T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI ALKOL BAZLI EL ANTİSEPTİKLERİNİN ULUSAL/ULUSLARARASI STANDARTLAR İLE İN VİVO VE İN VİTRO DEĞERLENDİRİLMESİ Dr. Tuncay TOPAÇ UZMANLIK TEZİ Bursa-2013 T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ TIBBİ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI ALKOL BAZLI EL ANTİSEPTİKLERİNİN ULUSAL/ULUSLARARASI STANDARTLAR İLE İN VİVO VE İN VİTRO DEĞERLENDİRİLMESİ Dr. Tuncay TOPAÇ Danışman: Prof. Dr. Cüneyt ÖZAKIN UZMANLIK TEZİ Bursa-2013 İÇİNDEKİLER Türkçe Özet……………………………………………………………...ii İngilizce Özet……………………………………………………………iii Giriş……………………………………………………………………….1 Gereç ve Yöntem.……………………………………………………..27 Bulgular…………………………………………………………………...47 Tartışma ve Sonuç………………………..……………………………80 Kaynaklar……………………………………..………………………...85 Teşekkür…………………………………………………………….......90 Özgeçmiş………………………………………………....……………...91 i ÖZET Hastane enfeksiyonlarının önlenmesi ile ilgili en önemli unsurlar arasında el hijyeni yer almaktadır. El hijyeni el yıkama yanı sıra antiseptiklerin ele uygulanması ile de sağlanmaktadır. El hijyenini sağlamak üzere hastanelerde yaygın kullanım alanı bulan alkol bazlı antiseptiklerin etkililiğini değerlendirmeye yönelik çeşitli standartlar bulunmaktadır. EN1500 standardı Avrupa’da kullanılan en yaygın standart olup Türk Standartları Enstitüsü tarafından da aynen kabul edilerek yürürlüğe konmuştur. Çalışmamızda beş adet ticari el antiseptiği ve Dünya Sağlık Örgütü tarafından önerilen el antiseptik formülasyonu-II’nin etkililiği 3 ml x 30 saniye x 1 ve 3 ml x 30 saniye x 2 uygulama şekilleri için EN1500 standardı ile değerlendirilmiştir. 3 ml x 30 saniye x 1 şeklinde uygulandığında test edilen antiseptiklerin hiçbiri standardın gereğini sağlayamamıştır. 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulandıklarında bütün antiseptikler EN1500 standardını sağlamaktadır. Etiketlerinde genellikle 3 ml x 30 saniye x 1 şeklinde uygulanmaları önerilen alkol bazlı el antiseptiklerinin uygulama süreleri uzatılmalı ya da 30 saniyede etkinlik sağlamak isteniyorsa alkol oranı daha yüksek el antiseptikleri kullanılmalıdır. Anahtar Kelimeler: EN1500, hijyenik el antisepsisi, DSÖ formülasyon-II, antimikrobiyal etkililik. ii SUMMARY IN VIVO AND IN VITRO EVALUATION OF ALCOHOL-BASED HAND ANTISEPTICS BY NATIONAL/INTERNATIONAL STANDARDS Hand hygiene is among the most important measures in preventing hospital acquired infections. Hand hygiene is achieved through hand washing as well as application of antiseptics to hands. There are various standards on the evaluation of the efficacy of alcohol-based antiseptics that are in widespread use in hospitals. The EN1500 standard is the most commonly used standard in this field in Europe and has also been accepted in its entirety and entered into force by the Turkish Standards Institution. In our study, efficacies of five commercially available hand antiseptics as well as that of the hand antiseptic Formulation-II suggested by the World Health Organization have been evaluated with the EN1500 standard for the 3 ml x 30 seconds x 1 and 3 ml x 30 seconds x 2 application patterns. When applied in the 3 ml x 30 seconds x 1 pattern, none of the tested antiseptics has been able to meet the requirements of the standard. When applied in the 3 ml x 30 seconds x 2 pattern, all the tested antiseptics meet the requirements of the EN1500 standard. The application times of the alcohol-based hand antiseptics, which are generally recommended to be applied in a 3 ml x 30 seconds x 1 pattern in product labeling, should be extended, or if achieving efficiency within 30 seconds is desired, hand antiseptics with high alcohol content should be used. Key Words: EN1500, hygienic hand antisepsis, WHO formulation-II, antimicrobial efficacy. iii GİRİŞ Çok sayıda çalışma mikroorganizmaların hastane ortamına ve hastalara yayılmasında sağlık çalışanlarının ellerinin çok önemli bir araç olduğunu göstermiştir (1). El hijyenine uyum hastane kökenli enfeksiyonların önlenmesinde vazgeçilmez bir faktör olarak değerlendirilmektedir. Yeterli el hijyeni, standart önlemlerin bir parçası olmasının yanı sıra katater ilişkili dolaşım enfeksiyonları, katater ilişkili idrar yolu enfeksiyonları, cerrahi alan enfeksiyonları, ventilatör ilişkili pnömoni gibi spesifik bölge enfeksiyonlarının önlenmesine yönelik yaklaşımlarda da önemle vurgulanmaktadır (2). Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) tarafından hazırlanan sağlık hizmetlerinde el hijyeni konulu 2009 yılı kılavuzunda (1) el hijyeninin uygulanması gereken durumlar şu şekilde belirtilmiştir: 1) Hastaya direkt temastan önce ve sonra, 2) Hasta bakımı için invazif bir araç kullanmadan önce (eldiven kullanılsın ya da kullanılmasın), 3) Vücut sıvı ve atıkları, müköz membranlar, sağlam olmayan deri ve pansuman malzemelerine dokunduktan sonra, 4) Bakım sırasında hastanın kontamine vücut bölgesinden temiz vücut bölgesine geçerken, 5) Hastanın hemen yakınındaki cansız yüzeyler ve nesnelere (medikal ekipman dahil) temastan sonra, 6) Steril ya da steril olmayan eldivenleri çıkardıktan sonra. El hijyeni el yıkama şeklinde uygulanabileceği gibi el antiseptikleri ile el ovalama şeklinde de uygulanabilir. “El yıkama” basit ya da antiseptik içeren sabun ve suyla ellerin yıkanması olarak tanımlanırken “antiseptik el ovalama”, suya, sabuna, durulamaya ve havlu ile kurutmaya ihtiyaç duymadan el antiseptiklerinin kullanılarak mikroorganizmaların azaltılması olarak tanımlanmıştır. Antiseptik, canlı dokulardaki mikroorganizmaları 1 inaktive eden ya da üremelerini inhibe eden antimikrobiyal madde olarak tanımlanır. Dezenfektan terimi ise cansız yüzeyler için kullanılmaktadır. Bununla birlikte bazı ülkelerde “el antiseptikleri” yerine “el dezenfektanları” isimlendirmesi yaygın olarak kullanılmaktadır. El antisepsisi, hijyenik el antisepsisi ve cerrahi el antisepsisi olarak ikiye ayrılmaktadır. Hijyenik el antisepsisi tanımı ellerdeki geçici floranın, kalıcı florayı etkilemeksizin azaltılması amacıyla uygulanan el yıkama ya da el ovalama işlemleri olarak tanımlanmaktadır. Cerrahi el antisepsisi ise ameliyat öncesi cerrahi ekibin ellerindeki geçici florayı ortadan kaldırmak ve kalıcı florayı azaltmak amacıyla uygulanan işlem olarak tanımlanmıştır. Cerrahi el antisepsisi antiseptikli sabun ve suyla el yıkama şeklinde yapılabileceği gibi el antiseptikleri ile ovalama şeklinde de uygulanabilmektedir. Hijyenik el ovalamadan farklı olarak uygulama süreleri daha uzundur. DSÖ kılavuzunda yer alan konsensüs raporunda ellerin görünür olarak kirli olduğu, kan ve vücut sıvıları bulaştığı durumlarda, tuvaleti kullandıktan sonra ve Clostridium difficile salgınlarında olduğu gibi ispatlanmış ya da muhtemel spor oluşturan patojen maruziyetinde ellerin su ve sabunla yıkanması önerilmekte, bunlar dışında kalan rutin el antisepsisi uygulamalarında ise tercihan alkol bazlı el antiseptikleri ile el ovalama önerilmektedir. Sağlık çalışanlarının el hijyenine uyumunu azaltan faktörler içerisinde yer alan, uygun yerleşimli ve yeterli sayıda lavabo bulunmaması, kağıt havlu ve sabun teminindeki sıkıntılar el yıkama uygulaması ile ilişkili dezavantajlardır (3). El antiseptiklerinin içerdiği alkolün neden olduğu cilt kuruluğu, ürünlerin içine katılan yumuşatıcı, nemlendirici ajanlarla ortadan kaldırılabilmekte ya da azaltılabilmektedir. Bu tür ajanlar içeren el antiseptiklerinin sabunla el yıkamaya göre ellerde daha az tahriş ve kurumaya yol açtığı rapor edilmiştir (4,5). Ayrıca el hijyenine uyumu azaltan faktörlerden bir diğeri olan personelin zaman kısıtlılığı ve aşırı iş yükü dikkate alındığında el antiseptiklerinin nispeten kısa uygulama süreleri ve kolay ulaşılabilirliği uygulamanın bir başka avantajıdır. 2 El yıkama işleminde kullanılan su, sabun ve kağıt havlunun kontaminasyon riski bulunmaktadır. Sartor ve ark. (6) hastanede kullanılan kontamine sıvı sabundan kaynaklanan bir Serratia marcescens salgınını rapor etmişlerdir. Çalışmalarında kontamine sabunla el yıkama sonrası sağlık personelinin ellerinin S marcescens ile 54 kat fazla kontamine olduğunu göstermişlerdir. Caetano ve ark. (7) Brezilya’daki bir hastanede analiz ettikleri 55 sıvı sabun dispenserinden 33’ünün Burkholderia cepacia, Pseudomonas putida , Pseudomonas aeruginosa , Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae ve Pseudomonas luteola ile kontamine olduğunu ve dispenserlerin doldurulmasında kullanılan orijinal ambalajındaki bir sabunda da kontaminasyon varlığını göstermişlerdir. Diğer taraftan alkol bazlı solüsyonların kontaminasyonu da rapor edilmiştir. Hsueh ve ark. (8) içki fabrikasından temin edilen kontamine etanole bağlı nozokomiyal Bacillus cereus psödoepidemisini rapor etmişlerdir. Nasser ve ark. (9) bir üniversite hastanesinde 1993-2000 yılları arasında, 361 hastada saptanmış olan B cepacia’ ya bağlı kan dolaşım enfeksiyonlarını araştırmışlardır. Polimeraz zincir reaksiyonu-restriction fragment length polymorphism yöntemiyle kaynağın katater takılacak hastaların cilt antisepsisini sağlamak için hazırlanan alkolün sulandırılmasında kullanılan musluk suyu olduğunu göstermişlerdir. Bacillus gibi bakterilerin sporlarının alkol içeren solüsyonlarda yaşayabildiği bilinmekle birlikte sporsuz bir bakteri olan B cepacia’nın bir suşunun %70 alkol içeren kaplarda yaşayabilmesi dikkate değer bir bulgudur. I. El Antiseptikleri El antiseptikleri alkoller, diğer antiseptikler ve alkoller ve diğer antiseptiklerin kombinasyonu şeklinde sınıflandırılabilir. 3 I.1. Alkoller El antiseptiklerinin çoğunluğu alkol olarak etanol, izopropanol, n- propanol ya da bunların ikili kombinasyonlarını içermektedir (Şekil-1). Ürünlerin içerdiği alkol konsantrasyonları hacim yüzdesi (ml/100 ml, v/v), ağırlık yüzdesi (g/100 g, m/m) ya da ağırlık/hacim yüzdesi (g/100 ml, m/v) şeklinde ifade edilmektedir. Şekil-1: Antiseptik solüsyonlarda yer alan alkol türleri. Tablo-1’de etanol, n-propanol ve izopropanolün çeşitli konsantrasyonları hacim ve ağırlık yüzdesi şeklinde karşılaştırılmıştır. Hacim yüzdesi değeri, sıcaklık ve reaksiyon konsantrasyonu gibi değişkenlerden etkilenmekteyken ağırlık yüzdesi değeri bu değişkenlerden etkilenmemektedir. Örneğin ağırlıkça yüzde 70’lik etanol, 15ºC’de hazırlandığında hacimce %76,8’a karşılık gelirken, 25ºC’de hazırlandığında %80,5’e karşılık gelmektedir (1). Ayrıca, karışımlarda oluşan hacim kontraksiyonu nedeniyle alkol solüsyonlarının üretiminde alkol hacmi yerine ağırlığının esas alınması önerilmektedir (10). 4 Tablo-1: Aköz etanol, propan-2-ol, ve propan-1-ol’ün ağırlık ve hacim yüzdesi olarak konsantrasyonları (10). Ağırlık 20ºC'de Hacim ( % ml/ml) (% g/g) Etanol Propan-2-ol Propan-1-ol 40 47,4 47 46,5 50 57,8 57 56,5 60 67,7 67,2 66,2 70 76,9 76,5 76,1 80 85,4 85 84,5 90 93,2 93,8 93,5 95 96,7 97,5 97,2 100 100 100 100 20ºC'de Hacim Ağırlık (% g/g) ( % ml/ml) Etanol Propan-2-ol Propan-1-ol 40 33,4 33,5 34 50 42,6 43 43,4 60 52,1 53,7 53,9 70 62,6 62,8 63,5 80 73,4 73,5 74,5 90 85,8 86 86 95 92,5 92,8 93 100 100 100 100 Alkollerin antimikrobiyal etki mekanizması tam olarak anlaşılamamış olmakla birlikte en belirgin etkileri protein denatürasyonu ve koagülasyonuna neden olmalarıdır. Protein denatürasyon ve koagülasyonu sonucu bakteriyel hücre duvarı, hücre membranı ve çeşitli enzimatik proteinlerin yapısı bozulmaktadır. Denatürasyon mekanizması absolü etanolün, suyla karıştırılmış etanole göre daha az bakterisidal aktivite göstermesi gözlemi ile desteklenmektedir, çünkü proteinler su varlığında daha hızlı denatüre olmaktadır (10). Alkollerin düşük konsantrasyonlarda gözlenen bakteriyostatik etkisinin hücre bölünmesi için gerekli metabolitlerin üretimini inhibe etmesi sonucu oluştuğu düşünülmektedir. 5 Alkoller in vitro olarak vejetatif bakterilere karşı belirgin germisidal aktivite göstermektedir. Vankomisin dirençli Enterococcus ve metisilin dirençli Staphylococcus aureus gibi çoklu ilaca dirençli bakteriler de dahil olmak üzere gram-pozitif ve gram negatif bakterilere ve tüberküloz basiline etkili olmalarına rağmen bakteriyel sporlara ve protozoon ookistlerine etkili değillerdir. Bazı araştırıcılar alkol bazlı el antiseptiklerinin yaygın kullanımının Clostridium difficile salgınlarında artışa neden olabileceğini ileri sürmüşlerse de bu iddia şimdiye kadar ispatlanamamıştır (2). Parazitlere karşı etkisizlik, tropikal bölgelerde el yıkama yerine alkol bazlı el antiseptiklerinin kullanımınının yaygınlaştırılmasında bir endişe konusudur. Çünkü el yıkamanın en azından kistleri mekanik olarak uzaklaştırma etkisi bulunmaktadır. Literatürde alkollerin antiviral etkinliği ile ilgili genel bir uzlaşma bulunmamaktadır. Lipofilik, zarflı virüslerin, alkoller ile zarfsız virüslere göre daha kolay inaktive olduğu bilinmektedir (10). Herpes simplex virus, human immunodeficiency virus (HIV), influenza virus, respiratory sinsitial virus (RSV) gibi çeşitli zarflı (lipofilik) virüslerin alkollere karşı in vitro duyarlılığı gösterilmiştir (11-14). Hepatit B virüsü ve muhtemelen hepatit C virüsü gibi diğer bazı zarflı virüsler ise alkollere karşı daha az duyarlıdır (15). Zarfsız virüsler olan adenovirus, rhinovirus ve rotavirus ile Sattar ve ark. (16)’nın yaptığı in vivo bir çalışmada gönüllülerin parmak uçlarının kontaminasyonu sonrası %60 etanol içeren ticari bir antiseptiğin etkisi test edilmiştir. Üç virüsün enfektivite titrelerinde 3-4 log’luk azalma saptanmıştır. Bununla birlikte alkol konsantrasyonuna, süreye ve viral değişkene bağlı olarak alkoller, hepatit A virüsü ve diğer zarfsız virüslere etkisiz olabilir. Schurman ve Eggers (13), zarfsız virüslerin inaktivasyonunun sıcaklık, dezenfektanın viral hacme oranı ve protein yükünden etkilendiğini belirtmiştir. Blaney ve ark. (17) Amerika Birleşik Devletleri (ABD)’nin kuzey-doğu eyaletlerindeki uzun süreli bakım kuruluşlarında Aralık 2006-Mart 2007 döneminde görülen norovirus salgınlarını inceledikleri çalışmalarında alkol bazlı el antiseptiklerini su ve sabuna eşit veya daha fazla kullanan kuruluşlardaki norovirüs oranlarının altı 6 kat daha yüksek olduğunu rapor etmişlerdir. Alkol bazlı antiseptiklerin özellikle zarfsız virüslere etkileri ile ilgili daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Alkoller çeşitli dermatofitler ve mayalara karşı da germisidal etkinliğe sahiptir. Alkoller diğer birçok antiseptikten persistan (rezidüel) etkilerinin olmaması ile ayrılmaktadır. Bununla birlikte cilde uygulandıktan sonra cilt bakterilerinin tekrar üremeleri yavaşlamaktadır. Bu, muhtemelen alkolün bakteriler üzerindeki subletal etkisinden kaynaklanmaktadır (18). Persistan etki sağlanması için alkol bazlı formülasyonlara klorheksidin, kuaterner amonyum bileşikleri, oktenidin veya triklosan eklenmektedir (19). Gaonkar ve ark. (20) nemlendirici olarak oktoksigliserin ve koruyucu içeren alkol bazlı bir antiseptik ürünün sinerjistik etki sonucu geçici patojenlere karşı etkisinin uzadığını raporlamıştır. Alkol bazlı el antiseptiklerinin etkililiği alkolün türü, konsantrasyonu, temas süresi, hacmi ve alkol uygulanırken ellerin ıslak olup olmaması faktörlerine bağlıdır. Alkol türü ve antimikrobiyal etkililik arasında açık bir ilişki olduğu ortaya konmuştur, buna göre n-propanol en etkili türdür ve bunu izopropanol ve etanol takip etmektedir. Hacimce (v/v) %42 n-propanol, %60 izopropanol ve %77 etanolün cilt üzerinde eşdeğer bakterisidal etkinlik sağladığı kabul edilmiştir (19). 