T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Rhodobacter capsulatus BAKTERİSİNDE SİTOKROM C OKSİDAZ BİYOGENESİZ ’İNDE ROL ALAN GENLERİN BELİRLENMESİ VE FONKSİYONLARININ TANIMLANMASI Semra AYGÜN-SUNAR DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI BURSA 2006 T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Rhodobacter capsulatus SİTOKROM C OKSİDAZ BİYOGENESİZ ’İNDE ROL ALAN GENLERİN BELİRLENMESİ VE FONKSİYONLARININ TANIMLANMASI Semra AYGÜN-SUNAR DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Prof. Dr. Rahmi BİLALOĞLU Doç. Dr. Sevnur MANDACI 1. Danışman 2. Danışman Bu tez 01/12//2006 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oybirliği ile kabul edilmiştir. Prof. Dr. Rahmi BİLALOĞLU Prof. Dr. Ünal EGELİ Prof. Dr. Sezai TÜRKEL Prof. Dr. Ahmet ÖZATA Yard. Doç. Dr. Nilüfer AYDEMİR i ÖZET Rhodobacter capsulatus Bakterisinde Sitokrom c Oksidaz Biyogenesiz ’inde Rol Alan Genlerin Belirlenmesi ve Fonksiyonlarının Tanımlanması C-tipi sitokromlar, sitokrom bc1 kompleksi veya cbb3-tip sitokrom c oksidaz gibi elektron transfer zincir bileşenlerinin alt birimleri ya da fizyolojik ortağı olan ve hem kofaktörü içeren proteinlerdir. Sitokrom c proteinlerindeki hem molekülü kompleks posttranslasyonal olgunlaşma süreçleri aracılığında apositokromlara kovalent olarak bağlanır. Bu çalışmada, besi yerine bağlı fotosentetik üreme özelliği gösteren ve farklı c-tipi sitokrom proteinlerinden yoksun Rhodobacter capsulatus mutantlarından yararlanılarak sitokrom cbb3 oksidaz ve c-tipi sitokromların biyogenesizinden sorumlu yeni genler araştırıldı. R. capsulatus kromozomal kütüphaneleri kullanılarak yapılan genetik tamamlama testleri sonunda mutant fenotipinden sorumlu ve genomda bitişik yer alan iki gen (RRC00138 ve RRC00139) tanımlandı. R. capsulatus genom analizlerinde RRC00138 gen ürünü başlangıçta 1-açil-sn-gliserol-3-fosfat açiltransferaz enzimi (AGPAT) olarak ve RRC00139 gen ürünü ise hipotetik sitozolik protein olarak tanımlıydı. Ancak yeni yapılan biyoinformatik analizler sonunda, bu iki gen ürünün amino asit dizisinin Sinorhizobium meliloti ’de ornitin lipid (OL) biyosentezinden sorumlu OlsA ve OlsB enzim dizileri ile benzerlik gösterdikleri görüldü. RRC00138 ve RRC00139 mutantlarının membranları tüm gliserofosfolipidleri yaban soy oranında içermesine rağmen, OL ’i içermemeleri, bu iki genin R. capsulatus ’da OL biyosentezi için gerekli olduğunu gösterdi. OL ’lerin bakteriyel membranların bir bileşeni oldukları çok uzun zamandır bilinmektedir. Bakterilere özgü bu amino-lipidler, B-lenfositlerin çoğalımı, adjuvantisiti ve makrofajların aktivasyonunu kapsayan konakçı bağışıklık sistemini uyarırlar. OL ’ler bakterilerde oldukça geniş yayılım göstermelerine ve farklı biyolojik etkilere sahip olmalarına rağmen, bu lipidlerin bakterilerdeki rolü bugüne kadar tam olarak açıklanamamıştır. Bu çalışma ile OL ’lerin farklı bakteriyel üreme koşulları altında, c-tipi sitokromlarını da kapsayan bazı sitoplazmik membran proteinlerin optimal sabit miktarları için önemli oldukları görülmüştür ve OL ’lerin bakterilerdeki yeni ve önemli başka bir biyolojik rolü literatüre kazandırılmıştır. ANAHTAR KELİMELER: Rhodobacter capsulatus, c-tipi sitokromlar, sitokrom cbb3 oksidaz, 1-açil-sn-gliseroltrifosfat açiltransferaz, ornitin lipid, sitoplazmik membran proteinleri. ii ABSTRACT Identification of Genes Involved in Biogenesis of Cytochrome c Oxidase from Rhodobacter capsulatus and Determination of Their Functions The c-type cytochromes are haemoproteins that are subunits or physiological partners of electron transport chain components, like the cytochrome bc1 complex or the cbb3-type cytochrome c oxidase. Their haem moieties are covalently attached to the corresponding apocytochromes via a complex posttranslational maturation process. In this work, using the Rhodobacter capsulatus mutants that exhibited medium-dependent photosynthetic growth and lacked various c-type cytochromes, additional genes involved in this process were sought. Genetic complementation of these cytochrome cbb3 oxidase-minus mutants using R. capsulatus chromosomal libraries uncovered two novel genes, RRC00138 and RRC00139, which are adjacent to each other. Although on R. capsulatus genome RRC00138 and RRC00139 were annotated as corresponding to the 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase and a hypothetical cytosolic protein, respectively, more recent searches revealed that they are highly homologous to the ornithine lipid (OL) biosynthesis genes, olsA and olsB, in Sinorhizobium meliloti, respectively. Membranes of the RRC00138 and RRC00139 knock out mutants contained all major phospolipids at wild-type levels but lacked the non phosphorous OL, demonstrating these genes are required for OL biosynthesis in R. capsulatus. The non-phosphorus OLs have long been known as constituents of bacterial membranes. These eubacteria-specific amino-lipids induce potent host immune responses, including B-lymphocyte mitogenicity, adjuvanticity and macrophage activation. Despite the widespread occurrence of OL, and diverse biological effects they elicit, up until now their role in bacteria producing them remained completely unknown. Our findings now indicate that under certain bacterial growth conditions OL are crucial for optimal steady-state amounts of some extracytoplasmic proteins, including several c-type cytochromes, and attribute them a novel and important biological function. KEYWORDS: Rhodobacter capsulatus, cytochrome cbb3 oxidase, c-type cytochromes, 1-acyl- sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase, ornithine lipid, extracytoplasmic membrane proteins. iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ ÖZET..................................................................................................................... i ABSTRACT........................................................................................................... ii İÇİNDEKİLER..................................................................................................... iii SİMGELER DİZİNİ............................................................................................. vi ŞEKİLLER DİZİNİ.............................................................................................. viii ÇİZELGELER DİZİNİ........................................................................................ x 1. GİRİŞ................................................................................................................. 1 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI............................................................................. 6 2.1. Sitokromlar.................................................................................................. 6 2.1.1. C-Tipi Sitokromlar............................................................................. 6 2.1.1.1. C-tipi Sitokromların Biyogenesizi........................................ 8 2.2. Solunum Oksidazları.................................................................................... 9 2.2.1. Sitokrom cbb3 Oksidaz Enzimi........................................................... 11 2.3. Membran Lipidleri....................................................................................... 11 2.3.1. Gliserofosfolipidler............................................................................. 12 2.3.1.1.Gliserofosfolipidlerin Biyosentezi........................................... 13 2.3.1.2. Gliserofosfolipidlerin Hücre Fonksiyonundaki Rolleri.......... 15 2.3.1.3. 1-açil-sn-gliserol-3-fosfat açiltransferazlar (AGPAT)........... 16 2.3.2. Fosfat Grubu İçermeyen Lipidler........................................................ 18 2.3.2.1. Ornitin Lipidler....................................................................... 19 2.3.2.1.1 Ornitin Lipidlerin Kimyasal Yapısı......................... 20 2.3.2.1.2 Ornitin Lipidlerin Biyosentezi................................. 21 2.3.2.1.3. Ornitin Lipidlerin Üretimi...................................... 23 2.3.2.1.4. Ornitin Lipidlerin Biyolojik Aktiviteleri................ 24 2.4. Model Organizma Rhodobacter capsulatus................................................ 25 2.4.1. R. capsulatus ’da C-tipi Sitokromların Biyogenesizi........................ 28 2.4.2. R. capsulatus Sitokrom cbb3 Oksidaz ve Enzimin Biyogenesizi....... 31 2.4.3. R. capsulatus ’da Membran Polar Lipidleri....................................... 34 3. MATERYAL VE YÖNTEM............................................................................ 37 3.1. Materyal....................................................................................................... 37 3.1.1. Bakteri Soyları ve Plazmitler............................................................ 37 3.1.2. Kimyasallar ve Enzimler.................................................................. 37 3.2. Yöntem........................................................................................................ 46 3.2.1. Bakteri Soylarının Üreme Koşulları............................................... 46 3.2.2. Standart DNA Manipulasyonları...................................................... 46 3.2.3. DNA Dizi Analizi ve Biyoinformatik Analizler............................... 47 3.2.4. Gen İnaktivasyonu (İnterpozon Mutagenezi)................................... 47 3.2.5. Konjugasyon (Üçlü Eşleşme)........................................................... 55 3.2.6. Null ('Knock-out') Mutantların Eldesi.............................................. 55 3.2.7. Sitokrom c Oksidaz Aktivite Testi (Nadi Reaksiyonu).................... 57 3.2.8. İntrasitoplazmik Membran Vesiküllerinin (Kromotofor Membran) 5 7 Eldesi................................................................................................. 3.2.9. Hem Boyama ile C-Tipi Sitokromların Analizi................................ 58 3.2.10. RRC00138 Gen Ürününün Kontrollü İşleyişi................................. 59 iv 3.2.10.1. RRC00138 Geninin Klonlanması..................................... 59 3.2.10.2. RRC00138 Gen Ürününün E. coli ’deki İşleyişi.............. 62 3.2.10.3. RRC00138 Gen Ürününün R. capsulatus ’daki İşleyişi... 62 3.2.10.4. RRC00138 Protein İşlevselliğinin İmmunoblot 63 (Western blot) Analizi ile Gözlenmesi.............................. 3.2.11. Fenotip Tamamlama Testleri.......................................................... 65 3.2.12. In vitro GPAT+AGPAT Aktivite Testi.......................................... 65 3.2.13. [14C]-G3P ile İn vitro Koşullarda İşaretlenmiş Kromotofor 66 Membranından Lipid İzolasyonu ve Ayrışımı............................................ 3.2.14. Total Hücre Membran Lipidlerin İzolasyonu................................. 66 3.2.14.1. İn vivo Koşullarda [1-14C]asetat ile İşaretlenmiş 66 Hücrelerden Lipid İzolasyonu........................................ 3.2.14.2. Radyoaktif ile İşaretlenmemiş Hücrelerden Lipid 67 İzolasyonu...................................................................... 3.2.14.3. Lipid Ekstrakların İki Boyutlu İnce Tabaka 67 Kromotografisinde Ayrışımı ve Lipidlerin Gözlenmesi 3.2.15. Kütle Spektrometri Analizi ile OL ’in Tanımlanması.................... 68 3.2.16. “Pulse-chase” İşaretleme ve İmmunopresipitasyon........................ 69 4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI........................................................................... 71 4.1. MR2, IJ1 ve AYG4 Mutantlarındaki Mutasyon Taşıyan Gen(ler)in 71 Belirlenmesi............................................................................................ 4.2. Null (Knock-out) Mutant Eldesi ve Mutantların Fenotipik 72 Karakterizasyonu..................................................................................... 4.3. RRC00138 ve RRC00139 Genlerinin Dizi Analizi.................................... 76 4.4. RRC00138 ve RRC00139 Null Mutantlarının C-tipi Sitokrom Protein 78 Profili.......................................................................................................... 4.5. RRC00138 ve RRC00139 Null Mutantlarının Zengin Besi Ortamındaki 80 (MPYE) Sıcaklığa Bağlı Fenotipi.............................................................. 4.6. RRC00139, RRC00138 Geninin İşleyişinde Polar Etki Göstermez........... 82 4.7. RRC00138 Geninin E. coli plsC(Ts) Mutant Fenotipini Tamamlama 83 Yeteneği.................................................................................................. 4.8. RRC00138 Gen Ürününün R. capsulatus ’daki İşlevselliği....................... 86 4.9. RRC00138 Null Mutantında İn vitro GPAT+AGPAT Aktivite Testi....... 87 4.10. RRC00138 ve RRC00139 Aminoasit Dizilerinin Ornitin Lipid 88 Biyosentezini Katalizleyen Gen Ürünlerin Dizileri ile Homolojisi........ 4.11. RRC00138 ve RRC00139 Null Mutantlarının Membran Polar Lipid 91 Profili....................................................................................................... 4.12. R. capsulatus da OL Biyosentezi Fosfat Miktarıyla İlgili Değildir......... 97 4.13. R. capsulatus ve S. meliloti Türleri Arasında Heterolog Tamamlama 100 Testi......................................................................................................... 4.14. R. capsulatus OL ’in Kimyasal Yapısı.................................................... 102 4.15. OL ’in Yokluğunda Minimal Besi Ortamında (MedA) 35°C Sıcaklıkta 106 Sitokrom cy ’ın Üretimi ve Yıkımı.......................................................... 4.16. RRC00138 ve RRC00139 Mutantlarında Membran Protein Profili......... 108 5. TARTIŞMA....................................................................................................... 109 v 6. KAYNAKLAR.................................................................................................. 116 7. EKLER.............................................................................................................. 133 8. TEŞEKKÜR..................................................................................................... 139 9. ÖZGEÇMİŞ...................................................................................................... 141 vi SİMGELER DİZİNİ µ : mikro ∆ : delta aa : amino asit ACP : açil taşıyıcı protein AGPAT : 1-açil-sn-gliserol-3-fosfat açiltransferaz APS : amonyum per sülfat ATP : adenozin trifosfat bç : baz çifti CDP : sitidin difosfat CL : kardiyolipin CMP : sitidin monofosfat COG : ortolog gen sınıfı CPA : siklopropanoik asit Cpm : sayım/dakika CoA : koenzim A CTP : sitidin trifosfat (fosfatidat sitidilitransferaz) Da : dalton DAB : diaminobenzidin DAG : diaçilgliserol DMPD : N,N-dimetil-p-fenilen diamin DMPE : dimetilfosfatidilethanolamin dNTP : deoksinükleozit trifosfat ETZ : enerji transfer zinciri g : relatif santrifüj kuvveti (RCF) G3P : gliserol-3-fosfat GPAT : gliserol-3-fosfat açiltransferaz GTA : gen transfer ajanı Kbç : kilo baz çifti Kda : kilo dalton LPA : lisofosfatidik asit vii LPE : lisofosfatidiletanolamin LOL : liso ornitin lipid LPS : lipopolisakkarit MedA : minimal besi ortamı MPYE : zenginleştirilmiş besi ortamı MS : kütle spektrometri m/z : iyon ağırlığının birleşmiş atomik ağırlık ünitesine oranı Nadi : sitokrom c oksidaz aktivitesini gosteren bir boyama reaksiyonu (α-naftol+dimetilfenil diamin+O2→indofenol mavisi+ H2O) OL : ornitin lipid ORF : açık okuma bölgesi PA : fosfatidik asit PAGE : poliakrilamit jel elektroforezi PC : fosfatidilkolin PE : fosfatidiletanolamin Pfam : çok sayıda protein familyasını içeren data bankası PG : fosfatidilgliserol PGP : fosfatidilgliserol fosfat PlsC : 1-açil-sn-gliserol-3-fosfat açiltransferaz PPi : pirofosfat iyon PZR : polimeraz zincir reaksiyonu SDS : sodyum dodesil sülfat TEMED : N,N,N’,N’-tetra-metil-etilendiamin TLC : ince tabaka kromotografisi TMBZ : 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin Ts : sıcaklığa duyarlı v : hacim 2D : iki boyutlu viii ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1. R. capsulatus sitokrom cbb3 oksidaz mutantlarında c-tipi sitokrom 3 protein profili................................................................................... Şekil 1.2. Kromozomal DNA parçalarını taşıyan plazmitlerin fiziksel ve 5 genetik haritası................................................................................. Şekil 2.1. Hem kofaktörünün (demir protoporfirin IX) apositokromdaki 7 korunmuş hem bağlanma motifine (-Cys-Xaa-Yaa-Cys-His-) kovalent olarak bağlanması.............................................................. Şekil 2.2. Gliserofosfolipidlerin kimyasal yapısı............................................. 13 Şekil 2.3. Ornitin lipidlerin kimyasal yapısı.................................................... 21 Şekil 2.4. Sinorhizobium meliloti ’de ornitin lipid biyosentez yolu................. 22 Şekil 2.5. Rhodobacter capsulatus ’un elektron mikroskobik görüntüsü........ 26 Şekil 2.6. R. capsulatus ’da aerobik ve fotosentetik elektron transfer (ET) 27 yolları............................................................................................... Şekil 2.7. R. capsulatus ’da c-tipi sitokrom proteinlerinin biyogenesiz yolu.. 30 Şekil 2.8. R. capsulatus sitokrom cbb3 oksidaz enziminin biyogenesizinde 33 ccoGHIS gen ürünlerinin rollerini özetleyen model........................ Şekil 2.9. R. capsulatus ’da öngörülen gliserofosfolipid biyosentez yolu....... 36 Şekil 3.1. pHP45 omega plazmit haritası......................................................... 49 Şekil 3.2. pMRC2 türevi plazmitlerin fiziksel ve genetik haritası................... 50 Şekil 3.3. pMRC türevi plazmitlerin fiziksel ve genetik haritası..................... 53 Şekil 3.4. pSEM5 türevi plazmitlerin fiziksel ve genetik haritası.................... 54 Şekil 3.5. pBAD/Myc-HisA vektörü ve türevinin fiziksel ve genetik haritası. 61 Şekil 3.6. pSEM18 plazmitinin fiziksel ve genetik haritası............................. 63 Şekil 4.1. R. capsulatus RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının 75 sıcaklık ve besi yerine bağlı üreme fenotipleri................................ Şekil 4.2. R. capsulatus RRC00138 amino asit dizisinin diğer 77 organizmalardaki homologları ile karşılaştırılması........................ Şekil 4.3. R. capsulatus RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının c-tip 79 sitokrom protein profili.................................................................... Şekil 4.4. R. capsulatus RRC00138 null mutantının (SA4) 25 °C sıcaklıkta 82 MPYE veya MedA besiyerlerinde aerobik koşullarda üreyen hücrelerinden izole edilen intrasitoplazmik membran vesiküllerindeki c-tip sitokrom profili............................................ Şekil 4.5. R. capsulatus RRC00138 gen ürünün E. coli ’deki işleyişi ve E. 85 coli plsC ve plsB-plsX mutantlarının üreme fenotipini tamamlama yeteneği............................................................................................ Şekil 4.6. R. capsulatus RRC00138 gen ürünün R. capsulatus ’daki 86 işleyişinin immunoblot tekniği ile analizi........................................ Şekil 4.7. R. capsulatus yaban soy ve RRC00138 null mutantının in vitro 87 koşullardaki GPAT+AGPAT aktivite testi...................................... Şekil 4.8. R. capsulatus RRC00138 ’in amino asit dizisi ile S. meliloti OlsA 89 ’in amino asit dizisinin karşılaştırılması.......................................... Şekil 4.9. R. capsulatus RRC00139 ’in amino asit dizisi ile S. meliloti OlsB 90 ’in amino asit dizisinin karşılaştırılması.......................................... Şekil 4.10. S. meliloti yaban soy ve OlsB mutantının membran lipid profili….. 91 ix Şekil 4.11. R. capsulatus yaban soy, RRC00138 ve RRC00139 null 93 mutantlarında serbest amino grubuna sahip lipidlerin ninhidrin boyama ile tanımlanması………………......................................... Şekil 4.12. Minimal MedA besi yerinde [14C]-asetat varlığında üreyen R. 94 capsulatus yaban soy, RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının membran polar lipid profili....................................... Şekil 4.13. Zenginleştirilmiş MPYE besi yerinde [14C]-asetat varlığında 95 üreyen R. capsulatus yaban soy, RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının membran lipid profili................................................. Şekil 4.14. 25°C sıcaklıkta MPYE besi yerinde üreyen RRC00138 null 97 mutantının membran polar lipid profili............................................ Şekil 4.15. Farklı fosfat konsantrasyonları içeren besi ortamlarında üreyen R. 99 capsulatus yaban soyunun hücresel lipid profili.............................. Şekil 4.16. R. capsulatus ve S. meliloti türleri arasında heterolog tamamlama 101 testleri ve transkonjugantların polar lipid profili......................... Şekil 4.17. R. capsulatus ve S. meliloti bakterilerindeki OL ’in kütle 103 spektrometre tekniği ile analizi........................................................ Şekil 4.18. S. meliloti ve R. capsulatus türlerinde bulunan OL ’in kimyasal 105 yapısı................................................................................................ Şekil 4.19. 35°C sıcaklıkta minimal MedA besi yerinde üreyen OL ’den 107 yoksun mutantta gözlenen sitokrom cy proteinin üretimi ve yıkımı............................................................................................... Şekil 4.20. Yaban soy ve OL ’den yoksun mutantın membran protein 108 profilinin SDS-PAGE ile karşılaştırılması...................................... x ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan bakteri soyları, plazmitler ve elde edilen 38 rekombinant plazmit ve null mutantları........................................... Çizelge 4.1. Delesyon-insersiyon alleli taşıyan rekombinant plazmitlerin MR2, 73 IJ1 ve AYG4-25 mutantların Nadi fenotiplerini tamamlama yetenekleri........................................................................................ Çizelge 4.2. R. capsulatus null mutantlarının farklı besi ortamlarında 74 mikroaerofilik ve anaerobik fotosentetik koşullar altında üreme özellikleri ve Nadi reaksiyonunu katalizleme yetenekleri................ Çizelge 4.3. RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının farklı sıcaklık ve besi 81 ortamlarında fotosentetik üreme özellikleri ve Nadi fenotipleri...... Çizelge 4.4. MedA besi yerinde üretilmiş R. capsulatus yaban soy, RRC00138 96 ve RRC00139 null mutantlarının ve transkonjugantların membran polar lipid kompozisyonu................................................................. 1. GİRİŞ Biyolojik membranlar, kovalent olmayan etkileşimler ile birarada tutunan yüzlerce farklı protein moleküllerinden ve ince lipid tabakasından oluşur. Sitokromlar; fotosentez, aerobik ve anaerobik solunum yollarında önemli işlevleri olan proteinlerdir. Bu proteinlerden c-tipi sitokromlar, hem prostetik grubunun bu proteinlere kovalent olarak bağlı olmasıyla diğer sitokromlardan ayrılırlar (Pettigrew ve Moore, 1987). C-tipi sitokromlar küçük, periplazmik veya membrana bağlı proteinlerdir. Bu proteinler ayrıca elektron transfer zincirinde yer alan sitokrom bc1 ve sitokrom c oksidaz gibi pek çok alt birimden oluşmuş protein komplekslerinin alt birimlerini oluştururlar. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda, sitokrom c proteinlerinin mitokondriden salındıklarında ökaryotlardaki programlı hücre ölümünü (apoptoz) uyardıkları da belirlenmiştir (Martinou ve ark., 2000; Jiang ve Wang, 2004). C-tipi sitokromlar; kofaktörün proteine yerleşimi, protein katlanması ve membrana transferi gibi çalışmalarda model olarak kullanılırlar. Fotosentetik fakültatif fototrof Rhodobacter capsulatus yüksek ve düşük oksijen konsantrasyonlarında aktif hale geçebilen tek tip sitokrom c oksidaz (sitokrom cbb3 oksidaz) enzimi içerir. Membrana bağlı c-tipi sitokrom proteinlerini içeren kompleks bir yapıya sahip olan bu enzimin biyogenesizine yönelik sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Önceki çalışmalarda (Koch ve ark., 1998; 2000) kimyasal (EMS, Etil methane sülfanat) mutagenezden sonra elde edilen mutant populasyondan sonra oksidaz aktivitesi göstermeyen (Nadi−) mutanlar izole edildi ve mutasyonların bir kısmının enzimin yapısal genlerini kodlayan ccoNOQP operonunda, diğer bir kısmının ise operonun hemen üst tarafında yer alan ccoGHIS genlerinde yer aldıkları genetik tamamlama testleri ile tespit edildi. Bu mutantlara ek olarak, ccoNOQP genleri bakımından haploid (MT1131) ve diploid (MT1131/pOX15) soylarından elde edilen MR2, IJ1 (Koch ve ark., 1998) ve AYG4 (Aygün, 1999) isimli Nadi− mutantlar ise ccoNOQP ve ccoGHIS genleri ile yaban soy fenotipine tamamlanmadı. Diğer yandan bu mutantlar diğer sitokrom oksidaz mutantlarından farklı olarak besi yerine bağlı farklı fotosentetik (F) üreme fenotipi gösterdi. Buna göre, mutantlar minimal (MedA) besi yerinde Nadi−/F+, zenginleştirilmiş (MPYE) besiyerinde ise Nadi−/F− fenotipi 2 gösterir.MPYE besi yerinde aerobik koşullarda üreyen mutantların intrasitoplazmik membran vesiküllerindeki (kromotofor) membrana bağlı ve çözünür kısımda ise periplazmik c-tipi sitokrom proteinlerin varlığı TMBZ/SDS-PAGE tekniği ile incelendi (Koch ve ark., 1998; Aygün, 1999). Mutantların kromotofor membranları incelendiğinde her üçünün de sadece sitokrom bc1 kompleksinin c-tipi alt birimi olan sitokrom c1 proteinini içerdikleri görüldü (Şekil 1.1A). Buna karşılık, mutantlar solunum zincirinde sitokrom bc1 kompleksi ile sitokrom cbb3 oksidaz enzimi arasında elektron taşıyıcısı olarak görev yapan sitokrom cy proteinini içermezler. Yine sitokrom cbb3 oksidazın c-tipi sitokrom proteinleri (sitokrom cp ve sitokrom co) MR2 ve IJ1 mutantlarında gözlenmezken, AYG mutantı taşıdığı ccoNOQP genleri sayesinde yaban soya kıyasla az miktarda olmakla beraber sitokrom co proteinini ürettiği gözlendi (Şekil 1.1, 2.-4. kuyular). Mutantların çözünür formdaki periplazmik sitokrom c2 proteinin varlığı incelendiğinde ise her üç mutantta bu proteinin sentezlenmediği görüldü (Şekil 1.1B, 2-4. kuyular). Diğer yandan, GK32 (Koch ve ark., 1998) ve CW1 (Koch ve ark., 2000) gibi yapısal ve biyogenesiz oksidaz mutantlarında ise, sitokrom cp ve sitokrom co proteinleri haricinde diğer sitokrom c proteinlerinin yaban soy oranında üretildiği gözlendi (Şekil 1.1A ve 1.1B 5.-6. kuyular). Elde edilen bu bulgular, MR2, IJ1 ve AYG4 mutantlarında sadece sitokrom cbb3 oksidaz aktivitesinin etkilenmediğini, aynı zamanda c-tipi sitokromların biyogenesizinin de etkilendiğini gösterdi. Mutantlar bu özellikleri ile literatürde yayınlanmış oksidaz mutantlarından farklılık gösterir. Diğer yandan MR2 ve IJ1 mutantlarındaki c-tipi sitokromların yokluğunun transkripsiyonel-translasyonel ya da sekresyonal bir hatadan kaynaklanıp kaynaklanmadığı da test edildi (Aygun-Sunar ve ark., 2006). Bu amaçla ccoN::lacZ, cycY::lacZ ve cycY::phoA füzyonlarını taşıyan plazmitler mutantlara aktarılmış ve elde edilen transkonjugantların β-galaktosidaz ve alkalin fosfataz aktiviteleri incelendi. MPYE besiyerinde solunumla üretilmiş transkonjugantların β-galaktosidaz ve alkalin fosfataz aktiviteleri incelendiğinde, mutantların yaban soy oranında enzim aktivitelerine sahip oldukları görüldü. Bu da, c-tipi sitokromların yokluğunun, transkripsiyonel, translasyonel veya sekresyonal bir hatadan kaynaklanmadığını gösterdi. 3 Zenginleştirilmiş MPYE besi ortamı A Ys IJ1 MR2 AYG4 GK32 CW1 kDa 32 cp 31 c1 29 cy 28 co 1 2 3 4 5 6 B c’ c2 M 1 2 3 4 5 6 Şekil 1.1. R. capsulatus sitokrom cbb3 oksidaz mutantlarında c-tipi sitokrom protein profili. Zenginleştirilmiş MPYE besi yerinde aerobik koşullarda üreyen oksidaz mutantlarının membrana bağlı (A) ve çözünür formdaki (B) c-tip sitokrom protein profilleri gösterilmiştir. İntrasitoplazmik membran vesikülleri veya çözünür kısım %16.5 ’luk Trisin-SDS-PAGE ’de (Schägger ve von Jagow, 1987) ayrıştırıldı ve peroksidaz aktivitesine sahip c-tipi sitokrom proteinlerini gözlemek için jel, TMBZ (3’3, 5’ 5- tetrametilbenzidin) ile boyandı (Thomas ve ark., 1976). cp ve co, sitokrom cbb3 oksidazın alt birimleri; c1, sitokrom bc1 kompleksinin alt birimi; cy, membrana bağlı elektron taşıyıcı protein; c2, periplazmik elektron taşıyıcı protein, Ys, R. capsulatus yaban soyu (MT1131), GK32 (∆ccoNO::kan, Koch ve ark., 1998) ve CW1 (∆ccoGHIS::spe, Koch ve ark., 2000) sitokrom cbb3 oksidazın yapısal ve biyogenesiz mutantları, (B) de M isimli kuyuya sitokrom c markır olarak yüklenmiştir. 4 Üreme fenotipi, c-tipi sitokrom profili ve genetik tamamlanma özellikleri ile diğer oksidaz mutantlarından farklılık gösteren bu mutantların Nadi fenotipinden sorumlu gen(ler)i taşıyan DNA parçası araştırıldı. Bu amaçla, farklı R. capsulatus kromozomal kütüphaneleri mutant bakterilere aktarıldı ve transkonjugantlar arasından Nadi+ fenotipini kazananlar seçildi. Her üç mutantın da oksidaz fenotipini yaban soy oranında tamamlayabilen pMRC plazmiti (Koch ve ark., 1998) ve sadece MR2/AYG4-25 mutantlarını tamamlayabilen pMRB (Koch ve ark., 1998) ve pAY1 (Aygün, 1999) plazmitleri izole edildi (Şekil 1.2). Restriksiyon endonükleaz ile kesimler yapıldı ve analizler pMRC plazmitinin 5.9 kbç uzunluğunda EcoRI kromozomal DNA parçasını; pMRB/pAY1 plazmitlerinin ise 7 kbç uzunluğunda BamHI kromozomal DNA parçasını taşıdıklarını gösterdi. Daha sonra izole edilen kromozomal DNA parçalarının 5′ ve 3′ uçlarının dizi analizi yapıldı ve bu diziler R. capsulatus genom dizileriyle (http://ergo.integratedgenomics.com) karşılaştırıldı. Buna göre pMRC plazmitinin iki adet yarım [RRC00132 (ilvD; dihidroksi asit dehidrataz) ve RRC00143 (proA, gamma glutamil fosfat redüktaz-GPR)] ve yedi adet tam protein kodlayıcı bölge (ORF) [RRC00133 (exoD; ekzopolisakkarit sentez proteini), RRC00135, RRC00136, RRC00138 (plsC; 1-açil-sn-gliserol-3-fosfat açiltransferaz-AGPAT), RRC00139, RRC00140 ve RRC00142] içerdiği belirlendi. Diğer yandan, pMRB/pAY1 klonlarının 5′ ucunda bulunan genlerin de, pMRC plazmitindeki genlerin bir bölümü ile örtüştüğü görüldü. Yapılan genetik tamamlama testleri ve dizi analizleri sonunda, pMRB/pAY1 plazmitleri üzerinde yer alan genler tarafından Nadi fenotipi tamamlanan MR2 ve AYG4-25 mutantlarının, IJ1 mutantından farklı olabileceğini gösterdi (Aygün, 1999). Bu tez çalışmasında, sitokrom cbb3 oksidaz aktivitesinden yoksun ve farklı c-tipi sitokromları üretemeyen MR2, IJ1 ve AYG4 mutantlarının detaylı genetik ve biyokimyasal analizleri yapılarak, mutantların fenotipinden sorumlu henüz tanımlanmamış gen(ler)in belirlenmesi ve fonksiyonlarının aydınlatılması amaçlandı. Şekil 1.2. Kromozomal DNA parçalarını taşıyan plazmitlerin fiziksel ve genetik haritası. Farklı büyüklükteki kromozomal DNA parçalarını taşıyan pAY1 (Aygün, 1999), pMRB, pMRC ve pMRC2 (Koch ve ark., 1998) plazmitlerinin IJ1 ve MR2/AYG4-25 mutantlarının sitokrom c oksidaz aktivitelerini (Nadi fenotipi) tamamlama özellikleri sağ tarafta gösterilmiştir. BamHI (Ba) ve EcoRI (E) restriksiyon endonükleazları gösterilmiştir. 