Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 34 (2) 45-51, 2008 ORİJİNAL YAZI Sıçanlarda Pilocarpin ile Oluşturulan Epilepsi Modelinde Topiramat’ın Antikonvulsan Etkileri Behzat NOYAN Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı, Bursa. ÖZET Bu çalışmada, topiramat (TPM) tedavisinin antikonvulsan ve hipokampüste çinko translokasyonu üzerine olan etkisinin araştırılması amaç- landı. Bu yolla TPM’ın hipokampusdeki çinko iyonları üzerinden etki ederek antiepileptik etki göstermesinde bir rolünün olup olmadığı araştırıldı. Deneylerde 300-350g. arasında erkek, erişkin Spraque-Dawley sıçanlar kullanıldı. Sıçanlardan elektrokortikografik (ECoG) kayıtların alınabilmesi için deneyler öncesinde tüm sıçanlara anestezi altında (thiopental sodium, 40 mg/kg, i.v.) 5 adet çelik paslanmaz vida elektrod epidural olarak yerleştirildi ve i.c.v. enjeksiyon için sol lateral ventriküllerine kanül yerleştirildi. Pilokarpin HCl enjeksiyonu (380 mg/kg i.p.) ile nöbet oluşturuldu. Pilokarpin HCl enjeksiyonunundan 10 dk. önce 20, 60 ve 100 mg/kg topiramat (i.p.), CaEDTA (100 mM i.c.v.) ve ZnCl2 (35 mg/kg i.p.) enjeksiyonları yapıldı. Aynı zamanda bu hayvanların davranışsal değişiklikleri gözlemlendi. Pilokarpin enjeksiyonundan iki saat sonra diazepam enjeksiyonu ile nöbetler sonlandırıldı. Sıçanlar 24 saat sonunda anestezi altında dekapite edilerek hızla beyinleri çıkarıldı. Hipokampal boyama (TSQ) ile çinko iyonlarının postsinaptik nöronlara geçip geçmediği incelendi. Status epileptikus (SE) insidansı, 24 saatlik yaşam şansı ve nöbet skorları değerlendirildiğinde, TPM’ın antikonvulsan etkileri saptandı. Tüm TPM gruplarında ECoG kayıtlarda sivri dalgaların amplitüd ve frekanslarının daha düşük olduğu gözlendi. 100 mg/kg dozda uygulandığında TPM’ın hipokampüste çinko translokasyonu üzerine etkili olduğu yani çinko iyonlarının yosunsu liflerin presinaptik terminallerinden postsinaptik nöronlara geçişini engellediği görüldü. Anahtar Kelimeler: Çinko. Topiramat. ECoG. Pilocarpine. TSQ. Anticonvulsan Effects of Topiramate in the Pilocarpine Model of Epilepsy in Rats ABSTRACT The effects of topiramate (TPM) therapy on zinc translocation and anticonvulsan outcomes have been researched in this study. Also whether TPM has a role on antiepileptic effect by affecting the zinc ions on the hippocampus has been investigated. Adult, male Spraque-Dawley rats between 300-350g. have been used in the experiments. To receive the electrocorticographic (ECoG) data from the rats, 5 stainless steel screw electrodes were implanted epidurally under anesthesia (thiopental sodium, 40 mg/kg, i.v.) to all of the rats and canuls were placed in the left lateral ventricles for i.c.v. injection before the experiments. Seizures were provoked by pilokarpine-HCl injection (380 mg/kg i.p.). Ten minutes before pilocarpine-HCI injection; 20, 60 and 100 mg/kg topiramate (i.p.), CaEDTA (100 mM i.c.v.) and ZnCl2 (35 mg/kg i.p.) have been introduced into the groups accordingly. Concurrently, the behavioral variances of the animals were observed during this process. After two hours of pilocarpine injection, seizure were terminated by diazepam injection. By the end of 24 hours, the rats under anesthesia were decapitated, their brains were removed rapidly and the state of zinc ions was analyzed by hippocampal staining (TSQ). When the status epilepticus (SE) incidence, 24-hour survival, and the seizure scores were analyzed, the anticonvulsan effects of TPM were confirmed. The amplitude and frequency of the spikes in the ECoG records were less in all of the TPM groups. When 100 mg/kg was applied, TPM was effective on the zinc translocation. This shows that TPM prevents the translocation of zinc ions from the presynaptic terminals of mossy fibers to postsynaptic neurons. Key Words: Zinc. Topiramate. ECoG. Pilocarpine. TSQ. Epilepsi, tüm populasyonda yüksek oranında görülen 1,2 Geliş Tarihi: 01.02.2008 yaygın önemli bir sağlık problemidir . Patogenezinin Kabul Tarihi: 05.03.2008 anlaşılmasındaki ilerlemelere rağmen, nöbetlerin ve epilepsinin hücresel temelleri hala tam olarak bilin- Dr. Behzat NOYAN memekte ve dolayısıyla var olan ilaç tedavileri sadece Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, semptomların kontrol altında tutulmasına yönelmekte- Fizyoloji Anabilim Dalı dir3,4. 