gerekli besiyeri hacmine ve hücre sayısına göre seyreltme yapıldı. Daha sonra, DU 145 ve PC-3 hücreleri 100 μl RPMI 1640 besiyeri 3 içerisinde 5x10 hücre/kuyucuk olacak şekilde 96 kuyucuklu mikroplakalara ekildi. Test edilen her konsantrasyon için 3 tekrarlı (triplicate) hücre ekimi yapıldı. Ayrıca, negatif kontrol (maksimum canlılık, tedavi edilmemiş hücre kontrolü) için 100 μl RPMI 1640 3 besiyeri içerisinde 5x10 /kuyucuk yoğunlukta hücre ekimi gerçekleştirildi. Kör (blank) kuyucuklarına ise sadece 100 μl RPMI 1640 besiyeri (hücre içermeyen) ilave edildi. Ardından, ekilen hücreler inverted mikroskopta kontrol edildi, yapışmalarını ve büyümelerini sağlamak için 24 saat boyunca 37 °Cʼye ayarlı, %5 CO2 içeren nemli etüvde inkübasyona bırakıldı. 61 3.2.8. Test bileşiklerinin hazırlanması ve hücrelere uygulanması Ham ekstrelerin ve kaba fraksiyonların hazırlanması 4 °Cʼde saklanan ham ekstreler ve kaba fraksiyonlar, DMSO içerisinde ultrasonik banyo yardımıyla çözdürüldü ve 100 mg/ml konsantrasyonda stok solüsyonlar hazırlandı. Bu stok solüsyonlar, her uygulama öncesi taze olarak hazırlandı ve 0,2 μmʼlik steril filtreden geçirildi. Elde edilen stok solüsyonlar, çalışma sonuna dek ışıktan muhafaza edildi. Unotein B (Oenothein B)ʼnin hazırlanması Unotein B, Epilobium cinsine ait türlerde bulunan polifenol bileşiklerinden biridir (Granica ve ark. 2012). Birçok çalışmada, unotein Bʼnin antikanser aktivite sergilediği bildirilmiştir (Miyamoto ve ark. 1987, 1993a,b, Aoki ve ark. 1995, Sakagami ve ark. 2000, Kiss ve ark. 2006). Sigma-Aldrich firmasından temin edilen ‘Oenothein B analytical standard’, bu çalışmada etken madde olarak kullanıldı. Toz haldeki unotein B maddesi (molekül ağırlığı: 1569,08 g/mol), DMSO içerisinde çözdürülerek 6 mg/ml (veya 3,82 mM) konsantrasyonda stok solüsyon hazırlandı. Bu stok solüsyon, her uygulama öncesi taze olarak hazırlandı ve çalışma sonuna dek ışıktan muhafaza edildi. ® Paklitaksel (Paclitaxel, Taxol )ʼin hazırlanması Prostat kanseri tedavisinde kemoterapötik ilaç olarak kullanılan paklitaksel, deneysel çalışmalarda pozitif kontrol olarak kullanıldı. Bu bağlamda, ham ekstrelerin, kaba fraksiyonların ve unotein Bʼnin her iki hücre hattı üzerindeki sitotoksik etkileri paklitakselin sitotoksik etkisiyle karşılaştırıldı. Sigma-Aldrich firmasından temin edilen toz haldeki paklitaksel (molekül ağırlığı: 853,91 g/mol), DMSO içerisinde çözdürülerek 1 mg/ml (veya 1,171 mM) konsantrasyonda ana stok solüsyonu hazırlandı ve alikotlanarak -80 °Cʼde saklandı. Ana stok solüsyonu, RPMI 1640 besiyeri (FBS, L- glutamin ve penisilin-streptomisin bileşenlerini içermeyen) içerisinde dilüe edilerek 8,5 μg/ml (veya 10 μM)ʼlik çalışma solüsyonu hazırlandı. Bu çalışma solüsyonu, her uygulama öncesi taze olarak hazırlandı ve çalışma sonuna dek ışıktan muhafaza edildi. 62 Test bileşiklerinin stok solüsyonlarından RPMI 1640 besiyeri ile gerekli seyreltmeler yapıldı. Böylece konsantrasyonları; ekstreler için 3,13-200 μg/ml aralığında, fraksiyonlar için 1,56-100 μg/ml aralığında, unotein B için 2,5-160 μg/ml aralığında ve paklitaksel (pozitif kontrol) için 0,001-0,5 μg/ml aralığında değişen final dozları hazırlandı. Seyreltme işlemleri sonunda, DMSOʼin son kültür ortamındaki konsantrasyonu ≤%0,1ʼdir. DU 145 ve PC-3 hücrelerinin bu konsantrasyonu tolere edebildikleri ön çalışmalarda doğrulanmış olup hücre canlılıkları üzerinde hiçbir olumsuz etki görülmemiştir. Hücre ekiminden 24 saat sonra, final konsantrasyonlardaki test bileşikleri 100 μl/kuyucuk olacak şekilde DU 145 ve PC-3 hücrelerine uygulandı. Test bileşikleri eklendikten sonra, tüm kuyucuklardaki son hacimlerin 200 μl olması için negatif kontrol ve kör için ayrılan kuyucuklara 100 μl besiyeri ilave edildi. Uygulamayı takiben hücreler, 37 °Cʼye ayarlı %5 CO2ʼli etüvde 24, 48 ve 72 saat süreyle inkübasyona bırakıldı. 96 kuyucuklu mikroplakalarda, test bileşiklerinin tüm dozları, negatif kontrol ve kör için 3 farklı kuyucuk (3 tekrar) kullanıldı. 3.2.9. Sitotoksik etkinin belirlenmesi E. hirsutum ekstrelerinin, kaba fraksiyonlarının, unotein Bʼnin ve paklitakselin prostat kanseri hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerini belirlemek amacıyla in vitro hücre canlılık deneyleri yürütüldü. Çalışma kapsamında, hücre canlılığını farklı parametrelere göre ölçen kolorimetrik testler (SRB ve XTT testleri) kullanıldı. Böylece, farklı türdeki sitotoksik analizlerle daha güvenilir sonuçların elde edilmesi amaçlandı. Sülforodamin B (SRB) hücre canlılık testi Sülforhodamin B (SRB) hücre canlılık testi, kültürdeki hücrelerin protein içeriğinin ölçülmesini sağlayan bir testtir (Skehan ve ark. 1990). Bu testin prensibi; asidik şartlar altında SRB boyasının (iki sülfonik gruplu, pembe renkli aminoksanten boyası), trikloroasetik asit (TCA) ile fikse edilmiş hücre proteinlerinin bazik aminoasitlerine bağlanmasına, bazik şartlar altında ise hücrelerden ayrılmasına dayanmaktadır. Oluşan renk değişiminin spektrofotometrik olarak değerlendirilmesi, hücresel protein miktarı ve dolayısıyla hücre canlılığı ve/veya sitotoksisite hakkında bilgiler sunmaktadır (Papazisis ve ark. 1997, Mathen ve Hardikar 2010). 63 İnkübasyon süresi (24, 48 ve 72 saatlik) sonunda, test bileşiklerinin DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki potansiyel sitotoksik aktiviteleri SRB hücre canlılık testiyle değerlendirildi. SRB testi, Skehan ve ark. (1990) tarafından tanımlanan protokolde küçük değişiklikler yapılarak yürütüldü. İlk olarak, hücresel proteinleri fikse etmek için 96 kuyucuklu mikroplakanın her kuyucuğuna 50 μl %50ʼlik (a/h) soğuk TCA (steril distile su içinde çözündürülmüş) solüsyonu eklendi ve TCA solüsyonunun her kuyucuktaki final konsantrasyonun %10 olması sağlandı. TCA ilavesi, fiksasyon sırasında hücre kaybı riskini en aza indirmek için dikkatlice yapıldı. Daha sonra, 4 °Cʼde en az 1 saat boyunca fiksasyon gerçekleştirildi. Fiksasyon süresi tamamlandıktan sonra, mikroplaka ters çevrilerek içeriği boşaltıldı. TCA solüsyonunu, besiyerini, metabolitleri ve serum proteinleri uzaklaştırmak için bütün kuyucuklar 5 defa deiyonize su ile yıkandı. Her yıkama sonunda, mikroplaka ters çevrilerek kuyucuklardaki deiyonize su boşaltıldı. Yıkama işlemini takiben mikroplaka kurumaya bırakıldı. Ardından, mikroplakanın her kuyucuğuna 50 μl %0,4ʼlük (a/h) SRB boyası (‘Sulfhorodamine B sodium salt’, %1 asetik asit içinde çözündürülmüş) eklendi, hücrelerin boyanmasına izin vermek için oda sıcaklığında ve karanlıkta 30 dakika boyunca inkübasyon gerçekleştirildi. Boyama süresinin sonunda, mikroplaka ters çevrilerek SRB boyası döküldü. Bağlanmayan boyayı uzaklaştırmak için, bütün kuyucuklar 5 defa %1ʼlik (h/h) asetik asit çözeltisi (steril distile su ile hazırlanmış) ile yıkandı. Her yıkama sonunda, mikroplaka ters çevrilerek kuyucuklardaki asetik asit boşaltıldı. Kuyucuklar tamamen kuruduktan sonra, hücre proteinlerine bağlanan boyayı çözmek amacıyla, her kuyucuğa 150 μl 10 mM tamponlanmamış Tris bazı (pH: 10, steril distile su içinde çözündürülmüş) ilave edildi. 10 dakika boyunca çalkalamalı inkübatörde bekletilen mikroplakanın optik yoğunluğu, mikroplaka okuyucu kullanılarak 595 nm dalga boyunda ölçüldü ve kantitatif absorbans değerleri elde edildi. XTT hücre canlılık testi XTT (2,3-bis(2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-[(fenilamino)karbonil]-2H-tetrazolyum hidroksit) hücre canlılık testi; tetrazolyum tabanlı, hızlı, kullanımı kolay ve güvenilir bir testtir. XTT reaktifi, metabolik olarak aktif hücreler tarafından turuncu renkli, suda çözünür formazan kristallerine indirgenir. Oluşan formazan yoğunluğunun spektrofotometrik olarak doğrudan ölçülmesiyle canlılığın değerlendirilmesi mümkün 64 olmaktadır (Scudiero ve ark. 1988). Bu sayede; XTT testi, hücre canlılığı/sitotoksisiste hakkında hassas ve doğru bilgi sunmaktadır (Berridge ve ark. 1996, Tokur ve Aksoy 2017). Test bileşiklerinin DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki olası sitotoksik etkileri, XTT hücre canlılık testiyle analiz edildi. Deney, ‘Cell Proliferation XTT’ kit içeriğinde bulunan ve firma tarafından önerilen protokole göre yürütüldü. Test bileşikleriyle tedavi süresi (24, 48 ve 72 saatlik) tamamlandıktan sonra, XTT reaktifi ve PMS (N-metil dibenzopirazin metil sülfat) içeren aktivasyon solüsyonu 37 °Cʼlik su banyosunda hızlıca çözdürüldü. Çözünmelerinden sonra, 5 ml XTT reaktifine 100 μl aktivasyon solüsyonu eklenerek bir mikroplaka (96 kuyucuk) için yeterli bir reaksiyon karışımı hazırlandı. Test bileşiklerini içeren besiyeri mikroplakanın tüm kuyucuklarından aspire edildi, hemen ardından her kuyucuğa 100 μl RPMI 1640 besiyeri (FBS, L-glutamin ve penisilin-streptomisin bileşenlerini içeren) eklendi. Daha sonra, taze olarak hazırlanmış reaksiyon karışımı 50 μl/kuyucuk olacak şekilde hücrelerin üzerine ilave edildi. Hücreler, 4 saat boyunca 37 °Cʼde, %5 CO2ʼli etüvde inkübe edildi. İnkübasyonu takiben oluşan renk değişimi miktarı (optik yoğunluk), mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm dalga boyunda ölçüldü. ‘Background’ absorbans değerleri (kör) ise, 655 nm dalga boyunda ölçüldü ve 450 nmʼde kaydedilen değerlerden çıkarılarak kantitatif absorbans değerleri elde edildi. XTT kimyasalı ışığa duyarlı olduğundan tüm işlemler karanlıkta gerçekleştirildi. Hücre canlılığının hesaplanması Hücre canlılık testlerinden elde edilen ham verilerin işlenmesi, Microsoft Office Excel programı kullanılarak yapıldı. Test bileşikleri uygulanmamış kontrol hücreleri (canlılığın %100 olarak kabul edildiği) referans alınarak test bileşikleri uygulanan hücrelerin canlılık oranları aşağıdaki formüle göre hesaplandı. % Canlılık = (ortalama Absbileşik - ortalama Abskör)/(ortalama Abskontrol - ortalama Abskör) (Abs: Okuma sonucu elde edilen absorbans değerlerini ifade etmektedir.) 65 Elde edilen sonuçlardan yola çıkarak, Microsoft Office Excel programında doza karşı yüzde canlılık grafikleri çizildi. Tahmin fonksiyonu kullanılarak, bu grafiklerden test bileşiklerinin IC50 değerleri hesaplandı. 3.2.10. Kombinasyon analizi Çalışma kapsamında araştırılan test bileşiklerinin DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkileri SRB ve XTT hücre canlılık testleriyle tarandıktan sonra, en aktif bileşiğin maserasyon yöntemiyle hazırlanan su ekstresi olduğu tespit edildi. Bu bulgudan hareketle, ekstre ile paklitaksel kombinasyonunun hücre canlılıkları üzerindeki muhtemel sinerjik etkisinin araştırılmasına karar verildi. Kombinasyon çalışmasında kullanılması planlanan ekstre ve paklitaksel dozları, hücre canlılık testlerinden elde edilen sonuçlar dikkate alınarak seçildi. Bu amaçla, DU 145 ve PC-3 3 hücreleri 100 μl RPMI 1640 besiyeri içinde, 5x10 hücre/kuyucuk yoğunlukta ve 3 tekrarlı olarak 96 kuyucuklu mikroplakaya ekildi. 37 °Cʼde, %5 CO2ʼli etüvde 24 saatlik inkübasyondan sonra, ekstre ile paklitakselin Çizelge 3.8ʼde gösterilen doz kombinasyonları 100 μl besiyeri içinde hücrelere uygulandı. Negatif kontrol için 200 μl besiyeri içinde kültüre edilen hücreler, kör içinse sadece 200 μl besiyeri kullanıldı. Pozitif kontrol olarak ise paklitaksel kullanıldı. 24, 48 ve 72 saat süren kombinasyon tedavisi sonrası, hücrelerin canlılıkları SRB ve XTT testleriyle değerlendirildi. Verilerin işlenmesi, hücre canlılık yüzdelerinin ve IC50 değerlerinin hesaplanması daha önce açıklanan formüle göre yapıldı. 66 Çizelge 3.8. Kombinasyon analizi için oluşturulan tedavi grupları Tedavi Dozları (μg/ml) Tedavi Grupları Ekstre (E) Paklitaksel Negatif Kontrol 1. - - (Yalnızca hücreler) - 0,001 Pozitif Kontrol 2. - 0,002 (Hücreler + Paklitaksel) - 0,004 33 - Test Grubu 3. 66 - (Hücreler + Ekstre) 99 - 33 + 0,001 33 + 0,002 33 + 0,004 66 + 0,001 Kombinasyon Grubu 4. 66 + 0,002 (Hücreler + Ekstre + Paklitaksel) 66 + 0,004 99 + 0,001 99 + 0,002 99 + 0,004 3.2.11. Hücre morfolojisinin değerlendirilmesi Ham ekstrelerin, kaba fraksiyonların, unotein Bʼnin ve paklitakselin hücre morfolojileri ve canlılıkları üzerindeki etkileri, inverted mikroskopta hücre canlılık testleriyle eş zamanlı olarak analiz edildi. Test bileşikleri ve ayrıca kombinasyon grupları ile 24, 48 ve 72 saatlik inkübasyon periyodu tamamlandığında, hücre canlılık testlerini çalışmadan önce DU 145 ve PC-3 hücreleri inverted mikroskobun x10ʼluk büyütmesi kullanılarak fotoğraflandı. Hücrelerin adezyon durumları, konfluensi seviyeleri, şekil ve boyut değişimleri, negatif kontrol hücreleri ile ve ayrıca DMSO (%0,1 konsantrasyonda) ile muamele edilmiş hücre grubu ile kıyaslandı. Böylece, test edilen bileşiklerin sitotoksik aktivitelerinin mikroskobik olarak da doğrulanması sağlandı. 67 3.2.12. Kaspazla kırılmış sitokeratin 18 (M30) düzeylerinin ölçülmesi Apoptoz sırasında, hücrelerin sitoplazmik ve nükleer iskeleti yeniden yapılanmakta ve hücre morfolojisi önemli değişikliklere uğramaktadır (Oberhammer ve ark. 1994, van Engeland ve ark. 1997). Bu süreç boyunca, sadece apoptotik hücrelerde aktifleşen kaspazlar birçok hücresel proteininin yıkılmasına yol açmaktadır. Epitelyal hücrelerde, kaspazların en önemli substratlarından biri de hücre iskeletinde yer alan ve ara filament protein ailesine ait sitokeratin 18 (cytokeratin, CK18)ʼdir. Apoptoz geçiren hücrelerde; 238 396 CK18, kaspazlar tarafından Aspartat 238 (Asp ) ve Aspartat 396 (Asp ) noktasından kırılarak CK18Asp396 neo-epitopu (M30 antijeni) oluşmaktadır. Apoptotik hücrelerden serum veya plazmaya salınan bu neo-epitopun, monoklonal bir antikor olan M30 tarafından tanınmasıyla apoptozun erken evreleri saptanmış olmaktadır (Leers ve ark. 1999, Kramer ve ark. 2004, Schutte ve ark. 2004, van der Kuip ve ark. 2006). Bu prensibe dayanarak, apoptotik hücre kültürü süpernatantlarındaki kaspazla kırılmış CK 18 fragmentlerini ölçmek için immünohistokimyasal yöntemlerden biri olan M30 ELISA testi kullanıldı. M30 ELISA, katı fazlı sandviç (iki yönlü) enzim immünosorbent testidir. Bu test ile apoptoz miktarının belirlenmesi, CK 18ʼin ölçülmesinden kaynaklandığı için kullanılan hücre hatlarının bu proteini eksprese etmesi gerekmektedir. Bu çalışmada kullanılan DU 145 ve PC-3 hücrelerinin, CK 18 proteini için majör ekspresyon gösterdiği literatürde bildirilmiştir (Sherwood ve ark. 1990). Bu sebeple, kültüre edilen DU 145 ve PC-3 hücrelerinin M30 ELISA testiyle analiz edilmesi uygundur. Bu amaçla; DU 145 ve PC-3 hücreleri, sayılarak 200 μl RPMI 1640 3 besiyeri içinde, 5x10 hücre/kuyucuk olacak şekilde (3 tekrarlı) 96 kuyucuklu mikroplakaya ekildi. 37 °Cʼde, %5 CO2ʼli etüvde 24 saatlik inkübasyonu takiben, tüm kuyucuklardan hücrelere zarar vermeden 100 μl besiyeri uzaklaştırıldı. XTT ve SRB testi sonuçlarına göre, 48 saatlik periyotta DU 145 ve PC-3 hücreleri için elde edilen ortalama IC50 dozları hücrelere uygulanacak bileşik konsantrasyonları olarak belirlendi (Çizelge 3.9). Besiyeri içinde dilüe edilip istenilen dozlarda hazırlanan test bileşikleri, tüm kuyucuklardaki hücrelere 100 μl hacimde uygulandı. Negatif kontrol için sadece besiyeri içinde kültüre edilen hücreler kullanıldı ve ilgili kuyucuklara 100 μl besiyeri ilave edildi. Hücrelerde apoptozu indüklediği bilinen paklitaksel ise pozitif kontrol 68 olarak kullanıldı. Test bileşikleri uygulandıktan sonra, hücreler 24, 48 ve 72 saat süreyle 37 °Cʼde, %5 CO2ʼli etüvde inkübasyona tabi tutuldu. Çizelge 3.9. DU 145 ve PC-3 hücre hatları için elde edilen ortalama IC50 dozları Ortalama IC 50 Dozları (μg/ml) DU 145 PC-3 Ekstre (E) 90,65 113,40 Fraksiyon (E2) 114,62 77,23 Unotein B 122,31 86,46 Paklitaksel 0,0045 0,015 Ekstre (E) + Paklitaksel kombinasyonu 90,65 + 0,0045 113,40 + 0,015 Süre sonunda hücreleri lizis etmek için 200 μl besiyeri içindeki hücrelerin üzerine doğrudan 10 μl %10’luk (h/h) Nonidet P-40 (NP-40, steril distile su içinde hazırlanmış) solüsyonu eklendi ve mikroplaka çalkayıcı kullanılarak 600 rpmʼde ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca lizis işlemi gerçekleştirildi. Lizis tamamlandıktan sonra, hücre lizatları pipetaj yapılarak kuyucuklardan toplandı ve 2000 rpmʼde 30 saniye süreyle santrifüj yapıldı. Bu sayede, ölü hücrelerden süpernatantlara transfer olan kaspazla TM kırılmış CK 18 fragmentlerinin ölçülmesi, ‘M30 CytoDeath ELISA kit’ içeriğine ve üreticinin talimatlarına göre yürütüldü. Analiz, her örnek ve/veya standart için iki tekrarlı (dublike) olarak ve oda sıcaklığında (24±3 °C) gerçekleştirildi. Deney öncesi, tüm reaktifler oda sıcaklığına getirildi ve kullanmadan önce vorteks ile karıştırıldı. Yüzeyi CK 18ʼi tanıyan fare monoklonal M6 antikoru ile kaplı 96 kuyucuklu mikroplakanın her kuyucuğuna 25 μl süpernatant ve standart eklendi. Hemen ardından, tüm kuyucuklara 75 μl M30 CytoDeath horseradish peroksidaz (horseradish peroxidase, HRP) konjugat solüsyonu (HRP enzimi ile konjuge fare monoklonal M30 antikoru) eklendi ve mikroplaka çalkalayıcı kullanılarak 600 rpmʼde, oda sıcaklığında 4 saat süreyle inkübe edildi. M6 antikoru/M30 antijeni/enzim işaretli M30 antikoru sandviç kompleksinin oluşmasını takiben, bağlanmayan fazla konjugatı uzaklaştırmak için manual olarak yıkama yapıldı. İnkübasyon solüsyonu mikroplakadan aspire edildi ve tüm kuyucuklar 250 μl yıkama solüsyonuyla 5 kez yıkandı. Daha sonra, her kuyucuğa 200 μl 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidin (TMB) substratı eklendi, oda sıcaklığında ve karanlıkta 20±1 dakika boyunca inkübe edildi. Reaksiyona bağlı olarak gerçekleşen renk oluşumu, her kuyucuğa 50 μl stop solüsyonu (1 M sülfürik asit (H2SO4) içeren) 69 beklenmesiyle durduruldu. Ardından, mikroplaka okuyucuda 450 nmʼde absorbans belirlendi. Oluşan renk şiddeti, örnekteki M30 antijen konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. M30 antijen konsantrasyonunun hesaplanması TM M30 CytoDeath ELISA sonuçları Microsoft Office Excel programı kullanılarak hesaplandı. Ölçülen absorbanslara karşı bilinen konsantrasyonlardan standart bir eğri grafiği çizildi ve eğri denklemi oluşturuldu. Bu grafik ve denklemden yararlanarak örneklerdeki M30 antijen miktarları hesaplandı. M30 antijen konsantrasyonları litre başına birim (U/L) olarak ifade edildi. 3.2.13. Floresan miksroskobunda hücre ölüm modunun belirlenmesi Bu çalışma kapsamında; test bileşiklerine maruz kalmış hücrelerin ölüm modları, morfoloji tabanlı testlerden biri olan floresan mikroskopi ile değerlendirildi. Bu yöntemin prensibi, floresan boyaların DNAʼya bağlanarak kromatini ve nükleusu görünür kılmasıdır. Böylece, floresan mikroskop aracılığıyla hem canlı/ölü hücre ayrımı yapılabilmektedir hem de hücrelerin ölüm şekilleri tespit edilebilmektedir (Ulukaya 2003, Ulukaya ve ark. 2011). Floresan boyama çalışmasında, hücre membranından nüfuz ederek canlı ve ölü tüm hücreleri boyayan Hoechst 33342 floresan boyası kullanıldı. Ayrıca, ölü hücreleri canlı hücrelerden ayırt etmek için Hoechst 33342 boyası, sadece ölü hücreleri boyayabilen Propidyum İyodür boyası ile birlikte kullanıldı. Propidyum iyodür boyası, hücre membranı bütünlüğüne bağlı olarak hücre canlılığının tespitine olanak sağlamaktadır. Bu boya, intakt yani bütünlüğü bozulmamış membrana sahip canlı hücrelere nüfuz edemediği için canlı hücreler propidyum iyodür boyası ile boyanmamaktadır. Bunun aksine; propidyum iyodür boyası, bütünlüğü bozulmuş, hasar görmüş membrana sahip hücrelere girerek tüm ölü hücreleri (primer nekrotik ve sekonder nekrotik/geç apototik) boyamaktadır. Bu bağlamda, ikili boyama yöntemiyle hücre canlılığının ve ölüm modunun tespiti nükleus morfolojisi dikkate alınarak aşağıdaki kıstaslara göre yapıldı. Bu kıstaslar Çizelge 3.10ʼda özetlendi (Ulukaya 2003, Ulukaya ve ark. 2011). 70 Canlı hücreler: Nükleusları normal boyuttadır. Hoechst 33342 boyasıyla boyanırlar, ancak propidyum iyodür boyasıyla boyanmazlar. Erken apoptotik hücreler: Apoptozun erken safhasındaki hücrelerde membran bütünlüğü korunduğu için bu hücreler propidyum iyodür boyasıyla boyanmazlar. Fakat hücreler Hoechst 33342 boyası için pozitiftirler. Kromatin yoğunlaşması, piknotik ve/veya fragmente nükleus gibi apoptotik değişikliklerin varlığı, erken apoptotik hücrelerin teşhisinde en önemli bulgudur. Geç apoptotik/sekonder nekrotik hücreler: Sekonder nekroz, apoptozun geç safhasıdır. Bu evrede, hücrelerin membran bütünlüğü bozulduğundan hücreler propidyum iyodür boyası için pozitiftir. Ayrıca, hücreler Hoechst 33342 boyasıyla da boyanırlar. Bunun yanı sıra, geç apoptotik veya sekonder nekrotik hücrelerde, apoptoza özgü belirteçler de mevcuttur. (Primer) Nekrotik hücreler: Hem propidyum iyodür boyası hem de Hoechst 33342 boyası ile boyanarak ölü oldukları belirlenen hücrelerin nükleuslarında apoptotik görünüm yoktur. Apoptotik hücrelerden farklı olarak, nekrotik hücrelerin nükleusları canlı hücrelerin nükleuslarından göreceli olarak daha büyüktür. Nekrotik hücrelerin gerçekleştirdiği floresan ışıma ilk başta normaldir, ancak nekroz süreci ilerledikçe hücrelerin lizise uğramalarından dolayı floresan ışıma yoğunluğu azalır. Çizelge 3.10. İkili boyama yöntemiyle hücre ölüm modunun tespit edilmesi Hoechst Propidyum Apoptotik 33342 İyodür Morfoloji Canlı Hücreler + - - Erken Apoptotik Hücreler + - + Geç Apoptotik/Sekonder Nekrotik Hücreler + + + (Primer) Nekrotik Hücreler + + - +, boyanma durumunu; -, boyanmama durumunu ifade etmektedir. Test bileşiklerinin DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki etkilerini ikili boyama yöntemiyle saptamak amacıyla ilk olarak, tripan mavisi boyası kullanılarak Neubauer hemositometresinde canlı hücre sayımı yapıldı. Daha sonra, 6 kuyucuklu mikroplakanın 71 kuyucuklarının içlerine steril cam lameller (24 mm x 24 mm) yerleştirildi. DU 145 5 4 (1x10 hücre/kuyucuk) ve PC-3 (7,5x10 hücre/kuyucuk) hücreleri, 1,5 ml RPMI 1640 besiyeri içinde 3 tekrarlı olarak doğrudan cam lamellerin üzerine ekildi. 37 °Cʼde %5 CO2ʼli etüvde 24 saatlik inkübasyonu takiben, hücrelere zarar vermeden kuyucuklardaki tüm besiyeri aspire edildi. Beklemeden kuyucuklara 1,5 ml taze besiyeri ilave edildi. Ardından, XTT ve SRB yöntemleriyle test bileşikleri için belirlenen ortalama IC50 dozları (bkz. Çizelge 3.9), 1,5 ml besiyeri içinde cam lameller üzerindeki hücrelere uygulandı. Negatif kontrol için sadece besiyeri içinde kültüre edilen aynı sayıdaki hücreler kullanılırken, pozitif kontrol için paklitaksel kullanıldı. Ardından, hücreler %5 CO2 içeren 37 °Cʼlik etüvde 48 saat süreyle test bileşiklerine maruz bırakıldı. İkili boya karışımını hazırlamak üzere, Hoechst 33342 (200 μg/mlʼlik ana stok) ve propidyum iyodür (‘Propidium iodide’, 100 μg/mlʼlik ana stok) boyaları 1X PBS solüsyonu (Ca ve Mg içermeyen) içinde seyreltildi. Son konsantrasyonları; Hoechst 33342 boyası için 3 μg/ml, propidyum iyodür boyası için 7 μg/ml olan çalışma solüsyonları elde edildi. 37 °Cʼde %5 CO2ʼli etüvde 48 saatlik tedavi sona erdiğinde, hücrelere zarar vermeden kuyucuklardaki tüm besiyeri uzaklaştırıldı. Sonra, cam lamellerin üzerindeki hücreler 1X PBS solüsyonu ile yıkandı. İkili boya karışımından 250 μl alınarak doğrudan hücrelerin üzerine uygulandı ve 15 dakika boyunca 37 °Cʼde karanlık inkübasyona tabi tutuldu. Süre sonunda, cam lamel üzerine 10-20 μl daha boya karışımı eklenerek steril cam lam (26 mm x 76 mm) ile kapatıldı. Floresan ataçmanlı inverted mikroskobun x20 büyütmesi kullanılarak aynı alandaki hücrelerin fotoğrafları çekildi. Hücre ölüm modları ‘Kameram 21 (Mikrosistem)’ yazılımı kullanılarak analiz edildi. 3.2.14. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu Test bileşiklerinin, hücre ölüm yolaklarında (apoptoz, nekroz ve otofaji) görevli genlerin ekspresyon profili üzerindeki etkileri, kantitatif gerçek zamanlı PZR ile belirlendi. Kantitatif gerçek zamanlı PZR, nükleik asit dizilerinin kantifikasyonu ile gen ekspresyonunun gerçek zamanlı olarak saptanmasında kullanılan bir yöntemdir (Rodríguez ve ark. 2015, Hawkins ve Guest 2017). Bu yöntemde, reaksiyon boyunca PZR ürünü yapısına dâhil olan floresan boyalar kullanılarak DNA miktarı izlenmektedir. Floresan sinyaldeki artış, PZR ürünü miktarı ile doğru orantılıdır (Anonim 208). 72 ® Kantitatif gerçek zamanlı PZR analizinde; SYBR Green gibi spesifik olmayan boyalar veya hidrolizis probları, moleküler işaretler, floresan rezorans enerji transferi (FRET) probları ve Scorpions primerleri gibi floresan boyalara bağlı sekansa özgü primerler/problar kullanılabilmektedir (Rodriguez-Lazaro ve Hernandez 2013). Hidrolizis probları, kantitatif gerçek zamanlı PZR protokollerinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Rodríguez ve ark. 2015). Bu problar, iki etiket ile işaretlidir. Bunlardan; 5ʼ ucundaki floresan ‘haberci’ (raportör, reporter) molekül, 3ʼ ucundaki ise ‘baskılayıcı’ (quencher) moleküldür. Prob intakt iken haberci moleküle yakın olan baskılayıcı molekül, haberci molekülün floresan sinyal oluşturmasını engellemektedir. PZR reaksiyonu sırasında, primer uzaması probun hedef diziye bağlandığı noktaya geldiği zaman, Taq polimeraz enziminin 5ʼ→3ʼ ekzonükleaz aktivitesi hidrolizis probunu yıkar. Böylece, haberci ve baskılayıcı moleküller birbirinden ayrılır ve serbest hale geçen haberci molekül floresan sinyal oluşturur. Her PZR döngüsü boyunca, hedef dizi miktarı arttıkça daha fazla prob yıkılır ve floresan sinyal miktarı artar. Dolayısıyla, floresan sinyal şiddeti örnekte bulunan amplikon miktarı ile doğru orantılıdır. Sonuç olarak; kantitatif gerçek zamanlı PZR yöntemlerinden prob tabanlı olanları, boya tabanlı olanlarından daha spesifik olduğu için analizlerde daha çok tercih edilmektedir. Bu amaçla, hücre ölüm yolaklarında kilit rol üstlenen bazı genlerin ekspresyon seviyelerindeki değişimler, prob tabanlı PZR yöntemiyle analiz edildi (Holland ve ark. 1991, Livak ve ark. 1995, Hawkins ve Guest 2017, Neidler 2017, Anonim 2018). RNA izolasyonu Hücrelerden ribonükleik asit (RNA) izolasyonu, ‘innuPREP RNA mini kit’ kullanılarak 2 gerçekleştirildi. Öncelikle, DU 145 ve PC-3 hücreleri sayılarak 75 cm ʼlik flasklara 7 6 ml RPMI 1640 besiyeri içinde 5x10 hücre olacak şekilde ekildi. Hücrelerin flask yüzeyine tutunmalarını sağlamak üzere, tüm flasklar 8 saat boyunca %5 CO2 içeren 37 °Cʼlik etüvde inkübe edildi. Tüm hücrelerin flask yüzeyine yapıştıkları belirlendikten sonra, XTT ve SRB yöntemleriyle test bileşikleri için tespit edilen ortalama IC50 2 değerleri (Çizelge 3.9) hücrelerin bulunduğu 75 cm ʼlik flasklara 3 ml RPMI 1640 besiyeri içinde eklendi. RNA izolasyonunda, negatif (sadece besiyerindeki hücreler) ve pozitif (paklitaksel uygulanan hücreler) kontrol grupları da çalışıldı. 18 saatlik inkübasyondan sonra, DU 145 ve PC-3 hücreleri tripsinizasyon işlemiyle flasklardan 15 73 mlʼlik falkon tüplere toplandı ve 2000 rpmʼde 5 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrası, hücre pelleti 1 ml 1X PBS (pH: 7,4) ile yıkanarak ikinci kez santrifüje tabi tutuldu. Santrifüj sonrası elde edilen hücre pelletinden innuPREP RNA mini kit talimatlarında küçük değişiklikler yapılarak aşağıda tarif edildiği gibi RNA izolasyonu yürütüldü. İlk olarak, homojenize edilen hücre pelleti üzerine 500 μl ‘Lysis Solution RL’ eklenip oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi. Hücre pelleti bekleme süresi boyunca her 5 dakikada bir resüspanse edildi. Lizis işlemi tamamlandıktan sonra lizat, vorteks cihazında karıştırıldı ve 2 mlʼlik tüp içinde bulunan ‘D’ kodlu filtre (mavi renkli) üzerine aktarılarak 11 000 rpmʼde 2 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonunda; filtreye bağlanan genomik DNA ortamdan uzaklaştırıldı, filtreden geçerek 2 mlʼlik tüp içerisinde toplanan süzüntü ise RNAʼyı içermekteydi. Bu süzüntünün üzerine, 500 μl %70ʼlik (h/h) etanol ilave edilerek pipetaj yapıldı. Ardından bu karışım, 2 mlʼlik tüp içine yerleştirilmiş ‘R’ kodlu filtre (pembe renkli) üzerine aktarılarak 11 000 rpmʼde 2 dakika santrifüj yapıldı. Süre sonunda, süzüntüyü içeren tüp atıldı. RNAʼnın bağlandığı ‘R’ kodlu filtre yeni bir tüpe yerleştirildi. Bu filtre üzerine, 500 μl ‘HS’ kodlu yıkama solüsyonu eklendi ve 11 000 rpmʼde 1 dakika santrifüj edildi. Daha sonra, süzüntüyü içeren tüp atılarak aynı filtre yeni bir 2 mlʼlik tüp içine yerleştirildi. Bu filtrenin üzerine, ‘LS’ kodlu yıkama solüsyonundan 700 μl eklendi ve 11 000 rpmʼde 1 dakika boyunca tekrar santrifüj yapıldı. Santrifüj bittikten sonra, aynı filtre yeni bir 2 mlʼlik tüp içine alındı. Tüm etanol kalıntılarını uzaklaştırmak için 11 000 rpmʼde 3 dakika boyunca santrifüj yapıldı. Santrifüj işleminin ardından, filtre 1,5 mlʼlik elüsyon tüp içine yerleştirildi. Filtreye bağlanan RNA’nın eldesi için, filtre üzerine 30 μl RNaz içermeyen su ilave edildi ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, filtre üzerine tekrar 30 μl RNaz içermeyen su ilave edildi ve oda sıcaklığında ikinci kez 5 dakikalık inkübasyon yapıldı. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, 11 000 rpmʼde 1 dakika boyunca santrifüj yapıldı. Santrifüj işleminin ardından, elüsyon tüpte toplanan süzüntü total RNAʼyı içermektedir. İzole edilen RNAʼların miktarı (ng/μl) ve saflığı (260/280 nm dalga boyundaki absorbans değeri) spektrofotometrede ölçülerek belirlendi. Total RNA örnekleri, çalışma yapılıncaya kadar -80 °Cʼde saklandı. 74 Komplementer DNA (Complementary DNA, cDNA) sentezi Elde edilen RNA örneklerinden ‘iScript™ cDNA synthesis kit’ kullanılarak ters transkripsiyon (reverse transcription, RT) yöntemiyle komplementer DNA (complementary DNA, cDNA) sentezlendi. Reaksiyon öncesi, izole edilen tüm RNA örneklerinin konsantrasyonları, RNaz içermeyen steril saf su kullanılarak eşitlendi. Daha sonra, cDNA sentezi için Çizelge 3.11ʼde belirtildiği şekilde reaksiyon karışımı hazırlandı. Çizelge 3.11. cDNA sentezinde kullanılan reaksiyon karışımı Bileşenler Hacim (µl) Tek reaksiyon n sayıda reaksiyon RNA örneği 15 15 n 5x iScript Reaction Mix 4 4 n iScript Reverse Transcriptase 1 1 n Toplam 20 20 n Son hacim olarak 20 µl reaksiyon karışımı içeren 0,2 µlʼlik PZR tüpleri, Thermal Cycler (termal çevrim) cihazına yerleştirildi. Cihazda, sırasıyla 25 °Cʼde 5 dakika (priming); 46 °Cʼde 20 dakika (RT); 95 °Cʼde 1 dakika (RT inaktivasyonu) ve 4 °Cʼde bekleme (isteğe bağlı) aşamalarından oluşan program ayarlanarak reaksiyon gerçekleştirildi. Elde edilen cDNA örnekleri, kantitatif gerçek zamanlı PZR analizinde kullanılmak üzere -20 °Cʼye kaldırıldı. Primer tasarımı ve optimizasyonu Kantitatif gerçek zamanlı PZR testlerinin spesifikliği, tasarlanan primer ve probların uygunluğu ile yakından ilişkilidir. Bu nedenle; primer ve probların optimum tasarımı, test başarısında önemli paya sahiptir (Rosadas ve ark. 2013, Rodríguez ve ark. 2015). Bu çalışmada, hedef gen bölgeleri için kullanılacak olan primer ve problar, ‘NCBI’ ve ‘Ensemble’ gen bankaları kullanılarak tasarlandı. Elde edilen primerlerin spesifikliği, ‘Blast’ programı ile kontrol edildi. Analiz sonuçlarını standardize etmek için, ACTB (β- Actin) ‘housekeeping’ geni referans (kontrol) olarak kullanıldı. Kullanılan primer ve problar, Çizelge 3.12ʼde listelendi. 75 Çizelge 3.12. Kantitatif gerçek zamanlı PZR analizinde kullanılan genler ve primer dizileri Yolak Gen Left (L) / Right (R) primerler L: AGTCTGTGCCCAAATCAACA Caspase 8 (CASP8) R: TGCTTCTCTCTTTGCTGAATTCTT Apoptoz L: GGCAAAATAAGCATGCAGGTA Caspase 10 (CASP10) (Ekstrinsik) R: TGTTAGCAGATGCTCCTTGC L: TCTACCTCCGAAGCGTCCT FADD R: CCTTCCTGGAGAGAACCAAA L: TTACACAGCCGCCAATAAGA Cytochrome C (CYCS) R: TCATTTTTGTTCCAGGGATGT Apoptoz L: CATACTCCACAGCACCTGGTT Caspase 3 (CASP3) (İntrinsik) R: GGCACAAAGCGACTGGAT L: TCAGGCCCCATATGATCG Caspase 9 (CASP9) R: GACTCCCTCGAGTCTCCAGAT L: ACAGTGCGAGTCAGCTCAAG PARP1 R: CCACCTCATCGCCTTTTCT Nekroz L: CTGGGCGTCATCATAGAGG RIPK1 R: TTCCTTTTACAGAAAGCGGAGT L: CGGGTGAAGGTGGTTCCT ATG5 R: TTATTTCAACCAAAGCCAAACTT Otofaji L: ACCGTGTCACCATCCAGGAA Beclin 1 (BECN1) R: CTGGCGAGGAGTTTCAATAAA L: GCACCCAGCACAATGAAGA Housekeeping β-Actin (ACTB) R: CGATCCACACGGAGTACTTG Tasarlanan forward ve reverse primerler, optimizasyon için önce 100 µM’a sulandırıldı. Daha sonra, bu primerlerden her parametre için 10 µMʼlık ara stoklar oluşturularak kantitatif gerçek zamanlı PZR analizine hazır hale getirildi. Kantitatif gerçek zamanlı PZR Hücre ölümü ile ilişkili genlerin ekspresyon değişiklikleri (bkz. Çizelge 3.12), ® ® ‘LightCycler 480 Probes Master’ kullanılarak LightCycler 480 II cihazında gerçekleştirilen cDNA amplifikasyonu ile belirlendi. Bu amaçla; sentezlenen cDNAʼlar, ® ilgili gen bölgeleri için tasarlanan primerler ve problar ile LightCycler 480 Probes Master kullanılarak bir reaksiyon karışımı hazırlandı (Çizelge 3.13). 76 Çizelge 3.13. Kantitatif gerçek zamanlı PZR analizinde kullanılan reaksiyon karışımı Bileşenler Hacim (µl) Tek reaksiyon n sayıda reaksiyon PZR-grade su 1,25 1,25 n Forward primer (10 μM) 0,5 0,5 n Reverse primer (10 μM) 0,5 0,5 n UPL prob (10 μM) 0,25 0,25 n ® LightCycler 480 Probes Master (2X) 5 5 n cDNA 2,5 2,5 n Toplam 10 10 n Reaksiyon sayısına göre, cDNA hariç tüm bileşenlerin eklenmesiyle hazırlanan bu karışımdan 7,5 μl alınarak 96 kuyucuklu PZR mikroplakasının tüm kuyucuklarına dağıtıldı. Sonra, üzerlerine 2,5 μl cDNA örneği eklenerek her gen için toplam reaksiyon hacminin 10 μl olması sağlandı. Hazırlanan mikroplakanın üzeri kapatıldı ve kısa süreli ® santrifüj edildi. Ardından, mikroplaka LightCycler 480 II cihazına yerleştirildi ve Çizelge 3.14ʼde belirtilen protokole göre gerçek zamanlı olarak cDNA amplifikasyonu gerçekleştirildi. Çizelge 3.14. Kantitatif gerçek zamanlı PZR analizi için cihaz protokolü Program Adı Pre-inkübasyon Amplifikasyon Soğutma Analiz Modu Yok Kuantifikasyon Modu Yok Döngü Sayısı 1 45 1 Hedef Sıcaklık 95 °C 95 °C 60 °C 72 °C 40 °C Süre 10 dakika 10 saniye 30 saniye 1 saniye 30 saniye Sıcaklık Artış Hızı 4,8 °C/s 4,8 °C/s 2,5 °C/s 4,8 °C/s 2 °C/s Okuma Modu Yok Yok Yok Tek Yok Veri analizi Kantitatif gerçek zamanlı PZR sonunda elde edilen veriler ‘Absolute Quantification’ ve ‘Advanced Relative Quantification’ yöntemleriyle analiz edildi. Elde edilen sonuçlarda ‘Relative Quantification’ yapabilmek için ‘Fold Change’ yöntemi kullanıldı. Bu yöntemle, hedef genin CT (cycle threshold) değerleri ACTB (β-Actin) gen seviyeleri ile normalize edildi. Normalize değerler, kontrol grupları ile oranlanarak genlerin 77 ekspresyon değişimini gösteren ‘Fold Change’ değerleri bulundu. ‘Fold Change’ değerleri, 2ʼden büyük ise anlamlı ‘target up regülasyon’; -2ʼden küçük ise anlamlı ‘target down regülasyon’ durumunu ifade etmektedir. Gen ekspresyon verilerinin değerlendirilmesi ile hücrelerde aktif olan ölüm yolakları tespit edildi. 3.2.15. Western blot analizi Test bileşiklerine maruz bırakılan hücrelerin hedef protein ekspresyonlarındaki değişiklikleri saptamak amacıyla protein blotlama veya immünoblotlama olarak da bilinen western blot yöntemi kullanıldı. Bu teknik, bir hücre veya doku lizatında bulunan hedef proteinlerin ayrılarak tanımlanması prensibine dayanmaktadır. Özetlenecek olursa; western blot analizinde ilk olarak, sodyum dodesil sülfat- poliakrilamid jel elektroforezi (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) ile proteinlerin molekül ağırlıklarına göre ayrılmaları sağlanır. Daha sonra proteinler, hedef proteine özgü antikorlar kullanılarak analiz yapmak üzere jelden bir membran üzerine transfer edilir (Burnette 1981, Kurien ve Scofield 2006, Jensen 2012). Bu çalışmada, western blot yöntemiyle hedef proteinlerin görüntülenmesinde izlenen aşamalar aşağıda özetlendi. Total protein izolasyonu Ekspresyon çalışmalarından (mRNA ve protein düzeyindeki) anlamlı sonuçlar elde edebilmek adına, hücrelerden total proteinlerin ve RNAʼların izole edilmesi eş zamanlı olarak gerçekleştirildi. Total protein izolasyonu için, DU 145 ve PC-3 hücreleri 5 ml 2 RPMI 1640 besiyeri içinde 25 cm ʼlik flasklara ekildi. 8 saat boyunca, 37 °Cʼde %5 CO2ʼli etüvde inkübe edilerek hücrelerin flask yüzeyine tutunmalarını sağlandı. Daha sonra, DU 145 ve PC-3 hücreleri 18 saat süreyle test bileşiklerinin ortalama IC50 dozlarına (bkz. Çizelge 3.9) maruz bırakıldı. Total protein izolasyonunda, negatif (sadece besiyerindeki hücreler) ve pozitif (paklitaksel uygulanan hücreler) kontrol grupları da çalışıldı. İnkübasyon süresinin bitiminde; bütün flasklardaki hücreler tripsinize edildi, soğuk 1X PBS (pH: 7,4) ile yıkandı ve buz üzerindeki 15 mlʼlik falkon tüplere toplandı. Soğutmalı santrifüjde (5 °C), 1500 g devirde 5 dakikalık santrifüjden sonra süpernatant uzaklaştırıldı ve hücre pelleti üzerine 200 μl soğuk 1X PBS (pH: 7,4) 78 eklendi. Homojenize edilen hücre süspansiyonu 1,5 mlʼlik eppendorf tüpte toplanarak soğutmalı santrifüjde (5 °C), 1500 gʼde 5 dakika tekrar santrifüj edildi. Santrifüj sonrası, tüpte hiç PBS kalıntısı kalmayacak şekilde tüm süpernatant uzaklaştırıldı. Hücrelerin lizisi için, pellet üzerine 200 μl RIPA tampon çözeltisi (10 ml ‘RIPA lysis and extraction buffer’ içinde 100 μl 100X proteaz/fosfataz inhibitör karışımı ve 30 μl Triton X-100 içeren) eklendi, vortekslendi ve 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletildi. Elde edilen lizatlar; soğutmalı santrifüjde (5 °C), 14 000 gʼde 15 dakika süreyle santrifüj edildi. Santrifüjden sonra, total proteinleri içeren süpernatant, soğuk 1,5 mlʼlik eppendorf tüpe aktarıldı ve çalışma yapılıncaya kadar -80 °Cʼde saklandı. Total protein konsantrasyonunun ölçülmesi TM Total protein örneklerinin konsantrasyonları ‘Pierce BCA protein assay kit’ kullanılarak kolorimetrik olarak ölçüldü. BCA (biçinkoninik asit), bakır sülfat içeren yeşil renkli bir solüsyondur. Bu test, protein örneği ile etkileşen BCA solüsyonundaki +2 +1 Cu iyonunun Cu iyonuna indirgenmesi ve oluşan suda çözünebilir mor renkli ürünün spektrofotometrik olarak ölçülmesiyle proteinlerin bilinmeyen konsantrasyonlarının belirlenmesi temeline dayanmaktadır (Smith ve ark. 1985). Protein konsantrasyonu tayini için öncelikle, kit içerisindeki ‘BCA Reagent A’ ve ‘BCA Reagent B’ reaktiflerinden örnek sayısına göre 50:1 (h/h) oranında alınarak bir çalışma solüsyonu hazırlandı. Bu çalışma solüsyonu, 96 kuyucuklu mikroplakada örnek ve blank (kör) için ayrılan kuyucuklara 200 µl hacminde 2 tekrarlı olarak dağıtıldı. Örnek kuyucuklarına, buz üzerinde bekletilen protein örneklerinden 25 µl; blank kuyucuklarına ise RIPA tampon çözeltisinden 25 µl eklenerek nazikçe pipetaj yapıldı. Daha sonra, mikroplaka 37 °Cʼde, çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca inkübasyona bırakıldı. Süre sonunda, mikroplaka okuyucuda 562 nmʼde absorbans okuması yapıldı. Elde edilen absorbans değerleri, Microsoft Office Excel programında analiz edildi ve denklem kullanılarak protein konsantrasyonları (μg/ml) hesaplandı. En düşük konsantrasyona sahip örnek baz alınarak diğer örneklerin konsantrasyonları RIPA tampon çözeltisiyle seyreltildi ve bütün proteinlerin konsantrasyonları eşitlendi. Protein örneklerini denatüre etmek için, tüm örnekler 2X Sample tamponu, Laemmli (2- Merkaptoetanol eklenmiş) ile 1:1 (h/h) oranda karıştırıldı ve 95-100 °Cʼye ayarlı kuru 79 ısı bloğunda 5 dakika ısıtıldı. Protein örnekleri soğuduktan sonra jele yüklendi, hemen yükleme yapılmadıysa çalışma aşamasına dek -20 °Cʼde saklandı. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Denatüre protein örnekleri, SDS-PAGE yöntemi kullanılarak molekül ağırlıklarına göre ayrıldı. Bu amaçla; %4-15 yüzdeliğe sahip hazır mini jel (‘Mini-protean TGX precast protein gels’), jel kasetine sabitlenip elektroforez tankına (‘Mini-protean tetra cell (2- gel) and tetra blotting module’) yerleştirildi. Daha sonra, tankın içi doluluk sınırına kadar steril distile su içinde seyreltilmiş 1X yürütme tamponu (10X tris/glycine/SDS running buffer) ile dolduruldu. Jel kuyucukları içinde kalan koruma sıvısı, pipetaj işlemi yapılarak temizlendi. Eşit miktarda (25 μl) protein içeren örnekler özel pipet uçları ile SDS-PAGE kuyucuklarına yüklendi. Kontrol olarak, hem renkli marker (‘color prestained protein standard, broad range, 11-245 kDa’) hem de biyotinli protein ladder (‘biotinylated protein ladder detection pack’ içinde yer alan) kullanıldı. Biyotinli protein ladder, kullanılmadan önce 95-100 °Cʼye ayarlı kuru ısı bloğunda 2 dakika ısıtılıp soğumaya bırakıldı. Renkli marker ve biyotinli protein ladder, 7 μl hacimde jele yüklendi. Proteinler, 80 volt (V)ʼda 30 dakika yürütüldü, sonra voltaj 100 Vʼa arttırılarak yaklaşık 2 saat boyunca elektroforez işlemi gerçekleştirildi. Şekil 3.12. SDS-PAGE 80 Islak transfer Elektroforez işlemiyle, jel üzerinde bantlar oluşturarak molekül ağırlıklarına göre ayrılmış olan proteinlerin membrana aktarılması için, ıslak transfer yöntemiyle elektroblotlama (‘electroblotting’) yapıldı. Bu yöntem, jel-membran sandviç düzeneğinin 1X transfer tamponu içine tamamen daldırılmasıyla yürütüldü. 1 litre transfer tamponu (1X) hazırlamak için; 700 ml steril distile su içine, 200 ml metanol ve 100 ml ‘Pierce™ 10X western blot transfer buffer (metanol-free)’ eklendi. Elektroforezin bitmesine yakın, transfer düzeneğinde kullanılan tüm materyaller 1X transfer tamponu bulunan küvet içine alınıp ıslatıldı. 0,45 μm por büyüklüğüne sahip polivinilidin florür (PVDF) transfer membranı, önce %100 metanol sonra steril distile su ile yıkanarak 1X transfer tamponu içine alındı. Bromfenol mavisi boyası jellerin sonuna ulaştığında, elektroforez işlemi durduruldu. Transfer kaseti üzerine, katot kutbundan (-) anot kutbuna (+) doğru sırasıyla; fiber ped, blotlama kağıdı, jel, membran, tekrar blotlama kağıdı ve fiber ped konuldu ve her kat 1X transfer tamponu ile ıslatılarak sandviç düzeneği oluşturuldu. Daha sonra, transfer kaseti ve soğutma ünitesi blotlama modülüne (‘Mini-protean tetra cell (2-gel) and tetra blotting module’) yerleştirildi ve tankın içi doluluk sınırına kadar 1X transfer tamponu ile dolduruldu. Ardından, tank güç kaynağına bağlandı ve soğuk ortamda 300 miliamper (mA) akımda 2 saat boyunca transfer işlemi gerçekleştirildi (Şekil 3.13). Bu işlem sayesinde; negatif yüklü proteinlerin (SDSʼden dolayı), katottan anoda doğru göç ederek jelden membrana transfer olması sağlandı. 81 Şekil 3.13. Transfer materyallerinin hazırlanması ve ıslak transferin gerçekleştirilmesi Bloklama ve antikor inkübasyonları Transfer tamamlandıktan sonra, membranla primer antikor arasında spesifik olmayan bağlanmaları engellemek amacıyla %5ʼlik yağsız kuru süt tozu çözeltisi (1X Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBS-T) çözeltisi ve %2 sodyum azid ile hazırlanmış) ile bloklama yapıldı. Bu kapsamda; membran, %5ʼlik yağsız kuru süt tozu çözeltisi ile oda sıcaklığında ve yatay çalkalayıcıda, nispeten düşük hızda 1 saatlik inkübasyona tabi tutuldu. Bloklama süresi sonunda; bu membranlar, 1X TBS-T çözeltisi (10X TBS-T stokunun, steril distile su ile seyreltilmesiyle hazırlanmış) ile 3 kez ve 10 dakika süreyle yatay çalkayıcı üzerinde, nispeten yüksek hızda yıkandı. Primer antikorlar ile işaretleme için öncelikle, hedef proteinlere özgü monoklonal antikorlar önerilen çözeltiler içinde ve dilüsyon oranlarında seyreltildi (Çizelge 3.15). Daha sonra; membranlar, taze olarak hazırlanan bu primer antikor solüsyonu ile çalkalayıcı üzerinde (nispeten düşük hızda) ve 4 °Cʼde gece boyu inkübe edildi. Ertesi gün, membranları primer antikor kalıntılarından uzaklaştırmak için 1X TBS-T çözeltisi ile 3 kez 10 dakika yıkama yapıldı. Ardından, membranlara kemiluminesans deteksiyon için enzim (HRP) ile konjuge sekonder antikor işaretlemesi yapıldı. Western blot analizinde kullanılan primer antikorlar ‘rabbit’ yani tavşan kaynaklı olduğundan dolayı ‘anti-rabbit IgG’ sekonder antikoru ile çalışıldı. Sekonder antikor, %5ʼlik yağsız süt tozu çözeltisinde 1:3000 oranında seyreltildi. Biyotinli protein ladder deteksiyonu için bu karışıma, 1:10 000 oranında seyreltilmiş anti-biyotin (‘biotinylated protein ladder 82 detection pack’ içinde yer alan) de eklendi. Ardından, membranlar çalkalayıcı üzerinde (nispeten düşük hızda) ve oda sıcaklığında sekonder antikor solüsyonu ile 1 saat muamale edildi. İnkübasyondan sonra, membranları sekonder antikor kalıntılarından uzaklaştırmak için 3 kez 10 dakika boyunca 1X TBS-T çözeltisi ile yıkama yapıldı. Çizelge 3.15. Western blot analizinde kullanılan primer antikorlara ilişkin bilgiler Primer Antikor Molekül Ağırlığı Dilüsyon Çözeltisi Dilüsyon Oranı β-Actin 45 kDa %5 sığır serum albümini 1:1000 Atg5 55 kDa %5 sığır serum albümini 1:1000 Caspase-3 17, 19, 35 kDa %5 yağsız kuru süt tozu 1:1000 Caspase-8 10, 57 kDa %5 sığır serum albümini 1:1000 Caspase-9 35, 37, 47 kDa %5 yağsız kuru süt tozu 1:1000 Caspase-10 22, 59 kDa %5 sığır serum albümini 1:1000 Cytochrome c 14 kDa %5 sığır serum albümini 1:1000 Hedef proteinlerin görüntülenmesi Hedef proteinleri membran üzerinde görüntüleyebilmek amacıyla, substrat içeren ışığa hassas reaktif karışımı (‘Luminata Forte Western HRP substrate’) membranların üzerine 2 ml hacimde eklendi ve 3 dakika boyunca karanlıkta inkübe edildi. Antikora bağlı enzimin katalizlediği reaksiyon sonucu oluşan kemilüminesan sinyal, görüntüleme cihazında görüntülendi. Protein bantları ‘ImageLab’ yazılımı ile analiz edildi. 3.2.16. İstatistiksel analiz Tüm istatistiksel analizler SPSS (Statistical Package for Social Sciences) 20 bilgisayar paket programı kullanılarak yapıldı. Tüm analizlerin sonuçları, ortalama ± standart sapma olarak sunuldu. Normal dağılım gösteren verilerin kıyaslanması için ‘One way ANOVA (tek yönlü varyans analizi)’ testi kullanıldı. İstatistiksel olarak anlamlı veriler p<0.05 değerine göre belirlendi. 83 4. BULGULAR 4.1. Botanik Çalışmalara İlişkin Bulgular 4.1.1. Tayin anahtarları Tez çalışması kapsamında, Bursa (A2) ili sınırları içinde gerçekleştirilen arazi çalışmaları sonucunda, E. hirsutum bitkisinin Orhaneli, Sadağı Kanyonuʼnda dere yatağı kenarlarındaki nemli topraklarda yayılış gösterdiği saptandı. Ekstraksiyon çalışmaları için araştırma alanındaki E. hirsutum bitkisinin toprak üstü kısımlarından küçük ölçekte örnek toplandı. Bitki türünün tanımlanması için aşağıda verilen tayin anahtarlarından faydalanıldı. Onagraceae familyasına ait cinslerin tayin anahtarı 1. Sepaller ve petaller 2 tane; meyve kapalı, 1-2 tohumlu 1. Circaea 1. Sepaller 4-5; petaller 4-5 tane veya yok; meyve çok tohumlu bir kapsül 2. Sepaller 4-5 tane, meyvede kalıcı; petaller 0-5 tane; stamenler 4-10 tane 3. Ludwigia 2. Sepaller ve petaller 4 tane, erken dökülen; stamenler 8 tane 3. Tohumlar kalaza tüyleri içerir; korolla beyaz veya morumsu-pembe renkli 4. Epilobium 3. Tohumlar kalaza tüyleri içermez; korolla sarı renkli 2. Oenothera Epilobium L. cinsine ait taksonların tayin anahtarı 1. Alt yapraklar spiral olarak düzenlenmiş; çiçekler zigomorfik (Sect. Chamaenerion) 2. Çiçek durumu, keskin bir şekilde geriye doğru kıvrık tomurcuklar ile basit bir rasem; yapraklar tüysüz veya çok az pübesent (ince ve kısa tüylü); tohumlar pürüzsüz 1. angustifolium 84 2. Çiçek durumu, dik tomurcuklar ile bileşik bir rasem; yapraklar tüysüz veya yoğun olarak çok kısa sık tüylerle kaplı; tohumlar ince papilloz 3. Yapraklar tüysüz, dar eliptik, serrülat (testere dişçikli); stilüs genellikle stamenlerden daha uzun 2. colchicum 3. Yapraklar pubesent veya tüysüz, lanseolat (mızraksı), düz, tam kenarlı; stilüs stamenlerin uzunluğunda 4. Yapraklar yoğun olarak yatık-çok kısa sık tüylerle kaplı, linear (şeritsi)- lanseolat 3. stevenii 4. Yapraklar seyrek yayılışlı-pubesent, linear 4. dodonaei 1. Alt yapraklar karşılıklı veya dairesel; çiçekler düzenli (Sect. Epilobium) 5. Stigma derin 4-loblu yapıda 6. Gövde uzun tüylerle kaplı 7. Yapraklar gövdeyi saran ve dekürent; petaller 8-20 mm, morumsu 5. hirsutum 7. Yapraklar fakat subsesil gövdeyi saran değil; petaller 5-8 mm, pembe 6. parviflorum 6. Gövde kırışık tüylü veya tüysüz 8. Yapraklar ovat-lanseolat, geniş yuvarlak tabanda kenarlar serrat (testere dişli); petiyol (yaprak sapı) 0-2 mm 7. montanum 8. Yapraklar lanseolat, küneat (kamamsı) tabanda kenarlar bütün; petiyol 4-10 mm 8. lanceolatum 5. Stigma düz, bütün veya çok yüzeysel loblu 9. Çiçek durumu tomurcukta sarkık veya düşük; tohumlar pürüzsüz veya papilloz ise 1,5-2 mm; yapraklar düz, tam kenarlı ya da dentat 10. Alt yapraklar dairesel, keskin serrat 9. alpestre 10. Alt yapraklar karşılıklı, düz, tam kenarlı veya dentat 85 11. Yapraklar en az 4 kat daha geniş; tohumlar 1,6-2 mm 14. palustre 11. Yapraklar en fazla 3 kat geniş; tohumlar 1-1,5 mm 12. Bitki boyu 4, 10(20) cm; yapraklar düz, tam kenarlı; tohumlar pellusid gagalı 21. anagallidifolium 12. Bitki boyu (5)10, 50 cm; yapraklar dentat; tohumlar pellusid gaga yok 13. Petaller pembemsi-mor, 6-10 mm 19. ponticum 13. Petaller beyaz veya soluk pembe, 4,6-6(8) mm 17. frigidum 9. Çiçek durumu tomurucukta dik; tohumlar papilloz, bezen çok ince, 1-1,5 mm; yapraklar dentat veya serrat 14. Gövde çiçek durumunun altında salgı tüylü; çiçek durumu kırışık tüylü, salgısız; yaprak aksillerinde yavru soğanlar veya vejatatif sürgünler var 20. gemmascens 14. Gövde genellikle kırışık tüylü ve salgısız ya da tüysüz, salgılı ise çiçek durumu salgı tüylü; yavru soğanlar yok 15. Çiçekler 3-5,5 mm; tohumlar kısa gagalı 16. Tohumlar 13 tane, 1,5 mm büyüklüğünde, attenüat (daralan); gövde sıklıkla basit; çiçek durumu kısmen salgı tüylü 16. confusum 16. Tohumlar 1 mm, obovat (ters yumurtamsı); gövde çok dallı; çiçek durumu çok yoğun kısa tüylerle kaplı; tüyler salgısız, kırışık 15. minutiflorum 15. Çiçekler 4-15 mm; tohumlar gagalı değil 17. Çiçek durumu yoğun olarak kırışık tüylü, salgısız veya kalikslerin üzerinde birkaç salgı tüylü 18. Yapraklar tabanda ovat, subkordat (yüreksi) veya turunkat (kesik); gövde sıklıkla 2 yüksek hat şeklinde 13. roseum 86 18. Yapraklar eliptik veya oblong (dikdörtgensi), sıklıkla tabanda küneat; gövde genellikle 4-köşeli 19. Kapsüller (5)7-11 cm; bitkiler gövde tabanındaki subsesil rozetlerle yayılırlar; çiçek durumunda salgı tüyleri yok 10. tetragonum 19. Kapsüller 4-6 cm; bitkiler yapraklı topraküstü stolonlarla yayılırlar; çiçek durumunda sıklıkla birkaç salgı tüyü mevcut 11. obscurum 17. Çiçek durumunun tümü veya birçoğu salgı tüylü 20. Petaller 4, 5 (-6) mm; petiyoller 0,5-8 mm; yapraklar tabanda küneat; salgı tüyleri çoğunlukla pediseller ve çiçek durumunun ana dalları ile sınırlı 13. roseum 20. Petaller 6-15 mm; petiyoller 0-2 mm; yapraklar genellikle geniş tabanlı; çiçek durumu belirgin bir şekilde salgılı-pubesent 21. Tohumlar obovat, kabaca papilloz; stigma kısa çomaksı, emarginat değil 12. anatolicum 21. Tohumlar attenüat, ince papilloz; stigma kapitat, emarginat veya tepede belirsiz 4-loblu 18. algidum Sect. Chamaenerion Tausch. (Syn: Chamaenerion Adans.). Yaprakların tümü spiral şekilde düzenlenmiştir. Çiçekler zigomorfik simetrili, üstteki 2 petal alttaki 2 petalden daha geniş; stigma derin 4-loblu. 4.1.2. Ekstraksiyon ve fraksiyonlama çalışmaları E. hirsutum bitkisinin, DU 145 ve PC-3 androjen bağımsız prostat kanseri hücreleri üzerindeki sitotoksik etkisini değerlendirmek üzere biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yaklaşımı temel alınarak ekstraksiyon ve fraksiyonlama çalışmaları yürütüldü. Bu bağlamda, ekstrelerin ve fraksiyonların aktivitelerinin tespitinde 87 sitotoksisite etkili oldu. Bu amaçla; bitkisel drog (bitkinin toprak üstü kısımları), çeşitli yöntemler kullanılarak farklı polaritedeki çözücülerle ön ekstraksiyon çalışmasına tabi tutuldu. Elde edilen ham ekstrelerin sitotoksik aktiviteleri, iki farklı hücre canlılık testiyle in vitro olarak tarandı. Her iki testin sonuçlarına göre, hücre hatları karşısında en güçlü aktiviteyi gösteren ekstre (maserasyon yöntemiyle hazırlanan su ekstresi) belirlendi. Bu aktiviteden sorumlu bileşiği veya bileşikleri izole edebilmek amacıyla aktif ekstreden sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemiyle kaba fraksiyonlar hazırlandı. E. hirsutum bitkisinden elde edilen ham ekstreler ve kaba fraksiyonlar ile ilgili bilgiler ise Çizelge 4.1ʼde verildi. Çizelge 4.1. Epilobium hirsutum L. bitkisinden elde edilen ham ekstreler ve kaba fraksiyonlar Kod Ekstraksiyon Yöntemi Açıklama Ham Ekstreler A Maserasyon n-Hekzan ekstresi B Maserasyon Diklorometan ekstresi C Maserasyon %100 metanol ekstresi D Maserasyon %80 metanol ekstresi E Maserasyon Su ekstresi F Soxhlet ekstraksiyonu n-Hekzan ekstresi Soxhlet ekstraksiyonu sonrası G %80 metanol ekstresi maserasyon Soxhlet ekstraksiyonu sonrası geri H %80 metanol ekstresi çeviren soğutucuda ekstraksiyon K İnfüzyon Su ekstresi Kaba Fraksiyonlar E1 Sıvı-sıvı ekstraksiyonu Kloroform fraksiyonu E2 Sıvı-sıvı ekstraksiyonu Etil asetat fraksiyonu E3 Sıvı-sıvı ekstraksiyonu n-Butanol fraksiyonu Su fraksiyonu (fraksiyonlanma E4 Sıvı-sıvı ekstraksiyonu sonrası kalan sulu kısım) Tez çalışması kapsamında, biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yöntemi kullanılarak ekstre ve fraksiyonların hazırlanması Şekil 4.1ʼde özetlendi. Ekstrelerin ve fraksiyonların sitotoksik etkilerine ilişkin bulgular ise bir sonraki bölümde verildi. 88 Şekil 4.1. Biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yöntemi ile ekstrelerin ve fraksiyonların elde edilmesi 89 4.2. In Vitro ve Moleküler Çalışmalara İlişkin Bulgular 4.2.1. Ham ekstrelerin sitotoksik etkilerine ilişkin bulgular E. hirsutum bitkisinden elde edilen ham ekstrelerin (A, B, C, D, E, F, G, H ve K), DU 145 ve PC-3 prostat kanseri hücreleri üzerindeki potansiyel sitotoksik aktiviteleri in vitro hücre canlılık testleriyle araştırıldı. Bu amaçla, kolorimetrik testler olan SRB ve XTT hücre canlılık testlerinden yararlanıldı. SRB hücre canlılık testi bulguları İlk olarak, E. hirsutum bitkisinden ön ekstraksiyon yöntemleriyle hazırlanan ham ekstrelerin, DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki sitotoksik aktiviteleri SRB testiyle tarandı. Sitotoksik etkisi en yüksek olan ekstreyi saptamak amacıyla, hücreler 24, 48 ve 72 saat boyunca farklı ekstre konsantrasyonları (3,13-200 μg/ml) ile muamele edildi ve tedavi sürelerini takiben elde edilen sonuçlar Şekil 4.2ʼde gösterildi. Elde edilen verilere göre; DU 145 hücrelerinde, tüm ekstreler arasında en iyi sitotoksik etkiyi gösteren ekstrelerin E ve H kodlu ekstreler olduğu tespit edildi. Bu ekstrelerin, negatif kontrol ile kıyaslandığında, DU 145 hücrelerinin canlılıklarını, doza ve zamana bağlı olarak anlamlı bir şekilde azalttığı belirlendi (p<0,05). İki ekstrenin de DU 145 hücreleri üzerindeki sitotoksik aktivitesi benzer bir eğilim gösterdi. Bu ekstrelerin özellikle 200 ve 100 μg/mlʼlık dozlarının, hücre canlılıklarında keskin bir azalışa neden olduğu gözlendi. Buna karşılık, D ve G kodlu ekstrelerin sadece 200 ve 100 μg/mlʼlık dozlarının DU 145 hücrelerinde güçlü sitotoksisiteye neden olduğu görüldü. K kodlu ekstrenin ise, zayıf sitotoksik etki göstererek sadece 200 μg/mlʼlık dozda DU 145 hücrelerini öldürdüğü saptandı. 24 - 72 saatlik tedavi aralığında A, B, C ve F kodlu ekstreler için DU 145 hücrelerinde sitotoksik etkiden ziyade daha çok antiproliferatif/sitostatik etkinin (hücre büyümesini engelleyen etki) varlığı gözlendi. 90 Şekil 4.2. DU 145 hücrelerine ham ekstrelerin uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, ham ekstre uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 91 SRB hücre canlılık testiyle elde edilen sonuçlar incelendiğinde; ham ekstrelerin (A-K), PC-3 hücrelerinde DU 145 hücre hattına benzer bir sitotoksik aktivite gösterdiği belirlendi (Şekil 4.3). PC-3 hücrelerinde, E ve H kodlu ekstrelerin negatif kontrol ile karşılaştırıldığında doza ve zamana bağımlı olarak sitotoksik etkiler gösterdiği bulundu (p<0,05). Bu ekstreler, söz konusu etkilerini yüksek dozlarda (200 ve 100 μg/ml) gösterirken, daha düşük dozlarda dikkate değer bir etki tespit edilemedi. D, G ve K kodlu ekstrelerin uygulandığı PC-3 hücrelerinde, konsantrasyon arttıkça hücre canlılık oranlarında anlamlı azalmalar (p<0,05) gözlense de sitotoksik açıdan en önemli etkiler, ekstrelerin sadece 200 μg/mlʼlık dozlarında saptandı. PC-3 hücrelerinde, taranan tüm ekstreler arasında en zayıf sitotoksik etkiyi gösteren ekstreler; B, C ve K kodlu ekstreler olarak belirlendi. Ancak, DU 145 hücrelerinin aksine PC-3 hücrelerinde, bu ekstrelerin 200 μg/mlʼlık dozlarının hücre canlılıklarını ciddi oranda azalttığı görüldü (p<0,05). A ve F kodlu ekstrelerin, PC-3 hücreleri üzerindeki etkisi ise antiproliferatif/sitostatik olarak değerlendirildi. 