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Sitokromlar Sitokromlar, prostetik grup olarak bir veya birden fazla hem molekülü içeren elektron taşıyıcı proteinlerdir. Hem prostetik grubu, merkezde demir atomu ile çevrelenmiş protoporfirin halkasından oluşur. Demir atomu, oksidasyon ve redüksiyon tepkimelerinde Fe+3 ve Fe+2 arasında değiştiğinden, hem molekülü elektron transfer sistemlerinde redoks aktif elektron vericisi ve alıcısı olarak görev yapar. Bu sistemler, elektrokimyasal proton gradientini oluşturan protonların membranın diğer tarafına geçişlerinde kullanılır. Proton gradienti daha sonra membrana bağlı H+-ATPaz (ATP sentez) enzimi tarafından, adenozin difosfat (ADP) ’ın γ-fosforilasyonu ile adenozin trifosfat (ATP) ’ın sentezinde kullanılır. Birçok hücrede ATP oksidatif fosforilasyon veya fotofosforilasyon yoluyla sentezlenir. ATP, biyosentez, taşıma, signal transferi, kemotaksis ve fototaksis gibi çok sayıda enerji gerektiren hücresel süreçlerde kullanılır (Lemberg ve Barrett, 1973). Sitokromlar, membrana bağlı veya hareketli çözünür elektron taşıyıcıları ya da redoks aktif enzim komplekslerinin bir parçası olarak görev yaparlar. Prokaryotlarda, sitokromlar sitoplazmik membranın dışında; ökaryotlarda ise, mitokondri ya da kloroplastlarda yer alırlar. Bu proteinler gerek prokaryotik gerekse ökaryotik organizmalarda aerobik ve anaerobik solunum ve/veya fotosentezde görev alırlar (Lemberg ve Barrett, 1973). Sitokromlar, içerdikleri prostetik grubundaki hem molekülünün tipine göre sınıflandırılır. Buna göre, sitokrom a, sitokrom d ve sitokrom o proteinleri sırasıyla hem A, hem D ve hem O içerirken, sitokrom b ve sitokrom c proteinleri ise hem B içerir. 2.1.1. C-Tipi Sitokromlar C-tipi sitokromlar, apoproteinin evrim boyunca korunmuş (-Cys-Xaa-Yaa-Cys- His-) motifinde yer alan sistein (Cys) amino asitine kovalent olarak bağlı bir veya daha fazla hem grubu (protohem IX, hem b) içeren elektron transfer proteinleridir (Şekil 2.1). 7 Hem molekülünün vinil yan zincirleri ile proteinin sistein amino asitleri arasındaki tiyoeter bağları kovalent olarak bağlıdır ve bu bağlar stero-özgündür (Moore ve Pettigrew, 1990). Apoprotein ve hem molekülü sitoplazmada sentezlenir ve bu iki bileşen birbirinden bağımsız olarak membrandan periplazmaya geçerler. Daha sonra bu bileşenler sitokrom c biyogenesiz proteinleri aracılığıyla kovalentli bağlanarak işlevsel c-tipi sitokromlar oluşur. Şekil 2.1. Hem kofaktörünün (demir protoporfirin IX) apositokromdaki korunmuş hem bağlanma motifine (-Cys-Xaa-Yaa-Cys-His-) kovalent olarak bağlanması. Hem molekülünün vinil yan zincileri (vinil-2 ve vinil-4) ile apositokromdaki sistein (Cys) amino asitleri arasındaki tiyoeter bağları kovalent ve stero-özgündür. Histidin (His) amino asiti, hem molekülüne beşinci aksiyal bağ (yeşil renkte kesikli çizgi) ile bağlanır (A) ve (B). Hem molekülünde demir, kavuniçi; pirol nitrojen halkası ise mavi renkte gösterilmiştir (http://chemistry.jcu.edu/dmascotti/images/heme.gif ve S. Turkarslan ’dan temin edilmiştir). C-tipi sitokromlar genellikle membranın p-tarafında (pozitif yüklü) yer alırlar. Prokaryotlarda c-tipi sitokromlar hücresel yerleşimlerine göre ayrılırlar. Buna göre ya periplazmada çözünür formda ya da sitoplazmik membrana yerleştiklerinde periplazmaya doğru yönelmiş yani membrana bağlı olarak bulunurlar. Gram-negatif bakterilerde çözünür ya da membrana bağlı olarak periplazmada; gram-pozitif bakterilerde ise hidrofobik bağlar veya kovalent olmayan protein-protein etkileşim yoluyla sitoplazmik membranın dış tarafında yer alırlar. Çok nadir olarak, sitokrom c proteinleri gram-negatif bakterinin dış membranında da bulunmaktadır (Myers ve Myers, 1992). Ökaryotik organizmalarda ise mitokondri membran arası boşluğunda ve 8 kloroplast tilakoid membran lümeninde yer alırlar. C-tipi sitokromlar, ATP üretimi için gerekli fotosentetik ve solunum enerji transdüksiyon kompleksleri arasında elektron transferi gibi farklı hücresel süreçlerin elzem molekülleri olarak işlev yaptıklarından bakterilerin farklı üreme koşulları için oldukça önemlidir. 2.1.1.1. C-tipi Sitokromların Biyogenesizi C-tipi sitokromların biyogenesizi ya da in vivo c-tipi sitokrom proteinlerin olgunlaşması, posttranslasyonal yani protein sentez sonrası süreçleri kapsar. Buna göre, kovalent hem bağının oluşumu, sitokrom polipeptidin (apoprotein) membrana transferinden sonra sitokrom c proteinin tümden katlanması (holositokrom c) gibi süreçler için biyogenesiz yani olgunlaşma terimleri kullanılmaktadır. Gram-negatif bakteriler apositokrom c ve hem molekülünü sitoplazmada sentezler ancak doğal holositokrom c ’lerin katlanması için gerekli hem ligasyon formasyonunu periplazmada oluştururlar. Böylece c-tipi sitokromların olgunlaşması, posttranslasyonal protein modifikasyonlarının anlaşılmasına yönelik çalışmalar için iyi bir örnek teşkil eder. Bakterilerde yapılan genetik çalışmalar sonunda c-tipi sitokromların olgunlaşma sürecinde birçok bileşenin yer aldığı ve bu sürecin organizmadan organizmaya farklılık gösterdiği belirlendi (Kranz ve ark., 1998). Örneğin, özgün üreme koşullarında sadece az sayıda c-tipi sitokrom içeren Escherichia coli gibi gram-negatif bakterilerde bile, posttranslasyonal süreçler çok bileşenli birden fazla yol içerir (Crooke ve Cole, 1995; Eaves ve ark., 1998). Bugüne kadar prokaryotik ve ökaryotik organizmalarda holositokrom c formasyonunda üç farklı posttranslasyonal sürece rastlanılmış ve bu süreçler sistem-1 (Ccm), sistem-2 ve sistem-3 olarak adlandırılmıştır (Kranz ve ark., 1998; Page ve ark., 1998). Buna göre, bitki ve protozoal mitokondri, arkea, birçok gram-negatif bakteri sistem-1 olarak adlandırılan biyogenesiz sürecini kullanırlar. Sistem-2 δ-, ε- ve bazı β-proteobakterilerde, arkealarda, birçok gram-pozitif bakteri, bitki, siyanobakteriler ve alglerde bulunur. Sistem-3 ise mantar, vertebrate ve invertebrate mitokondrilerinde bulunur (Bernard ve ark., 2003). Bu farklı biyogenesiz sistemlerinden sistem-3 membran arası boşluğunda yer alan sitokrom c hem liyaz (CCHL) olarak isimlendirilen en az iki enzim tarafından sitokrom c biyogenesizini 9 gerçekleştiren en küçük komplekstir (Zollner ve ark., 1992). Buna karşılık sistem-1 ve sistem-2 daha kompleks olup, hem b ’nin apositokroma bağlanmasını düzenleyen çok sayıda bileşene gereksinim duyar. Bazı organizmalarda birden fazla farklı biyogenesiz süreçleri de yer almaktadır. Örneğin, β-proteobakterilerden Bordetella bronchispetica ve B. parapertussis ve gram-pozitif bakterilerden Desulfitobacterium hafniense genomlarında sistem-1 ve sistem-2 ’ye ait genler bulunmuştur (Stevens ve ark., 2004). E. coli, R. capsulatus ve Bradyrhizobium japonicum gibi gram-negatif model bakterilerinde c-tipi sitokromlar, özgün olgunlaşma bileşenleri ve sitoplazma dışındaki tiyoredüksiyon ve tiyooksidasyon yollarını kapsayan posttranslasyonal süreçler (Ccm- sistem 1) aracılığıyla üretilir (Porat ve ark., 2004; Turkarslan ve ark., 2006). Ccm- sistem 1, ccmABCDEFGHI ve ccdA olarak tanımlanmış en az on genden oluşur. Bu genler, membran proteinlerini ve periplazmik çözünür proteinleri kodlarlar. Bu proteinlerin bir kısmı, c-tipi apositokromların sitoplazmik membrana geçişlerinden sonra şaperon görevi yaparlar. Diğer proteinler ise, periplazmadaki hem kofaktörlerinin dağıtılmasında ve hem molekülünün kovalent ve stero-özgünlüğü ile apositokroma bağlanmasında görev alır (Kranz ve ark., 1998; Page ve ark., 1998; Thöny-Meyer, 2002; Allen ve ark., 2003). 2.2. Solunum Oksidazları Solunum oksidazları, mitokondri ve aerobik bakterilerin oksijenli solunumun elektron taşıma zincirinde son elektron alıcısı olarak yer alan ve moleküler oksijenin suya dönüşüm reaksiyonunu katalizleyen çok alt birimli membran bileşenleri olup, demir-bakır oksidazlar alt grubunun bir üyesidirler. Solunum oksidazları, oksijenin suya indirgendiği hem ve bakır atomlarını içeren bimetalik aktif bölgeye sahiptir (Garcia- Horsman ve ark., 1994a; Richter ve Ludwig, 2003). Solunum oksidazların büyük bir çoğunluğunda substrat, oksijen eğilimleri, hem tipleri ve metal kompozisyonlarında farklılıklar gözlenir. Bu enzimler elektron vericisi olarak hidrokinon veya sitokrom c kullanmalarına bağlı olarak kinol (QH2) oksidaz ve sitokrom c oksidaz olarak adlandırılmış olan iki alt familyaya ayrılırlar. Bu iki oksidaz arasındaki en önemli fark, sitokrom c oksidazın ikinci alt biriminin hidrofilik bölgesinde binüklear bakır 10 merkezinin (CuA) bulunması, diğer yandan QH2 oksidazda ise CuA ’nın bulunmamasıdır. Sitokrom c oksidazın bir alt sınıfı olan aa3-tip oksidaz mitokondri ve kloroplastta bulunurken (Saraste, 1990), cbb3-tip oksidaz ise proteobakteriler ve Cytophaga, Flexibacter ve Bacteroides ’de bulunur (Pitcher ve Watmough, 2004; Cosseau ve Batut, 2004). Bazı aerobik bakteriyel türlerde değişik fizyolojik koşullarda aktif hale geçebilen birden fazla farklı oksidaz tipi bulunur. Bu özellik, bakterilerin hücre yaşam döngüsü boyunca değişen çevresel oksijen konsantrasyonlarına uyumunu sağlar. Örneğin, E. coli iki farklı tipte kinol oksidaz enzimi (sitokrom bo3 ve sitokrom bd) içerirken (Anraku ve Gennis, 1987), Paracoccus denitrificans ise üç farklı oksidaz enzimine (aa3- ve cbb3-tip sitokrom c oksidaz ve bb3-tip kinol oksidaz) sahiptir (de Gier ve ark., 1996). Yine, yüksek oksijen içeren ortamlarda üreyen R. sphaeroides hücrelerinin membranlarında aa3-tip oksidaz enzimi sentezlenirken (Shapleigh ve ark., 1992), mikroaerobik ve anaerobik koşullarda ise cbb3-tip oksidaz enzimi sentezlenir (Garcia-Horsman ve ark., 1994b). Solunum oksidazların I. alt biriminde bulunan hem ve bakır atomundan oluşan özgün binüklear merkez oldukça korunmuştur (Saraste, 1990; Pereira ve ark., 2001). Herbir oksidaz, I. alt biriminde A-, O- ve B-tip gibi farklı hem kofaktörü içerir. Mitokondriyel oksidazlarda sadece hem A bulunmasına karşılık, bakteriyel oksidazlarda A, O veya B-tip hem grupları bulunur (Calhoun ve ark., 1994). I. alt birim iki hem molekülü içerir. Bunlardan biri kimyasal ve spektroskobik özelliklerinden dolayı yüksek devirli hem (örneğin, hem a3 veya hem b3) olarak isimlendirilir. Bu hem molekülü beş- bağa sahiptir ve bakır atomu (CuB) ile birlikte oksijen bağlanma bölgesini oluşturur. İkinci hem molekülü ise altı-bağa sahiptir ve düşük devirli hem olarak isimlendirilir. Oksidaz enzimleri, sitokrom c veya kinoldan gelen elektronları I. alt birimindeki binüklear merkeze iletir. Sitokrom c oksidaz ve kinol oksidaz enzimleri arasındaki yapısal farklılıklar II. alt biriminde gözlenir. Sitokrom c oksidazın II. alt birimi sitokrom c bağlanma bölgesi ve redoks aktif binüklear bakır merkezi (CuA) içerirken, kinol oksidazlar ise aktif CuA merkezi içermez (Fukaya ve ark., 1993; Lauraeus ve ark., 1991; Matsushita ve ark., 1990; Minghetti ve ark., 1992). 11 2.2.1. Sitokrom cbb3 Oksidaz Enzimi Sitokrom cbb3 oksidaz enzimi, hem-CuB binüklear merkezinde hidroksietil farnesil yan zincirinden yoksun hem B molekülü içermesiyle hem O veya hem A içeren diğer solunum oksidazlarından ayrılır (Wu ve ark., 1992). Ancak bu yan zincirinin oksidaz enziminin fonksiyonu için gerekli olmadığı yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Gray ve ark., 1994; Garcia-Horsman ve ark., 1994b; Wang ve ark., 1995). Cbb3 oksidaz enzimi substrat olarak sitokrom c ’yi kullanır ve diğer oksidazlardan farklı olarak CuA-içeren alt birimin yerine membrana bağlı c-tipi sitokrom alt birimleri (sitokrom cp ve sitokrom co) içerir (Gray ve ark., 1994; Garcia-Horsman ve ark., 1994b). cbb3-tip sitokrom c oksidaz yüksek oksijen konsantrasyonlarına karşı eğilim gösterdiğinden patojenik ve patojenik olmayan bakterilerde mikroaerobik koşullar altında solunumla üremeyi desteklemektedir (Pitcher ve ark., 2002). Sitokrom cbb3 oksidaz enzimi P. denitrificans (de Gier ve ark., 1996), R. sphaeroides (Garcia- Horsman ve ark., 1994b), R. capsulatus (Gray ve ark., 1994), Bradyrhizobium japonicum (Preisig ve ark., 1996) ve Pseudomonas stutzeri (Urbani ve ark., 2001) gibi bazı proteobakter türleri, Cytophaga, Flexibacter ve Bacteroides ’lerde bulunmaktadır (Pitcher ve Watmough, 2004; Cosseau ve Batut, 2004). 2.3. Membran Lipidleri Membran lipidleri, lipid çift tabakasını oluşturan amfipatik moleküller olup, kovalent olmayan etkileşimler ile stabilize olurlar. Hücre membranlarındaki lipidlerin dinamikliği, membran proteinlerin fonksiyonunu da etkilemektedir. Lipid çift tabakası asimetrik olup, tabakanın her bir yarısının lipid kompozisyonu diğer yarısından farklıdır. Bakteriden insana kadar tüm organizmaların membranları değişik lipid kompozisyonlarına sahiptir ve genelde yaygın olan membran lipidleri; gliserofosfolipidlerdir. Çoğu bakteri türünde lipid çift tabakası genellikle fosfatidilgliserol (PG), fosfatidiletanolamin (PE) ve kardiyolipin (difosfatidilgliserol, CL) ’den oluşur. Bu lipidlere ek olarak, bakteriyel membranlarda bazıları daha fazla, bazıları ise daha az miktarda ama oldukça çeşitlenmiş lipidler de yer almaktadır. Bu tür 12 lipidler grubunda, PE ’nin metillenmiş türevleri [monometilfosfatidiletanolamin (MMPE), dimetilfosfatidiletanolamin (DMPE)] ve fosfatidilkolin (PC) yer alır. Oldukça seyrek bulunan diğer gliseofosfolipidler ise fosfatidilserin (PS) ve fosfatidilinositol (PI) ’dir. Fosfor içeren lipidlerden başka, birçok bakterinin membranları genellikle amino asit türevi olan ve fosfat grubu taşımayan lipidler de içerir. Belirli büyüme koşulları altında gözlenebilen bu tür lipidler; hopanoidler, glikolipidler, sülfür içeren lipid (sülfokuinovosil diaçilgliserol, SL), betain lipid (diaçilgliseril N,N,N trimetilhomoserin, DGTS) ve ornitin amino asiti türevi lipidler (ornitin lipid, OL) olarak rapor edilmişlerdir (Lopez-Lara ve ark., 2003; Sohlenkamp ve ark., 2003). 2.3.1. Gliserofosfolipidler Gliserofosfolipidler, hidrofilik (suyu seven) polar baş kısım ve hidrofobik (suyu sevmeyen) kuyruk kısmından meydana gelir. Hidrofilik polar baş kısmı, bir ya da daha fazla fosfat grubunu; hidrofobik kuyruk kısmı ise gliserol molekülüne bağlı iki yağ asiti zincirinden oluşur (Şekil 2.2). Birçok gliserofosfolipid molekülleri suda yer aldıkları zaman, hidrofilik kısımları su ile temas ederken, hidrofobik uçları ise birlikte yapışmaya zorlanır ve böylece lipid çift tabakası oluşur. Yağ asitlerinin doygunluğu ve uzunluğu da gliserofosfolipid moleküllerinin membran çift tabakasındaki paketlenme yeteneğini ve membranın akışkanlığını etkiler (Goldfine, 1984). 13 Şekil 2.2. Gliserofosfolipidlerin kimyasal yapısı. Gliserolün iki alkol grubunun birer yağ asidi ve diğer alkol grubunun ise bir fosforik asit ile esterleşmesiyle gliserofosfolipidler oluşur. 2.3.1.1. Gliserofosfolipidlerin Biyosentezi Membran gliserofosfolipidlerin biyosentez ve fonksiyonları hakkındaki bilgiler, lipid biyokimyası ve moleküler genetik çalışmalar için elverişli E. coli ’de yapılan çalışmalar sonucunda elde edildi. E. coli ’de bulunan gliserofosfolipidler PE, PG ve CL ’dir. Buna karşılık, PC, PI veya sfingomiyelin bulunmaz (Raetz, 1986; Cronan ve Rock, 1996). E. coli, membran iç katmanında %40 oranında gliserofosfolipid içerir iken, membran dış katmanında ise yaklaşık %25 oranında gliserofosfolipid içerir (DiRusso ve ark., 1999). E. coli ’de gliserofosfolipidler genellikle sn-1 pozisyonunda doymuş açil zinciri (C16:0) ve sn-2 pozisyonunda ise doymamış yağ asiti zincirlerini (C16:1 veya C18:1) içerirler (Cronan ve Rock, 1996). Gliserofosfolipidlerin biyosentez yolu ilk kez Kennedy ve arkadaşları tarafından açıklandı (Kanfer ve Kennedy, 1964). Gliserofosfolipidlerin de novo biyosentezinin ilk basamağı, iç membranın sitoplazmik kısmında gliserol-3-fosfat (G3P) ve yağ asiti substratlarının kullanımıyla gerçekleşir (Cronan ve Rock, 1996). 14 Buna göre peş peşe gerçekleşen iki açiltransferaz reaksiyonu açil grubunu açil vericisinden G3P ’a transfer eder. E. coli açil vericisi olarak hem açil-açil taşıyıcı proteini (ACP) hem de açil-koenzim A (CoA) ’yı kullanabilir (Ailhaud ve Vagelos, 1966; Van den Bosch ve Vagelos, 1970; Goldfine ve Ailhaud, 1971). Buna karşılık, R. sphaeroides (Lueking ve Goldfine, 1975) ve Clostridum butyricum (Goldfine ve ark., 1967; Goldfine ve Ailhaud, 1971) gibi bazı bakteriler ise açil vericisi olarak sadece açil- ACP ’yi kullanmaktadırlar. İlk açiltransferaz reaksiyonu sn-G3P açiltransferaz enzimi (GPAT, PlsB [E.C.2.3.1.15]) tarafından katalizlenir. GPAT enzimi, açil zincirini sn-1 pozisyonundaki sn-G3P ’a transfer ederek 1-açil-sn-G3P (lisofosfatidik asit, LPA) ’un oluşumunu sağlar (Rock ve ark., 1981). Biyosentez yolunun ikinci basamağı ise 1-açil- sn-G3P açiltransferaz (AGPAT, PlsC [E.C.2.3.1.51]) tarafından gerçekleşir. AGPAT enzimi, GPAT tarafından katalizlenen birinci basamağa benzer şekilde görev alır (Kessels ve ark., 1983) ve açil zincirini sn-2 pozisyonundaki LPA ’ya transfer ederek, 1,2-diaçil-sn-G3P (fosfatidik asit, PA) ara ürününün oluşumunu sağlar (Coleman, 1990; 1992). PA daha sonra CdsA enzimi tarafından aktif CDP-diaçilgliserol (DAG) ara ürününe dönüşür. PA, CTP (fosfatidat sitidilitranferaz) ’nin alfa fosforil grubuna hücum ederek, CDP-DAG ve PPi oluşur. CDP-DAG ise daha sonra PE veya PG ve CL ’in sentezinde kullanılır. PE sentez yolundaki ilk enzim fosfatidilserin (PS) sentaz (pssA gen ürünü); ikinci enzim ise PS dekarboksilaz enzimi (Psd) ’dir. Buna göre, PS sentaz enzimi CDP ’yi serine dönüştürerek PS ’nin oluşumunu; Psd enzimi ise zwitterionik PE ’nin üretimini sağlar. PG ve CL oluşumunu sağlayan gliserofosfolipid biyosentez yolunun diğer bir dalı fosfatidil-gliserofosfat sentaz enzimi (pgsA gen ürünü) ile başlar. PgsA enzimi CDP-DAG ’dan fosfatidilgliserofosfat (PGP) ’ın sentezini katalizler. Daha sonra PGP ’den fosforil grubunun hidroliziyle PG ’nin sentezi gerçekleşir. Bu hidrolitik basamağı en az üç farklı enzimin (PgpA, PgpB ve henüz bilinmeyen bir protein) katalizlediği düşünülmektedir (Dillon ve ark., 1996). En son aşamada ise iki PE molekülü biraraya gelerek CL ve gliserol oluşur. Kardiyolipin sentaz (cls gen ürünü) enzimi tarafından katalizlenen bu reaksiyon basamağı tersiniridir (Tropp, 1997). 15 2.3.1.2. Gliserofosfolipidlerin Hücre Fonksiyonundaki Rolleri E. coli gliserofosfolipid biyosentez yolunda yer alan PssA dışındaki tüm enzimler membrana bağlıdır. PssA ise sitozolik bir enzim olmakla beraber, fonksiyon halindeyken membrana bağlı olduğu düşünülmektedir. Bu enzimlerin aktif bölgelerini G3P, CTP ve ACP ’nin açillenmiş türevleri gibi suda çözünür öncüllere sahip olduklarından, gliserofosfolipid sentezi iç membran lipid tabakasının iç yaprakçığında gerçekleştiği sanılmaktadır. İn vitro (Huijbregts ve ark., 1996) ve in vivo (Langley ve ark., 1982) işaretleme çalışmaları bu görüşü desteklemektedir. Buna göre, lipid tabakasında yeni sentezlenmiş gliserofosfolipid moleküllerinin membranın iç yaprakçığından dış yaprakçığına hareket ve rotasyonu (“flip”) için bir mekanizma görev alır. Gliserofosfolipidler tüm canlı organizmalarda membranı şekillendiren en önemli bileşenlerdir. Lipidler, membran lipid çift tabakasının fiziksel organizasyonunda, proteinlerin membrana transferlerinde, sinyal transdüksiyon yolunda ve hücre bölünmesinin başlangıç aşamasında ve membranlar aracılığıyla gerçekleşen iyon ve metabolit transferinde görev alırlar. Ayrıca, moleküler şaperon olarak membran proteinlerinin katlanması ve yerleşimine yardım ederler. Membran lipid kompozisyonu proteinlerin yapı ve fonksiyonunu değiştirmekte olup, lipid kompozisyonunda gözlenen geçici ya da bölgesel değişikliklerin hücresel süreçlerin potansiyel düzenleyicileri olduğu düşünülmektedir. Bazı membran gliserofosfolipidlerin fonksiyonlarını ve hücre için gerekliliğini örneklemek gerekirse, PG, CL ve PE gibi iyonik olmayan gliserofosfolipidler DnaA proteinine bağlı DNA replikasyonun başlangıç aşamasında gereklidir (Xia ve Dowhan, 1995). Yine, PG ve CL oksidatif fosforilasyon ve membran geçirgenliği gibi normal mitokondriyel fonksiyonlar için önemlidir. Oksidatif fosforilasyon ve fotofosforilasyonda yer alan birçok protein komplekslerinin (sitokrom aa3 oksidaz (Robinson, 1993), F0F1 ATP sentez (Eble ve ark., 1990) ve sitokrom bc1 kompleksi (Yu ve ark., 1978)) dördüncül yapılarında CL ’in bulunduğu ve bu proteinlerin fonksiyonel aktiviteleri için CL ’e gereksinim duyduğu yapılan birçok çalışma ile gösterildi. Diğer 16 yandan, PE ise laktoz permeaz enziminin (LacY) fonksiyonel katlanmasında moleküler şaperon görevi (Bogdanov ve Dowhan, 1998; Bogdanov ve ark., 1999) üstlenmekte olup, ayrıca kemotaksis ve bakterinin hareketliliği gibi birçok yaşamsal faaliyetler için de gereklidir. Yine asidik lipidlerin sekretör proteinleri (SecA, SecY ve SecE) kapsayan translokasyon sisteminin membrana yerleşiminde gerekliliği bilinmektedir (van Klompenburg ve de Kruijff, 1998). 2.3.1.3. 1-açil-sn-gliserol-3-fosfat açiltransferazlar (AGPAT) Fosfatidik asit (PA), hücre membran gliserofosfolipid biyosentezinde çok önemli bir ara üründür (Coleman, 1990; 1992). E. coli ’de bu ürün plsC geni tarafından kodlanan AGPAT enziminin (EC 2.3.1.51) aracılığında üretilir. E. coli ’de tek bir AGPAT enzimi bulunmakta olup, plsC mutantı [plsC(Ts)] yüksek sıcaklıkta (42°C) ölümcüldür. Buna karşılık, bazı bakterilerde birden fazla fonksiyonel AGPAT enzimi bulunmaktadır. Örneğin, patojenik Neisseria türlerinde (N. meningitidis ve N. gonorrhoeae) in vitro koşullarda AGPAT aktivitesi gösteren iki enziminin (NlaA ve NlaB) varlığı belirlendi (Shih ve ark., 1999; Swartley ve ark., 1995). Bu enzimleri kodlayan nlaA ve nlaB genleri E. coli plsC(Ts) mutantına aktarıldığında bu iki genin mutantın üreme fenotipini tamamladığı görüldü. Genomda birbirinden farklı bölgede yer alan bu iki genin inaktivasyonu da membran gliserofosfolipid kompozisyonunda değişikliklere sebep olmuştur. Gliserofosfolipid profilinde gözlenen bu değişiklikler aynı zamanda kapsül ve pili oluşumu gibi hücre yüzeyi bileşenleri üzerinde de pleiotrofik etkilere neden olmuştur. Örneğin, NlaA mutantında ekstraselüler kapsüler polisakkarit ve pili ifadesinde artma gözlenmiştir. Açiltransferaz enzim aktivitesi N. gonorrhoeae NlaA mutantında azalırken, N. meningitidis NlaA mutantında ise artma göstermiştir. Bununla beraber, NlaA ve NlaB mutantları birbirinden farklı fenotip göstermişler ve böylece NlaA ve NlaB ’nin in vivo koşullarda farklı biyokimyasal fonksiyonlara sahip olduğu görülmüştür. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada ise bir gram-pozitif bakteri olan Pseudomonas fluorescens ’de AGPAT enzimini kodlayan plsC geni ile homolojiye sahip üç gen (hdtS, patB ve olsA) tanımlanmış ve bu genler detaylı olarak karakterize 17 edilmiştir (Cullinane ve ark., 2005). Buna göre, sadece hdtS knock-out mutantında yaban soya kıyasla üreme eksikliği görülmüştür. Yine hdtS mutantında patB mutantına kıyasla daha düşük AGPAT aktivitesi gözlenmiş ve bu da hdtS geninin hücrede birinci derecede fonksiyonel AGPAT enzimini kodladığını göstermiştir. HdtS geni E. coli plsC(Ts) mutantının üreme kusurunu tamamen; PatB geni ise kısmen tamamlamıştır. Ancak olsA geni E. coli plsC mutantını tamamlayamamıştır. HtdS mutantı hücresel yağ asiti kompozisyonundaki C16:C18 oranını değiştirirken, patB ve olsA mutantlarında ise yağ asiti profilinde önemli bir değişiklik gözlenmemiştir. Mutantlarda tanımlanmış bir diğer farklılık ise, htdS mutantında kamçı aracılığındaki harekette kusur gözlenirken, patB mutantında ise bakteriyel hareketlilikte herhangi bir etki gözlenmemiştir. Bakterilerde çok geniş bir dağılım göstermekle beraber, AGPAT homologları ökaryotik organizmalarda da bulunmaktadır. Birkaç bitki ve hayvandaki AGPAT homologlarının işleyişi, E. coli plsC(Ts) mutantının üremesini sağlamıştır (Brown ve ark., 1994; Hanke ve ark., 1995; West ve ark., 1997). Bir kültür bitkisi olan Limnanthes douglasii de iki adet AGPAT homoloğu protein belirlenmiş ve tek bir proteinin tohum gelişimini sınırladığı gözlenmiştir (Brown ve ark., 1995). E. coli, Salmonella typhimurum, Borrelia burgdorferi, Saccharomyces cerevisiae, mısır ve hindistan cevizi gibi farklı prokaryotik ve ökaryotik organizmalardaki AGPAT homologlarının amino asit dizileri karşılaştırıldığında NHQS ve PEGTR peptid dizilerinden oluşan iki bölgenin tüm AGPAT türlerinde korunmuş olduğu görülmüştür (Coleman, 1990; Nagiec ve ark., 1993; Brown ve ark., 1994; Ojaimi ve ark., 1994; Knutzon ve ark., 1995). IPB002123A ve IPB2123B olarak isimlendirilmiş bu korunmuş diziler AGPAT enziminde açil-CoA ve/veya açil-ACP bağlanma bölgesini oluşturduğu düşünülmektedir (Shih ve ark., 1999; West ve ark., 1997). AGPAT ’daki diğer homoloji gösteren bölgelerin de enzimin aktivite ya da özgünlüğü için önemli olduğu düşünülmektedir. Nagiec ve arkadaşları (1993) S. cerevisiae plsC homologunda (SLC1) tek bir amino asit değişikliğinin (Gln-44→Leu- 44) uzun zincirli açil-CoA için enzimin özgünlüğünü değiştirmede yeterli olduğunu göstermişlerdir. Ayrıca, Heat ve Rock (1998) birçok gliserofosfolipid açiltransferaz enzimlerinde (GPAT ve AGPAT) HX4D peptid motifinin korunmuş olduğunu 18 göstermiştir. Buna göre, E. coli GPAT ’daki motifde yer alan korunmuş histidin (H306) ve aspartik asit (D311) amino asitlerine yönlendirilmiş mutagenez yapılarak elde edilen mutasyonlar E. coli GPAT aktivitesinden yoksun mutant (SJ22) bakteriye aktarılmıştır. Buna göre açil-CoA vericisi kullanılarak yapılan GPAT aktivite testinde H306A (His- 306→Ala-306) mutasyonunu taşıyan mutant membranında enzimin inaktif olduğu gözlenmiştir. Benzer şekilde D311A (Asp-311→Ala-311) mutasyonunu taşıyan bakteride enzim inaktif iken, D311E (Asp-311→Glu-311) mutasyonunu taşıyan bakteride ise %10 oranında enzim aktivitesi gözlenmiştir. Böylece, amino asit dizisindeki değişiklikler AGPAT enzim aktivitesini ve özgünlüğünü değiştirmede yeterli görülmektedir. E. coli plsB geni tarafından kodlanan protein az çok korunmuş olup, bu proteinin homologları α- ve β-proteobakterilerde ve mikobakteriler ile sınırlı kalmaktadır. PlsC homologlarının bakterilerdeki varlığı, PlsB gibi olmakla beraber daha fazla sınırlıdır ve mikobakterilerle daha zayıf bir homoloji gösterirler. E. coli ’de plsB ve plsC gen ürünlerinin kısmi amino asit dizisi birbirleriyle homoloji gösterir ve bu iki enzimin birlikte koordinasyonlu fonksiyon gösterdikleri düşünülmektedir (Cronan ve Rock, 1996). Buna karşılık, bazı bakteri genomları bir ya da birden fazla plsC gen homologuna sahip iken, plsB gen homologu içermemektedirler. Clostridum butyricum bakterisinde plsD geni tarafından kodlanan proteinin dizisi GPAT ’dan daha çok AGPAT ’ın dizisine benzerlik göstermiştir. Yine, ifade olan PlsD proteininde açiltransferaz enzim aktivitesi gözlenmemesine karşın, plsD geninin E. coli plsB26- plsX50 mutantının büyüme fenotipini tamamladığı gözlenmiştir (Heath ve ark., 1997). 2.3.2 Fosfat Grubu İçermeyen Lipidler Hücre membranının lipid kompozisyonu organizmanın fizyolojk koşullarına bağlı olarak değişebilir (López-Lara ve ark., 2003). Bazı bakterilerde sınırlı fosfat koşulları altında fosfat grubu içermeyen lipidlerin bazı membran fosfolipidlerin kısmen yerini aldığı gözlenmiştir. Örneğin, B. subtilis (Minnikin ve ark., 1972), P. diminuta, P. fluorescens (Minnikin ve Abdolrahimzadeh, 1974), R. sphaeroides (Benning ve ark., 1995) ve S. meliloti (Geiger, 1998; Geiger ve ark., 1999) bakterilerinde fosforsuz 19 lipidler olarak diaçiltrimetilhomoserin (DGTS), sülfolipid (sulfoküinovosil diaçilgliserol, SL) ve ornitin lipid (OL) tespit edilmiştir. DGTS bazı basit ökaryotlarda ve birçok bakteride bulunmaktadır. DGTS yapı olarak PC ile benzerlik gösterdiğinden, bakterilerde sınırlı fosfat koşullar altında DGTS, kısmen PC ’nin yerini alır (Benning ve ark., 1995; Geiger ve ark., 1999). SL ’ler tüm yüksek yapılı bitkilerin ve birçok fotosentetik bakterinin membranlarında bulunur. Bu lipidlerin genelde fotosentetik üreme için önemli olmadığı bilinmekle beraber, sınırlı fosfat koşulları altında ise R. sphaeroides ve siyanobakterilerin fotosentetik üremelerinde mutlak gerekli olduğu gözlenmiştir (Benning ve ark., 1993; Güler ve ark., 1996). Diğer yandan SL ’ler S. meliloti ve Rhizobium leguminosarum gibi bazı fotosentetik olmayan bakterilerde de bulunurken (Benning, 1998), E. coli ve Agrobacterium türlerinde ise bulunmaz. Diğer bir fosforsuz lipid olan OL ’ler ise yaygın olarak bakterilerde bulunmakta olup, ökaryotlarda ve arkealarda ise bulunmamaktadır (López-Lara ve ark., 2003). 2.3.2.1. Ornitin Lipidler OL ’ler birçok gram-negatif bakteri (Ratledge ve Wilkinson, 1988; Asselineau, 1991) ve Mycobacterium ve Streptomyces gibi (Lanéelle ve ark., 1990) gram-pozitif bakterilerde bulunmaktadır. Ayrıca, patojen Flavobacterium (Kawai ve ark., 1988a) ve Burkholderia (Phung ve ark., 1995) türlerinde OL, temel lipid olarak rapor edilmiş ve bu tür bakterilerin patojenitelerinde önemli olabileceği düşünülmüştür. Diğer yandan OL ’ler arkea ve ökaryotik organizmalarda ise bulunmamaktadır. Yine, gliserofosfolipid biyosentez mekanizması en çok çalışılan E. coli ise OL ’nden yoksundur. 20 2.3.2.1.1. Ornitin Lipidlerin Kimyasal Yapısı OL ’lerin kimyasal yapısı birçok organizmada tanımlanmış olup, üç farklı OL sınıfının bulunduğu bilinmektedir (Goldfine, 1982). Birçok gram negatif bakteride gözlenen OL ’ler zwitterionik olup, genellikle α-N-(açiloksiaçil)-ornitin yapısındadır (Knoche and Shively, 1972). Bu yapıda, 3- (veya 2-) hidroksi yağ asiti ornitin amino asitinin α-amino grubuna amid bağı ile bağlanır ve ikinci yağ asiti ise birinci yağ asitin hidroksil grubuna ester bağı ile bağlanır (Şekil 2.3A). Örneğin, S. meliloti de ester bağı ile bağlı yağ asitinin hidroksil grubu üçüncü pozisyonda yer alırken (Geiger ve ark., 1999), Burkholderia cepacia (Taylor ve ark., 1998) ve Flavobacterium türlerinde (Asselineau, 1991) ise ikinci pozisyonda yer alır. Bu tip zwitterionik OL ’ler genellikle az ya da hiç PE içermeyen Streptomyces türlerinde ya da diğer türlerde ise sınırlı fosfat koşullarında baskın olarak bulunurlar (Batrakov ve Bergelson, 1978). İkinci yapıda ornitinin karboksil grubu α-hidroksi yağ asiti ile ester bağı ile bağlanırken, ornitinin α-amino grubu ise 3-hidroksi yağ asitine bağlıdır (Şekil 2.3B). Bu tip OL lere Actinomyces türlerinde (Batrakov ve Bergelson, 1978) rastlanılmaktadır. Üçüncü OL yapısında ise iki yağ asitinden birincisi ester bağı ile etilen glikole; ikinci yağ asiti ise amid bağı ile ornitinin α-amino grubuna bağlanır. Bu OL yapısı Mycobacterium bovis (Prome ve ark., 1969), Brucella melitensis B. abortus, Bordetella pertussis (Thiele ve Schwinn, 1973) bakterilerinde yer alır. Bazı türlerde farklı kromotografik mobiliteye sahip birkaç OL bulunmaktadır. Örneğin; Burkholderia cepacia ester-bağlı 2-hidroksi yağ asitinin varlığı ve yokluğuna bağlı iki farklı OL içerir (Kawai ve ark., 1988b; Cox ve Wilkinson, 1989; Taylor ve ark., 1998). 