ENDEMİK Verbascum bombyciferum Boiss. TÜRÜNÜN GENETİK ÇEŞİTLİLİĞİNİN ISSR YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ MERVE GÜVEN ENDEM İK Verbascum bombyciferum Boiss. TÜRÜNÜN GENETİK ÇEŞİTLİLİĞİNİN ISSR YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ MERVE GÜVEN T. C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ENDEMİK Verbascum bombyciferum Boiss. TÜRÜNÜN GENETİK ÇEŞİTLİLİĞİNİN ISSR YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ MERVE GÜVEN Yrd. Doç. Dr. Figen ERSOY Doç. Dr. Özer YILMAZ (Danışman) (İkinci Danışman) YÜKSEK LİSANS TEZİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI BURSA - 2017 Her Hakkı Saklıdır U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; - tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, - görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, - başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, - atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, - kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, - ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. ../../…. Merve GÜVEN ÖZET Yüksek Lisans Tezi ENDEMİK Verbascum bombyciferum Boiss. TÜRÜNÜN GENETİK ÇEŞİTLİLİĞİNİN ISSR YÖNTEMİ İLE BELİRLENMESİ Merve GÜVEN Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Danışman: Yrd. Doç. Dr. Figen ERSOY İkinci Danışman: Doç. Dr. Özer YILMAZ (Uludağ Üniversitesi) Verbascum bombyciferum Boiss. Marmara Bölgesi’nde yayılış gösteren Türkiye endemiği bir bitki türüdür. Bu çalışmada Bursa ve çevresinden toplanan Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait 82 bireyden oluşan 16 popülasyon moleküler markör tekniklerinden ISSR yöntemi ile analiz edilmiştir. Bu güne kadar bu türe ait morfoloji çalışmalarının dışında herhangi bir genetik varyasyon çalışması yapılmamıştır. 13 adet ISSR primeri kullanılarak yapılan polimeraz zincir reaksiyonları sonucunda 86 adet polimorfik bant elde edilmiştir. Polimorfik bantlar Popgen32 programına aktarılarak genetik uzaklıklar, genetik çeşitlilik ve genetik farklılaşma parametreleri belirlenmiştir. 82 bireye ait toplam polimorfizm % 100 olarak belirlenmiştir. Popülasyonlara ait ortalama polimorfik bant yüzdesi, Nei’ ye göre genetik çeşitlilik (H) ve Shannon bilgi indeksi (I) sırasıyla % 58,21, 0,2025 ve 0,3046 olarak belirlenmiştir. Toplam genetik çeşitlilik (Ht), popülasyonlar arası genetik çeşitlilik (Hs), Nei’ ye göre popülasyonlar arasındaki genetik farklılaşma indeksi (Gst) sırasıyla 0,2880, 0,2025 ve 0,2970 olduğu belirlenmiştir. Çalışma sonucunda birey ve popülasyonların genetik ilişki dendrogramları oluşturulmuştur. Sonuçlar NTSYSpc programında çizilen PCA (Principal Component Analysis) haritası ile desteklenmiştir. Anahtar Kelimeler: Verbascum bombyciferum Boiss., Moleküler markör, ISSR, Genetik çeşitlilik, Polimorfizm, PCR 2017, viii + 38 sayfa ABSTRACT MSc. Thesis IDENTIFICATION OF GENETIC DIVERSITY OF ENDEMIC Verbascum bombyciferum Boiss. USING ISSR Merve Güven Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Molecular Biology and Genetic Supervisor: Asst. Prof. Dr. Figen ERSOY Second Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Özer YILMAZ (Uludağ University) Verbascum bombyciferum Boiss. is a plant species endemic to Turkey, spreading in the Marmara Region. In this study, 16 populations from 82 individuals Verbascum bombiciferum Boiss. were collected from Bursa and its province. Plants were analyzed by a molecular marker technique, ISSR. Up to date, except morphology studies no other study was performed related to genetic variation of this species. 86 polymorphic bands were obtained as a result of polymerase chain reactions using 13 ISSR primers. Polymorphic bands were analyzed using Popgen32 program and genetic distances, genetic diversity and genetic differentiation parameters were calculated by this program. The total polymorphism of 82 individuals was determined as 100%. Within the populations, average values of percentage of polymorphic bands (PPB), Nei’s genetic diversity (H) and Shanon’s diversity index (I) was calculated as 58,21%, 0,2025 and 0,3046, respectively. Total genetic variation (Ht), genetic diversity (Hs) and genetic differentiation among the populations were found to be 0,2880, 0,2025 and 0,2970 respectively. As a result of this study genetic relationships of individuals and populations were shown as dendograms. The results were also supported by the PCA (Principal Component Analysis) using the NTSYSpc program. Key Words: Verbascum bombyciferum Boiss., Molecular marker, ISSR, Genetic diversity, Polymorphism, PCR 2017, viii + 38 pages. ii TEŞEKKÜR Tezimin yürütülmesinde bütün ilgi ve rehberliğini esirgemeyen, kibar davranışları, desteği ve anlayışı ile öğrencisi olmaktan gurur ve mutluluk duyduğum danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Figen ERSOY’a, Çalışmamda Verbascum bombyciferum Boiss. yaprak örneklerinin toplanıp getirilmesini sağlayan ve destekleriyle tezime katkıda bulunan eş danışman hocam Doç. Dr. Özer YILMAZ’a, Bölümümüzün kurulmasında ve devamlılığında gösterdiği çabalarını ve çalışmalarındaki azmini örnek aldığım Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölüm Başkanı Prof. Dr. Sezai TÜRKEL’e, Hayatımın her döneminde desteklerini daima yanımda hissettiğim ve evlatları olmaktan kıvanç duyduğum sevgili annem ve babama, Birlikte mutlu bir yaşama adımlarımızı attığımız ve bana sonsuz sevgiyle bakan eşim Enes Güven’e, sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Merve GÜVEN …./…/…. iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET............................................................................................................................. i ABSTRACT ................................................................................................................. ii TEŞEKKÜR ............................................................................................................... iii İÇİNDEKİLER ........................................................................................................... iv SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ .................................................................. v ŞEKİLER DİZİNİ ...................................................................................................... vii ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................ viii 1.GİRİŞ ........................................................................................................................ 1 2. GENEL BİLGİLER ................................................................................................. 1 2.1. Verbascum Tarihi .................................................................................................. 1 2.2. Verbascum bombyciferum Boiss. .......................................................................... 2 2.3. Bursa İline Ait Coğrafik Bilgiler........................................................................... 4 2.4. DNA Markör Teknikleri ve Bitki Biyoteknolojisindeki Yeri ............................... 5 2.4.1. ISSR (Basit Tekrarlı Diziler Arası Polimorfizm)............................................... 6 3. MATERYAL VE YÖNTEM ................................................................................... 8 3.1. Materyal ................................................................................................................ 8 3.1.1. İncelenen Verbascum bomyciferum Boiss. türünün popülasyon hatları ............ 8 3.2. Yöntem ................................................................................................................ 11 3.2.1. ISSR primer seçimi .......................................................................................... 11 3.2.2. DNA izolayonu ................................................................................................ 12 3.2.3. DNA konsantrasyonunun belirlenmesi ............................................................ 