T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI ANABİLİM DALI ÇOCUK ENDOKRİNOLOJİ BİLİM DALI LEVAMİZOL VE FOSFONOFORMİK ASİTİN FARELERDE KEMİK MİNERAL YOĞUNLUĞU ÜZERİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ Uzm. Dr. Durmuş DOĞAN YANDAL UZMANLIK TEZİ Bursa–2015 T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI ANABİLİM DALI ÇOCUK ENDOKRİNOLOJİ BİLİM DALI LEVAMİZOL VE FOSFONOFORMİK ASİTİN FARELERDE KEMİK MİNERAL YOĞUNLUĞU ÜZERİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ Uzm. Dr. Durmuş DOĞAN YANDAL UZMANLIK TEZİ Danışman: Doç. Dr. Halil SAĞLAM Bursa–2015 İÇİNDEKİLER Özet…………………………………………………………….. ii İngilizce Özet ………………………………………………… iii Giriş ……………………………………………………………. 1 Kemik ve Mikro Yapısı …………………………………… 1 Fosfor Metabolizması ……………………………………. 6 Kemiğin Mineralizasyonu ……………………………..… 9 Levamizolün Mineralizasyon Üzerine Etkileri ……….. 18 Fosfonoformik Asitin Mineralizasyon Üzerine Etkileri 20 Mikrotomografi ……………………………………………. 22 Gereç ve Yöntem ……………………………………………. 25 Bulgular ………………………………………………………. 32 Tartışma ve Sonuç ………………………………………….. 40 Kaynaklar …………………………………………………….. 47 Teşekkür ……………………………………………………… 57 Özgeçmiş ……………………………………………………… 58 İ ÖZET Mineralizasyonun lokal kontrolünde iki inorganik fosfordan (Pi) oluşmuş pirofosfat (PPi) ve Pi/PPi oranı esansiyel rol alır. Lokal Pi ve Pi/PPi oranına etki eden iki önemli basamak alkali fosfataz (TNSALP) ve sodyum- fosfor (NaPi) ko-transport aktiviteleridir. Hücre kültür çalışmalarında bu basamakların ayrı ayrı ya da birlikte inhibisyonu, mineralizasyon sürecinin daha iyi anlaşılmasında yol gösterici olmuştur. Bu çalışmada bir nonselektif NaPi kotransport blokeri olan foscarnet (150 mg/kg) ve bir TNSALP inhibitörü olan levamizolün (25 mg/kg) kemik mineral yoğunluğu ve kemiğin mikro- yapısı üzerine etkisi Balb/c türü farelerde araştırılmıştır. Bulgular levamizolün toksik doza yakın uygulanmasının serum TNSALP, fosfor, kalsiyum ve kemik morfometresinde anlamlı bir değişiklik oluşturmadığını in-vivo olarak ilk kez ortaya koymuştur. Ayrıca daha önceki az sayıdaki verilerin aksine foscarnet tedavisinin serum TNSALP ve fosfor değerlerinde belirgin atışa ve kortikal kemik parametrelerinde değişikliklere neden olduğu da in-vivo olarak ilk kez gösterilmiştir. Sonuç olarak yeni geliştirilecek daha spesifik NaPi kotransporter blokerlerinin, kemik mineralizasyonu ve mikroyapısına etkilerini in-vivo olarak inceleyen daha kapsamlı çalışmalar, kemik hastalıkları olan hastalarımızı daha iyi tedavi edebilmek için bir hedef olabilir. Anahtar Kelimeler: Foscarnet, levamizol, inorganik fosfor, kemik mikroyapısı, mikrotomografi. İi SUMMARY Investigation of The Effects of Levamisole and Phosphonoformic Acid on Bone Mineral Density in Mice Pyrophosphate (PPi), formed by two inorganic phosphate (Pi), and Pi/PPi ratio play main role in the local control of mineralization. Tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNSALP) activity and sodium-phosphate co-transporters are two main mechanisms affecting local Pi concentration and Pi/PPi ratio. Inhibition of one or both of these mechanisms in tissue cultures has leaded us to better understand the mineralization process. In this study, the effects of foscarnet (150 mg/kg/day), a non selective inhibitor of NaPi cotransporters, and levamizol (25 mg/kg/day), a TNSALP inhibitor, on bone mineral density and bone micro-structure in Balb/c mice were assessed. Study findings revealed in-vivo for the first time that near toxic dose of levamizole did not produce any significant changes in serum levels of TNSALP, inorganic phosphate and calcium as well as in bone micro- structure. In addition, it was also shown in-vivo for the first time that foscarnet treatment caused significant increases in serum TNSALP and inorganic phosphate levels and significant changes in cortical bone parameters, in contrast to very limited previous data. In conclusion, more extensive and detailed in-vivo studies evaluating the effects of newly developed, more specific NaPi cotransporter blockers on bone mineralization and microstructure may be targets for us to better treat our patients with bone diseases. Key words: Foscarnet, levamisole, inorganic phosphate, bone microstructure. iii GİRİŞ I. Kemik ve Mikroyapısı Erişkin bir insan sesamoid kemikler hariç toplam 213 kemik içerir. Uzun kemik, yassı kemik ve düzensiz kenarlı kemikler olarak üç grupta incelenebilir. Yassı kemikler membranöz kemikleşme ve uzun kemikler hem enkondral hem de mebranöz kemikleşme ile oluşur ya da büyürler (1). İskelet sistemi vücut için destek, iskele, hareketler için kasların tutunma yerleri olarak, iç organları çevreleyerek koruma, mineral hemostazisi, asit-baz dengesini sağlama, büyüme faktörleri ve sitokinler için depo olmak, hematopoezin gerçekleştiği boşlukları oluşturmak gibi çok sayıda görevi vardır (1,2). Uzun kemikler diyafiz, metafiz, epifizden oluşur. Diyafiz yoğun kortikal kemik, metafiz ve epifiz ise yoğun olarak trabeküler yani süngerimsi kemikten oluşmakta ve bu oluşumların dış çeperi ince bir kortikal tabaka ile çevrilimektedir. Vücudumuzdaki kemiklerin %80’i kortikal, %20’si trabeküler kemik yapısındadır (1). Kortikal kemikler yoğun, sert yapıda olup ilik alanını çevrelerler. Trabeküler kemikler daha çok boşluklardan ve bu boşlukların içerisinde bal peteği ya da örümcek ağı şeklinde yerleşmiş trabekulalardan oluşmuştur. Kortikal kemik trabeküler kemiğe göre daha az aktiftir (3). Kortikal kemik osteonlardan oluşur. Osteonlar, haversiyan sistemler olarak adlandırılır. Haversiyan sistemler silindirik yapıda olup dairesel lamellerden oluşur. Haversiyan kanalları kortikal yapıdaki porositeleri oluşturur. Kortikal porosite normal bir kemikte %5’den azdır. Sağlıklı bir yaşlanmada kortikal porositi artar ve kortikal kemik incelir. Kortikal kemiğin dış yüzüne periostal yüzey, iç yüzüne endosteal yüzey adı verilir. Periosteal yüzeydeki osteogenez kemiğin enine büyüme, genişleme ve şekillenmesinde ve kırık iyileşmesinde önemli bir rol oynar. Kemik yapımı (kemik formasyonu) tipik olarak periosteal yüzeyde daha fazladır. Bu nedenle kemik yaşlandıkça 1 enine büyüme devam edecektir. Endosteal yüzeyde ise yeniden şekillenme daha çok aktiftir. Bu yüzeyde kemik rezorbsiyonu daha fazladır (1,3). Şekil-1: Kemiğin mikroyapısı (1). I.A. Kemik Modeling ve Remodeling Süreçleri Kemik uzunlamasına ve enine büyür. Longutidinal ve enine büyüme özellikle çocukluk ve puberte döneminde daha belirgindir. Longutidinal büyüme, büyüme plağında kıkırdak birikimi ve bu kıkırdağın mineralize olacak kemik doku ile yer değiştirmesi ile gerçekleşir (1,4). Osteoblast, osteosit ve osteoklastların koordineli ve birbirleri ile uyumlu çalışmalarıyla gerçekleşen süreçler kemiğin modeling ve remodeling süreçleridir (1,3,5). Kemiğin modelingi (şekillenme) büyüme sürecinde uygun kemik şekli ve kemik kitlesinin artmasını sağlar. Bu süreç özellikle periosteal kemik yapımı ile gerçekleşir. Burada önemli bir süreçte endosteal yüzeyde yer alan rezorbsiyondur. Sonuçta ilik mesafesi genişler. Buradaki süreç periosteal kemik yapımı lehine olduğu için kemik enine genişleyerek toplam kemik kütlesinde artış meydana gelir (1). Kemik modeling