NAR KABUĞU EKSTRAKTININ M İKROALG ÜZERİNE ENKAPSÜLE EDİLMESİNİ N ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞT IRILMASI NURAY YAĞMU R i T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ NAR KABUĞU EKSTRAKTININ MİKROALG ÜZERİNE ENKAPSÜLE EDİLMESİNİN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Nuray YAĞMUR 0000-0001-7559-3320 Prof. Dr. Saliha ŞAHİN (Danışman) DOKTORA TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI BURSA – 2022 Her Hakkı Saklıdır ii TEZ ONAYI Nuray YAĞMUR tarafından hazırlanan “NAR KABUĞU EKSTRAKTININ MİKROALG ÜZERİNE ENKAPSÜLE EDİLMESİNİN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı’nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Başkan : Prof. Dr. Aysun TÜRKMEN İmza 0000-0001-7461-4038 Giresun Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Saliha ŞAHİN İmza 0000-0003-2887-5688 Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Lütfiye Yılmaz ERSAN İmza 0000-0001-9588-6200 Uludağ Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Saliha Esin ÇELİK İmza 0000-0003-3527-5349 İstanbul Üniversitesi-Cerrahpaşa, Mühendislik Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Önder AYBASTIER İmza 0000-0002-0380-1992 Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Hüseyin Aksel EREN Enstitü Müdürü ../../2022 iii B.U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; − tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, − görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, − başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, − atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, − kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, − ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. …/…/2022 Nuray YAĞMUR iv TEZ YAYINLANMA FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezin/raporun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kâğıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma izni Bursa Uludağ Üniversitesi’ne aittir. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet hakları ile tezin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları tarafımıza ait olacaktır. Tezde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanılması zorunlu metinlerin yazılı izin alınarak kullandığını ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederiz. Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” kapsamında, yönerge tarafından belirtilen kısıtlamalar olmadığı takdirde tezin YÖK Ulusal Tez Merkezi / B.U.Ü. Kütüphanesi Açık Erişim Sistemi ve üye olunan diğer veri tabanlarının (Proquest veri tabanı gibi) erişimine açılması uygundur. Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Nuray YAĞMUR Tarih Tarih İmza İmza Bu bölüme kişinin kendi el yazısı ile okudum Bu bölüme kişinin kendi el yazısı ile okudum anladım yazmalı ve imzalanmalıdır. anladım yazmalı ve imzalanmalıdır. v ÖZET Doktora Tezi NAR KABUĞU EKSTRAKTININ MİKROALG ÜZERİNE ENKAPSÜLE EDİLMESİNİN ANALİTİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI Nuray YAĞMUR Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Tez çalışmamızda doğal kaynaklı nar kabuğunda bulunan antioksidan maddeler ekstrakte edildikten sonra, ekstraktların antioksidan özellikleri belirlenmiştir. Yapılan kromatografik analiz çalışmalarına göre ekstraktta ellagik asit, punikalin, punikalagin ve p-kumarik asit tayin edilmiştir. Daha sonra Spirulina yüzeyine nar kabuğu ekstraktının maksimum verimle mikroenkapsülasyonu için Box-Behnken tasarımı (BBD) ile birleştirilmiş yanıt yüzeyi yöntemi (RSM) uygulanmış ve enkapsülasyon başarıyla gerçekleştirilmiştir. Optimizasyon sonucunda sıcaklık 29°C, enkapsülasyon süresi 35 dk ve ekstrakt/mikroalg oranı 2,93 mL/g olarak belirlenmiştir. Nar kabuğu-mikroalg çiftinin yapısal tayinleri FT-IR, DSC ve SEM cihazları kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen nar kabuğu-mikroalg çiftinin in-vitro gastrointestinal koşullarda mide ve bağırsak ortamında ellagik asit salınımı incelenmiştir. Nar kabuğu ekstraktı, nar kabuğu-mikroalg çiftinin ve mikroalgin direkt eklenerek üretildiği 6 farklı yoğurt örneği fizikokimyasal, mikrobiyolojik, spektroskopik ve duyusal/tekstür özellikleri bakımından değerlendirilmiştir. Spirulina mikroalginin yoğurda eklenmesiyle protein seviyesinin daha da arttığı gözlemlenmiş, dolayısıyla tüketiminde insan sağlığı açısından fayda sağlayacağı düşünülmüştür. Aynı zamanda yüksek antioksidan özelliği ile katıldığı yoğurda antioksidan özellik de kazandırmıştır. Protein dışındaki değerli besin öğelerini içermesi ve doğal kaynaklı olması nedeniyle fonksiyonelliği artırılmış doğal bir ürün elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Enkapsülasyon, yoğurt, antioksidan madde, mikroalg, nar kabuğu 2022, xv + 144 sayfa. vi ABSTRACT PhD Thesis THE EVALUATION OF ENCAPSULATION POMEGRANATE PEEL EXTRACT ONTO MICROALGAE BY ANALYTICAL METHODS Nuray YAĞMUR Bursa Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN In this thesis study, after extracting the antioxidant substances found in the naturally sourced pomegranate peel, the antioxidant properties of the extracts were determined. According to the chromatographic analysis studies, ellagic acid, punicalin, punicalagin and p-coumaric acid were determined in the extract. Then, the response surface methodology (RSM) combined with the Box-Behnken design (BBD) was applied to the Spirulina surface for microencapsulation of the pomegranate peel extract with maximum efficiency and the encapsulation was successfully carried out. As a result of the optimization, the temperature was 29°C, the encapsulation time was 35 min and the extract/microalgae ratio was determined as 2.93 mL/g. Structural determinations of the pomegranate peel-microalgae pair were made using FT-IR, DSC and SEM devices. The release of ellagic acid in the stomach and intestinal environment of the obtained pomegranate peel-microalgae pair was investigated in-vitro gastrointestinal conditions. Pomegranate peel extract was evaluated in terms of physicochemical, microbiological, spectroscopic and sensory/texture properties of pomegranate peel-microalgae pair and 6 different yoghurt samples produced by adding microalgae directly. It was observed that the protein level increased with the addition of Spirulina microalgae to yoghurt, and it was thought that its consumption would be beneficial for human health. At the same time, it added antioxidant properties to yoghurt with its high antioxidant properties. Due to the fact that it contains valuable nutrients other than protein and is of natural origin, a natural product with increased functionality has been obtained. Key words: Encapsulation, yoghurt, antioxidant, microalgae, pomegranate peel 2022, xv + 144 pages. vii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR Tez çalışmasında, doğal kaynaklı antioksidan özelliği olan Spirulina mikroalginin üzerine nar kabuğu ekstraktı enkapsüle edilmiş, elde edilen mikroalg-antioksidan çifti yoğurt üretim prosesinde ortama eklenmiştir. Çalışmalar hem Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü Kromatografi Araştırma Laboratuvarı hem de Bursa Gıda ve Yem Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü’nde sürdürülmüştür. Tezimin ve akademik kariyer projemin her aşamasında bilgisini, tecrübesini, desteğini esirgemeyen, yoluma ışık tutan, ‘Danışman’ kavramının her niteliğini bünyesinde layığıyla taşıyan, sabırla ilerlediğimiz bu yolda bana daima güç ve cesaret veren, öğrencisi olduğum için onur ve gurur duyduğum, çok kıymetli canım danışman hocam Prof. Dr. Saliha ŞAHİN’e özel şükran ve teşekkürlerimi sunarım. Analizlerim sırasında ve sonrasında yorumlamada bilgilerini ve desteklerini paylaşan, tezimin gelişmesinde bilimsel anlamda beni hazırlayan ve yetiştiren değerli Tez İzleme Komitesi hocalarım Prof. Dr. Lütfiye YILMAZ ERSAN ve Doç. Dr. Saliha Esin ÇELİK’e teşekkürlerimi sunarım. Deneysel çalışmamın her aşamasında büyük emeği geçen ve yakın desteğini gördüğüm canım arkadaşım Yüksek Kimyager Büşra KARKAR’a ve değerli hocam Doç. Dr. Önder AYBASTIER’e teşekkürlerimi sunarım. Yoğurt üretiminde kullandığım starter kültür bakterileri suşlarımın temininde yardımlarını esirgemeyen, değerli katkıları için Chr. Hansen’s Laboratorium Denmark A/S’nin İstanbul’daki temsilcisi Peyma Sanayi A.Ş.’ye teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmasında TAGEM/HSGYAD/A/19/A3/P1/938 proje no’su ile desteklerini sunan Tarım ve Orman Bakanlığı Tarımsal Araştırmalar ve Politikalar Genel Müdürlüğü’ne teşekkürlerimi sunarım. Hayatım boyunca en zor anlarımda bana güç veren, maddi ve manevi destekleriyle daima yanımda hissettiren kıymetlilerim biricik annem Emine AKGÜN ve babam Yunis AKGÜN’e, kızkardeşten öte olan hayattaki danışmanım canım ablam Fatma KAYAHAN’a, hayatına dahil olduğum andan itibaren hayatımın en büyük destekçisi olmuş, yoğun çalışma ortamıma uyum sağlayıp her anımda beni yalnız bırakmayan canımın içi eşim Burak YAĞMUR’a ve değerli ailesine, tez çalışmalarımın tam ortasında dünyamın merkezine oturan, hayatıma renk katmış, pozitif enerjimi ve gücümü kendisinden aldığım biricik oğlum Yekta YAĞMUR’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım, iyi ki benimlesiniz.. Nuray YAĞMUR 05/07/2022 viii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ............................................................................................................................... vi ABSTRACT .................................................................................................................... vii ÖNSÖZ ve TEŞEKKÜR ................................................................................................ viii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ...................................................................... xi ŞEKİLLER DİZİNİ ........................................................................................................ xiii ÇİZELGELER DİZİNİ .................................................................................................. xiv 1. GİRİŞ ..................................................................................................................... 1 2. KURAMSAL TEMELLER .......................................................................................... 4 2.1. Algler ..................................................................................................................... 4 2. 2. Mikroalgler ................................................................................................................ 6 2. 3. Spirulina .................................................................................................................... 6 2. 4. Antioksidan Maddeler ............................................................................................... 9 2. 5. Nar (Punica granatum L. ) ...................................................................................... 10 2. 6. Enkapsülasyon ........................................................................................................ 14 2. 7. Enkapsülasyon Yönteminin Gıda Endüstrisinde Kullanımı ................................... 19 2.8. Yoğurt ................................................................................................................... 21 3. MATERYAL ve YÖNTEM ........................................................................................ 25 3.1. Materyal ................................................................................................................... 25 3.1.1. Spirulina mikroalgi ............................................................................................... 25 3.1.2. Nar meyvesi .......................................................................................................... 25 3.1.3. Çiğ süt ................................................................................................................... 25 3.1.4. Süt tozu ................................................................................................................. 25 3.1.5. Starter kültür.......................................................................................................... 25 3.1.6. Cihazlar ................................................................................................................. 26 3.1.7. Kimyasallar ........................................................................................................... 28 3.1.8. Sarf malzemeler .................................................................................................... 29 3.1.9. Çözeltiler ............................................................................................................... 30 3.2. Yöntem ................................................................................................................... 34 3.2.1. Spirulina mikroalgi ile yapılan çalışmalar ............................................................ 35 3.2.2. Nar kabuğu ekstraktının hazırlanması ve analizi .................................................. 36 3.2.3. Enkapsülasyon çalışmaları .................................................................................... 40 3.2.4. FT-IR, DSC ve SEM analizleri çalışmaları........................................................... 42 3.2.5. Adsorpsiyon izoterm çalışmaları .......................................................................... 43 3.2.6. Fotokimyasal kararlılık çalışmaları ....................................................................... 43 3.2.7. Optimizasyon çalışmaları ...................................................................................... 44 3.2.8. Simüle edilen gastrointestinal koşullar altında kontrollü salınım çalışmaları ...... 47 3.2.9. Yoğurt üretimi ....................................................................................................... 49 3.2.10. Fizikokimyasal, Mikrobiyolojik, Spektroskopik, Duyusal/Tekstür ve İstatistiksel Analizler ................................................................................................................... 53 4. BULGULAR ve TARTIŞMA ..................................................................................... 63 4.1. Spirulina Mikroalgi ile Yapılan Çalışmalar ............................................................. 63 4.2. Nar Kabuğu Ekstraktlarının Analizi......................................................................... 64 4.3. Enkapsülasyon Çalışmaları ...................................................................................... 69 4.4. FT-IR, DSC ve SEM Analizleri Çalışmaları ........................................................... 70 4.5. Adsorpsiyon İzoterm Çalışmaları ............................................................................ 75 4.6. Fotokimyasal Kararlılık Çalışmaları ........................................................................ 77 ix 4.7. Optimizasyon Çalışmaları ........................................................................................ 78 4.8. Simüle Edilen Gastrointestinal Koşullar Altında Kontrollü Salınım Çalışmaları ... 82 4.9. Yoğurt Üretimi ......................................................................................................... 86 4.10. Fizikokimyasal, Mikrobiyolojik, Spektroskopik, Duyusal/Tekstür ve İstatistiksel Analizler ................................................................................................................... 87 5. SONUÇ ................................................................................................................. 131 KAYNAKLAR ............................................................................................................. 134 ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................. 144 x SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama ssp Alt tür dk Dakika cm-1 Dalga sayısı g Gram h/h Hacim/Hacim kg Kilogram kV Kilovolt F Kjeldahl Protein Dönüşüm Faktörü kob Koloni Oluşturan Birim L Litre qm Maksimum Adsorpsiyon Kapasitesi μg Mikrogram μL Mikrolitre μm Mikrometre mg Miligram mL Mililitre mm Milimetre mM Milimolar ppm Milyonda bir M Molarite n Örnek Sayısı R2 Korelasyon Katsayısı Rpm Dakikadaki devir sayısı Kısaltmalar Açıklama ABD Amerikan Birleşik Devletleri A.Ş. Anonim Şirketi AQ Aqua Ar-Ge Araştırma Geliştirme ABTS 2,2’-Azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) BSAE Sığır Serum Albumin Eşdeğeri BHA Butillenmiş Hidroksi Anisol BHT Butillenmiş Hidroksi Toluen MRS De Man, Rogosa ve Sharpe DPPH 2,2-Difenil-1-pikrilhidrazil DSC Diferansiyel Taramalı Kalorimetri FT-IR Fourier Dönüşümlü Kızılötesi GAE Gallik Asit Eşdeğeri GC Gaz Kromatografisi HPLC- DAD Yüksek Perfomanslı Sıvı Kromatografisi-Diod Serili Dedektör EE Kapsülleme Etkinliği xi EY Kapsülleme Verimliliği LA Laktik Asit L. bulgaricus Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus LC Sıvı Kromatografisi PVDF Poliviniliden diflorür PG Propil gallat AOAC Resmi Analitik Kimyagerler Derneği SGF Simüle Edilmiş Mide Sıvısı SIF Simüle Edilmiş Bağırsak Sıvısı Std. Sapma Standart Sapma S. thermophilus Streptococcus thermophilus SEM Taramalı Elektron Mikroskobu LOQ Tayin limiti LOD Tespit limiti UV/VIS Ultraviyole/Görünür bölge xii ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1.1. BHT ile serbest radikalin gerçekleştirdiği tepkime .......................................... 1 Şekil 1.2. Mikroenkapsül oluşumu ................................................................................... 3 Şekil 2.1. Makroalg (Spagetti Alg) ................................................................................... 5 Şekil 2.2. Mikroalg (Chlorella vulgaris) .......................................................................... 6 Şekil 2.3. Spirulina platensis ............................................................................................ 7 Şekil 2.4. Nar .................................................................................................................. 11 Şekil 2.5. Enkapsülasyonda aktif bileşenler (öz) ve enkapsülasyon matriksi (kabuk) ... 15 Şekil 2.6. Kapsülleme tipleri ........................................................................................... 17 Şekil 3.1. Nar kabuğu ekstraksiyonu işlem basamakları ................................................ 37 Şekil 3.2. Yoğurt üretim prosesi işlem basamakları ....................................................... 51 Şekil 3.3. Üretilen 6 farklı yoğurt örneği ........................................................................ 53 Şekil 3.4. Duyusal muayene form örneği ........................................................................ 62 Şekil 4.1. Spirulina hidroalkolik ekstraktının HPLC kromatogramı (450 nm)............... 64 Şekil 4.2. Nar kabuğu hidroalkolik ekstraktının HPLC kromatogramı (360 nm) ........... 65 Şekil 4.3. Nar kabuğu sulu ekstraktının HPLC kromatogramı (360 nm)........................ 65 Şekil 4.4. Nar kabuğu hidroalkolik ekstraktının HPLC kromatogramı (280 nm) ........... 66 Şekil 4.5. Nar kabuğu sulu ekstraktının HPLC kromatogramı (280 nm)........................ 67 Şekil 4.6. 2., 4. ve 6. saat aralıklarında tutunma yüzdesi (%) grafiği ............................ 69 Şekil 4.7. FTIR spektrumları ........................................................................................... 71 Şekil 4.8. Ellagik asit, yüklü ve yüklü olmayan Spirulina’ların DSC termogramları .... 72 Şekil 4.9. Yüklü ve yüklü olmayan Spirulina’ların yüzeylerinin SEM görüntüleri ....... 74 Şekil 4.10. Adsorpsiyon izotermi grafikleri .................................................................... 76 Şekil 4.10. Adsorpsiyon izotermi grafikleri (devam)...................................................... 77 Şekil 4.11. Enkapsüle edilen antioksidan maddenin fotokimyasal kararlılığı ................ 78 Şekil 4.12. Yanıt yüzeyi grafikleri. ................................................................................. 81 Şekil 4.12. Enkapsüllenen ellagik asidin in vitro sindirimde salınımı ............................ 84 Şekil 4.13. Renk ölçümü sonuçlarının değerlendirmesinde kullanılan renk skalası ..... 118 Şekil 4.14. Üretilen yoğurtların satın alma niyeti ......................................................... 130 xiii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Enkapsülasyon teknikleri ............................................................................ 15 Çizelge 3.1. Cihazların özellikleri ve kullanım amaçları ................................................ 26 Çizelge 3.1. Cihazların özellikleri ve kullanım amaçları (devam) .................................. 27 Çizelge 3.2. Kimyasallar ................................................................................................. 28 Çizelge 3.2. Kimyasallar (devam) ................................................................................... 29 Çizelge 3.3. Sarf malzemeler .......................................................................................... 29 Çizelge 3.3. Sarf malzemeler (devam) ............................................................................ 30 Çizelge 3.4. Çalışma metodolojisi .................................................................................. 34 Çizelge 3.5. Enkapsülasyon işlemine ilişkin deneme deseni .......................................... 41 Çizelge 3.6. BBD’de kullanılan bağımsız değişkenler ve aralıkları ............................... 45 Çizelge 3.7. BBD’de enkapsülasyon için tasarlanan deney tablosu ............................... 46 Çizelge 3.8.Yoğurt üretimine ilişkin deneme deseni ...................................................... 50 Çizelge 3.9. Fizikokimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal/tekstür analizlerin listesi ....... 54 Çizelge 3.10. Yoğurtlarda yapılan analizlere ait deneme deseni .................................... 57 Çizelge 4.1. Spirulina mikroalginin toplam protein miktarı tayini ................................. 63 Çizelge 4.2. Karotenoidlerin HPLC-DAD analiz koşulları ............................................ 64 Çizelge 4.3. Nar kabuğu ekstraktlarında bulunan ellagik asit miktarı ............................ 66 Çizelge 4.4. Kalibrasyon grafikleri ................................................................................. 67 Çizelge 4.5. Nar kabuğu ekstraktlarında bulunan fenolikler .......................................... 68 Çizelge 4.6. Geri kazanım çalışmaları (n=3) .................................................................. 68 Çizelge 4.7. Antioksidan kapasite ve toplam fenolik madde tayin sonuçları ................. 69 Çizelge 4.8. Langmuir ve Freundlich izoterm model parametreleri ............................... 75 Çizelge 4.9. Ellagik asidin mikroalg-nar kabuğu ekstraktlarındaki kararlılığı ............... 78 Çizelge 4.10. Box-Behnken tasarımı .............................................................................. 79 Çizelge 4.11. Enkapsülasyon optimizasyonu için ANOVA analizi ................................ 80 Çizelge 4.12. Yoğurtların üretim aşamasındaki inkübasyon süreleri ............................. 86 Çizelge 4.13. Çiğ sütün fiziksel ve kimyasal özellikleri ................................................. 87 Çizelge 4.14. Yağsız süt tozunun bazı özellikleri ........................................................... 88 Çizelge 4.15. Yoğurtlarda yapılan fizikokimyasal analizlerin sonuçları ........................ 89 Çizelge 4.16. Yoğurtların % kuru madde değerleri değişimi.......................................... 90 Çizelge 4.17. Yoğurtların % yağ değerleri değişimi ....................................................... 91 Çizelge 4.18. Yoğurtların % süt yağsız kuru madde değerleri değişimi ......................... 91 Çizelge 4.19. Yoğurtların pH değerleri değişimi ............................................................ 92 Çizelge 4.20. Yoğurtların % LA titre edilebilir asitlik değerleri değişimi...................... 93 Çizelge 4.21. Yoğurtların % kül değerleri değişimi ....................................................... 94 Çizelge 4.22. Yoğurtların % toplam protein değerleri değişimi ..................................... 95 Çizelge 4.23. Yoğurtların % laktoz değerleri değişimi ................................................... 96 Çizelge 4.24. Fizikokimyasal özelliklerin istatistik analizi ............................................ 97 Çizelge 4.25. Yoğurtlarda yapılan mikrobiyolojik analizlerin sonuçları ........................ 98 Çizelge 4.26. Yoğurtların laktik asit bakterileri sayıları değişimi .................................. 99 Çizelge 4.27. Laktik asit bakterileri sayılarının istatistik analizi .................................... 99 Çizelge 4.28. Yoğurtların serum ayrılması değerleri değişimi ..................................... 101 Çizelge 4.29. Serum ayrılması değerlerinin istatistik analizi ........................................ 101 Çizelge 4.30. Yoğurtlarda yapılan spektroskopik analizlerin sonuçları ....................... 103 Çizelge 4.31. Yoğurtların spektroskopik analiz değerleri değişimi .............................. 105 Çizelge 4.32. Spektroskopik analiz değerlerinin istatistik analizi ................................ 106 xiv Çizelge 4.33. Yoğurtlarda yapılan organik asit analizlerinin sonuçları ........................ 107 Çizelge 4.34. Yoğurtların laktik asit değerleri değişimi ............................................... 108 Çizelge 4.35. Yoğurtların sitrik asit değerleri değişimi ................................................ 108 Çizelge 4.36. Yoğurtların ürik asit değerleri değişimi .................................................. 109 Çizelge 4.37. Organik asit değerlerinin istatistik analizi .............................................. 110 Çizelge 4.38. Yoğurtlarda yapılan uçucu organik bileşen analizinin sonuçları ............ 111 Çizelge 4.39. Yoğurtların uçucu organik bileşen değerleri değişimi ............................ 112 Çizelge 4.40. Uçucu organik bileşen değerlerinin istatistik analizi .............................. 113 Çizelge 4.41. Yoğurtlarda yapılan tekstür profil analizlerinin sonuçları ...................... 114 Çizelge 4.42. Yoğurtların sıkılık değerleri değişimi ..................................................... 115 Çizelge 4.43. Yoğurtların kıvam değerleri değişimi ..................................................... 115 Çizelge 4.44. Yoğurtların iç yapışkanlık değerleri değişimi ......................................... 116 Çizelge 4.45. Yoğurtların viskozite değerleri değişimi ................................................ 116 Çizelge 4.46. Tekstür profil analiz parametre değerlerinin istatistik analizi ................ 117 Çizelge 4.47. Yoğurtlarda yapılan renk ölçümü sonuçları ............................................ 119 Çizelge 4.48. Yoğurtların L değerleri değişimi ............................................................ 120 Çizelge 4.49. Yoğurtların a değerleri değişimi ............................................................. 120 Çizelge 4.50. Yoğurtların b değerleri değişimi ............................................................. 121 Çizelge 4.51. Renk ölçümü değerlerinin istatistik analizi ............................................. 122 Çizelge 4.52. Yoğurtların duyusal muayene testi sonuçları .......................................... 124 Çizelge 4.53. Yoğurtların renk değerleri değişimi ........................................................ 125 Çizelge 4.54. Yoğurtların görünüş değerleri değişimi .................................................. 125 Çizelge 4.55. Yoğurtların kıvam (kaşıkta) değerleri değişimi ...................................... 126 Çizelge 4.56. Yoğurtların kıvam (ağızda) değerleri değişimi ....................................... 126 Çizelge 4.57. Yoğurtların koku değerleri değişimi ....................................................... 127 Çizelge 4.58. Yoğurtların tat değerleri değişimi ........................................................... 127 Çizelge 4.59. Yoğurtların duyusal asitlik değerleri değişimi ........................................ 128 Çizelge 4.60. Yoğurtların genel kabul edilebilirlik değerleri değişimi ......................... 128 Çizelge 4.61. Duyusal muayene test parametreleri değerlerinin istatistik analizi ........ 129 xv 1. GİRİŞ Antioksidanlar; oksidasyonu engelleyici veya azaltıcı, aynı zamanda dokularda oluşan serbest radikallerin zararlı etkilerini önleyici ve koruyucu maddeler olarak bilinirler. Gıdalarda katkı maddesi olarak kullanılmakta olup, dahil oldukları gıdaların raf ömürlerini uzatırlar. Günümüzde gıda ürünlerine eklenen doğal katkı maddelerinin yerini çok çeşitli sentetik ve kimyasal antioksidanlar (BHA, BHT, PG vb.) almaktadır. Ülkemizde gıda sektöründe bu sentetik, kimyasal katkı maddeleri gıdaların raf ömrünü uzatmak, oksidasyon ve acıma gibi bozulma reaksiyonlarını önlemek için kullanılmaktadır. Aşağıdaki şekilde görüldüğü gibi, serbest radikallerle girdikleri reaksiyonlar sonucu oksidasyon reaksiyonlarını engeller (Şekil 1.1). BHT BHT Radikal Şekil 1.1. BHT ile serbest radikalin gerçekleştirdiği tepkime https://iverson.cm.utexas.edu/courses/310N/MOTD%20Fl05/MOTDfl03/BHT.html: Erişim tarihi: 01.06.2019 Bu ve benzeri sentetik ve kimyasal antioksidanların dahil edildikleri gıdalarda, koruyucu etkilerinin yanı sıra insan sağlığı üzerinde toksik etkileri de bulunmaktadır. Örneğin, BHT (Bütil hidroksi toluen), çevresel koşullara bağlı olarak toksik özellikler sergilemekte ve doğrudan ciltle temasında vücutta akciğer dokusuna nüfuz etmektedir (Toxicology, 2002). 1 Bu nedenle BHT gibi antioksidanların kullanımı insan sağlığı için büyük tehlike arz etmektedir. Bu maddeler gıdaların doğal özelliklerini kaybetmelerine neden olduğundan kullanımları sakıncalı ve yasaktır. Fonksiyonel grupları (antioksidanlar, koruyucular, renklendiriciler, tatlandırıcılar vb.) tanımlanmış olan gıda katkı maddelerinin doğal kaynaklardan üretimi, gıda güvenliği açısından öncelik verilmesi gereken ve hedeflenen Ar-Ge konularındandır. Dolayısıyla, gıda ürünlerinde antioksidan koruyucu olarak doğal ürünlerin kullanılması son derece önemlidir. Literatürdeki son çalışmalarda bitkiler (tahıllar, yağlı tohumlar, meyveler, sebzeler, baharatlar ve çaylar), hayvansal ürünler (amino asitler, peptidler ve karotenoidler), enzimler (katalaz, süperoksit dismutaz ve glutatyon peroksidaz) ve bazı mikroorganizmalar doğal antioksidanlar olarak kullanılmaktadır. Birçok rapor, bu tür doğal antioksidanların bazen sentetik antioksidanlardan daha etkili olduğunu belirtmiştir. Günümüzde yüksek protein içeriğine sahip, yağda ve suda çözünen lifleri olan ve zengin mineralli mikroalgler gıda olarak tüketimdedir. Fenoller, flavonoidler ve tanenler gibi fenolik bileşenler içerdiklerinden, antioksidan etkiye sahiptirler. Son zamanlarda popülerlik kazanan algler, gıda alanında rahatlıkla kullanılabilmektedir. Bu tez kapsamında en önemli alglerden biri olan ve besin değeri yüksek doğal bir antioksidan kaynağı Spirulina mikroalgi kullanılmıştır. "Süper besin" olarak da tanınan Spirulina, bir tür siyanobakteridir. Gıdalarda antioksidan koruyucu olarak doğal ürünlerin kullanılması son derece önemlidir. Tez çalışmasında kullanılan bir diğer doğal ürün ise nar kabuğudur. Nar; içerdiği flavonoidler, polifenoller, antosiyaninler, tanenler, punikalagin ve punikalin gibi yüksek antioksidan özelliklere sahip fenolik bileşikler nedeniyle son yıllarda en çok çalışılan değerli meyvelerden biri haline gelmiştir. Özellikle narın kabuğunun besin içeriği, suyuna oranla daha fazladır ve ekstraktlarının gösterdiği antioksidan, anti- kanser, antibakteriyel ve anti-inflamatuar etkilere ait bilgiler literatürde yer almaktadır. 2 Tez çalışmasında doğal kaynaklı antioksidan özellikte mikroalg üzerine başka bir antioksidan madde tutturulmuş ve mikroalg-antioksidan madde çifti elde edilmiştir. Dolayısıyla antioksidan özelliğin ve mikroalg üzerinde enkapsüle edilen antioksidan maddenin zamana bağlı kullanım ömrünün artırılması hedeflenmektedir. Bu nedenle mikroenkapsülasyon yöntemi tez çalışmasında önemli bir rol oynamaktadır (Şekil 1.2). Şekil 1.2. Mikroenkapsül oluşumu https://mivegida.com/bilgi-merkezi/enkapsulasyon- teknolojisi/: Erişim tarihi: 01.06.2019 Avantajlı bir uygulama yöntemi olan mikroenkapsülasyon, son zamanlarda gıda üreticilerinin dikkatini çekmektedir. Alglerle doğal antioksidan maddelerin immobilizasyonu da yaygın olarak kullanımdadır. Bu tez çalışmasında hassas olan içeriğinin oksijen, ışık, asit, alkali gibi dış etmenlere karşı korunması amacıyla nar kabuğu ekstraktlarının Spirulina mikroalgi yüzeyine mikroenkapsülasyonu (tutturma) gerçekleştirilmiştir. Burada kaplama materyali olarak mikroalg, aktif bileşen olarak da iki farklı ortamda elde edilmiş nar kabuğu ekstraktları kullanılmıştır. Daha sonra elde edilen mikroenkapsüllerin gıda ürünlerinde doğal kaynaklı antioksidan madde olarak kullanılabilirliği yoğurt üzerinde denenmiştir. Yoğurt üretim prosesinde ortama eklenen mikroalg-antioksidan çiftinin, yoğurt depolama koşullarındaki etkisi ve koruyucu madde olarak kullanılabilirliği incelenmiştir. Elde edilen yoğurdun antioksidan özelliğinin artırılması, besin kalitesinin ve fonksiyonelliğinin iyileştirilmesi tez çalışması hedefleri arasındadır. Elde edilen sonuçlar ile doğal antioksidanların sentetik antioksidan maddelere alternatif olarak gıdalarda kullanımı araştırılmıştır. 3 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1. Algler Latince’de "su yosunu" anlamına gelen algler, deniz ekosisteminde en önemli canlı kaynaklarından olup fotosentez ile ilk üretimi gerçekleştiren primer üretici canlılardır ve besin zincirinin önemli bir parçasını oluştururlar. Alglerden günümüzde gıda, tarım, kozmetik, tıp, eczacılık, biyoteknoloji, enerji, kimya ve endüstri dallarında yararlanılmaktadır. Fotosentetik karbon üretimine büyük katkı sağlayan algler, güneşte veya yapay kurutucularda kurutulduktan sonra gıda olarak da tüketilebilmektedir (Özdemir ve Erkmen, 2013). Çeşitli salataları, yemekleri, çorbaları, sosları ve çayları hazırlanabilmektedir (Oğur, 2016). Çin, Japonya ve Kore’de birkaç yüzyıl önce başlayan bu akım, şimdilerde diğer ülkelere de yayılmıştır. Özellikle diyet ürünü olarak daha çok kabul görmüştür. Alglerin içeriğinde asit, amin, enzim, alkaloit, selüloz, glikozit, iz elementler (Al, B, Ca, Co, Cr, F, Fe, Ga, K, Mg, Mn, Na, Ni, Zn) ve inorganik mineraller, lipitler, yağ asitleri, steroller, steroitler, fenolik bileşenler (antosiyanin, fenil propanoit, fenolik asit, flavonoit, kinon, kumarin, lignan, şikimat, şikimik asit, tanen), fitohormonlar (giberellin, öksin), protein, peptit, aminoasit, vitaminler (B1, B2, B12, C, E, H, K, folik asit, nikotinik asit, pantotenik asit), pigmentler ve uçucu bileşenler (akrilik, aldehit, alkol, asetik, butirik, fenol, formik, miristik, palmitik asit, terpenler) gibi çok değerli bileşenler bulunmaktadır (Brownlee ve diğerleri, 2005; Chapman ve Buchheim, 1992; McCourt, 1995). Bir diğer araştırmada; alglerde yağ asitleri, steroitler, karotenoitler, polisakkaritler, lektinler, mikosporin benzeri amino asitler, halojenli bileşikler, poliketitler ve toksinlerin varlığı vurgulanmıştır (Cardozo ve diğerleri, 2007). Alglerle ilgili yapılan çalışmalar antimikrobiyal, sitotoksik, antimutojenik, antikanser ve antitümöral etkilere sahip olduklarını göstermiştir. Ayrıca bünyelerindeki fenol, flavonoid ve tanen gibi fenolik yapıdaki bileşenler antioksidan aktivite ve serbest 4 radikal süpürücü etkiyi de desteklemektedir (Al-Saif ve diğerleri, 2014; Li ve diğerleri, 2007; Meenakshi ve diğerleri, 2011). Algler kendi aralarında yapısal olarak mikroalg (prokaryotik) ve makroalg (ökaryotik) olmak üzere iki büyük sınıfa ayrılırlar. Mikroalgler “Mavi-yeşil algler” (Cyanophyta) olarak anılırlar (Şekil 2.2). Makroalgler ise kamçı taşımalarına veya pigmentasyonlarına göre; Kahverengi algler (Phaeophyta), Kırmızı algler (Rhodophyta), Yeşil algler (Chlorophyta), Diyatomeler (Chrysophyta) ve Kamçılı algler (Flagelleta) olarak kendi içinde sınıflandırılmaktadır (Şekil 2.1). Gıda olarak daha çok makroalgler tüketilmektedir. Endüstriyel üretimde daha çok denizel makroalgler hammadde olarak kullanılmaktadır. Çünkü mikroalglerin üretiminde kontaminasyon riski ve hasatlarında zorluklar yaşanmaktadır (Özdemir ve Erkmen, 2013). Şekil 2.1. Makroalg (Spagetti Alg) https://www.atlasakvaryum.com/index.php?id=358: Erişim tarihi: 01.06.2019 5 Şekil 2.2. Mikroalg (Chlorella vulgaris) http://yua.gmp-factory.com/superfood/organic- powder/organic-chlorella-vulgaris-powder-protein.html: Erişim tarihi: 01.06.2019 2. 