92 Şekil 4.3. PC-3 hücrelerine ham ekstrelerin uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, ham ekstre uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 93 Ham ekstre uygulanan DU 145 ve PC-3 hücrelerinin SRB hücre canlılık testiyle doza karşı yüzde canlılık grafiklerinden türetilen ve hücrelerin %50ʼsini öldüren inhibitör konsantrasyon olarak ifade edilen IC50 değerleri, Çizelge 4.2ʼde verildi. IC50 değerleri dikkate alındığında, her iki hücre hattında da en iyi sitotoksik aktivitelerin 72 saatlik tedavi süresinde elde edildiği görüldü. Bu sonuç; ham ekstreler ile daha uzun süreli tedavinin, daha düşük IC50 dozlarına ve buna bağlı olarak daha yüksek sitotoksik etkilere neden olmasıyla açıklandı. Ham ekstrelerin uygulandığı DU 145 ve PC-3 hücrelerinde tespit edilen en düşük IC50 dozları E ve H kodlu ekstrelere aittir. 72 saatlik uygulama için E kodlu ekstrenin DU 145 hücrelerindeki IC50 dozu 67,14 μg/ml, PC-3 hücrelerindeki IC50 dozu ise 94,50 μg/ml olarak belirlendi. H kodlu ekstre için 72. saatte elde edilen IC50 değerleri ise sırasıyla; DU 145 hücre hattında 55,96 μg/ml, PC-3 hücre hattında 87,17 μg/ml olarak bulundu. Bu ekstrelerin etki derecelerine benzer etkinlik gösteren diğer ekstrelerin D ve G kodlu ekstreler olduğu görüldü. SRB testiyle elde edilen IC50 değerleri kıyaslandığında, DU 145 hücrelerinin D, E, G ve H kodlu ekstrelere PC-3 hücrelerinden daha duyarlı olduğu bulundu. Bunlara ek olarak; B, C ve K kodlu ekstrelerin PC-3 hücrelerinde daha etkili olduğu ancak bu ekstreler için hesaplanan IC50 dozlarının nispeten yüksek olduğu belirlendi. Her iki hücre hattında, A ve F kodlu ekstreler için ise etkin dozlar belirlenememiş olup hesaplanan IC50 değerleri uygulanan doz aralığının dışındadır (IC50 >200 μg/ml). Çizelge 4.2. Epilobium hirsutum L. ham ekstrelerinin SRB testiyle hesaplanan IC50 dozları Ham IC50 Dozları (μg/ml) Ekstreler DU 145 PC-3 24 Saat 48 Saat 72 Saat 24 Saat 48 Saat 72 Saat A >200 >200 >200 >200 >200 >200 B >200 >200 >200 >200 >200 188,80 C >200 >200 >200 >200 >200 140,63 D >200 124,60 79,26 >200 173,08 124,86 E 157,89 95,37 67,14 >200 145,12 94,50 F >200 >200 >200 >200 >200 >200 G >200 138,25 91,67 >200 >200 136,97 H 169,23 87,93 55,96 >200 136,70 87,17 K >200 194,26 141,15 >200 179,45 115,29 94 XTT hücre canlılık testi bulguları Ham ekstrelerin DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki sitotoksik etkilerini doğrulamak için, XTT hücre canlılık testinden yararlanıldı. Ham ekstrelerin 3,13-200 μg/ml aralığında yer alan konsantrasyonları ile 24, 48 ve 72 saatlik tedaviden sonra elde edilen sonuçlara göre, E kodlu ekstrenin DU 145 hücre hattına karşı en güçlü sitotoksik aktiviteyi gösterdiği tespit edildi (Şekil 4.4). Bu ekstrenin, negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, DU 145 hücre canlılıklarını doza ve zamana bağımlı olarak anlamlı şekilde azalttığı görüldü (p<0,05). Ancak, bu ekstrenin uygulanan tüm dozlarda sitotoksik etki göstermediği belirlendi. 24 saatlik tedavi sonrası, E kodlu ekstrenin sadece 200 μg/mlʼlik dozunda sitotoksik etki gözlenirken 48 ve 72 saatlik muameleler sonucu, hem 200 μg/ml hem de 100 μg/ml konsantrasyonlarda sitotoksik etki incelendi. E kodlu ekstrenin daha düşük dozlarının ise, DU 145 hücreleri üzerinde antiproliferatif/sitostatik olarak etki gösterdiği belirlendi. E kodlu ekstreden sonra, DU 145 hücrelerine karşı en iyi sitotoksik aktiviteyi gösteren ekstreler; D, G ve H kodlu ekstreler olup bu ekstrelerin etki dereceleri birbirine benzerdir. K kodlu ekstrenin, DU 145 hücreleri karşında en güçlü sitotoksik etkiyi kısa süreli tedavide (24. saat) göstermesi bu çalışma için dikkat çekici bir sonuç oldu. 95 Şekil 4.4. DU 145 hücrelerine ham ekstrelerin uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, ham ekstre uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 96 Şekil 4.5ʼde gösterildiği gibi, taranan tüm ham ekstrelerin, PC-3 hücre hattında diğer hücre hattına benzer sitotoksik aktivite sergilediği incelendi. Bu hücre hattında da, sitotoksik açıdan en yüksek etki E kodlu ekstrede tespit edildi. Bu ekstre ile muamele sonrası, konsantrasyon ve tedavi süresi artışına bağlı olarak PC-3 hücre canlılıklarında, negatif kontrole kıyasla, anlamlı azalışlar olduğu belirlendi (p<0,05). 24. saatte, bu ekstrenin yalnızca 200 μg/mlʼlik dozunun sitotoksik olarak, daha düşük dozlarının (3,13-100 μg/ml) ise antiproliferatif/sitostatik olarak etkili olduğu görüldü. Bunun aksine, tedavi süresinin 48. ve 72. saatlerinde, ekstrenin hem 200 μg/ml hem de 100 μg/mlʼlik dozlarının sitotoksisiteye yol açtığı gözlendi. Bu süre içinde, diğer dozların (3,13-50 μg/ml) sitotoksik etkiden çok hücre çoğalmasını baskılayıcı yönde etki gösterdiği bulundu. 24-72 saatlik tedavi aralığında, PC-3 hücrelerine karşı E kodlu ekstre haricinde en iyi sitotoksik aktiviteyi sergileyen diğer ekstreler; D, G ve H kodlu ekstrelerdir. Bu ekstrelerin aktiviteleri birbirine yakın düzeydedir. Tüm bunlara ilave olarak; 72 saatlik tedaviden sonra, K kodlu ekstreye ait 200 μg/mlʼlik konsantrasyonun PC-3 hücrelerinde sitotoksik etkiye neden olduğu belirlendi. A, B, C ve F kodlu ekstrelerin ise antiproliferatif/sitostatik etkili olduğu, ancak DU 145 hücrelerinden farklı olarak PC-3 hücrelerinin C kodlu ekstreye daha duyarlı olduğu gözlendi. 97 Şekil 4.5. PC-3 hücrelerine ham ekstrelerin uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, ham ekstre uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 98 Ham ekstrelerin sitotoksik etkilerinin değerlendirilmesinde önemli olan IC50 değerleri, DU 145 ve PC-3 hücrelerine ait XTT hücre canlılık testi sonuçlarından yola çıkılarak hesaplandı. Çizelge 4.3ʼde verilen sonuçlar incelendiğinde, her iki hücre hattında da ham ekstrelere ait en düşük IC50 değerleri 72 saatlik tedavi sonunda belirlendi. İstisnai olarak, K kodlu ekstre için en güçlü sitotoksik etki, 24. saatte ve sadece DU 145 hücre hattında tespit edildi (IC50 dozu: 83,78 μg/ml). Hem DU 145 hem de PC-3 hücrelerinde en düşük IC50 değerlerinin hesaplandığı dolayısıyla en güçlü sitotoksik aktiviteyi sergileyen ekstrenin, E kodlu ekstre olduğu saptandı. 72 saatlik muamelenin ardından, E kodlu ekstrenin DU 145 hücrelerindeki IC50 dozu 64,58 μg/ml iken, PC-3 hücrelerindeki IC50 dozu 53,23 μg/ml olarak hesaplandı. Bu sonuç, hücrelerin bu ekstreye karşı duyarlılıklarının benzer olduğu göstermektedir. Sitotoksik etki olarak nispeten birbirine yakın sonuçlar veren diğer ekstreler; D, G ve H kodlu ekstrelerdir ve bu etki, iki hücre hattında da geçerlidir. Ancak, hücrelerin D kodlu ekstreden çok G ve H kodlu ekstreler ile tedaviye daha iyi yanıt verdiği gözlendi. Ayrıca, K kodlu ekstrenin hem DU 145 hem de PC-3 hücrelerine karşı zayıf sitotoksik etki gösterdiği belirlendi. A, B, C ve F kodlu ekstreler için ise sitotoksisiteye dair olumlu bir bulgu elde edilememiş olup IC50 değerleri iki hücre hattı için de doz aralığının dışındadır (IC50 >200 μg/ml). Çizelge 4.3. Epilobium hirsutum L. ham ekstrelerinin XTT testiyle hesaplanan IC50 dozları Ham IC50 Dozları (μg/ml) Ekstreler DU 145 PC-3 24 Saat 48 Saat 72 Saat 24 Saat 48 Saat 72 Saat A >200 >200 >200 >200 >200 >200 B >200 >200 >200 >200 >200 >200 C >200 >200 >200 >200 >200 >200 D >200 180,23 104,50 >200 >200 124,77 E 143,39 85,93 64,58 129,49 81,67 53,23 F >200 >200 >200 >200 >200 >200 G >200 >200 94,67 >200 200 109,91 H >200 >200 99,02 >200 200 100,46 K 83,78 >200 >200 >200 >200 162,94 Kısaca özetlemek gerekirse; farklı E. hirsutum ekstrelerinin test edilen hücre hatları karşısındaki sitotoksik etkileri ilk önce SRB hücre canlılık testiyle araştırıldı. Daha 99 sonra, bu testten elde edilen verilerin doğruluğunu teyit etmek için seçilen alternatif bir test ile aynı deneysel şartlar altında analiz yapılması planlandı. Bu amaçla, XTT hücre canlılık testi kullanılarak ikinci bir deney yürütüldü. Sonuç olarak, bu iki farklı testten elde edilen bulguların birbiriyle uyumlu olduğu ve SRB testiyle hesaplanan IC50 dozlarının görece düşük olduğu bulundu. Bu bulgulardan yola çıkarak, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde en güçlü sitotoksik etki, su içinde maserasyon yöntemiyle hazırlanan E kodlu ekstrede görüldü. Bu bağlamda, biyolojik aktivite rehberli olarak aktiviteden sorumlu bileşikleri tanımlayabilmek için sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi kullanılarak E kodlu ekstreden kaba fraksiyonlama gerçekleştirildi. 4.2.2. Kaba fraksiyonların sitotoksik etkilerine ilişkin bulgular E. hirsutum bitkisine ait E kodlu ham ekstreden elde edilen kaba fraksiyonların (E1, E2, E3 ve E4) DU 145 ve PC-3 prostat kanseri hücreleri üzerindeki olası sitotoksik etkileri, ekstreler ile aynı deney koşulları altında incelendi. Bu kapsamda, kaba fraksiyonların sitotoksik ve/veya antiproliferatif/sitostatik etkileri, SRB ve XTT hücre canlılık testleri ile değerlendirildi. SRB hücre canlılık testi bulguları E1, E2, E3 ve E4 olarak adlandırılan 4 farklı fraksiyonunun (1,56-100 μg/ml konsantrasyon aralığındaki) DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki etkisi, 24, 48 ve 72 saat sonra ilk olarak SRB hücre canlılık testiyle analiz edildi. Şekil 4.6ʼda verildiği üzere, tüm kaba fraksiyonların, negatif kontrole kıyasla, DU 145 hücre canlılıklarında doza ve zamana bağlı anlamlı azalışlar gösterdiği belirlendi (p<0,05). Fraksiyonlar arasında, E2 kodlu etil asetat fraksiyonunun diğer fraksiyonlardan daha etkili olduğu bulundu. Ancak, bu fraksiyonun yalnızca en yüksek konsantrasyonun (100 μg/ml) DU 145 hücrelerinde sitotoksisiteye neden olduğu görüldü. Bununla beraber, DU 145 hücre hattında, E3 ve E4 kodlu fraksiyonların E2 kodlu fraksiyona yakın sitotoksik aktivite sergilediği tespit edildi. Bu fraksiyonların aktiviteleri benzer bir eğilim göstermiş olup etkili oldukları doz 100 μg/mlʼdir. E1 kodlu fraksiyon için, tüm dozların; diğer 100 fraksiyonlar için, <100 μg/ml dozların hücre çoğalmasını baskılayarak antiproliferatif/sitostatik yönde etki gösterdiği belirlendi. Şekil 4.6. DU 145 hücrelerine kaba fraksiyonların uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, kaba fraksiyon uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. *, ϕ, # ve o Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 101 Test edilen kaba fraksiyonların çalışma dozları ve inkübasyon süresi arttıkça, PC-3 hücre canlılıklarında da istatistiksel olarak anlamlı azalışlar belirlendi (p<0,05). DU 145 hücrelerinde gözlemlendiği gibi, E2 kodlu fraksiyonun PC-3 hücrelerine karşı diğer fraksiyonlardan daha güçlü sitotoksik etki gösterdiği saptandı (Şekil 4.7). Fakat 24, 48 ve 72 saat boyunca, PC-3 hücrelerinin bu fraksiyona DU 145 hücrelerinden daha duyarlı olduğu gözlendi. PC-3 hücre hattı için en önemli etki, E2 fraksiyonunun en yüksek dozunda (100 μg/ml) görüldü ve sadece bu dozun hücrelerde sitotoksisiteye neden olduğu belirlendi. Daha düşük dozlarda ise, etki daha zayıf olmakla birlikte hücre çoğalmasının baskılanması (antiproliferatif/sitostatik etki) açısından önemlidir. Diğer yandan, E1, E3 ve E4 kodlu fraksiyonların varlığında, en yüksek konsantrasyonda dahi bu hücre hattı için sitotoksik etki elde edilemedi. Bu sebeple; E1, E3 ve E4 kodlu fraksiyonların aktiviteleri, antiproliferatif/sitostatik olarak değerlendirildi. Ayrıca, E3 ve E4 kodlu fraksiyonların, aktivite bakımından birbirine benzer sonuçlar verdiği görüldü. 102 Şekil 4.7. PC-3 hücrelerine kaba fraksiyonların uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, kaba fraksiyon uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. *, ϕ, # ve o Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 103 Çizelge 4.4. Epilobium hirsutum L. kaba fraksiyonlarının SRB testiyle hesaplanan IC50 dozları IC50 Dozları (μg/ml) DU 145 PC-3 24 Saat 48 Saat 72 Saat 24 Saat 48 Saat 72 Saat Kaba fraksiyonlar E1 >100 >100 >100 >100 >100 >100 E2 >100 79,24 67,82 >100 68,87 52,24 E3 >100 >100 >100 >100 >100 65,51 E4 >100 >100 >100 >100 >100 >100 Ham ekstre E >100 95,37 67,14 >100 >100 94,50 DU 145 ve PC-3 hücreleri için, kaba fraksiyonların ve bu fraksiyonların elde edildiği ham ekstrenin IC50 değerleri Çizelge 4.4ʼde sunuldu. Bu sonuçlara göre; 24 saat sonunda, tüm fraksiyonların, kullanılan konsantrasyonlarda iki hücre hattı üzerinde sitotoksik olmadığı bulundu (IC50 >100 μg/ml). Bunun aksine, 48 saatlik tedavi sonrası, hücre hatlarında sadece E2 kodlu fraksiyonun sitotoksik etkisi saptandı. DU 145 ve PC- 3 hücrelerinin bu fraksiyona karşı neredeyse eşit seviyede duyarlı olduğu gözlendi (IC50 dozları; 79,24 μg/ml ve 68,87 μg/ml, sırasıyla). Daha uzun süreli tedavinin daha düşük IC50 değerlerine neden olduğu gösterilerek, 72. saatte E2 kodlu fraksiyon için her iki hücre hattında da en düşük IC50 dozları elde edildi (IC50 dozları; DU 145 için 67,82 μg/ml ve PC-3 için 52,24 μg/ml). 72 saatlik tedaviden sonra, diğer fraksiyonların (E1, E3 ve E4), DU 145 hücrelerine karşı olası bir sitotoksik aktivitesi belirlenmezken PC-3 hücrelerinde E2 kodlu fraksiyonun yanı sıra E3 kodlu fraksiyonun da önemli bir etkiye sahip olduğu görüldü. Sonuçlar ele alındığında, daha düşük IC50 değerleri elde edilmesi nedeniyle, PC-3 hücrelerinin çalışılan fraksiyonlara DU 145 hücrelerinden daha duyarlı olduğu sonucuna varıldı. Çizelge 4.4ʼde özetlendiği üzere, tüm kaba fraksiyonların sitotoksik aktiviteleri farklı konsantrasyon aralıklarında ham ekstrenin sitotoksik aktivitesi ile karşılaştırıldı. DU 145 hücrelerinde, E2 kodlu fraksiyonun E kodlu ekstre ile benzer seviyede sitotoksik etki gösterdiği bulundu. Aksine; E1, E3 ve E4 kodlu fraksiyonların sitotoksik ve/veya antiproliferatif (sitostatik) etki bakımından ekstreden daha az potansiyele sahip olduğu gözlendi. PC-3 hücre hattında ise, E2 ve E3 kodlu fraksiyonların ekstreye göre daha 104 yüksek sitotoksik aktivite sergilemesi dikkat çekici bir sonuç oldu. Öte yandan; E1 ve E4 kodlu fraksiyonların, tedavi süresi boyunca ekstre kadar önemli bir etki gösteremediği tespit edildi. XTT hücre canlılık testi bulguları SRB testi bulgularından hareketle, kaba fraksiyonlar için elde edilen sonuçları doğrulamak amacıyla XTT hücre canlılık testinin yürütülmesine karar verildi. Bu nedenle; 24, 48 ve 72 saat boyunca, tüm fraksiyonların DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki sitotoksik aktiviteleri aynı doz aralığında (1,56-100 μg/ml) test edildi. Farklı fraksiyon konsantrasyonlarının DU 145 ve PC-3 hücrelerine karşı etkisi, sırasıyla Şekil 4.8 ve Şekil 4.9ʼda sunuldu. Analiz sonuçlarına göre; E2 kodlu fraksiyonun varlığında, DU 145 hücre canlılıklarında doza ve zamana bağlı olarak anlamlı azalışlar (p<0,05) tespit edilmesine rağmen, canlılık oranlarının en yüksek konsantrasyonda dahi %50ʼnin altına düşmediği görüldü. Bu sonuç, E2 kodlu fraksiyonun DU 145 hücrelerinde sitotoksik etkiden ziyade antiproliferatif/sitostatik ölçekte etkili olduğu anlamına gelmektedir. Diğer fraksiyonlar (E1, E3 ve E4 kodlu) ise, DU 145 hücre çoğalmasını, nispeten yüksek dozlarda, kısmen baskılayarak antiproliferatif/sitostatik şekilde etki gösterdi (Şekil 4.8). PC-3 hücreleri için elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde; DU 145 hücrelerindeki duruma benzer şekilde, en etkili fraksiyonun E2 kodlu fraksiyonun olduğu, ancak bu fraksiyonun PC-3 hücrelerinde daha iyi aktivite sergilediği görüldü. Şekil 4.9ʼda gösterildiği gibi, PC-3 hücre hattı için E2 kodlu fraksiyonunun 100 μg/mlʼlik konsantrasyonunda, negatif kontrole kıyasla, istatistiksel olarak anlamlı sitotoksik etki söz konusudur (p<0,05). 24, 48 ve 72 saat boyunca, sözü edilen fraksiyonun, daha düşük dozlarda proliferatif bir etki göstermesi, fakat 100 μg/ml doza ulaşıldığında hücre canlılığının ani ve belirgin bir şekilde %50ʼnin altına düşmesi dikkat çekici bir sonuçtur. PC-3 hücre hattında, E2 kodlu fraksiyondan sonra en iyi aktivite E3 kodlu fraksiyon için kaydedildi. Ancak, bu fraksiyon, 24-48 saat aralığında hücre büyümesini baskılayarak antiproliferatif/sitostatik etkinlik gösterdi. E1 kodlu fraksiyon için zayıf ancak istatistiksel olarak en anlamlı antiproliferatif/sitostatik etki, 72. saatte ölçüldü. E4 105 kodlu fraksiyonda saptanan kayda değer tek etki, 72 saatlik inkübasyon sonrası 100 μg/mlʼlik doz için elde edilen antiproliferatif/sitostatik ölçekli etkidir (Şekil 4.9). Şekil 4.8. DU 145 hücrelerine kaba fraksiyonların uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, kaba fraksiyon uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. *, ϕ, # ve o Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 106 Şekil 4.9. PC-3 hücrelerine kaba fraksiyonların uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, kaba fraksiyon uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. *, ϕ, # ve o Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 107 Ham ekstrenin ve bu ekstreye ait kaba fraksiyonların, her iki hücre hattı için elde edilen IC50 değerlerinin karşılaştırılması Çizelge 4.5ʼde verildi. DU 145 hücre hattı için; 24, 48 ve 72 saat sonunda elde edilen tüm fraksiyonların (E1, E2, E3 ve E4) IC50 değerleri uygulanan doz aralıklarının dışındadır (IC50 >100 μg/ml). E2 kodlu fraksiyonun 100 μg/mlʼlik dozunun varlığında, DU 145 hücre canlılıkları önemli oranda azalmasına karşın, sitotoksik olarak bir etki gözlenmedi (hücre canlılıkları, 24. saatte %69,60; 48. saatte %65,91 ve 72. saatte %62,23). PC-3 hücrelerinde, E2 kodlu fraksiyon dışındaki fraksiyonlar için test edilen doz aralığında IC50 değeri hesaplanamadı (IC50 >100 μg/ml). PC-3 hücreleri için fraksiyonlar arasında sitotoksik açıdan en aktif fraksiyon, E2 kodlu fraksiyon olarak belirlendi. PC-3 hücrelerinde, bu fraksiyona ait IC50 dozlarının 24, 48 ve 72 saatlik tedaviler arasında önemli farklılıklar gösterdiği bulundu. 3 farklı tedavi süresi sonunda elde edilen IC50 değerleri birbirine yakın olmakla birlikte en düşük IC50 değerine 72. saat sonunda ulaşıldı (IC50 değeri: 73,22 μg/ml). E3 kodlu fraksiyon 100 μg/mlʼlik dozda, özellikle 72 saatlik tedaviden sonra, PC-3 hücre canlılığını önemli oranda düşürmesine rağmen (%56,63) sitotoksik olarak etki gösteremedi. XTT testiyle elde edilen veriler kıyaslandığında, PC-3 hücrelerinin fraksiyonlara karşı DU 145 hücrelerinden daha hassas olduğu görüldü. Çizelge 4.5. Epilobium hirsutum L. kaba fraksiyonlarının XTT testiyle hesaplanan IC50 dozları IC50 Dozları (μg/ml) DU 145 PC-3 24 Saat 48 Saat 72 Saat 24 Saat 48 Saat 72 Saat Kaba fraksiyonlar E1 >100 >100 >100 >100 >100 >100 E2 >100 >100 >100 81,87 76,47 73,22 E3 >100 >100 >100 >100 >100 >100 E4 >100 >100 >100 >100 >100 >100 Ham ekstre E >100 85,93 64,58 >100 81,67 53,23 Çizelge 4.5ʼde verildiği gibi, tüm kaba fraksiyonların ve E kodlu ham ekstrenin sitotoksik potansiyellerinin kıyaslanması, elde edilen IC50 değerlerine göre yapıldı. XTT testi sonuçlarına göre, taranan tüm fraksiyonların DU 145 hücreleri üzerinde ham ekstre kadar sitotoksik aktivite göstermediği belirlendi. PC-3 hücrelerinde; E1, E3 ve E4 kodlu 108 fraksiyonların ham ekstreden daha zayıf aktivite sergilediği bulundu. E2 kodlu fraksiyonun ise PC-3 hücreleri karşısında ekstre ile kıyaslanabilir değerde sitotoksik etki gösterdiği saptandı. 24. ve 48. saatlerde, E2 kodlu fraksiyon için ekstreden daha düşük IC50 değerleri elde edildi ve bu fraksiyonun ekstreden nispeten iyi bir sitotoksik aktiviteye sahip olduğu gözlendi. Ancak, PC-3 hücrelerinde 72 saat sonunda ekstrenin E2 kodlu fraksiyona kıyasla daha güçlü sitotoksisiteye neden olduğu görüldü. Sitotoksisite deneyleri kapsamında elde edilen tüm sonuçlar ışığında; kaba fraksiyonların prostat kanseri hücrelerine karşı E kodlu ekstre kadar etkili olmadığı, ancak kaba fraksiyonlar arasından E kodlu ekstreye en yakın etkiyi E2 kodlu fraksiyonun gösterdiği bulunmuştur. E kodlu ham ekstrede bulunan etken maddelerin veya bileşiklerin birlikte bulunduklarında sinerjik etki gösterdikleri açıktır. Kaba fraksiyonların E kodlu ekstreden daha zayıf sitotoksik etkinliğe sahip olması nedeniyle, alt fraksiyonlama çalışmasının yapılmamasına karar verilmiştir. Bu bağlamda, ileri analizlere E kodlu ekstre ve E2 kodlu fraksiyon ile devam edilmesi planlanmıştır. 4.2.3. Unotein Bʼnin sitotoksik etkisine ilişkin bulgular Tez çalışmasında kullanılan unotein Bʼnin DU 145 ve PC-3 hücre canlılıkları üzerindeki etkisi, kaba fraksiyonlar ile eş zamanlı olarak analiz edildi. Unotein Bʼnin muhtemel aktivitesinin tespiti için kolorimetrik testler olan SRB ve XTT hücre canlılık testlerinden yararlanıldı. SRB hücre canlılık testi bulguları Unotein Bʼnin farklı konsantrasyonlarına (2,5-160 μg/ml) maruz bırakılan DU 145 ve PC-3 hücrelerinin canlılık oranlarındaki değişim; 24, 48 ve 72 saat sonra SRB deneyi ile belirlendi. Unotein Bʼnin, negatif kontrole oranla, DU 145 hücre canlılıklarında hem doza hem de zamana bağlı olarak anlamlı azalışlara neden olduğu gözlendi (p<0,05) (Şekil 4.10). 24 saatlik tedaviyi takiben unotein Bʼnin, uygulanan tüm dozlarda, DU 145 hücre hattına karşı sitotoksik etkisi belirlenemedi. Bu süre zarfında elde edilen tek kayda değer sonuç, en yüksek dozdaki (160 μg/ml) antiproliferatif/sitostatik ölçekli etkidir. Daha uzun süreli tedavinin sonucu olarak, 48. ve 72. saatlerde unotein Bʼnin 109 DU 145 hücreleri üzerinde daha güçlü sitotoksik aktivite sergilediği saptandı. 48. saatte, 160 μg/mlʼlik en yüksek konsantrasyonun; 72. saatte ise 160 ve 80 μg/mlʼlik konsantrasyonların önemli ölçüde hücre ölümüne (sitotoksisiteye) neden olduğu gözlendi. Bununla birlikte, daha düşük dozlarda antiproliferatif/sitostatik etki kaydedildi. 24, 48 ve 72 saat boyunca unotein B uygulanan PC-3 hücreleri için DU 145 hücrelerine benzer bir sitotoksisite grafiği elde edildi (Şekil 4.10). Unotein Bʼnin PC-3 hücre canlılığını, negatif kontrole kıyasla, doza ve zamana bağlı olarak anlamlı şekilde azalttığı görüldü (p<0,05). Ancak, bu bileşiğin tüm çalışma dozlarında sitotoksik etki söz konusu değildir. 24 ve 48 saatlik tedavilerden sonra sadece en yüksek konsantrasyonda (160 μg/ml) sitotoksik aktivite incelenirken, 72 saatlik tedaviyi takiben en yüksek iki konsantrasyonda da (160 ve 80 μg/ml) sitotoksik etki tespit edildi. Bunun yanı sıra, tedavi süresince daha düşük dozların antiproliferatif/sitostatik bakımdan PC-3 hücrelerine karşı önemli bir etkinlik gösterdiği kaydedildi. 110 Şekil 4.10. DU 145 ve PC-3 hücrelerine unotein B uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, unotein B uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * ve ϕ Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 111 Çalışmada kullanılan unotein Bʼnin DU 145 ve PC-3 hücreleri için elde edilen IC50 değerleri Çizelge 4.6ʼda gösterildi. Elde edilen IC50 sonuçlarına göre; iki hücre hattında 24, 48 ve 72 saatlik tedaviler arasında önemli farklılıklar belirlendi. Bu bulgu; uzun süreli tedavilerin, sitotoksik ajanların etkinliğini arttırdığını ve daha düşük IC50 değerlerinin elde edilmesini açıklamaktadır. 24 saat sonra hesaplanan IC50 değerleri, DU 145 hücreleri için doz aralığı dışındayken (>160 μg/ml) PC-3 hücre hattı için 150,64 μg/mlʼdir. 48 saatlik tedavinin ardından unotein Bʼnin, DU 145 hücrelerindeki IC50 dozu 103,12 μg/ml, PC-3 hücrelerindeki IC50 dozu ise 84,93 μg/ml olarak bulundu. 72. saatte DU 145 ve PC-3 hücreleri için hesaplanan IC50 değerleri ise sırasıyla 61,74 μg/ml ve 51,43 μg/mlʼdir. PC-3 hücreleri için elde edilen IC50 dozlarının DU 145 hücreleri için hesaplanan IC50 dozlarından görece daha düşük olması nedeniyle PC-3 hücrelerinin unotein Bʼye daha duyarlı olduğu söylenebilmektedir. Çizelge 4.6. Unotein Bʼnin SRB testiyle hesaplanan IC50 dozları IC50 Dozları (μg/ml) 24 Saat 48 Saat 72 Saat DU 145 >160 103,12 61,74 PC-3 150,64 84,93 51,43 XTT hücre canlılık testi bulguları SRB testi ile sağlanan bulguları teyit etmek amacıyla aynı deneysel şartlar altında XTT hücre canlılık testi yürütüldü. Bu bağlamda; DU 145 ve PC-3 hücre hatlarına, 24, 48 ve 72 saat boyunca artan dozlardaki (2,5-160 μg/ml) unotein B uygulandı ve süre bitiminde hücresel canlılıklar incelendi. Analiz sonuçlarına göre; negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, unotein Bʼnin her iki hücre canlılığında da doza ve zamana bağlı olarak anlamlı azalışlara neden olduğu belirlendi (p<0,05) (Şekil 4.11). Fakat PC-3 hücre canlılıklarındaki düşüşün, DU 145 hücrelerinden istatistiksel olarak daha önemli olduğu görüldü. DU 145 hücrelerinde, ilk 24 saatlik tedavide unotein Bʼnin uygulanan tüm dozlarda sitotoksik olmadığı, ancak en yüksek dozunda (160 μg/ml) zayıf ancak istatistiksel olarak önemli bir antiproliferatif/sitostatik etki gösterdiği incelendi. 48. ve 72. saatlerde ise yalnızca 160 μg/mlʼlik en yüksek konsantrasyonda sitotoksik aktivite gözlendi. Bu zaman aralıklarında, daha düşük dozların (<160 μg/ml) DU 145 112 hücrelerine karşı zayıf da olsa antiproliferatif/sitostatik etki gösterdiği sonucuna ulaşıldı. DU 145 hücrelerinden farklı olarak, unotein Bʼnin PC-3 hücreleri üzerinde daha etkili olduğu gözlendi. Sözü edilen bileşik, konsantrasyon ve inkübasyon süresi artışına bağlı olarak PC-3 hücre canlılıklarında, negatif kontrole kıyasla, istatistiksel olarak anlamlı azalmalara sebep oldu (p<0,05) (Şekil 4.11). PC-3 hücrelerinde, 24 ve 48 saatlik tedaviyi takiben sitotoksik olarak etkisi ölçülen unotein B konsantrasyonu 160 μg/mlʼdir. 72. saatte, bu hücre hattı için unotein B bileşiğinin sitotoksik etkisi 160 ve 80 μg/mlʼlik dozlarda elde edildi. Ayrıca, PC-3 hücrelerinde, bu bileşiğin düşük konsantrasyonlarda antiproliferatif/sitostatik olarak daha güçlü aktivite sergilediği belirlendi. 113 Şekil 4.11. DU 145 ve PC-3 hücrelerine unotein B uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, unotein B uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * ve ϕ Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 114 DU 145 ve PC-3 hücreleri için XTT testi sonuçlarına göre hesaplanan unotein Bʼye ait IC50 değerleri Çizelge 4.7ʼde gösterildi. SRB testi sonuçlarına uygun olarak, XTT testiyle en düşük IC50 değerleri 72 saatlik inkübasyon sonunda elde edildi. 24 saatte, unotein B için DU 145 hücrelerinde IC50 değeri hesaplanamazken (>160 μg/ml), PC-3 hücrelerinde elde edilen IC50 değeri 142,05 μg/mlʼdir. 48 saat sonra, DU 145 ve PC-3 hücreleri için belirlenen IC50 dozları arasında önemli fark bulunmaktadır (IC50 değerleri: 146,19 μg/ml ve 91,38 μg/ml, sırasıyla). Benzer sonuç, 72 saatlik tedavi sonucu hesaplanan IC50 değerlerinde de mevcuttur. Nitekim 72. saatte DU 145 ve PC-3 hücrelerinde unotein B için tespit edilen IC50 sonuçları, sırasıyla, 117,26 μg/ml ve 72,06 μg/mlʼdir. XTT testi bulgularından hareketle, unotein Bʼnin PC-3 hücrelerine karşı daha güçlü sitotoksik aktivite gösterdiği görülmektedir. Çizelge 4.7. Unotein Bʼnin XTT testiyle hesaplanan IC50 dozları IC50 Dozları (μg/ml) 24 Saat 48 Saat 72 Saat DU 145 >160 146,19 117,26 PC-3 142,05 91,38 72,06 Sonuç olarak, tez çalışmasında kullanılan unotein Bʼnin prostat kanseri hücre hatları üzerindeki potansiyel etkilerini in vitro olarak çalışmak üzere hem SRB hem de XTT hücre canlılık testi yürütüldü. Elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde, her iki test ile ulaşılan verilerin birbiriyle uyumlu olduğu görüldü. Bununla birlikte, SRB testiyle hesaplanan IC50 değerlerinin nispeten daha düşük olduğu bulundu. Unotein B bileşiği ile tedaviye PC-3 hücrelerinin daha duyarlı gözlendi. 4.2.4. Paklitakselʼin sitotoksik etkisine ilişkin bulgular Deneysel çalışmalarda, pozitif kontrol olarak kemoterapötik bir ilaç olan paklitaksel kullanıldı. Paklitakselin farklı konsantrasyonlarda DU 145 ve PC-3 hücrelerine karşı sitotoksik etkisi, SRB ve XTT hücre canlılık testleri çalışılarak değerlendirildi. 115 SRB hücre canlılık testi bulguları Paklitakselin DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki doza ve zamana bağlı sitotoksik aktivitesi Şekil 4.12ʼde gösterildi. SRB hücre canlılık testi sonuçlarına göre; 0,001-0,5 μg/ml aralığındaki tüm dozlarda, negatif kontrole oranla, hücre canlılıklarının anlamlı bir şekilde azaldığı gözlendi (p<0,05). 24 saat sonra, hem DU 145 hem de PC-3 hücrelerinde doz artışına bağlı olarak canlılık yüzdelerinin ciddi anlamda düştüğü, ancak en yüksek konsantrasyonda (0,5 μg/ml) dahi sitotoksik etki elde edilemediği gözlendi. Bu nedenle, paklitakselin 24 saatlik tedavi sonundaki etkisinin büyüme baskılayıcı yönde (antiproliferatif/sitostatik) olduğu belirtilebilir. 