20. yüzyılın başında Harrington ve Walker (21), çeşitli bakteriler içeren nemli ve kurutulmuş ipliklerle yaptıkları deneylerde etanolün farklı konsantrasyonlarının etkililiğini test etmişlerdir. Nemli ipliklerdeki E coli, %60- %99 konsantrasyonlarındaki etanol ile 5 dakikadan kısa sürede öldürülmüşken, bakteri uygulandıktan sonra kurutulan ipliklerde sadece %50- 60 konsantrasyonlarında öldürülebilmişlerdir. İpliklerde kurutulmuş olan E coli, P aeruginosa, Staphyolococcus epidermidis ve Staphylococcus aureus, %94-99 konsantrasyonlarındaki etanole 24 saat maruz kalmalarına rağmen öldürülememişlerdir. Bu sonuç denatürasyon için su mevcudiyetinin gerekliliğini göstermektedir. Bununla birlikte el antiseptiklerinde en güçlü ve hızlı antimikrobiyal etki n-propanol ve izopropanol için %100 7 konsantrasyonunda etanol için ise %85-95 konsantrasyonlarında gözlenmektedir. Bunun nedeni ciltteki bakterilerin kuru olmamasıdır. Etanolün en etkili konsantrasyonunun %77 (v/v) olduğu görüşü sadece kuru bakteriler için geçerlidir. Etkili uygulama için alkol konsantrasyonlarının n-propanol için %60, izopropanol için %80 ve etanol için %90’ın altına düşürülmemesi önerilmektedir (10). Alkol bazlı el antiseptiklerinin etkililiği, kullanım miktarı ve süresi ile de ilişkilidir. Larson ve ark. 1 ml alkolün, 3 ml alkolden anlamlı derecede daha az etkili olduğunu raporlamışlardır (22). Alkol bazlı el antiseptiklerinin ellere uygulanması gereken miktar bilinmemektedir ve muhtemelen ürünün içeriğine göre değişebilir. Genel olarak uygulama sonrası 10-15 saniyeden kısa sürede eller kuruyorsa uygulanan miktar yetersiz kabul edilir. Alkoller çok iyi temizleyici ajanlar değildirler ve ellerde gözle görünür kir veya proteinli materyallerin varlığında kullanılmaları önerilmemektedir. I.2. Klorheksidin Klorheksidin ilk olarak 1950’de İngiltere’de proguanil tip sentetik antimalaryal ajanların araştırılması sırasında sentez edilmiş, yüksek düzey antibakteriyel etkinliği, düşük toksisitesi ve cilt ve müköz membranlara güçlü afinitesi nedeniyle topikal antiseptik olarak kullanılmaya başlanmıştır. Klorheksidin normalde suda çok az çözünürken diglukonat tuzu suda kolayca çözünebilmektedir. Katyonik bir bisbiguanid olan klorheksidinin etki mekanizması sitoplazmik membranı bozarak, hücre içeriğinin çökelmesine sebep olması ile ilişkilendirilmiştir (23). Geniş antibakteriyel spektruma sahip olmasına rağmen gram pozitif bakterilere etkisi, gram negatif bakterilerden daha belirgindir. Özellikle bazı Proteus ve Providencia suşlarının klorheksidine yüksek derecede dirençli olduğu gösterilmiştir (24,25). Klorheksidinin sporosidal etkisi bulunmamaktadır. Mikobakterilere yüksek derecede bakteriyostatik etkisi bulunmakla birlikte letal etkisi bulunmamaktadır. Ancak, etanol çözeltileri içinde tüberkülosidal etkisi ve yüksek sıcaklıklarda (98-100ºC) sporosidal etkisi mevcuttur (26). 8 Kan, serum, püy gibi organik materyaller klorheksidinin aktivitesini azaltsa da ciddi bir şekilde etkilemezler. Klorheksidinin katyonik doğasından dolayı aktivitesi, doğal sabunlar, çeşitli inorganik anyonlar, non-iyonik sürfaktanlar tarafından azaltılmaktadır (27). Walsh ve ark. (28) klorheksidin içeren deterjanla el yıkama sonrası kullanılan anyonik emülsifiye edici madde içeren el kremlerinin klorheksidinin antibakteriyel etkisini azalttığını göstermişlerdir. İn vitro olarak Herpes simplex virus, cytomegalovirus, influenza ve RSV gibi zarflı virüslere karşı etkili olmasına rağmen, diğer birçok antiseptikler gibi adenovirus, enterovirus gibi zarfsız virüslere karşı belirgin etkisi yoktur. Montefiori ve ark. (29) %4 klorheksidin içeren el yıkama preparatı ve %70’lik izopropil alkoldeki %0,5’lik klorheksidin çözeltisinin 15 saniye temas süresinde hücre kültüründe üretilen HIV tip I’i %100 inaktive ettiğini göstermişlerdir. Klorheksidinin ani antibakteriyel etkisi alkollerden daha yavaşken, povidon-iyot, triklosan, heksaklorofen ve kloroksilenol içeren benzer preparasyonlardan daha hızlıdır. Klorheksidin; heksaklorofen ve triklosan ile kıyaslanabilir rezidüel etkiye ve özellikle gram negatif bakteriler için daha geniş bakterisidal spektruma sahiptir (27). Alkol bazlı antiseptiklere düşük konsantrasyonlarda katılan (%0,5- %1) klorheksidinin, tek başına alkol içeren solüsyonlara göre rezidüel aktviteyi belirgin olarak arttırdığı raporlanmıştır (30). Bununla birlikte Rotter ve ark. (31) tarafından yapılmış olan bir çalışma bu raporu desteklememektedir. European Norm (EN) 12791 standardı (32) baz alınarak yapılan bu çalışmada cerrahi el antisepsisinde kullanılan, birinde ilaveten klorheksidin, diğerinde ilaveten meketronyum etilsülfat bulunan üç propanol bazlı ürünün bakteriyel popülasyon kinetiği değerlendirilmiştir. Gönüllüler gruplara ayrılarak ellerini 3 dakika süreyle test edilen ürünlerle ovaladıktan hemen sonra cilt florasını oluşturan bakterilerin sayısındaki logaritmik azalmanın hesaplanması için numuneler alınmıştır. Daha sonra rezidüel aktivitenin belirlenmesi için ellere steril eldiven giydirilmiştir. 6 saat sonra eldivenler çıkarılarak tekrar numune alınmış ve cilt florasındaki bakterilerin 9 sayısındaki artış saptanmıştır. Bu artış ürünlerin rezidüel aktivitesi ile ters orantılıdır. Çalışma sonucunda ürünler arasında rezidüel aktivite arasında anlamlı bir fark bulunmamıştır. Araştırmacılar yeterli ani bakterisit etki sağlayacak konsantrasyondaki alkol bazlı süspansiyonlara rezidüel etkiyi arttırmak amacıyla klorheksidin gibi ajanların katılmasının minör bir yarar sağlayacağını vurgulamışlardır. Klorheksidin içeren ve içermeyen solüsyonların propanol tür ve miktarlarının eş olmaması nedeniyle klorheksidin ilavesinin rezidüel etkiyi arttırmadığını ifade etmek hatalı olabilir. Önerilen konsantrasyonlarda kullanıldığında klorheksidine bağlı cilt irritasyonu ve aşırı duyarlılık insidansı düşüktür. %1’in üzerindeki konsantrasyonlarda konjunktivit ve ciddi korneal hasara neden olabileceği için gözle temasından kaçınılmalıdır. Birçok çalışma klorheksidinin ciltten son derece az absorbe olduğunu ya da hiç absorbe olmadığını göstermektedir. Ciltten absorbe edilen klorheksidine bağlı toksisiteyi gösteren bir rapor yayınlanmamıştır (27). I.3. İyot ve iyodoforlar İyodun antiseptik özelliği 1800’lerden beri bilinmekle birlikte, irritan etkisi ve ciltte renk değişikliğine yol açması nedeniyle günümüzde yerini iyodoforlarlara bırakmıştır. İyodoforlar taşıyıcı polimerik organik moleküller ve iyottan oluşmuş bir komplekstir. İçerdiği taşıyıcı moleküllerin en az 3 özelliği olması gerekmektedir: (a) iyot çözünürlüğünü arttırmak, (b) iyodun sürekli salınımını sağlayacak bir rezervuar oluşturmak, (c) serbest moleküler iyodun denge konsantrasyonunu azaltmak. Kullanılan taşıyıcılar arasında en iyi bilineni povidon (polivinilpirolidinon)’dur (Şekil-2). n:m~18 Şekil-2: Katı povidon-iyodun yapısı. 10 İçerdikleri moleküler iyot (serbest iyot) miktarı iyodoforların antimikrobiyal etkisini belirler. “Mevcut iyot” kavramı, iyodoforun içerdiği toplam iyot miktarına karşılık gelmektedir. %10 povidon-iyot çözeltisinin mevcut iyot içeriği %1 iken, sağladığı serbest iyot konsantrasyonu 1ppm’dir (33). İyodoforlar iyoda göre daha az irritasyon ve dermatite neden olurken, el hijyeninde kullanılan birçok ürüne göre daha çok irritan kontakt dermatite neden olmaktadır (34). İyodun antimikrobiyal etkisinden temel olarak mikroorganizmaların hücre duvarına hızla penetre olması sorumludur. Hücre ölümüyle sonuçlanan mekanizmalar içinde muhtemelen en önemlisi iyodun sistein aminoasidinin SH gruplarını okside etmesidir. Bu mekanizma protein zincirlerini birbirine bağlayan disülfit (-S-S-) bağlarının kaybı ve protein sentezinde bozulma ile sonuçlanmaktadır. Muhtemel diğer mekanizmalar DNA denatürasyonuna yol açması ve doymamış yağ asitlerine bağlanarak hücre membran yapısını bozmasıdır (33). Çoğu iyodofor preparasyonu %7,5-10 konsantrasyonlarında povidon iyot içermektedir. Cerrahi hazırlıkta kullanılan ve fırçalama şeklinde uygulanan antimikrobiyal sabunlar bunlar içinde yer almaktadır. Berkelman ve ark.’nın yaptığı çalışmada %10 povidon-iyot içeren preparasyonların 1/100’e kadar çeşitli dilüsyonlarının antibakteriyel etkisi in vitro olarak test edilmiştir. Çalışma sonucunda dilüsyonların bakterisidal etkisinin stok solüsyondan daha hızlı olduğu gözlenmiştir. İyodoforların dilüsyonlarında gözlenen bu atipik davranış, dilüsyonlar arttıkça serbest iyot miktarının da bir noktaya kadar artması ile ilişkilidir (35). İyot ve iyodoforların gram pozitif ve gram negatif bakterilere, tüberküloz basillerine, mantarlara ve virüslere karşı aktivitesi bulunmaktadır (33). Bacillus ve Clostridium sporlarına karşı etkili olmakla birlikte bu etki antiseptiklerde kullanılan konsantrasyonlardan belirgin olarak daha yüksek konsantrasyonlar için geçerlidir (19). İyodoforlar, kan ve balgam gibi organik materyallerin varlığında hızla nötralize olurlar (36,37). 11 İyodoforların persistan aktivitesi ile ilgili yayınlarda nispeten farklı sonuçlara ulaşılmıştır. Ellerin iyodoforla yıkanması sonrası persistan aktivite Paulson ve ark. (38) tarafından 6 saat olarak bulunmuşken, diğer bazı araştırmacılar 30- 60 dakika olarak raporlamışlardır (39,40). Gottardi (41), ellere çeşitli iyot solüsyonları uyguladıktan sonra cillten emilen iyotun geri difüzyonunu fotometrik bir metod ile göstermiştir. Bu metodla 3 ila 5 dakika boyunca povidon-iyot uygulamasını takiben ellerde 0,5 ila 1 saat boyunca absorbe edilen iyotun geri akışını saptayabilmiştir. Araştırmacı, iyotun geri difüzyonu sürdüğü müddetçe cildin derin bölgelerinde aktif bir dezenfeksiyonun meydana geldiğini ve bunun cilt dezenfeksiyonu sahasında kendine özgü bir özellik olduğunu ifade etmektedir. Povidon-iyot solüsyonlarının üretim koşulları nedeniyle gram negatif bakterilerle kontaminasyonu rapor edilmiştir. Berkelman ve ark. (42) New York’ta altı ay boyunca 52 hastayı etkileyen B cepacia psödoepidemisinin %10 povidon iyot solüsyonundan kaynaklandığını raporlamışlardır. I.4. Kuaterner Amonyum Bileşikleri (Kuatlar) Kuatlar, genel yapı olarak 4 alkil radikaline (R1–R4 ) bağlı 5 değerli bir nitrojen atomu ile küçük bir anyondan (X- ) oluşan katyonik yüzey aktif maddelerdir. (Şekil-3) Şekil-3: Kuaterner amonyum bileşiklerinin genel yapısı ve benzalkonyum klorit. Son yıllarda antimikrobiyal etkinliğe sahip çok sayıda kuat piyasaya sunulmuştur. Bu geniş bileşik grubu içinde antiseptik olarak en yaygın kullanım alanı bulan benzalkonyum klorit’tir. Grup içinde antiseptik olarak 12 kullanılan diğer bileşikler içerisinde benzetonyum klorit, setrimid ve setilpridinyum klorit yer almaktadır. Kuatların antimikrobiyal etki mekanizması muhtemelen hücre membranına bağlanmalarını takiben küçük molekül ağırlıklı sitoplazmik yapıtaşlarının geçişine yol açmalarıyla ilişkilidir. Kuatlar, yüksek konsantrasyonlarda bazı organizmalara karşı mikrobisidal aktivite göstermesine rağmen temel olarak bakteriyostatik ve fungostatik ajanlardır (19). Gram pozitif bakterilere, gram negatif basillerden daha etkilidirler. Mikobakterilere ve mantarlara karşı zayıf aktivite gösterirler. Geçmişte yapılan çalışmalarda çok düşük konsantrasyonlarda bile sporosidal ve tüberkülosidal aktivite gösterdiği rapor edilmiş ve üretici firmalar tarafından bu şekilde tanıtılmış olmalarına rağmen Amerikan Resmi Analitik Kimyacılar Birliği (AOAC) tarafından yapılan çalışmalar bu sonuçları doğrulamamıştır. Geçmişte yapılan testlerde kuatların yetersiz nötralizasyonu nedeniyle hatalı sonuçlara ulaşıldığı düşünülmektedir. (43). Kuatların lipofilik virüslere karşı aktivitesi bulunmakla birlikte hidrofilik virüsleri etkilememektedirler. Antimikrobiyal aktiviteleri, organik materyal varlığından etkilenir ve anyonik deterjanlar ile uyumlu değillerdir. Kuatlardan benzalkonyum klorit ve meketronyum etilsülfat bazı ticari alkol bazlı el antiseptiklerine de katılmaktadır. Rotter ve ark. (31), alkol bazlı el antiseptiklerine meketronyum etilsülfat ilavesinin minör bir yarar sağladığını rapor etmişlerdir. Kuatlar genel olarak iyi tolere edilirler ve düşük allerjenik potansiyele sahiptirler. Gram negatiflere karşı zayıf etkinliği nedeniyle bu bakterilerle kontamine olma eğilimi gösteren kuatların neden olduğu enfeksiyon ve psödoenfeksiyon salgınları birçok kez raporlanmıştır (44,45). Hatta, mikrobiyoloji laboratuvarları bir kuat olan setrimidi P aeruginosa izolasyonu için seçici besiyerlerinde kullanmaktadır (46). Japonya ve Avrupa’da toplanan S aureus izolatlarının %6 ile 42’sinde kuatlara direnci gösteren genler tespit edilmiştir (47). 13 I.5. Triklosan Ticari olarak Irgasan DP-300 olarak bilinen triklosan bir bisfenol bileşiğidir (Şekil-4). Suda çok az çözünürken, alkollerde ve anyonik sabunlar gibi çeşitli deterjanlarda iyi çözünmektedir. Triklosan, cerrahi ve hijyenik el antisepsisi için deterjanlara (%0,4-%2), alkollere (%0,2 - 0,5) ve bunlar dışında düşük toksisite ve irritasyon profili nedeniyle deodorant, şampuan, losyon, diş macunu gibi çeşitli kişisel bakım ürünlerine katılmaktadır (26). Şekil-4: Triklosanın yapısı. Triklosanın 10 dakika uygulamada minimim inhibitör konsantrasyonu (MİK) 0,1-10 µg/ml aralığında iken minimum bakterisidal konsantrasyonu (MBK) 25-500 µg/ml aralığında olup temel olarak bakteriyostatik etkilidir. Gram pozitifler bakterilere etkisi, gram negatif basillere etkisinden daha fazladır. Özellikle Pseudomonas aeruginosa’ya karşı etkisi zayıf olup, birçok suşun inhibisyonu için 100-1000 µg/ml konsantrasyonları gerekmektedir. Candida türlerine karşı iyi fungistatik (10 µg/ml) ve fungisidal (25 µg/ml, 10 dakika) aktivite gösterirken, Aspergillus gibi çeşitli küflere karşı zayıf aktivite (MİK: 100 µg/ml) göstermektedir (19). Triklosan nozokomiyal öneme sahip birçok virüse karşı yeterli etkiye sahip değildir. Triklosanın antimikrobiyal özelliği sitoplazmik membrana ve yağ asidi, RNA ve protein sentezi üzerine olan etkileriyle ilişkilendirilmiştir. Düşük konsantrasyonlarda yağ asidi sentezinde görevli olan enoil asil-taşıyıcı protein redüktaz enzimini spesifik olarak inhibe etmekteyken (48), yüksek 14 konsantrasyonlarda membranın yapısının bozulması ile ilişkili daha genel etkilere neden olmaktadır. Düşük konsantrasyonlarda gözlenen tek hedefe yönelik etkisi, triklosanı birden çok hedefe yönelen diğer birçok antiseptikten ayırmaktadır. Triklosanın inhibe ettiği enzimin benzeri mikobakterilerde mikolik asit sentezinde de yer almakta olup izoniazidin hedefini oluşturmaktadır. Bu nedenle triklosanın aşırı kullanımı sonucu antibiyotiğe dirençli suşların yayılabileceği endişesi raporlanmıştır (49-51). Triklosan ayrıca P aeruginosa ’daki çoklu ilaç efflux pompaları için de bir substrattır (52). Laboratuvarda gözlenen triklosan MİK değeri yüksek izolatların klinik önemi bilinmemektedir. Bu bakteriler triklosanın kullanım konsantrasyonlarına duyarlıdırlar. Bununla birlikte yaygın kullanım alanı bulan triklosanın antibiyotik direnci ile ilişkisini saptamaya yönelik ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Triklosanın aktivitesi, organik materyalden önemli derecede etkilenmez. Bazı formülasyonlara katılan polisorbat 80 (Tween 80) gibi bazı etoksilli sürfaktanlar triklosanı misel yapısı içinde hapsederek etkisini engelleyebilirler (19). I.6. Kloroksilenol Para-kloro-meta-ksilenol (PCMX) olarak da bilinen kloroksilenol bir klorofenol bileşiğidir (Şekil-5). Birçok kozmetik üründe koruyucu olarak ve antimikrobiyal sabun ve el ovalama preparatlarında aktif madde olarak kullanılmaktadır. Suda yeterli derecede çözünebilirken, alkali solüsyonlar ve organik çözücülerdeki çözünürlüğü daha yüksektir. Sıklıkla uygun sabun çözeltilerinde terpineol ya da çam terebentini ile birlikte çözdürülür. Antimikrobiyal özelliği bakteriyel enzimleri inaktive etmesi ve hücre duvarı değişikliklerine sebep olması ile ilişkilendirilimiştir (19). Şekil-5: Kloroksilenolün yapısı. 15 Gram pozitif bakterilere, gram negatiflerden daha etkilidir. Solüsyonlarına etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) eklenmesi özellikle Pseudomonas türlerine ve diğer patojenlere karşı etkisini arttırır (53). Sporosidal değildir ve tüberküloz basili, bazı mantarlar ve virüslere karşı ortalama etkinliğe sahiptir (54,55). Genel olarak yüzeylerdeki bakterilerin süspansiyon içindeki bakterilere göre antimikrobiyallere daha dirençli olduğu bilinmektedir. Ancak Bloomfield ve ark. (56), kloroksilenolün yüzeydeki P aeruginosa’ya süspansiyondakinden daha etkili olduğunu göstermişlerdir. Das ve ark. (57) S epidermidis ve E coli’nin yüzeyde ve süspansiyonda kloroksilenolden eşit derecede etkilendiğini raporlamışlardır. Kloroksilenolün antimikrobiyal etkisinin organik materyal varlığından etkilendiği (26) bildirildiği gibi, bu etkinin minimal olduğunu bildiren yayınlar da (19) vardır. Son yıllarda yapılmış, sağlık çalışanlarının kullanımına yönelik kloroksilenol preparatları ile ilgili yayın sayısı çok azdır. Bu çalışmalardan da elde edilen sonuçlar bazen çelişkili olmuştur. I.7. Heksaklorofen Bir bisfenol bileşiği olan heksaklorofenin %3’lük solüsyonu 1950’ler ve 1960’ların başında el antisepisisinde ve bakımevleri ve hastanelerde bebeklerin rutin banyosunda sık olarak kullanılmıştır. 1970’lerin başında heksaklorofenle yıkanan bebekler ve rutin olarak heksaklorofenle ellerini yıkayan bakım personelinin kanlarında 0.1-0.6 ppm düzeylerinde heksaklorofen saptanmış ve bazı bebeklerde nörotoksisiteye yol açtığı gösterilmiştir (58,59). Amerikan İlaç ve Gıda Dairesi (FDA) tarafından hazırlanan Geçici Nihai Monograf (60)’ta antiseptik el yıkama ürünlerinde kullanım için heksaklorofenin genel olarak güvenli ve etkili bir antiseptik olmadığı bildirilmiştir. Heksaklorofen günümüzde dünya çapında yasaklanmıştır. 