2. Mikroalgler Mikroalgler, doğal ortamlarının sıcaklık, pH, tuzluluk, ışık yoğunluğu, basınç gibi zorlu ve sert koşullarına uyum sağlayan mekanizmaları olan tek hücreli mikroorganizmalardır. Bu koşullara geniş bir alanda biyolojik olarak aktif sekonder metabolitleri sentezleyerek adapte olurlar (Markou ve Nerantzis, 2013). Çeşitli çalışmalar mikroalglerin içeriğindeki çoklu doymamış asitler, vitaminler, pigmentler, polifenoller, polisakaritler ve proteinlerden dolayı antioksidan (Herrero ve diğerleri, 2012), antiinflamatuar (Vázquez ve diğerleri, 2011) ve antimikrobiyal (Al-Saif ve diğerleri, 2014) özelliklerini vurgulamıştır. 2. 3. Spirulina Bilimsel adı Arthrospira platensis olan "mavi-yeşil alg" türü olarak bilinen Spirulina, spiral filamentöz yapısına sahip bir siyanobakteri cinsidir (Small, 2011). Mikroskobik spiraller şeklinde büyür. Bu spiraller birbirilerine yapışma eğiliminde olduğundan hasatı da kolay olur (Şekil 2.3). Koyu mavi-yeşil bir rengi vardır ve göreceli olarak da 6 yumuşak bir tada sahiptir. Hücre duvarı, sindirilemez selüloz yerine mukopolisakkaritlerden oluştuğu için, insan sindirim sistemi tarafından kolaylıkla parçalanır ve vücudun biyokimyasında hızla asimile olurlar (Belay ve diğerleri, 1993). Şekil 2.3. Spirulina platensis https://www.antioksidan.info/spirulina-detay/ganoderma- lucidum/spirulina/spirulina-detay: Erişim tarihi: 01.06.2019 Spirulina yaklaşık ağırlıkça %60-70 oranında protein ve %4 vitamin (özellikle A, B1, B2, B6, B12, D, E ve K) içeriğine sahip mikroskobik filamentli bir yosundur. Bunun dışında, mikro ve makro mineraller (Fe, Ca, P, Mg, Cr), çeşitli karotenoidler (karoten, klorofil, fikosiyanin, zeaksantin) ve polisakkaritleri de bünyesinde barındırır. Beyin fonksiyonu, üreme sağlığı, büyüme ve gelişme, deri ve saç büyümesi, kemik sağlığı ve metabolizma regülasyonunda önemli rol oynayan omega-6 yağ asidine de sahiptir. Bu yağ asidi en çok linoleik asit şeklinde tüketilir ve vücutta γ-linolenik aside dönüştürülürken, Spirulina bu yağ asidinin tam formunu içerir, etkili emilim ve güçlü etki sağlar. Spirulina ticari olarak üretilmekte ve dünya genelindeki gıda mağazalarında bir gıda takviyesi olarak satılmaktadır. Aynı zamanda diyet ürünü besin takviyesi, sakız, şeker veya diğer ambalajlı yiyeceklerde gıda boyası olarak günümüzde kullanımı vardır. 7 Günümüzde bilim insanları Spirulina’nın besleyici değerinin yanında olası terapötik etkilerini de araştırmaktadırlar. Birçok klinik araştırma, kolesterol ve kanserin azaltılması ile bağışıklık sisteminin güçlendirilmesi, bağırsaktaki yararlı bakterilerin artırılması, ağır metallerin ve ilaçların nefrotoksisitesinin azaltılması ve radyasyondan korunmaya kadar değişen çeşitli terapötik etkilere işaret etmektedir (Belay ve diğerleri, 1993). Yine yapılan çalışmalarda Spirulina mikroalginin; akut, subkronik ve kronik toksisite, üreme, mutajenite ve teratojenite için hayvan deneylerinde vücut veya organ toksisitesine neden olmadığı kanıtlanmıştır (Chamorro ve diğerleri, 1996). Spirulina biyokütlesinin, iz elementler içeren preparatların üretimi için uygun bir hammadde olduğunu göstermeyi amaçlayan bir çalışmada Spirulina, protein olarak oldukça zengin, uzun süredir yiyecek olarak kullanılmış, toksik olmayan, biyoteknolojik ve biyokimyasal olarak çok uygun dengeli bir nesne olarak betimlenmiştir. Hem ekim koşulları hem de besiyerinin bileşimi, biyokütlenin kullanım amacına bağlı olarak değişebilir. Belirli iz elementlerle zenginleştirilmiş biyokütle elde etmek için Spirulina hücrelerinin büyüme sürecinde metal biriktirme yetenekleri önem arz etmektedir. Hem kontrollü şartlar altında elde edilen Spirulina biyokütlesi hem de saflaştırılmış protein ekstraktları, eser elementli preparatların üretimi için iyi bir kaynaktır (Cepoi ve diğerleri, 2017). Spirulina sp’den ekstrakte edilen fikosiyaninin ekstrüzyon yöntemiyle aljinat/kitosan ile kaplandığı bir çalışmada ise kapsüllenmiş fikosiyanin sıcaklık ve pH değişikliklerinden etkilenmemiştir. Yapılan deneyler, aljinatın oranını değiştirerek gerçekleştirilmiştir. En yüksek enkapsülasyon verimi %2 aljinat, %2,5 CaCl2 içeren ve 1:1 fikosiyanin:aljinat oranı ile elde edilmiştir. Boyutu ve homojenliği açısından her bir mikrokapsül SEM/XRD ile değerlendirilmiştir (Suzery ve diğerleri, 2015). Dewi ve diğerleri (2017) yaptıkları çalışmada, dondurarak kurutma yöntemi sonucu maltodekstrin (M), κ-Karajenan (C) ve Na-aljinat (A) gibi farklı kaplama malzemeleri ile elde ettikleri Spirulina sp. fikosiyanin mikrokapsüllerinin (F) fiziksel özelliklerini araştırmışlardır. Mikrokapsüller, üç çeşit kaplama malzemesinin sırasıyla, ağırlıkça %10 (FM), %9:1 (FMA) ve %9:1 (FMC) oranları ile oluşturulmuştur. Sonuç olarak, %1 Na- 8 aljinat içeren FMA’da, en yüksek kütle yoğunluğu (%0,334 g/mL) ve toplam çözünür katı (%9,067) görülmüştür. Kromameter ile yapılan renk analizi, FMC’nin diğer numunelere kıyasla en mavi rengi ürettiğini göstermiştir. Camsı geçiş sıcaklığı (Tg), tüm numunelerde diferansiyel taramalı kalorimetre (DSC) ile incelenmiştir. 2. 4. Antioksidan Maddeler Vücudumuzdaki kimyasal reaksiyonlarla veya dış etkenlerle oluşan, hücrelerin yapısını kötü yönde etkileyen serbest radikallerin işlevini sona erdiren, dolayısıyla kanser gibi ölümcül hastalıklar dahil olmak üzere birçok hastalığa sebebiyet verebilecek zincir reaksiyonlarını da önleyen moleküller antioksidanlar olarak bilinmektedir. Uluslararası Gıda Kodeks Komisyonu’na göre ise gıdada yağın acılaşması ve renk değişimleri gibi oksidasyon reaksiyonları sonucunda oluşan bozulmaları önleyerek raf ömrünü uzatan maddelerdir. Antioksidanlar doğal ve yapay olmak üzere kaynaklarına göre iki gruba ayrılırlar. Doğal antioksidanlar olarak tokoferoller, askorbik asit ve türevleri, NDGA (Nordihidroguairatik asit), aminoasitler, peptidler, proteinler, vitaminler (A, C, E), fenolik bilesikler (fenolik asitler, flavonoidler vb.) ve karotenoidler örnek verilirken yapay antioksidanların en bilinenleri ise BHA (Butillenmiş hidroksi anisol), BHT (Butillenmiş hidroksi toluen) ve PG (Propil gallat)’tır. İnsan sağlığı için antioksidanların kimyasal yapıları, çözünürlükleri, yapı/aktivite ilişkileri ve doğal kaynaklardan elde edilebilmeleri çok önemli etkenlerdir (Kaur ve Kapoor, 2001). Antioksidanlar bitkilerde, mantarlarda ve alglerde fazlasıyla bulunan doğal katkı maddeleridir ve sentetik olanlara tercihen bir alternatiftir (Caleja ve diğerleri, 2016). Hem vücut hücreleri ile üretilirler, hem de gıdalar yoluyla alınabilirler. Tıpkı antioksidan maddeler gibi fenolik bileşiklerin de önemli bir bölümü antioksidatif etki gösterirler. "Polifenoller" olarak da adlandırılan fenolik bileşikler yapılarında benzen halkasına bir ya da daha fazla hidroksil grubu bulundururlar. Flavonoidler ve fenolik asitler diye ikiye ayrılırlar. Fenolik bileşiklerin doğal antioksidan aktiviteleri 9 serbest radikallerin sebep olduğu reaksiyonlarda etkili olup çeşitli kanser türleri, kalp hastalığı ve akciğer hastalıkları gibi pek çok hastalıkların oluşumuna engel olurlar (Nizamlıoğlu ve Nas, 2010). Antioksidan özelliklerine ek olarak, fenolik bileşikler anti- mikrobiyal, anti-enflamatuar, antialerjenik, anti-aterojenik, anti-trombotik etkiler gibi geniş bir yelpazede fizyolojik özellikler gösterirler (Cilek ve diğerleri, 2012). Bir antioksidan türü olan rosmarinik ve karnosik asitlerin yeşil teknikler arasında önde gelen ultrason destekli ve mikrodalga destekli ekstraksiyonla biberiye yapraklarından seçici olarak geri kazanımını konu alan bir çalışmada, daha geleneksel katı sıvı ekstraksiyon işlemlerine oranla fenol verimi üç kattan fazla artmıştır. Seçicilik açısından, oldukça yüksek rosmarinik asit içeriği (kurutulmuş ekstraktın %6,8’i), ultrason altında etil alkolde elde edilmiştir. Kurutulmuş ekstraktın %13’üne kadar en yüksek karnosik asit içeriği ultrason destekli ekstraksiyon ile n-heksanda elde edilmiştir. Sonuçta, geleneksel olmayan enerji kaynakları ve özellikle yüksek yoğunluklu ultrason, biberiye yaprağı ekstraksiyonu için hızlı, verimli ve seçici tekniklerdir ve yüksek rosmarinik ve karnosik asit içerikli fraksiyonlar elde etmeye yardımcı olmuştur (Bellumori ve diğerleri, 2016). 2. 5. Nar (Punica granatum L. ) Dünyada kültüre alınan ilk bitkiler arasında gösterilen bir meyve olan nar (Punica granatum Linn. ); insan sağlığına olan yararları ve ticari yaşamdaki değerinin yanı sıra kültür hayatında da sıkça bahsi geçen bir meyvedir (Şekil 2.4). Türkiye ise dünyanın önde gelen nar üreticisi olan ülkelerinden biridir. Fitokimyasallarca zengin olup antosiyaninler, ellagitanenler gibi antioksidan ve antitümör aktiviteleri ispatlanmış fenolik maddeleri de içeren nar, son yıllarda en çok araştırılan meyvelerden biri haline gelmiştir. Punikalagin ve punikalin gibi nispeten yüksek bir antioksidan içeriğine sahip fenolik bileşiklerden bazıları sadece bu meyvede bulunur. Fenolikler bitki dokularında eşit olarak dağılmamıştır. Çözünür fenolikler hücrelerde vakuollarda bulunurken; çözünmez fenolikler çoğunlukla mekaniksel güç sağlamak; doku bütünlüğü ve bitki gelişimini 10 düzenleyip korumak için hücre duvarlarında bulunurlar (Naczk ve Shahidi, 2004). Narlarda bu çeşitlenme sadece kalitatif değil, aynı zamanda kantitatiftir. Narın antimikrobiyal aktiviteleri Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli ve Yersinia enterocolitica’a karşı kanıtlanmıştır (Al-Zoreky, 2009). Nar suyunun antioksidan, antihipertansif ve anti-kanser etkileri ile ilgili çok sayıda çalışma yayınlanmıştır (Aviram ve Dornfeld, 2001; Çam ve diğerleri, 2009; Malik ve diğerleri, 2005). Nar suyu üretiminden sonra bütün meyvenin %40’ına kadar olan nar kabuğu kısmı bir yan ürün olarak kalır. Li ve diğerleri (2006); nar kabuğu ekstraktının posa ekstraktından 10 kat daha fazla fenolik içeriğinin olduğunu öne sürmüştür. Şekil 2.4. Nar https://www.birgun.net/amp/haber/nar-nasil-kolay-ayiklanir-186480: Erişim tarihi: 01.06.2019 Nar kabuğu ekstraktının aynı zamanda antibakteriyel, antiinflamatuar ve anti-alerjik aktiviteleri çalışılmıştır (Panichayupakaranant ve diğerleri, 2010). Nar kabuklarının hidroalkollü ekstraktları normal ve diyabetik farelerin kan glikoz seviyesini önemli ölçüde azaltarak anti-diyabetik aktiviteler göstermiştir (Jafri ve diğerleri, 2000). Bu sonuçlar nar kabuğunun fenoliklerinin çok amaçlı biyoaktif madde şeklinde kullanılabileceğini göstermektedir. 11 Nar kabuklarından elde edilen doğal polifenoller dış ortamdan korunmalıdır çünkü ısıya nispeten daha az olmak üzere oksijen, ışık, asit ve alkaliye karşı fazlasıyla duyarlıdır. Bu nedenle, fenolik bileşiklerin uygulamasında polifenolün yapısal bütünlüğünü korumak, tadını maskelemek, suda çözünürlüğünü artırmak ve biyoyararlılığı için işlenmiş koruyucu ürünlerin tüketim boyunca formülasyonu gerekmektedir. Bu konuda yapılan bir çalışmada nar kabuğu polifenollerinin emülsiyon yöntemiyle ß- siklodekstrin/2-hidroksipropil ß-siklodekstrin ile kaplanmıştır. %20 oranında polifenol katı faz ekstraksiyonu kullanılarak izole edilmiştir. Siklodekstrinlerin varlığı nar ekstraktların toplam fenolik içeriği ve antioksidan aktivitesini artırmıştır (Rodsamran ve Sothornvit, 2018). Yine benzer bir çalışmada nar kabukları polifenollerini içeren ekstraktı, kalsiyum aljinat tanecikleri ile iyonik jelleşme yöntemi ile kapsüllenmiştir. Ekstraktın enkapsülasyon verimi üzerindeki çeşitli oluşum faktörlerinin etkileri (sodyum aljinat konsantrasyonu, kalsiyum klorür konsantrasyonu, kalsiyum klorüre maruz kalma süresi, jelleşme banyosu süresinin muhafaza edilmesi ve ekstrakt konsantrasyonu) incelenmiştir. En iyi sonuç %3 sodyum aljinatla kaplanmış 100 mL damıtılmış su içinde 1 g nar kabukları ekstraktı içeren ve 20 dk boyunca 0,05 M kalsiyum klorür içinde karışmış ve 15 dk boyunca bir jelleştirme banyosunda tutulmuş olan deneyle elde edilmiştir. Bu optimize edilmiş koşullarla toplam ekstrakt polifenollerinin %43,90’ı ve toplam ekstrakt proantosiyanidinlerinin %46,34’ü kapsüllenmiştir. Kalsiyum aljinat taneciklerinde nar kabuğu ekstraktının mikrokapsüllenmesi, doğal antioksidanlarla ilaç ve gıda takviyesi için umut verici bir tekniktir (Zam ve diğerleri, 2014). Nar suyu ve etil alkollü ekstraktlarının biyoaktif bileşenlerinin sprey kurutucu yöntemiyle maltodekstrin ya da soya proteini izolatları ile kaplandığı çalışmada ise full faktöriyel tasarımı modelinde kaplama materyalinin oranı ve sıcaklık bağımsız değişken olarak kullanılmıştır. Optimal koşullar altında elde edilen biyoaktif bileşiklerin mikrokapsül tozlarının kararlılığı, 60°C’de etüvde 56 gün boyunca çalışılmıştır. Elde edilen sonuca göre polifenollerin kapsülleme verimliliği soya proteini matriksinde maltodekstrin matriksine oranla önemli ölçüde daha yüksek olmuştur. Ancak depolama 12 süresi boyunca daha düşük bozunma oranı sabitine sahip maltodekstrin matriksi antosiyaninler için daha iyi bir koruma etkisi göstermiştir. Mikrokapsüller yoğurtlara ilave edildiğinde kapsüllenen biyoaktif bileşiklerin kararlılığı (nar kabuğu etil alkollü ekstraktların maltodekstrin kapsülleri hariç), kapsülleme olmayanlara benzer bir davranış sergilemiştir (Robert ve diğerleri, 2010). Konjuge linolenik asit yönünden zengin nar çekirdeği yağının mikrokapsüllendiği bir çalışmada ise kapsülleyici madde olarak, sodyum aljinat veya trehaloz; emülsiyonlaştırıcı olarak da kalsiyum kazeinat kullanılmıştır. İç çekirdek malzemesi olan nar çekirdeği yağı ile suyu içeren bir yağ emülsiyonu hazırlanmıştır. Böylece emülsiyon dondurularak kurutulup, kurutulmuş ürün toz haline getirilmiştir. İki kapsülleyicinin performansı, çekirdek malzemenin mikrokapsüllerden salınım hızı ve mikrokapsüllerin sert koşullara karşı kararlılığı açısından karşılaştırılmıştır. Mikrokapsüllerin yüzey morfolojisi taramalı elektron mikroskobu altında incelendiğinde her iki tür mikrokapsülün de düzensiz yüzey morfolojisine sahip olduğu görülmüştür. Mikrokapsüllerin salınım hızları ise UV-spektrofotometre ile çalışılmış ve trehaloz bazlı mikrokapsüller daha yüksek salınım hızı göstermiştir. Mikrokapsüllerin belirli bir zaman periyodu boyunca 110°C’ye maruz bırakılması üzerine, sodyum aljinat mikrokapsüllerinin orijinal özelliklerini korudukları gözlenmiş, dolayısıyla, sodyum aljinat mikrokapsüllerinin trehaloz mikrokapsüllere göre ısıya daha fazla dayanıklı oldukları sonucuna varılmıştır (Gupta ve diğerleri, 2012). Mikrokapsülleme koşullarının nar kabuğu fenoliklerinin ürün kalitesi üzerindeki etkilerinin araştırıldığı diğer bir çalışmada da optimal sonuçlar 160ºC hava giriş sıcaklığı ve ağırlıkça 1/1 ya da 1/3 fenolik/maltodekstrin oranı ile elde edilmiştir. +4°C’de 90 günlük depolamada fenolik içerik açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark (p>0.05) olmamıştır. Aynı zamanda kaplamada kullanılan maltodekstrin üzerinden bir fark gözlemlenmemiştir. Bu çalışmada ayrıca gıda modeli olarak kullanılan dondurmanın fonksiyonel özelliklerinin zenginleştirilmesi için elde edilen mikrokapsüllenmiş fenolikleri ağırlıkça %0,5 ve %1 oranlarında kullanılmıştır. Antioksidan etki ve alfa-glukozidaz inhibe edici etki kontrol örneği ile karşılaştırılarak araştırılmıştır (Çam ve diğerleri, 2014). 13 2. 6. Enkapsülasyon Fonksiyonel gıda üretiminde, farmasötik, nutrasötik ve kozmetik endüstrisinde çokça kullanılan fenol bakımından zengin ürünlerin üretimi için doğal ürünlerden fenolik bileşiklerin eldesinde ekstraksiyon basamağı çok önemlidir (Cilek ve diğerleri, 2012). Maserasyon, basınçlı sıvı ekstraksiyonu, mikrodalga ve ultrason destekli ekstraksiyonlar farklı ekstraksiyon tiplerinin bazı örnekleridir. Etil alkol, metil alkol, aseton, su veya bunların karışımları çözücü olarak kullanılabilir. Ancak gıdalar işlendiğinde özel dikkat gerekir. Kullanılan çözücüler; sağlık ve güvenlik konularıyla ilgili herhangi bir toksisiteye sahip olmamalı veya kullanımdan sonra herhangi bir artık bırakmamalıdır (Adil ve diğerleri, 2008). Ayrıca taze fenolik bileşik ekstraktları, uzun süre çözücü ortamında kalınca yapıları bozulmakta ve düşük kararlılığa sahip oldukları için muhafaza süresi çok kısa tutulmaktadır. Bu nedenle fenolik bileşiklerin muhafaza sürelerini artırmak, oksijen, ısı ve ışık gibi dış etmenlere karşı daha dayanıklı hale getirmek için enkapsülasyon tekniği son yıllarda önem kazanmıştır. Böylece fenolik bileşikler çözücü ortamından alınıp katı formda daha kararlı ve daha uzun sürelerde saklanabilmektedir. Enkapsülasyon işlemi 60 yılı aşkın bir süredir farmokoloji, kimya, kozmetik, gıda, boya tarım, ilaç, enerji ve savunma gibi alanlarda kullanılmaktadır (Ünal ve Erginkaya, 2010). Gıda sektöründe genellikle, sıvı damlacıkların, katı taneciklerin veya gaz bileşenlerinin gıda saflığında kaplama materyalleri ile kaplanması için ürünlerin fonksiyonel özelliklerini geliştirmek, raf ömürlerini ve biyoyararlılıklarını artırmak amacıyla kullanılmaktadır. Enkapsülasyon; sıvı veya gaz formundaki biyoaktif gıda bileşenlerinin, enzimlerin, hücre ve diğer maddelerin, protein veya karbohidrat esaslı kaplama materyali olan ince bir film tabakası ya da polimer kapsüller ile kaplanarak kaplanan hassas materyalin kullanıma kadar korunması işlemidir (Şekil 2.5). 14 Şekil 2.5. Enkapsülasyonda aktif bileşenler (öz) ve enkapsülasyon matriksi (kabuk) https://balchem.com/human-nutrition-health/technologies/microencapsulation/: Erişim tarihi: 01.06.2019 Sonuç olarak mikrokapsül içeriği; hava, nem, ışık gibi çevresel koşullardan korunmuş olur (Jackson ve Lee, 1991). Gıda ürünleri içerisinde çoğunlukla aroma bileşenleri, katı ve sıvı yağlar, enzimler, vitaminler, mineraller ve renk bileşenleri enkapsüle edilmektedir (Koç ve diğerleri, 2010). Son zamanlarda popüler olan antioksidanlar üzerinden de enkapsülasyon işlemi gerçekleşmektedir. Günümüzde bilinen en yaygın kullanılan enkapsülasyon teknikleri aşağıdaki gibidir. Çizelge 2.1. Enkapsülasyon teknikleri Adı Çalışma Prensibi Emülsiyon Genellikle sulu çözeltilerdeki biyoaktif bileşenlerin kapsüllenmesi hazırlama için kullanılır. Ultra- Temel olayı akustik kabarcıklar olan bu teknikte basınç farkından sonikasyon oluşan türbülans ile küçük parçacıklar elde edilmektedir (Li ve Fogler, 1978). Mikro- İki kısma ayrılan bir basınç akımı prensibi ile çalışmaktadır. akışkanlaştırıcı Akışın her kısmı bir delikten geçer ve sıvı, etkileşim haznesi olan mikro-akışkanlaştırıcının etkileşim haznesine taşınır (Mahdi Jafari ve diğerleri, 2006). Dondurarak Isıya duyarlı maddelerin termal bozunma reaksiyonlarını en aza kurutma indirmek için kullanılan bu teknik maliyetlidir. Uygulaması, antioksidanlar gibi çok yüksek değerli içeriklerle sınırlıdır (Augustin ve Hemar, 2009). Püskürtmeli Bir polimer çözeltisi içine yayılan çekirdek partiküllerinin sıcak kurutma bölmeye püskürtülmesi şeklindeki bu işlem düşük maliyetlidir. 15 Enkapsülasyonun temel nedenleri şöyle özetlenebilir: 1. Uyumsuz bileşikleri ayırmak 2. Sıvıların katı hale getirilmesi 3. Kararlılığı artırma (çevreden gelen oksidasyon ve deaktivasyona karşı enkapsüle materyali korumak) 4. Enkapsüle edilen materyalin tadını, kokusunu ve aktivitesini maskelemek 5. Mevcut çevrenin korunması 6. Aktif bileşiklerin, kontrollü olarak açığa çıkarılması (Ünal ve Erginkaya, 2010). Bir bileşenin bulunduğu ortam ile ilişkisinin sınırlandırılması gerektiğinde, bu madde enkapsüle edilerek ortamdan ayrılabilmektedir. Kaplanan madde; içeriklerini koruma, istenildiğinde farklı sürelerde ve ortamlarda serbest hale geçirilip gerekli koşulların sağlandığı ortamlarda çalışabilme özelliklerine sahiptir. Burada kaplamada kullanılan materyalin özellikleri de etkilidir (Kınık ve diğerleri, 2003). Genel olarak enkapsülasyon tekniğinde kararlılığı yüksek, uygun geçirgenlikli, istenen düzeyde boyutları olan ve ortamla uyumluluğu yüksek kapsüller istenir. Bu özellikler için çok farklı kaplama materyalleri kullanılmaktadır (Aloğlu ve Öner, 2010). İdeal bir kaplama materyali; 1. Toksik olmamalı 2. Kolay uygulanabilmeli 3. Tam koruma sağlamalı 4. Enkapsüle edilen materyal ile reaksiyona girmemeli 5. Ekonomik olmalıdır. Sıralanan bu özelliklerin tümünü taşıyan bir kaplama materyali bulunmamaktadır. Bu nedenle, pratikte diğer kaplama materyalleri, oksijen tüketiciler, antioksidanlar, şelat ajanları ve biyosürfaktanlar gibi tamamlayıcılar da kullanılmaktadır (Ünal ve Erginkaya, 2010). 16 Mikroenkapsülasyon için farklı türlerde kapsülleme malzemeleri kullanılmaktadır (Jackson ve Lee, 1991). Karbohidratlar (sakkaroz, nişasta, maltodekstrin, dekstran, mısır şurupları), lipidler (monogliseritler, digliseritler, stearik asit, tristearin, parafin, balmumu, iç yağlar, vaks ve sertleştirilmiş yağlar), proteinler (kazein, jelatin, süt serumu, albümin, gluten), zamklar (sodyum aljinat, arap zamkı, agar, karragenan), selülozlar (metil selüloz, etil selüloz, karboksimetil selüloz, asetil selüloz, nitro selüloz, selüloz asetat ftalat, selüloz asetat butil ftalat), inorganik materyaller (kalsiyum sülfat, killer, silikatlar) örnek olarak verilebilir. Ayrıca polisakkarit, protein ve mineraller açısından önemli bir gıda kaynağı olan algler de kaplama malzemesi olarak kullanılmaktadır. Kapsüllemede yaygın olarak 2 tip görülmektedir. Birincisi, bir kabuk ile sınırlanmış tek bir çekirdeğe sahip olan mononükleer kapsüller şeklinde, ikincisi ise bir matris içine gömülü çekirdek materyalin olduğu küme şeklindedir (Şekil 2.6) (Schrooyen ve diğerleri, 2001). Uygulanan proses teknolojileri ve kaplama malzemeleri (çekirdek materyalin yanı sıra) kapsüllerin spesifik şeklini belirlemede etkilidir. Şekil 2.6. Kapsülleme tipleri (Mahavidyalaya, 2019) Haematococcus pluvialis, karoten yapısında doğal antioksidan olan astaksantince dünyanın en zengin mikroalgidir. Kittikaiwan ve diğerleri (2007) yaptıkları bir çalışmada, Haematococcus pluvialis’in homojen kitosan hücrelerine enkapsülasyonu sonucu kitosan-alg kapsülleri elde edilmiştir. Yosun tanelerinin kitosan çözeltisine 17 tekrar tekrar daldırılmasıyla hazırlanan taneciklerinin boyut ve şekli düzgün olmuştur. Çoğu karotenoidler gibi astaksantin de doymamış bir moleküldür. Yüksek sıcaklık, ışık ve yükseltgen koşullarda cis formundan düşük aktiviteli trans formuna dönüşebilir. Sonuç olarak, enkapsüle edilmiş astaksantinin biyolojik aktivitesi bu teknikle bu etkilerden korunmuş olur. Çalışmada aynı zamanda alg hücreleri içine enkapsüle edilmiş astaksantinin antioksidan aktivitesi de incelenmiştir. Kapsülleme işleminden sonra H. pluvialis’teki astaksantin içeriğinde önemli bir azalma olmamıştır. Başka bir çalışmada ise antioksidan, antibakteriyel, anti-kanser vb. farmakolojik etkilere sahip, bir polifenol türü olan kurkumin (Cur) Chlorella vulgaris alg hücresine enkapsülasyonu yapılmıştır. Daha sonra enkapsüle kurkuminin, floresans mikroskop, termogravimetri, diferansiyel taramalı kalorimetri ve Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi teknikleri ile analizi yapılmıştır. Sonuçlar kurkuminin alg hücre duvarı boşluklarına yerleştiği konusunda fikir vermiştir. Termal kararlılığı da ispatlanmıştır. Serbest haldeki formlarına göre alg ve Cur enkapsüllerinin termal kararlılığı, 0– 300ºC’de %3,8, 300–600ºC’de %33 daha yüksek bulunmuştur. Kapsüllemeden sonra, Cur’in fotokararlılığı yaklaşık 2,5 kat artmıştır. Alg içindeki Cur’in adsorpsiyon izotermi, Freundlich izoterm modeline uygun bulunmuştur. Mikrokapsüller diğer çalışılmış biyotaşıyıcılardan (lipozom vb.) daha yüksek değerde ağırlıkça yaklaşık %55’e kadar Cur ile yüklenmiştir. Sonuç olarak, Chlorella vulgaris hücresinin Cur için yeni bir sabit taşıyıcı olarak kullanılabileceği kanıtlanmıştır (Jafari ve diğerleri, 2016). Başka bir çalışmada ise, likopen yüklü Chlorella pyrenoidosa hücreleri (CPC’ler) elde edilmiştir. Elde edilen kompleksin kapsülleme verimliliği (%EY) %13,06±0,89; kapsülleme etkinliği (%EE) %96,31±3,10’dur. Floresan analizleri kapsüllemeyi doğrulamıştır. Ayrıca X-ışını kırınımı, termogravimetrik analiz ve diferansiyel taramalı kalorimetri analizleri de yapılmış ve yüklü kapsüller ile yüklenmemiş CPC’ler, likopen ve bunların fiziksel karışımları karşılaştırılmıştır. Sonuçta veriler, likopenin komplekste kristallenmeden amorf halde bulunduğunu göstermiştir. Bozunma kinetikleri incelendiğinde; kapsülleme, likopen kararlılığını artırmıştır. Likopen yüklü CPC’ler 25°C’de 25 gün muhafaza edildikten sonra DPPH serbest radikallerine karşı antioksidan aktiviteleri araştırılmış, serbest haline göre antioksidan etkileri daha yüksek olmuştur. 18 Bu çalışma ile, CPC’lerde likopenin kapsüllenmesinin fizibilitesi incelenmiş ve oksidatif stresi azaltan yeni nutrasötiklerin üretiminde kullanılabilecek her iki malzemenin aktiviteleri birleştirilmiştir (Pu ve Tang, 2017). 2. 7. Enkapsülasyon Yönteminin Gıda Endüstrisinde Kullanımı Caleja ve diğerleri (2016) yoğurtlarda doğal ve sentetik farklı antioksidan koruyucu maddelerin bulunması ile ilgili kıyaslamalı bir çalışma yapmışlardır. Matricaria recutita L. (chamomile) ve Foeniculum vulgare Mill. (fennel) doğal katkı maddesi olarak kullanılmıştır. pH ve besin değerleri açısından çok büyük bir fark görülmemiştir. Ancak, doğal katkı maddesinin kullanıldığı yoğurtlarda antioksidan etki daha yüksek bulunmuştur. Emülsiyon yöntemiyle Thai pirinç otu özünün maltodekstrin ile kaplandığı bir çalışmada mikrokapsüllenmiş toz (MP) enkapsüller, 1:4 ve 1:9 maltodekstrin oranları ile elde edilmiştir. MP1:4 enkapsüllere göre MP 1:9 enkapsüller, daha düşük toplam fenolik içerik (TPC) gösterirken antioksidan kapasiteleri daha yüksek olmuştur. Karboksimetil selüloz karıştırılmış filme eklenen MP 1:9’de, su bariyeri ve TPC artmıştır. Sonuç olarak kuru ve yağlı gıda ürünlerinin raf ömrünü uzatmaya yardımcı biyoaktif ve biyobozunur ambalaj malzemesi olarak bu filmin kullanılabileceği düşünülmüştür (Rodsamran ve Sothornvit, 2018). Vişne posasının emülsiyon yöntemiyle maltodekstrin ve arap zamkı ile kaplandığı bir çalışmada ise kaplama malzemesinde arap zamkı oranı arttığında kapsülleme verimliliği artmıştır. En iyi kapsüller 20 dk sonikasyon ve 1:20’lik çekirdek-kaplama oranı ile hazırlanmıştır (Cilek ve diğerleri, 2012). Başka bir çalışmada ise propolis özü sprey kurutucu yöntemiyle jelatin/mannitol ile kaplanmış ve elde edilen spreyle kurutulmuş partiküllerin antimikrobiyal aktiviteleri, Staphylococcus aureus’a karşı muhafaza edilmiştir (Bruschi ve diğerleri, 2003). 19 Serrano-Cruz ve diğerleri (2013) de Roselle özünü faz ayrımı yöntemiyle karboksimetil selüloz (CMC), peynir altı suyu proteinleri ve pektin karışımı ile kaplamışlardır. Peynir altı suyu proteinleri fenolik bileşiklerin salınımını desteklerken, diğer taraftan CMC salınımlarını inhibe etmiştir. Liu ve diğerleri (2015) ise Phyllanthus urinaria özünü koaservasyon yöntemiyle glisinin ile kaplamıştır. Fenolik bileşiklerin salınımında pH etkili olmuştur. Nanopartiküller ortama pH 7,4’te daha hızlı ve pH 1,2’de daha yavaş serbest bırakılmıştır. Kuersetin ve ferulik asidin elektroçekim yöntemiyle Amaranth protein izolatı ve ultra ince pullulan ile kaplandığı diğer bir çalışmadaysa enkapsüle antioksidanların serbest antioksidanlara göre antioksidan kapasiteleri in vitro olarak daha yüksek bulunmuştur (Aceituno-Medina ve diğerleri, 2015). Sığır serum albümininin, lizozim veya miyoglobin ile kaplandığı çalışmada ise kuersetinin simüle edilmiş intestinal sıvı içinde kararlılığı korunmuştur (Fang ve diğerleri, 2011). Yine kuersetin başka bir çalışmada Ha ve dğerleri (2013) tarafından jelleşme yöntemiyle β-laktoglobulin ile birleştirilmiş linoleik asitle kitosan oligosakkarit ile kaplanmıştır. Hem yüklü linoleik asit miktarı hem de alt ortam sıcaklığı arttığında nanopartiküllerin boyutu artmıştır. Kuersetinin sıvı- sıvı dağılımı yöntemiyle zein/kazeinat ile kaplandığı çalışmada ise, zein oranlarına bağlı olarak iğne benzeri veya küresel parçacıklar elde edilmiştir. Enkapsüle kuersetin, bazik pH’ya ve ultraviyole ışığına karşı kimyasal olarak kararlı kalmıştır (Patel ve diğerleri, 2012). Yapılan başka bir çalışmada da polifenolik bileşiklerce zengin konsantre Roselle kaliks bitkisi (Hibiscus sabdariffa L.) ekstraktı içeren jelatin taneleri katman üstüne katman yöntemiyle aljinatla kaplanmış ve CaCl2 kullanılarak iyonotropik olarak jelleştirilmiştir. Bu teknikle elde edilen tek kaplamalı ve çift kaplamalı boncuklarda yüklü ekstraktın salınım modeli değerlendirilmiştir. Buna göre, H. sabdariffa’nın polifenollerin salınımı, aljinat tabakalarının sayısı ve kalsiyum klorür çözeltisine daldırma süresinin artırılmasıyla kontrol edilebilmiştir (Díaz-Bandera ve diğerleri, 2013). 20 Diğer bir çalışmada da jelleşme yöntemi kullanılarak siyanidin-3-O-glukozit (C3G) soya ferritin ile kaplanmış ve kapsülleme, termal kararlılığı artırmış ve C3G’nin taşınmasını kolaylaştırmıştır (Zhang ve diğerleri, 2014). Yaban mersini ekstraktı ile yapılan çalışmada da yöntem olarak ekstrüksiyon ve kaplama materyali olarak aljinat/poli-L-lizin kullanılmıştır. Bu partiküllerin sulu çekirdeklerinde antioksidan özellikteki antosiyaninler vardır ve gıdalarda sağlık açısından yarar sağlayan katkı maddesi olarak kullanılabilirler. Farklı türlerde sıvı dolgulu kalsiyum aljinat/poli-L-lisin kapsüllerinin mekanik kararlılığı ve salınım kinetiği çalışılmıştır. Yapılan deneylerde kapsüllerin deformasyonu, poli-L-lizin konsantrasyonu ve adsorpsiyon süresinin bir fonksiyonu olarak ölçülmüştür. Aynı zamanda sıvı dolu aljinat kapsüllerinin mekanik özelliklerinin, poli-L-lizin ilavesiyle seçici olarak değiştirilebileceği ve ayarlanabileceği belirlenmiştir. Antosiyaninlerin salınımı pH 1,0 ve 4,5’te yüksek olmuş, ancak kapsüllerde yüksek miktarda antosiyanin alıkonulmuş, yani ilaç salınım özellikleri, çok bileşenli kapsüllerin farklı bileşimleri için önemli ölçüde değişmemiştir (Leick ve diğerleri, 2011). Yaban mersini antosiyanininin emülsiyon yöntemiyle peynir altı suyu proteini (ısı jelasyonu) ile kaplandığı çalışmada bir emülgatör yardımıyla ortalama çap azaltılmış; ancak emülgatörün eklenmesi kapsülleme verimliliğini azaltmıştır (Betz ve Kulozik, 2012). Isı muamelesi ise, kapsüllenmiş mikrokapsüllerin antioksidan aktivitesini önemli ölçüde azaltmıştır (Betz ve diğerleri, 2012). Mikrokapsüller, simüle edilmiş intestinal sıvılardaki (pH 6,8) antosiyanin salınımını geciktirmiştir (Schantz ve diğerleri, 2014). Kapsüllenmiş yaban mersini özleri, HT29 kolon karsinom hücrelerinin büyümesini inhibe etmiştir (Kropat ve diğerleri, 2013). 2.8. Yoğurt Yoğurt; Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ve Steptococcus thermophilus bakterileri aracılığıyla laktik asit fermantasyonu ile elde edilen fermente süt ürünüdür. Ortaya çıkan laktik asit ile ürüne karakteristik yapısını ve duyusal özelliklerini veren süt proteini etkileşime girer. İnsanların beslenme düzeninde önemli bir yere sahip olan, 21 çoğu ülkede kitlesel olarak üretilen ve tüketilen yoğurtlara büyük ölçüde değer verilmektedir (O’Connell ve Fox, 2001; Serafeimidou ve diğerleri, 2013; Shori ve Baba, 2014). Yoğurt denildiğinde akla gelen, içerdiği insan sağlığına faydalı zengin besin maddeleridir. Yapılan araştırmalara göre özellikle kas ve kemiklerde etkili, kan şekerini dengeleyici, yüksek tansiyonu önleyici, tok hissettirdiği için kilo vermeye yardımcı ve bunun gibi daha birçok faydası bulunan geleneksel bir besindir. Süt ürünleri ile ilgili yapılan çalışmalar, bu ürünlere sınırlı kapsamda biyoaktif maddeler eklenebileceğine işaret etmektedir. Bu yüzden, bu sınır aralıklarında çalışan bazı bilim adamları bitki ya da meyve merkezli katkı maddeleri ile yoğurdu karıştırmışlardır. Doğal katkı maddesinin kullanıldığı yoğurtlarda daha yüksek antioksidan etki gözlemlenmiştir (Caleja ve diğerleri, 2016). Literatürde kapsüle edilmiş probiyotik bakterilerin yoğurt gibi fermente süt ürünlerinde kullanılmasının bu bakterilerin canlılığını sürdürmesi için iyi bir yöntem olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur (Kailasapathy, 2002). Kapsülleme yolu ile koruma altına alınan bakterilerin yoğurtta canlılıklarını koruma oranı %80-95 arasında değişmiştir. Kapsülleme işlemi sırasında bakteri hücreleri fazla zarar görmemekte ve enzimatik faaliyetleri engellenmemektedir. Yapılan bir çalışmada probiyotik bakterilerin enkapsüle edilmesi ile bu bakterilerin yüksek asitliğe karşı dayanımı artırılarak ürünün raf ömrü boyunca hücrelerin canlılığı muhafaza edilebilmiştir. Probiyotik hücreler canlılıklarının geliştirilmesi için prebiyotik maddelerle (örn. dirençli nişasta) kapsüle edilmiştir. Araştırma sonucunda mısır nişastası kullanımının kaplamada bakterilerin canlılığını nişasta kullanılmadan kaplananlara kıyasla artırdığını tespit etmişler ancak; kaplama işleminin yüksek asit ve safra tuzu ortamında bakterilerin canlılıklarının artmasında önemli bir etkisinin olmadığını belirlemişlerdir. Araştırmada ayrıca kaplanmış bakterilerin canlılıkları 8 haftalık depolama sonunda 0,5 log birimi azalmışken, serbest hücrelerin sayısı 1 log birimi azalmıştır (Capela ve diğerleri, 2006; Sultana ve diğerleri, 2000). 