48 saat sonra, paklitaksel dozlarının büyük çoğunluğunda iki hücre hattı için önemli sitotoksik etkiler kaydedildi. DU 145 hücreleri için, paklitakselin en düşük iki konsantrasyonunda (0,001 ve 0,003 μg/ml) tespit edilen etki, antiproliferatif/sitostatik kapsamda olup diğer yüksek dozlarda önemli sitotoksik aktivitelerin var olduğu görüldü. Özellikle, paklitaksel konsantrasyonu 0,005 μg/mlʼye ulaştığında DU 145 hücre canlılıklarının ciddi bir biçimde düştüğü tespit edildi. PC-3 hücrelerinde ise; 0,001, 0,003 ve 0,005 μg/ml konsantrasyonları dışındaki paklitaksel dozlarında dikkate değer sitotoksik etkiler saptandı. Fakat 0,01 μg/mlʼlik konsantrasyondan sonra, doz artışına rağmen hücre canlılık yüzdelerinde önemli bir azalış olmadığı, nispeten sabit kaldığı gözlendi. Etki süresine bağlı olarak, iki hücre hattı için en güçlü sitotoksik etkiler 72. saat sonunda elde edildi. DU 145 hücrelerinde, en düşük paklitaksel dozu (0,001 μg/ml) haricindeki tüm dozlarda güçlü sitotoksik etkiler söz konusu iken PC-3 hücrelerinde paklitakselin sitotoksik etkinliğinin 0,005 μg/mlʼlik konsantrasyonda başladığı görülmektedir. Paklitakselin uygulanmasından 72 saat sonra, konsantrasyona bağlı olarak DU 145 ve PC-3 hücrelerinin ölmesiyle canlılık değerlerinin anlamlı bir şekilde düştüğü incelendi. Ancak 0,02 μg/mlʼlik dozdan itibaren iki hücre hattına ait canlılık oranlarının neredeyse aynı yüzdelikte devam ettiği ve tedavi süresi boyunca sözü edilen hücrelerin tamamının ölmediği gözlendi. 116 Şekil 4.12. DU 145 ve PC-3 hücrelerine paklitaksel uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, Paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * ve ϕ Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 117 Paklitaksel uygulanan DU 145 ve PC-3 hücrelerinin SRB hücre canlılık testi sonuçlarına göre hesaplanan IC50 değerleri Çizelge 4.8ʼde sunuldu. Tedaviden 24 saat sonra, paklitakselin DU 145 ve PC-3 hücrelerine karşı fark edilir bir etkisi olmakla beraber bu hücre hatlarında paklitaksel için IC50 dozu elde edilemedi (>0,5 μg/ml). Bu etkinin aksine, hücre canlılıklarının 48. saatte keskin bir hızla azaldığı belirlendi. Buna bağlı olarak, paklitakselin DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki IC50 değerleri sırasıyla, 0,0043 μg/ml ve 0,0089 μg/ml olarak bulundu. Bu çalışma kapsamında, daha önce analiz edilmiş test bileşiklerine (ekstre, fraksiyon ve unotein B) dair bulgularda ifade edildiği gibi, daha uzun süreli tedavilerin sitotoksik aktiviteye olumlu bir etki sağladığı görülmektedir. 72 saatlik tedavinin ardından paklitakselin; DU 145 hücrelerindeki IC50 değeri 0,0029 μg/ml iken, PC-3 hücrelerindeki IC50 değeri 0,0045 μg/mlʼdir. Bu sebeple, paklitaksel için en düşük IC50 değerleri dolayısıyla en güçlü sitotoksik aktiviteler 72 saatin sonunda elde edildi. Bu sonuçlar göz önüne alındığında, hesaplanan IC50 değerlerinin DU 145 hücrelerinde daha düşük olması nedeniyle bu hücre hattının paklitaksel tedavisine daha duyarlı olduğu söylenebilmektedir. Çizelge 4.8. Paklitakselin SRB testiyle hesaplanan IC50 dozları IC50 Dozları (μg/ml) 24 Saat 48 Saat 72 Saat DU 145 >0,5 0,0043 0,0029 PC-3 >0,5 0,0089 0,0045 XTT hücre canlılık testi bulguları SRB testiyle elde edilen bulgular doğrultusunda, pozitif kontrol olarak çalışılan paklitakselin mevcut sitotoksik aktivitesinin XTT hücre canlılık testi ile doğrulanmasına karar verildi. Bu amaçla, 0,001-0,5 μg/ml konsantrasyon aralığında hazırlanan paklitakselin, DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki etkileri 24, 48 ve 72 saat boyunca aynı ortam koşulları altında araştırıldı. Şekil 4.13ʼde verildiği gibi, negatif kontrol grupları ile kıyaslandığında, DU 145 ve PC-3 hücre canlılıklarındaki doza ve zamana bağımlı azalışların istatistiksel olarak anlamlı düzeyde olduğu saptandı (p<0,05). 24 saatlik tedaviyi takiben, DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki proliferasyonun doz artışıyla orantılı olarak baskılandığı ve güçlü antiproliferatif (sitostatik) etkinin mevcut olduğu 118 bulundu. Tedavi süresinin etkisine dayalı olarak, 48. saatte sitotoksik aktivite adına her iki hücre hattı için de daha iyi veriler elde edildi. DU 145 hücrelerinde, paklitakselin 0,005 μg/ml ve daha yüksek konsantrasyonlarında sitotoksik etkinin söz konusu olduğu ve etkinin doz artışı ile paralel olarak arttığı görüldü. Bununla beraber, 0,01 μg/mlʼlik dozdan itibaren giderek artan dozlarda, sitotoksik etkinin benzer seviyede devam ettiği ve hücresel canlılıkların neredeyse aynı yüzdede seyrettiği belirlendi. PC-3 hücreleri için, 48 saatlik tedavide 24. saate göre daha iyi aktiviteler elde edildi. 0,02-0,5 μg/ml doz aralığında önemli sitotoksik etkiler gözlenmekle birlikte, özellikle yüksek dozlarda, hücre canlılıklarında belirgin bir değişiklik tespit edilemedi. Paklitaksel ile 72 saatlik inkübasyon sonrası, iki hücre hattında da sitoksik etkinin incelendiği konsantrasyon aralığı; 0,005-0,5 μg/mlʼdir. PC-3 hücre canlılıklarının 0,02 μg/mlʼlik doza kadar önemli derecede azaldığı, fakat bu dozdan sonra canlılık değerlerinin tedavi periyodu sonuna dek değişmeden kaldığı görüldü. 119 Şekil 4.13. DU 145 ve PC-3 hücrelerine paklitaksel uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza ve zamana bağlı olarak değişimi. NK, paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * ve ϕ Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre farklı dozlar kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 120 Paklitakselin prostat kanseri hücre hatları karşısındaki mevcut sitotoksik etkisini teyit etmek amacıyla uygulanan XTT hücre canlılık testi sonuçlarının SRB testi verileriyle uyumlu olduğu belirlendi. Çizelge 4.9ʼda gösterildiği üzere, paklitaksele maruz bırakılan DU 145 ve PC-3 hücreleri için 24. saat sonunda IC50 değerleri tespit edilemedi. 48 saatlik tedavi sonrası, çalışılan doz aralığında paklitaksel için önemli sitotoksik etkiler saptanmış olup hesaplanan IC50 değerleri; DU 145 hücrelerinde 0,0047 μg/ml, PC-3 hücrelerinde 0,0198 μg/mlʼdir. Tedavi süresinin ilerlemesiyle orantılı olarak sitotoksisite açısından en iyi verilere 72. saat sonunda ulaşıldı. 72 saat boyunca paklitaksel ile muamele edilen DU 145 ve PC-3 hücreleri için elde edilen IC50 dozları sırasıyla, 0,0041 μg/ml ve 0,0048 μg/mlʼdir. XTT testi sonuçlarından hareketle; 48 saatlik sürede PC-3 hücre hattının, 72 saatlik periyotta ise iki hücre hattının eşit seviyede paklitaksele karşı duyarlılık gösterdiği söylenebilmektedir. Çizelge 4.9. Paklitakselin XTT testiyle hesaplanan IC50 dozları IC50 Dozları (μg/ml) 24 Saat 48 Saat 72 Saat DU 145 >0,5 0,0047 0,0041 PC-3 >0,5 0,0198 0,0048 4.2.5. Kombinasyon analizine ilişkin bulgular E. hirsutum ekstresi (E kodlu) ile paklitaksel kombinasyonunun DU 145 ve PC-3 hücre hatlarındaki sitotoksik potansiyeli, SRB ve XTT hücre canlılık testleri kullanılarak tespit edildi. Kombinasyon çalışmasında, E kodlu bitki ekstresi ve paklitaksel için SRB ve XTT hücre canlılık testleriyle belirlenen IC50 değerlerinin 1:2 oranda dilüe edilmesiyle hazırlanan farklı kombinasyon dozları kullanıldı (bkz. Çizelge 3.8). Analiz için DU 145 ve PC-3 hücreleri ekstre ve paklitaksel dozları ile eş zamanlı tedaviye bırakıldı. 24, 48 ve 72 saat sonra kombine etkiler, ekstrenin ve paklitakselin ayrı olarak gösterdiği sitotoksik aktiviteler ile karşılaştırıldı. 121 SRB hücre canlılık testi bulguları Ekstre - paklitaksel kombinasyon etkilerini değerlendirmek amacıyla ilk olarak SRB hücre canlılık testiyle analiz gerçekleştirildi. DU 145 hücrelerinde, 24 saat sonra, ayrı olarak uygulanan ekstrenin ve paklitakselin hücre canlılıklarında, negatif kontrole kıyasla, doza bağımlı olarak anlamlı azalışlara neden olduğu tespit edildi (p<0,05) (Şekil 4.14). Negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, kombinasyon tedavisinin, hücre canlılıklarında anlamlı fakat daha zayıf azalmalara neden olduğu bulundu (p<0,05). Ancak bu süre boyunca, ekstre ve paklitakselin hem ayrı hem kombine olarak çalışıldığı hücre gruplarında hiçbir sitotoksik aktivite saptanmadı. Şekil 4.14. DU 145 hücrelerine 24 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 122 48 saatlik tedaviyi takiben, ekstrenin ve paklitakselin birbirinden ayrı şekilde DU 145 hücre canlılıklarında, negatif kontrole kıyasla, doza bağlı anlamlı düşüşlere neden olduğu bulundu (p<0,05) (Şekil 4.15). 66+0,002 μg/ml ve 99+0,002 μg/ml kombinasyonlarının hücre canlılıklarında neden olduğu farklılıkların negatif kontrole göre anlamlı olmadığı bulundu (p>0,05). Bu tedavi süresinde, sadece 33+0,001 μg/ml kombinasyonunun uygulandığı DU 145 hücrelerinde canlılık oranının kısmen azaldığı görüldü (p<0,05). Diğer kombinasyon gruplarında ise; ekstrenin ve paklitakselin, DU 145 hücrelerine karşı birlikte gösterdikleri etkinin, tek başına sergiledikleri etkiden daha zayıf olduğu saptandı. 48 saat sonunda, DU 145 hücrelerine karşı sitotoksik aktivitelerin gözlendiği 99 μg/ml ekstre ile 0,004 μg/ml paklitakselin kombine edildiklerinde sitotoksik etkinin kaybolduğu ve canlılık oranın %77,38 olduğu görüldü. Şekil 4.15. DU 145 hücrelerine 48 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 123 72 saatlik sonuçlar incelendiğinde; ekstrenin ve paklitakselin tek başına ve kombine olarak, DU 145 hücre canlılıklarında, negatif kontrole kıyasla, konsantrasyona bağımlı anlamlı azalışlara sebep olduğu saptandı (p<0,05) (Şekil 4.16). Özellikle, ekstrenin 66 ve 99 μg/mlʼlik dozlarında, paklitakselin ise 0,002 ve 0,004 μg/mlʼlik dozlarında dikkate değer sitotoksik etkiler gözlendi. Bunun aksine; kombinasyon gruplarının, ekstrenin veya paklitakselin DU 145 hücrelerinde tek başına neden olduğu sitotoksik etkinliği belirgin şekilde azalttığı tespit edildi. 33+0,002 μg/ml ve 33+0,004 μg/ml kombinasyon gruplarında, ekstrenin paklitakselin etkisini zayıflattığı bulundu. Benzer şekilde; sitotoksik 66 ve 99 μg/mlʼlik ekstre dozları ve sitotoksik etkisi bulunmayan 0,001 μg/mlʼlik paklitaksel dozu ile oluşturulan kombinasyon gruplarında, ilacın, ekstrenin aktivitesini baskıladığı belirlendi. Tek başlarına sitotoksik etki oluşturan diğer ekstre ve paklitaksel dozlarının DU 145 hücrelerine birlikte uygulandığında bu etkinin kaybolduğu gözlendi. Şekil 4.16. DU 145 hücrelerine 72 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 124 PC-3 hücre hattı için SRB hücre canlılık testiyle elde edilen sonuçlar incelendiğinde, DU 145 hücrelerindeki etkilere benzer bulgular tespit edildi. 24 saatlik test sonucuna göre, ekstrenin ve paklitakselin ayrı olarak uygulandığı hücrelerde canlılık oranlarının çok düşük derecelerde değişim gösterdiği belirlenirken (p<0,05), kombinasyon tedavisi sonrasında hücre canlılıklarının (ekstre veya paklitaksel uygulanan hücrelere kıyasla) nispeten arttığı gözlendi (Şekil 4.17). 66+0,001 μg/ml ve 66+0,002 μg/ml kombinasyon tedavileri dışında tüm gruplarda, hücre canlılıklarındaki azalışların negatif kontrole göre anlamlı olduğu bulundu (p<0,05). Fakat, kombinasyon gruplarındaki bu değişimin genel olarak anlamlı olmadığı görüldü (p<0,05). Şekil 4.17. PC-3 hücrelerine 24 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 125 48 saat sonra, negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, sadece ekstre veya sadece paklitaksel ile muamele edilen PC-3 hücrelerinin canlılıklarında doza bağlı anlamlı azalmalar saptanmasına karşın (p<0,05) sitotoksik etki varlığı belirlenemedi (Şekil 4.18). Bu süre zarfında, yalnızca 33+0,002 μg/ml kombinasyonunda hücre canlılığının kısmen düştüğü ve zayıf bir sinerjik etkinin söz konusu olduğu görüldü. Ekstrenin ve paklitakselin birarada kullanıldığı diğer kombinasyon gruplarında ise, bileşiklerin tek başlarına sergiledikleri etkilerinin kaybolduğu ve hücrelerin canlılıklarını korudukları tespit edildi. Şekil 4.18. PC-3 hücrelerine 48 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 126 Ekstre, paklitaksel ve bu bileşiklerin kombinasyonları ile 72 saat boyunca muamele edilen PC-3 hücrelerinin canlılık değerlerindeki etkiler incelendiğinde, daha önceki sonuçlara benzer verilerin elde edildiği görüldü. Ekstrenin, paklitakselin ve bu bileşiklerin kombinasyonlarının, PC-3 hücre canlılıklarında, negatif kontrole kıyasla, anlamlı azalışlara neden olduğu bulundu (p<0,05). Bu tedavi süresi sonunda, ekstre için 99 μg/mlʼlik dozda; paklitaksel için ise 0,004 μg/mlʼlik dozda dikkate değer sitotoksik etkiler gözlendi (p<0,05) (Şekil 4.19). Ekstrenin ve paklitakselin, farklı dozlar ile oluşturulan kombinasyon gruplarında, hücre canlılıklarının yükseldiği ve hücrelerin kombinasyon tedavisine daha dirençli hale geldikleri belirlendi. Şekil 4.19. PC-3 hücrelerine 72 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının SRB testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 127 Kombinasyon tedavisine maruz bırakılan DU 145 ve PC-3 hücrelerinin SRB hücre canlılık testi sonuçlarına göre hesaplanan IC50 değerleri Çizelge 4.10ʼda sunuldu. Sitotoksik (>IC50) ve sitotoksik olmayan (99+0,004 μg/ml). Çizelge 4.10. Kombinasyon tedavisinin SRB testiyle hesaplanan IC50 dozları IC50 Dozları (μg/ml) 24 Saat 48 Saat 72 Saat DU 145 >99+0,004 >99+0,004 >99+0,004 PC-3 >99+0,004 >99+0,004 >99+0,004 XTT hücre canlılık testi bulguları DU 145 ve PC-3 prostat kanseri hücrelerinde, ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının 24, 48 ve 72 saatlik etkileri XTT hücre canlılık yöntemiyle doğrulandı. 24 saatlik tedavi sonrası, ekstrenin ve paklitakselin tek başlarına uygulandığı DU 145 hücrelerinde canlılıkların, negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, doza bağlı olarak azaldığı gözlendi (p<0,05) (Şekil 4.20). 66+0,001 μg/ml, 66+0,004 μg/ml ve 99+0,001 μg/ml kombinasyon grupları ile muamele edilen hücrelerin canlılıklarındaki düşüşler, negatif kontrole göre anlamlı olarak kabul edildi (p<0,05). Bu iki bileşiğin farklı dozlarla oluşturulan kombine etkileri analiz edildiğinde; ekstreye veya paklitaksele göre, hücre canlılıklarında artışa dayalı bir etki saptandı. Bu sebeple, ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının hücre canlılıkları üzerinde sitotoksik açıdan zayıf etkilere yol açtığı açıkça söylenebilmektedir. 128 Şekil 4.20. DU 145 hücrelerine 24 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 48 saat süren tedavi sonrası, hem ekstrenin hem de paklitakselin ayrı olarak, hücre canlılıklarını, negatif kontrole kıyasla, doza bağlı anlamlı bir şekilde azalttığı belirlendi (p<0,05). Şekil 4.21ʼde verildiği gibi, ekstrenin 99 μg/ml konsantrasyonunda, paklitakselin ise 0,004 μg/ml konsantrasyonunda DU 145 hücrelerine karşı sitotoksik aktivitelerin söz konusu olduğu görülmektedir. Ancak DU 145 hücreleri, bu bileşiklerin farklı dozlardaki kombinasyonları ile 48 saat boyunca tedaviye bırakıldıktan sonra, tek başlarına olan etkinliklerinin yok olduğu belirlendi. Bütün kombinasyon gruplarında, hücre canlılık oranlarının %50ʼnin altına düşmediği saptandı. Dolayısıyla, ekstre- paklitaksel kombinasyonlarının, DU 145 hücre hattı üzerinde sitotoksik bakımdan etkisiz kaldığı görüldü. 129 Şekil 4.21. DU 145 hücrelerine 48 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 72 saatlik tedavinin ardından; ekstrenin, DU 145 hücre canlılıklarında negatif kontrole göre, doza bağımlı şekilde anlamlı azalmalar gösterdiği tespit edilirken (p<0,05), sadece en yüksek iki konsantrasyonda (66 ve 99 μg/ml) sitotoksik etki saptandı (Şekil 4.22). Benzer olarak, paklitakselin DU 145 hücre canlılıklarını, negatif kontrole kıyasla, doza bağımlı olarak ve anlamlı şekilde azalttığı ve test edilen dozlar arasında sadece 0,004 μg/mlʼlik en yüksek dozun sitotoksik olduğu incelendi. Kombinasyon tedavisi sonrası, ekstre ve paklitaksel için ayrı olarak elde edilen canlılık değerlerinden daha yüksek canlılık yüzdeleri elde edildi. DU 145 hücrelerine ait canlılık oranları; 99 μg/ml ekstrede %4,28 olarak, 0,004 μg/ml paklitakselde %30,76 olarak hesaplanmasına karşın, bu dozların kombinasyonunda hücre canlılığının %95,91 olarak ölçülmesi, bu çalışma için dikkat çekici bir bulgudur. Bu veriler doğrultusunda; DU 145 hücrelerinin, ekstreye 130 ve paklitaksele karşı kombinasyon durumundaki duyarlılıklarının azaldığı ve tedaviye daha dirençli hale geldikleri söylenebilmektedir. Şekil 4.22. DU 145 hücrelerine 72 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 131 Ekstre, paklitaksel ve bu bileşiklerin kombinasyonu ile 24, 48 ve 72 saatlik tedavi sonrası XTT testiyle elde edilen sonuçlara göre, DU 145 hücrelerinde incelenen etkilerin PC-3 hücreleri için de geçerli olduğu görüldü. Şekil 4.23ʼde özetlendiği gibi, 24 saat sonra, ekstrenin ve paklitakselin ayrı olarak, PC-3 hücre canlılıklarını doza bağlı şekilde azalttığı ancak bu tedavi süresinde sitotoksik anlamda etkinlik gösteremedikleri belirlendi (p<0,05). Ekstrenin ve paklitakselin kombine etkileri analiz edildiğinde; hücre canlılık oranlarının, negatif kontrol canlılığına (%100) yakın hatta bu değerin üzerinde olduğu görüldü. Daha önce elde edilen sonuçlara paralel olarak, bu iki bileşiğin kombine halde PC-3 hücrelerine uygulanmasının potansiyel etkilerde kayıplara yol açtığı söylenebilmektedir. Şekil 4.23. PC-3 hücrelerine 24 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 132 48 saatlik tedaviyi takiben negatif kontrol ile kıyaslandığında, hem ekstrenin hem de paklitakselin PC-3 hücre canlılıklarında doza bağlı olarak anlamlı azalışlara neden olduğu gözlendi (p<0,05) (Şekil 4.24). Ekstrenin ve paklitakselin 48 saat boyunca tek başlarına gösterdikleri etkiler incelendiğinde, sadece ekstrenin 99 μg/mlʼlik konsantrasyonunun sitotoksik aktiviteye sahip olduğu belirlendi. PC-3 hücrelerinde, farklı dozlarla oluşturulan bütün kombinasyon gruplarında, ekstrenin veya paklitakselin aktivitesini azaltıcı yönde etkileşimler belirlendi. 48 saat boyunca, sadece 99 μg/ml ekstre ile tedaviye bırakılan hücrelerde gözlemlenen sitotoksik aktivitenin, toksik olmayan paklitaksel dozlarıyla kombinasyonun da baskılanması, bu çalışmada elde edilen şaşırtıcı bir sonuçtur. Şekil 4.24. PC-3 hücrelerine 48 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 133 XTT hücre canlılık testiyle analiz edilen 72 saatlik sonuçlar, benzer olarak önceki bulguları işaret etmektedir. Ekstre veya paklitaksel tedavisine bağlı olarak, konsantrasyon arttıkça PC-3 hücre canlılıklarının anlamlı ölçüde azaldığı bulundu (p<0,05) (Şekil 4.25). Ekstre için 66 ve 99 μg/mlʼlik dozlarda sitotoksik etki gözlenirken, paklitaksel için yalnızca en yüksek doz olan 0,004 μg/mlʼlik dozda sitotoksik etki elde edildi. Bu verilerin aksine; ekstrenin ve paklitakselin kombine edildikleri zaman PC-3 hücrelerine karşı tek başlarına olan etkilerinden farklı etkiler sergiledikleri ve hücrelerin kombinasyon tedavisine direnç kazandıkları tespit edildi. Özellikle, tek başlarına sitotoksik etki gösteren ekstre ve ilaç dozlarının kombinasyonları (66+0,004 μg/ml ve 99+0,004 μg/ml) için elde edilen bulgular daha ilgi çekicidir. Bu dozlarda kurulan kombinasyonların, PC-3 hücrelerinin canlılık oranlarını azaltma yerine arttırmaya yönelik bir etki göstermesi önemli bir bulgudur. Şekil 4.25. PC-3 hücrelerine 72 saat boyunca ekstre ve paklitaksel kombinasyonlarının uygulanması sonrasında hücre canlılığının XTT testiyle elde edilen doza bağlı olarak değişimi. NK, ekstre ve paklitaksel uygulanmayan (0 μg/ml) negatif kontrol grubunu ifade etmektedir. Her bir veri noktası 3 bağımsız kuyucuğun ortalamasını temsil etmektedir. * Aynı zaman dilimi içinde negatif kontrole göre; o ekstreye göre; # paklitaksele göre kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlılığı (p<0,05) ifade etmektedir. 134 Kombinasyon tedavisine maruz bırakılan DU 145 ve PC-3 hücrelerinin XTT hücre canlılık testi sonuçlarına göre hesaplanan IC50 değerleri Çizelge 4.11ʼde sunuldu. Sitotoksik (>IC50) ve sitotoksik olmayan (99+0,004 μg/ml). Çizelge 4.11. Kombinasyon tedavisinin XTT testiyle hesaplanan IC50 dozları IC50 Dozları (μg/ml) 24 Saat 48 Saat 72 Saat DU 145 >99+0,004 >99+0,004 >99+0,004 PC-3 >99+0,004 >99+0,004 >99+0,004 Özetlemek gerekirse; tez çalışmasının bu aşamasında, en güçlü sitotoksik aktiviteyi sergileyen E kodlu ekstrenin, prostat kanseri tedavisinde kullanılan kematerapötik bir ilaç olan paklitaksel ile kombinasyonunun, DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki olası sinerjik etkisi araştırıldı. Kombinasyon analizi, DU 145 ve PC-3 hücrelerinin canlılık oranlarındaki değişimler temel alınarak yürütüldü. Bu amaçla; 24, 48 ve 72 saatlik tedavi süreleri sonunda SRB hücre canlılık testiyle belirlenen sonuçlar, XTT hücre canlılık testiyle doğrulandı. Bu testlerden elde edilen verilerin birbiriyle uyumlu olduğu görüldü. Ancak, ulaşılmak istenen sonuçtan farklı olarak, kombinasyon gruplarının tümünde her iki hücre hattı için de sinerjik etki belirlenemedi. Buna karşılık; kombine edilen ekstre ve paklitaksel arasında, ‘antagonistik etki’ olarak adlandırılabilecek etkileşim sonucu sözü edilen bileşiklerin aktivitelerinde azalma tespit edildi. Bu etkinin bir sonucu olarak, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde kombinasyon tedavisi için IC50 değerleri hesaplanamadı. 135 4.2.6. Hücre morfolojilerindeki değişikliklere ilişkin bulgular Ham ekstrelerin, kaba fraksiyonların, unotein Bʼnin, paklitakselin ve kombinasyon gruplarının 24, 48 ve 72 saat süreyle DU 145 ve PC-3 hücrelerinde neden olduğu morfolojik değişiklikler, inverted mikroskop altında (x10ʼluk büyütmede) analiz edildi. Hücrelerin adezyon ve konfluensi durumlarındaki değişiklikler, şekillerindeki ve boyutlarındaki farklılıklar, negatif kontrol hücreleri ve %0,1 konsantrasyonda DMSO uygulanmış hücreler ile karşılaştırıldı. Ham ekstrelerin DU 145 ve PC-3 hücre hatları üzerine etkileri Ham ekstreler (A, B, C, D, E, F, G, H ve K kodlu) ile 24 saatlik tedaviden sonra, özellikle 100 ve 200 μg/ml konsantrasyonlarda, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde önemli değişiklikler analiz edildi (Şekil 4.26). Ekstrelerin daha düşük konsantrasyonlarında, sitotoksisiteyi işaret eden önemli morfolojik değişimler incelenmedi. DU 145 ve PC-3 hücrelerinde E kodlu ekstrenin, taranan tüm ekstreler arasında en güçlü sitotoksik aktiviteyi sergileyen ekstre olduğu mikroskobik analizle de doğrulandı. E kodlu ekstre ile 24 saatlik tedaviden sonra, negatif kontrol hücreleri ve DMSO (%0,1) uygulanmış hücrelere kıyasla, proliferasyonun büyük ölçüde azaldığı ve ölü hücre sayılarının arttığı görüldü. E kodlu ekstrenin 100 μg/mlʼlik dozunda, hücre adezyonlarının zayıfladığı ve hücrelerin epitelyal morfolojilerini kaybetmeye başladıkları görüldü. E kodlu ekstrenin 200 μg/mlʼlik dozunda ise, hücre boyutlarının küçüldüğü ve hücrelerin yuvarlak şekil aldıkları görüldü. Diğer ekstrelerin, özellikle 200 μg/mlʼlik dozlarında, hücre morfolojilerinin kısmen değiştiği gözlemlendi. Negatif kontrol ve DMSO (%0,1) ile muamele edilmiş hücrelerin ise, şekil ve büyüklük bakımından normal oldukları ve canlılıklarını korudukları incelendi. 136 Şekil 4.26. Ham ekstrelerin farklı konsantrasyonları (100 ve 200 μg/ml) ile 24 saatlik tedaviden sonra DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10) 137 48 saatlik tedaviden sonra, E kodlu ekstrenin, DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerinde önemli ölçüde sitotoksik olduğu mikroskobik olarak değerlendirildi (Şekil 4.27). E kodlu ekstrenin hem 200 μg/mlʼlik hem de 100 μg/mlʼlik dozunda, DU 145 ve PC-3 hücre yoğunluklarının, negatif kontrole ve DMSO (%0,1) ile muamele edilmiş hücrelere göre oldukça azaldığı gözlendi. Hücrelerin adezyon yeteneklerini kaybetmelerine bağlı olarak yuvarlaklaştıkları ve küçüldükleri incelendi. DU 145 ve PC-3 hücre yapılarındaki bu değişiklikler, E kodlu ekstrenin 200 μg/mlʼlik dozunda daha belirgindir. D, G, H ve K kodlu ekstreler, 100 ve 200 μg/mlʼlik konsantrasyonlarda DU 145 ve PC-3 hücre morfolojilerinde dikkate değer değişimler gösterdi. Negatif kontrol ve DMSO (%0,1) kontrolü ile karşılaştırıldığında; hücre sayılarının azaldığı, epitelyal morfolojilerin kaybolmaya başladığı ve bu ekstrelerin, özellikle 200 μg/mlʼlik dozlarında, hücrelerin küçük ve yuvarlak yapıda oldukları incelendi. A, B, C ve F kodlu ekstrelerin, DU 145 ve PC-3 hücre proliferasyonlarını baskıladığı gözlense de, hücre ölümlerinin diğer ekstrelerin uygulandığı hücrelere nazaran daha az olduğu belirlendi. Negatif kontrol ve DMSO (%0,1) uygulanmış hücrelerin ise, şekil ve büyüklük bakımından düzenli oldukları ve canlılıklarını kaybetmeden çoğalmaya devam ettikleri görüldü. 138 Şekil 4.27. Ham ekstrelerin farklı konsantrasyonları (100 ve 200 μg/ml) ile 48 saatlik tedaviden sonra DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10) 139 Daha uzun süreli tedavinin sonucu olarak; 72 saat sonra, ham ekstrelerin DU 145 ve PC-3 hücrelerinde gözle görülür farklılıklaşmalara neden olduğu tespit edildi (Şekil 4.28). Hücre fotoğraflarından da anlaşıldığı üzere; E kodlu ekstre, tedavi süresince en güçlü sitotoksik aktiviteyi sergileyen ekstre oldu. Bu ekstrenin 100 ve 200 μg/mlʼlik konsantrasyonlarında, tüm hücrelerin canlılıklarını kaybettiği ve kültür yüzeyinden ayrıldıkları, bundan dolayı küçük, yuvarlak yapılı hücrelerin besiyeri içinde yüzdüğü gözlendi. Bu etkinin, iki hücre hattında da geçerli olduğu görüldü. DU 145 ve PC-3 hücrelerinde, E kodlu ekstreden sonra güçlü sitotoksik etkinlik gösteren ekstrelerin D, G, H ve K kodlu ekstreler olduğunu hücresel yapılarda gözlenen değişimler kanıtlar niteliktedir. A, B, C ve F kodlu ekstreler ile muamele edilen DU 145 ve PC-3 hücreleri mikroskobik olarak analiz edildiğinde; hücre yoğunluğunun negatif kontrole veya DMSO (%0,1) kontrolüne göre azaldığı, hücrelerin epitelyal morfolojilerinin bozulmaya başladığı ve kimi hücrelerin küçük, yuvarlak yapı kazandıkları göründü. Sözü edilen ekstreler arasında en iyi etkiyi C kodlu ekstrenin gösterdiği belirlendi. Tüm ham ekstrelerin diğer dozlarında (<100 μg/ml), DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojileri için bariz sitotoksisite belirtileri gözlenmedi. Negatif kontrol hücrelerinin ve DMSO (%0,1) uygulanmış hücrelerin ise 72 saat boyunca normal şekillerini ve boyutlarını korudukları incelendi. Bu bulgu, DU 145 ve PC-3 hücrelerinin nispeten uzun bir süre gibi görünen 72 saat sonunda dahi canlılıklarını koruduklarını ve yüksek oranda çoğalmaya devam ettiklerini gözler önüne sermektedir. 140 Şekil 4.28. Ham ekstrelerin farklı konsantrasyonları (100 ve 200 μg/ml) ile 72 saatlik tedaviden sonra DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10) 141 Kaba fraksiyonların DU 145 ve PC-3 hücre hatları üzerine etkileri Kaba fraksiyonlar (E1, E2, E3 ve E4 kodlu) ile 24, 48 ve 72 saat boyunca inkübe edilen DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojik değişikliklerini analiz etmek üzere, inverted mikroskop (x10ʼluk büyütmede) kullanılarak temsili fotoğraflar çekildi. Hücrelerdeki değişimler, negatif kontrol hücreleri ve %0,1 konsantrasyonda DMSO uygulanmış hücreler ile kıyaslandı. 100 μg/ml konsantrasyondaki E2 kodlu fraksiyon ile 24 saatlik tedaviden sonra, DU 145 hücrelerinin konfluensi düzeyinin büyük oranda azaldığı ve hücrelerin adezyon yeteneklerini kaybederek yuvarlaklaşmaya başladıkları görüldü. Diğer fraksiyonların (E1, E3 ve E4) uygulandığı DU 145 hücrelerinde belirgin morfolojik değişimler saptanmadı. PC-3 hücreleri için çekilen fotoğraflar analiz edildiğinde, benzer etkilerin söz konusu olduğu belirlendi. 24 saatlik tedaviyi takiben, E2 kodlu fraksiyonun (100 μg/ml), PC-3 hücre yoğunluğunu ciddi bir şekilde düşürdüğü incelendi. Kalan fraksiyonların (E1, E3 ve E4), PC-3 hücrelerine karşı 24 saatte etkili olmadığı gözlendi (Şekil 4.29). 142 Şekil 4.29. Kaba fraksiyonlar (100 μg/ml) ile 24 saatlik tedaviden sonra DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10) 48 saatlik tedaviyi takiben, E2 kodlu fraksiyonun 100 μg/mlʼlik konsantrasyonunda, DU 145 hücrelerinin yoğunluklarının düştüğü ve bazı hücrelerin, adezyonlarının azalması sonucu küçük ve yuvarlak morfoloji kazandıkları görüldü. E4 kodlu fraksiyon (100 μg/ml) ile muamele edilen DU 145 hücrelerinin bir kısmının 24. saate göre daha yuvarlak ve küçük yapıda olduğu tespit edildi. DU 145 hücrelerinde, sitotoksik etkiyi gösteren bu tür morfolojik değişikliklerin E1 ve E3 kodlu fraksiyonların varlığında daha zayıf olduğu gözlemlendi. 