16059 Görükle / Bursa Tel: 0 224 4429137 Antikonvulzanlar, esas olarak merkezi sinir sistemine e-mail: noyan@uludag.edu.tr zarar vermeden ve solunumu deprese etmeden epilep- tik nöbetlerin baskılanması için kullanılırlar5 . Birkaç yeni antiepileptik ilaçtan birisi olan topiramat (TPM) 45 B. Noyan [2,3: 4,5- bis-0- (1-methylethyli-dene) β−D- reseptörlerin endojen bir nörotransmitteri ve fructopyranose sulfamate], (C12H21NO8S) hem deney- nöromodulatörü olarak hizmet ettiği düşünülmekte- sel6,7 hem klinik çalışmalarda8 geniş spektrumlu dir20,28-30. Veziküler çinkonun glutamat ile beraber antiepileptik aktiviteye ve nöroprotektif etkiye sahip epilepsi, beyin travması gibi patolojik durumlardan olduğu bildirilen bir bileşiktir. TPM’ın basit veya sonra aşırı salınımında nörotoksik bir hal aldığı bildi- kompleks parsiyal nöbetlere ve jeneralize tonik– rilmiştir31-34. Yapılan çalışmalarda i.c.v. CaEDTA klonik nöbetlere karşı hem çocuklarda hem erişkinler- (ekstrasellüler çinko şelatörü) enjeksiyonu ile çinko de etkili olduğu bildirilmiştir9. TPM’ın diğer şelasyonu sonucu hipokampusdeki nöronal hasarın ve antikonvulzanlara benzer şekilde voltaj duyarlı Na+ nöronal ölümün yavaşladığı saptanmıştır35,36. Epileptik kanallarını bloke ettiği, epileptiform deşarjların süre- nöbetlerde fazla miktarda salınan çinkonun sini ve her deşarjda ortaya çıkan aksiyon potansiyelle- postsinaptik nöronlarda, kalsiyum bağımlı AMPA/KA rini azalttığı bildirilmiştir10,11. GABAA reseptörünün reseptörleri için eksitatör, NMDA ve GABAA resep- düzenlediği klor akışını arttırdığı yani GABAA resep- törleri için de inhibitör bir ajan olarak rol oynadığı törü üzerine düzenleyici etkisi olduğu ve genellikle bildirilmiştir20,37,38. Ayrıca çinko içeren yollar status GABA aktivitesini güçlendirdiği bildirilmektedir. epileptikus (SE) ve tekrarlayan nöbetlerde sinaptik Sadece TPM’a özgü olduğu öne sürülen bir özellik reorganizasyon (sprouting) içerisindedir39. Deneysel olarak glutamat reseptör alt tiplerinden Kainat ve oluşturulan epilepside, iskemi, kafa ya da beyin trav- AMPA reseptörlerini bloke etmesidir11-14. Ancak ması gibi akut durumlarla ilişkili olarak aşırı miktarda NMDA reseptörleri üzerinde anlamlı etkisi olmadığı bildirilmiştir11,12. L tipi yüksek voltajla aktive olan çinko presinaptik vezikülden salındıktan sonra, Ca++ kanallarında negatif modulasyon sağladığı yani postsinaptik nöronlara geçmekte ve orada toksik etki Ca++ akışını azalttığı10,13,15, K+ kanallarını aktive etti- göstererek, nöronların hasarlanmasına ve ölümüne 36,40-43 ği6,13,16, sinir uçlarından glutamat ve aspartat gibi neden olmaktadır . eksitatör aminoasit salınımını inhibe ettiği de bildiril- Bu çalışmada epileptik nöbetlerde hipokampuste miştir12,17. glutamat ile birlikte aşırı miktarda salınan ve nöron- Çinko vücutta en yaygın bulunan ikinci eser element- larda eksitotoksisitesi nedeniyle hücre ölümüne neden tir ve memeli beyninde büyük miktarda bulunur. Çin- olan çinko iyonları ile yeni bir antiepileptik ajan olan ko beyin olgunlaşması ve fonksiyonları için gerekli- topiramatın antikonvulsan etkisini gösterdiği reseptör dir18,19. Bütün dokularda çoğu enzimlerin sentezi için tiplerinin aynı olmasına dayanılarak, topiramat tedavi- esansiyel olmasına rağmen beyindeki çinkonun diğer sinin çinko translokasyonu üzerine olan etkisinin