22 Martins ve diğerleri (2014) de çalışmasında R. ulmifolius çiçek tomurcuklarının sulu ve hidroalkolik ekstraktları elde etmişler, içeriğindeki fenolik bileşikleri (24 tane) kimyasal ve biyolojik olarak karakterize etmişlerdir. En çok bulunanları ellagitanin türevleri, H- 10 izomeri ve lambertianin olmuştur. Daha yüksek fenolik içeriğe ve antioksidan aktiviteye sahip hidroalkolik ekstrakt, bir aljinat bazlı matrikste mikroenkapsüllenmiş ve antioksidan yararlarından dolayı bir yoğurt içine katılmıştır. Örnekler arasında mikrokapsüllü ekstraktı içeren yoğurt, kontrol grubu yoğurda göre (serbest ekstrakt içeren) daha yüksek bir antioksidan aktivite göstermiştir. Sonuç olarak, R. ulmifolius hidroalkolik ekstraktı antioksidan aktivitesi ispatlanmış ve mikroenkapsülleme tekniği ile korunmuştur. Diğer bir çalışmada, %1 kapsüllenmiş (En) ve %1 kapsüllenmemiş (NE) üzüm çekirdeği ekstraktının (GSE) fermentasyondan önce süte eklenmesi ile yoğurtlar elde edilmiş ve elde edilen yoğurtların fizikokimyasal özellikleri, toplam fenolik içerikleri, antioksidan aktiviteleri araştırılmıştır. Kapsüllenen GSE, kontrol grubuna göre duyusal özellikler, asitlik, su tutma kapasitesi, viskozite açısından benzer sonuçlar vermiş; ancak 3 kat toplam fenolik miktar, 4 kat antioksidan aktivite artışı görülmüştür. Yine canlı kalmış Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ve Steptococcus thermophilus bakterilerinin sayısında hiçbir etkisi olmamıştır. En-GSE yoğurdu ile karşılaştırıldığında, NE-GSE ürününün, 3 hafta depolama esnasında zayıf duyusal özellikleri ve daha az polifenol kararlılığı olmuştur. Mikroenkapsüllenmiş GSE eklenerek yoğurdun fonksiyonel değerinin artırılabileceği düşünülmüştür. Antioksidan aktivitesini artırmak için yoğurtta mikroenkapsüllenmiş GSE, fonksiyonel bir katkı maddesi olarak kullanılabilir (Yadav ve diğerleri, 2018). Olası bir fonksiyonel bileşen olan fıstık filizi ekstraktı mikroenkapsüllerinin (PPSEM) elde edildiği çalışmada da enkapsüller toz haline getirilmiş ve 16 gün boyunca +4°C’de saklanmıştır. Yoğurdun içine katılarak fizikokimyasal ve duyusal özellikleri açısından araştırılmıştır. Polifenol olan resveratrolün yoğurtlardan salınma oranları, düşük konsantrasyonlarda (%0,25 ve %0,5 ağırlık/hacim) en aza indirilmiştir. Viskozite, daha yüksek PPSEM konsantrasyonlarında yavaş yavaş azalmıştır. Yoğurt üretmek için 23 düşük konsantrasyonlarda PPSEM kullanılabileceği sonucuna ulaşılmıştır (Lee ve diğerleri, 2013). Başka bir çalışmada ise, yoğurt içerisine vişne posası eklenmesiyle yoğurtta fizikokimyasal özellikler, duyusal özellikler, fenolik içerik ve antioksidan aktivite incelenmiştir. Vişne posası %0, %8, %12 ve %16 oranlarında eklenmiş olup, ölçümler 14 günlük soğuk depolama boyunca kontrol edilmiştir. Yoğurttaki vişne posası konsantrasyonu artığında, pH ve peynir altı suyu ayrılması artarken; toplam katı, yağ, protein, kül, titre edilebilir asitlik ve viskozite değerleri gibi parametreler ise azalmıştır. Depolama sırasında, yoğurtlardaki toplam fenolik içerik mg örnek başına 20 µg gallik asit eşdeğerinden 81 µg’a ve antioksidan aktivite %48’den %86’ya kadar yükselmiştir (Şengül ve diğerleri, 2012). 24 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Spirulina mikroalgi Çalışmada enkapsülasyon işleminde kaplama materyali olarak kullanılan saf bitki değeri 1:20 olan Spirulina (Mavi-Yeşil Algler) toz ekstresi, ticari olarak Nu-da Gıda Nebati Yağ ve Yem Sanayi Ticaret Anonim Şirketi'nden E611 kodu ile satın alınmıştır. 3.1.2. Nar meyvesi Çalışmada enkapsülasyon işleminde kullanılan nar kabuğu ekstraktı eldesi için gereken nar meyveleri piyasadan ticari olarak satın alınmış, temizlenmiş ve daha sonra analiz için kullanılmıştır. 3.1.3. Çiğ süt Çalışmada yoğurt üretiminde kullanılan çiğ süt Bursa’da faaliyet gösteren bir süt işletmesinden ticari olarak satın alınmıştır. 3.1.4. Süt tozu Çalışmada çiğ sütün kuru maddesini artırmak amacıyla Pınar Süt A.Ş. tarafından üretilen yağsız süt tozu kullanılmıştır. 3.1.5. Starter kültür Yoğurt üretiminde kullanılan pastörize sütlere katılan starter kültürler S. thermophilus + L. bulgaricus suşlarının karışımı olarak 713503 no’su ve FD-DVS YC-350/30x50U kodu ile Chr. Hansen’s Laboratorium Denmark A/S’nin İstanbul’daki temsilcisi Peyma Sanayi A.Ş. tarafından sağlanmıştır. Dondurularak kurutulmuş laktik kültürün raf ömrü 24 ay, önerilen depolama sıcaklığı da <–18°C’dir. Aseptik tekniğe uygun bir sekilde 25 rekonstitüe süt içerisinde çoğaltılıp aktif hale getirilmiş ve süte 42-45°C’de inokule edilmiştir. 3.1.6. Cihazlar Tez kapsamında yapılan çalışmalarda kullanılan cihazlar, özellikleri ve kullanım amaçları Çizelge 3.1’de verilmiştir. Çizelge 3.1. Cihazların özellikleri ve kullanım amaçları Cihaz Adı Özellikleri Kullanım Amacı UV-VIS Cary 50 Conc, Spirulina mikroalgi, nar kabuğu Spektro- Varian sulu/hidroalkolik ve yoğurt ekstraktlarının fotometresi fenolik madde ve antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi ve enkapsülasyon çalışmalarında kullanılmıştır. Yüksek 1200 Series, Ekstraktlardaki fenolik madde ve performanslı Agilent karotenoidlerin kantitatif tayininde sıvı Technologies kullanılmıştır. kromatografisi- diod serili dedektör (HPLC- DAD) Liyofilizatör FreeZone 2,5 Plus, Enkapsülasyon işlemlerinde kullanılmıştır. Labconco Çoklu manyetik MS-MP8, Wisd Analizlerde kullanılacak çözeltilerin karıştırıcı hazırlanmasında kullanılmıştır. Isıtıcılı manyetik Are, Velp Analizlerde kullanılacak çözeltilerin karıştırıcı hazırlanmasında kullanılmıştır. Ultrasonik banyo 2,8 L, United Rekonstitüe sütün hazırlanmasında kullanılmıştır. pH metre HI 221, Hanna Analizlerde kullanılacak tampon çözeltilerin hazırlanmasında kullanılmıştır. Santrifüj Z 206 A, Analizlerde örnek hazırlama aşamasında Hermle kullanılmıştır. Etüv DRY-Line, VWR Mikroalgin ve nar kabuklarının kurutulması amacıyla kullanılmıştır. Vorteks VM-10, Wisd Analizlerde örnek hazırlamada karıştırıcı kullanılmıştır. Analitik terazi MS105DU, Analizlerde kullanılacak kimyasalların ve METTLER örneklerin tartımında kullanılmıştır. (±0,00001 g hassasiyet) 26 Çizelge 3.1. Cihazların özellikleri ve kullanım amaçları (devam) Saf su cihazı Option Q DV25, Elga Analizlerde kullanılan saf suyun Purelab temininde kullanılmıştır. Protein Yakma Gerhardt Protein analizi için kullanılmıştır. Ünitesi Protein Distilasyon Gerhardt Vapodes 45S Protein analizi için kullanılmıştır. ve Titrasyon Ünitesi Etüv Binder ED115 Fizikokimyasal analizlerde kullanılmıştır. Hassas Terazi Sartorius BL 210 S Analizlerde kullanılacak kimyasalların ve örneklerin tartımında kullanılmıştır. Su Banyosu Nüve BM30 Fizikokimyasal analizlerde kullanılmıştır. HPLC Shimadzu, Yoğurtlarda organik asit analizi için Prominence-İ LC- kullanılmıştır. 2030C 3D Plus SEM SEM-EDX, Carl Zeiss Enkapsülasyonu doğrulamak için Evo 40, Almanya kullanılmıştır. DSC Perkin Elmer. DSC Enkapsülasyonu doğrulamak için 4000, ABD kullanılmıştır. FT-IR Perkin Elmer, Enkapsülasyonu doğrulamak için Spectrum Two, USA kullanılmıştır. Sıcaklık Kontrollü MCİ-55D Ekstraksiyon ve enkapsülasyon Otomatik işlemlerinde kullanılmıştır. Çalkalayıcı Su Banyosu SW 23 Ekstraksiyon ve enkapsülasyon (Isıtmalı- işlemlerinde kullanılmıştır. Çalkalamalı) Ta.xt plus Tekstür Stable Micro Systems Yoğurtlarda tekstür analizi için cihazı kullanılmıştır. Zaman-Hız Ayarlı Heidolph, Multi Reax HPLC analizi öncesi hazırlık çalkalayıcı aşamasında kullanılmıştır. Santrifüj Sigma 3-16KL HPLC analizi öncesi hazırlık aşamasında kullanılmıştır. GC-MS-FID-HS Agient Yoğurtlarda uçucu organik bileşen Technologies7697, analizi için kullanılmıştır. Headspace Sampler, 5977A Renk Tayin Cihazı Hunter-Lab Yoğurtlarda renk ölçümü için kullanılmıştır. İnkübatör Memmert, 100-800 Yoğurt üretimi için kullanılmıştır. Otoklav Nüve Steam Art Ot Rekonstitüe süt hazırlanmasında ve 40L sterilizasyon amacıyla kullanılmıştır. 27 3.1.7. Kimyasallar Analitik saflıktaki kimyasallar Tez kapsamında yapılan çalışmalarda kullanılan kimyasallar Çizelge 3.2’de verilmiştir. Çizelge 3.2. Kimyasallar Kimyasal Adı Firma Katalog Numarası 1,5-difenilkarbazit Sigma-Aldrich 259225 α-karoten Sigma-Aldrich 40395 β-karoten Sigma-Aldrich C4582 β-kriptoksantin Extrasynthese 0317 S ABTS Sigma-Aldrich A1888 Amonyak İsolab 903.016 Amonyum karbonat Sigma-Aldrich 11204 Asetonitril İsolab 901.037 Bakır (II) sülfat pentahidrat İsolab 911.022 Borik asit Sigma-Aldrich B6768 Sığır serum albümin Sigma-Aldrich A9418 Çinko asetat dihidrat İsolab 996.016 Demir (III) klorid Merck 803945 Demir (II) sülfat heptahidrat Merck 103965 Deniz kumu Sigma-Aldrich 274739 Ellagik asit Sigma-Aldrich E2250 Etil alkol İsolab 920.027 Fenolftalein Merck 107233 Folin-Ciocalteau reaktifi Sigma-Aldrich F9252 Formik asit Merck 100264 Fosfor wolfram asidi Sigma-Aldrich P4006 Gallik asit Sigma-Aldrich 27645 Glasiyal asetik asit Sigma-Aldrich 1018302500 Gliserol İsolab 927.023 Gümüş nitrat İsolab 968.046 Hekzan İsolab 930.027 Hidroklorik asit Merck 100314 İzoamil alkol Sigma-Aldrich 100978 Katalizör tablet Merck 115348 p-Kumarik asit Sigma-Aldrich C9008 Magnezyum klorür Sigma M8266 Metil alkol Merck 106007 Metilen mavisi İsolab 947.D05 MRS agar SIAL 969964 28 Çizelge 3.2. Kimyasallar (devam) Kimyasal Adı Firma Katalog Numarası M17 agar SIAL 63016 Pankreatin Sigma P3292 Pepsin Sigma 77160 Potasyum dihidrojen fosfat Sigma-Aldrich 1.04873 Potasyum ferrosiyanür İsolab 960.076 Potasyum klorür Sigma-Aldrich 746436 Potasyum kromat İsolab 960.046 Potasyum peroksidisülfat Merck 105091 Potasyum sodyum tartarat tetra hidrat SIAL 25508 Punikalin Sigma-Aldrich 67988 Punikalagin Sigma P0023 Sodyum dihidrojen fosfat Merck 141677 Sodyum bikarbonat Sigma-Aldrich S6014 Sodyum hidroksit Sigma-Aldrich 795429 Sodyum karbonat Sigma-Aldrich 791768 Sodyum klorür SIAL 31434 Sodyum potasyum tartarat tetrahidrat Sigma-Aldrich 217255 Sülfürik asit İsolab 970.026 ter-Bütil metil eter Merck 101845 Trietilamin Merck 808352 Troloks Aldrich 238813 Zeaksantin Sigma-Aldrich 14681 3.1.8. Sarf malzemeler Tez kapsamında kullanılan sarf malzemeler Çizelge 3.3 ’te verilmiştir. Çizelge 3.3. Sarf malzemeler Malzeme Adı Firma Katalog Özellikleri Numarası Bond Elut C18 Agilent Technologies 14256023 5 g/20 mL/120 μm kartuş Bütirometre Bursa Teknik Kimya F63154 Ölçüm aralığı %0-8 (Gerber) arası, cam, tıpalı Kaynama taşı İsolab 030.60.006 3,0-3,5 mm çap Kjeldahl tartım Aldrich WHA10313032 Whatman, 609 kj kayıkçığı Magnet İsolab I.057.01.040 40x8 mm Mikropipet Eppendorf Research Z683809 10 – 100 μL 29 Çizelge 3.3. Sarf malzemeler (devam) Malzeme Firma Katalog Özellikleri Adı Numarası Mikropipet Eppendorf Research Z683825 100 – 1000 μL Mikropipet Eppendorf Research Z683833 500 – 5000 μL Süt pipeti İsolab I.021.05.011 Cam, bullu, AS kalite, grup (Gerber) sertifikalı,mavi skala, 11 mL 3.1.9. Çözeltiler Toplam fenolik madde tayininde kullanılan çözeltilerin hazırlanması • Lowry A çözeltisi: 0,1 M NaOH içinde %2’lik Na2CO3 çözülerek hazırlanmıştır. • Lowry B çözeltisi: %1’lik NaKC4H4O6 içinde %5’lik CuSO4’ın çözünmesiyle hazırlanmıştır. • Lowry C çözeltisi: Lowry A ve Lowry B çözeltileri 50:1 oranında karıştırılarak hazırlanmıştır. • Folin-Ciocalteu çözeltisi: Folin-Ciocalteu reaktifinin 1:3 oranında saf su ile seyreltilerek hazırlanmıştır. • Gallik asit çözeltisi: 0,1 g Gallik asit az miktarda metil alkol ile çözülüp toplam hacim 100 mL’ye metil alkolle tamamlanarak hazırlanmıştır. Antioksidan kapasite tayininde kullanılan çözeltilerin hazırlanması ABTS yöntemi: • ABTS radikal çözeltisi: 7 mM ABTS çözeltisi içinde 2,45 mM K2S2O8 su ile çözülerek 24 saat boyunca karanlık ortamda bekletilmiştir. 24 saat sonra ABTS radikal çözeltisi su ile 1:10 oranında seyreltilerek hazırlanmıştır. • Troloks çözeltisi: 0,1 g Troloks az miktarda metil alkol ile çözülüp toplam hacim 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. 30 Chromac yöntemi: • pH 2,8 Fosfat tamponu: 6,24 g NaH2PO4.2H2O az miktarda su ile çözülerek %85’lik H3PO4 (1,685 g/mL) (0,68 mL) ile asitlendirilir ve toplam hacim su ile 1 L’ye tamamlanır. • Potasyum klorür çözeltisi (0,2 M): 0,3725 g KCl tartılarak saf su ile 25 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. • Hidroklorik asit (0,2 M): 41,45 mL derişik HCl (12,06 M) saf su ile 50 mL’ye tamamlanarak ara stok 10 M HCl hazırlanmıştır. Hazırlanan ara stoktan 0,5 mL alınarak saf su ile 25 mL’ye tamamlanarak 0,2 M HCl çözeltisi hazırlanmıştır. • pH 1,2 Tamponu: 25 mL 0,2 M KCl ve 42,5 mL 0,2 M HCl karıştırılıp saf su ile 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. • Potasyum dikromat çözeltisi: 5 mg K2Cr2O7 toplam hacim 100 mL olacak şekilde pH 2,8 tamponu ile çözülerek hazırlanmıştır. • 1,5-Difenilkarbazit çözeltisi (3,4x10-4 M): 0,08 mg 1,5-Difenilkarbazit toplam hacim 100 mL olacak şekilde pH 2,8 tamponu ile çözülerek hazırlanmıştır. • Troloks çözeltisi: 0,1 g Troloks az miktarda metil alkol ile çözülüp toplam hacim 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. Cuprac yöntemi: • 1,0x10-2 M Bakır klorür çözeltisi: 0,4262 g CuCl2.2H2O suda çözülerek 100 mL’ye saf su ile seyreltilmiştir. • 7,5x10-3 M Neokuproin çözeltisi: 0,0390 g Neokuproin %96’lık etil alkolde çözülerek 25 mL’ye etil alkol ile seyreltilir. • 1 M, pH=7,0 Amonyum asetat tampon çözeltisi: 19,27 g NH4Ac suda çözülerek 250 mL’ye saf su ile seyreltilir. Bradford yöntemi: • Mikroalg ekstraktı örneklerindeki toplam protein miktarının tayin edilmesi için standart sığır serum albumin (BSA) kullanılarak kalibrasyon çözeltileri 31 hazırlanmıştır. Her bir standart bileşik metil alkol ile çözülerek 2-40 mg/L derişim aralığında hazırlanmıştır. Kromatografik analizler için kullanılan çözeltilerinin hazırlanması • Ekstraktlardaki ve yoğurtlardaki fenolik bileşiklerin kantitatif tayini için standart fenolik bileşikler kullanılarak kalibrasyon çözeltileri hazırlanmıştır. Her bir standart bileşik metil alkol ile çözülerek 1-20 mg/L derişim aralığında hazırlanmıştır. • Mikroalg ekstraktı örneklerindeki karotenoidlerin kantitatif tayini için standart karotenoid bileşikler kullanılarak kalibrasyon çözeltileri hazırlanmıştır. Her bir standart bileşik diklorometan ile çözülerek 0,25-10 mg/L derişim aralığında hazırlanmıştır. Fizikokimyasal analizler için kullanılan çözeltilerin hazırlanması Kjeldahl yöntemi: • Borik Asit (%3): 30 g H3BO3 suda çözülerek saf su ile 1 L’ye tamamlanır. • Kostik soda (%32): 320 g NaOH suda çözülerek saf su ile 1 L’ye tamamlanır. • Sülfirik asit (0,1 N): 0,1 N H2SO4; 2,72 mL %98’lik H2SO4 saf su ile 1 L’ye tamamlanır (%97’lik ile 2,74 mL kullanılır). Gerber yöntemi: • Yoğunluğu 1,82 g/mL olan H2SO4’ten 1 L hazırlamak için, yoğunluğu 1,82 g/mL olan H2SO4’in konsantrasyonu bulunur (C=%90,05). 1000x1,82x0,9005=1638,91 g saf H2SO4 olması gerekir. %98’lik ve yoğunluğu 1,84 olan H2SO4’ten 909 mL alıp, 1 L’ye saf su ile tamamlanır. 32 Titre edilebilir asitlik yöntemi: • 0,1 M Sodyum hidroksit çözeltisinin hazırlanışı: 4,2-4,5 g arasında bir miktar NaOH tartılıp, kaynamış ve soğutulmuş saf su (CO2’i çıkarılmış) içinde çözülerek 1 L’ye tamamlanır. • %1’lik Fenolftalein indikatörü çözeltisinin hazırlanışı: 1 g fenolftalein 100 mL’lik ölçülü balona tartılır, etil alkol ile çözülerek 100 mL’ye tamamlanır. Nişasta analizi: • %1’lik Hidroklorik asit (HCl) çözeltisinin hazırlanışı: 22,71 mL %37’lik HCl alınarak (su için d=1 kabulü ile) 972,97 mL su ile karıştırılarak istenen çözelti hazırlanmış olur. • %4’lük Wolfram fosfor asidi çözeltisinin hazırlanışı: 4 g Wolfram fosfor asidi tartılır ve saf suyla 100 mL’ye tamamlanır. Laktoz analizi: • Fehling A çözeltisi: 34,64 g CuSO4.5H2O damıtık su ile çözülerek 500 mL’ye tamamlanır. Filtre edildikten sonra renkli şişede saklanır. • Fehling B çözeltisi: 173 g Potasyum sodyum tartarat tetrahidrat ve 50 g NaOH saf suda çözülür, 500 mL’ye tamamlanır, süzülür ve renkli şişede saklanır. • Carrez 1 çözeltisi: 219 g Çinko asetat saf suda çözülür. Üzerine 30 mL glasiyal asetik asit eklendikten sonra 1 L’ye tamamlanır. • Carrez 2 çözeltisi: 106 g Potasyum ferrosiyanür saf suda çözülür ve 1 L’ye tamamlanır. • %1’lik metilen mavisi indikatörü: 1g metilen mavisi 100 mL’lik ölçülü balona tartılır, etil alkolde çözülerek çizgisine kadar tamamlanır. 33 3.2. Yöntem Yapılan tez çalışmaları 11 ana bölümden oluşmaktadır. Çizelge 3.4’te tez kapsamında yapılan tüm işlemlerin listesi bulunmaktadır. Çizelge 3.4. Çalışma metodolojisi Yöntemler Analizin yapıldığı kurum Bursa Gıda ve Yem 1. Spirulina mikroalgi ile yapılan Kontrol Merkez Araştırma çalışmalar Enstitüsü Müdürlüğü / Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi 2. Nar kabuğu ekstraktının hazırlanması ve analizi Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi 3. Enkapsülasyon işlemi Mikroalg- Bursa Gıda ve Yem nar 4. FT-IR, DSC ve SEM analizleri Kontrol Merkez Araştırma kabuğu çalışmaları Enstitüsü Müdürlüğü / ekstraktı Bursa Uludağ Üniversitesi çifti Fen-Edebiyat Fakültesi 5. Adsorpsiyon izoterm çalışmaları 6. Fotokimyasal kararlılık çalışmaları Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi 7. Optimizasyon çalışmaları 8. Simüle edilen gastrointestinal koşullar altında kontrollü salınım çalışmaları 10. Yoğurt üretimi Çiğ sütte yapılan Bursa Gıda ve Yem Yoğurt 11. Fizikokimyasal, Mikrobiyolojik, analizler Kontrol Merkez Araştırma örnekleri Enstitüsü Müdürlüğü / Spektroskopik, Süt tozunda yapılan analizler Bursa Uludağ Üniversitesi Duyusal/Tekstür ve Yoğurtta yapılan Fen-Edebiyat Fakültesi İstatistiksel Analizler analizler 34 Çalışmada öncelikle kaplama materyali olarak kullanılan mikroalg türü Spirulina’nın içeriğinin belirlenmesi amacıyla çalışmalar yapılmıştır. Daha sonra nar kabuğunun farklı çözücü ortamlarında ekstrakte edilmesi, ekstraktların spektroskopik ve kromatografik yöntemlerle araştırılması çalışmaları yapılmıştır. Akabinde optimizasyon işlemi ve belirlenen optimize koşullarda da enkapsülasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. FTIR, DSC, SEM analizleri ile enkapsülasyonun doğruluğu araştırılmıştır. Daha sonra enkapsüle edilen antioksidan madde miktarı belirlenmiş; maksimum kapsülleme verimliliği çalışmalarından sonra adsorpsiyon izoterm grafikleri elde edilmiştir. En uygun mikroalg-antioksidan çiftinin, muhafaza çalışmaları ve simüle edilen gastrointestinal koşullarda kontrollü salınım çalışmaları yapılmıştır. Son olarak enkapsüle edilen antioksidan maddenin yoğurt depolama süresine katkısının belirlenmesi için yoğurt üretim prosesine geçilmiştir. Fermantasyondan önce süte katılan farklı katkı maddeleri ile elde edilen 6 farklı (biri kontrol) fonksiyonel yoğurtların depolama koşullarında 1., 7., 14. ve 21. günlerde mikrobiyolojik, fizikokimyasal, duyusal/tekstür ve spektroskopik analizleri yapılmıştır. En son olarak da, yoğurtlarda örnek çeşitleri ve depolama süreleri arasındaki farklılığı ortaya koymak adına istatistik analizi uygulanmıştır. 3.2.1. Spirulina mikroalgi ile yapılan çalışmalar Ticari olarak satın alınan hasat edilmiş Spirulina mikroalgi, kullanımdan önce bir gün boyunca 60ºC’de etüvde kurutulmuştur. Sonra 2,5 g tartılıp 25 mL %80 (h/h) etil alkol- su karışımında 2 saat sıcaklık kontrollü bir otomatik çalkalayıcıda 35°C’de ekstrakte edilmiştir. Hazırlanan ekstraktın kromatografik yöntemle karotenoid içeriği, spektroskopik yöntemle de toplam protein içeriği belirlenmiştir. Kapsülleme için kaplama malzemesi olarak kullanılan mikroalglerin toplam protein yüzdesinin bilinmesi oldukça önemlidir. Toplam protein miktarının tayin edilmesi için standart sığır serum albumin (BSA) ile kalibrasyon grafiği çizilmiştir. Örneklere (0,1 mL), saf su ve Lowry C çözeltisi eklenmiştir. Daha sonra Folin-Ciocalteu reaktifi eklenmiştir. Karışım, 30 dk boyunca karanlıkta bekletilmiş ve 750 nm dalga boyunda absorbansları ölçülmüştür. Örnekler için toplam protein miktarları BSA kalibrasyon 35 grafiği kullanılarak ″sığır serum albumin eşdeğeri (BSAE)/g liyofilize alg″ şeklinde hesaplanmıştır. Aynı zamanda Kjeldahl yöntemi ile de protein tayini yapılmıştır (AOAC Official Method 991.20). 0,5-1,0 g arası Spirulina mikroalgi Kjeldahl tartım kayıkçığı içine tartılmış ve yakma tüpüne aktarılmıştır. Üzerine 20 mL derişik H2SO4, 2 adet Katalizör tableti ve 4-5 kaynama taşı konularak yakma gerçekleştirilmiştir. Parçalanma işlemi üç aşamada olmuştur (150°C’de 20 dk, 300°C’de 30 dk ve 420°C’de 80 dk). Yakma işleminden sonra distilasyon yapılmıştır. Hesaplama için aşağıdaki formül kullanılmıştır. % Toplam N = (numune için harcanan H2SO4 hacmi, mL - Kör için harcanan (3.1) H2SO4 hacmi, mL) x H2SO4’in normalite x 1,4007) / numune hacmi, g % Protein = % N x 6,25 (faktör çarpanı) Spirulina mikroalginde bulunan karotenoidlerin belirlenmesi için hazırlanan Spirulina ekstraktı Bursa Uludağ Üniversitesi’nde Agilent Technology Series 1200 HPLC sistem (Waldbronn, Almanya) ile kromatografik olarak analiz edilmiştir. Analiz sırasında YMC Karotenoid C30 (250 x 4,6 mm, 5 μm, YMC Co., Ltd) kolonu kullanılmıştır. %95 metil alkol-%5 H2O (H2O: %0,05 trimetilamin içerir) (çözücü A) ve ter-bütil metil eter (çözücü B), 20 µL enjeksiyon hacmi ve 1,0 mL/dk akış hızında mobil faz olarak kullanılmıştır. Gradyan koşulları şu şekildedir: 0-15 dk %5 B, 15-20 dk %20 B, 20-30 dk %30 B, 30-40 dk %40 B, 40-45 dk %75 B, 45. dk %5 B, toplam çalışma süresi 45 dk’dır. Tüm ölçümler, Spirulina ekstraktındaki karotenoidler için 450 nm dalga boyunda absorbans alınmıştır. Pikler, tutunma sürelerinin ve spektrumlarının standart karotenoidlerle karşılaştırılması ile belirlenmiştir. 3.2.2. Nar kabuğu ekstraktının hazırlanması ve analizi Taze, kaliteli nar meyveleri marketten ticari olarak satın alınmıştır. Çekirdeklerinden ve nar suyundan ayrılmış nar kabukları yıkanmıştır. Sonrasında nar kabukları 48 saat boyunca 40°C’de etüvde kurutulmuştur. Kurutulan kabuklar bir blender yardımıyla 36 öğütülmüş, sonrasında kullanıma kadar -24°C’de saklanmıştır. Nar kabuğunun ekstrakte edilmesi hem sulu hem de hidroalkolik ortam olmak üzere iki yöntemle gerçekleştirilmiştir (Şekil 3.1). Şekil 3.1. Nar kabuğu ekstraksiyonu işlem basamakları Birinci yöntemde; 5 g kurutulmuş öğütülmüş nar kabukları bir cam balona alınmıştır. İçine 25 mL distile su konulup konulup 35°C’de 3 saat boyunca sıcaklık kontrollü otomatik çalkalayıcıda ekstraksiyon yapılmıştır. Sonra filtre kağıdından süzülüp katı fazdan ayrılan sulu ekstrakt kullanıma kadar +4°C’de muhafaza edilmiştir. İkinci yöntemde; 5 g kurutulmuş öğütülmüş nar kabukları bir cam balona alınmıştır. İçine 25 mL %80 (h/h) etil alkol-su karışımı konulup 35°C’de 3 saat boyunca sıcaklık kontrollü otomatik çalkalayıcıda ekstraksiyon yapılmıştır. Sonra filtre kağıdından süzülüp katı fazdan ayrılan hidroalkolik ekstrakt kullanıma kadar +4°C’de muhafaza edilmiştir. 37 Farklı çözücüler kullanılarak elde edilen ekstraktların toplam fenolik madde miktarları ve antioksidan aktiviteleri arasında bir fark olup olmadığını görmek için iki farklı çözücü ortamı kullanılmıştır (Singh ve diğerleri, 2018). Literatürde farklı organik nar kabuğu ekstraktları (aseton, metil alkol ve etil asetat esaslı ekstraktlar) elde edilmiş, her birinin polifenolik profili ve antibakteriyel özellikleri belirlenmiş ve organik olarak dahil edilecek potansiyel antimikrobiyal bileşenler olarak kullanılıp kullanılamayacağı araştırılmıştır (Cano-Lamadrid ve diğerleri, 2020). Toplam fenolik madde tayini Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi’nde Folin-Ciocalteu yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Kalibrasyon grafiği için hazırlanan standart gallik asit çözeltileri kullanılmıştır. 0,1 M NaOH içinde %2’lik Na2CO3 olacak şekilde Lowry A çözeltisi ve %1’lik NaKC4H4O6 içinde %0,5 CuSO4 olacak şekilde Lowry B çözeltisi hazırlanmıştır. Lowry A ve Lowry B 50:1 (h/h) oranında karıştırılarak Lowry C çözeltisi hazırlanmıştır. Analiz tüplerine 2,5 mL Lowry C çözeltisi, 0,25 mL Folin-Ciocalteu reaktifi, x mL örnek/standart ve y mL (2-x) mL su eklenmiştir. Toplam fenol tayinleri için örneklerin ve standartların 750 nm’de absorbansı ölçülmüştür. En küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Örnekler için toplam fenol miktarları hesaplanan kalibrasyon denklemi kullanılarak mg gallik asit/g örnek şeklinde hesaplanmıştır (Şahin ve diğerleri, 2015). Antioksidan kapasite tayini Bursa Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi’nde ABTS yöntemi kullanılarak yapılmıştır. ABTS yönteminde ABTS sulu çözeltisi K2S2O8 ile karıştırılarak karanlıkta 12-16 saat bekletilmiştir. Süre sonunda elde edilen ABTS çözeltisi %96’lık etil alkolle 1:10 oranında seyreltilmiştir. 4 mL etil alkol ve 1 mL ABTS karıştırılarak 6. dk sonunda 734 nm dalga boyunda kör örnek için absorbans değeri okunmuştur (Akör). Her bir örnekten x mL alınmış, üzerine (4-x) mL etil alkol ve 1 mL ABTS çözeltisi ilave edilerek karıştırılmıştır, 6. dk sonunda 734 nm’de absorbans değeri okunmuştur (Aörnek). Ölçümler sonucunda % inhibisyon değerleri hesaplanmıştır (Denklem 3.5). ABTS yönteminde standart madde olarak troloks kullanılmıştır. Her bir standardın 734 nm dalga boyunda absorbans grafiğe okunarak troloks miktarına (mg) göre grafiğe geçirilmiştir. Kalibrasyon grafiğinden yararlanarak ekstraktların 38 antioksidan kapasite değerleri “mg troloks/g örnek” şeklinde hesaplanmıştır (Şahin ve diğerleri, 2012). Nar kabuğu sulu ve hidroalkolik ekstraktları ile Spirulina mikroalgi ekstraktının antioksidan kapasitelerinin karşılaştırılması amacıyla ABTS yönteminin yanında Chromac ve Cuprac yöntemleri de çalışılmıştır. Chromac yönteminde pH 2,8 tamponu NaH2PO4.2H2O ve H3PO4 ile 1 L’ye saf suyla tamamlayarak; Cr6+ çözeltisi tampon çözeltisi kullanılarak; 1,5-difenil karbazit çözeltisi ise 1,5-difenil karbazit katısı, aseton ve tampon çözelti ile hazırlanmıştır. pH 1,2 tamponu da KCl ve HCl ile hazırlanmıştır. Kör örnek için 0,5 mL su, 3,5 mL pH 1,2 tamponu, 0,5 mL Cr6+ çözeltisi karıştırılmış ve 1 dk bekletilmiştir. Sonra üzerine 0,5 mL 1,5-difenil karbazit çözeltisi eklenip 50. dk sonunda 540 nm’de absorbans değeri okunmuştur (Akör). Örnek analizi için ise x mL örnek, (0,5-x) mL su, 3,5 mL pH 2,8 tamponu ve 0,5 mL Cr6+ çözeltisi karıştırılmıştır. Sonra üzerine 0,5 mL 1,5-difenil karbazit çözeltisi eklenip 50. dk sonunda 540 nm’de absorbans değeri okunmuştur (Aörnek). Kör-örnek hesaplaması yapılmıştır. Standart madde olarak troloks kullanılmıştır. Her bir standardın 734 nm dalga boyunda absorbans grafiğe okunarak troloks miktarına (mg) göre grafiğe geçirilmiştir. Kalibrasyon grafiğinden yararlanarak ekstraktların antioksidan kapasite değerleri “mg troloks/g örnek” şeklinde hesaplanmıştır (Işık ve diğerleri, 2013). Cuprac yönteminde ise Cu(II) klorür çözeltisi CuCl2.2H2O katısı suda çözülerek, neokuproin çözeltisi neokuproin katısı %96’lık etil alkolde çözülerek ve amonyum asetat (pH=7,0) tampon çözeltisi de NH4Ac katısı saf suyla çözülüp seyreltilerek hazırlanmıştır. Deneysel çalışmada, 1 mL Cu(II) klorür çözeltisi, 1 mL neokuproin alkoldeki çözeltisi ve 1 mL amonyum asetat tamponu çözeltileri karıştırılmış, üzerine x mL ekstrakt, (4-x) mL saf su ilave edilmiştir. İşlemi takip eden 30 dk sonunda içerisinde antioksidan bulunmayan örneğe karşı 450 nm’de absorbans değerleri okunmuştur. Kalibrasyon grafiği için troloks çözeltileri hazırlanmıştır. En küçük kareler yöntemiyle doğru denklemi hesaplanmıştır. Ekstraktlar için antioksidan kapasite değeri hesaplanan kalibrasyon denklemi kullanılarak µmol troloks/g örnek olarak hesaplanmıştır (Apak ve diğerleri, 2008). 39 Aynı zamanda hazırlanan nar kabuğu ekstraktlarında bulunan ellagik asit ve türevleri (punikalin, punikalagin ve p-kumarik asit) kromatografik yöntemle de belirlenmiştir. Nar kabuğu hidroalkolik ve sulu ekstraktları Agilent Technology Series 1200 HPLC sistemi (Waldbronn, Almanya) ile kromatografik olarak analiz edilmiştir. Analiz sırasında Xbridge C18 (4,6x 250 mm, 3,5 µm, Waters) kolonu kullanılmıştır. Asetonitril ve %1 sulu formik asit gradyanlı çözelti sistemi, 10 µL enjeksiyon hacmi ve 0,5 mL/dk akış hızında mobil faz olarak kullanılmıştır. Mobil faz, su (çözücü A) ve asetonitril (çözücü B) içindeki %1 formik asittir. Gradyan koşulları şu şekildedir: 0-10 dk %13 B, 10-20 dk %41,5 B, 20-25 dk %70 B, 25–35 dk %10 B, toplam çalışma süresi 35 dk’dır. Tüm ölçümler 260, 280, 320 ve 360 nm dalga boylarında yapılmıştır. 3.2.3. Enkapsülasyon çalışmaları Bu tez çalışmasında hasat edilmiş mikroalgin yüzeyine nar kabuğu sulu ve hidroalkolik ekstrakları ayrı ayrı enkapsüle (tutturma) edilmiştir. Bu amaçla hasat edilmiş Spirulina mikroalgi ticari olarak satın alınmıştır. Literatürde daha önce yapılmış çalışmaya benzer olarak bu çalışmada da, ellagik asit kapsüllemesi 25°C’de başarılı olmamıştır, dolayısıyla ellagik asit kapsülleme verimliliği de önemsiz seviyede düşük çıkmıştır. Aynı deneyler 35ºC’de tekrarlanmış olup yüksek kapsülleme verimliliği elde edilmiştir (Jafari ve diğerleri, 2016). Enkapsülasyon için, 40 mg/mL (5 mL) nar kabuğu hidroalkolik ekstraktı ile 2,5 g önceden 60°C’de etüvde bir gün boyunca kurutulmuş Spirulina mikroalgi bir cam balona konulup, 16 mL %99,9’luk etil alkol- 4 mL damıtık su çözücü karışımında sıcaklık kontrollü otomatik çalkalayıcıda 35°C’de 6 saat karıştırılmıştır. Yine aynı şekilde 40 mg/mL (5 mL) nar kabuğu sulu ekstraktı ile yukarıdaki işlemler tekrarlanmıştır. Diğerinden tek farkı, çözücü sistemi olarak 20 mL of %99,9 etil alkol kullanılmıştır. 40 2., 4. ve 6. saat aralıklarında süspansiyonlardan alınan örnekler 15’er dk 5000 devirde santrifüj edilmiştir. Sonra filtre kağıdından süzülüp geriye kalan katı kısımlar liyofilize edilmiştir (Jafari ve diğerleri, 2016; Pu ve Tang, 2017) (Çizelge 3.5). Bu denemenin amacı enkapsülasyon için gereken en uygun süreyi belirlemektir. Bu amaçla toplam fenolik madde tayini yapılmıştır. Çizelge 3.5. Enkapsülasyon işlemine ilişkin deneme deseni Spirulina mikroalgi Liyofilize nar kabuğu sulu ekstraktı Liyofilize nar kabuğu hidroalkolik ekstraktı S1 S2 HA1 HA2 2., 4. ve 6. saat 2., 4. ve 6. saat 2., 4. ve 6. saat 2., 4. ve 6. saat örnek alınmıştır. örnek alınmıştır. örnek alınmıştır. örnek alınmıştır. 15 dk, 5000 rpm 15 dk, 5000 rpm santrifüj santrifüj 15 dk, 5000 rpm 15 dk, 5000 rpm edilmiştir. edilmiştir. santrifüj edilmiştir. santrifüj edilmiştir. Liyofilizatörde Liyofilizatörde Liyofilizatörde Liyofilizatörde kurutulmuştur. kurutulmuştur. kurutulmuştur. kurutulmuştur. FTIR, DSC, FTIR, DSC, FTIR, DSC, FTIR, DSC, SEM ve SEM ve SEM ve SEM ve spektroskopik spektroskopik spektroskopik spektroskopik analizler analizler analizler analizler yapılmıştır. yapılmıştır. yapılmıştır. yapılmıştır. Toplam 12 örnek (3 Saat dilimine ait örnek x 2 Tekrar x 2 Çeşit nar kabuğu ekstraktı) Mikroalg-antioksidan çifti yüzeyinin toplam fenolik madde miktarının belirlenmesi için, belirli oranlarda standart gallik asit çözeltileri ile bir kalibrasyon eğrisi çizilmiştir. 100 mg numune tartılıp 1 mL %80 (h/h) etil alkol-su karışımı içinde çözdükten sonra 1 dk boyunca vortekslenmiştir. Daha sonra santrifüjlenmiş ekstrakttan 0,1 mL süzüntü alınıp üzerine saf su, Lowry C çözeltisi ve Folin-Ciocalteu reaktifi eklenmiştir. Karışım karanlıkta 30 dk bekletilmiş ve 750 nm’de absorbans ölçülmüştür. Örneklerin toplam fenolik içeriği, hesaplanan kalibrasyon denklemi kullanılarak gallik asit eşdeğeri (GAE)/g liyofilize alg olarak hesaplanmıştır. 41 Enkapsüle edilmemiş mikroalg için de bu işlemler tekrarlanmıştır. Sonuç olarak, tutunma %’sinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Kapsülleme verimliliğini (%EY) ve kapsülleme etkinliğini (%EE) hesaplamak için kullanılan formüller aşağıdaki gibidir: Kapsülleme etkinliği (%) = [(Kapsüllenmiş ellagik asit kütlesi) / Başlangıçta (3.2) eklenen toplam ellagik asit kütlesi] * 100 Kapsülleme verimliliği (%) = [(Kapsüllenmiş ellagik asit kütlesi) / Elde edilen mikroenkapsül kütlesi] * 100 3.2.4. FT-IR, DSC ve SEM analizleri çalışmaları Mikroalg-nar kabuğu ekstraktı çifti arasında enkapsülasyon yöntemi ile tutunma olup olmadığını yani ellagik asidin Spirulina hücrelerinin boşluklarına yerleşip yerleşmediğini öğrenmek için boş Spirulina hücreleri ve ellagik asit yüklü Spirulina hücreleri arasında SEM, FT-IR ve DSC karşılaştırmalı çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca mikroalg-antioksidan çifti yüzeyinin toplam fenolik madde miktarı tayini de yapılmıştır. Ellagik asit yüklü mikroalg enkapsüllerinin karakterizasyonu FTIR spektrometresi (Perkin Elmer, Spectrum 100, ABD) cihazında analizleri yapılmıştır. FT-IR analizi, fonksiyonel grupları tanımlarken ve kaplama malzemesi (Spirulina) ile ekstrakt bileşenleri (ellagik asit) arasındaki ilişkiyi karakterize ederken yardımcı olmuştur. DSC, Spirulina-ellagik asit kompleksini aydınlatmak için kullanılan bir diğer tekniktir. Ellagik asidin bu taşıyıcıdaki fizikokimyasal durumunu ve mikroalgle arasında herhangi bir etkileşim olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Saf ellagik asit, Spirulina ve nar kabuğu ekstraktlı Spirulina’ların DSC çalışmaları, DSC Diferansiyel Tarama Kalorimetresi (Perkin Elmer. DSC 4000, ABD) cihazı ile gerçekleştirilmiştir. Cihazın çalışma koşulları şu şekildedir: 1) 30°C’de 1 dk bekletme, 2) 10°C/dk ile 30°C’den 400°C’ye ısıtma, 3) 400°C’de 5 dk bekletme ve 4) 400°C’den 30°C’ye 10°C/dk ile soğutma. 42 SEM analizi, hizmet alımı şeklinde Bursa Uludağ Üniversitesi Fizik Bölümü’nde yaptırılmıştır. Spirulina üzerine mikroenkapsüllenmiş ellagik asidin yüzey morfolojisi, 10-20 Kv’ta SEM (Carl Zeiss Evo 40, Almanya) cihazı ile incelenmiştir. Ellagik asit yüklü olan ve olmayan mikroalgler, alüminyum çubuklar üzerine monte edilmiş ve püskürtme ile altınla kaplanmıştır. 3.2.5. Adsorpsiyon izoterm çalışmaları Toplam fenolik madde miktarı çalışmaları sonucunda maksimum kapsülleme verimliliği (%) 2 saat sonra elde edildiğinden uygun karıştırma süresi olarak belirlenmiştir. Daha sonra liyofilize edilmiş nar kabuğu ekstraktlarından farklı miktarlarda (4, 8, 16, 24, 32 ve 40 mg/mL) alınıp, Spirulina mikroalgi ile su ve %80 (h/h) etil alkol-su çözücü ortamlarında ayrı ayrı cam balonlara konulup otomatik çalkayıcıda 35°C’de 2’şer saat karıştırılmıştır. 2. saat sonunda alınan örnekler 15 dk 5000 devirde santrifüj edilmiştir. Sonra filtre kağıdından süzülüp geriye kalan katı kısım liyofilize edilmiştir. Süzüntüde tutunmadan geriye kalan ellagik asit miktarları kromatografik yöntemle tayin edilmiştir. Başlangıç miktarlarından, tutunmadan geriye kalan ellagik asit miktarları çıkartılarak mikroalg üzerinde enkapsüle edilen ellagik asit miktarları bulunmuştur. Adsorpsiyon dengesi kurulduktan sonra, çözelti fazında adsorbe edilen maddenin sabit konsantrasyonu genellikle sabit sıcaklıkta konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak belirlenir. İzoterm modellerini belirlemek için hidroalkolik/sulu ekstrakt deneylerinden elde edilen veriler kullanılmıştır. Burada ellagik asidin Spirulina üzerine adsorpsiyonu için Langmuir ve Freundlich izoterm modelleri kullanılmıştır ve bu miktar değerleri kullanılarak izoterm grafikleri çıkartılmıştır (Jafari ve diğerleri, 2016; Pu ve Tang, 2017). 3.2.6. Fotokimyasal kararlılık çalışmaları Mikroalg-nar kabuğu ekstraktı çiftinin fotokimyasal kararlılığı, toplam fenolik içerik yöntemiyle belirlenmiştir. Ayrıca mikroalgler üzerindeki ellagik asit miktarının belirlenmesi için HPLC analizi kullanılmıştır. Buna göre mikroenkapsüllenmiş mikroalg-nar kabuğu hidroalkolik/sulu ekstraktları buzdolabında 21 gün +4ºC’de 43 bekletilmiş ve her hafta sonunda toplam fenolik içerik belirlenmiştir. 7 gün aralıklarla alınan numuneler %80 (h/h) etil alkol-su karışımı içinde çözülmüş ve 1 dk vortekslenmiştir. Katı ve sıvı kısım ayrıldıktan sonra sıvı ekstrakt ile ölçümler yapılmıştır. 