21 Şekil 2.3. Ornitin lipidlerin kimyasal yapısı. (A) 3-hidroksi yağ asiti ornitinin α-amino grubuna amid bağıyla; ikinci yağ asiti ise birinci yağ asitin hidroksil grubuna ester bağı ile bağlanır. (B) ornitinin karboksil grubu α-hidroksi yağ asiti ile ester bağı ile bağlanırken, ornitinin α- amino grubu ise 3-hidroksi yağ asitine bağlıdır. 2.3.2.1.2. Ornitin Lipidlerin Biyosentezi Geiger ve arkadaşları, ilk kez S. meliloti ’de OL biyosentezinin iki farklı enzimatik aktiviteyle gerçekleştiğini gösterdi (Weissenmayer ve ark., 2002; Gao ve ark., 2004) (Şekil 2.4). Buna göre α-N-(açiloksiaçil)-ornitin yapısında gözlenen S. meliloti OL biyosentezinde rol alan ilk enzim OlsB olarak tanımlanmış olup, bu enzim ornitin amino asitinin α-amino grubu ile birinci yağ asiti arasında amid bağının (N- açiltransferaz) oluşumu için gereklidir. OlsB enzimi 3-hidroksiaçil-ACP ’ye gereksinim duyar ve ornitinden OL biyosentezinin ara ürünü olan liso ornitin lipid (LOL) ’in oluşumunu sağlar. OlsA olarak isimlendirilmiş OL biyosentezinde yer alan ikinci enzim ise birinci yağ asitin 3-hidroksil grubu ile ikinci yağ asitin karboksil grubu arasında ester bağının (O-açiltransferaz) oluşumundan sorumlu olup, LOL ’in OL ’e dönüşüm reaksiyonunu katalizler. Her iki enzimde açil vericisi olarak sadece açil-ACP proteinini kullanır. OlsB OlsA 3- AcpP hidroksi- açil -AcpP AcpP Ornitin açil -AcpP Liso-ornitin lipid (LOL) Ornitin lipid (OL) Şekil 2.4. Sinorhizobium meliloti ’de ornitin lipid biyosentez yolu (Gao ve ark., 2004). 23 2.3.2.1.3. Ornitin Lipidlerin Üretimi Genel olarak, birçok organizma çevresindeki kimyasal ve fiziksel değişikliklere cevap verebilmek için membran lipid kompozisyonlarını değiştirebilir ve böylece uygun olmayan koşullarda yaşamlarını sürdürebilirler (Los ve Murata, 2004). Sınırlı fosfat içeren üreme ortamlarının, bakterilerin lipid kompozisyonuna olan etkilerine yönelik pekçok çalışma yapılmıştır. Özellikle B. subtilis (Minnikin ve ark., 1972), P. diminuta, P. fluorescens (Minnikin ve Abdolrahimzadeh, 1974), Burkholderia cepacia (Taylor ve ark., 1998), R. sphaeroides (Benning ve ark., 1995), Hypomicrobium (Batrakov ve Nikitin, 1996) ve S. meliloti (Geiger ve ark., 1999) bakterileri sınırlı fosfat içeren besi ortamlarında üretildiklerinde OL ’in, bazı membran gliserofosfolipidlerinin kısmen yerini aldığı görüldü. Bu bakterilerde OL ve PE zwitterionik yapıya sahip olduklarından bakteri membranında dönüşümlü olarak yer aldığı gözlenmiştir (Wilkinson, 1972). Diğer yandan, P. fluorescens ’de sınırlı magnezyum içeren bazı üreme kültürlerinde ise OL ’nin üretilmediği görüldü (Minnikin ve Abdolrahimzadeh, 1974). Yine, P. rubescens ’in katı ve sıvı besi ortamlarında üreyen hücrelerinden izole edilen lipid kompozisyonunda da bazı farklılıklar gözlenir. Buna göre katı besi ortamında üreyen bakteride OL temel lipid iken, sıvı ortamda üreyenlerden elde edilen lipid izolatlarında ise OL ’e rastlanılmamıştır (Wilkinson, 1972). P. denitrificans ’de ise düşük divalent katyon konsantrasyonları içeren kompleks besi ortamlarında üretildiğinde ise zwitterionik OL ’i daha fazla miktarda ürettiği görülmüştür. R. sphaeroides ’de ise OL ’nin aerobik üreme koşullarında metabolik olarak sabit olması ve daha sonrasında da fotosentetik üreme koşullarına adaptasyon göstermesi nedeniyle, OL ’nin membranda yapısal bir bileşen olarak rol oynadığını düşündürmüştür (Gorchein, 1968). Diğer yandan, OL ’ler P. rubescens ve Thiobacillus thiooxydans bakterilerinde fermentasyon ile üretilmektedir (Wilkinson, 1972). 24 2.3.2.1.4. Ornitin Lipidlerin Biyolojik Aktiviteleri OL ’ler amid ve ester bağlarıyla bağlı yağ asitleri içerdiklerinden bakteriyel lipopolisakkaritlerin (LPS) endotoksin aktivitesinden sorumlu lipid A ile yapı olarak benzerlik gösterir (Kawai ve Akagawa, 1989). Diğer yandan, iki molekül arasında hidrofilik kısım, yağ asitlerinin karbon zincir uzunluğu ve moleküler büyüklük gibi farklılıklarda gözlenir. Lipid A gibi bazı bakteriyel lipidlerin ökaryotik organizma ile temasa geçtiklerinde güçlü reaksiyonlara neden oldukları bilinmektedir. Bakteriyel endotoksinler, tümör nekrosis faktör (TNF) α, interlökin (IL)-1 β, prostaglandin E2 (PGE2) ve koloni-uyarıcı faktör gibi immün düzenleyici bileşenleri üretmek için makrofajları aktive ederler (Galanos ve ark., 1985; Kotani ve ark., 1985; Rietschel ve ark., 1980; 1982; Sibley ve ark., 1988). Bu bilgiler ışığı altında OL ’nin immün düzenleyici aktivitelerinin LPS ile kısmen farklı olmakla beraber benzer olacağı düşünülmüş ve OL ’lerin biyolojik aktivitelerine yönelik pekçok çalışma yapılmıştır. OL ’ler tıpkı LPS ’ler gibi Toll-benzeri reseptör-CD14 ’e bağlı yol aracılığında (Kawai ve ark., 2000a) PGE2 ve IL-1β üreten makrofaj hücrelerini aktive ettikleri gözlenmiştir. Buna ilaveten, güçlü B-lenfosit çoğalımı göstermişlerdir. TNF-α indükleme aktivitesi karın zarı makrofajlarında daha zayıf olmasına karşılık (Kawai ve Akagawa, 1989), makrofaj-benzeri hücrelerde daha güçlü olduğu görülmüştür (Kawai ve ark., 2000b). TNF-α ’nin tavşan endotoksin vücut sıcaklığında (Michie ve ark., 1988; Kawasaki ve ark., 1989) ve endoksin fare hipotermik yanıtda (Bauss ve ark., 1987) önemli rol aldığı tahmin edilmektedir. OL ’ler oldukça zayıf TNF-α indükleyici aktivite gösterdiklerinden farelerde zayıf hipotermik yanıta sebep olurlar (Kawai ve ark., 1996). Lipid A molekülleri toksik olmasına karşılık, OL ’ler toksik değildir (Kawai ve Akagawa, 1989). Bu nedenle OL ’ler toksik olmayan aşı adjuvantları olarak da kullanılabilirler (Kawai ve Akagawa 1989; Kato ve Goto 1997; Kawai ve ark., 1999). Zayıf TNF-α indükleyici aktivitesinden kaynaklanarak OL ’nin toksik özellikte olmaması OL ’in sadece immün düzenleyicisi olarak değil aynı zamanda endoksin antagonistleri olarak da kullanılmasında avantaj sağlamaktadır. Farelere endotoksin lipid A ’dan önce OL verildiğinde, OL ’lerin fareleri letal endotoksinemiden koruduğu gözlenmiştir (Kawai ve ark., 1991). Bu durumun iki molekül arasında gözlenen yapısal 25 benzerlikten kaynaklandığı düşünülmektedir. Buna göre OL, lipid A ’nın neden olduğu olaylara antagonistik bloklayıcı olarak fonksiyon gösterebilmektedir. OL ’nin birçok Bordetella (Kawai ve Yano, 1983), Flavobacterium (Kawai ve ark., 1988a) ve Pseudomonas türlerinde (Kawai ve ark., 1988b) lipid interaksiyonlarıyla insan ve tavşan eritrositlerinde hemaglütinasyona neden oldukları belirlenmiştir. OL ’ler reaktif oksijen radikallerinin üretilmesinde öncü konakçı savunma mekanizmasında önemli rol oynayan insan polimorfonüklear lökosit (PMN) kemotaksisleri uyarmakta ve fonksiyonlarını aktive etmektedir (Miyazaki ve ark., 1993; Kawai ve ark., 2000a). Membran lipidlerinin simbiyosiz oluşumunda bazı etkilerinin olduğu bilinmektedir (de Rudder ve ark., 1997). Ancak S. meliloti ’de OL biyosentezinde yer alan genlere ait mutantlar karakterize edildiğinde yonca bitkisiyle olan simbiyotik interaksiyonlarda OL ’nin önemli olmadığı görülmüştür (Weissenmayer ve ark., 2002). 2.4. Model Organizma Rhodobacter capsulatus R. capsulatus mor bakterilerin alt şubesinin bir üyesidir. Bu alt şube, genellikle ökaryotik hücrelerle yakın ortaklıklar kuran ve mitokondrilerin endosimbiyont ataları olduğu düşünülen toprak bakterilerinden oluşur (Woese, 1987). R. capsulatus mor- sülfürsüz, gram-negatif fakültatif bir fototroftur. R. capsulatus intraselülar fotosentetik membrana sahiptir (Cohen-Bazire ve ark., 1957) ve membranlar, bakteriyoklorofil ve hücrenin ışık-toplayıcı pigmentlerini içeren kromotofor olarak isimlendirilen vesiküller şeklinde görünürler (Gorchein ve ark., 1968) (Şekil 2.5). 26 Şekil 2.5. Rhodobacter capsulatus ’un elektron mikroskobik görüntüsü. R. capsulatus oldukça dallanmış elektron transfer (ET) yollarına sahip olduğundan farklı büyüme koşullarında üreyebilme yeteneğindedir (Zannoni, 1995) (Şekil 2.6). Buna göre, anaerobik fotosentetik yolu, kinol havuzu (Qhavuzu) ve farklı elektron taşıyıcı proteinler (sitokrom c2 ve sitokrom cy) ile birbirine bağlı reaksiyon merkezi ve sitokrom bc1 kompleksi arasında devirsel gerçekleşir. Solunum ET yolu ise, Qhavuzu ’ndan sonra iki kola ayrılır. Sitokrom cbb3 oksidaz enziminin kullanıldığı solunum yolu mitokondriyel solunum zincirindeki proteinlere yapı ve işlev bakımından benzer proteinler içermektedir. Alternatif solunum yolunda ise yaygın bir şekilde prokaryotlarda bulunan QH2 oksidaz enzimi bulunur (La Monica ve Marrs, 1976; Zannoni ve ark., 1976; Lang ve ark., 1996). Bu solunum yolu tüm c-tipi sitokrom proteinlerinden yoksun olup, b- ve d-tipi sitokromlar içermektedir. R. capsulatus ayrıca dimetil sülfoksit (DMSO), trietilamin oksit veya nitröz oksit gibi elektron alıcılarını kullanarak anaerobik karanlık koşullarda da üreyebilmektedir. Şekil 2.6. R. capsulatus ’da aerobik ve fotosentetik elektron transfer (ET) yolları. Fotosentetik ET yolunda, elektron akışı devirseldir. Işıkla aktifleşen reaksiyon merkezinden gelen elektronlar, sırasıyla ubikinon havuza (Qhavuz), sitokrom bc1 kompleksine ve elektron taşıyıcı c-tipi sitokrom proteinlerine (sitokrom c2 veya sitokrom cy) iletilir ve tekrar reaksiyon merkezine geri dönerler. Solunum ET yolunda ise farklı solunum dehidrogenazlardan (NADH, süksinat ve malat dehidrogenazlar) gelen elektronlar Qhavuz ’una iletilir. Elektronlar bu aşamadan sonra, tercihe göre iki farklı solunum yolundan birine geçer. Mitokondriyel ET zincirine benzeyen yol, sitokrom bc1 kompleksi, sitokrom c2 ya da sitokrom cy ve sitokrom cbb3 oksidaz enzimlerini içerir. Diğer solunum yolu ise, c-tipi sitokrom proteinlerinden yoksun olup, ubihidrokinon oksidaz (QH2) enzimi içerir. Fotosentez ve solunum yolunda bulunan c-tipi sitokrom içeren proteinler (sit c1, sit c2, sit cy, sit co ve sit cp) kırmızı renkte gösterilmiştir. 28 2.4.1. R. capsulatus ’da C-tipi Sitokromların Biyogenesizi R. capsulatus farklı üreme yollarına sahip olması, moleküler ve genetik yönden analizlere elverişli olması nedeniyle c-tipi sitokromların aydınlatılmasında (Zannoni, 1995) ve sitokromların biyogenesiz çalışmaları için de iyi bir model olmaktadırlar. R. capsulatus farklı üreme koşulları altında sistem-1 biyogenesiz yolunu kullanarak birçok c-tipi sitokrom proteinini üretir. Buna göre, R. capsulatus anaerobik fotosentetik üreme koşullarında sitokrom c1 ve sitokrom c2 veya sitokrom cy proteinlerine gereksinim duyar (Zannoni ve Daldal, 1993). Benzer şekilde, mitokondri-benzeri solunumla üremede ise sitokrom c1, sitokrom c2 veya sitokrom cy ’den başka sitokrom cbb3 oksidaz enziminin alt birimleri olan sitokrom co ve sitokrom cp proteinleri gereklidir (Gray ve ark., 1994; Koch ve ark., 1998). R. capsulatus ’un içerdiği c-tipi sitokrom proteinleri (c1, c2, cy, co , cp ve c′) topolojik olarak birbirinden farklılık gösterir. Buna göre, sitokrom cy, sitokrom co ve sitokrom cp amino-ucundan, sitokrom c1 ise karboksil-ucundan sitoplazmik membrana bağlıdır. Diğer yandan, sitokrom c2 ve sitokrom c′ ise sinyal dizilerine sahip olup, çözünür periplazmik proteinlerdir (Moore ve Pettigrew, 1990). R. capsulatus ’da sitokrom c eksikliği gözlenen mutantlar üzerindeki çalışmalar ile c-tipi sitokromların olgunlaşmasında en az on bileşenin (ccmABCDEFGHI ve ccdA) gerekli olduğu gösterilmiştir (Lang ve ark., 1996; Monika ve ark., 1997; Goldman ve ark., 1997; Deshmukh ve ark., 2000; Turkarslan ve ark., 2006). Apositokromlar, sitoplazmada üretilir ve sekretör proteinlerinin aracılığında (Sec-bağımlı yol) membrandan periplazmaya geçer (Helde ve ark., 1997). Apositokromların sinyal peptidleri ya işlenilir ya da amino-uç membran çapası olarak kullanılır. Disülfit bağ formasyonu (oksitlenme) apositokromdaki korunmuş hem bağlanma motifinde (– CXYCH–) yer alan sistein amino asitleri arasında DsbA/DsbB proteinleri aracılığında gerçekleşir (Metheringhma ve ark., 1995; Missiakas ve Raina, 1997; Setterdahl ve ark., 2000). Biyogenesiz yolunun tiyoredüksiyon kısmında yer alan CcdA (Deshmukh ve ark., 2000), CcmG (Beckman ve Kranz, 1993) ve CcmH (Beckman ve ark., 1992) proteinleri, hem bağı oluşmadan önce apositokromun sistenil yan zincirini indirger. Diğer yandan, hem kofaktörleri sitoplazmada sentezlenir ve CcmABCD’den oluşan kompleks yardımıyla periplazmaya geçer. CcmE proteini tarafından taşınan hem 29 molekülü, CcmF ve CcmH proteinlerinin yardımıyla apositokroma kovalent olarak bağlanır. CcmI proteinin de DsbA/DsbB yolu aracılığıyla oksitlenen apositokrom c ’leri hem ligasyon bölgelerine ve devamında da periplazmaya translokasyonlarında şaperonluk görevi yaptığı ileri düşünülmektedir (Lang ve ark., 1996; Sanders ve ark., 2005). Şekil 2.7 ’de R. capsulatus ’da Ccm-sistem 1 sitokrom c biyogenesiz modeli şematik olarak gösterilmiştir. 30 Şekil 2.7. R. capsulatus ’da c-tipi sitokrom proteinlerinin biyogenesiz yolu. Sitokromlar preapositokromlar olarak sitoplazmada üretilir ve sekretör (Sec) proteinleri yoluyla membrana geçerler. Daha sonra sinyal dizilerin işlenmesiyle apositokromlar oluşur. Periplazmada, hem bağlanma bölgesindeki sisteinler DsbA /DsbB proteinleri tarafından disülfitlere oksitlenir. Apositokromlar CcmI tarafından hem bağlanma bölgesine geçer ancak apositokromlar hem kofaktörüne bağlanmadan önce disülfitlere indirgenir. Sitoplazmada sentezlenen hem molekülü de CcmABCD kompleksi aracılığıyla periplazmaya geçer ve CcmE, CcmF ve CcmH proteinleri aracılığıyla apositokroma kovalent olarak bağlanır (S.Turkarslan ’dan temin edilmiştir). 31 2.4.2. R. capsulatus ’da Sitokrom cbb3 Oksidaz ve Enzimin Biyogenesizi R. capsulatus, R. sphaeroides ve P. denitrificans gibi yakın akrabalarına kıyasla, düşük ve yüksek oksijen konsantrasyonlarında aktif hale geçebilen tek tip oksidaz enzimine (sitokrom cbb3 oksidaz) sahiptir. R. capsulatus sitokrom cbb3 oksidaz enziminin izole edilen örneklerinde üç büyük alt ünite elde edilmiştir (Gray ve ark., 1994). I. alt birim (CcoN) integral membran proteini olup bakır-oksidaz enzim ailesinde tanımlanmış altı adet korunmuş histidin amino asiti içerir (Pitcher ve Watmough, 2004; Hosler ve ark., 1993). CcoN, tahmini moleküler ağırlığı 58 kDa olan 532 amino asitlik polipeptidi kodlar. Bu alt birimde, düşük devirli hem b ile oksijenin suya indirgendiği yüksek devirli hem b3-CuB bimetalik merkez bulunmaktadır. Rhizobia türlerinde FixN nin sitokrom cbb3 oksidazın fonksiyonu ve yerleşimi için gerekli olduğu belirlenmiştir (Zufferey ve ark., 1996). II. ve III. alt birimler ise membrana bağlı c-tipi sitokromlar içerir ve sitokrom c den alınan elektronların CcoN nin katalitik binüklear merkezine transferinde gereklidir. CcoO, II. alt birime karşılık gelir, membrana bağlıdır ve bir adet sitokrom c proteini (sitokrom co) içerir. CcoO, 242 amino asitlik bir polipeptiti kodlar ve moleküler ağırlığı 28 kDa dır. CcoP, moleküler ağırlığı 32 kDa olan 288 amino asit peptidi kodlar. CcoQ geni küçük, membrana bağlı bir polipeptid kodlar. B. japonicum (Zufferey ve ark., 1996) bakterisinde CcoQ geninin delesyonunun sitokrom c miktarında bir azalmaya neden olmasına rağmen, oksidaz enziminin aktivitesi ya da yerleşiminde belli bir etki göstermemiştir. CcoQ enzim aktivitesi için gerekli olmamasına rağmen, sitokrom cbb3 oksidazın aerobik koşullar altında düzenlenmesi ilgili olduğu düşünülmektedir (Oh ve Kaplan, 2002). Sitokrom c oksidaz gibi çok alt birimli membran protein komplekslerinde; polipeptidlerin şifrelenmesi ve katlanması, prostetik grubların ve pigmentlerin bağlanması, alt birimlerin olgunlaşması ve fonksiyonel membran kompleksleri arasındaki etkileşimleri kapsayan biyogenesiz işlemleri ve polipeptitlerin membrana yerleşim süreçleri gibi posttranslasyonal modifikasyon basamakları birden fazla protein tarafından desteklenmektedir (Merchant ve Dreyfuss, 1998). Genel olarak bu süreçler hakkında bilgiler sınırlıdır. Rhizobial türlerde ccoGHIS gen ürünlerinin sitokrom cbb3 oksidazın biyosentez için gerekli olduğu belirlenmiştir (Batut ve Boistard, 1994; Preisig 32 ve ark., 1996). Koch ve arkadaşları (2000), R. capsulatus ’da, aktif sitokrom cbb3 oksidaz enziminin formasyon ve kararlılığının ccoGHIS gen ürünlerinin yokluğundan etkilendiğini ve bundan dolayı ccoGHIS gen ürünlerinin enzimin biyogenesizinde ilgili olduklarını göstermiştir (Şekil 2.8). Diğer yandan, S. meliloti (Kahn ve ark., 1989) ve B. japonicum (Preisig ve ark., 1996) bakterilerinde ccoGHIS homologlarının operon oluşturduklarını buna karşılık R. capsulatus ’da ccoG, ccoH, ccoI ve ccoS genlerinin herbirinin kendi promotorları olduğu ve bağımsız olarak ifade edildikleri belirlenmiştir (Koch ve ark., 2000). R. capsulatus ’da dahil birçok bakteride ccoNOQP ve ccoGHIS genlerinin hemen üst tarafında FNR-bağlanma bölgesi bulunmaktadır (Koch ve ark., 1998). FnrL, R. sphaeroides ’de ccoNOQP in pozitif regülatörü olup, fotosentez ve DMSO varlığında anaerobik koşullarda karanlık büyümede gereklidir (Mouncey ve Kaplan, 1998). R. capsulatus ’da ise sadece sitokrom cbb3 oksidaz enzimi bulunduğundan ve de bu enzim farklı oksijen konsantrasyonlarında aktif olduğundan, FnrL nin solunumla üreme sırasındaki işleyişinin diğerlerinden farklı olduğu düşülmektedir. CcoG nin inaktivasyonu ile elde edilen null mutantı sitokrom oksidaz aktivitesi gösterebildiğinden, ccoG geninin enzim aktivitesi için gerekli olmadığı görülmüştür. Buna karşılık, CcoG geninin yokluğunun telürit azalmasında etkili olduğu redoks reaksiyonları ile ilişkili ferrodoksin motifi içerdiği belirlenmiştir (Koch ve ark., 2000). CcoH ve CcoI null mutantlarında ise oldukça az miktarda sitokrom cbb3 oksidaz aktivitesi görülmüş ve bu durumun ise bakteride bu genlerin yokluğunda oksidaz enziminin çabucak yıkıma uğrayabilme ihtimalini düşündürmüştür. CcoI geni ise CPx- tip ATP-bağımlı taşıyıcılarla homoloji göstermektedir. Diğer yandan ccoS geninin yokluğunda ise enzimin I. alt birimde yer alan Cu ve b-tip hem gruplarının bulunmadığı görülmüştür. Yakın bir zamanda yapılan bir çalışma ise, sitokrom cbb3 oksidaz enziminin alt birimlerinin sabit fakat aktif olmayan CcoNOQ (210 kDa) alt kompleksinin CcoNOQP (230 kDa) aktif kompleksine geçişi aracılığıyla membrana yerleştiklerini gösterdi (Kulajta ve ark., 2006). 33 Şekil 2.8. R. capsulatus sitokrom cbb3 oksidaz enziminin biyogenesizinde ccoGHIS gen ürünlerinin rollerini özetleyen model (Koch ve ark., 2000). 34 Fonksiyonel c-tipi sitokromların varlığı, hücrelerin fotosentetik üreme ve aktif sitokrom c oksidaz aracılığıyla Nadi reaksiyonunu (Keilin, 1966) katalizleyebilme yetenekleri (Nadi+) ile gözlenebilinir. Nadi reaksiyonu, sitokrom c oksidaz aktivitesine özgü bir indikatör olup aktif oksidaz enzimine sahip yaban soy hücreleri, O2’ nin ve elektron taşıyıcıların varlığında α-naftol ’ü indolfenol mavisine dönüştürerek (α- Naftol+ DMPD+O2=indolfenol mavisi+H2O) mavi renk alırlar (Nadi +). Buna karşılık enzim aktivitesi göstermeyen mutant bakteriler ise boyanmadan kalırlar (Nadi–). Buna göre, tüm c-tipi sitokromlardan yoksun R. capsulatus mutantları fotosentez ile üreyemez ve sitokrom c oksidaz aktivitesi gösteremezler (Nadi−). Ancak bu tip mutantlar, b-tipi sitokrom içeren QH2 enzimini kullanan alternatif solunum yolu ile aerobik koşullarda üreyebilirler. 2.4.3. R. capsulatus ’da Membran Polar Lipidleri R. capsulatus ’da başlıca membran polar lipidleri PE, PG ve PC ’dir. Bu önemli gliserofosfolipidlere ilaveten OL ve DGTS gibi fosfat grubu içermeyen lipidler de (Asselineau, 1991) yer alır. Diğer yandan R. capsulatus ’un toplam hücre ekstraktlarında SL ve CL ’e rastlanılmamıştır (Imhof ve Imhoff, 1995). Bakteri membranındaki lipidler çoğunlukla cis-vaccenic asit (cis-11-18:1) yağ asitini içerirler (Smith, 1988). R. capsulatus ’da öngörülmüş tahmini gliserofosfolipid biyosentez yolu Şekil 2.9 ’da şematize edilmiştir. E. coli ve R. capsulatus bakterilerinin gliserofosfolipid biyosentez yolu bazı yönlerden farklılık göstermektedir. Buna göre ilk olarak, E. coli GPAT ve AGPAT ’ın katalizlediği açiltransferaz reaksiyonlarında farklı açil vericileri kullanırken, R. capsulatus ise tıpkı yakın akrabası olan R. sphaeroides (Lueking ve Goldfine, 1975) gibi sadece açil-ACP ’ye karşı özgünlük gösterir. İkinci fark ise, diğer intrasellüler membran sistemine sahip gram-negatif bakterilerde olduğu gibi R. capsulatus PE ’nin metillenmiş türevlerini [monometil-PE (MMPE) ve dimetil-PE (DMPE)] ve fosfatidilkolin (PC) içermektedir (Goldfine, 1984). E. coli ’de ise PC ya da PE ile PC arasında herhangi bir N-metillenmiş ara ürün bulunmamaktadır. PC, ökaryotik organizmalarda başlıca membran fosfolipidi olup, PC ’nin biyosentezi CDP- kolin yolu ve metilasyon yolu olmak üzere iki alternatif yoldan gerçekleşir. Ancak bakterilerde bulunan PC ’nin biyosentezi ise metilasyon yolu gerçekleşmektedir. MMPE 35 ve DMPE, PC biyosentez yolunun ara ürünlerdir. Buna göre Rhodobacter türlerinde PE ’nin PC ’ye dönüşümü PE-N-metiltransferaz enziminin (pmt), metil vericisi olarak kullanılan S-adenosil-L-metiyoninden metil grublarını peşpeşe üç basamakta transfer etmesiyle gerçekleşir. Diğer yandan, S. meliloti bakterisinde PC ’nin biyosentezi ökaryotik organizmalarda olduğu gibi iki farklı yoldan gerçekleşir. Üçüncü bir fark ise, iki PG molekülünün bir araya gelmesi ile oluşan CL ’nin E. coli ’de sentezlenmesine karşılık, R. capsulatus ’da üretilmemesidir Şekil 2.9. R. capsulatus da öngörülen gliserofosfolipid biyosentez yolu. SAM, S- adenosilmetiyonin; SAHC, S-adenosilhomosistein. 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3. 1. Materyal 3.1.1. Bakteri Soyları ve Plazmitler Çalışmada kullanılan bakteri soyları, null mutantlar ve plazmitler Çizelge 3.1 ’de gösterildi. 3.1.2. Kimyasallar ve Enzimler Miniprep DNA izolasyon (Qiagen, 27106) ve agaroz jel izolasyon (QIAquick gel extraction kit, 28706) kitleri Qiagen ’den, restriksiyon enzimleri ve DNA modifikasyon enzimleri New England Biolab (NEB) ’dan temin edildi. Radyoaktif kimyasallar ([1-14C]-asetat ve L-[14C(U)]-gliserol-3-fosfat disodium salt (G3P)) ise Perkin Elmer ve NENTM Life Science Products ’dan alındı. Tüm antibiyotikler Sigma Chemical Co. ’dan, oligonükleotid primerler ve anti-Myc1-9E10 antikoru Pennsylvania Üniversitesi ’nin Cell Center biriminden temin edildi. 46 Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan bakteri soyları, plazmitler ve elde edilen rekombinant plazmit ve null mutantları. Soy Genotip Fenotipc Kaynak E. coli HB101 F−, ∆(gpt-proA)62 leuB6 supE44 ara-14 galK2 lacY1 StrR; r − m − B B Sambrook ve ark. ∆(mcrC-mrr) rpsL20 (StrR) xyl-5 mtl-1 recA13 (1989) TOP10 F− mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 Klonlamada konakçı soy Invitrogen ∆lacX74 recA1 deoR araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK RrpsL (Str ) endA1 nupG SM2-1 −plsC1 metC162::Tn10 thr-1 ara-14 ∆(gal-attλ)99 hisG4 PlsC , sıcaklığa duyarlı Coleman (1990) rpsL136 xyl-5 mtl-1 lacY1 tsx-78 eda-50 rfbD1 thi-1 mutant SJ22 plsB26 plsX50 panD2 zac-220::Tn10 glpD3 glpR2 glpKi PlsB−, G3P oksotrofik Rock ve relA1 spoT1 pit-10 phoA8 ompF627 fluA22 fadL701 mutant Jackowski (1982) R. capsulatus MT1131a crtD121 RifR Yaban soy, Nadi+, F+ Scolnik ve ark. (1980) MT1131/pOX15b crtD121 RifR, ccoNOQP diploid soyu TetR, Nadi+, F+ Koch ve ark. (1998) IJ1 Sitokrom cbb3 oksidaz mutantı Nadi −, F−/ MPYE, Koch ve ark. F+/ MedA (1998) 47 Çizelge 3.1 (Devam) Soy Genotip Fenotipc Kaynak MR2 Sitokrom cbb3 oksidaz mutantı Nadi −, F−/ MPYE, Koch ve ark. F+/ MedA (1998) Y262 Gen Transfer Ajan (GTA) Yen ve ark. partiküllerini fazla (1979) miktarda üreten soy GK32 ∆(ccoNO:: kan) Nadi −, F+ Koch ve ark. (1998) CW1 ∆(ccoGHIS:: spe) Nadi −, F+ Koch ve ark. (2000) AYG4 Sitokrom cbb3 oksidaz mutantı TetR, Nadi −, F−/ MPYE, Aygün (1999) F+/ MedA AYG4-25 pOX15 plazmiti çıkartılmış AYG4 mutantı TetS, Nadi −, F−/ MPYE, Aygün (1999) F+/ MedA SA1 RRC00138::spe Nadi −, F−/ MPYE, Bu çalışma F+/ MedA SA2 + + RRC00136::spe Nadi , F Bu çalışma SA3 [ ( + + ∆ ilvD-ExoD):: spe] Nadi , F Bu çalışma 48 Çizelge 3.1 (Devam) Soy Genotip Fenotipc Kaynak SA4 [∆(RRC00138):: spe] Nadi −, F−/ MPYE, Bu çalışma F+/ MedA SA5 [∆(RRC00140):: spe] Nadi +, F+ Bu çalışma SA6 [∆(RRC00139):: spe] Nadi −, F−/ MPYE, Bu çalışma F+/ MedA SA8 ∆[(RRC00139-RRC00138):: spe] Nadi −, F−/ MPYE, Bu çalışma F+/ MedA S. meliloti Sm 1021 Yaban soy Weissenmayer ve ark. (2002) ORLD1 KanR olsA::kan Weissenmayer ve ark. (2002) AAK1 R olsB::kan Kan Gao ve ark. (2004) 49 Çizelge 3.1 (Devam) Soy Genotip Fenotipc Kaynak Plazmitler pRK2013 + Rtra (RK2) Kan , konjugatif yardımcı Ditta ve ark. plazmit (1985) pRK404/ pRK415 RK2 TetR, konakçı sınırı geniş Ditta ve ark. vektör (1985) pBR322 TetR AmfR, klonlama Sambrook ve ark. vektörü (1989) pHP45Ω Spektinomisin antibiyotik kaseti (Ωspe) pHP45 SpeR StrR AmfR Prentki ve Krisch vektöründe (1984) pOX15 Sitokrom cbb3 oksidaz enziminin ccoNOQP yapısal Tet R Koch ve ark. genleri pRK404 vektöründe (1998) pMRC 5.6 kbç lik kromozomal EcoRI DNA parçası pLAFR1 TetR Koch ve ark. vektöründe (1998) pMRC2 4.5 kbç lik kromozomal EcoRI DNA parçası pRK415 TetR Koch ve ark. vektöründe (1998) pMRB/pAY1 7 kbç lik kromozomal BamHI DNA parçası pRK404 TetR Koch ve ark. vektöründe (1998), Aygün (1999) 50 Çizelge 3.1 (Devam) Soy Genotip Fenotipc Kaynak pMRB4 1.5 kbç lik kromozomal EcoRI DNA parçası pRK415 TetR Koch ve ark. vektöründe (1998) pSEM1 pMRC2 plazmitin BamHI enzimi ile kesilmesi ve uçların TetR Bu çalışma birleşmesi (1200 bç lik delesyon) pSEM2 pSEM1 plazmiti üzerindeki RRC00136 genine özgü XhoI TetR SpeR Bu çalışma dizisinden spe kasetini taşıyan 2.0 kbç lik SmaI DNA parçasının yerleştirilmesi pSEM3 pSEM1 plazmiti üzerindeki ilvD-ExoD genlerindeki TetR SpeR Bu çalışma 1365 bç lik BstEII DNA parçasının çıkarılıp, spe kasetini taşıyan 2.0 kbç lik SmaI DNA parçasının yerleştirilmesi pSEM4 pMRC plazmiti üzerindeki R R RRC00138 genine özgü Tet Spe Bu çalışma BamHI enzim dizisinden, spe kasetini içeren 2.0 kbç lik DNA parçasının klonlanması pSEM5 pMRC plazmit üzerindeki 5.3 kbç lik EcoRV-HindIII AmfR Bu çalışma DNA parçasının, pBR322 vektörüne aynı enzim dizilerinden klonlanması pSEM6 pSEM5 plazmitindeki RRC00140 genine ait 19 bç lik SpeR AmfR Bu çalışma HpaI DNA parçasının çıkarılıp, yerine spe kasetini taşıyan 2.0 kbç lik SmaI DNA parçasının yerleştirilmesi pSEM7 pSEM6 plazmitindeki 2.6 kbç lik PstI DNA parçasının TetR SpeR Bu çalışma pRK415 vektörüne PstI enzim dizisinden klonlanması 51 Çizelge 3.1 (Devam) Soy Genotip Fenotipc Kaynak pSEM8 pSEM5 plazmitindeki R RRRC00139 genine ait 313 bç lik Spe Amf Bu çalışma RsrII DNA parçasının çıkarılıp, yerine spe kasetini taşıyan 2.0 kbç lik SmaI DNA parçasının yerleştirilmesi pSEM9 pSEM8 plazmitindeki 2.7 kbç lik XhoI-Bsu36I DNA TetR SpeR Bu çalışma parçasının, BamHI restriksiyon enzim dizisinden pRK415 vektörüne klonlanması pSEM10 pSEM5 plazmitindeki R RRRC00138 genine ait 522 bç lik Tet Spe Bu çalışma BstXI-NotI DNA parçasının çıkarılıp, yerine spe kasetini taşıyan 2.0 kbç lik SmaI DNA parçasının yerleştirilmesi pSEM11 pSEM10 plazmitindeki 5.3 kbç lik EcoRV-EcoRI DNA TetR SpeR Bu çalışma parçasının, BamHI restriksiyon enzim dizisinden pRK415 vektörüne klonlanması pSEM12 pSEM5 plazmitinde RRC00138-RRC00139 genlerini SpeR AmfR Bu çalışma içeren 2.0 kbç lik MluI DNA parçasının çıkarılıp, yerine spe kasetini taşıyan 2.0 kbç lik SmaI DNA parçasının yerleştirilmesi pSEM13 pSEM12 plazmitindeki 5.0 kbç lik EcoRV-Bsu36I DNA TetR SpeR Bu çalışma parçasının, BamHI restriksiyon enzim dizisinden pRK415 vektörüne klonlanması 52 Çizelge 3.1 (Devam) Soy Genotip Fenotipc Kaynak pSEM16 pSEM10 plazmitindeki 5.6 kbç lik EcoRV-HpaI DNA TetR SpeR Bu çalışma parçasının, BamHI restriksiyon enzim dizisinden pRK415 vektörüne klonlanması pBAD/Myc-HisA AmfR , PBAD promotoru Invitrogen kontrolünde arabinoz ile indüklenen dozaja bağlı vektör pSEM17 RRC00138 genini içeren 828 bç lik PZR ürününün NcoI- AmfR Bu çalışma EcoRI dizilerinden pBAD/Myc-HisA vektörüne klonlanması pSEM18 pSEM17 plazmitinin NsiI restriksiyon enzim dizisinin, TetR AmfR Bu çalışma PstI restriksiyon dizisinden pRK415 vektörüne klonlanması pSEM19 R RRC00139 genini içeren 777 bç lik PZR ürününün NcoI- Amf Bu çalışma ScaI dizilerinden pBAD/Myc-HisA vektörüne klonlanması pSEM20 pSEM19 plazmitinin NsiI dizisinin, PstI restriksiyon TetR AmfR Bu çalışma dizisinden pRK415 vektörüne klonlanması pBW51 R S. meliloti olsA geni Tet Weissenmayer ve ark. (2002) 53 Çizelge 3.1 (Devam) Soy Genotip Fenotipc Kaynak pJG21 S. meliloti olsB geni TetR Gao ve ark. (2004) . aR capsulatus MT1131, üreme özellikleri ve c-tipi sitokrom profilleri nedeniyle yaban soy olarak tanımlanmıştır. Y262 ve AYG4 soyları dışında diğer tüm R. capsulatus soyları MT1131 soyu türevidir. bMT1131/pOX15, yaban soya (MT1131) kıyasla beş kat daha fazla sitokrom cbb3 oksidaz enzimini üretir (Koch ve ark., 1998). cF, fotosentetik üremeyi; Nadi, sitokrom c oksidaz aktivitesine bağlı α-naftol ’ün indofenol mavisine dönüşüm reaksiyonunu; AmfR, KanR, RifR, SpeR, StrR ve TetR sırasıyla amfisilin, kanamisin, rifampisin, spektinomisin, streptomisin ve tetrasiklin antibiyotiklerine dirençliliği; TetS, tetrasikline duyarlılığı; tra+, transfer genlerinin varlığını gösterir. 