TOPRAKTAN ĠZOLE EDĠLEN BACILLUS SP. SUġLARINDAN FĠTAZ ENZĠMĠNĠN KISMĠ SAFLAġTIRILMASI VE KARAKTERĠZASYONU Dilara AKÇAKOCA T.C. ULUDAĞ ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ TOPRAKTAN ĠZOLE EDĠLEN BACILLUS SP. SUġLARINDAN FĠTAZ ENZĠMĠNĠN KISMĠ SAFLAġTIRILMASI VE KARAKTERĠZASYONU Dilara AKÇAKOCA Prof. Dr. Elif DEMĠRKAN ( DanıĢman ) YÜKSEK LĠSANS TEZĠ BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI BURSA -2014 TEZ ONAYI Dilara AKÇAKOCA tarafından hazırlanan “Topraktan izole edilen Bacillus sp. suşlarından fitaz enziminin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı‟nda YÜKSEK LĠSANS TEZĠ olarak kabul edilmiştir. DanıĢman: Prof. Dr. Elif DEMİRKAN BaĢkan: Prof. Dr. Elif DEMİRKAN Uludağ Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Anabilim Dalı Üye: Doç. Dr. Sibel TAŞ Uludağ Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Anabilim Dalı Üye: Yrd. Doç. Dr. Figen ERSOY Uludağ Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Ali Osman DEMĠR Enstitü Müdürü …/…/… BĠLĠMSEL ETĠK BĠLDĠRĠMĠ U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalıĢmasında; - tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, - görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, - başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, -atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, - kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, - ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 17/09/2014 Dilara AKÇAKOCA i ÖZET Yüksek Lisans Tezi TOPRAKTAN İZOLE EDİLEN Bacillus sp. SUŞLARINDAN FİTAZ ENZİMİNİN KISMİ SAFLAŞTIRILMASI VE KARAKTERİZASYONU Dilara AKÇAKOCA Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı DanıĢman: Prof. Dr. Elif DEMİRKAN Bu çalışmada Türkiye‟ nin 30 farklı ilinden temin edilen toprak örneklerinden 300 adet bakteri izole edilmiştir. Bakterilerin morfolojik ve fizyolojik özellikleri incelenmiş ve 236 bakteri Bacillus cinsi olarak tanımlanmıştır. Bütün suşların fitaz aktiviteleri fitaz tarama ortamı (PSM) kullanılarak tespit edilmiş ve açık zonların çapı mm olarak gösterilmiştir.Toplam 19 Bacillus sp.suşu ekstraselüler fitaz üreticisi olarak bulunmuştur. Bu suşlar arasında, en geniş zona sahip Bacillus sp.‟nin 2 suşu seçilmiştir. Bunlar Bacillus sp. EBD 9-1 (zon çapı:11 mm) ve EBD 19-9 (zon çapı:9 mm) olarak isimlendirilmiştir. Bakteriler sıvı ortam içinde enzim üretim kapasitesi için test edilmiştir. En yüksek fitaz aktivitesini (600 U/mL) Bacillus sp. EBD 9-1 suşu göstermiştir. Bacillus sp. EBD 9-1 „den elde edilen fitaz kısmen saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Amonyum sülfat çökeltmesi (%70), diyalizasyon ve ultrafiltrasyon saflaştırma aşamasından sonra, enzim 2.06 kez saflaştırılmıştır. Saf enzim üzerine sıcaklık ve stabilitesinin, pH ve stabilitesinin, farklı potansiyel bileşiklerin etkileri araştırılmıştır. Enzimin Km ve Vmax değerleri saptanmış, moleküler ağırlığı belirlenerek enzim karakterize edilmiştir. Saflaştırılan enzimin optimum sıcaklık 60°C olarak bulunmuştur. 60°C‟de ham enzim aktivitesi ile karşılaştırıldığında saflaştırılmış enzim % 20 oranında artmıştır. Termostabilite çalışmaları saf enzimin 60° C'de 50 dakika boyunca % 69 oranında muhafaza edildiğini göstermiştir, bu nedenle termostabil enzim olabilir.Optimum pH değeri 7.0 olarak belirlenmiştir. Saf enzimin aktivitesi asidik tarafa göre alkalin tarafta daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Diğer yandan, fitaz aktivitesi bazı farklı potansiyel bileşikler tarafından etkilenmektedir. Bu çalışmada, 1 mM konsantrasyondaki potansiyel bileşiklerin 5 mM'den daha etkili ++ ++ olduğu saptanmıştır. Ca and Mg gibi metal iyonlarının saf enzim aktivitesi üzerinde stimulatör rol oynadığı belirlenmiştir. Fakat SDS daha güçlü bir inhibitör etki göstermiştir. Saflaştırılmış enzim için Vmax ve Km kinetik değerleri sırasıyla 333 U / ml ve 2 mM olarak bulunmuştur.Enzimin moleküler ağırlığı yaklaşık 45 kDa belirlenmiştir. Burada, yeni fitaz enziminin geniş bir endüstriyel uygulamaya sahip olabileceği ve hayvan yemi katkı maddesi olarak kullanılabileceği rapor edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Fitaz, Bacillus, kısmi saflaştırma, karakterizasyon 2014, xii + 81sayfa. i ABSTRACT MSc Thesis PARTIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF PHYTASE ENZYME FROM Bacillus sp. STRAINS ISOLATED FROM SOIL Dilara Akçakoca Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Elif DEMİRKAN In this study, 300 bacteria were isolated from soil samples are provided from 30 different cities of Turkey. Morphological and physiological features of bacteria were investigated, and 236 bacteria were defined as Bacillus genus. The phytase activities of all strains were assayed using phytase screening medium (PSM), and exhibited as diameter of clear zone in mm. Total 19 Bacillus sp. strains were found as extracellular phytase producer.Among of these strains, two strains of Bacillus sp. that had the largest zones were selected. They were named as Bacillus sp. EBD 9-1 (zone diameter:11 mm) and EBD 19-9 (zone diameter:9 mm). Bacteria were tested for enzyme production capacity in the liquid mediumBacillus sp. EBD 9-1 strain showed the highest phytase activity (600 U/mL).The phytase obtained from Bacillus sp. EBD 9-1 was partial purified and characterized. After the purification steps of ammonium sulphate precipitation (70%), dialization and ultrafiltration,the enzyme was purified 2.06 fold. The effects of temperature and stability, pH and stability, different potential compounds on partial pure enzyme were investigated. Km and Vmax values of the enzyme were calculated, molecular weight was determined and, enzyme was characterized.The optimum temperature of purified enzyme was found as 60°C. The purified enzyme activity compared with crude enzyme activity at 60°C was increased by 20%. Thermostability studies showed that pure enzyme was retained as 69% for 50 min at 60°C, therefore it might be a thermostable enzyme. The optiumum pH was determined as 7.0 It was observed that the activity of pure enzyme is higher at the alkaline sidethan the acidic side.On the other hand, the phytase activity is influenced by several different potential compounds. In this study, 1 mM concentrations of potential compounds was found to be more effective than 5 mM. ++ ++ Metal ions such as Ca and Mg were stimulated on the purified enzyme activity. But, SDS showed stronger inhibitory effect.Kinetic values of Vmax and Km for the purified enzyme were 333 U/mL and 2 mM, respectively. The molecular weight of enzyme was determined about 45 kDa.Here, we reported that novel phytase enzyme may have wide industrial application, and can be as an animal feed additive. Anahtar Kelimeler:Phytase, Bacillus, isolation, partial purification, characterization 2014, xii + 81 pages. ii TEġEKKÜR Lisans dönemimden bu yana bana bilgi ve birikimini daima sunan, yönlendirici fikirleri ile daima yol gösteren, sabrı ve anlayışıyla bana her zaman örnek olup yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Elif DEMİRKAN‟ a, HDP(F) – 2013/29 No‟lu Proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Uludağ Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri Birimi Başkanlığı‟na, Akademik çalışmalarımda ve yaşantımda her zaman yanımda olan ve desteğini esirgemeyen sevgili arkadaşlarım Alev USTA ve Eren BAYGIN‟a, Maddi ve manevi destekleri ile bugüne kadar hep yanımda olan ve varlıklarıyla bana güç veren başta sevgili annem Meral AKÇAKOCA ve sevgili babam Fahri AKÇAKOCA olmak üzere tüm aileme en içten dileklerimle teşekkür eder, sevgi ve saygılarımı sunarım. Dilara AKÇAKOCA 17/09/2014 iii ĠÇĠNDEKĠLER Sayfa ÖZET………………. .................................................................................................... i ABSTRACT ................................................................................................................. ii TEŞEKKÜR ................................................................................................................ iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ................................................................. vii ŞEKİLLER DİZİNİ ...................................................................................................... x ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................... xii 1. GİRİŞ………… ........................................................................................................ 1 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI ...................................................................................... 6 2.1. Fitik Asit (Myo-İnositol Hexaphosphate, Tuz Formu Fitat) Tarihçesi, Kimyasal Yapısı ve Özellikleri …. ............................................................................................... 6 2.2. Fitaz Enzimi (Myo-inositol-hegzafosfat fosfohidrolaz; EC 3.1.3.8). ....................... 9 2.3. Fitaz Enziminin Kaynakları .................................................................................. 13 2.3.1. Bitkisel Fitazlar ................................................................................................. 13 2.3.2. Hayvansal Fitazlar ............................................................................................. 14 2.3.3. Mikrobiyal Fitazlar ............................................................................................ 14 2.4. Fitazların Kullanım Alanları ................................................................................. 17 2.4.1. Yem Katkı Maddesi Olarak ............................................................................... 17 2.4.2. Gıda Sanayi ....................................................................................................... 17 2.4.3. Kağıt Endüstrisi................................................................................................. 18 2.4.4. Toprak İyileştirme ............................................................................................. 19 2.4.5. Biyoteknoloji .................................................................................................... 19 2.5. Bacillus Hakkında Genel Bilgiler ........................................................................ 19 3.. MATERYAL VE YÖNTEM.................................................................................. 21 3.1. Materyal ............................................................................................................... 21 3.2. Yöntem ................................................................................................................ 22 3.2.1. Fitaz Pozitif Bakterilerin İzolasyonu ................................................................. 22 3.2.2. Bacillus‟ un Taksonomik Sınıflandırılması İçin Morfolojik ve Fizyolojik Özelliklerin Belirlenmesi... ......................................................................................... 23 3.2.2.1. Hareketlilik Testi ............................................................................................ 24 3.2.2.2. Katalaz Testi .................................................................................................. 24 iv 3.2.2.3. Gram Boyama ................................................................................................ 24 3.2.2.4. Spor Boyama .................................................................................................. 25 3.2.3.Bakteri Üretiminde Kullanılan Besiyerleri .......................................................... 25 3.2.4.Enzim Üretimi İçin Kullanılan Besiyeri .............................................................. 26 3.2.5.Bakteri Üretim Koşulları .................................................................................... 26 3.2.6.Bakteri Üremesinin Ölçülmesi ............................................................................ 27 3.2.7.Enzim Aktivitesinin Ölçülmesi ........................................................................... 27 3.2.8.İnorganik Fosfat Standart Grafiği ve Hazırlanışı ................................................. 29 3.2.9.Enzim Aktivitesi Ölçümünde Kullanılan Solusyonlar ......................................... 29 3.3.Fitazın Kısmi Saflaştırılması ................................................................................. 30 3.3.1.Amonyum Sülfat Çöktürmesi ............................................................................. 30 3.3.2.Diyaliz……........................................................................................................ 31 3.3.3.Ultrafiltrasyon İle Diyalizatın Konsantre Edilmesi.............................................. 31 3.4.Protein Miktarının Belirlenmesi ............................................................................ 31 3.5.Enzimin Karakterize Edilmesi ............................................................................... 33 3.5.1.Enzim Aktivitesi Üzerine Sıcaklığın Etkisi ......................................................... 33 3.5.2.Enzim Aktivitesi Üzerine pH‟nın Etkisi ............................................................. 33 3.5.3.Enzim Aktivitesi Üzerine Potansiyel Bileşiklerin Etkisi ..................................... 33 3.5.4.Kinetik Parametrelerin Saptanması ..................................................................... 33 3.6.Enzimin Moleküler Ağırlığının Tespiti .................................................................. 33 3.6.1.Çözeltilerin ve Jelin Hazırlanması ...................................................................... 33 3.6.2.Örneklerin Hazırlanması ve Elektroforez Koşulları ............................................ 36 3.6.3.Boyama ve Boyanın Uzaklaştırılması ................................................................. 36 4.BULGULAR ........................................................................................................... 37 4.1.Fitaz Pozitif Bakterilerin Belirlenmesi ................................................................... 37 4.2.Biyokimyasal ve Morfolojik Testler ...................................................................... 39 4.2.1.Biyokimyasal Testler .......................................................................................... 39 4.2.2.Morfolojik Testler .............................................................................................. 40 4.3.Maksimum Fitaz Üretim Ortamının Belirlenmesi .................................................. 44 4.4.İnorganik Fosfat Standart Grafiği ve Hazırlanışı .................................................... 45 4.5.Fitaz Enziminin Kısmi Saflaştırılması ................................................................... 46 4.6.Fitaz Enziminin Karakterizasyonu ......................................................................... 48 v 4.6.1.Enzim Aktivitesi Üzerine Sıcaklığın Etkisi ......................................................... 48 4.6.2.Sıcaklık Stabilitesinin Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi....................................... 49 4.6.3.pH‟nın ve pH Stabilitesinin Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi .............................. 