sürecinde yapım 2 (anabolik modeling) ve yıkım (katabolik modeling) kortikal kemiğin farklı yüzlerinde aynı anda gerçekleşir (6,7) (Şekil-2). Özellikle doğumdan büyümenin duraksadığı döneme kadar aktif olarak devam eder. Ancak kemiklerde oluşacak kırıkların tamirinde ve mekanik yüklenmeye uyum sağlamak açısından düşük bir hızda erişkin hayatta da sürmektedir (5,7). Ayrıca modeling süreci hiperparatiroidi, renal osteodistrofi gibi durumlarda erişkin hayatta da aktif hale gelebilir (1,8–10). Modeling sürecini etkileyen en önemli faktör mekanik yüktür. Şekil–2: Kemik modeling ve remodeling süreçleri (7). Diğer önemli bir süreç olan remodelling (yeniden şekillenme) doğumla başlar ve ölüme kadar devam eder (1). Kemik remodelingi “kemik yapım- yıkım” (turnover) döngüsünü sağlayan böylece kemik kitlesinin sağlıklı devam etmesini, mekanik yüklenmelere uyumu, mikokırıkların düzeltilmesi ve kalsiyum/fosfor metabolizmasının devam etmesini sağlayan önemli bir süreçtir (7). Kemik yapım-yıkım dengesi olarak da bilinen bu süreç erişkin kemik metabolizmasının tamamına yakınını oluşturur. Kemiğin rastgele bir 3 yüzeyinde küçük bir alanda (paket) rezorbsiyon osteoklastlarca gerçekleştirilir. Kısa bir dinlenme süreci sonrası osteoblastlar yeni kemik matriksini ve mineralizasyonu gerçekleştirirler. Bu süreç modelingden farklı olarak genelde kemiğin aynı yüzeyinde yer alan birbirini takip eden yıkım- yapım dengesindedir (1,7) (Şekil-2). Remodeling süreci perimenopozal ve erken postmenopozal dönemde artar ve ilerleyen yaşlarda azalır. Ancak bu azalma dahi premenopozal dönemdeki remodeling sürecinden daha hızlıdır. Erkeklerde ise orta yaşlardan sonra artış gösterdiği düşünülmektedir (1). I.B. Kemiğin Hücreleri I.B.a. Osteoklast Osteoklast kemiğin mineralize ekstraselüler matriksinin rezorpsiyonundan sorumlu hücredir. Osteoklastlar hematopeoetik kök hücrelerinden köken alırlar (11). Bu öncüllerden olgun bir osteoklast oluşumunda bazı uyarıcı moleküllere ihtiyaç vardır. Bu moleküllerden en iyi bilineni osteoblast, osteosit ve stromal hücrelerden salınan RANKL (Receptor Activator for Nuclear factor κ B Ligand) ve M-CSF (macrophage colony- stimulating factor)’dir (12). Bu uyarıcı faktörlerin önemli bir kısmı osteoblastlardan salgılanmaktadır. Bu nedenle “osteoklast gelişimi osteoblastlara bağımlıdır” denilebilir. Olgun osteoklastlar integrin adı verilen hücre bağlayıcı reseptör ile kemik yüzeyine bağlanır. Kemik yüzeyine bağlandıktan sonra osteoklast polarizasyonu gerçekleşir. Böylece osteoklastın kemik yüzeyi ile temas eden plazma membranı bağlantı yüzeyini önemli derecede artırmak için girintili ve çıkıntılı bir hale gelir. Bu parmaksı çıkıntıların oluştuğu yüzeye “ruffled border” denilir (1). Osteoklastlar fırçamsı plasma membranından hidrojen iyonu ve Cl sekrete ederek asidifikasyonu ve mineral hidrolizini gerçekleştirirler. Yine aynı şekilde salgılanan Kathepsin-K ve matriks metalloprotein-9 (MMP-9) gibi enzimler de matriksde yer alan organik maddelerin parçalanmasında görev alırlar (13–15). I.B.b. Osteoblast Özellikle tip 1 kollojenden zengin ekstraselüler matrikisin (ESM) yapımından sorumlu hücredir. Bu ESM daha sonra mineralize olacak ve kemiği meydana getirecektir. Osteoblastlar, osteoprogenitör hücrelerden 4 farklılaşırlar. Osteoprogenitör hücrelerse mezenkimal kök hücrelerden farklılaşırlar (1,16,17). Bu farklılaşma süreci hematopoetik sistemdeki farklılaşma kadar net tanımlanmış değildir. Osteoprogenitör hücreler kemikte periost altında endosteum ve kemik iliğinde bulunurlar. Pre-osteoblasttan osteoblast dönüşümünde hücreler genişler kuboidal bir görünüm alırlar. Bu osteoblastlar kemik matriksinin sentezinden sorumlu olduğu için belirigin bir endoplazmik retikulum ve golgi yapısı dikkat çeker (1). Osteoblastlardan salgılanan en önemli portein tip 1 kollojendir. Bunun dışında birçok kollojen olmayan proteinde eksprese eder (1,18). Preosteoblastan sonra proliferasyon gerçekleşmez. I.B.c. Osteosit Osteoblast olgunlaşma safhasında, osteoblastın çevresi kemik matriksi ile çevrelendiğinde osteoblast olgunlaşmasının son safhası gerçekleşir. Bu safhada osteoblast morfolojik olarak değişir ve stoplazmik organellerini kaybeder, iğsi uzantıları olan ince bir hücre haline gelir. Bu hücreye osteosit adı verilir (19,20). Osteositler kemikte lakuna adıverilen oyuklarda yerleşirler. Birbirleriyle ve osteoblastlar dentritik uzantıları ile bağlantı halindedirler. Bu dentritik uzantılar kanakuli adı verilen ince kanallardan geçer. Sonuçta osteositler lakunakanakuli adı verilen bir yapı içerisinde yer alırlar (1). Kemikte yer alan en fazla sayıdaki hücredir. Bu durum kemiğe etkisinin boyutunu doğru orantılı artırmaktadır. Osteositlerin kemiğin canlılığında ve diğer fonksiyonların gerçekleşmesinde görevleri olduğu ifade edilmektedir. Bir orkestra şefi gibi kemiği yönettiği söylenebilir (20). Birden çok görevi vardır. Bunlardan ilki mekanosensör olarak görev alır. Diğer önemli bir görevi kalsiyum ve fosfor hemostazisini (FGF23, PHEX, DMPP1 ekspresyonları ile) sağlar. Diğer bir etkisi de kemiğin yapım ve yıkımını kontrol etmektir (RANKL, OPG, sclerostin salgılayarak) (21,22). II. Fosfor Metabolizması Fosforun vücudumuzda esansiyel bir rolü vardır (23). Bu etkinliğini gösterebilmesi için serum fosfor düzeyi belirli aralıklarda tutulmalıdır. Serum 5 fosfor düzeyi, barsak fosfor geri emilimi, renal fosfor atılımı ya da reabsorbsiyonu, kemik mineralizasyonu ve rezorbsiyon dengesi ile sağlanır. Paratiroid hormonu (PTH), 1-25-dihidroksivitamin D ve Fibroblast growth factor 23 (FGF23) gibi birçok humoral faktörler bu süreçte etkilidir (24). Fosfor kalsiyumdan sonra vücudumuzda bulunan ikinci en çok mineraldir. Fosfor tüm hücrelerde hücre bütünlüğü, metabolik yolakların çalışması, enerji sağlanması, kas ve iskelet sisteminin yapısı ve çalışması, DNA ve nükleik asitlerin yapısında yer alan böylece yaşamsal süreçlerin devamlılığında önemli bir yeri olan mineraldir (23). İnsan vücudu yaşamsal fonksiyonlarında esansiyel olan bu mineralden faydalanabilmek için intestinal emilimi, renal geri emilimi artırmış ve büyük miktarlarda kemiklerde depolamıştır. Erişkin bir insanda toplam vücut fosforunun %80-90 kadarı kemikte geri kalan miktar ise hücre dışı alan, yumuşak dokular, eritrositler ve hücre içinde yer alır. Plazma fosfor miktarı toplam fosfor miktarımızın %0,1 kadarıdır. Plazma fosfor düzeyi kalsiyum gibi katı ve dar bir sınırda tutulmaz ancak belirlenmiş daha geniş değer aralığı vardır. Bunu sağlayan hemostatik kompleks süreçler vardır. Plazma fosfor limitleri canlının çeşidi ve yaşına göre değişmektedir. Örneğin balıklarda fosfor düzeyi oldukça yüksek iken insanlarda daha azdır. Ayrıca erişkin bir insanın plazma Pi düzeyi bir yenidoğan ya da infanta göre daha azdır (25). Diyet ile alınan fosforun %70 proksimal barsaklardan emilir. Normal şartlarda barsaklardan emilen fosfor miktarı renal kaybedilene eşit olup, nötr bir fosfor balansı vardır (23). Gerikalan %30 ise vitamin D ve Na-Pi kanalların rol aldığı aktif bir süreçle emilir (26,27). Ekstraselüler alandaki fosfor konsantrasyonu sıkı bir humoral mekanizmaların etkisi altındadır. Bu sürece fosfor hemostazisi adı verilir. Bu hemostazis günümüzde önemli bir ölçüde açıklanmış olsa da yine de tam anlaşılabilmiş değildir (24). Birçok organ bu hemostazisde etkin bir rol alır. intestinal fosfor emilimi, renal fosfor reabsorbisyonu, kemik mineralizasyon ve rezorbsiyonu etkileyerek fosfor denegesini sağlayan birçok humoral mekanizmalar vardır. Günümüz bilgileri ile fosfor hemostazisinin barsak-kmik- böbrek-paratiroid bez aksında kontrol edildiğini bilmekteyiz (24,28). 