46 3.2. Yöntem 3.2.1. Bakteri Soylarının Üreme Koşulları R. capsulatus soyları fotosentetik ve aerobik üreme koşullarında zenginleştirilmiş besi ortamında (MPYE) (Daldal ve ark., 1986) ya da karbon kaynağı olarak süksinat içeren minimal besi ortamında (MedA) (Sistrom, 1960) (Ek-1) üretildi. Gerektiğinde antibiyotikler belirli konsantrasyonlarda (tetrasiklin, 2.5 µg/ml; kanamisin, 10 µg/ml; spektinomisin, 10 µg/ml) (Jenney ve Daldal, 1993) besi ortamına ilave edildi. Bakteriler karanlıkta aerobik koşullar altında 35 ya da 25°C ’de petri kabında 2-3 gün veya çalkalayıcılı inkübatörde (150-200 devir/dakika) sıvı kültürde 18- 24 saat süreyle üretildi. Fotosentetik koşullarda ise bakteriler, 35 ya da 25°C sıcaklıkta ışık varlığında (tungsten lambası, 60W) petri kabında hidrojen ve karbondioksit üreten gaz paketleri (BBL Microbiology systems, Cockeyville, MD) ile üç gün süreyle inkübe edildi. E. coli konakçı soyları ve plazmit içeren hücre soyları aerobik üreme koşullarında zengin Luria-Bertani (LB) besi ortamında (Miller, 1972) (Ek-1) gerektiğinde uygun antibiyotikler (50 µg/ml kanamisin, 12.5 µg/ml tetrasiklin, 100 µg/ml amfisilin, 50 µg/ml spektinomisin) ilave edilerek üretildi. E. coli soyları petri kabında veya sıvı kültürde yüksek devirli çalkalayıcı inkübatörde 37°C ’de yaklaşık 16 saat süreyle inkübe edildi (Sambrook ve ark., 1989). E. coli 1-açil-sn-gliserol-3-fosfat açiltransferaz (AGPAT) mutantları (plsC(Ts), Coleman, 1990) LB besi ortamında 28°C sıcaklıkta; sn-gliserol-3-fosfat açiltransferaz (GPAT) (PlsB-G3P oksotrofik, Rock ve Jackowski, 1982) mutantı ise G3P içeren minimal besi yerinde (MedE) (Ek-1) (Miller, 1972) 37°C sıcaklıkta üretildi. 3.2.2. Standart DNA Manipulasyonları 5-10 ml ’lik E. coli kültürlerinden plazmit DNA izolasyonu QIAprep® Spin Miniprep kiti kullanılarak yapıldı. Restriksiyon enzim kesimleri, klonlama, transformasyon ve agaroz jel elektroforezi gibi moleküler genetik teknikler standart 47 protokollerden (Sambrook ve ark., 1989) yararlanılarak gerçekleştirildi. Restriksiyon endonükleazlarla kesim sonunda elde edilen DNA parçalarının agaroz jelden izolasyonu QIAquick gel extraction kit kullanılarak yapıldı. Gerektiğinde yapışkan DNA uçları (örneğin, plazmit DNA ’sının BamHI veya EcoRI gibi restriksiyon endonükleazlar ile kesimi), Klenow fragmenti ve deoksinükleozit trifosfat (dNTP) (Amersham) karışımı ile 37°C ’de 1 saat ve 75°C ’de 10 dakika ’lık inkübasyonlar sonunda küt uç haline getirildi. Klonlama da, vektör/insört oranı 1:1, 1:2 ya da 1:3 olacak şekilde DNA uçları T4 DNA ligaz enzimi aracılığında 4°C ’de 16 saatlik inkübasyon ile birleştirildi. Klonlama ürünleri ve plazmit DNA ’ları kompatent E. coli soylarına (HB101, TOP10, SM2-1 veya SJ22) elektrotransformasyon (MicroPulserTM, Biorad) yöntemiyle aktarıldı. DNA dizilerinin amplifikasyonu Pfu DNA polimeraz enziminin (Stratagene) varlığında Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) tekniği kullanılarak (GeneAmp 9600, Perkin Elmer Cetus) gerçekleştirildi. 3.2.3. DNA Dizi Analizi ve Biyoinformatik Analizler Otomatik DNA dizi analizleri, Big-dye terminator cycle sequencing kit (AmfliTaq FS’, Applied Biosystems) ve oligonükleotidler kullanılarak Pennsylvania Üniversitesi ’nin Dizi Analiz biriminde yaptırılmıştır. Elde edilen DNA dizilerindeki restriksiyon endonükleaz kesim noktalarının belirlenmesinde MacVectorTM 7.2.3 programından (IBI, Kodak) yararlanıldı. Homoloji araştırmalarında BLAST2 (tblastn) programı (Altschul ve ark., 1990) ve amino asit dizi karşılaştırmalarında ise CLUSTALW programı (Thompson ve ark., 1994) kullanıldı. 3.2.4. Gen İnaktivasyonu (İnterpozon Mutagenezi) MR2, IJ1 ve AYG4 mutantlarının Nadi fenotipinden sorumlu dokuz protein kodlayıcı bölge (ORF) içeren 5.6 kbç ’lik pMRC insörtünün restriksiyon enzim haritası MacVectorTM 7.2.3 programı kullanılarak elde edildi. Böylece kromozomal DNA parçası üzerinde yer alan ORF ’leri bir ya da birden fazla noktadan kesen ve hiç kesmeyen restriksiyon endonükleaz enzimleri belirlendi. Daha sonra ‘Knock-out’ yönteminden (interpozon mutagenez) yararlanılarak, insört üzerinde yer alan genlerin 48 fonksiyonları tamamen elimine edildi. Bunun için, pHP45omega plazmitindeki (Prentki ve Krisch, 1984) spektinomisin antibiyotik direnç (spe) kaseti (Şekil 3.1) insört üzerindeki genlere yerleştirilerek delesyon-insersiyon allel inaktivasyonu ile gen etkisiz hale getirildi. pMRC2 plazmit (Şekil 3.2) DNA ’sı, klonu iki noktadan kesen BamHI restriksiyon enzimi ile kesime tabi tutuldu ve 13.8 ve 1.3 kbç ’lik kesim ürünleri elde edildi. 13.8 kbç ’lik DNA parçası agaroz jelden izole edilerek, DNA fragmentleri ligaz enzimi ile birleştirildi. Elde edilen pSEM1 plazmiti (Şekil 3.2) üzerinde yer alan ORF lerin bir kısmı delesyon-insersiyon allel inaktivasyonu ile inaktive edildi. Buna göre, RRC00136 geninin insersiyonel mutagenezi için; pSEM1 plazmit DNA ’sı üzerinde taşıdığı 215 bç uzunluğundaki RRC00136 genini tek noktadan kesen XhoI restriksiyon enzimi ile kesildi. Linear hale getirilen pSEM1 plazmit DNA ’sı daha sonra küt uç haline getirildi. Diğer yandan, pHP45omega plazmiti SmaI ve PstI enzimleri ile kesildi ve elde edilen 2 kbç ’lik spe kasetini içeren SmaI-SmaI DNA parçası jelden izole edildi. Küt uç SmaI restriksiyon enzim dizilerine sahip spe kasetini taşıyan DNA parçası ile pSEM1 plazmit DNA sı birleştirildi ve pSEM2 plazmiti (RRC00136::spe) elde edildi (Şekil 3.2). RRC00132 ve RRC00133 genlerinin birlikte delesyonu için, pSEM1 plazmit DNA ’sı, BstEII restriksiyon enzimi ile kesilerek, 12.5 ve 1.3 kbç ’lik kesim ürünleri elde edildi. 12.5 kbç ’lik DNA parçası agaroz jelden izole edildi ve küt uç haline getirildi. Daha sonra SmaI restriksiyon enzim dizilerine sahip 2 kbç ’lik spe kaseti ile birleştirilerek pSEM3 [∆(RRC00132-RRC00133::spe)] plazmiti elde edildi (Şekil 3.2). 49 Şekil 3.1. pHP45 omega plazmit haritası (Prentki ve Krisch, 1984). Sm, streptomisin; Spc, spektinomisin ve Ap, amfisilin antibiyotik direnç genini; ( ) transkripsiyon yönünü; ( ) ise translasyon ve sonlanma sinyallerini gösterir. pMRC plazmit DNA ’sı EcoRV ve HindIII restriksiyon enzimleri ile kesilerek 5.3 kbç ’lik DNA parçası aynı enzim dizileri ile kesilmiş 4.3 kbç ’lik alt klonlamalara elverişli olan pBR322 vektörüne (Sambrook ve ark., 1989) klonlandı ve pSEM5 plazmiti elde edildi. Daha sonra pSEM5 plazmitinin üzerinde yer alan ORF ’ler inaktive edildi. Buna göre, RRC00140 geninin delesyonu için, pSEM5 plazmit DNA ’sı, geni iki noktadan kesen HpaI restriksiyon enzimi ile kesildi. Kesim sonunda RRC00140 geninden çıkan 19 bç ’lik DNA parçasının yerine SmaI enzimi ile kesilmiş 2 kbç ’lik spe kaseti yerleştirildi. Elde edilen klon pSEM6 [∆(RRC00140::spe)] olarak isimlendirildi. RRC00139 geninin delesyonu için, pSEM5 plazmit DNA ’sı, RRC00139 genini iki noktadan kesen RsrII restriksiyon enzimi ile kesildi. Kesim sonunda RRC00139 ’dan çıkan 313 bç ’lik DNA parçasının yerine SmaI enzimi ile kesilmiş 2 kbç ’lik spe kaseti yerleştirildi. Elde edilen klon pSEM8 ∆[RRC00139::spe] olarak isimlendirildi. RRC00138 ve RRC00139 genlerinin birlikte delesyonu için; pSEM5 plazmit DNA sı, üzerinde yer alan RRC00138 ve RRC00139 genlerinin ikisini de kesen MluI restriksiyon enzimi ile kesimle tabi tutuldu. Elde edilen 7.5 ve 2 kbç ’lik kesim ürünlerinden 7.5 kbç ’lik DNA parçası agaroz jelden izole edildi. Uçlar küt uç haline getirildikten sonra 2 kbç ’lik SmaI dizisine sahip spe kaseti ile birleştirilerek pSEM12 plazmiti ∆[RRC00138-RRC00139::spe] elde edildi. Şekil 3.2. pMRC2 türevi plazmitlerin fiziksel ve genetik haritası. Plazmit üzerinde yer alan ORF lerin transkripsiyon yönleri oklarla; Ω-spe kaseti, çapraz çizgili kutu ve restriksiyon endonükleazlar (BamHI ve EcoRI) ise Ba ve E şeklinde gösterilmiştir. 51 RRC00138 geninin insersiyonu için, pMRC plazmit DNA ’sı RRC00138 genini tek noktadan kesen BamHI enzimi ile kesildi. Linear hale getirilen pMRC plazmit DNA ’sı, BamHI enzimi ile kesilmiş 2 kbç ’lik spe kasetini veren diziler ile birleştirilerek pSEM4 plazmiti (RRC00138::spe) elde edildi (Şekil 3.3). RRC00138 geninin delesyonu için ise, pSEM5 plazmiti DNA ’sı, RRC00138 genini kesen BstXI ve NotI enzimleri ile kesildi ve 9.1 ve 0.5 kbç ’lik DNA parçaları elde edildi. Agaroz jelden izole edilen 9.1 kbç ’lik DNA parçası küt uç haline getirildi ve SmaI dizilerine sahip 2 kbç ’lik spe kaseti ile birleştirildi. Elde edilen klon pSEM10 [∆(RRC00138::spe)] olarak isimlendirildi. Elde edilen pSEM2, pSEM3, pSEM4, pSEM6, pSEM8 ve pSEM12 plazmitleri restriksiyon enzim kesimleri ve üzerinde taşıdıkları gen(ler)e özgü primerler kullanılarak dizi analizi ile doğrulandı. pSEM5 plazmiti pBR322 vektör türevi olduğundan, pSEM5 plazmiti üzerinde yer alan inaktif genleri R. capsulatus bakterisine aktarabilmek için, bu genleri taşıyan DNA fragmentleri konjugatif özellikteki RK2 türevi pRK415 vektörüne klonlandılar. Buna göre, PstI enzimi ile kesilerek pSEM6 plazmit DNA ’sından elde edilen 2627 bç ’lik DNA parçası, PstI enzimi kesilerek linear hale getirilmiş 10.6 kbç ’lik pRK415 vektörüne klonlandı ve pSEM7 plazmiti [∆(RRC00140::spe)] elde edildi (Şekil 3.3). Diğer yandan, pSEM8 plazmit DNA ’sının XhoI ve Bsu36I enzimleri ile kesildi ve elde edilen DNA parçası küt uç haline getirildi ve BamHI enzimi ile kesilmiş ve devamında küt uç hale getirilmiş pRK415 vektörüne klonlandı. Elde edilen yeni klon pSEM9 [∆(RRC00139::spe)] olarak isimlendirildi (Şekil 3.3). Yine, pSEM10 plazmit DNA ’sı EcoRV-EcoRI enzimleri ile kesilerek elde edilen 5321 bç ’lik DNA parçası jelden izole edildi ve küt uç hale getirildi. Daha sonra BamHI enzimi ile kesilmiş ve küt uç haline getirilmiş pRK415 vektör DNA ’sı ile birleştirilerek pSEM11 plazmiti [∆(RRC00138::spe)] elde edildi (Şekil 3.4). pSEM10 plazmit DNA ’sı EcoRI-HpaI enzimleri ile kesildi ve elde edilen 5321 bç ’lik DNA parçası jelden izole edilerek devamında küt uç haline getirildi. Daha sonra BamHI enzimi ile kesilmiş ve küt uç haline getirilmiş pRK415 vektör DNA ’sı ile birleştirildi ve elde edilen yeni klon pSEM16 [∆(RRC00138::spe)] olarak isimlendirildi (Şekil 3.4). pSEM12 plazmit DNA 52 sının ise EcoRV ve Bsu36I enzimleri ile kesilmesiyle elde edilen 4.9 kbç lik kesim ürünü jelden izole edildi ve uçlar küt uç hale getirildi. BamHI enzimi ile kesilerek linear hale getirilen ve devamında uçları küt uç haline getirilen pRK415 vektör DNA ’sı ile birleştirilerek pSEM13 [∆(RRC00138-RRC00139::spe)] olarak isimlendirilen yeni bir klon elde edildi (Şekil 3.4). Şekil 3.3. pMRC türevi plazmitlerin fiziksel ve genetik haritası. Plazmit üzerinde yer alan ORF lerin transkripsiyon yönleri oklarla; Ω-spe kaseti, çapraz çizgili kutu ve restriksiyon endonükleazlar (BamHI, EcoRI, PstI, RsrII ve XhoI) ise Ba, E, Ps, Rs ve Xh şeklinde gösterilmiştir. Şekil 3.4. pSEM5 türevi plazmitlerin fiziksel ve genetik haritası. Plazmit üzerinde yer alan ORF lerin transkripsiyon yönleri oklarla; Ω-spe kaseti, çapraz çizgili kutu ve restriksiyon endonükleazlar (BstXI, Bsu36I, EcoRI, EcoRV, MluI ve NotI) ise Bs,Bsu, E, EV, Ml ve N şeklinde gösterilmiştir 55 3.2.5. Konjugasyon (Üçlü Eşleşme) RK2 türevi pRK415 plazmiti üzerinde yer alan genler, pRK2013 yardımcı plazmit (Ditta ve ark., 1985) aracılığında üçlü eşleşme (konjugasyon) yöntemiyle R. capsulatus mutant soylarına aktarıldı. Bunun için, R. capsulatus soylarının 10 ml ’lik MedA sıvı besiyerinde; yardımcı veya verici plazmit içeren hücreler ise uygun antibiyotik içeren 5 ’er ml sıvı LB besiyerlerindeki kültürleri hazırlandı. R. capsulatus soylarının 630 nm, E. coli soylarının ise 600 nm dalga boyundaki hücre yoğunlukları ölçüldü. Daha sonra R. capsulatus ve E. coli soylarına ait hücreler santifüjle çöktürüldü (oda sıcaklığı, 2500xg, 10 dakika) ve antibiyotikten arındırılmak için hücreler üç kez sıvı MedA içerisinde süspanse edildi. : OD =1 ’de 7.5x108 R. capsulatus 630nm hücre/ml ve 8 E. coli: OD600nm=1 ’de 5.0x10 hücre/ml formülünden yararlanılarak hücreler MedA besiyerinde süspanse edildi. Alıcı R. capsulatus hücrelerin, verici E. coli hücresine oranı 1/5 olacak şekilde MedA petri kabının ortasına 100 µl alıcı hücreler, diğer iki yanına da 20 ’şer µl yardımcı ve verici hücreler konuldu. Hücreler petri kabının ortasında cam çubuğun köşesi ile iyice karıştırılarak 35°C sıcaklıkta gece boyu üremeye bırakıldı. Daha sonra hücreler üzerine 1 ml sıvı MedA eklenerek, hücreler cam çubuk yardımıyla petri kabının kenarına toplatıldı ve eppendorf tüplerine aktarıldı. Hücreler santrifüjle çöktürülerek üç kez MedA ile yıkandı ve en son aşamada hücreler 400 µl MedA ’de süspanse edildi. Hücre süspansiyonları, aktarılan verici plazmitin taşıdığı antibiyotik markırına bağlı olarak uygun antibiyotik içeren seçici MedA-agar petri kaplarına 5, 10 ve 50 ’şer µl olacak şekilde yayıldı. Hücreler 3-4 gün süreyle 35°C ’lik inkübatörde üremeye bırakıldı. 3.2.6. Null (‘Knock-out’) Mutantların Eldesi Kromozomal (knock-out veya null) mutantların eldesi, R. capsulatus bakterisine özgü Gen Transfer Ajanı (GTA) aracılığında homolog rekombinasyon yoluyla (Yen ve ark., 1979) gerçekleştirildi. GTA, kültür içinde diğer hücrelere genetik bilgi aktaran bir vektör olarak iş görmekte olup, transdüksiyona benzeyen bir genetik aktarım gerçekleştirir. Buna göre, rasgele üretilen hücre genomunun yaklaşık 4.5 kbç ’lik DNA parçası homolog rekombinasyon yolu ile alıcı bakteriye aktarılır. 56 Delesyon-insersiyon alleli taşıyan plazmitler (pSEM2, pSEM3, pSEM4, pSEM7, pSEM9, pSEM11, pSEM13 ve pSEM16; bkz. Bölüm 3.2.4) R. capsulatus bakterisinin GTA ’yı fazla miktarda üreten Y262 soyuna konjugasyon yöntemi ile aktarıldı. Transkonjugantlar, plazmitlerin taşıdığı spektinomisin (Spe) antibiyotik kasetinden dolayı MedA+Spe besi yerinde seçildiler. Daha sonra 50 transkonjugant, iki farklı MedA+Spe petri kabına kısa çizgiler halinde çizilerek 35°C ’de bir gün süreyle inkübe edildi. GTA ek vitaminlere gereksinim duyduğundan, bu aşamadan sonra zenginleştirilmiş besi yeri (MPYE) kullanıldı. Hücrelerin üzerine 1-2 ml sıvı MPYE besiyeri konularak, hücreler petri kabından toplandı ve santrifüjle çöktürüldü. Hücreler iki kez 1 ml MPYE besi yerinde süspanse edilip, santrifüjle çöktürüldü. En son aşamada hücreler 1 ml MPYE ’de süspanse edilip ağzı sıkı kapanan 14 ml ’lik cam tüplerine aktarıldı ve bir gün süreyle 35°C ’de anaerobik fotosentetik şartlarda üretildiler. Ertesi gün, tüp ağzına kadar MPYE besi yeri ile doldurularak hücreler lizis aşamasına gelinceye kadar (3-5 gün) fotosentetik şartlarda üretilmeye devam edildi. GTA partiküllerini taşıyan transkonjugantlar lizis aşamasına ulaştıktan sonra 3-5 dakika süreyle santrifüjle çöktürüldü (800xg). Üst fazdan yaklaşık 3-4 ml alınarak önce 0.45 µm daha sonra da 0.2 µm ’lik filterdan geçirildi. Diğer yandan çaprazlamadan bir gün önce hazırlananan alıcı yaban soyunun (MT1131) 10 ml ’lik MPYE sıvı kültürü de santrifüjle çöktürüldü (2.500xg, 10 dakika). Hücreler daha sonra üç kez 3 ml GTA tamponu [10 mM Tris-HCl (pH:7.8), 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 1 mM NaCl ve 500 µg/ml BSA (Sigma fraction V)] ile yıkanarak santrifuj ile çöktürüldü. En son aşamada da hücreler 1 ml GTA tamponunda süspanse edilerek çaprazlamada kullanılmaya hazır hale getirildi. GTA çaprazlama; 100 µl alıcı, 100 µl GTA ve 100 µl GTA tampon çözeltisi içeren 4.5 ml ’lik kültür tüplerinde gerçekleştirildi. Kontrol olarak, sadece GTA ve GTA tamponu veya sadece alıcı soy ve GTA tamponu içeren çaprazlama tüpleri de hazırlandı. Tüpler önce 37°C ’de 10 dakika, daha sonra da 35°C ’de 2 saat süreyle inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında, tüplere 3 ml %0.7 ’lik agar içeren MPYE eklenerek, transdüktantlar MPYE+Spe petri kaplarına döküldü. Petriler 3-4 gün süreyle 35°C ’de inkübe edildi. Elde edilen null mutantlar MPYE+Spe içeren petrilere çizildi ve Nadi reaksiyonunu katalizleyebilme yetenekleri test edildi. 57 3.2.7. Sitokrom c Oksidaz Aktivite Testi (Nadi Reaksiyonu) Knock-out mutantların ve inaktif genleri taşıyan plazmitlerin mutantları tamamlama yetenekleri Nadi reaksiyonu ile test edildi. Bunun için, sitokrom c oksidaza özel elektron vericisi olan DMPD (N,N-dimetil-p-fenilendiamin) (Sigma, D-5004) ve ∝- Naftol (Sigma, N-1000) kullanımıyla reaksiyon (DMPD + ∝-Naftol + O2→ indofenol mavisi + H2O) gerçekleştirildi (Keilin, 1966). 0.1 gr ∝-Naftol, 10 ml etanol içerisinde (35 mM); 0.1 gr DMPD de 10 ml suda (30 mM) çözülerek 1:1 (v/v) oranında karıştırıldı ve aerobik koşullarda büyümüş bakterilerin üzerine döküldü. Aktif sitokrom c oksidaz enzimine sahip koloniler 30 sn içinde mavi renge dönüşürken (Nadi+), oksidaz aktivitesinden yoksun koloniler ise Nadi boyası ile reaksiyon vermezler (Nadi−). Nadi reaksiyonu sadece sitokrom cbb3 oksidaz enziminin sitokrom co ve sitokrom cp proteinlerine gereksinim duyduğundan, sitokrom c1, sitokrom cy veya sitokrom c2 ’nin eksikliği Nadi reaksiyonunu etkilemez. 3.2.8. İntrasitoplazmik Membran Vesiküllerinin (Kromotofor Membran) Eldesi İç-dış membran vesikülleri (intrasitoplazmik membran vesikülleri ya da kromotofor) yüksek basınç altınta hücrelerin parçalanması ile izole edildi (Gray ve ark., 1994). Bunun için, öncellikle R. capsulatus ’un yaban soy (MT1131) ve knock-out mutantlarının 1 ’er litrelik MPYE veya MedA sıvı besiyerlerinde 35° veya 25°C sıcaklıkta aerobik (ve MedA besi yerinde 35° C de fotosentetik) koşullardaki kültürleri hazırlandı. Hücreler logaritmik üreme fazına (OD630 ~ 0.6) ulaştıklarında santrifujle çöktürüldü (2500xg, 4ºC, 30 dakika). Daha sonra hücreler MOPS (morpholine propanesulfonic acid) tamponu (50 mM MOPS, pH:8 /1 mM KCl) ile iki kez yıkanarak üst sıvılar tamamen uzaklaştırıldı. Pellet 10 ml MOPS tamponu ile buzda süspanse edildi ve 1 mM PMSF, 10 mM MgCl2, 0.05 mg/ml RNAz ve 0.05 mg/ml DNAz ilave edildi. Hücreler 18,000 psi ’lik yüksek basınçta (French pressure cell press, SLM Aminco) iki kez parçalandı ve hücrelere 10 mM EDTA (pH.8) ilave edildi. Parçalanmamış hücreleri ve büyük membran parçalarını elimine etmek için hücreler 25.000xg ’de 4°C ’de 45 dakika süreyle çöktürüldü (Beckmann J2-21). Tüpteki üst sıvı bir pipetle alınarak ultrasantrifüj tüpüne aktarıldı ve 4°C ’de 2 saat süreyle (150.000xg, 58 Sorvall Ultracentrifuge, Beckmann L8-70M) çöktürüldü. Oluşan üst sıvı, suda çözünen c-tipi sitokromları; pellet ise kromatofor membranlarını içerir. Kromatofor membran eldesi için pelet 10 ml MOPS/KCl içerisinde çözülerek bir kere daha ultrasantrifüjle çöktürüldü (150.000xg, 4°C, 1 saat). Böylece oluşan pelletin üst sıvısı tamamen uzaklaştırılarak, oluşan pelet 200-500 µl MOPS/KCl içerisinde çözüldü ve kullanıncaya kadar -85ºC ’de saklandı. Çözünür formdaki proteinleri membran parçacıklarından ayırmak için üst sıvı 150.000xg ’da 4-8 saat süreyle çöktürüldü. Daha sonra üst sıvı kolondan (YM-10, Milipore) geçirilerek konsantre edildi ve -85ºC ’de saklandı. Protein konsantrasyonu, standart olarak sığır serum albumü (BSA) kullanılarak Lowry metoduna (Lowry ve ark., 1951) göre belirlendi. 3.2.9. Hem Boyama ile C-Tipi Sitokromların Analizi Membrana bağlı ya da çözünür formdaki sitokrom c proteinlerini gözlemek için öncellikle, 100 µg kromotofor membranı ya da çözünür fraksiyon 1:1 oranında 1X SDS- jel yükleme boyası (75 mM Tris (pH.7), %6 SDS, %15 gliserol (w/v), %0.025 bromofenol mavisi ve %3 β-merkaptoetanol) ile karıştırıldı ve 37°C ’de 10 dakika süreyle ısıtılarak proteinler denatüre edildi. Daha sonra 28-32 kDa moleküler ağırlığı arasındaki c-tipi sitokromları iyi ayırabilmek için, proteinler %16.5 akrilamit ve %3 kross-linker içeren Trisin-SDS-PAGE (Schägger ve von Jagow, 1987) (Ek-2) ’de ayrıştırıldı. Protein bandların iyi ayrılması için kullanılan büyük jel sisteminde (Bio- Rad) örnekler kuyudan çıkıncaya kadar 30V ’da yaklaşık 30-40 dakika daha sonra da 90V ’da 16-20 saat süreyle yürütüldüler. Proteinler Trisin-SDS-PAGE ’de yürütüldükten sonra, sülfihidril grubu içeren β- merkaptoetanol ün jelden uzaklaştırılması için, jel 1 saat süre ile 4-5 kez değiştirilmek suretiyle ön yıkama solüsyonunda [0.25M Sodyum Asetat (pH:5/Asetik asit)] inkübe edildi. Daha sonra membrana bağlı veya çözünür formdaki c-tip sitokromlar, kovalent olarak bağlı hem gruplarının endojenik peroksidaz aktivitelerine sahip olmaları özelliğiyle 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMBZ) ve hidrojen peroksit (H2O2) (Thomas ve ark., 1976) kullanarak gözlendi. Buna göre jel, 40 ml TMBZ boyası [(3:7) 6.3 mM TMBZ:0.25M Sodyum asetat (pH:5/Asetik asit)] içerisinde karanlık bir ortamda 1 saat 59 süreyle inkübe edildi. 18 mg TMBZ (Aldrich Chemical Co., 86,033-6) 12 ml metanolde alüminyum folye ile muhafaza edilmiş bir kab içerisinde boya tamamen çözününceye kadar 20-30 dakika süreyle karıştırıldı. Daha sonra üzerine 28 ml sodyum asetat solüsyonu eklendi ve karışım jel üzerine döküldü. Bir saatlik inkübasyon sonrasında jele %30 ’luk H2O2 den mikropipetle eklendi. Protein bandları belirdikten sonra jele geri yıkama solüsyonu [(3:7) 3 ml isoproponol:7 ml Na-Asetat] veya dH2O ya alındı ve resimlendi. 3.2.10. RRC00138 Gen Ürününün Kontrollü İşleyişi 3.2.10.1. RRC00138 Geninin Klonlanması RRC00138 geni kalıp DNA olarak pMRC plazmit DNA ’sı ve NcoI ve EcoRI restriksiyon enzim dizileri içeren oligonükleotidler (RRC00138-NcoI 5′-GGACG CCCATGGCACGACCGATCTGG-3′ ve RRC00138-EcoRI 5′-CTGCGCGAATTC CGCGACCGCTGACC-3′) kullanılarak Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) tekniği ile çoğaltıldı. Buna göre, %15 (v/v) gliserol, 0.1 mM dNTP, 100 pmol oligonükleotid, 100 ng pMRC plazmit DNA ’sı ve 2.5 U Pfu DNA polimeraz enziminden (Stratagene) oluşan PZR reaksiyon tüpü hazırlandı. R. capsulatus genomu guanin ve sitozin nükleotidleri açısından oldukça zengin olduğundan, reaksiyon tüplerine gliserol eklenmesine ilaveten reaksiyon tüpleri PZR döngüsünden önce 98°C ’de 10 dakika süreyle inkübe edildi. Daha sonra 98°C ’de 30 saniye, 62°C ’de 20 saniye ve 72°C ’de 2 dakikadan oluşan 30 devirlik PZR programı kullanıldı. En son aşamada ise PZR tüpleri 72°C ’de 10 dakika ve 4°C ’de gece boyu inkübe edildi. RRC00138 genini içeren PZR ürünü PBAD promotoru ve AraC regülatör proteininin kontrolünde L-arabinoz ile indüklenebilen pBAD/Myc-HisA vektörüne (Invitrogen, Şekil 3.5A) klonlandı. Bunun için, 828 bç ’lik PZR ürünü NcoI ve EcoRI restriksiyon enzimleri ile kesildi ve aynı enzimler ile kesilmiş pBAD/Myc-HisA vektör DNA ’sının uçları ile birleştirildi. Böylece elde edilen yeni klon pSEM17 olarak isimlendirildi (Şekil 3.5B). pSEM17 plazmiti üzerinde yer alan RRC00138 geninin nükleotid dizileri pBAD-Seq-F (5′-ATGCCATAGCATTTTTATCC-3′) ve pBAD-Seq- 60 R (5′-GATTTA ATCTGTATCAGG-3′) oligonükleotidleri kullanılarak her iki uçtan okundu. DNA dizi analizi ile vektörün translasyon başlama ve sonlanma dizilerinin doğru bir şekilde yer aldığı doğrulanmış oldu. Şekil 3.5. pBAD/Myc-HisA vektörü (A) ve türevinin (B) fiziksel ve genetik haritası. L-arabinoz ile indüklenen pBAD/Myc-HisA vektörü (Invitrogen) üzerinde yer alan PBAD (araBAD promotör), heterolog gen işlevselliğinin dozaja bağlı regülasyonunu sağlar. ATG (Başlama kodonu), translasyonal başlama bölgesini temin eder. MCS (Çoklu klonlama bölgesi), genin vektöre insersiyonu için elverişli restriksiyon enzim dizilerini içerir. C-uç myc epitop kuyruğu (Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu) proteinin işlevselliğinin Anti-myc antikoruyla; C-uç polihistidin bölgesi ise protein işlevselliğinin Anti-His antikoruyla gözlenmesini sağlar. araC geni, PBAD promotörün regülasyonu için gerekli regülatör proteinini kodlar. Term, rrnB transkripsiyon terminasyon bölgesini; pBR322 ori (ColE1) ise düşük oranda replikasyonu ve E. coli ’de çoğalmayı sağlar. 18 3.2.10.2. RRC00138 Gen Ürününün E. coli ’deki İşleyişi RRC00138 geninin PBAD promotoru kontrolünde E. coli ’deki işleyişi için öncellikle pSEM17 plazmiti E. coli plsC(Ts) mutantına transfer edildi ve SM2- 1/pSEM17 transformantı 28°C sıcaklıkta amfisilin (Amf) antibiyotiği içeren LB besiyerinde seçildi. Daha sonra gece boyu üremiş transformanta ait sıvı kültürden beş kez 100 ’er µl alınarak 10 ml LB+Amf içeren 100 ’er ml lik erlenmayerlere inoküle edildi. Hücreler 600 nm ’de ∼0.5 hücre yoğunluğu gösterinceye kadar 28°C ’lik çalkalayıcılı inkübatörde üremeye bırakıldı. Daha sonra farklı erlenmayerlerde üretilen hücrelere %0 ’dan % 2 (w/v) ’ye kadar değişen konsantrasyonlarda (%0.0002, %0.002, %0.02, %0.2 ve %2) L-arabinoz eklenerek, hücreler 4 saat süreyle üretilmeye devam ettiler. Arabinoz ile indüksiyondan sonra hücrelerden 1 ’er ml alınarak, santrifüjle (13.000 devir/dakika, 3 dakika) çöktürüldü. Pelletler kullanılıncaya kadar –20 °C ’de saklanıldı. 3.2.10.3. RRC00138 Gen Ürününün R. capsulatus ’daki İşleyişi RRC00138 geninin R. capsulatus ’deki işleyişi için öncellikle pBAD promotörü, AraC proteini ve RRC00138 genini içeren pSEM17 plazmiti pRK415 vektörüne klonlandı. Bunun için, NsiI restriksiyon enzimi ile kesilerek linear hale getirilen pSEM17 plazmiti, NsiI dizisine tamamlayıcı diziye sahip PstI enzimi ile kesilmiş pRK415 vektör dizisi ile birleştirildi ve pSEM18 plazmiti (Şekil 3.6) elde edildi. Daha sonra pSEM18 plazmiti SA1 (RRC00138::spe) mutantına konjugasyon ile aktarıldı. SA1/pSEM18 transkonjugantı, %2 L-arabinoz içeren veya içermeyen MPYE besi yerinde aerobik koşullarda 16 saat süreyle üretildi ve intrasitoplazmik membran vesikülleri izole edildi. 6 3 Şekil 3.6. pSEM18 rekombinant plazmitin fiziksel ve genetik haritası. pBAD/Myc-HisA vektörü üzerinde yer alan pBAD, araC ve Amp kısaltmaları Şekil 3.6 da açıklanmıştır. Plac, pRK415 plazmit promotörü; Tet, tetrasiklin; OriV ise replikasyon orjini olarak gösterilmiştir. 3.2.10.4. RRC00138 Protein İşlevselliğinin İmmunoblot (Western blot) Analizi ile Gözlenmesi RRC00138 gen ürününün E. coli veya R. capsulatus ’daki işlevselliği immunoblot analizi ile gözlendi. RRC00138 gen ürünün E. coli ’deki işlevselliğini gözlemek için öncellikle pellet haline getirilen L-arabinoz ile indüklenen hücre ekstraktları 100 ml 1X SDS-jel yükleme boyasında süspanse edilerek, 95°C ’de 4-5 dakika süreyle inkübe edilerek denatüre edildi. Daha sonra 10 ml ’lik protein ekstraktları %12 ’lik sodyum dodesil sulfat-poliakrilamit jel elektroforezinde (SDS- PAGE) (Läemmli, 1970) (Ek-2) ayrıştırıldıktan sonra proteinler PVDF (Polivinildifluorid, Bio-Rad) membranına bir dakika süreyle %100 ’lük metanol içeri 6 4 içerisinde bekletildi. Daha sonra PVDF membranı, dört adet 3 MM Whatman kağıdı ve jel transfer tamponu (12 mM Tris, 96 mM Glisin, %10 Metanol) içinde 10-15 dakika süreyle inkübe edildiler. Whatman kağıdı (2)/membran/jel/whatman kağıdı (2) sandviçi hazırlanarak elektroforetik transfer sistemine (Trans-Blot Semi Dry Transfer Cell, Bio- Rad) yerleştirildi. 15 volt ’da 30 dakika transfer işlemi gerçekleşti. Blot daha sonra metanol içerisinde 1 dakika bekletildi ve 20 ml bloklama çözeltisi (%5 Süt tozu, %0.1 Tween-20, 1X TBS (TBS: 50 mM Tris-pH.7.4, 150 mM NaCl) içerisine alınarak düşük devirli çalkalayıcı üzerinde gece boyu 4C ’de inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında blot iki kez 5 dakika süreyle 1X TBS-T (TBS-Tween 20) tamponu ile yıkandı ve daha sonra birincil antikorda (anti-Myc1-9E10, 1:250 dilusyonda TBS+ %2 süt tozu) üç saat oda sıcaklığında inkübe edildi. 5 ’er dakika süreyle üç kez TBS-T tamponu ile yıkamalardan sonra, blot ikincil antikorla (horseradish peroxidase-conjugated anti- mouse (1:1000 dilüsyonda, Amersham Pharmacia Biotech)) bir saat oda sıcaklığında muamele edildi. 5 ’er dakika süreyle üç kez TBS-T tamponu ile yıkamalardan sonra, NiCl2 ile aktivitesi arttırılan diaminobenzidin (DAB) boyası (Hsu ve Soban, 1982) ile protein gözlendi. Boyama solüsyonu için, 12.6 mg DAB, 18 ml 50 mM Tris/HCl (pH:8) solüsyonunda çözüldü ve karışıma 2 ml %0.3 ’lük NiCl2 ilave edildi. Protein bantlarının gözlenmesi için boyama solüsyonuna 5-10 µl hidrojen peroksit (H2O2) damlatılarak 5- 10 dakika süreyle bekletildi. Bandlar belirdikten sonra reaksiyon dH20 eklenerek durduruldu. RRC00138 geninin R. capsulatus ’deki işleyişini gözlemek için, SA1/pSEM18 transkonjugantının %2 L-arabinoz varlığında veya yokluğunda üretilmiş hücrelerine ait kromotofor membran proteinleri (100 µg) 1:1 oranında 2X SDS-jel yükleme boyası ile karıştırıldı. Tüpler 37°C ’de 10 dakika süreyle inkübe edilerek proteinler denatüre edildi. Membran proteinleri %12 ’lik SDS-PAGE ’de ayrıştırıldı ve daha sonra PVDF membranına transfer edildi. Blot, anti-Myc1-9E10 antibadisi (1:1000), AP-conjugated goat anti-mouse (1:1000, Biorad) ve 4-nitroblue tetrazolium/5-bromo-4-cloro-3-indolyl phosphate (NBT/BCIP, Sigma Inc.) ile muamele edildi. 6 5 3.2.11. Fenotip Tamamlama Testleri RRC00138 gen ürünün E. coli ’deki işleyişini immunoblot analizi ile gözlendikten sonra, RRC00138 geninin E. coli mutasyonunu tamamlama yeteneği test edildi. SM2-1/pSEM17 ve negatif kontrol olarak kullanılan SM2-1/pBAD-Myc-HisA transformantları 28°C sıcaklıkta gece boyu inkübe edildiler. Daha sonra transformantlar farklı L-arabinoz konsantrasyonları (%0.0002, %0.002, %0.02, %0.2 ve %2) içeren LB+Amf petri kaplarına iki set halinde çizildi. Bir set 28°C ’lik inkübatörde, diğer set ise 42°C ’lik inkübatörde gece boyu bırakılarak transformantların üreme fenotipleri gözlendi. Diğer yandan, RRC00138 geninin E. coli G3P oksotrofik mutant soyunu (SJ22, plsB26-plsX50 (Rock ve Jackowski, 1982)) tamamlama yeteneği de testi edildi. Bunun için, pSEM17 ve pBAD/Myc-HisA plazmitleri SJ22 mutantına aktarıldı ve transformantlar 37°C sıcaklıkta inkübatörde gece boyu inkübe edildi. RRC00138 geninin E. coli mutasyonunu tamamlama yeteneği için transformantlar farklı konsantrasyonlardaki L-arabinoz (%0.0002, %0.002, %0.02, %0.2, %2) varlığında G3P içeren veya içermeyen MedE besi ortamına çizildi ve 37°C ’lik inkübatörde gece boyu bırakılarak transformantların üreme fenotipleri gözlendi. 3.2.12. In vitro GPAT+AGPAT Aktivite Testi R. capsulatus yaban soy (MT1131) ve RRC00138 null mutantının [SA1; (RRC00138::spe)] G3P açilltransferaz (GPAT) ve 1,2 diaçil G3P açilltransferaz (AGPAT) enzim aktivite testi, intrasitoplazmik membran partikülleri kullanılarak in vitro koşullarda, Goldfine (1969) ’nın “filter paper” metoduna göre yapıldı. Buna göre, 100 mM KH2PO4 (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol (DTT), 0.6 mM G3P, 29 µM cis-18:1- (∆11)ACP (vassenil-açil taşıyıcı protein) ve 0.3 µCi [14C]-G3P ’dan oluşan 150 µl ’lik reaksiyon karışımı hazırlandı. Reaksiyon, 1.25-2.5 µg kromotofor membran partiküllerinin reaksiyon karışımına eklenmesi ile başladı ve reaksiyon tüpleri 37°C ’de inkübe edildi. İnkübasyon başladıktan 0., 1., 2. ve 4. dakikalarda tüpler inkübatörden alındı ve reaksiyon karışımı Whatmann 3MM kağıdına konularak reaksiyon durduruldu. 6 6 Daha sonra filter kağıt %10, 5 ve 1 ’lik trikloroasetik asit (TCA) ile beşer dakika sürelerle yıkandı ve kurutuldu. Radyoaktivite miktarı (cpm) sintilasyon sayım cihazında ölçüldü. 