12 3.2.4. PZR reaksiyonu ................................................................................................ 13 3.2.5. Elektroforez ...................................................................................................... 13 3.2.6. Verilerin değerlendirilmesi .............................................................................. 14 4. BULGULAR .......................................................................................................... 15 4.1. ISSR Analizi İçin Genomik DNA İzolasyon Miktarları ..................................... 15 4.2. PZR ve Elektroforez Sonucu ............................................................................... 16 4.3. Verilere Ait Genetik Analizler ............................................................................ 16 4.4. ISSR Çalışması Analiz Sonuçları ve Polimorfik Bölgelerin Değerlendirilmesi . 21 5. SONUÇ .................................................................................................................. 29 KAYNAKLAR .......................................................................................................... 31 EKLER ....................................................................................................................... 33 EK 1. Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait genetik çeşitlilik parametreleri... 34 EK 2. Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait genetik farklılık parametreleri ... 36 ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................... 38 iv SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama °C Santigrat Derece µg Mikrogram µM Mikromolar µL Mikrolitre Kısaltmalar Açıklama AFLP Amplified Fragment Length Polymorphisms bç Baz çifti bkz Bakınız cm Santimetre Dk Dakika DNA Deoksiribo Nükleik Asit dNTP Deoksi-nükleotid trifosfat EDTA Etilen Diamin Tetra Asetik asit EtBr Etidyum Bromür g Gram GC Guanin-sitozin Gst Nei’ye göre popülasyonlar arasındaki genetik farklılaşma indeksi H Nei’ ye göre genetik çeşitlilik çeşitlilik Hs Popülasyonlar arası genetik çeşitlilik Ht Toplam genetik çeşitlilik I Shannon bilgi indeksi ISSR Inter-Simple Sequence Repeat km Kilometre m Metre mg Milligram mL Mililitre mM Milimolar Na Gözlenen alel numarası ng Nanogram Nm Popülasyonlar arasındaki tahmini gen akışı nt Nükleotit PBB% Polimorfik alellerin yüzdesi PCA Principal Component Analysis pmol Pikomol PZR Polimeraz Zincir Reaksiyonu RAPD Rastgele Çogaltılmıs Polimorfik DNA RFLP Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi rpm Dakikadaki devir sn Saniye v SSR Simple Sequence Repeats (Basit Dizi Tekrarlaması) TBE Tris-Borik Asit-EDTA U Ünite UPGMA Unweigted Pair Group Method Arithmetic Average UV Mor ötesi vi ŞEKİLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Verbascum bombyciferum Boiss. çiçek oluşumu ve genel görünümü ......... 3 Şekil 2.2. Herbaryum örneği olan Verbascum bombyciferum Boiss. yaprağı ............. 3 Şekil 2.3. Bursa iline ait çalışma haritası ..................................................................... 5 Şekil 3.1. Çalışmada kullanılan Verbascum bombycferium Boiss. popülasyonlarının topladığı bölgelerin coğrafi haritası ............................................................. 8 Şekil 4.1. % 1’lik agaroz jelde 13 adet ISSR primeri ile koşturulan DNA’ların UV ortamdaki görüntürü .................................................................................. 16 Şekil 4.2. 82 adet Verbascum bomyciferum Boiss. bireyine ait UPGMA metodu ile çizilen bireyler arası dendrogram .............................................................. 22 Şekil 4.3. 82 adet Verbascum bomyciferum Boiss. bireyine ait UPGMA metodu ile çizilen bireyler arası dendrogram radyal dağılımı ..................................... 23 Şekil 4.4. 16 adet Verbascum bomyciferum Boiss. popülasyonuna ait UPGMA metodu ile çizilen popülasyonlar arası dendrogram .................................. 24 Şekil 4.5. 16 adet Verbascum bomyciferum Boiss. bireyine ait UPGMA metodu ile çizilen popülasyonlar arası dendrogram radyal dağılımı ........................... 25 Şekil 4.6. Verbascum bomyciferum Boiss. 16 popülasyonu arasında PCA (Principal Component Analysis) gösterimi ................................................................ 28 vii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan Verbascum bombycferium Boiss. türünün lokalite hatları ve her popülasyonda kullanılan birey sayısı ................................. 9 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan Verbascum bombycferium Boiss. türünün lokalite hatları ve her popülasyonda kullanılan birey sayısı ............................... 10 Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan ISSR primerleri ve özellikleri ............................. 11 Çizelge 3.4. PZR reaksiyon karışımı için kullanılan miktarlar ve son konsantrasyon değerleri ................................................................................................. 13 Çizelge 3.5. 5X TBE çözeltisi için kullanılan solüsyonlar ve miktarları ................... 14 Çizelge 4.1. İzolasyon sonucunda bireylere ait konsantrasyon miktarları ................. 15 Çizelge 4.2. Verbascum bomyciferum Boiss. türüne ait ISSR çalışmasında belirlenen alel sayısı ve belirlenen alel büyüklükleri.............................................. 17 Çizelge 4.3. Verbascum bombycferium Boiss. bireylerinin polimorfik bant gösterimi ................................................................................................ 18 Çizelge 4.4. 16 adet Verbascum bomyciferum Boiss. popülasyonuna ait Nei 1978 genetik kimlik (diagonal üzerinde) ve genetik uzaklık (diagonal altında) tarafsız sonuçları .................................................................................... 20 Çizelge 4.5. Verbascum bomyciferum Boiss.’e ait popülasyon içi genetik çeşitlilik ve popülasyonlar arası genetik farklılaşma parametreleri .......................... 26 Çizelge 4.6. Verbascum bomyciferum Boiss.’e ait toplam genetik çeşitlilik ve toplam genetik farklılaşma değerleri ................................................................. 27 viii 1. GİRİŞ Türkiye’nin sahip olduğu zengin bitki çeşitliliği yerli ve yabancı araştırmacıların dikkatini çekmektedir. Türkiye Florası, Avrupa kıtasına yakın tür çeşitliliğine sahiptir. Bugüne kadar Türkiye Florası üzerinde pek çok çalışma yapılmış olup bunlardan en çok bilinenleri Boissier’in editörlüğünü yaptığı ‘Flora Orientalis’ (1867) ve Davis ve ark.’ın yazmış olduğu ‘Flora of Turkey and East Agean Island’ kitaplarıdır (1965). Türkiye’de Astragalus L. (Geven) cinsinden sonra en çok tür sayısına sahip olan ikinci cins Verbascum L. (Sığırkuyruğu) cinsidir. Tür sayısının fazla ve endemizm oranının yüksek olması nedeniyle Anadolu Verbascum cinsi için bir gen merkezi konumundadır. Verbascum türlerinin gruplandırılmasında stamen (erkek organların) sayısı önemlidir. 4 stamene sahip olanlar geçmişte Celsia L., 5 stamenli olanlar Verbascum cinsi altında toplanmıştır (Linnaeus 1753). Celsia cinsinde yer alan türler daha sonra Verbascum cinsine aktarılmıştır (Huber-Morath 1971). Bu çalışma 2014 yılında Bursa ve çevresinden toplanan Verbascum bombyciferum Boiss. türünün, popülasyon ve birey düzeyinde moleküler karakterizasyonunu belirlemek ve bireylerin genetik çeşitliliğini saptamak için yapılmıştır. 