16 II. El Antiseptiklerinin Antimikrobiyal Etkililiğinin Test Edilmesi Sağlık kuruluşlarında yaygın kullanım alanı bulan alkol bazlı el antiseptik ürünlerinin seçimi için DSÖ konsensüs raporunda dikkate alınması önerilen faktörlerden biri ürünün rölatif olarak etkili olmasıdır. Etkililik (efficacy) kavramı el hijyeni formülasyonlarının laboratuvarda ya da in vivo olarak test edilen potansiyel etkisine karşılık gelirken, etkinlik (effectiveness) kavramı saha deneylerinde olduğu gibi bir formülasyonun kullanımının patojenlerin geçişinde azalma, çapraz bulaşma hızlarında düşme gibi parametreler dikkate alınarak klinik koşullarda değerlendirilmesi olarak tanımlanmıştır (1). Antiseptik ve dezenfektanların değerlendirilmeleri için birçok metod denenmiştir. Bunları test organizmasına göre; bakteri, mikobakteri, spor, fungus, virüslere karşı ve etki mekanizmalarına göre; –sidal ve –statik testler olarak sınıflandırmak mümkündür. Ancak uygun nitelikteki laboratuvarlar tarafından tekrar edilebilir ve karşılaştırılabilir sonuçlara ulaşmak için metodların detaylı olarak tanımlandığı standartlara ihtiyaç duyulmuştur. Amerikan Resmi Analitik Kimyacılar Birliği (AOAC), Alman Hijyen ve Mikrobiyoloji Cemiyeti (DGHM), Fransız Standardizasyon Birliği (AFNOR), Alman Veterinerlik Cemiyeti (DVG) ve İngiliz Standardizasyon Enstitüsü (BSI) gibi çeşitli kuruluşlar dezenfektanların test edilmesine yönelik çeşitli metodlar yayınlamışlardır. Dezenfektan ve antiseptiklerin test edilmesi sahasında en önemli gelişme 1990’da Avrupa Standardizasyon Komitesi (CEN) tarafından “TC216 Kimyasal Dezenfektanlar ve Antiseptikler” isimli teknik komitenin kurulmasıdır. TC216’nın faaliyet alanı “terminoloji ve gerekliliklerin standardizasyonu, kullanım koşulları altındaki potansiyel etkiyi de içeren test metodları, kimyasal dezenfektan ve antiseptiklerin bütün kullanım alanlarındaki kullanılış ve etiketlenme önerileri.” olarak belirtilmiştir. TC216’da dezenfektanların kullanıldığı alanlara göre üç çalışma grubu bulunmaktadır. Grup 1 tıp, grup 2 veterinerlik ve grup 3 yiyecek hijyeni ve evsel ve kurumsal kullanım alanları ile ilgilenmektedir (61). Tıp alanında kullanılan antiseptik ve 17 dezenfektanların test edilmesine yönelik standart test metotları Tablo-2’de gösterilmiştir. Dezenfektan ve antiseptik ürünlerin değerlendirilmesinde kullanılan test metodları TC216 tarafından 3 faza ayrılmıştır (62): Faz 1 testleri bir ürünün kullanım amacına özgü şartlar dikkate alınmaksızın bakterisidal, fungisidal veya sporosidal aktivitesinin değerlendirildiği kantitatif süspansiyon testleridir. Faz 2 testler iki adım içerir: Faz 2 adım 1 testleri bir ürünün kullanım amacına uygun pratik şartlar simüle edilerek bakterisidal, fungisidal, mikobakterisidal, sporosidal, veya virüsidal aktivitesinin değerlendirildiği kantitatif süspansiyon testleridir. Faz 2 adım 2 testleri ise bir ürünün gerçek kullanım şartlarındaki bakterisidal, fungisidal, mikobakterisidal, sporosidal veya virüsidal aktivitesinin değerlendirildiği kantitatif testlerdir. Adım 1’den farklı olarak bunlar süspansiyon testi olmayıp, yüzey ve enstrüman dezenfektanları, el yıkama ve el ovalama ajanları ve benzerlerinin test edildiği yüzeylerin, kontamine nesnelerin ya da gönüllülerin ellerinin kullanıldığı laboratuvar testleridir. Faz 3 testleri ise yukarıda tanımlanan “etkinlik” ile ilişkili saha çalışmalarıdır. Bu tür testler için geçerli bir metodoloji henüz bulunmamaktadır. 18 Tablo-2: CEN, Tıbbi alan – Standart test metotları (62). Aktivite türü Ürünün tip ve/veya Faz, amacı adım Bakterisidal Fungisidal Mikobakterisidal Virüsidal Sporisidal Legionella Hij yenik el yıkama 2,1 prEN12054 *** *** EN14476 *** 2,2 EN1499 *** *** *** *** Hij yenik el ovalama 2,1 prEN12054 *** *** EN14476 *** 2,2 EN1500 *** *** ** *** Cerrahi el ovalama ve el y ıkama 2,1 prEN12054 *** *** *** *** Cerrahi el dez enfeksiyonu 2,2 EN12791 *** *** *** *** Yü zey dezenfeksiyonu 2,1 ** ** EN14348 EN14476 ** Te miz ve kirli koşullar 2,2 ** ** ** * ** En strüman dezenfeksiyonu 2,1 EN13727 EN13624 EN14348 EN14476 * Te miz ve kirli koşullar 2,2 EN14561 EN14561 prEN14563 * * Su arıtma 2,1 *** *** *** *** *** * *Çalışma onaylandı. **Henüz onaylanmış çalışma yok, fakat gelecekte ilişkili standartlar ortaya konabilir. ***Bir test geliştirilmesi planlanmıyor. 19 II.1. İn Vitro Bakterisidal Testler Süspansiyon testleri belirli hacimdeki bakteri süspansiyonunun test edilecek konsantrasyondaki bir antiseptik içine eklendikten sonra tanımlanmış süreler sonunda karışımdan bir kısım alınarak bakterinin ölüp ölmediğinin belirlenmesi esasına dayanır. Bu testler karışımdan alınan kısımda üreme var ya da yok şeklinde kalitatif olarak değerlendirilebileceği gibi canlı kalan mikroorganizmaların sayısının saptanarak başlangıç bakteri sayısı ile karşılaştırılması yoluyla kantitatif olarak da değerlendirilebilir (61). Kalitatif süspansiyon testlerine örnek olarak dezenfektan aktivitesinin fenol ile karşılaştırıldığı fenol katsayısı testleri verilebilir (Şekil-6). Şekil-6: Rideal-Walker testi ile fenol katsayısının belirlenmesi (61). 20 El antiseptiklerinin test edilmesinde kantitatif süspansiyon testleri kullanılmaktadır. Bu testlerde antiseptik maruziyeti sonrası canlı kalan hücrelerin sayılması için iki teknik kullanılmaktadır. Direkt kültür ya da membran filtrasyon tekniği. Direkt kültür tekniğinde test süresi sonunda antiseptik-bakteri karışımından alınan kısım ve/veya dilüsyonları solid besiyerlerine aktarılır. Yayma plak yöntemi ile ekim yapılarak inkübasyon sonrası canlı kalan hücreler sayılır. Başlangıç inokulumundaki bakteri sayısı da uygun dilüsyonlar yapılarak aynı şekilde belirlenir. Yayma plak yerine dökme plak yöntemi de uygulanabilir. Başlangıç ve test süresi sonunda canlı kalan bakteri sayılarının logaritmaları arasındaki fark logaritmik azaltma faktörü veya mikrobisidal ya da germisidal etki olarak tanımlanmaktadır. Direkt kültür tekniği kullanıldığında belirlenen süre sonunda antiseptik etkiyi durdurmak için uygun nötralizan ya da inaktivatörün kullanılması gerekmektedir. Dilüsyon nötralizasyon yöntemi olarak da bilinen bu yöntemde nötralizasyonun geçerliliğinin ve mikroorganizma üzerinde toksik etkisi olmadığının ayrıca gösterilmesi gerekir. Uygun nötralizanın bulunamadığı durumlarda membran filtrasyon tekniği kullanılabilir. Bu teknikte belirlerlenen süre sonunda antiseptik-bakteri karışımı bir membrandan filtre edilir ve takiben steril fizyolojik salinle yıkanarak antiseptiğin uzaklaştırılması sağlanır. Membranda kalan bakteriler sayılır. Yöntem duyarlı olmakla birlikte bazı yüzey aktif özellikteki antiseptiklerin uzaklaştırılması problemli olabilir (61). Ovalama şeklinde uygulanan el antiseptikleri ve antimikrobiyal el yıkama ürünlerinin değerlendirilmesi için CEN tarafından geliştirilmiş olan kantitatif süspansiyon testi “prEN12054” (Kimyasal dezenfektanlar ve antiseptikler-Tıpta kullanılan hijyenik ve cerrahi el ovalama ve el yıkama ürünlerinin bakterisidal aktivitesinin değerlendirilmesi için kantitatif süspansiyon testi, test metodu ve gereklilikler)’dir (63). Faz 2, adım 1 sınıfında yer alan bu standartta el ovalama ajanları için 1 dakika ve gerekirse 30 saniyelik temas süresi sonunda bakteri sayısında en az 5 log bir azalma olması şart koşulmuştur. Standartta dilüsyon-nötralizasyon ve membran filtrasyon yöntemlerinin prosedürleri ve validasyonları ayrı ayrı 21 tanımlanmıştır. Test bakterileri S aureus, P aeruginosa, E coli K12 ve Enterococcus hirae’nin standart suşlarıdır. ABD’de el antiseptikleri ile ilgili standart test metotları FDA tarafından hazırlanmakta ve American Society for Testing and Materials (ASTM) standartları olarak isimlendirilmektedir. FDA tarafından yayınlanan Geçici Nihai Monograf’ta (60) el antiseptiklerinin in vitro test edilmesi için zaman- öldürme testi önerilmektedir. prEN12054 metodu ile benzer prensipte olmasına rağmen bu testin temel farkı klinik izolatları da içeren çok sayıda bakteriyel suşun test edilmesidir. II.2. İn Vivo Bakterisidal Testler Hijyenik ve cerrahi el antiseptiklerinin test edilmeleri için ayrı in vivo standartlar kullanılmaktadır. Hijyenik el antisepsisinde sağlık çalışanlarının ellerindeki kontaminan bakterilerin uzaklaştırılması hedeflenmektedir ve persistan aktivite önem taşımaz. Cerrahi el antisepsisinde ise kontaminan bakterilere ek olarak kalıcı cilt florasının da mümkün olduğunca azaltılması hedeflenmektedir ve ürünün persistan aktivitesi önem taşımaktadır. II.2.1. Hiyenik el antiseptiklerine yönelik in vivo standartlar Hijyenik el yıkama ve el ovalama ürünlerinin değerlendirilmesi için CEN tarafından hazırlanmış olan standartlar sırasıyla; EN1499 (Hijyenik el yıkama-Test metodu ve gereklilikler) ve EN1500 (Hijyenik el ovalama-Test metodu ve gereklilikler)’dir (64,65). Bu standartlar faz 2 adım 2 sınıfında yer alan ve gönüllülerin katılımıyla gerçekleştirilen in vivo testlerdir. EN1499 ve EN1500 standartlarında eldeki kontaminan bakterileri temsilen katılımcıların elleri antiseptik ovalama ya da yıkama maddesinin uygulanmasından önce E coli K12 standart suşundan hazırlanan bir süspansiyon ile yapay olarak kontamine edilmektedir. Yapay kontaminasyon sonrası eldeki başlangıç bakteri sayısının belirlenmesi için ilk numuneler alınır. Antiseptik maddenin uygulanmasından sonra elde canlı kalan bakteri sayısının belirlenmesi için son numuneler alınır. Bu standartlarda dilüsyon nötralizasyon metodu kullanılmaktadır. EN1500 standardı on iki ila on beş gönüllünün katılımıyla gerçekleştirilmektedir. Test edilen ürünün referans antiseptik olan %60 (v/v) 22 izopropanol ile karşılaştırılması için bütün katılımcılar hem referansı hem de test edilen ürünü denerler. Her bir katılımcıdan referans ve ürün için elde edilen logaritmik azaltma faktörlerinin istatistiksel olarak karşılaştırması yapılır. Katılımcıların sağ ve sol elleri için logaritmik azaltma faktörleri ayrı ayrı hesaplanarak metodun istatistiksel kesinliği arttırılmaktadır. Bir ürünün testi geçebilmesi için etkisinin referanstan anlamlı olarak düşük olmaması gerekmektedir. Avrupa’da yaygın kullanılan bu standartların yerine ABD’de şu standartlar kullanılmaktadır: ASTM E1174-13 (Sağlık Personeli El Yıkama Formülasyonlarının Etkliliğini Değerlendirmek İçin Standart Test Metodu), ASTM E2755-10 (El Arındırıcı [sanitizer] Formülasyonların Bakteri Giderici Etkisinin Erişkinlerin Elleri Kullanılarak Belirlenmesi İçin Standart Test Metodu), ASTM E2276-10 (Hijyenik El Yıkama ve El Ovalama Ajanlarının Bakteri Giderici Etkisinin Erişkinlerin Parmak Uçları Kullanılarak Belirlenmesi İçin Standart Test Metodu). El yıkama ajanlarının test edildiği E1174 ve el ovalama ajanlarının test edildiği E2755 standartlarında da EN1500 standardında olduğu gibi ellerin yapay olarak bakteriyel kontaminasyonunu takiben test edilen materyalin uygulanması sonrasında ellerde canlı kalan bakteri sayısının tespiti yapılmakta ve uygulama öncesi değerle karşılaştırılmaktadır. Bu iki standardın EN1500’ten temel farkı logaritmik azaltma faktörü değerlerinin birinci kontaminasyon-antiseptik uygulama siklusundan sonra ve aynı siklus tekrar edilerek onuncu siklustan sonra da belirlenmesidir. Onuncu siklustan sonra elde edilen logaritmik azaltma faktörü test edilen ürünün tekrarlayan kullanımı sonucu oluşacak etkiyi göstermektedir. Bu iki standartta test edilen ürünler bir referans ürünle karşılaştırılmazlar, birinci ve onuncu siklusun sonunda elde edilen logaritmik azaltma faktörlerinin belirlenen değerin altına inmemesi şartı aranmaktadır. E2755’te E1174’ten farklı olarak ellerin kontaminasyonu için uygulanan bakteri süspansiyonunun yoğunluğu arttırılarak hacmi azaltılmıştır. Böylece kontamine edilen ellerin antiseptik el 23 ovalama ajanı uygulanmadan önce hemen kuruması ve ajanın dilüsyonuna neden olmaması hedeflenmiştir. E2276 metodunda el ovalama ve el yıkama ajanlarının test edilmesi için ellerin bütünü değil sadece parmak uçları kullanılmaktadır. Bakteri süspansiyonu küçük hacimlerde parmak uçlarının pulpa kısmının ortasına pipetle uygulanmaktadır. Çok daha küçük ve belirli bir alanın kontamine edilmesi teste katılan gönüllüler açısından daha az risk taşımaktadır. II.2.2. Cerrahi El Antiseptiklerine Yönelik İn Vivo Standartlar Cerrahi el ovalama ve el yıkama ajanlarının test edilmesinde ellerdeki kontaminan bakteriler ve geçici floranın ortadan kaldırılmasına ilaveten kalıcı floranın da makul düzeyde azaltılması gerekmektedir. Cerrahi ajanların test edildiği standartlarda bu nedenle eller yapay olarak kontamine edilmeyip mevcut cilt florasında ajanların uygulanması sonrası ne kadar azalma olduğu değerlendirilmektedir. CEN cerrahi öncesi uygulanan ovalama antiseptiklerinin test edilmesi için EN12791 (Cerrahi el dezenfeksiyonu-test metodu ve gereklilikler) standardını önermektedir (32). Bu standartta test edilen ürün ile belirlenen sürede (en fazla 5 dakika) elde edilen bakterisidal etki, referans süspansiyon olan %60’lık izopropanol ile 3 dakikada elde edilen bakterisidal etkiden anlamlı derecede daha yüksek olmalıdır. Kalıcı floradaki azalma esas alındığı için, referans ve ürünün testleri arasında katılımcıların ellerindeki kalıcı floranın normal düzeye gelmesi için bir hafta beklenir. Standartta opsiyonel olarak 3 saat sonraki persistan aktivite de gösterilebilmektedir. Cerrahi amaçlı fırçalama şeklinde kullanılan ürünlerin test edilmesi için FDA tarafından ASTM E1115 standardı hazırlanmıştır. Ürünün kalıcı flora üzerindeki ani ve persistan aktivitesi değerlendirilmektedir. El antiseptiklerinin bakterisidal etkileri dışında fungusidal ve virüsidal etkilerinin değerlendirilmesine yönelik standartlar da mevcuttur. Bu standartların özeti Tablo-3’te sunulmuştur. 24 Tablo-3: El antiseptiklerinin virüsidal ve fungusidal etkilerini değerlendirmeye yönelik standartlar. Metot Test Organizması Temel Prosedür ASTM E1838 Adenovirus, rotavirus, rhinovirus 10 mikrolitre virüs süspansiyonu her bir parmak ucuna uygulanır. Virüsler için parmak ucu metodu ve hepatit A virüsü İnokulum kuruduktan sonra 10-30 saniye süre ile 1ml test formülasyonu ya da kontrol uygulanır. Takiben parmak uçlarından canlı virüs sayısının tespiti için numune alınır. Başlangıç virüs titresi, inokulumun kuruması sırasındaki kayıp ve virüsün mekanik uzaklaştırılmasını değerlendirmek için kontroller uygulanır. Metod el ovalama ve el yıkama ürünlerinin değerlendirilmesi için uygundur. ASTM E2011 Rotavirus ve rhinovirus Bu metod, gerektiğinde parmak ucu metodunun (E1838) Virüsler için "bütün el" metodu doğrulanması için tasarlanmıştır. Her iki el virüslerle kontamine edilir ve takiben test formülasyonu uygulanır (el yıkama ya da el ovalama ürünü). Her iki elin bütün yüzeyinden alınan numunede canlı virüs sayısı tespit edilir. ASTM E2613 Candida albicans, Aspergillus ASTM E1838'e benzer Mantarlar için parmak ucu metodu niger EN14476 Adenovirus tip 5, Poliovirus tip 1 Ürün süspansiyonu, virüs süspansiyonuna eklenir. İstenen Virüsler için kantitatif süspansiyon testi reaksiyon süresi sonunda karışımdan bir kısım alınarak virüsidal aktivitesi nötralize edilerek canlı virüs sayısı tespit edilir. El ovalama ve el yıkama ürünlerinin yanı sıra yüzey ve enstrüman dezenfektanlarının test edilmesi için de uygulanan in vitro bir testtir. 25 Hijyenik el ovalama ürünlerinin değerlendirilmesine yönelik CEN tarafından hazırlanan bir standart olan EN1500, Türk Standartları Enstitüsü (TSE) tarafından da aynen kabul edilerek 2001 yılında yürürlüğe konmuştur. Araştırmalarımızda EN1500 standardı ile ilgili Türkiye’de yapılmış çalışmaya rastlanmamıştır. Ülkemizde, sağlık kuruluşlarına antiseptik alımı sırasında ihale teknik şartnamelerinde sunulması istenmesine rağmen yukarıda söz edilen standardı test eden merkez bulunmamaktadır. Tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarında, EN1500 standardının önerdiği testlerin, piyasadan temin edilen beş adet antiseptik ürün ve DSÖ tarafından önerilen el ovalama formülasyonu II ile uygulanarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Ürünler öncelikle prEN12054 standardı ile in vitro olarak test edildikten sonra EN1500 standardı ile değerlendirilmiştir. 