3.2.13. [14C]-G3P ile İn vitro Koşullarda İşaretlenmiş Kromotofor Membranından Lipid İzolasyonu ve Ayrışımı Bölüm 3.2.11 ’de açıklandığı gibi reaksiyon karışımı hazırlandı ve reaksiyon tüpü 37°C ’de dört dakika süreyle inkübe edildi. Daha sonra tüplere 1.6 ml kloroform:metanol (1:1 v/v) karışımı, 151 µl H2O ve 800 µl 0.1 N HCl eklenerek reaksiyon durduruldu. Karışım santrifüj ile çöktürüldü (1.200 devir/dakika, 7 dakika) ve iki faz elde edildi. Lipid bileşenlerini içeren kloroform fazı (alt faz) yeni bir tüpe aktarıldı ve argon gazı altında buharlaştırıldı. Lipidler 200 µl kloroform ’da çözüldü ve 10 µl lipid ekstraktı 10x10 cm2 boyutundaki silika tabakaya (Silica Gel H plate) yüklendi. Ayrıca silika tabakanın diğer tarafına işaretlenmemiş lisofosfatidik asit (10 µg) ve fosfatidik asit (10 µg) standardları da yüklendi. TLC tabaka kloroform:metanol:asetik asit (39:9:3 v/v/v) içeren solvent sisteminde ayrıştırıldı. Silika tabaka daha sonra fosfoimager (Kodak) içinde gece boyu bekletildi ve radyoaktif lekeler, IMAGEQUANT programı (v. 3.30) kullanılarak Molecular Dynamics Phosphoimager (Storm 860) ’de tanımlandı. Diğer yandan, silika tabakaya iyodin boyası püskürtülerek LPA ve PA standardlarının silika tabakadaki lokalizasyonu belirlendi ve radyoaktif lekeler ile karşılaştırıldı. 3.2.14. Total Hücre Membran Lipidlerin İzolasyonu 3.2.14.1. 14İn vivo Koşullarda [1- C]asetat ile İşaretlenmiş Hücrelerden Lipid İzolasyonu R. capsulatus yaban soy, null mutantları ve transkonjugantların MPYE veya MedA besi yerlerinde 35 ya da 25 °C sıcaklıktaki gece boyu kültürleri hazırlandı. Gece boyu kültüründen 100 µl, 1 ml uygun besiyerine inoküle edildi ve tüplere 2 µl [1-14C]- asetat (60 mCi/mmol) eklendi. Bakteriler MedA besi yerinde 24 saat; MPYE 6 7 besiyerinde ise 30 saat süreyle inkübe edildi. Diğer yandan, benzer şekilde S. meliloti yaban soy, null mutantları ve transkonjugantların da sıvı MedA besiyerinde 30 °C sıcaklıkta [1-14C]-asetat varlığında kültürleri hazırlandı. Hücreler santrifüj ile çöktürüldü (4.000 devir/dakika, 5 dakika) ve 500 µl dH2O ile yıkanarak tekrar çöktürüldü. Lipidler Bligh ve Dyer (1959) ’in metoduna göre izole edildi. Bunun için, hücreler önce 100 µl dH2O ’da çözüldü. Daha sonra 100 µl kloroform:200 µl metanol hücrelere eklendi ve hücreler iki dakika süreyle vortekslendi. Karışıma önce 100 µl kloroform eklenerek 30 sn, daha sonra 100 µl dH2O eklenerek 30 sn daha vorteksle karıştırıldı ve hücreler santrifüjle çöktürüldü. Oluşan iki fazdan kloroform içeren alt faz yeni bir tüpe transfer edildi ve argon gazı altında buharlaştırıldı. Lipidler 100 µl kloroformda çözüldü ve sintilasyon sayım cihazında radyoaktivitesi (cpm) ölçüldü. 3.2.14.2. Radyoaktif ile İşaretlenmemiş Hücrelerden Lipid İzolasyonu 50 ml ’lik hücre kültürlerinden lipidlerin izolasyonu Benning ve Somerville (1992) metoduna göre gerçekleştirildi. Buna göre, R. capsulatus yaban soy ve null mutantları 50 ml MPYE ya da MedA sıvı besiyerlerinde 35°C sıcaklıkta; S. meliloti yaban soy ve OlsB mutantı 50 ml MedA besiyerinde 30°C sıcaklıkta eksponensiyonel faza (A630nm =0.7-0.8) kadar üretildi. Hücreler daha sonra santrifüj ile çöktürüldü ve dH2O ile yıkandı. Hücreler 0.5 ml dH2O içerisinde süspanse edilerek Corex cam tüpüne transfer edildi. Tüplere 4 ml kloroform:metanol (1:1 v/v) karışımı eklendi ve karışım 4- 5 dakika süreyle vortekslenerek lipidler izole edildi. Karışıma daha sonra 1 M KCl-0.2 M H3PO4 ’dan 1.3 ml eklenerek vortekslenmeye devam edildi. Santrifüj ile çöktürme (8.000 devir/dakika, 15 dakika) sonunda iki faz oluştu. Lipidleri içeren alt klorofom fazı bir tüpe aktarılarak argon gazı altında buharlaştırıldı ve lipid konsantrasyonu 10 mg/ml olacak şekilde lipidler kloroformda çözüldü. 3.2.14.3. Lipid Ekstrakların İki Boyutlu İnce Tabaka Kromotografisinde Ayrışımı ve Lipidlerin Gözlenmesi [1-14C]-asetat ile işaretlenmiş (60.000 cpm) ya da işaretlenmemiş (10 ng) lipid ekstraktları 10x10 cm2 boyutunda analitik TLC silika gel 60 F254 tabakta (Sigma- 6 8 Aldrich) iki boyutlu ince tabaka kromotografi (2D-TLC) yöntemiyle ayrıştırıldı. Bunun için, silika tabaka önce 120°C ’de 30 dakika süreyle inkübe edilerek aktive edildi. Lipidler silika tabakanın sağ-alt köşesine yüklendi. Tabaka, kloroform-metanol-dH2O (14:6:1, vol/vol/vol) ’dan oluşan solvent içeren tankın içine yerleştirildi. Kapiler olarak solvent silika tabakanın üst kısmına ulaştığı zaman, tabaka tanktan çıkarılarak vakum desikatöründe 45 dakika süreyle kurutuldu. Daha sonra tabaka saat yönünde 90° döndürülerek kloroform-metanol-glasiyel asetik asit (13:5:2, vol/vol/vol) ’den oluşan solvent sisteminde ikinci kez ayrıştırıldı (de Rudder ve ark. 1997). Radyoaktif ile işaretlenmemiş R. capsulatus hücrelerden izole edilen lipidler özgün lipid boya spreyleri kullanarak, renk reaksiyonları ile gözlendi. Buna göre, serbest amino grubu içeren lipidler (PE ve OL) ninhidrin boya ve ısıyla kırmızı-mor renk vermesiyle diğer polar lipidlerinden ayırt edilir. Bunun için, silika tabakaya önce %0.3 ’lük ninhidrin boyası (Sigma, N-1286) püskürtüldü ve daha sonra tabaka 120 °C ’de 5-10 dakika süreyle ısıtılarak kırmızı-mor renk oluşumu gözlendi (Dawson, 1967). Fosfolipidleri (PE, PG, PC ve DMPE) gözlemek için silika tabakaya %0.3 (w/v) ’lük ammonium molibdenum mavi spreyi (Sigma, M-1942) püskürtüldü (Dittmer ve Lester, 1964). Bakteri soyların lipid profilleri PE (Dr. Norah Jonston-UPENN ’dan temin edildi), PG (Sigma-Aldrich) ve PC (Sigma-Aldrich, P7443) referans substratlarıyla karşılaştırılarak tanımlandı. Radyoaktif lipid lekeleri ise Molecular Dynamics phosphoimager ve IMAGEQUANT programı ile gözlendi. 3.2.15. Kütle Spektrometri Analizi ile OL in Tanımlanması R. capsulatus ve S. meliloti bakterilerindeki OL in kütle spektroskobik analizi Pennsylvania Üniversitesi-Farmakoloji Bölümü-Kütle Spektroskobi Laboratuvarında gerçekleştirildi. Buna göre öncellikle, R. capsulatus MT1131 yaban soyu ve RRC00139- RRC00138 ikili mutantı (SA8), S. meliloti de Sm-1021 yaban soyu ve OlsB mutantına (ORLD1) ait lipidler (10 ng) 20x20 cm2 boyutundaki silika tabakaya yüklendi. Tüm lipid profilini herhangi bir boya kullanmadan gözlemek içinde aynı tabakaya yaklaşık 10.000 cpm [1-14C]asetat ile işaretlenmiş lipid ekstraktları da yüklendi. Lipidler 2D- TLC ’de ayrıştırıldı ve fosfoimager ile tüm membran polar lipidlerinin yerleri belirlendi. 6 9 Daha sonra yaban soylarda OL içeren leke, mutantlarda ise PE nin hemen altında OL lekesine karşılık geldiği bilinen bölge tabakadan kazınarak çıkarıldı. OL içeren (ve içermeyen) silika partikülleri 500 µl kloroform:metanol (30:70, vol/vol) ve 0.1% formik asit (pH 5.6) içerisinde çözülerek, santrifüj edildi (9.000 devir/dakika, 2 dakika). Elde edilen üst sıvı elektrospray iyonizasyon kütle spektrometre (MS/MS) (Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City, CA) tekniği ile analiz edildi. 3.2.16. “Pulse-chase” İşaretleme ve İmmunopresipitasyon Fonksiyonel sitokrom cy proteinin (Myllykallio ve ark., 1997) minimal MedA besi yerinde 35°C sıcaklıktaki üretimi ve yıkım oranı “pulse-chase” işaretleme ve immunopresipitasyon yöntemleri kullanılarak incelendi. Bu amaçla, karboksil ucu FLAG oktapeptid dizisine (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) bağlı sitokrom cy genini (sit cy-FLAG) taşıyan pHM7 plazmiti (Myllykallio ve ark., 1997) yaban soy (MT1131) ve RRC00139-RRC00138 ikili mutantına (SA8) aktarıldı. Elde edilen transkonjugantlar MedA besi yerinde 35°C sıcaklıkta eksponensiyonel faza kadar (A630=0.75) üretildi. Hücreler, son konsantrasyonu 1 mCi/ml olacak şekilde [ 14C]amino asit karışımı ile beş dakika süreyle inkübe edildi ve protein sentez inhibitörü kloramfenikol (200 mg/ml) varlığında veya yokluğunda kasamino asit (%0.1) eklenerek reaksiyon durduruldu. Belli zaman noktalarında (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 30, 60, 120, 240 ve 480 dakika), 1 ml ’lik hücreler alınarak, buzda bekletildi. Hücreler daha sonra santrifüjle çöktürüldü ve DNaz (50 mg/ml), RNaz (50 mg/ml), fenilmetilsülfonik asit (1 mM) ve ε-amino-n-kaproik asit (0.1 mM) içeren 100 µl lizis tamponunda (CelLytic™ B 2X Cell lysis reagent, Sigma B7310) çözüldü. Hücreler iki dakika süreyle vortekslenerek lizis edildi. 0.2 mg/ ml lizozim hücrelere eklendikten sonra tüpler oda sıcaklığında 10 dakika süreyle bekletildi. Daha sonra tüplere 10 mM EDTA eklendi ve hücreler 13.000 devir/dakika da 15 dakika süreyle çöktürüldü. Herbir zaman noktası için, toplam 1.25 x106 cpm üst sıvı alındı ve 40 µl Anti-Flag M2 affinity jel (Sigma A2220) içeren eppendorf tübüne aktarıldı. Karışım, 4°C ’de üç saat süreyle çalkalıyıcılı inkübatörde inkübe edildi. İmmunokompleks daha sonra santrifüj ile çöktürüldü ve beş kez %0.01 dodesilmaltosit içeren 1X TBS tamponunda yıkandı. Pelletler 1X SDS-örnek yükleme tamponunda çözülerek, 95°C ’de 4-5 dakika süreyle inkübe ederek proteinler 7 0 denatüre edildi. Proteinler %15 lik SDS-PAGE ’de ayrıştırıldı. Elektroforez sonrasında jel, %25 metanol – %10 asetik asit içerisinde 20 dakika bekletildi ve sonrasında kurutularak fosfoimager kasetine yerleştirildi. Radyoaktif protein bandları Molecular Dynamics phosphoimager ve IMAGEQUANT programı ile analiz edildi. 4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI 4.1. MR2, IJ1 ve AYG4 Mutantlarındaki Mutasyon Taşıyan Gen(ler)in Belirlenmesi Önceki çalışmalarda, R. capsulatus MR2, IJ1 ve AYG4 isimli mutantların sitokrom cbb3 oksidaz negatif (Nadi −) fenotiplerinin enziminin yapısal (ccoNOQP) ve bilinen biyogenesiz (ccoGHIS) genleri ile Nadi pozitif fenotipe tamamlanmadığı gösterilmiştir. R. capsulatus’ un kromozomal DNA kütüphaneleri kullanılarak yapılan tamamlama testleri sonucunda, bu mutantların oksidaz fenotipini tamamlayabilen kromozomal DNA parçaları (pMRC, pMRB/pAY1) izole edildi (Koch ve ark., 1998; Aygün, 1999). Bu çalışmada, ilgili fenotipten sorumlu gen(ler)in belirlenebilmesi için kromozomal DNA parçaları üzerinde yer alan genlerin aktiviteleri bozularak elde edilen null (knock-out) mutantlarının genetik ve biyokimyasal analizleri yapıldı. MR2, IJ1 ve AYG4 mutantlarında Nadi fenotipini yaban soy oranında tamamlayan 5600-bç ’lik EcoRI-EcoRI DNA parçasını (pMRC) tek bir noktadan kesen veya hiç kesmeyen restriksiyon endonükleaz enzim haritası MacVectorTM 7.2.3. programı kullanarak tespit edildi. Daha sonra Materyal ve Yöntem ’de ayrıntılı şekilde açıklandığı gibi, kromozomal DNA parçaları üzerinde yer alan birçok açık okuma bölgesi delesyon-insersiyon yapılarak bozuldu ve böylece pSEM2 [∆(RRC00132- RRC00133::spe)], pSEM3 (RRC00136::spe), pSEM4 (RRC00138::spe), pSEM11 [∆(RRC00138::spe)], pSEM16 [∆(RRC00138::spe)], pSEM7 [∆(RRC00142::spe)], pSEM9 [∆(RRC00139::spe)] ve pSEM13 [∆(RRC00138-RRC00139::spe)] isimleri verilen rekombinant plazmitler elde edildi (Şekil 3.2, 3.3 ve 3.4). Bu plazmitler daha sonra MR2, IJ1 ve AYG4-25 (pOX15 plazmiti çıkartılmış AYG4 mutant soyu; Aygün, 1999) mutantlarına çaprazlamayla aktarıldı ve plazmitlerin mutantların Nadi fenotiplerini tamamlama yetenekleri test edildi. Buna göre, pSEM2, pSEM3 veya pSEM7 plazmitini taşıyan her üç mutant Nadi− fenotipini korudu (Çizelge 4.1). Buna karşılık, (RRC00138::spe) mutasyonuna sahip pSEM4 veya pSEM16 plazmitini taşıyan IJ1 Nadi− fenotipini korurken, AYG4-25 ve MR2 ise Nadi+ fenotipi gösterdi (Çizelge 4.1). Diğer yandan [∆(RRC00139::spe)] mutasyonuna sahip pSEM9 plazmitini taşıyan 72 IJ1 mutantı Nadi+ fenotipi gösterirken, AYG4-25 ve MR2 mutantları ise Nadi− fenotiplerini korudular (Çizelge 4.1). RRC00138 ve RRC00139 genlerinin birlikte delesyonunu [∆(RRC00139-RRC00138::spe)] taşıyan pSEM13 veya pSEM11 plazmitinin varlığında da doğrulayıcı biçimde mutantların yine Nadi− fenotipi taşıdıkları görüldü (Çizelge 4.1). Bu sonuç, RRC00138 geninin IJ1 mutantının; RRC00139 geninin de MR2 ve AYG4-25 mutantlarının fenotipinden sorumlu olduklarını gösterdi. 4.2. Null Mutant Eldesi ve Mutantların Fenotipik Karakterizasyonu Genetik tamamlama testleri sonunda RRC00138 ve RRC00139 genlerinin sitokrom cbb3 oksidaz enziminin aktivitesi için gerekli yeni genler olabilecekleri sonucuna varıldı. Ancak hem elde edilen bu sonucu doğrulamak hem de kromozomal DNA parçası üzerinde yer alan diğer genlerin verdiği fenotipik özellikleri belirlemek için genlere ait null mutantları oluşturuldu. Bunun için, ‘Knock-out’ yöntemiyle elde edilen [∆(RRC00132-RRC00133::spe)], (RRC00136::spe), [∆(RRC00138::spe)], (RRC00138::spe), [∆(RRC00142::spe)], [∆(RRC00139::spe)] ve [∆(RRC00139- RRC00138::spe)] insersiyon-delesyon alleleri R. capsulatus ’un MT1131 yaban soy kromozomuna GTA partikülleri aracılığında homolog rekombinasyon yoluyla aktarıldı (Yen ve ark., 1979). Böylece sırasıyla SA2 [∆(RRC00132-RRC00133::spe)], SA3 (RRC00136::spe), SA4 [∆(RRC00138::spe)], SA1 (RRC00138::spe), SA5 [∆(RRC00142::spe)], SA6 [∆(RRC00139::spe)] ve SA8 [∆(RRC00139- RRC00138::spe)] null mutantları elde edildi. Mutantların farklı besi ortamlarındaki (zenginleştirilmiş MPYE ve minimal MedA) Nadi reaksiyonunu katalizleyebilme yetenekleri ile üreme özellikleri incelendi (Çizelge 4.2). SA2, SA3 ve SA5 mutantları farklı besi yerlerinde aerobik ve fotosentetik koşullarda üreyebilme yeteneği ve Nadi+ fenotipi gösterdi. Buna karşılık, SA1, SA4, SA6 ve SA8 mutantları ise optimal inkübasyon sıcaklığında (35°C) her iki besi yerinde de sitokrom c oksidaz aktivitesinden yoksun olup, Nadi− fenotipi verdi (Çizelge 4.2; Şekil 4.1). Ayrıca bu null mutantları fotosentetik koşullarda besi ortamına bağlı farklı üreme fenotipi gösterdi. Buna göre mutantlar MedA besiyerinde fotosentez ile üreyebilirken, MPYE besi yerinde ise üreyemedi (Çizelge 4.2; Şekil 4.1). Böylece SA1, SA4, SA6 ve SA8 null 73 mutantlarında gözlenen Nadi fenotipi ve fotosentetik koşullardaki üreme özellikleri kimyasal mutagenez sonunda elde edilen MR2, IJ1 ve AYG4 mutantlarının fenotipi ile aynı olduğu görüldü. Çizelge 4.1. Delesyon-insersiyon alleli taşıyan rekombinant plazmitlerin MR2, IJ1 ve AYG4-25 mutantların Nadi fenotiplerini tamamlama yetenekleri. Nadi fenotipleri Plazmitler Genotip IJ1 MR2 AYG4- 25 pMRC2 ilvD─, exoD+, RRC00135+, RRC00136+, + ─ ─ RRC00138+, RRC00139─, RRC00140─, RRC00142─, proA─ pSEM1 ilvD─, exoD+, RRC00135+, RRC00136+, ─ ─ ─ RRC00138─, RRC00139─, RRC00140─, RRC00142─, proA─ pSEM2 ilvD─, exoD+, RRC00135+, ∆RRC00136, ─ ─ ─ RRC00138─, RRC00139─, RRC00140─, RRC00142─, proA─ pSEM3 ∆(ilvD-exoD), RRC00135+, RRC00136+, ─ ─ ─ RRC00138─, RRC00139─, RRC00140─, RRC00142─, proA─ pMRC ilvD─, exoD+, RRC00135+, RRC00136+, + + + RRC00138+, RRC00139+, RRC00140+ RRC00142+, proA─ pSEM4 ilvD─, exoD+, RRC00135+, RRC00136+, ─ + + RRC00138─, RRC00139+, RRC00140+ RRC00142+, proA─ pSEM7 ilvD─, exoD─, RRC00135─, RRC00136─ ─ ─ ─ RRC00138─, RRC00139─, ∆(RRC00140), RRC00142+, proA─ pSEM9 ilvD─, exoD─, RRC00135─, RRC00136─ + ─ ─ RRC00138+, ∆(RRC00139), RRC00140+, RRC00142+, proA─ pSEM11 ilvD─, exoD+, RRC00135+, RRC00136+ ─ ─ ─ ∆(RRC00138), RRC00139─, RRC00140─, RRC00142─, proA─ pSEM16 ilvD─, exoD+, RRC00135+, RRC00136+ ─ + + ∆(RRC00138), RRC00139+, RRC00140─, RRC00142─, proA─ pSEM13 ilvD─, exoD+, RRC00135+, RRC00136─ ─ ─ ─ ∆(RRC00138-RRC00139), RRC00140─, RRC00142+, proA─ 74 Çizelge 4.2. R. capsulatus null mutantlarının farklı besi ortamlarında aerobik ve anaerobik fotosentetik koşullar altındaki üreme özellikleri ve Nadi reaksiyonunu katalizleme yetenekleri. MedAa MPYEa Soylar Genotip Sb/Nadic Fb S/Nadi F MT1131 Yaban soy +/+ + +/+ + SA1 (RRC00138:spe) +/− + +/− − SA2 (RRC00136::spe) +/+ + +/+ + SA3 [∆(ilvD-ExoD):: spe] +/+ + +/+ + SA4 [∆(RRC00138):spe] +/− + +/− − SA5 [∆(RRC00140):: spe] +/+ + +/+ + SA6 [∆(RRC00139):spe] +/− + +/− − SA8 [∆(RRC00139-RRC00138):spe] +/− + +/− − a MedA, minimal besi yeri; MPYE, zengin besi yeri. b S, aerobik koşullarda üremeyi; F, fotosentez ile üremeyi; + ve − ise belirtilen koşullar altında R. capsulatus soylarının üreme yeteneğini gösterir. c Nadi+ veya Nadi−, sitokrom c oksidaz aktivitesinin varlığını veya yokluğunu gösterir. Diğer yandan, MR2, IJ1 ve AYG4-25 mutantlarının Nadi fenotipini tamamlayan pMRC plazmiti SA1, SA4, SA6 ve SA8 null mutantlarına aktarıldığında, beklenildiği gibi mutantlar her iki besi yerinde de Nadi+ fenotipi gösterdiler ve zenginleştirilmiş MPYE besi ortamında fotosentez ile üreyebilme yeteneğini geri kazandılar. Genomda RRC00138 veya RRC00139 geninin inaktivasyonu, sitokrom cbb3 oksidaz aktivitesinin eksikliğine neden olduğundan, bu genlerin enzim aktivitesi için gerekli, daha önce rapor edilmemiş ve oksidaz biyogenesizde rol alan yeni genler olduğunu doğruladı. Zengin MPYE besi ortamı Minimal MedA besi ortamı Zengin MPYE besi ortamı Minimal MedA besi ortamı N+ (Ys) N- (∆138) N+ (Ys) N- ( +∆ +138) N (Ys) N+ (∆138) N (Ys) N- (∆138) N- ( -∆ -139) N (∆139-138) N- (∆ -139) N- ( +∆139-138) N+ (∆139) N (∆139-138) N (∆139) N (∆139-138) Ys ∆138 Ys ∆138 Ys ∆138 Ys ∆138 ∆139 ∆139-138 ∆139 ∆139-138 ∆139 ∆139-138 ∆139 ∆139-138 35 °C 25 °C Şekil 4.1. R. capsulatus RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının sıcaklık ve besi yerine bağlı üreme fenotipleri. R. capsulatus soyları solunum (üstteki iki sıra) ya da fotosentetik (alttaki iki sıra) üreme koşullarında MPYE veya MedA besi yerlerinde 35°C (soldaki iki sütun) ya da 25°C sıcaklıkta (sağdaki iki sütun) inkübe edildi. Solunumla üreyen koloniler daha sonra Nadi (N) reaksiyonu ile boyandılar. Mutantlar, MPYE besi ortamında 35°C ’de F−/N−, 25°C ’de F+/N+; MedA besi ortamında ise 35 ve 25°C ’de F+/N− fenotipi gösterdiler. Ys, Yaban soy; ∆138, RRC00138 null mutantı (SA4); ∆139, RRC00139 null mutantı (SA6), ∆139- 138, RRC00139-138 ikili mutantı (SA8). F o t o s e n t e z ( F ) S o l u n u m / N a d i ( N ) 76 4.3. RRC00138 ve RRC00139 Genlerinin Dizi Analizi R. capsulatus RRC00138 ve RRC00139 genleri genomda 2G06-2D11 isimli DNA parçası üzerinde yer alır. Buna göre, RRC00139 geni 123.579-122.803 pozisyonda, RRC00138 geni ise 122.803-121.976 pozisyonda bulunur. RRC00139, 777 bç uzunluğunda olup, 259 amino asitten oluşur ve tahmini 29.315 Da moleküler ağırlığına sahiptir. RRC00138 ise 828 bç uzunluğunda olup, 276 amino asitten oluşur ve tahmini 30.718 Da moleküler ağırlığındadır. R. capsulatus genom bilgi bankasında (http://www.ergo-light.com/ERGO/CGI/) RRC00138 gen ürününün membran gliserofosfolipid biyosentezinde gerekli 1-açil-sn- gliserol-3-fosfat açiltransferaz (PlsC, AGPAT) enzimini kodladığı bildirilmiştir. Gerçekten de genom bilgi bankasından elde edilen RRC00138 amino asit dizisinin BLAST analizleri (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi/) yapıldığında, bu protein dizisinin pek çok prokaryotik ve ökaryotik organizmaların AGPAT dizisi (COG0204 ortolog grubu, pfam01553) ile yüksek derecede benzerliğe sahip olduğu görüldü (Şekil 4.2). Örneğin; RRC00138 amino asit dizisi E. coli PlsC dizisi ile %26 oranında aynı ve %39 oranında benzer amino asit içerir. Yine, RRC00138 dizisi Saccharomyces cerevisiae ’nın PlsC dizisi ile %33 oranında aynı ve %48 oranında benzer amino asite sahiptir. RRC00138, tıpkı E. coli ve diğer organizmalardaki AGPAT ’lar gibi gliserol açiltransferazlara özgün korunmuş dizilere sahiptir. E. coli ’de AGPAT enzimi, açil zincirini açil-açil taşıyıcı protein (ACP) ya da açil-koenzim A (CoA) ’dan alarak 1-açil-sn-gliserol-3-fosfat (lisofosfatidik asit, LPA)’ a transfer ederek, membran gliserofosfolipidlerin öncü bileşeninin (1,2 diaçil-sn-gliserol-3-fosfat (fosfatidik asit, PA)) oluşumunu sağlar (Rock ve ark., 1981). Diğer yandan R. capsulatus genom bankasında RRC00139 gen ürünü hipotetik sitozolik protein olarak tanımlanmıştır. RRC00139 hakkında detaylı bilgiye ulaşabilmek için genom bankasından elde edilen RRC00139 un amino asit dizisi diğer prokaryotik ve ökaryotik organizmaların genomları ile karşılaştırıldı (BLAST analizi) ve RRC00139 dizisinin hemolisin fonksiyonuna sahip protein ailesiyle (COG3176 ortolog grubu; Tatusov ve ark., 2001) homolojiye sahip olduğu görüldü. Şekil 4.2. R. capsulatus RRC00138 amino asit dizisinin diğer organizmalardaki homologları ile karşılaştırılması. RRC00138 dizisi (R.caps_138); E. coli (E.coli_PlsC), S. cerevisiae (S.cere_PlsC) ve N. meningitidis (N.meni_NlaA) bakterilerindeki AGPAT dizileri ile CLUSTAL W programı kullanılarak karşılaştırıldı. BOXSHADE programı kullanarak tam korunmuş amino asit dizileri siyah kutu, kısmen korunmuş diziler ise gri kutu içerisinde gösterildi. Gliserol açiltransferazlarda korunmuş HX4D motifi ise (*) ile gösterilmiştir. 78 4.4. RRC00138 ve RRC00139 Null Mutantlarının C-tipi Sitokrom Protein Profili SA4 [∆(RRC00138::spe)], SA6 [∆(RRC00139::spe)] ve SA8 [∆(RRC00139- RRC00138::spe)] null mutantlarının c-tipi sitokrom içeriği TMBZ/SDS-PAGE (Schägger ve von Jagow, 1987; Thomas ve ark., 1976) analizi ile incelendi (Şekil 4.3-A ve B). Zenginleştirilmiş (MPYE) veya minimal (MedA) besiyerlerinde solunumla üreyen null mutantlarının intrasitoplazmik membran vesikülleri (kromotofor membranı) ve çözünür kısımları Materyal ve Yöntem ’de açıklanıldığı gibi izole edildi ve proteinler Trisin-SDS-PAGE sisteminde elektroforez ile ayrıştırıldı. C-tipi sitokromlar, içerdikleri kovalent bağlı hem gruplarının peroksidaz aktivitelerinden yararlanılarak, TMBZ (3,3’,5,5’-tetrametilbenzidin) ve hidrojen peroksit (H2O2) varlığında gözlendi. R. capsulatus yaban soyu (MT1131) solunumla üretildiğinde; hücrenin intrasitoplazmik membran vesiküllerinde, 32, 31, 29 ve 28 kDa moleküler ağırlıklarında membrana bağlı dört farklı c-tipi sitokrom proteinleri gözlenir (Şekil 4.3-A; 2. ve 6. kuyular). 31 kDa moleküler ağırlığındaki protein, sitokrom bc1 kompleksinin c1 alt birimi (Gray ve ark., 1994; Jenney ve ark., 1994), 29 kDa ağırlığındaki protein ise, membrana bağlı elektron taşıyıcı görevi yapan sitokrom cy proteinidir (Jenney ve Daldal, 1993; Jenney ve ark., 1994; Myllykallio ve ark., 1999). 32 ve 28 kDa moleküler ağırlığındaki proteinler ise, sitokrom cbb3 oksidaz ’ın sitokrom co ve cp alt birimleridir (Gray ve ark., 1994; Koch ve ark., 1998). Suda çözünür formda ise yaban soy yaklaşık 14 kDa moleküler ağırlığındaki sitokrom c2 ve sitokrom c’ proteinlerini içerir (Şekil 4.3-B; 1. kuyu). Şekil 4.3. R. capsulatus RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının c-tip sitokrom protein profili. Zenginleştirilmiş MPYE veya minimal MedA besi ortamında optimal sıcaklıkta (35°C) aerobik koşullarda üreyen yaban soy ve null mutantlarından izole edilen intrasitoplazmik membran vesikülleri (A) ve 35°C sıcaklıkta MPYE besi ortamında üreyen hücrelerden izole edilen çözünür kısım (B) %16.5’luk Trisin-SDS-PAGE ’de ayrıştırıldı (Schägger ve von Jagow, 1987). Elektroforezden sonra, TMBZ (3’3,5’,5-tetrametilbenzidin) boyama (Thomas ve ark., 1976) ile c-tipi sitokromların varlığı gözlendi. cp ve co, sitokrom cbb3 oksidaz enziminin alt birimleri; c1, sitokrom bc1 kompleksinin alt birimi; cy, membrana bağlı elektron taşıyıcı protein; c2, periplazmik elektron taşıyıcı protein. Ys, Yaban soy (MT1131); ∆138, RRC00138 null mutantı (SA4); ∆139, RRC00139 null mutantı (SA6), ∆139-138, RRC00139-138 ikili mutantı (SA8); ∆139-8/(139-8)+, kromozomal DNA parçasını taşıyan RRC00139-138 ikili mutantı (SA8/pMRC). 80 RRC00139 ve RRC00138 null mutantları optimal sıcaklıkta (35°C) aerobik koşullarda üretildiklerinde besi yerine bağlı farklı c-tipi sitokrom profili içerdikleri görüldü. Buna göre, zengin MPYE besi ortamında üreyen mutant hücrelerden izole edilen intrasitoplazmik membran vesiküllerinde yaban soya kıyasla az miktarda olmakla beraber sadece sitokrom c1 proteini gözlendi (Şekil 4.3-A; 3-5. kuyular). Çözünür kısım incelendiğinde ise mutantların sitokrom c2 proteinini üretemedikleri görüldü (Şekil 4.3- B; 2-4. kuyular). Buna karşılık, minimal MedA besi yerinde üreyen mutantlardan elde edilen intrasitoplazmik membran vesikülleri ve çözünür kısım incelendiğinde ise yaban soya kıyasla az miktarda olmakla beraber tüm c-tipi sitokromları içerdikleri görüldü (Şekil 4.3-A; 3-5. kuyular ve data gösterilmemiştir). SA4, SA6 ve SA8 null mutantlarının Nadi fenotipini tamamlayabilen pMRC plazmiti aktarıldığında ise elde edilen transkonjugantların beklenildiği gibi tüm c-tipi sitokrom proteinleri yaban soy oranında üretebildikleri görüldü (Şekil 4.3-A; 10. kuyu). Fotosentetik koşullarda minimal MedA besi ortamında üreyen SA4, SA6 ve SA8 null mutantlarından izole edilen intrasitoplazmik membran vesikülleri incelendiğinde mutantların yaban soyda olduğu gibi sitokrom c1 ve sitokrom cy proteinlerini içerdikleri görüldü. Ancak mutant hücrelere ait çözünür kısım incelendiğinde ise mutantların periplazmik sitokrom c2 ’yi sentezlemediği belirlendi (data gösterilmemiştir). 4.5. RRC00138 ve RRC00139 Null Mutantlarının Zengin Besi Ortamındaki (MPYE) Sıcaklığa Bağlı Fenotipi RRC00139 ve RRC00138 null mutantlarının optimal sıcaklıkta (35°C) besi yerine bağlı farklı fenotipik özellikleri dikkate alınarak, mutantların düşük sıcaklıkta) gösterdikleri fenotipler de incelendi. Buna göre null mutantları farklı besi ortamında 25°C sıcaklıkta üretildi ve mutantların Nadi fenotipleri, fotosentetik üreme özellikleri ve c-tipi sitokrom profili irdelendi (Çizelge 4.3; Şekil 4.1 ve Şekil 4.4). RRC00138 (SA4), RRC00139 (SA6) ve RRC00139-RRC00138 (SA8) mutantlarının 35°C sıcaklıkta MPYE besiyerinde gösterdikleri Nadi− fenotipinin aksine, 25°C ’de mutantlar sitokrom c oksidaz aktivitelerini geri kazandılar (Nadi+). Ayrıca, mutantların 25°C ’de oksijensiz fotosentetik koşullarda MPYE besi ortamında üreme yeteneklerini geri kazandıkları da 81 gözlendi (Çizelge 4.3 ve Şekil 4.1). Bundan başka, SA4 mutantının 25°C sıcaklıkta MPYE besiyerinde üreyen hücrelerinden izole edilen kromotofor membranları incelendiğinde de mutantın yaban soya kıyasla az olmakla beraber membrana bağlı tüm c-tipi sitokrom proteinlerini içerdiği görüldü (Şekil 4.4). Çizelge 4.3. RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının farklı sıcaklık ve besi ortamlarında fotosentetik üreme özellikleri ve Nadi fenotipleri. 35 °C 25 °C MedAa MPYEa MedA MPYE Nadib Fc Nadi F Nadi F Nadi F Mutant SA4 (∆ + + + + RRC00138::spe) − − − − SA6 (∆ + RRC00139::spe) − − − − + + + SA8 − + − − − + + + [∆(RRC00138-139)::spe] aMedA, minimal besi yeri; MPYE, zenginleştirilmiş besi yeri; bNadi+ ya da Nadi−, sitokrom c oksidaz aktivitesinin varlığını ya da yokluğunu; cF, fotosentez ile üremeyi; + ve − ise belirtilen koşullar altında soyların üreme yeteneğini gösterir. Mutantların sıcaklığa bağlı MPYE besiyerinde gösterdikleri farklı fenotiplerinin aksine mutantlar 25°C sıcaklıkta MedA besiyerinde tıpkı 35°C sıcaklıkta olduğu gibi Nadi− fenotipi gösterdi (Çizelge 4.3 ve Şekil 4.1). Diğer yandan, 25°C sıcaklıkta MedA besiyerinde üreyen SA4 mutantının intrasitoplazmik vesikülleri incelendiğinde 35°C ’de gösterdikleri protein profilinin aksine birçok c-tipi sitokrom proteinlerini daha düşük miktarda içerdiği görüldü (Şekil 4.4). Mutanlarda gözlenen sıcaklığa bağlı bu fenotip değişikliklerini anlamak için sıcaklık-değişim deneyi yapıldı. Buna göre, mutantlar MPYE besiyerinde 25°C sıcaklıktaki inkübatörde 2-3 gün süreyle üretildi ve daha sonra 35°C ’lik inkübatöre transfer edilerek 1-2 gün daha üremeye bırakıldı. Mutantların Nadi fenotipleri incelendiğinde ise sitokrom oksidaz aktivitelerini 8 2 kaybettikleri görüldü (Nadi−). Bunun aksine, 35°C sıcaklıktaki inkübatörde iki gün süreyle üretildikten sonra 25°C ’lik inkübatörde 1-2 gün üremeye bırakıldıklarında ise oksidaz aktivitelerini geri kazandıkları ve böylece Nadi+ fenotipi gösterdikleri görüldü. Şekil 4.4. R. ca psulatus RRC00138 null mutantının (SA4) 25°C sıcaklıkta MPYE veya MedA besi ortamında aerobik koşullarda üreyen hücrelerinden izole edilen intrasitoplazmik membran vesiküllerindeki c-tip sitokrom profili. 4.6. RRC00139 Geni RRC00138 ’in İşlevselliğinde Polar Etki Göstermez Genetik tamamlama testleri ile RRC00138 genini içeren pMRC2 plazmitinin IJ1 ve SA4/SA1 mutantlarını; RRC00139 genini içeren pMRB/pAY1 plazmitlerinin de MR2/AYG4-25 ve SA6 mutantlarının Nadi fenotiplerini tamamladığı görüldü. RRC00139 geninin, RRC00138 geninin işlevselliğinde herhangi bir polar etkisinin olup olmadığını anlamak için detaylı genetik tamamlama testleri yapıldı. Buna göre, pSEM4 (RRC00138::spe) plazmiti SA6 mutantına [∆(RRC00139::spe)]; pSEM9 [∆(RRC00139::spe)] plazmiti ise SA4 [∆(RRC00138::spe)] mutantına aktarıldı ve elde edilen transkonjugantların Nadi fenotipleri incelendi. SA6/pSEM4 ([∆(RRC00139::spe)]/(RRC00138::spe)) ve SA4/pSEM9 ([∆(RRC00138::spe)]/ [∆(RRC00139::spe)]) transkonjugantları sitokrom c oksidaz aktivitelerini geri kazanarak Nadi+ fenotipi gösterdi. Bu sonuç, RRC00139 genindeki interpozon mutagenesizin RRC00138 geninin işlevselliğinde herhangi bir polar etkisinin olmadığını gösterdi. 8 3 4.7. RRC00138 Geninin E. coli plsC(Ts) Mutant Fenotipini Tamamlama Yeteneği RRC00138 ’in amino asit dizisi AGPAT ailesi ile yüksek derecede benzerlik gösterdiğinden, RRC00138 geninin AGPAT aktivitesine sahip bir enzim kodlayıp kodlamadığı incelendi. Bu amaçla, RRC00138 geni E. coli plsC(Ts) mutantına (SM2-1) aktarılarak, genin mutasyonu tamamlama yeteneği test edildi. SM2-1 mutantı plsC ’nin sıcaklığa duyarlı (Ts) allelini taşır ve 42°C sıcaklıkta üreyemez (Coleman, 1990). RRC00138 geninin tamamlama yeteneğini test edebilmek için, öncellikle RRC00138 geni PBAD promotoru altında L-arabinoz ile indüklenebilen pBAD/Myc-HisA vektörüne klonlandı (pSEM17 plazmiti, Şekil 3.5B). RRC00138 geninin SM2-1 mutantındaki işleyişi L-arabinozun indüksiyonu ile gerçekleşti ve genin işlevselliği Anti-myc antikoru varlığında immunoblot analizi ile gözlendi. Buna göre, %0.02, 0.2 ve 2 ’lik L-arabinoz ile indüklenen SM2-1/pSEM17 transformant hücrelerinden izole edilen protein ekstraktlarında, yaklaşık 31 kDa büyüklüğünde bir protein bandı gözlendi (Şekil 4.5-A, 3-5. kuyu). Bu değer, RRC00138 gen ürünü için hesaplanan 30.718 Da moleküler ağırlığına denk gelmektedir. Bu protein bandı, L-arabinoz ile indüklenmeyen hücrelerden elde edilen protein ekstraktlarında ise gözlenmedi (Şekil 4.5-A, 2. kuyu). Genetik tamamlama testi için, SM2-1/pSEM17 transkonjugantı farklı L-arabinoz konsantrasyonlarında hazırlanan LB petri kabına çizilerek, 42°C ’lik inkübatörde üretildi. %2 ve %0.2 ’lik L-arabinoz içeren besi ortamında tam (Şekil 4.5-B); %0.02 ’lik L-arabinoz içeren besi ortamında ise az bir üreme gözlendi. Negatif kontrol olarak çizilen SM2-1/pBAD-Myc-HisA transkonjugantında ise herhangi bir üreme gözlenmedi. R. capsulatus ’da bugüne kadar henüz tanımlanmış plsB homologu bulunmadığından RRC00138 geninin AGPAT ile birlikte GPAT aktivitesini de kodlayıp kodlamadığı test edildi. İn vivo koşullarda RRC00138 gen ürününün GPAT aktivitesini test etmek için, RRC00138 genini taşıyan plazmit E. coli plsB26, plsX50 G3P oksotrofik mutantına (SJ22; Rock ve Jackowski, 1982) aktarılarak, genin mutasyonu tamamlama yeteneği incelendi. E. coli SJ22 mutantında, plsB26 alelli mutant proteinin kararlılık özelliğini ve enzimin kinetiğini değiştiren missense mutasyonu taşır. Diğer yandan 8 4 plsX50 alleli ise missense mutasyonu taşımakta olup, plsB mutantının G3P oksotrofik özellik göstermesi için mutlak gereklidir. pSEM17 plazmitinin SJ22 mutantına aktarılmasıyla elde edilen transformant G3P ’dan yoksun ancak farklı L-arabinoz konsantrasyonlarına sahip minimal besi yeri (MedE) içeren petri kaplarında optimal üreme sıcaklığında (37°C) üretildi. SJ22/pSEM17 transformantı yüksek L-arabinoz (%2) içeren besi ortamında bile herhangi bir üreme göstermedi (Şekil 4.5-C). Tüm bu sonuçlar bize R. capsulatus RRC00138 geninin özgün AGPAT aktivitesiyle E. coli plsC geninin fonksiyonel homoloğu olduğunu gösterdi. Şekil 4.5. R. capsulatus RRC00138 gen ürünün E. coli ’deki işleyişi ve E. coli plsC ve plsB-plsX mutantlarının üreme fenotipini tamamlama yeteneği. (A) İmmunoblot analizi. (1), L-arabinoz ile indüksiyondan önceki; (2), indüklenmemiş total; (3), %0.02 ’ lik L-arabinoz ile indüklenmiş; (4) %0.2 ’lik L-arabinoz ile indüklenmiş ve (5), %2 ’lik L-arabinoz ile indüklenmiş hücre ekstraktları %12 ’lik SDS-PAGE de ayrıştırıldı ve PVDF membranına transfer edilerek RRC00138 proteini Anti-myc antikoru ile gözlendi. (B) RRC00138 genini taşıyan E. coli sıcaklığa duyarlı mutantın (plsC(Ts)) %2 ’lik L- arabinozun varlığında veya yokluğunda üreyebilme yeteneği. (C) RRC00138 genini taşıyan E. coli gliserol-3-fosfat oksotrofik mutantın %2 ’lik L- arabinozun varlığında veya yokluğunda üreyebilme yeteneği. 