50 4.6.4.Enzim Aktivitesi Üzerine Potansiyel Bileşiklerin Etkisi ..................................... 52 4.6.5.Enzim Aktivitesi Üzerine Substrat Konsantrasyonunun Etkisi ............................ 54 4.7.Enzimin Moleküler Ağırlığının Tespiti .................................................................. 56 5.TARTIŞMA VE SONUÇ ......................................................................................... 59 KAYNAKLAR ........................................................................................................... 70 ÖZGEÇMİŞ................................................................................................................ 81 vi SĠMGELER VE KISALTMALAR DĠZĠNĠ Simgeler Açıklama % Yüzde Orantı [S] Substrat Konsantrasyonu °C Santigrat Derece Cm Santimetre dk Dakika g Gram IU Uluslararası enzim ünitesi kDa Kilodalton Km Michaelis-Menten sabitesi Log Logaritmik M Molar mg Miligram +2 Mg Magnezyum İyonu mL Mililitre mM Milimolar mmol Milimol nm Nanometre μl Mikrolitre μL Mikrolitre μM Mikromolar μmol Mikromol vii Kısaltmalar Açıklama (NH4)2SO4 Amonyum Sülfat APS Amonyum persülfat BaCl2, Baryum Klorür BPP β-Propellar fosfataz BSA Sığır serum albumini Ca+2 Kalsiyum iyonu CaCl2 Kalsiyum Klorür CuSO4, Bakır sülfat EC Enzim Komisyonu EDTA Etilendiamin tetraasetik asit FeSO4, Demir sülfat HAP Histidin asit fosfataz HCl Hidroklorik Asit KH2PO4 Potasyum Dihidrojen Fosfat KI Potasyum İyodür LiSO4, Lityum sülfat Mg+2 Magnezyum İyonu MgSO4 Magnezyum Sülfat MnSO4, Mangan sülfat MW Molecular Weight Na2HPO4.7H2O Disodyum Hidrojen Fosfat Heptahidrat NaCl Sodyum Klorür NaH2PO4.2H2O Sodyum Dihidrojen Fosfat Dehidrat OD Optik Dansite PAGE Poliakrilamid jel elektroforezi PAP Purple asit fosfataz viii PSM Fitaz tarama ortamı rpm Revolutions Per Minute SDS Sodyum dodesil sülfat SDS-PAGE Sodyum dodesil sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi sp. Tür TCA Trikloro asetik asit TEMED N,N,N‟,N‟-Tetrametiletilendiamin Tris 2-Amino-2-Hidroksimetilpropan-1,3-diol Vmax Maksimum enzim aktivitesi ZnSO4, Çinko sülfat ix ġEKĠLLER DĠZĠNĠ Şekil 1. 1.Endüstriyel enzimlerin dünya piyasasındaki payı .............................. ………..4 Şekil 2. 1. Neuberg (1908) ve Anderson (1914) tarafından önerilen fitat (fitik asit) yapısı ..................................................................................................................... 6 Şekil 2. 2.Fitik asit (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexafosfat) .............................................. 7 Şekil 2. 3. Fitik asitteki fosfat grupları ile metal iyon komplekslerindeki farklı bağlanma yolları .................................................................................................................... 7 Şekil 2. 4.Biyokimyasal özellikleri ve sekans analizlerine göre fitazların sınıflandırılması ................................................................................................... 11 Şekil 2. 5. Fitatın, fitaz enzimi ile inositole hidrolizi ................................................... 12 Şekil 3. 1. Kullanılan toprak örneklerinin alındığı iller ................................................ 21 Şekil 3. 2. Protein standart grafiği. .............................................................................. 32 Şekil 4. 1. Fitaz pozitif izolatın besiyerindeki görüntüsü ............................................. 37 Şekil 4. 2. Bacillus sp. izolatların taksonomik özellikleri . ........................................... 39 Şekil 4. 3. Belirlenen kolonilerde serbest oksijenin kabarcıklar halinde görünümü ...... 40 Şekil 4. 4. Bakteriyal koloni tipleri ............................................................................. 40 Şekil 4. 5. EBD 9-1 bakterisinin 100X objektifte görünümü (Olympus CH-2) ............. 41 Şekil 4. 6. Petri kutusundaki yumuşak agarlı besiyerinde hareketlilik kontrolü ............ 41 Şekil 4. 7. Işık mikroskobunda bakterilerin görünümü................................................. 42 Şekil 4. 8.Bakterilerin spor boyama sonrası görünümü ................................................ 43 Şekil 4. 9. Zon çapı yüksek 2 adet bakterinin üreme ve enzim aktivitelerinin karşılaştırılması .................................................................................................... 45 Şekil 4. 10. İnorganik fosfat standart grafiği ................................................................ 41 Şekil 4. 11. Sıcaklığın ham ve kısmi saf enzim üzerine etkisi ...................................... 49 Şekil 4. 12. 60°C‟de ham ve saf enzimin stabilitesi ..................................................... 50 Şekil 4. 13.pH‟nın ham ve kısmi saf enzim üzerine etkisi ............................................ 51 Şekil 4. 14. pH 7.0‟de ham ve saf enzimin stabilitesi .................................................. 52 x Şekil 4. 15. Çeşitli potansiyel bileşiklerin saf enzim üzerine etkisi ............................. 54 Şekil 4. 16. Fitaz aktivitesi üzerine substrat konsantrasyonunun etkisi ......................... 56 Şekil 4. 17.SDS-PAGE sonrası elde edilen jelde protein bandlarının görünümü .......... 57 Şekil 4. 18. Standart proteinlerin Rf değerleri ve molekül ağırlıklarına göre oluşturulan standart eğri ........................................................................................................ 58 xi ÇĠZELGELER DĠZĠNĠ Çizelge 2. 1. Mikrabiyal fitazların bazı özellikleri ....................................................... 16 Çizelge 3. 1. Fitaz pozitif bakterilerin seçiminde kullanılan katı besiyeri ..................... 23 Çizelge 3. 2. Biyokimyasal testlerde kullanılan besiyerleri . ........................................ 24 Çizelge 3. 3. Bakteri üretiminde kullanılan besiyerleri ................................................ 26 Çizelge 3. 4. Fitaz üretimn ortamının tespitinde kullanılan sıvı besiyeri ...................... 26 Çizelge 3. 5. Fitaz aktivite tayini reaksiyon bileşenleri ................................................ 28 Çizelge 4. 1. Fitaz pozitif bakterilerin zon çapları ....................................................... 38 Çizelge 4. 2. Bacillus cinsinin belirlenmesinde kullanılan morfolojik testler ve test sonuçları .............................................................................................................. 43 Çizelge 4. 3. Fitaz içerikli besiyerinde üretilen zon çapı yüksek iki bakterilerin enzim aktivitelerinin karşılaştırılması ............................................................................. 44 Çizelge 4. 4.Farklı konsantrasyonlarda amonyum sülfat çöktürmesi ............................ 47 Çizelge 4. 5. Fitaz enziminin saflaştırma basamakları ................................................. 41 Çizelge 4. 6. Fitaz enzimi üzerine sıcaklığın etkisi ...................................................... 41 Çizelge 4. 7. Sıcaklık stabilitesinin fitaz enzimi üzerine etkisi ..................................... 49 Çizelge 4. 8.Enzim üzerine pH etkisinin belirlenmesi.................................................. 50 Çizelge 4. 9. pH stabilitesinin enzim üzerine etkisi...................................................... 51 Çizelge 4. 10. Potansiyel bileşiklerin enzim aktivitesi üzerine etkisi ............................ 53 Çizelge 4. 11. Fitaz enzimi üzerine substrat konsantrasyonunun etkisi ........................ 55 xii 1. GĠRĠġ Enzimler, canlı organizmalar tarafından üretilen özelleşmiş katalitik fonksiyonlara sahip protein molekülleridir ve canlı organizmaların hayatsal faaliyetlerini gerçekleştirmeleri için gerekli pek çok biyokimyasal reaksiyonlardan sorumludurlar. İlk zamanlar, enzimatik reaksiyonlar nitelikleri bilinmemesine rağmen yazının kullanılmasından çok yıllar önce gözlemlenmiş ve kullanılmıştır. Sütün ekşimesi, şekerin fermentasyon ile alkol oluşturması, şarap, sirke ve peynirin yapılması, ekmeğin mayalanması gibi enzimatik reaksiyonlar çok eskiden beri bilinmekte ve kullanılmaktaydı. Şarap üretimi için fermantasyonun kullanılmasını Yunanlılar Baküs‟e atfederler. Bugün bu reaksiyonların enzimlerden meydana geldiği bilinmektedir. Fakat uzun zaman bu reaksiyonların bazı mikroorganizmaların mevcudiyeti ve canlı halde bulunması ile mümkün olabileceği zannedilmekteydi. Biyolojik kataliz, ilk kez 1800‟lerin ilk yıllarında, mide salgıları vasıtasıyla etin sindirilmesinin, tükürük ve çeşitli bitki ekstraktları vasıtasıyla nişastanın şekere dönüştürülmesinin incelenmesi çalışmalarında tanındı ve tanımlandı. Payen ve Persoz 1833‟de malt ekstratından alkol ile nişastayı parçalayan enzimi presipite etmişler ve diastase adını vermişlerdir. Takriben aynı tarihlerde Beaumont mide suyunun sindirimi kolaylaştırıcı etkisinin kimyasal bir maddeye bağlı olduğunu bulmuş ve 1836‟da da Schwann bu maddeyi izole ederek pepsin adını vermiştir (Polaina ve ark. 2007). Lous Pasteur, 1850‟lerde, şekerin maya vasıtasıyla alkole fermantasyonunun “fermentler” vasıtasıyla katalizlendiği sonucuna vardı ve daha sonra “enzimler” olarak adlandırılan bu fermentlerin canlı maya hücrelerinin yapısından ayrılmaz olduğunu kabul etti. Pasteur‟ün bu görüşü uzun yıllar kabul gördü. Ancak 1897‟de Eduard Buchner tarafından maya ekstraktlarının şekeri alkole fermente edebildiğinin keşfi, fermantasyonu sağlayan enzimlerin canlı hücre yapısından çıkarıldığında da fonksiyon görebildiğini kanıtladı. Hansen 1874 yılında, enzim preparatının (rennet) standart bir şekilde üretildiği ilk ticari firma olan C. Hansen Laboratuvarını kurmuştur. Frederick W. Kühne 1878‟de bu moleküllere „„enzim‟‟ adını vermiştir (Nelson ve Cox 2004, Whitehurst ve Van Oort 2010). Bütün proteinler gibi enzimlerin de monomeri, amino asitlerdir. Enzimleri diğer protein moleküllerinden ayıran özelliği biyokimyasal 1 reaksiyonları katalizleme yeteneğidir ve bu yeteneği sayesinde pek çok çalışma alanlarında ilgi kaynağı olmaktadır (Anonymous 2001, Wolfson ve ark. 2008). Bugün ekmek, bira ve peynir üretimi gibi ekonomik sahalarda, temizlik alanları gibi günlük yaşamda ve bir sağlık alanı olan tıpta teşhis ve tedavide enzimler büyük rol oynamaktadır. Ayrıca, tekstil endüstrisinde, kimya endüstrisinde, kağıt üretiminde gıda endüstrisinde, ziraatta, hayvan beslenmesinde, biyolojik savaşta, atık giderme işlemleri gibi birçok kullanım alanları bulunmaktadır (Daniels 1992, Kirk ve ark. 2002). Enzimlerin çok farklı alanlarda kullanılması, özellikle çevre kirliliğine yol açmamaları, kimyasal süreçleri daha ılımlı koşullarda ve ekonomik olarak gerçekleştirmesi sebebi ile dikkatlerin bu konu üzerine çekilmesine yol açmış ve enzim teknolojisi çok hızlı ilerleyen bir konuma gelmiştir. Enzimler, hayvanlar ve bitkiler tarafından sentezlenmesine rağmen, kontrollü koşullarda kısa sürede ürün elde edilmesinden dolayı mikroorganizmalar asıl kaynağı teşkil etmektedir. Mikrobiyal enzimlerin üretim kolaylığı ve ucuzluğu dolayısıyla kullanımı gün geçtikçe artmakta ve önem kazanmaktadır. Endüstriyel enzimler arasında önemi gittikçe artan fitaz enzimi yem endüstrisinde hayvan beslenmesinde kullanılan önemli bir ekstrasellüler enzimdir (Anonymous 2001, Wolfson ve ark. 2008). Mikrobiyal enzimler yenilenebilir kaynaklardan üretilir ve biyolojik olarak bozulabilir. Enzimlerin üretiminden elde edilen atıklar, toprak verimini arttırmada gübre olarak tarımsal arazilerde kullanılabilir. Çeşitli sektörlerde çevre ve aletlere zararlı etkilere neden olan kimyasalların kullanıldığı eski metodların yerini, biyolojik olarak yıkıma uğrayan enzimlerin kullanıldığı yeni işlemler almaktadır. Enzim kaynağı olarak mikroorganizmaların tercih edilmesinin diğer nedenleri ise, oluşturdukları yan ürünlerin az olması, aktivitelerinin yüksek ve daha stabil olması, ekonomik ve yüksek oranlarda saf olarak üretilebilmeleridir. Örneğin, mikrobiyal enzimlerin ekstrem sıcaklık ve pH değerlerinde, çok yüksek düzeyde aktivite göstermeleri endüstri açısından oldukça önemlidir (Wiseman 1987, Horikoshi 1999, Kirk ve ark. 2002). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık % 90‟ı mikroorganizmalardan üretilmektedir (Wolfgang 2004). 2 Mikroorganizmalardan elde edilen enzimlerin tüm dünya genelinde yıllık kullanım oranlarına bakıldığında % 25 alkalin proteaz, % 21 diğer proteazlar, % 18 amilaz, % 10 renin, % 3 tripsin, % 3 lipaz, % 10 diğer karbohidrat parçalayan enzimler (selülaz ve ksilanaz gibi) ve % 10 kadar ise analitik ve farmasötik enzimlerdir (Rao ve ark. 1998). Bu enzimlerin endüstriyel kullanım alanlarına göre dağılımına bakıldığında, % 29‟unun gıda sektöründe, % 15‟inin hayvan yemi sektöründe, % 56‟sının ise genel teknik alanlarda kullanıldığı görülmektedir (Kirk ve ark. 2002, Schallmey ve ark. 2004). Endüstriyel enzimlerin 2010 yılında dünya piyasasındaki payı tahminen 3,3 milyar dolar civarındadır. Bu pazarın 2015 yılında %6‟lık büyüme oranı ile 4,4 milyar dolara ulaşması beklenmektedir. Teknik enzimler 2010 yılında sadece 1 milyar dolar değerinde iken bu sektör 2015 yılında % 6.6 yıllık bileşik büyüme oranı ile 1,5 milyar dolara ulaşacağı tahmin edilmektedir. Teknik enzimlerin en yüksek satışı, deri pazarının ardından biyoetanol pazarında meydana gelmiştir. Gıda ve içecek enzimleri segmentinın dünya piyasasındaki payı 2010 yılında 975 milyon dolarken bu rakam % 5,1 yıllık bileşik büyüme oranı ile 2015 yılında 1,3 milyar dolara yükseleceği öngörülmektedir. Yem enzimleri pazarı 2013 yılında 275 milyon dolar değerindeyken, bu pazarın 2017 yılında 1 milyar doların üzerine çıkacağı düşünülmektedir. Mevcut küresel fitaz pazarının ise yılda yaklaşık 350 milyon dolar olduğu tahmin edilmektedir. Domuz için tüm diyetler genelinde fıtazın ortalama penetrasyonoranı yaklaşık % 70 olup, tavukçuluk sektöründe bu oran yaklaşık % 90 civarındadır (Anonymous, 2011). 3 ġekil 1.1. Endüstriyel enzimlerin dünya piyasasındaki payı (Anonymous, 2011). Önemli bir endüstriyel enzim olan fitazlar (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase), tahıllar, baklagil ve yağlı tohumların önemli bir içeriği olan Fitat (fitik asit, myo-inositol hexakisphosphate)‟ı hidrolize eden enzim olup, fitatı inorganik monofosfat, myo-inositol fosfat ve serbest myo-inositol‟e hidrolize etmektedir (Kerovuo ve Tynkkynen2000). Fitaz enzimi bakteri, fungus ve maya gibi mikroorganizmalar tarafından sentezlenmektedir. Günümüzde ticari olarak üretimde toprak fungusu olan Aspergillus kullanılsa da, substrat spesifikliği, proteolisise karşı direnç göstermesi ve katalitik aktivitesi gibi özelliklerinden dolayı bakteriyel fitazlar, fungal enzimlere alternatif oluşturabilmektedir (Konietzny ve Greiner 2004). Aerobacter aerogenes (Greaves 1967), Pseudomonas sp. (Irving ve Cosgrove 1971), B. subtilis (Powar ve Jagannathan 1982), Klebsiella sp. (Shah ve Parekh 1990), B. subtilis (natto) (Shimizu 1992), E. coli (Greiner ve ark. 1993), Enterobacter sp.4 (Yoon ve ark. 1996) ve Bacillus sp. DS11 (Kim ve ark. 1998) gibi bakteriler iyi birer fitaz üreticisi olarak rapor edilmiştir. Özellikle Bacillus suşları patojen olmamaları ve sentezledikleri fitazı hücre dışına salgılama yeteneğinde olduklarından endüstride önemli bir yere sahiptir. 