26 GEREÇ VE YÖNTEM Çalışma için Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Araştırmalar Etik Kurulu’ndan 26 Mart 2013 tarih ve 2013-6/5 sayılı karar ile izin alınmıştır. Çalışmaya katılan gönüllüler laboratuvar personelimiz arasından seçilmiştir. Gönüllülere çalışma hakkında bilgi verilerek, çalışmaya katılmayı kabul edenlerin bilgilendirilmiş gönüllü olur formlarını doldurmaları ve onaylamaları istenmiştir. I. Kullanılan Bakteriler prEN12054 metodunda Escherichia coli K12 NCTC 10538, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Enterococcus hirae ATCC 10541 ve Pseudomonas aeruginosa ATCC 35032 suşları kullanılmıştır. EN1500 metodunda ise sadece E coli K12 NCTC 10538 kullanılmıştır: II. Test Edilen Antiseptikler Çalışmamızda piyasadan temin edilen beş adet antiseptik ürün ve DSÖ kılavuzu tarafından önerilmiş olan formülasyon-II (DSÖ-II) test edilmiştir. Piyasadan temin edilen ürünler çalışmamızda markalarından bağımsız, içeriklerine özgü olarak A, B, C, D ve E harfleri ile ifade edilmiştir. Formülasyon-II DSÖ kılavuzunda belirtildiği şekilde laboratuvarda hazırlanmıştır. Test edilen antiseptik ürünlerin içerdiği aktif maddeler Tablo- 4’te gösterilmiştir. Formülasyon-II’nin hazırlanışı: 1000 ml hacimli cam balon içerisine 715,5 ml %99,5 izopropil alkol (Merck, Almanya), 41,7 ml %3 H2O2 (Bikar, Türkiye) ve 14,5 ml %99,8 gliserol (Prolabo, Fransa) eklendikten sonra distile su ile hacim 1000 ml’’ye tamamlandı. Karıştırıldıktan sonra 1000 ml hacimli ışık geçirmez özellikte kapaklı bir cam şişeye aktarıldı. 27 EN1500 standardında tanımlanan referans solüsyonun hazırlanışı: Cam bir balona, 600 ml izopropil alkol eklendikten sonra distile su ile hacim 1000 ml’ye tamamlandı. Karıştırıldıktan sonra 1000 ml hacimli ışık geçirmeyen kapaklı bir cam şişeye aktarıldı. Tablo-4: Test edilen antiseptik ürünlerin içerdiği aktif maddeler. Antiseptikler Aktif maddeler A* %70 2-propanol. %60 (m/m) 2-propanol, B %0,15 (m/m) benzalkonyum klorür, %0,1 (m/m) Undesilenik asit. %75 (v/v) 2-propanol, DSÖ-II %0,125 (v/v) Hidrojen Peroksit (%3). C %70 (v/v) 2-propanol. %70 (v/v) etil alkol, D %10 (v/v) 2-propanol. E %63,14 (m/m) 2-propanol. m/m: Ağırlıkça yüzde, v/v: Hacimce yüzde. * : Hacim ya da ağırlık yüzdesi belirtilmemiştir. III. Kullanılan Cihazlar Derin dondurucu -20ºC (Bosch, Almanya) Etüv (Nüve EN 120, Türkiye) Otoklav (Nüve OT 4060 V, Türkiye) Nefelometre cihazı ( BD PhoenixSpec, ABD) Elektronik tartı (Shimadzu AUW220 D, Japonya) 28 Medikal su arıtma cihazı (RentRO 2000, Kros, Türkiye ) Manyetik karıştırıcı (Boeco MSH 200, Almanya ) Kronometre (Casio, Japonya) IV. Kullanılan Nötralizan ve Besiyerleri Tripton soy broth (TSB) besiyerinin hazırlanışı: 15 g Tripton (Oxoid, İngiltere), 5 g bakteriyolojik pepton (Oxoid, İngiltere), 5 g NaCl (Merck, Almanya) bir balona konduktan sonra distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak karıştırıldı. 121°C’de 15 dakika otoklavda sterilize edildi. EN1500 standardında tanımlanan kontaminasyon sıvısının hazırlanmasında kullanıldı. İlk değer numunelerini elde etmek için kullanılacak steril plastik petri kutuları içine 10’ar ml ve ilk değer numunelerinin dilüsyonlarını hazırlamak için 1,5 ml’lik ependorf tüpleri içine 900’er µl dağıtıldı. Tripton soy agar (TSA) besiyerinin hazırlanışı: 15 g Tripton, 5 g bakteriyolojik pepton, 5 g NaCl ve 15 g bakteriyolojik agar (Oxoid, İngiltere) distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak karıştırıldı. Otoklavda sterilize edildi. Besiyeri 50°C'ye kadar soğutulduktan sonra 9 cm çapında steril plastik petri kutularına 15’er ml hacimde dağıtıldı. Çalışmada kullanılan bütün bakteri suşlarının üretilmesi için kullanıldı. prEN12054 standardında yapılan koloni sayım ekimlerinde kullanmak üzere 15 cm çapındaki petri kutularına 40’ar ml olacak şekilde dağıtıldı. Sodyum deoksikolatlı tripton soy agar besiyerinin hazırlanışı: Tripton soya agar karışımının litresine 0,5 g sodyum deoksilat (AppliChem, Almanya) eklenerek otoklavlandı. 50°C'ye kadar soğutulduktan sonra steril petri kutularına 15’er ml döküldü. EN1500 standardında tanımlandığı şekilde elde edilen ilk değer ve son değer numunelerinin dilüsyonlarından yapılan koloni sayım ekimlerinde kullanıldı. 29 Dilüentin hazırlanması: 1 g tripton, 8,5 g NaCl ve 1000 ml distile su karıştırılarak otoklavda sterilize edildi. prEN12054 standardında kullanıldı. Nötralizanlı tripton soy broth (NTSB)’un hazırlanması: Nötralizan olarak yumurta sarısı ve tween 80 (Merck, Almanya) kullanıldı. Çatlağı olmayan 3-4 adet taze yumurta, deterjanla yıkandıktan ve durulandıktan sonra %90 izopropil alkol içeren bir kap içerisine konarak iki saat bekletildi. Steril eldiven giyilerek kaptan çıkarılan yumurtalar bek alevi yakınında birkaç dakika bekletilerek alkolün uçması sağlandı. Steriliteye dikkat ederek kırılan yumurtaların sarısı ayrılıp 100 ml hacimli steril polipropilen bir kaba konuldu. Kısa bir süre karıştırılan yumurta sarısı, steril tel süzgeçten geçirilerek ikinci bir steril kaba aktarıldı. Böylece zarından ayrılmış yumurta sarısı elde edildi. Kırk gram Tween 80, 15 g tripton, 5 g bakteriyolojik pepton ve 5 g NaCl, distile su ile 950 ml’ye tamamlandı. Karışım otoklavda sterilize edildikten sonra manyetik karıştırıcı ile yaklaşık bir saat karıştırılarak şeffaf ve homojen bir görünüm alması sağlandı. Sıcaklığı yaklaşık 50°C'ye düşünce karışımın içine önceden hazırlanmış olan steril yumurta sarısından 50 ml ilave edilerek manyetik karıştırıcıda bir saat kadar daha karıştırıldı. Elde edilen NTSB’den steril bir cam tüpe 10 ml kadar alınarak sterilite kontrolü için etüve kaldırıldı. Etüvde 24 saat bekletilen numuneden tripton soy agar plaklarına pasajlar yapılarak üreme açısından kontrol edildi. Hazırlanan NTSB steril olduğu doğrulandıktan sonra EN1500 standardında kullanılabilir. Çalışmada NTSB, son değer numunelerinin elde edileceği steril plastik petri kutuları içine 10’ar ml ve son değer numunelerinin dilüsyonlarını hazırlamak için 1,5 ml’lik ependorf tüpleri içine 900’er µl dağıtıldı. Nötralizanlı Dilüent (ND)’in hazırlanışı: 40 g Tween 80, 1 g Tripton, 8,5 g NaCl distile su ile 950 ml’ye tamamlandı. Karıştırıldıktan sonra otoklavlanarak sterilize edildi. Sıcaklığı yaklaşık 50°C'ye düşünce karışımın içine önceden hazırlanmış olan steril yumurta sarısından 50 ml ilave edilerek manyetik karıştırıcıda bir saat kadar karıştırıldı. Sterilite kontrolü yapıldıktan sonra prEN12054 standardında kullanıldı. 30 V. Diğer Malzemeler Burgulu, kapaklı steril tüp (15 ml) (Becton Dickinson, ABD) Ependorf tüpü (1.5 ml) (AHN Biotechnologie GmbH, Almanya) Mikropipet (100, 1000 µL) (Gilson, Amerika Birleşik Devletleri) Steril petri kutusu (90 mm çapında) (Fıratmed, Türkiye) Steril petri kutusu (150 mm çapında) (LP Italiana SPA, İtalya) Steril 100 ml’lik polipropilen idrar kabı (Fıratmed, Türkiye) Cam balonlar (1000 ve 2000 ml hacminde) (İsolab, Almanya) Steril Drigalski spatülleri (İsolab, Almanya) VI. Antiseptiklerin prEN12054 Standardı ile Test Edilmesi Bütün antiseptikler EN1500 standardı ile test edilmeden önce prEN12054 standardı ile test edilmişlerdir. VI.1. Dilüsyon-Nötralizasyon Metodunun Validasyonu Steril tüpler içinde dilüent kullanılarak bakteri süspansiyonları hazırlanmıştır. Vorteksle karıştırıldıktan sonra nefelometre ile bakteri yoğunlukları 0,5 - 0,7 McFarland olacak şekilde ayarlanmıştır. Elde edilen bakteri test süspansiyonlarının, 9’ar ml dilüent içeren steril tüplerde 10-6’ya kadar dilüsyonları hazırlanmıştır. (Şekil-6). 10-6 dilüsyonundan 15 cm çaplı iki adet tripton soya agar (TSA) besiyerine birer ml aktarılarak drigalski spatülleri kullanılıp yayma plak yöntemi ile koloni sayım ekimleri yapılmıştır. Plaklar 24- 48 saat 37ºC’de inkübe edildikten sonra koloni sayımları yapılıp ortalamaları alınarak koloni oluşturan birim (kob) cinsinden N değeri hesaplanmıştır. 9 ml steril nötralizanlı dilüentin içine test edilen bakterinin 10-5 dilüsyonundan 1 ml ilave edilerek kronometre başlatılmış ve birkaç saniye vortekslenmiştir. Bir dakikanın dolmasına yakın tekrar vortekslenmiş ve süre sonunda iki adet TSA besiyerine birer ml aktarılmıştır. Yayma plak yöntemi 31 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Koloni sayım 1 ekimleri 2 3 4 5 6 N (2 plak) 1 ml Bakteri test Dilüent 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 süspansiyon (9 ml) u 1 ml Seri dilüsyonlar 1 ml Koloni sayım ekimleri N 5 ’ (2 plak) 1 ml Bakteri (10-5) Nötralizanlı t=0 t=1’ dilüent (9 ml) Şekil-6: prEN12054 standardı, dilüsyon-nötralizasyon metodu validasyonu (N ve N’ değerlerinin elde edilmesi). 32 1 ml t=0 Dilüent 1 ml Antiseptik (9 ml) t=5’ Nötralizanlı t=0 dilüent (8 ml) 1 ml 5 t=0 t=5’ Bakteri (10-5) t=1’ n’ Koloni sayım ekimleri Şekil-7: prEN12054 standardı, dilüsyon nötralizasyon metodu validasyonu (n’ değerinin elde edilmesi). 33 ile koloni sayım ekimleri yapılan plaklar 24-48 saat 37ºC’de inkübe edildikten sonra koloni sayımları yapılıp ortalaması alınarak N’ değeri (kob) hesaplanmıştır. Steril bir tüp içindeki 9 ml test antiseptiğinin üzerine 1 ml dilüent ilave edilerek beş dakika bekletilmiştir (Şekil-7). Sürenin hemen başında ve bitimine yakın birkaç saniye vorteksle karıştırılmıştır. Sürenin sonunda karışımdan 1 ml alınarak 8 ml nötralizanlı dilüent içeren tüpe aktarılmış ve beş dakika daha bekletilmiştir. Sürenin hemen başında ve bitimine yakın birkaç saniye vorteksle karıştırılmıştır. Süre sonunda karışımın içine test edilen bakterinin 10-5 dilüsyonundan 1 ml ilave edilerek bir dakika bekletilmiştir. Aynı şekilde sürenin başında ve sonuna doğru vortekle karıştırılmıştır. Bir dakikalık sürenin sonunda karışımdan birer ml alınarak iki adet TSA besiyerine aktarılmış ve yayma plak yöntemi ile koloni sayım ekimleri yapılmıştır. Plaklar 24-48 saat 37ºC’de inkübe edildikten sonra koloni sayımları yapılıp ortalaması alınarak n’ değeri (kob) hesaplanmıştır. Elde edilmiş olan N değeri bakteri test süspansiyonu kontrolü, N’ değeri nötralizan kontrolü, n’ değeri ise dilüsyon nötralizasyon testi kontrolüdür. N’ değeri kullanılan nötralizanın bakteri üzerinde toksik etkisi olup olmadığını, n’ değeri ise dilüsyon nötralizasyonun antiseptiği etkili bir şekilde nötralize edip etmediğini göstermektedir. Dilüsyon nötralizasyon metodunun geçerli olabilmesi için aşağıdaki şartların sağlanması gerekmektedir: a) N ve N’ değerlerinin hesaplanacağı plaklardaki koloni sayısı 300’den çok olmamalıdır. b) N ve N’ değerleri 100 ile 300 kob arasında olmalıdır. c) N’ değeri N/2’den küçük olmamalıdır (N’ ≥ N / 2). d) n’ değeri N’/2’den küçük olmamalıdır (n’ ≥ N’ / 2). VI.2. Antiseptiklerin prEN12054 Standardı ile Test Edilmesi Steril bir tüp içindeki 9 ml test antiseptiğinin üzerine 1 ml bakteri test süspansiyonu eklenmiştir (Şekil-8). Hemen kronometre başlatılarak 30 saniye süre tutulmuştur. Sürenin hemen başında ve sonuna doğru karışım birkaç 34 saniye vorteksle karıştırılmıştır. Bir dakika sonunda (t=1’), 1 ml karışım 8 ml nötralizanlı dilüent ve 1 ml steril distile su içeren steril bir tüpün içine aktarılmıştır. Karıştırıldıktan sonra birer ml alınarak iki adet TSA besiyerine aktarılıp koloni sayım ekimleri yapılmıştır. Plaklar inkübe edildikten sonra koloni sayımları yapılıp ortalaması alınarak 1 dakika için n değeri hesaplanmıştır. Yukarıdaki prosedür 30 saniyelik süre için (t=30’’) ayrıca uygulanarak 30 saniye için n değeri hesaplanmıştır. n değeri test edilen antiseptiğin test edilen bakteri üzerindeki antibakteriyel etkisini yansıtmaktadır. Test edilen antiseptik başlangıç bakteri yoğunluğu olan (t=0) 1x107 - 3x107 kob/ml değerini 1 dakika sonunda (t=1’) en çok 3x102 kob/ml olacak şekilde azaltmalıdır. Bu azalma logaritmik olarak ifade edilirse başlangıç bakteri sayısı 1x107 kob/ml için 4,52 log; 3x107 kob/ml için 5 log’a karşılık gelir. Bu şart 4 standart bakteri suşu için de sağlanmalıdır. Bu şartı sağlayan hijyenik el ovalama antiseptikleri bir dakikalık sürede prEN12054 standardını karşılaşmış kabul edilirler. Üretici firma ürünü için 30 saniyelik uygulamanın yeterli olduğunu belirtmişse prosedür 30 saniye için de tekrar edilir. Bu durumda ürünün aynı şartları 30 saniyede sağlaması gerekmektedir. Test ettiğimiz ürünlerde 30 saniyelik kullanım önerildiği için test prosedürü 30 saniye için de tekrar edilmiştir. Test edilen A, B, C, D, E ve DSÖ-II antiseptiklerinin her biri 4 standart bakteri suşu ile yukarıda tanımlandığı şekilde ayrı ayrı test edilerek N, N’, n ve n’ değerleri elde edilmiştir. 35 1 ml Test karışımı t=0 Bakteri test Antiseptik süspansiyonu (9 ml) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Koloni sayım Koloni sayım ekimleri ekimleri (2 plak) (2 plak) 1 ml 1 ml Test karışımı Test karışımı t=30’’ ND+su t=1’ ND+su (8 ml+1ml) n (8 ml+1ml) n (30’’) (1’) ND: Nötralizanlı dilüent Şekil-8: prEN12054 standardı, test metodu. 36 VII. Antiseptiklerin EN1500 Standardı ile Test Edilmesi Antiseptikler EN1500 standardında on beş gönüllünün katılımıyla test edilmiştir. VII.1. Deney Düzeni 6 adet antiseptik ürün iki farklı uygulama şekli için toplam 4 deney setinde test edilmiştir. Uygulama şekillerinden biri 3 ml antiseptiğin, 30 saniyelik el ovalama süresi ile uygulanması (3 ml x 30 saniye x 1), diğeri ise 3 ml antiseptiğin 30 saniye ovalama süresi ile uygulandıktan sonra aynı işlemin bir kez daha tekrar edilmesidir (3 ml x 30 saniye x 2). Her bir set ayrı bir günde yapılmış ve her bir sette bütün gönüllülere 3 adet antiseptik iki uygulama şeklinden biri ile uygulanmıştır. Bütün setlere aynı gönüllüler katılmış ve her sette test edilen antiseptiklerle birlikte referans solüsyon da uygulanmıştır. Referans solüsyon olan %60 (v/v) izopropil alkol bütün setlerde standartta tanımlandığı gibi (3 ml x 30 saniye x 2) şeklinde uygulanmıştır. Setlerde test edilen antiseptikler ve uygulama şekilleri aşağıda gösterilmiştir: Set 1: A, B ve DSÖ-II; (3 ml x 30 saniye x 1) Set 2: A, B ve DSÖ-II; (3 ml x 30 saniye x 2) Set 3: C, D, E; (3 ml x 30 saniye x 1) Set 4: C, D, E; (3 ml x 30 saniye x 2) Her bir sette bütün gönüllülerin 3 adet antiseptiği ve referans solüsyonu (R) kullandıkları bir Latin kare dizaynı uygulanmıştır. Bunun için gönüllüler 4 gruba ayrılmışlardır (4+4+4+3 kişi). Böylece her bir set dört deney yapılarak tamamlanmıştır. Set 1’de uygulanan Latin kare dizaynı Tablo-5’de gösterilmiştir. 37 Tablo-5: Set 1 çalışmasında uygulanan Latin kare dizaynı. Deney 1 → Deney 2 → Deney 3 → Deney 4 Grup 1 A B C R Grup 2 B C R A Grup 3 C R A B Grup 4 R A B C VII.2. Kontaminasyon Sıvısının Hazırlanması: 2 litre steril tripton soy broth (TSB) içeren bir cam balona E coli K 12 NCTC 10538 standart suşundan hazırlanan 5 ml’lik bakteri süspansiyonu ilave edilerek bir gece 37ºC’de inkübe edilmiştir. Ertesi gün bakteri yoğunluğu nefelometrik olarak 1 MacFarland olacak şekilde ayarlanmıştır. Elde edilen kontaminasyon sıvısı birer litrelik iki behere eşit olarak bölüştürülmüştür. Bir deney setinde bütün gönüllüler aynı kontaminasyon sıvısını kullandılar. VII.3. EN1500 Test Metodunun Aşamaları İzlenen aşamalar sırasıyla; 1. Gönüllüler ellerini basit sıvı sabunla 1 dakika boyunca yıkarlar. Böylece ellerdeki geçici flora uzaklaştırılır (Şekil-9 A). 2. Kağıt havlu ile kurulamayı takiben, ellerini 5 saniye süreyle kontaminasyon sıvısına midmetakarpal seviyeye kadar daldırırlar (Şekil-9 B, C). 3. Kontaminasyon sıvısından çıkarılan eller parmaklar aralık olacak şekilde 3 dakika boyunca havada kurutulur (Şekil-9 D). 4. Gönüllüler, İçerisinde 10 ml TSB bulunan 9 cm çapındaki steril petri kutularının içine parmak uçlarını daldırarak 1 dakika boyunca ovuşturma hareketi yaparlar. Böylece yapay olarak kontamine edilmiş olan ellerdeki bakteri yoğunluğunu yansıtan ilk değerlerin hesaplanacağı ilk değer numuneleri elde edilmiş olur. Sağ ve sol eller için ayrı petri kutuları kullanılır (Şekil-9 E). 5. Takiben gönüllülerin ellerine test edilecek antiseptik ürün (ya da referans solüsyon) uygulanır (Şekil-9 F). Ovalama işleme standartta tanımlanan şekilde yapılır (Şekil-9 G-L). 38 6. Uygulama sonrası eller 5 saniye süre ile akan musluk suyu altından geçirilir (Şekil-9 M). Böylece ellerdeki antiseptik uzaklaştırılmaya çalışılır. 7. Takiben gönüllüler ellerini içerisinde 10’ar ml nötralizanlı tripton soya brot (NTSB) içeren petri kutularına daldırarak 1 dakika boyunca parmak uçları ile ovuşturma hareketi yaparlar (Şekil-9 N). Bu aşamada kullanılan nötralizan eldeki antiseptik kalıntılarının etkisini durdurmak için kullanılmaktadır. Böylece antiseptik uygulanması sonrası elde kalan bakterilerin sayısının (son değer) hesaplanmasında kullanılacak son değer numuneleri elde edilmiş olur. Sağ ve sol eller için ayrı petri kutuları kullanılır. A B B B Eller yumuşak sabunla 1 dakika süreyle yı kanır ve kağıt havlu ile kurulanır (A), (B). C D ElleBr kontaminasyon sıvısına 5 saniye sü reByle midmetakarpal seviyeye kadar daldırılır (C). Havada 3 dakika süreyle kurutulur (D). Şekil-9: EN1500 test metodunda uygulanan işlemler. 39 E F B B Ilk değer numunelerinin elde edilmesi için 10 ml TSB bulunan petri kutularının içinde parmak uçları ile ovuşt urma hareketi yapılır (E). 