3.2.7. Optimizasyon çalışmaları Doğal bileşiklerin kararlılığı ve antioksidan özellikleri; sıcaklık, matriks, pH, enzimlerin varlığı gibi potansiyel faktörlere ve diğer faktörlere bağlıdır (Dag ve diğerleri, 2017). Bu tez çalışmasında yapılan çalışmalar ve bilimsel araştırmalar neticesinde, daha önce rastgele seçilen koşullarda yapılan enkapsülasyon işleminin optimum koşullar altında yapılması bir gereklilik haline gelmiştir. Optimizasyon, bilindiği gibi, bir sistemi mümkün olan en az maliyetle en verimli hale getirmek için uygulanan işlem veya yöntemlerin hepsidir. Burada enkapsülasyon işlemini mümkün olan en iyi duruma getirmek için tercih edilmiştir. Kapsülleme verimliliği, serbest radikal süpürme aktivitesi ve toplam/yüzey fenolik içerik gibi parametreler mikroenkapsülasyon işlemi değişkenlerinin optimizasyonundan etkilenir. Aynı zamanda zaman, maliyet ve işçilikten tasarruf sağlanır. Bu tez çalışmasında, nar kabuğu hidroalkolik ekstraktından ellagik asidin Spirulina üzerine mikroenkapsülasyonu optimize edilmiştir. Enkapsülasyon işlemi parametrelerini optimize etmek ve tek faktörlü deney sonuçlarına dayanarak faktörler arasındaki etkileşimleri gözlemlemek için basit ve etkili teknik olan Box-Behnken tasarımı (BBD) (Sharif ve diğerleri, 2014), optimal deney koşullarını seçmek için ise etkin bir istatistiksel yöntem olan yüzey analiz yöntemi (RSM) kullanılmıştır. RSM, faktörler arasındaki etkileşimleri incelemek ve işlem parametrelerini optimize etmek için kullanılabilen bir istatistiksel tekniktir (Xu ve diğerleri, 2015). Yüzey analiz yöntemi aynı zamanda, gıda endüstrisinde, gıda ürünlerini geliştirmek için ve de elde edilecek son ürünün tepkilerini etkileyecek iki veya daha fazla faktöre sahip 44 işlemleri optimize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır (De Souza Neves Ellendersen ve diğerleri, 2012; Peña ve diğerleri, 2014). Meyvelerin yan ürünleri gibi bitkisel kaynakların fitokimyasallarının ekstraksiyonu sırasında sıcaklık, süre, karıştırma hızı gibi parametreleri de optimize eden ve yaygın olarak kullanılan optimizasyon aracıdır. Genellikle merkezi kompozit döndürülebilir tasarım için geçerlidir (Jorge ve diğerleri, 2013; Li ve diğerleri, 2012; Yim ve diğerleri, 2012). Endüstriyel önemi olan farklı biyoteknolojik ve biyokimyasal ürünleri üretmek ve optimize etmek için de sık kullanılmaktadır (Şahin ve diğerleri, 2016). Optimum mikroenkapsülleme elde etmek için üç seviyeli, üç değişkenli Box-Behnken tasarımı ile birleştirilmiş yanıt yüzeyi metodolojisi uygulanmıştır. Bu üç bağımsız değişkeni optimize etmek için merkez noktasında 5 tekrar içeren 17 deneyli bir Box- Behnken tasarımı (BBD) ile birleştirilmiş yanıt yüzeyi metodolojisi uygulanmak üzere tasarlanmıştır (Denklem 3.3). N=2k(k-1)+Ck…………………..(k: faktör sayısı, Ck: merkez noktalar) (3.3) N=2.3(3-1)+5=17 deney Tez çalışmasında enkapsülasyon işleminin parametrelerini optimize etmek, enkapsülasyon değişkenleri arasındaki etkileşimleri araştırmak ve maksimum kapsülleme verimliliği üzerindeki etkisini araştırmak için farklı koşullar incelenmiştir (Çizelge 3.6). Burada bağımsız değişkenler olarak sıcaklık (°C), enkapsülasyon süresi (dk) ve ekstrakt/mikroalg oranı (mL/g) seçilmiştir. Çizelge 3.6. BBD’de kullanılan bağımsız değişkenler ve aralıkları Bağımsız değişkenler Faktör Kodlanmış ve gerçek seviyeler -1 0 +1 Sıcaklık (°C) x1 25 35 45 Enkapsülasyon süresi (dk) x3 30 105 180 Ekstrakt/Mikroalg (mL/g) x2 1 2 3 Çizelge 3.6, BBD’de ellagik asit enkapsüllemesi için kullanılan bağımsız değişkenlerin gerçek ve kodlanmış seviyelerini göstermektedir. Bağımsız değişkenler ve bunların 45 seviyeleri, ekstraksiyon sıcaklığı (25 ile 45°C), enkapsülleme süresi (30 ile 180 dk) ve ekstrakt/mikroalg oranı (1 ile 3 mL/g) olarak belirlenmiştir. Spirulina üzerinde enkapsüllenen ellagik asit miktarı, tasarım deneylerinin (y) yanıt değişkeni olarak seçilmiştir. Tüm etkileşim terimlerini içeren ikinci dereceden polinom Denklem 3.4, mikroalgde enkapsüllenen tahmini ellagik asit miktarını hesaplamak için kullanılmıştır. (3.4) Burada y yanıt değişkenidir, b0 ofset terimidir, bi doğrusal etkidir, bii ikinci dereceden etkidir, bij etkileşim etkisidir ve xi ve xj bağımsız değişkenlerdir. Çizelge 3.7. BBD’de enkapsülasyon için tasarlanan deney tablosu Faktörler Deney x1 x2 x3 Sıcaklık (°C) Enkapsülasyon süresi (dk) Ekstrakt/Mikroalg (mL/g) 1 25 30 2 2 45 30 2 3 25 180 2 4 45 180 2 5 25 105 1 6 45 105 1 7 25 105 3 8 45 105 3 9 35 30 1 10 35 180 1 11 35 30 3 12 35 180 3 13 35 105 2 14 35 105 2 15 35 105 2 16 35 105 2 17 35 105 2 46 On yedi deney beş kez artırılarak gerçek hatayı belirlemek için merkez noktalara uygulamak üzere tasarlanmıştır (Çizelge 3.7). Deneysel sonuçların analizi için Design Expert programı (7.0.0 versiyonu) seçilmiştir. Yukarıdaki denklemde gösterildiği gibi ikinci dereceden polinom modeli elde etmek için bağımsız değişkenlerin ve yanıt değişkenlerinin ilgili verileri analiz edilmiştir. Optimum koşullar altında yapılan enkapsülasyon işlemi sonrası elde edilen mikroalg- nar kabuğu ekstraktı çifti bu tez çalışmasının daha sonraki tüm basamaklarında kullanılmıştır. 3.2.8. Simüle edilen gastrointestinal koşullar altında kontrollü salınım çalışmaları Ellagik asit yüklü mikroenkapsüller, sindirimden sonra ellagik asit ve türevlerinin potansiyel mevcudiyeti için önemli bir başlangıç ölçüsü olan in vitro salım çalışmaları ile karakterize edilmiştir (Fawole ve Opara, 2016). Mikroalgde enkapsüllenen ellagik asidin gastrointestinal geçişi sırasında simüle edilmiş gastrik koşullar altında mikroalg yüzeyinden kontrollü salınımı araştırılarak, mikroenkapsüllemenin ellagik asidin salınım özellikleri üzerindeki etkisi değerlendirilmiştir. Simüle edilmiş gastrointestinal sıvılarla in vitro sindirimin sonuçları, ellagik asidin içeriğinin ve biyolojik aktivitesinin belirlenmesi ve mikroenkapsülasyon sürecini optimize etme konusunda çalışan diğer araştırmacılara rehberlik edecektir. Simüle gastrointestinal şartlar altında serbest bırakılan kapsüllenmiş antioksidan maddenin spektroskopik analizi için toplam fenolik içeriğin belirlenmesinde Folin- Ciocalteu yöntemi, kromatografik analizi için antioksidan maddenin miktarının belirlenmesinde HPLC-DAD analizi, antioksidan kapasitenin belirlenmesinde ise ABTS yöntemi yardımcı olmuştur (Cilek ve diğerleri, 2012; Sariburun ve diğerleri, 2010). Enkapsüllerin yapısal özelliklerini değerlendirmek ve serbest bırakma kinetiğini incelemek için enkapsüle edilen antioksidan maddenin in vitro sindirimi ve mikroalg yüzeyinden kontrollü salınımı, mide ve bağırsak sıvısının simülasyonu ile sıcaklık kontrollü otomatik çalkalayıcıda gerçekleştirilmiştir. 47 Simüle edilen gastrik sıvının (SGF) insan vücudunda olduğu gibi yapılması için, 2 g NaCl, 3,2 g pepsin ile muamele edilmiştir. Sonrasında, 7 mL HCl eklenip son hacim su ile 1 L’ye tamamlanmıştır. Karışımın pH’sı 1,2’ye ayarlanmıştır. Daha sonra, 50 mg kapsüllenen mikroalg, 10 mL’lik bir test tüpünde (80 rpm’de inkübe edilmiştir), 37°C’de 120 dk boyunca 0,7 mL SGF ile karıştırılmıştır. Tüpler oda sıcaklığına soğutulduktan sonra, süzüntü 0,2 M NaOH çözeltisi ile nötralize edilmiştir. Simüle edilmiş bağırsak sıvısı (SIF) için, 6,8 g KH2P04 suda (250 mL) çözülmüştür. Üzerine 77 mL 0,2 M NaOH ve 500 mL distile su eklenmiştir. Sonra 10 g pankreatin ile muamele edilip son hacim 1 L’ye saf suyla tamamlanmıştır. Karışımın pH’sı 0,2 M NaOH ve 0,2 M HCl ile 6,8’e ayarlanmıştır. Daha sonra, 50 mg kapsüllenen mikroalg, 10 mL’lik bir test tüpünde 1,2 mL SIF ile muamele edilip çalkalama olmadan 37°C’de 120 dk boyunca bir su banyosunda bekletilmiştir. Oda sıcaklığına soğutulan karışım süzülüp ardından aktivasyonun inhibisyonu için 100 mL 3M HCl ile süzüntünün pH’sı 1,2’ye ayarlanmıştır. 15 dk bekletildikten sonra çözelti, 900 mL 0,2M NaOH ile nötralize edilmiştir (pH 7,0) (Dag ve diğerleri, 2017).. Fenolik bileşiklerin toplam miktarını belirlemek için, belirli oranlarda standart gallik asit çözeltileri ile bir kalibrasyon eğrisi çizilmiştir. 100 mg numune tartılıp 1 mL %80 (h/h) etil alkol-su karışımı içinde çözdükten sonra 1 dk boyunca vortekslenmiştir. Daha sonra santrifüjlenmiş ekstrakttan 0,1 mL süzüntü alınıp üzerine saf su, Lowry C çözeltisi ve Folin-Ciocalteu reaktifi eklenmiştir. Karışım karanlıkta 30 dk bekletilmiş ve 750 nm’de absorbans ölçülmüştür. Örneklerin toplam fenolik içeriği, hesaplanan kalibrasyon denklemi kullanılarak gallik asit eşdeğeri (GAE)/g liyofilize alg olarak hesaplanmıştır. Aynı zamanda kontrollü salınım çalışmalarından sonra da, ekstraktın (100 µL) toplam fenolik madde içeriği belirlenmiştir. ABTS yöntemi için, 7 mM ABTS sulu çözeltisi, 2,45 mM K2S208 ile karıştırılmış ve 12-16 saat boyunca karanlıkta tutulmuştur. Süre sonunda elde edilen ABTS çözeltisi, %96 etil alkol ile 1:10 oranında seyreltilmiştir. 4 mL etil alkol ve 1 mL ABTS ile 6. dk 48 sonunda, kör örnek için 734 nm dalga boyunda absorbans değeri okunmuştur. Her numunenin üzerine (4-x) mL etil alkol ve 1 mL ABTS çözeltisi ilave edilip absorbans değeri 6. dk sonunda 734 nm’de okunmuştur. % İnhibisyon değerleri aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır. % İnhibisyon= Akör − Aörnek ×100 (3.5) Akör ABTS yönteminde standart madde olarak Trolox kullanılmış olup belirli miktarlarda hazırlanan standart çözeltilerin 734 nm dalga boyundaki absorbansları trolox (mg) miktarına karşı grafiğe geçirilmiştir. Bu kalibrasyon grafiği kullanılarak, ekstraktların antioksidan kapasite değerleri mg trolox eşdeğeri (TE)/g örnek olarak hesaplanmıştır. Aynı zamanda kontrollü salınım çalışmalarından sonra da, ekstraktın antioksidan kapasitesi (100 µL) belirlenmiştir. Simüle edilen gastrointestinal şartlar altında mikroalg üzerine enkapsüle edilen antioksidan maddenin salınım davranışı için kapsüllenmiş mikroalg ile 120’şer dk çalışıldıktan sonra çözelti ortamına salınan kapsüllenmiş antioksidan maddenin miktarı sindirimden önce ve sindirimden sonra HPLC ile hesaplanmıştır. 3.2.9. Yoğurt üretimi Denemenin düzenlenmesi Yoğurt üretiminde, ürünler 100 g’lık ağzı kapaklı steril plastik kaplara yerleştirilmiştir. +4±1°C sıcaklıktaki buzdolabında depolanan örneklerin fizikokimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal/tekstür analizleri depolamanın 1., 7., 14. ve 21. günlerinde yapılmıştır. Çalışma aşağıda belirtilen deneme desenine göre iki tekerrürlü olarak yürütülmüştür (Çizelge 3.8). 49 Çizelge 3.8.Yoğurt üretimine ilişkin deneme deseni Ürün Çeşidi Uygulama Şekli Depolama Süresi (Gün) 1 7 14 21 YC Kontrol grubu yoğurt örneği YM %1 Spirulina mikroalgi katılmış yoğurt örneği YNS %1 Nar kabuğu sulu ekstraktı katılmış yoğurt örneği YNSE %1 Enkapsüle nar kabuğu sulu ekstraktı katılmış yoğurt örneği YNH %1 Nar kabuğu hidroalkolik ekstraktı katılmış yoğurt örneği YNHE %1 Enkapsüle nar kabuğu hidroalkolik ekstraktı katılmış yoğurt örneği Starter Kültürün Aktive Edilmesi Yoğurt üretim prosesinde kullanılacak olan starter kültür (Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaricus + Streptecoccus thermophilus) 1 gün önce aktif hale getirilmek üzere hazırlanmıştır. Liyofilize kültürlerden işletme kültürü eldesinde öncelikle rekonstitüe süt hazırlanmıştır. 72 g yağsız süt tozu 600 mL saf su içerisinde, süt tozunun iyice çözünmesi için yaklaşık 1 saat boyunca oda sıcaklığında ultrasonik banyoda karışması sağlanmıştır. Hazırlanan substrat (12 g/100 mL) özel kapaklı şişelere aktarılmış ve 121°C’de 15 dk sterilize edilmiştir. 45°C’ye soğutulan substratın içine aseptik koşullarda starter kültür aşılanmış ve inkübatöre konulmuştur. Aseptik ortam koşullarının sağlanmaması durumunda kontamine olabilen mikroorganizmalar, starter kültürün aktivitesini ve yoğurt kalitesini olumsuz etkilemektedir. Bu sıcaklıkta inkübasyondayken pH 5’e ulaşana kadar bekletilmiştir. Hazırlanan kültür +4°C’ye soğutulmuş ve kullanıma kadar bu sıcaklıkta bekletilmiştir. Yoğurt üretimi Çalışmada yoğurt üretiminde kullanılan çiğ süt Bursa’da faaliyet gösteren bir süt işletmesinden ticari olarak satın alınmıştır. Süt işletmesine ait sabah sağımından alınan 15 L çiğ inek sütü iyice karıştırılarak yaklaşık 40°C’de homojen hale getirilmiştir. 50 Çiğ inek sütü Süt tozu katımı (%3, 30°C’de) Pastörizasyon (90°C’de 10 dk) 6 tane 2,5 L’lik kaplara doldurulmuştur (1) (2) (3) (4) (5) (6) Kontrol %1 %1 %1 %1 %1 grubu Spirulina nar kabuğu enkapsüle nar kabuğu enkapsüle mikroalgi sulu nar kabuğu hidroalkolik nar kabuğu ekstraktı sulu ekstraktı hidroalkolik ekstraktı ekstraktı Kültürle Aşılama (%3) (Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaricus + Streptecoccus thermophilus) İnkübasyon (42°C’d e pH 4,7’ye kadar) Soğutma (Oda S ıcaklığında 30 dk) +4°C’de 21 G ün Depolama Şekil 3.2. Yoğurt üretim prosesi işlem basamakları 51 Yoğurt üretim prosesine ait akış şeması Şekil 3.2’deki gibidir. Daha önceden steril edilmiş çelik bir tencereye alınarak çiğ inek sütünün kuru maddesini artırmak amacıyla 30°C’ye ısıtılmış, bu sıcaklıkta %3 oranında yağsız süt tozu katılmıştır. 90°C’de 10 dk ısıtılmış ve 60-70°C’ye soğutulan süt 6 farklı steril plastik kaba paylaştırılmıştır. Sıcaklık yaklaşık 50°C’ye geldiğinde ise kontrol grubu dışındaki kaplara 25 mL ekstraktlardan, 25’er g Spirulina mikroalgi ve enkapsüle ekstraktlardan eklenmiştir. Hidroalkolik ekstraktın çözücüsü eklenmeden önce N2 gazı altında ortamdan uzaklaştırılmıştır. Daha sonra kültür grubu için önerilen inkübasyon sıcaklığına (45°C) soğutulmuştur. %3 oranında starter kültür ile aşılanan 6 farklı süt, steril karıştırıcılarla karıştırılmış 100 mL’lik steril plastik kaplara aktarılmıştır. İnkübasyon süreci yoğurdun karakteristik tat/aroma ve tekstürel özelliklerinin oluşmasında çok önemli bir basamaktır. İnkübatöre konulan yoğurtların 1’er saat aralıklarla pH kontrolleri yapılmıştır. pH 4,7’ye gelen örnekler inkübatörden çıkarılmış ve oda sıcaklığında 30 dk bekletilerek buzdolabına (+4°C) alınmış ve burada 21 gün boyunca depolanmak üzere saklanmıştır. Elde edilen yoğurtların kodlarıyla birlikte fiziksel görünümüne ait görüntü Şekil 3.3’te yer almaktadır. YC kontrol grubunu, YM %1 Spirulina mikroalgi katılmış grubu, YNS %1 nar kabuğu sulu ekstraktı katılmış grubu, YNSE %1 enkapsüle nar kabuğu sulu ekstraktı katılmış grubu, YNH %1 nar kabuğu hidroalkolikekstraktı katılmış grubu, YNHE %1 enkapsüle nar kabuğu hidroalkolik ekstraktı katılmış grubu temsil etmektedir. Şekil 3.3’te de görüldüğü gibi, mikroalgin direkt eklendiği örneğin (YM) rengi, enkapsüle mikroalgli örneklerin (YNSE, YNHE) renklerine nazaran daha koyu yeşildir. 52 Şekil 3.3. Üretilen 6 farklı yoğurt örneği (YC, YM, YNS, YNSE, YNH, YNHE) Üretim sonrası steril numune kaplarında dolumu yapılan yoğurtların buzdolabı koşullarındaki depolamasının 1., 7., 14. ve 21. günlerinde analizleri yapılmak üzere yoğurt numuneleri alınmıştır. 3.2.10. Fizikokimyasal, Mikrobiyolojik, Spektroskopik, Duyusal/Tekstür ve İstatistiksel Analizler Bu tez çalışmasında yapılan fizikokimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal/tekstür analizlerin listesi ve analizlerde kullanılan yöntemler Çizelge 3.9’da listelenmiştir. Üretimde kullanılan çiğ süt ve süt tozu ve üretimden sonra biri kontrol olmak üzere 6 farklı yoğurt olmak üzere 3 grup altında analizler yapılmıştır. Her bir analizin yapılması planlanmış yöntemlerinin isimleri de belirtilmiştir. 53 Çizelge 3.9. Fizikokimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal/tekstür analizlerin listesi Analizler Çiğ Süt Süt tozu Yoğurt Toplam Aerobik Yoğurtta Serum Mezofilik Bakteri Süt Tozunda Yağ Miktarı Tayini Ayrılması (Sezgin ve ark Sayısı (ISO 4833-1 (TS1330 Yöntemi) 1994) Yöntemi) Yoğurtta Organik Asit Analizi (HPLC ile) Sütte Kuru Madde Süt Tozunda Toplam Protein Tayini (TS1330 Tayini (AOAC Official Method Yoğurtta Asetaldehit Yöntemi) 991.20) Tayini (GC ile) Yoğurtta M17 ve MRS Sütte Yağ Miktarı Agar Tayini (ISO 7889 Tayini (TS1330 Yöntemi) Yöntemi) Yoğurtta Kuru Madde Tayini (TS1330 Süt Tozunda Yöntemi) Karbohidrat Yoğurtta Süt Yağsız Sütte Süt Yağsız Hesaplanması İçin Kuru madde Miktarı Kuru madde Oranı Nişasta miktarı (TS1330 Yöntemi) (TS1330 Yöntemi) (GMAM) Yoğurtta Yağ Miktarı Tayini (TS1330 Yöntemi) Yoğurtta pH Tayini (TS Sütte Toplam 591 yöntemi) Protein Tayini Yoğurtta Titre Edilebilir (AOAC Official Asitlik Tayini (TS1330 Method 991.20) Yöntemi) Yoğurtta Kül Tayini Süt Tozunda (GMMAM yöntemi) Karbohidrat Yoğurtta Toplam Protein Hesaplanması Tayini (AOAC Official Method 991.20) Sütte pH Tayini Süt Tozunda Yoğurtta Laktoz Miktarı (TS 591 yöntemi) Karbohidrat (AOAC 930.28 Hesaplanması İçin Yöntemi) Laktoz miktarı Yoğurtta Duyusal (AOAC 930.28 Muayene (TS 1330 Yöntemi) Yöntemi) Sütte Titre Tekstürel Parametrelerin Edilebilir Asitlik Tayini (Tekstür cihazı Tayini (TS1330 ile), Renk Ölçümü (TS Yöntemi) 1466) 54 Çiğ Sütte Yapılan Analizler Yoğurt üretiminde kullanılan çiğ sütün işleme alınmadan önce fizikokimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal/tekstür analizleri yapılmıştır. Fizikokimyasal özelliklerinin belirlenmesi için kuru madde, yağ miktarı, süt yağsız kuru madde oranı, toplam protein, pH ve titre edilebilir asitlik analizleri yapılmıştır. Kuru madde analizinde, sabit tartımdaki kurutma kapları kapaklarıyla tartılarak darası tespit edilmiştir. Çiğ sütten kurutma kabına 3-4 mL kadar tartılmıştır. Kurutma kabı ve kapakları 102±2°C’a ayarlanmış etüvde 3 saat bırakıldıktan sonra kapakları kapatılarak desikatöre alınmış ve oda sıcaklığında tartılmıştır. Yağ analizinde, çiğ süt 40ºC’lik su banyosunda bekletilmiş ve homojenleştirilmiştir. Bütirometrenin içine 10 mL sülfirik asit (dH2SO4=1,82 g/mL), pipetle alınan 11 mL süt örneği ve 1 mL izoamil alkol (d=0,812-0,818 g/mL) eklenmiştir. Bütirometre tıpa ile kapatılıp alt üst edilerek santrifüje yerleştirilip 5 dk süre ile 55°C’de santrifüjlendikten sonra yağ değeri okunmuştur. Süt örneklerinde süt yağsız kuru madde oranı, kuru madde değerinden süt yağı değeri çıkarılarak hesaplanmıştır. Toplam protein analizinde, çiğ sütten ~2 mL Kjeldahl tartım kayıkçığına tartılmış ve yakma tüpüne aktarılmıştır. Üzerine 20 mL derişik sülfirik asit, 2 adet katalizör tableti ve 4-5 kaynama taşı konularak yakma işlemi yapılmıştır. Tüpler 30 dk oda sıcaklığında soğumaya bırakılmış ve distilasyon işlemine geçilmiştir. % Toplam N üzerinden % toplam protein hesaplanmıştır. pH analizinde, çiğ sütün içine pH-metrenin elektrodu daldırılıp enstrümental olarak ölçülmüştür. 55 Titre edilebilir asitlik analizinde, çiğ sütten 25 mL alınıp üzerine 1 mL %1’lik fenolftalein çözeltisi eklenmiştir. 0,1 M sodyum hidroksit çözeltisi ile 5 sn sabit kalabilen hafif pembe renge kadar titre edilip sarfiyat kaydedilmiştir. Üretimde kullanılan çiğ sütün mikrobiyolojik analizi için ise toplam aerobik mezofilik bakteri sayısı analizi yapılmıştır (Çizelge 3.9). Çiğ sütten 1/10’luk seri dilüsyonlar hazırlanarak petri kaplarına ekimler yapılmış ve 30±1oC’de 72±3 saat inkübasyona bırakılmıştır. En son olarak koloni sayımı gerçekleştirilmiştir. Süt Tozunda Yapılan Analizler Yoğurt üretiminde kullanılan süt tozunun da işlem alınmadan önce kimyasal analizleri yapılmıştır. Yoğurt üretiminde kullanılan süt tozunun kimyasal özelliklerinin belirlenmesi için yağ miktarı ve toplam protein analizleri ile karbohidrat hesaplanmasında kullanılan nişasta ve laktoz miktarı analizleri yapılmıştır (Çizelge 3.9). Yağ miktarı analizinde, bütirometrenin içine 10 mL sülfürik asit ve 3 mL saf su konulmuş, üzerine 1,69 g süt tozu tartılmıştır. 1 mL izoamil alkol ile yeteri kadar damıtık su eklenmiş ve süt tozu eriyinceye kadar alt üst edilip su banyosunda bekletilmiştir. 5 dk santrifüjden sonra yağ değeri okunmuştur. Toplam protein analizi yukarıda belirtildiği gibi ~0,5 g süt tozu ile gerçekleştirilmiştir. Nişasta ve laktoz miktarlarının % olarak toplamı karbohidrat miktarının yüzdesini belirler. Nişasta analizinde, 5 g süt tozu 100 mL’lik ölçü balonuna alınmış, üzerine 2 kere 25’er mL %1’lik HCl eklenmiştir. Kaynamakta olan su banyosunda 15 dk bektildikten sonra üzerine 30-35 mL saf su ve 10 mL fosfor wolfram asidi konulmuş ve çizgisine kadar saf suyla tamamlanmıştır. Süzgeç kağıdından süzülüp, süzüntü polarimetre tüpüne alınarak çevirme derecesi ölçülmüştür. 56 Laktoz analizinde ise süt tozundan 2,5 g 250 mL’lik ölçü balonuna tartılmıştır. 5’er mL Carrez I ve Carrez II eklendikten sonra balon çizgisine tamamlanmış, 2 mL daha su eklenmiştir. 15 dk bekledikten sonra süzülmüştür. Süzüntüden 50 mL, 100 mL’lik ölçü balonuna konulup çizgisine kadar su ile tamamlanmıştır ve sonra titrasyon yapılıp sarfiyat kaydedilmiştir. Yoğurtta Yapılan Analizler Yoğurt üretimi gerçekleştirildikten sonra depolamanın 1., 7., 14. ve 21. günlerinde fizikokimyasal, mikrobiyolojik ve duyusal/tekstür analizleri bütün yoğurtlarda 2 paralelli olarak yapılmıştır (Çizelge 3.10). Çizelge 3.10. Yoğurtlarda yapılan analizlere ait deneme deseni Yoğurt Örnekleri 1. 2. Spirulina 3. Nar kabuğu 4. Enkapsüle 5. Nar kabuğu 6. Enkapsüle Kontrol mikroalgi sulu ekstraktı nar kabuğu hidroalkolik nar kabuğu grubu katılmış katılmış yoğurt sulu ekstraktı ekstraktı hidroalkolik yoğurt yoğurt örneği katılmış katılmış ekstraktı örneği örneği yoğurt örneği yoğurt örneği katılmış yoğurt örneği 21 gün boyunca +4°C’de depolanmıştır. 1.Gün alınan 7.Gün alınan 14.Gün alınan 21.Gün alınan örnek örnek örnek örnek (2 Tekrar) (2 Tekrar) (2 Tekrar) (2 Tekrar) Fizikokimyasal Fizikokimyasal Fizikokimyasal Fizikokimyasal analizler analizler analizler analizler Mikrobiyolojik Mikrobiyolojik Mikrobiyolojik Mikrobiyolojik analizler analizler analizler analizler Spektroskopik Spektroskopik Spektroskopik Spektroskopik analizler analizler analizler analizler Duyusal/Tekstür Duyusal/Tekstür Duyusal/Tekstür Duyusal/Tekstür Profil Analizleri Profil Analizleri Profil Analizleri Profil Analizleri 6 x 2 x 4=48 örnek Elde edilen 6 farklı yoğurt türünün fizikokimyasal özelliklerinin belirlenmesi için kuru madde, süt yağsız kuru madde oranı, yağ miktarı, pH, titre edilebilir asitlik, kül, toplam protein ve laktoz analizleri yapılmıştır. 57 Kuru madde analizinde, sabit tartımdaki içinde 25 g kadar kum ve cam çubuk bulunan kurutma kapları kapaklarıyla tartılarak darası tespit edilmiştir. Homojen haldeki yoğurttan kurutma kabına ~3 g kadar tartılmış, yoğurt cam çubukla bir miktar saf su konularak kumla karıştırılmıştır. Kurutma kap ve kapakları 105±2°C’a ayarlanmış etüvde 2 saat 30 dk bırakıldıktan sonra kapakları kapatılarak desikatöre alınmış ve oda sıcaklığında tartılmıştır. Yağ analizinde, homojenleştirilmiş yoğurttan behere 50 g tartılmış, üzerine 5 mL amonyak çözeltisi (%25’lik) eklenmiştir. Cam çubukla karıştırılmıştır. Bütirometrenin içine 10 mL sülfirik asit (dH2SO4=1,82 g/mL), pipetle alınan 11 mL süt örneği ve 1 mL izoamil alkol (d=0,812-0,818 g/mL) eklenmiştir. Bütirometre tıpa ile kapatılıp alt üst edilerek santrifüje yerleştirilip 5 dk süre ile 55°C’de santrifüjlendikten sonra yağ değeri okunmuştur. Yoğurt örneklerinde süt yağsız kuru madde oranı, kuru madde değerinden süt yağı değeri çıkarılarak hesaplanmıştır. pH analizinde, yoğurdun içine pH-metrenin elektrodu daldırılıp enstrümental olarak ölçülmüştür. Titre edilebilir asitlik analizinde, yoğurttan behere 10 g tartılıp üzerine 10 mL 40ºC’ye getirilmiş saf sudan eklenmiştir. Sonra 1 mL %1’lik fenolftalein çözeltisi konulup 0,1 M sodyum hidroksit çözeltisi ile 5 sn sabit kalabilen hafif pembe renge kadar titre edilip sarfiyat kaydedilmiştir. Kül tayininde, önceden darası alınmış porselen krozeye yoğurttan ~2 g tartılmış, bek alevinde ön yakma işlemi yapılmıştır. Sonra 500-600ºC’a ayarlanmış kül fırınına homojen beyazımsı bir renk alıncaya kadar (~6 saat) konulmuştur. Desikatörde soğutularak, tartılmıştır. Toplam protein analizi yukarıda belirtildiği gibi ~1,5-2 g yoğurt ile gerçekleştirilmiştir. 58 Laktoz analizinde ise süt tozundan 20 g 250 mL’lik ölçü balonuna tartılmıştır. 2’şer mL Carrez I ve Carrez II eklendikten sonra balon çizgisine tamamlanmış, 2 mL daha su eklenmiştir. 15 dk bekledikten sonra süzülmüştür. Süzüntüden 50 mL, 100 mL’lik ölçü balonuna konulup çizgisine kadar su ile tamamlanmıştır ve sonra titrasyon yapılıp sarfiyat kaydedilmiştir. Yoğurtların mikrobiyolojik analizi için ise M17 ve MRS agar tayini yapılmıştır (Çizelge 3.9). Yoğurttan alınan en az 10 g numune 90 mL MRD ile aseptik koşullarda homojenize edildikten sonra 1/10’luk seri dilüsyonlar hazırlanarak her iki bakteri türüne ait petri kaplarına ayrı ayrı ekimler yapılmış ve 37oC’de Laktobacillus delbruecki subsp. bulgaricus sayımı için 72 saat, Streptecoccus thermophilus sayımı için 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. En son olarak koloni sayımı gerçekleştirilmiştir. Serum ayrılması analizinde ise tartılan miktarlardan (25 g) buzdolabı sıcaklığında (+4°C) 2 saat sonunda kaba filtre kağıdından geçerek ayrılan serumlar volumetrik olarak (mL) ölçülüp hesaplanmıştır (Çizelge 3.9). Aynı zamanda üretilen yoğurtların spektroskopik analizleri de yapılmıştır. Ölçümler 3’er paralel olarak alınmıştır. 6 farklı yoğurt örneğinden 1 g alınıp üzerine 5 mL %80 (h/h) etil alkol-su karışımı eklenmiş ve 1 dk vorteks edilmiştir. Daha sonra tüpler 3000 rpm’de 10 dk boyunca santrifüj edilerek santrifügattan 100 μL alınıp Bölüm 3.2.2’de anlatıldığı gibi toplam fenolik madde tayini için Folin-Ciocalteu yöntemi, antioksidan kapasite tayini için ABTS yöntemi yapılmıştır. Elde edilen 6 farklı yoğurtta bulunan organik asitlerin analizi depolamanın 1., 7., 14. ve 21. günlerinde alınan örnekler üzerinden Gıda ve Yem Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü’nde HPLC-DAD ile kromatografik olarak yapılmış olup, ppm cinsinden tespit edilmiştir. Bunun için 6 farklı gruptan 2’şer g yoğurt numunesi falkon tüplere tartılmış, üzerilerine 40’ar mL saf su konulmuştur. Heidoph marka çalkalayıcıda 50 rpm’de 1 saat boyunca çalkalanmıştır. Daha sonra Sigma marka santrifüjde 22ºC ve 4500 rpm’de 10 dk santrifüj edilip santrifügattan şırınga ile çekilmiş ve 0,45 μm’lik hidrofilik PVDF Millipore Millex-HV filtreden viallere süzülmüştür. Yoğurt örneği 59 ekstraktları Shimadzu Prominence-İ LC-2030C 3D Plus Liquid Chromatograph sistemi ile analiz edilmiştir. Analiz sırasında AQ-C18 (4,0 x 150mm, 3µm) kolonu kullanılmıştır. 20 dk’lık izokritik akışta fosfat tamponu (0,002 M KH2PO4 ile hazırlanmış KH2PO4/o-H3PO4, pH=2,40) çözelti sistemi olarak hazırlanmış, 10 µL enjeksiyon hacmi ve 0,6 mL/dk akış hızında mobil faz olarak kullanılmıştır. Ölçümler tespit edilen organik asitlere göre farklı dalga boylarında yapılmıştır (Çizelge 3.9). Yine elde edilen 6 farklı yoğurtta bulunan karbonil bileşenlerinin analizi de Gıda ve Yem Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü’nde depolamanın başında (1. gün) ve sonunda (21. gün) alınan örneklerde 5977A kodlu Agient Technologies GC- MS-FID-HS sistemi ile yapılmıştır. Cihaz 7697A kodlu Headspace Sampler ve 7890B GC sistemlerinden oluşmaktadır. 5’er g tartılan yoğurt örnekleri GC-Headspace viallerine konulmuştur. Aroma kaybı olmaması için crimper ile kapakları hemen kapatılmış ve analize alınmıştır (Çizelge 3.9). Tekstür profil analizleri kapsamında viskozite (index of viscosity), kıvam (consistency), iç yapışkanlık (cohesiveness) ve sıkılık (firmness) analizleri Gıda ve Yem Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Duyusal Laboratuvarı’nda TA.XT-plus Texture Analyser (Stable Micro Systems) cihazı ile yapılmıştır. Ölçümlerde “back extrusion cell” ve 5 kg’lık “load cell” kullanılmıstır. “Yoghurt Project” başlıklı proje ile çalışılmış olup testler 1 mm/sn hızda ve 10 mm daldırma mesafesinde yapılmıstır. Analiz için 100’er mL steril kaplardaki yoğurt örnekleri depolamanın 1., 7., 14. ve 21. günlerinde yoğurda özel A/BE-d35, “Back Extrusion Rig” 35 mm disk takılı probla işleme alınmıştır. Sonuçlar toplanarak analiz edilmiştir. Renk ölçümünde ise L/a/b değerlerinin tespiti için renk tayini cihazı (Hunter-Lab) kullanılmıştır. Analiz öncesinde refraktometre açılarak 5 dk optik ışık yoğunluğunun dengelenmesi için beklenmiştir. Behere alınan bir kısım numune saf su ile seyreltilip, homojen hale getirilmiştir. Örnekler refraktometrede 20°C suda çözünür kuru maddesi 12 brikse getirilene kadar seyreltilerek karıştırılmıştır. Hunter Lab okuma kabına ve cihaza yerleştirilmiş ve 6 farklı yoğurdun değeri paralelli olarak okunmuştur (TS 1466). 60 Üretimi gerçekleştirilen 6 farklı yoğurdun depolamanın 1., 7., 14. ve 21. günlerinde alınan örneklerinin duyusal değerlendirmesi, Gıda ve Yem Kontrol Merkez Araştırma Enstitüsü Müdürlüğü Duyusal Laboratuvarı’nda daha önceden duyusal muayene eğitimi almış 6 kişilik bir ekip ve tez danışmanı Bursa Uludağ Üniversitesi öğretim üyesi Prof. Dr. Saliha Şahin tarafından gerçekleştirilmiştir. Yoğurtla renk, görünüş, kıvam (kaşıkta), kıvam (ağızda), koku, tat, duyusal asitlik ve genel kabul edilebilirlik parametrelerine göre 5 puanlık skala kullanılarak değerlendirilmiştir. Ayrıca yoğurtların satın alma niyetleri de “Kesinlikle Alırım”, “Alırım”, “Belirsiz”, “Almam” ve “Kesinlikle Almam” şeklinde derecelendirilmiştir. Duyusal muayene için kullanılan formun bir örneği aşağıdaki gibidir (Şekil 3.4). Tüm analizlerde elde edilen sonuçların değerlendirilmesi için, yoğurtlarda örnek çeşitleri ve depolama süreleri arasındaki farklılığı belirlemek üzere tesadüf parselleri deneme deseni ile buna göre varyans analizi uygulanmıştır. Örneklerde temel istatistiki değerler belirlenmiş ve varyans analizi sonuçlarına göre önemli bulunan varyasyon kaynaklarının, Fischer çoklu karşılaştırma testi ile p<0.05 düzeyinde karşılaştırmaları yapılmıştır. Sonuç olarak, örnek çeşidi ve depolama sürelerinin oluşturdukları farklılıklar ortaya konulmuştur (MINITAB 17 Statistical Software). 61 …gün YOĞURT DUYUSAL DEĞERLENDİRME FORMU Panelistin Adı Soyadı : Tarih : … / … / ………... Ürün Adı : Saat : … : … Örnek Adları/Kodları Kalite Kriterleri YC YM YNS YNSE YNH YNHE Renk Görünüş Kıvam (Kaşıkta) Kıvam (Ağızda) Koku Tat Duyusal Asitlik Genel Kabul Edilebilirlik Açıklama: Aşağıda verilen kalite kriterleri açısından size verilen kodlu örnekleri ayrı ayrı 5 puan üzerinden değerlendiriniz. Puan Değerleri İle İlgili Açıklama 1. Çok Kötü 2. Kötü 3. Orta 4. İyi 5. Çok İyi Kalite Kriterleri İle İlgili Açıklama İstenen Özellikler İstenmeyen Özellikler Renk:-Temiz, parlak-Homojen renk dağılımı -Temiz, mat (Daha az) Renk:-Temiz olmayan, mat -Homojen olmayan renk dağılımı Görünüş:-Serum ayrılması olmamış -Çatlak ve gaz kabarcığı bulunmayan, homojen - -Gözenekli/ lekeli/ çatlak Pürüzsüz yapı -Yabancı Madde İçermeyen Görünüş:-Serum ayrılması olmuş -Çok sayıda çatlak ve gaz kabarcığı olan, homojen Kıvam (Kaşıkta):-Kesitte dolgun, düzgün yapıda, homojen olmayan -Pütürlü yapı -Gözle görülebilen her türlü yabancı madde –Karıştırıldığında koyu bir akıcılık-Serumu hemen ayrılmayan, serumu az ayrılan Kıvam (Kaşıkta):-Kesitte çok akıcı, homojen olmayan ve pütürlü Kıvam (Ağızda):-Dille damak arasında kolayca dağılmayan, en az dağılan -Dolgun yapıda, -Karıştırıldığında çok akıcı-Serumu hemen ve fazla miktarda ayrılan homojen Kıvam (Ağızda):-Dille damak arasında tutulamayan, akıcı -Dipte tortu bulunduran Koku:-Kendine özgü -Hoş koku -Yosun kokusu -Meyvemsi koku Koku:-Kendine özgü olmayan -Yavan ya da ekşi koku -Sabunumsu -Küf kokusu Tat:-Kendine özgü (hafif ekşimsi) -Hafif ekşimsi, Hafif Tatlımsı (Daha az) -Yosunumsu tat - Tat:- Ekşi acımsı, küfümsü, yem kokusu -Yoğun düzeyde yabancı tat, kükürt, acılık, küf, Meyvemsi tat asidite SATIN ALMA NİYETİ Kesinlikle Alırım Alırım Belirsiz Kesinlikle Almam Almam Örnek Adları/Kodları Şekil 3.4. Duyusal muayene form örneği 62 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. Spirulina Mikroalgi ile Yapılan Çalışmalar Toplam protein miktarının tayin edilmesi için standart sığır serum albumin (BSA) ile çizilen Çizelge 4.1’deki kalibrasyon grafiği değerleri kullanılarak Spirulina mikroalginin toplam proteini %40,00±0,01 olarak hesaplanmıştır. Çizelge 4.1. Spirulina mikroalginin toplam protein miktarı tayini Derişim (mg/L BSA) y denklemi R2 2-40 y=0,0155x+0,0177 0,9992 Kjeldahl metodu ile yapılan protein tayinine göre ise benzer şekilde Spirulina mikroalginin toplam proteini 41,55±2,44 (%95 k=2) olarak hesaplanmıştır (F=1,0 Kör:0,1) (AOAC Official Method 991.20). Spirulina’nın bu yüksek protein değerinin, katıldığı gıdada toplam proteini artırabileceği düşünülmektedir. Mikroalg yüzeyindeki heterojenez fonksiyonel grupların, aktif malzeme yükleme kapasitesi güçlüdür (Domozych, 2011). Çalıştığımız yüksek protein içerikli Spirulina mikroalgi de ellagik asit enkapsülasyonu açısından avantaj sağlamaktadır. Ayrıca ellagik asit protein bileşeninde olduğu gibi lipid, polisakkarit vb. diğer fonksiyonel gruplarla da etkileşime girebildiğinden, mikroalg hücreleri üzerine kapsüllenmesinde kolaylık sağlanacaktır. Spirulina ekstraktı ile yapılan kromatografik analiz sonuçlarına göre tutunma süreleri standart karotenoidler ile karşılaştırılarak pikler elde edilmiş ve sonuçta dört farklı karotenoid tespit edilmiştir. Bu karotenoidler, Şekil 4.1’de görüldüğü gibi α-karoten, β- karoten, β-kriptoksantin ve zeaksantindir. 63 35 30 25 1 20 15 10 4 5 2 3 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Zaman (dk) Şekil 4.1. Spirulina hidroalkolik ekstraktının HPLC kromatogramı (450 nm) 1. Zeaksantin (22.76 dk) 2. ß-kriptoksantin (28.28 dk) 3. α-karoten (32.94 dk) 4. ß- karoten (36.40 dk) Standart karotenoidler tarafından çizilen kalibrasyon grafiklerinin y denklemine ve kromatogramda tespit edilen karotenoidlerin pik alanlarına göre, Spirulina mikroalgindeki α-karoten 11,93 mg/kg, β-karoten 18,81 mg/kg, β-kriptoksantin 28,01 mg/kg ve zeaksantin 16,58 mg/kg olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.2). Mikroalgde miktarca en çok bulunan karotenoid β-kriptoksantindir. Çizelge 4.2. Karotenoidlerin HPLC-DAD analiz koşulları Karotenoid Derişim y denklemi R2 Spirulina mikroalginde (mg/L) bulunan miktar (mg/kg) α-Karoten y=118,09x-17,225 0,999 11,93 ß- Karoten 0,25-10 y=154,56x-19,5 0,998 18,81 ß-kriptoksantin y=57,735x-22,287 0,997 28,01 Zeaksantin y=265,7x-23,055 0,998 16,58 4.2. Nar Kabuğu Ekstraktlarının Analizi Şekil 4.2 ve Şekil 4.3’te nar kabuğunun hidroalkolik ve sulu ekstraktlarına ait kromatogramları görülmektedir. Kromatogramlara bakıldığında ellagik asit 22,82 dk (hidroalkolik ekstrakt) ve 22,74 dk (sulu ekstrakt)’larda tespit edilmiştir. 64 Absorbans (mAu) 600 500 3 400 300 200 1 2 100 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Zaman (dk) Şekil 4.2. Nar kabuğu hidroalkolik ekstraktının HPLC kromatogramı (360 nm) 1. Ellagik asit türevi (19.64 dk) 2. Ellagik asit türevi (21.89 dk) 3. Ellagik asit (22.82 dk) 1400 1200 1000 800 600 400 3 1 200 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Zaman (dk) Şekil 4.3. Nar kabuğu sulu ekstraktının HPLC kromatogramı (360 nm) 1. Ellagik asit türevi (19.58 dk) 2. Ellagik asit türevi (21.87 dk) 3. Ellagik asit (22.74 dk) HPLC kromatogramlarına göre nar kabuğu ekstraktlarındaki ellagik asit miktarları kalibrasyon grafiğinin y denklemine göre hesaplanmıştır (Çizelge 4.3). 