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Verbascum Tarihi Verbascum terimi, anlamını Yunanca’da sakal tüylü bitki anlamına gelen barbascum kelimesinden almaktadır (Karavelioğulları 2004). Verbascum cinsi Scrophulariaceae familyasından olup dünya üzerinde önemli bir floraya sahiptir. Günümüze kadar dünyada 360 taksonu tespit edilmiştir (Heywood 1993). Türkiye’de ise son verilere göre 244 tür ve 129 hibrit bulunmaktadır (Davis ve ark. 1965, Huber-Morath 1978, Aytaç ve Duman 2012). Türkiye’de bulunan Verbascum türlerinin 193’ü endemiktir (Karavelioğulları ve ark. 2011). Verbascum cinsi dünyada Bothrospermae Murb. ve Aulacospermae Murb. olmak üzere iki seleksiyona ayrılır. Bu iki seleksiyon arasındaki 1 en önemli fark tohum morfolojilerinin birbirinden farklı olmasıdır (Karavelioğulları ve ark. 2011). Türkiye’deki Verbascum türlerinin hepsi Bothrospermae Murb. seleksiyonunda bulunur (Murbeck 1925, 1933, Huber-Morath 1971). Dünyanın her yerinde Verbascum cinsine farklı isimler verilmiştir. Türkiye’de bu isimler bulundukları yörelere göre farklılaşmış olup bunlar Sığırcık kuyruğu, Sığır Kuyruğu, Yılan Yastığı, Kuzukulağı, Balık Bitkisi gibi ifade edilmektedir (Karavelioğulları 2004). Türker ve Gürel (2005) yaptıkları araştırmalarda Yunanlılar ve Romalılar döneminden bu yana Verbascum türlerinin çiçek ve yapraklarının; boğaz ağrısı, öksürük, bronşit, tüberküloz, astım gibi hastalıklarda kullanıldığına değinmiştir. Verbascum bitkisinin içerisindeki müsilaj yapısı ve diğer saponinler üst solunum yollarına iyi geliyor olduğu bilinse de dolaşımsal faaliyetleri yakın zamanda incelenmeye başlanmıştır. Verbascum, antiviral çalışmalara da konu olmuş ve Mehrotra (1989) tarafından tavuk embriyolarındaki influenza hastalıklarına karşı tedavi edici olarak kullanıldığı belirtilmiştir. Türker ve Camper (2002) hemoroid ve diyarenin tedavisinde kullanılan Verbascum türlerinin egzama gibi deri yaraları ve aynı zamanda migren gibi hastalıkların tedavisinde de kullanıldığını belirtmiştir. Bazı Verbascum tohumlarının yaptığı zehir etkisinden dolayı halk tarafından kullanıldığı bilinmektedir. Verbascum speciosum Schrad bitki ektraktlarının, Drosophila melanogaster’de gelişim bozukluklarına neden olarak ölüm oranlarını arttırdığı tespit edilmiştir (Uysal ve ark. 2012). 2.2. Verbascum bombyciferum Boiss. Türkiye için endemik olan Verbascum bombyciferum Boiss. yalnızca Bursa ve çevresinde yayılış göstermektedir. V. bombyciferum türünün gövde boyları 50-150 cm arasında değişmektedir. Bitkinin tümü yoğun tüy örtüsü ile kaplıdır. Çiçekleri 5 stamenli olup sarı renklidir (Şekil 2.1, Şekil 2.2). Açık alanlarda ve yol kenarlarında yetişmektedir. Çiçeklenmesi Nisan ve Temmuz ayları arasında gerçekleşmektedir. Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait daha önceden yapılmış genetik çeşitlilik 2 çalışması bulunmamaktadır. Bu türün gram (+) bakterilere antimikrobiyal aktiviteleri incelenmiş ve aktivite artışı gözlenmiştir (Dülger ve ark. 2002). Şekil 2.1. Verbascum bombyciferum Boiss. çiçek oluşumu ve genel görünümü (Çenil 2007) Şekil 2.2. Herbaryum örneği olan Verbascum bombyciferum Boiss. yaprağı (Çenil 2007) 3 2.3.Bursa İline Ait Coğrafik Bilgiler Bursa kuzeyde Kocaeli, Yalova, İstanbul ve Marmara Denizi, doğuda Bilecik, Adapazarı, batıda Balıkesir, güneyde Eskişehir, Kütahya ile çevrelenmiştir. Bursa’nın Marmara Denizi’ndeki kıyı uzunluğu 135 km’dir. Bu kıyılarda doğuya gidildikçe Mudanya ve Gemlik, batıda Bandırma, kuzeyde Armutlu, Narlı, Fıstıklı gibi beldeler yer almaktadır (Daşkın 2001). Bursa’nın en önemli oluşumları Uludağ, İznik Gölü ve Uluabat Gölü olup Şekil 2.3’te gösterilmektedir. Bursa bölgelere göre iklim farklılıkları gösterirken, genel itibariyle ılıman iklime sahiptir. Uludağ etekleri sert iklime sahip ve kar yağışı alırken, kuzeye daha yumuşak bir iklim hâkim olmaktadır. Bursa’da yılın en sıcak ayları Temmuz ve Eylül iken en soğuk Şubat ve Mart aylarıdır. Bursa üzerinde birçok bitki türünü barındırmakta ve bunlardan önemli bir kısmını endemik bitkiler oluşturmaktadır. Dünyadaki çeşitli araştırmacılar bunu öğrenerek, Bursa’da bitki toplamak için bulunmuştur (Çenil 2007). Endemik bitkilerde büyük bir grup içeren Verbascum türleri birçok araştırmacı tarafından incelenmiştir (Mehrotra 1989, Türker ve Camper 2002, Uysal ve ark. 2012). 4 Şekil 2.3. Bursa iline ait çalışma haritası (http://s5.photobucket.com/user/karakus/library/bursa%20harita?sort=2&page=1, 2016) 2.4. DNA Markör Teknikleri ve Bitki Biyoteknolojisindeki Yeri Belirli bir gen bölgesinde bulunan DNA parçalarına ya da herhangi bir gen bölgesine moleküler markörler denir. Genomda DNA dizilerinin benzerliklerini ve farklılıklarını belirlemek için kullanılan markör teknikleri son yıllarda birçok konuda tercih edilen seleksiyon yöntemlerinden biridir. Bu seçilim hızlı ve tekrarlanabilirliği yüksek olması sebebiyle bitki ıslahında ve bitki hastalık genlerinin tespit edilmesinde kullanılmaktadır. Moleküler markörlerin kullanımıyla birlikte dayanıklılık genleri tespit edilmekte, böylece genlerin kromozom ürerinde haritalanması ve klonlanması mümkün olmaktadır (Milligan ve ark. 1998, Rossi ve ark. 1998). Polimeraz Zincir Reaksiyonunun (PZR) 5 bulunmasından sonra tarımsal açıdan gen tespiti, filogenetik analizler ve gen etiketleme gibi markör destekli seleksiyon çalışmaları kolaylaşmıştır (Joshi ve ark. 2000). Markör çalışmaları PZR bağımlı ve PZR bağımlı olmayan olarak iki gruptan oluşturmaktadır. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms) PZR bağımlı olmayan moleküler markör tekniğidir. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) ve SSR (Simple Sequence Repeats) ise PZR bağımlı moleküler markör tekniklerinden başlıcalarıdır. SSR bölgeleri arasındaki DNA sekansları ise ISSR (Inter-simple Sequence Repeat) dizilerini oluşturmaktadır. 2.4.1. ISSR (Basit Tekrarlı Diziler Arası Polimorfizm) DNA dizilerinde mikrosatellit olarak bilinen, tekrarlanan gen bölgeleri bulunmaktadır. Bunlar basit dizi tekrarları olarak adlandırılırlar (SSR). Mikrosatellitler, gen bölgesi içine dağılmış olup yüksek derecede korunmaktadır (Thomas ve ark. 2006). Bu mikrosatellit sekanslarında ikili, üçlü, ve dörtlü şeklinde tekrar eden nükleotitler bulunmaktadır. Basit dizi tekrarları arasında kalan DNA sekansları ise Inter Simple Sequence Repeat (Basit Tekrarlı Diziler Arası) olarak tanımlanmaktadır. Bilinen mikrosatellit dizilerinden yola çıkılarak hazırlanan primerler ile iki bölge arası çoğaltılır. Bu primerler genellikle yaklaşık 15-30 nükleotit uzunluğunda seçilmektedir. Daha sonra agaroz jel elektroforezinde koşturularak belirli boyalar ile çoğaltılan DNA bantlarının işaretlenmesi yapılır. Seçilen primerlere bağlı olarak farklı büyüklükte bantlar belirlenir. Belirlenen bantlar sonucunda gen haritalaması yapılmasının yanı sıra DNA bölgelerindeki değişkenlikler karşılaştırmalı olarak gözlenebilmektedir. ISSR yönteminde primer seçimi önemlidir. İçeriğindeki GC miktarı yüksek olan primerler bağlanma sıcaklığının fazla olmasını yol açar. Bağlanma sıcaklığı yükseldikçe daha kararlı bağlanmalar oluşur. ISSR kullanımının çeşitli avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır. Herhangi bir dizi içeriği bilinmeden primerlerin oluşturulabilmesi ISSR yönteminin en önemli avantajıdır. 6 ISSR markörleri ile çalışırken az miktar örnek doku yeterli olmaktadır ve diğer moleküler markörlere göre daha hızlı uygulanabilir. ISSR tekniği diğer yöntemlere göre maliyeti az olan bir tekniktir. AFLP tekniğine göre daha az adıma sahip olması ve çalışma kolaylığı sağladığı için ISSR yöntemi daha çok tercih edilir. Benzer uzunluktaki dizi parçalarının homolog olmaması ve RAPD yöntemine benzer şekilde tekrarlanabilirliğin düşük olması dezavantajlarıdır (Kesawat ve Das 2009). Düşük genomik DNA kalitesinden kolaylıkla etkilenir. 7 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. İncelenen Verbascum bomyciferum Boiss. türünün popülasyon hatları Bu çalışmada Marmara Bölgesi’nin farklı arazilerinden toplanan Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait 16 popülasyon materyal olarak kullanılmıştır (Şekil 3.1). Örnekler Uludağ Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü öğretim üyesi Doç. Dr. Özer Yılmaz tarafından temin edilmiştir. Bütün çalışmalar laboratuvar koşullarında gerçekleştirilmiştir. Örnek yapraklar -20 ºC saklama koşullarında muhafaza edilmiştir. Her popülasyonda en az 3, en fazla 7 birey kullanılmıştır. Toplam Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait 82 birey analiz edilmiştir. Şekil 3.1. Çalışmada kullanılan Verbascum bombycferium Boiss. popülasyonlarının topladığı bölgelerin coğrafi haritası 8 Örnekleme yapılan bölgelere ait popülasyonların lokalitelerini gösteren ayrıntılı bilgi Çizelge 3.1’de verilmiştir. Her bölgeden Verbascum bombycferium Boiss. türüne ait birden fazla birey toplanmıştır. Birey kayıt numaraları ve isimleri Çizelge 3.2’de gösterilmiştir. Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan Verbascum bombycferium Boiss. türünün lokalite hatları ve her popülasyonda kullanılan birey sayısı HARİTA POPÜLASYON POPÜLASYON LOKALİTESİ Kullanılan NO İSMİ örnek sayısı 1 62/2014 BURSA: Nilüfer, Orhaneli Barajı çevresi, 312 m, 6 25.06.2014 2 72/2014 BURSA: Nilüfer, Uludağ, Gökdere, Misi karşısı, 5 24.07.2014 3 73/2014 BURSA: Nilüfer, Çalı, Çalı – Atlas, 24.07.2014 4 4 77/2014 BURSA: Gürsu, Barakfakih – Dışkaya, 255 m, 3 25.07.2014 5 78/2014 BURSA: Gürsu, Barakfakih – Ağlaşan, 303 m, 6 25.07.2014 6 80/2014 BURSA: Gemlik, Gemlik – Kumla, 65 m, 5 14.08.2014 7 81/2014 BURSA: Gemlik, Kumla – Haydariye, 2. km, 4 14.08.2014 8 82/2014 BURSA: Narlı, 52 m, 14.08.2014 7 9 95/2014 BURSA: Gemlik, Narlı çevresi, 29 m, 27.08.2014 6 10 96/2014 BURSA: Narlı – Fıstıklı, 27 m 5 11 97/2014 BURSA: Narlı, Karayolları Kampı arkasındaki 5 yamaçlar 12 98/2014 YALOVA: Narlı – Armutlu, 25 m, 27.08.2014 5 13 99/2014 YALOVA: Kapaklı – Armutlu, Kapaklı çevresi, 63 5 m, 27.08.2014 14 101/2014 YALOVA: Kapaklı – Armutlu, 63 m, 27.08.2014 6 15 118/2014 BURSA: Osmangazi, Gündoğdu, 320 m, 28.08.2014 5 16 119/2014 BURSA: Mudanya, Mudanya – Kumyaka, 56 m, 5 05.09.2015 9 Çizelge 3.2. Çalışmada kullanılan Verbascum bombycferium Boiss. türüne ait birey kayıt numaraları No Birey kayıt no No Birey kayıt no No Birey kayıt no No Birey kayıt no 1 OrhaneliB1 24 Ağlaşan6 47 Fıstıklı1 70 Kapaklı4 2 OrhaneliB2 25 Kumla1 48 Fıstıklı2 71 Kapaklı5 3 OrhaneliB3 26 Kumla2 49 Fıstıklı3 72 Kapaklı6 4 OrhaneliB4 27 Kumla3 50 Fıstıklı4 73 Gündoğdu1 5 OrhaneliB5 28 Kumla4 51 Fıstıklı5 74 Gündoğdu2 6 OrhaneliB6 29 Kumla5 52 KarayollarıK1 75 Gündoğdu3 7 Misi1 30 Haydariye1 53 KarayollarıK2 76 Gündoğdu4 8 Misi2 31 Haydariye2 54 KarayollarıK3 77 Gündoğdu5 9 Misi3 32 Haydariye3 55 KarayollarıK4 78 Kumyaka1 10 Misi4 33 Haydariye4 56 KarayollarıK5 79 Kumyaka2 11 Misi5 34 Narlı1 57 Armutlu1 80 Kumyaka3 12 ÇalıAtlas1 35 Narlı2 58 Armutlu2 81 Kumyaka4 13 ÇalıAtlas2 36 Narlı3 59 Armutlu3 82 Kumyaka5 14 ÇalıAtlas3 37 Narlı4 60 Armutlu4 15 ÇalıAtlas4 38 Narlı5 61 Armutlu5 16 Dışkaya1 39 Narlı6 62 KapaklıÇev1 17 Dışkaya2 40 Narlı7 63 KapaklıÇev2 18 Dışkaya3 41 NarlıÇev1 64 KapaklıÇev3 19 Ağlaşan1 42 NarlıÇev2 65 KapaklıÇev4 20 Ağlaşan2 43 NarlıÇev3 66 KapaklıÇev5 21 Ağlaşan3 44 NarlıÇev4 67 Kapaklı1 22 Ağlaşan4 45 NarlıÇev5 68 Kapaklı2 23 Ağlaşan5 46 NarlıÇev6 69 Kapaklı3 3.2. Yöntem 10 3.2.1. ISSR primer seçimi Bu çalışmada 13 adet ISSR primeri kullanılmıştır. Kullanılan primerlerin DNA dizilimleri, nükleotid uzunlukları ve bağlanma sıcaklıkları Çizelge 3.3’de gösterilmiştir. Çizelge 3.3. Çalışmada kullanılan ISSR primerleri ve özellikleri Primer Adı DNA dizilimi Nükleotid uzunluğu Bağlanma sıcaklığı (ºC) (5’-3’) ISSR1 (GA)8-C 17 nt 42 ISSR2 (GA)8-G 17 nt 47 ISSR3 (GA)8-T 17 nt 55 ISSR4B (AC)8-T 17 nt 56 ISSR5 (AC)8-G 17 nt 53 ISSR6 (AC)8-C 17 nt 51 ISSR7 (AC)8-A 17 nt 51 ISSR10 (GTG)5 15nt 55 ISSR 11 (GAC)5 15 nt 55 ISSR 12 (CAC)5 15 nt 58 ISSR 13 (GATA)4 16 nt 40 ISSR 14 (CTC)5 15 nt 51 ISSR15 (GACA)5 20 nt 57 3.2.2. DNA izolasyonu 11 DNA izolasyonunda QIAGEN firmasının “DNeasy Bitkiden DNA İzolasyon Mini Kiti” kullanıldı. Yaprak örnekleri sıvı azot yardımıyla havanda ezilerek 2 mL’lik eppendorf tüplere alındı. Üzerine 400 µL AP1 tamponu ve 4 µl RNase A ilave edilip 65 ºC’de 10 dk inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında eppendorf tüpünün içerisine 130 µL AP2 tamponu ilave edilerek çalkalandı. Ardından 5 dk buz kalıbında bekletilerek 14 000 rpm’de ScanSpeed marka Mini model santrifüjde santrifüj yapıldı. Oluşan sıvı faz pelletten ayrılarak QIAshredder mini çalkalama kolonuna alındı. 14 000 rpm’de 2 dk santrifüj yapıldıktan sonra filtre atıldı ve sıvı faz temiz bir tüpe alındı. Oluşan sıvı fazın 1,5 katı kadar AP3 tamponu ilave edilerek pipet yardımıyla karıştırıldı. Karışımın 650 µL’si DNeasy mini çalkalama kolonuna alınıp 8 000 rpm’de 1 dk santrifüj yapıldı. Filtrenin alt kısmına geçen sıvı faz dökülerek kalan karışıma da aynı işlem uygulandı. Filtrenin altına biriken sıvı faz tekrar döküldü. Bu sayede bitki DNA’sı filtrede tutulmuş olmaktadır. Üzerine 500 µL AW tamponu ilave edildi ve 8 000 rpm’de 1 dk santrifüj yapılarak birinci yıkama işlemi gerçekleştirildi. Daha sonra filtrenin altına toplanan sıvı faz dökülerek tekrar 500 µL AW tamponu ilave edildi ve 15 000 rmp’de 2 dk santrifüj yapıldı. Sıvı faz tekrar döküldü ve DNA’yı tutan filtre temiz bir eppendorf tüpünün üzerine koyuldu. Üzerine 75 µL AE tamponu ilave edilerek 5 dk oda sıcaklığında bekletildi. Daha sonra 8 000 rpm’de 1 dk santrifüj yapıldı. Filtreden serbest hale geçen DNA, filtrenin altındaki tüpte toplandı. Bu lizat alındı ve tekrar filtrenin üzerine koyularak bu işlem tekrarlandı. Bu yöntem, stok DNA oluşturmak üzere her birey için tek tek uygulandı. 3.2.3. DNA konsantrasyonunun belirlenmesi İzolasyonu sonucunda elde edilen stok DNA’lardan 2 µL örnek alınarak Thermo Nanodrop ND-2000 spektrofotometre ile DNA konstantrasyon ölçümlü yapılmıştır. 260/280 absorbans oranı ~1,6-2,11 olan DNA örnekleri PZR işlemi için seçilmiştir. Bütün DNA örnekleri -20 C saklama koşullarında tutulmuştur. 3.2.4. PZR reaksiyonu 12 Polimeraz zincir reaksiyonları New England Biolabs PZR protokolünden optimize edilerek yapıldı. ISSR analizi için hazırlanan PZR karışımının toplam hacmi 25 µL olacak şekilde hazırlandı. Çalışmada 200 µL steril PZR tüpü kullanıldı. Toplam 25 µL’lik PZR karışımını oluşturmak için kullanılan solüsyonlar Çizelge 3.4’te verilmiştir. Çizelge 3.4. PZR reaksiyon karışımı için kullanılan miktarlar ve son konsantrasyon değerleri PZR reaksiyon karışımı 25 μl Son konsantrasyon reaksiyon 10X Standart tampon çözeltisi 2,5 μL 1X 10 mM dNTP karışımı 0,5 µL 200 µM 25 mM MgCl2 1,5 µL 1,5 mM 10 µM (10 pmol/µL) Primer 2 µL 0,8 µM (0,05–1 µM) Stok DNA 2 µL 200 ng 5 U/µL Taq DNA Polimeraz 0,25 µL 1,25 U PZR distile suyu 16,25 µL Reaksiyona 94 ºC’de 3 dk ön denatürasyon işlemiyle başlanmıştır. Ardından örnekler denatürasyon için 94 ºC’de 45 sn, primerlerin DNA’ ya bağlanma sıcaklığı için çizelge 3.2’de optimizasyon sonucu gösterilen sıcaklıklarda 45 sn, uzama aşaması için 72 ºC’de 1,30 sn 35 döngü gerçekleştirilmiştir. Son uzama aşaması için 72 ºC’de 5 dk bekletilmiştir. 3.2.5. Elektroforez Tris, borik asit ve EDTA kullanılarak 5X TBE çözeltisi hazırlandı. 5X TBE çözeltisi oluşturma miktarları Çizelge 3.4’te gösterilmiştir. Ardından 5X çözeltisinden 200 mL alınıp üzerine 800 mL distile su ile tamamlanarak 1X çözeltisi hazırlandı. Sonra 1X çözeltisinden 100 mL alındı ve içerisine 1 g agaroz ilave edilerek konsantrasyon % 1 olacak şekilde agaroz jel hazırlandı. Yeterli miktar ısıtılarak hazırlanan jele etidyum bromür ilave edildikten sonra elektroforez tankına döküldü ve 40 dk bekletildi. Örneklere 5 µL jel görüntüleme boyası ilave edildikten sonra 1X tamponu doldurulan 13 tanktaki kuyucuklara yüklendi. Elde edilen PZR ürünleri agaroz jel elektroforezinde 100 V’da 1 saat koşturuldu. Çizelge 3.5. 5X TBE çözeltisi için kullanılan solüsyonlar ve miktarları 5X TBE Madde miktarı Tris 54 g Borik asit 27,5 g EDTA (pH 8) 20 mL 3.2.6. Verilerin değerlendirilmesi Çalışmada elektroforez işleminden sonra DNA bantlarının görüntüsü jel görüntüleme sistemi kullanılarak tespit edilmiştir. Polimorfik bantlar 1 (var) ve 0 (yok) olarak skorlanmıştır. 82 birey ve bunların oluşturduğu 16 popülasyon, Popgen32 genetik analiz programı kullanılarak oluşturulan matris üzerinden benzerlik katsayısı hesaplanmıştır. Sonuçlar birey ve popülasyon düzeyinde ayrıntılı olarak analiz edilmiştir. 