4 Bu çalışmada, 30 farklı ilden alınan topraktan izole edilecek olan yeni Bacillus sp. suşlarından maksimum fitaz enzim aktivitesi gösteren bir adet Bacillus sp. seçilerek, bu suş tarafından fitaz üretimi gerçekleştirilecek. Enzim kısmi olarak saflaştırılarak karakterize edilecektir. Saf enzimin optimum sıcaklık, pH ve bunların stabiliteleri; çeşitli metal iyonlarının etkisi; substrat spesifikliği; kinetik parametreleri ve moleküler ağırlığı tespit edilecektir. 5 2. KAYNAK ARAġTIRMASI 2.1.Fitik Asit (myo-inositol hexaphosphate, tuz formu fitat) tarihçesi, kimyasal yapısı ve özellikleri Fitik asidin bulunuşu 1855-1856 yıllarında Hartig‟in bir çok bitki tohumundan nişastasız küçük tanecikleri izole etmesiyle başlar. Hartig bu küçük partiküllerin tohumun çimlenmesi ve bitkinin büyümesi için temel olan maddelerin kaynağı olarak düşünür (Scott ve Loewus 1986,Kim ve ark. 1999). Daha sonra Pfeffer (1872), Hartig tarafından izole edilen bu partiküllerin nişasta içermediğini ancak Ca, Mg ve P içerdiğini bulmuştur. Ayrıca bu partiküller içinde organik maddeler de gözlemlenmiş ve fosfatın karbonhidrat ile birleştiği tahmin edilmiştir ve inosite-fosforik asit olarak adlandırılmıştır (Schulze ve Winterstein 1896). Fitik asidin yapısı yirminci yüzyıl boyunca kimya bilimciler tarafından pek çok kez yoğun tartışılan bir konu olmuştur. Fitik asidin kimyasal yapısı hakkında Neuberg (1908) ve Anderson (1914) tarafından önerilen iki yapı ortaya atılmıştır (Rodriguez ve ark. 2000, Mullaney ve ark. 2002, Lehmann ve ark. 2000) (Şekil.2.1). Bu iki yapı ile ilgili tartışma, bileşiğin içindeki fosfat gruplarının izomerik yapısına üç güçlü bağlı su moleküllerinin dahil olup olmadığı olmuştur.Element analizi, x-ışını kristalografisi ve nükleer manyetik rezonans (NMR) ile yapılan çalışmalar Anderson tarafından önerilen kimyasal yapıyı destekler nitelikte olduğu ortaya çıkmıştır (Purva 2004). ġekil 2. 1. (A) Neuberg (1908) ve (B) Anderson (1914) tarafından önerilen fitat (fitik asit) yapısı. (Tran 2010) 6 Fitik asit, myoinositol halkası ve buna bağlı inorganik fosfattan ibaret serbest bir ester asididir (Şekil 2.2). Kimyasal adı, myoinositol 1,2,3,4,5,6 hekzakis dihidrojen fosfattır. Fitat, fitik asitin Ca, Mg, K ve Fe tuzlarıdır, tahıl ve baklagillerde fosforun depo formudur ve toplam fosforun % 80‟den fazlasını oluşturur (Laboure ve ark. 1993) (Şekil 2.3). Fitatlar, bitki tohumlarında, dane yemlerde, kök ve yumrularda yaygın olarak farklı düzeylerde (%0.1-6.0) bulunurlar. Yemeklik baklagiller diyetsel bir fitat kaynağıdırlar (Ergün ve ark. 2002). ġekil 2.2. Fitik asit (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexafosfat) ġekil 2.3. Fitik asitteki fosfat grupları ile metal iyon komplekslerindeki farklı bağlanma yolları (Tran 2010) 7 Tohumların yanı sıra yan ürünlerinde de % 1-2 oranında fitik asit bulunmaktadır ve bu oran tohumlardaki toplam fosforun % 60‟dan fazlasını oluşturmaktadır (Reddy ve ark. 1982). Bununla birlikte birçok bitki türünün köklerinde, yumrularında, spor ve polenlerinde de daha düşük miktarlarda bulunabilmektedir (Feil 2001). Mısır tohumları, örneğin % 0.89 fitik asit içermektedir ki, total fosforun % 88‟ini oluşturur. Bu nedenle fitin genellikle fosfor ve myo-inositol depo şekli gibi kabul edilir. Her ikisi de tohumun çimlenmesi için gereklidir (Laboure ve ark. 1993). Fitik asit, merkezinde myo-inositol halkasından uzanan altı fosfat grubu ile negatif +2 +2 +2 +2 +2 yüklüdür. Bu özelliğinden dolayı K , Mg , Ca , Zn ve Fe gibi katyonlara mükemmel bir şelatlayıcı olarak rol oynar. Fitik asit ile divalent katyonların oluşturduğu kompleks, normal gastrointestinal pH da, yani pH 4.0-8.0 arasında en az çözünürlüktedir. Bu durum, hayvanlar ve insanlarda bu minerallerin absorbsiyonu ve sindirimini olumsuz etkiler (Raboy 2001). Fitik asit besinlerin besinsel değerini azaltır. Bu sebeplerden dolayı, insanlar ve hayvanlar için anti besinsel faktör olarak kabul edilir (Kumar ve ark. 2010, Sandberg 2002,Bhandari ve Kawabata 2004). Fitik asit yüksek derecede iyonize ortofosfat grubu içerdiği için protein, karbonhidrat ve mineral maddelerle erimeyen kompleks bileşiklerin meydana gelmesine de yol açmaktadır. Böylece bunların sindirilme derecesi azalmaktadır. Fitin fosforunun yeteri kadar değerlendirilememesi önemli miktarda fosforun dışkı ile atılmasına yol açmaktadır. Fitin fosforunun değerlendirilebilmesi için fitik asit molekülünün hidrolize olması gerekmektedir. Monogastrik hayvanlarda (tavuk, domuz ve insanlarda) fitik asidi hidrolize eden enzimlerin yokluğu nedeniyle fitat fosforunu parçalamaları mümkün değildir (Robert ve ark. 2002,Jeri ve ark. 2005). Dolayısıyla bunların yemlerine inorganik fosfat eklenir ve iyi bir büyüme sağlanır. Ancak bu eklenen inorganik fosfat, fitik asidin antinutritive etkisini azaltmaz. Bu problem fitaz eklenip fitat hidrolizinin sağlanması ile çözülebilmiştir (Simell ve ark. 1989). Dolayısıyla fitaz önemli bir endüstriyel enzim ve geniş kapsamlı araştırmaların konusu olmuştur. Son yıllarda fitaz enzimlerinin özellikle hayvan yetiştiriciliği yapılan alanlarda hayvan gübresiyle ortaya çıkan fosfor kirliliğini 8 azaltmak amacıyla kullanımını da gündeme getirmiştir(Simons ve ark. 1990, Cromwell ve ark. 1995) Fitatlara mide-bağırsak sistemindeki bazı mineralleri bağlayıcı ve onların yarayışlılığını azaltan özelliklerinden dolayı besleme değerini azaltan bileşikler gözü ile bakılmıştır. Son zamanlarda yayınlanan veriler kan serumundaki kolesterol ve trigliserit seviyesini düşürmesi yanında, fitatların bağlayıcı özelliklerinin demir kaynaklı bağırsak kanserine karşı koruyucu faydalarının olduğunu göstermiştir. Aynı zamanda, fitatlar lipid peroksidasyonunu azaltma gibi faydaları ile doğal antioksidant özelliği de göstermektedir (Zhou ve Erdman 1995). Buna ilave olarak, yemeklik tane baklagiller önemli derecede kalsiyum, bakır, demir, magnezyum, fosfor, potasyum ve çinko kaynağıdırlar (Geil ve Anderson 1994). Bu minerallerin içeriği ve biyolojik olarak yarayışlılığı büyük oranda bunların işlenme (pişirme) sürecinin derecesine bağlılık göstermekte olup, emilimleri üründe bulunan fitat seviyesine bağlı olarak etkilenmektedir (Liener 1994). Yapılan bir çok çalışmada fitatı parçalayan enzimlerin fitatdan fosfor kullanımını artırmakta olduğu ve çevrede ortofosfat birikimini önemli derecede azalttığı bildirilmiştir (Cromwell ve ark. 1995, Simons ve ark. 1990). Ayrıca bunların yanı sıra myo-inositol fosfatların hazırlanması, kağıt endüstrisi ve toprak iyileştirme alanlarında da fitaz enzimi kullanılmaktadır. Ayrıca son yıllarda biyoteknoloji alanındaki gelişmeler sonucunda heterolog mikrobiyal ekspresyon sistemleriyle büyük miktarlarda ve düşük maliyetli fitaz üretimi de mümkün olabilmektedir. 2.2.Fitaz Enzimi (Myo-inositol-hegzafosfat fosfohidrolaz; EC 3.1.3.8) İlk olarak fitaz aktivitesinin Suzuki vd. (1907) tarafından buğday kepeğinde ve McCollum ve Hart (1908) tarafından buzağıların kanında bulunduğu bildirilmiştir. Daha sonra bitki, maya, bakteri ve funguslarda varlığı belirlenmiştir. Ayrıca insan ve hayvanlarda ince barsak mukozası ve kalın barsaklarda bulunan mikroflora tarafından endojen olarak üretildiği tespit edilmiştir. Fakat bitki ve mikrobiyal fitaz aktivitesinin aksine, insan ve hayvanlarda bulunan endojen fitazın aktivitesinin daha önemsiz olduğu saptanmıştır ( Weremko ve ark. 1997, Kumar ve ark. 2010). 9 Fitatı parçalayan bu enzimler Enzim Sınıflandırılmasında Hidrolazlar grubunda olup, IUPAC-IUB (International Union of Pure and Applied Chemistry and the International Union of Biochemistry) tarafından iki sınıfa ayrılmıştır: Fitatın (D-3) pozisyonundaki ortofosfatı uzaklaştıran 3-fitaz (myo-inositol-hekzakisfosfat 3-fosfohidrolaz, EC 3.1.3.8) ve myo-inositol halkasındaki L-6 (D-4) pozisyonundaki defosforilasyonu sağlayan 6-fitaz (myo-inositol-hekzakisfosfat 6-fosfohidrolaz, EC 3.1.3.26). Mikrobiyal fitazlar genellikle 3-fitaz sınıfında yer alırken bitkisel kökenli fitazlar 6-fitaz sınıfında yer almaktadır (Konietzny ve Greiner 2002). Fakat, bazı istisnalar vardır: soybean fitazı 3-phytase (Phillippy ve Johnston, 1993) and Escherichiacoli fitazı ise 6-phytase (Konietzny ve ark.1993)‟dır (Tran2010) Fitazlar aktif merkezlerinin geometrisi ve katalitik mekanizmalarına göre histidin asit fosfataz (histidine acid phosphatase, HAP) fitazı, ß-pervane fitazı (β-propeller phytase, BPP), mor asit fosfataz (purple acid phosphatase, PAP) fitazı olarak sınıflandırılmıştır. Kataliz için optimum pH değerine göre de, fitazlar asit, nötr ya da alkalin gibi isimlendirilebilir (Mullaney ve Ullah 2003). Histidin asit fitazı I.Sınıfta yer alırken, alkalin fitaz II. Sınıfta yer almaktadır. Oh ve arkadaşları aminoasit sekansları ve biyokimyasal özelliklerine göre 2 büyük grup içerisine almışlardır ( HAP‟lar ve alkalin fitazlar). Bunları da 4 alt gruba ayırmışlardır (Fitaz A, , B, C, D) (Şekil 2.4). (Oh ve ark. 2004).Ancak bitki fitazları bu sınıflandırma içine alınmamaktadır. Bacillus sp.fitazları alkalin ß-pervane fitazı (BPP) içinde yer almaktadır (Kerovuo ve ark. 1998, Kim ve ark. 1998). 10 ġekil 2.4. Biyokimyasal özellikleri ve sekans analizlerine göre fitazların sınıflandırılması (Oh ve ark.2004). Fosfatazlar çeşitli fosfatlı organik moleküllerde monofosfoester bağlarının hidrolizini katalizleyen geniş bir enzim sınıfıdır. Ancak, bu enzimler fitik asitteki monofosfoester bağlarını hidrolizleyemez. Fitatı hidrolizleyen enzimlerin varlığının saptanmasıyla, fitik asidin monofosfoester bağlarını hidrolizleyen enzimlerin fitaz olarak adlandırılan özel bir sınıfa ait olduğu bildirilmiştir (Kerovuo 2000). Fitaz (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase), fitatı (fitik asiti, myo- inositol-1,2,3,4,5,6-hexakis dihidrojen fosfat), inorganik monofosfat, myo-inositol fosfat ve serbest myo-inositol‟e hidrolize eden enzimdir (Kerovuo 2000) (Şekil 2.5). Fitazlar genelde histidin asit fosfataz ailesine ait olup, fosforil transfer reaksiyonunda, fosfohistidin ara ürünlerini kullanan fosfotazların alt sınıfıdır (Van Etten 1982, Pasamontes ve ark. 1997, Lei ve ark. 2007). 11 ġekil 2.5. Fitatın, fitaz enzimi ile inositole hidrolizi(Yu ve ark.2012). Fitaz enzimi Shieh ve Ware (1968) tarafından, fitatın hidrolizi sonucu serbest kalan inorganik fosfattan dolayı, bitki orjinli hayvan yemlerinin değerini arttırmak için, hayvan yemi katkısı olarak önerilmiştir (Mitchell ve ark. 1997). İlk ticari fitaz enzimi olan Natuphos, ilk olarak Aspergillus niger‟den izole edilmiş, 10 N-glikolizasyon bölgeleri ile 80 kDa moleküler ağırlığa sahip ve 1.4 kb DNA fragmenti tarafından kodlanmış, Aspergillus niger PhyA‟dır (Van Hartingsveldt ve ark. 1993, Han ve Lei 1999) ve 1991‟de piyasaya çıkmıştır. Fitazlar, genellikle 40-100 kDa moleküler ağırlığa sahip olan monomerik protein olarak değerlendirilmektedir. Geniş substrat spesifikliği göstermekle birlikte, genellikle optimum pH ve sıcaklığı 4.5-6.0 ve 45-60°C‟dır.Fitazın kristal yapısı, 2.5 A° çözünürlükte tespit edilmiştir. Fitazın immobilizasyonu, thermostabilitesini arttırmak için bulunmuştur (Pandey ve ark. 2001). Fitaz enzimi bakteri, fungus ve maya gibi mikroorganizmalar tarafından sentezlenmektedir. Günümüzde ticari olarak üretimde toprak fungusu olan Aspergillus üzerinde durulmaktadır. Ancak substrat spesifikliği, proteolisise karşı direnç göstermesi ve katalitik aktivitesi gibi özelliklerinden dolayı bakteriyel fitazlar, fungal enzimlere alternatif oluşturabilmektedir (Konietzny ve Greiner 2004). Aerobacter aerogenes (Greaves 1967), Pseudomonas sp. (Irving ve Cosgrove 1971), B. subtilis (Powar ve Jagannathan 1982), Klebsiella sp. (Shah ve Parekh,1990), B. subtilis (natto) (Shimizu 1992), E. coli (Greiner ve ark. 1993), Enterobacter sp.4 (Yoon ve ark. 1996) ve Bacillus 12 sp. DS11 (Kim ve ark. 1998) gibi bakterilerde saptanmıştır. Bacillus suşları patojen olmamaları ve sentezledikleri fitazı hücre dışına salgılama yeteneğinde olduklarından endüstride önemli bir yere sahiptir. Bacillus fitazlarının moleküler ağırlığı 38-47 kDa, nötral pH‟da optimal ve optimum sıcaklığı 55-70°C arasındadır (Polaina ve MacCabe 2007). Fitazın gübreyle atılan fosfor miktarında meydana getirmiş olduğu azalma %20 ile 50 arasında değişmektedir (Kornegay 2001). Fitaz enzimi kullanımı Avrupa‟da giderek yaygınlaşmış ve bazı Avrupa ülkelerinde bu zorunlu hale getirilmiştir (Kutlu 2000). Dünyadaki fitaz pazarının her yıl %5 artması ile 200 milyon $‟dan daha fazla bir değerde olduğu tahmin edilmektedir (Anonymous 2009). 2.3.Fitaz Enziminin Kaynakları 2.3.1. Bitkisel Fitazlar Fitaz aktivitesi hububat, bakliyat ve yağlı tohumlarda (Viveros ve ark. 2000) ya da avokado ve taze soğan yaprakları gibi oldukça tüketilen meyve ve sebzelerde tespit edilmiştir (Phillippy ve Wyatt 2001). Bazı tahıl taneleri (buğday, kavuzlu buğday, çavdar, arpa, tritikale) 5.000 unit/kg‟den daha fazla aktiviteye ulaşabilen yüksek seviyede fitaz aktivitesi gösterirler. Bu tahılların ve ürünlerinin bitkisel fitaz kaynağı olarak kullanımı, hayvan beslenme çalışmalarında denenmiştir (Han ve ark. 1997). Bitkilerden elde edilen fitazlar genelde optimum pH‟sı 4.5-6.0 ve optimum sıcaklığı 38- 55 °C aralığında olan histidin asit fosfatazlardır. Bunun yanında bitki fitazlarının kinetik özelliklerinde büyük farklılıklar bulunmaktadır (Km 30-300 μM; kcat 43-704 s−1 ve spesifik aktivite 43-636 U/mg protein). Moleküler ağırlıkları 47-76 kDa‟dur (Lei ve ark. 2007). Histidin asit fosfotaz ailesindeki bitkisel fitazlar, genellikle 6-fitaz olarak kabul edilir. Ancak, yapılan çalışmalarda bitkisel fitazların bazılarının (Lupin LP11 and LP12) ortofosfatı hidrolizlemeye, inositol halkasının D-3 pozisyonundan başladığı belirlenmiştir (Greiner ve ark. 2002). Bazı bitkisel fitazların alkalin fosfataz ya da purple asit fosfataz olduğu saptanmıştır. Zambak poleni fitazının optimum pH‟sının 8.0 ve sıcaklığının ise, 55°C olduğu bildirilmiştir (Jog ve ark. 2005). Enzimin kalsiyum tarafından aktive olduğu, EDTA tarafından inhibisyona uğradığı ve son ürün olarak D- myo-Ins-1,2,3-trifosfat açığa çıktığı ve dar bir substrat spesifikliğine sahip olduğu 13 bildirilmiştir. Hegeman (2001) çimlenmiş soya fasülyesinden izole edilen fitaz geninin, histidin asit fosfataza hiçbir benzerlik göstermediğini, fakat iki çekirdekli Fe(III)-Me(II) merkezini içermesi ile purple asit fosfotazlara yüksek oranda benzerlik gösterdiğini bildirmiştir. Enzimin optimum pH‟sının 4.5-5.0 ve optimum sıcaklığının 58°C olduğu belirlenmiştir. Optimum pH‟sı asidik olan bitki fitazlarının yanısıra alkali ortamda optimum aktivite gösteren bitki fitazları da mevcuttur. Bu nedenle bitki fitazları optimum pH‟sına göre asidik ve alkali olmak üzere iki gruba ayrılabilir. Asidik bitki fitazları, pH 5.0, alkali fitazlar ise, pH 8.0 civarında optimum aktiviteye sahiptirler. 