65 Absorbans (mAu) Absorbans (mAu) Çizelge 4.3. Nar kabuğu ekstraktlarında bulunan ellagik asit miktarı Derişim (mg/L ellagik asit) y denklemi R2 3-24 y=10,45x-23,592 0,9909 Buna göre nar kabuğu hidroalkolik ekstraktında 6,83 mg/g örnek, sulu ekstraktında ise 4,07 mg/g örnek olarak belirlenmiştir. Ekstraktlarda bulunan punikalin, punikalagin ve p-kumarik asidin de temin edilen standartlarla HPLC-DAD analizleri yine aynı çalışma koşulları ile yapılmıştır. Tüm ölçümler 260, 280, 320 ve 360 nm dalga boylarında yapılmıştır. Şekil 4.4 ve Şekil 4.5’te nar kabuğunun hidroalkolik ve sulu ekstraktlarına ait kromatogramları görülmektedir. Kromatogramlara bakıldığında punikalin 5.73 dk’da, punikalagin 12.05 dk’da, p-kumarik asit 24.16 dk’da tespit edilmiştir. Ellagik asit ise 23.32 dk’da tespit edilmiştir. Bu HPLC analizleri ön denemelerle eş zamanlı yapılmadığı için alıkonma zamanlarında farklılık oluşmuştur. 1800 1 1600 1400 1200 4 1000 800 600 400 2 3 200 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Zaman (dk) Şekil 4.4. Nar kabuğu hidroalkolik ekstraktının HPLC kromatogramı (280 nm) 1. Punikalin (5.73 dk) 2. Punikalagin (12.05 dk) 3. Ellagik asit (23.32 dk) 4. p-Kumarik asit (24.16 dk) 66 Absorbans (mAu) 2500 1 2000 1500 1000 4 500 2 3 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Zaman (dk) Şekil 4.5. Nar kabuğu sulu ekstraktının HPLC kromatogramı (280 nm) 1. Punikalin (5.73 dk) 2. Punikalagin (12.05 dk) 3. Ellagik asit (23.32 dk) 4. p-Kumarik asit (24.16 dk) Çizelge 4.4. Kalibrasyon grafikleri 2Doğrusal aralık(ppm) y denklemi R Sulu/Hidroalkolik ekstrakt Punikalin 3-20 ppm y = 67,411x - 88,958 0,9955 Punikalagin 5-20 ppm y = 9,9797x - 20,957 0,9952 Ellagik asit 1-20 ppm y = 43,281x - 11,731 0,9991 p-kumarik asit 1-20 ppm y = 131,27x + 5,0257 0,9999 HPLC kromatogramlarına göre nar kabuğu ekstraktlarındaki punikalin, punikalagin, ellagik asit ve p-kumarik asidin miktarları kalibrasyon grafiğinin y denklemine göre hesaplanmıştır. Buna göre nar kabuğu hidroalkolik ekstraktında ve sulu ekstraktında ayrı ayrı belirlenen miktarlara Çizelge 4.5’te yer verilmiştir. Sonuç olarak, sulu ekstrakt içinde en fazla bulunan fenolik bileşik ellagik asit (4,84 mg/g) ve punikalagin (4,38 mg/g); hidroalkolik ekstrakt içinde en fazla bulunan fenolik madde ise punikalagin (13,24 mg/g) ve punikalindir (6,43 mg/g). 67 Absorbans (mAu) Çizelge 4.5. Nar kabuğu ekstraktlarında bulunan fenolikler Fenolik bileşikler Su ekstrakt (mg/g) Hidroalkolik ekstrakt (mg/g) Punikalin 1,81 ± 0,03 6,43 ± 0,42 Punikalagin 4,38 ± 0,04 13,24 ± 0,15 Ellagik asit 4,84 ± 0,08 5,06 ± 0,03 p-kumarik asit 0,04 ± 0,00 0,08 ± 0,00 Nar kabuğunun ekstraksiyon verimini hesaplayabilmek için 4 farklı fenolik bileşik için geri kazanım çalışmaları yapılmıştır (Çizelge 4.6). Pik alanlarının belirlenmesi için her bir standart fenolik bileşikten Çizelge 4.4’te belirlenen derişim aralıklarında hazırlanmıştır. Kromatografik olarak incelenip her bir standardın pik alanları belirlenmiş olup doğru denklemleri kullanılarak asıl derişimlerine geçilmiştir. Aynı zamanda belirlenen derişimlerde hazırlanan standart fenolik bileşiklerin nar kabuğu ile aynı koşullarda ekstraksiyonu yapılarak kromatografik olarak incelenmiş ve pik alanları belirlenmiştir. Ekstraksiyon işleminden sonraki derişimler yine standartların doğru denklemi üzerinden hesaplanmıştır. Sonuç olarak, elde edilen verilerle 4 standart fenolik bileşiğinin ekstraksiyondan sonraki % verim değerleri belirlenmiştir. Çizelge 4.6. Geri kazanım çalışmaları (n=3) λ (nm) LOD LOQ Tekrarla- Gerikazanım verimi (%) (ppm) (ppm) nabilirlik (%RSD) Sulu Hidroalkolik Punikalin 260 0,56 1,86 1,13 111,84±1,26 110,02 ± 5,20 Punikalagin 260 0,52 1,73 0,65 106,04±1,77 102,53 ± 6,73 Ellagik asit 360 0,06 0,19 1,51 95,75 ±3,39 100,27 ± 2,76 p-kumarik asit 320 0,08 0,27 1,16 94,63±5,43 106,05 ± 1,13 Tez çalışmasında kullanılan nar kabuğu ve Spirulina ekstraktlarının toplam fenolik madde miktarlarını belirlemek için Folin-Ciocalteu yöntemi, antioksidan kapasitelerini belirlemek için ise ABTS, Chromac ve Cuprac yöntemleri kullanılmıştır. Elde edilen veriler Çizelge 4.7’de verilmiştir. Buna göre, sulu ekstraktın (36,07 mg GAE/g örnek) toplam fenolik madde miktarı hidroalkolik ekstrakta (31,72 mg GAE/g örnek) göre daha fazladır. Antioksidan kapasite açısından ABTS ve Chromac 68 yöntemlerine göre sulu ekstrakt daha fazla iken; Cuprac yöntemine göre hidroalkolik ekstraktın antioksidan kapasitesi daha yüksek bulunmuıştur. Spirulina ekstraktının toplam fenolik madde miktarı ve antioksidan kapasitesi nar kabuğu ekstraktlarına nazaran daha düşük bulunmuştur. Çizelge 4.7. Antioksidan kapasite ve toplam fenolik madde tayin sonuçları mg GAE/ mg troloks/g örnek±std sapma g örnek ±std sapma ABTS Chromac Cuprac Folin Sulu ekstrakt 282,83±7,85 63,29±0,06 478,46±13,81 36,07±0,30 Hidroalkolik ekstrakt 201,67±1,84 60,00±0,41 494,76±0,27 31,72±1,90 Spirulina ekstraktı 77,63±1,20 4,62±3,97 3,68±0,45 8,38±0,98 4.3. Enkapsülasyon Çalışmaları Ellagik asidin Spirulina üzerine adsorpsiyonu, karıştırma süresinin bir fonksiyonu olarak incelenmiştir. Bolüm 3.2.3’te de belirtildiği gibi, ilk olarak nar kabuğu hidroalkolik/sulu ekstraktları ve Spirulina 6 saat boyunca hidroalkolik/sulu çözücü ortamlarında ayrı ayrı enkapsüllenmiştir. 2., 4. ve 6. saat aralıklarından alınan numuneler karakterize edilmiştir. 70 60 50 40 30 20 Nar kabuğu hidroalkolik ekstraktı 10 Nar kabuğu su ekstraktı 0 0 2 Sa4at 6 8 Şekil 4.6. 2., 4. ve 6. saat aralıklarında tutunma yüzdesi (%) grafiği 69 Tutunma yüzdesi (%) Şekil 4.6’da gösterildiği gibi, mikroenkapsülleme süresi arttığında enkapsülleme verimliliği azalmıştır. Buna göre, mikroenkapsüllemenin maksimum verimde gerçekleştirildiği süre 2 saat olarak belirlenmiştir. Bu saatin sonunda ellagik asidin maksimum adsorpsiyon kapasitesi (qm) 56,2±1,7 mg/100 mg Spirulina (EY=%56,2)’dır. Daha sonra, belirlenen bu süre içinde adsorpsiyon izotermleri ile ilgili diğer prosedürler gerçekleştirilmiştir. 4.4. FT-IR, DSC ve SEM Analizleri Çalışmaları FT-IR çalışmaları kapsamında çalışılmış nar kabuğu ekstraktı, Spirulina ve enkapsüllenmiş nar kabuğu hidroalkolik/sulu ekstraktlarına ait tüm pikler Şekil 4.7 b’de verilmiştir. Spirulina üzerine mikroenkapsüllenmiş hidroalkolik/sulu ekstraktların IR spektrumları ile yüklü olmayan Spirulina spektrumu benzerdir. Neredeyse aynı piklere ve bantlara rastlanmıştır. Buradan, nar kabuğundan ekstrakte edilen ellagik asidin mikroalg hücreleri içine mikroenkapsüllenmesinin başarıyla gerçekleştiği düşünülmüştür. Nar kabuğu spektrumunu diğerlerinden ayıran şey ise daha çok ellagik asit ile ilgili spektrum bantlarıdır. Spirulina hücre bileşenleriyle etkileşiminden dolayı nar kabuğunda oluşmuş piklerin büyük çoğunluğu diğer 3 spektrumda gözlemlenmemiştir. Referans çalışmaya bakarak da mikroenkapsüllemenin gerçekleştiği kanısına varılmıştır (Jafari ve diğerleri, 2016). Burada da yine benzer pikler/bantlar görülmektedir. Alg ile kurkuminin etkileşimine ait pikler algin pikleri ile benzerdir (Şekil 4.7 a). Şekil 4.7 b’ye detaylı olarak bakıldığında, tüm numune spektrumlarında -OH gerilmesi ve moleküller arası hidrojen bağlarından dolayı geniş bir bant tespit edilmiştir. Nar kabuğu için 3288 cm-1, Spirulina için 3283 cm-1, hidroalkolik ekstrakt mikroenkapsülü için 3273 cm-1 ve sulu ekstrakt mikroenkapsülü için 3277 cm-1 civarındadır. Nar kabuğunun piki, diğerlerinden farklı olup daha geniştir. 70 100 98 96 94 92 90 88 86 84 82 80 Nar kabuğu 78 Spirulina 76 Enkapsüle edilen nar hidroalkolik ekstraktı 74 Enkapsüle edilen nar su ekstraktı 72 70 3800 3300 2800 2300cm-1 1800 1300 800 300 B Şekil 4.7. FTIR spektrumları a. Referans çalışma b. Tez çalışması Nar kabuğu dışındaki spektrumlarda, -CH3 asimetrik gerilme titreşimleri gözlenmiştir (Spirulina 2957 cm-1, hidroalkolik ekstrakt mikroenkapsülü 2959 cm-1 ve sulu ekstrakt mikroenkapsülü 2956 cm-1). C-H simetrik gerilme titreşimleri ise nar kabuğunda 2851 cm-1, Spirulina’da 2846 cm-1, hidroalkolik ekstrakt mikroenkapsülünde 2845 cm-1 ve sulu ekstrakt mikroenkapsülünde 2844 cm-1’de görülmüştür. 71 %T Spirulina’da 1639 cm-1, hidroalkolik ekstrakt mikroenkapsülünde 1622 cm-1 ve sulu ekstrakt mikroenkapsülünde 1624 cm-1’teki güçlü ve keskin bantların, C=O gerilmesinden dolayı olduğu düşünülmüştür. Ancak nar kabuğu spektrumunda daha az keskin olan C=O gerilme piki (1716 cm-1’de) daha büyük dalga sayısında oluşmuştur. C=O piklerine ek olarak, N-H bükülme ve C-N gerilme titreşimlerinin kombinasyonu (yaklaşık 1536 cm-1’de) proteinle ilgilidir. Benzer şekilde, lipid içeren pikler (ester karbonil grubundan gelen yan zincirin C-H gerilme titreşimi ve C=O gerilme titreşim modu) yaklaşık 1732 cm-1’de görülmüştür. Polisakkaritlerin C-O-C’sine bağlı karbohidrat absorpsiyon bantları tüm spektrumlarda yaklaşık 1149 cm-1, 1077 cm-1, 1024 cm-1’de görülmüştür. Diğer pikler birbirine benzemektedir. Yine aynı şekilde DSC termogramlarına bakıldığında da, elde edilen enkapsüllerin erime, kaynama veya süblimleşme noktaları gibi fiziksel hallerinde bazı değişiklikler olmuştur (Şekil 4.8). 50 40 30 20 SSppiruirliunalina HHidirdoarlokaolliko elkisktraekkt strakt 10 SSuluul euk setrkasktrakt EElllalgaikg aiksi tasit 0 30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 Sıcaklık (°C) Şekil 4.8. Ellagik asit, yüklü ve yüklü olmayan Spirulina’ların DSC termogramları 72 Isı akışı (Endo up-mW) Ellagik asit termogramında, suyun yapıdan uzaklaştırılmasıyla ilgili olarak 125°C’de endotermik bir pik vardır. Ellagik asidin erime noktası 298,69°C’dir. Bu aynı zamanda endotermik piktir. İlerleyen sıcaklıklarda ise termal bozunma başlamıştır. Spirulina’nın DSC termogramında iki karakteristik endotermik pik tespit edilmiştir. Bu pikler, suyun mikroalg boşluğundan atılmasından kaynaklı 82°C’de ve erime noktası dolayısıyla 235°C’de görülmüştür. Mikroalg endotermik pikleri ise ellagik asitten farklı olarak daha düşük sıcaklıklarda görülmüştür. Ellagik asit-Spirulina komplekslerinin termogramlarına bakıldığında ise, su buharlaşma pikleri (hidroalkolik ekstrakt: 80°C ve sulu ekstrakt: 85°C) Spirulina ile benzer sıcaklıklarda görülmüştür. Erime ile ilgili endotermik pikler daha yüksek sıcaklıklarda tespit edilmiştir (hidroalkolik ekstrakt: 254,86°C ve sulu ekstrakt: 260,15°C). Termogramda 125°C’de bir endotermik pik bulunmamaktadır. Bu da ellagik asidin mikroalg hücrelerinde amorf olarak bulunduğunu düşündürmektedir. Yine ellagik asitten farklı erime sıcaklıklarının görülmesi de, ellagik asidin düzenli olarak yerleştiğini ve kompleksin mikroalg hücrelerinde oluştuğunu göstermektedir. Mikroalg hücrelerinde homojen bir oluşum olduğu anlamına gelmektedir. Kör ve hidroalkolik/sulu nar kabuğu ekstraktları içeren Spirulina mikropartiküllerin yüzey morfolojisi incelenmiş olup görüntüleri 1000x ve 2000x büyütme ile Şekil 4.9’da verilmiştir. Görüntülere bakıldığında, boş Spirulina ve Spirulina üzerine enkapsüllenmiş nar kabuğu hidroalkolik/sulu ekstraktlarının yüzeyleri arasında büyük bir fark olduğu anlaşılmıştır. Boş Spirulina mikropartiküllerinin 1000x büyütmeli yapılarında düz bir yüzeye sahip dairesel şekiller görülmektedir (Şekil 4.9 a). Spirulina üzerine enkapsüllenmiş ellagik nar kabuğu hidroalkolik/sulu ekstraktlarının her ikisinde de kapsülleme izleri benzerdir. Bu durum daha yakın çekim görüntülerinde net olarak gözlemlenmiştir. Yüklü Spirulina mikropartikülleri ise pürüzlü yüzeyde olup düzensiz şekillere sahiptir. Farklı boyutlarda oluşmuş bu yapılar, şekilsizdir (Şekil 4.9 b ve 4.9 d). Aynı şekilde, 73 Şekil 4.9 c ve 4.9 e’de, 2000x büyütme ile görüntülenen Spirulina mikropartiküllerinin yüzeylerinde gözlemlenen adsorpsiyon daha yakından çok net anlaşılmıştır. A B C D E Şekil 4.9. Yüklü ve yüklü olmayan Spirulina’ların yüzeylerinin SEM görüntüleri A) Boş Spirulina B) ve D) Spirulina/hidroalkolik ve Spirulina/sulu ekstraktları (1000x büyütme) C) ve E) Spirulina/hidroalkolik ve Spirulina/sulu ekstraktları (2000x büyütme) SEM, FT-IR ve DSC analizlerinin sonuçlarına bakıldığında, nar kabuğu ekstraktlarındaki ellagik asidin Spirulina mikroalgine mikroenkapsülasyonunun gerçekleştiği kanısına varılmıştır. 74 4.5. Adsorpsiyon İzoterm Çalışmaları Langmuir izoterminde yüzeyde adsorbe edilmiş moleküller aynı adsorpsiyon enerjisine sahiptirler. Dolayısıyla homojen bir yapıda olduklarından yüzeydeki moleküller birbiriyle etkileşmezler. Öte yandan, Freundlich izotermlerinde ise adsorpsiyon heterojen yüzeylerde olmaktadır. Yani adsorban yüzeyinde farklı enerjiye sahip bölgeler bulunmaktadır. Ellagik asidin mikroalg yüzeyine adsorpsiyonunun dengesi kurulduktan sonra, çözelti fazında adsorbe edilen maddenin sabit konsantrasyonu belirlenmiş ve hidroalkolik/sulu ekstrakt deneylerinden elde edilen verilerle Langmuir ve Freundlich izoterm modelleri üzerinden izoterm grafikleri çıkartılmıştır (Şekil 4.10). Ayrıca Langmuir ve Freundlich izoterm modellerinin parametrelerine ait bilgiler de aşağıda verilmiştir (Çizelge 4.8). Çizelge 4.8. Langmuir ve Freundlich izoterm model parametreleri Langmuir izotermi sabitleri Freundlich izotermi sabitleri qm KL R2 n Kf R2 (mg/g) (L/mg) (mg/g)(mL/mg)1/n Hidroalkolik 2,14 260,09 0,9671 2,31 9,41 0,9824 ekstrakt Sulu 1,64 197,06 0,9648 1,99 9,64 0,9961 ekstrakt Çizelge 4.8 ve Şekil 4.10’daki sonuçlara göre, ellagik asidin mikroalg yüzeyine adsorpsiyonu, Freundlich izoterm denkleminde daha yüksek bir korelasyon değeri vermiştir (0,98’den büyüktür). Langmuir izoterm denklemi için R2 hidroalkolik ekstraktta 0,9671 ve sulu ekstraktta 0,9648’dir. Adsorpsiyon bölgelerinin homojenliğini yansıtan Langmuir modelinin korelasyonu daha düşük olmuştur. Bu korelasyon katsayısı Spirulina mikroalg yüzeyindeki heterojenez fonksiyonel gruplarına işaret eder, bu nedenle heterojen adsorpsiyon olduğu düşünülmüştür. 75 A B Şekil 4.10. Adsorpsiyon izotermi grafikleri A) Sulu ekstrakt-Langmuir izotermi B) Hidroalkolik ekstrakt-Langmuir izotermi 76 C D Şekil 4.10. Adsorpsiyon izotermi grafikleri (devam) C) Sulu ekstrakt-Freundlich izotermi D) Hidroalkolik ekstrakt-Freundlich izotermi Sonuç olarak, mikroalg üzerinde enkapsüle edilen ellagik asit miktarları değerleri ile çizilen adsorpsiyon izotermlerinde Freundlich izoterm modeli daha uygun bulunmuştur. 4.6. Fotokimyasal Kararlılık Çalışmaları Spirulina yüzeyinde tutunan ve dış etkenlere karşı korunan aktif bileşen ellagik asidin miktarı sıfırıncı günde %100 olarak kabul edilerek 7 günlük aralıklarla ölçüm yapılmıştır. Şekil 4.11’de görüldüğü gibi yüzeydeki ellagik asit miktarı her iki tür 77 ekstraktta da gün geçtikçe çok yavaş azalmıştır. Buradan, mikroenkapsülasyon yönteminin ellagik asidin kararlılığını korumak ideal olduğu düşünülmüştür. 4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 HHididroroalaklkoolilkik e ekkstsrtarkakt t 0.50 SSuululu e ekkstsrtarkakt t 0.00 0 7 Gün sayısı 14 21 Şekil 4.11. Enkapsüle edilen antioksidan maddenin fotokimyasal kararlılığı Bununla birlikte, Çizelge 4.9’da da gösterildiği gibi, sulu ekstraktlı mikroalgin yüzeyinde kalan ellagik asit miktarı hidroalkolik ekstraktlı olandan daha fazla olmuştur. Yani, sulu ekstrakt ile mikrokapsülleme yapıldığında ellagik asit daha kararlı olmuştur. Çizelge 4.9. Ellagik asidin mikroalg-nar kabuğu ekstraktlarındaki kararlılığı Depolama Süresi (Gün) 0 7 14 21 Hidroalkolik ekstrakt 100 98,86 ± 0,05 96,41 ± 0,06 93,92 ± 5,92 Sulu ekstrakt 100 99,47 ± 0,25 99,06 ± 0,03 94,63 ± 3,30 4.7. Optimizasyon Çalışmaları Bölüm 3.2.7’de verilen denklem 3.4’te gösterildiği gibi ikinci dereceden polinom modeli elde etmek için bağımsız değişkenlerin ve yanıt değişkenlerinin ilgili verileri analiz edilmiştir. Faktörlerin Box Behnken tasarımı ve 17 deney için deneysel ve tahmin edilen ellagik asit (mg) miktarları Çizelge 4.10’da gösterilmiştir. 78 mg gallik asit/g örnek Çizelge 4.10. Box-Behnken tasarımı Faktörler Enkapsüllenen ellagik asit miktarları (mg) Deney x1 x2 x3 Deneysel Tahmini Sıcaklık(°C) Enkapsülleme Ekstrakt/Mikroalg süresi (dk) (mL/g) 1 25 30 2 9,64 9,99 2 45 30 2 7,31 7,69 3 25 180 2 9,82 9,43 4 45 180 2 4,29 3,95 5 25 105 1 5,28 5,21 6 45 105 1 2,63 2,52 7 25 105 3 12,31 12,42 8 45 105 3 7,27 7,34 9 35 30 1 4,79 4,52 10 35 180 1 3,63 4,08 11 35 30 3 12,69 12,24 12 35 180 3 8,10 8,38 13 35 105 2 7,32 7,08 14 35 105 2 7,52 7,08 15 35 105 2 7,10 7,08 16 35 105 2 6,87 7,08 17 35 105 2 6,61 7,08 Yukarıda da görüldüğü gibi, deneysel ve tahmin edilen değerler arasında yakın bir ilişki söz konusudur. Bu, geliştirilen modelin kabul edilebilir bir yanıtı anlamına gelmektedir. 17 deneyden, deney 7 (25°C sıcaklık, 105 dk enkapsülleme süresi, 3 mL/g ekstrakt/mikroalg oranı) ve deney 11 (35°C sıcaklık, 30 dk enkapsülleme süresi, 3 mL/g ekstrakt/mikroalg oranı) iki maksimum miktarda ellagik asit üretmiştir (sırasıyla 12,31 ve 12,69 mg). En düşük ellagik asit miktarı (2,63 mg) deney 6’da (45°C sıcaklık, 105 dk enkapsülleme süresi, 1 mL/g ekstrakt/mikroalg oranı) gözlemlenmiştir. Spirulina’da enkapsüllenen ellagik asidin optimizasyonu için enkapsülleme sıcaklığı ile ekstrakt/mikroalg oranı arasında ters bir ilişki tespit edilmiştir. Çizelge 4.11 ise, ellagik asit enkapsülasyonunun optimizasyonu için uygulanan ikinci dereceden polinom modeli için ANOVA’nın sonuçlarını göstermektedir. 79 Çizelge 4.11. Enkapsülasyon optimizasyonu için ANOVA analizi Kaynak Kareler Serbestlik Alan toplamı derecesi karesi F-değeri p değeri Prob>F Model 120.38 9 13.38 57.51 < 0.0001a x1 30.20 1 30.20 129.85 < 0.0001a x2 9.21 1 9.21 39.62 0.0004a x3 72.28 1 72.28 310.74 < 0.0001a x1x2 2.54 1 2.54 10.94 0.0130 a x1x3 1.42 1 1.42 6.10 0.0428 a x2x3 2.94 1 2.94 12.62 0.0093 a x12 0.066 1 0.066 0.29 0.6099 b x22 1.31 1 1.31 5.64 0.0493 a x32 0.48 1 0.48 2.04 0.1960 b Residual 1.63 7 0.23 Lack of fit 1.11 3 0.37 2.88 0.1666b Gerçek hata 0.52 4 0.13 Cor total 122.01 16 R2= 0.9867 a“Prob>F” de 0.05’ten küçük ise anlamlı. b“Prob>F” de 0.05’ten büyük ise anlamsız. Bu sonuçlara göre, “Prob>F” değerlerinin 0.0500’den küçük olması nedeniyle model oldukça anlamlı çıkmıştır. Yalnızca x12 (0.6099) ve x32 (0.1960) modelleri 0.1000’den büyüktür, dolayısıyla anlamlı değildir. 2.88’lik “Lack-of-Fit F-değeri”, uyum eksikliğinin gerçek hataya göre önemli olmadığı anlamına gelmektedir. Gürültü nedeniyle bu kadar büyük bir “Lack-of-Fit F-değeri” nin oluşma olasılığı %16.66’dır. Bu nedenle, önemsiz olan bu Lack-of-Fit değeri iyi bir sonuç olarak kabul edilmiştir ve bu model, enkapsülasyon koşullarının optimizasyonuna uygulanabilir. Ayrıca, gerçek hatanın değerinin düşük olması, verilerin iyi bir şekilde tekrarlanabilirliğini göstermiştir. “R2 değeri” (0.9867) de modelin verilerimizdeki toplam varyansı açıklamada ne kadar iyi olduğunu göstermiştir. Ayrıca, 4’ten büyük olması istenen model uygunluk kesinlik oranı (26.758) da uygun bir sinyali göstermiştir. Denklem 4.1’de görüldüğü gibi, daha önce belirtilen ikinci dereceden polinom Denklem 3.4’e göre hesaplanan mikroalgde enkapsüllenen ellagik asit miktarının tahmin edilen yanıtının sonuçları aşağıdaki gibidir: y = – 1,94 x1 – 1,07 x2+ 3,01 x3 – 0,80 x1 x2 – 0,60 x1 x3 – 0,86 x2 x3+ 0,56 x22 (4.1) 80 Mikroalg enkapsülasyonunun parametreleri ve enkapsüllenen ellagik asit miktarı arasındaki etkileşimleri tanımlamak için yanıt yüzeyinin üç boyutlu görüntüleri de üretilmiştir. Şekil 4.12, yanıt yüzeyi grafiklerini göstermektedir. A B C Şekil 4.12. Yanıt yüzeyi grafikleri. Toplam fenolik içerik üzerindeki (A) enkapsülleme süresi ve sıcaklığın (B) ekstrakt/mikroalg oranı ve sıcaklığın (C) ekstrakt/mikroalg oranı ve enkapsülleme süresinin etkisini gösterir. Yanıt grafiğinden (Şekil 4.12 a), hem sıcaklık hem de enkapsülleme süresi azaldığında, mikroalg yüzeyinde enkapsüllenen ellagik asit miktarının önemli ölçüde arttığı ve iki değişkenin enkapsüllenen ellagik asidin yanıtı üzerinde ters etki gösterdiği anlaşılmaktadır. Şekil 4.12 b’de de görüldüğü gibi sıcaklık 45°C’den 25°C’ye 81 düşürüldüğünde ve ekstrakt/mikroalg oranı yüksek tutulduğunda (3’e yakın), enkapsüllenen ellagik asit miktarı da yüksek bulunmuştur. Şekil 4.12 c’ye bakıldığında ise, ekstrakt/mikroalg oranındaki artış ve enkapsülleme süresindeki düşüşle (180 dk’dan 30 dk’ya), yine artan miktarda ellagik asit gözlemlenmiştir. Referans indeks olan mikroalgde enkapsüllenen ellagik asit miktarına göre, RSM analizi ile elde edilen optimum koşullar aşağıdaki gibidir: Sıcaklık 29°C Enkapsülleme süresi 35 dk Ekstrakt/mikroalg oranı 2,93 mL/g Bu optimum koşullar altında mikroalgde enkapsüllenen toplam teorik ellagik asit miktarı, 2,5 g alg materyalinde 13,0016 mg olmuştur. Elde ettiğimiz deneysel sonuç ise 13,39±0,18 mg’dır. Bu sonuçlar birbiriyle uyumludur. Sonuç olarak, Box-Behnken tasarımı (BBD) ile birleştirilmiş yüzey analiz yöntemi (RSM) mikroenkapsülasyon prosedürünü optimize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Ekstraksiyon sıcaklığı, enkapsülleme süresi ve ekstrakt/mikroalg oranındaki değişimlerin, mikroalgde enkapsüllenen ellagik asit miktarı üzerinde hem olumlu hem de olumsuz etkileri olduğu gözlemlenmiştir. Bu faktörlerin optimum koşulları, mikroalgde enkapsüllenen en yüksek toplam ellagik asit miktarını elde etmek için belirlenmiştir. Sonuçlara göre optimum koşullar 29°C sıcaklık, 35 dk enkapsülleme süresi ve 2,93 mL/g ekstrakt/mikroalg oranıdır. 4.8. Simüle Edilen Gastrointestinal Koşullar Altında Kontrollü Salınım Çalışmaları Enkapsüllenen ellagik asidin yapısal özelliklerini ve salınım kinetiğini değerlendirmek için, in vitro sindirimi ve salınımı, mide ve bağırsak sıvılarının simülasyonu ile incelenmiştir. Ellagik asidin salınım davranışı 120 dk boyunca incelenmiştir. Optimum koşullar altında elde ettiğimiz mikroalgde enkapsüllenen ellagik asit deneysel sonuç 82 miktarı, 2,5 g mikroalgde 13,39±0,18 mg’dır. Simüle edilmiş gastrointestinal sindirim çalışması için 50 mg enkapsüllenen mikroalg kullandığımızdan, mikroalgdeki enkapsüllenmiş ellagik asidin başlangıç miktarı, sindirimden önce 0,268 mg’dır. 120 dk’lık sindirimden sonra HPLC ile belirlenen çözelti ortamına salınan ellagik asit miktarı, SGF içinde 0,017 mg ve SIF içinde 0,050 mg olarak belirlenmiştir. Ellagitanninler asidik ortamın SGF koşulları altında kararlıdır, ancak SIF koşulları altında ellagik aside bozunabilirler (Karaś ve diğerleri, 2017). Nar kabuğu ekstraktının ellagitannin içerdiği bilinmektedir, ancak kontrollü salınım çalışmaları esnasında bir ellagitannin standardı temin edilemediğinden ekstrakttaki ellagitannin miktarı belirlenememiştir. Nar kabuğu ekstraktında ellagitannin bulunduğu için Spirulina’da enkapsüllenmiştir. Bu nedenle, in vitro sindirimde optimum şekilde enkapsüllenmiş ellagik asidin salınımı için, SIF’de SGF’den daha yüksek bir salınım oranı göstermiştir. Şekil 4.12, 120 dk boyunca in vitro sindirimden sonra salınan çözeltinin toplam fenolik içeriklerini ve antioksidan kapasitelerini göstermektedir. Şekil 4.12 a’da gösterilen sonuçlara bakılacak olunursa, simüle edilmiş mide sindiriminden sonra Spirulina/ellagik asidin toplam fenolik içeriği 212,55 ± 4,50 mg GAE/g liyofilize alg iken, başlangıçtaki toplam fenolik içeriği 217,33 ± 41,78 GAE/g liyofilize alg’dir. Dag ve diğerleri (2017) de yaptıkları çalışmada SGF koşullarında benzer bir düşüş gözlemlemişlerdir. Benzer şekilde, bağırsak sindiriminden sonra Spirulina/ellagik asidin toplam fenolik içeriği 14,25±1,01 mg GAE/g liyofilize alg iken, başlangıçtaki toplam fenolik içeriği 16,92±0,72 mg GAE/g liyofilize alg’dir. Mikroalgden fenolik içeriğin 120 dk sonra salınımı, SGF’de (pH 1,2), SIF’den (pH 6,8) daha yüksektir. 120 dk’lık bağırsak sindiriminden sonra toplam fenolik içerikteki küçük düşüş, fenolik bileşiklerin alkali ortamda (pH 6,8) yavaş salınımı ile açıklanabilir. Buna karşılık, SIF koşulundaki enkapsülün fenolik içeriği, SGF koşulundan daha yüksektir. Bu, fenolik bileşiklerin salınımının SGF’deki asidik ortamdan etkilendiğini kanıtlamaktadır. 83 250 0 saat 2 saat 200 150 100 50 0 saat 2 saat 0 SGF SIF A 250 200 2 saat 150 100 0 saat 2 saat 50 0 saat 0 SGF SIF B Şekil 4.12. Enkapsüllenen ellagik asidin in vitro sindirimde salınımı (A) Toplam fenolik içerikleri ve (B) Antioksidan kapasiteleri Yine benzer bir sonuca, Dag ve diğerleri (2017) çalışmalarında yer vermişlerdir. Buna göre, maltodekstrin ve maltodekstrin/arap zamkı (9:1) gibi kaplama malzemeleri için gözlemlenen SGF koşullarında SIF koşullarındakinden daha yüksek bir fenolik salınım gözlemlenmiştir. Şekil 4.12 b’ye göre, gastrik sindirimden sonra antioksidan kapasite 27,69 ± 4,03 mg TE/g liyofilize algden 67,79±0,49 mg TE/g liyofilize alg’e yükselmiştir. Benzer şekilde, bağırsak sindiriminden sonra 100,04 mg TE/g liyofilize alg’den 156,38 mg TE/g liyofilize alg’e kadar antioksidan kapasitede bir artış elde 84 Antioksidan kapasite Toplam fenolik içerik (mg TE/g örnek) (mg GE/g örnek) edilmiştir. En yüksek toplam fenolik içerik mide sindiriminden sonra belirlendiğinden, salınan çözeltinin antioksidan kapasitesi bağırsak sindiriminden sonra en yüksek olmuştur (Şekil 4.12 b). Yine, belirlenemeyen ellagik asit türevleri de, salınan çözeltinin toplam fenolik içeriğine ve antioksidan kapasitesine katkıda bulunur. Flores ve diğerleri (2014) ise çalışmalarında, arap zamkı ve peynir altı suyu proteini izolatlarından antosiyaninlerin salınımını karşılaştırmışlardır. SGF analizinde arap zamkı ve peynir altı suyu proteini izolatlarından salınan çözeltilerin toplam fenolik içeriğinin ve antioksidan kapasitesinin artığını, ancak SIF analizinde sadece peynir altı suyundan salınan çözeltinin toplam fenolik içerikte ve antioksidan aktivitesinde artış olduğunu ve arap zamkından salınan çözeltininkinde ise azalma olduğunu ifade etmişlerdir. Sonuç olarak, peynir altı suyu proteininin çalışmaları için uygun bir kapsülleyici olduğuna karar vermişlerdir (Flores ve diğerleri, 2014). Başka bir in vitro gastrointestinal çalışmada, sonuçlar tam tersi olmuştur. Enkapsüllenmiş Averrhoa carambola posası ekstraktından polifenollerin salınımının mide sıvısında bağırsak sıvısından daha fazla olduğunu göstermişlerdir (Saikia ve diğerleri, 2015). İn vitro sindirime katılan fenolik bileşiklerin kararlılığı üzerine yaptığı çalışmalarda, tespit edilen fenolik bileşiklerin çoğu kararlı değildir (Saura-Calixto ve diğerleri, 2007; Siracusa ve diğerleri, 2011). Uygulanan kaplama malzemesinin doğası ile ilişkilendirilmiştir. Enkapsüllenen bileşiklerin in vitro sindirim sırasındaki davranışı, sindirim enzimlerine karşı dirençleri, bileşiklerin yerleştirildiği kaplama malzemesinin bileşimi ve gastrointestinal sistemdeki pH koşulları ile ilgilidir. Sonuç olarak, kaplama malzemesinin davranışı ve fenolik bileşiğin kararlılığı nedeniyle antioksidan kapasite ve toplam fenolik içerik değişebilir. 85 4.9. Yoğurt Üretimi Şekil 3.2’deki endüstriyel yoğurt üretimine ait akış şemasına göre kültür grubu için önerilen inkübasyon sıcaklığına soğutulmuş 6 farklı süt, %3 oranında starter kültür ile aşılanmıştır. Steril karıştırıcılarla karıştırılarak 100 mL’lik steril plastik kaplara aktarıldıktan sonra 42°C’de inkübasyona tabi tutulmuşlardır. İnkübatöre konulan yoğurtların önce 1’er saat, sonra yarım saat aralıklarla pH kontrolleri yapılmıştır. Bu aşamada eklenen tüm katkı maddeleri inkübasyon sürelerinde farklılıklar meydana getirmiştir. pH ~4,6-4,7’ye gelen örnekler inkübatörden çıkarılmış ve oda sıcaklığında 30 dk bekletilerek buzdolabına (+4°C) alınmış ve burada 21 gün boyunca depolanmak üzere saklanmıştır. Çizelge 4.12. Yoğurtların üretim aşamasındaki inkübasyon süreleri Örnek Çeşidi İnkübasyon Süresi YC 2 saat 20 dk YM 2 saat 5 dk YNS 2 saat 13 dk YNSE 1 saat 25 dk YNH 1 saat 25 dk YNHE 1 saat Tüm yoğurtların inkübasyon süreleri Çizelge 4.12’de verilmiştir. Literatürde Spirulina eklenmiş yoğurtlarda fermantasyonun hızlandığına dair bilgiler mevcuttur (Barkallah ve diğerleri, 2017). Burada da mikroalgin eklendiği yoğurtlarda inkübasyon süresinin kısaldığı tespit edilmiş; bu durumun literatürle uyumlu olduğu düşünülmüştür. Yine aynı şekilde hidroalkolik ekstraktın katıldığı YNH kodlu yoğurt örneğinde de fermantasyon süresi azalmıştır. 86 4.10. Fizikokimyasal, Mikrobiyolojik, Spektroskopik, Duyusal/Tekstür ve İstatistiksel Analizler Çiğ Sütte Yapılan Analizler Çiğ sütün işleme alınmadan önce fizikokimyasal analizleri yapılmıştır. Yoğurt üretiminde kullanılan çiğ sütün fiziksel ve kimyasal özellikleri Çizelge 4.12’de verilmiştir. Türk Gıda Kodeksi İçme Sütleri Tebliği (Tebliğ No: 2019/12)’ne göre çiğ inek sütünün protein miktarı en az %2,9, tam yağlı sınıfı için yağ miktarı en az %3,5, yağsız kuru madde miktarı ise en az %8,0 olmalıdır. Laktik asit cinsinden titrasyon asitliği ise %0,135-0,200 aralığında olmalıdır. Üretimde kullanılan çiğ sütün fizikokimyasal özellikleri tebliğdeki değerlerle uyumludur (Çizelge 4.13). Çiğ inek sütünün toplam canlı bakteri sayısı ise TS 1018/Nisan 2002’ye göre 30ºC’de kob/mL olarak en çok 105 kob/mL olmalıdır. Üretimde kullanılan çiğ sütün toplam aerobik mezofilik bakteri sayısı 1.0x104 kob/mL olarak saptanmıştır (ISO 4833-1 Yöntemi). Buna göre çiğ süt kullanıma uygun bulunmuştur. Çizelge 4.13. Çiğ sütün fiziksel ve kimyasal özellikleri Kuru madde Süt Yağsız Süt yağı Protein pH Titrasyon ÇİĞ Kuru madde Asitliği SÜT 13,04±0,68 8,94±0,22 4,1±0,21 3,36±0,21 6,50 0,17±0,01 Süt tozunda Yapılan Analizler Süt tozunun işleme alınmadan önce kimyasal analizleri yapılmıştır. Üretimde kullanılan yağsız süt tozunun bazı kimyasal özellikleri 100 g üzerinden Çizelge 4.14’te verilmiştir. Yağlı süt tozu yoğurtta okside aroma geliştirebildiğinden yağsız süt tozu tercih edilmiştir. Türk Gıda Kodeksi Koyulaştırılmış Süt ve Süt tozu Tebliği (Tebliğ No: 2005/18)’ne göre yağsız süt tozunun yağ miktarı en çok %1,5 olmalıdır. Buna göre üretimde kullanılan yağsız süt tozunun değeri tebliğdeki değerle uyumludur (Çizelge 4.14). 87 Çizelge 4.14. Yağsız süt tozunun bazı özellikleri YAĞSIZ Süt Yağı Protein Laktoz SÜT TOZU 0,20 33 54,20 Yoğurtta Yapılan Analizler Yoğurt üretiminde sütün kuru maddesinin artırılması ile sütün su bağlama kapasitesinin arttığı yani yoğurt pıhtısının sıkılığının arttığı bilinmektedir (Lucey, 2002). Hatta yapılan bir çalışmada %10’dan %15’e çıkartılan sütün kuru madde yüzdesi ile bu artış 2 kat olmuştur (Harwalkar ve Kalab, 1986). Aynı zamanda istenen fiziksel ve duyusal özelliklere sahip yoğurt eldesi için de bu işlem gereklidir. Bu amaçla yoğurt üretiminde 30°C’ye getirilen süte %3 oranında süt tozu eklenmiştir. %3-4’ü geçen oranlarda yoğurtta pütürlülük görülebilmektedir. Yoğurt üretim prosesinde geleneksel yöntemle üretilen yoğurdun geliştirilmesi ve fonksiyonel özellik katmak amacıyla homojenize edilmiş çiğ süt kullanılarak biri kontrol olmak üzere 6 farklı yoğurt üretimi gerçekleştirilmiştir. Deneme yoğurtlarının fizikokimyasal, mikrobiyolojik, spektroskopik, duyusal vb. özellikleri depolama süresi boyunca takip edilmiştir. Elde edilen sonuçlar aşağıdaki çizelgelerde ayrı ayrı verilmiştir. Yoğurt üretim prosesinde süte eklenen farklı katkı maddelerinin kimyasal kompozisyonları birbirinden farklıdır. Dolayısıyla elde edilen son ürün olan yoğurdun fiziksel ve duyusal özelliklerinde farklılıklar olabilmektedir (Özer, 2006). Yaygın (1999) kuru madde miktarının fermente süt ürünü olan yoğurdun bileşimi, besin değeri, aroması, raf ömrü ve yoğurt bakterilerinin aktivitesi üzerinde etkili olduğunu belirtmiştir. Üretilen 6 farklı yoğurt örneğinin kuru madde değerlerinde depolama boyunca dalgalanmalar gözlemlenmiştir. Bu durumun örneklerin analize alınmadan tam anlamıyla homojenize edilememesinden kaynaklanabileceği düşünülmüştür (Çizelge 4.16). 88 Çizelge 4.15. Yoğurtlarda yapılan fizikokimyasal analizlerin sonuçları Örnek Depolama Süresi Kuru madde(%) Yağ(%) Süt Yağsız Kuru pH Titre edilebilir Çeşidi (Gün) madde(%) Asitlik(%LA) Kül(%) Toplam Laktoz(%) Protein(%) 1. 18,10±0,95 5,14±0,25 12,96±0,98 4,20±0,01 1,21±0,01 1,13±0,01 4,72±0,30 5,28±0,26 7. 18,44±0,96 5,03±0,24 13,41±0,99 4,03±0,01 1,35±0,01 1,13±0,01 4,85±0,31 5,86±0,29 YC 14. 16,15±0,84 5,03±0,24 11,12±0,88 4,07±0,01 1,68±0,01 1,10±0,01 5,09±0,32 5,62±0,27 21. 16,63±0,87 4,26±0,21 12,37±0,89 3,99±0,01 1,58±0,01 1,04±0,01 4,61±0,29 6,36±0,31 1. 17,73±0,93 3,60±0,17 14,13±0,94 4,30±0,01 1,40±0,01 1,20±0,01 5,48±0,35 6,29±0,31 7. 17,29±0,11 3,60±0,17 13,69±0,92 3,95±0,01 1,63±0,01 1,18±0,01 5,30±0,33 5,86±0,29 YM 14. 17,81±0,93 4,04±0,20 13,77±0,95 3,93±0,01 1,83±0,01 1,17±0,01 5,46±0,35 5,78±0,28 21. 18,38±0,96 3,60±0,17 14,78±0,98 3,89±0,01 1,77±0,01 1,13±0,01 5,16±0,33 6,47±0,32 1. 16,92±0,88 3,71±0,18 13,21±0,90 4,22±0,01 1,21±0,01 1,14±0,01 4,88±0,31 5,96±0,29 7. 17,21±0,11 3,71±0,18 13,50±0,92 4,05±0,01 1,54±0,01 1,17±0,01 4,65±0,30 6,07±0,30 YNS 14. 16,78±0,88 3,93±0,19 12,85±0,90 3,97±0,01 1,79±0,01 1,11±0,01 4,92±0,31 6,14±0,30 21. 17,24±0,90 3,49±0,17 13,75±0,92 3,97±0,01 1,52±0,01 1,01±0,01 4,79±0,31 6,29±0,31 1. 16,29±0,85 3,82±0,19 12,47±0,87 4,22±0,01 1,17±0,01 1,03±0,01 4,68±0,30 5,70±0,28 7. 16,13±0,84 4,04±0,20 12,09±0,87 4,09±0,01 1,40±0,01 1,02±0,01 4,55±0,29 5,27±0,26 YNSE 14. 16,32±0,85 3,93±0,19 12,39±0,87 3,90±0,01 1,67±0,01 1,01±0,01 4,85±0,31 5,12±0,25 21. 17,26±0,90 3,82±0,19 13,44±0,92 3,86±0,01 1,55±0,01 0,99±0,01 4,77±0,30 5,65±0,28 1. 15,68±0,82 4,04±0,20 11,64±0,84 4,15±0,01 1,20±0,01 1,03±0,04 4,42±0,28 5,47±0,27 7. 15,63±0,82 3,93±0,19 11,70±0,84 4,01±0,01 1,41±0,01 0,98±0,01 4,34±0,28 5,58±0,27 YNH 14. 15,69±0,82 3,60±0,17 12,09±0,84 3,95±0,01 1,58±0,01 0,96±0,01 4,53±0,29 5,62±0,27 21. 16,02±0,84 3,93±0,19 12,09±0,86 3,92±0,01 1,49±0,01 0,89±0,01 3,96±0,25 5,80±0,28 1. 16,71±0,87 3,93±0,19 12,78±0,89 4,25±0,01 1,31±0,01 1,03±0,01 4,79±0,31 5,43±0,27 7. 15,93±0,83 3,71±0,18 12,22±0,85 4,04±0,01 1,40±0,01 0,94±0,01 4,34±0,28 5,09±0,25 YNHE 14. 16,13±0,84 3,71±0,18 12,42±0,86 3,90±0,01 1,73±0,01 0,93±0,01 4,94±0,31 5,49±0,27 21. 16,26±0,85 3,71±0,18 12,55±0,87 3,92±0,01 1,46±0,01 0,83±0,01 4,78±0,30 5,08±0,25 89 Yoğurtlarda depolamanın 1. gününde ortalama kuru madde değeri %16,91 iken 21. gününde %16,97 olmuştur (Çizelge 4.16). Depolama boyunca kuru madde değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.24). Kontrol ve %1 Spirulina’lı yoğurtların ortalama değerleri sırasıyla %17,33 ve %17,79’dur. Bu sonuçlara göre iki örnek arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmuştur. Çizelge 4.16. Yoğurtların % kuru madde değerleri değişimi Kuru madde (%) (%95 k=2) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 18,10±0,95aA 18,44±0,96aA 16,15±0,84dB 16,63±0,87cB YM 17,73±0,93aBC 17,29±0,11bC 17,81±0,93aB 18,38±0,96aA YNS 16,92±0,88bAB 17,21±0,11bA 16,78±0,88bB 17,24±0,90bA YNSE 16,29±0,85cB 16,13±0,84cB 16,32±0,85cB 17,26±0,90bA YNH 15,68±0,82dA 15,63±0,82dA 15,69±0,82eA 16,02±0,84dA YNHE 16,71±0,87bcA 15,93±0,83cdB 16,13±0,84dB 16,26±0,85cdB En küçük 15,68±0,82 15,63±0,82 15,69±0,82 16,02±0,84 En Büyük 18,10±0,95 18,44±0,96 17,81±0,93 18,38±0,96 Ortalama 16,91±0,88 16,77±0,61 16,48±0,86 16,97±0,89 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Yağ analizi sürecinde yoğurtların homojenizasyonu çok önemli bir basamaktır. Homojen hale getirilen yoğurtlardaki yağ globül çapları küçülür ve yağ oranı sonuçları daha yüksek bulunur. Depolama süresi boyunca yağ miktarları çok değişmemekle birlikte homojenizasyonun tam olarak yapılamamasından dolayı yağ sonuçlarında dalgalanmalar gözlemlenmiştir. En yüksek yağ değerleri YC kodlu kontrol yoğurdunda görülmüştür (Çizelge 4.17). Yoğurtların depolama boyunca yağ değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmüştür (p<0.05) (Çizelge 4.24). Çizelgede 4.24’te de görüldüğü üzere, depolama süresi uzadığında % süt yağı bileşiminde büyük farklılık gözlemlenmemiştir. Depolamanın 1. gününe ait örneklerin ortalama yağ değeri %4,04 iken, 21. gününde bu değer 3,80 bulunmuştur (Çizelge 4.17). 