86 4.8. RRC00138 Gen Ürünün R. capsulatus ’daki İşlevselliği RRC00138 gen ürünün R. capsulatus ’daki işleyişini gözlemek için öncellikle pBAD promotörü tarafından kontrol edilen RRC00138 genini taşıyan plazmit pRK415 plazmitine klonlanarak pSEM18 plazmiti (Şekil 3.6) elde edildi ve rekombinant plazmit SA1 (RRC00138::spe) mutantına çaprazlamayla aktarıldı. SA1/pSEM18 transkonjugantı ve negatif kontrol olarak kullanılan SA1 mutantı %2 L-arabinoz içeren veya içermeyen MPYE besiyerinde üretildi ve hücrelerden izole edilen kromotofor membranlarındaki RRC00138 proteinin işleyişi immunoblot tekniği ile incelendi. Beklenildiği gibi yaklaşık 31 kDa moleküler ağırlığındaki protein bandı %2 L-arabinoz içeren besi ortamında üreyen SA1/pSEM18 transkonjugantında gözlendi (Şekil 4.6, 4. kuyu). Diğer yandan, SA1/pSEM18 transkonjugantının L-arabinoz içeren veya içermeyen MPYE besiyerlerindeki Nadi fenotipi ve c-tipi sitokrom profili de incelendi. L-arabinozun varlığı veya yokluğunda transkonjugantın Nadi reaksiyonunu katalizleyebildiği ve tüm c-tipi sitokrom proteinlerini yaban soy oranında üretebildiği gözlendi (data gösterilmemiştir). Şekil 4.6. R. capsulatus RRC00138 gen ürünün R. capsulatus ’daki işleyişinin immunoblot tekniği ile analizi. (1), (RRC00138::spe) mutantının indüklenmemiş; (2), (RRC00138::spe) mutantının %2 ’lik L- arabinoz ile indüklenmiş; (3) (RRC00138::spe)/(RRC00138)+ transkonjugantının indüklenmemiş; (4), (RRC00138::spe)/ (RRC00138)+ transkonjugantının %2 ’lik L-arabinoz ile indüklenmiş hücrelerinden izole edilen kromotofor membranları immünoblot tekniği ile incelendi. 87 4.9. RRC00138 Null Mutantında İn vitro GPAT+AGPAT Aktivite Testi RRC00138 ile diğer AGPAT homologlarının protein düzeyinde gösterdikleri homoloji, RRC00138 gen ürünün R. capsulatus ’da AGPAT olarak görev alabileceği ihtimalini getirdi. Bu nedenle, in vitro koşullar altında açil vericisi olarak cis-vasenil- ACP ve açil alıcısı olarak [14C]-G3P kullanılarak R. capsulatus yaban soy (MT1131) ve RRC00138 null mutantının (SA1) intrasitoplazmik membran vesiküllerinde GPAT+AGPAT aktiviteleri Materyal ve Yöntemde açıklandığı gibi “filter-disk” testi (Goldfıne, 1969) ile incelendi. Buna göre, RRC00138 mutantının yaban soy oranında G3P açiltransferaz aktivitesi gösterdiği görüldü (Şekil 4.7A). Ayrıca, her iki soya ait reaksiyon karışımı silika tabakada ince tabaka kromotografisi (TLC) yöntemiyle ayrıştırıldığında da RRC00138 mutantının yaban soy ile benzer oranda PA ’yı üretebildiği gözlendi (Şekil 4.7B). Şekil 4.7. R. capsulatus yaban soy ve RRC00138 null mutantının in vitro koşullardaki GPAT+AGPAT aktivite testi. A) MPYE besi ortamında solunumla üreyen yaban soy ve RRC00138 mutantına ait intrasitoplazmik membran vesikülleri 14C-G3P ile işaretlendi ve farklı zaman noktalarında alınan örneklerdeki enzim aktivitesi ölçüldü. B) 14C-G3P ile işaretlen intrasitoplazmik membran vesiküllerindeki lipidler izole edildi ve TLC tabakada ayrıştırıldı. LPA, lisofosfatidik asit; PA, fosfatidik asit; Ys, yaban soy; ∆138, RRC00138 null mutantı (SA1). 88 R. capsulatus ’da RRC00138 geninin inaktivasyonun letal olmaması, mutantların yaban soy oranında G3P açiltransferaz aktivitesi göstermesi ve PA ’yı üretebilmesi bize c-tipi sitokrom proteinlerinin yokluğunun gliserofosfolipid biyosentez yolundaki bir eksiklikten kaynaklanmadığını göstermektedir. Ayrıca bu sonuç R. capsulatus ’un E. coli ’den farklı olarak gliserofosfolipid biyosentezi için alternatif AGPAT enzim(ler)ini de kullanabileceğini gösterdi. Biyoinformatik analizlerle R. capsulatus genomunda AGPAT protein dizisi ile homoloji gösteren iki açık okuma bölgesi (RRC00316 ve RRC03498) tespit edildi. RRC00316 geni, genomda RRC00138 ile aynı bölgede yer alırken, RRC03498 geni ise genomda bu iki genden farklı bir bölgede yer almaktadır. 4.10. RRC00138 ve RRC00139 Aminoasit Dizilerinin Ornitin Lipid Biyosentezini Katalizleyen Gen Ürünlerin Dizileri ile Homolojisi Yeni yapılan biyoinformatik analizlerle, RRC00138 geninin amino asit dizisinin bitkilerde nodül oluşturan Sinorhizobium meliloti OlsA protein dizisi ile yüksek derecede homoloji gösterdiği görüldü (%29 oranında aynı ve %25 oranında benzer amino asit) (Şekil 4.8). Benzer şekilde, RRC00139 amino asit dizisi de aynı bakterinin OlsB dizisi ile yüksek derecede benzerlik gösterdi (%34 oranında aynı ve %28 oranında benzer amino asit) (Şekil 4.9). olsA ve olsB gen ürünleri S. meliloti ’de ornitin lipid (OL) biyosentez yolunda gerekli genlerdir (Gao ve ark., 2004; Weissenmayer ve ark., 2002). RRC00138 ve RRC00139 genlerinin protein düzeyinde OlsA ve OlsB dizileriyle homoloji göstermesi, bize RRC00138 ve RRC00139 genlerinin R. capsulatus ’da OL biyosentezinden sorumlu genler olabileceği ihtimalini getirdi. Bu nedenle, RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarındaki membran polar lipid profilleri incelenerek, bu iki genin OL biyosentezinde gerekli genler olup olmadığı araştırıldı. Şekil 4.8. R. capsulatus RRC00138 ’in amino asit dizisi ile S. meliloti OlsA ’in amino asit dizisinin karşılaştırılması. (*), her iki proteinde de korunmuş amino asitleri; (:) ve (.) ise her iki proteinde bulunan benzer amino asitleri gösterir. Şekil 4.9. R. capsulatus RRC00139 ’in amino asit dizisi ile S. meliloti OlsB ’in amino asit dizisinin karşılaştırılması. (*), her iki proteinde de korunmuş amino asitleri; (:) ve (.) ise her iki proteinde bulunan benzer amino asitleri gösterir. 91 4.11. RRC00138 ve RRC00139 Null Mutantlarının Membran Polar Lipid Profili R. capsulatus MT1131 yaban soy, RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarına ve transkonjugantlara ait [14C]asetat ile işaretlenmiş veya işaretlenmemiş hücrelerden toplam hücresel lipidleri Materyal ve Yöntem ’de açıklandığı gibi izole edildi. Membran polar lipidleri [fosfatidilethanolamin (PE), dimetilfosfatidilethanolamin (DMPE), diaçilgliseril trimetilhomoserin (DGTS), fosfatidilgliserol (PG), fosfatidilkolin (PC) ve ornitin lipid (OL)] relatif mobilitileri (RF), uygun referans kimyasal ve özgün bileşiklerden yararlanılarak ve S. meliloti yaban soyunun (Sm-1021) lipid profili (Weissenmayer ve ark., 2002; Gao ve ark., 2004) (Şekil 4.10) ile karşılaştırılarak tanımlandı (Şekil 4.11). Şekil 4.10. S. meliloti yaban soy ve OlsB mutantının membran polar lipid profili. Minimal MedA besi yerinde [14C]asetat varlığında üreyen S. meliloti 1021 yaban soyu (A) ve OlsB null mutantının [∆(olsB::kan), AAK1] (B) lipid ekstraktları iki boyutlu ince tabaka kromotoğrafi (2D-TLC) tekniği ile ayrıştırıldı. Membran lipidleri, fosfatidil gliserol (PG), fosfatidil ethanolamin (PE), dimetilfosfatidilethanolamin (DMPE), fosfatidil kolin (PC), kardiolipin (CL) ve ornitin lipid (OL) TLC kromotogramında gösterilmiştir. Solvent sistemi olarak birinci boyut (↑) için kloroform/metanol/dH2O (14:6:1, v/v/v) ve ikinci boyut (←) için ise kloroform/metanol/glasiyal asetik asit (13:5:2, v/v/v) kullanıldı (de Rudder ve ark., 1999). O, orjin. 92 R. capsulatus MT1131 yaban soyuna ait toplam lipid ekstraktı [14C]-asetat ile işaretlenmiş veya işaretlenmemiş hücrelerden izole edildi ve iki boyutlu ince tabaka kromotografi (2D-TLC) tekniği ile ayrıştırıldı (Şekil 4.11A, 4.12A, 4.13A). Radyoaktif ile işaretlenmemiş toplam hücre lipid ekstraktları kromotogramda ayrıştırıldıktan sonra serbest amino gruplarını taşıyan lipidleri (PE ve OL) gözlemek için kromotograma ninhidrin boyası püskürtüldü. Boyama sonunda sadece iki lipid lekesi ninhidrin boyası ile reaksiyon göstererek kırmızı-mor renk verdi (Şekil 4.11A). Daha sonra membran gliserofosfolipidlerini gözlemek için kromotograma molibdenum mavisi püskürtüldü. Fosfat grubu içeren lipidlere ait spotlar molibdenum boyası ile mavi renk verdi (örneğin, PE, PG, PC, data gösterilmemiştir). Ninhidrin-pozitif ve molibdenum mavisi- pozitif gösteren lipid lekesi kromotograma yüklenen farklı ticari lipid markırların yardımıyla PE olarak tanımlandı. Ancak PE nin hemen altında yer alan diğer ninhidrin- pozitif lekesi ise molibdenum mavisi ile reaksiyon göstermedi. S. meliloti de aynı 2D- TLC solvent sistemi kullanıldığında gözlenen bu ninhidrin-pozitif ve molibdenum mavisi-negatif lekenin kütle spektrometrik analizler ile OL olarak tanımlanmıştır (Şekil 4.11A ve Geiger ve ark., 1999). Yine kullanılan lipid markırları sayesinde molibdenum mavisi-pozitif fakat ninhidrin-negatif lipid lekelerin de PC ve PG ’ye karşılık geldiği görüldü (data gösterilmemiştir). MT1131 yaban soyunun [14C]-asetat ile işaretlenmiş hücrelerinden izole edilen lipidler 2D-TLC ’de ayrıştırıldı ve radyoaktif lipid lekeleri S. meliloti yaban soy hücrelerine ait lipid profili (Şekil 4.10A) ile karşılaştırıldı. Buna göre, PE, PG, PC, DMPE ve OL ’nin varlığı diğer yandan CL ’nin yokluğu R. capsulatus yaban soyunda gözlendi (Şekil 4.12A ve Şekil 4.13A). MPYE veya MedA besiyerlerinde [14C]-asetat varlığında ya da yokluğunda üreyen SA4, SA6 ve SA8 null mutantlarına ait hücresel lipidler analiz edildiğinde, mutantların yaban soy oranında membran fosfolipidlerini (PE, PC, PG ve DMPE) üretebildikleri gözlendi (Şekil 4.12B, C ve D, Şekil 4.13B ve C). Ancak OL ’e karşılık gelen lipid lekesi hem ninhidrin boyamayla (Şekil 4.11B ve C) hem de fosfoimager da görülmedi (Şekil 4.12B, C ve D; Şekil 4.13B ve C). Ayrıca farklı besi ortamlarında (MPYE veya MedA) üreyen mutantlarda OL ’nin gözlenmemesi OL ’nin yokluğunun 93 besi ortamında bağlı olmadığını gösterdi (Şekil 4.12B, C ve D; Şekil 4.13B ve C). Diğer yandan, RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının Nadi fenotipini tamamlayan pMRC plazmitini taşıdıklarındaki OL ’i üretebilme yeteneği incelendiğinde ise transkonjugantların OL ’i yaban soy oranında üretebildikleri gözlendi (Şekil 4.12D). Şekil 4.11. R. capsulatus yaban soy, RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarında serbest amino grubuna sahip lipidlerin ninhidrin boyama ile belirlenmesi. Minimal MedA besi yerinde optimal sıcaklıkta üreyen R. capsulatus MT1131 yaban soyu (A), RRC00139 null mutantı [∆(RRC00139::spe), SA6] (B) ve RRC00138-RRC00139 ikili mutantına [∆(RRC00138-RRC00139::spe), SA8] (C) ait lipid ekstraktları Şekil 4.10 ’da açıklandığı şekilde ayrıştırıldı ve kromotograma ninhidrin boyası püskürtüldü. Serbest amino grubu içeren lipidlerin (fosfatidil ethanolamin (PE) ve ornitin lipid (OL)) ’in kromotogramdaki lokalizasyonları gösterilmiştir. 1, PE standartını; 2, Lisofosfatidilethanolamin (LPE) standartını; O ise orjini gösterir. Şekil 4.12. Minimal MedA besi yerinde [14C]asetat varlığında büyütülmüş R. capsulatus yaban soy, RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının membran polar lipid profili. MedA besi yerinde [14C]-asetat ile işaretlenmiş R. capsulatus MT1131 yaban soyu (A), RRC00138 null mutantı [∆(RR00C138::spe), SA4] (B), RRC00139 null mutantı [∆(RRC00139::spe), SA6] (C), RRC00139-138 ikili mutantı [∆(RRC00138-RRC00139::spe), SA8] (D) ve pMRC plazmitini taşıyan RRC00138 mutantına [SA4/pMRC] (E) ait lipid ekstraktları Şekil 4.10 ’da açıklandığı şekilde ayrıştırıldı ve fosfoimager da radyoaktif lipid lekeleri tarandı. Membran lipidlerin (PG, PE, DMPE, PC ve OL) kromotogram üzerindeki lokalizasyonları gösterilmiştir. O, orjin. Şekil 4.13. Zenginleştirilmiş MPYE besi yerinde [14C]-asetat varlığında büyütülmüş R. capsulatus yaban soy, RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının membran lipid profili. MPYE besi yerinde optimal sıcaklıkta [14C]-asetat ile işaretlenmiş R. capsulatus MT1131 yaban soyu (A), RRC00138 null mutantı [∆(RR00C138::spe), SA4] (B), RRC00139 null mutantına [∆(RRC00139::spe), SA6] (C) ait lipid ekstraktları Şekil 4.10 ’da açıklandığı şekilde ayrıştırıldı ve fosfoimager da radyoaktif lipid lekeleri tarandı. 9 6 R. capsulatus yaban soy, null mutantları ve transkonjugantlarda gözlenen polar lipidlerin total yüzdesi incelendiğinde, OL ’den yoksun null mutantlardaki PE, PG ve PC miktarlarının yaban soy oranında olduğu gözlendi. Ancak mutanların Nadi fenotipini tamamlayan pMRC plazmitini taşıyan transkonjugantlardaki OL miktarının yaban soya kıyasla iki kat arttığı gözlendi. Yine transkonjugantlardaki PE miktarında mutantlara kıyasla artma buna karşılık PC miktarında ise azalma görüldü (Çizelge 4.4). Çizelge 4.4. MedA besi yerinde üreyen R. capsulatus yaban soy, RRC00138 ve RRC00139 null mutantlarının ve transkonjugantların membran polar lipid kompozisyonu. Lipid kompozisyonu (Toplam 14C ’ın % ’si) PE PG PC OL Yaban soy 19.1 ± 0.6 20.1 ± 0.3 45.4 ± 0.2 4.3 ± 0.2 Mutantlar SA4 [∆(RRC00138::spe)] 21.2 ± 0.1 22.9 ± 0.2 41.9 ± 0.4 n.d. SA6 [∆(RRC00139::spe)] 17.4 ± 0.5 18.6 ± 0.3 56.2 ± 0.8 n.d. SA8 [∆(RRC00139-138::spe)] 18 ± 0.6 20.5 ± 0.4 49.5 ± 0.7 n.d. Transkonjugantlar SA4/pMRC 33.3 ± 0.3 19.3 ± 0.2 23.7 ± 0.3 9.7 ± 0.7 SA6/pMRC 30.7 ± 0.5 18.6 ± 0.3 33.9 ± 0.4 9.2 ± 0.5 SA8/pMRC 32.0 ± 0.7 23.0 ± 0.4 24.3 ± 0.6 9.4 ± 0.5 n.d. gözlenmeyenler RRC00138 ve RRC00139 mutantlarının MPYE besiyerinde sıcaklığa bağlı gösterdikleri fenotip değişikleri göz önüne alınarak SA4 mutantının 25°C sıcaklıktaki polar lipid kompozisyonu yaban soy ile karşılaştırılarak incelendi (Şekil 4.14). Buna göre SA4 mutantının 25°C ’de MPYE besiyerinde üreyen hücrelerinden izole edilen 9 7 lipid ekstraktları analiz edildiğinde mutantın OL dışında tüm fosfolipidleri yaban soy oranında üretebildiği gözlendi (Şekil 4.14B). Böylece, OL ’in farklı sıcaklık ve besiyerlerinde yokluğuna rağmen, hücreler ancak belli sıcaklık ve besiyeri kombinasyonlarında farklı c-tipi sitokrom proteinlerini üretebildiği görüldü. Bu da bize, OL ’in bakterilerdeki rolünün fizyolojik üreme koşullarıyla sıkıca bağlantılı olma olasılığını düşündürdü. Şekil 4.14. 25°C sıcaklıkta MPYE besi yerinde üreyen RRC00138 null mutantının membran polar lipid profili. 25°C sıcaklıkta MPYE besi yerinde [14C]-asetat varlığında üreyen MT1131 yaban soyu (A) ve SA4 mutantına (B) ait lipid ekstraktları Şekil 4.10 ’da açıklandığı şekilde ayrıştırıldı ve fosfoimager da radyoaktif lipid lekeleri tarandı. 4.12. R. capsulatus ’da OL Biyosentezi Fosfat Miktarıyla İlgili Değildir Genellikle OL, bakteriyel total lipidlerin oldukça küçük bir kısmını oluşturur. Ancak bazı türlerde ortamdaki sınırlı fosfat varlığında PE ’nin miktarında azalma buna karşılık OL ’nin miktarında ise artma gözlenir (Minnikin ve Abdolrahimzadeh, 1974; Benning ve ark., 1995; Geiger ve ark., 1999). Bu nedenle, R. capsulatus ’daki OL miktarının da ortamdaki fosfat miktarıyla bir ilişkisi olup olmadığı incelendi. MedA minimal besi yeri 20 mM fosfat içerirken, MPYE besi yeri sınırlı miktarda (yaklaşık 1-3 mM) fosfat içermektedir. Buna göre, MT1131 yaban soyu 0.1 mM, 1 mM veya 20 mM fosfat içeren minimal MedA besi yeri veya zenginleştirilmiş MPYE besi yerinde [14C]- 9 8 asetat varlığında üretildi ve total hücre lipidleri 2D-TLC tekniği ile ayrıştırıldı (Şekil 4.15A, B, C ve D). MedA besi ortamındaki fosfat konsantrasyonu 20 mM (ya da 1 mM) ’dan 0.1 mM ’a düştüğünde fosfat grubundan yoksun diaçilgliseril trimetilhomoserinin (DGTS, Benning ve ark., 1995; Geiger ve ark., 1999) miktarında gözlenen artış ile yaban soydaki total lipid kompozisyonu değişti (Şekil 4.15A). Ancak OL miktarının farklı fosfat konsantrasyonlarında benzer oranda olduğu gözlendi (Şekil 4.15A, B, C ve D). Böylece, yaban soyunun yüksek fosfat (1 mM ya da 20 mM) içeren MedA ve MPYE besi yerlerinde benzer lipid profiline sahip olması bize R. capsulatus ’daki OL sentezinin ortamdaki fosfat miktarı ile düzenlenmediğini gösterdi. Şekil 4.15. Farklı fosfat konsantrasyonları içeren besi ortamlarında üreyen R. capsulatus yaban soyunun hücresel lipid profili. 0.1 mM fosfat (A), 1 mM fosfat (B) ya da 20 mM fosfat (C) içeren minimal Med A besiyerinde ya da zenginleştirilmiş MPYE besi yerinde (D) [14C]-asetat varlığında üreyen R. capsulatus MT1131 yaban soyuna ait lipid ekstraktları Şekil 4.10 ’da açıklandığı şekilde ayrıştırıldı ve fosfoimager da radyoaktif lipid lekeleri tarandı. 10 0 4.13. R. capsulatus ve S. meliloti Türleri Arasında Heterolog Tamamlama Testi RRC00138 ve RRC00139 genleri S. meliloti ’deki OL biyosentez yolunda gerekli genler ile homoloji gösterdiklerinden, R. capsulatus genlerinin S. meliloti genlerinin fonksiyonel homoloğu olup olmadıklarını anlamak için iki tür arasında tamamlama testi yapıldı. Buna göre, S. meliloti olsB genini taşıyan plazmit (pJG21, Gao ve ark., 2004) R. capsulatus RRC00139 null mutantına (SA6); diğer yandan R. − capsulatus RRC00139 genini taşıyan plazmit (pSEM20) ise S. meliloti OlsB mutantına (AAK1, Gao ve ark., 2004) çaprazlama ile aktarıldı. SA6/pJG21 ve AAK1/pSEM20 transkonjugantlarının MedA besi yerinde [14C]asetat varlığında üreyen hücrelerinden izole edilen lipid ekstraktları analiz edildiğinde her iki heterolog transkonjugantın da OL ’i üretebildiği gözlendi (Şekil 4.16B). Ayrıca, SA6/pJG21 transkonjugantının farklı besi ortamlarındaki Nadi fenotipi ve c-tipi sitokrom profilleri de incelendiğinde, transkonjugantın Nadi+ fenotipini geri kazandığı ve tüm c-tipi sitokrom proteinlerini yaban soy oranında üretebildiği gözlendi (data gösterilmemiştir). Diğer yandan, R. capsulatus RRC00139-RRC00138 genlerini taşıyan plazmit (pMRC) − S. meliloti OlsA mutantına (ORLD1, Weissenmayer ve ark., 2002); S. meliloti olsA genini taşıyan plazmit (pBW51) de R. capsulatus RRC00138 null mutantına (SA4) aktarıldı. SA4/pBW51 transkonjugantı OL ’i üretemezken (Şekil 4.16C), ORLD1/pMRC transkonjugantı ise oldukça yüksek oranda OL ’i üretebilme yeteneği kazandığı görüldü (Şekil 4.16D). Tüm genetik ve biyokimyasal tamamlama testleri, R. capsulatus RRC00138 ve RRC00139 genlerinin S. meliloti olsA ve olsB genlerinin fonksiyonel homoloğları olduklarını gösterdi. Şekil 4.16. R. capsulatus ve S. meliloti türleri arasında heterolog tamamlama testleri ve transkonjugantların polar lipid profili. R. capsulatus RRC00139 genini taşıyan S. meliloti OlsB mutantı (AAK1/pSEM20) (A), S. meliloti olsB genini taşıyan RRC00139 null mutantı (SA6/pJG21) (B), S. meliloti olsA genini taşıyan RRC00138 null mutantı (SA4/pBW51) (C) ve R. capsulatus RRC00138-139 genlerini taşıyan S. meliloti OlsA mutantına (ORLD1/pMRC) (D) ait lipid ekstraktları Şekil 4.10 ’da açıklandığı şekilde ayrıştırıldı ve fosfoimager da radyoaktif lipid lekeleri taran 10 2 4.14. R. capsulatus OL ’in Kimyasal Yapısı R. capsulatus OL ’in kimyasal yapısı kütle spektrometre analizi ve S. meliloti OL ’in kimyasal yapısı ile karşılaştırılarak incelendi. R. capsulatus ve S. meliloti bakterilerinin yaban soylarına ait hücresel membran lipidleri 2D-TLC ’de ayrıştırıldı ve OL ’e karşılık gelen leke silika tabakadan kazınarak kütle spektrometre tekniği kullanılarak analiz edildi. Pozitif kontrol olarak kullanılan S. meliloti OL ekstraktı için kütle spektrumun 600-800 m/z ’lik bölgesi tarandığında literatürde gösterildiği gibi (Geiger ve ark., 1999) 694 m/z ’de güçlü bir iyon [M + H]+ gözlendi (Şekil 4.17A). Ayrıca, 694 m/z ’lik bu iyonun MS/MS analizi yapıldığında ise sırasıyla protonlanmış ornitin ([Orn + H]+), ornitin B ve ornitin immonium iyonlarına karşılık gelen 415, 397, 379, 361, 133, 115 ve 70 m/z ’lik fragment ürünleri elde edildi. Buna karşılık, R. capsulatus yaban soyuna (MT1131) ait OL ise 680 m/z ’de güçlü bir iyon verirken, aynı iyon RRC00139-RRC00138 ikili mutantında (SA8) ise gözlenmedi (Şekil 4.17B). R. capsulatus yaban soyunda gözlenen 680 m/z ’lik iyonun MS/MS ve devamındaki fragmentasyon analizi, spektrumun düşük kütle bölgesinde (400 m/z ’e kadar) tıpkı S. meliloti OL ’de gözlenildiği gibi 397, 380, 361, 133, 115 ve 70 m/z ’lik ürünlerin varlığını gösterdi. S. meliloti ’deki OL ’nin 694 m/z olmasına karşılık, R. capsulatus OL ’in 680 m/z olması iki farklı bakteri soylarındaki OL ’ler arasında 14 m/z ’lik bir farka sebep olmuştur. Lisoornitin lipide (LOL) [M + H]+ karşılık gelen 415 m/z ’lik değere kadar fragmentasyon profili (Geiger ve ark., 1999; Gao ve ark., 2004) iki bakteride de aynı olup (Şekil 4.17A ve B), bu da iki farklı OL arasındaki farklılığın LOL düzeyinde olamayacağını gösterdi. S. meliloti OL ’in ikinci açil zincirinin 14 m/z ’lik 19 karbon- siklopropen yağ asit zinciri içerdiği bilinmektedir (Geiger ve ark., 1999). Ancak, R. capsulatus genomunda siklopropen yağ asiti sentez enzimini (cfa) kodlayan herhangi bir gen bulunmadığından, OL ’nin ikinci yağ asiti zincirinde siklopropen halkasının bulunamayacağı (Grogan ve Cronan, 1997), buna karşılık Rhodobacter türlerinde oldukça baskın olan 18:1-(∆11) doymamış yağ asitinin bulunabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle Şekil 4. 18B ’de R. capsulatus ’daki OL ’in kimyasal yapısı tahmini olarak çizilerek, S. meliloti OL ile karşılaştırılmıştır. Şekil 4.17. R. capsulatus ve S. meliloti bakterilerindeki OL ’in kütle spektrometre tekniği ile analizi. Kontrol örnek olarak hazırlanan S. meliloti yaban soy (1021) ve OlsA mutantı (A), R. capsulatus yaban soy (MT1131) ve RRC00139-138 ikili mutantına (SA8) (B) ait OL ’e karşılık gelen kromotografideki leke MS ve MS/MS analizine tabi tutuldu. Sağ tarafta yer alan kutu, 670-720 m/z ’lik bölgede OL ’e karşılık gelen büyük iyonun yaban soydaki varlığını buna karşılık mutantta ise yokluğunu gösterir. Yaban soya ait bölge kırmızı renkte, mutanta ait bölge ise mavi renkte gösterilmiştir. Şekil 4.17. (Devam) Şekil 4.18. S. meliloti ve R. capsulatus türlerinde bulunan OL ’in kimyasal yapısı. (A), S. meliloti ’de tanımlanmış (Geiger ve ark., 1999) ve (B) R. capsulatus ’da ise tahmini OL ’in kimyasal yapısı. İki farklı türdeki OL ’ler arasında ikinci yağ asitinde gözlenen fark elips içerisine alınmıştır. S. meliloti OL ’in ikinci yağ asitinde siklopropen halkasının varlığı kesin olarak bilinmekte olup, R. capsulatus OL ’de ise siklopropen halkası bulunmamaktadır. 106 4.15. OL ’in Yokluğunda Minimal Besi Ortamında (MedA) 35°C Sıcaklıkta Sitokrom cy ’in Üretimi ve Yıkımı OL ’den yoksun mutantlarda gözlenen c-tip sitokrom proteinlerinin miktarlarındaki azalmanın, az miktarda üretilmelerinden mi yoksa çabucak yıkıma uğramalarından mı kaynaklandığını anlamak için “pulse-chase” deneyi yapıldı. Buna göre, karboksil ucu FLAG epitopuna bağlı sitokrom cy proteinini taşıyan pHM7 plazmiti (sitokrom cy-FLAG) yaban soy ve RRC00139-RRC00138 ikili mutantına (SA8) aktarıldı. Daha sonra, MedA besi yerinde 35°C sıcaklıkta SA8 mutantında gözlenen sitokrom cy proteininin miktarı sitokrom cy-FLAG plazmitini taşıyan ve taşımayan MT1131 yaban soyu ile karşılaştırıldı (Şekil 4.19). Bu amaçla MedA besi yerinde üreyen SA8/pHM7 ve MT1131/pHM7 transkonjugantları ve MT1131 soyu beş dakika süreyle [14C]-amino asit karışımı ile inkübe edildi. İşaretlenen hücrelere %0.1 kasamino asit eklenerek reaksiyon durduruldu. Farklı zaman aralıklarında (0., 1., 2., 5., 10., 30., 60., 120. ve 480. dakikada) örnekler alınarak hücreler lizis tamponu ile parçalandı ve hücre ekstraktları anti-FLAG antikoruna bağlı agaroz jel (Anti-FLAG M2 Affinity gel) ile muamale edildi. Jele bağlanmış immunokompleksler (I) ve üst sıvılar (U) SDS- PAGE ’de ayrıştırıldı ve radyoaktif protein bandları fosfoimager da incelendi. Buna göre FLAG epitopuna taşıyan plazmite sahip yaban soy hücrelerindeki (MT1131/pHM7) sitokrom cy ’in varlığı ve değişen zaman aralıklarındaki sabitliği gözlendi (Şekil 4.19A ve B). Ancak OL ’den yoksun mutantlar incelendiğinde ise mutantın sitokrom cy proteinini yaban soya kıyasla daha az ürettiği görüldü (Şekil 4.19C). Diğer yandan, hem yaban soy hem de mutantaki sitokrom cy proteinin yıkım oranının 480. dakikaya kadar benzer kaldığı görüldü (data gösterilmemiştir). Böylece, MedA besi yerinde 35°C sıcaklıkta, OL ’in yokluğunun sitokrom cy ’in yıkımından ziyade proteinin üretimi üzerinde etkili olduğu belirlendi. Bu bulgular bize OL ’in en azından membrana bağlı sitokrom cy proteinin biyogenesiz sürecinde bir şekilde gerekli olabileceğini gösterdi. Şekil 4.19. 35°C sıcaklıkta minimal MedA besi yerinde üreyen OL ’den yoksun mutantta gözlenen sitokrom cy proteinin üretimi ve yıkımı. Karboksil-uca bağlı FLAG epitopuna sahip pHM7 plazmitini taşıyan R. capsulatus yaban soy (Ys, MT1131) (A ve B) ve RRC00139-138 ikili mutantı (∆139-138, SA8) (C) beş dakika süreyle [14C]amino asit karışımı ile işaretlendi ve reaksiyon %0.1 kasmino asit eklenmesiyle durduruldu. Farklı zaman noktalarında alınan örneklerdeki sit cy-FLAG ’ın miktarı anti-FLAG antikoru ile gözlendi. 108 4.16. RRC00138 ve RRC00139 Mutantlarında Membran Protein Profili Zenginleştirilmiş MPYE besi ortamında optimal sıcaklıkta (35°C) üreyen RRC00139-RRC00138 ikili mutantı (SA8) ve yaban soyun kromotofor membran proteinleri SDS-PAGE analizleriyle karşılaştırıldı. OL ’den yoksun SA8 null mutantında henüz bilinemeyen farklı membrana bağlı proteinlerin miktarlarında önemli değişiklikler gözlendi. SA8 mutantında bazı membran proteinlerin miktarında yaban soya kıyasla azalma, buna karşılık bazı proteinlerin miktarında ise önemli ölçüde artma gözlendi (Şekil 4.20). Bu durum, hücrelerin 35°C ’de MPYE besi yerinde üretildiklerinde OL yokluğunun c-tipi sitokrom proteinlerinden başka birçok sitoplazma dışı proteinlerini de etkilediğini gösterdi. Şekil 4.20. Yaban soy ve OL ’den yoksun mutantın membran protein profillerinin SDS- PAGE ile karşılaştırılması. Yaban soy (Ys, MT1131) ve OL üretemeyen RRC00139-RRC00138 ikili mutantı (139-138, SA8) 35°C sıcaklıkta MPYE besi ortamında büyütülmüş hücrelerinden intrasitoplazmik membran vesikülleri izole edildi. 50 µg protein %15 ’lik SDS-PAGE de ayrıştırıldı ve jel Coomassie mavisi ile boyandı. OL ’den yoksun mutantta farklı sitoplazma dışı proteinlerin yükselen (beyaz renkte ok işareti) ve azalan (siyah renkteki ok işareti) miktarları sol tarafta gösterilmiştir. 