48 saatlik tedavi sonrası, E2 kodlu fraksiyonun 100 μg/mlʼlik dozda, PC-3 hücre sayısını kayda değer oranda düşürdüğü analiz edildi. Hücrelerin 143 nerdeyse tamamının epitelyal morfolojilerinin bozularak küçük ve yuvarlak yapı kazandıkları incelendi. PC-3 hücrelerinde, E2 kodlu fraksiyona en yakın etkiyi E3 kodlu fraksiyonun sergilediği görüldü. E3 kodlu fraksiyon (100 μg/ml) varlığında, hücre adezyonlarının zayıfladığı ve kimi hücrelerin yuvarlaklaşmaya başladıkları görüldü. E4 kodlu fraksiyonun (100 μg/ml) ise, konfluensi derecesinde dikkate değer azalmaya neden olduğu bulundu. Bahsedilen morfolojik etkiler, E1 kodlu fraksiyon için 48. saatte gözlenmedi (Şekil 4.30). Şekil 4.30. Kaba fraksiyonlar (100 μg/ml) ile 48 saatlik tedaviden sonra DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10) 144 72 saatlik tedavi sonrası; E2 kodlu fraksiyonun (100 μg/ml), DU 145 hücre yoğunluğunda zamana bağlı olarak belirgin azalışlara yol açtığı gözlendi. Hücrelerin çoğunluğunun yuvarlak şekilli ve küçük boyutlu morfolojide olması sitotoksik aktiviteyi doğrulamaktadır. E3 ve E4 kodlu fraksiyon (100 μg/ml) ile 72 saatlik tedaviden sonra, 48. saate oranla daha fazla yuvarlak morfolojide hücrelerin incelenmesi nedeniyle güçlü sitotoksik etki söz konusudur. E1 kodlu fraksiyon (100 μg/ml) uygulanan DU 145 hücrelerinde sitotoksisiteyi işaret eden morfolojik özellikler tespit edilmedi ve hücre durumlarının negatif kontrol hücrelerine ve DMSO (%0,1) kontrol hücrelerine benzer olduğu görüldü. 72 saat sonra, E2 kodlu fraksiyonun (100 μg/ml) PC-3 hücreleri üzerinde daha belirgin morfolojik farklılıklara neden olduğu incelendi. Hücre yoğunluğundaki ciddi azalışlara ilave olarak hücrelerin küçük ve yuvarlak yapıda olmaları güçlü sitotoksik aktiviteyi kanıtlar niteliktedir. E3 ve E4 kodlu fraksiyonların 100 μg/mlʼlik dozlarında, 48. saate kıyasla daha belirgin morfolojik değişikliklerin gözlenmekle birlikte, E3 kodlu fraksiyonun uygulandığı grupta daha fazla yuvarlak, küçük yapılı hücre bulunması daha iyi sitotoksik etkinin var olduğunu göstermektedir. E1 kodlu fraksiyon (100 μg/ml) ile 72 saat boyunca tedavi edilen PC-3 hücrelerinin morfolojik olarak, negatif kontrol hücrelerinden ve DMSO (%0,1) kontrol hücrelerinden farklılık göstermediği incelendi. Tüm kaba fraksiyonların diğer dozlarında (<100 μg/ml), DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojileri için bariz sitotoksisite belirtileri gözlenmedi. Negatif kontrol hücrelerinin ve DMSO (%0,1) uygulanmış hücrelerin ise 72 saat boyunca normal şekillerini ve boyutlarını korudukları incelendi (Şekil 4.31). 145 Şekil 4.31. Kaba fraksiyonlar (100 μg/ml) ile 72 saatlik tedaviden sonra DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10) Unotein Bʼnin DU 145 ve PC-3 hücre hatları üzerine etkileri Çalışma kapsamında kullanılan unotein Bʼnin, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde neden olduğu morfoloijk değişiklikler inverted mikroskop (x10ʼluk büyütmede) altında analiz edildi. Unotein Bʼnin 80 μg/ml konsantrasyonda, DU 145 ve PC-3 hücre sayılarının, negatif kontrol ve DMSO (%0,1) kontrol hücrelerine kıyasla, önemli ölçüde azaldığı incelendi. Hücre adezyonlarının zayıflaması ve hücrelerin yuvarlak morfoloji kazanması ile karakterize olan hücresel ölümlerinin zamana bağlı olarak arttığı görüldü. 146 Unotein Bʼnin 160 μg/ml konsantrasyonunda daha güçlü sitotoksik etkilere neden olduğu, DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojilerinde incelenen belirgin değişikliklerden anlaşılmaktadır. Unotein B ile 24 saatlik tedavi sonrası, hem DU 145 hem de PC-3 hücrelerinin kültürlerdeki yoğunluklarının oldukça azaldığı gözlemlendi. Bu sürede, hücrelerin epitelyal özelliklerini kaybetmeye başladıkları ve bazı hücrelerin küçük, yuvarlak morfolojiye sahip oldukları belirlendi. 72. saatte daha güçlü etkiler gözlenmekle birlikte; 48 ve 72 saatlik tedavileri takiben, DU 145 ve PC-3 hücrelerinin adherent (yapışma) yeteneklerini kaybetmesinin bir sonucu olarak neredeyse tüm hücrelerin yuvarlaklaştığı görüldü. Hücre fotoğraflarından da görüldüğü üzere, 24-72 saatlik tedavi aralığında; PC-3 hücreleri, unotein B maddesine DU 145 hücrelerinden daha duyarlıdır. Unotein Bʼnin daha düşük dozlarında, iki hücre hattı için sitotoksisiteye dair belirgin morfolojik değişiklikler gözlenmedi. Negatif kontrol hücrelerinin ve DMSO (%0,1) ile tedaviye bırakılmış hücrelerin ise, inkübasyon periyodu boyunca canlılıklarını yitirmeden proliferasyonlarına devam ettikleri görüldü (Şekil 4.32). 147 Şekil 4.32. Unotein Bʼnin farklı konsantrasyonları (80 ve 160 μg/ml) ile 24, 48 ve 72 saatlik tedavilerden sonra DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10) 148 Paklitakselʼin DU 145 ve PC-3 hücre hatları üzerine etkileri Çalışma kapsamında pozitif kontrol olarak kullanılan paklitakselin, DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojileri üzerindeki etkileri, inverted mikroskop (x10ʼluk büyütmede) kullanılarak değerlendirildi. Hücrelere ait mikroskobik görüntüler Şekil 4.33ʼde verildi. Paklitaksel ile 24 saatlik inkübasyon sonrası, konsantrasyon 0,005 μg/mlʼye ulaştığında, hücre hatlarının canlılıklarını büyük oranda kaybettiği küçük ve yuvarlak yapılı hücrelerin varlığından açıkça anlaşılmaktadır. Bu konsantrasyondaki morfolojik değişimler, DU 145 hücrelerinde daha belirgindir. 0,01 μg/mlʼlik konsantrasyonda, her iki hücre hattına karşı sitotoksisiteyi işaret eden belirtiler daha kayda değerdir. 48 saat sonra, DU 145 hücre hattında doza bağlı hücre ölümlerinin artış gösterdiği incelendi. Bu süre zarfında, PC-3 hücrelerinde DU 145 hücrelerine kıyasla daha zayıf etkiler tespit edildi. 0,005 μg/mlʼlik paklitaksel dozunda hücrelerin epitelyal karakterlerini kaybetmeye başladıkları; 0,01 μg/mlʼlik paklitaksel dozunda ise hücre yoğunluğunun nispeten daha az olduğu ve hücrelerin yaklaşık yarısının kültür yüzeyinden ayrılması sonucu yuvarlak yapı aldığı görüldü. Paklitakselin farklı dozları ile 72 saatlik tedavi sonrası, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde tespit edilen en iyi sitotoksik aktiviteler mikroskobik olarak da doğrulandı. İki paklitaksel dozunda da, adhezyon yeteneklerinin yok olmasından dolayı kültürdeki tüm DU 145 hücrelerinin besiyeri içinde yüzdüğü belirlendi. PC-3 hücrelerinde sitotoksik etkiyi gösteren morfolojik değişiklikler; 0,005 μg/mlʼlik dozda zayıf iken, 0,01 μg/mlʼlik dozda daha belirgindir. Paklitakselin artan dozlara rağmen, hem DU 145 hem de PC-3 hücrelerinin morfolojilerinde dikkate değer değişikliklere neden olmadığı mikroskobik olarak da teyit edildi. Ayrıca, paklitakselin, PC-3 hücrelerine kıyasla, DU 145 hücrelerinde daha iyi etkinlik gösterdiği analiz edildi. Negatif kontrol hücrelerinin ve DMSO (%0,1) ile tedaviye bırakılmış hücrelerin ise, inkübasyon periyodu boyunca canlılıklarını koruyarak çoğalmalarını sürdürdükleri görüldü (Şekil 4.33). 149 Şekil 4.33. Paklitakselin farklı konsantrasyonları (0,005 ve 0,01 μg/ml) ile 24, 48 ve 72 saatlik tedavilerden sonra DU 145 ve PC-3 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10) 150 Kombinasyon tedavisinin DU 145 ve PC-3 hücre hatları üzerine etkileri Ham ekstreler arasında sitotoksik olarak en güçlü aktiviteyi sergileyen E kodlu ekstre ile paklitakselin DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki kombine etkileri inverted mikroskop (x10ʼluk büyütmede) kullanılarak analiz edildi. Bu bölümde yalnızca, E kodlu ekstre ve paklitaksel için her iki hücre hattında da en iyi sitotoksik etkilerin gözlendiği 99 μg/ml (ekstre) ve 0,004 μg/ml (paklitaksel) konsantrasyonların kombinasyon etkileri verildi. E kodlu ekstrenin, paklitakselin ve bu iki bileşiğin kombinasyonlarının 24, 48 ve 72 saatlik mikroskobik sonuçları incelendiğinde; bileşiklerin DU 145 hücrelerinde tek başlarına neden olduğu morfolojik değişikliklerin zamanla arttığı, ancak kombinasyon gruplarında hücre ölümüne bağlı bu değişimlerin ortadan kalktığı incelendi. Özellikle, ekstrenin ve ilacın en etkin olduğu 72. saatte DU 145 hücrelerinin konfluensi durumlarının önemli oranda azaldığı ve besiyeri içinde yüzen yuvarlak yapılı ölü hücrelerin var olduğu görüldü. Buna karşılık, kombinasyon grubundaki hücrelerinin tamamen farklı morfolojide oldukları ve epitelyal karakterlerini korudukları gözlendi. Bu tespitlerin, diğer kombinasyon gruplarında da söz konusu olduğu belirtilebilir. Negatif kontrol hücrelerinin ve DMSO (%0,1)ʼe maruz bırakılmış hücrelerin ise 24, 48 ve 72 saat boyunca sağlıklı oldukları ve proliferasyonlarına devam ettikleri görüldü (Şekil 4.34). 151 Şekil 4.34. Ekstre ve paklitaksel kombinasyonu ile 24, 48 ve 72 saatlik tedavilerden sonra DU 145 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10). E, ekstreyi; PAK, paklitakseli ifade etmektedir. 152 Kombinasyon tedavisi sonrası, DU 145 hücrelerinde elde edilen mikroskobik bulgular, PC-3 hücrelerinde de geçerlidir. E kodlu ekstrenin, paklitakselin ve bu iki bileşiğin kombinasyonlarının 24, 48 ve 72 saatlik mikroskobik sonuçları ele alındığında; bileşiklerin, ayrı olarak PC-3 hücre canlılıklarında zamana bağlı önemli azalışlara neden olduğu görüldü. Bu etkinin sonucu olarak, hücre morfolojilerinde belirgin değişiklikler incelendi. Bunun aksine; kombinasyon gruplarındaki hücrelerin morfoloji bakımından negatif kontrol ve DMSO (%0,1) kontrol gruplarından farklılık göstermediği mikroskobik olarak analiz edildi. Ekstrenin ve ilacın en aktif olduğu 72 saatlik tedavi sonrası, PC-3 hücre yoğunluklarının önemli oranda azaldığı ve besiyeri içinde yüzen yuvarlak yapılı ölü hücrelerin bulunduğu görüldü. Buna karşılık, kombinasyon grubundaki hücrelerinin epitelyal karakterlerini koruyarak tüm kültür yüzeyini kapladıkları gözlendi. Bu tespitlerin, diğer kombinasyon gruplarında da söz konusu olduğu ifade edilebilir. Negatif kontrol hücrelerinin ve DMSO (%0,1)ʼe maruz bırakılmış hücrelerin ise 24, 48 ve 72 saat boyunca canlılıklarını korudukları görüldü (Şekil 4.35). 153 Şekil 4.35. Ekstre ve paklitaksel kombinasyonu ile 24, 48 ve 72 saatlik tedavilerden sonra PC-3 hücrelerinin morfolojik görüntüleri (x10). E, ekstreyi; PAK, paklitakseli ifade etmektedir. 154 Özetle; ham ekstrelerin, kaba fraksiyonların, unotein Bʼnin, paklitakselin ve kombinasyon gruplarının (E kodlu ekstre+paklitaksel) hücre morfolojileri ve canlılıkları üzerindeki etkileri, 24, 48 ve 72 saat sonunda inverted mikroskop kullanılarak değerlendirildi. Elde edilen sonuçların doğruluğunu teyit etmek için hücre canlılık testleriyle eş zamanlı olarak mikroskop fotoğrafları alındı. Sonuç olarak; DU 145 ve PC-3 hücrelerinin mikroskobik analizleri, SRB ve XTT hücre canlılık testlerinden elde edilen bulguları desteklediği görülmektedir. 4.2.7. Kaspazla kırılmış sitokeratin 18 (M30) düzeylerine ilişkin bulgular Test bileşiklerinin DU 145 ve PC-3 hücrelerine karşı sitotoksik aktivite gösterdikleri tespit edildikten sonra, hücrelerdeki apoptoz miktarını belirlemek amacıyla kaspazla kırılmış CK 18 fragmentlerinin (M30) seviyeleri ölçüldü. Ekstre (E), fraksiyon (E2), unotein B, paklitaksel ve kombinasyon (E+paklitaksel) için belirlenen IC50 dozları ile 24, 48 ve 72 saatlik tedavilerden sonra elde edilen M30 ELISA testi sonuçları Şekil 4.36ʼda verildi. 24 saatlik tedavi sonucu, uygulanan tüm test bileşikleri için DU 145 ve PC-3 hücrelerinin M30 antijen düzeylerinde anlamlı bir değişim saptanmadı. 48 saat sonunda; DU 145 hücrelerinde fraksiyon dışındaki tüm test bileşiklerinin, PC-3 hücrelerinde ise tüm test gruplarının, negatif kontrole kıyasla, M30 antijen seviyelerinde artışlara neden olduğu, ancak bu artışların bariz bir artış şeklinde olmadığı belirlendi. 72 saatlik tedavi sonrası, unotein B haricinde test edilen tüm bileşenlerin, her iki hücre hattının M30 antijen düzeylerinde de önemli artışlara sebep olduğu görüldü. Özellikle, E kodlu ekstrenin, M30 antijen miktarları üzerindeki etkileri dikkat çekicidir. DU 145 hücrelerinde, ekstrenin M30 antijen konsantrasyonlarını negatif kontrole göre yaklaşık 3 kat arttırdığı gözlenirken, PC-3 hücrelerindeki değişimin yaklaşık 5 kat olduğu belirlendi. 72 saatlik kombinasyon uygulamasının ardından, DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki M30 antijen seviyelerinin, ekstre ve/veya paklitaksele göre düşük olduğunun belirlenmesi, önceki bulguların doğruluğunu güçlendirmektedir. Sonuç olarak; test bileşikleriyle tedavi sonrası, negatif kontrole göre M30 antijen düzeyleri önemli değişimler gösteren DU 145 ve PC-3 hücrelerinde, kaspazların aktivasyonuna bağlı apoptotik sürecin etkin olduğu söylenebilir. 155 Şekil 4.36. 24, 48 ve 72 saat boyunca ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (E+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B uygulanan DU 145 ve PC-3 hücrelerinin kaspazla kırılmış sitokeratin 18 (M30) düzeyleri 156 4.2.8. Floresan mikroskobunda ikili boyama yöntemine ilişkin bulgular Hücre canlılık testi (SRB ve XTT) sonuçlarından hareketle; hücre ölüm modunu değerlendirmek için floresan mikroskobu kullanılarak ikili boyama yöntemi (Hoechst 33342 ve propidyum iyodür) yürütüldü. Ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (E+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B için tespit edilen IC50 dozları ile 48 saat boyunca tedavi edilen DU 145 ve PC-3 hücrelerinin nükleus morfolojileri ve membran bütünlükleri, negatif kontrol grupları ile karşılaştırıldı. Şekil 4.37ʼde gösterildiği gibi, DU 145 negatif kontrol hücrelerinin normal ve yuvarlak nükleus morfolojisine sahip olduğu belirlendi. Ekstre, paklitaksel, kombinasyon, fraksiyon ve unotein B ile tedavi edilen DU 145 hücrelerinde ise, piknotik nükleus ve/veya nükleer kondenzasyon-fragmentasyon gibi apoptoza özgü morfolojik özellikler gözlendi. Özellikle ekstre, fraksiyon ve unotein Bʼye maruz bırakılan DU 145 hücrelerinde, Hoechst 33342 boyaması sonrası bazı hücre nükleuslarının kırmızımsı renkte oldukları görüldü. Nükleusları kırmızı renkte gözlenen hücreler, membran bütünlüklerini kaybeden hücreler olup propidyum iyodür boyasının hücre içine girmesi sonucu hücre nükleuslarının kırmızı renkte boyandığı incelendi. Bu sebeple, geç apoptotik/sekonder nekrotik hücre ölüm modunun etkin olduğu anlaşılmaktadır. Paklitaksel ile muamele edilmiş DU 145 hücrelerinin, apoptozun karakteristik özelliklerini (piknotik nükleus ve/veya nükleer kondenzasyon-fragmentasyon gibi) gösterdiği belirlendi. Ayrıca, bu hücrelerin propidyum iyodür için büyük oranda pozitif olduğu saptandı. Bundan dolayı, paklitakselin DU 145 hücrelerinde geç apoptotik/sekonder nekrotik hücre ölümüne neden olduğu tespit edildi. Ekstre ve paklitakselin kombine edilerek uygulandığı DU 145 hücrelerinde, piknotik nükleus ve/veya nükleer kondenzasyon-fragmentasyon ile nitelendirilen erken apoptotik hücrelere rastlanıldı. Ekstre ve paklitakselin tek başlarına sergiledikleri etki ile karşılaştırıldığında; kombinasyon grubunda, daha az hücrenin propidyum iyodür ile boyandığı görüldü. Bu sonuca göre, kombinasyon grubundaki hücrelerin ağırlıklı olarak erken apoptoza gittiği söylenebilmektedir. Özetle; tüm test bileşikleri ile tedavi sonrası DU 145 hücrelerinde gözlenen hücre ölüm şeklinin, genel olarak geç apoptotik/sekonder nekrotik olduğu belirtilebilmektedir. Bununla birlikte; apoptotik morfolojiye sahip olan, ancak propidyum iyodür ile boyanmayan erken apoptoz 157 döneminde hücrelerin varlığı da söz konusudur. Bu verilere ek olarak; ekstre, paklitaksel, fraksiyon ve unotein B uygulanan DU 145 hücrelerinde hücre yoğunluğunun, negatif kontrole kıyasla, yüksek oranda azaldığı; fakat, kombinasyon grubundaki hücre yoğunluklarında kayda değer azalış olmadığı görüldü (Şekil 4.37). Bu sonuçlar, hücre canlılık testlerinden elde edilen sonuçlar ile tutarlılık göstermektedir. 158 Şekil 4.37. Ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (E+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B uygulanan DU 145 hücrelerinin floresan mikroskobundaki ikili boyama görüntüleri. Negatif kontrol, test bileşikleri uygulanmayan (0 μg/ml) DU 145 hücrelerini ifade etmektedir. → Piknotik nükleus ve/veya nükleer fragmentasyon varlığını göstermektedir. 159 PC-3 hücrelerinin floresan mikroskop görüntüleri incelendiğinde; negatif kontrol hücrelerinin, normal ve yuvarlak nükleus morfolojisi sergilediği belirlendi. Ekstre uygulaması sonrası, PC-3 hücrelerinde piknotik nükleus ve/veya nükleer kondenzasyon- fragmentasyon gibi apoptoz ile ilişkili morfolojik değişimler saptandı. Bununla beraber, bazı hücrelerin membran bütünlüklerini kaybetmeleri nedeniyle nükleuslarının propidyum iyodür boyası ise boyandıkları gözlendi. Bu bağlamda; hücrelerin bir kısmı geç apoptotik/sekonder nekrotik olarak, bir kısmı ise erken apoptotik olarak (propidyum iyodür negatif olduğu için) değerlendirildi. Benzer durum, paklitaksel tedavisi sonrasında da gözlendi. Ekstre ve paklitaksel kombinasyonuna maruz bırakılan PC-3 hücrelerinin büyük bir kısmında, piknotik nükleus ve/veya nükleer kondenzasyon- fragmentasyon gözlendi. Ancak, propidyum iyodür için hücrelerin zayıf sinyal gösterdiği incelendi. Bu sebeple, kombinasyon tedavisiyle muamele edilen hücrelerde aktif olan hücre modunun erken apoptoz olduğu söylenebilmektedir. Fraksiyon ve unotein B ile tedavi sonrası, PC-3 hücrelerinde apoptoz göstergesi olarak piknotik nükleus ve/veya nükleer kondenzasyon-fragmentasyon varlığı gözlemlendi. Ayrıca, bu nükleus morfolojisine sahip hücrelerin büyük bir çoğunluğunun propidyum iyodür için pozitif olduğu saptandı. Bu kapsamda, hem fraksiyonun hem de unotein Bʼnin PC-3 hücrelerinde geç apoptoz/sekonder nekroza neden olduğu açıkça belirtilebilmektedir. Bu bulguların yanı sıra; test bileşikleriyle tedavi sonrası PC-3 hücre yoğunluklarının, negatif kontrole göre, önemli ölçüde azalış gösterdikleri belirlendi. Kombinasyon grubundaki hücre yoğunluklarının azalışı nispeten daha az olduğu görüldü (Şekil 4.38). Ulaşılan sonuçlar, hücre canlılık testlerinden elde edilen bulgular ile tutarlı bir eğilim sergilemektedir. Floresan mikroskobunda ikili boyama yöntemiyle yapılan analiz sonucu, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde etkin olan hücre modunun, genel olarak geç dönem apoptoz/sekonder nekroz olduğu söylenebilmektedir. Ancak, her iki hücre hattına ait mikroskop görüntülerinde erken dönem apoptotik hücrelerin varlığı da söz konusudur. Bu durum, hücrelerin test bileşiklerine karşı duyarlılık derecelerinin farklı olduğunu göstermektedir. Ekstre veya paklitaksel ile ayrı olarak kıyaslandığında, kombinasyon gruplarındaki propidyum iyodür için pozitif olan hücre sayısının daha az olması, hücrelerin kombinasyona direnç kazanmalarına ve tedaviye daha geç yanıt oluşturmalarına yol açmış olabilir. 160 Şekil 4.38. Ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (E+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B uygulanan PC-3 hücrelerinin floresan mikroskobundaki ikili boyama görüntüleri. Negatif kontrol, test bileşikleri uygulanmayan (0 μg/ml) PC-3 hücrelerini ifade etmektedir. → Piknotik nükleus ve/veya nükleer fragmentasyon varlığını göstermektedir. 161 4.2.9. Gen ekspresyon analizine ilişkin bulgular Ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (ekstre+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B ile 18 saatlik tedavi sonrası, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde aktive olan hücre ölüm modunu (apoptoz, nekroz ve otofaji) mRNA düzeyinde belirlemek amacıyla kantitatif gerçek zamanlı PZR analizi gerçekleştirildi. Bu bağlamda; hücre ölüm yolaklarında kilit rol üstlenen CASP8, CASP10, FADD (apoptoz, ekstrinsik), CASP3, CASP9, CYCS (apoptoz, intrinsik), PARP1, RIPK1 (nekroz), ATG5, BECN1 (otofaji) genlerinin ekspresyon profilleri incelendi. Kantitatif gerçek zamanlı PZR analizinde kullanılmak üzere izole edilen RNAʼların miktarları (ng/μl) ve saflıkları (260/280 nm dalga boyundaki absorbans değerleri) Çizelge 4.12ʼde gösterildi. Çizelge 4.12. RNA örneklerinin konsantrasyonları ve saflıkları Test Bileşikleri Konsantrasyon (ng/μl) Saflık (260/280) DU 145 Hücre Hattı Negatif Kontrol 1161,2 2,11 Ekstre (E) 1181,5 2,11 Paklitaksel 984,8 2,13 Kombinasyon (Ekstre+Paklitaksel) 1230,6 2,12 Fraksiyon (E2) 768,5 2,11 Unotein B 798,2 2,11 PC-3 Hücre Hattı Negatif Kontrol 1160,6 2,09 Ekstre (E) 1486,7 2,11 Paklitaksel 1506,9 2,11 Kombinasyon (Ekstre+Paklitaksel) 1266,6 2,11 Fraksiyon (E2) 1745,4 2,12 Unotein B 1529,2 2,13 162 Ekstre, paklitaksel ve kombinasyon grubu ile tedaviye bırakılan DU 145 hücrelerinde, ölüm yolakları ile ilişkili genlerin ekspresyon seviyelerinde anlamlı bir değişim saptanmadı. Buna karşılık; fraksiyon uygulamasının, sadece apoptozun intrinsik yolağında görevli olan CYCS geninin ekspresyonunu yaklaşık 2,5 kat arttırdığı (ʻup regülasyonʼ) tespit edildi. Bununla birlikte; unotein B ile muamele edilen DU 145 hücrelerinde, CASP8 ve CASP10 genlerinin (apoptozun ekstrinsik yolağında görevli) ekspresyonları, sırasıyla 2 ve 2,2 katlık anlamlı artış; CASP9 ve CYCS genlerinin (apoptozun intrinsik yolağında görevli) ekspresyonları ise, sırasıyla 3,4 ve 2,6 katlık anlamlı artış gösterdi (Şekil 4.39). Şekil 4.39. DU 145 hücrelerinde; ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (E+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B ile tedavi sonrası hücre ölüm yolakları ile ilişkili genlerin ekspresyon profilleri 163 PC-3 hücrelerinde; ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (ekstre+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B ile 18 saatlik tedavinin, hücre ölüm yolaklarında (apoptoz, nekroz ve otofaji) görevli genlerin ekspresyonları üzerine etkisi değerlendirildiğinde, DU 145 hücrelerinden farklı bulgulara ulaşıldığı görüldü. Ekstre ve kombinasyon tedavisi sonrası, otofajik hücre ölümü ile ilişkilendirilen ATG5 geninin ekspresyon düzeylerinde, yaklaşık 3 katlık değişim (ʻup regülasyonʼ) tespit edildi. Paklitaksel için CASP10 (apoptoz, ekstrinsik), CYCS (apoptoz, intrinsik) ve BECN1 (otofaji) genlerinin; fraksiyon için ise CASP10 ve CYCS genlerinin ekspresyon düzeylerinde anlamlı değişim gözlenmekle birlikte, bu değişimin beklenilenin aksine ʻdown regülasyonʼ (azalış) şeklinde olduğu incelendi. Unotein Bʼnin, PC-3 hücrelerinde incelenen genlerin ekspresyonları üzerine anlamlı bir etkisi belirlenmedi (Şekil 4.40). Şekil 4.40. PC-3 hücrelerinde; ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (E+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B ile tedavi sonrası hücre ölüm yolakları ile ilişkili genlerin ekspresyon profilleri 164 4.2.10. Western blot analizine ilişkin bulgular Ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (ekstre+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B ile 18 saatlik tedavi sonrası, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde aktive olan hücre ölüm modunu (apoptoz ve otofaji) protein düzeyinde belirlemek amacıyla western blot analizi gerçekleştirildi. Bu kapsamda; kantitatif gerçek zamanlı PZR analizi sonuçlarına göre, ekspresyon profilleri iki hücre hattında anlamlı değişiklik gösteren CASP8, CASP10 (apoptoz, ekstrinsik); CASP3, CASP9, CYCS (apoptoz, intrinsik); ATG5 (otofaji) genlerinin protein ifadelerindeki değişimler araştırıldı. Western blotlama kullanılmak üzere izole edilen total proteinlerin konsantrasyonları (μg/ml), Çizelge 4.13ʼde gösterildi. Çizelge 4.13. Protein örneklerinin konsantrasyonları Test Bileşikleri Konsantrasyon (μg/ml) DU 145 Hücre Hattı Negatif Kontrol 7,86 Ekstre (E) 8,14 Paklitaksel 7,66 Kombinasyon (Ekstre+Paklitaksel) 8,47 Fraksiyon (E2) 6,14 Unotein B 6,60 PC-3 Hücre Hattı Negatif Kontrol 7,05 Ekstre (E) 5,56 Paklitaksel 6,69 Kombinasyon (Ekstre+Paklitaksel) 6,72 Fraksiyon (E2) 5,75 Unotein B 6,05 Test bileşiklerinin, DU 145 hücrelerinde apoptoz ve otofaji ile ilgili proteinlerin ekspresyonları üzerine etkisi Şekil 4.41ʼde gösterildi. Ekstre ile tedaviyi takiben; CASP3, CASP9 ve ATG5 protein ekspresyonlarında, kontrole kıyasla, anlamlı artışlar tespit edildi. Bu bulgular; ekstrenin, DU 145 hücrelerinde hem apoptozun intrinsik yolağını hem de otofajiyi aktive ettiğini göstermektedir. Paklitakselin ATG5 protein düzeyinde artışa yol açtığı gözlenirken, CASP10 ve CYCS protein ekspresyonlarında kısmi azalışlara neden olduğu saptandı. Bu verilere dayanarak; paklitakselin, DU 145 hücrelerinde etkinleştirdiği ölüm modunun otofaji olduğu söylenebilmektedir. Ekstre ile 165 paklitakselin kombine edildiği hücre grubunda ise; CASP8, CASP3, CASP9 ve CYCS ifade seviyelerinde, ekstreye kıyasla, azalışlar gözlemlendi. Bunun yanı sıra, ekstrenin ve paklitakselin ayrı olarak uygulanması sonucu ATG5 ekspresyonunda incelenen artışın, kombinasyon durumunda azaldığı görüldü. Elde edilen bu sonuçlar, kombinasyon durumunda sitotoksik etkinin kaybolduğunu ortaya koyan SRB ve XTT testi bulgularını destekler niteliktedir. Kantitatif gerçek zamanlı PZR analizi sonuçlarından farklı olarak, fraksiyonun yalnızca CASP3 protein ifadesinde artışa neden olduğu belirlendi. Bununla birlikte, unotein B ile tedavi sonucu CASP3, CASP9 ve ATG5 proteinlerine ait ekspresyon düzeylerinde, kontrole oranla, anlamlı artışlar incelendi. Unotein B için western blotlama ile tespit edilen bu bulguların, gen ekspresyon sonuçları ile kısmen benzerlik taşıdığı görülmektedir. Şekil 4.41. DU 145 hücrelerinde; ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (E+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B ile tedavi sonrası hücre ölüm yolakları ile ilişkili proteinlerin ekspresyon profilleri. Yükleme kontrolü olarak β-Actin kullanıldı. 166 PC-3 hücrelerinde, apoptoz ve otofaji ile ilişkili proteinlerin ekspresyon profillerindeki değişiklikler Şekil 4.42ʼde gösterildi. Ekstre ile tedavi edilen PC-3 hücrelerinde, apoptozun intrinsik yolağında görevli CASP9 proteini için sinyal gözlenmezken, ATG5 protein ifadesinde kontrole kıyasla önemli artış tespit edildi. Bu bulgu, hücrelerde otofajik ölümün gerçekleştiğini göstermektedir ve gen ekspresyon analizi sonuçlarını desteklemektedir. Paklitaksel tedavisi sonrası, ekspresyon profilinde gözlenen dikkate değer tek değişimin, ATG5 protein ekspresyonundaki artış olduğu incelendi. Kombinasyon grubu için elde edilen protein bantları incelendiğinde, ekstre ve paklitakselin tek başlarına uygulanmasında artan ATG5 protein ifadesinin önemli ölçüde azaldığı belirlendi. Bu veri, SRB ve XTT testlerinin sonuçlarını doğrulamaktayken; mRNA (gen) ekspresyon analizi sonuçları ile tutarsız bir eğilim göstermektedir. Buna karşılık; kombinasyon grubu için CASP8 proteininde, ekstreye veya paklitaksele oranla, ekspresyon artışı olduğu saptandı. Bu veri, floresan boyama çalışmasıyla yüksek oranda tespit edilen erken apoptotik hücreleri işaret etmektedir. Fraksiyon tedavisine maruz bırakılan hücrelerin ATG5 protein ifadesinde artış gözlenmesi, otofajik hücre ölüm şeklinin varlığına dayandırılabilmektedir. Unotein B ile muamelenin, protein ekspresyon seviyeleri üzerine anlamlı bir etkisinin bulunmadığı, gen ekspresyon sonuçlarında olduğu gibi western blot bulgularında da incelendi. 167 Şekil 4.42. PC-3 hücrelerinde; ekstre (E), paklitaksel, kombinasyon (E+paklitaksel), fraksiyon (E2) ve unotein B ile tedavi sonrası hücre ölüm yolakları ile ilişkili proteinlerin ekspresyon profilleri. Yükleme kontrolü olarak β-Actin kullanıldı. 