2.3.2. Hayvansal Fitazlar Fitaz aktivitesi çeşitli hayvan türlerinin dokularında tespit edilmesine (Bitar ve Reinhold 1972) rağmen, hayvansal kaynaklı fitazların hiçbirinin moleküler karakterizasyonu tamamlanmamıştır. Bu enzimlerin çoğu fitat için Km değeri, 0.03-2.6 mM aralığındadır. Hayvansal fitazlar nötral ve alkali aralıkta optimum pH göstermesine rağmen, kümes hayvanlarının bağırsak epitel hücrelerinde yapılan bir çalışmada, optimum pH‟nın 5.5- 6.0 olduğu gösterilmiştir (Ellestad ve ark. 2002). Fitazlar bağırsak epitel hücre membranından izole edilmiş olsa da (Maenz ve Classen 1998, Ellestad ve ark. 2002), tek mideli hayvanlarda besinsel fitat fosforunun kullanılabilirliğini arttırmak için, düşük maliyetli ekzojen fitazın ilave edilmesi hayvansal fitazın araştırılmasını gölgede bırakmıştır. Kalın bağırsak veya rumende bulunan fitaz aktivitesi esasen mikrobiyal kökenlidir (Wise ve Gilburt 1982, Yanke ve ark. 1998). 2.3.3. Mikrobiyal fitazlar Fitaz enzimi bitkilerde, mikroorganizmalarda ve bazı hayvansal dokularda bulunmasına rağmen yapılan son araştırmalar mikrobiyal fitazların biyoteknolojik uygulamalar için en ümit verici olduğunu göstermiştir (Pandey ve ark. 2001, Vohra ve Satyanarayana 2003). Bakteri, maya ve funguslardan fitaz enzimleri karakterize edilmiş olup (Çizelge 2.1), günümüzde ticari olarak üretimde toprak fungusu olan Aspergillus üzerinde durulmaktadır. Ancak substrat spesifitesi, proteolisise karşı direnç göstermesi 14 ve katalitik aktivitesi gibi özelliklerinden dolayı bakteriyel fitazlar, fungal enzimlere alternatif oluşturabilmektedir (Konietzyn ve Greiner 2004). Bakteriyel fitazların ortalama olarak moleküler ağırlığı (40-55 kDa) glukolizasyon farkı olduğu için fungal fitazlardan (80-120 kDa) daha küçüktür (Choi ve ark. 2001, Golovan ve ark. 2000, Han ve Lei 1999, Kerovuo ve ark. 1998, Rodriguez ve ark. 2000a, Van Hartingveldt ve ark.1993). İzole edilen fitazların çoğunun pH optimumu 4.5-6.0 arasında yer almaktadır. Ancak Bacillus sp.‟ye ait nötral veya alkali fitazlar da bulunmaktadır (Choi ve ark. 2001, Kim ve ark. 1998). A. niger fitazının (phyA) pH optimumu ise asidik sınırlarda olup 2.5 ve 5.5‟dir. Bu iki sınır arasında aktivitede azalma meydana gelmektedir. Mikrobiyal fitazların çoğunun sıcaklık optimumu ise 45-60°C arasında yer almaktadır. Ancak Pasamontes ve ark. (1997 a,b) A. fumigatus‟a ait sıcaklığa dirençli fitazın 100°C‟ye kadar olan sıcaklıklarda 20 dakikalık inkübasyonlarda sadece %10‟luk kayıpla aktivitesini koruduğunu bildirmişlerdir. 15 Çizelge 2.1. Mikrobiyal Fitazların bazı özellikleri Fitaz Kaynağı pH optimumu Sıcaklık optimumu Spesifik aktivite (U/mg) Aspergillus niger 2.2, 5.0-5.5 55-58 50-103 Aspergillus terreus 5.0-5.5 70 142-196 Aspergillus fumigatus 5.0-6.0 60 23-28 Aspergillus oryzae 5.5 50 11 Aspergillus caespitosus 5.5 80 - Emericella nidulans 6.5 - 29-33 Myceliophthora thermophila 5.5 - 42 Thermomyces lanuginosus 6.0 65 110 Penicillium simplicissimum 4.0 55 3 Penicillium lycii 5.5 58 1080 Cladosporium 3.5 40 909 Pichia anomala 4.0 60 - Candida krusei 4.6 40 1210 Escherichia coli 4.5 55-60 811-1810 Klebsiella terrigena 5.0 58 205 Klebsiella pneumoniae 5.0, 5.5 50, 60 224, 297 Klebsiella aerogenes 4.5, 5.2 68 - Pantoea agglomerans 4.5 60 23 Citrobacter braaki 4.0 50 3457 Pseudomonas syringae 5.5 40 769 Bacilus subtilis 6.5-7.5 55-60 9-15 16 2.4.Fitaz enziminin kullanım alanları 2.4.1. Yem katkı maddesi olarak Fitat, tohumların çimlenmesi sırasında enerji ve fosfor kaynağı olarak görev alsa da bağlı fosfor tek mideli hayvanlarca çok az miktarda kullanılabilmektedir. Bu nedenle inorganik fosfor yenilenemez ve pahalı bir mineral olup kanatlı, domuz ve balık rasyonlarında fosfor kaynağı olarak ilave edilmektedir (Lei ve Porres 2003). Fitat ve fitata bağlı fosfor tüm kanatlı rasyonlarında bulunmakta ve fitat fosforunun da kısmen kullanıldığı bilinmekteydi (Lowe ve ark. 1939). İlk olarak Warden ve Schaible (1962), broylerde, ekzogen olarak verilen fitazın, fitat fosforunun kullanımını ve kemikteki mineralizasyonu artırdığını bildirmişlerdir. Ancak bundan yaklaşık 30 yıl sonra, yem katkısı olarak, fitata bağlı fosforu serbest bırakacak ve fosfor atığını azaltacak Aspergillus niger fitazının ticari olarak kullanımı başlamıştır. Günümüzde tek mideli hayvanlarda yem katkısı olarak fitaz kullanımı oldukça yaygınlaşmış olup hatta nişasta tabiatında olmayan polisakkaritleri parçalayan enzimlerden daha fazla kullanılmaktadır (Bedford 2003). Geçtiğimiz 10 yıl içerisinde kanatlı ve domuz rasyonlarında mikrobiyal fitaz kullanımı ile bu konudaki bilimsel çalışmalar ve deneyimler artmakta ve yem katkısı yeni fitaz enzimleri araştırılmakta ve kullanılmaktadır. Ruminantlar ise, rumendeki mikrobiyal flora tarafından üretilen fitaz enzimi ile fitatı parçalayabilmektedirler (Yanke ve ark. 1998). Fitatın parçalanması ile açığa çıkan fosfor hem mikrobiyal flora hem de konakçı ruminant tarafından kullanılmaktadır. 2.4.2. Gıda Sanayi Fitik asit tuzları olarak tanımlanan fitatlar, bitki tohumları ve danelerde fosfat ve inositolün başlıca depo formudur. Fitat bitki tohumlarının olgunlaşması sırasında oluşur ve olgun tohumlarda toplam fosfatın %60-90‟nını oluşturur (Loewus 2002). Fitat bu nedenle bitkisel kökenli gıdaların başlıca bileşenidir.Ancakfitat, besinlerdeki proteinler, amino asitler, kalsiyum, magnezyum, demir ve çinko gibi metal iyonlar ile suda çözünmez kompleksler oluşturduğundan dolayı anti besinsel faktör olarak hareket etmektedir. Bundan dolayı, diyetlerdeki bitki kökenli gıdaların miktarına ve gıdaların işlenme derecelerine bağlı olarak günlük fitat tüketimi en fazla 4500 mg‟a kadar 17 yükselmelidir. Ortalama olarak vejetaryen diyetlerinde ve gelişmekte olan ülkelerde kırsal kesimlerde günlük fitat tüketimi yaklaşık 2000-2600 mg olup bu değer karışık diyetlerde 150-1400 mg‟dır (Reddy 2002). Diyetlerde fitatın varlığı ile ilgilenilmesinin nedeni mineral alımındaki negatif etkisidir. Bu mineraller çinko, demir, kalsiyum, magnezyum, manganez ve bakırdır (Konietzny ve Greiner 2003, Lopez ve ark. 2002). Fizyolojik pH değerlerinde çözünmez mineral- fitat komplekslerinin oluşumu düşük mineral emiliminin temel nedeni olarak bildirilmektedir. Çünkü bu kompleksler aslında insan sindirim sisteminde absorbe olmamaktadır. Ayrıca sindirim sisteminin üst kısmında sınırlı miktarda mikrobiyal popülasyonun olması ve içsel fitatı hidrolize edici enzimlerin olmaması nedenleri ile ince bağırsakta, fitat çok sınırlı miktarda hidroliz olabilmektedir (Iqbal ve ark. 1994). Fitaz enzimi yem katkısı olarak kullanılmasının yanı sıra gıda sanayinde de büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak şimdiye kadar marketlerde fitaz enzimi kullanılmış gıdalar bulunmamaktaydı. Bu alandaki çalışmalar, gıda işlemede teknik geliştirmenin yanı sıra bitki kökenli gıdaların besleyici değerlerinin artırılması üzerine yoğunlaşmıştır. Fitat içeriği yüksek diyetler mineral maddelerin absorbsiyonunu oldukça azaltmakta (Konietzny ve Greiner 2003, Lopez ve ark. 2002) ve gıdaların işlenmeleri sırasında fitatın defosforilasyonu, sadece kısmen fosforile olmuş myo-inositol fosfat esterlerinin oluşmasına neden olmaktadır (Sandberg ve ark. 1999). Gıda sanayinde gıdaların işlenmesi sırasında fitaz ilavesi ekmek yapımı (Haros ve ark. 2001), bitkisel protein izolatlarının üretimi (Fredrikson ve ark. 2001, Wang ve ark. 1999) ve tahıl kepeklerini parçalamada kullanılmaktadır (Kvist ve ark. 2005). 2.4.3. Kağıt endüstrisi Kağıt endüstrisinde bitki fitik asitinin uzaklaştırılması oldukça önemlidir. Günümüzde termostabil fitazlar, kağıt hamuru ve kağıt yapma aşamalarında fitik asiti parçalamak amacıyla kullanılan biyolojik maddelerdir. Fitik asitin enzimatik olarak parçalanması sonucunda kanserojen veya toksik maddeler içeren ürünler oluşmaz. Bu nedenle kağıt endüstrisinde fitaz enzimlerinin kullanımı, daha temiz bir teknolojinin kullanılmış olması ve dolayısıyla çevreyi koruma açısından önem taşımaktadır (Liu ve ark. 1998). 18 2.4.4. Toprak iyileĢtirme Bazı alanlarda toprakta, fitik asit ve türevleri toplam organik fosforun %50‟sini oluşturabilmektedir (Dalal 1978). Findenegg ve Nelemans (1993), mısır bitkisi için topraktaki fitik asitten fosforun kullanılabilmesinde fitazın etkisini araştırmışlardır. Toprağa fitaz ilave edildiğinde fitinin parçalanma oranının artmasına bağlı o larak büyümeyi uyardığını bildirmişlerdir. Bu çalışma bitkilerin köklerinde fitaz geninin ekspresyonu ile transgenik bitkilerle topraktaki fosforun kullanılabileceği düşüncesini ortaya çıkarmıştır (Day 1996). 2.4.5. Biyoteknoloji Geçtiğimiz 20 yıl içerisinde fitaz enzimi, besleme, çevre koruma ve biyoteknoloji alanlarındaki bilim adamlarının dikkatini çekmektedir. Fitazlar özellikle biyoteknolojik uygulamalarda (özellikle yem ve gıdalardaki fitat içeriğini azaltmada) büyük bir önem taşımaktadır (Lei ve Stahl 2001, Vohra ve Satyanarayana 2003). 2.5.Bacillus Hakkında Genel Bilgiler Bacillus adı, 1872 yılında Ferdinand Cohn tarafından ilk defa kullanılmıştır (Lin 1997). Bacillaceae familyasına dâhil olup, Gram pozitif (bazı türleri değişken), aerobik veya fakültatif anaerobik, spor oluşturan, çubuk şeklinde bakterilerdir. Çoğunlukla mezofilik olmakla birlikte psikrotrof ve termofilik türleri de vardır (Ayhan 2000). Endospor oluştururlar. Vejetatif hücreler 0,5x1,2 μm ile 2,5x10 μm çapındadır. Bacillus cinsinin koloni morfolojisi çeşitlilik gösterir. Tek ya da çok sayıda hücreden oluşan uzun zincirler meydana getirebilirler. Hücrede bulunan sporun şekli ve yeri, türler arasında farklılık gösterir. Sporlar genellikle silindirik, elipsoidal, oval ya da yuvarlaktır. Sporun hücre üzerindeki konumu ise merkezde, merkeze yakın veya uçta bulunabilir (Lennete ve ark. 1985). Bacillus‟ların tanımlanması ve türler arasındaki farklılıkların belirlenmesinde spor ve konumları temel alınabilmektedir. Bazı türler fakültatif anaerob özellikte olsalar ve oksidaz testleri değişkenlik gösterse de, daima katalaz pozitiftirler. Bilinen birkaç tür hareketsizdir. Tür düzeyinde 19 tanımlamada önemli bir yer tutan spor şekilleri ve konumları, faz-kontrast veya spor boyama ile kolayca saptanabilir. Şekerleri fermente ederler ve sonuçta gaz oluşumu görülmeksizin asit üretirler. Proteinleri ise, amonyak oluşturarak parçalarlar ve böylece kokuşmaya neden olurlar. DNA'larındaki G+C mol oranı %32-62'dir (Çon ve GÖKALP 1997). Bütün türleri Nutrient Agar, Trypticase Soy Agar, Brain Heart Infusion ve Kanlı Agar gibi besiyerlerinde oldukça iyi ürer. Karbon kaynağı olarak organik asit, şeker ve alkol içeren; nitrojen kaynağı olarak da amonyum bulunduran sentetik ortamlarda çok iyi gelişirler (Kaynar ve Beyatlı 2006). Bacillus cinsi bakteriler toprak, hayvan dışkıları ve bitkisel atıklar üzerinde yaygın olarak bulunurlar. Bu cinsin bireylerinin çoğu zararsız, izolasyonu ve teşhisi kolay, hızlı büyüme oranı ile fermentasyon süresi kısadır. Genel olarak güvenli olmaları, sentezledikleri proteinleri dış ortama salgılama kapasiteleri gibi birçok nedenden dolayı cazip endüstriyel organizmalardır. Bacillus türleri çeşitli kompleks substratlara karşı aktivite gösteren çok sayıda ve çeşitli hidrolitik enzimler üretmekte ve salgılamaktadırlar. Bu nedenle Bacillus cinsindeki organizmalar, endüstriyel alanda α- amilaz, fitaz, proteaz, glukanaz, glukoz izomeraz ve endonükleaz gibi enzimlerin üretiminde yaygın şekilde kullanılmaktadırlar (Arıkan ve Gözükara 2012) 20 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1.Materyal Çalışmada kullanılacak Bacillus suşları Türkiye‟nin 30 farklı ilinden alınan toprak örneklerinden izole edilmiştir. İzolasyon sonucu en yüksek fitaz aktivitesine sahip Bacillus sp.‟ler farklı içerikli ortamlarda üretilmişler ve bunlardan en iyi enzim aktivitesinin saptandığı üreme ortamı ve Bacillus sp. Tespit edilerek, çalışmaya bu bakteri ile devam edilmiştir ve Bacillus sp.‟ler daha sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere kültür saklama besiyerinde korunmuştur. ġekil 3.1. Kullanılan toprak örneklerinin alındığı iller: Adana, Amasya, Ardahan, Artvin, Balıkesir, Bartın, Bilecik, Burdur, Denizli, Edirne, Eskişehir, Hatay, Kastamonu, Kayseri, Kırklareli, Kocaeli, Konya, Kütahya, Malatya, Manisa, Mersin, Niğde, Ordu, Sakarya, Sinop, Sivas, Trabzon, Tunceli, Tokat, Zonguldak. 21 3.2.Yöntem 3.2.1. Fitaz pozitif bakterilerin izolasyonu Çalışmalarda kullanılacak olan fitaz pozitif bakterilerin izolasyonu için,toprakların ince kısmından 0,25 g tartılmış ve 10 ml steril fizyolojik tuzlu su içerisinde iyice vortekslenerek karıştırılmıştır. Örnekler, 60°C‟ de 30 dakika tutularak vejetatif formların ölmesi, ortamda yalnızca sporlu bakterilerin kalması sağlanmış ve tüplerin ağızları kapatılarak soğumaya bırakılmıştır (Lennette ve ark. 1985) Bakterilerin fitaz üretme kapasitelerinin katı besiyerde belirlenmesi amacıyla modifiye edilmiş fitaz tarama ortamı (PSM) kullanılmıştır (Çizelge 3.1). Fitaz tarama ortamının hazırlanmasında, tüm maddeler miktarına uygun bir şekilde ölçülüp erlende karıştırılmış ve bu şekilde otoklavlanmıştır. Otoklav işlemi bittikten sonra 50-55°C‟ ye kadar soğutulan besiyerleri, 180°C‟ de 1 saat pastör fırınında steril edilen petri kaplarına 15‟er ml dökülerek soğumaya bırakılmıştır. -4 -5 -6 -7 -8 -9 Farklı illerden alınan toprak örneklerinden 10 , 10 , 10 , 10 , 10 ve 10 olmak üzere seri dilüsyonlar yapılmış ve petrilere 0,1 mL örnek pipetlenerek yayma yöntemine göre ekim yapılmıştır (Temiz 1994). Ekimi tamamlanan petriler 37°C‟ de 96 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda petri kaplarındaki koloniler gözlemlenmiş, zon oluşumunun varlığına göre bakteriler fitaz pozitif olarak değerlendirilmiştir. Zonların büyüklükleri cetvel ile ölçülmüştür. Çalışmada zon çapı büyük olan suşlar seçilmiş ve saf kültür olarak nütrient brothlu agarlı ortamda kültüre edilerek, daha sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere +4°C‟ de saklanmıştır. 22 Çizelge 3.1. Fitaz pozitif bakterilerin seçiminde kullanılan katı besiyeri (Howson ve Davis 1983) Ġçerik Fitatlı besiyeri (g/L) Glukoz 20 Na-Fitat 4 CaCl2.2H2O 2 NH4NO3 5 KCl 0,5 MgSO4.7H2O 0,5 FeSO4.7H2O 0,01 MnSO4.7H2O 0,01 Agar 15 pH 7.0 3.2.2. Bacillus’ un taksonomik sınıflandırılması için morfolojik ve fizyolojik özelliklerinin belirlenmesi Elde edilen bakterilerden, en büyük zon çapına sahip bakterilerin saf kültürlerinin morfolojik ve fizyolojik özellikleri incelenerek, Bergey’s Manual of Systematic Microbiology’ den alınan tayin anahtarına göre Bacillus’ lar belirlenmiştir (Buchanan and Gibbons 1974). 23 Çizelge 3. 2. Biyokimyasal testlerde kullanılan besiyerleri (Çotuk 2003). Hareketlilik Katalaz Spor Gram Ġçerik Testi Testi Boyama Boyama (% g) (% g) (% g) (% g) NiĢasta - - - - Nutrient Broth 0.8 0.8 0.8 0.8 Agar 1 2 1 1 pH 7.0 7.0 7.0 7.0 Bacillus cinsini tanımak için 2 adet biyokimyasal test ve 2 adet morfolojik test olmak üzere, toplam 4 adet test yapılmıştır (Çizelge 3.2). 3.2.2.1.Hareketlilik testi Hareketlilik testi için agar ve nutrient broth kullanılarak ortam hazırlanmıştır (Çizelge 3.2). Steril petriler, alt taraflarından kalemle çizilerek ikiye bölünmüş ve bakteri ekilecek kısım işaretlenmiştir. Belirlenen bölgeye 0.1 mL pipetlenen üremiş sıvı kültür, çizgiyi geçmeyecek şekilde, drigalski özesi ile iyice yayıldıktan sonra 37°C‟ de 18 saat boyunca inkübasyona bırakılmıştır (Temiz 1994). 