3 ml antiseptik ürün (ya da referans solüsyon) uy gulanır (F). G H A Standart el ovalama prosedürüne göre avuç larıAn ovalanması (G), sağ el sırtı üzerine sol avuç yerleştirilmiş, parmaklar iç içe geçmiş pozisyonda ovalama ve tam tersi (H ). I J Avuçlar ve iç içe geçmiş olan parmaklar ın Aovalanması (I), parmak arkalarının avuç içine sürtünecek şe kilde ovalanması (J). Şekil-9 (devamı): EN1500 test metodunda uygulanan işlemler. 40 L K L A B Sağ avuç içinde kavranmış olan sol başpar mağın döndürülerek ovuşturulması ve tam tersi (K). Sağ elin parmak uçlarının sol avuç içine bastırılarak döndürme ve ileri geri hareketlerle ovuşturu lması ve tam tersi (L). M N I I Antiseptiğin uzaklaştırılması için eller 5 saniye süreyle akan musluk suyu altından geçirilir (M). Son değer numunelerinin elde edilmesi için 10 ml NTSB bulunan petri kutularının içinde parmak uçları ile ovuş turma hareketi yapılır (N). Şekil-9 (devamı): EN1500 test metodunda uygulanan işlemler. VII.4. İlk Değer ve Son Değerlerin Elde Edilmesi Elde edilen ilk değer numunelerinin 900’ar µl TSB içeren steril ependorf tüplerinde 10-4’e kadar dilüsyonları hazırlandı (Şekil-10 A). 10-3 ve 10-4 dilüsyonlarından 100’er µl TSA plaklarına aktarılarak koloni sayım ekimleri yapıldı. Aktarılan miktar 100 µl olduğu için TSA plakları 10-4 ve 10-5 dilüsyonlarına karşılık gelmektedir. 41 Son değer numunelerinin 900 µl NTSB içeren steril ependorf tüpünde 10-1 dilüsyonu hazırlandı (Şekil-10 B). Dilüe edilmemiş olan son değer numunesinden 1000 µl ve 100 µl; 10-1 dilüsyonundan ise 100 µl TSA plaklarına aktarılıp koloni sayım ekimleri yapıldı. Böylece TSA plaklarındaki nihai dilüsyonlar sırasıyla 100, 10-1 ve 10-2 olmaktadır. Yukarıda bahsedilen dilüsyon ve ekim işlemleri her bir gönüllünün sağ ve sol elinden ayrı ayrı elde edilen ilk değer ve son değer numuneleri için tekrar edilmiştir. Plaklar nihai dilüsyonlar dikkate alınarak etiketlenip 37ºC’de 24-48 saat inkübe edildikten sonra koloniler sayılmıştır. 42 100µl 100µl 100µl 100µl 900µl TSB TSB İlk değer numunesi 10-1 10-2 10-3 10-4 100µl 100µl TSA Koloni sayım ekimi (10-4) TSA Koloni sayım A ekimi (10-5) 100µl 900µl NTSB 10-1 NTSB Son değer numunesi 1000µl 100µl 100µl TSA Koloni sayım ekimi (100) TSA Koloni sayım TSA -2 Koloni sayım ekimi (10 ) B ekimi (10-1) TSB: Tripton soy broth, NTSB: Nötralizanlı tripton soy broth, TSA: Tripton soy agar Şekil-10: Elde edilen ilk değer (A) ve son değer (B) numunelerinin dilüsyonlarının hazırlanması ve koloni sayım ekimlerinin yapılması. 43 VII.5. Logaritmik Azaltma Faktörünün Hesaplanması (log AF) log AF antiseptiğin etki gücünün bir göstergesidir. Bir deney setinde her bir gönüllünün test edilen üç antiseptik ve referans solüsyon için log AF’leri hesaplanmaktadır. Log AF’nin hesaplanma şekli aşağıda sunulmuştur: Koloni sayımları yapıldıktan sonra ilk değerlerin elde edilmesi için 10-4 ve 10-5 plaklarından; son değerlerin elde edilmesi için 100, 10-1 ve 10-2 plaklarından koloni sayısı 15 ile 300 arasında olan plaklar esas alınır. Antiseptiğin etkisine bağlı olarak son değer plaklarında 15 ve üzerinde koloni bulunan plak yoksa, mevcutlar içinde en çok koloni olan plak esas alınır. Ardışık dilüsyonlarda koloni sayısı 15-300 arasında olan iki plak mevcutsa bunların ağırlıklı aritmetik ortalaması alınmıştır. Ağırlıklı aritmetik ortalamayı hesaplamak için kullanılan formül aşağıdaki gibidir: Ağırlıklı aritmetik ortalama = T / 1,1 x k T: İki plaktaki toplam koloni sayısı k: Ardışık iki dilüsyon içinde daha konsantre olanın oranı. Şekil-11’de örnek olarak Set 2 çalışmasında 15. kişinin A antiseptiği için sağ ve sol elinden elde edilen ilk değer ve son değer plakları gösterilmiştir. 15 ile 300 arası koloni bulunan sağ ilk 10-5, sağ son 100, sol ilk 10-5 ve sol son 100 plakları hesaplamalarda kullanılan plaklardır (Sırasıyla: 41, 66, 43 ve 46 kob). 44 Şekil-11: Set 2 çalışmasında A antiseptiği için 15. kişinin sağ ve sol elinden elde edilen dilüsyonların ekimleri. 45 Bu değerler aşağıdaki gibi hesaplanarak log AF değeri bulunur. VII.6. EN1500 Standardının İstatistiksel Analizi: İstatistiksel analizler IBM SPSS Statistics 20 paket programında yapılmıştır. Her bir deney setinde test edilen antiseptik ürünlerden elde edilen ve referans solüsyondan elde edilen bireysel log AF değerlerinin karşılaştırılması için Wilcoxon testi kullanılmıştır. 46 BULGULAR I. prEN12054 Standart Test Metodu Sonuçları I.1. Dilüsyon Nötralizasyon Metodunun Validasyonu DSÖ-II formülasyonu için dört standart bakteri ile elde edilen N, N’ ve n’ değerleri Tablo-6’da gösterilmiştir. Bütün N ve N’ değerleri 100-300 kob aralığındadır. Her bir bakteri için elde edilen N’ değerleri, N değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu bulgu nötralizanın bakteriler üzerinde toksik etkisi olmadığını göstermektedir. Bütün n’ değerleri N’ değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu da seçilen nötralizanın DSÖ-II formülasyonu için uygun olduğunu göstermektedir. Tablo-6: DSÖ-II formülasyonu için validasyon sonuçları. Plak başına koloni sayısı (ortalama kob) Test Bakterisi Bakteri test Nötralizasyon validasyonu süspansiyonu Kontrol Test Staphylococcus aureus 212,233 1 9 2 , 2 0 6 1 4 3 , 1 6 3 (N=222,5) (N'=199) (n'=153) Pseudomonas aeruginosa 249,232 271,235 156,178 (N=240,5) ( N ' = 2 5 3 ) (n'=167) Escherichia coli 177,160 1 5 9,166 8 3 , 1 1 2 (N=168,5) (N'=162,5) (n'=97,5) Enterococcus hirae 148,152 1 4 0 ,158 151, 130 (N=150) (N'=149) (n'=140,5) A antiseptiği için dört standart bakteri ile elde edilen N, N’ ve n’ değerleri Tablo-7’de gösterilmiştir. Bütün N ve N’ değerleri 100-300 kob 47 aralığındadır. Her bir bakteri için elde edilen N’ değerleri, N değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu bulgu nötralizanın bakteriler üzerinde toksik etkisi olmadığını göstermektedir. Bütün n’ değerleri N’ değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu da seçilen nötralizanın A antiseptiği için uygun olduğunu göstermektedir. Tablo-7: A antiseptiği için validasyon sonuçları. Plak başına koloni sayısı (ortalama kob) Test Bakterisi Bakteri test Nötralizasyon validasyonu süspansiyonu Kontrol Test Staphylococcus aureus 212,233 1 9 2 , 2 0 6 2 1 4 , 2 0 6 (N=222,5) (N'=199) (n'=210) Pseudomonas aeruginosa 148,185 154,162 98,91 (N=166,5) ( N ' = 1 5 8 ) (n'=94,5) Escherichia coli 177,160 1 5 9,166 1 7 7 , 1 5 0 (N=168,5) (N'=162,5) (n'=163,5) Enterococcus hirae 148,152 1 4 0 ,158 151, 130 (N=150) (N'=149) (n'=140,5) B antiseptiği için dört standart bakteri ile elde edilen N, N’ ve n’ değerleri Tablo-8’de gösterilmiştir. Bütün N ve N’ değerleri 100-300 kob aralığındadır. Her bir bakteri için elde edilen N’ değerleri, N değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu bulgu nötralizanın bakteriler üzerinde toksik etkisi olmadığını göstermektedir. Bütün n’ değerleri N’ değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu da seçilen nötralizanın B antiseptiği için uygun olduğunu göstermektedir. 48 Tablo-8: B antiseptiği için validasyon sonuçları. Plak başına koloni sayısı (ortalama kob) Test Bakterisi Bakteri test Nötralizasyon validasyonu süspansiyonu Kontrol Test Staphylococcus aureus 212,233 1 9 2 , 2 0 6 2 0 8 , 2 0 4 (N=222,5) (N'=199) (n'=206) Pseudomonas aeruginosa 290,247 279,282 139,158 (N=268,5) ( N ' = 2 8 0 , 5 ) (n'=148,5) Escherichia coli 177,160 1 5 9,166 1 3 2 , 1 6 3 (N=168,5) (N'=162,5) (n'=147,5) Enterococcus hirae 148,152 1 4 0 ,158 148, 124 (N=150) (N'=149) (n'=136) C antiseptiği için dört standart bakteri ile elde edilen N, N’ ve n’ değerleri Tablo-9’da gösterilmiştir. Bütün N ve N’ değerleri 100-300 kob aralığındadır. Her bir bakteri için elde edilen N’ değerleri, N değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu bulgu nötralizanın bakteriler üzerinde toksik etkisi olmadığını göstermektedir. Bütün n’ değerleri N’ değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu da seçilen nötralizanın C antiseptiği için uygun olduğunu göstermektedir. Tablo-9: C antiseptiği için validasyon sonuçları. Plak başına koloni sayısı (ortalama kob) Test Bakterisi Bakteri test Nötralizasyon validasyonu süspansiyonu Kontrol Test Staphylococcus aureus 205,189 1 7 4 , 1 8 1 1 8 4 , 1 6 6 (N=197) (N'=177,5) (n'=175) Pseudomonas aeruginosa 290,247 279,282 239,213 (N=268,5) ( N ' = 2 8 0 , 5 ) (n'=226) Escherichia coli 161,171 1 5 9,166 1 3 2 , 1 6 3 (N=166) (N'=162,5) (n'=147,5) Enterococcus hirae 184,209 1 5 7 ,173 171, 157 (N=196,5) (N'=165) (n'=164) 49 D antiseptiği için dört standart bakteri ile elde edilen N, N’ ve n’ değerleri Tablo-10’da gösterilmiştir. Bütün N ve N’ değerleri 100-300 kob aralığındadır. Her bir bakteri için elde edilen N’ değerleri, N değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu bulgu nötralizanın bakteriler üzerinde toksik etkisi olmadığını göstermektedir. Bütün n’ değerleri N’ değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu da seçilen nötralizanın D antiseptiği için uygun olduğunu göstermektedir. Tablo-10: D antiseptiği için validasyon sonuçları. Plak başına koloni sayısı (ortalama kob) Test Bakterisi Bakteri test Nötralizasyon validasyonu süspansiyonu Kontrol Test Staphylococcus aureus 205,189 1 7 4 , 1 8 1 1 7 2 , 1 6 3 (N=197) (N'=177,5) (n'=167,5) Pseudomonas aeruginosa 148,185 1 5 4 , 1 6 2 146,132 (166,5) (N'=158) (n'=139) Escherichia coli 178,168 1 4 3,166 1 4 8 , 1 6 6 (N=173) (N'=154,5) (n'=157) Enterococcus hirae 184,209 1 5 7 ,173 176, 160 (N=196,5) (N'=165) (n'=168) E antiseptiği için dört standart bakteri ile elde edilen N, N’ ve n’ değerleri Tablo-11’de gösterilmiştir. Bütün N ve N’ değerleri 100-300 kob aralığındadır. Her bir bakteri için elde edilen N’ değerleri, N değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu bulgu nötralizanın bakteriler üzerinde toksik etkisi olmadığını göstermektedir. Bütün n’ değerleri N’ değerlerinin yarısından daha büyüktür. Bu da seçilen nötralizanın E antiseptiği için uygun olduğunu göstermektedir. 50 Tablo-11: E antiseptiği için validasyon sonuçları. Plak başına koloni sayısı (ortalama kob) Test Bakterisi Bakteri test Nötralizasyon validasyonu süspansiyonu Kontrol Test Staphylococcus aureus 205,189 1 7 4 , 1 8 1 1 8 7 , 1 5 9 (N=197) (N'=177,5) (n'=173) Pseudomonas aeruginosa 290,247 2 7 9 , 2 8 2 186,200 (268,5) (N'=280,5) (n'=193) Escherichia coli 179,194 1 7 1, 197 2 0 3 , 180 (N=186,5) (N'=184) (n'=191,5) Enterococcus hirae 184,209 1 5 7 ,173 183, 166 (N=196,5) (N'=165) (n'=174,5) Yapılan bütün validasyon deneylerinde seçilen nötralizanın bakteriler üzerinde toksik etkisi olmadığı ve bütün antiseptikleri yeterli şekilde nötralize ettiği görülmüştür. I.2. Test Sonuçları Altı antiseptik ürünün prEN12054 standardı ile 1 dakikalık temas süresi için test sonuçları Tablo-12’de sunulmuştur. Aynı bakteri test süspansiyonları ile 30 saniye temas süresi için aynı basamaklar tekrar edilmiştir. Sonuçlar 1 dakikalık temas süresi ile tamamen aynı olduğu için ayrı bir tablo şeklinde gösterilmemiştir. 30 saniye ve 1 dakikalık temas süreleri için bütün antiseptikler bakteri sayısında 6 log’un üzerinde bir azalmaya neden olmuşlar ve standardın gereğini sağlamışlardır. 51 Tablo-12: Antiseptik ürünlerin prEN12054 standardına göre 1 dakika* için değerlendirme sonuçları. DSÖ-II formülasyonu A antiseptiği B antiseptiği kob/ml (test karışımı) kob/ml (test karışımı) kob/ml (test karışımı) t=1' Plak t=1' Plak t=1' Plak Test Bakterisi başına log AF başına log başına log koloni t=0 (N) t=1' (n) koloni t=0 (N) t=1' (n) AF koloni t=0 (N) t=1' (n) AF sayıları sayıları sayıları S aureus 0, 0 2,22x107 <1x101 >6,35 0, 0 2,22x107 <1x101 >6,35 0, 0 2,22x107 <1x101 >6,35 P aeruginosa 0, 0 2,40x107 <1x101 >6,38 0, 0 1,66x107 <1x101 >6,22 0, 0 2,68x107 <1x101 >6,43 E coli 0, 0 1,68x107 <1x101 >6,22 0, 0 1,68x107 <1x101 >6,23 0, 0 1,68x107 <1x101 >6,23 E hirae 0, 0 1,5x107 <1x101 >6,18 0, 0 1,5x107 <1x101 >6,18 0, 0 1,5x107 <1x101 >6,18 C antiseptiği D antiseptiği E antiseptiği kob/ml (test karışımı) kob/ml (test karışımı) kob/ml (test karışımı) t=1' Plak t=1' Plak t=1' Plak Test Bakterisi başına log AF başına log başına log koloni t=0 (N) t=1' (n) koloni t=0 (N) t=1' (n) AF koloni t=0 (N) t=1' (n) AF sayıları sayıları sayıları S aureus 0, 0 1,97 x107 <1x101 >6,29 0, 0 1,97x107 <1x101 >6,29 0, 0 1,97x107 <1x101 >6,29 P aeruginosa 0, 0 2,68x107 <1x101 >6,43 0, 0 1,66x107 <1x101 >6,22 0, 0 2,68x107 <1x101 >6,43 E coli 0, 0 1,66x107 <1x101 >6,22 0, 0 1,73x107 <1x101 >6,24 0, 0 1,86x107 <1x101 >6,27 E hirae 0, 0 1,96x107 <1x101 >6,29 0, 0 1,96x107 <1x101 >6,29 0, 0 1,96x107 <1x101 >6,29 *30 saniye için elde edilen değerler tamamen aynı olduğu için ayrıca sunulmamıştır. 52 II. EN1500 Standart Test Metodu Sonuçları II.1. Koloni Sayım Sonuçları II.1.1 Set 1 Çalışması Sonuçları Set 1 çalışmasında A,B antiseptikleri ve DSÖ-II formülasyonu 30 saniye el ovalama süresi için test edilmişlerdir. Referans solüsyon standartta belirtildiği gibi 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulanmıştır. Elde edilen koloni sayıları Tablo-13, 14, 15 ve 16’da gösterilmiştir. A antiseptiği testinde onuncu kişinin sağ el ve sol el son değerleri; dördüncü ve 14. kişinin sağ el son değerleri ile beşinci kişinin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-13). B antiseptiği testinde dördüncü, onuncu, 11. ve 15. kişilerin sağ el ve sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo- 14). DSÖ-II testinde dördüncü, altıncı ve onuncu kişilerin sağ el ve sol el son değerleri ile sekizinci, dokuzuncu ve 12. kişilerin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-15). Referans solüsyon testinde üçüncü ve yedinci kişilerin sağ el ve sol el son değerleri; birinci, ikinci, onuncu ve 11. kişilerin sol el son değerleri ile 14. kişinin sağ el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-16). 53 Tablo-13: Set 1, A ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik : A Uygulama : 3 ml x 30 saniye x 1 Süspansiyon : 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 34 >300 >300 67 >300 46 >300 >300 40 2 >300 84 >300 >300 49 >300 105 >300 >300 58 3 >300 85 >300 >300 78 >300 92 >300 >300 118 4 >300 129 >300 139 11 >300 88 >300 174* 15* 5 >300 143 >300 249* 28* >300 151 >300 >300 51 6 >300 123 >300 >300 104 >300 110 >300 >300 42 7 >300 106 >300 >300 44 >300 72 >300 >300 109 8 >300 88 >300 >300 78 >300 92 >300 >300 132 9 >300 77 >300 >300 51 >300 111 >300 >300 165 10 >300 82 >300 201* 28* >300 82 >300 255* 21* 11 >300 97 >300 >300 85 >300 105 >300 >300 93 12 >300 103 >300 >300 44 >300 124 >300 >300 109 13 >300 76 >300 63 9 >300 85 >300 30 6 14 >300 55 >300 50 2 >300 57 >300 168* 16* 15 >300 93 >300 105 9 >300 63 >300 75 8 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 54 Tablo-14: Set 1, B ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik : B Uygulama : 3 ml x 30 saniye x 1 Süspansiyon : 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 91 >300 >300 45 >300 91 >300 >300 45 2 >300 82 >300 >300 126 >300 82 >300 >300 126 3 >300 81 >300 >300 102 >300 81 >300 >300 102 4 >300 95 >300 229* 31* >300 95 >300 229* 31* 5 >300 112 >300 >300 64 >300 112 >300 >300 64 6 >300 107 >300 >300 42 >300 107 >300 >300 42 7 >300 84 >300 >300 55 >300 84 >300 >300 55 8 >300 112 >300 >300 62 >300 112 >300 >300 62 9 >300 76 >300 >300 59 >300 76 >300 >300 59 10 >300 144 >300 279* 45* >300 144 >300 279* 45* 11 >300 114 >300 272* 39* >300 114 >300 272* 39* 12 >300 124 >300 >300 51 >300 124 >300 >300 51 13 >300 65 9 0 0 >300 65 9 0 0 14 >300 69 96 8 1 >300 69 96 8 1 15 >300 42 273* 24* 5 >300 42 273* 24* 5 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 55 Tablo-15: Set 1, DSÖ-II formülasyonu için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik : DSÖ-II Uygulama : 3 ml x 30 saniye x 1 Süspansiyon : 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 123 >300 >300 52 >300 105 >300 >300 110 2 >300 114 >300 >300 57 >300 116 >300 >300 53 3 >300 149 >300 >300 34 >300 106 >300 >300 64 4 >300 160 >300 163* 17* >300 135 >300 184* 19* 5 >300 197 >300 155 11 >300 171 >300 135 12 6 >300 112 >300 198* 22* >300 120 >300 143* 16* 7 >300 66 >300 >300 42 >300 86 >300 >300 65 8 >300 95 >300 218* 29* >300 67 >300 >300 103 9 >300 118 >300 284* 27* >300 112 >300 >300 33 10 >300 109 >300 246* 18* >300 100 >300 261* 39* 11 >300 118 >300 61 8 >300 60 >300 83 5 12 >300 124 >300 237* 21* >300 75 >300 >300 32 13 >300 39 >300 >300 64 >300 62 >300 65 7 14 >300 65 >300 49 6 >300 61 >300 77 7 15 >300 61 >300 90 10 >300 49 >300 53 2 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 56 Tablo-16: Set 1, referans solüsyon için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik : Referans solüsyon Uygulama : 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon : 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 94 >300 265* 32* >300 130 >300 >300 55 2 >300 108 >300 204* 20* >300 114 >300 >300 44 3 >300 124 >300 207* 22* >300 94 >300 237* 27* 4 >300 171 >300 40 3 >300 165 >300 66 2 5 >300 148 >300 79 9 >300 158 >300 42 2 6 >300 139 >300 138 11 >300 143 >300 142 13 7 >300 45 175* 22* 4 >300 57 171* 19* 4 8 >300 91 >300 46 7 >300 117 >300 121 11 9 >300 108 >300 59 5 >300 80 >300 65 6 10 >300 116 245* 22* 3 >300 72 >300 58 7 11 >300 70 175* 19* 4 >300 101 >300 59 4 12 >300 95 >300 78 9 >300 122 >300 133 10 13 >300 57 125 13 1 >300 45 95 9 0 14 >300 51 10 0 0 >300 47 266* 31* 3 15 >300 86 79 5 1 >300 80 >300 35 5 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 57 II.1.2. Set 2 Çalışması Sonuçları Set 2 çalışmasında A,B antiseptikleri ve DSÖ-II formülasyonu 3 ml, 30 saniye, x 2 kez uygulaması için test edilmiştir. Referans solüsyon standartta belirtildiği gibi 3 ml, 30 saniye, x 2 kez şeklinde uygulanmıştır. Elde edilen koloni sayıları Tablo-17, 18, 19 ve 20’de sunulmuştur. A antiseptiği testinde birinci, ikinci, dördüncü, beşinci, yedinci ve onuncu kişilerin sağ el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-17). B antiseptiği testinde 11. kişinin sağ el ilk değeri; üçüncü, altıncı ve 14. kişilerin sağ el ve sol el son değerleri; birinci, ikinci, sekizinci ve 15. kişilerin sağ el son değerleri ile yedinci ve 11. kişilerin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-18). DSÖ-II formülasyonu testinde altıncı kişinin sol el ilk değeri; üçüncü ve dokuzuncu kişilerin sağ el ve sol el son değerleri; dördüncü, beşinci, sekizinci ve 11. kişilerin sağ el son değerleri ile birinci, yedinci ve onuncu kişilerin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-19). Referans solüsyon testinde üçüncü, sekizinci, 12. ve 13. kişilerin sağ el son değerleri ile birinci, altıncı ve dokuzuncu kişilerin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-20). 