90 Çizelge 4.17. Yoğurtların % yağ değerleri değişimi Yağ (%) (%95 k=2) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 5,14±0,25aA 5,03±0,24aB 5,03±0,24aB 4,29±0,21aC YM 3,60±0,17fB 3,60±0,17fB 4,04±0,20bA 3,63±0,17eB YNS 3,71±0,18eB 3,71±0,18eB 3,93±0,19fA 3,52±0,17fC YNSE 3,82±0,19dC 4,04±0,20bA 3,93±0,19dB 3,85±0,19cC YNH 4,04±0,20bA 3,93±0,19cB 3,60±0,17cC 3,96±0,19bB YNHE 3,93±0,19cA 3,71±0,18dB 3,71±0,18eB 3,74±0,18dB En küçük 3,60±0,17 3,60±0,17 3,60±0,17 3,52±0,17 En Büyük 5,14±0,25 5,03±0,24 5,03±0,24 4,29±0,21 Ortalama 4,04±0,20 4,00±0,19 4,04±0,20 3,80±0,19 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.18. Yoğurtların % süt yağsız kuru madde değerleri değişimi Süt Yağsız Kuru madde (%) (%95 k=2) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 12,96±0,98bB 13,41±0,99aA 11,12±0,88eD 12,37±0,89cC YM 14,13±0,94aB 13,69±0,92aC 13,77±0,95aBC 14,78±0,98aA YNS 13,21±0,90bBC 13,50±0,92aAB 12,85±0,90bC 13,75±0,92bA YNSE 12,47±0,87cB 12,09±0,87bcB 12,39±0,87cB 13,44±0,92bA YNH 11,64±0,84dB 11,70±0,84cAB 12,09±0,84dAB 12,09±0,86cA YNHE 12,78±0,89bcA 12,22±0,85bB 12,42±0,86cAB 12,55±0,87cAB En küçük 11,64±0,84 11,70±0,84 11,12±0,88 12,09±0,86 En Büyük 14,13±0,94 13,69±0,92 13,65±0,95 14,78±0,98 Ortalama 12,87±0,90 12,77±0,90 12,42±0,88 13,16±0,91 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Yoğurtların kuru madde içeriğine bağlı olarak değişen süt yağsız kuru madde değerleri Çizelge 4.18’de verilmiştir. En düşük ortalama süt yağsız kuru madde değeri YNH kodlu kontrol yoğurduna (%11,87) ait olup en yüksek değerlere sahip örnekler sırasıyla YM (%14,08) ve YNS (%13,32)’dir. Yoğurtların depolama boyunca süt yağsız kuru madde değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında istatistiksel olarak 91 önemli bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.24). Depolamanın 1. gününe ait örneklerin ortalama süt yağsız kuru madde değeri %12,87 iken, 21. gününde %13,15’tir (Çizelge 4.18). YM kodlu yoğurt örneğinin YC kodlu kontrol grubuna göre yağ oranlarının düşük olması sebebiyle buna paralel olarak süt yağsız kuru madde değerlerinde artış söz konusu olmuştur. Yoğurtların 21 gün depolama sürecinde pH değerlerindeki değişime ait veriler Çizelge 4.19’da verilmiştir. Depolama süresinin çok önemli seviyede etkili olduğu pH değerlerinde yoğurtların zamanla hızla pH’larının azaldığı gözlemlenmiştir. Depolamanın 1. gününde 4,15- 4,30 aralığında ölçülen pH değerleri depolamanın 21. gününde 3,86-3,99 aralığına kadar düşmüştür. Bu durumda yoğurt bakterilerinin faaliyetlerinin payı büyüktür. Çünkü zamanla titre edilebilir asitliği artırmaktadırlar. YC kodlu kontrol grubu yoğurt örneğinde pH değeri en yüksekken, mikroalgin katıldığı yoğurtlarda (YM, YNSE, YNHE) pH değerleri daha düşük tespit edilmiştir. Çizelge 4.19. Yoğurtların pH değerleri değişimi pH (20-21ºC’de) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 4,20±0,01eA 4,03±0,01dC 4,07±0,01aB 3,99±0,01aD YM 4,30±0,01aA 3,95±0,01fB 3,93±0,01dC 3,89±0,01eD YNS 4,22±0,01dA 4,05±0,01bB 3,97±0,01bC 3,97±0,01bC YNSE 4,22±0,01cA 4,09±0,01aB 3,90±0,01fC 3,86±0,01fD YNH 4,15±0,01fA 4,01±0,01eB 3,95±0,01cC 3,92±0,01dD YNHE 4,25±0,01bA 4,04±0,01cB 3,90±0,01eD 3,92±0,01cC En küçük 4,15±0,01 3,95±0,01 3,90±0,01 3,86±0,01 En Büyük 4,30±0,01 4,09±0,01 4,07±0,01 3,99±0,01 Ortalama 4,22±0,01 4,03±0,01 3,95±0,01 3,93±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Spirulina tozu katılmış yoğurtlarda laktik asit bakterilerinin canlılığının mikroalg tarafından desteklendiği ve aynı zamanda titre edilebilir asitliği artırdığı ile ilgili literatürde bilgiler mevcuttur (Shin ve diğerleri, 2008). Fox (aktaran Guldas ve Irkin, 2010) Spirulina mikroalginin yapısında bulunan önemli miktarda protein, vitamin, mineral gibi besinlerin hem yoğurt starter bakterileri hem de probiyotik bakteriler için eşsiz bir kaynak olabileceğini ifade 92 etmiştir. Çünkü gelişmek ve canlılıklarını sürdürebilmek için besinlere ihtiyaç duyar (Kearney ve diğerleri, 2008). Elde ettiğimiz veriler literatürdeki sonuçlarla uyumludur. Depolama sırasında asitlik gelişiminin yavaşlamasıyla ürünün raf ömrü uzamaktadır (Lauber ve diğerleri, 2001; Neve ve diğerleri, 2001). Depolama boyunca asitliğin artması raf ömrü açısından istenen bir özellik değildir. Çizelge 4.20. Yoğurtların % LA titre edilebilir asitlik değerleri değişimi Titre Edilebilir Asitlik (%LA) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 1,21±0,01dD 1,35±0,01fC 1,68±0,01dA 1,58±0,01bB YM 1,40±0,01aD 1,63±0,01aC 1,83±0,01aA 1,77±0,01aB YNS 1,21±0,01cD 1,54±0,01bB 1,79±0,01bA 1,52±0,01dD YNSE 1,17±0,01fD 1,40±0,01eC 1,67±0,01eA 1,55±0,01cB YNH 1,20±0,01eD 1,41±0,01cC 1,58±0,01fA 1,49±0,01eB YNHE 1,31±0,01bD 1,40±0,01dC 1,73±0,01cA 1,46±0,01fB En küçük 1,17±0,01 1,35±0,01 1,58±0,01 1,46±0,01 En Büyük 1,40±0,01 1,63±0,01 1,79±0,01 1,77±0,01 Ortalama 1,25±0,01 1,46±0,01 1,71±0,01 1,56±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Depolama sırasında özellikle laktoz içeriğindeki artışla birlikte asitlik de hızla artmaktadır (Özer, 2006). Elde edilen sonuçlarda da benzer durum görülmüştür. Titre edilebilir asitlik değeri mikroalgin direkt eklendiği YM kodlu yoğurt örneğinde, YC kodlu kontrol grubuna göre hissedilir şekilde artmıştır. Bu durum enkapsüle mikroalgli yoğurtlarda (YNSE ve YNHE) görülmemiştir. Enkapsüllenmemiş mikroalg içeren yoğurt (YM) ile karşılaştırıldığında daha düşük değerler gözlemlenmiştir. Dahası, kontrol yoğurduna yakın sonuçlar göstermiştir. Titre edilebilir asitlik değerleri, soğuk depolama sırasında tüm örnekler için artmıştır. Depolamanın 1. gününde örneklere ait titre edilebilir asitlik değeri ortalama 1,25 iken, 21. gününde 1,56 olmuştur (Çizelge 4.20). Depolamanın titre edilebilir asitlik değerlerindeki etkisi, duyusal asitlik muayenesinde de panelistler tarafından hissedilmiş ve ifade edilmiştir. 93 Yoğurtların depolama boyunca pH değerlerinin ve titre edilebilir asitlik değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.24). Yoğurtlarda kül içeriğinin ise depolama koşullarında azaldığı görülmüştür. Burada, kül miktarının bir kısmının serumla birlikte ortamdan ayrılmış olabileceği düşünülmüştür (Özer, 2006). Kül miktarının YC kodlu kontrol yoğurduna kıyasla YM kodlu mikroalgin eklendiği örnekte yüksek olduğu görülmüştür. Çizelge 4.21. Yoğurtların % kül değerleri değişimi Kül (%) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 1,13±0,01bA 1,13±0,01cA 1,10±0,01cB 1,04±0,01bC YM 1,20±0,01aA 1,18±0,01aB 1,17±0,01aB 1,13±0,01aC YNS 1,14±0,01bB 1,17±0,01bA 1,11±0,01bC 1,01±0,01cD YNSE 1,03±0,01cA 1,02±0,01dAB 1,01±0,01dB 0,99±0,01dC YNH 1,03±0,04cA 0,98±0,01eAB 0,96±0,01eB 0,89±0,01eC YNHE 1,03±0,01cA 0,94±0,01fB 0,93±0,01fB 0,83±0,01fC En küçük 1,03±0,01 0,94±0,01 0,93±0,01 0,83±0,01 En Büyük 1,20±0,01 1,18±0,01 1,17±0,01 1,13±0,01 Ortalama 1,09±0,02 1,07±0,01 1,05±0,01 0,98±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Yoğurtların depolama boyunca kül değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.24). Depolamanın 1. gününde kül değerlerinde örneklerin ortalaması 1,09 iken 21. gününde 0,98’dir (Çizelge 4.21). Yoğurdun sahip olduğu kabul edilebilir derecedeki tekstürel ve duyusal özelliklerinin depolama süresince korunabilmesi için süt proteinlerinde artış sağlanması gerekmektedir. Tüm yoğurtlarda toplam protein yüzdesi %3,96 ile %5,48 arasında değişkenlik göstermiştir. Genel olarak depolama süresi boyunca protein miktarlarında artış meydana gelmiştir (Çizelge 4.22). Mikroalgin eklendiği YM kodlu yoğurt örneğinde protein içeriğindeki artış kontrol 94 grubuna göre hissedilir bir şekilde gözlemlenmiştir. Böylece mikroalgin bu tez çalışmasında tespit edilen yüksek protein içeriği, katıldığı yoğurtlarda da olumlu yönde katkıda bulunmuş olup protein içeriğini artırmıştır. Çizelge 4.22. Yoğurtların % toplam protein değerleri değişimi Toplam Protein (%) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 4,72±0,30dC 4,85±0,31bB 5,09±0,32bA 4,61±0,29dD YM 5,48±0,35aA 5,30±0,33aC 5,46±0,35aA 5,16±0,33aB YNS 4,88±0,31bB 4,65±0,30cD 4,92±0,31dA 4,79±0,31bC YNSE 4,68±0,30eC 4,55±0,29dD 4,85±0,31eA 4,77±0,30cB YNH 4,42±0,28fB 4,34±0,28eC 4,53±0,29fA 3,96±0,25eD YNHE 4,79±0,31cB 4,34±0,28eC 4,94±0,31cA 4,78±0,30bcB En küçük 4,42±0,28 4,34±0,28 4,53±0,29 3,96±0,25 En Büyük 5,48±0,35 5,30±0,33 5,46±0,35 5,16±0,33 Ortalama 4,83±0,31 4,67±0,30 4,97±0,32 4,77±0,30 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Yoğurtların depolama boyunca protein değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.24). Depolama boyunca protein değerlerinde dalgalanma söz konusu olup 1. güne ait örnekler arası ortalama değer %4,83 iken 21. güne ait değer ise %4,67 olarak bulunmuştur. Kuru madde değerlerindeki değişikliğe bağlı olarak protein değerleri de paralel olarak değişim göstermiştir. Yoğurtların 21 günlük depolaması esnasında laktoz değerlerindeki değişim Çizelge 4.23’te gösterilmiştir. Buna göre genel olarak % laktoz değerlerinde artış tespit edilmiştir. Depolamanın 1. gününde örneklerin ortalama laktoz miktarı %5,69 iken son gününde bu değer %5,94’e çıkmıştır. 95 Çizelge 4.23. Yoğurtların % laktoz değerleri değişimi Laktoz (%) (%95 k=2) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 5,28±0,26fD 5,86±0,29bB 5,62±0,27cC 6,36±0,31bA YM 6,29±0,31aB 5,86±0,29bC 5,78±0,28bD 6,47±0,32aA YNS 5,96±0,29bD 6,07±0,30aC 6,14±0,30aB 6,29±0,31bA YNSE 5,70±0,28cA 5,27±0,26dB 5,12±0,25eC 5,65±0,28dA YNH 5,47±0,27dD 5,58±0,27cC 5,62±0,27cB 5,80±0,28cA YNHE 5,43±0,27eB 5,09±0,25eC 5,49±0,27dA 5,08±0,25eC En küçük 5,28±0,26 5,09±0,25 5,12±0,25 5,08±0,25 En Büyük 6,29±0,31 6,07±0,30 6,14±0,30 6,47±0,32 Ortalama 5,69±0,24 5,62±0,28 5,63±0,27 5,94±0,29 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Yoğurtların depolama boyunca laktoz değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakılacak olunursa istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar vardır (p<0.05) (Çizelge 4.24). En düşük laktoz miktarı YNSE kodlu yoğurda, en yüksek laktoz miktarı ise YNS kodlu yoğurda aittir. 96 Çizelge 4.24. Fizikokimyasal özelliklerin istatistik analizi Süt Yağsız Titre Örnek Çeşidi N Kuru madde Yağ Kuru pH Edilebilir Kül Protein Laktoz madde Asitlik YC 8 17,33b 4,87a 12,46c 4,08a 1,46d 1,11b 4,82b 5,78b YM 8 17,80a 3,72d 14,08a 4,02d 1,66a 1,18a 5,30a 6,10a YNS 8 17,04c 3,72d 13,32b 4,06b 1,52b 1,11b 4,81b 6,11a YNSE 8 16,50d 3,91b 12,59c 4,02d 1,45e 1,02c 4,71c 5,43d YNH 8 15,76f 3,88b 11,88d 4,01e 1,43f 0,97d 4,31d 5,62c YNHE 8 16,26e 3,77c 12,49c 4,03c 1,48c 0,94e 4,71c 5,27e Depolama Süresi (gün) 1.gün 12 16,97ab 4,05a 12,86b 4,23a 1,26d 1,10a 4,83b 5,69b 7.gün 12 16,77b 4,01b 12,76b 4,03b 1,46c 1,08b 4,64d 5,62c 14.gün 12 16,48c 4,05a 12,43c 3,96c 1,72a 1,05c 4,97a 5,63c 21.gün 12 16,97a 3,81c 13,16a 3,93d 1,57b 0,99d 4,68c 5,94a ANOVA Örnek Çeşidi * * * * * * * * Depolama Süresi * * * * * * * * Örnek Çeşidi x Depolama Süresi * * * * * * * * Farklı harf taşıyan ortalamalar birbirinden farklıdır (* p<0.05) 97 Üretilen 6 farklı yoğurdun bakteri miktarlarındaki değişimler 21 günlük depolama süresi boyunca hafta hafta Çizelge 4.25’te verilmiştir. Yoğurtlarda asitlendirilmiş MRS ve M17 besiyerlerinde Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaricus ve Streptecoccus thermophilus bakterilerinin uygun sıcaklık ortamında üretilerek koloni sayım tekniğine dayalı elde edilmiş sonuçlarında laktik asit bakterileri sayıları 8,04 log10 kob/g ile 9,34 log10 kob/g arasında dağılım göstermiştir. Kontrol yoğurduna göre diğer yoğurt türlerinde laktik asit bakterileri sayıları daha fazla bulunmuştur. Spirulina tozunun yoğurda eklendiği bir çalışmada, ilaveyle birlikte tüm bakterilerin canlılıklarının arttığı ifade edilmiştir (Guldas ve Irkin, 2010). Bu durumun Spirulina mikroalginin besleyici özelliklerinden kaynaklandığı düşünülmüştür (Akalın ve diğerleri, 2009). Çizelge 4.25. Yoğurtlarda yapılan mikrobiyolojik analizlerin sonuçları Örnek Depolama MRSA (log10 M17 (log10 TOPLAM (log10 kob/g) Çeşidi Süresi (Gün) kob/g) (L. kob/g) (S. (Toplam laktik asit bulgaricus) thermophilus) bakterileri) 1. 7,15±0,01 8,23±0,01 8,26±0,01 YC 7. 8,48±0,01 8,94±0,01 8,08±0,01 14. 8,11±0,01 8,34±0,01 8,54±0,01 21. 8,20±0,01 8,20±0,01 8,51±0,01 1. 7,66±0,01 8,26±0,01 8,36±0,01 YM 7. 8,32±0,01 8,20±0,01 8,57±0,01 14. 8,34±0,01 8,18±0,01 8,57±0,01 21. 8,08±0,01 7,78±0,01 8,26±0,01 1. 7,26±0,01 7,96±0,01 8,04±0,01 YNS 7. 8,60±0,01 8,72±0,01 8,96±0,01 14. 8,38±0,01 8,52±0,01 8,75±0,01 21. 8,30±0,01 7,93±0,01 8,46±0,01 1. 7,41±0,01 7,98±0,01 8,08±0,01 YNSE 7. 8,78±0,01 8,60±0,01 9,00±0,01 14. 8,38±0,01 8,20±0,01 8,60±0,01 21. 8,18±0,01 7,30±0,01 8,23±0,01 1. 7,38±0,01 8,41±0,01 8,45±0,01 YNH 7. 8,45±0,01 7,79±0,01 8,53±0,01 14. 8,41±0,01 8,08±0,01 8,58±0,01 21. 8,30±0,01 8,26±0,01 8,58±0,01 1. 7,23±0,01 7,90±0,01 8,99±0,01 YNHE 7. 9,32±0,01 7,78±0,01 9,34±0,01 14. 8,34±0,01 7,91±0,01 8,48±0,01 21. 8,34±0,01 8,34±0,01 8,64±0,01 98 Çizelge 4.26. Yoğurtların laktik asit bakterileri sayıları değişimi Mikrobiyolojik (log10 kob/g) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 8,26±0,01dC 8,08±0,01fD 8,54±0,01dA 8,51±0,01cB YM 8,36±0,01cB 8,57±0,01dA 8,57±0,01cA 8,26±0,01eC YNS 8,04±0,01fD 8,96±0,01cA 8,75±0,01aB 8,46±0,01dC YNSE 8,08±0,01eD 9,00±0,01bA 8,60±0,01bB 8,23±0,01cF YNH 8,45±0,01bC 8,53±0,01eB 8,58±0,01cA 8,58±0,01bA YNHE 8,99±0,01aB 9,34±0,01aA 8,48±0,01eD 8,64±0,01aC En küçük 8,04±0,01 8,08±0,01 8,48±0,01 8,23±0,01 En Büyük 8,99±0,01 9,34±0,01 8,75±0,01 8,64±0,01 Ortalama 8,36±0,01 8,75±0,01 8,59±0,01 8,45±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.27. Laktik asit bakterileri sayılarının istatistik analizi Örnek Çeşidi N log10 kob/g YC 8 8,35f YM 8 8,45e YNS 8 8,56b YNSE 8 8,48d YNH 8 8,54c YNHE 8 8,87a Depolama Süresi (gün) 1.gün 12 8,37d 7.gün 12 8,75a 14.gün 12 8,59b 21.gün 12 8,45c ANOVA Örnek Çeşidi * Depolama Süresi * Örnek Çeşidi x Depolama Süresi * Farklı harf taşıyan ortalamalar birbirinden farklıdır (* p<0.05) Yoğurtların depolama boyunca laktik asit bakterileri sayılarının değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında örnek çeşidi, depolama süresi ve örnek çeşidi x depolama süresi açısından değerler istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.27). Depolamanın 1. gününde yoğurtlarda bulunan laktik asit bakterileri sayısı 8,36 log10 kob/g 99 iken, 21. gününde 8,45 log10 kob/g’dir. Her iki karakteristik mikroorganizmanın depolama sonuna kadar yoğurtlarda mevcut oldukları ve canlı kaldıkları düşünülmüştür. Yoğurtlarda görülen serum ayrılması, istenmeyen yapısal kusurlardan biridir. Oluşma sebepleri olarak düşük miktardaki süt bileşenleri (protein içeriği, kuru madde içeriği vb.), hızlı asitlik değişimleri, inkübasyon sırasında sarsma, yetersiz pastörizasyon uygulaması, zayıf ürün formülasyonu ve yetersiz inkübasyon sayılabilir (Bakırcı ve diğerleri, 2015; Bulut-Solak ve Akın, 2012; Pearse ve Mackinlay, 1989). Depolama sırasında ayrılan serumun miktarı, yoğurdun kalitesini gösteren en önemli parametrelerden olup fazla miktarda serumun ayrılması istenmeyen olumsuz bir durumdur (Senaka Ranadheera ve diğerleri, 2012). Asitlik değeri de, yoğurdun yapısını ve serumun ayrılmasını etkilemektedir. Yoğurt üretiminde pH 5,2-5,3’te kazein parçacılarının destabilizasyonu sonucunda başlayan pıhtılaşma, izoelektrik nokta olan pH 4,6-4,7’de tamamlanmaktadır (Tamime ve Robinson, 1999). Kazein yoğurtta pH 4,6’dan küçük değerlerde daha fazla su tutarken, sonuçta daha az serum ayrılır. Üretim esnasında kuru madde artırıldığında viskozite artarken, serum ayrılması ise azalmaktadır. Yoğurt jelinin sıkılığı aynı zamanda protein içeriği ile de bağlantılıdır. pH 4,0 ile 4,6 arasında proteinler daha fazla su tutarken, viskozite artar (Atamer ve diğerleri, 1986). Protein moleküllerinin kümelenmesi ile sıkılık da artar, serum ayrılması azalır. Proteinler arası etkileşimler tamamlanmadığında zayıf pıhtı oluştuğu için serum ayrılması riski de artmaktadır (Dannenberg ve Kessler, 1988). Aynı zamanda bir çalışmada süt yağı globüllerinin de su tutmada önemli bir rol oynayabileceği ifade edilmiştir (Hongyu ve diğerleri, 2001). Depolama süresi boyunca yoğurtlarda serum ayrılması değerlerinde bir dalgalanma vardır. Protein ve kazeindeki değişimler bu durumdan sorumlu etkenlerdir. Yoğurt numunelerinden ayrılan serum miktarlarında depolama süresi boyunca meydana gelen serum ayrılması değerleri Çizelge 4.28’de verilmiştir. Biri kontrol grubu olmak üzere, 6 farklı yoğurt örneğinden ayrılan serum miktarlarında muhafaza boyunca genel olarak azalma tespit edilmiştir. Çizelgede de görüldüğü gibi, serum ayrılması değerleri 4,11/25 g yoğurt ile 5,07 mL/25 g yoğurt arasında değişmekte olup, minimum (2,97 mL/25 g yoğurt) ve maksimum (7,30 mL/25 g yoğurt) değerler sırasıyla YC ve YNH kodlu örneklerde saptanmıştır. 100 Çizelge 4.28. Yoğurtların serum ayrılması değerleri değişimi Serum Ayrılması (mL/ 25 g yoğurt) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 4,90±0,01dB 2,79±0,01fD 4,30±0,01cC 5,15±0,01bA YM 3,00±0,07fD 4,63±0,01cA 3,95±0,01eB 3,68±0,01eC YNS 4,30±0,01eB 5,00±0,07bA 3,00±0,07fC 4,38±0,01dB YNSE 5,60±0,01bB 5,88±0,01aA 4,45±0,01bC 3,38±0,01fD YNH 7,30±0,01aA 4,25±0,01dC 4,10±0,01dD 4,73±0,01cB YNHE 5,30±0,01cB 4,18±0,01eD 4,83±0,01aC 5,40±0,01aA En küçük 3,00±0,01 2,79±0,01 3,00±0,01 3,38±0,01 En Büyük 7,30±0,01 5,88±0,01 4,83±0,01 5,40±0,01 Ortalama 5,07±0,02 4,46±0,02 4,11±0,02 4,45±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.29. Serum ayrılması değerlerinin istatistik analizi Örnek Çeşidi N Serum Ayrılması YC 8 4,29d YM 8 3,83f YNS 8 4,20e YNSE 8 4,83c YNH 8 5,10a YNHE 8 4,93b Depolama Süresi (gün) 1.gün 12 5,08a 7.gün 12 4,47b 14.gün 12 4,12c 21.gün 12 4,46b ANOVA Örnek Çeşidi * Depolama Süresi * Örnek Çeşidi x Depolama Süresi * Farklı harf taşıyan ortalamalar birbirinden farklıdır (* p<0.05) Yoğurtların depolama boyunca serum ayrılması değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakılacak olunursa istatistiksel olarak farklılık vardır (p<0.05) (Çizelge 4.29). Depolamanın 1. gününde 5,07 mL/25 g yoğurt serum ayrılmışken son gününde 4,45 mL/25 g yoğurt serum ayrılmıştır. 101 Üretilen 6 farklı yoğurt örneğinde depolama boyunca fenolik madde açısından da analizler yapılmıştır. Gallik asit kalibrasyon eğrisinden yararlanılarak elde edilen toplam fenolik madde değerleri Çizelge 4.30’daki gibi değişim göstermiştir. Yoğurtlarda toplam fenolik madde değerleri 1,44-5,23 mg GAE/g örnek arasında dağılım göstermiştir. Elde edilen sonuçlara genel olarak bakıldığında kontrol grubuna göre Spirulina mikroalginin katıldığı yoğurtlarda toplam fenolik maddede artış görülmüştür. Yine ekstraktlı yoğurtlarda da nar kabuğunun içerisindeki değerli fenolik bileşiklerden ötürü toplam fenolik maddede oldukça yüksek değerler tespit edilmiştir. Yoğurtların depolama boyunca toplam fenolik madde değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.32). Depolama koşullarında da bu artışlar devam etmiştir. Bu artışın enkapsüllü yoğurt örneklerinde (YNSE, YNHE) mikroenkapsüllerden antioksidan özellikteki fenolik maddelerin kontrollü salınımından kaynaklanabileceği düşünülmüştür. Aynı zamanda yoğurt bakterilerinin canlılığını sürdürebilmesi için Spirulina mikroalginin içeriğindeki değerli besin öğelerini kullanabilecekleri ve bu besin öğelerinin parçalanma ürünlerinin de toplam fenolik madde ve antioksidan kapasitede artışa neden olabileceği düşünülmüştür. Bu nedenle mikroalgin direkt katıldığı örnekte (YM) de diğerlerine nazaran az olmakla birlikte depolama süresince aynı durum söz konusudur. Ekstraktlı yoğurtlarda (YNS, YNH) nar kabuğunda bulunan ellagitanninlerin direkt salınımı ve parçalanması ile farklı fenolik bileşiklere dönüşümleri neticesinde değerlerde dalgalanmalar olabileceği düşünülmüştür. YC kodlu yoğurt örneğinde ise hissedilir bir artış gözlemlenmemiştir. İlk güne ait ortalama değer 1,93 mg GAE/g örnek iken, son gününde 2,37 mg GAE/g örnek bulunmuştur. Üretilen 6 farklı yoğurt örneğinin depolama boyunca antioksidan kapasite analizleri ABTS metodu ile yapılmış ve troloks kalibrasyon eğrisinden yararlanılarak elde edilen değerlerdeki değişimler değerlendirilmiştir (Çizelge 4.30). 102 Çizelge 4.30. Yoğurtlarda yapılan spektroskopik analizlerin sonuçları Örnek Depolama Toplam Fenolik Madde (gallik Antioksidan Kapasite Çeşidi Süresi (Gün) asit eşdeğeri/g örnek) (mg troloks/g örnek) 1. 1,44±0,05 0,17±0,04 YC 7. 2,01±0,06 0,18±0,08 14. 2,05±0,02 0,14±0,00 21. 2,10±0,01 0,25±0,06 1. 2,01±0,23 0,16±0,03 YM 7. 2,40±0,13 0,17±0,03 14. 2,83±0,10 0,09±0,00 21. 2,28±0,11 0,35±0,15 1. 2,12±0,50 0,30±0,01 YNS 7. 2,27±0,11 0,31±0,03 14. 3,31±0,72 0,25±0,02 21. 3,34±1,77 0,57±0,02 1. 2,16±0,93 0,18±0,05 YNSE 7. 2,19±0,02 0,19±0,02 14. 5,23±0,25 0,40±0,02 21. 2,28±0,10 0,36±0,15 1. 2,27±0,05 0,23±0,08 YNH 7. 1,97±0,10 0,25±0,02 14. 3,09±0,00 0,22±0,00 21. 2,14±0,09 0,42±0,04 1. 1,58±0,12 0,16±0,02 YNHE 7. 1,98±0,23 0,10±0,00 14. 2,63±0,00 0,19±0,12 21. 2,10±0,10 0,31±0,02 Tüm yoğurtlarda antioksidan kapasitede kontrol yoğurduna göre bir artış olmuştur. Bu durumda nar kabuğunda doğal halde bulunan antioksidan etki gösteren değerli fenolik bileşiklerin etkisi fazladır. Ekstraksiyonla doğal ortamından ayrılan fenolik bileşiklerin hem ekstrakt olarak hem de enkapsüller halinde katıldığı yoğurtlarda yüksek antioksidan etki gösterdiği düşünülmüştür. Aynı zamanda mikroalgler de içeriğindeki sayısız serbest radikallerden dolayı doğal antioksidan etki göstermektedirler (Barkallah ve diğerleri, 2017). Dolayısıyla Spirulina mikroalginin katıldığı yoğurtlarda da net bir artış gözlemlenmiştir. Mikroalgin yapısındaki klorofil, karotenoid ve fikosiyanin içeriğindeki artışla da ilişkilendirilmiştir (Beheshtipour ve diğerleri, 2012). Benzer durum, kontrol yoğurduna göre hidroksil radikal süpürme aktivitesinin ve aynı zamanda besin miktarının daha fazla bulunduğu çalışmalarda da görülmüştür (Shin ve diğerleri, 2008). Elde ettiğimiz sonuçlar, literatür ile uyumlu bulunmuştur. 103 Yoğurtların depolama boyunca antioksidan kapasite değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçları da yine istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.32). Mikroalg biyokütlesinden fenoliklerin ve fikosiyaninlerin salınımı ile enkapsüle antioksidan maddenin kontrollü salınımına bağlı olarak radikal süpürme aktivite değerlerinde bir artış söz konusudur (Alizadeh Khaledabad ve diğerleri, 2020). Depolamanın 1. gününde antioksidan kapasite ortalama 0,20 mg troloks/g örnek iken, 21. gününde 0,38 mg troloks/g örnek’tir. 104 Çizelge 4.31. Yoğurtların spektroskopik analiz değerleri değişimi Toplam Fenolik Madde Antioksidan Kapasite Örnek Çeşidi Depolama Süresi Depolama Süresi 1 7 14 21 1 7 14 21 YC 1,44±0,05bC 2,01±0,06bB 2,05±0,02dAB 2,10±0,01aA 0,17±0,04bAB 0,18±0,08bAB 0,14±0,00cdB 0,25±0,06cA YM 2,01±0,23abC 2,40±0,13bB 2,83±0,10bcA 2,28±0,11aBC 0,16±0,03bB 0,17±0,03bB 0,09±0,00dB 0,35±0,15bcA YNS 2,12±0,50abA 2,27±0,11aA 3,31±0,72bA 3,34±1,77aA 0,30±0,01aB 0,31±0,03aB 0,25±0,02bC 0,57±0,02aA YNSE 2,16±0,93abB 2,19±0,02aB 5,23±0,25aA 2,28±0,10aB 0,18±0,05bB 0,19±0,02bB 0,40±0,02aA 0,36±0,15bcA YNH 2,27±0,05aB 1,97±0,10abD 3,09±0,00bcA 2,14±0,09aC 0,23±0,08abB 0,25±0,02abB 0,22±0,00bcB 0,42±0,04abA YNHE 1,58±0,12abC 1,98±0,23bB 2,63±0,00cA 2,10±0,10aB 0,16±0,02bB 0,10±0,00bB 0,19±0,12bcB 0,31±0,02bcA En küçük 1,44±0,05 1,97±0,10 2,05±0,02 2,10±0,01 0,16±0,03 0,10±0,00 0,09±0,00 0,25±0,06 En Büyük 2,27±0,05 2,40±0,13 5,23±0,25 3,34±1,77 0,30±0,01 0,31±0,03 0,40±0,02 0,57±0,02 Ortalama 1,93±0,31 2,14±0,11 3,19±0,18 2,37±0,36 0,20±0,04 0,20±0,03 0,22±0,03 0,38±0,07 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) 105 Çizelge 4.32. Spektroskopik analiz değerlerinin istatistik analizi Örnek Çeşidi N Toplam Fenolik Madde Antioksidan Kapasite YC 12 1,90c 0,18c YM 12 2,38b 0,19c YNS 12 2,76a 0,360a YNSE 12 2,97a 0,28b YNH 12 2,37b 0,28b YNHE 12 2,07bc 0,19c Depolama Süresi (gün) 1.gün 18 1,93c 0,20b 7.gün 18 2,14bc 0,20b 14.gün 18 3,19a 0,22b 21.gün 18 2,37b 0,38a ANOVA Örnek Çeşidi * * Depolama Süresi * * Örnek Çeşidi x Depolama Süresi * * Farklı harf taşıyan ortalamalar birbirinden farklıdır (* p<0.05) Yoğurt üretiminde kullanılan starter kültürlerin (Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaricus + Streptecoccus thermophilus) her ikisi de homofermentatif yolla süt şekerini yani laktozu metabolize eder (4.1). Ortamda oluşan laktik asit pH’yı düşürerek jelleşmeye kadar olan süreci başlatır. Aynı zamanda, yoğurtta keskin asidik tadın oluşumuna katkıda bulunup tat ve aromasının dengesinde görev alır (Zourari ve diğerleri, 1992). C6H22O11 (Laktoz) + H2O 4C3H6O3 (Laktik asit) (4.1) Fermantasyon sonucu laktik asit oluşumu, yoğurt üretiminde kullanılan bakteri suşlarının türüne bağlıdır. Elde edilen 6 farklı yoğurtta bulunan organik asitlerin analizi için depolamanın 1., 7., 14. ve 21. günlerinde alınan örneklerin HPLC-DAD ile kromatografik olarak analizleri yapılmıştır Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.33’te verilmiştir. Laktik asit oluşumunun yanında sitrik asit ve ürik asit de tespit edilmiştir. 106 Çizelge 4.33. Yoğurtlarda yapılan organik asit analizlerinin sonuçları Örnek Depolama Çeşidi Süresi (Gün) Laktik asit (ppm) Sitrik asit (ppm) Ürik asit (ppm) 1. 693,40±0,14 109,75±0,58 450,24±0,85 YC 7. 697,78±10,45 138,28±16,96 456,95±8,58 14. 706,41±0,61 169,49±42,54 449,44±0,85 21. 730,74±21,39 139,55±7,87 412,32±14,84 1. 775,37±0,15 120,70±0,37 470,95±1,29 YM 7. 819,76±2,87 130,59±2,17 477,98±9,43 14. 836,72±0,01 160,57±2,68 493,19±2,12 21. 838,42±165,04 146,06±29,01 450,34±72,35 1. 719,02±0,62 123,99±0,18 490,60±0,72 YNS 7. 727,12±6,78 130,43±1,05 481,59±7,14 14. 750,11±2,52 158,25±0,87 492,12±7,26 21. 754,54±63,79 143,34±34,55 457,35±53,81 1. 676,89±0,01 111,94±0,41 432,70±0,70 YNSE 7. 675,83±0,07 130,38±2,17 429,41±8,94 14. 760,62±1,42 168,06±2,43 423,45±2,95 21. 738,86±92,75 127,01±11,46 416,32±37,85 1. 679,72±0,46 111,61±0,16 447,93±0,43 YNH 7. 676,70±7,64 121,54±0,30 449,11±6,15 14. 657,51±0,47 147,64±3,21 446,30±1,08 21. 739,11±152,47 142,28±27,62 418,67±80,58 1. 721,68±0,32 111,78±0,21 429,92±0,82 YNHE 7. 669,27±8,70 129,11±3,63 431,11±5,51 14. 745,64±0,16 165,22±5,54 436,50±6,88 21. 726,39±45,14 124,65±4,38 407,36±12,52 Yoğurtların depolama boyunca laktik asit değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında örnek çeşidi bakımından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olurken (p<0.05), depolama süresi bakımından istatistiksel açıdan önemsiz bulunmuştur (p>0.05). Yine örnek çeşidi x depolama süresi bakımından da sonuçlar istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur (p>0.05) (Çizelge 4.37). Laktik asit miktarı örneklerde 657,51 ppm ile 838,42 ppm arasında dağılım göstermiştir (Çizelge 4.34). YM kodlu yoğurt örneğinde laktik asit miktarları, YC kodlu kontrol yoğurt örneğine nazaran yüksek bulunmuştur. 107 Çizelge 4.34. Yoğurtların laktik asit değerleri değişimi Laktik asit Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 693,40±0,14dB 697,78±10,45cAB 706,41±0,61eAB 730,74±21,39aA YM 775,37±0,15aA 819,76±2,87aA 836,72±0,01aA 838,42±165,04aA YNS 719,02±0,62cA 727,12±6,78bA 750,11±2,52cA 754,54±63,79aA YNSE 676,89±0,01fA 675,83±0,07dA 760,62±1,42bA 738,86±92,75aA YNH 679,72±0,46eA 676,70±7,64dA 657,51±0,47fA 739,11±152,47aA YNHE 721,68±0,32bAB 669,27±8,70dB 745,64±0,16dA 726,39±45,14aAB En küçük 676,89±0,01 669,27±8,70 657,51±0,47 726,39±45,14 En Büyük 775,37±0,15 819,76±2,87 836,72±0,01 838,42±165,04 Ortalama 711,01±0,28 711,08±6,09 742,84±0,87 754,68±90,10 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.35. Yoğurtların sitrik asit değerleri değişimi Sitrik asit Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 109,75±0,58cA 138,28±16,96aA 169,49±42,54aA 139,55±7,87aA YM 120,70±0,37aA 130,59±2,17aA 160,57±2,68aA 146,06±29,01aA YNS 123,99±0,18aA 130,43±1,05aA 158,25±0,87aA 143,34±34,55aA YNSE 111,94±0,41bC 130,38±2,17aB 168,06±2,43aA 127,01±11,46aBC YNH 111,61±0,16bA 121,54±0,30aA 147,64±3,21aA 142,28±27,62aA YNHE 111,78±0,21bB 129,11±3,63aB 165,22±5,54aA 124,65±4,38aB En küçük 109,75±0,58 121,54±0,30 147,64±3,21 124,65±4,38 En Büyük 123,99±0,18 138,28±16,96 169,49±42,54 146,06±29,01 Ortalama 114,96±0,32 130,06±4,38 161,54±9,55 137,15±19,15 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Yoğurtların depolama boyunca sitrik asit değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında örnek çeşidi bakımından istatistiksel olarak önemsiz bulunurken (p>0.05), depolama süresi bakımından istatistiksel açıdan anlamlı farklılıklar söz konusudur (p<0.05) (Çizelge 4.37). 108 Depolamanın 1. gününde örneklere ait ortalama sitrik asit miktarı 114,96 ppm iken, 21. gününde ise 137,15 ppm olmuştur (Çizelge 4.35). Yine örnek çeşidi x depolama süresi bakımından da sonuçlar istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur (p>0.05). Çizelge 4.36. Yoğurtların ürik asit değerleri değişimi Ürik asit Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 450,24±0,85cA 456,95±8,58bA 449,44±0,85bA 412,32±14,84aB YM 470,95±1,29bA 477,98±9,43aA 493,19±2,12aA 450,34±72,35aA YNS 490,60±0,72aA 481,59±7,14aA 492,12±7,26aA 457,35±53,81aA YNSE 432,70±0,70eA 429,41±8,94dA 423,45±2,95dA 416,32±37,85aA YNH 447,93±0,43dA 449,11±6,15bcA 446,30±1,08bcA 418,67±80,58aA YNHE 429,92±0,82fA 431,11±5,51cdA 436,50±6,88cA 407,36±12,52aB En küçük 429,92±0,82 429,41±8,94 423,45±2,95 407,36±12,52 En Büyük 490,60±0,72 481,59±7,14 493,19±2,12 457,35±53,81 Ortalama 453,72±0,80 454,36±7,63 456,83±3,52 427,06±45,33 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Yoğurtların depolama boyunca ürik asit değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında örnek çeşidi ve depolama süresi bakımından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar varken (p<0.05), örnek çeşidi x depolama süresi bakımından istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur (p>0.05) (Çizelge 4.37). Örnekler arasında en düşük ürik asit değerine sahip YNSE kodlu yoğurt (425,47 ppm) örneği iken, en yüksek ürik asit değerine sahip YNS kodlu yoğurt (480,41 ppm) örneğidir. Depolamanın 1. gününde örneklere ait ortalama ürik asit miktarı 453,72 ppm iken, 21. gününde ise bu miktar 427,06 ppm olmuştur (Çizelge 4.36). 109 Çizelge 4.37. Organik asit değerlerinin istatistik analizi Örnek Çeşidi N Laktik asit Sitrik Asit Ürik Asit YC 8 707,08b 139,27a 442,24b YM 8 817,57a 139,48a 473,12a YNS 8 737,70b 139,00a 480,42a YNSE 8 713,05b 134,34a 425,47b YNH 8 688,26b 130,77a 440,50b YNHE 8 715,74b 132,69a 426,22b Depolama Süresi (gün) 1.gün 12 711,01a 114,96c 453,73a 7.gün 12 711,08a 130,05b 454,36a 14.gün 12 742,83a 161,54a 456,83a 21.gün 12 754,68a 137,15b 427,06b ANOVA Örnek Çeşidi * Önemsiz * Depolama Süresi Önemsiz * * Örnek Çeşidi x Depolama Süresi Önemsiz Önemsiz Önemsiz Farklı harf taşıyan ortalamalar birbirinden farklıdır (* p<0.05) Yoğurtta fermantasyon esnasında üretilen uçucu organik tat/aroma bileşenleri, depolamanın ilk 24 saati içerisinde oluşumunu büyük miktarda tamamlamaktadır (Imhof ve diğerleri, 1994). Karbonil bileşikleri ve laktik asit, tat/aroma dengesini oluşturmada birincil faktördür (Beshkova ve diğerleri, 1998). Yoğurtta bulunan karbonil bileşenlerinin birbirlerine oranlarının tat ve aromaya olan katkılarına ilişkin bir çalışma bulunmamaktadır. Yoğurdun temel aroma bileşeni asetaldehit olup; asetoin, diasetil gibi diğer minör bileşenleri ise tat ve aroma dengesinde destekleyici etkiye sahip aroma bileşenleridir (Thornhill ve Cogan, 1984). Her iki yoğurt kültürü de bu karbonil bileşenlerini üretebilmektedir. Asetaldehit, depolama sırasında kolayca asetata okside olduğu için yoğurdun klasik tat/aroma özelliklerinde bir miktar azalma olmaktadır. Yoğurt üretiminde kullanılan sütün türüne ve yağ özelliklerine bağlı olarak da artan bu kayıp, genelde yağlı sütlerle sınırlıdır. Yapılan çalışmalarda depolama sürecinde meydana gelen asetaldehit miktarı düşüşü, diasetil+asetoin konsantrasyonunda görülmemiştir. Çünkü yoğurt bakterileri diasetil redüktaz enzimi aktivitesi sınırlıdır (Hegazi ve Abo‐Elnaga, 1990). 110 Çizelge 4.38. Yoğurtlarda yapılan uçucu organik bileşen analizinin sonuçları Örnek Çeşidi Depolama Süresi (Gün) Asetaldehit (ppm) Diasetil (ppm) Asetoin (ppm) YC 1. 20,07±0,01 1,70±0,01 69,45±0,01 21. 16,52±0,01 1,05±0,01 42,42±0,01 YM 1. 12,20±0,01 0,93±0,01 36,06±0,01 21. 14,03±0,01 0,99±0,01 36,73±0,01 YNS 1. 14,83±0,01 0,63±0,01 52,55±0,01 21. 12,69±0,01 0,70±0,01 57,93±0,01 YNSE 1. 21,66±0,01 0,81±0,01 37,20±0,01 21. 18,50±0,01 0,82±0,01 33,28±0,01 YNH 1. 18,98±0,01 0,77±0,01 72,70±0,01 21. 21,09±0,01 0,88±0,01 50,63±0,01 YNHE 1. 19,30±0,01 1,06±0,01 58,53±0,01 21. 19,42±0,01 0,94±0,01 58,88±0,01 Depolamanın başında (1. gün) ve sonunda (21. gün) 6 farklı yoğurttan alınan örneklerde uçucu organik bileşen tayini GC-MS-FID-HS sistemi ile yapılmış olup sonuçları Çizelge 4.38’de verilmiştir. Karışık yoğurt kültürü kullanılarak yapılan bir üretimde asetaldehit 2,0- 41,0 µg/g, aseton 1,3-4,0 µg/g, asetoin 2,2-5,7 µg/g ve diasetil 0,4-0,9 µg/g aralıklarında saptanmıştır (Tamime ve Robinson, 1999). Karakteristik yoğurt tat/aromasının oluşması için en ideal asetaldehit konsantrasyonu aralığı ise 10-25 ppm’dir. Tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlara göre, yoğurt örneklerimizde ideal aralıklarda asetaldehit ve diasetil oluşumu gözlemlenmiştir. Ancak asetoin açışından üst sınırın üstünde (>5,7 µg/g) bir oluşum gözlemlenmiştir. Detaylı olarak bakıldığında, asetaldehitin miktarında depolamanın 1. gününe kıyasla 21. günde YC, YNS ve YNSE kodlu yoğurtlarda azalma gözlemlenmiştir. YM, YNH ve YNHE kodlu yoğurtlarda ise az miktarda artma gözlemlenmiştir. YNSE kodlu yoğurt örneğinde hissedilir bir artış olmamıştır. Dolayısıyla, YM, YNH ve YNHE yoğurtlarda asetaldehit yönünden tat ve aromada depolamanın sonuncu gününde bir artış söz konusudur. Diasetil miktarları açısından değerlendirildiğinde ise depolamanın 1. gününe kıyasla 21. günde YC ve YNHE kodlu yoğurtlarda azalma meydana gelmiştir. YM, YNS, YNSE ve YNH kodlu yoğurtlarda belirgin bir değişim gözlenmemekle birlikte depolamanın sonuna dek diasetil yönünden tat ve aroma korunmuştur. Asetoin karbonil bileşenini içeren yoğurtlardan YC, YNSE ve YNH kodlu olanlarında depolamanın son gününe gelindiğinde belirgin bir azalma 111 oluşmuştur. YM, YNS ve YNHE kodlu yoğurtlarda ise az miktarda artış söz konusu olmuş, tat ve aromada asetoinin katkısı depolamanın son gününe kadar korunmuştur. Çizelge 4.39. Yoğurtların uçucu organik bileşen değerleri değişimi Asetaldehit (ppm) Diasetil (ppm) Asetoin (ppm) Örnek Çeşidi Depolama Süresi Depolama Süresi Depolama Süresi 1 21 1 21 1 21 YC 20,07±0,01bA 16,52±0,01dB 1,70±0,01aA 1,05±0,01aB 69,45±0,01bA 42,42±0,01dB YM 12,20±0,01fB 14,03±0,01eA 0,93±0,01cB 0,99±0,01bA 36,06±0,01fB 36,73±0,01eA YNS 14,83±0,01eA 12,69±0,01fB 0,63±0,01fB 0,70±0,01fA 52,55±0,01dB 57,93±0,01bA YNSE 21,66±0,01aA 18,50±0,01cB 0,81±0,01dB 0,82±0,01eA 37,20±0,01eA 33,28±0,01fB YNH 18,98±0,01dB 21,09±0,01aA 0,77±0,01eB 0,88±0,01dA 72,70±0,01aA 50,63±0,01cB YNHE 19,30±0,01cB 19,42±0,01bA 1,06±0,01bA 0,94±0,01cB 58,53±0,01cB 58,88±0,01aA En küçük 12,20±0,01 12,69±0,01 0,63±0,01 0,70±0,01 36,06±0,01 33,28±0,01 En Büyük 21,66±0,01 21,09±0,01 1,70±0,01 1,05±0,01 72,70±0,01 58,88±0,01 Ortalama 17,84±0,01 17,04±0,01 0,98±0,01 0,90±0,01 54,42±0,01 46,65±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Yoğurtların depolama boyunca uçucu organik bileşenlerin değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında tüm organik bileşen çeşitleri için sonuçlarda istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.40). Asetaldehit yönünden en az miktarı içeren örnek YM kodlu yoğurt (13,14 ppm) örneğinde iken, diasetil yönünden YNS kodlu (0,67 ppm) ve asetoin yönünden ise YNSE kodlu (35,24 ppm) yoğurt örneğinde tespit edilmiştir. En yüksek değerler ise sırasıyla asetaldehitte YNSE kodlu (20,08 ppm), diasetilde YC kodlu (1,38 ppm) ve asetoinde de YNH kodlu (61,67 ppm) yoğurt örneğinde görülmüştür. Depolamanın 1. gününde 17,85 ppm olan asetaldehit miktarı, 21. günde 17,04 ppm’e doğru azalmıştır. Diasetil bakımından ise sıralama 0,986 ppm (1. gün) ve 0,901 ppm (21. gün) iken, asetoinde bu sıralama 54,42 ppm (1. gün) ve 46,65 ppm (21. gün) olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.39). 