3.2.2.2.Katalaz testi Katalaz testinde katı ve sıvı ortamlar kullanılarak, farklı yöntemlerle test yapılabilmektedir. Çalışmada ise, % 0.8 nutrient broth içeren agarlı ortama ekilmiş bakteriler, 18 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda oluşan koloniler üzerine 1-2 damla % 3‟ lük H2O2 damlatılmış ve gaz çıkışı olup olmamasına göre değerlendirme yapılmıştır. 3.2.2.3.Gram boyama Gram boyama işlemi Temiz (1994)‟ in belirttiği yönteme göre yapılmıştır. Buna göre; bakterilerin 18 saatlik taze kültürlerinden, steril öze ile alınarak 1 damla steril distile su ile yayma preparat hazırlanmış ve preparatlar havada kurumaya bırakılmıştır. Kuruma tamamlandıktan sonra lamlar 3 defa alevden geçirilerek tespit işlemi yapılmıştır. Daha 24 sonra lamların üzerine, mikrobiyal film tabakasını kaplayacak şekilde, bol miktarda kristal viole damlatılarak 1 dakika beklenmiştir. Kristal viole yıkanarak uzaklaştırıldıktan sonra lamların üzerine % 0.5 I ve % 5 KI ile hazırlanmış gram iyodin (lugol) dökülerek yine 1 dakika beklenmiştir. Boya, suyla uzaklaştırılmış ve lamlar % 95‟lik etil alkol ile renk kayboluncaya kadar yıkanmıştır. Ardından, film tabakasının üzerine safranin eklenmiş ve 45 saniye beklenmiş ve boya yıkanarak uzaklaştırılmıştır. Bu şekilde hazırlanan preparatlar, havada kurutulmuş ve immersiyon yağı ile 10x100‟ lük objektifte, Olympus CH-2 marka ışık mikroskobunda incelenmiştir. İyi boyanmış olan örneklerde Gram (+) olan mikroorganizmalar koyu mor (menekşe) renkli, Gram (-) olanlar ise açık pembe renkli görünümleri ile ayırt edilmiştir. 3.2.2.4.Spor boyama Endospor boyama işlemi Özkaya-Durlu (2000)‟ nun belirttiği yönteme göre yapılmıştır. Buna göre; taze kültürleri hazırlanan bakteriler, lam üzerine 1 damla steril distile su ile iyice yayılarak havada kurutulmuş ardından 3 kez alevden geçirilerek fikse edilmiştir. Örnekler malaşit yeşili ile alevde 5 dakika etkiye bırakılmış ve buharlaştıkça boya ilave edilmiştir. Distile su ile yıkanan örnekler 30 saniye safranin ile boyanmış ve distile suyla tekrar yıkanıp havada kurutulduktan sonra bakteri sporlarının morfolojileri, Olympus CH-2 marka araştırma mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. 3.2.3. Bakteri üretiminde kullanılan besiyerleri Çalışmada kullanılan bakterilerin saklanması, geliştirilmesi amacıyla farklı besiyerleri kullanılmıştır (Çizelge 3.3). Buna göre, bakterilerin buzdolabı koşullarında uzun süre dayanmalarını sağlamak için, Çizelge 3.3‟de verilen kültür saklama besiyerikullanılmış olup, kültürler 30 günde 1 kez yeniden hazırlanan agarlı besiyerine aşılanmak sureti ile korunmuşlardır. 25 Çizelge 3. 3. Bakteri üretiminde kullanılan besiyerleri (Sarıkaya 1995) Ġçerik Kültür saklama besiyeri (% g) Bakteri geliĢtirme besiyeri (% g) Tripton - 1 Yeast Extract - 0,5 Nutrient Broth 0.8 - NaCl 0.8 1 Agar 2.0 - pH 7.0 7.0 3.2.4. Enzim üretimi için kullanılan besiyeri Biyokimyasal ve morfolojik testler sonucunda tespit edilen Bacillus sp.‟ler içerisinde fitaz hidroliz oranı (Zon çapı) en yüksek2 adetsuş, fitaz üretim kapasitelerinin belirlenmesi amacıyla, Çizelge 3.4‟teki modifiye besiyerinde üretilmişlerdir (Demirkan ve ark. 2014). Çizelge 3.4. Fitaz üretim ortamının tespitinde kullanılan sıvı besiyeri(Demirkan ve ark. 2014). Ġçerik Besiyeri (g/L) Laktoz 5 Meat Extract 8 CaCl2 1 Na- Fitat 5 pH 7.5 3.2.5. Bakteri üretim koĢulları Kültür saklama ortamından (Çizelge 3.3) steril öze ile alınan bakteri kültürü, içerisinde 30 mL bakteri geliştirme besiyeri (Çizelge 3.3) bulunan 100 mL‟ lik erlene aşılanmış, 37°C‟ de 150 devir/dk çalkalama hızına sahip inkübatörde 48 saat süre ile üretilmiştir. Bu bakterinin enzim üretim kapasitesini saptamak amacıyla 48 saatlik bakteri kültürlerinin 600 nm‟ deki optik yoğunlukları (O.D) spektrofotometre (Beckman 26 Coulter- DU 700) kullanılarak, bir standart elde edebilmek amacıyla, steril fizyolojik tuzlu su ile 0.3‟ e ayarlanmıştır. Bu şekilde ayarlanan kültür çözeltilerinden, içerisinde 150 mL maksimum enzim üretiminin elde edildiği enzim üretim besiyeri (Çizelge 3.4) bulunan 500 mL‟ lik erlenlere %3 oranında aşılanmış ve 37°C‟ de 150 devir/dk çalkalama hızına sahip inkübatörde 72 saat süre boyunca inkübe edilmiştir. Üreme ve enzim aktivite tayinleri 16., 24., 40., 48., 64. ve 72. saatlerde yapılarak bakterinin gelişme grafiği çıkarılmış ve maksimum enzim üretim zamanı saptanmıştır. 3.2.6. Bakteri üremesinin ölçülmesi Bakteri üremesinin belirlenmesi amacıyla, besiyerinin bulanıklığı spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. 3.2.5‟ te belirtilen yöntemle inkübasyona bırakılan besiyerlerinden, belirlenen saatlerde örnek alınarak, 600 nm dalga boyunda okunmuştur. Fitaz üretiminde kullanılan besiyeri kör olarak kullanılmıştır ve optik yoğunluk (OD) değerlerinin okunmasıyla bakteri üreme miktarı belirlenmiştir (Sarıkaya 1995). Elde edilen optik yoğunluk (OD) değişimleri, zamana karşı grafiklenerek gelişme eğrileri çıkarılmıştır. 3.2.7. Enzim aktivitesinin ölçülmesi Fitaz aktivitesinin tayininde Coi ve ark. (2001)‟ ın kullandıkları yöntemden faydalanılmıştır. Bu amaçla, öncelikle kültür ortamından 10 ml alınarak 15 dakika süre ile +4ºC‟ de santrifüj edilerek (5000 devir/dk) bakteri hücrelerinin bulunduğu pelet kısmı ile enzim içeren sıvı kısım birbirinden ayrılmıştır. Enzim aktivite tayininde substrat çözeltisi olarak 50 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 7.0) tamponuna 2mM Na-Fitat eklenmiştir. Bu substrat çözeltisi işlemden önce her seferinde taze olarak hazırlanmıştır. Deneylerde 1 adet kör tüp ve her bir enzim örneği için 2 adet örnek tüpü kullanılmıştır (Çizelge 3.5). Her iki örnek tüpüne 0.9‟ ar ml substrat çözeltisi, kör tüpüne ise 0,75 ml TCA çözeltesi ilave edilmiş ve tüpler 37°C‟ lik su banyosunda 5 dakika bekletilerek reaksiyon sıcaklığına getirilmiştir. Daha sonra substrat içeren tüplere 0.1 ml enzim çözeltisinden, kör tüpe ise 0,1 ml Tris-HCl (pH 7.0) tamponu ilave edilerek 37°C‟ de 30 dakika inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda örnek tüplerine 0,75 ml 27 TCA çözeltisinden eklenerek reaksiyon durdurulmuş ve kör tüpüne ise 0,9 ml substrat eklenip, tüpler tüp karıştırıcısında (Vortex) karıştırılmıştır. Bu karışıma % 5,5 sülfürik asitle hazırlanan % 2,5 amonyum molibdat çözeltisi ile % 2,5 ferroz sülfat renk reaktifinden 1,5 ml ilave edilmiş ve örneklerin absorbansları köre karşı spektrofotometrede ölçülmüştür. Çizelge 3.5. Fitaz aktivite tayini reaksiyon bileşenleri Reaksiyon bileşenleri Örnek Tüpü Kontrol Tüpü Substrat çözeltisi 0,9 mL - % 5‟ lik TCA çözeltisi - 0,75 mL 37ºC‟ de su banyosunda 5 dakika bekletilir. Enzim çözeltisi 0,1 mL - 0.1 M Tris-HCl Tamponu - 0,1 mL 37ºC‟ de su banyosunda 30 dakika bekletilir. % 5‟ lik TCA çözeltisi 0,75 mL - Substrat çözeltisi - 0,9 mL Vortekle karıştırılır. Renk çözeltisi 1,5 mL 1,5 mL 700 nm‟ de absorbans ölçümü Enzim akivitesi Unit (IU) cinsinden hesaplanmış olup, Standart deney koşullarında dakikada 1 µmol sodyum fitattan inorganik fosfatın serbestlenmesini sağlayan enzim miktarı olarak ifade edilmiştir. Enzim aktivitesi aşağıdaki formülle hesaplanmıştır (Anonymous, 2014). 28 Pi (µM) Enzim Aktivitesi (U /mL) = t (dk) x VE (mL) Pi : Salınan fosfatın miktarı t : zaman VE : Kullanılan enzimin hacmi 3.2.8. Ġnorganik Fosfat Standart Grafiği ve HazırlanıĢı İnorganik fosfor miktarını saptamak için farklı konsantrasyonlarda(0-100 μM) standart KH2PO4 çözeltileri hazırlandı. İnorganik fosfor miktarı, 3.2.7‟de tarif edildiği gibi spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. 3.2.9. Enzim aktivitesi ölçümünde kullanılan solusyonlar 3.2.9.1.0.1 M Tris-HCl Tamponu (pH: 7.0) 12,11 gr Tris tartılır ve 900 ml distile su ile seyreltilir. Çözelti 2N HCl ile pH: 7.0‟a getirilir. Son hacim 1 L‟ ye tamamlanır. 3.2.9.2.%5’ lik TCA (Trikloroasetik asit) çözeltesinin hazırlanması 5 gr TCA tartılır ve son hacim distile su ile 100 ml‟ ye tamamlanır. 3.2.9.3.Substrat çözeltisinin hazırlanması 50 ml 0.1 M Tris HCl (pH: 7.0) çözeltisi içerisine 2mM Na-Fitat karıştırılır. (Kim ve ark. 1998) 3.2.9.4.Renk çözeltisinin hazırlanması Renk ayıracı a ve b çözeltileri ile sırasıyla 4:1 oranında hazırlanır. 29 a) % 5,5 Sülfürik Asitte hazırlanan %2,5 Amonyum molibdat çözeltisi 90,5 ml‟ lik distile suya 5,5 ml sülfürik asit ilave edilir. 2,4 g Amonyum molibdat tartılır ve bu çözeltiye ilave edilir. b) % 2,5 Ferroz sülfat 2,5 g ferroz sülfat tartılır ve distile su ile 100 ml‟ ye tamamlanır. Günlük olarak hazırlanır. 3.2.9.5.KH2PO4 substratı hazırlanıĢı 0,14 gr KH2PO4 tartılılır ve çözeltiye 100 ml distile su ilave edilir. 3.3.Fitazın Kısmi SaflaĢtırılması En yüksek fitaz aktivitesine sahip bir adet Bacillus sp.‟ nin fitaz enzimi kısmi olarak saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir. Bu amaçla, bakteri modifiye besiyerinde 48 saat süre ile inkübe edilmiş ve inkübasyon sonucu üretim ortamı +4°C‟ de, 5000 rpm‟de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Süpernatant ham enzim olarak kullanılmıştır. Ham enzim birbirini takip eden 3 basamakta kısmi olarak saflaştırılmıştır. Ham enzim ve her bir basamankatki enzim örneklerinde enzim aktivite ve protein tayinleri yapılmıştır. Protein tayini, standart olarak „Sığır Serum Albumin‟ i kullanılarak Lowry ve ark. (1951) metoduna göre belirlenmiştir.Tüm saflaştırma adımları +4 °C‟ de yapılmıştır. 3.3.1. Amonyum Sülfat Çöktürmesi Ham enzimin en iyi çökelme gösterdiği tuz konsantrasyonunu belirlemek için farklı konsantrasyonlarda ( % 50, % 60, % 70, % 80) amonyum sülfat kullanılmıştır. Ham enzim çözeltisi üzerine havanda toz haline getirilmiş % amonyum sülfat +4 ºC‟ de çok yavaş bir şekilde eklenerek manyetik karıştırıcı üzerinde çözündürülmüştür. Bu şekilde hazırlanan karışım +4 ºC‟de manyetik karıştırıcıda karıştırılarak bir gece bekletilmiştir. Daha sonra karışım 10.000 rpm‟de 30 dakika santrifüjlenmiş, süpernatant ve pelletler birbirinden ayrılmıştır. Pellet 1 mM CaCl2 içeren 20mM Tris-HCl (pH 7.0) tamponunda tamponunda çözülmüş ve aktivite - protein tayinleri yapılmıştır. 30 3.3.2. Diyaliz Amonyum sülfat çöktürmesi sonucu elde edilen pellet 1 mM CaCl2 içeren 20mM Tris- HCl (pH 7.0) tamponunda çözülmüştür. Yarı geçirgen bir membrandan oluşan diyaliz tüpü (Selüloz membran, Sigma-Aldrich, MWCO-Molecular Weight Cut Off 12.000 Da, 25 mm x 16mm) uygun uzunlukta kesilmiş ve bir ucu sıkıca bağlanmıştır. Tek tip gözenek büyüklüğü sağlamak ve ağır metal kontaminantları gidermek için distile sudan geçirilmiştir. Diyaliz tüpüne örnek aktarılmış, diğer ucu da ip yardımı ile bağlanmıştır. Bu şekilde hazırlanan diyaliz tüpü, aynı tampon içeren 1 L‟lik beherin içine alınmış ve behere balık atılarak karışımın sürekli hareketi sağlanmıştır. Diyaliz işlemi manyetik karıştırıcı üzerinde 4°C‟de gerçekleştirilmiştir. Tampon 3 defa değiştirilerek diyalize devam edilmiştir. Amonyum sülfatın tamamen uzaklaşıp uzaklaşmadığını saptamak için diyazlide olan tampondan 1-2 damla alınmış ve üzerine 0.1 N HCl ve doygun BaCl2 çözeltisinden 1-2 damla damlatılmıştır. Bulanıklık görülmemesi sonucu diyaliz bitirilmiştir (Trautwein ve Kuhlmann 1982). Diyalizatın aktivite ve protein tayinleri yapılmıştır. 3.3.3. Ultrafiltrasyon ile Diyalizatın Konsantre Edilmesi Diyalizat, ultra filtrasyon (MW cut-off 30,000 ve 10,000) tüpüne alınmış ve 4°C‟de 5000 rpm‟de 15 dakika sürelerle istenilen hacme kadar konsantre edilmiştir. Konsantre edilen örneğin aktivite ve protein tayinleri yapılmıştır. 3.4.Protein miktarının belirlenmesi Protein miktarının belirlenmesi için de Lowry Metodu kullanılmıştır (Lowry 1951). Protein standart grafiğinin oluşturulması için 0,005 gr BSA 10 mL distile suda çözülmüştür. Konsantrasyonu 0-500 µg/mL olacak şekilde uygun sulandırma yapılarak hazırlanan örneklerin absorbansları 546 nm‟de ölçülmüş (Beckman Coulter-UD 700) ve standart eğri grafiği hazırlanmıştır. Ayıraç A: % 3‟ lük Na2CO3 (0.1 N NaOH‟ da çözünmüş) Ayıraç B: % 1‟ lik CuSO4 (% 1‟ lik K-Na- tartarat‟ da çözünmüş) 31 Ayıraç C: % 2‟ lik K-Na-tartarat Ayıraç D: İhtiyaca göre günlük A, B ve C ayıraçlarından hazırlanır (25:1:1 oranında). Ayıraç E: 1:1 oranında seyreltilmiş Folin ciocalteus fenol ayıracı 1 mL örnek alınmış, üzerine D ayıracından 5 mL eklenmiş ve karıştırıldıktan sonra 10 dakika karanlıkta inkübe edilmiştir. Kör için ise 1 mL distile su ve D ayıracı alınarak aynı işlemler uygulanmıştır. Daha sonra 0,5 mL E çözeltisi eklenerek vortekslendikten sonra karanlıkta 20 dakika beklenmiş ve köre karşı, 546 nm‟de absorbansları okunarak sonuçlar elde edilmiştir. Okunan bu absorbanslar standart protein konsantrasyonlarına karşı grafiğe geçirilmiştir (Şekil3.2). 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 y = 0,0016x + 0,023 0,4 R² = 0,9923 0,3 0,2 0,1 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Protein Konsantrasyonu (µg/mL) ġekil 3.2. Protein standart grafiği 32 Absorbans (546 nm) 3.5.Enzimin Karakterize edilmesi 3.5.1. Enzim Aktivitesi Üzerine Sıcaklığın Etkisi Kısmi olarak saflaştırılmış fitazın sıcaklık profili 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ve º 80 C arasında tespiti ile elde edilerek optimum sıcaklık değeri saptanmıştır. Sıcaklık º stabilitesini tespit etmek için enzim 60, 70 ve 80 C‟ lik sıcaklıklarda belli saatlerde inkübe edilmiş ve aktivite tayini yapılmıştır. Aktiviteler % bağıl aktivite olarak hesaplanmıştır. 3.5.2. Enzim Aktivitesi Üzerine pH’nın etkisi Optimal pH, glisin-HCl (pH 2.0 ve 3.0), sodyum asetat (pH 4.0-6.0), Tris-HCl (pH 7.0 ve 8.0), glisin-NaOH (pH 9.0 ve 10) kullanılarak 0.1 M ve pH 2.0-10.0 arasında aktivitenin ölçülmesi ile tespit edilmiştir. Enzimin pH stabilitesi pH 6.0, 7.0 ve 8.0‟de belli saatlerde belirlenmiştir. Aktiviteler % bağıl aktivite olarak hesaplanmıştır. 3.5.3. Enzim Aktivitesi Üzerine Potansiyel BileĢiklerin Etkisi Enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının, tuzların ve redükleyici bileşiklerin etkisini tespit etmek üzere enzim 1 ve 5 mM MnSO4, MgSO4, FeSO4, ZnSO4, CuSO4, CaCl2, LiSO4, BaCl2, NaCl, KCl, SDS, EDTA, 2-merkaptoetanol ile inkübe edilerek aktivite tayini yapılmıştır. Aktiviteler % bağıl aktivite olarak hesaplanmıştır. 3.5.4. Kinetik Parametrelerin Saptanması Fitaz‟ın Vmax ve Km değerleri farklı konsantrasyonlarda hazırlanacak olan sodyum fitat kullanılarak çizilecek olan Line weaver–Burk grafiği ile tespit edilecektir. 