4. BULGULAR 4.1. ISSR Analizi İçin Genomik DNA İzolasyon Miktarları 14 Verbascum bombyciferum Boiss. bitkisinin yapraklarından DNA izolasyonu gerçekleştirildikten sonra Nanodrop ND-1000 spektrofotometrede ölçümleri yapıldı ve konsantrasyonları mikrolitredeki ng miktarına göre kayıt edildi. Bireylerin konsantrasyon miktarları Çizelge 4.1’de gösterilmiştir. Çalışma sonucuna göre en az DNA miktarı 15,8 ng/µL olup, en fazla DNA miktarı 1061,2 ng/µL olarak saptanmıştır. Çizelge 4.1. İzolasyon sonucunda bireylere ait konsantrasyon miktarları Birey Kons. ng/µL Birey Kons. ng/µL Birey Kons. ng/µL Birey Kons. ng/µL no no no no 1 106,5 24 416,3 47 205,3 70 170,9 2 39,5 25 358,1 48 262,1 71 77,7 3 253,9 26 32,3 49 311,1 72 32,1 4 58,8 27 15,8 50 202,9 73 158,9 5 52,3 28 76,4 51 469,7 74 167,5 6 28,7 29 93,4 52 223,2 75 650,1 7 149,9 30 876,2 53 79,8 76 1061,2 8 42,8 31 439,4 54 70,6 77 88,0 9 49,3 32 79,1 55 77,1 78 32,3 10 21,3 33 271,2 56 266,5 79 17,9 11 50,8 34 250,5 57 350,8 80 34,7 12 254,8 35 40,6 58 642,1 81 49,8 13 52,9 36 45,3 59 20,5 82 354,3 14 58,8 37 42,5 60 232,2 15 23,8 38 52,7 61 39,0 16 91,8 39 36,2 62 267,4 17 240,1 40 40,5 63 548,6 18 49,0 41 117,5 64 95,6 19 177,8 42 137,9 65 41,8 20 41,1 43 62,3 66 111,9 21 39,8 44 268,2 67 56,4 22 24,7 45 269,9 68 146,7 23 30,0 46 40,8 69 87,7 4.2. PZR ve Elektroforez Sonucu 15 İzolasyon işlemi yapılarak elde edilen DNA’lar, seçilen primerleri içeren 25 µL’lik PZR karışımı ile polimeraz zincir reaksiyonuna tabi tutulmuştur. Reaksiyon sonucunda alınan her tüp etidyum bromür ile boyanıp % 1’lik agaroz jelde koşturuldu. İşaretleyici olarak New England Biolabs 100 bç DNA ladder kullanılarak bant büyüklükleri belirlendi. Agaroz jel elektroforezi sonrasında UV ortamda izlenen jel görüntüleme sonucu Şekil 4.1’de örnek olarak gösterilmiştir. Şekil 4.1. %1’lik agaroz jelde ISSR 13 primeri ile koşturulan DNA’ların UV ortamdaki görüntüsü 4.3. Verilere Ait Genetik Analizler Verbascum bomyciferum Boiss. türüne ait Marmara Bölgesi’nden toplanan 82 adet bireyin (16 popülasyon), 13 adet ISSR primeri ile çalışılması sonucunda her bireyde toplam 86 tane alel tespit edilmiştir. Tespit edilen alel sayıları ve büyüklükleri Çizelge 4.2’de gösterilmiştir. ISSR primerlerden elde edilen alel büyüklükleri referans işaretleriyiciyle karşılaştırılarak yaklaşık 300 ile 1500 bç arasında belirlenmiştir. Çizelge 4.2. Verbascum bomyciferum Boiss. türüne ait ISSR çalışmasında belirlenen alel sayısı ve belirlenen alel büyüklükleri 16 Primer Adı Alel Sayısı Alel Büyüklükleri (bç) ISSR1 9 300, 400, 500, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200 ISSR2 4 500, 600, 800, 1000 ISSR3 8 300, 400, 450, 500, 600, 800, 900, 1100 ISSR4B 10 350, 450, 500, 600, 650, 800, 900, 1100, 1300, 1500 ISSR5 7 350, 450, 500, 600, 700, 900, 1000 ISSR6 10 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1100, 1300 ISSR7 5 400, 500, 600, 750, 1000 ISSR10 11 300, 350, 400, 490, 520, 640, 760, 880, 930, 1250, 1400 ISSR 11 7 380, 470, 550, 680, 730, 850, 950 ISSR 12 3 500, 800, 1050 ISSR 13 3 500, 530, 770 ISSR 14 2 1300, 1400 ISSR 15 8 370, 450, 600, 750, 950, 1350, 1500 TOPLAM 86 ORTALAMA 6,6 Primerlere ait aleller (toplam bant sayısı) incelendiğinde en fazla polimorfik alel ISSR10’da 11 adet, en az polimorfik alel ise ISSR14’te 2 adet olarak bulunmuştur. ISSR1, ISSR2, ISSR3, ISSR4B, ISSR5, ISSR6, ISSR7, ISSR10, ISSR11, ISSR12, ISSR13, ISSR14, ISSR15 primerlerinden elde edilen toplam 86 bandın polimorfik olduğu belirlenmiştir. Primer başına düşen ortalama polimorfik alel sayısı 6,6 olarak hesaplanmıştır. Agaroz jel elektroforezinden alınan görüntüler bant olması durumunda 1 (var), olmaması durumunda 0 (yok) şeklinde belirlenmiştir ve sonuçların tablosu oluşturulmuştur. 82 adet Verbascum bomyciferum Boiss. bireyine ait polimorfik bantların 1 ve 0 olarak skorlama sonucu tek bir tablo yapılarak Çizelge 4.3’te gösterilmiştir. Çizelge 4.3. Verbascum bomyciferum Boiss. bireylerinin polimorfik bant gösterimi No Polimorfik bantlar (1-86) 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 17 2 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 3 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 4 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 5 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 6 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 7 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 8 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 9 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 2 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 3 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 4 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 5 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 6 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 7 1 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 8 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 9 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 2 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 2 3 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 2 4 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 5 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 2 6 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 2 7 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 2 8 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 2 9 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 3 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 3 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 3 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 3 4 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 5 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 3 6 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 7 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 8 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 3 9 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 4 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 4 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 4 2 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 4 3 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 4 4 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 4 5 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 4 6 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 4 7 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 4 8 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 9 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 5 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 2 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 5 3 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 5 4 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 5 5 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 5 6 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 7 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 5 8 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 5 9 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 6 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 6 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 6 2 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 6 3 1 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 6 4 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 6 5 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 6 6 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 6 7 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 6 8 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 6 9 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 7 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 7 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 2 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 7 3 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 4 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 7 5 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 7 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 8 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 7 9 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 8 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 8 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 8 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Verbascum bomyciferum Boiss. türüne ait 82 birey ve bu bireylerin oluşturduğu 16 popülasyona ait skorlama sonucunda genetik benzerlik ve farklılıklar Popgen32 bilgisayar programı kullanılarak analiz edilmiştir. Bu analizde kümelenme temelli 18 filogenetik analiz grubuna dahil olan Unweigted Pair Group Method Arithmetic Average (UPGMA) metodundan yararlanılmıştır. Popgen32 programındaki analiz sonucundan elde edilen benzerlik matriksi alınarak bireylere ve popülasyonlara ait dendrogramlar ve dendrogramların radyal dağılımı FigTree v1.4.2 programı kullanılarak elde edilmiştir. Dendrogramlar, Nei 1978 tarafsız hesaplamasına ait genetik kimlik ve genetik mesafe temeline dayandırılmıştır. Bireyler arası dendrogram Şekil 4.2’de, popülasyonlar arası dendrogram Şekil 4.4’te gösterilmiştir. Bireylere ve popülasyonlara ait radyal dağılım ise sırasıyla Şekil 4.3 ve Şekil 4.5’te gösterilmiştir. 