109 5. Tartışma Fakültatif fototrof R. capsulatus ’da c-tipi sitokrom proteinleri, elektron transfer zincirinde bağımsız ya da enzim komplekslerinin (sitokrom bc1 kompleksi ve sitokrom cbb3 oksidaz) bir alt birimi olarak yer alan membrana bağlı veya periplazmada çözünür proteinlerdir. R. capsulatus ’da c-tipi sitokrom proteinlerinin yapımı ve işlevsel hale gelmesi sırasında mutlak gerekli en az on adet gen (ccmABCDEFGHI ve ccdA) tanımlandı (Kranz ve ark.,1998; Thöny-Meyer, 2002; Allen ve ark., 2003). Bakterinin solunum zincirinin en son elektron alıcı proteini olan sitokrom cbb3 oksidaz enziminin posttranslasyonal sürecinde ise ccoGHIS genlerin önemli rol aldığı belirlenmiştir (Koch ve ark., 2000). Fakat, daha önceki çalışmalarla izole edilen R. capsulatus ’da sitokrom cbb3 oksidaz aktivitesinden yoksun (Nadi −) besi ortamına bağlı farklı fotosentetik üreme ve c-tipi sitokrom protein profili gösteren IJ1, MR2 (Koch ve ark., 1998) ve AYG4 (Aygün, 1999) mutantları, c-tipi sitokrom proteinlerin ve cbb3 oksidazın biyogenesizi ile ilgili bilinen genleri ile Nadi fenotipleri tamamlanmadı. Buna karşılık, R. capsulatus kromozomal kütüphaneleri kullanılarak yapılan tamamlama testleri ile her üç mutantın da Nadi fenotipini tamamlayan kromozomal DNA parçası (pMRC) izole edildi ve klon üzerindeki ORF ler belirlendi (Koch ve ark., 1998; Aygün, 1999). Bu çalışmada ise kromozomal DNA parçasında yer alan ORF lerin detaylı genetik ve biyokimyasal analizleri ile sitokrom cbb3 oksidaz mutantlarının Nadi fenotipinden sorumlu gen(ler)in tanımlanması ve bu yeni genlerin fonksiyonlarının aydınlatılması amaçlandı. Interpozon mutagenezi tekniği ile inaktif hale getirilmiş pMRC klonu üzerinde bulunan ORF ler mutantlara aktarıldığında, RRC00138 delesyonunu taşıyan plazmit IJ1 mutantının; RRC00139 delesyonunu taşıyan plazmit ise MR2 ve AYG4-25 mutantlarının Nadi− fenotipini korudu. RRC00139 ve RRC00138 genlerinin inaktivasyonu ile elde edilen null mutantlarının (SA1, SA4, SA6 ve SA8) da oksidaz aktivitesi göstermemesi (Nadi−), R. capsulatus ’daki sitokrom cbb3 oksidaz ve c-tipi sitokrom biyogenesizinden sorumlu yeni genlerin RRC00139 ve RRC00138 olduğunu gösterdi. Null mutantları sıcaklığa bağlı Nadi fenotipi ve besi ortamı ve sıcaklığa bağlı farklı fotosentetik üreme özelliği gösterdiler (Çizelge 4.2; Şekil 4.1). Buna göre, optimal üreme sıcaklığında zenginleştirilmiş MPYE besi ortamında üreyen mutantların 110 intrasitoplazmik membran vesikülleri ve periplazmik çözünür kısımları incelendiğinde mutantların sitokrom c1 dışındaki diğer tüm c-tipi sitokromları üretemedikleri gözlendi (Şekil 4.3). Diğer yandan minimal MedA besi ortamında büyüyen hücrelere ait ekstraktlarda ise yaban soya kıyasla daha düşük miktarda olmakla beraber mutantların tüm c-tipi sitokrom proteinleri üretebildikleri görüldü (Şekil 4.3). Düşük sıcaklıkta MPYE besi ortamında ise mutantlar Nadi+ fenotipini ve fotosentetik büyüme yeteneğini geri kazandı ve yaban soya oranla düşük miktarda olmakla beraber tüm c-tipi sitokromları üretebildiler (Şekil 4.1, Şekil 4.4). Ancak MedA besi ortamında düşük sıcaklıkta üreyen mutantların Nadi− fenotipini korudukları ve tüm c-tipi sitokrom proteinlerini de optimal sıcaklıkta üreyen hücrelere kıyasla daha az ürettikleri görüldü. Mutantlar zenginleştirilmiş MPYE besi ortamında sıcaklığa bağlı olarak gösterdikleri farklı Nadi fenotipi, fotosentetik büyüme özelliği ve c-tipi sitokrom protein profili ile oldukça ilgi çekici bir fenotip taşımaktadırlar (Şekil 4.1, Şekil 4.3, Şekil 4.4). RRC00139 ve RRC00138 genlerinin başlangıçtaki biyoinformatik analizleri, RRC00139 gen ürününün hipotetik sitozolik proteini; RRC00138 gen ürününün ise tahmini AGPAT enzimini kodladığını gösterdi. Gerçekten, RRC00138 ’in amino asit dizisi, E. coli plsC gen ürününün (Coleman, 1992) dizisi ile yüksek oranda benzerlik göstermektedir. PlsC geni membran gliserofosfolipid biyosentezinde gerekli 1-açil-sn- gliserol-3-fosfat açiltransferaz (AGPAT) enzimini kodlar. RRC00138 dizisi ile E. coli ’nin AGPAT dizisi arasında görülen homolojiden yararlanılarak yapılan genetik tamamlama testi sonunda RRC00138 ’in E. coli plsC(Ts) mutantına yüksek sıcaklıkta üreme yeteneği kazandırdığı görüldü (Şekil 4.5). Ancak, RRC00138 gen inaktivasyonun mutantın G3P açiltransferaz enzim aktivitesini değiştirmemesi ve PA ’yı yaban soy oranında üretebilmesi (Şekil 4.7), R. capsulatus ’da PA sentez yolunda birden fazla enzimin olabileceği ihtimalini getirmektedir. E. coli ’de fonksiyonel bir AGPAT enziminin bulunmasına karşın, birçok bakteri ve ökaryotik organizmalarda birden fazla AGPAT aktivitesine sahip enzim tanımlandı. R. capsulatus genomunda yapılan detaylı biyoinformatik analizler (http://www.integratedgenomics.com) RRC00138 ’den başka AGPAT enzimini kodladığı tahmin edilen iki ORF (RRC00316 ve RRC03498) ’nin varlığını gösterdi. Bu ORF ’lerden RRC00316, genomda RRC00138 ile aynı bölgede (2G06-2D11) yer almakta olup, RRC00316 ’nın amino asit dizisi E. coli AGPAT dizisi 111 ile %19 oranında aynı ve %32 oranında ise benzer amino asit içerir. RRC03498 geni ise bu iki ORF den farklı bir bölgede (1A01-1C09) yer alır ve E. coli AGPAT ile %19 oranında aynı ve %26 oranında da benzer amino asite sahiptir. Bazı bakterilerde PA oluşumunu katalizleyen birden fazla AGPAT enziminin varlığı merak edilen bir konudur. Yapılan bazı çalışmalar, birden fazla AGPAT ’ın varlığının membran gliserofosfolipidlerin sentez ve regülasyonuna olanak sağladığını göstermiştir (Brown ve ark., 2002; Shih ve ark., 1999). Yine birden fazla bulunan AGPAT enzimleri değişik çevresel koşullarında fonksiyon gösterebildiklerinden, bakterinin yaşamını sürdürmesi açısından oldukça önemlidir. Son zamanlarda yapılan biyoinformatik analizler RRC00139 ve RRC00138 amino asit dizilerinin S. meliloti ’de OL biyosentezini katalizleyen olsB ve olsA gen ürünlerinin dizileri ile yüksek derecede homolojiye sahip olduğunu gösterdi. Homoloji bilgisinden yararlanılarak R. capsulatus genlerinin OL biyosentezinde gerekli genler olup olmadığı incelendi. Buna göre RRC00139 ve RRC00138 null mutantlarının hücresel polar lipid bileşenleri incelendiğinde mutantların temel gliserofosfolipidleri (PE, PG ve PC) yaban soy oranında içerdikleri buna karşılık fosfat grubu içermeyen lipid grubunda yer alan ornitin lipidi (OL) ise üretemedikleri gözlendi (Şekil 4.11A ve B; Şekil 4.12B, C ve D; Şekil 4.13B ve C). Mutantların RRC00139 ve/veya RRC00138 genlerini taşıyan plazmitlerle genetik tamamlama testleri, protein ve lipid eksikliğini gidermektedir (Şekil 4.3A-10. kuyu; Şekil 4.3B-5. kuyu; Şekil 4.12E). Böylece, birbiriyle çokta ilişkisi olduğu hemen anlaşılamayan bakteriyel iki farklı sürecin, uygun fizyolojik koşullar altında aslında birbiriyle oldukça ilgili olduğu görüldü. S. meliloti ve R. capsulatus türleri arasında heterolog tamamlama testleri yapıldığında RRC00139 ve RRC00138 gen ürünlerinin S. meliloti ’de OL biyosentezini katalizleyen olsB ve olsA genlerinin fonksiyonel homoloğları olduğunu gösterdi (Şekil 4.16). Diğer yandan kütle spektrometrik analizler, lisoornitin lipid (LOL) ’in kimyasal olarak her iki bakteri türünde aynı olduğunu ancak OL ürünün farklı olduğunu gösterdi (Şekil 4.17). Buna göre, R. capsulatus bakterisindeki OL ’in, S. meliloti ’de gözlenen OL ’in aksine, ikinci yağ asiti zincirinde siklopropen halkasını içermediği belirlendi (Şekil 4.18). Kütle spektrometre analizleri ile gözlenen bu sonuç, biyoinformatik 112 analizler sonunda R. capsulatus genomunda siklopropen sentaz enzimini kodlayan cfa geninin bulunmaması ile doğrulandı. OlsA geninin yokluğunda hem S. meliloti hem de R. capsulatus mutantlarında LOL ’in birikmediği ve RRC00139 ve RRC00138 genlerinin ise S. meliloti ’de OL ’i fazla miktarda ürettiği gözlenmiştir. OlsB geninin aksine S. meliloti olsA geninin R. capsulatus RRC00138 knock-out mutant fenotipini tamamlama yeteneğinden yoksun olması, bu türler arasındaki OlsA enzimlerinin farklı olabilme olasılığını artırmıştır. Gerçekten, S. meliloti ve P. fluorescens bakterilerinde bulunan olsA genleri E. coli plsC geniyle oldukça yüksek homoloji gösterir. Ancak, bu genler E. coli plsC(Ts) mutantlarının büyüme fenotipini tamamlama yeteneğinden yoksundur (Weissenmayer ve ark., 2002; Cullinane ve ark., 2005). olsA gen aktivitesine sahip RRC00138 geni plsC(Ts) mutant fenotipini tamamladığından, R. capsulatus olsA geni diğer bakterilerdeki olsA genlerinden farklı görünmektedir. Ancak diğer yandan, RRC00138 ’ın R. capsulatus ’daki temel AGPAT olmaması nedeniyle, bakteride bulunan alternatif AGPAT enzimlerini kodlayan genlerin genetik ve biyokimyasal yönden karakterizasyonlarına başlanılmış olup (Aygun-Sunar ve ark.-hazırlık aşamasında), elde edilecek sonuçlar ile bu genlerin membran gliserofosfolipid biyosentezindeki rolleri aydınlatılacaktır. OL ’ler, gram-negatif ve gram-pozitif bakteriler, Pseudomonads, Mycobacteria, Streptomyces ve Rhizobia (Asselineau, 1991) türlerini kapsayan insan patojenleri ve bitki simbiyontları arasında oldukça yaygındır. OL ’ler, memelilerde güçlü bir konakçı bağışıklık yanıtı sağlar. Böylece OL ’ler, B-lenfositlerin çoğalması, hemagulitinasyon, adjuvantisiti, hipotermiya (Kawai ve ark., 1996), reaktif oksijen radikallerinin üretimi (Kawai ve ark., 2000b), Toll-benzeri reseptör CD14-bağlı yol aracılığında makrofajların aktivasyonu ve interlökin-1 ve prostaglandin E2 ’nin üretimini (Kawai ve ark., 2000a) gerçekleştirir. Bakterilerde ise OL, ortamda sınırlı fosfat varlığında fosfolipidlerin yerini alır, ancak OL ’lerin bu özgün fonksiyonu hakkında bilgiler oldukça sınırlıdır (López- Lara ve ark., 2005; Rojas-Jimenez ve ark., 2005). R. capsulatus RRC00139 ve RRC00138 genlerinin fonksiyonlarını aydınlatmaya yönelik yapılan detaylı genetik ve biyokimyasal analizler bu genlerinden herhangi birindeki mutasyonun OL sentezini engellediği ve özellikle zenginleştirilmiş besi 113 ortamında (MPYE) optimal üreme sıcaklığında (35°C) bazı c-tip sitokromların üretilmedikleri gözlenmiştir. OL ’in yokluğunun, 35°C ’de minimal besiyerinde (MedA) üreyen hücrelerde örneğin sitokrom cy proteininin üretimini etkilediği ve bu nedenle sitokrom cy ’ın az miktarda sentezlediği belirlendi. (Şekil 4.19). MPYE besi yerinde 35°C sıcaklıkta üreyen mutantlarda ise, c-tipi sitokrom proteinlerinden başka diğer bazı sitoplazma dışı proteinlerin de miktarlarında yaban soya kıyasla bir azalma görüldü (Şekil 4.20). Değişik fizyolojik koşullar altında, OL ’in yokluğunda bazı c-tipi sitokromların ve diğer bazı membran proteinlerin eksikliğine hangi bileşenlerin neden olduğu oldukça merak uyandırmaktadır. Olasılıklardan birisi; 35°C sıcaklıkta MedA besi ortamında üreyen hücrelerde OL, membran protein üretiminin henüz bilinmeyen basamak ya da bileşen(lerin)e doğrudan ya da dolaylı olarak gereksinim duyuyor olabilir. OL ’nin yokluğunda bu bileşenlerdeki aksaklıklar farklı c-tipi sitokromların ve diğer membran proteinlerin üretilmelerini azaltabilir. Bu durum c-tipi sitokrom proteinlerin olgunlaşmasındaki eksikliklerden dolayı mutantlarda gözlenen kompleks fotosentetik üreme ve Nadi fenotiplerine benzer bir durum olabilir (Lang ve ark., 1996; Sanders ve ark., 2005). Diğer bir olasılık ise, OL ’in yokluğunda c-tipi sitokromların ve diğer membran proteinlerin normal miktarlarda üretilmelerine karşın farklı üreme koşulları ve membran lipid kompozisyonundaki değişmelerin neden olabileceği membrana bağlı streslerden (Raivio, 2005) dolayı çabucak yıkıma uğrayabilirler. Zenginleştirilmiş MPYE besiyerinde 35°C sıcaklıkta üreyen OL içermeyen R. capsulatus hücrelerinde bazı c-tipi sitokromların düşük miktarlarda gözlenmesi bu olasılığı güçlendirmektedir. Sıcaklık, osmatik stress gibi farklı çevresel faktörlerin membran lipidlerin fiziksel özelliklerinde değişimlere neden oldukları ve özgün lipidlerin genellikle bakterilerin optimum üreme sıcaklığını etkiledikleri bilinmektedir (Cronan, 2003; Los ve Murata, 2004). R. capsulatus ’da dahil olmak üzere birçok bakteride yüksek üreme sıcaklığı, şaperon ve proteaz aktivitesi gösteren ısı-şok proteinlerini indüklemektedir. Örneğin, sitoplazma dışı protein yıkımına neden olan periplazmik serin proteaz (DegP) sıcaklığa bağlı olarak aktive göstermektedir. R. capsulatus ’da disülfit bağının oluşumundan sorumlu DsbA proteinin yokluğunda mutantlarda üreme kusurları gözlenmiş ve bu mutantlardaki DegP protein aktivitesinin yaban soya kıyasla daha fazla olduğu görülmüştür (Onder ve ark.,-yazım aşamasında). 114 Bakteri membranında fosfolipidlere kıyasla daha az miktarda gözlenen OL ’lerin rolü ne olabilir sorusuna cevap verebilmek için öncellikle fosfolipidlerin rollerinin anlaşılması gerekir. Genel olarak, biyolojik membranlardaki polar lipidler, permeabilite bariyeri ve membrana bağlı proteinler için destek görevi yapan akışkan yapıyı sağlama görevini yaparlar (Raetz ve Dowhan, 1990; Cronan, 2003). Fizikokimyasal özelliklerinden dolayı bazı lipidler hücre bölünmesi veya DNA replikasyonu gibi kritik fonksiyonlara sahip özgün proteinlerin membrana yerleşmelerine yardım ederler (Dowhan ve ark., 2004). Yine birçok bakteri ve mitokondride yapılan çalışmalar ile membran proteini-fosfolipid interaksiyonlarının proteinlerin fonksiyonlarına olan etkileri gösterilmiştir (Dowhan ve ark., 2004; van dalen ve Kruijff, 2004). Örneğin; membran proteinleri genellikle kardiyolipin (CL) ve sülfolipidler gibi özgün lipidler ile birlikte kristalize edilmektedirler (Roszak ve ark., 2003; Lange ve ark., 2001). Böylece protein-lipid interaksiyonları, proteinlerin membrandaki yerleşimleri, katlanmaları, enzimatik aktivite sabitliğinde önemlidir (Bogdanov ve Dowhan, 1999; Sedlak ve Robinson, 1999). Fosfolipidler ayrıca solunum ve fotosentetik elektron zincirlerinde fonksiyon yapan membran proteinlerinin çok moleküllü bir yapı oluşturmalarını da sağlar (Zhang ve ark., 2002). Tüm bu bilgiler ve OL ’in yokluğunda gözlenen üreme koşullarına bağlı kompleks fenotipler, OL ’nin yokluğunun hücre membranların özelliklerinde değişikliklere neden olabileceğini bize düşündürmektedir. Bu değişikliklerin temelinde yatan mekanizmalar henüz bilinemediğinden, OL ’den yoksun mutantlarda fenotiplerin dolaylı olarak görüldüğü ve bunun ilave bazı hücresel bileşenlere bağlı olduğu düşünülmektedir. OL ’den yoksun R. capsulatus mutantlarının besi ortamı ve üreme sıcaklığına bağlı gösterdikleri karmaşık ve değişken fenotiplerin anlaşılması oldukça önemlidir. Bu nedenle gelecekte, farklı fizyolojik koşullarda OL ’in yokluğunun özgün membran proteinlerin sadece üretim oranını mı yoksa sentez sonrası yıkım oranını mı ya da her iki faktörüde mi etkilediği ve gözlenen bu değişikliklerin temelinde yatan moleküler mekanizma(ların)nın neler olduğu açıklanması gereken önemli sorulardır. OL içermeyen R. capsulatus mutantlarında gözlenen bu önemli değişikliklerin araştırılması, OL ’in başta bu bakteri olmak üzere diğer birçok bakterideki önemininin anlaşılmasını sağlayacaktır. 115 R. capsulatus ’un, OL içeren S. meliloti ve R. sphaeroides gibi bazı bakterilerden farklı olarak CL içermediği 2D-TLC analizi ile belirlendiği gibi, E. coli bakterisinde CL ’i kodlayan cls geni ile homolojiye sahip bir gene R. capsulatus genomunda rastlanılmamıştır. Mikrobiyal genom bilgi bankasından yararlanılarak, bakterilerin %15 ’inin OL içerdiği buna karşılık CL içermediği, yine benzer yüzde de CL ’i içerdiği ancak OL ’i içermediği gözlenmiştir. S. meliloti bakterisinde OL ’den yoksun mutantların herhangi bir fenotip göstermemesi, makromoleküler kompleks oluşumu sırasında özgün membran protein-lipid interaksiyonlarında OL ve CL ’in birbirinin yerine geçerek görev yapabilecekleri olasılığını düşündürmektedir. Bu nedenle devam etmekte olan yeni deneyler ile CL ’in varlığında veya yokluğunda OL ’i üretemeyen mutantların detaylı analizlerine başlanılmış olup, bu iki farklı lipid türünün protein aktiviteleri üzerinde benzer veya farklı rolleri aydınlatılmaya çalışılmaktadır. 116 6. KAYNAKLAR AILHAUD, G. P. ve P. R VAGELOS. 1966. Palmityl-acyl Carrier Protein as Acyl Donor for Complex Lipid Biosynthesis in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 241: 3866- 3868. ALLEN, J. W., P. D. BARKER ve S. J. FERGUSON. 2003. A Cytochrome b562 Variant With a c-type Cytochrome CXXCH Heme-binding Motif as a Probe of the Escherichia coli Cytochrome c Maturation System. J. Biol. Chem., 278: 52075–52083. ALTSCHUL, S. F., W. GISH, W. MILLER, E. W. MEYERS ve D. J. LIPMAN. 1999. Basic Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol., 215: 403-410. ANRAKU, Y. ve R. B. GENNİS. 1987. The Aerobic Respiratory Chain of Escherichia coli. Trends Biochem. Sci., 12: 262-266. ASSELINEAU, J. 1991. Bacterial Lipids Containing Amino Acids or Peptides Linked by Amide Bonds. Fortschr. Chem. Org. Naturs., 56: 1-85. AYGÜN, S. 1999. Rhodobacter capsulatus Bakterisinde Sitokrom c Oksidaz Mutantlarının Eldesi ve Karakterizasyonu. Yüksek Lisans Tezi, BaÜ, Fen Bilimleri Enstitüsü, Balıkesir. 104 s. AYGUN-SUNAR, S., S. MANDACI, H.-G. KOCH, I. V. J. MURRAY, H. GOLDFINE ve F. DALDAL. 2006. Ornithine Lipid is Required for Optimal Steady-state Amounts of C-type Cytochromes in Rhodobacter capsulatus. Mol. Microbiol., 61(2): 418–435. BATRAKOV, S. G. ve L. D. BERGELSON. 1978. Lipids of the Streptomyces Structural Investigation and Biological Interrelation. Chem. Phys. Lipids, 21: 1-29. BATRAKOV, S. G. ve D. I. NIKITIN. 1996. Lipid Composition of the Phosphatidylcholine-producing Bacterium Hyphomicrobium vulgare NP-160. Biochim. Biophys. Acta., 1302(2): 129-137. BATUT, J. ve P. BOISTARD. 1994. Oxygen Control in Rhizobium. Antonie van Leeuwenhoek, 66: 129-150. BAUSS, F., W. DRÖGE ve D. N. MÄNNEL. 1987. Tumor Necrosis Factor Mediates Endotoxic Effects in Mice. Infect. Immun., 55(7): 1622–1625. BECKMAN, D. L., D. R. TRAWICK ve R. G. KRANZ. 1992. Bacterial c Cytochrome Biogenesis. Genes Dev., 6: 268-283. BECKMAN, D. L. ve R. G. KRANZ. 1993. Cytochromes c Biogenesis in a Photosynthetic Bacterium Requires a Periplasmic Thioredoxin-like Protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2179-2183. 117 BENNING, C. ve C. R. SOMERVILLE. 1992. Isolation and Genetic Complementation of a Sulfolipid-deficient Mutant of Rhodobacter sphaeroides. J. Bacteriol., 174: 2352- 2360. BENNING, C., J. T. BEATTY, R. C. PRINCE ve C. R. SOMERVILLE. 1993. The Sulfolipid Sulfoquinovosyldiacylglycerol is not Required for Photosynthetic Electron Transport in Rhodobacter sphaeroides but Enhances Growth Under Phosphate Limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1561-1565. BENNING, C., Z. H. HUANG ve D. A. GAGE. 1995. Accumulation of a Novel Glycolipid and a Betaine Lipid in Cells of Rhodobacter sphaeroides Grown Under Phosphate Limitation. Arch. Biochem. Biophys., 317: 103–111. BENNING, C. 1998. Biosynthesis and Function of the Sulfolipid Sulfoquinovosyl diacylglycerol. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 49: 53–75. BERNARD, D. G., S. T. GABILLY, G. DUJARDIN, S. MERCHANT, P. P. HAMEL. 2003. Overlapping Specificities of the Mitochondrial Cytochrome c and c1 Heme Lyases. J. Biol. Chem., 278: 49732-49742. BLIGH, E. G. ve J. W. DYER. 1959. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Can. J. Biochem. Physiol., 37: 911-917. BROWN, A. P., J. COLEMAN, A. M. TOMMEY, M. D. WATSON ve A. R. SLABAS. 1994. Isolation and Characterization of a Maize cDNA That Complements a 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate Acyltransferase Mutant of Escherichia coli and Encodes a Protein which has Similarities to Other Acyltransferases. Plant Mol. Biol., 26: 211– 223. BROWN, A. P., C. L. BROUGH, J. T. KROON ve A. R. SLABAS. 1995. Identification of a cDNA that Encodes a 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate Acyltransferase from Limnanthes douglasii. Plant Mol. Biol., 29: 267–278. BROWN, A. P., S. CARNABY, C. L. BROUGH, M. BRAZIER ve A. R. SLABAS. 2002. Limnanthes douglasii Lysophospahtidic Acid Acyltransferases: Immunological Quantification, Acyl Selectivity and Functional Replacement of Escherichia coli plsC Gene. Biochem J., 364:795-805. BOGDANOV, M. ve W. DOWHAN. 1998. Phospholipid-assistant Protein Folding: Phosphatidylethanolamine is Required at a Late Step of the Conformational Maturation of the Polytopic Membrane Protein Lactose Permease. EMBO J., 17: 5255-5264. BOGDANOV, M., M. UMEDA ve W. DOWHAN. 1999. Phospholipid-assisted Refolding of an Integral Membrane Protein. Minimum Structural Features for Phosphatidylethanolamine to Act as a Molecular Chaperone. J. Biol. Chem., 274: 12339-12345. 118 CALHOUN, M. W., J. W. THOMAS ve R. B. GENNIS. 1994. The Cytochrome Oxidase. Superfamily of Redox-driven Proton Pumps. Trends Biochem. Sci., 19: 325- 330. COHEN-BAZIRE, G., W., R. SISTROM ve R. Y. STANIER. 1957. Kinetic Studies on Pigment Synthesis by Nonsulfur Purple Bacteria. J. Cell. Comp. Physiol., 49:25-68. COLEMAN, J. 1990. Characterization of Escherichia coli Cells Deficient in 1-acyl-sn- glycerol-3-phosphate Acyltransferase Activity. J. Biol. Chem., 265: 17215-17221. COLEMAN, J. 1992. Characterization of the Escherichia coli Gene for 1-acyl-sn- glycerol-3-phosphate Acyltransferase (plsC). Mol. Gen. Genet., 232:295-303. COSSEAU, C. ve J. BATUT. 2004. Genomics of the CcoNOQP-encoded cbb3 Oxidase Complex in Bacteria. Arc. Microbiol., 181(2): 89-96. COX, A. D. ve S. G. WILKINSON. 1989. Polar Lipids and Fatty Acids of Pseudomonas cepacia. Biochim. Biophys. Acta, 1001: 60-67. CROOKE, H. ve J. COLE. 1995. The Biogenesis of c-type Cytochromes in Escherichia coli Requires a Membrane-bound Protein, DipZ, with a Protein Disulphide Isomerase- like Domain. Mol. Microbiol., 15: 1139–1150. CRONAN, J. E. JR. ve C. O. ROCK. 1996. Biosynthesis of Membrane Lipids. In Escherichia coli and nd Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, 2 edition, p.612-636. Edited by F. C. Neidhardt ve ark. Washington, DC:American Society for Microbiology. CRONAN, J. E., Jr. 2003. Bacterial Membrane Lipids: Where Do We Stand? Annu. Rev. Microbiol., 57: 203–224. CULLINANE, M., C. BAYSSE, J. P. MORRISSEY ve E F. O’GARA. 2005. Identification of Two Lysophosphatidic Acid Acyltransferase Genes With Overlapping Function in Pseudomonas fluorescens. Microbiology, 151: 3071-3080. DALDAL, F., S. CHENG, J. APPLEBAUM, E. DAVIDSON ve R. PRINCE. 1986. Cytochrome c2 is not Essential for Photosynthetic Growth of Rhodopseudomonas capsulata. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2012-2016. DAWSON, R. M. C. 1967. Analysis of Phosphatides and Glycolipids by Chromatography of Their Partial hydrolysis of Alcoholysis Products, p. 163-189. In G. Marinetti (ed.), Chromotographic Analysis of Lipids, vol. 1. Marcel Dekker, Inc., New York. DE GIER, J.-W. L., M. SCHEPPER, W. N. M. REJINDERS ve ark. 1996. Structural and Functional Analysis of aa3-type and cbb3-type Cytochrome c Oxidases of Paracoccus denitrificans Reveals Significant Differences in Proton-pump Design. Mol. Microbiol., 20: 1247-1260. 119 DESHMUKH, M., G. BRASSEUR ve F. DALDAL. 2000. Novel Rhodobacter capsulatus Genes Required for the Biogenesis of Various c-type Cytochromes. Mol. Microbiol., 35: 123-138. DILLON, D. A., W. I. WU, B. RIEDEL, J. B. WISSING, W. DOWHAN ve G. M. CARMAN. 1996. The Escherichia coli pgpB Gene Encodes for a Diacylglycerol Pyrophosphate Phosphatase activity. J. Biol. Chem., 271: 30548-30553. DiRusso, C. C., P. N. Black ve J. D. Weimar. 1999. Molecular Inroads into the Regulation and Metabolism of Fatty Acids, Lessons From Bacteria. Prog. Lipid Res., 38: 129-197. DITTA, G., T. SCHMIDHAUSER, E. YACOBSON ve diğerleri. 1985. Plasmids Related to the Broad Host Range Vector, pRK290, Useful for Gene Cloning and for Monitoring Gene Expression. Plasmid, 13: 149-153. DITTMER, J. C. ve R. L. LESTER. 1964. A Simple Specific Spray for the Detection of Phospholipids on Thin-layer Chromotograms. J. Lipid Res., 5: 126-127. DOWHAN, W. E. MILEYKOVSKAYA ve M. BOGDANOV. 2004. Diversity and Versatility of Lipid–Protein Interactions Revealed by Molecular Genetic Approaches. Biochim. Biophys. Acta., 1666: 19–39. EAVES, D. J., J. GROVE, W. STAUDENMANN ve diğerleri. 1998. Involvement of Products of the nrfEFG Genes in the Covalent Attachment of Haem c to a Novel Cysteine–lysine Motif in the Cytochrome c552 Nitrite Reductase From Escherichia coli. Mol. Microbiol., 43: 205–216. EBLE, K. S., W. B. COLEMAN, R. R. HANTGAN ve C. C. CUNNINGHAM. 1990. Tightly Associated Cardiolipin in the Bovine Heart Mitochondrial ATP Synthase as Analyzed by 31P Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Biol. Chem., 265: 19434-19440. FUKAYA, M., K. TAYAMA, T. TAMAKI ve diğerleri. 1993. Characterization of a Cytochrome a1 that Functions as a Ubiquinol Oxidase in Acetobacter aceti. J. Bacteriol., 175(14): 4307-4314. GALANOS, C., O. LÜDERITZ, E. T. RIETSCHE ve diğerleri. 1985. Synthetic and Natural Escherichia coli Free Lipid A Express Identical Endotoxic Activities. Eur. J. Biochem.,148(1): 1–5. GAO, J., B. WEISSENMAYER, A. M. TAYLOR, J. THOMAS-OATES, I-M. LOPEZ- LARA ve O. GEIGER. 2004. Identification of a Gene Required for the Formation of Lyso-ornithine Lipid, an Intermediate in the Biosynthesis of Ornithine-containing Lipids. Mol. Microbiol., 53: 1757–1770. 120 GARCIA-HORSMAN, J. A., B. BARQUERA, J. RUMBLEY, J. MA ve R. B. GENNIS. 1994a. The Superfamily of Heme-copper Respiratory Oxidases. J. Bacteriol., 176: 5587-5600. GARCIA-HORSMAN, J. A., E. BERRY, J. P. SHAPLEIGH, J. O. ALBEN ve R. B. GENNIS. 1994b. A Novel Cytochrome c Oxidase from Rhodobacter sphaeroides that Lacks CuA. Biochemistry, 33: 3113–311. GEIGER, O. 1998. Phospholipids and Alternative Membrane Lipids. In The Rhizobiaceae: Molecular Biology of Model Plant-Associated bacteria. Spaink, H.P. Kondorosi, A., ve Hooykaas, P.J.J. (eds). Dordreht, the Netherlands:Kluwer Academic Publishers. Pp. 55-80. GEIGER, O., V. ROHRS, B. WEISSENMAYER, T. M. FINAN ve J. THOMAS- OATES. 1999. The Regulator Gene phoB Mediates Phosphate Stress-controlled Synthesis of the Membrane Lipid Diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol., 32: 63–73. GOLDFINE, H., G. P. AILHAUD ve P. R. VAGELOS. 1967. Involvemant of Acyl Carrier Protein in Acylation of Glycerol 3-Phosphate in Clostridium butyricum. Evidence for Participation of Acyl Thioesters of Acyl Carrier Protein. J. Biol. Chem., 242: 4466-4475. GOLDFINE, H. 1969. Filter Paper Disk Assay for Lipid Synthesis. Methods in Enzymology, 14: 649-651. GOLDFINE, H. ve G. P. AILHAUD. 1971. Fatty Acyl-acyl Carrier Protein and Fatty Acyl-CoA in the Biosynthesis of Phosphatidic Acid in Clostridium butyricum. Biochem. Biophys. Res. Commun., 45: 1127-1133. GOLDFINE, H. 1982. Lipids of Prokaryotes-structure and Distribution. Curr. Topics Membr. Trans., 17: 1-43. GOLDFINE, H. 1984. Bacterial Membranes and Lipid Packing Theory. J. Lipid Res., 25: 1501-1507. GOLDMAN, B. S., D. L. BECKMAN, A. BALI, E. M. MONIKA, K. K. GABBERT ve R. G. KRANZ. 1997. Molecular and Immunological Analysis of an ABC Transporter Complex Required for Cytochrome c Biogenesis. J. Mol. Biol., 268: 724–738. GORCHEIN, A., A. NEUBERGER ve G. H. TAIT. 1968. The Isolation and Characterization of Subcellular Fractions From Pigmented and Unpigmented Celia of Rhodopseudomonas sphaeroides. Proc. R. Soc. London Ser. B, 170: 229-246. GORCHEIN, A. 1968. Studies on the Structure of an Ornithine-Containing Lipid from Non-Sulphur Purple Bacteria. Biochim. Biophys. Acta., 152: 358-367. 121 GRAY, K. A., M. GROOMS, H. MYLLYKALLIO, C. MOOMAW, C. SLAUGHTER ve F. DALDAL. 1994. Rhodobacter capsulatus Contains a Novel cb-type Cytochrome c Oxidase without a CuA Center. Biochemistry, 33: 3120-3127. GROGAN, D. W. ve J. E. JR. CRONAN. 1997. Cyclopropane Ring Formation in Membrane Lipids of Bacteria. Microbiol. Molec. Biol. Rev., 61: 429-441. GÜLER, S., A. SEELIGER, H. HARTEL, G. RENGER ve C. BENNING. 1996. A Null Mutant of Synechococcus sp. PCC7942 Deficient in the Sulfolipid Sulfoquinovosyl Diacylglycerol. J. Biol. Chem., 271 (13): 7501–7507. HANKE C., F. P. WOLTER, J. COLEMAN, G. PETEREK ve M. FRENTZEN. 1995. A Plant Acyltransferase Involved in Triacylglycerol Biosynthesis Complements an E. coli sn-1-acylglycerol-3-phosphate Acyltransferase Mutant. Eur. J. Biochem., 232: 806- 810. HEATH R. J., H. GOLDFINE ve C.O. ROCK. 1997. A gene (plsD) from Clostridium butyricum that Functionally Substitutes for the sn-glycerol-3-phosphate Acyltransferase Gene (plsB) of Escherichia coli. J. Bacteriol., 179: 7257-7263. HEATH, R. J. ve C. O. ROCK. 1998. A Conserved Histidine is Essential for Glycerolipid Acyltransferase Catalysis. J. Bacteriol., 180: 1425–1430. HELDE, R., B. WIESLER, E. WACHTER ve diğerleri. 1997. Comparative Characterization of SecA From the α-subclass Purple bacterium Rhodobacter capsulatus and Escherichia coli Reveals Differences in Membrane and Precursor Specificity. J. Bacteriol., 179: 4003–4012. HOSLER, J. P., S. FERGUSON-MILLER, M. W. CALHOUN ve diğerleri. 1993. Insight into the Active-site Structure and Function of Cytochrome Oxidase by Analysis of Site-directed Mutants of Bacterial Cytochrome aa3 Oxidase and Cytochrome bo. J. Bioenerg. Biomembr., 25: 121-136. HSU, S. M. ve E. SOBAN. 1982. Color Modification of Diaminobenzidine (DAB) Precipitation by Metallic Ions and Its Application for Double Immunohistochemistry. J. Histochem. Cytochem, 30:1079-1082. HUIJBREGTS, R. P., A. I. DE KROON ve B. DE KRUIJFF. 1996. Rapid Transmembrane Movement of C6-NBD-labeled Phospholipids Across the Inner Membrane of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta., 1469: 43-61. IMHOFF, J. F. ve U. BIAS-IMHOFF. 1995. in Blankenship RE, Madigan MT, Bauer CE editors. Anoxygenic photosynthetic bacteria. Dordrecht:Kluwer Academic Publishers. 10, Lipids, quinones and fatty acids of anoxygenic phototrophic bacteria. P. 179-205. 122 JENNEY, F. E. JR. ve F. DALDAL. 1993. A Novel Membrane-associated C-type Cytochrome, Cytochrome cy, can Mediate the Photosynthetic Growth of Rhodobacter capsulatus and Rhodobacter sphaeroides. EMBO J., 12: 1283-92. JENNEY, F. E. JR, R. C. PRINCE ve F. DALDAL. 1994. Roles of the Soluble Cytochrome c2 and Membrane-associated Cytochrome cy of Rhodobacter capsulatus in Photosynthetic Electron Transfer. Biochemistry, 33(9): 2496–2502. JIANG, X. ve X. WANG. 2004. Cytochrome-c-mediated Apoptosis. Annu. Rev. Biochem., 73: 87–106. KAHN, D., M. DAVID, O. DOMERGUE, M.-L. DAVERAN, J. GHAI, P. R. HIRSCH ve J. BATUT. 1989. Rhizobium meliloti fixGHI Sequence Predicts Involvement of a Specific Cation Pump in Symbiotic Nitrogen Fixation. J. Bacteriol., 171: 929-939. KANFER, J. ve E. P. KENNEDY. 1964. Metabolism and Function of Bacterial Lipids. II. Biosynthesis of Phospholipids in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 239: 1720-1726. KATO, H. ve N. GATO. 1997. Adjuvanticity of an Ornithine-containing Lipid of Flavobacterium meningosepticum as a Candidate Vaccine Adjuvant. Microbiol. Immunol., 41(2): 101-106. KAWAI, Y. ve I. YANO. 1983. Ornithine-containing Lipid of Bordetella pertussis, a New Type of Hemagglutinin. Eur. J. Biochem.,136(3): 531–538. KAWAI, Y., I. YANO ve K. KANEDA. 1988a. Various Kinds of Lipoamino Acids Including a Novel Serine-containing Lipid in an Opportunistic Pathogen Flavobacterium. Their Structures and Biological Activities on Erythrocytes. Eur. J. Biochem., 171: 73–80. KAWAI, Y., I. YANO, K. KANEDA ve E. YABUUCHI. 1988b. Ornithine-containing Lipids of Some Pseudomonas Species. Eur. J. Biochem., 175: 633–641. KAWAI, Y. ve K. AKAGAWA. 1989. Macrophage Activation by an Ornithine- containing Lipid or a Serine-containing Lipid. Infect. Immun., 57(7): 2086–2091. KAWAI, Y., K. KANEDA, Y. MORISAWA ve K. AKAGAWA. 1991. Protection of Mice From Lethal Endotoxemia by Use of an Ornithine-containing Lipid or a Serine- containing Lipid. Infect. Immun., 59: 2560–2566. KAWAI, Y., N. TAKASUKA, K. AKAGAWA ve S. NAITO. 1996. Hypothermic Response of Mice to Ornithine-containing Lipids and to Endotoxin. Infect. Immun., 64: 2101–2105. KAWAI, Y. Y. NAKAGAWA, T. MATUYAMA ve diğerleri. 1999. A Typical Bacterial Ornithine-containing Lipid Nα-(D)-[3 (hexadecanoyloxy)hexadecanoyl]- ornithine is a Strong Stimulant for Macrophages and a Useful Adjuvant. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 23: 67-73. 123 KAWAI, Y., N. TAKASUKA, K. INOUE, K. AKAGAWA ve M. NISHIJIMA. 2000a. Ornithine-containing Lipids Stimulate CD14-dependent TNF-alpha Production From Murine Macrophage-like J774.1 and RAW 264.7 Cells. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 28: 197–203. KAWAI, Y., A. I. OKAWARAB, H. OKUYAMA, F. KURA ve K. SUZUKI. 2000b. Modulation of Chemotaxis, O(2)(-) Production and Myeloperoxidase Release From Human Polymorphonuclear Leukocytes by the Ornithine-containing Lipid and the Serine Glycine-Containing Lipid of Flavobacterium. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 28: 205–209. KAWASAKI, H., M. MORIYAMA, Y. OHTANI, M. NAITOH, A. TANAKA ve H. NARIUCHI. 1989. Analysis of Endotoxin Fever in Rabbits by Using a Monoclonal Antibody to Tumor Necrosis Factor (cachectin). Infect. Immun., 57: 3131–3135. KEILIN, D. 1966. The History of Cell Respiration and Cytochromes. Cambridge University Press, Cambridge, United Kingdom. KESSELS, J. M. M., H. OUSEN ve H. VAN DEN BOSCH. 1983. Facilitated Utilization of Endogenously Synthesized Lysophosphatidic Acid by 1- acylglycerophosphate Acyltransferase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta., 753: 227–235. KNUTZON, D. S., K. D. LARDIZABAL, J. S. NELSEN, J. L. BLEIBAUM, H. M. DAVIES ve J. G. METZ. 1995. Cloning of a Coconut Endosperm cDNA Encoding a 1- acyl-sn-glycerol-3-phosphate Acyltransferase that Accepts Medium-chain-length Substrates. Plant Physiol., 109: 999–1006. KNOCHE, H. W. ve J. M. SHIVELY. 