3.6.Enzimin Moleküler Ağırlığının Tespiti Enzimin moleküler ağırlığının belirlenmesi için Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi kullanılmıştır. (Laemmli 1970) 3.6.1. Çözeltilerin ve Jelin hazırlanması a) Polimer matriksi kurmak için akrilamid ve N, N‟-metilen-bisakrilamid kullanılmıştır. Bunun için; 28,8 g akrilamid ve 1,2 g bis akrilamid tartılıp distile su 33 ile toplam 100 mL içerisinde çözdürülmüş ve Whatman No:1 filtre kâğıdından süzülerek, kahverengi bir şişede 0-5ºC‟ de muhafaza edilmiştir. Bu çözelti 2 ay süreyle bozulmadan saklanabilmektedir. (Sarıkaya 1995). Akrilamid çok güçlü bir nörotoksik madde olduğundan çalışırken eldiven ve maske kullanılmalıdır. b) 1 M Tris-HCl (pH 6.8 ) Çözeltiyi hazırlamak için 12,11 gr Tris Base tartılmış, bir miktar suda çözüldükten sonra pH 6.8‟ e ayarlanmış ve distile su ile 100 mL‟ ye tamamlanmıştır. c) 1 M Tris-HCl (pH 8.8) Çözeltiyi hazırlamak için 12,11 gr Tris Base tartılmış, bir miktar suda çözüldükten sonra pH 8.8‟ e ayarlanmış ve distile su ile 100 mL‟ ye tamamlanmıştır. d) % 10‟luk Amonyum Per Sulfat (APS) 10 g APS tartılmış ve hacmi distile su ile 100 mL‟ ye tamamlanmıştır. e) Örnek Tamponu 100 mL için stok solüsyon; 1 M Tris-HCl pH 6.8 6,5 ml Gliserol 10 ml SDS 2 gr dH2O 4ºC‟ de muhafaza 100 ml Her bir örnek için 100 µl stok solüsyondan alınmış ve üzerine 5 µl β-mercaptoetanol eklenmiştir. Spatül ucu kadar Bromfenol Mavisi eklenip vortekslenmiştir. f) Yürütme Tamponu (Running Buffer) Tris Base 3gr Glisin 14,4 gr SDS 1gr dH2O 1L 34 g) Yıkama Çözeltisi İzopropil alkol 250 mL Asetik asit 100 mL dH2O 650 mL h) Boyama Çözeltisi 1,5 g Commassie-brilliant R- 250 mavisi 250 mL izopropil alkolde çözülmüş, daha sonra üzerine 100 mL asetik asit ve 650 mL distile su eklenmiştir. Jelin Hazırlanması SDS-PAGE için 2 tip jel hazırlanır. 1) %12,5 Ayırma Jeli hazırlanışı (2 jel için) dH2O 2,0 mL 1M Tris-HCl pH:8.8 4,4 mL %1 SDS 1,2 mL %30 Akrilamid 4,2 mL %3 Amonyum Persülfat 0,2 mL TEMED 8 µL 2) %4 Yükleme Jeli hazırlanışı (2 jel için) dH2O 3,06 mL 1M Tris-HCl pH:6.8 1260 µL %1 SDS 50 µL %30 Akrilamid 660 µL %3 Amonyum Persülfat 100 µL TEMED 5 µL Jellerin hazırlanmasında dikkat edilmesi gereken en önemli nokta TEMED‟ in eklenmesidir. TEMED polimerleştirici ajan olduğundan, eklendikten sonra pipet ile iyice karıştırmalı ve vakit kaybetmeden çözelti cam plakalar arasına dökülmelidir. Örnekler hazırlandıktan sonra, cam plakalar elektroforez (Bio-Rad) mandalına yerleştirilmiş ve sızma olmayacak şekilde iyice sabitlenmiştir. Ayırma jeli, mikropipet yardımıyla cam plakaların arasına yavaşça dökülmüş ve üzerine isopropil alkol dökülerek, üst yüzeyin düzgün bir şekilde donması beklenmiştir. 35 Donma tamamlandıktan sonra alkol distile su ile iyice yıkanmış ardından kurutma kağıdı ile kalan su plakaların arasından alınmıştır. Daha sonra sıkıştırma jeli de aynı yöntemle plakaların arasından dökülmüş, donması beklenmeden elektroforez tarağı yerleştirilmiştir. Donma tamamlandıktan sonra tarak çıkarılmış ve kuyucukların düzgün bir şekilde oluşması sağlanmıştır 3.6.2. Örneklerin hazırlanması ve elektroforez koĢulları Fitaz enziminin moleküler ağırlığının belirlenmesi amacıyla 10 farklı protein içeren (SigmaMarker S8445) çözelti standart olarak kullanılmıştır. Ham enzim, amonyum sülfat çöktürmesiyle elde edilen supernatant ve pelet ile diyaliz sonrası örneklerinden 75 µl, ependorf tüplerine konularak üzerlerine 25 µl örnek tamponu (bkz. 3.6.1. e) eklenerek hacim 100 µl‟ ye tamamlanmıştır. Tüm tüpler 5 dakika süreyle kaynar suda bekletilmiştir. Daha önce hazırlanmış olan jel, elektroforez tankına oturtularak alt ve üst hazneleri yürütme tamponu (bkz. 3.6.1. f) ile doldurulmuştur. Tankın her iki tarafına da konmuş olan jellerdeki kuyucukların içerilerine, mikropipet yardımıyla 25 µl örnek konmuş ve tanka akım verilerek elektroforez işlemi başlatılmıştır. İzleme boyası jelin 1 cm altında kalacak hale geldiğinde ise elektroforez işlemi bitirilmiştir. Jele, örneklerin düzgün sırada ilerlemesi için önce 80 V, örnekler ayırma jeline geçtikten sonra 150 V sabit akım verilmiştir. Elektroforez işlemi yaklaşık 2,5 saat sürmüştür. 3.6.3. Boyama ve boyanın uzaklaĢtırılması Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra üst plaka jeli yırtmayacak şekilde çıkarılmıştır. Sıkıştırma jeli bir spatül yardımıyla, ayırma jelinden ayrılmış, marker yüklenen kuyucuğun kenarı bir çentik atılarak jel işaretlenmiştir. Dikkatli bir şekilde, yırtmadan çıkarılan jel, içerisine boyama çözeltisi (bkz. 3.6.1. h) bulunan plastik kaba konarak 1 gece çalkalayıcıda bekletilmiştir. Boyanan jel, içinde yıkama çözeltisi (bkz. 3.6.1.g) bulunan başka bir kaba alınarak boya uzaklaştırılmıştır. Örneklerin molekül ağırlıkları, standart proteinler baz alınarak belirlenmiştir. 36 4. BULGULAR 4.1.Fitaz Pozitif Bakterilerin Belirlenmesi Bu çalışmada Türkiye‟nin 30 farklı ilinden alınan toprak örneğinden 300 adet bakteri izole edilmiştir. İzole edilen bakterilerin Bacillus olup olmadığını belirlemek üzere biyokimyasal ve morfolojik testler yapılmış, bu testlerin sonucunda 236 adet bakterinin Bacillus sp. olduğu belirlenmiştir. Bacillus sp. suşları arasında 19 tanesinin 120. saat sonucunda, 6 tane zayıf açıklıkta çevresel hidrolitik zonlu (2-4 mm), 10 tane orta açıklıkta çevresel hidrolitik zonlu (5-8 mm), 3 tane geniş açıklıkta çevresel hidrolitik zonlu bölgelere (9-11 mm) sahip olduğu gözlemlenmiştir. Bu suşlar arasında en geniş zonu gösteren 2 adet suş seçilmiştir. Bunlardan 11 mm zonu gösteren Bacillus sp. suşu EBD 9-1 olarak ve 9 mm zon çapına sahip EBD 19-9 olarak adlandırılmıştır. Fitaz pozitif özellik gösteren izolatın besiyerindeki görüntüsü Şekil 4.1‟ de verilmiştir. ġekil 4.1. Fitaz üreten Bacillus sp. EBD 9-1‟ in PSM ortamındaki görüntüsü 37 Çizelge 4.1. Fitaz pozitif bakterilerin zon çapları Bakteri No İller Koloni Çapı (mm) Zon Çapı (mm) 2-1 Bilecik 3,2 5 2-2 Bilecik 3,2 3,5 3-6 Kırklareli 2,8 3 4-8 Kayseri 2 2,2 5-4 Manisa 4 4,5 5-5 Manisa 3 3,1 9-1 Trabzon 7 11 9-9 Trabzon 2,8 3 10-8 Tunceli 4,2 6 14-3 Balıkesir 4,5 7,5 14-5 Balıkesir 5 6,5 14-6 Balıkesir 4,8 7,8 15-7 Hatay 6,5 8 15-9 Hatay 6,8 7,3 18-7 Bartın 6,2 6,5 19-4 Edirne 6,1 9 19-9 Edirne 5 9 23-1 Sivas 5,5 5,6 23-2 Sivas 5,1 8 38 4.2.Biyokimyasal ve Morfolojik Testler Genel olarak Bacillus cinsini belirlemek amacıyla aşağıdaki tayin anahtarı kullanılmaktadır (Şekil 4.2). ġekil 4. 2. Bacillus sp. izolatların taksonomik özellikleri (Buchanan ve Gibbons 1974). 4.2.1. Biyokimyasal testler 4.2.1.1.Katalaz testi Katalaz bir enzim olup çoğunlukla aerobik mikroorganizmalar tarafından oluşturulurlar. Bu enzim ortamdaki hidrojen peroksiti (H2O2) su ve oksijene ayrıştırmaktadır. 3.2.3.2‟ ye göre yapılan katalaz testi sonunda, katı bakteri kültürlerine H2O2 damlatıldığında, serbest oksijenin gaz kabarcıkları halinde gözlenmesi, hidrojen peroksitin ayrışmasını dolayısıyla da katalaz varlığını gösterdiğinden tüm bakteriler katalaz (+) olarak değerlendirilmiştir (Şekil 4.3). 39 ġekil 4. 3. Belirlenen kolonilerde serbest oksijenin kabarcıklar halinde görünümü 4.2.2. Morfolojik testler 4.2.2.1.Koloni yapısı ve bakterilerin Ģekli Bakteriler, farklı karakteristik koloni tiplerine sahiptirler (Şekil 4.4). Koloni Tipleri Noktasal Yuvarlak Dalgalı Flamentli Rizoid ġekil 4. 4. Bakteriyal koloni tipleri 40 Çalışmamızda elde ettiğimiz bakterilerin noktasal, flamentli ve dalgalı koloni tipi özellik gösterdiği tespit edilmiştir. Mikroskobik incelemeler (Olympus CH-2) sonucunda ise bakterilerin hepsinin çubuk (basil) şeklinde olduğu görülmüştür (Şekil 4.5). ġekil 4.5. EBD 9-1 bakterisinin 100X objektifte görünümü (Olympus CH-2) 4.2.2.2.Hareketlilik testi 3.2.3.1‟ e göre yapılan hareketlilik testi sonucunda tüm bakterilerin hareketli (Şekil 4.6) olduğu belirlenmiştir (bkz. Çizelge 4.2). ġekil 4. 6. Petri kutusundaki yumuşak agarlı besiyerinde hareketlilik kontrolü 41 4.2.2.3.Gram boyama Bakterilerin tanımlanmasında önemli bir aşama olan gram boyama 3.2.2.3‟ e göre yapılmış olup, ilk boya olarak kullanılan kristal viyoleyi hücre içinde tutabilen bakteriler gram (+) olarak kabul edilmiş olup, denemeye alınan tüm bakteriler mor menekşe bir renk gösteren gram (+) olarak değerlendirilmişlerdir (Şekil 4.7). ġekil 4. 7. Işık mikroskobunda bakterilerinin görünümü (100X) 4.2.2.4.Spor boyama Spor oluşumu Bacillaceae familyasının tipik özelliğidir. Endospor oluşumu bu familyanın üyeleri olan Bacillus ve Clostridium cinsi bakterilerde görülmektedir. Denemeye alınan bakterilerde spor boyama 3.2.2.5‟ e göre yapılmış olup, tüm bakterilerin sporlu oldukları ve sporun hücre içindeki konumunun terminal (uç) bölgede olduğu saptanmıştır. İncelemeler Olympus CH-2 marka ışık mikroskobunda, 100X objektifte, immersiyon yağı ile yapılmıştır (Şekil 4.8). 42 ġekil 4. 8.Bakterilerin spor boyama sonrası görünümü (100X) Yapılan biyokimyasal ve morfolojik tesler sonucunda tüm bakterilerin Bacillus cinsine ait olduğu belirlenmiştir. Çalışma sonrasında zon çapları dikkate alınarak ayrılan 2 adet bakteri üreme eğrileri çıkarılmak üzere denemeye alınmıştır (Çizelge 4.2). Çizelge 4. 2. Bacillus cinsinin belirlenmesinde kullanılan morfolojik testler ve test sonuçları TESTLER 9-1 19-9 Koloni şekli Dalgalı Dalgalı Şekil Basil Basil Gram Boyama + + Spor boyama + + Endospor Pozisyonu ┬ ┬ Hareketlilik + + 43 4.3.Maksimum Fitaz Üretim Ortamının Belirlenmesi En geniş zonu gösteren Bacillus sp.EBD 9-1 ve Bacillus sp. EBD 19-9 suşlarından maksimum enzim üretimi amacıyla Çizelge 3.3 ve 3.4‟ te belirtilen besiyerleri kullanılarak üretilmiştir. 24, 48, 72 ve 96. saatlerde yapılan aktivite sonucuna göre Trabzon ilinden alınan topraktan izole edilen Bacillus sp. EBD 9-1‟in en yüksek fitaz aktivitesine sahip olduğu saptanmıştır (bkz. Çizelge 4.3 ve Şekil 4.9). Zon çapı yüksek 2 bakterinin enzim aktivitelerinin karşılaştırılması sonucu, EBD 9-1 nolu bakterinin 48. saatte 600 U/mL ile maksimum aktiviteye ulaşırken, maksimum üremenin 48. saatte (OD600= 2,03) olduğu saptanmıştır. Daha sonraki çalışmalarda Bacillus sp. EBD 9-1 bakterisi ile devam edilmiştir. Çizelge 4.3.Fitaz içerikli besiyerinde üretilen zon çapı yüksek 2 bakterinin enzim aktivitelerinin karşılaştırılması Ġnkübasyon Süresi EBD 9-1 EBD 19-9 U/mL OD600 U/mL OD600 24. saat 510 1,53 442 0,62 48. saat 600 2,03 486 0,78 72. saat 520 1,94 359 0,83 96. saat 470 1,20 340 0,69 120. saat 430 0,82 250 0,61 44 700 2,5 9-1 19-9 600 2 500 1,5 400 300 U/mL 1 OD 200 0,5 100 0 0 24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 Saat ġekil 4.9. Zon çapı yüksek 2 adet bakterinin üreme ve enzim aktivitelerinin karşılaştırması. 4.4.Ġnorganik Fosfat Standart Grafiği ve HazırlanıĢı İnorganik fosfor miktarını saptamak için farklı konsantrasyonlarda(0-100 μM) standart KH2PO4 çözeltileri hazırlandı. İnorganik fosfor miktarı, daha önce tarif edildiği gibi spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Konsantrasyona karşı absorbans grafiği linear regresyon analiziyle çizilerek konsantrasyonu bilinmeyen örneğin inorganik fosfat konsantrasyonu, standart grafiğinden elde edilen doğru denkleminin formülünden hesaplandı (Şekil 4.10). Doğrunun denklemi y = 0,0011x + 0,0014, regresyon katsayısı 2 R = 0.9995‟dir. 45 Enzim aktivitesi (IU/mL) OD (600nm) 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 y = 0,001x + 0,001 0,02 R² = 0,999 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 İnorganik Fosfat Konsantrasyonu (µM) ġekil 4.10. İnorganik fosfat standart grafiği 4.5.Fitaz enziminin kısmi saflaĢtırılması Enzimin saflaştırma işlemine geçilmeden önce Bacillus sp. EBD 9-1 suşu 3.2.5 ve 3.2.6‟de belirtiği gibi üretilmiştir. Üretim sonrası süpernetant santrifügasyonla ayrılmış ve ham enzim çözeltisi olarak saflaştırma işlemlerinde kullanılmıştır. Ham enzim sırasıyla amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve ultrafiltrasyon işlemlerinden geçirilerek kısmi olarak saflaştırılmıştır. Saflaştırma adımlarında elde edilen fraksiyonların aktivite ve protein tayinleri standart koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma SDS-PAGE ile kontrol edilmiştir. Standart proteinler kullanılarak enzimin molekül ağırlığı belirlenmiştir. Kültür ortamı santrifüj edildikten sonra ham enzim içeren süpernatant amonyum sülfat çöktürme denemeleri için kullanılmıştır. Ham enzim için ayrı ayrı % 50, % 60, % 70, % 80 konsantrasyonlarında amonyum sülfat çöktürmeleri yapılarak enzimin en iyi çöktüğü % amonyum sülfat konsantrasyonu belirlenmiştir (Çizelge 4.4). Buna göre % 70‟lik çöktürmeden elde edilen enzimin aktivitesi 590 U/ml olup, diğer konsantrasyonlardaki çöktürmelerden yüksek olduğu için, bundan sonraki aşamalarda % 70‟ lik amonyum sülfat çöktürmesi yapılmış ve elde edilen pellet 1 mM CaCl2 içeren 20mM Tris-HCl (pH 7.0) tamponunda 36 saat diyaliz edilmiştir. 46 Absorbans (700nm) Çizelge 4.4. Farklı Konsantrasyonlarda Amonyum Sülfat çöktürmesi Fraksiyonlar Enzim Aktivitesi ( U/mL) Ham enzim 600 %50 350 %60 570 %70 590 %80 550 Diyaliz sonrası yapılan aktivite tayinlerinde enzim % 4,9 ve 1.71 kez saflaştırılmıştır. Diyalizat ultra filtrasyon (MW cut-off 30,000 ve 10,000) tüp ile santrifüj edilerek konsantre edilmiş ve enzim 2,06 kez saflaştırılmıştır (Çizelge 4.5). Kısmi olarak saflaştırılan enzim karakterize edilmiştir. Çizelge 4.5. Fitaz enziminin saflaştırma basamakları. 1 2 Saflaştırma Hacim Toplam Toplam Spesifik Verim Saflık Basamağı (mL) Protein Aktivite Aktivite (%) (Kez) (mg) (U) (U/mg) Ham Enzim 100 205,7 60000 291 100 1 Amonyum sülfat 15 440 14,8 1,51 çöktürmesi (%70) 20,1 8850 Diyaliz 14 5,94 2940 497 4,9 1,71 Ultrafiltrasyon 10 2,5 1500 600 2,5 2,06 1 Verim, toplam aktivite üzerinden hesaplanmıştır. 2 Saflık, spesifik aktivite üzerinden hesaplanmıştır. 47 4.6.Fitaz enziminin karakterizasyonu Enzimin karakterize edilmesi amacıyla 3.2.6‟da belirtildiği şekilde yapılan üretim sonucunda, santrifügasyonla ayrılan enzim çözeltisi ham enzim olarak elde edilmiş ve enzim sırasıyla amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz, ultrafiltrasyon işlemlerinden geçirilerek kısmi olarak saflaştırılmıştır. Kısmi saf enzim çözeltisi üzerine sıcaklık, sıcaklık stabilitesi, pH ve pH stabilitesi ile farklı metal iyonlarının etkilerine bakılmıştır. Ayrıca kısmi olarak saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı jel elektroforez yöntemi (Laemmli 1974) ile tayin edilmiştir. 4.6.1. Enzim aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisi Enzim üzerine sıcaklık derecelerinin etkilerini belirlemek üzere 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ve 80ºC‟ lerde aktivite tayini yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar kontrol olarak kullanılan sıcaklık derecesinden (37ºC) elde edilen ve 100 olarak kabul edilen aktivite değerlerine göre % olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.6) Çizelge 4.6. Fitaz enzimi üzerine sıcaklığın etkisi Sıcaklık (°C) Ham Enzim (%) Kısmi Saf enzim (%) 37 (kontrol) 100 100 40 102 106 45 104 113 50 107 116 55 109 124 60 116 139 70 83 82 80 67 37 Elde edilen sonuçlara göre saf enzimin 60°C‟ de maksimum aktivite gösterdiği saptanmıştır (Şekil 4.11). Kısmı olarak saflaştırılan enzimin aktivitesi ham enzime göre %20 artmıştır.Düşük ve yüksek sıcaklıklarda aktivite değerleri birbirine yakın bulunmuştur. Düşük sıcaklıklarda enzim daha stabil kalmıştır. 48 160 140 120 100 80 60 40 20 0 37 40 45 50 55 60 70 80 Saf enzim (%) Sıcaklık Değerleri ( C) Ham enzim (%) ġekil 4.11. Sıcaklığın ham ve kısmi saf enzim üzerine etkisi 4.6.2. Sıcaklık stabilitesinin enzim aktivitesi üzerine etkisi Enzimin maksimum aktivite gösterdiği 60°C‟ de enzim örneğinin stabilitesine bakılmış ve enzim çözeltisi su banyosunda 30, 40, 50, 60, 70 dakika süre ile tutulmuştur. Elde edilen sonuçlara göre saf enzimin 30. dakikada maksimum aktivite gösterdiği saptanmıştır (Çizelge 4.7). Sürenin artması ile hem ham hem de saf enzim aktivitesinde oransal bir düşüş gözlenmiştir (Şekil 4.12). Ancak, saf enzim 60 dakikada %79 oranında aktivite kaybı saptanmıştır. Çizelge 4.7. Sıcaklık stabilitesinin fitaz enzimi üzerine etkisi 60 C° Ham Enzim (%) Kısmi Saf enzim (%) (Dakika) 30 (kontrol) 100 100 40 82 75 50 77 69 60 78 21 70 64 20 49 Bağıl Aktivite (%) 120 100 80 60 40 20 0 30 40 50 60 70 Saf enzim (%) Dakika Ham enzim (%) ġekil 4.12. 