araş- dokulardan farklı bir özelliği presinaptik terminallerde tırılması amaçlanmıştır. Aynı zamanda TPM’ın davra- veziküler lokalizasyonudur20. Çinkonun presinaptik nışsal değişiklikler ve ECoG kayıtları üzerine hangi veziküller içine alınmasını sağlayan Zinc-Transporter- dozunun antikonvulsan olarak etkin olduğu saptanma- 3 (ZnT-3) olarak isimlendirilen özel bir pompa, nöron- ya çalışılmıştır. ların sinaptik veziküllerinin membranları üzerinde lokalize olmuştur22,23. ZnT-3 proteininin immunohistokimyasal lokalizasyonu sayesinde çinko Gereç ve Yöntem içeren nöronlar tanınabilmektedir24. Hipokampus ve amigdala bölgeleri yüksek yoğunlukta çinko içeren Çalışmada ağırlıkları 300-350g arasında 120 adet nöron terminallerine sahiptir25. Beyinde en yüksek erkek, erişkin Spraque-Dawley sıçanlar kullanıldı. yoğunlukta çinko içeren bölge hipokampusdur. Hayvanlar Uludağ Üniversitesi Deney Hayvanları Hipokampusun çoğu nöronunda çinko yaygın olması- Merkezi’nden sağlandı. Çalışma için Uludağ Üniversi- na rağmen hipokampal yosunsu liflerinin terminalle- tesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi’nden izin rindeki glutamat içeren veziküllerde çinko konsantras- alındı. Sıçanlar sıcaklığı 20-22°C olan odalarda (12 yonu yaklaşık 300 µM’dır26. Bu ilişki glutamat depo- saat aydınlık/12 saat karanlık) beş tanesi bir kafeste lanması, salınımı veya glutamat reseptörlerinin olacak şekilde tutuldu ve standart sıçan diyeti ile bes- modulasyonunda çinkonun önemine dikkat çekmekte- lendi. Yem ve su alımları serbest bırakıldı. dir24. Çalışma, deneysel epilepside TPM’ın beklenen Beyindeki toplam çinkonun yaklaşık % 10’u antikonvulsan etkisinin, nöbetlerde aşırı miktarda glutamaterjik nöronların sinaptik vezikülleri içinde salınan çinkoyu etkileyip etkilemediğini gözlemlemek bulunurken, % 90’lık kısmı ise metalloproteinler tara- 19 amacı için yapıldığından, deney gruplarında fından tutulur . Metal bağlayan proteinlere sıkıca pilokarpin HCl enjeksiyonları yapıldı ve TPM tedavisi bağlı olan metabolik çinkonun aksine veziküler çinko ile birlikte çinko veya çinko şelatörü verildi. serbesttir veya zayıfca bağlıdır. Bu özelliği nedeniyle seçici floresan boyamalar veya Neo-Timm boyama27 CaEDTA’nın çinko iyonlarını bağladığı ve ZnCl2’ün yöntemleriyle saptanabilmektedir. Veziküler çinkonun de bir çinko kaynağı olduğu bilindiğinden topiramatın memeli beyninde sinaptik nörotransmisyonda rol çinko iyonları üzerine etkisinin araştırılabilmesi için oynadığı ve NMDA, AMPA/Kainat ve GABA gibi çalışma aşağıda belirtilen gruplardan oluşturuldu; 46 Pilocarpin Epilepsisinde Topiramat 1) Nöbet Kontrol Grubu (n=10): Pilokarpin HCl Nöbet şiddetleri bu şekilde değerlendirilen sıçanlar enjeksiyonu (380 mg/kg i.p.) ile nöbet oluşturulan ayrıca status epileptikusa (SE) girme oranı, nöbet grup. latansı ve 24 saatlik yaşam şansı açısında da davranış- 2) Nöbet + TPM Tedavili Grup (n=30): Pilokarpin sal olarak değerlendirildi. TPM’ın akut etkisinin ince- HCl enjeksiyonunundan 10 dk. önce 20, 60 ve 100 lenebilmesi için nöbetler pilokarpin enjeksiyonundan mg/kg topiramat (i.p.) verilen grup. iki saat sonra diazepam enjeksiyonu ile sonlandırıldı. 3) Nöbet + TPM + CaEDTA Grubu (n=40): Sıçanlar 24 saat sonunda anestezi altında dekapite Pilokarpin HCl enjeksiyonundan 10 dk. önce 20, edilerek hızla beyinleri çıkarıldı. Hipokampal boyama 60 ve 100 mg/kg topiramat ve CaEDTA (100 mM için sol hemisfer izole edildi ve alınan parçalar CO2 i.c.v.) enjeksiyonu yapılan grup. gazı ile dondurularak -80 oC de saklandı. Daha sonra- 4) Nöbet + TPM + ZnCl Grubu (n=40): Pilokarpin sında alınan kesitlerde N-(6-methoxy-8-quinolyl)-2 HCl enjeksiyonundan 10 dk. önce 20, 60 ve 100 para-toluenesulfonamide (TSQ) boyaması yapılarak mg/kg topiramat ve ZnCl (35 mg/kg i.p.) enjeksi- hipokampusde çinko floresanı yoluyla çinko iyonları-2 yonu