58 Tablo-17: Set 2, A ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: A Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 81 88 7 1 >300 61 151* 16* 2 2 >300 103 >300 61 7 >300 95 >300 107* 16* 3 >300 95 199 14 1 >300 78 >300 36 3 4 >300 63 68 6 0 >300 89 232* 17* 2 5 >300 137 187 12 2 >300 116 >300 273* 29* 6 >300 95 >300 36 2 >300 101 >300 >300 33 7 >300 102 >300 43 3 >300 94 >300 225* 28* 8 >300 173 >300 116 10 >300 127 >300 >300 70 9 >300 139 >300 27 2 >300 118 >300 185 9 10 >300 137 >300 90 7 >300 96 >300 210* 20* 11 >300 145 21 1 0 >300 129 >300 63 5 12 >300 104 110 9 0 >300 129 >300 98 8 13 >300 78 19 2 0 >300 89 63 6 1 14 >300 98 >300 49 4 >300 97 >300 81 12 15 >300 43 46 3 0 >300 41 66 6 1 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 59 Tablo-18: Set 2, B ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: B Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 151 >300 43 4 >300 114 295* 27* 2 2 >300 102 >300 65 7 >300 107 >300 118* 19* 3 >300 75 247* 27* 2 >300 68 286* 33* 3 4 >300 85 209 11 2 >300 90 >300 41 6 5 >300 80 >300 52 6 >300 51 >300 48 6 6 >300 91 269* 34* 2 >300 117 >300 175* 15* 7 >300 108 >300 131* 15* >300 97 >300 >300 27 8 >300 123 >300 39 0 >300 114 >300 157* 15* 9 >300 104 >301 36 3 >300 161 >300 153 14 10 >300 126 >300 46 1 >300 111 >300 81 8 11 >300 81 181* 16* 0 250* 34* 85 7 2 12 >300 116 >300 36 2 >300 121 91 8 1 13 >300 41 >300 33 1 >300 85 >300 68 7 14 >300 87 240* 28* 3 >300 106 291* 38* 2 15 >300 67 115 13 1 >300 98 244* 26* 1 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 60 Tablo-19: Set 2, DSÖ-II formülasyonu için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: DSÖ-II Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 130 160* 15* 2 >300 126 >300 83 13 2 >300 137 92 9 2 >300 118 >300 39 2 3 >300 139 139* 15* 1 >300 114 263* 24* 3 4 >300 109 85 7 0 >300 108 192* 22* 1 5 >300 78 61 6 1 >300 103 147* 15* 0 6 252* 23* 31 3 0 >300 45 75 7 2 7 >300 66 205* 26* 2 >300 94 >300 >300 39 8 >300 118 >300 29 3 >300 84 >300 148* 19* 9 >300 117 148* 17* 1 >300 123 >300 193* 21* 10 >300 118 254* 21* 2 >300 81 >300 115 8 11 >300 113 41 3 0 >300 157 118* 15* 0 12 >300 44 75 6 0 >300 54 69 12 0 13 >300 57 21 3 0 >300 43 10 0 0 14 >300 87 13 1 0 >300 69 88 7 2 15 >300 55 19 2 1 >300 69 82 10 1 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 61 Tablo-20: Set 2, referans solüsyon için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: Referans solüsyon Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 138 292* 33* 4 >300 126 >300 56 9 2 >300 93 >300 51 5 >300 75 >300 94 14 3 >300 155 >300 73 6 >300 137 >300 167* 18* 4 >300 93 58 6 1 >300 93 >300 37 8 5 >300 33 >300 48 5 >300 49 >300 117 9 6 >300 24 >300 92* 15* >300 31 >300 65 5 7 >300 115 >300 155 13 >300 103 >300 178 3 8 >300 124 >300 171 13 >300 119 >300 213* 27* 9 >300 122 287* 29* 6 >300 114 >300 109 9 10 >300 118 >300 106 12 >300 121 >300 >300 59 11 >300 48 112 11 1 >300 55 >300 51 5 12 >300 95 132 10 2 >300 129 289* 41* 4 13 >300 78 53 5 0 >300 101 229* 21* 1 14 >300 64 >300 56 2 >300 143 >300 84 10 15 >300 61 46 9 1 >300 61 59 4 0 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 62 II.1.3. Set 3 Çalışması Sonuçları Set 3 çalışmasında C,D ve E antiseptikleri 30 saniye el ovalama süresi için test edilmişlerdir. Referans solüsyon standartta belirtildiği gibi 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulanmıştır. Elde edilen koloni sayıları Tablo-21, 22, 23 ve 24’te gösterilmiştir. C antiseptiği testinde ikinci kişinin sağ el ve sol el son değerleri; üçüncü ve 11. kişilerin sağ el son değerleri; dördüncü, beşinci ve 12. kişilerin sol el son değerleri ile beşinci kişinin sağ el ve altıncı kişinin sol el ilk değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-21). D antiseptiği testinde ikinci kişinin sağ el son değeri ile dördüncü, beşinci ve yedinci kişilerin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-22). E antiseptiği testinde dördüncü kişinin sağ ve sol el son değerleri; 11. kişinin sağ el son değeri ile ikinci, üçüncü, beşinci, sekizinci, 12. ve 13. kişilerin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-23). Referans solüsyon testinde onuncu kişinin sağ el ve sol el son değerleri; birinci, sekizinci ve dokuzuncu ve 15. kişilerin sağ el son değerleri ile ikinci, beşinci, altıncı ve 14. kişilerin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-24). 63 Tablo-21: Set 3, C ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: C Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 1 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 151 >300 >300 36 >300 116 >300 >300 40 2 >300 143 >300 139* 19* >300 126 >300 108* 16* 3 >300 152 >300 95 13 >300 90 >300 226* 18* 4 >300 58 295* 31* 8 >300 43 >300 32 0 5 >300 47 235* 24* 3 297* 50* 111 14 1 6 295* 28* >300 35 4 >300 76 32 1 0 7 >300 134 >300 46 3 >300 90 >300 146 13 8 >300 99 >300 120 10 >300 83 >300 48 4 9 >300 132 >300 104 13 >300 84 >300 >300 44 10 >300 109 >300 36 1 >300 81 >300 40 0 11 >300 157 >300 >300 21 >300 110 >300 128* 19* 12 >300 151 >300 111* 16* >300 82 >300 >300 83 13 >300 161 >300 >300 74 >300 137 >300 >300 66 14 >300 140 >300 >300 49 >300 163 >300 >300 75 15 >300 142 >300 >300 41 >300 148 >300 >300 119 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 64 Tablo-22: Set 3, D ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: D Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 1 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 50 >300 46 5 >300 55 >300 81 10 2 >300 62 >300 114 14 >300 55 >300 136* 18* 3 >300 80 >300 144 14 >300 86 >300 226 14 4 >300 121 >300 227* 30* >300 101 >300 >300 58 5 >300 115 >300 221* 21* >300 97 >300 >300 38 6 >300 139 >300 94 10 >300 99 >300 137 11 7 >300 127 >300 224* 19* >300 150 >300 >300 39 8 >300 155 >300 >300 50 >300 103 >300 >300 72 9 >300 168 >300 >300 117 >300 129 >300 >300 157 10 >300 192 >300 >300 98 >300 115 >300 >300 140 11 >300 171 >300 >300 107 >300 153 >300 >300 96 12 >300 203 >300 >300 72 >300 141 >300 >300 81 13 >300 122 >300 >300 152 >300 115 >300 >300 145 14 >300 151 >300 >300 205 >300 130 >300 >300 175 15 >300 120 >300 >300 285 >300 117 >300 >300 295 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 65 Tablo-23: Set 3, E ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: E Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 1 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 59 >300 59 2 >300 99 >300 80 12 2 >300 123 >300 211* 20* >300 115 >300 >300 113 3 >300 103 >300 237* 31* >300 109 >300 >300 30 4 >300 49 254* 29* 5 >300 76 278* 25* 0 5 >300 106 206* 18* 2 >300 52 >300 71 5 6 >300 108 >300 52 1 >300 176 90 7 2 7 >300 101 >300 138 10 >300 67 >300 116 6 8 >300 99 288* 34* 4 >300 64 >300 134 14 9 >300 159 >300 107 9 >300 84 >300 >300 24 10 >300 169 >300 109 7 >300 139 >300 >300 46 11 >300 177 >300 136 13 >300 128 >300 176* 18* 12 >300 199 >300 261* 26* >300 126 >300 >300 30 13 >300 115 >300 213* 24* >300 128 >300 >300 37 14 >300 95 >300 >300 28 >300 77 >300 >300 30 15 >300 134 >300 >300 46 >300 110 >300 >300 63 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 66 Tablo-24: Set 3, referans solüsyon için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: Referans solüsyon Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 81 12 1 0 >300 55 229* 28* 3 2 >300 62 191* 27* 2 >300 62 >300 29 4 3 >300 96 >300 60 4 >300 91 >300 177 14 4 >300 78 23 3 0 >300 62 43 6 0 5 >300 65 133* 15* 3 >300 93 123 11 1 6 >300 104 249* 30* 2 >300 88 >300 42 4 7 >300 100 42 5 0 >300 77 19 2 0 8 >300 128 61 7 0 >300 50 121* 15* 0 9 >300 114 65 6 0 >300 125 293* 32* 2 10 >300 77 179* 25* 1 >300 51 289* 36* 1 11 >300 123 69 6 0 >300 93 105 12 1 12 >300 195 >300 33 4 >300 140 >300 34 2 13 >300 154 >300 39 5 >300 119 >300 103 11 14 >300 128 >300 162* 21* >300 142 >300 >300 29 15 >300 131 >300 106 8 >300 118 >300 163* 16* Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 67 II.1.4. Set 4 Çalışması Sonuçları Set 4 çalışmasında C,D ve E antiseptikleri 3 ml x 30 saniye x 2 uygulaması için test edilmiştir. Referans solüsyon standartta belirtildiği gibi 3 ml x 30 saniye x 2 kez şeklinde uygulanmıştır. Elde edilen koloni sayıları Tablo-25, 26, 27 ve 28’te gösterilmiştir. C antiseptiği testinde dördüncü ve sekizinci kişi sağ el ve sol el ilk değerleri; dokuzuncu ve 12. kişinin sağ el son değerleri ile üçüncü ve 11. kişinin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-25). D antiseptiği testinde sekizinci kişinin sağ el ve sol el ilk ve son değerleri; üçüncü kişinin sol el ilk ve son değerleri; dördüncü kişinin sağ ve sol el ilk değerleri; 13. kişinin sağ el ve sol el son değerleri; birinci, ikinci, üçüncü, beşinci ve 12. kişilerin sağ el son değerleri ile 11. kişinin sol el son değerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-26). E antiseptiği testinde ikinci kişi sağ el ilk değeri; dördüncü, yedinci, sekizinci, 11. ve 12. kişilerin sağ el son değerleri ile ikinci, üçüncü, onuncu, 13. ve 15. kişilerin sol el son değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-27). Referans solüsyon testinde dokuzuncu kişinin sağ el ve sol el son değerleri; beşinci ve 11. kişinin sağ el son değerleri ile birinci, altıncı, onuncu ve 15.kişinin sol el değerlerinin hesaplanmasında ardışık dilüsyonlarda 15 ila 300 koloni içeren ikişer plak bulunduğu için ağırlıklı ortalama kullanılmıştır (Tablo-28). 68 Tablo-25: Set 4, C ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: C Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 155 143 11 2 >300 150 >300 34 2 2 >300 81 43 2 2 >300 73 13 1 0 3 >300 78 226* 20* 2 >300 56 >300 88 3 4 225* 34* 53 5 0 215* 18* >300 33 5 5 >300 117 31 2 0 >300 69 22 1 0 6 >300 82 >300 90 3 >300 84 >300 135 12 7 >300 120 >300 42 5 >300 81 >300 76 0 8 186* 21* 62 9 0 251* 19* 73 4 0 9 >300 74 >300 35 4 >300 58 223* 21* 4 10 >300 71 147 12 1 >300 73 174 14 1 11 >300 73 289* 33* 3 >300 87 >300 97 9 12 >300 107 >300 60 7 >300 111 >300 214* 17* 13 >300 83 32 3 0 >300 80 11 0 0 14 >300 129 18 0 0 >300 102 34 1 0 15 >300 106 118 9 2 >300 81 153 8 3 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 69 Tablo-26: Set 4, D ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: D Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 120 >300 89 6 >300 176 >300 132* 15* 2 >300 33 98 14 1 >300 69 295* 41* 2 3 292* 27* >300 160* 19* >300 36 >300 212* 29* 4 261* 25* 121 12 0 279* 27* 154 13 1 5 >300 101 161 13 0 >300 79 291* 47* 4 6 >300 65 >300 76 5 >300 87 >300 119 7 7 >300 82 >300 61 6 >300 103 >300 >300 142 8 281* 35* 145* 15* 0 193* 27* 238* 19* 1 9 >300 132 >300 182 14 >300 75 >300 >300 44 10 >300 107 151 14 2 >300 108 79 6 0 11 >300 124 >300 204* 24* >300 132 >300 >300 39 12 >300 107 >300 113 12 >300 132 >300 170* 15* 13 >300 132 75* 15* 0 >300 125 256* 23* 3 14 >300 124 >300 80 6 >300 89 >300 105 11 15 >300 133 63 6 2 >300 128 93 11 0 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 70 Tablo-27: Set 4, E ürünü için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: E Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon: 3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 109 >300 29 1 >300 96 >300 150 13 2 >300 78 175* 23* 0 172* 26* >300 49 4 3 >300 127 142* 21* 3 >300 81 >300 >300 54 4 >300 117 >300 40 1 >300 59 >300 143* 21* 5 >300 127 >300 52 7 >300 48 62 4 0 6 >300 105 >300 67 5 >300 35 >300 160 11 7 >300 129 >300 81 6 >300 143 >300 125* 17* 8 >300 65 113 8 2 >300 70 234* 20* 3 9 >300 113 >300 107 0 >300 85 >300 146 11 10 >300 97 231* 34* 0 >300 155 >300 38 6 11 >300 140 >300 149 10 >300 107 >300 155* 19* 12 >300 115 >300 60 6 >300 98 176* 15* 2 13 >300 91 191* 15* 2 >300 94 >300 40 2 14 >300 115 >300 64 4 >300 124 >300 >300 55 15 >300 93 295* 33* 1 >300 67 39 4 0 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 71 Tablo-28: Set 4, referans solüsyon için el ovalama prosedürü deney sonuçları. Antiseptik: Referans solüsyon Uygulama: 3 ml x 30 saniye x 2 Süspansiyon: 1,5-3x108 kob/ml 10x dilüsyonundan elde edilen plak başına düşen koloni sayıları Kişi No Sol el Sağ el İlk değerler Son değerler İlk değerler Son değerler 10-4 10-5 100 10-1 10-2 10-4 10-5 100 10-1 10-2 1 >300 140 >300 231* 27* >300 106 >300 >300 91 2 >300 58 >300 49 6 102 12 >300 108 10 3 >300 45 >300 51 3 >300 38 >300 >300 39 4 >300 88 >300 36 6 >300 91 >300 91 7 5 >300 112 >300 58 3 >300 111 >300 125* 20* 6 >300 90 181* 22* 0 >300 129 >300 67 9 7 >300 62 >300 >300 49 >300 97 >300 >300 125 8 >300 91 132 11 0 >300 134 >300 89 5 9 >300 81 >300 93* 15* >300 49 >300 268* 29* 10 >300 110 >300 85* 16* >300 102 >300 226 13 11 >300 128 >300 >300 34 >300 100 >300 291* 32* 12 >300 139 >300 >300 42 >300 107 >300 >300 42 13 >300 76 >300 63 4 >300 81 >300 68 7 14 >300 114 >300 50 2 >300 114 >300 60 7 15 >300 136 245* 21* 1 >300 149 66 9 0 Kalın vurgulu sayılar : Hesaplamalarda kullanılan değerler * : Ağırlıklı ortalaması alınan değerler 72 II.2. Hesaplanan log Değerleri Set 1, 2, 3 ve 4 çalışmaları için hesaplanan bireysel log değerleri Tablo-29, 30, 31 ve 32’de gösterilmiştir. Set 1 çalışmasında referans solüsyon için hesaplanan log AF değerleri 3,46 – 4,97 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 4,24 (standart sapma: 0,43) olarak hesaplanmıştır. A antiseptiği için hesaplanan log AF değerleri 2,88 – 4,27 aralığında değişmektedir. Üç bireysel log AF değeri 3’ün altındadır. Ortalama log AF değeri 3,38 (0,43) olarak hesaplanmıştır. B antiseptiği için hesaplanan log AF değerleri 2,78 – 5,69 aralığında değişmektedir. İki bireysel log AF değeri 3’ün altındadır. Ortalama log AF değeri 3,56 (0,72) olarak hesaplanmıştır. DSÖ-II formülasyonu için hesaplanan log AF değerleri 3,16 – 4,10 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 3,62 (0,33) olarak hesaplanmıştır (Tablo-29). Set 2 çalışmasında referans solüsyon için hesaplanan log AF değerleri 3,54 – 5,07 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 4,24 (0,48) olarak hesaplanmıştır. A antiseptiği için hesaplanan log AF değerleri 3,72 – 5,38 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 4,42 (0,48) olarak hesaplanmıştır. B antiseptiği için hesaplanan log AF değerleri 3,73 – 4,82 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 4,33 (0,29) olarak hesaplanmıştır. DSÖ-II formülasyonu için hesaplanan log AF değerleri 3,94 – 5,53 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 4,79 (0,46) olarak hesaplanmıştır (Tablo-30). Set 3 çalışmasında referans solüsyon için hesaplanan log AF değerleri 3,79-5,49 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 4,65 (0,52) olarak hesaplanmıştır. C antiseptiği için hesaplanan log AF değerleri 3,32 – 4,65 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 3,90 (0,42) olarak hesaplanmıştır. D antiseptiği için hesaplanan log AF değerleri 2,61 – 4,01 aralığında değişmektedir. Üç bireysel log AF değeri 3’ün altındadır. Ortalama log AF değeri 3,36 (0,41) olarak hesaplanmıştır. E antiseptiği için hesaplanan log AF değerleri 3,35 – 4,80 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 3,89 (0,40) olarak hesaplanmıştır (Tablo-31). 