60°C‟ de ham ve saf enzim stabilitesi 4.6.3. pH’nın ve pH stabilitesinin enzim aktivitesi üzerine etkisi Fitaz enziminin optimum pH değerlerini belirlemek amacıyla enzim 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 ve 10.0 pH‟larda hazırlanan substrat çözeltilerinde aktivite tayini yapılmıştır. Yapılan çalışmalar sırasında kontrol olarak kullanılan pH‟ da (7.0) elde edilen sonuçlar %100 olarak kabul edilmiş ve diğer sonuçlar buna göre % olarak hesaplanmıştır. Çizelge 4.8 ve Şekil 4.13‟de de görüldüğü gibi enzimin optimum pH değerlerinin 7.0 olduğu saptanmıştır. Enzimin asidik ortamdan ziyade alkali ortamda yüksek aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Çizelge 4.8. Enzim üzerine pH etkisinin belirlenmesi pH Ham Enzim (%) Kısmi Saf enzim (%) 2.0 21 22 3.0 31 43 4.0 33 47 5.0 64 53 6.0 83 63 7.0 (Kontrol) 100 100 8.0 94 81 9.0 43 45 10.0 38 35 50 Bağıl Aktivite (%) 120 100 80 60 40 20 0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 Saf enzim (%) pH Ham enzim (%) ġekil 4.13. pH‟nın ham ve kısmi saf enzim üzerine etkisi Çizelge 4.9‟da görüldüğü gibi enzimin pH stabilitesini belirlemek amacıyla enzim pH 7.0‟de 1 saat boyunca tutulmuş ve 1 saat sonunda saf enzim aktivitesini % 76 oranında koruduğu saptanmıştır (Şekil 4.14). Ham enzim ise 1 saat boyunca aktivitesini korumuştur. Çizelge 4.9. pH stabilitesinin enzim üzerine etkisi pH 7.0 Ham Enzim (%) Kısmi Saf enzim (%) (Dakika) 30 (Kontrol) 100 100 40 108 102 50 104 83 60 91 76 51 Bağıl Aktivite (%) 120 100 80 60 40 20 0 30 40 50 60 Saf enzim (%) Dakika Ham enzim (%) ġekil 4.14. pH 7.0 „de ham ve saf enzimin stabilitesi 4.6.4. Enzim aktivitesi üzerine potansiyel bileĢiklerin etkisi Enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının, tuzların ve redükleyici bileşiklerin etkisini tespit etmek üzere enzim 1 ve 5 mM MnSO4, MgSO4, FeSO4, ZnSO4, CuSO4, CaCl2, LiSO4, BaCl2, NaCl, KCl, SDS, EDTA, 2-merkaptoetanol ile inkübe edilmiştir. Elde edilen sonuçlar içerisinde hiçbir metal iyonu bulunmayan substrat çözeltisi ile elde edilen aktivite %100 olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.10). 52 Bağıl Aktivite (%) Çizelge 4.10. Potansiyel bileşiklerin enzim aktivitesi üzerine etkisi Ham Enzim Kısmi Saf enzim 1mM (%) 5mM (%) 1mM (%) 5mM (%) Kontrol* 100 100 100 100 MnSO4 115 94 89 81 MgSO4 120 97 101 86 FeSO4 51 43 62 54 ZnSO4 55 38 55 45 CuSO4 63 39 52 32 CaCl2 138 99 114 101 LiSO4 92 87 80 66 BaCl2 90 54 50 27 NaCl 92 83 80 79 KCl 96 86 62 53 SDS 25 23 37 25 EDTA 84 67 51 48 2-βmer 68 43 52 39 *Potansiyel bileşik içermemektedir. Şekil 4.15‟te görüldüğü gibi 1mM konsantrasyonundaki çeşitli potansiyel bileşiklerin enzim aktivitesini 5mM‟a göre daha fazla arttırtığı tespit edilmiştir. Bununla beraber CaCl2 ve MgSO4 iyonlarının enzim aktivitesi üzerine aktivatör etki yaptığı, ancak diğer metal iyonlarının inhibitör etki yaptığı saptanmıştır. Özellikle SDS enzim aktivitesini güçlü olarak inhibe etmiştir. 53 120 Potansiyel Bileşikler 100 (1mM) 80 Potansiyel Bileşikler 60 (5mM) 40 20 0 Potansiyel BileĢikler ġekil 4.15. Çeşitli potansiyel bileşiklerin saf enzim üzerine etkileri 4.6.5. Enzim Aktivitesi Üzerine Substrat Konsantrasyonunun Etkisi Fitaz aktivitesi üzerine substratın konsantrasyonunun etkisi saptamak amacıyla, 0.01-0,1 g arasındaki konsantrasyonlarda sodyum fitat optimum sıcaklık ve pH‟da (37 °C ve pH 7.0) belirlenen inkübasyon süresinde ortama ilave edilerek enzim aktivitesi standart deney koşullarında ölçüldü (Çizelge 4.11). 54 Bağıl Aktivite (%) Çizelge 4.11. Fitaz aktivitesi üzerine substrat konsantrasyonunun etkisi Substrat konsantrasyonu Saf enzim (%) (gr) 0,01 25 0,02 38 0,03 58 0,04 75 0,05 84 0,06 94 0,07 100 0,08 98 0,09 94 0,1 92 Substrat konsantrasyonunun 0.01 g‟dan 0,1 g‟a kadar belli bir oranda artırılması ile enzim aktivitesinin kademeli olarak arttığı görüldü. Fitazın maksimum hızını (Vmax) ve Michaelis-Menten sabitesini (Km) saptamak için, 1/V‟ye karşı 1/[S] olarak Lineweaver- Burk y = ax + b doğru grafiğinden yararlanıldı. Lineweaver-Burk grafiği, 1/V‟ye karşı 1/[S] olarak çizildi (Şekil 4.16). Bu grafikten elde edilen doğrunun denklemi ise,y = 2 0,006x+0,003 olarak, tamamlayıcılık katsayısı (R ) ise R² = 0,995 bulundu. Denklemde doğrunun dikey ekseni kestiği nokta 1/Vmax = 0,003değerini verdiğinden, Vmax değeri 333U/mL olarak hesaplandı., Km değeri 2mM olarak bulundu. 55 ġekil 4.16. Fitaz aktivitesi üzerine substrat konsantrasyonunun etkisi ( Lineweaver-Burk grafiği ve Michaelis-Menten Grafiği) 4.7.Enzimin moleküler ağırlığının tespiti Kısmi olarak saflaştırılan enzim örneğinin moleküler ağırlığını belirlemek amacıyla, elektroforez jeline enzim örneği yanında moleküler ağırlıkları bilinen standart protein çözeltisi de uygulanmış ve elektroforez işlemi sonucunda oluşan bandların (Şekil 4.17) Rf değerlerinden yararlanılarak aşağıda verilen formüle göre enzim ve standart protein çözeltisinin göreceli hareketlilik değerleri hesaplanmıştır. Rf = Proteinin aldığı yol (cm) / Ġzleme boyasının aldığı yol (cm) Moleküler ağırlıkları bilinen standart proteinlerin göreceli hareketlilik değerleri ve molekül ağırlıkları ile bir standart eğri elde edilmiştir (Şekil 4.18). Elde edilen grafiğin analizi yapılarak, örneğin moleküler ağırlığı saptanmıştır.Amonyum sülfat çöktürmesi, diyalizat ve ultrafiltrasyonu sonucunda adım adım kısmi olarak saflaştırılan enzim örneğinin molekül ağırlığının aynı olduğu, Şekil 4.18‟da görüldüğü gibi tek bir band halinde bir sırada yerleştiği saptanmıştır. Koyu band halinde görülen enzimin moleküler ağırlığının yaklaşık olarak 45 kDa olduğu tespit edilmiştir. 56 1 2 3 4 5 6 ġekil 4.17. SDS-PAGE sonrası elde edilen jelde protein bantlarının görünümü. 1. Marker 2. Ham enzim 3. Çöktürme pelet 4. Diyaliz 5-6. Ultrafiltrasyon 57 5,2 5,1 5 y = -1,014x + 5,273 4,9 R² = 0,992 4,8 4,7 4,6 4,5 4,4 4,3 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Rf ġekil 4.18. Standart proteinlerin Rf değerleri ve molekül ağırlıklarına göre oluşturulan standart eğri. 58 log MW 5. TARTIġMA VE SONUÇ Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle mikroorganizma kaynaklıdırlar. Bunun nedeni mikroorganizma kökenli enzimlerin, bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, ekstrem koşullarda aktivite gösterebilmeleri ve büyük boyutlarda üretilebilmeleridir. Yüksek bitkilerin vakuollerde artık ürünler olarak, bir tür enzim inhibitörleri ve/veya toksik karakterli maddeleri depoladıkları bilinmektedir. Bitkilerden enzim elde edilmesi sırasında bu yapılar ürüne karıştıkları için, bitki enzimleri, endüstri ve klinikte enzim kaynağı olarak tercih edilmemektedirler (Wiseman 1987). Her ne kadar mikrobiyal enzimlerin kullanımı için yukarıda belirtildiği gibi çok geçerli nedenler varsa da, her mikrobiyal enzim endüstriyel alanda kullanılmamaktadır. Endüstride kullanılan enzimlerin, bir ürünün üretilmesinde bazı avantajlara sahip olması gerekmektedir. Buna göre, bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi maliyet bakımından ucuz olması, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması ve en önemlisi de enzimin alerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olmasına bağlıdır (Wiseman 1987). Bugüne kadar 2000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunlardan yaklaşık 100 tanesi ticari olarak kullanıma uygun bulunmuştur. Fakat günümüzde bunlardan sadece 18 tanesi endüstriyel amaçla üretilmektedir (Zeman ve McCrea 1985). Biyoteknoloji kaynaklı çalışmalar Amerika Birleşik Devletlerinde çok fazla odaklanmış olmakla birlikte, günümüzde, Japonya ve Kanada, biyoteknolojiyi (özellikle moleküler biyoteknolojiyi) stratejik alan kategorisinde değerlendirerek, özel şirketlerin yanı sıra, hükümetler düzeyinde destekleme ve geliştirme kararı almışlardır (Glick ve Pasternak 2003). Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle, biyoteknolojinin endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar, daha da önem kazanmaktadır. Özellikle birkaç ülke dışındaki diğer ülkeler bu konuda tamamen dışa bağımlı durumdadırlar. 59 Endüstride faydalı olan ve ticari olarak kullanılan enzimlerin bazı avantajlara sahip olması gerekmektedir. Buna göre bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilmesi için, işlem maliyeti bakımından ucuz olması, fiziksel ve kimyasal koşullara bağlı olmadan aktivitesini en yüksek düzeyde koruması ve mümkün olan en uzun süreyle sürdürmesi, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olması, allerjik ya da toksik etkiye sahip olmaması, yani güvenilir olması gerekir (Sarıkaya 1995). Fitazlar; (myo-inositol-hexakis fosfat fosfohidrolazlar) asit fosfataz enzimleridir; etkili olarak fitik asitten fosfatı ayırır ve myo-inositol ve inorganik fosfat oluştururlar (Mitchell ve ark. 1997). Fitazlar son 15 yıldır biyoteknoloji, çevresel koruma, besin alanlarında hem bilim adamları hem de girisimcilerin ilgisini çekmektedir (Lei ve Stahl 2001). Domuz ve kümes hayvanlarının basit yapılı midelerinden dolayı (Bitar ve Reinhold 1972), bu hayvanlar, yemlerinde kullanılan tohumlardaki fitat fosfatını kullanamazlar ve diyetlerine inorganik fosfat eklenmesi oldukça pahalıdır. Ayrıca diyetteki kullanılmamıs fitat fosforu bu hayvanlar tarafından dıskı ile atılır ve bu da fosfor kirliliğine neden olur (Sweeten 1992). Hindistan‟da hayvan yemlerine dikalsiyum fosfat (DCP) eklenmektedir ve fitazın %50-60 DCP‟nin yerini aldığı görülmüstür.10 kg DCP‟nin 250 gr fitaz enzimine karsılık geldiği tahmin edilmektedir. Bunların yanı sıra fitazlar, fitatların parçalanmasıyla olusan spesifik ürünlerin ekonomik olarak üretimi için önemlidir. Fitazlar, myo-inositol-hexafosfat‟ın sıralı hidrolizini gerçeklestirerek, myo-inositol fosfat üretimini sağlarlar (Greiner ve Konietzy 1993). Son yıllarda endüstriyel öneminden dolayı hem bilim adamları, hem de girisimcilerin ilgisini çektiği için çalısmalarımızda fitaz enzimi üretimi amacıyla Bacillus sp. örnekleri izole edilerek, bunlardan en iyi sonucu veren sus kullanılmıstır. Bu amaçla yapılan çalışmada Türkiye topraklarından toplam 300 adet bakteri izole edilmiştir.BakterilerinBacillus olup olmadığı Bergey‟ s Manual of Determinative Bacteriology‟ e göre morfolojik ve biyokimyasal testler ile tespit edilmiştir. Testler sonucunda 236 adet bakteriBacillus olarak saptanmıştır. Çalışmamızda bakterilerin fitaz üretip üretmediğini belirlemek için fitat içerikli ortamda yayma metodu kullanılmıştır. 60 236 bakteri içerisinde yüksek fitaz aktiviteli 19 adet Bacillussp.seçilmiştir. Bu bakteriler arasından en geniş zon çapına sahip 2 adet suş Bacillus sp. EBD 9-1, EBD 19-9 suşu olarak adlandırılmıştır. Yaptığımız izolasyon çalışmaları sonucunda en büyük zon gösteren 2 adet Bacillus sp.‟ lerin üreme ve enzim aktiviteleri sıvı üreme ortamında 24-72 saat boyunca takip edildiğinde Bacillus sp. EBD 9-1 suşunun diğerine göre daha verimli bir suş olduğu saptanmıştır. Bacillus sp. EBD 9-1‟ in üreme grafiği incelendiğinde maksimum enzim üretiminin durağan fazın ortasında olduğu saptanmıştır. Bu 48. saate denk gelmekte olup aktivite 600 U/mL olarak saptanırken bakteri üremesinin 48. saatte O.D2,03 olduğu gözlenmiştir. Doğadan yeni fitaz potent Bacillussp.lerin izolasyonu birçok araştırmacı tarafından kendi doğal kaynakları kullanılarak araştırılmıştır. Bunlardan Sreeramulu ve ark. (1996),Lactobacillus amylovorus’tan, Yoon ve ark. (1996) Enterobacter sp. 4‟ten, In ve ark. (2004)Pseudomonas fragi Y9451 suşundan, Casey ve Walsh (2004)Rhizopus oligosporus ATCC 22959 suşundan, Soni ve Khire (2007)Aspergillus niger NCIM 563 suşundan, Anastasio ve ark. (2010)Enterococcus faecium A86 ve Lactobacillus plantarum H5 suşundan ekstraselüler fitaz enzimi üretimini araştırmışlardır.Zuo ve ark. (2010)Lactobacillus casei suşunun ekstraselüler ve intraselüler fitaz enzimi ile ilgili çalışmalar rapor etmişlerdir. Kerovuo (1998), 21 adet Bacillus sp. suşunu Na-Fitat içeren LB broth besiyerinde ve buğday kepeği içeren besiyerinde üretmiştir. LB broth‟lu besiyerinde fitaz üretimi gözlenmezken, buğday kepeği içeren besiyerinde 2 Bacillus sp. suşunda fitaz aktivitesi saptanmıştır. En yüksek fitaz aktivitesi gösteren VTTE-68013 adlı bakteri çalışmalarda kullanılmak üzere seçilmiştir. Priest (1977), maksimum enzim üretiminin logaritmik üreme fazının sonlarına doğru olduğunu ve artışın bir süre sonra durma fazında da devam ettiğini belirtmişse de, kendi yaptığımız ve diğer araştırıcıların çalışma sonuçları kıyaslandığında bunun her zaman geçerli olmadığını göstermektedir. 61 Choi ve ark. (2001), Bacillus sp. KHU-10‟dan elde ettikleri fitaz enzimi üretiminin durgun fazın sonlarına doğru maksimum verime ulaştığını bildirmişlerdir. Bakterinin üremeye paralel olarak 72. saatte maksimum enzim aktivitesine ulaştığını tespit etmişlerdir. Dechavez ve ark. (2011), B. megaterium ile fitaz üretimini 96 saatlik inkübasyon sonrası saptamışlardır. Sreedevi ve ark (2012), izole ettikleri bir Bacillus sp.