168 5. TARTIŞMA ve SONUÇ Kanser çağımızın en önemli sağlık sorunudur. Her yıl milyonlarca insan kanser hastalığına yakalanmakta ve kanser nedeniyle hayatını kaybetmektedir (Anonim 2019a, Anonim 2020a). Günümüzde, kanser insidansı ve mortalite oranlarında görülen artışa paralel olarak kanser alanındaki araştırmalar da giderek hız kazanmaktadır. Bu araştırmaların odaklandığı temel noktalar, tedavi esnasında karşılaşılan problemleri çözüme ulaştıracak ve tedavide tam başarı sağlayacak etkili tedavi seçenekleri geliştirmektir. Prostat kanseri, ülkemizde ve dünyada en sık görülen ikinci kanser türüdür (Anonim 2019a, Anonim 2020a). Multifaktöriyel bir hastalık olan prostat kanserinde, yaş almanın ve aile öyküsünün en önemli risk faktörleri oldukları bildirilmiştir (Schulz ve ark. 2003, Kral ve ark. 2011, Anonim 2013). Prostat kanserinde, hastalığın evresine ve yayılımına ek olarak hastanın durumu da değerlendirilerek uygun bir tedavi yöntemi planlanmaktadır. Metastaz olgusu bulunmayan ve lokalize haldeki prostat kanserlerinde radikal prostatektomi olarak da adlandırılan cerrahi müdahale veya radyoterapi yöntemleri kullanılırken, ileri evredeki ve metastaz saptanmış prostat kanserlerinde, kemoterapi ve hormon tedavisi tek başlarına ya da kombine halde uygulanabilmektedir (Gilligan ve Kantoff 2002, Schulz ve ark. 2003, Anonim 2019c). Bu tedavi seçenekleri sayesinde, prostat kanserinde sağ kalım süreleri uzatılabilmekte ve uygulanan tedavilerden başarı elde edilebilmektedir. Buna karşılık; tedaviye cevap vermeme, direnç kazanma gibi etkinliği sınırlandıran durumlar ile karşılaşmak, prostat kanseri tedavisinin başarı oranını ciddi ölçüde düşürmektedir. Bundan dolayı, günümüzde uygulanan tedavi protokollerinde, tam etkinlik gösterebilecek ve prostat kanserine özgü aktif kemoterapötik ajanlara gereksinim vardır. Bitkiler âlemi, kanser alanındaki çalışmalar için her zaman mükemmel bir kaynak olmuştur. Günümüzde, klinikte kullanılan bitkisel kökenli ilaçların yaklaşık dörtte üçünün geleneksel bitki ilaçlarından türev alması, ilaç geliştirme sürecinde bitkilerin ne kadar değerli olduğunun altını çizmektedir (Eid ve ark. 2015). Bu bağlamda, belirli hastalıklara iyi geldiği düşünülerek, tecrübeye dayalı olarak yıllar boyunca kullanılan tıbbi bitkilerin, etnobotanik veriler doğrultusunda bilimsel olarak değerlendirilmesi 169 büyük önem taşımaktadır. Böylelikle, etnobotanik bilgi birikimleri yeni antikanser ilaçların ve etken bileşiklerin keşfedilme sürecine katkıda bulunmaktadır. Ayrıca, geleneksel tıpta kullanılagelen bitkiler hakkında elde edilen verilerin bilimsel olarak ispatlanmasına da olanak tanımaktadır (Başer 1995, Sadıkoğlu 1998). Etnobotanik veriler ışığında, hücre ölüm yolaklarının (apoptoz, nekroz ve otofaji) aktivasyonunda etkili olabilecek ve prostat kanserinin tedavisine yeni ilaçlar sağlama potansiyeli gösterebilecek tıbbi bitkiler tarafımızca araştırılmıştır ve Onagraceae familyasına ait Epilobium hirsutum L. (tüylü yakı otu) bitkisinin, tez kapsamında incelemeye değer bir bitki olduğu kanaatine varılmıştır. E. hirsutum bitkisinin, halk tıbbında başta prostat kanseri olmak üzere birçok hastalığın tedavisinde kullanımına ilişkin bilgiler mevcuttur (Hiermann 1983, Hiermann ve ark. 1986, Pogrel ve ark. 1993, Hostettmann 1995, Gruenwald 1998, Gruenwald ve ark. 2000, Tita ve ark. 2001, Everest ve Öztürk 2005). Bununla birlikte; yapılan literatür taramasında, sözü edilen bitkinin prostat kanseri ve diğer kanser türlerindeki biyolojik aktivitelerini araştıran çok az sayıda çalışma olduğu görülmüştür. Ayrıca, Epilobium cinsine ait diğer türler ile ilgili yapılan araştırmaların da kısıtlı olduğu gözlenmiştir. Literatürde, E. hirsutum bitkisinin DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki etkilerini araştıran bir çalışma bulunmamaktadır. Üstelik söz konusu bitkiden ‘biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yaklaşımı’na göre hazırlanan ekstrelerin ve fraksiyonların in vitro sitotoksik etkisini moleküler kapsamda analiz eden herhangi bir çalışmaya da rastlanılmamıştır. Bu açıdan ele alındığında; mevcut tez çalışması, bu bitkinin DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki sitotoksik etkilerini moleküler seviyede ortaya koyan ilk çalışmadır. Bu bağlamda, tez çalışmasının yeni bilgiler ile literatüre katkı sağlayacağı öngörülmektedir. E. hirsutum bitkisinin DU 145 ve PC-3 prostat kanseri hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkisini belirleyebilmek, bitkideki etken maddeleri izole edebilmek ve tanımlayabilmek için ‘biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yaklaşımı’ temel alınmıştır. Biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yöntemi, bitkisel materyallerde karışım halinde bulunan fitokimyasallar arasındaki aktif bileşiklerin konsantre olarak elde edilmesine ve tanımlanmasına fayda sağlayan modern bir yöntemdir (Hook ve ark. 170 1997). Tez kapsamında çalışma materyalini oluşturan E. hirsutum bitkisinin etnobotanik/etnofarmakolojik öneme sahip olması nedeniyle, biyolojik aktivite rehberli fraksiyonlama yaklaşımına göre kapsamlı bir ön ekstraksiyon çalışması gerçekleştirilmesi planlanmıştır. Bu amaçla, bitkinin toprak üstü kısımlarından değişen polaritelerde çözücüler ve farklı ekstraksiyon yöntemleri kullanılarak ham ekstreler hazırlanmıştır. Ekstrelerin ve fraksiyonların DU 145 ve PC-3 hücre hatları üzerindeki in vitro aktiviteleri sitotoksik olarak taranmıştır. E. hirsutum bitkisinden elde edilen 9 farklı ham ekstrenin etkileri, ilk olarak SRB hücre canlılık testiyle değerlendirilmiştir. SRB testi, Ulusal Kanser Enstitüsünün 1985 yılında başlattığı büyük ölçekli antikanser ilaç keşfi programında kullanılan bir test olması sebebiyle seçilmiştir (Aslantürk 2018). Ham ekstreler (3,13-200 μg/ml) ile 24, 48 ve 72 saatlik tedavi sonunda SRB testiyle elde edilen sonuçlara göre; E (su ile maserasyona tabi tutulan) ve H (%80 metanol ekstresi ile geri çeviren soğutucuda ekstre edilen) kodlu ekstreler, analiz edilen tüm ham ekstreler arasında iki hücre hattına karşı da en güçlü sitotoksik aktiviteleri sergileyen ekstrelerdir. Bitkisel kökenli materyallerin sitotoksisitesi çalışılırken, farklı bir parametreye bağlı olarak hücresel canlılığı ölçen bir test ile sonuçların doğrulanması gerekmektedir (Keepers ve ark. 1991, Patel ve ark. 2009, Patel ve Patel 2011, Vajrabhaya ve Korsuwannawong 2018). Bu sebeple; tez çalışmasında SRB testine ilave olarak, XTT testi ile de sitotoksisite araştırılmıştır. XTT hücre canlılık testi, SRB testinde olduğu gibi aynı deneysel şartlar altında gerçekleştirilmiştir. 24, 48 ve 72 saat boyunca ham ekstreler (3,13-200 μg/ml) ile tedavi sonrası, XTT testiyle elde edilen sonuçlara göre; E kodlu ekstrenin, tüm ekstreler arasında iki hücre hattına karşı da en güçlü sitotoksik aktiviteyi gösteren ekstre olduğu tespit edilmiştir. SRB ve XTT hücre canlılık testleriyle en güçlü sitotoksik etkiler, en düşük IC50 değerlerinin hesaplandığı 72 saatlik tedavi süresi sonunda elde edilmiştir. SRB ve XTT testi sonuçlarına hesaplanan IC50 değerleri kıyaslanarak en güçlü sitotoksisiteye (= en düşük IC50 değerlerine yol açarak) neden olan ekstre ve/veya ekstreler belirlenmeye çalışılmıştır. SRB testi sonuçlarına göre; iki hücre hattına karşı 171 en iyi sitotoksik etkiyi sergileyen E ve H kodlu ekstrelerin, 72 saat sonunda hesaplanan IC50 değerleri sırasıyla; DU 145 hücreleri için 67,14 μg/ml ve 55,96 μg/ml iken, PC-3 hücreleri için 94,50 μg/ml ve 87,17 μg/mlʼdir. XTT testi bulguları incelendiğinde; her iki hücre hattı üzerinde, en güçlü sitotoksik aktivitenin tespit edildiği E kodlu ekstrenin, DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki IC50 değerleri ise, sırasıyla 64,58 μg/ml ve 53,23 μg/mlʼdir. H kodlu ekstre için XTT testiyle hesaplanan IC50 dozları; DU 145 hücrelerinde 99,02 μg/ml, PC-3 hücrelerinde 100,46 μg/ml olup SRB testiyle elde edilen değerlerden nispeten daha yüksek olarak bulunmuştur. Stolarczyk ve ark. (2013a, 2013b), E. hirsutum bitkisinin toprak üstü kısımlarından hazırlanan su ekstresinin farklı dozlarının (20, 50 ve 70 μg/ml) LNCaP androjen bağımlı prostat kanseri hücre hattı üzerindeki antiproliferatif etkisini değerlendirmiş olup 72 saatlik tedavi sonrasında su ekstresinin IC50 değerini 37,3 μg/ml olarak belirlemiştir. Bu sonuçlar dikkate alındığında, E kodlu ekstre için mevcut tez çalışmasında elde edilen IC50 değerleri nispeten daha yüksek olsa da, sonuçların birbirine yakın ve bizim çalışmamızı destekleyici özellikte olduğu görülmektedir. Stolarczyk ve ark. (2013a, 2013b); E. hirsutum su ekstresinin sitotoksik etkisini, bizim çalışmamızdan farklı olarak, androjen bağımlı bir prostat kanseri hücre hattı olan LNCaPʼde analiz etmiştir. Ayrıca, uygulanan ekstraksiyon yöntemi de bizim çalışmamızdan farklılık göstermektedir. Bununla birlikte, bitkilerin yetiştikleri lokasyonlar farklıdır ve buna bağlı olarak, sahip oldukları fitokimyasal kompozisyonlar da farklılık göstermiş olabilir Tüm bunlar göz önüne alındığında, IC50 değerlerindeki kısmi farklılıklar beklenen bir durumdur. Epilobium cinsine ait diğer türler olan E. angustifolium ve E. parviflorum bitkilerinden hazırlanan su ekstrelerinin LNCaP hücrelerinde sitotoksik etkilere neden olduğu gösteren in vivo ve in vitro çalışmalar mevcuttur (Stolarczyk ve ark. 2013a, 2013b, Piwowarski ve ark. 2017). Kiss ve ark. (2006a, 2006b) tarafından yürütülen çalışmalarda, E. angustifolium su ekstresinin SK-N-SK nöroblastoma hücreleri ve PC-3 androjen bağımsız prostat kanseri hücreleri karşısında, sırasıyla 50 μg/ml ve 100 μg/ml IC50 dozları ile yüksek sitotoksik aktivite sergilediği belirlenmiştir. Daha erken tarihli bir araştırma, farklı E. parviflorum ekstreleri arasından, sadece su ekstresinin antiBPH etki sergilediğini göstermiştir (Lesuisse ve ark. 1996, Ducrey ve ark. 1997). Başka bir çalışmada ise, E. rosmarinifolium, E. angustifolium, E. tetragonum, E. palustre ve E. 172 hirsutum bitkilerinin farklı ekstrelerinin; PZ-HPV-7 (transforme epitelyal prostat hücreleri), HMEC (primer mem epitel hücreleri), 1321N1 (beyin hücreleri) ve LNCaP hücreleri gibi farklı birçok insan hücre hattı karşısında antiproliferatif aktiviteler gösterdiği bildirilmiştir. Ancak bu çalışmada, ilgili bitki türleri için 100-780 μg/ml arasında değişen IC50 değerleri elde edilmiştir. Çalışmada etanol ekstrelerinin kullanılması, yüksek IC50 değerlerinin elde edilmesinin sebebi olarak açıklanmıştır (Vitalone ve ark. 2003a, Vitalone ve ark. 2003b). Tez çalışmasında elde edilen bulgular, literatür bilgileriyle karşılaştırıldığında; E. hirsutum ve diğer Epilobium türlerinden hazırlanan su ekstrelerinin, prostat kanseri hücre hatları karşısında daha güçlü sitotoksisiteye yol açtığı görülmektedir. Bizim çalışmamızda da en iyi sitotoksik etkiyi gösteren ekstrenin su ekstresi olduğu bulunmuştur. Yapılan morfolojik analiz ile elde edilen mikroskop görüntüleri de bu bulguları desteklemektedir. Bu bağlamda; ulaşılan sonuçlar, literatürdeki diğer çalışma sonuçlarıyla uyum göstermektedir. Bu veriler ışığında; biyoaktivite rehberli fraksiyonlama yaklaşımına göre, farklı polaritedeki çözücüler ve sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemi kullanılarak E kodlu su ekstresinden kaba fraksiyonlama yapılmıştır. Kaba fraksiyonların DU 145 ve PC-3 hücreleri üzerindeki etkileri, 1,56-100 μg/ml doz aralığındaki 24, 48 ve 72 saatlik tedavilerden sonra SRB ve XTT testleriyle incelenmiştir. İki testin analiziyle ulaşılan sonuçlar; DU 145 ve PC-3 hücrelerinde en aktif fraksiyonun E2 kodlu etil asetat fraksiyonunun olduğunu göstermiştir. Bu fraksiyon için en güçlü sitotoksik etkiler, 72 saatlik tedavi sonunda saptanmış olup DU 145 ve PC-3 hücrelerinin IC50 değerleri; SRB testi için 67,80 μg/ml ve 52,24 μg/ml iken XTT testi için >100 μg/ml ve 73,22 μg/mlʼdir. Literatürde, E. angustifolium etil asetat ve n-butanol ekstrelerinin, benign prostat hiperplazisi epitel-1 (BPH-1) hücrelerinde in vitro antiBPH etkiler gösterdiği bildirilmesine (Deng ve ark. 2019) karşılık, etil asetat ve n-butanol ekstrelerinin prostat kanseri hücrelerindeki sitotoksik aktivitelerine dair herhangi bir araştırma yoktur. Bu tez çalışmasında; fraksiyonlar için elde edilen IC50 sonuçları, E kodlu ekstre için hesaplanan IC50 değerleri ile karşılaştırıldığında, E2 kodlu fraksiyonunun ve diğer fraksiyonların DU 145 ve PC-3 hücrelerinde E kodlu ekstre kadar etkili olmadığı görülmüştür. Ayrıca, mikroskop görüntüleri de, ulaşılan sonuçları destekleyici niteliktedir. Bu bulgular, E kodlu ham ekstrede bulunan etken maddelerin veya bileşiklerin birlikte bulunmaları 173 durumunda sinerjik etki gösterdiklerini açıklamaktadır. Stolarczyk ve ark. (2013b), E. hirsutum su ekstresinde tüm bileşiklerin bir arada bulunmasının ve bu bileşiklerin aditif ve/veya sinerjik etkilerinin bir sonucu olarak, E. hirsutum bitkisinin LNCaP hücrelerinde önemli biyolojik aktiviteler gösterdiğini ifade etmiştir. Birçok çalışmada, Epilobium türlerinden hazırlanan polar ekstrelerde dominant olarak bulunan dimerik makrosiklik ellajitanen bileşiği olan unotein Bʼnin ekstrelerin biyolojik aktivitesinden sorumlu olduğu ve özellikle antikanser etki gösterdiği ifade edilmiştir (Ducrey ve ark. 1997, Kiss ve ark. 2006b, Kiss ve ark. 2011, Stolarczyk ve ark. 2013a, 2013b, Granica ve ark. 2014). Mevcut tez çalışmasında, farklı polaritedeki ekstrelerin sitotoksik aktivitelerinin taranması sonucu, polar özellikteki su ekstresinde en güçlü etkiler gözlenmiştir. Bu sonuçtan hareketle, su ekstresinin biyolojik aktivitesinde unotein B bileşiğinin de önemli bir katkısı olabileceği düşünülmüştür. Bu amaçla, unotein Bʼnin (2,5-160 μg/ml) DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki sitotoksik etkileri 24, 48 ve 72 saat boyunca SRB ve XTT testleriyle analiz edilmiştir. Unotein Bʼnin en güçlü etkisi, her iki hücre hattında da 72 saatlik tedaviyi takiben belirlenmiştir ve mikroskop görüntüleri elde edilen sonuçları kanıtlamaktadır. Bu maddenin, DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki IC50 dozları, SRB testiyle 61,74 μg/ml ve 51,43 μg/ml olarak, XTT testiyle 117,26 μg/ml ve 72,06 μg/ml olarak tespit edilmiştir. E. hirsutum bitkisinden izole edilen unotein Bʼnin LNCaP hücrelerindeki etkisinin araştırıldığı bir çalışmada, unotein Bʼnin IC50 değeri 7,8 μg/ml olarak bulunmuştur (Stolarczyk ve ark. 2013b). Tez çalışmasında, belirlenen IC50 değerlerinin yüksek olması, ticari olarak firmadan temin edilen hazır unotein B maddesinin kullanılmasından kaynaklanabilir. Bizim çalışmamıza benzer olarak, ticari unotein B bileşiğinin A549 insan küçük hücreli dışı akciğer kanserindeki antiproliferatif etkisinin araştırıldığı çalışmada IC50 değeri 25,49 μM (= 40 μg/ml) olarak bulunmuştur (Pei ve ark. 2019). Lythraceae familyasına ait Cuphea hyssopifolia bitkisinden izole edilen unotein B bileşiğinin 36 saat boyunca; KB (epidermoid karsinoma), HeLa (servikal karsinoma), DU 145 (androjen bağımsız prostat karsinoma) ve Hep 3B (hepatoselüler karsinoma) insan karsinoma hücre hatlarındaki büyüme baskılayıcı etkileri analiz edilmiştir ve 11,4-54,5 μg/ml aralığında değişiklik gösteren IC50 dozları hesaplanmıştır (Wang ve ark. 1999). Bu çalışmaların sonuçları, bizim çalışma sonuçlarımızla benzerlik göstermekte olup, unotein Bʼnin 174 önemli bir antikanser bileşik olduğunu gözler önüne sererek bulgularımızı desteklemektedir. Söz konusu tez çalışmasının her deneysel aşamasında, pozitif kontrol olarak paklitaksel kullanılmıştır. Paklitakselin prostat kanseri hücre hatlarındaki IC50 dozları, çalışmalarda geniş bir aralıkta değişkenlik göstermektedir. Bu çalışmalarda, IC50 dozları nM, μM veya μg/ml olarak ifade edilmektedir. Tez çalışmasında, paklitakselin IC50 dozları, kıyaslamada kolaylık sağlaması adına test edilen diğer bileşiklerin IC50 dozları ile birlikte μg/ml biriminde verilmiştir. SRB ve XTT testleriyle, paklitaksel için DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki en düşük IC50 değerleri, 72 saatlik inkübasyon sonunda hesaplanmıştır. DU 145 ve PC-3 hücre hatlarında, SRB testiyle elde edilen IC50 değerleri sırasıyla, 0,0029 μg/ml (= 3,08 nM) ve 0,0045 μg/ml (= 5,44 nM) iken, XTT testiyle elde edilen IC50 değerleri ise sırasıyla, 0,0041 μg/ml (= 4,86 nM) ve 0,0048 μg/ml (= 5,94 nM)ʼdir. Bizim çalışmamızda olduğu gibi, firmadan ticari olarak hazır temin edilen paklitaksel ile yapılan çalışmalarda paklitakselin sitotoksik etkinlikleri araştırılmıştır. Kreis ve ark. (2001), paklitakselin 72. saatteki IC50 dozlarını DU 145 hücrelerinde 15,73 μM, PC-3 hücrelerinde ise 12,35 μM olarak bulmuştur. Dogan Sigva ve ark. (2019) ise, DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki paklitaksel IC50 dozlarını sırasıyla, 8,85 μM ve 3,08 μM olarak hesaplamıştır. Bu verilerden hareketle, tez çalışmasında analiz edilen paklitakselin, DU 145 ve PC-3 hücreleri karşısında daha iyi sitotoksik etki gösterdiği söylenebilmektedir. Ham ekstreler, kaba fraksiyonlar ve unotein B ile tedavi sonrası, en düşük IC50 değerleri, başka bir ifadeyle; en güçlü sitotoksik etkiler 72 saatlik tedavide sonunda gözlenmiştir. 72 saatin uzun bir tedavi süresi olduğu düşünülse de, farklı dozlar kullanılarak birçok ekstrenin sitotoksik aktivitelerinin tarandığı çalışmalar için bu tedavi aralığı yararlı olmaktadır (Ulukaya ve ark. 2008). Ayrıca, bu çalışmada kullanılan DU 145 ve PC-3 hücrelerinin en az 96 saate kadar canlılıklarını koruduğu gözlenmiştir. Ham ekstreler, kaba fraksiyonlar, unotein B ve paklitaksel ile 72 saatlik tedavi süresi sonunda bile az sayıda hücrenin canlılıklarını koruduğu çekilen mikroskop fotoğraflarında da görülmüştür. 175 Çalışma kapsamında, E kodlu ekstrenin DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki dikkate değer sitotoksik etkileri göz önüne alındığında, sözü edilen ekstrenin, prostat kanseri tedavisinde kullanılan bir ilaç olan paklitaksel ile kombine etkilerinin değerlendirilmesi planlanmıştır. SRB ve XTT testleri ile yapılan analiz sonuçlarında, tüm kombinasyon gruplarında 24, 48 ve 72 saatlik tedavi süresi boyunca sinerjik etkiye ilişkin bir belirtiye rastlanılmamıştır. Sitotoksik olmayan (IC50) ekstre ve paklitaksel ile kombine edilen hücre gruplarında dahi canlılık oranlarının oldukça yüksek olduğu belirlenmiştir. Mikroskopta yapılan morfolojik gözlemler de bu sonuçları desteklemektedir. Bu veriler ışığında, ekstre ile paklitakselin aynı hücre kültüründe bulunduklarında, etkileşime girerek antagonistik bir etki yarattıkları ve sitotoksik aktivitelerin inhibe olduğu söylenebilir. Ulaştığımız bu bulguları kıyaslayabileceğimiz, E. hirsutum bitkisi veya yakın akraba türler ile paklitaksel kombinasyonunun antagonistik etkilerini gösteren benzer bir çalışma literatürde bulunmamaktadır. Ancak, farklı zamanlarda gerçekleştirilen iki benzer çalışma, bizim çalışmamızda olduğu gibi E. hirsutum bitkisinin ilaç mekanizması üzerine etkileri ile ilgili bilgiler sunmaktadır. Bu çalışmalarda, E. hirsutum su ekstresinin, ilaç metabolizmasında görevli enzimlerin ekspresyon seviyeleri üzerindeki olası etkileri in vivo olarak araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlarda, enzimlerin ekspresyon seviyelerindeki azalmanın sonucu olarak, ilaç metabolizmasının baskılandığı ve ilaç toksisitesinin gerçekleştiği gözlemlenmiştir. Her iki çalışmada da araştırmacılar, geleneksel ve tamamlayıcı tedavi rutinlerinde E. hirsutum bitkisini kullanan kişileri, bu sonuçlar ile karşılaşma ihtimalleri konusunda uyarmıştır (Karakurt ve ark. 2013, Celik ve ark. 2016). Bizim çalışmamızda, E. hirsutum bitkisi, paklitaksel ile farklı bir mekanizma aracılığıyla sitotoksik aktivitelerin baskılanmasıyla sonuçlanan etkileşim göstermiş olabilir. Literatürde, prostat kanseri dâhil olmak üzere birçok kanser türünde, bitki ekstrelerinin paklitakselin etkinliğini sinerjik olarak arttırdığına ilişkin çok sayıda çalışma bulunmaktadır (Lee ve ark. 2013, Zhou ve ark. 2015, Dogan Sigva ve ark. 2019, Xie ve ark. 2019). Bunun aksine, bitki ve paklitaksel kombinasyonlarının antagonistik aktivite gösterdiğine dair çalışma sayısı çok nadirdir. Tai ve ark. (2006), Oplopanax horridus bitkisinden hazırlanan %70 etanol ekstresi ile paklitaksel veya kamptotesin ilaçlarının kombine etkilerini kanser hücre hatlarında (K562, HL60, MCF7 ve MDA-MB-468) araştırmıştır ve test edilen 19 176 kombinasyon grubundan 10 tanesinde antagonistik etki saptamıştır. Başka bir çalışmada, Saposhnikovia divaricata bitkisinin köklerinden hazırlanan %70 etanol ekstresinin paklitaksel veya kamptotesin ilaçlarıyla kombinasyonunun MDA-MB-468 hücrelerinde antagonistik etkiye yol açtığı gösterilmiştir (Tai ve Cheung 2007). Bu çalışmalardan elde edilen sonuçların, bizim bulgularımızla örtüştüğü görülmektedir. Bu bilgiler ışığında, E. hirsutum su ekstrelerinin güvenilirliğini ispatlamak ve etki mekanizmasını aydınlatabilmek için daha fazla ilaç-etkileşim deneylerinin yapılması gerektiği kanaatine varılmıştır (Vitalone ve Allkanjari 2018). Sitotoksik aktiviteler değerlendirildikten sonra; çalışmanın bir sonraki kısmında, 24, 48 ve 72 saat boyunca E kodlu ekstre, E2 kodlu fraksiyon, unotein B, paklitaksel ve kombinasyon tedavisine maruz bırakılan DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki apoptoz miktarları, kaspazla kırılmış CK 18 fragmentlerinin (M30) seviyelerine göre belirlenmiştir. 24 saatlik tedavi sonrası, hiçbir test bileşiğinin DU 145 ve PC-3 hücrelerinin M30 antijen düzeylerinde herhangi bir artışa neden olmadığı görülmüştür. Test bileşikleriyle 48 saatlik tedavi sonrası, iki hücre hattının M30 antijen seviyelerinde kısmi artışlar görülse de bu değişimlerin önemli kabul edilebilecek bir seviyede olmadığı gözlenmiştir. 24 ve 48 saatlik tedavilerde, M30 antijen seviyelerinde gözle görülür farklılıklar gözlenmemesinin sebebi, test bileşiklerinin bu süre boyunca DU 145 ve PC-3 hücreleri karşısında, 72. saate nazaran daha zayıf sitotoksik aktivite göstermesi olarak açıklanabilir. Hücre canlılık testleri ile en güçlü sitotoksik aktivitelerin 72. saatte tespit edilmesi, bu bulguları doğrulamakta olup 72 saatlik tedavi sonuçlarının daha değerli bilgiler vereceği düşünülmüştür. 72 saatlik sonuçlar incelendiğinde; E kodlu ekstrenin, hem DU 145 hem de PC-3 hücrelerinin M30 antijen seviyelerinde dikkate değer artışlara yol açtığı görülmüştür. M30 ELISA testi, erken dönemdeki apoptotik etkinliklerin tespitine olanak sağlayan güvenilir bir testtir (McPartland ve ark. 2005). Bu sonuç, E kodlu ekstrenin DU 145 ve PC-3 hücrelerinde ölüm şekli olarak erken apoptozu indüklediğini göstermektedir. Bu sonuçları karşılaştırabilmek adına yapılan literatür taramasında, E. hirsutum bitkisinin veya yakın türlerin, kanser hücrelerinin M30 antijen seviyelerindeki etkisini araştıran herhangi bir kaynağa ulaşılamamıştır. E. hirsutum su ekstresi (20, 50 ve 70 μg/ml) ile 72 saat boyunca tedaviye bırakılan LNCaP hücrelerinin kaspaz-3 aktivitesinin ELISA kiti kullanılarak ölçüldüğü bir araştırmada, 177 kaspaz-3 aktivitesinde doza bağlı olarak önemli artışlar tespit edilmiştir (Stolarczyk ve ark. 2013a). Erken apoptotik hücrelerde; CK18, kaspaz-9 tarafından kırılarak kaspazla kırılmış sitokeratin 18 olarak adlandırılan M30 antijeni oluşmaktadır ve bu apoptoz süreci kaspaz-3 ve kaspaz-7 aktivitesi ile sürdürülmektedir (Schutte ve ark. 2004). Bu bilgi göz önüne alındığında, Stolarczyk ve ark. (2013a)ʼnın çalışması, bizim çalışma sonuçlarımızı büyük ölçüde desteklemektedir. Kombinasyon grubu için elde edilen sonuçlar incelendiğinde; M30 antijen seviyelerinde negatif kontrole kıyasla kısmi artış belirlenmesine karşın, ekstre ve/veya paklitaksele göre M30 antijen seviyelerinin daha düşük olduğu görülmüştür. Bu sonuç, sitotoksisite çalışmalarında ve morfolojik analizde ulaşılan bulgular ile uyum göstermektedir. 72 saatlik tedavi periyodunda; E2 kodlu fraksiyonun ve paklitakselin DU 145 ve PC-3 hücrelerinde M30 antijen seviyelerini az da olsa arttırdığı gözlenirken, unotein Bʼnin iki hücre hattının M30 antijen seviyeleirnde değişikliğe yol açmadığı görülmüştür. Bu sonuçlar; sözü edilen test bileşikleri ile tedavi sonrası, kültürde erken apoptotik hücrelerin bulunmadığını veya az miktarda bulunduğunu ya da bu bileşiklerin sergiledikleri sitotoksik etkilerin, farklı bir ölüm şeklinden kaynaklandığını düşündürmüştür. Bu bulgudan hareketle; test bileşiklerine maruz kalmış DU 145 ve PC-3 hücrelerindeki ölüm modları, ikili floresan boyama (Hoechst 33342 ve propidyum iyodür) yöntemiyle nükleus morfolojileri de dikkate alınarak daha detaylı olarak incelenmiştir. DU 145 ve PC-3 hücrelerinin test bileşikleri ile 48 saatlik tedavisi sonrası elde edilen floresan mikroskop görüntüleri incelendiğinde; E kodlu ekstre, E2 kodlu fraksiyon, unotein B, paklitaksel ve kombinasyon tedavisinin propidyum iyodür boyası için pozitif sonuç verdiği gözlenmiştir. Bu sonuç; tüm test bileşiklerinin, hücrelerin membran bütünlüğünü bozarak primer nekroza (nekroz) veya geç apoptoza (sekonder nekroz) yol açtığını göstermektedir. Bu ayrımı yapabilmek için DU 145 ve PC-3 hücreleri, eş zamanlı olarak propidyum iyodür ve Hoechst 33342 ile boyanmıştır. Sonuçlar incelendiğinde; test bileşiklerinin uygulandığı her iki hücre hattında da, piknotik nükleus ve/veya nükleer kondenzasyon-fragmentasyon ile karakterize olan apoptoza özgü morfoloji saptanmıştır. E kodlu ekstrenin, hücrelerde neden olduğu sitotoksik etkinin geç apoptoz/sekonder nekroz olduğu gözlenmekle birlikte çok sayıda erken apoptotik hücrelerin varlığı da söz konusudur. Ekstrenin erken apoptoza neden olduğu, 178 daha önceden M30 antijen seviyelerindeki artışlardan tespit edilmiştir. Kombinasyon grubunda, propidyum iyodür ile boyanan hücre sayısının ekstreye ve/veya paklitaksele göre daha az olduğu, hatta propidyum iyodür için PC-3 hücrelerinden zayıf sinyal alındığı görülmüştür. Ayrıca her iki hücre hattında da erken apoptotik hücrelerin varlığı tespit edilmiştir. Bu sonuç; kombinasyon uygulamasının, hücrelerin apoptoza veya nekroza gitmesini tamamen baskılamadığı ancak bu süreci ciddi ölçüde yavaşlattığı şeklinde yorumlanmıştır. Bu veriler, hücre canlılık testi sonuçlarının ve mikroskop görüntülerinin doğruluklarını göstermektedir. Ayrıca, kombinasyon grubunda M30 antijen seviyelerinde gözlenen kısmi artışın da erken apoptotik hücrelerin varlığından kaynaklandığı düşünülmektedir. Elde edilen mikroskop görüntülerine göre; unotein B ile tedavi, çoğu hücrenin propidyum iyodür ile boyanmasına neden olmuştur ve erken dönem apoptotik hücre sayısı azdır. Bu veri, unotein Bʼnin DU 145 ve PC-3 hücrelerinde geç apoptoz/sekonder nekroze indüklediğini göstermektedir. Hücrelerin M30 antijen seviyelerinde bu bileşik için kayda değer bir değişim saptanmaması bu bulguyu kanıtlar niteliktedir. Bu bulgular doğrultusunda, çalışmanın bir sonraki kısmında, test bileşikleri ile tedaviyi takiben DU 145 ve PC-3 hücrelerinde aktive olan hücre ölüm modunu (apoptoz, nekroz ve otofaji) belirleyebilmek amacıyla, hem kantitatif gerçek zamanlı PZR analizi hem de western blot analizi gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, 3 temel hücre ölüm yolağında kilit rol üstlenen genlerin (CASP8, CASP10, FADD, CASP3, CASP9, CYCS, PARP1, RIPK1, ATG5, BECN1) ekspresyon profilleri mRNA düzeyinde analiz edilmiştir. Elde edilen gen ekspresyon sonuçlarına göre anlamlı değişim gösteren genlerin ekspresyon düzeylerinin western blot analiziyle protein seviyesinde belirlenmesi hedeflenmiştir. Western blot analizi sonuçları, DU 145 ve PC-3 hücrelerinde hücre ölümü ile ilişkili genlerin protein ifadelerindeki değişimler hakkında daha detaylı bilgiler sunmuştur. Ulaşılan sonuçlar incelendiğinde; DU 145 hücrelerinde ekstre, paklitaksel ve kombinasyon uygulamaları sonucu, kantitatif gerçek zamanlı PZR analizi ile mRNA düzeylerinde anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir. Buna karşılık; Western blot analizi aracılığıyla, E kodlu ekstrenin, DU 145 hücrelerinde CASP3, CASP9 ve ATG5 protein seviyelerinde artışlara yol açtığı ve hem apoptozun intrinsik yolağını hem de otofajiyi aktive ettiği gösterilmiştir. Stolarczyk ve ark. (2013a), bizim verilerimizle uyumlu 179 olarak, E. hirsutum su ekstresinin, LNCaP hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyelinin bozulmasıyla ilişkili olarak apoptozun mitokondriyal (intrinsik) yolağını indüklediğini göstermiştir. Tez çalışması kapsamında; ekstrenin, intrinsik apoptoz yolağına ilave olarak otofajiyi de tetiklediği gözlenmiştir. Apoptoz ve otofaji farklı işleyiş mekanizmalarına sahip olmakla birlikte, bu iki ölüm şekli arasında karmaşık ve ilginç ilişkilerin bulunduğu ifade edilmiştir. Dahası, otofaji ve apoptozun birlikte aktive olarak hücresel ölüme neden oldukları bildirilmiştir (Gozuacik ve Kimchi 2004, Gozuacik ve ark. 2008). Çalışmamızda, DU 145 hücre hattında, paklitakselin ATG5 protein düzeyinde artışa yol açması şaşırtıcı bir sonuçtur. Birkaç çalışmada, paklitakselin DU 145 ve PC-3 hücrelerinde apoptozu indüklediği gösterilmiştir (Kreis ve ark. 2001, Jiang ve ark. 2008). Bununla birlikte; yeni yapılan bir çalışmada, ATG5 ekspresyonunun susturulduğu Ras-NIH 3T3 hücrelerinin ATG5 eksprese edememesi sebebiyle paklitaksele direnç kazandığı bildirilmiştir (Eom ve ark. 2019). Bu çalışma, bulgularımızı destekleyerek paklitaksel tedavisinin ATG5 gen ifadesindeki etkisini ortaya koymaktadır. Kombinasyon tedavisine bırakılan DU 145 hücrelerinde, CASP8, CASP3, CASP9, CYCS ve ATG5 protein seviyelerinin azaldığı tespit edilmiştir. Bu veriler, kombinasyon tedavisi için elde edilen önceki çalışma sonuçlarımızı kanıtlamaktadır. E2 kodlu fraksiyonun, CASP3 ifadesini protein düzeyinde, CYCS ifadesini ise mRNA seviyesinde arttırarak DU 145 hücrelerinde intrinsik apoptoz yolağını aktivite ettiği görülmüştür. Unotein Bʼnin ise, hem ekstrinsik apoptoz yolağıyla ilişkili CASP8 ve CASP10 genlerinin hem de intrinsik apoptoz yolağıyla ilişkili CASP9 ve CYCS genlerinin ekspresyonlarında anlamlı artışlara neden olduğu kantitatif gerçek zamanlı PZR analizi ile gözlenmiştir. Western Blot analizi ise, CASP3 ve CASP9ʼa ek olarak ATG5 protein seviyelerinde de anlamlı artışları ortaya çıkarmıştır. Unotein B tedavisi, E kodlu ekstrede olduğu gibi hem apotozis hem de otofaji yolaklarını tetiklemiş olabilir. Ayrıca, unotein Bʼnin A549 hücrelerinde apoptoza neden olduğunu gösteren çalışma sonuçları bizim sonuçlarımızla büyük ölçüde örtüşmektedir (Pei ve ark. 2019). PC-3 hücrelerinde, ekstre ile tedavi sonrası otofaji ile ilişkili ATG5 gen ve protein ekspresyon seviyelerinde anlamlı artış gözlenmiştir. Apoptozun engellendiği koşullarda, otofajinin programlı bir hücre ölüm mekanizması olarak görev yapabildiği ifade 180 edilmiştir ve bu durum, otofaji ile apoptoz arasındaki iletişimin bir göstergesi olduğu bildirilmiştir (Gozuacik 2008). Çalışmamızda, ekstrenin apoptozu indüklediği farklı yöntemler aracılığıyla gösterilmiştir ve bu sonuçlar, ekspresyon sonuçları ile bir bütün olarak ele alındığında, böyle bir mekanizmanın söz konusu olabileceğini belirtmektedir. Paklitaksel tedavi sonrası DU 145 hücrelerinde gözlendiği gibi, PC-3 hücrelerinde de ATG5 protein ifadesinin arttığı tespit edilmiştir. Bu sonuç, çalışmada beklenilenin dışında bir sonuç olmakla birlikte, yeni yayınlanmış bir makalede ATG5 ile paklitaksel arasında incelenen ilişki, bizim çalışmamız ile uyum göstermektedir (Eom ve ark. 2019). Kombinasyon tedavisine maruz bırakılan hücrelerde, ATG5 protein ifadesi azalış gösterirken, CASP8 proteininde artışı olduğu saptanmıştır. CASP8 protein ifadesindeki artış, M30 antijen testi ve floresan boyama çalışmasında incelendiği üzere erken apoptotik hücrelerin varlığından kaynaklanıyor olabilir. E2 kodlu fraksiyonun, ATG5 protein ifadesini arttırdığı ve DU 145 hücrelerinden farklı olarak PC-3 hücrelerinde otofaji indüklediği gözlemlenmiştir. PC-3 hücrelerinde, unotein Bʼnin hücre ölüm yolakları ile ilgili genlerin ekspresyonlarında mRNA veya protein seviyesinde herhangi bir değişikliğe neden olmadığı belirlenmiştir. Kantitatif gerçek zamanlı PZR analizi ile western blot analizi sonuçları ve daha önceki çalışmalardan elde edilen bulgular bir bütün olarak değerlendirilecek olursa; çalışma kapsamında araştırılan ekstrenin, fraksiyonun, paklitakselin, unotein Bʼnin ve kombinasyon uygulamasının, farklı genlerin aktivasyon gösterdiği mekanizmalar sayesinde DU 145 ve PC-3 hücrelerinde sitotoksik/apoptotik etkilere neden olduğu belirlenmiştir. Kombinasyon grubu dışındaki test bileşiklerinin, bu hücrelerde, otofajinin katkı sağladığı bir program aracılığıyla apoptoza yol açtığı söylenebilmektedir. Kombinasyon tedavisinin ise daha önceki bulgularla uyumlu olarak, iki hücre hattında erken apoptozu aktive ettiği, ancak bu dönemde apoptotik etkiyi durdurduğu veya apoptoz sürecini yavaşlattığı tahmin edilmektedir. Bu mekanizmanın daha kapsamlı bir şekilde aydınlatılmasına ve E. hirsutum bitkisi ile paklitaksel ilacı arasındaki etkileşimin toksisite açısından ortaya konulmasına ihtiyaç duyulmaktadır. 