yapılan grup. nın transloke olup olmadığı tespit edildi. Nöbetlerde periferal yan etkilerinin azaltılması için pilokarpin HCl verilmeden 30 dk. önce metil- TSQ Floresan Boyaması scopolamine (1 mg/kg, s.c.) enjeksiyonu yapıldı. Çinkonun floresan görünümü için -80o C de saklanan CaEDTA’nın intraserebroventriküler enjeksiyonu için beyin parçalarından kryostat yardımıyla -25 o C de 10 stereotaksik koordinatlar göz önüne alınarak µm kalınlığında frozen kesitler alındı ve kesitlerde (Bregma’nın 1,5 mm sol laterali ve 1 mm posteriorü, TSQ boyaması yapıldı. Kesitler 1 dakika boyunca 4,0-4,2 mm derinlik) sıçanların kafatasına bir kanül TSQ (4,5 µM) solüsyonunda (140 mM sodyum yerleştiridi ve enjeksiyonlar (10 µl CaEDTA) barbutal ve 140 mM sodyum asetat tamponunda) Hamilton mikroenjektörü ile yapıldı. immerse edildikten sonra 1 dk boyunca serum fizyolo- jik (NaCl, %0.9) ile yıkandı ve bir floresans mikros-kobunda incelendi45. 360 nm eksitasyon, 460 nm e- ECoG Kayıtlarının Alınması misyon filtreleri kullanıldı. Mikroskoba bağlı bir ka- Sıçanlardan elektrokortikografik (ECoG) kayıtların mera ile çekilen hipokampuse ait görüntüler kayıt ve alınabilmesi için deneyler öncesinde tüm sıçanlara analizleri için bilgisayar ortamına aktarıldı. anestezi altında (thiopental sodium, 40 mg/kg, i.v.) 4 adet çelik paslanmaz vida elektrod epidural olarak yerleştirildi (fronto-parietal elektrodlar, bregmanın 2 İstatistik mm anterior ve 2 mm posteriorüne ve orta hattın her Status epileptikusa girme ve 24 saat yaşam şansı yüz- iki tarafta 2 mm lateraline). Nazal kemik üzerine yer- deleri nöbet kontrol grubu ile diğer gruplar arasında leştirilen bir elektrod referans elektrod olarak kullanıl- Fisher’in kesin ki-kare testi uygulanarak değerlendi- dı. Bütün elektrotlar kafatasına dişçi akriliği ile sabit- rildi. SE latansı yüzdelerinin nöbet kontrol grubuna lendi, lokal antibiyotik ve ağrı kesici uygulanarak deri göre değerlendirilmesinde ANOVA testi kullanıldı. kapatıldı. Deneylere cerrahi işlemlerden 3 gün sonra Anlamlı farklılık düzeyi olarak p<0.05 alındı. başlandı. Bulgular Deneysel İşlemler Deneysel işlemlerden önce tüm hayvanların ECoG Tüm gruplarda pilokarpin verilmesinden yaklaşık 5 dk (MP 100 data acquisition and analysis system, Biopac sonra kolinerjik stimulasyon bulguları olan salivasyon, Systems, Inc.) kayıtları alındı. Kayıtlamaya pilokarpin piloereksiyon, diuresis, tremor, çiğneme hareketleri HCl enjeksiyonundan 120 dk. sonraya kadar devam gibi limbik otomatik hareketler saptandı. 15-20 dk edildi. Bu süreçte hayvanların davranışsal değişiklik- sonrasında bazı sıçanlarda baş sallama, rearing ve leri gözlemlenerek aşağıdaki Racine44 skalasına göre forelimb clonus görüldü. Bunu bazı sıçanlarda düşme, skorlandırıldı; jeneralize konvulsiyonlar ve SE takip etti. SE tüm 0: Hareketsiz gruplarda ortalama pilokarpine enjeksiyonundan 39- 1: Fasial otomatizmalar 41 dk sonrasında görüldü. Grupların SE latansları arasında fark görülmedi (Tablo-I). Nöbet-kontrol 2: Baş sallama grubunda %90 görülen SE insidansı TPM’ın 100 3: Unilateral veya bilateral ön ekstremite klonusu mg/kg verildigi sıçanlarda %30’a düştü. 24 saatlik 4: Bilateral ön ekstremite klonusu ve ayağa kalkma yaşam şansı bulguları da kontrol grubunda ancak %20 5: Ayağa kalkma, düşme, yuvarlanma, jeneralize kon- iken, TPM 100 mg/kg grubunda %90 olarak bulundu. vulsiyonlar ve status epileptikus Nöbet skorları değerlendirildiğinde TPM’ın 100 mg/kg enjekte edildiği hayvanlardaki nöbet şiddetin- 47 B. Noyan deki azalmalar nöbet-kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı düzeydeydi (Tablo-I). Tablo I. Nöbet-kontrol grubu ile farklı dozlarda TPM, CaEDTA ve ZnCl2 verilen grupların status epileptikusa girme oranı, nöbet latansı, 24 sa- atlik yaşam şansı ve nöbet skoru açısından karşılaştırılması ve grupların ortalamaları (mean ± S.H.). SE 24-saat Nöbet Skoru Şekil 2: GRUPLAR SE Latansı (dk) Yaşam (sayı- Nöbet kontrol grubunda pilokarpin (380 mg/kg) veril- (n=10) (%) (ortalama ± şansı dereceleme) S.H.) (%) (ortalama ± dikten sonra nöbet sırasında ECoG kaydı. S.H.) Nöbet-Kontrol Grubu (pilokarpin 380 mg/kg) 90 40.7±1.6 20 4.6±0.1 N-TPM 20 mg/kg 80 39.1±1.7 60 4.1±0.2 N-TPM 60 80 40.1±1.3 60 3.9±0.2 N-TPM 100 30* 40.3±1.4 90** 2.9±0.3*** N-ZnCl2 60 48.7±8.9 60 4±0.4 N-ZnCl2-TPM 20 70 52.5±11.3 60 3.5±0.3 N-ZnCl2-TPM 60 60 42.8±4 60 4±0.4 N-ZnCl2-TPM 100 60 35±4.5 70 3.4±0.3 N-CaEDTA 70 40±6.1 70 4.2±0.2 N-CaEDTA-TPM 20 70 39.2±5.9 60 4.4±0.2 Şekil 3: N-CaEDTA-TPM 60 70 40.7±4.5 50 4.2±0.2 Pilokarpin (380 mg/kg) verildikten sonra 20 mg/kg N-CaEDTA-TPM 100 70 38.5±4.8 70 4.1±0.3 dozda TPM uygulanan grubun ECoG kaydı. Nöbet-Kontrol grubuna göre * p<0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001 ECoG açısından nöbet kontrol grubu ile karşılaştırıl- dığında tüm Nöbet-TPM gruplarında spike’ların amplitüdlerinin ve frekanslarının daha düşük olduğu gözlendi. Nöbet-TPM 100 grubunda spike’ların voltaj- larının diğer TPM gruplarına göre oldukça düşük olması dikkati çekti. Nöbet-TPM 20, Nöbet-TPM 60 grupları arasında ECoG paterni açısından önemli fark- lılık gözlemlenmedi. Nöbet ile beraber TPM verilen gruplarla karşılaştırıldığında CaEDTA ile beraber TPM verilen gruplarda bir değişiklik görülmedi. Çin- Şekil 4: ko ile beraber TPM verilen gruplarda da bir farklılık Pilokarpin (380 mg/kg) verildikten sonra 60 mg/kg belirlenmedi (Şekil: 1-5). dozda TPM uygulanan grubun ECoG kaydı. Şekil 1: Şekil 5: Nöbet kontrol grubunda pilokarpin (380 mg/kg) Pilokarpin (380 mg/kg) verildikten sonra 100 mg/kg verilmeden önceki ECoG kaydı dozda TPM uygulanan grubun ECoG kaydı. 48 Pilocarpin Epilepsisinde Topiramat Çinko iyonlarının translokasyonu açısından değerlen- davranışsal değişiklikler gibi parametreler üzerinde dirildiğinde (TSQ boyama) yalnızca 100 mg/kg dozda olumlu etkileri görüldü. Her ne kadar dozaj farklılıkla- TPM verildiğinde çinko iyonlarının postsinaptik nö- rı olsada pilokarpin ile oluşturduğumuz akut SE mo- ronlara geçmediği gözlenirken, 20 ve 60 mg/kg dozda delimizdeki bulgularımız insan ve deney hayvanların- TPM ve nöbet kontrol gruplarında çinko iyonlarının da yapılan çalışmalarda TPM’ın belirtilen postsinaptik nöronlara geçtiği gözlemlendi (Şekil: 6, antikonvulsan etkisi ile paralel sonuçlardır6-8. 20 ve 60 Şekil: 7). Nöbet ile beraber TPM verilen gruplarla mg/kg dozlarda SE insidansı ve nöbet skoru açısından CaEDTA ile beraber TPM verilen gruplar karşılaştı- azalma, 24 saat yaşam şansı açısından bir artış görül- rıldığında olumlu yönde bir değişiklik görülmedi yine mekle beraber bu bulgularımız istatistiksel açıdan çinko iyonları ile beraber TPM verilen gruplarda da önemli bulunmamıştır. TPM 100 mg/kg dozda veril- bir değişiklik saptanmadı. diğinde sıçanların yaşama şanslarını önemli derecede yükseltirken, nöbet skorlarını ve SE insidansını da önemli derecede azaltmıştır. Kontrol gurubu ile karşı- laştırıldığında 100 mg/kg TPM’ın nöbet sırasındaki ECoG dalgalarının amplitüdlerinde ve frekanslarında azalmaya neden olduğu bulgumuz, SE’a girme oranı ve düşen nöbet skorları ile birbirini destekler nitelik- tedir ve antikonvulsan etkiyi göstermektedir. Bu akut antikonvulsan etki TPM’ın etkisinin araştırıldığı EEG çalışmaları ile benzerlik göstermektedir10,46,47. Ayrıca TPM’ın nöbet frekansı üzerine fazla etkisi olmaması- na rağmen yüksek dozlarda, spike amplitüdlerinde azalma eğilimi olduğu fakat bunun da istatistiksel olarak anlamsız olduğunu ileri süren çalışmalar da vardır13. Şekil 6: Çinkonun sinaptik transmisyondaki rolünün fizyolojik Hipokampüsde Nöbet-Kontrol Grubuna ait TSQ ve patofizyolojik koşullarda hala tam olarak aydınlatı- floresan görüntüsü. Beyazlamalar (bleaching) çinko lamamış olmasına rağmen veziküler çinkonun iyonlarının postsinaptik nöronlara glutamat ile beraber epilepsi, beyin travması ve iskemi geçişini göstermektedir. gibi durumlardan sonra aşırı salınımında nörotoksik bir hal aldığı çeşitli çalışmalarda bildirilmiştir31-34. Bu koşullarda çinko iyonları presinaptik veziküllerden salındıktan sonra postsinaptik nöronlara geçmekte ve nöronların hasarlanmasına veya ölümüne neden ol- maktadır25,41-43,48,49. Yaptığımız literatür taramasında TPM’ın epileptik nöbetlerde beyinde çinko iyonlarının çeşitli kaynaklardan salınımı ve regülasyonu üzerine olan etkisine ait herhangi bir bilgiye rastlanamamıştır. Çeşitli histokimyasal boyama yöntemleri içerisinde TSQ boyaması hipokampusde çinkonun lokalizasyo- nun belirlenmesi açısından tam duyarlı bir yöntemdir. Nöbet kontrol grubu TSQ boyamalarımızda bizde nöbet sırasında çinkonun yosunsu liflerin uçlarından postsinaptik nöronlara geçişini gözlemledik. Yine Suh ve arkadaşları49 pilokarpin HCl enjeksiyonu yoluyla Şekil 7: nöbet oluşturdukları sıçanlardan 24 saat sonra aldıkları Hipokampüsde 100 mg/kg dozda TPM verilen ve nö- hipokampal kesitlerinde neuropil floresansının azaldı- bet oluşturulan gruba ait TSQ floresan görüntüsü. ğını ve postsinaptik nöronlarda TSQ boyanması gö- Beyazlamanın azaldığı ve sadece CA3 alanındaki rüldüğünü dolayısıyla çinko translokasyonunun oldu- yosunsu liflere ait presinaptik uçlarda çinko iyonları- ğunu gösterdiler. Oysa akut çalışmamızda 100 mg/kg nın normal floresan verdiği görülmektedir. dozdaki TPM grubunda TSQ boyaması sonucunda postsinaptik nöronlara geçiş görülmemiştir. Dolayısıy- la bu dozda TPM çinkonun presinaptik uçlardan Tartışma salınımını engellemiştir. Yapılan çalışmalarda i.c.v. CaEDTA (ekstrasellüler çinko şelatörü) enjeksiyonu Çalışmamızda pilokarpin enjeksiyonundan 10 dakika ile çinko şelasyonu sonucu hipokampusdeki nöronal önce uygulanan TPM’ın antikonvulsan etkileri, özel- hasarın ve nöronal ölümün yavaşladığı saptanmıştır36. likle 100 mg/kg dozda uygulanan TPM’ın ECoG ve Bizim çalışmamızda CaEDTA’nın bu tip bir etkisi 49 B. Noyan görülmemiştir. Benzer şekilde akut dönemde çinko 16. Glauser T. Topiramate. Epilepsia 1999; 40(suppl 5): 71-80. şelatörünün etkisizliği daha öncede bildirilmiştir41,50. 17. Kanda T, Kurokawa M, Tamura S, Nakamura J, Ishii A, İlginç olarak bazı çalışmalarda ekstraselüler çinko Kuwana Y, et al. Topiramate reduces abnormally high şelatörü CaEDTA’nın “ZnT -null mice” larda kainatla extracellular levels of glutamate and aspartate in the 3 hippocampus of spontaneously epileptic rats (SER). Life Sci oluşturulan ve iki saatte sona erdirilen nöbet şiddetini 1996; 59(19): 1607-16. azaltmadığı gösterilmiştir22,23. 18. Takeda A. Movement of zinc and its functional significance in Sonuçta çalışmamızda 100 mg/kg TPM tedavisinin, the brain. Brain Research Reviews 2000; 34: 137-48. SE insidansını azalttığını, nöbet skorunu düşürdüğünü, 19. Takeda A, Minami A, Seki Y, Oku N. Differential effects of 24 saat yaşam şansını arttırdığını, ECoG’de zinc on glutamatergic and GABAergic neurotransmitter systems in the hippocampus. Journal of Neuroscience Research spike’ların amplitüdlerinin ve frekanslarının daha 2004; 75: 225-9. düşük olmasına neden olduğunu gözlemledik. Ayrıca 20. Weiss JH, Sensi SL, Ca2+-Zn2+ permeable AMPA or kainate çalışmamız hipokampuste çinko iyonlarının receptors: possible key factors in selective neurodegeneration. postsinaptik nöronlara geçişini engellemesi nedeniyle Trends Neurosci 2000; 23: 365-71. TPM’ın antiepileptik ve nöron koruyucu etkisi üzerine 21. Weiss JH, Sensi SL, Koh JY. Zn2+: a novel ionic mediator of daha önce saptanmış olan yolaklarının yanı sıra beyin neural injury in brain disease. Trends in Pharmacological çinko iyonları üzerine de etki ederek antiepileptik etki Science (TIPS) 2000; 21: 395-401. göstermesinde rolü olabileceğini göstermektedir. 