6 II.A. Sodyum-Fosfor Kotransporterları Kemik, barsaklar ve böbreklerde yer alan çeşitli fosfor transport sistemleri tüm vücuttaki fosfor hemostazisinin sağlanmasında esansiyel olduğunu bilmekteyiz. Birçok dokuda birçok çeşit transport sistemlerin eksprese edilmektedir (29). Fosforun anyonik yani negatif yüklü inorganik hali [inorganik fosfor (Pi)] hücrelerce kullanılmaktadır. Bu durum negatif elektrokimyasal potansiyeli olan membrandan Fosforun basit difüzyon ile geçmesini engeller. Bu geçişte çeşitli fosfor transporterlarına ihtiyaç vardır. Hücreler ekstraselüler alandan negatif yüklü Pi’yi ikincil aktif transport ile almaktadırlar. Bu amaçla özelleşmiş sodyum bağımlı fosfor kanalları kullanmaktadır (29). İnvivo ve invitro çalışmalarda üç ana tip sodyum/fosfor kotransporter tanımlanmıştır. Tüm bu Pi kotransporterlar, membranı birçok kez geçen yapıdadırlar. “Solute carier series” (SLC) protein ailesine aittirler (30). II.A.a. Tip 1 Sodyum-Fosfor Kotransporter İlk tanımlanan NaPi transporter üyesidir. Daha çok böbrek tübulus hücreleri epitelinde yer almaktadır. Daha az olarak ta beyin ve karaciğerde bulunur. Sonradan anlaşılmıştır ki bu kotransporter aslında diğer anyonların taşınmasında daha çok görev almaktadır. Fosfordan kısıtlı beslenme durumunda ise bu kanalların ekspresyonu değişmemektedir (29). II.A.b. Tip 2 Sodyum-Fosfor Kotransporter Tip 2 NaPi iyon taşıyıcılar NaPi2a, NaPi2b, NaPi2c adı altında üç izoformu vardır. NaPi2a, böbreğe spesifik olup, böbrek renal tubüler ve epitel hücrelerin apikal yüzeyinde yer alır. Proksimal tübülden Pi reabsorbsiyonundan sorumlu en önemli proteindir. Bu proteini kodlayan gende fonksiyon kaybı fosfor atılımında ciddi bir artışa ve serumda hipofosfatemiye neden olur (31). Bu kanalın fonksiyonları Pi hemostazisinde rol alan hormonal yolaklarla kontrol edilmektedir. PTH bu kanalın en önemli düzenleyicisidir. PTH hücre apikal yüzeyinde yer alan bu kanalların internalizasyonuna neden olarak lizozomal degradasyona yönlendirir. Sonuçta Pi reabsorbsiyonu yapacak kanal sayısı azalır ve Pi atılımı artar. 7 Aynı şekilde FGF-23 de NaPİ2a’nın ekspresyonunu azaltarak Pi atılımını artırır. Tip 2 NaPi iyon taşıyıcılarının diğer izoformu NaPi2c’dir. Genel olarak NaPi2a ile benzer yerlerde eksprese olmaktadır. FGF23/Vitamin D aracılığıyla reğüle edilmektedir. Etkisi NaPi2a ile de benzerdir. Ayırt edici özelliklerinden bir tanesi taşıdıkları sodyum molekül (Na) sayılarının farklı olması (NaPi2c iki adet, NaPi2a üç adet Na taşır) (32). Ratlarda yapılan çalışmada özellikle weaning döneminden önce NaPi2c’nin eksprese edildiğini daha sonra belirgin azaldığını göstermiştir (33). Belki bu nedenle NaPi2a’da meydana gelen bozukluklarda NaPi2c kompansasyon yapamamaktadır (32). NaPi2b daha çok intestinal ve akciğer tip-2 alveolar hücrelerle ilişkilidir. Kalsitriol (1-25(OH)2-D3) intestinal Pi emilimini artırmaktadır. Bu etkisini NaPi2b ekspresyonunu artırarak yapar. NaPi2b, Pi hemostazisinde intestinal Pi reabsorbsiyonunda etkilidir ve böylece kan Pi düzeyini arttırır (32). II.A.c. Tip 3 Sodyum-Fosfor Kotransporter NaPİ iyon taşıyıcılarının en son tanımlanan üyesi Tip 3 Napi iyon taşıyıcısıdır. Bunlar ilk olarak “retroviral receptors for gibbon ape leukemia virus” (Glvr-1) ve “receptors for rat amphotrophic virus” (Ram-1) olarak tanımlanmışlardır. Yeni keşfedilmiş özelliklerinden dolayı bu proteinler yeniden adlandırılmıştır (29). Pi transportunda esansiyel yolları ve birçok dokuda eksprese edilmesi nedeniyle Pi transporter anlamına gelen Pit1 ve Pit2 isimleri verilmiştir. Diğer Pi taşıyıcıların tersine bu proteinler beyin, karaciğer, kemik, böbrek plesanta, iskelet kası, kıkırdak, dalak, timus, prostat, tetis, over, ince barsak, lökositlerde eksprese oldukları gösterilmiştir. NaPi1 birçok iyon için taşıyıcı özelliği olsa da Pit1 ve Pit2 sadece Pi ve Na’ya özgüdür. Ayrıca hücredışı Pi azalmasında ya da diyette Pi kısıtlanmasında dokularda Pit ekspresyonlarının arttığı gösterilmiştir. Tip 3 NaPi taşıyıcıları birçok dokuda Pi’nin hücre membranından taşınmasında esansiyel ve önemli bir rolü olduğunu söyleyebiliriz (32). 8 III. Kemiğin Mineralizasyonu Kemik organik ve inorganik materyallerin uyumlu birlikteliklerinden oluşmuş biyolojik kompozit bir dokudur (34). Biyomineralizasyon sadece kemik ve dişlerle sınırlı bir alanda geçerlidir. Bu dokular dışındaki mineralizasyonlar yaşamsal sorunlar oluşturabilmektedir (35). Kemik birden çok özellikleşmiş hücre ve kompleks bir ekstraselüler matriks içerir. Osteoblast kemik yüzeyinde bulunur ve kemik yapımından yani organik matriks ve inorganik yapıların formasyonundan sorumludur. Osteositogenezis osteoblastın osteosite dönüşüm sürecidir. Bu süreç mineralziasyon ile paralel gelişir. III.A. Mineralizasyonun lokal ve sistemik regülasyonu Mineralizasyonu kontrol eden süreçlerin ana hedefleri Ca ve fosfor iyonlarıdır. Bu iyonlar hidroksiapetit (HA) bileşenleri olup mineralizasyonun gerçekleşmesinde bu iyonların varlığı ve yeterliliği esansiyeldir (36). Bu iyonların yetersizliğinde mineralizasyon bozulur ve rikets, osteomalazi denilen hastalıklar meydan gelir. Fosfor tüm hücreler için olmazsa olmaz bir iyondur. Hücre yaşamı, çoğalma, büyüme, iletişim, enerji metabolizması ve kemik mineralizasyonu için esansiyeldir (23). Fosforun serumda az olması (hipo-) ya da çok olması (hiper-) vücut için istenmeyen ve zararlı durumlardır. Besinlerle alınan organik ya da inorganik fosfor barsaklardan emilir ve dolaşıma karışır. Bu fosforun büyük kısmı kemiklerde depo edilir. Fazlası böbreklerden atılır. III.A.a. Mineralizasyonda Lokal Pi Kontrolü Mineralizasyonun lokal kontrolünde fosfor dengesi önemli bir rolü vardır (36). Diyette fosfor eksikliği ya da renal atılım fazlalığı mineralizasyonu bozacaktır (37). Sistemik fosfor konsantrasyonu kemik dokudaki lokal Pi seviyesinde ve osteodin mineralizasyon sürecinde oldukça önemlidir. Ancak sistemik Pi düzeyinin ayarlanmasında bugüne kadar bildiğimiz PTH-Dvitamin aksı yetersiz kalmaktadır (38). Sistemik kontrolde bu aksa FG23’de eklenmiştir ve bu hormon fosforun vücuttaki net balansı üzerine etkilidir (32). Ancak bu hormonal düzeylerin tekbaşlarına kemik yada diş dokusundaki lokal Pi üzerine etkisi ve mineralziasyonu açıklamadaki rolleri yeterli değildir (39). 