181 Sonuç olarak; tez kapsamında araştırılan ve ülkemizde doğal olarak yayılış gösteren Epilobium hirsutum L. (tüylü yakı otu) bitkisinin ve bitkinin dominant ellajitanen bileşiği olan unotein Bʼnin, androjen bağımsız insan prostat kanseri hücreleri (DU 145 ve PC-3) üzerindeki sitotoksik etkileri moleküler düzeyde ortaya konmuştur. Sitotoksik aktivitenin, otofajinin katkı sağladığı apoptoz süreciyle gerçekleştiği düşünülmektedir. Bu doğrultuda, ulaştığımız sonuçlar otofaji ile apoptoz arasındaki etkileşimin varlığını desteklemektedir. İnvaziv karakterli DU 145 ve PC-3 hücreleri dikkate alındığında, tez çalışmasının literatüre değerli bilgiler sunacağı düşünülmektedir. Mevcut tez çalışması, halk tıbbında uzun süredir kullanılagelen etnobotanik öneme sahip tıbbi bitkinin tedavi edici etkilerinin bilimsel olarak kanıtlanmasına olanak sağlamıştır. Bununla birlikte; E. hirsutum ekstresi ve paklitaksel ile oluşturulan kombinasyon tedavisi, öngörülenin aksine, sitotoksik etkilerin baskılandığı antagonistik bir etkiyle sonuçlanmıştır. Söz konusu tez çalışması, E. hirsutum bitkisinin paklitaksel ile birlikte gösterdiği antagonistik etkiyi ortaya koyan ilk çalışma olması nedeniyle büyük önem taşımaktadır. Bu nedenle; E. hirsutum bitkisinin, paklitaksel ve benzeri diğer kemoterapötik ilaçlar ile etkileşim mekanizması aydınlatılana dek bitkinin geleneksel ve tamamlayıcı tıpta kullanımı konusunda tıbbi tavsiyelere uyulması gerektiği sonucuna ulaşılmıştır. Söz konusu bitkinin sitotoksik/apoptotik etkilerinin, ilk kez DU 145 ve PC-3 androjen bağımsız prostat kanseri hücreleri üzerinde çalışılmasıyla literatür bilgisine katkıda bulunulduğu düşünülmektedir. Bu veriler ışığında; güçlü aktivite sergileyen test bileşiklerinin fitokimyasal bileşimlerinin aydınlatılması ve in vivo etkilerin değerlendirilmesi adına ileri analizlerin gerçekleştirilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. 182 KAYNAKLAR Abate-Shen, C., Shen, M.M. 2000. Molecular genetics of prostate cancer. Genes Dev., 14: 2410-2434. Abate-Shen, C., Shen, M.M. 2002. Mouse models of prostate carcinogenesis. Trends Genet., 18: S1-S5. Abo, K.A., Adeyemi, A.A. Adeite, D.A. 2000. Ethnobotanical survey of plants used in the treatment of infertility and sexually transmitted diseases in southwest Nigeria. Afr. J. Med. Med. Sci., 29: 325-327. Ahmad, I., Mehmood, Z., Mohammad, F. 1998. Screening of some Indian medicinal plants for their antimicrobial properties. J. Ethnopharmacol, 62: 183-193. Alimirah, F., Chen, J., Basrawala, Z., Xin, H., Choubey, D. 2006. DU-145 and PC-3 human prostate cancer cell lines express androgen receptor: Implications for the androgen receptor functions and regulation. FEBS Letters, 580(9): 2294-2300. Alley, M.C., Scudiero, D.A., Monks, A., Hursey, M.L., Czerwinski, M.J., Fine, D.L., Abbott, B.J., Mayo, J.G., Shoemaker, R.H., Boyd, M.R. 1988. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res., 48(3): 589-601. Ang-Lee, M.K., Moss, J., Yuan, C.S. 2001. Herbal medicines and perioperative care. JAMA, 286(2): 208-216. Anonim, 2005. Trade in Medicinal Plants. FAO, Rome. Anonim, 2008. Real-time PCR: from theory to practice. İnvitrogen, http://corelabs.cgrb.oregonstate.edu/sites/default/files/Real%20Time%20PCR.From%2 0Theory%20to%20 Practice.pdf-/Erişim tarihi: 09 Mart 2018). Anonim, 2011. The World Traditional Medicines Situation, in Traditional medicines: Global Situation, Issues and Challenges. World Health Organization (WHO), yayın no: 3, Geneva. Anonim, 2013. Dünyada prostat kanseri. http://www.prostatkanseridernegi.org/ prostat- kanseri/dunyada-prostat-kanseri (Erişim tarihi: 28.06.2020). Anonim, 2018. LightCycler® 480 Probes Master. https://www.lifescience.roche.com/en_tr/products/lightcycler14301-480-probes master.html#details-(Erişim tarihi: 10 Mart 2018). Anonim, 2019a. World Fact Sheets, Source: Globocan 2018. World Health Organization, Lyon. 183 Anonim, 2019b. Population Fact Sheets, Turkey, Source: Globocan 2018. World Health Organization, Lyon. Anonim, 2019c. Chemotherapy for Prostate Cancer. https://www.cancer.org/cancer/prostate-cancer/treating/chemotherapy.html-(Erişim tarihi: 21.12.2019). Anonim, 2020a. WHO outlines steps to save 7 million lives from cancer. World Health Organization, Lyon. Anonim, 2020b. Onagraceae. TÜBİVES, http://194.27.225.161/yasin/tubives/ index.php?sayfa=hizli_ara-(Erişim tarihi: 12.02.2020). Aoki, K., Maruta, H., Uchiumi, F., Hatano, T., Yoshida, T., Tanuma, S.I. 1995. A macrocircular ellagitannin, oenothein b, suppresses mouse mammary tumor gene expression via inhibition of Poly(ADP-ribose) glycohydrolase. Biochem. Bioph. Res. Comm., 210(2): 329–337. Aslan, R., Karakuş, Z. 2019. Gelenekten Günümüze Tıbbi ve Aromatik Bitkiler. Göller Bölgesi Aylık Hakemli Ekonomi ve Kültür Dergisi, 6: 73. Aslantürk, Ö.S. 2018. In Vitro Cytotoxicity and Cell Viability Assays: Principles, Advantages, and Disadvantages: Genotoxicity - A Predictable Risk to Our Actual World, Ed.: Larramendy, M.L., Soloneski, S., InTech, London, United Kingdom, pp: 1- 17. Averett, J.E., Kerr, B.J., Raven, P.H. 1978. The flavonoids of Onagraceae, tribe Epilobieae: Epilobium sect. epilobium. American Journal of Botany, 65, 567-570. Averett, J.E., Raven, P.H., Becker, H. 1979. The flavonoids of Onagraceae: tribe Epilobieae. American Journal of Botany, 66, 1151-1155. Averett, J.E., Raven, P.H., 1984. Flavonoids of Onagraceae. Annales of the Missouri Botanical Garden, 71, 30-34. Barakat, H.H., Hussein, S.A.M., Marzouk, M.S., Merfort, I., Linscheid, M., Nawwar, M.A.M. 1997. Polyphenolic metabolites of Epilobium hirsutum. Phytochemistry, 46, 935-941. Başer, K.H.C. 1995. Tıbbi Bitkiler. Bilim ve Teknik, 331: 76-79. Battinelli, L., Tita, B., Evandri, M.G., Mazzanti, G. 2001. Antimicrobial activity of Epilobium spp. extracts. II Farmaco, 56: 345-348. Baykara O. 2016. Kanser Tedavisinde Güncel Yaklaşımlar. Balıkesir Sağlık Bilimleri Dergisi, 5(3): 154-165. 184 Baytop, T. 1984. Türkiye’de Bitkiler ile Tedavi. İstanbul Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Yayınları, 520 s. Baytop, T. 1999. Türkiye’de Bitkiler ile Tedavi: Geçmişte ve Bugün. Nobel Tıp Kitapevleri, İstanbul, 480 s. (1984 basımına ilaveli 2. Baskı). Bejenaru, L.E., Olah, N., Mogosanu, G.D., Bejenaru, C., Neamtu, J., Popescu, H. 2009. Researches upon the free amino acids serine and threonine in five Epilobium species (Onagraceae). Farmacia, 57, 485-491. Berridge, M.V., Tan, A.S., McCoy, K.D., Wang, R. 1996. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochemica, 4:14-19. Bhatia, H., Sharma, Y.P., Manhas, R.K., Kumar, K. 2014. Ethnomedicinal plants used by the villagers of district Udhampur, J&K, India. Journal of Ethnopharmacology, 151(2): 1005-1018. Brower, V. 2008. Back to nature: extinction of medicinal plants threatens drug discovery. J. Natl. Cancer Inst., 100: 838-839. Burnette, W.N. 1981. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem., 112(2): 195-203. Catalona, W.J., Richie, J.P., Ahmann, F.R., Hudson, M.A., Scardino, P.T., Flanigan, R.C., DeKernion, J.B., Ratliff, T.L., Kavoussi, L.R., Dalkin, B.L., Waters, W.B., MacFarlane, M.T., Southwick, P.C. 1994. Comparison of digital rectal examination and serum prostate specific antigen in the early detection of prostate cancer: results of a multicenter clinical trial of 6,630 men. The Journal of Urology, 151 (5): 1283-90. Celik, G., Semiz, A., Karakurt, S., Gencler‐Ozkan, A.M., Arslan, S., Adali, O., Sen, A. 2016. Inhibitory action of Epilobium hirsutum extract and its constituent ellagic acid on drug‐metabolizing enzymes. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 41(2): 109-116. Chan, F.K., Shisler, J., Bixby, J.G., Felices, M., Zheng, L., Appel, M., Orenstein, J., Moss, B., Lenardo, M.J. 2003. A role for tumor necrosis factor receptor-2 and receptor-interacting protein in programmed necrosis and antiviral responses. J. Biol. Chem., 278: 51613-51621. Cho, Y.S., Challa, S., Moquin, D., Genga, R., Ray, T.D., Guildford, M., Chan, F.K. 2009. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell, 137: 1112-1123. Clark, W.H. 1991. Tumour progression and the nature of cancer. Br. J. Cancer, 64: 631-644. 185 Clark, L.C., Combs, G.F., Turnbull, B.W., Slate, E.H., Chalker, D.K., Chow, J., Davis, L.S., Glover, R.A., Graham, G.F., Gross, E.G., Krongrad, A., Lesher, J.L., Park, H.K., Sanders, B.B., Smith, C.L., Taylor, J.R. 1996. Effects of selenium supplementation for cancer prevention in patients with carcinoma of the skin. A randomize9d controlled trial. Nutritional Prevention of Cancer Study Group. JAMA, 276 (24): 1957-63. Cohen, G.M., Sun, X.M., Fearnhead, H., MacFarlane, M., Brown, D.G., Snowden, R.T., Dinsdale, D. 1994. Formation of large molecular weight fragments of DNA is a key committed step of apoptosis in thymocytes. J. Immunol., 153: 507-516. Colstein, P., Kroemer, G. 2007. Cell death by necrosis: towards a molecular definition. Trends Biochem. Sci., 32: 37-43. Cragg, G.M., Newman, D.J. 2005. Plants as a source of anti-cancer agents. Journal of Ethnopharmacology, 100: 72-79. Craig, L.C., Gregory, J.D., Hausmann, W. 1950. Versatile laboratory concentration device. Anal. Chem., 22(11): 1462. Cronquist, A. 1968. The evaluation and classification of flowering plants. Thomas Nelson & Sons Ltd., London, pp. 396. Croteau, R., Kutchan, T.M. and Lewis, N.G. 2000. Natural products (secondary metabolites: Biochemistry and Molecular Biology of Plant, Ed.: Buchannan, B.B., Gruissem, W., Jones, R.L., American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, 1250–1318. Crozier, A., Jaganath, I.B., Clifford, M.N. 2006. Phenols, Polyphenols and Tannins: An Overview: Plant Secondary Metabolites: Occurrence, Structure and Role in the Human Diet, Ed.: Crozier, A., Clifford, M.N., Ashihara, H., Blackwell Publishing Ltd, USA, 1-24. Datta, B.K., Rahman, I. Das, T.K. 1998. Antifungal activity of Indian plant extracts. Mycoses, 41: 535-536. Davis, P.H. 1972. Flora of Turkey and the East Aegean Islands Vol. 4. Edinburgh University Press, Edinburgh, 657 pp. Demirci, F.,Özek, G., Kırımer, N., İşcan, G., Kürkçüoğlu, M., Demirci, B., Altıntaş, A. 2010a. Bitki Kimyası ve Analiz Yöntemleri. Anadolu Üniversitesi Yayını No: 2100, Eskişehir, Türkiye, 209 s. Demirci, F., Genç, L., Öztürk, N., Öztürk, Y., Demirci, B., Yazan, Y. 2010b. Tıbbi ve aromatik bitkilerin kullanım alanları ve etiği. Anadolu Üniversitesi Yayını No: 2098, Eskişehir, Türkiye, 345 s. 186 Deng, L., Zong, W., Tao, X., Liu, S., Feng, Z., Lin, Y., Liao, Z., Chen, M. 2019. Evaluation of the therapeutic effect against benign prostatic hyperplasia and the active constituents from Epilobium angustifolium L. J. Ethnopharmacol., 232: 1-10. Dewick, P.M. 2002. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach, 2nd edition. JohnWiley and Sons, Chichester, 507 pp. Dogan Sigva, Balci Okcanoğlu, T., Avci, C.B., Yilmaz Süslüer, S., Kayabasi, C., Turna, B., Dodurga, Y., Nazli, O., Gündüz, C. 2019. Investigation of the synergistic effects of paclitaxel and herbal substances and endemic plant extracts on cell cycle and apoptosis signal pathways in prostate cancer cell lines. Gene., 687: 261-271. Doyle, A., Griffiths, J.B., Newell, D.G. 1995. Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures. John Wiley & Sons, Inc., Chichester, England, 352 pp. Ducrey, B., Wolfender, J.L., Marston, A., Hostettmann, K. 1995. Analysis of flavonol glycosides of 13 Epilobium species (Onagraceae) by LC-UV and thermo spray LC-MS. Phytochemistry, 38, 129-137. Ducrey, B., Marston, A., Gohring, S., Hartmann, R.W., Hostettmann, K. 1997. Inhibition of 5 alpha-reductase and aromatase by the ellagitannins oenothein A and oenothein B from Epilobium species. Planta Medica, 63,111-114. Efferth, T., Miyachi, H., Drexler, H.G., Gebhart, E. 2002. Methylthioadenosine phosphorylase as target for chemoselective treatment of T-cell acute lymphoblastic leukemic cells. Blood cells, molecules and diseases, 28: 47-56. Efferth, T., Saeed, M.E.M., Mirghani, E., Alim, A., Yassin, Z., Saeed, E., Khalid, H.E., Daak, S. 2017. Integration of phytochemicals and phytotherapy into cancer precision medicine. Oncotarget, 8(30): 50284-50304. Eid, S.Y., El-Readi, M.Z., Fatani, S.H., Eldin, E.E.M.N., Wink, M. 2015. Natural Products Modulate the Multifactorial Multidrug Resistance of Cancer. Pharmacology & Pharmacy, 6: 146-176. Eisenberg-Lerner, A., Bialik, S., Simon, H.U., Kimchi, A. 2009. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death Differ., 16: 966-975. Engel, T., Henshall, D.C. 2009. Apoptosis, Bcl-2 family proteins and caspases: the ABCs of seizure-damage and epileptogenesis? IJPPP, 1: 97-115. Eom, S.Y., Hwang 1, S-H., Yeom, H., Lee, M. 2019. An ATG5 knockout promotes paclitaxel resistance in v-Ha-ras-transformed NIH 3T3 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 513(1): 234-241. 187 Eum, K.H., Lee, M. 2011. Crosstalk between autophagy and apoptosis in the regulation of paclitaxel-induced cell death in v-Ha-rastransformed fibroblasts. Mol. Cell. Biochem., 348: 61-68. Everest, A., Öztürk, E. 2005. Focusing on the ethnobotanical uses of plants in Mersin and Adana provinces (Turkey). J. Ethnobiol. Ethnomed., 1: 6. Faydalıoğlu, E., Sürücüoğlu, M.S. 2013. Tıbbi ve Aromatik Bitkilerin Antimikrobiyel, Antioksidan Aktiviteleri ve Kullanım Olanakları. EÜ Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 6(2): 233-265. Ford, V.S., Gottlieb, L.D. 2007. Tribal relationships within Onagraceae inferred from PgiC sequences. Systematic Botany, 32, 348-356. Fraenkel, G.S. 1959. The Raison d’Être of Secondary Plant Substances These Odd Chemicals Arose as a Means of Protecting Plants from Insects and Now Guide Insects to Food. Science, 129(3361): 1466-1470. Galluzzi, L., Kroemer, G. 2008. Necroptosis: a specialized pathway of programmed necrosis. Cell, 135: 1161-1163. Ghobrial, I.M., Witzig, T.E., Adjei, A.A. 2005. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy. Cancer J. Clin., 55: 178-194. Gilligan, T., Kantoff, P.W. 2002. Chemotherapy for prostate cancer. Urology, 60: 94- 100. Gozuacik, D., Kimchi, A. 2004. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism. Oncogene, 23(16): 2891-2906. Gozuacik, D., Bialik, S., Raveh, T., Mitou, G., Shohat, G., Sabanay, H., Mizushima, N., Yoshimori, T., Kimchi, A. 2008. DAP-kinase is a mediator of endoplasmic reticulum stress-induced caspase activation and autophagic cell death. Cell Death Differ., 15(12): 1875-1886. Göktaş, Ö., Gıdık, B. 2019. Tıbbi ve Aromatik Bitkilerin Kullanım Alanları. Bayburt Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 2(1): 136-142. Granica, S., Bazylko, A, Kiss, A.K. 2012. Determination of macrocyclic ellagitannin oenothein B in plant materials by HPLC-DAD-MS: method development and validation. Phytochem. Anal., 23(6):582-587. Granica, S., Piwowarski J.P., Czerwińska, M.E., Kiss, A.K. 2014. Phytochemistry, pharmacology and traditional uses of different Epilobium species (Onagraceae): a review. J. Ethnopharmacol., 156:316-46. Gruenwald, J. 1998. The emerging role of herbal medicine in health care in Europe. Drug Inf. J., 32, 151-153. 188 Gruenwald, J., Brendler, T., Jaenicke, C. 2000. PDR for Herbal. Medical Economics Company, New Jersey, USA, 858 pp. Gueritte, F., Fahy, J. 2005. The vinca alkaloids (Chapter 7): Anticancer Agents from Natural Products, Ed.: Cragg, G.M., Kingston, D.G.I., Newman, D.J., Brunner- Routledge Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, pp: 123-136. Güner, A., Aslan, S., Ekim, T., Vural, M., Babaç, M.T. 2012. Türkiye Bitkileri Listesi (Damarlı Bitkiler). Nezahat Gökyiğit Botanik Bahçesi ve Flora Araştırmaları Derneği Yayını, İstanbul, 1290 s. Hacıbekiroğlu, İ., Kodaz, H., Türkmen, E. 2015. İleri evre prostat kanserinde hormon tedavisi. Türk Onkoloji Dergisi, 30(1): 25-33. Haddock, E.A., Gupta, R.K., Al-Shafi, S.M.K., Haslam, E. 1982. The metabolism of gallic acid and hexahydroxydiphenic acid in plants. Part1. Introduction. Naturally occuring galloyl esters. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, 2515- 2524. Halberstein, R.A. 2005. Medicinal plants: historical and crosscultural usage patterns. Ann. Epidemiol., 15(9): 686-699. Hanahan, D., Weinberg, R. A. 2000. The Hallmarks of Cancer. Cell, 100: 57–70. Hanahan, D., Weinberg, R.A. 2011. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell, 144: 646-674. Hara, T., Takamura, A., Kishi, C., Iemura, S., Natsume, T., Guan, J.L., Mizushima, N. 2008. FIP200, a uLK-interacting protein, is required for autophagosome formation in mammalian cells. J. Cell Biol., 181: 497-510. Hassa, P.O. 2009. The molecular “Jekyll and Hyde” duality of PARP1 in cell death and cell survival. Front. Biosci., 14: 72-111. Haussknecht C. 1884. Monographie der gattung Epilobium. Jena, Germany. Hawkins, S.F., Guest, P.C. 2017. Multiplex Analyses Using Real-Time Quantitative PCR. Methods Mol. Biol., 1546:125-133. He, C., Klionsky, D.J. 2009. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu. Rev. Genet., 43: 67-93. He, S., Wang, L., Miao, L., Wang, T., Du, F., Zhao, L., Wang, X. 2009. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell, 137: 1100-1111. 189 Hevesi Toth, B., Balazs, A., Vukics, V., Szoke, E., Kery, A. 2006. Identification of Epilobium species and willow-herbs (Onagraceae) by HPLC analysis of flavonoids as chemotaxonomic markers. Chromatographia, 63,S119-S123. Hevesi Toth, B., Blazics, B., Kery, A. 2009. Polyphenol composition and antioxidant capacity of Epilobium species. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 49, 26-31. Hiermann, A. 1983. The investigation of active compounds from Epilobium species; 1. Communication: the flavonoid patterns. Scientia Pharmaceutica, 51, 158-167. Hiermann, A., Juan, H., Sametz, W. 1986. Influence of Epilobium extracts on prostaglandin biosynthesis and carrageenin induced oedema of the rat paw. J. Ethnopharmacol., 17: 161-169. Hiermann, A. 1995. Phytochemical characterization of Epilobium angustifolium L. and its differentiation to other Epilobium species by TLC and HPLC. Scientia Pharmaceutica, 63,135-144. Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R., Gelfand, D.H. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 88(16): 7276- 7280. Holler, N., Zaru, R., Micheau, O., Thome, M., Attinger, A., Valitutti, S., Bodmer, J.L., Schneider, P., Seed, B., Tschopp, J. 2000. Fas triggers an alternative, caspase-8- independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule. Nat. Immunol., 1: 489-495. Hook, D.J., Pack, E.J., Yacobucci, J.J., GUSS, J. 1997. Approaches to automating the dereplication of bioactive natural products. The key step in high throughput screening of bioactive materials from natural sources. J. Biomol. Screening, 2: 145-152. Hosokawa, N., Hara, T., Kaizuka, T., Kishi, C., Takamura, A., Miura, Y., Iemura, S., Natsume, T., Takehana, K., Yamada, N., Guan, J.L., Oshiro, N., Mizushima, N. 2009. Nutrient-dependent mTORC1 association with the ULK1-Atg13-FIP200 complex required for autophagy. Mol. Biol. Cell, 20(7): 1981-1991. Hostettmann, K. 1995. Flavonoids and bioflavonoids 1995: proceedings of the International Bioflavonoid Symposium. 9th Hungarian Bioflavonoid Symposium, 16-19 July 1995, Vienna, Austria. Howard, G.Z., Mabry, T.J. 1972. Distribution of flavonoids in twenty-one species of Oenothera. Phytochemistry, 11, 289-291. 190 Itokawa, H., Wang, X., Lee, K.-H. 2005. Homoharringtonine and related compounds (Chapter 4): Anticancer Agents from Natural Products, Ed.: Cragg, G.M., Kingston, D.G.I., Newman, D.J., Brunner-Routledge Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, pp: 47-70. Ivancheva, S., Manolova, N., Serkedjieva, J., Dimov, V., Ivanovska, N. 1992. Polyphenols from Bulgarian medicinal plants with anti‐infectious activity. Basic Life Sciences, 59: 717-728. İli, P. 2003. Bazı Tıbbi Bitkilerin Kimyasal İçerikleri ve Hayvanlara Etkileri. Yüksek Lisans Tezi. PAÜ, Fen Bilimleri Enstitüsü, Denizli. Jain, A.K., Singh, D., Dubey, K., Maurya, R., Mittal, S., Pandey, A.K. 2017. Models and Methods for In Vitro Toxicity: In Vitro Toxicology 1st Edition, Ed.: Dhawan, A., Kwon, S., Academic Press, London, United Kingdom, pp: 45-65. Jamous, R.M., Abu Zaitoun, S.Y., Husein, A.I., Qasem, I.B.Y., Ali‐Shtayeh, M.S. 2015. Screening for biological activities of medicinal plants used in traditional Arabic palestinian herbal medicine. European Journal of Medicinal Plants, 9(1): 1-13. Jamous, R.M., Ali‐Shtayeh, M.S., Abu‐Zaitoun, S.Y., Markovics, A., Azaizeh, H. 2017. Effects of selected Palestinian plants on the in vitro exsheathment of the third stage larvae of gastrointestinal nematodes. BMC Veterinary Research, 13(1): 308. Jamshidi-Kia, F., Lorigooini, Z., Amini-Khoe, H. 2018. Medicinal plants: Past history and future perspective. Journal of Herbmed Pharmacology, 7(1): 1-7. Jennings, T.A. 1999. Lyophilization: Introduction and Basic Principles. Informa Healthcare USA, Inc., New York, USA, 664 pp. Jensen, E.C. 2012. The basics of western blotting. Anat. Rec. (Hoboken), 295(3): 369- 371. Jordan, M.A., Toso, R.J., Thrower, D., Wilson, L. 1993. Mechanism of mitotic block and inhibition of cell proliferation by Taxol at low concentrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9552-9556. Jordan, M.A., Wilson, L. 1998. Microtubules and actin filaments: dynamic targets for cancer chemotherapy. Curr. Opin. Cell Biol., 10: 123-130. Jouan-Lanhouet, S., Arshad, M.I., Piquet-Pellorce, C., Martin-Chouly, C., Le Moigne-Muller, G., Van Herreweghe, F., Takahashi, N., Sergent, O., Lagadic- Gossmann, D., Vandenabeele, P., Samson, M., Dimanche-Boitrel, M.T. 2012. TRAIL induces necroptosis involving RIPK1/RIPK3-dependent PARP-1 activation. Cell Death Differ., 19: 2003-2014. 191 Joy, P.P., Thomas, J., Mathew, S., Skaria, B.P. 2001. Medicinal plants: Tropical Horticulture Vol 2, Editörler: Bose, T.K., Kabir, J., Joy, P.P., Naya Prakash, India, pp: 449-632. Kabera, J.N., Semana, E., Mussa, A.R., He, Xin 2014. Plant Secondary Metabolites: Biosynthesis, Classification, Function and Pharmacological Properties. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2: 377-392. Kaighn, M.E., Narayan, K.S., Ohnuki ,Y., Lechner, J.F., Jones, L.W. 1979. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3). Invest. Urol., 17(1): 16-23. Kamada, Y., Funakoshi, T., Shintani, T., Nagano, K., Ohsumi, M., Ohsumi, Y. 2000. Tor-mediated induction of autophagy via an Apg1 protein kinase complex. J. Cell Biol., 150: 1507-1513. Karadağ, A. 2016. Otofaji: Programlı Hücre Ölümü. Ankara Sağlık Hizmetleri Dergisi, 15(2): 19-26. Karakurt, S., Semiz, A., Celik, G., Gencler‐Ozkan, A.M., Sen, A., Adali, O. 2013. Epilobium hirsutum alters xenobiotic metabolizing CYP1A1, CYP2E1, NQO1 and GPx activities, mRNA and protein levels in rats. Pharmaceutical Biology, 51(5): 650-658. Karakurt, S., Semiz, A., Celik, G., Gencler‐Ozkan, A.M., Sen, A., Adali, O. 2016. Contribution of ellagic acid on the antioxidant potential of medicinal plant Epilobium hirsutum. Nutrition and Cancer, 68(1): 173-183. Keepers, Y.P., Pizao, P.E., Peters, G.J., Van, A.J., Winograd, B., Pinedo, H.M. 1991. Comparison of the sulforhodamine B protein and tetrazolium (MTT) assays for in vitro chemosensitivity testing. Eur. J. Cancer., 27: 897-900. Kelly, K. 2009. The History of medicine. Early Civilizations of Medicine The History Prehistoric Times to 500 C.E. Facts on file, New York, USA, 174 pp. Kendir, G., Güvenç, A. 2010. Etnobotanik ve Türkiye’de Yapılmış Etnobotanik Çalışmalara Genel Bir Bakış. Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Dergisi, 30(1): 49-80. Kerr, J.F., Wyllie, A.H., Currie, A.R. 1972. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, 26: 239- 257. Kırımer, N., Demirci, B., Özek, T. 2010. Tıbbi ve aromatik bitkisel ürünlerin üretimi ve kalite kontrolü. Anadolu Üniversitesi Yayını No: 2109, Eskişehir, Türkiye, 149 s. Kim, Y.S., Morgan, M.J., Choksi, S., Liu, Z.G. 2007. TNF-induced activation of the Nox1 NADPH oxidase and its role in the induction of necrotic cell death. Mol. Cell, 26: 675-687. 