112 Çizelge 4.40. Uçucu organik bileşen değerlerinin istatistik analizi Örnek Çeşidi N Asetaldehit Diasetil Asetoin YC 4 18,30d 1,38a 55,94c YM 4 13,14f 0,97c 36,40e YNS 4 13,77e 0,67f 55,25d YNSE 4 20,09a 0,82e 35,25f YNH 4 20,04b 0,83d 61,67a YNHE 4 19,37c 1,01b 58,71b Depolama Süresi (gün) 1.gün 12 17,85a 0,99a 54,42a 21.gün 12 17,05b 0,90b 46,65b ANOVA Örnek Çeşidi * * * Depolama Süresi * * * Örnek Çeşidi x Depolama Süresi * * * Farklı harf taşıyan ortalamalar birbirinden farklıdır (* p<0.05) Üretilen 6 farklı yoğurdun depolamanın 1., 7., 14. ve 21. günlerinde alınan örnekleri Tekstür profil analizleri için işleme alınmış olup elde edilen tüm sonuçlar Çizelge 4.41’de verilmiştir. Ölçümler, steril numune kaplarındaki yoğurt örneklerine direkt daldırma ile yapılmıştır. Yapılan bir çalışmada Spirulina eklenmiş yoğurtlarda yoğurdun dokusal özellikleri ile duyusal kabul edilebilirliğinin korunduğu ifade edilmiştir (Barkallah ve diğerleri, 2017). Sıkılık parametresinde en yüksek değer YC kodlu (302,69) kontrol yoğurdunda, en düşük değer ise YNH kodlu (205,61) yoğurt örneğinde ölçülmüştür (Çizelge 4.42). Depolama boyunca sıkılık değerleri artmış olup, 1. günde 235,66 olan değer 21. günde 267,19 olmuştur. Kıvam parametresinde de sonuçlar sıkılık ile paralel olarak değişim göstermiştir. En yüksek değer yine YC kodlu (7643) kontrol yoğurdunda, en düşük değer ise YNH kodlu (4935,99) yoğurt örneğinde ölçülmüştür (Çizelge 4.43). Depolama boyunca kıvam değerleri artmış olup, 1. günde 5681,69 olan değer 21. günde 6579,81 olmuştur. 113 Çizelge 4.41. Yoğurtlarda yapılan tekstür profil analizlerinin sonuçları Örnek Depolama Sıkılık Kıvam İç Yapışkanlık Viskozite Çeşidi Süresi (Firmness) (Consistency) (Cohesiveness) (Viscosity) (Gün) (g) (g.sn) (g) (g.sn) 1. 236,65 5887,47 -136,95 -253,37 YC 7. 253,19 6454,02 -154,48 -320,66 14. 310,38 7536,37 -156,53 -334,04 21. 410,43 10694,04 -249,36 -499,00 1. 314,07 6908,37 -164,64 -333,92 YM 7. 327,72 7164,48 -167,23 -354,68 14. 242,66 6136,05 -144,97 -298,07 21. 280,59 6990,35 -159,60 -289,73 1. 262,89 6915,45 -172,07 -339,18 YNS 7. 268,68 6403,00 -160,54 -293,38 14. 264,59 6499,08 -205,48 -293,42 21. 283,11 6539,22 -183,77 -356,20 1. 204,90 4837,23 -207,59 -243,36 YNSE 7. 241,36 5851,74 -227,96 -239,87 14. 230,59 5371,10 -130,39 -258,10 21. 217,15 5434,45 -132,13 -285,37 1. 186,02 4501,69 -127,64 -202,59 YNH 7. 227,45 5557,80 -124,23 -238,24 14. 207,51 5010,24 -110,42 -202,91 21. 201,45 4674,20 -105,03 -174,79 1. 209,34 5039,86 -123,24 -259,66 YNHE 7. 203,73 4950,61 -120,47 -234,45 14. 213,90 5099,54 -140,91 -203,47 21. 210,46 5146,61 -111,01 -207,19 İç yapışkanlık ve viskozite parametrelerinde elde edilen veriler sadece vektörel olarak negatif değer almışlardır. Büyüklük olarak (-) değerler gözetmeksizin sonuçlar değerlendirilmiştir. İç yapışkanlık parametresinde en yüksek değer bu sefer YNS kodlu (-180,47) kontrol yoğurdunda, en düşük değer ise YNH kodlu (-116,83) yoğurt örneğinde ölçülmüştür (Çizelge 4.44). Depolama boyunca genel olarak iç yapışkanlık değerlerinde artma olmuş, 1. günde - 155,34 olan değer, 21. günde -156,82’ye yükselmiştir. Kıvam sonuçlarıyla uyumlu olarak değişen viskozite değerlerinde de en yüksek değer YC kodlu (-351,78) kontrol yoğurduna, en düşük değer ise YNH kodlu (-204,62) yoğurt örneğine aittir (Çizelge 4.45). Depolama boyunca genel olarak viskozite değerlerinde de bir artış söz konusudur, buna göre 1. günde -272,01 olan değer, 21. günde -302,05 olmuştur. 114 Çizelge 4.42. Yoğurtların sıkılık değerleri değişimi Sıkılık Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 236,65±0,11cD 253,19±0,08cC 310,38±0,01aB 410,43±0,01aA YM 314,07±0,01aB 327,72±0,01aA 242,66±0,01cC 280,59±0,01cD YNS 262,89±0,01bD 268,68±0,01bB 264,59±0,01bC 283,11±0,01bA YNSE 204,90±0,01eD 241,36±0,01dA 241,36±0,01dB 217,15±0,01dC YNH 186,02±0,01fD 227,45±0,01eA 207,51±0,01fB 201,45±0,01fC YNHE 209,34±0,01dC 203,73±0,01fD 213,90±0,01eA 210,46±0,01eB En küçük 186,02±0,01 203,73±0,01 207,51±0,01 201,46±0,01 En Büyük 314,07±0,01 327,72±0,01 310,38±0,01 410,43±0,01 Ortalama 235,65±0,03 253,69±0,02 246,73±0,01 235,65±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.43. Yoğurtların kıvam değerleri değişimi Kıvam Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 5887,47±0,09cD 6454,02±0,06bC 7536,37±0,01aB 10694,04±0,01aA YM 6908,37±0,01bC 7164,48±0,01aA 6136,05±0,01cD 6990,35±0,01bB YNS 6915,45±0,01aA 6403,00±0,01cD 6499,08±0,01bC 6539,22±0,01cB YNSE 4837,23±0,01eD 5851,74±0,01dA 5371,10±0,01dC 5434,45±0,01dB YNH 4501,69±0,01fD 5557,80±0,01eA 5010,24±0,01fB 4674,20±0,01fC YNHE 5039,86±0,01dC 4950,61±0,01fD 5099,54±0,01eB 5146,61±0,01eA En küçük 4501,69±0,01 4950,61±0,01 5010,24±0,01 4674,20±0,01 En Büyük 6915,45±0,01 7164,48±0,01 7536,37±0,01 10694,04±0,01 Ortalama 5681,17±0,02 6063,61±0,02 5942,06±0,01 4979,81±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) 115 Çizelge 4.44. Yoğurtların iç yapışkanlık değerleri değişimi İç Yapışkanlık Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC -136,95±0,11dD -154,48±0,01dC -156,53±0,04bB -249,36±0,01aA YM -164,64±0,01cB -167,23±0,01bA -144,97±0,01cD -159,60±0,03cC YNS -172,07±0,01bC -160,54±0,01cD -205,48±0,01aA -183,77±0,01bB YNSE -207,59±0,01aB -227,96±0,01aA -130,39±0,01eD -132,13±0,01dC YNH -127,64±0,01eA -124,23±0,01eB -110,42±0,01fC -105,03±0,01fD YNHE -123,24±0,01fB -120,47±0,01fC -140,91±0,01dA -111,01±0,01eD En küçük -123,24±0,01 -120,47±0,01 -110,42±0,01 -105,03±0,01 En Büyük -207,59±0,01 -227,96±0,01 -205,48±0,01 -249,36±0,01 Ortalama 155,36±0,03 159,15±0,01 148,12±0,02 156,82±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.45. Yoğurtların viskozite değerleri değişimi Viskozite Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC -253,37±0,02dD -320,66±0,03bC -334,04±0,01aB -499,00±0,01aA YM -333,92±0,01bB -354,68±0,01aA -298,07±0,01bC -289,73±0,01cD YNS -339,18±0,01aB -293,38±0,01cD -293,42±0,01cC -356,20±0,01bA YNSE -243,36±0,03eC -239,87±0,02dD -258,10±0,02dB -285,37±0,02dA YNH -202,59±0,01fC -238,24±0,01eA -202,91±0,01fB -174,79±0,03fD YNHE -259,66±0,01cA -234,45±0,01fB -203,47±0,01eD -207,19±0,01eC En küçük -202,59±0,01 -234,45±0,01 -202,91±0,01 -174,79±0,01 En Büyük -339,18±0,01 -354,68±0,01 -334,04±0,01 -499,00±0,01 Ortalama -272,01±0,02 -280,21±0,02 -265,00±0,01 -302,05±0,02 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) TA.XT-plus Texture Analyser (Stable Micro Systems) cihazı ile elde edilen sonuçlara bakılacak olunursa, yoğurtların depolama boyunca tekstür profil analiz parametre değerlerinin değişimine ilişkin tüm istatistiksel analiz sonuçları istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.46). 116 Çizelge 4.46. Tekstür profil analiz parametre değerlerinin istatistik analizi Örnek Çeşidi N Sıkılık Kıvam İç Yapışkanlık Viskozite YC 8 302,70a 7643,00a -174,32c -351,78a YM 8 291,26b 6799,81b -159,11d -319,10c YNS 8 268,82c 6589,19c -180,47a -320,55b YNSE 8 223,51d 5373,63d -174,52b -256,67d YNH 8 205,61f 4935,99f -116,84f -204,63f YNHE 8 209,36e 5059,16e -123,91e -226,20e Depolama Süresi (gün) 1.gün 12 235,66d 5681,69d -155,35c -272,02c 7.gün 12 253,70b 6063,62b -159,16a -280,22b 14.gün 12 244,94c 5942,07c -148,12d -265,01d 21.gün 12 267,20a 6579,81a -156,82b -302,05a ANOVA Örnek Çeşidi * * * * Depolama Süresi * * * * Örnek Çeşidi x Depolama Süresi * * * * Farklı harf taşıyan ortalamalar birbirinden farklıdır (* p<0.05) Süt ürünlerinde oluşan renkler tüketici kabulü ve satın alma niyeti bakımından son derece önem arz etmektedir (Dönmez ve diğerleri, 2017). Bu nedenle bu tez çalışmasında yoğurtların renk ölçüm analizleri de çalışılmıştır. Yoğurtların belirtilen 4 farklı depolama gününde alınan örnekleri üzerinden renk parametre değerleri tespit edilmiştir. Bu parametrelerde L aydınlık, a kırmızı ve yeşil renk yoğunluğunu, b ise sarı ve mavi renk yoğunluğunu temsil etmektedir (Şimşek ve diğerleri, 2010). Hunter-Lab ile elde edilen renk ölçümü sonuçlarının değerlendirmesinde aşağıdaki renk skalası kullanılmaktadır (Şekil 4.13). Üç boyutlu koordinat sisteminde L değeri dikey eksende parlaklıktan/beyazdan (100), koyuluğa/siyaha (0) doğru olan değişimi ifade etmektedir. Buna göre, L değeri 100’e yakınlaştıkça renk beyaza doğru, 0’a yakınlaştıkça siyaha doğru gitmektedir. Koordinat sisteminde a; pozitif koordinatta (+) kırmızı ve negatif koordinatta (-) yeşil renkleri ifade etmektedir. a değeri negatif değerde büyüdükçe yeşil renk yoğunluğu, pozitif değerde büyüdükçe kırmızı renk yoğunluğu artmaktadır. b için ise yine negatif yönde değer büyüdükçe yoğun bir mavi, pozitif yönde değer büyüdükçe yoğun bir sarı renk algılanmaktadır. 117 Şekil 4.13. Renk ölçümü sonuçlarının değerlendirmesinde kullanılan renk skalası (TS 1466) Mikroalglerin sanayi ürünlerinde kullanımını sınırlayan önemli bir etki, ürünlerin rengini değiştiren yeşil pigmentler olup; bu etkiyi azaltan ve tavsiye edilen, yine mikroenkapsülasyon yöntemidir (Nourmohammadi ve diğerleri, 2020). 6 farklı yoğurdun paralelli olarak okunan değerleri Çizelge 4.47’de verilmiştir. Hunter-Lab cihazı ile elde edilen sonuçlara genel olarak bakılacak olunursa, yoğurtlarda Spirulina mikroalginin renginin baskın olduğu L/a/b değerleri ile net bir şekilde gözlemlenmiştir. YC, YNS ve YNH kodlu yoğurt örnekleri beyaza daha yakın renkte iken, YM, YNSE ve YNHE kodlu yoğurtlarda gri renge daha yakın sonuç elde edilmiştir. Mikroalg eklenmesinin yoğurtların L değerleri üzerine etkisi istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.52). Mikroenkapsüllü yoğurtlar ne kadar beyaz olursa, mikroalgin varlığı o kadar az hissedilir (Nourmohammadi ve diğerleri, 2020). Enkapsüle mikroalg katılan yoğurtlara (YNSE, YNHE) nazaran enkapsüllenmemiş yoğurt örneğinde (YM) daha düşük L değerine rastlanmıştır. Depolamanın son gününe doğru ise tüm numunelerde azalma eğilimindedir. a değerlerine bakılacak olunursa, beklendiği üzere YM, YNSE ve YNHE kodlu örneklerde yeşile yakın sonuçlar elde edilmiştir. Örnekler arasında mikroalgin direkt eklendiği (YM) yoğurt örneğinde daha baskın bir renk olduğundan daha yüksek a değerine sahip olup, enkapsüllü Spirulina’larda (YNSE, YNHE) bu değer daha düşük tespit edilmiştir. Buradan kapsüllemenin, kapsüllerin yeşil rengini azalttığı sonucuna varılmıştır. Depolama koşullarında 118 ise giderek azalan bir yeşil renk sonucu gözlemlenmiştir. Diğerlerinde önemli bir renk ayrımı gözlemlenmemiştir. Ancak depolama koşullarında eksi yönde artış olmuştur. Çizelge 4.47. Yoğurtlarda yapılan renk ölçümü sonuçları Örnek Çeşidi Depolama Süresi (Gün) L a b 1. 92,09±0,01 -2,39±0,00 12,41±0,01 YC 7. 91,88±0,01 -2,53±0,01 12,55±0,01 14. 91,99±0,01 -2,40±0,01 12,41±0,05 21. 91,80±0,02 -2,36±0,00 12,54±0,04 1. 54,63±0,01 -15,73±0,00 5,48±0,01 YM 7. 53,41±0,01 -13,87±0,01 5,07±0,00 14. 53,18±0,04 -14,10±0,01 5,06±0,02 21. 53,46±0,09 -13,39±0,01 5,18±0,01 1. 86,64±0,01 -1,66±0,02 12,15±0,01 YNS 7. 86,36±0,01 -1,78±0,01 12,27±0,00 14. 86,23±0,15 -1,75±0,01 12,23±0,12 21. 86,25±0,03 -1,83±0,01 12,39±0,01 1. 58,76±0,05 -11,27±0,00 4,87±0,01 YNSE 7. 57,88±0,16 -9,97±0,01 4,98±0,01 14. 57,17±0,08 -9,91±0,01 4,55±0,01 21. 59,08±0,69 -9,24±0,00 4,89±0,01 1. 87,59±0,01 -1,55±0,00 11,92±0,01 YNH 7. 87,39±0,04 -1,63±0,01 11,77±0,04 14. 87,28±0,04 -1,62±0,00 11,73±0,01 21. 87,32±0,04 -1,68±0,00 11,75±0,03 1. 63,74±0,32 -6,91±0,05 5,49±0,03 7. 60,33±0,31 -6,56±0,04 4,71±0,05 YNHE 14. 59,44±0,08 -6,60±0,01 4,69±0,02 21. 60,20±0,06 -6,43±0,02 4,69±0,06 b değerlerinde ise yine aynı kodlu yoğurt örneği gruplarında benzer sonuçlar elde edilmiştir. YC, YNS ve YNH kodlu yoğurtlarda pozitif yönde artan yani sarıya doğru ilerleyen renkler gözlemlenmiştir. YM, YNSE ve YNHE kodlu yoğurtlar sarı renkten daha uzak sonuçlar vermiştir. Depolama koşullarında önemli bir fark elde edilmemiştir. İlerleyen günlerde ilk grup yoğurt örnekleri için daha sarı renkte olma durumu, ikinci grup yoğurt örnekleri için ise azalan bir sarı renk eğilimi söz konusudur. 119 Çizelge 4.48. Yoğurtların L değerleri değişimi L Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 92,09±0,01aA 91,88±0,01aC 91,99±0,01aB 91,80±0,02aD YM 54,63±0,01fA 53,41±0,01fB 53,18±0,04fC 53,46±0,09fB YNS 86,64±0,01cA 86,36±0,01cB 86,23±0,15cB 86,25±0,03cB YNSE 58,76±0,05eAB 57,88±0,16eBC 57,17±0,08eC 59,08±0,69eA YNH 87,59±0,01bA 87,39±0,04bB 87,28±0,04bC 87,32±0,04bBC YNHE 63,74±0,32dA 60,33±0,31dB 59,44±0,08dC 60,20±0,06dB En küçük 54,63±0,01 53,41±0,01 53,18±0,04 53,46±0,09 En Büyük 92,09±0,01 91,88±0,01 91,99±0,01 91,80±0,02 Ortalama 73,91±0,07 72,88±0,09 72,55±0,07 73,04±0,16 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.49. Yoğurtların a değerleri değişimi a Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC -2,39±0,00dB -2,53±0,01dA -2,40±0,01dB -2,36±0,00dC YM -15,73±0,00aA -13,87±0,01aC -14,10±0,01aB -13,39±0,01aD YNS -1,66±0,02eC -1,78±0,01eB -1,75±0,01eB -1,83±0,01eA YNSE -11,27±0,00bA -9,97±0,01bB -9,91±0,01bC -9,24±0,00bD YNH -1,55±0,00fC -1,63±0,01f B -1,62±0,00fB -1,68±0,00fA YNHE -6,91±0,05cA -6,56±0,04cB -6,60±0,01cB -6,43±0,02cC En küçük -1,55±0,00 -1,63±0,01 -1,62±0,00 -1,68±0,00 En Büyük -15,73±0,00 -13,87±0,01 -14,10±0,01 -13,39±0,01 Ortalama -5,43±0,01 -6,06±0,02 -6,06±0,01 -5,82±0,01 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) L değeri açısından en yüksek değer YC kodlu (91,94) kontrol grubunda iken, en düşük değer mikroalgin direkt katıldığı YM kodlu (53,67) yoğurt örneğinde görülmüştür (Çizelge 4.48). Depolamanın 1. gününde örneklerin ortalama L değeri 73,90 iken, son gününde 73,02 olmuştur. 120 a değeri açısından ise en yüksek değer beklendiği üzere YM kodlu (-14,27) yoğurt örneğindeyken, en düşük değer YNH kodlu (-1,62) yoğurt örneğindedir (Çizelge 4.49). Depolamanın 1. gününde -6,58 olan a değeri, 21. gününde -5,82’ye gerilemiştir. Çizelge 4.50. Yoğurtların b değerleri değişimi b Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 12,41±0,01aB 12,55±0,01aA 12,41±0,05aB 12,54±0,04aA YM 5,48±0,01dA 5,07±0,00dC 5,06±0,02dC 5,18±0,01dB YNS 12,15±0,01bB 12,27±0,00bAB 12,23±0,12bAB 12,39±0,01bA YNSE 4,87±0,01eB 4,98±0,01eA 4,55±0,01fC 4,89±0,01eB YNH 11,92±0,01cA 11,77±0,04cB 11,73±0,01cB 11,75±0,03cB YNHE 5,49±0,03dA 4,71±0,05fB 4,69±0,02eB 4,69±0,06fB En küçük 4,87±0,01 4,71±0,05 4,55±0,01 4,69±0,06 En Büyük 12,41±0,01 12,55±0,01 12,41±0,05 12,54±0,04 Ortalama 8,72±0,01 8,56±0,02 8,45±0,04 8,57±0,03 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) b değerlerinde ise durum şöyledir: en yüksek YC kodlu (12,47) ve en düşük YNSE kodlu (4,82) yoğurt örneği şeklindedir (Çizelge 4.50). Depolamanın 1. gününde b değeri 8,72 iken, son gününde 8,57 olmuştur. Yoğurtların depolama boyunca renk ölçümü değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında örnek çeşidi, depolama süresi ve örnek çeşidi x depolama süresi bakımından tüm sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.52). Genel olarak elde edilen sonuçlara göre, yoğurtlarda Spirulina mikroalginin baskın olduğu kanıtlanmıştır. Yoğurtların renkleri depolama koşullarında daha mat olma eğiliminde olmuştur. Bu da depolama süresi boyunca giderek azalan L/a/b değerleri ile uyumludur. 121 Çizelge 4.51. Renk ölçümü değerlerinin istatistik analizi Örnek Çeşidi N L a b YC 8 91,94a -2,42d 12,47a YM 8 53,67f -14,27a 5,20d YNS 8 86,37c -1,75e 12,26b YNSE 8 58,22e -10,10b 4,82f YNH 8 87,39b -1,62f 11,79c YNHE 8 60,93d -6,62c 4,89e Depolama Süresi (gün) 1.gün 12 73,90a -6,58a 8,72a 7.gün 12 72,87b -6,05b 8,56b 14.gün 12 72,55c -6,06b 8,44c 21.gün 12 73,02b -5,82c 8,57b ANOVA Örnek Çeşidi * * * Depolama Süresi * * * Örnek Çeşidi x Depolama Süresi * * * Farklı harf taşıyan ortalamalar birbirinden farklıdır (* p<0.05) Tüketici tarafından beğenilen ve talep edilen yeni fonksiyonel ürünlerin üretilmesi açısından, öncesinde duyusal muayene testinin yapılması son derece önemlidir. Üretilen bu 6 farklı yoğurt örneğinin duyusal özelliklerine ait olan parametrelerin sonuçları Çizelge 4.52’de verilmiştir. Ayrıca, duyusal değerlendirmelerin belirli periyotlar halinde düzenli olarak yapılması, tutarlı sonuçlar doğurur. Yoğurt örnekleri depolama süreci boyunca her hafta düzenli olarak aynı kişiler tarafından teste tabi tutulmuştur. Renk, görünüş, kıvam (kaşıkta), kıvam (ağızda) koku, tat, duyusal asitlik ve genel kabul edilebilirlik parametreleri açısından toplam 7 kişi tarafından 1-5 puan aralığında hedonik test ile değerlendirilen yoğurt örnekleri genel olarak yüksek puanlarla beğeni almıştır. Mikroalgli yoğurtlarda (YM, YNSE, YNHE) renk açısından diğer yoğurt örneklerine nazaran daha düşük puanlar söz konusudur. Üretim sırasında mikroalgin ve mikroenkapsüllerin tam anlamıyla çözünmemesinden dolayı homojen renk dağılımı elde edilemediğinden bu durumun sonuçlarda negatif etkisi görülmüştür. En düşük puanı YNHE kodlu yoğurt örneği, en yüksek puanı ise hiçbir şey katılmamış kontrol yoğurdu YC almıştır. Bu durum görünüş ve kıvam parametrelerinde de görülmektedir. Dipte bir miktar tortu bulundurması panelistler tarafından olumsuz olarak değerlendirilmiştir. Bu açıdan en düşük 122 puanı YNHE, en yüksek puanı YC kodlu yoğurt örneği almıştır. Genel olarak, tüm yoğurt örnekleri kıvam açışından depolama süresi boyunca koyu bir akıcılığa sahip olmuştur. Dolayısıyla yoğurtlarda gözle görülebilir serum ayrılması olmamıştır veya az olmuştur. Sonuçlarda yine YNHE kodlu yoğurt örneği en düşük, YC kodlu yoğurt örneği en yüksek puanlara sahiptir. Koku parametresinde kendine özgü, hoş koku, yosun ve meyvemsi koku aranan özellikler arasında yer almaktadır. Spirulina mikroalginin baskın yosun kokusu YM kodlu yoğurt örneğinin en düşük puanı almasına sebep olmuştur. Mikroalgin yer aldığı mikroenkapsüllü yoğurt örnekleri (YNHE ve YNSE), nar kabuğu ekstraktlarının katıldığı (YNH ve YNS) yoğurtlarla benzer ve aynı zamanda yüksek puanlara sahiptir. En yüksek puanı yine YC kodlu kontrol yoğurdu almıştır. Kendine özgü (hafif ekşimsi), yosunumsu ve meyvemsi tat özelliklerinin arandığı tat parametresinde ise ekstraktlı yoğurtlarda (YNH ve YNS) en yüksek puanları almıştır. En düşük puan ise YNSE kodlu yoğurt örneğinde görülmektedir. 123 Çizelge 4.52. Yoğurtların duyusal muayene testi sonuçları Örnek Depolama Kıvam Kıvam Duyusal Genel Kabul Çeşidi Süresi (Gün) Renk Görünüş (Kaşıkta) (Ağızda) Koku Tat Asitlik Edilebilirlik 1. 4,86±0,38 4,86±0,38 4,86±0,38 4,57±0,53 4,57±0,53 3,86±0,90 3,14±0,90 4,14±0,69 YC 7. 4,71±0,49 4,71±0,48 4,14±0,53 4,14±0,69 4,14±0,53 3,71±0,76 3,14±1,07 4,14±0,90 14. 4,86±0,38 4,71±0,49 5,00±0,00 4,57±0,79 4,71±0,49 3,86±1,07 3,71±1,11 4,43±0,79 21. 4,86±0,38 4,86±0,38 4,43±0,53 4,29±0,76 4,71±0,49 4,14±0,69 4,00±1,15 4,14±1,46 1. 3,14±1,07 3,29±0,95 3,86±0,90 3,43±0,98 3,71±0,76 3,14±1,21 3,29±0,49 3,00±0,82 YM 7. 4,00±1,00 3,86±0,69 4,00±0,58 4,29±0,49 3,14±1,11 2,71±0,76 2,71±0,49 3,14±0,82 14. 4,00±0,82 3,71±0,76 4,43±0,98 4,14±0,90 3,71±0,76 2,86±0,90 2,86±0,69 2,57±1,33 21. 3,86±0,69 3,86±0,69 4,00±1,00 3,57±0,53 3,57±0,79 2,86±1,07 3,14±1,35 2,57±1,27 1. 4,14±0,38 4,29±0,49 4,29±0,95 3,71±0,98 4,00±0,58 3,86±0,69 4,00±0,82 3,86±0,69 YNS 7. 4,14±1,07 4,29±0,95 4,14±0,69 3,86±0,90 4,14±0,90 3,86±0,90 3,43±0,98 3,71±0,95 14. 4,14±0,69 4,29±0,76 4,86±0,38 4,43±0,82 4,29±0,76 4,14±0,90 3,43±1,27 3,57±1,13 21. 4,29±0,95 4,14±0,90 4,43±0,79 4,14±0,58 4,14±0,69 3,86±0,90 3,71±0,95 3,14±0,69 1. 3,43±0,98 3,57±0,98 3,71±1,11 3,57±0,98 4,14±0,69 3,71±0,76 3,43±0,53 3,43±0,79 YNSE 7. 3,86±0,69 3,71±0,76 3,71±0,76 3,86±0,90 4,00±0,58 3,43±0,79 3,29±0,38 3,57±0,79 14. 4,43±0,53 4,29±0,49 4,43±0,53 4,00±0,82 4,00±0,58 3,71±1,11 3,00±1,29 2,71±1,89 21. 3,86±0,38 4,00±0,58 4,14±0,90 4,00±0,58 3,86±0,90 3,14±0,90 3,42±0,79 3,14±0,90 1. 4,57±0,53 4,57±0,53 4,14±0,90 4,14±0,69 4,29±0,49 4,43±0,79 5,00±0,00 4,71±0,49 YNH 7. 4,57±0,53 4,43±0,79 3,86±0,69 3,29±0,49 4,00±0,82 4,00±0,82 3,71±0,95 4,00±0,82 14. 4,29±0,49 4,29±0,76 4,14±0,90 4,14±0,69 4,00±0,58 3,71±1,25 3,43±1,51 3,71±0,95 21. 4,71±0,49 4,57±0,79 4,43±1,13 4,29±0,76 4,14±0,69 4,57±0,79 4,14±0,90 4,43±0,53 1. 2,71±0,76 2,86±0,69 3,43±1,27 3,71±0,76 4,00±0,76 3,86±0,69 4,00±1,00 2,71±1,11 YNHE 7. 3,71±0,76 3,43±0,98 3,43±0,53 3,43±0,79 4,00±0,00 3,43±1,13 3,43±1,13 3,43±1,27 14. 3,71±0,49 3,57±0,53 4,00±0,82 3,86±0,69 3,86±0,69 3,71±0,76 3,14±1,21 2,71±1,38 21. 3,71±0,49 3,43±0,79 4,00±1,00 3,71±0,95 4,00±0,58 4,29±0,95 3,86±1,21 3,57±0,79 124 Çizelge 4.53. Yoğurtların renk değerleri değişimi Renk Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 4,86±0,38aA 4,71±0,49aA 4,86±0,38aA 4,86±0,38aA YM 3,14±1,07bA 4,00±1,0abcA 4,00±0,82bcA 3,86±0,69bA YNS 4,14±0,38bA 4,14±1,07abcA 4,14±0,69bcA 4,29±0,95abA YNSE 3,43±0,98bB 3,86±0,69bcAB 4,43±0,53abA 3,86±0,38bAB YNH 4,57±0,53aA 4,57±0,53abA 4,29±0,49abcA 4,71±0,49aA YNHE 2,71±0,76bB 3,71±0,76cA 3,71±0,49cA 3,71±0,49bA En küçük 2,71±0,76 3,71±0,76 3,71±0,49 3,71±0,49 En Büyük 4,86±0,38 4,71±0,49 4,86±0,38 4,86±0,38 Ortalama 3,80±0,68 4,17±0,76 4,24±0,57 4,22±0,56 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.54. Yoğurtların görünüş değerleri değişimi Görünüş Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 4,86±0,38aA 4,71±0,48aA 4,71±0,49aA 4,86±0,38aA YM 3,29±0,95cA 3,86±0,69abcA 3,71±0,76bcA 3,86±0,69bcA YNS 4,29±0,49abA 4,29±0,95abcA 4,29±0,76abA 4,14±0,90abcA YNSE 3,57±0,98bcA 3,71±0,76bcA 4,29±0,49abA 4,00±0,58bcA YNH 4,57±0,53aA 4,43±0,79abA 4,29±0,76abA 4,57±0,79abA YNHE 2,86±0,69cA 3,43±0,98cA 3,57±0,53cA 3,43±0,79cA En küçük 2,86±0,69 3,43±0,98 3,57±0,53 3,43±0,79 En Büyük 4,86±0,38 4,71±0,48 4,71±0,49 4,86±0,38 Ortalama 3,91±0,67 4,07±0,78 4,14±0,63 4,14±0,69 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Duyusal asitlik parametresinde yoğurdun kendine özgü ekşiliğinin duyusal olarak değerlendirildiği yoğurtlarda en düşük puanı mikroalgin direkt eklendiği YM kodlu yoğurt örneği almıştır. Mikroalgin asitliği hızlandırdığı düşünülmüştür. Bu durum sonuçlara da yansımıştır. 125 Çizelge 4.55. Yoğurtların kıvam (kaşıkta) değerleri değişimi Kıvam (Kaşıkta) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 4,86±0,38aAB 4,14±0,53aB 5,00±0,00aA 4,43±0,53aB YM 3,86±0,90abA 4,00±0,58abcA 4,43±0,98abcA 4,00±1,00aA YNS 4,29±0,95abA 4,14±0,69abA 4,86±0,38abA 4,43±0,79aA YNSE 3,71±1,11bA 3,71±0,76bcA 4,43±0,53abcA 4,14±0,90aA YNH 4,14±0,90abA 3,86±0,69abcA 4,14±0,90bcA 4,43±1,13aA YNHE 3,43±1,27bA 3,43±0,53cA 4,00±0,82cA 4,00±0,82aA En küçük 3,43±1,27 3,43±0,53 4,00±0,82 4,00±1,00 En Büyük 4,86±0,38 4,14±0,53 5,00±0,00 4,43±1,13 Ortalama 4,05±0,92 3,88±0,63 4,48±0,60 4,24±0,86 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.56. Yoğurtların kıvam (ağızda) değerleri değişimi Kıvam (Ağızda) Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 4,57±0,53aA 4,14±0,69abA 4,57±0,79aA 4,29±0,76aA YM 3,43±0,98bB 4,29±0,49aA 4,14±0,90aAB 3,57±0,53aAB YNS 3,71±0,76abA 3,86±0,69abcA 4,43±0,53aA 4,14±0,90aA YNSE 3,57±0,98bA 3,86±0,90abcA 4,00±0,82aA 4,00±0,58aA YNH 4,14±0,69abA 3,29±0,49cB 4,14±0,69aA 4,29±0,76aA YNHE 3,71±0,76abA 3,43±0,79bcA 3,86±0,69aA 3,71±0,95aA En küçük 3,43±0,98 3,29±0,49 3,86±0,69 3,57±0,53 En Büyük 4,57±0,53 4,29±0,49 4,57±0,79 4,29±0,76 Ortalama 3,86±0,78 3,81±0,68 4,19±0,74 4,00±0,75 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Renk, görünüş, kıvam, koku, tat gibi duyusal özellik parametrelerinin tümünü içeren genel kabul edilebilirlik kriteri açısından da değerlendirilen yoğurtlarda yine en düşük puan YM kodlu yoğurt örneğinde gözlemlenmiştir. En yüksek puan ise YC ve YNH kodlu yoğurtlarda görülmektedir. 126 Çizelge 4.57. Yoğurtların koku değerleri değişimi Koku Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 4,57±0,53aA 4,14±0,53aA 4,71±0,49aA 4,71±0,49aA YM 3,71±0,76bA 3,14±1,11bA 3,71±0,76bA 3,57±0,79bA YNS 4,00±0,58abAB 4,14±0,90aB 4,29±0,76abA 4,14±0,69abAB YNSE 4,14±0,69abA 4,00±0,58abA 4,00±0,58bA 3,86±0,90bA YNH 4,29±0,49abA 4,00±0,82abA 4,00±0,58bA 4,14±0,69abA YNHE 4,00±0,76abA 4,00±0,00abA 3,86±0,69bA 4,00±0,58abA En küçük 3,71±0,76 3,14±1,11 3,71±0,76 3,57±0,79 En Büyük 4,57±0,53 4,14±0,90 4,71±0,49 4,71±0,49 Ortalama 4,12±0,64 3,90±0,66 4,10±0,64 4,07±0,69 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.58. Yoğurtların tat değerleri değişimi Tat Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 3,86±0,90abA 3,71±0,76aA 3,86±1,07abA 4,14±0,69aA YM 3,14±1,21bA 2,71±0,76bA 2,86±0,90bA 2,86±1,07cA YNS 3,86±0,69abA 3,86±0,90aA 4,14±0,90aA 3,86±0,90abA YNSE 3,71±0,76abA 3,43±0,79abA 3,71±1,11abA 3,14±0,90bcA YNH 4,43±0,79aA 4,00±0,82aA 3,71±1,25abA 4,57±0,79aA YNHE 3,86±0,69abA 3,43±1,13abA 3,71±0,76abA 4,29±0,95aA En küçük 3,14±1,21 2,71±0,76 2,86±0,90 2,86±1,07 En Büyük 4,43±0,79 4,00±0,82 4,14±0,90 4,57±0,79 Ortalama 3,81±0,84 3,52±0,86 3,04±1,00 3,81±0,88 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Yoğurtların depolama boyunca duyusal muayene test parametreleri değerlerinin değişimine ilişkin istatistiksel analiz sonuçlarına bakıldığında örnek çeşidi bakımından sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.05) (Çizelge 4.61). Depolama süresi ve örnek çeşidi x depolama süresi bakımından ise renk, kıvam (kaşıkta) ve duyusal asitlik parametreleri dışında tüm sonuçlar istatistiksel olarak önemsiz bulunmuştur (p>0.05). 127 Çizelge 4.59. Yoğurtların duyusal asitlik değerleri değişimi Duyusal Asitlik Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 3,14±0,90cA 3,14±1,07abA 3,71±1,11aA 4,00±1,15aA YM 3,29±0,49bcA 2,71±0,49bA 2,86±0,69aA 3,14±1,35aA YNS 4,00±0,82bA 3,43±0,98abA 3,43±1,27aA 3,71±0,95aA YNSE 3,43±0,53bcA 3,29±0,38abA 3,00±1,29aA 3,42±0,79aA YNH 5,00±0,00aA 3,71±0,95aB 3,43±1,51aB 4,14±0,90aAB YNHE 4,00±1,00bA 3,43±1,13abA 3,14±1,21aA 3,86±1,21aA En küçük 3,14±0,90 2,71±0,49 2,86±0,69 3,14±1,35 En Büyük 5,00±0,00 3,71±0,95 3,71±1,11 4,14±0,90 Ortalama 2,29±0,62 3,29±0,83 3,26±1,18 3,71±1,06 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) Çizelge 4.60. Yoğurtların genel kabul edilebilirlik değerleri değişimi Genel Kabul Edilebilirlik Örnek Çeşidi Depolama Süresi 1 7 14 21 YC 4,14±0,69abA 4,14±0,90aA 4,43±0,79aA 4,14±1,46abA YM 3,00±0,82cA 3,14±0,82bA 2,57±1,33bA 2,57±1,27cA YNS 3,86±0,69abcA 3,71±0,95abA 3,57±1,13abA 3,14±0,69bcA YNSE 3,43±0,79bcA 3,57±0,79abA 2,71±1,89bA 3,14±0,90bcA YNH 4,71±0,49aA 4,00±0,82abAB 3,71±0,95abB 4,43±0,53aAB YNHE 2,71±1,11abcA 3,43±1,27abA 2,71±1,38bA 3,57±0,79abcA En küçük 2,71±1,11 3,14±0,82 2,57±1,33 2,57±1,27 En Büyük 4,71±0,49 4,14±0,90 4,43±0,79 4,43±0,53 Ortalama 3,64±0,77 3,67±0,93 3,26±1,25 3,50±0,94 a; Küçük harfler bir depolama süresindeki örnekler arası istatistiksel olarak farklı grupları belirtmektedir (p<0.05) A; Büyük harfler örneklerin her depolama süresindeki istatistiksel olarak farklı gruplarını belirtmektedir (p<0.05) 128 Çizelge 4.61. Duyusal muayene test parametreleri değerlerinin istatistik analizi Örnek Çeşidi N Renk Görünüş Kıvam Kıvam Duyusal Genel Kabul (Kaşıkta) (Ağızda) Koku Tat Asitlik Edilebilirlik YC 28 4,82a 4,79a 4,68a 4,39a 4,61a 3,89ab 3,50bc 4,21a YM 28 3,75de 3,68de 4,07bc 3,86b 3,57c 3,89c 3,00c 2,79c YNS 28 4,18bc 4,25bc 4,43ab 4,04ab 4,14b 3,93ab 3,64ab 3,57b YNSE 28 3,89cd 3,89cd 4,00c 3,86b 4,00b 3,50b 3,25bc 3,21bc YNH 28 4,54ab 4,46ab 4,14bc 3,96b 4,11b 4,18a 4,07a 4,21a YNHE 28 3,46e 3,32e 3,75c 3,68b 4,04b 3,82ab 3,61ab 3,25bc Depolama Süresi (gün) 1.gün 42 3,81b 3,90a 4,07b 3,86b 4,17a 3,81a 3,81a 3,74a 7.gün 42 4,17a 4,07a 3,93b 3,81b 3,98a 3,52a 3,26b 3,64ab 14.gün 42 4,24a 4,14a 4,48a 4,19a 4,10a 3,67a 3,26b 3,29b 21.gün 42 4,21a 4,14a 4,24ab 4,00ab 4,07a 3,81a 3,71a 3,50ab ANOVA Örnek Çeşidi * * * * * * * * Depolama Süresi * Önemsiz * Önemsiz Önemsiz Önemsiz * Önemsiz Örnek Çeşidi x Depolama Süresi Önemsiz Önemsiz Önemsiz Önemsiz Önemsiz Önemsiz Önemsiz Önemsiz Farklı harf taşıyan ortalamalar birbirinden farklıdır (* p<0.05) 129 Depolamanın 1. gününde renk puanı 3,81 iken 21. gününde 4,21’e yükselmiştir. Kıvam (kaşıkta) puanı ise depolamanın 1. gününde 4,07 iken yine 21. gününde bir artışla 4,24 olmuştur. Duyusal asitlik değerlerinde de düşüş söz konusudur. 1. günde 3,81 olan puan 21. günde 3,71 olmuştur. Duyusal değerlendirmelere göre panelistler, üretilen yoğurtların genel olarak depolama süresi boyunca asitliklerinin artması dolayısıyla ekşi tadın giderek artığını belirtmişlerdir. Spirulina mikroalginin direkt eklendiği YM kodlu yoğurt örneğinin yoğun yosunumsu, aromatik koku ve keskin hissedilen tadından dolayı rahatsızlıklarını ifade eden panelistler en az puan vererek de düşüncelerini desteklemişlerdir. Mikroenkapsülasyon yöntemi ile tat ve koku maskelendiği için enkapsüllü Spirulina’larda (YNSE, YNHE) mikroalgin rahatsız edici özellikleri azalmıştır. Nar kabuğu ekstraktlarının eklendiği yoğurtların meyvemsi, aromatik koku ve tadı, parlak rengi ve homojen renk dağılımı panelistlerin tercih sebebi olmuştur. Üretilen bu 6 farklı yoğurt örneği panelistler tarafından depolama süresi boyunca duyusal olarak test edilmiş, en son olarak panelistlere “Satın Alma Niyeti” açısından yoğurtların tercih edilip edilmediği sorulmuştur. Panelistlerce genel olarak beğeni görmüş bu yoğurt örnekleri “Kesinlikle Alırım”, “Alırım”, “Belirsiz”, “Almam” ve “Kesinlikle Almam” şeklinde panelistler tarafından derecelendirilmiştir. Şekil 4.14’te elde edilen tüm sonuçlara göre “Kesinlikle Alırım” şeklinde en çok derecelendirilen yani tüketimi en çok tercih edilen YNH kodlu yoğurt örneği olmuştur. YNS, YNHE ve YC kodlu yoğurt örnekleri de yakın sonuçlar almıştır. “Almam” ve “Kesinlikle Almam” şeklinde en çok YM kodlu yoğurt örneği değerlendirilmiştir. 14 12 10 8 6 4 2 0 YC YM YNS YNSE YNH YNHE Kesinlikle Alırım Alırım Belirsiz Almam Kesinlikle Almam Şekil 4.14. Üretilen yoğurtların satın alma niyeti 130 5. SONUÇ Literatürde yoğurdun düzenli olarak tüketildiğinde insan sağlığı açısından olumlu etkilerinin bulunduğu bilgilere yer verilmektedir. İçeriğindeki protein, mineral ve vitaminlerden dolayı biyoyararlılığı yüksek bir besin olup tüketiminde immün (bağışıklık) sistemini güçlendirmekte, tüm yaş grubu insanlarda sağlıklı ve besleyici ürün olarak bilinmektedir. Tüketici taleplerine cevap vermek adına yoğurt üretiminde de çeşitlilik artmıştır. Günümüzde teknolojinin gelişmesiyle birlikte farklı tekstürel (set, stirred vb.), kimyasal (yağsız, az yağlı, yarım yağlı, tam yağlı) ve duyusal (doğal, meyveli, katkılı vb.) özellikte yenilikçi yoğurtlar üretilmektedir. Yoğurda katılan doğal gıda ve gıda katkı maddeleri, içeriğini zenginleştirmekte ve besin değerinin artırılmasında olumlu etki yaratmaktadır. Bu amaçla yapılan değerli çalışmalara ek olarak, bu tezde fonksiyonel yoğurt üretimine yönelik yenilikçi çalışmalar mevcuttur. Bu çalışmada kullanılan proteince zengin Spirulina mikroalgi, biyoteknolojik olarak toksik olmayıp biyokimyasal olarak dengeli olduğundan günümüzde tüm dünyada gıda olarak kullanılmaktadır (Cepoi ve diğerleri, 2017). Al-Dhabi (2013)’ün Spirulina mikroalginde ağır metal analizi yaptığı çalışmada, çalışılan 25 numunede bulunan Ni, Zn, Hg, Pt, Mg ve Mn içeriğinin tamamının günlük alım seviyeleri içinde olduğundan Spirulina’nın güvenli bir şekilde tüketilebileceğini ifade etmiştir (Al-Dhabi, 2013). Günlük hayatta maruz kalınan kimyasalların ya da terapötik amaçla kullanılan ilaçların sebebiyet verdiği doku harabiyetlerinde Spirulina’nın iyileştirici, aynı zamanda koruyucu etkisi tespit edilmiştir (Belay, 2002). Mikroalglerin gıdalara katılması, besleyici ve renklendirici özellikleri ile reolojik açıdan da büyük önem arz etmektedir (Suzery ve diğerleri, 2018). Bu çalışmada, Spirulina mikroalgi ile nar kabuğu ekstraktlarının (sulu ve hidroalkolik) immobilizasyonu ile elde edilen mikroenkapsüllerin yoğurdun mevcut besinsel özelliklerinin yanında pozitif bir etki gösterip göstermediği araştırılmıştır. Spirulina mikroalgi ve nar kabuğu ekstraktlarını içeren fonksiyonel yoğurtların fizikokimyasal ve duyusal özelliklerinde mikroenkapsülasyonun pozitif etkisi görülmüştür. Ayrıca nar kabuğu ekstraktlarında bulunan ellagik asidin mikroenkapsüllerden kontrollü salınımının da incelendiği bu çalışmada üretilen 6 farklı yoğurdun fizikokimyasal, mikrobiyolojik, spektroskopik ve 131 duyusal/tekstür özelliklerinin depolama koşullarında gösterdiği farklılıklar vurgulanmıştır. Araştırma bulguları doğrultusunda özetle şunlar söylenebilir;  Spirulina mikroalginin toplam proteininin belirlenmesi için 2 yöntem çalışılmış, her iki yöntemle de %40 civarında oldukça yüksek bir sonuç elde edilmiştir. Spirulina mikroalginin yüksek protein içeriği ve yüzeyindeki heterojenez fonksiyonel gruplardan dolayı ellagik asit ile enkapsülasyonunda avantaj sağladığı görülmüştür. Spirulina ekstraktının içeriğinde kromatografik olarak tespit edilen 4 farklı karotenoidden miktarca en yüksek β-kriptoksantin bulunmuştur. Aynı zamanda yüzeyinde tespit edilen heterojenez fonksiyonel gruplar, ellagik asidin Spirulina üzerine adsorpsiyonu için Freundlich izoterm modeli ile uygun bulunmuştur.  