9 Tüm bu bilgiler ışığında, mineralizasyonun, sistemik (hormonal) etkilerin kolaylaştırdığı daha çok kemik lokal dokusundaki hücrelerce (osteoblast ve osteosit) kontrol edilen bir süreç olduğunu söyleyebiliriz. III.A.b. Mineralizasyonun Sistemik Kontrolü ve FGF23 Sistemik kalsiyum ve fosfat hemostazisinde geleneksel bilgiler PTH ve 1,25(OH)2D3 aksında gerçekleştiğidir. PTH tubüler epitellerin apikal yüzeyinde sodyum bağımlı fosfor kotransporterların miktarını azaltarak (internalizasyon ve degradasyon) renal fosfor reabsorbsiyonunu azaltır ve fosforun idrarla atılımını sağlar. Aynı anda kalsiyumun proksimal tübüllerden geri emiliminide sağlar böylece kalsiyumun idrarla atılımını azalır. Gerek PTH etkisi ile gerekse düşen fosforun etkisi ile böbrekte 1,25(OH)2D3 sentezi artar. Bu 1,25(OH)2D3 proksimal barsaklardan fosfor ve kalsiyum emilimini artırır. Böylece artan kalsiyumun fosforu azaltıcı etkisi ile birlikte artan kalsiyumun PTH üzerine baskılayıcı etkisi fosfatüriyi daha da azalttır. Tüm bu kısır döngü ile net fosfor kaybının olabileceği bir fosfor dengesinin sağlıklı açıklanmasında yetersiz kalmaktadır (38). Bu durumda Pi üzerine net fosfotürik etkiye sahip FGF23, ana düzenleyici olarak karşımıza çıkmaktadır. FGF23 yapısal olarak FGF ailesine benzese de kendisi dolaşıma salınan bir “hormon” olup böbrek üzerine etkileri vardır. Bu hormonun varlığı, mineral hemostazisinin kemik, barsak, böbrek, paratiroid bezi arasında feedback mekanizmalarla kontrol edildiği şeklinde tanımlanmasına neden olmuştur. Fgf23 ilk kez otozomal dominant hipofosfatemik riketse neden olduğu etkilerinin keşfi ile tanımlanmıştır (37) Daha sonra tümör-ilişkili osteomalizide etkisi gösterilmiştir (26). Çok öncelerden renal fosfor atılımı fazla olan ve sonuçta hipofosfatemisi ve bu hipofosfatemi ile uyumsuz düşük kalsitriol seviyesi olan hasta grupları tanımlanmaktadır. Bu hastalık gruplarındaki keşifler ve çalışmalar FGF23’ün fizyolojik fosfor regülasyonunda ve kemik- böbrek ilişkili hastalıklarda anahtar rol oynadığı tanımlanmıştır (40). FGF23, 30 kDa moleküler ağırlığında, FGF ailesinin bir üyesidir. Bir “hormon” olarak tanımlanır (40) . Büyük kısmı osteositler tarafından salgılanır daha az olarak osteoblastlardan salınır. Sonuçta kemikten kaynak alan bu hormonun hedef organı böbrektir. Hedef organlarında etkili olması için o 10 dokuda “klotho” adı verilen transmembran bir proteinin kofaktör etkisine ihtiyaç duyar (36). Reseptörü FGFR olup bir tirozin kinaz reseptörüdür. FGF23 hormonunun görevi proksimal tubüler sodyum-fosfor kotransporter ekspresyonunu azaltarak renal fosfor reabsorbsiyonunu inhibe etmek ve böylece fosfatüriye neden olmaktır (26,36). Ayrıca FGF23 renal 1-alfa hidroksilaz enzimini bilinmeyen bir şekilde inhibe eder ve 24-alfa hidroksilaz enzimini aktive eder. Böylece 1,25(OH)2D3 oluşumunu azaltır. Yüksek fosfor alımı ya da 1,25(OH)2D3 fazlalığı FGF23 ekspirasyonunu artırır ve böbrek Pi atılımı artar. Artan FGF23 1,25(OH)2D3 oluşumunu azaltır, PTH’ı baskılar ve sonuçta intestinal fosfor emilimi azalır (26,36). PTH, ostesit yüzeyindeki PTH1R reseptörü aracılığıyla kemiğe etki eder. Bu etki FGF23 ekspresyonunu artırır ve bu durum negatif feedback ile PTH kontrolü sağlar (36). FGF23’ün bu etkilerinden bağımsız olarak mineralizasyonu baskıladığı da gösterilmiştir. Ancak bu süreçte nasıl bir rol oynadığı halen netleşmemiştir (40). Wang ve ark. FGF23 overekspresyonu gerçekleştirdikleri rat kalvarya hücrelerinde mineralizasyonun sistemik fosfordan bağımsız inhibe olduğunu göstermişlerdir. Osteoblast hücre kültürlerine FGF23 tedavisinin benzer sonuçlar gösterdiği çalışmalarda gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalar FGF23 sistemik faktörlerden ve Pi’den bağımsız olarak mineralizasyonda gerekli ve etkili olduğunu göstermektedir (40,41). Bazı diğer çalışmacılar FG23 eksikliği olan “FG23-/-“ fareler üretmişlerdir (42,43). Bu fare grubunda beklenildiği gibi hiperfosfatemi, hiperkalsemi, yüksek 1,25(OH)2D3 ve baskılanmış PTH saptamışlardır. Ancak yüksek miktarda Pi, kalsiyum ve kalsitriole rağmen bu farelerin iskelet sistemlerinde ciddi mineralizasyon defektleri (osteomalazi, osteodosis) gözlenmiştir (43,44). Ayrıca Hipofosfatemik rikets (X bağımlı) fare modellerinde hipofosfatemi ve rikets geliştiği gösterilmesine rağmen sadece renal NaPi kanalları bloke edilen ve hipofosfatemi gelişen farelerde rikets ya da osteomalazi gelişmemiştir (45). Tüm bu çalışmalar kemik dokuda lokal Pi düzeylerinin, sistemikten ayrı olarak, mineralizasyonda etkili olduğunu göstermektedir. Yüksek fosfor uygulanmış damar düz kas hücre kültürlerinde kalsifikasyon geliştiği gözlenmiştir. Ayrıca bu kas hücrelerinde osteogenik 11 değişiklikler tespit edilmişti. Nonspesifik bir NaPi blokeri olan “Fosfonoformik asit” (foscarnet) uygulanması ile yüksek fosfora rağmen mineralizasyon gerçekleşmemiş ve kas hücrelerinde herhangi bir değişim gözlenmemiştir (35). Yine benzeri bir çalışmada damar düz kas hücre kültürlerinde Pit1 kanallarının spesifik ablasyonu ile kalsifikasyonda gerileme olduğu görülmüştür (46). Meleti ve ark. osteblast benzeri hücre kültürlerinde inorganik fosfor konsantrasyonun artması ile apoptozis geliştiği ve bu sürecin foscarnet uygulanması ile oluşmadığını göstermişlerdir (47). Damar düz kasında kalsifikasyon çalışılan araştırmalarda NaPi kotransporterlarının ve dolayısyla lokal Pi‘nin mineralizasyonda esansiyel bir rolü olduğu dikkat çekmektedir. Pi iyon konsantrasyonlarının özellikle matriks veziküllerinde ekstraselüler alana göre çok yüksek olmasına rağmen bu iyon akışı vezikül içine doğru olmaktadır. Bu durum özellikle fosfor transportunun transselüler ve aktif bir süreçle gerçekleştirdiğini düşündürmektedir (48,49). Kuşku yok ki bu süreçte ve dolayısı ile mineralizasyonda Pi kadar Pi‘nin transportuda önemli bir basamaktır. III.A.c. NaPi Kanallarının Mineralizasyon Sürecinde Etkileri NaPi taşıyıcıları yukarıda anlatıldığı gibi üç ana grupta incelebilir. Bunlardan NaPi2a, NaPi2c ve NaPi3 (Pit1 ve Pit2) osteoblastların hücre yüzeyinde olduğu gösterilmiştir (39,49). İlk iki kanal daha çok sırasıyla böbrek, karaciğer ve akciğerde olduğu gösterilmiş olup NaPi3’ün ise çoğu dokuda eksprese edildiği bilinmektedir. Osteoblastlar yüzeyinde yer alan NaPi kanalların sadece Pit1 ve Pit2 olduğunu gösteren hücre kültür çalışmaları olmasına rağmen yine osteblast ve benzeri hücre kültürlerinde NaPi2a ve NaPi2c kanallarını da gösterildiği çalışmalar yayınlanmıştır (39,49). Osteoblast yüzeyinde yer alan NaPi kanalların çeşitliği çelişkili olsa da bu kanalların mineralizasyon sürecinde önemli ve esansiyel bir rolü olduğu kuşku götürmüyor. Yinede özellikle Pit1’in intertisyel sıvıdan Pi absorbsiyonunu sağlamada merkezi bir rolü var gibi görünmektedir (39). Buna rağmen Pit1ve Pit2 ablasyonunun hücre viabilitisinde önemli bir değişiklik yapmaması 12 bunların etkilerinin başka yolaklardan kompanse edilebildiğini gösteriyor (50). Ancak osteogenik hücrelerin gerçekleştirdiği mineralizasyon sürecinde esansiyel bir rolleri olduğunu söyleyebiliriz. Bununla birlikte gerek damar kas hücrelerine gerekse osteojenik hücre kültürlerine bir non-spesifik NaPi inhibitörü olan foscarnetin uygulanması, mineralizasyonu azalttığı yada tamamen engellediği görülmüştür (35). III.A.