73 Set 4 çalışmasında referans solüsyon için hesaplanan log AF değerleri 3,00 – 5,05 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 3,91 (0,55) olarak hesaplanmıştır. C antiseptiği için hesaplanan log AF değerleri 3,88 – 5,67 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 4,68 (0,63) olarak hesaplanmıştır. D antiseptiği için hesaplanan log AF değerleri 3,23 – 5,23 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 4,17 (0,59) olarak hesaplanmıştır. E ürünü için hesaplanan log AF değerleri 3,77 – 4,86 aralığında değişmektedir. Ortalama log AF değeri 4,24 (0,35) olarak hesaplanmıştır (Tablo-32). 74 Tablo-29: Set 1, hesaplanan log değerlerinin (sağ ve sol el ortalamaları) listesi. Kişi Referans solüsyon Ürün A Ürün B DSÖ-II logx logy logAF logx logy logAF logx logy logAF logx logy logAF 1 7,04 3,59 3,46 6,60 3,71 2,88 6,93 4,90 3,19 7,06 4,04139 3,18 2 7,05 3,48 3,57 6,97 3,73 3,25 6,95 5,10 2,78 7,06 3,72428 3,32 3 7,03 3,35 3,68 6,95 3,98 2,96 6,89 4,93 2,92 7,10 3,80618 3,43 4 7,23 2,71 4,51 7,03 3,19 3,84 6,96 5,40 3,56 7,17 3,2661 3,93 5 7,18 2,76 4,42 7,17 3,55 3,61 7,05 5,33 3,11 7,26 3,13033 4,10 6 7,15 3,15 4,00 7,07 3,82 3,25 7,10 5,17 3,65 7,06 3,16 3,83 7 6,70 2,25 4,46 6,94 3,84 3,10 6,99 5,05 3,14 6,88 3,81291 3,16 8 7,01 2,87 4,14 6,95 4,01 2,95 7,04 4,99 3,22 6,90 4,01284 3,22 9 6,97 2,79 4,18 6,97 3,96 3,00 6,87 4,93 3,23 7,06 3,51851 3,58 10 6,96 2,57 4,39 6,91 3,36 3,55 7,12 5,34 3,54 7,02 3,43573 3,61 11 6,92 2,51 4,42 7,00 3,95 3,06 7,07 5,06 3,52 6,93 2,91908 4,07 12 7,03 3,01 4,02 7,05 3,84 3,21 7,01 5,11 3,42 6,98 3,50515 3,55 13 6,70 2,04 4,67 6,91 2,64 4,27 6,83 5,55 5,69 6,69 2,81291 3,38 14 6,69 1,72 4,97 6,75 2,96 3,79 6,76 5,28 4,49 6,80 2,88649 4,01 15 6,92 2,22 4,70 6,88 2,95 3,94 6,67 5,30 3,89 6,74 2,72428 3,90 6,97 2,73 4,24 6,94 3,57 3,38 6,95 5,16 3,56 6,98 3,38 3,62 s 0,17 0,54 0,43 0,13 0,44 0,43 0,13 0,19 0,72 0,16 0,44 0,33 N 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 logx : log ilk değer : logx, logy ve log AF'nin ortalamaları logy : log son değer s : Standart sapma log AF : log azaltma faktörü N : Değerlerin (kişilerin) numaraları 75 Tablo-30: Set 2, hesaplanan log değerlerinin (sağ ve sol el ortalamaları) listesi. Kişi Referans solüsyon Ürün A Ürün B DSÖ-II logx logy logAF logx logy logAF logx logy logAF logx logy logAF 1 7,12 2,61 4,51 6,85 2,06 4,78 7,12 2,55 4,57 7,11 2,56 4,55 2 6,92 2,84 4,08 7,00 2,92 4,08 7,02 2,95 4,06 7,10 2,28 4,83 3 7,16 3,04 4,12 6,93 2,43 4,51 6,85 2,43 4,42 7,10 2,28 4,82 4 6,97 2,17 4,80 6,87 2,09 4,78 6,94 2,47 4,48 7,04 2,11 4,93 5 6,60 2,87 3,73 7,10 2,86 4,25 6,81 2,70 4,11 6,95 1,98 4,98 6 6,44 2,90 3,54 6,99 3,04 3,95 7,01 2,84 4,17 6,53 1,68 4,84 7 7,04 3,22 3,82 6,99 3,00 3,99 7,01 3,28 3,73 6,90 2,96 3,94 8 7,08 3,29 3,80 7,17 3,45 3,72 7,07 2,89 4,18 7,00 2,82 4,18 9 7,07 2,75 4,32 7,11 2,85 4,26 7,11 2,87 4,24 7,08 2,73 4,35 10 7,08 3,40 3,68 7,06 3,14 3,92 7,07 2,79 4,29 6,99 2,73 4,26 11 6,71 2,38 4,33 7,14 2,06 5,08 6,66 2,09 4,57 7,12 1,85 5,28 12 7,04 2,30 4,75 7,06 2,52 4,55 7,07 2,26 4,82 6,69 1,86 4,83 13 6,95 2,04 4,91 6,92 1,54 5,38 6,77 2,68 4,10 6,69 1,16 5,53 14 6,98 2,84 4,14 6,99 2,80 4,19 6,98 2,43 4,55 6,89 1,53 5,36 15 6,79 1,72 5,07 6,62 1,74 4,88 6,91 2,23 4,68 6,79 1,60 5,19 6,93 2,69 4,24 6,99 2,57 4,42 6,96 2,63 4,33 6,93 2,14 4,79 s 0,21 0,48 0,48 0,14 0,56 0,48 0,14 0,32 0,29 0,18 0,54 0,46 N 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 logx : log ilk değer : logx, logy ve log AF'nin ortalamaları logy : log son değer s : Standart sapma log AF : log azaltma faktörü N : Değerlerin (kişilerin) numaraları 76 Tablo-31: Set 3, hesaplanan log değerlerinin (sağ ve sol el ortalamaları) listesi. Kişi Referans solüsyon Ürün C Ürün D Ürün E logx logy logAF logx logy logAF logx logy logAF logx logy logAF 1 6,82 1,72 5,10 7,12 3,58 3,54 6,72 2,79 3,93 6,88 2,84 4,05 2 6,79 2,38 4,41 7,13 3,10 4,02 6,77 3,10 3,66 7,08 3,69 3,39 3 6,97 3,01 3,96 7,07 3,16 3,91 6,92 3,26 3,66 7,03 3,43 3,59 4 6,84 1,50 5,34 6,70 2,49 4,21 7,04 3,57 3,48 6,79 2,43 4,36 5 6,89 2,11 4,78 6,59 2,21 4,38 7,02 3,46 3,56 6,87 2,58 4,29 6 6,98 2,51 4,47 6,67 2,02 4,65 7,07 3,05 4,01 7,14 2,34 4,80 7 6,94 1,45 5,49 7,04 2,91 4,13 7,14 3,47 3,67 6,92 3,10 3,81 8 6,90 1,94 4,96 6,96 2,88 4,08 7,10 3,78 3,32 6,90 2,80 4,10 9 7,08 2,14 4,94 7,02 3,33 3,69 7,17 4,13 3,04 7,06 3,20 3,86 10 6,80 2,37 4,43 6,97 2,58 4,39 7,17 4,07 3,10 7,19 3,35 3,84 11 7,03 1,93 5,10 7,12 3,22 3,89 7,21 4,01 3,20 7,18 3,19 3,99 12 7,22 2,52 4,69 7,05 3,49 3,56 7,23 3,88 3,35 7,20 3,45 3,75 13 7,13 2,80 4,33 7,17 3,84 3,33 7,07 4,17 2,90 7,08 3,45 3,63 14 7,13 3,34 3,79 7,18 3,78 3,40 7,15 4,28 2,87 6,93 3,46 3,47 15 7,09 3,12 3,98 7,16 3,84 3,32 7,07 4,46 2,61 7,08 3,73 3,35 6,97 2,32 4,65 7,00 3,10 3,90 7,06 3,70 3,36 7,02 3,14 3,89 s 0,13 0,58 0,52 0,19 0,58 0,42 0,15 0,50 0,41 0,13 0,44 0,40 N 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 logx : log ilk değer : logx, logy ve log AF'nin ortalamaları logy : log son değer s : Standart sapma log AF : log azaltma faktörü N : Değerlerin (kişilerin) numaraları 77 Tablo-32: Set 4, hesaplanan log değerlerinin (sağ ve sol el ortalamaları) listesi. Kişi Referans solüsyon Ürün C Ürün D Ürün E logx logy logAF logx logy logAF logx logy logAF logx logy logAF 1 7,09 3,66 3,42 7,18 2,34 4,84 7,16 3,04 4,12 7,01 2,82 4,19 2 6,39 2,86 3,52 6,89 1,37 5,51 6,68 2,24 4,44 6,57 2,47 4,10 3 6,62 3,15 3,47 6,82 2,65 4,17 6,51 3,28 3,23 7,01 2,95 4,05 4 6,95 2,76 4,19 6,35 2,12 4,23 6,43 2,14 4,29 6,92 2,89 4,03 5 7,05 2,94 4,11 6,95 1,42 5,54 6,95 2,35 4,60 6,89 2,25 4,64 6 7,03 2,55 4,49 6,92 3,04 3,88 6,88 2,98 3,90 6,78 3,02 3,77 7 6,89 3,89 3,00 6,99 2,75 4,24 6,96 3,47 3,49 7,13 3,01 4,12 8 7,04 2,53 4,51 6,33 1,83 4,50 6,38 2,27 4,11 6,83 2,21 4,62 9 6,80 3,21 3,59 6,82 2,45 4,37 7,00 3,45 3,55 6,99 3,10 3,89 10 7,02 3,16 3,87 6,86 2,20 4,65 7,03 2,04 4,99 7,09 2,48 4,61 11 7,05 3,50 3,55 6,90 2,73 4,17 7,11 3,45 3,65 7,09 3,19 3,90 12 7,09 3,62 3,46 7,04 3,05 3,99 7,07 3,14 3,94 7,03 2,51 4,52 13 6,89 2,82 4,08 6,91 1,27 5,64 7,11 2,16 4,95 6,97 2,44 4,53 14 7,06 2,74 4,32 7,06 1,39 5,67 7,02 2,96 4,06 7,08 3,27 3,80 15 7,15 2,10 5,05 6,97 2,13 4,84 7,12 1,88 5,23 6,90 2,03 4,86 6,94 3,03 3,91 6,87 2,18 4,68 6,89 2,72 4,17 6,95 2,71 4,24 s 0,21 0,49 0,55 0,23 0,61 0,63 0,26 0,58 0,59 0,14 0,39 0,35 N 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 logx : log ilk değer : logx, logy ve log AF'nin ortalamaları logy : log son değer s : Standart sapma log AF : log azaltma faktörü N : Değerlerin (kişilerin) numaraları 78 Set 1, 2, 3 ve 4 çalışmalarında hesaplanan ortalama log AF değerleri Tablo-33’de sunulmuştur. Tablo-33: Ortalama log AF değerleri Ortalama log AF (standart sapma) Antiseptikler Set 1 Set 2 R 4,24 (0,43) 4,24 (0,48) A 3,38 (0,43) 4,42 (0,48) B 3,56 (0,72) 4,33 (0,29) DSÖ-II 3,62 (0,33) 4,79 (0,46) Antiseptikler Ortalama log AF (standart sapma) Set 3 Set 4 R 4,65 (0,52) 3,91(0,50) C 3,90 (0,42) 4,68 (0,63) D 3,36 (0,41) 4,17 (0,59) E 3,89 (0,40) 4,24 (0,35) III. log Değerlerinin İstatistiksel Değerlendirilmesi Her bir set, farklı günlerde çalışıldığı için deney şartlarının değiştiği düşünülerek Wilcoxon testi ile kendi içinde değerlendirilmiştir. Set 1 ve 3 çalışmalarında test edilen antiseptikler 3 ml x 30 saniye x 1 şeklinde uygulanmıştır. Test edilen antiseptiklerden elde edilen bireysel log AF değerleri, referans solüsyondan elde edilen bireysel log AF değerleri ile Wilcoxon testi ile karşılaştırılmıştır. A, B, C, D, E antiseptikleri ve DSÖ-II formülasyonu 3 ml x 30 saniye x 1 şeklinde uygulandıklarında referans solüsyondan anlamlı derece daha az etkili bulunmuştur. Set 2 ve 4 çalışmalarında test edilen antiseptikler 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulanmıştır. Wilcoxon testi ile yapılan karşılaştırma sonucu A, B, C, D, E antiseptikleri ve DSÖ-II formülasyonu 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulandıklarında referans solüsyondan anlamlı derecede daha etkili bulunmuştur. 79 TARTIŞMA VE SONUÇ Hastanelerde kullanımı yaygınlaşan alkol bazlı el antiseptiklerinin seçimi ve değerlendirilmesi için detaylı olarak tanımlanmış standartların uygulanması gerekmektedir. Prado ve ark. (66), Brezilya’da kullanılmakta olan 12 adet alkol bazlı el antiseptik ürünün sekizinin 30 saniyelik uygulama süresinde EN1500 standardının şartlarını yerine getirmediğini raporlamışlardır. EN1500 standardı TSE tarafından da aynen kabul edildiği halde yaptığımız araştırmada ülkemizde EN1500 standardı ile ilişkili bir yayına rastlanmamıştır. prEN12054 standardı el antiseptikleri için geliştirilmiş in vitro bir test metodudur. Çalışmamızda altı adet antiseptiğin hepsi hem 30 saniye hem de 1 dakikalık temas sürelerinde bakteri sayısında 6 log’un üzerinde azalmaya neden olmuşlar ve prEN12054 testinde aranan en az 4,52-5 log azalma şartını yerine getirmişlerdir. Piyasadan temin edilen beş adet el antiseptiğinden A,C,D ve E ürünlerinin etiketlerinde hijyenik el antisepsisi için 3 ml x 30 saniye x 1 şeklinde uygulanmaları önerilmektedir. B ürününün etiketinde bu konuda bir bilgi verilmemiştir. DSÖ kılavuzunda DSÖ-II formülasyonu için belli bir uygulama süresi bildirilmemiş olmakla birlikte kılavuzda alkol bazlı el antiseptikleri ile hijyenik el ovalama süresi 20-30 saniye olarak belirtilmiştir. Çalışmamızda bütün el antiseptiklerini EN1500 standardı ile hem standardın önerdiği 3 ml x 30 saniye x 2 uygulaması için hem de genellikle önerilen 3 ml x 30 saniye x 1 uygulaması için ayrı ayrı test ettik. Bütün antiseptikler 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulandığında referans solüsyondan anlamlı derecede daha etkili bulunmuşlar ve standardın şartını sağlamışlardır. 3 ml x 30 saniye x 1 şeklinde uygulandıklarında ise antiseptiklerin hepsi referans solüsyondan anlamlı derecede daha az etkili bulunmuşlardır. DSÖ-II formülasyonunun da testi geçememesi önemli bir bulgudur. Aynı bulgu 2012’de Suchomel ve ark. (67) tarafından yapılan çalışmada da gözlenmiştir. Bu çalışmada DSÖ’nün etil alkol bazlı formülasyon-I’i ve 80 izopropil alkol bazlı formülasyon-II’si EN1500 test metodu ile değerlendirilmiştir. Her iki formülasyon da 3 ml x 30 saniye x 1 şeklinde uygulandığında referans solüsyondan daha az etkili bulunurken; 3 ml x 30 saniye x 2 olarak uygulandıklarında referanstan daha etkili bulunmuştur. Suchomel ve ark. DSÖ tarafından önerilen iki formülasyonu alkol oranlarını yükselterek modifiye etmişlerdir. Bunun için DSÖ-I formülasyonunda bulunan hacimce %80 etil alkol yerine ağırlıkça %80 etil alkol DSÖ-II formülasyonunda bulunan hacimce %75 izopropil alkol yerine ağırlıkça %75 izopropil alkol kullanmışlardır. Bu iki modifiye formül test edildiğinde her ikisinin de 30 saniyelik uygulama süresinde EN1500’ün gereklerini sağladığını göstermişlerdir. Antiseptik içeriği arttırılmış ürünler kullanılacağı zaman ürünlerin cilt üzerinde yan etkilerinde kullanımlarını kısıtlayacak bir artma olup olmadığı da gösterilmelidir. Çalışmamızda el antiseptiklerinin hepsi 30 saniyelik temas süresi için prEN12054 standardının gereğini sağlamışlarsa da hiç biri EN1500 standardının gereğini 30 saniyelik el ovalama süresinde sağlayamamıştır. Marchetti ve ark. (68) tarafından yapılan bir çalışmada cerrahi el antisepsisi için kullanılan iki adet alkol bazlı el ovalama ürünü ve üç adet el yıkama formülasyonu prEN12054 ve in vivo prEN12791 metodları ile test edilmiştir. Bütün antiseptikler prEN12054 standardının şartını sağlamış ancak el yıkama formülasyonlarından ikisi cerrahi el antiseptikleri için önerilen in vivo test olan prEN12791’i geçememiştir. Antiseptiklerin genellikle süspansiyon ortamında bakterileri daha kolay öldürdükleri bilinmektedir. Yaptığımız çalışmada bütün antiseptikler prEN12054 standardından kolayca geçmişlerdir. t=30’’ anında test karışımından alınan kısımdan yapılan koloni sayım ekimlerinde hiç koloni ürememiştir. Bu nedenle in vitro standardın şartlarının ağırlaştırılması önerilebilir. Belirlenen ovalama süresi için bir el antiseptiğinin EN1500 standardının gereğini yerine getirebilmesi için etkisinin referans solüsyon olan %60 (v/v) izopropil alkolün 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulanması ile elde edilen bakterisidal etkinin anlamlı düzeyde altına inmemesi gerekmektedir. DSÖ kılavuzunda alkol bazlı el antiseptiklerinin 20-30 saniye 81 uygulanması önerildiği halde formülasyon II’nin 30 saniyelik uygulama şekli ile EN1500 standardının şartını yerine getirememesi bu şartın gerektiğinden daha ağır olup olmadığı sorusunu akla getirmektedir. Çalışmamızda set 1, 2, 3 ve 4’te referans solüsyon için elde edilen log AF değerleri standart sapmaları ile birlikte sırasıyla 4,24 (0,43), 4,24 (0,48), 4,65 (0,52) ve 3,91 (0,50) olarak hesaplanmıştır. Bununla birlikte bir antiseptiğin enfeksiyonların çapraz bulaş ve direnç oranlarında azalma gibi parametrelerle ölçülen “etkinliği”nin yeterli olması için eldeki bakterilerde kaç logluk bir azalma yapması gerektiği bilinmemektedir (1). Bu konuda yapılacak araştırmalar EN1500 standardının şartlarının bilinçli bir şekilde yeniden tanımlanmasını sağlayacaktır. A,B ve DSÖ-II antiseptikleri içinde 30 saniye x 1 (Set 1) ve 30 saniye x 2 (Set 2) uygulamaları için en etkili olanı %75 (v/v) izopropil alkol içeren DSÖ-II formülasyonudur. Etken madde olarak A antiseptiği %70 izopropil alkol, B antiseptiği ise %60 (m/m) izopropil alkol, %0.15 (m/m) benzalkonyum klorür ve %0,1 (m/m) undesilenik asit içermektedir. A antiseptiğinin alkol içeriğinin hacimce ya da ağırlıkça olduğu konusunda bir bilgi bulunmamaktadır. B antiseptiğinin ağırlıkça ifade edilen alkol içeriği 20ºC’de yaklaşık hacimce %70 izopropil alkole denk gelmektedir. Bu oran DSÖ-II formülasyonunun içerdiği miktarın altındadır. C, D ve E antiseptikleri içinde 30 saniye x1 (Set 3) ve 30 saniye x 2 (Set 4) uygulamaları için en etkili olanı %70 (v/v) izopropil alkol içeren C antiseptiğidir. D antiseptiği %70 (v/v) etil alkol ve %10 (v/v) izopropil alkol içermektedir. E antiseptiği %62,14 (m/m) izopropil alkol içermektedir ve hacimce yaklaşık %70’e karşılık gelmektedir. C ve E antiseptiklerinin ortalama log AF değerleri 30 saniyelik uygulamada sırayla 3,90 ve 3,89 iken 1 dakikalık uygulamada sırayla 4,68 ve 4,24 olarak hesaplanmıştır. D ürünü test edilen ürünler içinde 30 saniye ve 1 dakikalık uygulamalarda en düşük log AF değerlerine (sırayla 3,36 ve 4,17) sahip olduğu için en zayıf etkili antiseptik olarak değerlendirilmiştir. EN1500 standardında referans antiseptik olan %60 izopropil alkol 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulanmaktadır. Bu bir dakikalık uygulama 82 süresi sağlık çalışanlarının gerçek hayatta el ovalama için ayırdıkları süreyi yansıtmamaktadır. Birçok çalışmada sağlık çalışanlarının el antisepsisi için ayırdıkları süre, ortalama 15 saniyeden az bulunmuştur (69,70). Bununla birlikte test ettiğimiz ürünler ile yeterli el antisepsisi sağlanabilmesi için 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulanmaları gerekmektedir. Pratik şartlarla örtüşmeyen bu uygulama şekli nedeniyle mümkünse daha kısa uygulama süresinde EN1500’ün gereğini sağlayabilecek, alkol içeriği daha yüksek antiseptiklerin tercih edilmesi daha uygundur. Ayrıca zayıf etkili bir ürünün iki katı miktarda kullanılması yerine antiseptik içeriği daha yüksek bir ürünün tercih edilmesi maliyet açısından da daha uygundur. Verdiğimiz tıbbi mikrobiyoloji laboratuvar hizmetinin yanı sıra altı adet el antiseptiğinin etkinliğini, kendi laboratuvar personelimizin yardımıyla EN1500 standardı ile test ettik. Çalışma sırasında çeşitli güçlüklerle karşılaşılmıştır. Çalışma sırasında rutin alan dışında olmak kaydı ile geniş bir alana ihtiyaç duyulmaktadır. Laboratuvar personelimiz rutin görevlerinin yanı sıra teste katılmak için ayrıca zaman ayırmak durumunda kalmıştır. Test sonucu elde edilen ilk ve son değer numunelerinin dilüsyon ve ekimlerinin vaktinde yapılabilmesi için yeterli sayıda personelin görevlendirilmesi gerekmektedir. EN1500 standardının her zaman çalışılan bir test olmaması ve sadece talep olduğunda çalışılması nedeniyle sürekli bir ekibin bu işle görevlendirilmesi pratik değildir. Bu nedenle laboratuvarımızda ihale dönemlerinde dahi, EN1500 standardının test edilmesi zor görünmektedir. Sonuç olarak: Bir el