19 Çizelge 4.4. 16 adet Verbascum bomyciferum Boiss. popülasyonuna ait Nei 1978 genetik kimlik (diagonal üzerinde) ve genetik uzaklık (diagonal altında) tarafsız sonuçları Popülasyon OrhaneliB Misi Çalı- Dışkaya Ağlaşan Kumla Haydariye Narlı Narlı Fıstıklı KarayollarıK Armutlu Kapaklı Kapaklı Gündoğdu Kumyaka Adı Atlas Çev. Çev. OrhaneliB ***** 0,9446 0,9316 0,9202 0,9364 0,8804 0,8749 0,8772 0,8495 0,8751 0,8936 0,8831 0,8813 0,9211 0,8821 0,8932 Misi 0,0570 ***** 0,9769 0,9155 0,9543 0,8946 0,9197 0,8820 0,8623 0,8897 0,8857 0,8864 0,9120 0,9296 0,9182 0,9287 Dışkaya 0,0709 0,0234 ***** 0,8874 0,9605 0,9293 0,9131 0,8839 0,8683 0,9077 0,9035 0,9071 0,9348 0,9411 0,9023 09493 Çalı-Atlas 0,0831 0,0883 0,1195 ***** 0,9210 0,8424 0,8388 0,8499 0,8333 0,8149 0,8714 0,8401 0,8394 0,8826 0,8270 0,8503 Ağlaşan 0,0657 0,0468 0,0403 0,0823 ***** 0,9263 0,9624 0,9290 0,8917 0,9658 0,9478 0,9410 0,9267 0,9497 0,9580 0,9332 Kuımla 0,1274 0,1113 0,0733 0,1714 0,0766 ***** 0,8915 0,8689 0,8467 0,8620 0,8803 0,8814 0,8933 0,9055 0,8557 0,8917 Haydariye 0,1336 0,0837 0,0909 0,1758 0,0383 0,1149 ***** 0,9347 0,9026 0,9829 0,9567 0,9424 0,9429 0,9595 0,9673 0,9153 Narlı 0,1310 0,1256 0,1234 0,1626 0,0737 0,1406 0,0675 ***** 0,9383 0,9254 0,9548 0,9252 0,9323 0,9437 0,8944 0,9002 Narlı Çev. 0,1632 0,1481 0,1412 0,1823 0,1146 0,1664 0,1025 0,0637 ***** 0,9000 0,9334 0,9384 0,9490 0,9357 0,8637 0,9102 Fıstıklı 0,1334 0,1169 0,0968 0,2046 0,0348 0,1485 0,0172 0,0775 0,1054 ***** 0,9618 0,9376 0,9399 0,9385 0,9861 0,9136 KarayollarıK 0,1125 0,1213 0,1015 0,1376 0,0536 0,1275 0,0443 0,0463 0,0689 0,0390 ***** 0,9694 0,9565 0,9562 0,9163 0,9246 Armutlu 0,1243 0,1205 0,0975 0,1743 0,0608 0,1263 0,0593 0,0778 0,0636 0,0644 0,0311 ***** 0,9628 0,9352 0,9039 0,9214 Kapaklı Çev. 0,1264 0,0922 0,0674 0,1751 0,0761 0,1128 0,0588 0,0701 0,0523 0,0620 0,0445 0,0379 ***** 0,9651 0,9013 0,9196 Kapaklı 0,0822 0,0730 0,0607 0,1249 0,0516 0,0992 0,0414 0,0580 0,0665 0,0635 0,0448 0,0670 0,0355 ***** 0,9227 0,9441 Gündoğdu 0,1255 0,0853 0,1028 0,1899 0,0429 0,1558 0,0333 0,1116 0,1465 0,0140 0,0875 0,1010 0,1039 0,0804 ***** 0,9180 Kumyaka 0,1129 0,0740 0,0520 0,1621 0,0691 0,1146 0,0885 0,1051 0,0941 0,0904 0,0784 0,0819 0,0838 0,0575 0,0856 ***** 20 4.4. ISSR Çalışması Analiz Sonuçları ve Polimorfik Bölgelerin Değerlendirilmesi Verbascum bomyciferum Boiss. türünün 82 örneği, bireyler arasında incelenediğinde Karayolları Kampı Çevresi 5 ve Ağlaşan 6 yakınlık gösterirken, Fıstıklı 3 ve Narlı 1 bireylerinin de genotipsel olarak en yakın mesafeyi koruduğu ortaya koyulmuştur. Bu sonuç coğrafi konumu desteklemekle birlikte Şekil 4.2’deki dendrogramda gözlenmektedir. Gündoğdu bölgesinden toplanan Gündoğdu 2’nin ise diğer bireylere en uzak genetik kimliğe sahip olduğu bulunmuştur. Verbascum bomyciferum Boiss. türüne ait popülasyonlar Orhaneli Baraj Çevresi, Misi, Çalı-Atlas, Dışkaya, Ağlaşan, Kumla, Haydariye, Narlı, Narlı Çevresi, Fıstıklı, Karayolları Kampı Çevresi, Armutlu, Kapaklı Çevresi, Gündoğdu ve Kumyaka- Mudanya lokasyonlarından toplanmıştır (bkz. Çizelge 3.1). Nei 1978 tarafsız sonuçlara göre genetik kimlik ölçümü en fazla 0,9861 ile Fıstıklı ve Gündoğdu popülasyonlarında görülmüştür. En az genetik kimlik ölçümü ise 0,8270 (Nei 1978) ile Gündoğdu ve Dışkaya popülasyonları arasında olduğu belirlenmiştir. Sonuçlar Şekil 4.4’te verilen dendrogramda detaylı olarak gözlenmiştir. Popülasyon düzeyinde Kapaklı Çevresi ve Kapaklı 0,9651 genetik kimlik değeri ile kendi içinde benzerlik gösterirken, Armutlu ve Karayolları Kampı Çevresi de 0,9694 genetik kimlik düzeyi ile coğrafi konumdaki yakınlığıyla örtüşmüştür. Misi ve Çalı- Atlas bölgesi de 0,9769 değeri ile popülasyonlar arası benzerliğinde ikinci sırada yer alarak coğrafi konumunu doğrulamıştır. Dışkaya popülasyonunun ana kümeden ayrılarak, genetik olarak diğer popülasyonlara daha uzak olduğu gözlenmiştir. Bu sonuç, dendrogramda gözlenmesiyle birlikte PCA (Principal Component Analysis) haritasında da doğrulanmıştır (Şekil 4.6). 21 Şekil 4.2. Verbascum bomyciferum Boiss. bireylerine ait UPGMA metodu ile çizilen bireyler arası dendrogram 22 Şekil 4.3. Verbascum bomyciferum Boiss. bireylerine ait UPGMA metodu ile çizilen bireyler arası dendrogram radyal dağılımı 23 Şekil 4.4. Verbascum bomyciferum Boiss. popülasyonlarına ait UPGMA metodu ile çizilen popülasyonlar arası dendrogram 24 Şekil 4.5. Verbascum bomyciferum Boiss. popülasyonlarına ait UPGMA metodu ile çizilen popülasyonlar arası dendrogram radyal dağılımı 25 Polimorfik alellerin yüzdesi (PBB%), gözlenen alel numarası (Na), alel efektiflik numarası (Ne), Nei’ ye göre genetik çeşitlilik (H), Shannon bilgi indeksi (I), toplam genetik çeşitlilik (Ht), popülasyonlar arası genetik çeşitlilik (Hs), Nei’ ye göre popülasyonlar arasındaki genetik farklılaşma indeksi (Gst), popülasyonlar arasındaki tahmini gen akışı (Nm) Popgen32 programı ile tespit edilmiştir. Bu sonuçlara ait genel durum Çizelge 4.5 ve Çizelge 4.6’da verilmiştir. Çizelge 4.5. Verbascum bomyciferum Boiss.’e ait popülasyon içi genetik çeşitlilik ve popülasyonlar arası genetik farklılaşma parametreleri Popülasyon Na Ne H I Polimorfik PPB% Adı Bant Sayısı OrhaneliB 1,6744 1,4494 0,2569 0,3789 58 67,44 Misi 1,5814 1,3493 0,2049 0,3075 50 58,14 Çalı-Atlas 1,5698 1,3428 0,2036 0,3058 49 56,98 Dışkaya 1,4651 1,3151 0,1810 0,2669 40 46,51 Ağlaşan 1,6628 1,3520 0,2146 0,3285 57 66,28 Kumla 1,4535 1,2771 0,1611 0,2410 39 45,35 Haydariye 1,4767 1,2877 0,1704 0,2559 41 47,67 Narlı 1,6860 1,4110 0,2348 0,3512 59 68,60 Narlı Çevresi 1,5000 1,3028 0,1763 0,2639 43 50,00 Fıstıklı 1,4767 1,2295 0,1457 0,2270 41 47,67 KarayollarıK 1,6512 1,4204 0,2399 0,3557 56 65,12 Armutlu 1,6047 1,3739 0,2184 0,3262 52 60,47 Kapaklı Çev. 1,5930 1,3876 0,2221 0,3289 51 59,30 Kapaklı 1,7209 1,4050 0,2378 0,3604 62 72,09 Gündığdu 1,5698 1,2509 0,1638 0,2592 49 56,98 Kumyaka 1,6279 1,3462 0,2081 0,3169 54 62,79 Ortalama 1,5821 1,3438 0,2025 0,3046 50,06 58,21 Popülasyon 2,000 1,4650 0,2881 0,4480 86 100 Düzeyi Her popülasyonun kendi bireyleri içinde genetik parametreleri incelendiğinde polimorfik bant yüzdesi % 45,35 ile % 72,09 arasında değiştiği ve ortalama polimorfik bant yüzdesinin % 58,21 olduğu tespit edilmiştir. Kapaklı popülasyonu 62 adet polimorfik bant ile en yüksek polimorfik bant yüzdesine sahip olmuştur. Yüksek genetik varyasyon gösteren Verbascum bomyciferum Boiss. için popülasyonlar arası Na, Ne, H ve I sonuçları sırasıyla 2,000, 1,4650, 0,2881 ve 0,4480 bulunmuştur (Çizelge 4.5). 16 popülasyonun popülasyonlar arası polimorfizmi % 100 olarak Popgen32 programı tarafından hesaplanmıştır. 