ç. Matriks Vezikülleri Matriks vezikülleri (MV) ekstraselüler, membrana bağlı yada ayrı 50- 200nm boyutunda nanoveziküllerdir. Kondrositler, osteoblast ve odontoblaslarca hücre yüzeyinden tomurcuklanarak oluşturulur (51,52). Vezikül membran yapısı hücre membran yapısından farklı olduğu bilinmektedir. Hücre membranın yapması gerekenden bir kısmını fazlasıyla gerçekleştirmesi gerektiği için özelleşmiş bir membran yapısı vardır diyebiliriz. Vezikül membranları fosfolipidlerden zengindir. Bu durum Ca afinitesi sağlar. Ayrıca MV, kalsiyum kanalları (annexin A2,A3,A5 CaATPaz), kalsiyum bağlayan protein (calbidin), ALP, NPP1, NaPi kanallarından ve PHOSPHO1’den zengin bir yapıya sahiptir (53,54) (Şekil-3). Matriks vezikülleri Ca ve Pi için bir toplanma alanı diyebiliriz, bu toplanma sonrası Ca-Pi amorf yapılar oluşur ve bu minerallerin birikiminin devam etmesi ile bu amorf yapılar veziküller içinde çözünemiyecek kadar çoğalmış olur ve HA kristallerini meydana getirirler. Bu süreç sonrasında HA kristalleri membranı parçalar ve ekstraselüler alan yani matrikse (osteid alan) kollajenlere yapışarak otururlar (52). Daha sonraki adım, bu HA kristallerin bir odak olarak görev yapması ve ekstraselüler alanda HA olgunlaşması, büyümesi ve dağılımın gerçekleşmesidir (52). Bu süreçler elektron mikroskopisi ile gösterilmiş olup matriks vezikülleri aracılığıyla mineralizasyon yaklaşık 40 yıldır bilinmektedir (55) (Şekil-4). Günümüze kadar bu görüşün doğruluğuna ilişkin birçok araştırma yayınlanmıştır (56–58). 13 Şekil-3: Matriks veizküllerinde mineralizasyon (59). Bu veziküllerin nasıl oluştuğu ve bu veziküllerin hangi sinyaller sonucu membrana gönderildiği net bilinmemektedir. Mineralizasyon sürecini açıklayan diğer hipotezler ve bulgular burada anlatılmamıştır. Ancak MV odak oluşumunda yada HA‘nın büyümesinde ve yayılmasında bir şekilde etkili olduğunu söylemek yanlış olmaz. Şekil-4: Matriks vezikülleri (60). 14 MV’de yer alan fosfolipidlerin çok olması Annexin kanalları ve kalsiyum bağlayan proteinlerin çok olması Ca için bir yapışma ve çekim merkezi olmaktadır. Zaten osteoblastlarca oluşturulduklarında MV içeriğinin Ca yönünden zengin olduğu gösterilmiştir (61). Bu Ca konsantrasyonunun artışı hücreden ayrıldıktan sonra devam eder. III.A.d. Matriks Veziküllerinde Pi Konsantrasyonun Artması Pi birikimini vezikül yüzeyinde yer alan çoğunluğunu Pit1 ve Pit2’ nin oluşturduğu yoğun NaPi kanalları sağlar. Bununla birlikte vezikül içinde Pi konsantrasyonunu artırmada önemli bir basamak olan PHOSPH1 enzimi özellikle organofosfatlardan (fosfokolin ve fosfoetonalamin) Pi serbestleştirir (62). Mineralizasyonu baskılayan PPi ise Ank kanalları aracılığıyla ekstraselüler alana atılır ve vezikül içinde mineralizasyonun daha da kolaylaşması sağlanır. Bunun dışında matriksden Pi sağlanması için vezikül ve hücre membranı yüzeyinde yer alan TNSALP, PPi’den Pİ serbestleştirir ve Pi vezikül içine geçer. Ayrıca bu basamak HA’nın matriksde büyümesi ve yayılımını PPi’yi azaltarak da kolaylaştırır. Nihayi sonuç, vezikülde Pi ve Ca konsantrasyonlarının artık çözünemeyecek düzeyde birikimi ve HA oluşumu ile sonuçlanır. Daha sonra HA’lar membranı parçalar ve matrikse yayılır. Burada ESM’deki Ca ve Pi ile olgunlaşmaya ve büyümeye devam eder (54,63–65). III.A.e. Pi/PPİ Oranının Mineralizasyona Etkisi Lokal regülasyonun merkezinde iki inorganik fosfor (Pi) dan oluşmuş Pirofosfat (PPi) ve Pi/PPi oranı yer alır (64). Ekstraselüler PPi, Pi‘nin kalsiyum ile kristal formu almasını (HA oluşumu) ve HA’nın büyümesini, yayılmasını inhibe eden anahtar düzenleyicidir (36). PPi hücrelerde birçok metabolik sürecin ek ürünü olarak meydana gelir (örn hücre içinde ATP den AMP oluşumunda açığa çıkar). Bu nedenle birçok dokuda hücre içi, hücre dışı ve plazmada bulunur (64). Ekstraselüller ve plazmada PPi’nin önemli miktarda bulunması, vücutta gelişi güzel kalsifikasyonun oluşumunu engeller. Vücudumuzda sadece PPİ’nin parçalandığı ve konsantrasyonun ayarlanabildiği kemik, diş ve kıkırdak dokularda mineralizasyon gelişir. Bu 15 durum mineralizasyonun niye sadece kemik ve benzeri dokularda olabildiğini açıklamaktadır. Ekstraselüler PPi, Pi‘nin kalsiyum ile kristal formu almasını böylece HA oluşumunu inhibe eder (64). PPi’nin olmadığı ya da üretilemediği durumlarda mineralizasyon kontrolsüz bir şekilde oluşacak ve beklenildiği gibi yaygın ektopik kalsifikasyonlar meydana gelecektir. Tersi bir durumda ise PPi’nin yıkılamadığı ya da çok yüksek düzeylere ulaştığında yeterli mineralizasyon sağlanamayacaktır (54). Kemik dokuda hücre dışı PPi konsatrasyonunu sağlayan iki önemli protein vardır. Bunlardan birincisi “Nucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase 1” (NPP1)’dir. NPP1 bir glikoprotein olup plazma membranında yer alan ektoenzimdir. Görevi ekstraselüler nükleotidlerinin pirofosfata hidrolizidir. Bu enzimi eksprese edemeyen fare modellerinde PPi düzeylerin düşük olduğu ve ektopik kalsifikasyonlar geliştiği görülmüştür (66). Aynı şekilde insanlarda NPP1 geninde delesyonların neden olduğu hastalıklar tanımlanmıştır. Bu hastalıklardan en dikkat çekeni “İnfantil Jeneralize Arterial Kalsifikasyon” olup mortalitesi oldukça yüksektir. Günümüzde bu hastalar bir pirofosfat analoğu olan bifosfonatlar ile tedavi edilmektedirler (67). Diğer PPi sağkayıcı ise “Progresif ankylosis protein (ank)” proteinidir. Bu protein hücre membranında yer alır. Hücre içinde oluşan PPi’nin hücre dışına taşınmasını sağlar. Ank geninde delesyon oluşturulmuş fare modellerinde ektopik kalsifikasyon, eklemlerde kalsifikasyon ve anklizon gözlenmiştir (65,68). Bu iki protein dışında ekstraselüler alanda PPi konsantrasyonunu azaltan diğer bir protein ise Dokuya Spesifik Olamayan Alkali Fosfataz (TNSALP)’dir. III.A.f. TNSALP ve mineralizasyon Alkali fosfataz (ALP) membrana bağlı bir ektoenzimdir. Yüksek PH’da monofosfat esterlerini hidrolize eder. İnsan ALP’si TNSALP, intestinal, plasenta, germ hücre olmak üzere dört çeşittir. TNSALP karaciğer, böbrek ve kemik gibi birçok dokuda eksprese edilmekte olup kemik formasyonundan sorumlu çeşididir (69). TNSALP özellikle osteoblast, hipertrofik kondrosit ve odontoblastların hücre membranlarında ve matriks veziküllerin membranlarında eksprese edilir. TNSALP’nin doğal substratları PPi, pridoksal 16 5-fosfat (PLP) ve beklide ATP ve fosfotetonalamindir. TNSALP, mineralizasyon sürecinde PPi hidrolize ederek serbest Pi açığa çıkartır. Sonuçta bir mineralizasyon inhibitörü olan PPi azalmış olur ve ayrıca HA’nın bir bileşimi olan Pi konsantrasyonun artışı gerçekleşir. Bu reaksiyon yeterli mineralizasyonun sağlanmasında özellikle matriksde HA formasyonun büyüyüp, yayılmasın da etkilidir (51,70). PLP, B6 vitaminin aktif bir formudur ve bu bileşik nöronal hücrelerin nörotransmitter oluşum reaksiyonlarında bir kofaktörüdür. PLP hücre ve kan beyin bariyerini geçemez. Bu nedenle öncelikle TNSALP tarafından defosforile edilmesi gerekir. Hücre membranını PL olarak geçer ve tekrar fosforillenerek PLP oluşur ve bu form nörotransmitter sentezlenmesinde görev alır (71). TNSALP aktivitesinin levamizol ile baskılanması mineralizasyonuda baskıladığı in-vitro çalışmalarda gösterilmiştir (72). TNSALP’nin kemik mineralizasyonundaki etkinliği ALP gen defekti sonucu oluşan hipofosfatazyalı hastalarda ve transgenetik fare modellerinde de gösterilmiştir (73,74). IV. Levamizolün Mineralizasyon Üzerine Olası Etkileri Levamizol, günümüzde veteriner hekimlikte antihelmitik olarak kullanılmaktadır (75). Geçmiş yıllarda insanlarda kullanılmış olup yan etkilerinden (agranülositoz, cilt nekrozları) dolayı günümüzde insanlarda rutin bir uygulama alanı yoktur (76,77). Bununla