Nar kabuğunun hidroalkolik ve sulu ekstraktları uygun koşullarda elde edilmiş, daha sonra içeriğindeki fenolik bileşiklerin miktarları kromatografik olarak belirlenmiştir. Bu çalışmanın ilk ve en önemli basamağını oluşturan nar kabuğu ekstraktlarının Spirulina yüzeyine optimum şekilde mikroenkapsülasyonu için Box-Behnken tasarımı (BBD) ile birleştirilmiş yanıt yüzeyi metodolojisi uygulanmış ve enkapsülasyon başarıyla gerçekleştirilmiştir. Böylece enkapsüle edilen antioksidan maddenin zamana bağlı kullanım ömrü artırılmıştır. Mikroalg yüzeyinde enkapsülasyonu FT-IR, DSC ve SEM analizleriyle ispatlanmıştır. Maksimum mikroenkapsülleme 2 saatte, 56,2±1,7 mg/100 mg Spirulina maksimum adsorpsiyon kapasitesiyle sonuçlanmıştır. Ellagik asidin fotokimyasal kararlılığı çalışmasında ise, 7 günlük aralıklarla yapılan ölçümler sonucunda yüzeydeki ellagik asit miktarı çok yavaş azalmıştır. Sonuç olarak, mikroenkapsülasyonun; ellagik asidin kararlılığını korumak için iyi bir yöntem olduğu düşünülmüştür. Daha sonra enkapsüllerin serbest bırakma kinetiğini incelemek için enkapsüle edilen antioksidan maddenin in vitro sindirimi ve mikroalg yüzeyinden kontrollü salınımı, gastrointestinal koşullarda mide ve bağırsak sıvısının simülasyonu ile gerçekleştirilmiştir.  Nar kabuğu ekstraktlarının, ekstraktlı mikroenkapsüllerin ve mikroalgin direkt eklenerek üretildiği 6 farklı yoğurt örneği fizikokimyasal, mikrobiyolojik, 132 spektroskopik ve duyusal/tekstür özellikleri bakımından değerlendirilmiştir. Spirulina mikroalginin yoğurda eklenmesiyle protein seviyesinin daha da arttığı gözlemlenmiş, dolayısıyla tüketiminde insan sağlığı açısından fayda sağlayacağı düşünülmüştür. Aynı zamanda yüksek antioksidan özelliği ile katıldığı yoğurda antioksidan özellik de kazandırmıştır. Protein dışındaki değerli besin öğelerini içermesi ve doğal kaynaklı bir ürün olması nedeniyle sentetik katkı maddelerine alternatif bir çözüm olabilecektir. Mikroalg-antioksidan çiftinin, yoğurt depolama koşullarına etkisi de belirlenmiştir.  Duyusal analiz sonuçlarında genel itibariyle beğenilerin yüksek olduğu tespit edilmiştir. Yapılan değerlendirme neticesinde, kapsülleme ile müşteri memnuniyetinin artabileceği düşünülmüştür. Mikroalglerin renk ve aroması mikroenkapsülasyon yöntemi ile maskelenmiş olup, süt ürünlerinde mikroalglerin kullanımı açısından gelecek vaat eden bir çalışma olduğu sonucuna varılmıştır. Yeşil renkte elde edilen mikroalgli yoğurtlar faydalı besinsel içeriğinin yanında tüketici tarafından görsel olarak da cezbedici olabilecektir. 133 KAYNAKLAR Aceituno-Medina, M., Mendoza, S., Rodríguez, B. A., Lagaron, J. M. ve López-Rubio, A. (2015). Improved antioxidant capacity of quercetin and ferulic acid during in- vitro digestion through encapsulation within food-grade electrospun fibers. Journal of Functional Foods. https://doi.org/10.1016/j.jff.2014.11.028 Adil, I. H., Yener, M. E. ve Bayındırlı, A. (2008). Extraction of total phenolics of sour cherry pomace by high pressure solvent and subcritical fluid and determination of the antioxidant activities of the extracts. Separation Science and Technology. https://doi.org/10.1080/01496390801888243 Akalın, A. S., Ünal, G. ve Dalay, M. C. (2009). Influence of Spirulina platensis biomass on microbiological viability in traditional and probiotic yoghurts during refrigerated storage. Italian Journal of Food Science. Al-Dhabi, N. A. (2013). Heavy metal analysis in commercial Spirulina products for human consumption. Saudi Journal of Biological Sciences. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2013.04.006 Al-Saif, S. S. A., Abdel-Raouf, N., El-Wazanani, H. A. ve Aref, I. A. (2014). Antibacterial substances from marine algae isolated from Jeddah coast of Red sea, Saudi Arabia. Saudi Journal of Biological Sciences, 21(1), 57–64. https://doi.org/10.1016/j.sjbs.2013.06.001 Al-Zoreky, N. S. (2009). Antimicrobial activity of pomegranate (Punica granatum L.) fruit peels. International Journal of Food Microbiology, 134(3), 244–248. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.07.002 Alizadeh Khaledabad, M., Ghasempour, Z., Moghaddas Kia, E., Rezazad Bari, M. ve Zarrin, R. (2020). Probiotic yoghurt functionalised with microalgae and Zedo gum: chemical, microbiological, rheological and sensory characteristics. International Journal of Dairy Technology, 73(1), 67–75. https://doi.org/10.1111/1471- 0307.12625 Aloğlu, H. Ş. ve Öner, Z. (2010). Peyniraltı Suyu Proteinlerinin Mikroenkapsülasyon Teknolojisinde Kaplama Materyali Olarak Kullanım Olanakları Potential Use of Whey Proteins as a Coating Material in Microencapsulation Technology. Akademik Gıda, 8(3), 38–42. Apak, R., Güçlü, K., Özyürek, M. ve Çelik, S. E. (2008). Mechanism of antioxidant capacity assays and the CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity) assay. Microchimica Acta. https://doi.org/10.1007/s00604-007-0777-0 Atamer, M., Yetişmeyen, A. ve Alpar, O. (1986). Farklı Isı Uygulamalarının İnek Sütlerinden Üretilen Yoğurtların Bazı Özellikleri Üzerine Etkisi. Içinde A.Ü. Ziraat Fakültesi (C. 11, Sayı 1, ss. 22–28). Augustin, M. A. ve Hemar, Y. (2009). Nano- and micro-structured assemblies for encapsulation of food ingredients. Içinde Chemical Society Reviews. https://doi.org/10.1039/b801739p Aviram, M. ve Dornfeld, L. (2001). Pomegranate juice consumption inhibits serum angiotensin converting enzyme activity and reduces systolic blood pressure. Atherosclerosis, 158(1), 195–198. https://doi.org/10.1016/S0021-9150(01)00412-9 Bakırcı, İ., Tohma, G. Ş. ve Yüksel, A. K. (2015). Erzurum Piyasas ı nda Sat ı sa Sunulan Yoğurtların Fiziksel, Kimyasal, Mikrobiyolojik ve Duyusal Özelliklerinin İncelenmesi. Akademik Gıda, 13(2), 127–134. Barkallah, M., Dammak, M., Louati, I., Hentati, F., Hadrich, B., Mechichi, T., Ayadi, 134 M. A., Fendri, I., Attia, H. ve Abdelkafi, S. (2017). Effect of Spirulina platensis fortification on physicochemical, textural, antioxidant and sensory properties of yoghurt during fermentation and storage. LWT - Food Science and Technology, 84, 323–330. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2017.05.071 Beheshtipour, H., Mortazavian, A. M., Haratian, P. ve Darani, K. K. (2012). Erratum to Effects of Chlorella vulgaris and Arthrospira platensis addition on viability of probiotic bacteria in yoghurt and its biochemical properties (Eur Food Res Technol, 10.1007/s00217-012-1798-4). European Food Research and Technology, 235(6), 1213. https://doi.org/10.1007/s00217-012-1843-3 Belay, A. (2002). The Potential Application of Spirulina ( Arthrospira ) as a Nutritional and Therapeutic Supplement in Health A Peer-Reviewed Journal on Nutraceuticals and Nutrition The Potential Application of Spirulina (Arthrospira ) as a Nutritional and. The Journal of the American Nutraceutical Association, 5(2), 27–48. Belay, A., Ota, Y., Miyakawa, K. ve Shimamatsu, H. (1993). Current knowledge on potential health benefits of Spirulina. Journal of Applied Phycology, 5(2), 235– 241. https://doi.org/10.1007/BF00004024 Bellumori, M., Innocenti, M., Binello, A., Boffa, L., Mulinacci, N. ve Cravotto, G. (2016). Selective recovery of rosmarinic and carnosic acids from rosemary leaves under ultrasound-and microwave-assisted extraction procedures. Comptes Rendus Chimie, 19(6), 699–706. https://doi.org/10.1016/j.crci.2015.12.013 Beshkova, D., Simova, E., Frengova, G. ve Simov, Z. (1998). Production of flavour compounds by yoghurt starter cultures. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 20(3–4), 180–186. https://doi.org/10.1038/sj.jim.2900504 Betz, M. ve Kulozik, U. (2012). Microencapsulation of bioactive bilberry anthocyanins by means of whey protein gels. Procedia Food Science. https://doi.org/10.1016/j.profoo.2011.10.006 Betz, M., Steiner, B., Schantz, M., Oidtmann, J., Mäder, K., Richling, E. ve Kulozik, U. (2012). Antioxidant capacity of bilberry extract microencapsulated in whey protein hydrogels. Food Research International. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2012.01.010 Brownlee, I. A., Allen, A., Pearson, J. P., Dettmar, P. W., Havler, M. E., Atherton, M. R. ve Onsøyen, E. (2005). Alginate as a source of dietary fiber. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. https://doi.org/10.1080/10408390500285673 Bruschi, M. L., Cardoso, M. L. C., Lucchesi, M. B. ve Gremião, M. P. D. (2003). Gelatin microparticles containing propolis obtained by spray-drying technique: Preparation and characterization. International Journal of Pharmaceutics. https://doi.org/10.1016/S0378-5173(03)00386-7 Bulut-Solak, B. ve Akın, N. (2012). Yoğurt çeşitleri, yoğurtlarda görülen bazı kusurlar ve çözüm önerileri. Academic Food Journal, 10(2), 115–120. Caleja, C., Barros, L., Antonio, A. L., Carocho, M., Oliveira, M. B. P. P. ve Ferreira, I. C. F. R. (2016). Fortification of yoghurts with different antioxidant preservatives: A comparative study between natural and synthetic additives. Food Chemistry, 210, 262–268. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.04.114 Cano-Lamadrid, M., Viuda-Martos, M., García-Garví, J. M., Clemente-Villalba, J., Carbonell-Barrachina, Á. A. ve Sendra, E. (2020). Polyphenolic Profile and Antimicrobial Potential of Peel Extracts Obtained from Organic Pomegranate (Punica granatum L.) Variety “Mollar De Elche”. Acta Horticulturae et Regiotecturae. https://doi.org/10.2478/ahr-2020-0001 135 Capela, P., Hay, T. K. C. ve Shah, N. P. (2006). Effect of cryoprotectants, prebiotics and microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze- dried yoghurt. Food Research International. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2005.07.007 Cardozo, K. H. M., Guaratini, T., Barros, M. P., Falcão, V. R., Tonon, A. P., Lopes, N. P., Campos, S., Torres, M. A., Souza, A. O., Colepicolo, P. ve Pinto, E. (2007). Metabolites from algae with economical impact. Içinde Comparative Biochemistry and Physiology - C Toxicology and Pharmacology. https://doi.org/10.1016/j.cbpc.2006.05.007 Cepoi, L., Chiriac, T., Rudi, L., Djur, S., Zosim, L., Bulimaga, V., Batir, L., Elenciuc, D. ve Rudic, V. (2017). Spirulina as a Raw Material for Products Containing Trace Elements. Içinde Recent Advances in Trace Elements. https://doi.org/10.1002/9781119133780.ch19 Chamorro, G., Salazar, M., Favila, L. ve Bourges, H. (1996). Pharmacology and toxicology of Spirulina alga. Revista de investigación clínica. Chapman, R. L. ve Buchheim, M. A. (1992). Green algae and the evolution of land plants: inferences from nuclear-encoded rRNA gene sequences. BioSystems. https://doi.org/10.1016/0303-2647(92)90015-Q Cilek, B., Luca, A., Hasirci, V., Sahin, S. ve Sumnu, G. (2012). Microencapsulation of phenolic compounds extracted from sour cherry pomace: Effect of formulation, ultrasonication time and core to coating ratio. European Food Research and Technology, 235(4), 587–596. https://doi.org/10.1007/s00217-012-1786-8 Çam, M., Hışıl, Y. ve Durmaz, G. (2009). Classification of eight pomegranate juices based on antioxidant capacity measured by four methods. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2008.06.009 Çam, M., İçyer, N. C. ve Erdoǧan, F. (2014). Pomegranate peel phenolics: Microencapsulation, storage stability and potential ingredient for functional food development. LWT - Food Science and Technology, 55(1), 117–123. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2013.09.011 Dag, D., Kilercioglu, M. ve Oztop, M. H. (2017). Physical and chemical characteristics of encapsulated goldenberry (Physalis peruviana L.) juice powder. LWT - Food Science and Technology. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2017.05.007 Dannenberg, F. ve Kessler, H.-G. (1988). Effect of denaturation of β-lactoglobuin on texture properties of set-style nonfat yoghurt. 2. firmness and flow properties. Milchwissenschaft-Milk Science International. De Souza Neves Ellendersen, L., Granato, D., Bigetti Guergoletto, K. ve Wosiacki, G. (2012). Development and sensory profile of a probiotic beverage from apple fermented with Lactobacillus casei. Engineering in Life Sciences. https://doi.org/10.1002/elsc.201100136 Dewi, E. N., Purnamayati, L. ve Kurniasih, R. A. (2017). Physical characteristics of phycocyanin from Spirulina microcapsules using different coating materials with freeze drying method. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. https://doi.org/10.1088/1755-1315/55/1/012060 Díaz-Bandera, D., Villanueva-Carvajal, A., Dublán-García, O., Quintero-Salazar, B. ve Dominguez-Lopez, A. (2013). Release kinetics of antioxidant compounds from Hibiscus sabdariffa L. encapsulated in gelatin beads and coated with sodium alginate. International Journal of Food Science and Technology. https://doi.org/10.1111/ijfs.12199 136 Domozych, D. S. (2011). Algal Cell Walls. Içinde eLS. https://doi.org/10.1002/9780470015902.a0000315.pub3 Dönmez, Ö., Mogol, B. A. ve Gökmen, V. (2017). Syneresis and rheological behaviors of set yoghurt containing green tea and green coffee powders. Journal of Dairy Science. https://doi.org/10.3168/jds.2016-11262 Fang, R., Hao, R., Wu, X., Li, Q., Leng, X. ve Jing, H. (2011). Bovine serum albumin nanoparticle promotes the stability of quercetin in simulated intestinal fluid. Journal of Agricultural and Food Chemistry. https://doi.org/10.1021/jf200718j Fawole, O. A. ve Opara, U. L. (2016). Stability of total phenolic concentration and antioxidant capacity of extracts from pomegranate co-products subjected to in vitro digestion. BMC Complementary and Alternative Medicine. https://doi.org/10.1186/s12906-016-1343-2 Flores, F. P., Singh, R. K., Kerr, W. L., Pegg, R. B. ve Kong, F. (2014). Total phenolics content and antioxidant capacities of microencapsulated blueberry anthocyanins during in vitro digestion. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2013.12.063 Guldas, M. ve Irkin, R. (2010). Influence of Spirulina platensis powder on the microflora of yoghurt and acidophilus milk. Mljekarstvo. Gupta, S. Sen, Ghosh, S., Maiti, P. ve Ghosh, M. (2012). Microencapsulation of conjugated linolenic acid–rich pomegranate seed oil by an emulsion method. Food Science and Technology International, 18(6), 549–558. https://doi.org/10.1177/1082013211433078 Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R. ve Lee, W. J. (2013). Formation and characterization of quercetin-loaded chitosan oligosaccharide/β-lactoglobulin nanoparticle. Food Research International. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2013.02.021 Harwalkar, V. R. ve Kalab, M. (1986). Relationship between microstructure and susceptibility to syneresis in yoghurt made from reconstituted non-fat dry milk. Food Microstructure. Hegazi, F. Z. ve Abo‐Elnaga, I. G. (1990). Dissimilation of organic acids by dairy lactic acid bacteria. Food / Nahrung. https://doi.org/10.1002/food.19900340905 Herrero, M., Mendiola, J. A., Plaza, M. ve Ibañez, E. (2012). Screening for bioactive compounds from algae. Içinde Advanced Biofuels and Bioproducts (C. 9781461433, ss. 833–872). https://doi.org/10.1007/978-1-4614-3348-4_35 Hongyu, W., Hulbert, G. J. ve Mount, J. R. (2001). Effects of ultrasound on milk homogenization and fermentation with yoghurt starter. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 1(3), 211–218. https://doi.org/10.1016/S1466- 8564(00)00020-5 Imhof, R., Glättli, H. ve Bosset, J. O. (1994). Volatile organic aroma compounds produced by thermophilic and mesophilic mixed strain dairy starter cultures. LWT - Food Science and Technology. https://doi.org/10.1006/fstl.1994.1090 Işık, E., Şahin, S. ve Demir, C. (2013). Development of a new chromium reducing antioxidant capacity (CHROMAC) assay for plants and fruits. Talanta, 111, 119– 124. https://doi.org/10.1016/J.TALANTA.2013.02.053 Jackson, L. S. ve Lee, K. (1991). Microencapsulation and the food industry. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie. Jafari, Y., Sabahi, H. ve Rahaie, M. (2016). Stability and loading properties of curcumin encapsulated in Chlorella vulgaris. Food Chemistry, 211, 700–706. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.05.115 137 Jafri, M. A., Aslam, M., Javed, K. ve Singh, S. (2000). Effect of Punica granatum Linn. (flowers) on blood glucose level in normal and alloxan-induced diabetic rats. Journal of Ethnopharmacology, 70(3), 309–314. https://doi.org/10.1016/S0378- 8741(99)00170-1 Jorge, A. J., De La Garza, T. H., Alejandro, Z. C., Ruth, B. C. ve Noé, A. C. (2013). The optimization of phenolic compounds extraction from cactus pear (Opuntia ficus-indica) skin in a reflux system using response surface methodology. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. https://doi.org/10.1016/S2221- 1691(13)60093-3 Kailasapathy, K. (2002). Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications. Current issues in intestinal microbiology. Karaś, M., Jakubczyk, A., Szymanowska, U., Złotek, U. ve Zielińska, E. (2017). Digestion and bioavailability of bioactive phytochemicals. Içinde International Journal of Food Science and Technology. https://doi.org/10.1111/ijfs.13323 Kaur, C. ve Kapoor, H. C. (2001). Antioxidants in fruits and vegetables - The millennium’s health. Içinde International Journal of Food Science and Technology. https://doi.org/10.1046/j.1365-2621.2001.00513.x Kearney, N., Stanton, C., Desmond, C., Coakley, M., Collins, J. K., Fitzgerald, G. ve Ross, R. P. (2008). Challenges associated with the development of probiotic- containing functional foods. Içinde Handbook of Fermented Functional Foods, Second Edition. Kittikaiwan, P., Powthongsook, S., Pavasant, P. ve Shotipruk, A. (2007). Encapsulation of Haematococcus pluvialis using chitosan for astaxanthin stability enhancement. Carbohydrate Polymers, 70(4), 378–385. https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2007.04.021 Kınık, Ö., Kavas, G. ve Yılmaz, E. (2003). Mikroenkapsülasyon Tekniği ve Süt teknolojisindeki Kullanım Olanakları. Içinde Gida (C. 28, Sayı 4, ss. 401–407). Koç, M., Sakin, M. ve Kaymak-Ertekin, F. (2010). Mikroenkapsülasyon ve Gıda Teknolojisinde Kullanımı. Mühendislik Bilimleri Dergisi. Kropat, C., Betz, M., Kulozik, U., Leick, S., Rehage, H., Boettler, U., Teller, N. ve Marko, D. (2013). Effect of microformulation on the bioactivity of an anthocyanin- rich bilberry pomace extract (Vaccinium myrtillus L.) in vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry. https://doi.org/10.1021/jf305180j Lauber, S., Klostermeyer, H. ve Henle, T. (2001). On the influence of non-enzymatic crosslinking of caseins on the gel strength of yoghurt. Nahrung - Food. https://doi.org/10.1002/1521-3803(20010601)45:3<215::aid-food215>3.3.co;2-t Lee, Y. K., Al Mijan, M., Ganesan, P., Yoo, S. ve Kwak, H. S. (2013). The physicochemical properties of yoghurt supplemented with microencapsulated peanut sprout extract, a possible functional ingredient. International Journal of Dairy Technology, 66(3), 417–423. https://doi.org/10.1111/1471-0307.12047 Leick, S., Kemper, A. ve Rehage, H. (2011). Alginate/poly-l-lysine capsules: Mechanical properties and drug release characteristics. Soft Matter. https://doi.org/10.1039/c1sm05676j Li, H. Bin, Cheng, K. W., Wong, C. C., Fan, K. W., Chen, F. ve Jiang, Y. (2007). Evaluation of antioxidant capacity and total phenolic content of different fractions of selected microalgae. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2006.06.022 Li, F., Yang, L., Zhao, T., Zhao, J., Zou, Y., Zou, Y. ve Wu, X. (2012). Optimization of 138 enzymatic pretreatment for n-hexane extraction of oil from Silybum marianum seeds using response surface methodology. Food and Bioproducts Processing. https://doi.org/10.1016/j.fbp.2011.02.010 Li, M. K. ve Fogler, H. S. (1978). Acoustic emulsification. Part 2. Breakup of the large primary oil droplets in a water medium. Journal of Fluid Mechanics, 88(3), 513– 528. https://doi.org/10.1017/S0022112078002244 Li, Y., Guo, C., Yang, J., Wei, J., Xu, J. ve Cheng, S. (2006). Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peel extract in comparison with pomegranate pulp extract. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2005.02.033 Liu, Y., Wei, S., Liao, M., Liu, L. ve Huang, Y. (2015). Self-assembly of glycinin nanoparticles for delivery of phenolic compounds from Phyllanthus urinaria. RSC Advances, 5(8), 5533–5541. https://doi.org/10.1039/c4ra14136a Lucey, J. A. (2002). Formation and physical properties of milk protein gels. Journal of Dairy Science. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(02)74078-2 Mahavidyalaya, N. M. (2019). Microencapsulation of Almond Oil and Its. 1, 847–852. Mahdi Jafari, S., He, Y. ve Bhandari, B. (2006). Nano-emulsion production by sonication and microfluidization - A comparison. International Journal of Food Properties, 9(3), 475–485. https://doi.org/10.1080/10942910600596464 Malik, A., Afaq, F., Sarfaraz, S., Adhami, V. M., Syed, D. N. ve Mukhtar, H. (2005). Pomegranate fruit juice for chemoprevention and chemotherapy of prostate cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. https://doi.org/10.1073/pnas.0505870102 Markou, G. ve Nerantzis, E. (2013). Microalgae for high-value compounds and biofuels production: A review with focus on cultivation under stress conditions. Içinde Biotechnology Advances. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.07.011 Martins, A., Barros, L., Carvalho, A. M., Santos-Buelga, C., Fernandes, I. P., Barreiro, F. ve Ferreira, I. C. F. R. (2014). Phenolic extracts of Rubus ulmifolius Schott flowers: Characterization, microencapsulation and incorporation into yoghurts as nutraceutical sources. Food and Function, 5(6), 1091–1100. https://doi.org/10.1039/c3fo60721f McCourt, R. M. (1995). Green algal phylogeny. Içinde Trends in Ecology ve Evolution. https://doi.org/10.1016/S0169-5347(00)89027-8 Meenakshi, S., Umayaparvathi, S., Arumugam, M. ve Balasubramanian, T. (2011). In vitro antioxidant properties and FTIR analysis of two seaweeds of Gulf of Mannar. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. https://doi.org/10.1016/S2221- 1691(11)60126-3 Naczk, M. ve Shahidi, F. (2004). Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of chromatography. A. Neve, H., Lorenzen, P. C., Mautner, A., Schlimme, E. ve Heller, K. J. (2001). Effects of transglutaminase treatment on the production of set skim milk yoghurt: Microbiological aspects. Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte, 53(4), 349–359. Nizamlıoğlu, N. M. ve Nas, S. (2010). Meyve ve Sebzelerde Bulunan Fenolik Bileşikler ; Yapıları ve Önemleri. Elektronik, 2010(1), 20–35. Nourmohammadi, N., Soleimanian-Zad, S. ve Shekarchizadeh, H. (2020). Effect of Spirulina (Arthrospira platensis) microencapsulated in alginate and whey protein concentrate addition on physicochemical and organoleptic properties of functional stirred yoghurt. Journal of the Science of Food and Agriculture. 139 https://doi.org/10.1002/jsfa.10576 O’Connell, J. E. ve Fox, P. F. (2001). Significance and applications of phenolic compounds in the production and quality of milk and dairy products: A review. Içinde International Dairy Journal. https://doi.org/10.1016/S0958-6946(01)00033- 4 Oğur, S. (2016). Kurutulmuş alglerin besin değeri ve gıda olarak kullanımı. Ege Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 33(1), 59. https://doi.org/10.12714/egejfas.2016.33.1.10 Özdemir, N. ve Erkmen, J. (2013). Yenilenebilir Biyoplastik Üretiminde Alglerin Kullanımı Use of Algae in Production of Renewable Bioplastics. The Black Sea Journal of Sciences, 3(8), 89–104. Özer, H. B. (2006). Yoğurt Bilimi ve Teknolojisi (1. baskı). Sidas Medya Ltd. Şti. Panichayupakaranant, P., Tewtrakul, S. ve Yuenyongsawad, S. (2010). Antibacterial, anti-inflammatory and anti-allergic activities of standardised pomegranate rind extract. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2010.04.054 Patel, A. R., Heussen, P. C. M., Hazekamp, J., Drost, E. ve Velikov, K. P. (2012). Quercetin loaded biopolymeric colloidal particles prepared by simultaneous precipitation of quercetin with hydrophobic protein in aqueous medium. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.01.054 Pearse, M. J. ve Mackinlay, A. G. (1989). Biochemical Aspects of Syneresis: A Review. Içinde Journal of Dairy Science. https://doi.org/10.3168/jds.S0022- 0302(89)79247-X Peña, W. E. L., de Andrade, N. J., Soares, N. F. F., Alvarenga, V. Ô. O., Rodrigues Junior, S., Granato, D., Giraldo Zuniga, A. D. ve de Souza Sant’Ana, A. (2014). Modelling Bacillus cereus adhesion on stainless steel surface as affected by temperature, pH and time. International Dairy Journal. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2013.08.006 Pu, C. ve Tang, W. (2017). Encapsulation of lycopene in Chlorella pyrenoidosa: Loading properties and stability improvement. Food Chemistry, 235, 283–289. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.05.069 Robert, P., Gorena, T., Romero, N., Sepulveda, E., Chavez, J. ve Saenz, C. (2010). Encapsulation of polyphenols and anthocyanins from pomegranate (Punica granatum) by spray drying. International Journal of Food Science and Technology, 45(7), 1386–1394. https://doi.org/10.1111/j.1365-2621.2010.02270.x Rodsamran, P. ve Sothornvit, R. (2018). Microencapsulation of Thai rice grass (O. Sativa cv. Khao Dawk Mali 105) extract incorporated to form bioactive carboxymethyl cellulose edible film. Food Chemistry, 242, 239–246. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.09.064 Saikia, S., Mahnot, N. K. ve Mahanta, C. L. (2015). Optimisation of phenolic extraction from Averrhoa carambola pomace by response surface methodology and its microencapsulation by spray and freeze drying. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.08.064 Sarıburun, E., Şahin, S., Demir, C., Türkben, C. ve Uylaşer, V. (2010). Phenolic content and antioxidant activity of raspberry and blackberry cultivars. Journal of Food Science. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2010.01571.x Saura-Calixto, F., Serrano, J. ve Goñi, I. (2007). Intake and bioaccessibility of total polyphenols in a whole diet. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2006.02.006 140 Schantz, M., Berg, S., Betz, M., Kulozik, U., Leick, S., Rehage, H., Schwarz, K., Baum, M. ve Richling, E. (2014). Triggered gastrointestinal release of anthocyanins from bilberries (vaccinium myrtillus L.). Acta Horticulturae, 1017, 381–386. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2014.1017.46 Schrooyen, P. M. M., Meer, R. van der ve Kruif, C. G. De. (2001). Microencapsulation: its application in nutrition. Proceedings of the Nutrition Society, 60(4), 475–479. https://doi.org/10.1079/pns2001112 Senaka Ranadheera, C., Evans, C. A., Adams, M. C. ve Baines, S. K. (2012). Probiotic viability and physico-chemical and sensory properties of plain and stirred fruit yoghurts made from goat’s milk. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.06.025 Serafeimidou, A., Zlatanos, S., Kritikos, G. ve Tourianis, A. (2013). Change of fatty acid profile, including conjugated linoleic acid (CLA) content, during refrigerated storage of yoghurt made of cow and sheep milk. Journal of Food Composition and Analysis. https://doi.org/10.1016/j.jfca.2013.02.011 Serrano-Cruz, M. R., Villanueva-Carvajal, A., Morales Rosales, E. J., Ramírez Dávila, J. F. ve Dominguez-Lopez, A. (2013). Controlled release and antioxidant activity of Roselle (Hibiscus sabdariffa L.) extract encapsulated in mixtures of carboxymethyl cellulose, whey protein, and pectin. LWT - Food Science and Technology. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2012.08.013 Sharif, K. M., Rahman, M. M., Azmir, J., Mohamed, A., Jahurul, M. H. A., Sahena, F. ve Zaidul, I. S. M. (2014). Experimental design of supercritical fluid extraction - A review. Içinde Journal of Food Engineering. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2013.10.003 Shin, Yu-Mi; Son, Chan-Wok; Sim, Hyun-Jung; Kim, Min-Hee; Kim, Mi-Yeon; Kwon, Oh-Yun; Kim, M.-R. (2008). Quality Characteristics and Antioxidant Activity of Spirulina added Yoghurt. Korean journal of food and cookery science, Korean J. food Cook. Sci. https://www.koreascience.or.kr/article/JAKO200817959501916.pdf Shori, A. B. ve Baba, A. S. (2014). Comparative antioxidant activity, proteolysis and in vitro α-amylase and α-glucosidase inhibition of Allium sativum-yoghurts made from cow and camel milk. Journal of Saudi Chemical Society. https://doi.org/10.1016/j.jscs.2011.09.014 Silva, M. B. (2016). Percepção da população assistida sobre a inserção de estudantes de medicina na Unidade Básica de Saúde. Trabalho de conclusão de curso, 1(9), 1– 10. https://doi.org/10.1017/CBO9781107415324.004 Singh, B., Singh, J. P., Kaur, A. ve Singh, N. (2018). Phenolic compounds as beneficial phytochemicals in pomegranate (Punica granatum L.) peel: A review. Food Chemistry. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.04.039 Siracusa, L., Kulisic-Bilusic, T., Politeo, O., Krause, I., Dejanovic, B. ve Ruberto, G. (2011). Phenolic composition and antioxidant activity of aqueous infusions from Capparis spinosa L. and Crithmum maritimum L. before and after submission to a two-step in vitro digestion model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. https://doi.org/10.1021/jf203096q Small, E. (2011). 37. Spirulina - food for the universe. Biodiversity. https://doi.org/10.1080/14888386.2011.642735 Sultana, K., Godward, G., Reynolds, N., Arumugaswamy, R., Peiris, P. ve Kailasapathy, K. (2000). Encapsulation of probiotic bacteria with alginate-starch 141 and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt. International Journal of Food Microbiology, 62(1–2), 47–55. https://doi.org/10.1016/S0168-1605(00)00380-9 Suzery, M., Hadiyanto, Sutanto, H., Soetrisnanto, D., Majid, D., Setyawan, D. ve Azizah, N. (2015). The improvement of phycocyanin stability extracted from Spirulina sp using extrusion encapsulation technique. AIP Conference Proceedings, 1699. https://doi.org/10.1063/1.4938296 Suzery, M., Hadiyanto, Sutanto, H., Widiastuti, Y. ve Judiono. (2018). Improvement the Yoghurt Nutritional Value, Organoleptic Properties and Preferences by Spirulina (Spirulina platensis) Supplementation. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering, 349(1), 0–7. https://doi.org/10.1088/1757-899X/349/1/012040 Şahin, S., Aybastier, Ö. ve Demir, C. (2016). Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Quercetin and Cyanidin from Pyracantha Coccinea and Their Scavenging Effect on Free Radicals. Journal of Food Biochemistry. https://doi.org/10.1111/jfbc.12236 Şahin, S., Işık, E., Aybastier, Ö. ve Demir, C. (2012). Orthogonal signal correction- based prediction of total antioxidant activity using partial least squares regression from chromatograms. Journal of Chemometrics, 26(7), 390–399. https://doi.org/10.1002/CEM.2450 Şahin, S., Oran, S., Şahintürk, P., Demir, C. ve Öztürk, Ş. (2015). Ramalina lichens and their major metabolites as possible natural antioxidant and antimicrobial agents. Journal of Food Biochemistry, 39(4), 471–477. https://doi.org/10.1111/jfbc.12142 Şengül, M., Erkaya, T., Şengül, M. ve Yıldız, H. (2012). The effect of adding sour cherry pulp into yoghurt on the physicochemical properties, phenolic content and antioxidant activity during storage. International Journal of Dairy Technology, 65(3), 429–436. https://doi.org/10.1111/j.1471-0307.2012.00838.x Şimşek, B., Gün, I. ve Çelebi, M. (2010). Isparta Yöresinde Üretilen Süzme Yo ğ urtlar ı n Protein Profilleri ve Bunlar ı n Kimyasal Özelliklerle İ li ş kisi Protein Profiles of Concentrated Yoghurts Produced in Isparta and Burdur ... Isparta Yöresinde Üretilen Süzme Yoğurtların Protein Profiller. Tamime, A. Y. ve Robinson, R. K. (1999). Yoghurt-Science and Technology, 2nd ed. By A Y Tamime and R K Robinson. Içinde International Journal of Dairy Technology (C. 52, Sayı 4). https://doi.org/10.1111/j.1471-0307.1999.tb02857.x Thornhill, P. J. ve Cogan, T. M. (1984). Use of gas-liquid chromatography to determine the end products of growth of lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 47(6), 1250–1254. https://doi.org/10.1128/aem.47.6.1250- 1254.1984 Toxicology, A. C. of. (2002). Final Report on the Safety Assess1. Toxicology, A. C. of. Final Report on the Safety Assessment of BHT 1. Int. J. Toxicol. 21, 19–94 (2002).ment of BHT 1. International journal of Toxicology. https://doi.org/10.1080/1091581029009651 Ünal, E. ve Erginkaya, Z. (2010). PROBİYOTİK MİKROORGANİZMALARIN MİKROENKAPSÜLASYONU. Derleme / Review GIDA. Vázquez, A. I. F., Sánchez, C. M. D., Delgado, N. G., Alfonso, A. M. S., Ortega, Y. S. ve Sánchez, H. C. (2011). Anti-inflammatory and analgesic activities of red seaweed Dichotomaria obtusata. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. https://doi.org/10.1590/S1984-82502011000100014 Xu, J., Wang, W., Liang, H., Zhang, Q. ve Li, Q. (2015). Optimization of ionic liquid 142 based ultrasonic assisted extraction of antioxidant compounds from Curcuma longa L. using response surface methodology. Industrial Crops and Products. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2015.07.025 Yadav, K., Bajaj, R. K., Mandal, S., Saha, P. ve Mann, B. (2018). Evaluation of total phenol content and antioxidant properties of encapsulated grape seed extract in yoghurt. International Journal of Dairy Technology, 71(1), 96–104. https://doi.org/10.1111/1471-0307.12464 Yaygın, H. (1999). Yoğurt Teknolojisi. Akdeniz Üniversitesi Basımevi. Yim, H. S., Chye, F. Y., Koo, S. M., Matanjun, P., How, S. E. ve Ho, C. W. (2012). Optimization of extraction time and temperature for antioxidant activity of edible wild mushroom, Pleurotus porrigens. Food and Bioproducts Processing. https://doi.org/10.1016/j.fbp.2011.04.001 Zam, W., Bashour, G., Abdelwahed, W. ve Khayata, W. (2014). Alginate-pomegranate peels’ polyphenols beads: Effects of formulation parameters on loading efficiency. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 50(4), 741–748. https://doi.org/10.1590/S1984-82502014000400009 Zhang, T., Lv, C., Chen, L., Bai, G., Zhao, G. ve Xu, C. (2014). Encapsulation of anthocyanin molecules within a ferritin nanocage increases their stability and cell uptake efficiency. Food Research International. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2014.02.041 Zourari, A., Accolas, J. P. ve Desmazeaud, M. J. (1992). Metabolism and biochemical characteristics of yogurt bacteria. A review. Le Lait, 72(1), 1–34. https://doi.org/10.1051/lait:199211 143 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : NURAY YAĞMUR Doğum Yeri ve Tarihi : ZONGULDAK-14.03.1986 Yabancı Dil : İNGİLİZCE Eğitim Durumu Lise : ZONGULDAK ATATÜRK ANADOLU LİSESİ Lisans : ANKARA ÜNİVERSİTESİ Yüksek Lisans : Çalıştığı Kurum(lar) : AFYON KOCATEPE ÜNİVERSİTESİ (2010-2017) BURSA GIDA ve YEM KONTROL MERKEZ ARAŞTIRMA ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ (2017-halen) İletişim (e-posta) : nurayakgun86@yahoo.com nuray.yagmur@tarimorman.gov.tr Akademik çalışmalar : 1. Yağmur, N. ve Şahin S., 2020. Encapsulation of ellagic acid from pomegranate peels in microalgae optimized by response surface methodology and an investigation of its controlled released under simulated gastrointestinal studies. Journal of Food Science, Vol. 85, Iss. 4, 2020. doi: 10.1111/1750-3841.15085. 2. Yağmur, N., Şahin, S. ve Korkmaz, E., 2020. Microencapsulation of ellagic acid extracted from pomegranate peel onto Spirulina: Characterization, loading and storage stability properties. Journal of Food Processing and Preservation, Vol. 45, Iss. 1, 2020. doi: 10.1111/JFPP.15086. 144