26 Verbascum bomyciferum Boiss.’e ait popülasyon içi gözlenen alel numarası (Na) 1,7209 ile 1,4535 arasında ve ortalaması 1,5821 olarak belirlenmiştir. Alel efektivite numarası (Ne) 1,2295 ile 1,4494 ve ortalaması 1,3438’dir. Nei’ye göre genetik çeşitlilik (H) en az Fıstıklı 0,1457 ve en fazla 0,2399 değeri ile Karayolları Kampı Çevresi’nde görülmüş olup ortalamaları 0,2025’tir. Shannon bilgi indeksi (I) 0,3789 ve 0,2270 arasındadır ve ortalaması 0,3046 olarak belirlenmiştir. % 45,35 ile Kumla popülasyonu popülasyonlar arası en düşük genetik varyasyonu gösterirken, Kapaklı ve Narlı popülasyonları %72,09 ile % 68,60 en yüksek genetik çeşitliliği göstermiştir. Çizelge 4.6. Verbascum bomyciferum Boiss.’e ait toplam genetik çeşitlilik ve toplam genetik farklılaşma değerleri Popülasyon Ht Hs Gst Nm Düzeyi Toplam 0,2880 0,2025 0,2970 1,1833 Değerler Toplam genetik çeşitlilik (Ht) ve popülasyonlar arası genetik çeşitlilik (Hs) sırasıyla, 0,2880 ve 0,2025 bulunmuştur. Nei’ ye göre popülasyonlar arasındaki genetik farklılaşma indeksi (Gst) 0,2970 olarak belirlenirken, popülasyonlar arasındaki tahmini gen akışı (Nm) 1,1833 değerinde tespit edilmiştir (Çizelge 4.6). 27 NarliCev 0.23 Diskaya Narli 0.11 KapakliCev Armutlu KarayollariK Kapakli OrhaneliB Kumla Kumyaka Coord. 2 -0.01 CaliAtlas Misi Aglasan Haydariye -0.14 Fistikli Gundogdu -0.26 -0.17 -0.06 0.06 0.18 0.30 Coord. 1 Şekil 4.6. Verbascum bomyciferum Boiss. popülasyonları arasında PCA (Principal Component Analysis) gösterimi 28 5. SONUÇ Yapılan araştırmada Marmara Bölgesi’ndeki çeşitli alanlardan toplanan 82 adet Verbascum bombyciferum Boiss. bireyi ve bunlardan oluşan 16 popülasyon moleküler markör tekniklerinden ISSR kullanılarak karakterize edilmiştir. Orhaneli Baraj Çevresi, Misi, Çalı-Atlas, Dışkaya, Ağlaşan, Kumla, Haydariye, Narlı, Narlı Çevresi, Fıstıklı, Karayolları Kampı Çevresi, Armutlu, Kapaklı Çevresi, Gündoğdu ve Kumyaka- Mudanya lokasyonlarından Verbascum bombyciferum Boiss. yaprak örnekleri alınmıştır. Yapraklardan elde edilen DNA’lar jel elektroforezinde yürütüldükten sonra elde edilen bantlar 1 ve 0 olarak skorlanmıştır. Skorlama sonrasında bireyler ve popülasyonlar arası genetik mesafeler belirlenerek genetik çeşitlikleri saptanmıştır. Elde edilen genetik mesafe matrisinden yararlanılarak bireyler ve popülasyonlar için dendrogramlar oluşturulmuştur. 82 adet Verbascum bombyciferum Boiss. bireyinin oluşturduğu dendrogram incelendiğinde, Ağlaşan 6 ve Karayolları Kampı Çevresi 5’in en yakın genetik mesafede olduğu saptanmıştır. Fıstıklı 3 ve Narlı 1 bireyleri de kendi arasında aynı yakınlığı göstermiştir. Genotipsel olarak en uzak mesafede Gündoğdu 2 bireyi tespit edilmiştir. Popülasyona ait dendrograma bakıldığında Ağlaşan, Haydariye, Fıstıklı ve Gündoğdu birinci grup, Orhaneli Baraj Çevresi, Misi, Çalı-Atlas ve Kumyaka ikinci grup, Narlı, Narlı Çevresi, Karayolları Kampı Çevresi, Armutlu, Kapaklı Çevresi ve Kapaklı popülasyonları üçüncü grup olarak belirlenmiş ve bu popülasyonların Kumla bölgesinden yayılış gösterdiği sonucuna varılmıştır. Coğrafik olarak en uzak olan popülasyon Dışkaya olup, genotipsel olarak da dendrogram üzerinde doğrulanmıştır. Fıstıklı ve Gündoğdu popülasyonlarının en yakın genotipte olduğu gözlenmiştir. Ağlaşan bölgesi coğrafik olarak Dışkaya bölgesine yakın olmasına rağmen, genotipik olarak Haydariye, Fıstıklı ve Gündoğdu popülasyonları ile daha fazla yakın mesafede yer almıştır. 29 Nei’ye göre genetik çeşitlilik (H) değeri en yüksek Orhaneli Barajı Çevresi’nde tespit edilmiştir. Bu değer heterozigotluğun en yüksek olduğu yer olup Verbascum bombyciferum Boiss. türünün Orhaneli Barajı Çevresi’nden orjinlendiğini düşünmemize sebep olmuştur. Atasal harita belirlemek ve genetik varyasyonu tespit etmek için sıkça kullanılan ISSR yöntemi, Verbascum bombyciferum Boiss. türü ile yapılan bu çalışmada da bireyler ve popülasyonlara ait genetik çeşitlilik hakkında detaylı bilgi vermiştir. 13 ISSR primeri belirlenerek kullanılan programda uygulanan UPGMA metodu (Ağırlıklı olmayan çift grup yöntemi) dizi çiftlerinin en benzer mesafe matrisine dayanıp aritmetik ortalamayı tespit ederek dendrogram çizilmesine kolaylık sağlamıştır. Çalışmada kullanılan ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) yöntemi Verbascum bombyciferum Boiss. türü için yapılan ilk genetik analiz olmuştur. Moleküler markör tekniklerinden olan ISSR yönteminin, Verbascum’un bir çok değişik türünde genetik çeşitlilik ortaya çıkarma çalışmalarında da başarıyla kullanılabileceği tespit edilmiştir. Bu çalışma ile son zamanlarda daha seyrek rastlanan Verbascum bombyciferum Boiss. türünün neslini çoğaltmak için yapılacak ıslah programlarına katkıda bulunacağı düşünülmüştür. Bu çalışmanın halk arasında bazı tedavi yöntemlerinde uygulanan Verbascum bombyciferum Boiss. ile ilgili yapılması muhtemel gen ekspresyon analizleri için temel çalışma olacağı ön görülmüştür. 30 KAYNAKLAR Aytaç, Z., Duman, H. 2012. Verbascum hasbenlii (Scrophulariaceae), a new species from Turkey. Turk J Bot, 36: 322-327. Boissier, E. 1867. Flora Orientalis. Geneve, 1068 pp. Çenil, T. 2007. Bursa ve çevresinde yayılışı olan Verbascum L. türleri üzerinde morfolojik ve taksonomik araştırmalar. Yüksek Lisans Tezi, Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Bursa. Daşkın, R. 2001. Bursa Şehir Florası. Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek lisans tezi, Bursa. Davis, P. H., Mill, R. R., Tan, K. 1965. Flora Of Turkey and the East Aegean Islands. Edinburg University Press, Edinburg, 567 pp. Dülger, B., Kırmızı, S., Arslan, H., Güleryüz, G. 2002. Antimicrobial Activity of Three Endemic Verbascum Species. Pharmaceutical Biology, 40: 587-589. Heywood, V.H. 1993. Flowering Plants of the World. Oxford University Press, New York. Huber-Morath, A. 1971. Die Türkishchen Verbasceen. Swiss, 166 pp. Huber-Morath, A. 1978. Verbascum L. In: Flora of Turkey and the East Aegean Islands, Ed.: Davis, P.H., Edinburgh Univ. Press, Edinburgh, pp: 461-603. Joshi, S.P., Gupta, V.S., Aggarwal, R.K., Ranjekar, P.K., Brar, D.S. 2000. Genetic diversity and phylogenetic relationship as revealed by inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism in the genus Oryza. Theor. Appl. Genet., 100: 1311–1320. Karakus, M. 2016. Bursa harita. http://s5.photobucket.com/user/karakus/library/bursa%20harita?sort=2&page=1 (Erişim tarihi: 28.03.2016). Karavelioğulları, F. A. 2004. Türkiye Verbascum’ları (A Grubu) revizyonu. Doktora Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara. Karavelioğulları, F. A., Yavru, A., Çelik, S., Başer, B. 2011. Verbascum ergin- hamzaoglui (Scrophulariaceae), a new species from South Anatolia, Turk J Bot, 35: 275-273. Kesawat, M.S., Das, B.K. 2009. Molecular Markers: It's Application in Crop Improvement. J. Crop Sci. Biotech., 12(4): 169-181. Linnaeus, C. 1753. Species Plantarum. Geneve, Switzerland, 560 pp. 31 Mehrotra, R. 1989. Verbacoside: A New Luteolin Glycoside From Verbascum thapsus. Journal of Natural Products, 52(3): 640-643. Milligan, S.B., J. Bodeau, J., Yahoobi, I. Kaloshian, P. Zabel, and V.M. Williamson 1998. The root knot nematode resistance gene Mi from tomato is a member of the Leucine Zipper, Nucleotide Binding, Leucine-Rich repeat family of plant Genes. The Plant Cell. 10: 1307-1319. Murberck, S. 1925. Monographie Der Gattung Celsia. Acta Universitatis Lunddensis,. 22(1): 1-239. Murberck, S. 1933. Monographie Der Gattung Verbascum. Acta Universitatis Lunddensis, 29(2): 1-630. Rossi, M., Goggin F.L., Milligan S.B., Kaloshian I., Ullman D.E., Williamson V.M. 1998. The nematode resistance gene Mi of tomato confers resistance against the potato aphid. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 9750-9754. Thomas, J., Vijayan, D., Joshi, S.D., Lopoz, J.S., Kumar, R.R. 2006. Genetic integrity of somaclonal variants in tea (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) as revealed by inter simple sequence repeats. Journal of Biotechnology. 123(2): 149-154. Türker, A.U., Camper, N. D. 2002. Biological activity of common mullein, a medical plant. Journal of Ethnopharmacology, 82: 117-125. Türker, A.U., Gürel, E. 2005. Common mullein (Verbascum thapsus L.) recent advances in research. Phytotherapy Research, 19(9): 733-9. Uysal, H., Aksakal, Ö., Aşkın, H. 2012. Developmental disorders caused by Verbascum speciosum Schrad. Extracts in Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 3(2): 7-11. 