birlikte özellikle antiproliferatif etkisinden dolayı, kolan kanserinde 5-FU ile birlikte tedavide kullanılmasına yönelik araştırmalar yapılmaktadır (78). Ayrıca immünmodulator etkilerine yönelik çalışmalar da olup özellikle nefrotik sendromlu çocukların tedavisinde denenmiş ve araştırılmıştır (79). Yaklaşık 40 yılı aşkın bir süredir levamizolün TNSALP üzerine inhibitör etkisi olduğu bilinmektedir (80). Bu etkiyi doza bağımlı, substrattan bağımsız, geri-dönüşümlü olarak göstermekte ve nonkompetitif inhibisyon yapmaktadır (81). Levamizol ve steoroizomeri tetramizolün mineralizasyon 17 sürecinde yer alan TNSALP‘nin etkisinin ortaya çıkarılmasında ve böylece mineralizasyonu daha iyi anlamamıza olanak vermiş bileşikler olduklarını söylemek yanlış olmaz. Beklide bu bileşikleri bilmemiz ve araştırmalarda yaygın kullanmamız günümüzde TNSALP’den daha çok söz etmemiz ve etkilerine daha hakim olmamızı sağlamıştır. Günümüzde PPİ’nin TNSALP için önemli bir substrat olduğunu bilmekteyiz. PPİ’nin hidrolizi mineralizasyon için gerekli olan Pi için önemli bir kaynaktır. Ancak hücre kültür ortamlarında TNSALP substratı olarak B-GP kullanılmakta olup bu bileşik in-vivo PPi’nin yerini tutmayabilir. PPi eklenmiş hücre kültürlerinde ise TNSALP aktivitesi ve gen ekspresyonu azaldığı başka çalışmalarla da gösterilmiştir. Adisson ark. çalışmasında PPi’nin direkt büyüyen HA kristallerine bağlanarak, OPN ekspresyonunu artırarak ve TNSALP aktivitesini azaltarak mineralizasyonu baskıladığı en az üç muhtemel yol tarif edilmektedir (64). Osteoblast hücre kültür, çalışmalarında TNSALP substratı olarak “beta-gliserofosfat” (B-GP) kullanılmaktadır. Levamizol bu hücre kültürlerinde TNSALP aktivitesinde azalma ve B-GP aracılıklı mineralizasyonda baskılanma meydan getirmektedir (64,82). Orimo ve ark.’nın çalışmasında B- GP’nin mineralizasyonu uyaran bir etkisi olduğunu göstermişlerdir. Yine bu çalışmada levamizol uygulanması ile TNSALP aktivitesi ile birlikte “TNSALP mRNA” ekspresyonu da azalmıştır (44). Araştırmacılar bu sonuca B-GP’nin TNSALP hidrolizi sonucu oluşan ürünlerinin mRNA ekspresyonun da etkili olabileceğini düşünmektedirler. B-GP, TNSALP ile hidrolizi ile Pi ve gliserol açığa çıkar. Bu ürünlerden gliserolün mineralizasyon ve ALP üzerine etkisi gözlenmemiştir. Pi, gerek HA formasyonunu kolaylaştırmakta gerekse henüz bilemediğimiz bir yoldan TNSALP ekspresyonunu artırmaktadır. İşte bu etkiler kültür ortamına levamizol eklenmesi ile gerçekleşmemektedir. TNSALP’de levamizol dozuna bağlı olarak tam inhibisyon sağlanabilmektedir. Bununla birlikte levamizol ortama eklenmesi AMP hidrolizini de bloke etmektedir. Ancak ATP eklenmesi ile gerçekleşen mineralizasyon sürecini (ATP aracılıklı mineralizasyon) etkilememesi (ya da kısmi etkilemesi) TNSALP’nin mineralizasyonda oynadığı rolü tek başına gerçekleştirmediğini 18 göstermektedir (51,83). TNSALP’ye benzer etki eden en az iki fosfataz daha vardır ve bu fosfatazlara levamizol etki etmemektedir (82,84,85). Burada diğer fosfatazların özellikleri ve fonksiyonları tartışılmayacaktır. Tavuk embriyolarından elde edilen kondrositlerden hazırlanan kültür ortamında levamizolün tip X kollajen sentezini ve bu kollajen aracılıklı mineralizasyonu azalttığı gösterilmiştir. Ayrıca Tip X kollajen mRNA ekspresyonuda azaldığı ifade edilmiştir (86). Levamizol mineralizasyon üzerine etkilerini inceleyen hücre kültür çalışmaları çok sayıda olsada invivo çalışmalar sınırlıdır. Bunun önemli bir nedeni invitro benzeri etki görmek için invivo toksik dozda levamizole ihtiyaç olacağı olabilir (77). Garba ve ark.’nın levamizolün I,25(OH)2D3 aracılıklı mineralizasyona etkisini inceledikleri invivo çalışmada düşük doz (40 mg/kg) ve yüksek doz (80 mg/kg) tedavi uygulamışlardır. Bu gruplarda tartı ve büyümede farklılık bulunmadığını bildirmişlerdir. Düşük doz levamizolun serum ALP düzeyini %18,4 ve yüksek doz levamizolün %61,3 oranında azalttığını saptamışlardır. Ayrıca ALP’nin mineralizasyon hızına etki edebilmesi için en azından %50 baskılanması gerektiği sonucuna ulaşılmışlardır. Ayrıca bu çalışmada doza bağlı olarak endosteal yüzeyde osteoid kalınlıktaki azalma mineralizasyon hızından daha belirgin olmuştur. Serum değerleri incelendiğinde ALP dışında, serum fosforun doz gruplarına göre sırayla %14,5 ve %22,8 azaldığı ancak kalsiyum değerlerinin ise değişmediği görülmüştür. Serum PPi düzeyi çalışılmamıştır. Bu çalışma levamizolün invivo serum biyokimyası ve kemik histomorfometresinin incelendiği tek çalışmadır (77). Özetle PPi düzeyinin mineralizasyon için kritik bir parametre olduğu düşünülürse bu düzeyi artıracak levamizol aracılıklı TNSALP inhibisyonu mineralizasyonu baskılamaktadır. Ayrıca osteoid doku sentezi ve kollajen sentezlerinide etkilediği söylenebilir. Ancak bu ilacın invivo etkileri konusunda yeterli çalışmalar yoktur. 19 V. Fosfonoformik Asitin Mineralizasyon Üzerine Etkileri Fosfonoformik asid ya da diğer bilinen ismi ile foscarnet bir PPİ analoğudur. Bu bileşik viral DNA polimeraz, RNA polimeraz ve reverse transkriptaz gibi enzimleri inhibe edici ajan olarak keşfedilmiş ve kullanılmaktadır. Günümüzde Herpes virüs hastalıklarında (ilaca dirençli sitolomegalovirüs(CMV), herpes simleks tip1 ve tip2), CMV retinitis ve HİV tedavisinde yer almaktadır (87,88). Günümüz tıbbında yaygın kullanılan ve etkileri daha çok incelenmiş “Bifosfonatlarda” bir PPi analoğudur. Bifosfonatlar “P-C-P” bileşiği içermesine karşın foscarnet sadece monofosfat bileşiği olarak “C-P” içerir (89). Foscarnet, bifosfonatlar gibi kemiklerde birikim göstermektedirler (89). Ancak foscarnetin invivo olarak kemik üzerine etkisi aydınlatılmış değildir. Bununla birlikte Swenson ve ark.’nın kedilere 14 gün boyunca uyguladılakları yüksek doz (1000 mg/kg/gün ) foscarnetin etkilerini inceledikleri çalışma, foscarnetin invivo toksik etkilerinin tespiti açısından dikkat çekicidir. Bu çalışmada foscarnetin rikets benzeri değişiliklere neden olduğunu ve yeni mineralizasyon alanlarının gelişmediğini saptamışlardır (89). Özetle aktif mineralizasyon ve “calcein” tutulumu (kemiği işaretlemek ve mineralizasyon hızını hesaplamak için kullanılan HA’ya afinitisi olan işaretleyici madde) tamamen durmuştur. Ayrıca osteoklastların sayılarında artış görmüşlerdir. Ancak bu osteoklastların aktivitelerini ölçememişlerdir. Serum değişikliklerinde ise tedavi gruplarında kalsiyumun yükseldiği, fosfor ve ALP değerlerinin azaldığını saptamışlardır. ALP değerlerindeki azalmayı osteoblast aktivitesinde azalmaya veya foscarnetin direkt osteoblasta toksik etkisine bağlamışlardır. Ratlarda bifosfonatlar ile yapılmış çalışmalarda elde edilen serum ve histomorfometrik inceleme sonuçları ile çoğunlukla benzer sonuçlar saptanmıştır (90). Bununla birlikte bifosfonat grubunda mineralizasyon alanlarında artış saptanırken (rezorbsiyonda daha belirgin azalmasının etkisi) foscarnet çalışmasında mineralizasyon tamamen durmuştur (89). Özetle, PFA mineralizasyonu bifosfonatlara göre daha güçlü durdurmaktadır. Osteoblast yüzeyinde ve matriks veziküllerinin yüzeyinde Na bağımlı fosfor kanalları yer almaktadır. Bu kanallar “vezikül içi Pi” miktarının 20 artmasına ve Ca-Pi amorf yapılarını ve daha sonrada HA gelişimi üzerinde etkilidirler (91,92). Foscarnet bir non-selektif NaPi kotransport blokeridir. Hücre kültürlerinde NaPi kanallarının bloke edilmesi için foscarnet kullanılır. Kültür ortamında 1mM dozda kullanılan foscarnet, Pi transportunu yaklaşık %75 oranında azaltmıştır (49). Başka bir çalışmada, kültür ortamına Pi aracılıklı mineralizasyon incelenmiş ve foscarnet mineralizasyon gelişimini belirgin baskılamıştır. Aynı ortamda TNSALP eksprasyonu ve aktivitesinde anlamlı bir değişiklik oluşmamıştır Bu çalışmada foscarnet, gerek B-GP aracılıklı gerekse Pi aracılıklı mineralizasyonu baskıladığı ancak TNSALP’yi baskılamadığı gösterilmiştir (51). Vasküler kalsifikasyon ateroskleroz gelişiminde önemli olup diyabet ve üremik hastalarda ciddi problemlere neden olmaktadır (35,46). Özellikle vasküler kalsifikasyon kronik böbrek yetersizliğinde önemli bir mortalite nedenidir. Bu kalsifikasyon sürecine ait invitro çalışmalarda vasküler düz kas hücre modelleri kullanılır. Bu hücre kültür ortamına yüksek Pi eklendiğinde düz kas hücrelerinde osteojenik değişiklikler olmakta ve bu süreç kalsifikasyon ile sonlanmaktadır. Yüksek fosfor içeren kültür ortamına foscarnet eklenmesi, bu kas hücrelerindeki değişikliği ve kalsifikasyonu inhibe etmektedir (35). Bu sonuç vasküler kalsifikasyonda, düz kas hücresi içerisine Pi akışının önemli bir mekanizma olduğunu, bu Pi akışında NaPi kanallarının önemli bir rolü olduğunu ve bu etkilerin foscarnet ile ortadan kaldırılabildiğini göstermektedir. VI. Mikrotomografi Mikrotomografi herhangi bir objeden mikron (mikrometre) (1/1000 mm) düzeyinde kesitler alınmasını ve uygun programlar aracılığı ile üç boyutlu modelleme yapılmasını ve objenin içerisinin görüntülenmesini sağlayan gelişmiş bir X-ray tomografi cihazıdır (93). Mikrotomografi bu işlemi yaparken objede herhangi bir destruksiyon yapmaz ve bu materyal daha başka incelemeler (örn histolojik incelemeler) için rahatlıkla kullanılabilir (94). 21 Şekil-5: Gelişmiş Mikron ya da mikron altı çözünürlükte tarama yapan bir mikrotomografi cihazı. Rutin radyoloji teknikleri olan “X-ray direkt grafileri” ve “DXA (dual energy X-ray absorbtiometry)” kemik hastalıkların değerlendirilmesinde çoğunlukla kullanılmaktadır. Direkt grafilerin çözünürlüğünün düşük olması ve sadece büyük boyutlu makroskopik lezyon ya da değişiklikleri göstermesi nedeniyle daha yüksek çözünürlüklü görüntülemeler geliştirilmiştir. Mikrotomografinin çalışma şekli bilgisayar tomografilerine benzemektedir (Şekil-6). Bir X ışını kaynağı ve bu kaynaktan çıkaran ışın örnekten geçer. Daha sonra bu ışınları toplayan bir dedektör ve elde edilen görüntüleri yapılandıran bir elektronik devre vardır Temel olarak iki tip mikrotomografi vardır. Bunlardan birincisi incelenecek canlı ya da örneğin sabit durduğu ancak kaynak ve dedektörün örnek etrafında döndüğü tip mikrotomografi cihazlarıdır (Şekil-7a). Bu çeşit tomografiler canlı hayvan incelemelerinde kullanılırlar. İkinci tip mikrotomografide dedektör ve kaynak sabittir ancak incelenecek örnek rotasyon yapar. Bu incelemede genelde ex- vivo örnekler incelenir ve daha yüksek çözünürlükte görüntüler sağlanabilir (94) (Şekil-7b). Dokudan ne kadar ince kesitler alınırsa o dokunun yapısını ve değişikliklerini daha doğru analizi mümkün olacaktır. Buradan hareketle ilk kez 1980 yılında, Jim Elliott tarafından mikrotomografi yapılmış ve 50 mikron kalınlıkta kesitlerle bir salyangoz incelenmiştir (95). Günümüzde çoğunlukla kullanılan tıbbi bilgisayar tomografisi yaklaşık 1-2 mm kalınlıkta kesitler alarak 22 dokunun ya da materyalin incelenmesini sağlamaktadır. Yüksek çözünürlüklü bir medikal bilgisayar tomografi cihazının 1 mm’lik bir düzeyde aldığı tek bir kesite rağmen, bir mikrotomografi cihazı bu alandan yaklaşık 1000 kesit alabilir ve incelenmesini sağlayabilir (96). Bu nedenle günümüzde preklinik alanında küçük hayvan ve dokuların görüntülenmesinde kullanılmaktadır. Mikrotomogarfı iyi bir rezolüsyon sağlasa da yumuşak doku çözünürlüğü iyi değildir. Bu nedenle yüksek kontrast veren dokularda özellikle kemik ve diş incelemelerinde yaygın kullanılmaktadır. Ancak yumuşak dokuda dağılarak kontrast sağlayan ajanların kullanıma girmesi ile yumuşak doku taramaları da artık yapılabilmektedir (94). Kemik incelemelerinde mikromografi hacimsel kemik mineral yoğunluğu ölçümü sağlamaktadır. Bu ölçümde kemiğin korteks ve trabeküler yapılarının ayrı ayrı incelenmesi ve üç boyutlu olarak mineral yoğunlukların hesaplanması sağlanabilmektedir (97). Şekil-6: Mikrotomografinin çalışma prensibi (94). Şekil-7: Mikrotomografilerin temel olarak iki şekilde çalışma prensibi vardır (94). 23 Şekil-8: Çalışmamızdan elde edilmiş bir trabeküler kemik 3D görüntüsü. 24 GEREÇ VE YÖNTEM I. Gereç Çalışmamız Uludağ Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan 01.07.2014 başvuru tarihli 2014-10/01 karar numaralı izni ile Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Yetiştirme Uygulama ve Araştırma Merkezinde gerçekleştirilmiştir. Çalışmamızda ağırlıkları 20 gr civarında 21 adet 3 aylık erkek Balb/c türü fare kullanılmıştır. Fareler 21-24°C oda sıcaklığında 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık foto periyodunda, polikarbon yapılı fare kafeslerinde 4’lü gruplar halinde, %18-20 protein içeren pelet fare yemi ve su ile “ad libitum” olacak şekilde beslenerek muhafaza edilmiştir. Hayvanların bakımı, terminasyon ve kan alma işlemleri ve bu işlemler için kullanılan anestezi protokolü Uluslarararası Sağlık Enstitüsü’nün Laboratuvar Hayvanlarını Koruma ve Kullanma Rehberindeki önergelere göre yapılmıştır (98). Bu çalışmada etkileri incelenen kimyasal bileşiklerden birincisi Levamisole hydrochloride [(−)-Tetramisole hydrochloride] (Sigma L9756, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) olmuştur (Şekil-9). Uygun doz (yaşamsal fonksiyonları etkilemiyecek yüksek doz) için ön çalışma yapılmıştır. Bu doz 25 mg/kg/gün intraperitoneal (ip) şeklinde uygulanması planlanmıştır. Levamizol, 10 mg/ml olacak şekilde %0,9 NaCl (Biosel İlac San. Ve Tic. A.S. , Beykoz, İstanbul) ile sulandırılmıştır. Her bir fareye tartısına göre doz ayarlanması yapılmış ve insülin enjektörleri ile ip olarak günlük tedavi uygulanmıştır. Her ilaç üç günde bir yeniden hazırlanmış ve bu hazırlanan miktar 4°C derecede muhafaza edilmiştir. Sodium phosphonoformate tribasic hexahydrate (Foscarnet) (Sigma-P6801, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) çalışmda kullanılan diğer bir kimyasaldır (Şekil-9). Fare dozları 150 mg/kg/gün olup ip olarak uygulanmıştır. Foscarnet, 60 mg/ml olacak şekilde %0,9 NaCl (Biosel İlac San. ve Tic. A.S., Beykoz, İstanbul) ile sulandırılmıştır. Her bir fareye tartısına 25 göre doz ayarlanması yapılmış ve insülin enjektörü aracılığıyla ünite hacimlerinde ip olarak günlük verilmiştir Her ilaç üç günde bir yeniden hazırlanmış ve bu hazırlanan miktar oda ısısında muhafaza edilmiştir. İlaçların hazırlanmasında 0,0001 gr hassasiyette hassas terazi (Radwag AS 220 Analitik Terazi Hassasiyet, Radom, Polanya) kullanılmıştır (Şekil-9). Kan alma anestezi işlemleri Uludağ Üniversitesi Deney Hayvanları Laboratuvarı’ndaki cerrahi malzemeler kullanılarak yapılmıştır. Mikrotomografi işlemleri Bruker Skyscan 1172 (Skyscan Ltd, Kontich, Belçika) marka ve model mikrotomografi cihazı ile Sabancı Üniversitesi Nanoteknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi’nde (SUNUM) gerçekleştirilmiştir. Şekil-9: Çalışmada kullanılan ilaçlar ve hassas terazi. II. Yöntem Çalışma başlangıcında her bir grupta 7 fare olacak şekilde 3 grup oluşturulmuştur (Şekil-10). 