22. Palmiter RD, Cole TB, Quaife CF, Findley SD. ZnT-3, a putative transporter of zinc into synaptic vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996; 93:14934-9. 23. Wenzel HJ, Cole TB, Bom DE, Schwartzkroin PA, Palmiter Kaynaklar RD. Ultrastructural localization of zinc transporter-3 (ZnT-3) to synaptic vesicle membranes within mossy fiber boutons in the 1. Blackburn TP, Sloviter RS. Epilepsy, parkinson’s disease, hippocampus of mouse and monkey. Proc. Natl. Acad. Sci. migraine and brain plasticity-the next paradigm shift? Current U.S.A. 1997; 94: 12676-81. Opinion in Pharmacology 2003; 3: 3-5. 24. Frederickson CJ, Suh SW, Silva D, Frederickson CATHY J, 2. Löscher W. Current status and future directions in the Tompson RB. Importance of zinc in the central nervous system: pharmacotherapy of epilepsy. Trends in Pharmacological The zinc-containing neuron. J. Nutr 2000; 130: 1471-83. Sciences 2002; 23(3): 113-8. 25. Frederickson CJ. Neurobiology of zinc and zinc-containing 3. McNamara JO. Cellular and molecular basis of epilepsy. The neurons. Int. Rev. Neurobiol 1989; 31: 145-238. Journal of Neuroscience 1994; 14(6): 3413-5. 26. Frederickson CJ, Klitenick MA, Manton WI, Kirkpatrick JB. 4. McNamara JO. Emerging insights into the genesis of epilepsy. Cytoarchitectonic distribution of zinc in the hippocampus of Nature 1999; 399(6738 Suppl): 15-22. man and the rat. Brain Res1983; 273: 335-9. 5. Soderpalm B. Anticonvulsants: aspects of their mechanisms of 27. Danscher G. The autometallographic zinc-sulphide metod. A action. European Journal of Pain 2002; 6(Suppl. A): 3-9. new approach involving in vivo creation of nanometer-sized zinc sulphide crystal lattices in zinc-enriched synaptic and 6. Shank RP, Gardocki JF, Vaught JL, et al. Topiramate: secretory vesicles. Histochem. J 1996; 28(5): 361-73. preclinical evaluation of structurally novel anticonvulsant. Epilepsia 1994; 35: 450-60. 28. Dudek FE. Zinc and epileptogenesis. Epilepsy Currents 2001; 1(2): 66-70 7. Wauquier A, Zhou S. Topiramate: a potent anticonvulsant in the amygdala-kindled rat. Epilepsy Res 1996; 24: 73-7. 29. Smart TG, Xie X, Krishek BJ. Modulation of inhibitory and excitatory amino acid receptor ion channels by zinc. Prog. 8. Bourgeois BF. New antiepileptic drugs. Curr. Opin. Pediatr Neurobiol 1994; 42: 393-441. 1996; 8: 543-8. 30. Frederickson CJ, Bush AI. Synaptically released zinc: 9. Bialer M, Johannessen SI, Kupferberg HJ, et al. Progres report Physiological functions and pathological effects. BioMetals on new antiepileptic drugs: a summary of the fourth Eilat 2001; 14: 353-66. conference. Epilepsy Res 1999; 34: 1-41. 31. Danscher G, Juhl S, Stoltenberg M, Krunderup B, Schroder HD, 10. Rigoulot MA, Boehrer A, Nehlig A. Effects of topiramate in Andreasen A. Autometallographic silver enhancement of zinc two models of genetically determined generalized epilepsy, the sulfide crystals created in cryostat sections from human brain GAERS and the audiogenic Wistar AS. Epilepsia 2003; 44(1): biopsies: a new technique that makes it feasible to demonstrate 14-9. zinc ions in tissue sections from biopsies and early autopsy 11. Niebauer M, Grunthal M. Topiramate reduces neuronal injury material. J. Histochem. Cytochem1997; 45: 1503-10. after experimental status epilepticus. Brain Research 1999; 837: 32. Sensi SL, Yin HZ, Carriedo SG, Rao SS, Weiss JH. Preferential 263-9. Zn2+ influx through Ca2+-permeable AMPA/Kainate channels 12. Borowicz KK, Luszczki JJ, Duda AM, Czuczwar SJ. Effect of triggers prolonged mitochondrial superoxide production. Proc. topiramate on the anticonvulsant activity of conventional Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999; 96: 2414-9. antiepileptic drugs in two models of experimental epilepsy. 