32 EKLER EK 1 Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait genetik çeşitlilik parametreleri EK 2 Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait genetik farklılık parametreleri 33 EKLER EK 1: Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait genetik çeşitlilik parametreleri ============================================================ Alel Örnek na* ne* h* I* Sayısı ============================================================ 1 82 2.0000 1.6397 0.3901 0.5788 2 82 2.0000 1.9908 0.4977 0.6908 3 82 2.0000 1.3009 0.2313 0.3929 4 82 2.0000 1.9958 0.4989 0.6921 5 82 2.0000 1.9741 0.4934 0.6866 6 82 2.0000 1.1098 0.0990 0.2050 7 82 2.0000 1.8804 0.4682 0.6610 8 82 2.0000 1.1452 0.1268 0.2485 9 82 2.0000 1.7263 0.4207 0.6116 10 82 2.0000 1.9993 0.4998 0.6930 11 82 2.0000 1.5552 0.3570 0.5424 12 82 2.0000 1.9773 0.4943 0.6874 13 82 2.0000 1.7605 0.4320 0.6235 14 82 2.0000 1.8449 0.4580 0.6505 15 82 2.0000 1.5618 0.3597 0.5454 16 82 2.0000 1.2116 0.1747 0.3177 17 82 2.0000 1.0573 0.0542 0.1273 18 82 2.0000 1.5036 0.3349 0.5175 19 82 2.0000 1.7266 0.4208 0.6117 20 82 2.0000 1.3929 0.2821 0.4558 21 82 2.0000 1.1555 0.1346 0.2602 22 82 2.0000 1.3276 0.2468 0.4125 23 82 2.0000 1.7570 0.4309 0.6223 24 82 2.0000 1.0525 0.0499 0.1190 25 82 2.0000 1.1274 0.1130 0.2273 26 82 2.0000 1.3204 0.2427 0.4073 27 82 2.0000 1.0708 0.0661 0.1492 28 82 2.0000 1.1568 0.1356 0.2617 29 82 2.0000 1.3547 0.2618 0.4312 30 82 2.0000 1.0418 0.0401 0.0998 31 82 2.0000 1.1437 0.1256 0.2468 32 82 2.0000 1.2352 0.1904 0.3392 33 82 2.0000 1.8582 0.4619 0.6545 34 82 2.0000 1.2144 0.1766 0.3204 35 82 2.0000 1.1399 0.1227 0.2423 36 82 2.0000 1.3082 0.2356 0.3984 37 82 2.0000 1.0260 0.0253 0.0686 38 82 2.0000 1.0826 0.0763 0.1671 39 82 2.0000 1.2083 0.1724 0.3146 40 82 2.0000 1.1007 0.0915 0.1927 41 82 2.0000 1.1751 0.1490 0.2814 42 82 2.0000 1.7210 0.4189 0.6097 34 43 82 2.0000 1.4552 0.3128 0.4921 44 82 2.0000 1.1171 0.1049 0.2144 45 82 2.0000 1.2063 0.1710 0.3127 46 82 2.0000 1.1166 0.1044 0.2137 47 82 2.0000 1.1951 0.1632 0.3017 48 82 2.0000 1.0832 0.0768 0.1679 49 82 2.0000 1.6824 0.4056 0.5955 50 82 2.0000 1.9475 0.4865 0.6796 51 82 2.0000 1.5203 0.3422 0.5258 52 82 2.0000 1.8357 0.4553 0.6477 53 82 2.0000 1.4807 0.3246 0.5058 54 82 2.0000 1.7318 0.4226 0.6136 55 82 2.0000 1.9861 0.4965 0.6896 56 82 2.0000 1.9852 0.4963 0.6894 57 82 2.0000 1.9456 0.4860 0.6791 58 82 2.0000 1.1892 0.1591 0.2959 59 82 2.0000 1.4771 0.3230 0.5038 60 82 2.0000 1.4145 0.2930 0.4688 61 82 2.0000 1.7955 0.4431 0.6351 62 82 2.0000 1.5488 0.3543 0.5394 63 82 2.0000 1.3515 0.2601 0.4290 64 82 2.0000 1.0819 0.0757 0.1660 65 82 2.0000 1.9459 0.4861 0.6792 66 82 2.0000 1.4399 0.3055 0.4836 67 82 2.0000 1.8362 0.4554 0.6478 68 82 2.0000 1.4306 0.3010 0.4782 69 82 2.0000 1.2886 0.2239 0.3835 70 82 2.0000 1.5149 0.3399 0.5232 71 82 2.0000 1.3492 0.2588 0.4275 72 82 2.0000 1.4386 0.3049 0.4828 73 82 2.0000 1.5312 0.3469 0.5311 74 82 2.0000 1.8461 0.4583 0.6509 75 82 2.0000 1.9850 0.4962 0.6894 76 82 2.0000 1.3652 0.2675 0.4381 77 82 2.0000 1.3929 0.2821 0.4558 78 82 2.0000 1.3246 0.2450 0.4103 79 82 2.0000 1.2427 0.1953 0.3458 80 82 2.0000 1.1878 0.1581 0.2945 81 82 2.0000 1.2667 0.2105 0.3661 82 82 2.0000 1.6730 0.4023 0.5920 83 82 2.0000 1.7909 0.4416 0.6336 84 82 2.0000 1.3690 0.2696 0.4406 85 82 2.0000 1.3947 0.2830 0.4568 86 82 2.0000 1.2929 0.2265 0.3868 Mean 82 2.0000 1.4650 0.2881 0.4480 St. Dev 0.0000 0.3061 0.1439 0.1792 ============================================================ * na = Observed number of alleles * ne = Effective number of alleles [Kimura and Crow (1964)] * h = Nei's (1973) gene diversity * I = Shannon's Information index [Lewontin (1972)] 35 EK 2: Verbascum bombyciferum Boiss. türüne ait genetik farklılık parametreleri ============================================================ Alel Örnek Ht Hs Gst Nm* sayısı ============================================================ 1 82 0.3968 0.2103 0.4700 0.5638 2 82 0.4996 0.2234 0.5529 0.4044 3 82 0.2452 0.1049 0.5723 0.3736 4 82 0.4975 0.3127 0.3715 0.8460 5 82 0.4948 0.4094 0.1726 2.3970 6 82 0.1015 0.0928 0.0862 5.3033 7 82 0.4674 0.3478 0.2559 1.4539 8 82 0.1302 0.1100 0.1550 2.7260 9 82 0.4166 0.3131 0.2485 1.5122 10 82 0.4998 0.2368 0.5262 0.4503 11 82 0.3490 0.2422 0.3061 1.1334 12 82 0.4986 0.1015 0.7964 0.1278 13 82 0.4474 0.3201 0.2845 1.2575 14 82 0.4644 0.3536 0.2386 1.5957 15 82 0.3573 0.2360 0.3394 0.9733 16 82 0.1715 0.1466 0.1452 2.9431 17 82 0.0486 0.0377 0.2239 1.7328 18 82 0.3317 0.2602 0.2158 1.8172 19 82 0.4194 0.3525 0.1596 2.6333 20 82 0.3080 0.1447 0.5302 0.4431 21 82 0.1223 0.0900 0.2637 1.3961 22 82 0.2456 0.1981 0.1934 2.0854 23 82 0.4286 0.2502 0.4163 0.7010 24 82 0.0455 0.0421 0.0734 6.3086 25 82 0.1145 0.0759 0.3370 0.9836 26 82 0.2508 0.1873 0.2532 1.4745 27 82 0.0589 0.0476 0.1907 2.1221 28 82 0.1458 0.1303 0.1063 4.2017 29 82 0.2676 0.2059 0.2307 1.6677 30 82 0.0498 0.0406 0.1858 2.1912 31 82 0.1298 0.1117 0.1396 3.0822 32 82 0.1833 0.1470 0.1978 2.0280 33 82 0.4678 0.3348 0.2842 1.2590 34 82 0.1592 0.1309 0.1778 2.3124 35 82 0.1175 0.1071 0.0879 5.1882 36 82 0.2350 0.1938 0.1756 2.3471 37 82 0.0238 0.0217 0.0862 5.2986 38 82 0.0856 0.0749 0.1248 3.5073 39 82 0.1923 0.1658 0.1378 3.1293 40 82 0.1032 0.0796 0.2289 1.6846 41 82 0.1485 0.1293 0.1293 3.3657 42 82 0.4065 0.2603 0.3597 0.8900 43 82 0.3345 0.2648 0.2083 1.9000 44 82 0.1218 0.0947 0.2231 1.7413 45 82 0.1580 0.1205 0.2372 1.6084 36 46 82 0.0925 0.0763 0.1748 2.3607 47 82 0.1470 0.1242 0.1551 2.7239 48 82 0.0724 0.0623 0.1392 3.0919 49 82 0.3842 0.2572 0.3306 1.0126 50 82 0.4818 0.3048 0.3673 0.8612 51 82 0.3529 0.2276 0.3550 0.9083 52 82 0.4542 0.3263 0.2815 1.2759 53 82 0.3196 0.2503 0.2170 1.8045 54 82 0.4169 0.3460 0.1701 2.4393 55 82 0.4969 0.4112 0.1725 2.3980 56 82 0.4945 0.3978 0.1955 2.0571 57 82 0.4884 0.3038 0.3780 0.8228 58 82 0.1507 0.1349 0.1052 4.2527 59 82 0.3072 0.1763 0.4262 0.6731 60 82 0.2758 0.2119 0.2319 1.6565 61 82 0.4434 0.3847 0.1324 3.2762 62 82 0.3420 0.2597 0.2407 1.5769 63 82 0.2545 0.1977 0.2234 1.7377 64 82 0.0741 0.0658 0.1114 3.9886 65 82 0.4809 0.3345 0.3044 1.1428 66 82 0.3033 0.2293 0.2438 1.5506 67 82 0.4622 0.1979 0.5719 0.3743 68 82 0.3007 0.2382 0.2079 1.9051 69 82 0.2236 0.1801 0.1944 2.0724 70 82 0.3314 0.2938 0.1135 3.9059 71 82 0.2411 0.1927 0.2008 1.9906 72 82 0.3106 0.1791 0.4233 0.6813 73 82 0.3596 0.2085 0.4202 0.6900 74 82 0.4480 0.2650 0.4086 0.7236 75 82 0.4900 0.2663 0.4565 0.5954 76 82 0.2527 0.1806 0.2853 1.2523 77 82 0.2834 0.2460 0.1318 3.2948 78 82 0.2404 0.2208 0.0815 5.6312 79 82 0.1942 0.1699 0.1254 3.4885 80 82 0.1558 0.1163 0.2537 1.4710 81 82 0.2229 0.1841 0.1741 2.3725 82 82 0.4133 0.2872 0.3052 1.1381 83 82 0.4515 0.3285 0.2724 1.3357 84 82 0.2976 0.1841 0.3814 0.8108 85 82 0.2911 0.1526 0.4757 0.5511 86 82 0.2246 0.1767 0.2134 1.8434 Mean 82 0.2880 0.2025 0.2970 1.1833 St. Dev 0.0208 0.0094 ============================================================ * Nm = estimate of gene flow from Gst or Gcs. E.g., Nm = 0.5(1 - Gst)/Gst; See McDermott and McDonald, Ann. Rev. Phytopathol. 31:353-373 (1993). The number of polymorphic loci is : 86 The percentage of polymorphic loci is : 100.00 37 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : MERVE GÜVEN Doğum Yeri ve Tarihi : BURSA, 1988 Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Ertuğrulgazi Lisesi (YDA) /2002-2006 Lisans : Ege Üni. F.E.F. Biyokimya B. / 2007-2012 Yüksek Lisans : U.Ü. F.B.E. Moleküler Biyoloji ve Genetik A.B.D Moleküler Genetik B.D /2013-2017 Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl : SORANUS Tüp Bebek Merkezi / 2013-2014 SERRA Biyoteknoloji ve Laboratuvar Ürünleri İthalat İhracat San. ve Tic. Ltd. Şti. / 2015-2016 İletişim (e-posta) : merveyasar160788@gmail.com 38