1. grup: kontrol grubu (serum fizyolojik, ip olarak uygulandı) (7 fare). 2. grup: foscarnet grubu (0,15 gr/kg foscarnet ip olarak uygulandı) (7 fare). 3. grup: levamizol grubu (25 mg/kg levamizol ip olarak uygulandı) (7 fare). 26 Şekil-10: Fare gruplarından genel bir görüntü. İlaç dozları farelere her sabah saat 10:00’da ip yoldan uygulandı. Farelere toplam 21 gün tedavi uygulandı. Tedavi başlangıcında ve haftalık tartıları ölçüldü ve kaydedildi. Tedavinin 22. gününde, 8 saatlik açlık sonrası “İzofuloran” anestezisi altında 2 ml’lik enjektör ile intrakardiyak ponksiyon uygulandı. Farelerden yaklaşık 500-800 mikrolitre kan örneği alındı ve servikal dislokasyon ile terminasyonları gerçekleştirildi (Şekil-11). Sakrifiye edilen farelerin sağ tibiaları çıkartıldı ve daha sonra mikrotomografi işlemi için uygun hazırlıkları yapıldı. II.A. Biyokimyasal Analizler Alınan kan örneklerinden serum kalsiyum, fosfor düzeyleri spektrofotometrik end-point yöntemiyle, serum ALP düzeyleri spektrofotometrik kinetik yöntemiyle Uludağ Üniversitesi Merkez Laboratuvarında tam otomatik biyokimya analizatörlerde çalışılmıştır. 27 Şekil-11: İnhalasyon anestezi cihazı, anestezi dönemi ve intrakardiyak ponksiyon işlemi. II.B. Mikrotomografi İçin Ön Hazırlıklar Alınan tibialar deri, yumuşak doku ve kas tabakaları temizlenerek serum fizyolojik ile ışlatılmış gazlı bezlere sarılarak, Eppendorf tüplerine yerleştirilmiştir. Numaralandırılan örnekler Mikrotomografi işlemine kadar - 20°C derecede muhafaza edilmiştir. II.C. Mikrotomografi ile Tarama ve Analiz Yöntemi Çalışmada Bruker Skyscan 1172 marka ve model mikrotomografi kullanılmıştır. Görüntüler 4000x2672 piksel boyutundaki projeksiyonlardan 2.98 µm çözünürlülükte elde edilmiştir. Numunelerin görüntü alanının dışına çıkmamaları için numunelerin uzun eksenleri, kendi ekseninde 180o döndürülen numune tutucunun uzun eksenleri ile mümkün olduğunca çakıştırılmıştır. Görüntüler 11 MP dijital dedektörden 8,75 µm fiziksel piksel boyutu ile elde edilmiştir. Cihaz, 86 kV, 116 µA enerji ayarlarıyla çalıştırılmış ve cihaza 0,5 mm alüminyum filtre yerleştirilmiştir. Filtre ışın sertleşmesi denilen etkiyi azaltmak adına yüksek enerjili fotonları kullanıp, düşük enerjili olanları filtrelemek için kullanılmaktadır. Halka yapaylığı denilen sorunu bertaraf etmek ve sinyal/gürültü oranını artırmak adına çekimden önce hizalama prosedürü ve yassı alan detektör kalibrasyonu yapılmıştır. 180o döndürülen numunelerden her 1o de 2000 ms poz süresi ile x-ışını projeksiyon görüntüsü alınmıştır. Her bir örnek için görüntüleme süresi 40-50 dakika olmuştur. TMD ve BMD için 0.25 ve 0.75 gr/cm3 hidroksiapatit 28 yoğunluğuna sahip fantom kullanılmıştır. Elde edilen projeksiyon görüntüleri NRecon isimli bir yazılımla yeniden oluşturulmuş ve kesitler elde edilmiştir. Kesit görüntüleri optimize etme adına "hizalama sonrası algortiması", "Kernel Gaussian (2 px) yumuşatma filtresi", "halka yapaylığı düzeltme algoritması", "ışın sertleşmesi düzeltme algortiması" kullanılmıştır. Hidroksiapatit fantomlar kullanılarak kalibrasyon yapılmış ve “Bone mineral density” (BMD) ve “Tissue mineral density” (TMD) ölçümleri gerçekleştirilmiştir (Şekil-12). Şekil-12: Mikromografi için hazırlanan kemik (tibia) (a), kemik örneklerinin tutturucuya eklenmesi (b), cihaz içerisine yerleştirilmiş kemik ve tutturucu (c) ve mikrotomografi cihazından görüntü (d). II.Ç. Mikrotomografi İncelemelerin Yapılacağı Alanların Bulunması Tibia örneklerinden elde edilen görüntülerin veri analizleri her kemiğin benzeri alanlarından yapılması gerekir. Görüntü analizleri için doğru alanların bulunması için büyüme plağının distal ucu “başlangıç noktası” olarak belirlenmiştir. Görüntü kesitlerinde büyüme plağının bittiği son kesitten 29 başlanarak distale 97 görüntü kesiti (0,29 mm) inilerek incelenecek trabeküler alanın proksimal ucu bulunmuştur. Bu noktadan distale 503 görüntü kesiti (1,5 mm) daha inilerek trabeküler alanın distal ucu bulunmuştur. Bu iki uç arasındaki alandan trabeküler morfometri ve mineral yoğunluğu analizleri yapılmıştır (Şekil-13). Kortikal kemik analizleri için kemiğin diyafizi seçilmiştir. Her kemikte aynı kortikal alanların analizi için trabeküler alt kesitten 764 kesit (2,21 mm) daha inilerek kortikal alanın üst kesidine ulaşılmış bu noktadan aşağıya 308 kesitlik alan (0,4 mm) kortikal analizler için kullanılmıştır (Şekil- 13). Şekil-13: Mikrotomografi ile kortikal ve trabeküler analizlerin yapıldığı alanlar. II.D. İstatistiksel Metot Verilerin istatistiksel analizi SPSS16.0 (SPPS Inc. California, IL, USA) istatistik paket programında yapılmıştır. Veriler ortalama±standart sapma seklinde belirtildi. Her bir gruptaki değişkenlerin normallik testleri Kolmogorov Smirnov testleri ile yapıldı. Verilerin dağılımının normal dağılıma uygun olduğu görüldü. Üç gruptaki verilerin ortalamalarının karşılaştırılması için “Tek 30 yönlü ANOVA” kullanıldı. ANOVA testinde anlamlık saptanan gruplarda “TUKEY HSD post hoc” analizleri yapıldı. Anlamlılık düzeyi p=0,05 olarak kabul edilmiştir. 31 BULGULAR Bu çalışmada levamizol ve fosfonoformik asidin serum ALP, kalsiyum, fosfor düzeylerine etkisi ve kemik mikroyapısı ve mineral yoğunluğunda meydana getirebilecekleri değişiklikler incelenmiştir. I. Biyokimyasal Sonuçlar I.A. Serum Kalsiyum Düzeyleri Ortalama kalsiyum değeri foscarnet grubunda 9±0,39 mg/dl, kontrol grubunda 8,6±0,22 mg/dl ve levamizol grubunun 8,70±0,43 mg/dl olarak bulundu (Şekil-14). Her ne kadar kalsiyum değerleri foscarnet grubunda daha yüksek bulunsa da aradaki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı düzeylerde değildi (p>0,05) (Tablo-1). Şekil-14: Grupların ortalama serum kalsiyum değerleri. I.B. Serum Fosfor Düzeyleri Ortalama fosfor değerleri foscarnet grubunda 9,6±3,1 mg/dl, kontrol grubunda 5,2±1,2 mg/dl, levamizol grubunda ise ortalama fosfor değeri 6,9±2,4 mg/dl saptanmıştır. Foscarnet grubunun fosfor değerleri kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmıştır (p=0,009). Levamizol grubunun ortalama fosfor değeri kontrol grubuna göre anlamlı bir değişim 32 göstermemiştir (p=0,415). Ayrıca foscarnet ve levamizol grupları arasında da anlamlı bir farklılık bulunmamıştır (Şekil-15) (Tablo-1). Şekil-15: Grupların ortalama fosfor düzeyleri ( *: kontrol grubu ile farklılığı p=0,009). I.C. Serum ALP Düzeyleri Foskarnet grubunun serum ALP ortalama değeri 103,85±17,4 IU/L kontrol grubunda 65,42±5,5 IU/L ve Levamizol grubunda ise 84,5±25,3 IU/L olarak saptandı. Foscarnet grubunun ortalama ALP değeri, kontrol grubunun ortalama ALP değerinden anlamlı olarak yüksek olduğu görüldü (p=0,003). Levamizol grubundaki artış anlamlı bulunmadı (p=0,155) (Şekil-16) (Tablo-1). Şekil-16: Grupların ortalama ALP düzeyleri ( * : kontrol grubu ile farklılığı p=0,003). 33 Tablo-1: Grupların ortalama biyokimyasal sonuçları (* : kontrol grubu ile farklılığı