192 Kingston, D.G.I. 2005. Taxol and its analogs (Chapter 6): Anticancer Agents from Natural Products, Ed.: Cragg, G.M., Kingston, D.G.I., Newman, D.J., Brunner- Routledge Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, pp: 89-122. Kiss, A., Kowalski, J., Melzig, M.F. 2004. Compounds from Epilobium angustifolium inhibit the specific metallopeptidases ACE, NEP and APN. Planta Medica, 70, 919- 923. Kiss, A., Kowalski, J., Melzig, M.F. 2006a. Effect of Epilobium angustifolium L. extracts and polyphenols on cell proliferation and neutral endopeptidase activity in selected cell lines. Pharmazie, 61(1): 66-69. Kiss, A., Kowalski, J., Melzig, M.F., 2006b. Induction of neutral endopeptidase activity in PC-3 cells by an aqueous extract of Epilobium angustifolium L. and oenothein B. Phytomedicine, 13: 284-289. Kiss, A.K., Bazylko, A., Filipek, A., Granica, S., Jaszewska, E., Kiarszys, U., Kośmider, A., Piwowarski, J. 2011. OenotheinB’s contribution to the anti- inflammatory and antioxidant activity of Epilobium sp. Phytomedicine, 18(7): 557-560. Klionsky, D.J., Lane, J.D. 2010. Alternative macroautophagy. Autophagy, 6(2): 201- 201. Kösa, S., Güral, S.M. 2019. Tıbbi ve Aromatik Bitkiler ve Peyzajda Kullanımları. Peyzaj-Eğitim, Bilim, Kültür ve Sanat Dergisi, 1(2019): 41-54. Kral, M., Rosinska, V., Student, V., Grepl, M., Hrabec, M., Bouchal, J. 2011. Genetic Determinants of Prostate Cancer: A Review. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub., 155(1): 3-10. Kramer, G., Erdal, H., Mertens, H.J., Nap, M., Mauermann, J., Steiner, G., Marberger, M., Bivén, K., Shoshan, M.C., Linder, S. 2004. Differentiation between cell death modes using measurements of different soluble forms of extracellular cytokeratin 18. Cancer Res., 64(5): 1751-1756. Kreis, W., Budman, D.R., Calabro, A. 2001. A reexamination of PSC 833 (Valspodar) as a cytotoxic agent and in combination with anticancer agents. Cancer Chemother. Pharmacol., 47(1): 78-82. Kroemer, G., Marino, G., Levine, B. 2010. Autophagy And İntegrated Stress Response. Mol. Cell, 40(2): 280-293. Kunduhoglu, B., Pilatin, S., Caliskan, F. 2011. Antimicrobial screening of some medicinal plants collected from Eskisehir, Turkey. Fresenius Environmental Bulletin, 20(4): 945-952. Kurien, B.T., Scofield, R.H. 2006. Western blotting. Methods, 38(4): 283-293. 193 Lampronti, I., Saab, A.M., Gambarı, R. 2006. Antiproliferative activity of essential oils derived from plants belonging to the Magnoliophyta division. Internatıonal Journal of Oncology, 29: 989-995. Laubenbacher, R., Hower, V., Jarrah, A., Torti, S.V., Shulaev, V., Mendes, P. Torti, F.M., Akman, S. 2009. A systems biology view of cancer. Biochim. Biophys. Acta, 1796(2): 129-139. Lee, K.-H., Xiao, Z. 2005. Podophyllotoxins and analogs (Chapter 5): Anticancer Agents from Natural Products, Ed.: Cragg, G.M., Kingston, D.G.I., Newman, D.J., Brunner-Routledge Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, pp: 71- 88. Lee, S-T., Wong, P-F., Hooper, J.D., Mustafa, M.R. 2013. Alpha-tomatine synergises with paclitaxel to enhance apoptosis of androgen-independent human prostate cancer PC-3 cells in vitro and in vivo. Phytomedicine, 20(14): 1297-1305. Leers, M.P., Kölgen, W., Björklund, V., Bergman, T., Tribbick, G., Persson, B., Björklund, P., Ramaekers, F.C., Björklund, B., Nap, M., Jörnvall, H., Schutte, B. 1999. Immunocytochemical detection and mapping of a cytokeratin 18 neo-epitope exposed during early apoptosis. J. Pathol., 187(5): 567-572. Lesuisse, D., Berjonneau, J., Ciot, C., Devaux, P., Doucet, B., Gourvest, J.F., Khemis, B., Lang, C., Legrand, R., Lowinski, M., Maquin, P., Parent, A., Schoot, B., Teutsch, G., Chodounska, H., Kasal, A. 1996. Determination of oenothein B as the active 5-alpha-reductase-inhibiting principle of the folk medicine Epilobium parviflorum. Journal of Natural Products, 59, 490-492. Levine, B., Klionsky, D.J. 2004. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Devi Cell, 6: 463-477. Li, P.C., Lam, E., Roos, W.P., Zdzienicka, M.Z., Kaina, B., Efferth, T. 2008. Artesunate derived from traditional Chinese medicine induces DNA damage and repair. Cancer research, 68: 4347-4351. Li, J., Yuan, J. 2008. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene, 27: 6194-6206. Lilja, H., Oldbring, J., Rannevik, G., Laurell, C.B. 1987. Seminal vesicle-secreted proteins and their reactions during gelation and liquefaction of human semen. J. Clin. Invest., 80(2): 281-285. Liu, B., Cheng, Y., Liu, Q., Bao, J.K., Yang, J.M. 2010. Autophagic pathways as new targets for cancer drug development. Acta Pharmacol. Sin., 31: 1154-1164. Livak, K.J., Flood, S.J., Marmaro, J., Giusti, W., Deetz, K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl., 4(6): 357- 362. 194 Llambi, F., Green, D.R. 2011. Apoptosis and oncogenesis: give and take in the BCL-2 family. Curr. Opin. Genet. Dev., 21: 12-20. Los, M., Mozoluk, M., Ferrari, D., Stepczynska, A., Stroh, C., Renz, A., Herceg, Z., Wang, Z.Q., Schulze-Osthoff, K. 2002. Activation and caspase-mediated inhibition of PARP: a molecular switch between fibroblast necrosis and apoptosis in death receptor signaling. Mol. Biol. Cell, 13: 978-988. Lovkova, M. Y., Buzuk, G. N., Sokolova, S. M., Kliment'eva, N. I. 2001. Chemical features of medicinal plants (Review). Applied biochemistry and microbiology, 37(3): 229-237. Majeski, A.E, Dice, J.F. 2004. Mechanisms of Chaperone-Mediated Autophagy. Int. J. Biochem. Cell Biol., 36(12): 2435-2444. Majno, G., Joris, I. 1995. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am. J. Pathol., 146: 3-15. Martin, S.J., Green, D.R. 1995. Protease activation during apoptosis: death by a thousand cuts? Cell, 82: 349-352. Maruta, H., Okita, N., Takasawa, R., Uchiumi, F., Hatano, T., Tanuma, S. 2007. The involvement of ATP produced via (ADP-Ribose)n in the maintenance of DNA replication apparatus during DNA repair. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 30(3): 447-450. Mathen, C., Hardikar, B.P. 2010. A Method for Photomicrography of Cytotoxicity in 96-Well Plates. Asian Journal of Biotechnology, 2(4): 232-238. Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. 2007. Role of autophagy in cancer. Nat. Rev. Cancer, 7: 961-967. McCormick, F. 1999. Signalling networks that cause cancer. Trends Cell Biol, 12: 53- 56. McGee, R.S., Herr, J.C. 1988. Human seminal vesicle-specific antigen is a substrate for prostate-specific antigen (or P-30). Biol. Reprod., 39: 499-510. McNeal, J.E. 1981. Zonal anatomy of the prostate. Prostate, 2: 35-49. McPartland, J.L., Guzail, M.A., Kendall, C.H., Pringle, J.H. 2005. Apoptosis in chronic viral hepatitis parallels histological activity: an immunohistochemical investigation using anti-activated caspase-3 and M30 cytodeath antibody. Int. J. Exp. Pathol., 86(1): 19-24. Mehrpour, M., Esclatine, A., Beau, I., Codogno, P. 2010. Overwiew of Macroautophagy Regulation in Mammalian Cells. Cell Research, 20: 748-762. 195 Miyamoto, K., Kishi, N., Koshiura, R. 1987. Relationship between the structures and the antitumor activities of tannins. Chem. Pharm. Bull., 35(2): 814-822. Miyamoto, K., Koshiura, R., Hatano, T., Yoshida, T., Okuda, T. 1992. Structures and activities of tannins in crude drugs (5) host-mediated antitumor activity. Journal of Pharmacobiodynamics, 15: S6. Miyamoto, K., Nomura, M., Murayama, T., Furukawa, T., Hatano, T., Yoshida, T., Koshiura, R., Okuda, T. 1993a. Antitumor activities of ellagitannins against sarcoma-180 in mice. Biol. Pharm. Bull., 16(4): 379-387. Miyamoto, K., Nomura, M., Sasakura, M., Matsui, E., Koshiura. R., Murayama, T., Furukawa, T., Hatano, T., Yoshida, T., Okuda, T. 1993b. Antitumor activity of oenothein B, a unique macrocyclic ellagitannin. Jpn. J. Cancer Res., 84(1): 99-103. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A.M., Klionsky, D.J. 2008. Autophagy Fights Disease Through Cellular Self-Digestion. Nature, 451: 1069-1075. Monaghan, R.L., Tkacz, J.S. 1990. Bioactive microbial products: Focus upon mechanism of action. Annual Review of Microbiology, 44: 271-301. Montague, J.W., Cidlowski, J.A. 1996. Cellular catabolism in apoptosis: DNA degradation and endonuclease activation. Experientia, 52: 957-962. Moubarak, R.S., Yuste, V.J., Artus, C., Bouharrour, A., Greer, P.A., Menissier-de Murcia, J., Susin, S.A. 2007. Sequential activation of poly(ADP-ribose) polymerase 1, calpains, and Bax is essential in apoptosis-inducing factor-mediated programmed necrosis. Mol. Cell. Biol., 27: 4844-4862. Nathan, C., Ding, A. 2011. Nonresolving inflammation. Cell, 140: 871-882. Nawwar, M.A.M., Marzouk, M.S., Nigge, W., Linscheid, M. 1997. High- performance liquid chromatographic electrospray ionization mass spectrometric screening for polyphenolic compounds of Epilobium hirsutum - the structure of the unique ellagitannin epilobamide A. Journal of Mass Spectrometry, 32: 645-654. Neidler, S. 2017. What are the differences between PCR, RT-PCR, qPCR, and RT- qPCR? https://www.enzolifesciences.com/science-center/technotes/2017/march/what- are-the-differences-between-pcr-rt-pcr-qpcr-and-rt-qpcr?/-(Erişim tarihi: 10 Mart 2018). Newman, D.J., Cragg, G.M. 2012. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J. Nat. Prod., 75: 311-335. Nikoletopoulou, V., Markaki, M., Palikaras, K., Tavernarakis, N. 2013. Crosstalk between apoptosis, necrosis and autophagy. Biochim. Biophys. Acta, 1833(12) :3448- 3459. 196 Nishida, K., Yamaguchi, O., Otsu, K. 2008. Crosstalk between autophagy and apoptosis in heart disease. Circ. Res., 103: 343-351. Nobili, S., Lippi, D., Witort, E., Donnini, M., Bausi, L., Mini, E. and Capaccioli, S. 2009. Natural Compounds for Cancer Treatment and Prevention. Pharmacological Research, 59: 365-378. Oberhammer, F.A., Hochegger, K., Fröschl, G., Tiefenbacher, R., Pavelka, M. 1994. Chromatin condensation during apoptosis is accompanied by degradation of lamin A+B, without enhanced activation of cdc2 kinase. J. Cell Biol., 126(4): 827-837. Ohsumi, Y. 2001. Molecular dissection of autophagy: two ubiquitin-like systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2: 211-216. Okada, T., Afendi, F. M., Altaf-Ul-Amin, M., Takahashi, H., Nakamura, K., Kanaya S. 2010. Metabolomics of Medicinal Plants: the Importance of Multivariate Analysis of Analytical Chemistry Data. Current Computer-Aided Drug Design, 6(3): 179-196. Okuyama, S., Makihata, N., Yoshimura, M., Amakura, Y., Yoshida, T., Nakajima, M., Furukawa, Y. 2013. Oenothein B Suppresses Lipopolysaccharide (LPS)-Induced Inflammation in the Mouse Brain. Int. J. Mol. Sci.,14, 9767-9778. Otsuka, H. 2006. Purification by Solvent Extraction Using Partition Coefficient: Natural Products Isolation, 2nd Edition (Methods in Biotechnology, Vol. 20), Ed.: Sarker, S.D., Latif, Z., Gray, A.I., Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, pp: 269- 273. Ouyang, L., Shi, Z., Zhao, S., Wang, F.T., Zhou, T.T., Liu, B., Bao, J.K. 2012. Programmed cell death pathways in cancer: a review of apoptosis, autophagy and programmed necrosis. Cell Prolif., 45: 487-498. Patel, S., Gheewala, N., Suthar, A., Shah, A. 2009. In-vitro cytotoxicity activity of Solanum nigrum extract against Hela cell line and Vero cell line. Int. J. Pharm. Pharm. Sci., 1: 38-46. Patel, R.M., Patel, S.K. 2011. Cytotoxic activity of methanolic extract of Artocarpus heterophyllus against A549, Hela and MCF-7 cell lines. J. App. Pharm. Sci., 1: 167- 171. Papazisis, K.T., Geromichalos, G.D., Dimitriadis, K.A., Kortsaris, A.H. 1997. Optimization of the sulforhodamine B colorimetric assay. J. Immunol. Methods., 208 (2): 151-158. Papsidero, L.D., Wang, M.C., Valenzuela, L.A., Murphy, G.P., Chu, T.M. 1980. A prostate antigen in sera of prostatic cancer patients. Cancer Res., 40(7): 2428-2432. 197 Pei, X., Xiao, J., Wei, G., Zhang, Y., Lin, F., Xiong, Z., Lu, L., Wang, X., Pang, G., Jiang, Y., Jiang, L. 2019. Oenothein B inhibits human non-small cell lung cancer A549 cell proliferation by ROS-mediated PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway. Chem. Biol. Interact., 298: 112-120. Pirvu, L., Nicorescu, V., Hlevca, C., Udeanu, D.I., Nicorescu, I. 2015. Antimicrobial and synergistic activity of some whole and selective Epilobium hirsutum L. (great willowherb) extracts tested on standard and wild staphylococcus Aureus strains. Farmácia, 63(5): 690-695. Pirvu, L., Nicorescu, I., Hlevca, C., Albu, B., Nicorescu, V. 2016. Epilobi hirsuti herba extracts influence the in vitro activity of common antibiotics on standard bacteria. Open Chemistry, 14: 65-75. Piwowarski, J.P., Bobrowska-Korczak, B., Stanisławska, I., Bielecki, W., Wrzesien, R., Granica, S., Krupa, K., Kiss, A.K. 2017. Evaluation of the Effect of Epilobium angustifolium Aqueous Extract on LNCaP Cell Proliferation in In Vitro and In Vivo Models. Planta Med., 83(14-15): 1159-1168. Pogrel, M.A., Pham, H:D, Guntenhoner, M., Stern, R. 1993. Profile of hyaluronidase activity distinguihes carbon dioxide laser from scalpel wound healing. Ann. Surg., 217, 196-200. Pourmorad, F., Ebrahimzadeh, M.A., Mahmoudi, M., Yasini, S. 2007. Antinociceptive activity of methanolic extract of Epilobium hirsutum. Pakistan Journal of Biological Sciences, 10(16): 2764-2767. Qiu, J. 2007. Traditional medicine: a culture in the balance. Nature, 448(7150): 126- 128. Rahier, N.J., Thomas, C.J., Hecht, S.M. 2005. Camptothecin and its analogs (Chapter 2): Anticancer Agents from Natural Products, Ed.: Cragg, G.M., Kingston, D.G.I., Newman, D.J., Brunner-Routledge Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, pp: 5-22. Ramstead, A.G., Schepetkin, I.A., Quinn, M.T., Jutila, M.A. 2012. Oenothein B, a cyclic dimeric ellagitannin isolated from Epilobium angustifolium, enhances IFNγ production by lymphocytes. PLoSOne, 7, e50546. Raven, P.H. 1962. The Genus Epilobium in Turkey. Notes from the Royal Botanic Garden Edinburgh, 24: 183-203. Riedl, S.J., Salvesen, G.S. 2007. The apoptosome: Signalling platform of cell death. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8: 405-413. Rodriguez-Lazaro, D., Hernandez, M. 2013. Real-time PCR in Food Science: Introduction. Curr. Issues Mol. Biol., 15: 25-38. 198 Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J.J., Andrade, M.J. 2015. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol., 1275:31-56. Roman,mI., Rusu, M.A., Puicǎ, C., Borşa, M. 2010. Cytotoxic effects of three species of Epilobium (Onagraceae) herbal extracts in rats. Studia Universitatis Vasile Goldis Arad, Seria Stiintele Vietii, 20(1): 19-23. Rosadas, C., Cabral-Castro, M.J., Vicente, A.C., Peralta, J.M., Puccioni-Sohler, M. 2013. Validation of a quantitative real-time PCR assay for HTLV-1 proviral load in peripheral blood mononuclear cells. J. Virol. Methods, 193(2): 536-541. Rowinsky, E.K. 1997. The development and clinical utility of the taxane class of antimicrotubule chemotherapy agents. Annu. Rev. Med., 48: 353-74. Roy, P.S., Saikia, B.J. 2016. Cancer and cure: A critical analysis. Indian J. Cancer, 53(3): 441-442. Sadıkoğlu, N. 1998. Cumhuriyet Dönemi Türk Etnobotanik Araştırmalar Arşivi. Yüksek Lisans Tezi, İÜ, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, İstanbul. Sakagami, H., Jiang, Y., Kusama, K., Atsumi, T., Ueha, T., Toguchi, M., Iwakura, I., Satoh, K., Ito, H., Hatano, T., Yoshida, T. 2000. Cytotoxic activity of hydrolyzable tannins against human oral tumor cell lines - A possible mechanism. Phytomedicine, 7(1): 39-47. Samuni-Blank, M., Izhaki, I., Dearing M. D., Gerchman, Y., Trabelcy, B., Lotan, A., Karasov, W. H., and Arad, Z. 2012. Intraspecific Directed Deterrence by the Mustard Oil Bomb in a Desert Plant. Current Biology, 22(13): 1218-1220. Saraste, A., Pulkki, K. 2000. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardiovasc. Res., 45: 528-537. Sarker, S.D., Latif, Z., Gray, A.I. 2006. Natural Products Isolation, 2nd Edition (Methods in Biotechnology, Vol. 20). Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, 515 pp. Sayers, T.J. 2011. Targeting the extrinsic apoptosis signaling pathway for cancer therapy. Cancer Immunol. Immunother., 60: 1173-1180. Scheller, C., Knoferle, J., Ullrich, A., Prottengeier, J., Racek, T., Sopper, S., Jassoy, C., Rethwilm, A., Koutsilieri, E. 2006. Caspase inhibition in apoptotic T cells triggers necrotic cell death depending on the cell type and the proapoptotic stimulus. J. Cell. Biochem., 97: 1350-1361. Schepetkin, I.A., Kirpotina, L.N., Jakiw, L., Khlebnikov, A.I., Blaskovich, C.L., Jutila, M.A., Quinn, M.T. 2009. Immunomodulatory activity of oenothein B isolated from Epilobium angustifolium. Journal of Immunology, 183, 6754-6766. 199 Schiff, P.B., Horwitz, S.B. 1980. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1561-1565. Schippmann, U.W.E., Leaman, D., Cunningham, A.B., 2006. A Comparison of Cultivation and Wild Collection of Medicinal and Aromatic Plants under Sustainability Aspects, Frontis, 17, 75-95. Schulz, W.A., Burchardt, M., Cronauer, M.V. 2003. Molecular biology of prostate cancer. Molecular Human Reproduction, 9(8): 437-448. Schutte, B., Henfling, M., Kölgen, W., Bouman, M., Meex, S., Leers, M.P., Nap, M., Björklund, V., Björklund, P., Björklund, B., Lane, E.B., Omary, M.B., Jörnvall, H., Ramaekers, F.C. 2004. Keratin 8/18 breakdown and reorganization during apoptosis. Exp. Cell Res., 297(1): 11-26. Scudiero, D.A., Shoemaker, R.H., Paull, K.D., Monks, A., Tierney, S., Nofziger, T.H., Currens, M.J., Seniff, D., Boyd, M.R. 1988. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Cancer Res., 48(17):4827-4833. Seidel, V. 2006. Initial and Bulk Extraction: Natural Products Isolation, 2nd Edition (Methods in Biotechnology, Vol. 20), Ed.: Sarker, S.D., Latif, Z., Gray, A.I., Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, pp: 27-46. Shamas-Din, A., Brahmbhatt, H., Leber, B., Andrews, D.W. 2011. BH3-only proteins: orchestrators of apoptosis. Biochim. Biophys. Acta, 1813: 508-520. Sharma, R., Manhas, R.K., Magotra, R. 2012. Ethnoveterinary remedies of diseases among milk yielding animals in Kathua, Jammu and Kashmir, India. Journal of Ethnopharmacology, 141(1): 265-272. Sheikh, N.A., Desai, T.R., Tirgar, P.R. 2017. Evaluation of iron chelating and antioxidant potential of Epilobium hirsutum for the management of iron overload disease. Biomed Pharmacother., 89: 1353-1361. Sherwood, E.R., Berg, L.A., Mitchell, N.J., McNeal, J.E., Kozlowski, J.M., Lee, C. 1990. Differential cytokeratin expression in normal, hyperplastic and malignant epithelial cells from human prostate. J. Urol., 143(1): 167-171. Shikov, A.N., Poltanov, E.A., Dorman, H.J.D., Makarov, V.G., Tikhonov, V.P., Hiltunen, R. 2006. Chemical composition and in vitro antioxidant evaluation of commercial water-soluble willow herb (Epilobium angustifolium L.) extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 3617-3624. Shintani, T., Klionsky, D.J. 2004. Autophagy in health and disease: a double-edged sword. Science, 306: 990-9955. 200 Shougang, J., Zu, Y., Fu, Y., Zhang, Y. 2008. Activation of the mitochondria-driven pathway of apoptosis in human PC-3 prostate cancer cells by a novel hydrophilic paclitaxel derivative, 7-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel. Internatıonal Journal of Oncology, 33: 103-111. Skehan, P., Storeng, R., Scudiero, D., Monks, A., McMahon, J., Vistica, D., Warren, J.T., Bokesh, H., Kenney, S., Boyd, M.R. 1990. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J. Natl. Cancer Inst., 82(13):1106- 1112. Skulachev, V.P. 2006. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis. Apoptosis, 11: 473-485. Slacanin, I., Marston, A., Hostettmann, K., Delabays, N., Darbellay, C. 1991. Isolation and determination of flavonol glycosides from Epilobium species. Journal of Chromatography, 557, 391-398. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., Klenk, D.C. 1985. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem., 150(1): 76-85. Solecki, R. 1975. Shanidar IV, a Neanderthal flower burial in Northern Iraq. Science, 190(4217): 880-881. Stamp, N. 2003. Out of the quagmire of plant defense hypotheses. The Quarterly Review of Biology, 78(1): 23-55. Stolarczyk, M., Naruszewicz, M., Kiss, A.K. 2013a. Extracts from Epilobium sp. herbs induce apoptosis in human hormone-dependent prostate cancer cells by activating the mitochondrial pathway. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 65, 1044-1054. Stolarczyk, M., Piwowarski, J.P., Granica, S., Stefańska, J., Naruszewicz, M., Kiss, A.K. 2013b. Extracts from Epilobium sp. herbs, their components and gut microbiota metabolites of Epilobium ellagitannins, urolithins, inhibit hormone-dependent prostate cancer cells-(LNCaP) proliferation and PSA secretion. Phytother. Res., 27(12): 1842- 1848. Stone, K.R., Mickey, D.D., Wunderli, H., Mickey, G.H., Paulson, D.F. 1978. Isolation of a human prostate carcinoma cell line (DU 145). Int. J. Cancer., 21(3): 274- 281. Strober, W. 2001. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol., Appendix 3:Appendix 3B. Suffness, M. 1995. Taxol® Science and Applications. CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 436 pp. 201 Şarışen, Ö., Çalışkan, D. 2005. Fitoterapi: Bitkilerle Tedaviye Dikkat(!). Sted, 14(8):182-187. Tai, J., Cheung, S., Cheah, S., Chan, E., Hasman, D. 2006. In vitro anti-proliferative and antioxidant studies on Devil's Club Oplopanax horridus. J. Ethnopharmacol., 108(2): 228-235. Tai, J., Cheung, S. 2007. Anti-proliferative and antioxidant activities of Saposhnikovia divaricata. Oncol. Rep., 18(1): 227-234. Temel, M., Tınmaz, B., Öztürk, M., Gündüz, O. 2018. Dünyada ve Türkiye’de Tıbbi- Aromatik Bitkilerin Üretimi ve Ticareti. KSÜ Tarım ve Doğa Derg., 21(Özel Sayı): 198-214. Thrane, U. 2001. Development in the Taxonomy of Fusarium Species Based on Secondary Metabolites: In Fusarium: Paul E. Nelson memorial symposium, Ed.: Summerell, B.A., APS Press, Minnesota, 29-49. Tita, B., Abdel-Haq, H., Vitalone, A., Mazzanti, G., Saso, L. 2001. Analgesic properties of Epilobium angustifolium, evaluated by the hot plate test and the writhing test. Farmaco., 56: 341-343. Tokur, O., Aksoy, A. 2017. In Vitro Sitotoksisite Testleri. Harran Üniv. Vet. Fak. Derg., 6(1): 112-118. Ullmann, M. 1978. Islamic Medicine. Edinburgh University Press, Edinburgh, 138 pp. Ullman, E., Fan, Y., Stawowczyk, M., Chen, H.M., Yue, Z., Zong, W.X. 2008. Autophagy promotes necrosis in apoptosis-deficient cells in response to ER stress. Cell Death Differ., 15: 422-425. Ulukaya, E. 2003. Apoptozis ders notları. http://biyokimya.uludag.edu.tr/apoptozis_ders_notu.pdf-(Erişim tarihi: 19 Nisan 2018). Ulukaya, E., Ozdikicioglu, F., Oral, A.Y., Demirci, M. 2008. The MTT assay yields a relatively lower result of growth inhibition than the ATP assay depending on the chemotherapeutic drugs tested. Toxicol. In Vitro, 22(1): 232-239. Ulukaya, E., Acilan, C., Yilmaz, Y. 2011. Apoptosis: Why and how does it occur in biology? Cell Biochemistry and Function, 29(6): 468-480. Vajrabhaya, L., Korsuwannawong, S. 2018. Cytotoxicity evaluation of a Thai herb using tetrazolium (MTT) and sulforhodamine B (SRB) assays. Journal of Analytical Science and Technology, 9(15): 1-6. van Engeland, M., Kuijpers, H.J., Ramaekers, F.C., Reutelingsperger, C.P., Schutte, B. 1997. Plasma membrane alterations and cytoskeletal changes in apoptosis. Exp. Cell Res., 235(2): 421-430. 202 van der Kuip, H., Mürdter, T.E., Sonnenberg, M., McClellan, M., Gutzeit, S., Gerteis, A., Simon, W., Fritz, P., Aulitzky, W.E. 2006. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer, 6: 86. Velasco, L., Goffman, F.D. 1999. Tocopherol and fatty acid composition of twenty- five species of Onagraceae Juss. Botanical Journal of the Linnean Society, 129, 359- 366. Vercammen, D., Brouckaert, G., Denecker, G., Van de Craen, M.,Declercq, W., Fiers, W., Vandenabeele, P. 1998. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J. Exp. Med., 188: 919-930. Vitali, F., Fonte, G., Saija, A., Tita, B. 2006. Inhibition of intestinal motility and secretion by extracts of Epilobium spp. in mice. Journal of Ethnopharmacology, 107: 342-348. Vitalone, A., McCroll, J., Thome, D., Costa, L.G., Tita, B. 2003a. Characterization of the effect of Epilobium extracts on human cell proliferation. Pharmacology, 69: 79- 87. Vitalone, A., Guizzetti, M., Costa, L.G., Tita, B. 2003b. Extracts of various species of Epilobium inhibit proliferation of human prostate cells. J. Pharm. Pharmacol., 55(5): 683-690. Vitalone, A., Allkanjari, O. 2018. Epilobium spp: Pharmacology and Phytochemistry. Review Phytother. Res., 32(7): 1229-1240. Voynova, E., Dimitrova, S., Naydenova, E., Karadjov, P. 1991. Inhibitory action of extracts of Maclura aurantiaca and Epilobium hirsutum on tumour models in mice. Acta Physiologica et Pharmacologica Bulgarica, 17(4): 50-52. Wang, M.C., Valenzuela, L.A., Murphy, G.P., Chu, T.M. 1979. Purification of a human prostate specific antigen. Invest Urol.,17(2): 159-163. Wang, C.C., Chen, L.G., Yang, L.L. 1999. Antitumor activity of four macrocyclic ellagitannins from Cuphea hyssopifolia. Cancer letters, 140(1-2): 195-200. Weaver, B.A. 2014. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol. Biol. Cell., 25(18): 2677-2681. White, E., DiPaola, R.S. 2009. The double-edged sword of autophagy modulation in cancer. Clin. Cancer Res., 15: 5308-5316. Wink, M. 1999. Introduction: Biochemistry, Role and Biotechnology of Secondary Metabolites. Annual Plant Reviews, 2, 1-16. 203 Wink, M. 2003. Evolution of Secondary Metabolites from an Ecological and Molecular Phylogenetic Perspective. Phytochemistry, 64, 3-19. Wink, M. 2008. Plant Secondary Metabolism: Diversity, Function and Its Evolution. Natural Product Communications, 3, 1205-1216. Wu, W., Liu, P., Li, J. 2012. Necroptosis: An emerging form of programmed cell death. Critical Reviews in Oncology/Hematology, 82, 249-258. Xie, Z., Klionsky, D.J. 2007. Autophagosome formation: core machinery and adaptaion. Nat. Cell Biol., 9: 1102-1109. Xie, Z., Wei, Y., Xu, J., Lei, J., Yu, J. 2019. Alkaloids from Piper nigrum Synergistically Enhanced the Effect of Paclitaxel against Paclitaxel-Resistant Cervical Cancer Cells through the Downregulation of Mcl-1. J. Agric. Food. Chem., 67(18): 5159-5168. Xu, Y., Huang, S., Liu, Z.G., Han, J. 2006. Poly (ADP-ribose) polymerase-1 signaling to mitochondria in necrotic cell death requires RIP1/TRAF2-mediated JNK1 activation. J. Biol. Chem., 281: 8788-8795. Yencilek, F., Koca, O., Kuru, M. 2018. Diagnosis in Prostate Cancer. Nucl. Med. Semin.,4: 163-173. Zargari, A. 1992. Medicinal Plants. Tehran University Press, Tehran, 889 pp. Zhang H. 2011. Bioactive Natural Products: Detection, Isolation, and Structural Determination. Phytomedicine, 18(10): 902-903. Zhou, Y., Shen, J., Xia, L., Wang, Y. 2015. Curcuma zedoaria (Berg.) Rosc. essential oil and paclitaxel synergistically enhance the apoptosis of SKOV3 cells. Mol. Med. Rep., 12(1): 1253-1257. 204 EK Bilimsel Araştırma İzninin Onaylanmasına İlişkin Yazı 205 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Buse VATANSEVER Doğum Yeri ve Tarihi : Bursa, 07 Nisan 1990 Yabancı Dil : İngilizce Eğitim Durumu Lise : Bursa Atatürk Lisesi, 2004-2007 Lisans : Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 2007-2011 Yüksek Lisans : Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 2012-2014 Çalıştığı Kurum(lar) : - İletişim (e-posta) : busevtnsvr90@gmail.com Akademik çalışmalar : Ardicli, S., Samli, H., Dincel, D., Ekiz, B., Yalcintan, B., Vatansever, B., Balci, F. 2018. Relationship of the bovine IGF1, TG, DGAT1 and MYF5 genes to meat colour, tenderness and cooking loss. Journal of Hellenic Veterinary Medical Society, 69(3): 1077-1087. Ardicli, S., Samli, H., Vatansever, B., Soyudal, B., Dincel, D., Balci, F. 2019. Comprehensive assessment of candidate genes associated with fattening performance in Holstein–Friesian Bulls. Arch. Anim. Breed., 62(1): 9-32. Samli, H., Samli, M., Vatansever, B., Ardicli, S., Aztopal, N., Dincel, D., Sahin, A., Balci, F. 2019. Paclitaxel resistance and the role of miRNAs in prostate cancer cell lines. World J. Urol., 37(6): 1117-1126. Samli, H., Samli, D.T., Ardicli, S., Samli, M., Vatansever, B. 2020. Evaluation of intercellular communication between normal human prostate epithelial cells and prostate cancer cell lines in co-culture model. Journal of Cellular Biotechnology, 6(1): 71-79. 206