33. Yin HZ, Weiss JH. Zn2+ permeates Ca2+ permeable Epilepsia 2003; 44(5): 640-6. AMPA/Kainate channels and triggers selective neural injury. 13. Fisher A, Wang X, Cock HR, Thom M, Patsalos PN, Walker NeuroReport 1995; 6: 2553-6. MC. Synergism between topiramate and budipine in refractory 34. Yin HZ, Ha DH, Carriedo SG, Weiss JH. Kainate-stimulated status epilepticus in the rat. Epilepsia 2004; 45(11): 1300-7. Zn2+ uptake labels cortical neurons with Ca2+-permeable 14. Koh S, Jensen FE. Topiramate blocks perinatal hypoxia- AMPA/Kainate channels. Brain Res 1998; 781: 45-55. induced seizures in rat pups. Ann. Neurol 2001; 50: 366-72. 35. Lee JY, Park J, Kim YH, Kim DH, Kim CG, Koh JY. Induction 15. Kaminski RM, Banerjee M, Rogawski MA. Topiramate by synaptic zinc of heat shock protein-70 in hippocampus after selectively protects against seizures induced by ATPA, a GluR5 kainate seizures. Exp. Neurol 2000; 161: 433-41. kainate receptor agonist. Neuropharmacology2004; 46: 1097- 1104. 50 Pilocarpin Epilepsisinde Topiramat 36. Suh SW, Chen JW, Motamedi M, Bell B, Listiak K, Pons NF, 45. Frederickson CJ, Kasarakis EJ, Ringo D, Frederickson RE. A et al. Evidence that synaptically-released zinc contributes to quinoline fluorescence method for visualizing and assaying the neuronal injury after traumatic brain injury. Brain Research histochemically reactive zinc (bouton zinc) in the brain. J. 2000; 852: 268-73. Neurosci. Methods 1987; 20(2): 91-103. 37. Gibbs JW, Shumate MD, Coulter DA. Differential epilepsy- 46. Rigoulot KE, Ferrandon A, Nehlig A. Neuroprotective associated alterations in postsynaptic GABAA receptor function properties of topiramate in the lithium-pilocarpine model of in dentate granule and CA1 neurons. J. Neurophysiol1997; 77: epilepsy. The Journal of Pharmacology and Experimental 1924-38. Therapeutics 2004; 308(2): 787-95. 38. Molnar P, Nadler JV. Synaptically-released zinc inhibits N- 47. Placidi F,Tombini M, Romigi A, Bianchi L, Izzi F, Sperli F, et metyl- D- aspartate receptor activation at recurrent mossy fiber al. Topiramate: effect of EEG interictal abnormalities and synapses. Brain Research 2001; 910: 205-7. background activity in patienets affected by focal epilepsy. 39. Ben-Ari Y. Cell death and synaptic reorganizations produced Epilepsy Research 2004; 58; 43-52. by seizures. Epilepsia 2001; 42(Suppl-3): 5-7. 48. Standstead HH, Frederickson CJ, Penland JG. History of zinc 40. Frederickson CJ, Hernandez MD, McGinty JF. Translocation of as related to brain function. J. Nutr 2000; 130: 496-502. zinc may contribute to seizure-induced death of neurons. Brain 49. Suh SW, Listiack K, Bell B, Chen J, Motamedi M, Silva D, et Research 1989; 480(1-2): 317-21. al. Detection of pathological zinc accumulation in neurons: 41. Noyan B, Jensen MS, Danscher G. The lack of effects of zinc methods for autopsy, biopsy, and cultured tissue. J. Histochem. and nitric oxide in initial state of pilocarpine-induced seizures. Cytochem 1999; 47: 969-72. European Journal of Epilepsy 2007; 16(5):410-6. 50. Noyan B. Temporal Lob Epilepsi’sinde L-Arginine ve 42. Tonder N, Johansen FF, Frederickson CJ, Zimmer J, Diemer CaEDTA’nın Etkileri. Uludağ Üniv. Tıp Fak. Dergisi 31(1): NH. Possible role of zinc in the selective degeneration of 15-9, 2005. dentate hilar neurons after cerebral ischemia in the adult rat. Neurosci. Lett 1990; 109: 247-52. 43. Koh JH, Suh SW, Gwag BJ, He YY, Hsu CY, Choi DW. The Teşekkür role of zinc in selective neuronal death after transient global cerebral ischemia. Science 1996; 272: 1013-6. 44. Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical Bu çalışma TUBİTAK tarafından (Proje No:SBAG- stimulation. II: motor seizure. Electroencephalogr. Clin. HD-117, 106S012) desteklenmiştir. Neurophysiol 1972; 32: 281-94. 51