antiseptiğinin eldeki bakteri sayısında kaç logluk bir azalma yapması gerektiğinin belirlenebilmesi için saha çalışmaları yapılmalıdır. Bu tür çalışmalar pratik olmaktan uzak ve yüksek maliyetli olsa da EN1500 ve diğer mevcut standartların şartlarının bilinçli bir şekilde tekrar tanımlanması için gerekmektedir. Test edilen antiseptik ürünler içerisinde A, C, D ve E ürünlerinin etiketlerinde hijyenik el antisepsisi için 3 ml x 30 saniye x 1 şeklinde uygulanmaları önerilmiştir. Ancak EN1500 standardına uygun el 83 antisepsisinin sağlanması için gerek bu ürünler gerekse B antiseptiği ve DSÖ-II formülasyonu 3 ml x 30 saniye x 2 şeklinde uygulanmalıdır. Bu nedenle bu ürünleri kullanacak sağlık personelinin yeterli el hijyeni için gereken süre konusunda uyarılması gerekmektedir. Ayrıca A, C, D ve E ürünlerinin etiketlerinde gerekli düzeltmenin yapılması ve bütün antiseptiklerin etiketinde “EN1500 standardının gereğini yerine getirecek düzeyde hijyenik antisepsinin sağlanabilmesi için 3 ml antiseptik ile 30 saniye ovalama yapıldıktan sonra ikinci 3 ml antiseptik ile aynı işlem bir kez daha tekrar edilmelidir.” ibaresinin yer alması sağlanmalıdır. EN1500 standardına uygun düzeyde el antisepsisi 30 saniyede uygulanmak isteniyorsa alkol oranı daha yüksek ürünler tercih edilmelidir. Bunun için alkol oranları etil alkol içeren ürünlerde ağırlıkça %80’in, izopropil alkol içeren ürünlerde ise ağırlıkça %75’in altına inmemelidir. Alkol içeriği yüksek ürünlerin kullanımı sağlık çalışanlarının uyumu ve maliyet açısından da daha avantajlıdır. Alkol bazlı el antiseptiklerinin avantajlarından biri kısa uygulama süresine sahip olmalarıdır. Bir dakikalık uygulama süresi alkol bazlı el antiseptiklerinden beklenen pratik faydayı azaltmaktadır. Yüksek alkol içeriğine sahip ürünler kullanılacaksa bunların cilt kuruluğuna neden olma gibi istenmeyen etkilerinin değerlendirilmesi göz ardı edilmemelidir. Test edilen antiseptiklerin hiç biri EN1500 standardının gereğini 30 saniyelik uygulama için sağlayamadığı halde hepsi de prEN12054 standardının gereğini 30 saniyede kolayca sağlamışlardır. Bu nedenle prEN12054 standardının antiseptiklerin etki gücünün kantitatif olarak karşılaştırılmasını sağlayacak şekilde modifiye edilmesi önerilir. İn vitro testler en azından çok zayıf etkili antiseptiklerin geçemeyeceği şekilde modifiye edilirse gönüllülerin katılımıyla gerçekleştirilen ve daha emek-yoğun ve maliyetli olan EN1500 standardı bu tür ürünler için gereksiz yere uygulanmamış olur. 84 KAYNAKLAR 1. World Health Organization. WHO Guidelines on Hand Hygiene in Health Care. Geneva, Switzerland: World Health Organization Press, 2009 2. Allegranzi B, Pittet D. Role of hand hygiene in healthcare-associated infection prevention. J Hosp Infect 2009;73:305-15 3. Pittet D, Hugonnet S, Harbarth S, Mourouga P, Sauvan V, Touveneau S, Perneger TV. Effectiveness of a hospital-wide programme to improve compliance with hand hygiene. Infection Control Programme. Lancet. 2000;356(9238):1307-12. Erratum in: Lancet 2000;356(9248):2196. 4. Larson EL, Aiello AE, Heilman JM, Lyle CT, Cronquist A, Stahl JB, Della- Latta P. Comparison of different regimens for surgical hand preparation. AORN J. 2001;73(2): 412-20. 5. Boyce JM, Kelliher S, Vallande N. Skin irritation and dryness associated with two hand-hygiene regimens: soap-and-water hand washing versus hand antisepsis with an alcoholic hand gel. Infect Control Hosp Epidemiol. 2000;21(7):442-8. 6. Sartor C, Jacomo V, Duvivier C, Tissot-Dupont H, Sambuc R, Drancourt M. Nosocomial Serratia marcescens infections associated with extrinsic contamination of a liquid nonmedicated soap. Infect Control Hosp Epidemiol. 2000;21(3):196-9. 7. Caetano JA, Lima MA, Di Ciero Miranda M, Serufo JC, Ponte PR. [Identification of bacterial contamination in liquid soap for hospital use]. Rev Esc Enferm USP. 2011;45(1):153-60. Portuguese. 8. Hsueh PR, Teng LJ, Yang PC, Pan HL, Ho SW, Luh KT. Nosocomial pseudoepidemic caused by Bacillus cereus traced to contaminated ethyl alcohol from a liquor factory. J Clin Microbiol. 1999;37(7):2280-4. 9. Nasser RM, Rahi AC, Haddad MF, Daoud Z, Irani-Hakime N, Almawi WY. Outbreak of Burkholderia cepacia bacteremia traced to contaminated hospital water used for dilution of an alcohol skin antiseptic. Infect Control Hosp Epidemiol. 2004;25(3):231-9. 10. Ali Y, Dolan MJ, Fendler EJ, Larson EL. Alcohols. In: Block SS, ed.Disinfection, sterilization and preservation, 5th ed.Philadelphia, PA, Lippincott Williams & Wilkins, 2001:229 - 253. 11. Kurtz JB. Virucidal effect of alcohols against echovirus 11. Lancet. 1979;1(8114):496-7. 12. van Bueren J, Larkin DP, Simpson RA. Inactivation of human immunodeficiency virus type 1 by alcohols. J Hosp Infect. 1994;28(2):137- 48. 13. Schürmann W, Eggers HJ. Antiviral activity of an alcoholic hand disinfectant. Comparison of the in vitro suspension test with in vivo experiments on hands, and on individual fingertips. Antiviral Res. 1983;3(1):25-41. 85 14. Platt J, Bucknall RA. The disinfection of respiratory syncytial virus by isopropanol and a chlorhexidine-detergent handwash. J Hosp Infect. 1985;6(1):89-94. 15. Sattar SA, Tetro J, Springthorpe VS, Giulivi A. Preventing the spread of hepatitis B and C viruses: where are germicides relevant? Am J Infect Control. 2001;29(3):187-97. 16. Sattar SA, Abebe M, Bueti AJ, Jampani H, Newman J, Hua S. Activity of an alcohol-based hand gel against human adeno-, rhino-, and rotaviruses using the fingerpad method. Infect Control Hosp Epidemiol. 2000;21(8):516-9. 17. Blaney DD, Daly ER, Kirkland KB, Tongren JE, Kelso PT, Talbot EA. Use of alcohol-based hand sanitizers as a risk factor for norovirus outbreaks in long-term care facilities in northern New England: December 2006 to March 2007. Am J Infect Control. 2011;39(4):296-301. 18. Lilly HA, Lowbury EJ, Wilkins MD, Zaggy A. Delayed antimicrobial effects of skin disinfection by alcohol. J Hyg (Lond). 1979;82(3):497-500. 19. Rotter M. Hand washing and hand disinfection. In: Mayhall CG, ed. Hospital epidemiology and infection control, 3rd ed. Philadelphia, PA, Lippincott Williams & Wilkins; 2004.1727–1746. 20. Gaonkar TA, Geraldo I, Caraos L, Modak SM. An alcohol hand rub containing a synergistic combination of an emollient and preservatives: prolonged activity against transient pathogens. J Hosp Infect. 2005;59(1):12-8. 21. Harrington C, Walker H. The germicidal action of alcohol. Boston Medical and Surgical Journal 1903; 148:548-52. 22. Larson EL, Eke PI, Wilder MP, Laughon BE. Quantity of soap as a variable in handwashing. Infect Control. 1987;8(9):371-5. 23. Larson EL. APIC guideline for handwashing and hand antisepsis in health care settings. American Journal of Infection Control, 1995, 23:251–269. 24. Baillie L. Chlorhexidine resistance among bacteria isolated from urine of catheterized patients. J Hosp Infect. 1987;10(1):83-6. 25. Ismaeel N, el-Moug T, Furr JR, Russell AD. Resistance of Providencia stuartii to chlorhexidine: a consideration of the role of the inner membrane. J Appl Bacteriol. 1986;60(4):361-7. 26. Moore SL, Payne DN. Types of antimicrobial agents. In: Fraise AP, Lambert PA, Maillard J-Y, eds. Russell, Hugo & Ayliffe’s Principles and practice of disinfection, preservation, and sterilization, 4th ed. Oxford, Blackwell Publishing Ltd, 2004. 8-97. 27. Denton GW. Chlorhexidine. In: Block SS, ed.Disinfection, sterilization and preservation, 5th ed.Philadelphia, PA, Lippincott Wılıams & Wilkins, 2001. 321-336. 28. Walsh B, Blakemore PH, Drabu YJ. The effect of handcream on the antibacterial activity of chlorhexidine gluconate. J Hosp Infect. 1987;9(1):30-3. 29. Montefiori DC, Robinson WE Jr, Modliszewski A, Mitchell WM. Effective inactivation of human immunodeficiency virus with chlorhexidine antiseptics containing detergents and alcohol. J Hosp Infect. 1990;15(3):279-82. 86 30. Aly R, Maibach HI. Comparative study on the antimicrobial effect of 0.5% chlorhexidine gluconate and 70% isopropyl alcohol on the normal flora of hands. Appl Environ Microbiol. 1979;37(3):610-3. 31. Rotter ML, Kampf G, Suchomel M, Kundi M. Population kinetics of the skin flora on gloved hands following surgical hand disinfection with 3 propanol-based hand rubs: a prospective, randomized, double-blind trial. Infect Control Hosp Epidemiol. 2007;28(3):346-50. 32. Comite´ Europe´en de Normalisation. Chemical disinfectants and antiseptics surgical hand disinfection test method and requirement (phase 2/step 2) EN12791. Brussels, Belgium. Comite´ Europe´en de Normalisation, 2006. 33. Gottardi W. Iodine and Iodine compounds. In: Block SS, ed.Disinfection, sterilization and preservation, 5th ed.Philadelphia, PA, Lippincott Wılıams & Wilkins, 2001. 159 – 183. 34. Larson E, Leyden JJ, McGinley KJ, Grove GL, Talbot GH. Physiologic and microbiologic changes in skin related to frequent handwashing. Infect Control. 1986;7(2):59-63. 35. Berkelman RL, Holland BW, Anderson RL. Increased bactericidal activity of dilute preparations of povidone-iodine solutions. J Clin Microbiol. 1982;15(4):635-9. 36. Sheikh W. Comparative antibacterial efficacy of Hibiclens and Betadine in the presence of pus derived from human wounds. Curr Ther Res 1986;40:1096 - 102. 37. Zamora JL, Price MF, Chuang P, Gentry LO. Inhibition of povidone- iodine’s antibacterial activity by common organic substances: an experimental study. Surgery 1985; 98:25 – 9. 38. Paulson DS. Comparative evaluation of five surgical hand scrub preparations. AORN J. 1994;60(2):246, 249-56. 39. Ayliffe GA, Babb JR, Davies JG, Lilly HA. Hand disinfection: a comparison of various agents in laboratory and ward studies. J Hosp Infect. 1988;11(3):226-43. 40. Wade JJ, Casewell MW. The evaluation of residual antimicrobial activity on hands and its clinical relevance. J Hosp Infect. 1991;18 Suppl B:23-8. 41. Gottardi W. The uptake and release of molecular idoien by the skin; chemical and bactericidal evidence of residual effects caused by povidone-iodine preparations. J. Hosp. Infec. 1995; 29:9-18. 42. Berkelman RL, Lewin S, Allen JR, Anderson RL, Budnick LD, Shapiro S, Friedman SM, Nicholas P, Holzman RS, Haley RW. Pseudobacteremia attributed to contamination of povidone-iodine with Pseudomonas cepacia. Ann Intern Med. 1981;95(1):32-6. 43. Merianos JJ. Surface-Active Agents. In: Block SS, ed.Disinfection, sterilization and preservation, 5th ed.Philadelphia, PA, Lippincott Wılıams & Wilkins, 2001. 283 - 320. 44. Frank MJ, Schaffner W. Contaminated aqueous benzalkonium chloride. An unnecessary hospital infection hazard. JAMA. 1976;236(21):2418-9. 45. Nakashima AK, Highsmith AK, Martone WJ. Survival of Serratia marcescens in benzalkonium chloride and in multiple-dose medication 87 vials: relationship to epidemic septic arthritis. J Clin Microbiol. 1987;25(6):1019-21. 46. Widmer AF, Frei R. Decontamination, Disinfection, and Sterilization. In Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA. ed. Manual of Clinical Microbiology 9th ed. Washington DC ASM Pres, 2007. 62-72 47. Mayer S, Boos M, Beyer A, Fluit AC, Schmitz FJ. Distribution of the antiseptic resistance genes qacA, qacB and qacC in 497 methicillin- resistant and -susceptible European isolates of Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother. 2001;47(6):896-7. 48. Heath RJ, Rubin JR, Holland DR, Zhang E, Snow ME, Rock CO. Mechanism of triclosan inhibition of bacterial fatty acid synthesis. J Biol Chem. 1999;274(16):11110-4. 49. McMurry LM, Oethinger M, Levy SB. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 1998;394(6693):531-2. 50. McMurry LM, Oethinger M, Levy SB. Overexpression of marA, soxS, or acrAB produces resistance to triclosan in laboratory and clinical strains of Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 1998;166(2):305-9. 51. McMurry LM, McDermott PF, Levy SB. Genetic evidence that InhA of Mycobacterium smegmatis is a target for triclosan. Antimicrob Agents Chemother. 1999;43(3):711-3. 52. Chuanchuen R, Beinlich K, Schweizer HP. Multidrug efflux pumps and triclosan resistance in Pseudomonas aeruginosa [abstract]. American Society for Microbiology annual meeting, Los Angeles, California, 2000. Abstract 31, p. 8. 53. Russell AD, Furr JR. The antibacterial activity of a new chloroxylenol preparation containing ethylenediamine tetraacetic acid. J Appl 54. Larson E, Talbot GH. An approach for selection of health care personel handwashing agents. Infect Control. 1986;7(8):419-24. 55. Larson E. Guideline for use of topical antimicrobial agents. Am J Infect Control. 1988;16(6):253-66. Review. Erratum in: Am J Infect Control 1991;19(1):59. 56. Bloomfield SF, Arthur M, Begun K, Patel H. Comparative testing of disinfectants using proposed European surface test methods. Lett Appl Microbiol 1993;17:119-25. 57. Das JR, Bhakoo M, Jones MV, Gilbert P. Changes in the biocide susceptibility of Staphylococcus epidermidis and Escherichia coli cells associated with rapid attachment to plastic surfaces. J Appl Microbiol. 1998;84(5):852-8. 58. Lockhart JD. How toxic is hexachlorophene? Pediatrics. 1972;50(2):229- 35. 59. Shuman RM, Leech RW, Alvord EC Jr. Neurotoxicity of hexachlorophene in humans. II. A clinicopathological study of 46 premature infants. Arch Neurol. 1975;32(5):320-5. 60. United States Food and Drug Administration. Tentative final monograph for healthcare antiseptic drug products; proposed rule. Federal Register, 1994:31441–52. 61. ,Reybrouck G. Antifungal activity of disinfectants In: Fraise AP, Lambert PA, Maillard J-Y, eds. Russell, Hugo & Ayliffe’s Principles and practice of 88 disinfection, preservation, and sterilization, 4th ed. Oxford: Blackwell Publishing Ltd; 2004. 220-40 62. Comite´ Europe´en de Normalisation. Chemical disinfectants and antiseptics - application of european standards for chemical disinfectants and antiseptics. prEN14885. Brussels, Belgium. Comite´ Europe´en de Normalisation, 2006. 63. Comite´ Europe´en de Normalisation. Chemical disinfectants and antiseptics - Quantitative suspension test for the evaluation of bactericidal activity of products for hygienic and surgical handrub and handwash used in human medicine - Test method and requirements (phase 2/step 1). prEN12054. Brussels, Belgium. Comite´ Europe´en de Normalisation, 1995. 64. Comite´ Europe´en de Normalisation. Chemical disinfectants and antiseptics - Hygienic handwash - Test method and requirements (phase 2/step 2) EN1499. Brussels, Belgium. Comite´ Europe´en de Normalisation, 1997. 65. Comite´ Europe´en de Normalisation. Chemical disinfectants and antiseptics - Hygienic handrub - Test method and requirements (phase 2/step 2) EN1500. Brussels, Belgium. Comite´ Europe´en de Normalisation, 1997. 66. do Prado MF, Coelho AC, de Brito JP, Ferreira DO, Junior AW, Menecucci Cda S, de Queiroz AB, Garcia LB, Cardoso CL, Tognim MC. Antimicrobial efficacy of alcohol-based hand gels with a 30-s application. Lett Appl Microbiol. 2012;54(6):564-7. 67. Suchomel M, Kundi M, Pittet D, Weinlich M, Rotter ML. Testing of the World Health Organization recommended formulations in their application as hygienic hand rubs and proposals for increased efficacy. Am J Infect Control. 2012;40(4):328-31. 68. Marchetti MG, Kampf G, Finzi G, Salvatorelli G. Evaluation of the bactericidal effect of five products for surgical hand disinfection according to prEN12054 and prEN12791. J Hosp Infect. 2003;54(1):63-7. 69. Quraishi ZA, McGuckin M, Blais FX. Duration of handwashing in intensive care units: a descriptive study. Am J Infect Control. 1984;12(2):83-7. 70. Meengs MR, Giles BK, Chisholm CD, Cordell WH, Nelson DR. Hand washing frequency in an emergency department. J Emerg Nurs. 1994;20(3):183-8. 89 TEŞEKKÜR Tez danışmanım Prof. Dr. Cüneyt Özakın başta olmak üzere, uzmanlık eğitimim sırasında yetişmemde emeği olan değerli hocalarıma, çalışma arkadaşlarıma, istatistiksel değerlendirmeyi yapan Dr. Deniz Sığırlı’ya, deney aşamalarında yardımcı olan kıymetli arkadaşım Emre Kurt’a, maddi ve manevi desteğinden dolayı aileme, özellikle sevgili eşim Burcu Şengül Topaç’a, uzmanlık eğitimim boyunca herhangi bir şekilde bana yardımı dokunan ve ismini sayamadığım herkese ayrı ayrı teşekkürlerimi sunarım. 90 ÖZGEÇMİŞ Adı: Tuncay Soyadı: Topaç Doğum yeri ve tarihi: Bursa, 24.12.1979 Eğitimi: 2008-2013 Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D.- Bursa 1996-2005 Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi - Bursa 1993-1996 Bursa Ali Osman Sönmez Fen Lisesi - Bursa 1990-1993 Bursa Atatürk Lisesi – Bursa 1985-1990 Bursa Altıparmak İlkokulu - Bursa Yabancı dili: İngilizce 91