1972. The Structure of an Ornithine-containing Lipid From Thiobacillus thiooxidans. J. Biol. Chem., 247: 170. KOCH, H.-G., O. HWANG ve F. DALDAL. 1998. Isolation and Characterization of Rhodobacter capsulatus Mutants Affected in Cytochrome cbb3 Oxidase Activity. J. Bacteriol., 180:969-978. KOCH, H.-G., C. WINTERSTEIN, A. S. SARIBAS, J. O. ALBEN ve F. DALDAL. 2000. Roles of the ccoGHIS Gene Products in the Biogenesis of the cbb3-type Cytochrome c Oxidase. J. Mol. Biol., 297: 49-65. KOTANI, S., H. TAKADA, M. TSUJIMOTO ve diğerleri. 1985. Synthetic Lipid A With Endotoxic and Related Biological Activities Comparable to Those of a Natural Lipid A From an Escherichia coli re-mutant. Infect. Immun., 149(1): 225–237. KRANZ, R, R. LILL, B. GOLDMAN, G. BONNARD ve S. MERCHANT. 1998. Molecular Mechanisms of Cytochrome c Biogenesis: Three Distinct Systems. Mol. Microbiol., 29: 383-396. 124 KULAJTA, C., J. O. THUMFART, S. HAID, F. DALDAL ve H-G. KOCH. 2006. Multi-step Assembly Pathway of the cbb3-type Cytochrome c Oxidase Complex. J. Mol. Biol., 355: 989-1004. LA MONICA, R. F. ve B. L. MARRS. 1976. The Branched Respiratory System of Photosynthetically Grown Rhodopseudomonas capsulata. Biochim. Biophys. Acta., 423: 431-439. LAEMMELI, U. K. 1970. Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriology T4. Nature, 227: 680-685. LANÈELLE, M.-A., D. PROMÈ, G. LANÈELLE ve J.-C. PROMÈ. 1990. Ornithine Lipid of Mycobacterium tuberculosis: Its Distribution in Some Slow- and Fast-growing Mycobacteria. J. Gen. Microbiol., 136: 773-778. LANG, S. E., F. E. JENNEY ve F. DALDAL. 1996. Rhodobacter capsulatus CycH: a Bipartite Gene Product with Pleiotropic Effetcs on the Biogenesis of Structurally Different c-type Cytochromes. J. Bacteriol., 178: 5279-5290. LANGE, C., J. H. NETT, B. L. TRUMPOWER ve C. HUNTE. 2001. Specific Roles of Tightly Bound Phospholipids in the Yeast Cytochrome bc1 Complex Structure. EMBO J., 20: 6591–6600. LANGLEY, K. E., E. HAWROT ve E E. P. KENNEDY. 1982. Membrane Assembly: Movement of Phosphatidylserine Between the Cytoplasmic and Outer Membranes of Escherichia coli. J. Bacteriol. 152: 1033-1041. LAURAEUS, M., T. HALTIA, M. SARASTE ve M. WIKSTROM. 1991. Bacillus subtilis Expresses Two Kinds of Haem-A-containing Terminal Oxidases. Eur. J. Biochem., 197(3): 699-705. LEMBERG, R. ve J. BARRETT. 1973. Cytochromes. Academic Press, New York. LÓPEZ-LARA, I. M., C. SOHLENKAMP ve O. GEIGER. 2003. Membrane Lipids in Plant-associated Bacteria: Their Biosynthesis and Possible functions. Mol. Plant Microbe Interact., 16: 567–579. LÓPEZ-LARA, I. M., J.-L. GAO, M. J. SOTO ve diğerleri. 2005. Phosphorus-free Membrane Lipids of Sinorhizobium meliloti are not Required for the Symbiosis With Alfalfa But Contribute to Increased Cell Yields Under Phosphorus Limiting Conditions of growth. Mol. Plant Microbe Interact., 18: 973–982. LOS, D.A. ve N. MURATA. 2004. Membrane Fluidity and its Roles in the Perception of Environmental Signals. Biochim. Biophys. Acta., 1666: 142-157. LOWRY, O. ve N. ROSEBROUGH. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem., 193:265-275. 125 LUEKING, D. R. ve H. GOLDFINE. 1975. Sn-glycerol-3-phosphate Acyltransferase Activity in Particulate Preparations from Anaerobic, Light-grown Cell of Rhodopseudomonas sphaeroides. The Involvement of Acyl Thiolester Derivatives of Acyl Carrier Protein in Complex Lipid Synthesis. J. Biol. Chem., 250: 8530-8535. MARRS, B. L. ve H. GEST. 1973. Genetic Mutations Affecting the Respiratory Electron-Transport System of the Photosynthetic Bacterium Rhodopseudomonas capsulata. J. Bacteriol., 114:1045-1051. MARTINOU, J. C., S. DESAGHER ve B. ANTONSSON. 2000. Cytochrome c Release From Mitochondria: All or Nothing. Nat. Cell Biol., 2(3): E41-E43. MATSUSHITA, K., E. SHINAGAWA, O. ADACHI ve M. AMEYAMA. 1990. Cytochrome a1 of Acetobacter aceti is a Cytochrome ba Functioning as Ubiquinol Oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9863–9867. MERCHANT, S. ve B. W. DREYFUSS. 1998. Posttranslational Assembly of Photosynthetic Metalloproteins. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 49: 25-51. METHERINGHAM, R., L. GRIFFITHS, H. CROOKE, S. FORSYTHE ve J. COLE. 1995. An Essential Role for DsbA in Cytochrome c Synthesis and Formate-dependent Nitrite Reduction by Escherichia coli K-12. Arch. Microbiol., 164(4): 301–307. MICHIE, H. R., K. R. MANOGUE, D. R. SPRIGGS ve diğerleri. 1988. Detection of Circulating Tumor Necrosis Factor After Endotoxin Administration. N. Engl. J. Med., 318(23): 1481–1486. MILLER, J. H. 1972. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. MINGHETTI, K. C., V. C. GOSWITZ, N. E. GABRIEL ve diğerleri. 1992. Modified, Large-scale Purification of the Cytochrome o Complex (bo-type oxidase) of Escherichia coli Yields a two Heme/one Copper Terminal Oxidase With High Specific Activity. Biochemistry, 31: 6917–6924. MINNIKIN, D. E., H. ABDOLRAHIMZADEH ve J. BADDILEY. 1972. Variation of Polar Lipid Composition of Bacillus subtilis (Marburg) With Different Growth Conditions. FEBS Lett., 27: 16–18. MINNIKIN, D. E. ve H. ABDOLRAHIMZADEH. 1974. The Replacement of Phosphatidyl-ethanolamine and Acidic Phospholipids by an Ornithine-amide Lipid and a minor Phosphorous free Lipid in Pseudomonas fluorescens NCMB 129. FEBS Lett., 43: 257–260. MISSIAKAS, D. ve S. RAINA. 1997. Protein Folding in the Bacterial Periplasm. J. Bacteriol., 179: 2465–2471. 126 MIYAZAKI, Y., S. OKA, H. HOTTA ve I. YANO. 1993. Stimulation and Inhibition of Polymorphonuclear Leukocytes Phagocytosis by Lipoamino Acids Isolated From Serratia marcescens. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 6: 265–272. MONIKA, E. M., B. S. GOLDMAN, D. L. BECKMAN ve R. G. KRANZ. 1997. A Thioreduction Pathway Tethered to the Membrane for Periplasmic Cytochromes c Biogenesis; in vitro and in vivo Studies. J. Mol. Biol., 271: 679-692. MOORE, G. R. ve G. W. PETTIGREW. 1990. Cytochrome c. Evolutionary, Structural and Physiological Aspects. Springer-Verlag KG, Berlin, Germany. MOUNCEY, N. J. ve S. KAPLAN. 1998. Oxygen Regulation of the ccoN Gene Encoding a Component of the cbb3 oxidase in Rhodobacter sphaeroides 2.4.1T: Involvement of the FnrL Protein. J. Bacteriol., 180: 2228-2231. MYERS, C. R. ve J. M. MYERS. 1992. Localization of Cytochromes to the Outer Membrane of Anaerobically Grown Shewanella putrefaciens MR-1. J. Bacteriol., 174: 3429-3438. MYLLYKALLIO, H., F. E. JR JENNEY, C. R. MOOMAW, C. A. SLAUGHTER ve F. DALDAL. 1997. Cytochrome cy of Rhodobacter capsulatus is Attached to the Cytoplasmic Membrane by an Uncleaved Signal Sequence-like Anchor. J. Bacteriol., 179: 2623–2631. MYLLYKALLIO, H., D. ZANNONI ve F. DALDAL. 1999. Rhodobacter sphaeroides Cytochrome cy is a Membrane-attached Electron Carrier That is Deficient in Photosynthesis but Proficient in Respiration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 4348– 4353. NAGIEC, M. M., G. B. WELLS, R. L. LESTER ve R. C. DICKSON. 1993. A Suppressor Gene That Enables Saccharomyces cerevisiae to Grow Without Making Sphingolipids Encodes a Protein that Resembles an Escherichia coli Fatty Acyltransferase. J. Biol. Chem., 268(29): 22156-22163. OH, J.-I. ve S. KAPLAN. 2002. Oxygen Adaptation. The Role of the CcoQ Subunit of the cbb3 Cytochrome c Oxidase of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1. J. Biol. Chem., 277(18): 16220-16228. OJAIMI, C., B. E. DAVIDSON, I. SAINT GIRONS ve I. G. OLD. 1994. Conservation of Gene Arrangement and an Unusual Organization of rRNA Genes in the Linear Chromosomes of the Lyme Disease Spirochetes Borrelia burgdorferi, B. garinii, and B. afzelii. Microbiology, 140: 2931-2940. PAGE, M. D., Y. SAMBONGI ve S. J. FERGUSON. 1998. Contrasting Routes of c- type Cytochrome Assembly in Mitochondria, Chloroplasts and Bacteria. Trends Biochem. Sci., 23: 103-108. 127 PEREIRA, M., M. SANTANA ve M. TEIXEIRA. 2001. A Novel Scenario for the Evolution of Haem-copper Oxygen Reductases. Biochim. Biophys. Acta., 1505: 185- 208. PETTIGREW, G. W. ve G. R. MOORE. 1987. Cytochromes c: Biological Aspects. Springer-Verlag, New York. PHUNG, L. V., T. T. B. CHI, H. HOTTA, E. YABUUCHI ve I. YANO. 1995. Cellular Lipid and Fatty Acid Compositions of Burkholderia pseudomallei Strains Isolated From Human and Environment in Viet Nam. Microbiol. Immunol., 39: 105-116. PITCHER, R. S., T. BRITTAIN ve N. J. WATMOUGH. 2002. Cytochrome cbb3 Oxidase and Bacterial Microaerobic Metabolism. Biochemical Society Transactions, 30: 653-658. PITCHER, R. S. ve N. J. WATMOUGH. 2004. The Bacterial Cytochrome cbb3 Oxidases. Biochim. Biophys. Acta. (Bioenergetics), 1655: 388–399. PORAT, A., S. H. CHO ve J. BECKWITH. 2004. The Unusual Transmembrane Electron Transporter DsbD and its Homologues: a Bacterial Family of Disulfide Reductases. Res. Microbiol., 155: 617–622. PREISIG, O., R. ZUFFEREY ve H. HENNECKE. 1996. The Bradyrhizobium japonicum fixGHIS Genes are Required for the Formation of the High-affnity cbb3-type Cytochrome Oxidase. Arch. Microbiol., 165: 297-305. PRENTKI, P. ve H. M. KRISCH. 1984. In vitro Insertional Mutagenesis with a Selectable DNA Fragment. Gene, 29: 293-303. PROME, J.-C., C. LACAVE ve M.-A. LANEELLE. 1969. Sur les structures de lipide a ornithine de Brucella melitensis et de Mycobacterium bovis (B. C. G.) C. R. Acad. Sci. Ser. C. 269:1664-1667. RAETZ, C. R .H. 1986. Molecular Genetics of Membrane Phospholipid Synthesis. Annu. Rev. Genet., 20: 253-295. RAETZ, C. R. H. ve W. DOWHAN. 1990. Biosynthesis and Function of Phospholipids in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 265: 1235–1238. RAIVIO, T. L. 2005. Envelope Stress Responses and Gram-negative Bacterial Pathogenesis. Mol. Microbiol., 56: 1119–1128. RATLEDGE, C. ve S. G. WILKINSON. 1988. Fatty Acids, Related and Derived Lipids. In Microbial Lipids, Vol. 1. Ratledge, C. ve S. G. Wilkinson (eds). London: Academic Press, pp. 23–53. RICHTER, O. ve B. LUDWIG. 2003. Cytochrome c Oxidase-Structure, Function, and Physiology of a Redox-driven Molecular Machine. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol., 128 147: 47-74. RIETSCHEL, E. T., U. SCHADE, O. LÜDERDITZ, H. FISCHER ve B. A. PESKAR. 1980. Prostaglandins in Endotoxicosis. In: Schlessinger D (ed) Microbiology. Am Soc Microbiology, Washington DC. RIETSCHEL, E. T., U. SCHADE, M. JENSEN, H. W. WOLLENWEBER, O. LUDERITZ ve S. G. GREISMAN. 1982. Bacterial Endotoxins: Chemical Structure, Biological Activity and Role in Septicaemia. Scand. J. Infect. Dis. Suppl., 31: 8-21. ROBINSON, N. C. 1993. Functional Binding of Cardiolipin to Cytochrome c Oxidase. J. Bioenerg. Biomembr., 25(2): 153-63. ROCK, C. O., J. E. CRONAN, JR. ve I. M. ARMITAGE. 1981. Molecular Properties of Acyl Carrier Protein Derivatives. J. Biol. Chem., 256: 2604-2674. ROCK, C. O. ve S. JACKOWSKI. 1982. Regulation of Phospholipid Synthesis in Escherichia coli. Composition of the Acyl-acyl Carrier Protein Pool in vivo. J. Biol. Chem., 257: 10759-10765. ROJAS-JIMENEZ, K., C. SOHLENKAMP, O. GEIGER, E. MARTINEZ-ROMERO, D. WERNER ve P. VINUESA. 2005. A CIC Chloride Channel Homolog and Ornithine-containing Membrane Lipids of Rhizobium tropici CIAT899 are Involved in Symbiotic Efficiency and Acid Tolerance. Mol. Plant Microbe Interact., 18: 1175–1185. ROSZAK, A. W., T. D. HOWARD, J. SOUTHALL, A. T. GARDINER, C. J. LAW, N. W. ISAACS ve R. J. COGDELL. 2003. Crystal Structure of the RC-LH1 Core Complex From Rhodopseudomonas palustris. Science, 302: 1969–1972. DE RUDDER, K. E. E, J. E. THOMAS-OATES ve O. GEIGER. 1997. Rhizobium meliloti Mutants Deficient in Phospholipids N-methyltransferase Still Contain Phosphatidylcholine. J. Bacteriol., 179: 6921-6928. SAMBROOK, J., E. F. FRITSCH ve T. MANIATIS. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. SANDERS, C., M. DESHMUKH, D. ASTOR, R. G. KRANZ ve F. DALDAL. 2005. Overproduction of CcmG and CcmFHRc Fully Suppresses the c-type Cytochrome Biogenesis Defect of Rhodobacter capsulatus CcmI-null Mutants. J. Bacteriol., 187: 4245–4256. SARASTE, M. 1990. Structural Features of Cytochrome Oxidase. Q. Rev. Biophys., 23: 331-366. SCHÄGGER, H. ve G. VON JAGOW. 1987. Tricine-Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Proteins in the Range Form 1 to 100 Kda. Anal. Biochem., 166: 368-379. 129 SCOLNIK, P. A., M. A. WALKER ve B. L. MARRS. 1980. Biosynthesis of Carotenoids Derived From Neurosporene in Rhodopseudomonas capsulata. J. Biol. Chem., 255: 2427-2432. SEDLAK, E. ve N. C. ROBINSON. 1999. Phospholipase A2 Digestion of Cardiolipin Bound to Bovine Cytochrome c Oxidase Alters Both Activity and Quaternary Structure. Biochemistry, 38: 14966–14972. SETTERDAHL, A. T., B. S. GOLDMAN, M. HIRASAWA, P. JACQUOT, A. J. SMITH, R. G. KRANZ ve D. B. KNAFF. 2000. Oxidation-reduction Properties of Disulfide-containing Proteins of the Rhodobacter capsulatus Cytochrome c Biogenesis System. Biochemistry, 39(33): 10172-10176. SHAPLEİGH, J. P., J. P. HOSLER, M. M. TECKLENBURG, Y. KIM, G. T. BABCOCK, R. B. GENNIS ve S. FERGUSON-MILLER. 1992. Definition of the Catalytic Site of Cytochrome c Oxidase: Specific Ligands of Heme a and the Heme a3- CuB Center. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(11): 4786–4790. SHIH, G. C., C. M. KAHLER, J. S. SWARTLEY, M. M. RAHMAN, J. COLEMAN, R. W CARLSON ve D. S. STEPHENS. 1999. Multiple Lysophosphatidic Acid Acyltransferases in Neisseria meningitidis. Mol. Microbiol., 32: 942–952. SIBLEY, C. H., A. TERRY ve C. R. H. RAETZ. 1988. Induction of K Light Chain Synthesis in 70Z/3 B Lymphoma Cells by Chemically Defined Lipid A Precursors. J. Biol. Chem., 263: 5098-5103. SIMON, R., U. PRIEFER ve A. PUHLER. 1983. A Broad Host Range Mobilization System For In Vivo Genetic Engineering:Transposon Mutagenesis In Gram-Negative Bacteria. Bio. Technology, 1:37-45. SISTROM, W. R. 1960. A requirement for Sodium in the Growth Medium of Rhodopseudomonas sphaeroides. J. Gen Microbiol., 22: 77–85. SMITH, P. F. 1988. in Ratledge C., Wilkinson S. G., editors. Microbial Lipids Vol 1. London:Acedemic Press: 8, Archaebacteria and Other Specialized Bacteria. P. 489-553. SOHLENKAMP, C., I. M. LÓPEZ-LARA ve O. GEIGER. 2003. Biosynthesis of Phosphatidylcholine in Bacteria. Prog. Lipid Res., 42: 115-162. STEVENS, J. M., O. DALTROP, J. W. A. ALLEN ve S. J. FERGUSON. 2004. C-type Cytochrome Formation: Chemical and Biological Enigmas. Acc. Chem. Res., 37: 999– 1007. SWARTLEY, J. S., J. T. BALTHAZAR, J. COLEMAN, W. M. SHAFER ve D. S. STEPHENS. 1995. Membrane Glycerophospholipid Biosynthesis in Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae: Identification, Characterization, and Mutagenesis of a Lysophosphatidic Acid Acyltransferase. Mol. Microbiol., 18: 401-412. 130 TATUSOV, R.L., D. A. NATALE, I. V. GARKAVTSEV ve diğerleri. 2001. The COG Database: New Developments in Phylogenetic Classification of Proteins from Complete Genomes. Nucleic Acids Res., 29: 22-28. TAYLOR, C. J., A. J. ANDERSON ve S. G. WILKINSON. 1998. Phenotypic Variation of Lipid Composition in Burkholderia cepacia: a Response to Increased Growth Temperature is a Greater Content of 2- hydroxy Acids in Phosphatidylethanolamine and Ornithine Amide Lipid. Microbiology, 144: 1737-1745. THIELE, O. W. ve G. SCHWINN. 1973. The Free Lipids of Brucella melitensis and Bordetella pertussis. Eur. J. Biochem., 34: 333-344. THOMAS, P. E., D. RYAN ve W. LEVIN. 1976. An Improved Staining Procedure for the Detection of the Peroxidase Activity of Cytochrome P450 on Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gels. Anal. Biochem., 75: 168-176. THOMPSON, J., D. HIGGINS ve T. GIBSON. 1994. CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighing, Position Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice. Nucleic Acid Res., 22: 4673-4680. THÖNY-MEYER, L., C. BECK, O. PREISIG ve H. HENNECKE. 1994. The ccoNOQP Gene Cluster Codes for a cb-Type Cytochrome c Oxidase That Functions in Aerobic Respiration of Rhodobacter capsulatus. Mol. Microbiol., 174: 705-716. THÖNY-MEYER, L., F. FISCHER, P. KUNZLER, D. RITZ ve H. HENNECKE. 1995. Escherichia coli Genes Required for Cytochrome c Maturation. J. Bacteriol., 177 (15): 4321-4326. THÖNY-MEYER, L. 2002. Cytochrome c Maturation: a Complex Pathway for a Simple Task? Biochem. Soc. Trans., 30: 633–638. TROPP, B. E. 1997. Cardiolipin Synthase From Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta., 1348:192-200. TURKARSLAN, S., C. SANDERS ve F. DALDAL. 2006. Extracytoplasmic Prosthetic Group Ligation to Apoproteins: Maturation of c-type Cytochromes. Mol. Microbiol., 60(3): 537-541. URBANI, A., S. GEMEINHARDT, A. WARNE ve M. SARASTE. 2001. Properties of the Detergent Solubilised Cytochrome c Oxidase (cytochrome cbb3) Purified from Pseudomonas stutzeri. FEBS Lett., 508: 29-35. VAN DEN BOSCH H. ve P. R. VAGELOS. 1970. Fatty Acyl-CoA and Fatty Acyl-acyl Carrier Protein as Acyl Donors in the Synthesis of Lysophosphatidate and Phosphatidate in Escherichia coli. Biochim, Biophys. Acta., 218:233-248. 131 VAN DALEN, A. ve B. DE KRUIJFF. 2004. The Role of Lipids in Membrane Insertion and Translocation of Bacterial proteins. Biochim, Biophys. Acta., 1694: 97-109. VAN DER OOST J., A. P. N. DE BOER, J. W. L. DE GIER ve diğerleri. 1994. The Heme–copper Oxidase Family Consists of Three Distinct Types of Terminal Oxidases and is Related to Nitric Oxide Reductase. FEMS Microbiol. Lett., 121: 1–10. VAN KLOMPENBURG, W. ve B. DE KRUIJFF. 1998. The Role of Anionic Lipids in Protein Insertion and Translocation in Bacterial Membranes. J. Membr. Biol., 162(1): 1- 7. WANG, J., K. A. GRAY, F. DALDAL ve D. L. ROUSSEAU. 1995. The cbb3-type Cytochrome c Oxidase from Rhodobacter capsulatus Contains a Unique Active Site. J. Am. Chem. Soc., 117: 9363-9364. WEISSENMAYER, B., J.-L. GAO, I. M. LOPEZ-LARA ve O. GEIGER. 2002. Identification of a Gene Required for the Biosynthesis of Ornithine-derived Lipids. Mol. Microbiol., 45: 721-733. WEST, J., C. K. TOMPKINS, N. BALANTAC ve diğerleri. 1997. Cloning and Expression of Two Human Lysophosphatidic Acid Acyltransferase cDNAs That Enhances Cytokine-Induced Signaling Responses in Cells. DNA Cell Biol., 16: 691- 701. WILKINSON, S. G. 1972. Composition and Structure of the Ornithine-containing Lipid From Pseudomonas rubescens. Biochim. Biophys. Acta., 270: 1-17. WOESE, C. R. 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev., 51: 221-271. WU, W., C. K. CHANG, C. VAROTSIS, G. T. BABCOCK, A. PUUSTINEN ve M. WIKSTRÖM. 1992. Structure of the Heme o Prosthetic Group from the Terminal Quinol Oxidase of Esherichia coli. J. Am. Chem. Soc., 1182-1187. XIA, W. ve W. DOWHAN. 1995. In vivo Evidence for the Involvement of Anionic Phospholipids in Initiation of DNA Replication in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 783–787. YEN, H. C., N. T. HU ve B. L. MARRS. 1979. Characterization of the Gene Transfer Agent Made by an Overproducer Mutant of Rhodopseudomonas capsulata. J. Mol. Biol., 131: 157-168. YU, C. A., S. NAGAOKA, L. YU ve T. E. KING. 1978. Evidence for the Existence of a Ubiquinone Protein and Its Radical in the Cytochromes b and c1 Region in the Mitochondrial Electron Transport Chain. Biochem. Biophys. Res. Commun., 82: 1070- 1078. ZANNONI, D., B. MELANDRI ve A. BACCARINI-MELANDRI. 1976. Energy Transduction in Photosynthetic Bacteria: Composition and Function of the Branched 132 Oxidase System in Wild-type and Respiration Deficient Mutants of Rhodopseudomonas capsulata. Biochim. Biophys. Acta., 423:413-430. ZANNONI, D. ve F. DALDAL. 1993. The Role of c-type Cytochromes in Catalyzing Oxidative and Photosynthetic Electron Transport in the Dual Functional Plasma Membrane of Facultative Phototrophs. Arch. Microbiol., 160: 413-423. ZANNONI, D. 1995. Aerobic and Anaerobic Electron Transport Chains in Anoxygenic Phototrophic Bacteria. p. 949. In R. E. Blankenship, M. T. Madigan and C. E. Bauer (ed). Anoxygenic photosynthetic bacteria. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. ZHANG, M., E. MILEYKOVSKAYA ve W. DOWHAN. 2002. Cardiolipin is Required for Supercomplex Formation in the Inner Mitochondrial Membrane. J. Biol. Chem., 277: 43553–43556. ZOLLNER, A., G. RODEL ve A. HAID. 1992. Molecular Cloning and Characterization of the Saccharomyces cerevisiae CYT2 Gene Encoding Cytochrome-c1-heme lyase. Eur. J. Biochem., 207: 1093-1100. ZUFFEREY, R., O. PREISIG, H. HENNECKE ve L. THÖNY-MEYER. 1996. Assembly and Function of the Cytochrome cbb3 Oxidase Subunits in Bradyrhizobium japonicum. J. Biol. Chem., 271 (15): 9114-9119. 133 7. EKLER Ek-1. Bakteri Besiyerleri 1. E. coli Soyları İçin Üreme Ortamları a) Sıvı LB-Besiyeri (Laura Bertani, zengin besi ortamı) (Miller, 1972): 1 litre hacim için Bakto tripton 10 g Maya özütü 5 g NaCl 10 g kimyasalları 800 ml distile suda çözülerek pH NaOH ile 7.5’a ayarlanır. Hacim dH2O ile 1 litreye tamamlanarak otoklavlanır. LB-Agar: 1 litre sıvı LB-besiyerine 15 g agar (%1.5) (Difco-Bacto agar) ilave edilerek besiyeri otoklavlanır. b) Med E-Besiyeri (Minimal besi ortamı) (Miller, 1972): 100 ml 50X stok için MgSO4.7H2O 1 g Sitrik asit. H2O 10 g K2HPO4. anhydrous 50 g NaNH4HPO4.4 H2O 17.5 g kimyasalları 100 ml distile suda çözüldü ve stok besiyerinden 20 ml otoklavlanır. β-alanin (1.5 µM) kasmino asit (%0.1) tihamin (%0.001) D-glukoz (%0.5) Gliserol-3-fosfat (%0.04) D-Pantotenik asit (1 µg ml) L-Methionin (0.025 mg ml) 134 2. R. capsulatus Soyları İçin Üreme Ortamları a) Sıvı Med A-Besiyeri (Minimal besi ortamı) (Sistrom, 1960): 1 litre hacim için (NH4) 2SO4 [%10] 5 ml Sodyum (ya da Potasyum) süksinat [%10] 20 ml NaCl [%10] 5 ml L-Glutamik asit [%5, pH:7] 2 ml L-Aspartik asit [%2, pH:7] 2 ml Solüsyon C 20 ml Potasyum fosfat [1M, pH:6.8] 20 ml distile suda karıştırılarak hacim 1 lt’ye tamamlanır. Besi ortamı otoklavlanarak sıcaklığı 50-55°C’ye düştüğünde steril 10 ml 100X Vitamin eklenerek karıştırılır. Med A-Agar: 1 litre hacim için (NH4) 2SO4 [%10] 5 ml Sodyum (ya da Potasyum) süksinat [%10] 20 ml NaCl [%10] 5 ml L-Glutamik asit [%5, pH:7] 2 ml L-Aspartik asit [%2, pH:7] 2 ml 920 ml distile suda karıştırılarak 15 g agar [%1.5] (Difco-Bacto agar) ilave edilerek besiyeri otoklavlanır. Otoklavlanan Med A besiyerinin sıcaklığı 50-55°C’ye düşürüldüğünde steril 20 ml Solüsyon C, 20 ml Potasyum fosfat [1M, pH:6.8] ve 10 ml 100X Vitamin eklenerek karıştırılır. 135 Med A Stok Solüsyonları A) Mikroelementler Solüsyonu 100 mililitre hacim için ZnSO4.7H2O 1 g EDTA 250 mg FeSO4.7H2O 500 mg H3BO3 11.4 mg MnSO4.H2O 154 mg CuSO4.5H2O 39.2 mg Co(NO3)2.6H2O 25 mg dH2O’da çözülerek hacim 1 litreye tamamlanır. Stok solüsyon otoklavlanarak sterilize edilir. B) Solüsyon C 1 litre hacim için Nitrilotriasetik asit 10 g MgSO4.7H2O 29.5 g CaCl2.2H2O 3.3 g FeSO4.7H2O 0.99 g Mikroelementler Solüsyonu 50 ml 800 ml dH2O’da çözülerek pH KOH ile 6.8-7’ye ayarlanır. Hacim dH2O ile 1 litreye tamamlanarak otoklavlanır. C) Vitaminler (100X): 1 litre hacim için Nikotinik asit 100 mg Thiamin HCl 25 mg Biotin (40 µg/ml stok) 12.5 ml dH2O çözülerek hacim 1 litreye tamamlanır. 0.22 µm steril filtre ile steril edilerek +4°C'de saklanır. 136 b) Sıvı MPYE-Besiyeri (Zenginleştirilmiş besi ortamı) (Daldal ve ark., 1986): 1 litre hacim için Bakto pepton (%0.3) 3 g Maya özütü (Yeast extract, %0.3) 3 g MgCl2 (1,6 mM) 1.6 ml CaCl2 (1 mM) 1 ml distile suda çözülerek pH NaOH ile 7’ye ayarlanır. MPYE besi ortamı otoklavlanarak sterilize edilir. MPYE-Agar: 1 litre sıvı MPYE besiyeri içeriğine 15 g agar (%1.5) (Difco-Bacto agar) eklenerek besiyeri otoklavlanır. * Besi ortamları, solüsyon ve tamponlar 121°C 'de 30 dakika otoklavlanarak sterilize edilir. 137 Ek-2 Tampon Çözeltiler 1. Agaroz jel elektroforez tampon çözeltisi (TBE:Tris-Borat EDTA) (20X) 1 litre hacim için Tris (Trizma Base) (1 M) 121 g. Borik Asit (1M) 61.7 g. EDTA .2H2O (pH:8) (20 mM) 7.44 g. dH2O ile hacim 1 litreye tamamlanarak otoklavlanır. 2. Schägger-tip SDS-Poliakrilamit jel elektroforezinde kullanılan tampon çözeltiler (Schägger ve Jagow, 1987). İçerik Anot Tamponu Katot Jel Tamponu Tamponu Tris-Baz 0.2M 0.1M 3M Trisin - 0.1M - SDS - %0.1 %0.3 pH pH:8.9 (HCl) pH:8.25 pH:8.45 (HCl) 3. SDS-Poliakrilamit jel elektroforezinde kullanılan tampon çözeltiler (Läemmeli, 1960) İçerik Elektrot Tamponu Ayırma Jel Yığma Jel (10X) Tamponu (4X) Tamponu (4X) Tris-Baz 0.25 M 1.5 M 0.5 M Glisin 1.92 M - - SDS 1 % - - pH 8.3 8.8 (HCl) 6.8 (HCl) 138 Ek-3. Protein Jellerinin Hazırlanışı 1. %16.5 luk Trisin-SDS-Poliakrilamit jelin hazırlanışı (Schägger ve Jagow, 1987). Solüsyonlar Ayırıcı Jel Yığma Jel (%16.5T,%3C, %13 Gliserol) Akrilamit/Bisakrilamit 6.65 ml 1 ml (%49.5T, %3C) Jel tamponu 6.65 ml 3.1 ml Gliserol 2.65 g _ Amonyum per sülfat 0.100 ml 0.100 ml (APS, %10) Temed 0.010 ml 0.010 ml dH2O 4.5 ml 8.4 ml Toplam 20 ml 12.5 ml 2. SDS-Poliakrilamit jelin hazırlanışı (Läemmeli, 1960) Solüsyonlar Ayırıcı Jel Ayırıcı Jel Yığma Jel (%15T,%3C) (%12T,%3C) (%10T,%3C) Akrilamit/Bisakrilamit 10 ml 8 ml 1.3 ml (%30) (37.5:1) Ayırma jel tamponu 7.5 ml 5 ml _ Yığma jel tamponu _ _ 3.15 ml SDS (%10) 0.200 ml 0.200 ml 0.125 ml Amonyum per sülfat 0.100 ml 0.100 ml 0.100 ml (APS, %10) Temed 0.010 ml 0.010 ml 0.010 ml dH2O 4.7 ml 6.7 ml 7.8 ml Toplam 20 ml 20 ml 12.5 ml 139 8. TEŞEKKÜR Doktora tez çalışması danışmanlığımı üstlenerek çalışmaların yürütülmesi sırasında ilgisini esirgemeyen ve her türlü kolaylığı sağlayan hocam Sayın Prof. Dr. Rahmi Bilaloğlu ’na teşekkür ederim. Doktora tez çalışmamda ikinci tez danışmanlığımı üstlenerek proje sonuçlarını teze dönüştürmem konusunda gerekli müsadeleri sağlayan, çalışma süresi boyunca yapıcı eleştri ve katkılarda bulunan, sekiz yılı aşkın süreden beri her zaman ilgi ve desteğini esirgemeyen hocam Sayın Doç. Dr. Sevnur Mandacı ’ya teşekkür ederim. Proje kapsamında elde ettiğimiz sonuçların doktora tez çalışması olarak sunulmasında gerekli müsadeleri sağlayan, her daim bilgi ve tecrübesini benimle paylaşan ve yönlendiren Pennsylvania Üniversitesi, Biyoloji Bölümünden (ABD) hocam Sayın Prof. Dr. Fevzi Daldal ’a teşekkür ederim Prof. Dr. Fevzi Daldal ‘ın grubunda yer alan eski ve yeni tüm çalışma arkadaşlarıma; Dr. Meenal Deshmukh, Dr. Maria Valkova, Dr. Elisabeth Darrouzet, Dr. Christine Winterstein, Dr. Kai Zhang, Dr. Thomas Bruser, Dr. Carsten Sanders, Dr. Jason Cooley, Serdar Türkarslan, Dr. Özlem Önder, Dr. Dong-Woo Lee ile TÜBITAK- GMBAE ’deki çalışma arkadaşlarım Dr. Yavuz Öztürk, Dr. Mehmet Öztürk ve Özlem Akkaya ’ya arkadaşlıkları ve bilimsel yardımlaşma ve paylaşımları için teşekkür ederim. Projeye değerli fikir ve önerileriyle katkı sağlayan, işbirliği içerisinde bulunduğumuz Pennsylvania Universitesi’nden Prof. Dr. Howard Goldfine ’a teşekkür ederim. Tez komite üyelerim, Prof. Dr. Ünal Egeli ve Prof. Dr. Sezai Türkel ’e yapıcı eleştri ve önerilerinden dolayı teşekkür ederim. 140 TÜBITAK-GMBAE nin eski ve yeni Enstitü müdürleri Prof. Dr. Engin Bermek, Prof. Dr. Beyazıt Çırakoğlu ve Doç. Dr. Kemal Baysal ’a tez projenin devamlılığı için gerekli müsadeleri tanıdıklarından dolayı teşekkür ederim. Her zaman ilgi ve sevgilerini esirgemeyen, hedeflerime ulaşmamda destekleyici yol gösterici ve koruyucu olarak sürekli yanımda bulunan, duydukları güvenle bana cesaret veren çok sevdiğim anneme, babama ve ablam Selda ’ya en içten teşekkürlerimi sunarım. Son olarak anlayışlı ve destekleyici tutumu ve sorunlara kesin ve kısa yoldan çözüm üreten yaklaşımıyla her zaman yanıbaşımda hissettiğim sevgili eşim Ulaş Sunar ’a çok teşekkür ederim. Bu tez çalışması NIH-GM38237 (Prof. Dr. Fevzi Daldal), TBAG-2128 (Doç. Dr. Sevnur Mandacı) ve UNESCO-L’oreal Co-Sponsored Fellowship For Young Women in Life Sciences (Semra Aygün-Sunar) kapsamında gerçekleşen projelerin belli bir bölümünden hazırlanarak sunulmuştur. 14 1 9. ÖZGEÇMİŞ 11 Ekim 1973 yılında Yalova ’da doğdu. 1992 yılında Balıkesir Üniversitesi Biyoloji Eğitimi Bölümünü kazandı ve 1996 yılında bölüm dördüncüsü olarak mezun oldu. Lisans bitirme çalışmasını Prof. Dr. Gülendam Tümen ’in danışmanlığında Yalova Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü ‘nde yürütülen projeye katılarak gerçekleştirdi ve “Bitki doku kültürleri” başlıklı tez çalışmasını hazırladı. Aynı yıl Balıkesir Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Eğitimi Bölümünün yüksek lisans programına başladı. 1997 yılında Prof. Dr. Fevzi Daldal (Pennsylvania Üniversitesi) ve Doç. Dr. Sevnur Mandacı (TÜBİTAK-Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü (GMBAE)) ’nın danışmanlıklarında TÜBİTAK- GMBAE-Moleküler Biyoenerjetik laboratuarında yürütülen projeye katıldı. Proje sonunda elde edilen sonuçlar “Rhodobacter capsulatus Bakterisinde Sitokrom c Oksidaz Mutantlarının Eldesi ve Karakterizasyonu” başlıklı yüksek lisans tez çalışması olarak hazırladı. 1999 yılında tez çalışmasını Prof. Dr. Gülendam Tümen ve Doç. Dr. Sevnur Mandacı ’nın danışmanlıklarında sunarak, yüksek lisans derecesini Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü ’nden aldı. 2001 Şubat döneminde Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Bölümünde doktora programına başladı. Doktora tezini Prof. Dr. Fevzi Daldal ’ın laboratuarında yürütülen ve yüksek lisans tez çalışmasından elde edilen sonuçlar doğrultusunda hazırlanan proje kapsamında gerçekleştirdi. “Rhodobacter capsulatus Sitokrom c Oksidaz Biyogenesiz ’inde Rol Alan Genlerin Belirlenmesi ve Fonksiyonlarının Tanımlanması” başlıklı doktora tez çalışmasını Prof. Dr. Rahmi Bilaloğlu ve Doç. Dr. Sevnur Mandacı ’nın danışmanlıklarında hazırladı. Kasım 1997-Mayıs 2005 tarihleri arasında TÜBİTAK-GMBAE ’de araştırmacı olarak çalıştı. Bu süre zarfında 2000 yılında altı aylık süreyle Dünya bankası ve TÜBİTAK-Marmara Araştırma Merkezi ’nin burs programından yararlanarak “Bakteriyel Moleküler Genetik” konusundaki yeni teknikleri öğrenmek üzere Prof. Dr. Daldal ’ın laboratuarına gitti. Yine, 2002 yılında dahil olduğu proje kapsamındaki çalışmaların devamlılığı için altı aylık süreyle Prof. Dr. Daldal ’ın laboratuarında çalışmaya devam etti. 2004 yılında UNESCO-L’oreal Co-Sponsored Fellowship For 14 2 Young Women in Life Sciences bursunu “Characterization of Novel Genes Involved in the Biogenesis of Cytochrome c Oxidase” başlıklı çalışma ile kazanarak tekrardan Prof. Dr. Daldal ’ın laboratuarına gitti. Halen aynı laboratuarda çalışmalarını sürdürmektedir.