‟nin 72 saat üretimi sonucu maksimum fitaz verimi sağlamışlardır. Sreeramulu ve ark. (1996), Lactobacillus amylovorus B4552 suşuna ait ekstraselüler fitaz aktivitesinin 125-146 U/ml aralığında olduğunu belirlemişlerdir. Raghavendra ve Halami (2009), Pediococcus pentosaceus CFR R38 ve CFR R35 suşlarına ait intraselüler fitaz aktivitesinin sırasıyla 213 U/ml, 89 U/ml olduğunu saptamışlardır. Anastasio ve ark. (2010), Enterococcus faecium A86 suşunun ekstraselüler fitaz aktivitesini 0.74 U/mL, Lactobacillus plantarum H5 ekstraselüler fitaz aktivitesini ise 0.71 U/mL olarak bulmuşlardır.Fu ve ark. (2011) 12 izolat elde etmişler ve bu izolatlardan B.licheniformis ZJ-6 suşundan en yüksek fitaz aktivitesini 0.1511 U/mL olarak saptamışlardır. Nabil ve ark. (2013),B. subtilis MJA adlı bakteride yaptıkları çalışmada maksimum fitaz üretiminin inkübasyondan 96 saat sonra (720 U/ml) belirlemişlerdir. Lata ve ark. (2013)Aspergillus heteromorphus MTCC 10685 suşundan logaritmik fazın sonu olan 120 saatte maksimum fitaz aktivitesini (17.88 U/mL) elde etmişlerdir. Singh ve ark. (2013) yeni izole ettikleri Bacillus subtilis DR6 suşundan maksimum fitaz üretimini logaritmik fazın sonu olan 72. saatte 378 U/mL olarak elde etmişlerdir. Çalışmalar sonucunda elde ettiğimiz verimli suş olan Bacillus sp. EBD 9-1‟den fitaz enzimini saflaştırmak amacıyla, sırasıyla amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve ultrafiltrasyon ile kısmi olarak saflaştırma yapılmıştır. Kısmi saf enzim üzerine sıcaklık ve stabilitesi, pH ve stabilitesi, çeşitli potansiyel bileşiklerin etkileri araştırılmış, enzimin Km ve Vmax değerleri saptanmış, molekül ağırlığı belirlenerek enzim karakterize edilmiştir. Enzim %2,5 verimle, 2.06 kez saflaştırılmıştır. Sıcaklık ve pH enzimlerin aktiviteleri üzerinde oldukça önemli olan parametrelerdir. Her enzimin optimum aktivite gösterdiği bir sıcaklık ve pH değeri vardır. Bu değerlerin 62 bilinmesi enzimin endüstriyel alanlarda kullanılıp kullanılamayacağı hakkında da bir fikir vermektedir. Yapılan çalışma sonuçlarına göre, Bacillus sp. EBD 9-1 bakterisinin ürettiği fitaz enzimi için optimum sıcaklık değeri 60°C olarak saptanmıştır. Enzimin termostabil karakterde olduğu düşünülmektedir. Kısmı olarak saflaştırılan enzimin aktivitesi ham enzime göre %20 oranında korunmuştur.Düşük ve yüksek sıcaklıklarda aktivite değerleri birbirine yakın bulunmuştur. Düşük sıcaklıklarda enzim daha stabil kalmıştır. Enzimin düşük sıcaklıklarda stabil kaldığı El-Toukhy ve ark. (2013) tarafından da Bacillus subtilis MJA için rapor edilmiştir. Enziminoptimum pH değeri ise 7.0 olarak belirlenmiştir.Enzimin asidik ortamdan ziyade alkali ortamda yüksek aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Dolayısıyla, enzimin alkali pH değerlerinde aktifliğini koruması sebebiyle, enzim alkolofilik bir enzim olarak belirlenmiştir. Çalışmamıza uygun olarak Bacillus sp.fitazlarının alkalin ß- pervane fitazı (BPP) içinde yer aldığı rapor edilmiştir (Kerovuo ve ark. 1998, Kim ve ark. 1998). Yoon ve ark. (1996), Enterobacter sp. 4 suşundan izole edilen fitazın optimum aktivite sıcaklığını50-60°C, Zamudio ve ark. (2001), Lactobacillus plantarum‟dan izole ettikleri fitazın optimum aktivite sıcaklığını65°C, Choi ve ark. (2001) Topraktan izole edilen Bacillus sp. KHU-10 adını verdikleri bakteri üzerine yaptıkları incelemelerde, 10 mM CaCl2 varlığında fitaz aktivitesinin optimum pH değerinin pH 6.0-9.5 arasında olduğu, sıcaklık değerinin ise 60°C olduğu belirtilmiştir. Kim ve ark.(2003), Citrobacter braakii YH-15‟den izole ettikleri fitazın optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 50°C olup 55°C‟de aktivitenin önemli ölçüde düştüğünü saptamışlardır. Casey ve Walsh (2003), Aspergillus niger ATCC 9142‟den saflaştırdıklarıenzimin. optimum sıcaklığını65°C, optimumpH‟sını ise5.0 olarak rapot etmişlerdir. De Angelis ve ark. (2003), L. sanfranciscensis CB1‟den izole edilen fitazın optimum aktivite sıcaklığını45°C,In ve ark. (2004), Pseudomonas fragi Y9451 suşundan izole edilen fitazın optimum aktivite sıcaklığını 70°C, Seo ve ark (2005),Aeromonas sp. LIK 63 1-5‟den izole ettikleri fitazın optimum aktivite gösterdiği sıcaklık 50°C olup 60°C‟de aktivitenin önemli ölçüde düştüğünü saptamışlardır. Martha Guerrero-Olazarán ve ark. (2010),B. subtilis VTTE-68013 adlı bakterinin buğday kepeği içeren ortamda 120 saatlik üremesi sonucu maksimum fitaz aktivitesi gösterdiğini ve aktivitenin 18.5 U/ml olduğunu belirtmişlerdir. Bunun yanında fitaz enziminin optimum pH aralığının pH 6.0-9.0 olduğu, sıcaklık değerinin ise 60-95°C arasında olduğunu saptamışlardır. Zuo ve ark. (2010), Lactobacilluscasei‟den izole ettikleri fitazın optimum aktivite sıcaklığını70°C olarak belirlemişlerdir. Lan (2011), yaptığı çalışmada Mitsuokella jalaludinii bakterisinden elde ettiği fitaz enzimini saflaştırmış ve karakterize etmiştir. Optimum pH değerini 4.0-5.0 aralığında bulurken, optimum sıcaklık değerini 55-60°C aralığında tespit etmiştir. Sasirekha ve ark. (2012) Pseudomonas aeruginosa p6‟den elde ettikleri fitaz enzimini amonyum sülfat ve diyaliz ile kısmen 2.2 kez saflaştırmışlar ve saf enzimin optimum sıcaklık ve pH‟sını sırasıyla, 37°C ve 6.0 olarak bulmuşlardır. Ekren (2013), Aspergillus niger UA-D suşundan ekstraselüler fitaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE Sefaroz CL-6B ve Fenil Sepharoz CL-4B işlemlerini uygulayarak % 2.6 verimle 73 kat saflaştırmıştır. Enzimin maksimum aktivitesini pH 3.0 ve 70°C‟ de saptamışlardır. Sreedevi ve Reddy (2013), topraktan izole ettikleri Bacillus subtilis C43 suşundan fitaz enzimini 8.7 kez saflaştırmışlar, enzimin optimum sıcaklığını 55°C‟de ve pH‟sını 5 olarak rapor etmişlerdir. Enzim 70°C‟nin altında aktivisini tamamen kaybetmiştir. El-Toukhy ve ark. (2013), B. subtilis MJA‟dan saflaştırdıkları fitaz enzimini karakterize ederek, optimum sıcaklık ve pH değerini sırasıyla 37°C ve pH 5.0-6.0 olarak belirlemişlerdir. Bununla birlikte enzimin düşük sıcaklıklarda da aktivitesini koruduğu ve geniş bir pH aralığına sahip olduğunu saptamışlardır. pH değişimleri enzimlerin konformasyonunda değişikliğe yol açmaktadır, çünkü enzimler farklı pH‟larda değişik iyonik gruplar oluştururlar (Cheetham 1995). Bu da bize, farklı pH‟larda enzim aktivitesinin neden büyük değişiklikler gösterdiğini 64 açıklamaktadır (Sarkar ve ark. 1998). Mao ve ark. (1992) ise enzim üretiminin sıcaklık ve pH değerleri ile belirlenip, kontrol edilebileceğini saptamışlardır. Görüldüğü gibi literatürlerdeBacillus türlerinden elde edilen fitazlar ile ilgili çok çeşitli sonuçlar bildirilmektedir ve bu da bize Bacillus türlerinin çok çeşitli özelliklerde fitazlara sahip olduklarını göstermektedir. Bazı enzimlerin aktivite gösterebilmesi için ortamda mutlaka metal iyonlarının bulunması gerekmektedir. Metal varlığında aktivite gösteren enzimlere ise metallo enzimler adı verilmektedir. Endüstride kullanılan önemli enzimlerin çoğu birer metallo enzimdir. Fitaz da bir metallo enzim olduğundan dolayı en iyi aktivite gösterdiği metal iyonunu belirlemek üzere bir çalışma yapılmıştır. Tarafımızdan modifiye edilen ortamda üretilen fitaz enziminin karakterize edilmesi amacıyla, kısmi saflaştırılmış fitaz enzimi üzerine 1mM ve 5mM MnSO4, MgSO4, FeSO4, ZnSO4, CuSO4, CaCl2, LiSO4, BaCl2, NaCl, KCl, SDS, EDTA, 2-merkaptoetanol metal iyonlarının etkilerine bakılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre. 1mM konsantrasyonundaki çeşitli potansiyel bileşiklerin enzim aktivitesini 5mM‟a göre daha fazla arttırtığı tespit edilmiştir. Bununla beraber CaCl2, MgSO4 ve MnSO4 iyonlarının enzim aktivitesi üzerine aktivatör etki yaptığı, ancak diğer metal iyonlarının inhibitör etki yaptığı saptanmıştır. Özellikle SDS enzim aktivitesini güçlü olarak inhibe etmiştir. +2 +2 Choi ve ark. (2001), Bacillus sp. KHU-10‟dan enzim aktivitesinin EDTA ve Ba , Cd , +2 +2 +2 +2 +2 Co , Cr , Cu , Hg , Mn gibi metal iyonları tarafından inhibe edildiğini tespit etmişlerdir. Casey ve Walsh (2003), Aspergillus niger ATCC 9142 suşundan elde ettikleri fitazın +2 +2 +2 +2 +2 +2 aktivitesi üzerine Mg , Mn Cu , Cd , Hg ,Zn ve Fiyonlarının kısmen stimule +2 ettiğini, Ca iyonu ile kısmen inhibe olduğugörülmüştür In ve ark. (2004), Pseudomonas fragi Y9451 suşundan üretilen fitazın 5 mM CaCl2 ile %83, FeCl2 ile %29, NiCl2 ile %78, MgCl2 ile %98, CoCl2 ile %65, CuCl2 ve ZnCl2 ile %20 oranında, 10 mM CaCl2 ile %16, FeCl2 ile %22, NiCl2 ile %37, MgCl2 ile %59, CoCl2 ile %33, CuCl2 ile %11, ZnCl2 ile %13 oranında aktivitesini koruduğunu saptamışlardır. Bu kimyasalların aksine enzimin 5 mM EDTA‟da %130, 10 mM EDTA‟da %171 oranında aktiviteye sahip olduğunu bildirmişlerdir. 65 Çalışmamızda elde ettiğimiz sonuca benzer olarak Tran ve ark. (2010),Bacillus sp. MD2 adlı bakteriden elde ettikleri fitaz enzimi üzerine çeşitli metal iyonlarının etkilerine +2 +2 +2 +2 baktıklarında, Ca ,Mg , Mn , Ba varlığında yüksek aktivite gösterdiğini belirtirken, +2 +2 +2 Cu , Co , Sn varlığında enzimin inhibe olduğunu belirtmektedirler. Lan (2011), Yaptığı çalışmada Mitsuokella jalaludinii bakterisinden elde ettiği fitaz +2 +2 +2 +3 enzimini saflaştırmış ve karakterize etmiştir. Bununla beraber Cu ,Zn , Fe ve Fe +2 +2 metal iyonlarının enzim aktivitesini güçlü bir şekilde inhibe ettiğini ancak, Ba ,Mn ve +2 Ca gibi metal iyonlarının enzim aktivitesini önemli ölçüde arttırdığını saptamıştır. Sreedevi ve Reddy (2013),B. subtilis C43‟den elde ettikleri fitaz enzimine çeşitli metal +2 + +2 + +2 +2 iyonlarının etkisini araştırdıklarında, Ca , Na , Cu , K , Co , Ni varlığında enzim +2, +2 +2 aktivitesini stimüle ettiğini ancak Mg Fe ve Mn varlığında enzimin inhibe olduğunu, özellikle EDTA‟nın enzim aktivitesini yüksek oranda (%55) azalttığını tespit etmişlerdir. El-Toukhy ve ark. (2013), B. subtilis MJA‟dan saflaştırdıkları fitaz enzimi üzerine iki +2 +2 değerli metal iyonlarının etkisine bakmışlardır. Cu ve Fe gibi katyonlarınfitaz +2 +2 aktivitesi üzerinde bir inhibisyon etkisi olduğunu, ancak Ca ve Mg gibi katyonların doza bağımlı olarak enzim aktivitesini arttırdığını tespit etmişlerdir. Km ve Vmax enzimin en önemli kiteniksel özelliklerini göstermektedir. Bunlar enzimin belli bir substart ile ne kadar çabuk doyuma ulaştığı (Km) ve ulaşabildiği en hızlı (Vmax) reaksiyondur. Bu özelliklerinin bilinmesi bir enzimin hücre içinde ne yaptığını ve o şartlardaki değişikliklere nasıl tepki verdiği hakkında fikir vermektedir. Km değeri düştükçe enzimin substarına olan ilgisi artmaktadır. Dier yandan Km değeri arttıkça enzimin substarata olan ilgisi ise düşmektedir. Kısmi saflaştırdığımız fitaz enziminin Vmax ve Km değerini bulmak için yapılan çalışmalarda, Lineweaver-Burk grafiğine göre maksimum enzim hızı Vmax333 U/mL, Km değeri ise 2 mM olarak bulundumuştur. Kmdeğerinin düşük olması, yeni izolattan elde ettiğimiz fitaz enziminin substraına ilgisinin fazla olduğunu göstermektedir. Farklı araştırıclar da farklı mikroorganizmalardan elde ettikleri fitazın Vmax ve Km değerlerine bakmışlar ve farklı sonuçlar elde etmişlerdir. Casey ve Walsh (2003), Aspergillus niger ATCC 9142‟den üretikleri ve saflaştırdıkları enzimin Km değeri 100 μM ve Vmax değeri 7 nmol/s olarak kaydedilmişolup, budeğerler 66 mikrobiyal fitazlar için daha önce bildirilen değerlerin aralığında düşüşolduğunu göstermiştir. Vats ve ark. (2005), Aspergillus niger bakterisinden ürettikleri ve saflaştırdıkları fitaz enziminin kinetik değerlerine bakmışlar,Vmax ve Km kinetik değerleri sırasıyla 1,074 IU/mL, 606 mM olarak belirlemişlerdir. El-Toukhy ve ark. (2013), B. subtilis MJA‟dan saflaştırdıkları fitazı enziminin Saf enzimin kinetik değerlerine bakılmış ve Vmax ve Km kinetik değerleri sırasıyla 510 U/mg, 0,485 mM olarak belirlemişlerdir. Ekren (2013), Fitaz enziminin fitik asit için Km değerini 180 μM ve Vmax değerini 54.35 U/mL olarak saptamıştır. Yaptığımız çalısmada Bacillus sp. EBD 9-1‟den izole ettiğimiz ve kısmi olarak saflaştırdığımız fitaz enziminin SDS-PAGE analizi sonucu tek band elde edilmiştir ve moleküler ağırlığı 45 kDa olarak saptanmıstır. Liu ve ark. (1998) fitazın moleküler ağırlığının organizma türlerine bağlı olarak 35-700 kDa arasında değistiğini belirtmislerdir. Tambe ve ark. (1994) Klebsiella aerogenes fitazının moleküler ağırlığının 700 kDa; Greiner ve ark. (1997) Klebsiella terrigera fitazının moleküler ağırlığının 40 kDa olduğunu bulmuslardır. Shimuzi (1992) Bacillus subtilis‟e ait fitazın moleküler ağırlığının 38 kDa olduğunu rapor etmislerdir. Powar ve Jagannathan (1982) Yaptıkları çalısmada, Bacillussubtilis‟den izole ettikleri fitazda birbirine yakın iki protein bandı bulmuslardır. Her iki bandın da fitaz aktivitesi verdiğini görmüslerdir. Bu iki izozimin bakteri tarafından üretilebileceğini düsünmüslerdir. Kim ve ark. (1998) Bacillusamyloliquefaciens tarafından üretilen fitazın 44 kDa olduğunu tespit etmislerdir.Choi ve ark. (2001), Bacillus sp. KHU-10‟dan saflaştırdıkları fitaz enziminin 46 ve 44 kDa olduğunu bildirmişlerdir. Casey ve Walsh (2003), Aspergillus niger ATCC 9142‟den üretilmişekstraselüler fitazı, ilk aşamada ultrafiltrasyon, ileri ki aşamalarda iyon değişimkromatografisi, jel filtrasyon adımlarınıizleyereksaflaştırmışlardır. Saflaştırılmışenzim, monomerik bir protein olup 84 kDamoleküler ağırlığına sahip olduğu bulunmuştur. 67 Kim ve ark (2003), Citrobacter braakii YH-15 suşundan izole ettikleri enzimin SDS- PAGE jelinde moleküler ağırlığının 47 kDa, Seo ve ark. (2005), Aeromonas sp. LIK 1-5 suşuna ait fitaz enziminin moleküler ağırlığının 44 kDa olarak tespit etmişlerdir. Shamna ve ark. (2012 ) yeni izolat Bacillus subtilis fitazının elektroforetik analiz sonucu moleküler ağırlığını yaklaşık olarak 40 kDa olarak belirlemişlerdir.. Ekren (2013), Aspergillus niger UA-D suşundan ekstraselüler fitaz enzimi amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE Sefaroz CL-6B ve Fenil Sepharoz CL-4B işlemlerini uygulayarak % 2.6 verimle 73 kat saflaştırmıştır. SDS-PAGE elektroforezinde tek bant elde edilmiş ve moleküler ağırlığını 65 kDa olarak hesaplamıştır. El-Toukhy ve ark. (2013), B. subtilis MJA‟dan saflaştırdıkları fitazı enziminin molekül ağırlığını 38 kDa olarak belirlemişlerdir Görüldüğü gibi, fitazları moleküler ağırlıkları açısından genellemek oldukça zor olmaktadır. Aynı türün farklı varyeteleri içerisinde, farklı molekül ağırlığına sahip fitazlar olabildiği gibi, farklı türlerde aynı molekül ağırlığına sahip fitazlar da saptanmıştır. Sonuç olarak, kendi kaynaklarımızdan yeniizole edilen veBacillus sp. EBD 9-1 olarak adlandırdığımız bakteriden yüksek verimde enzim üretimi sağlamış olup, enzim karakterize edilmiştir. Enzimim optimum sıcaklığı ve pH‟sı sırasıyla, 60 °C ve 7.0 +2 olarak saptanmıştır. Enzim Ca varlığında daha aktif olduğu belirlenmiştir. Km ve Vmax‟ı sırasıyla 2 mM, 333 U/mL bulunmuştur. Moleküler ağırlığı ise 45 kDa olarak tespit edilmiştir.Enzimliteratürdeki diğer yeni izole edilen Bacillus sp.‟den elde edilen fitaz enzimi ile karşılaştırıldığında aktivitesinin yüksek olması, ayrıca sıcaklık ve pH stabilitesinin de yüksek olması, Km değerinin düşük olması sebebi ile enzimin çeşitli endüstriyel alanlarda kullanım olanakları bulacağı mümkün gözükmektedir.Dünyada olduğu gibi, Türkiye‟de de enzim kullanımı her geçen gün artmaktadır. Bu proje kapsamında elde edilen fitaz enzimi, yem endüstrisi tarafından kullanılan ve her geçen gün kullanım oranı artan bir enzimdir. Çalışma sonucunda elde edilen yeni izolat Bacillus sp. EBD 9-1 fitaz enziminin hayvan yemi katkı maddesi olarak kullanılabilirliği olabilir. Bu amaçla, fitaz enzimi U.Ü. Veteriner 68 Fakültesi, Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı‟nda kanatlı rasyonlarına katılarak enzimin yemlerde kullanılabilirliği araştırılacaktır. Böylece dış ülkelerden satın alınan fitaz enziminin ülkemizde geniş çapta üretilmesi ve böylece ülke ekonomisine katkıda bulunması mümkün olabilecektir. 69 KAYNAKLAR Aehle, W., 2004. Enzymes in Industry Production and Application. Wiley-VCHVerlag, Weinheim, 484s. Anastasio, M., Pepe, O., Cirillo, T., Palomba, S., Blaiotta, G., Villani, F., 2010. Selection and Use of Phytate-Degrading LAB to Improve Cereal-Based Products by Mineral Solubilization During Dough Fermentation. Journal of Food Science, Vol. 75, Nr. 1. Anonymous, 2001. Enzymes a Primer on Use and Benefits Today and Tomorrow. 1800 Massachusetts Avenue, N.W. Second Flor Washington, DC 20036. s.1-34. Anonymous, 2009. http://www.danisco.com/animalnutrition Anonymous, 2011.http://www.bccresearch.com/market research/biotechnology/enzymes-industrial-applications-bio030f.html Anonymous, 2014. http://www.sigmaaldrich.com/technical- documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-phytase.html,2014). Arıkan, B., Gözükara, F., 2012. Isolation Of Thermopilic Bacillus sp., Production, Characterization And Determination Of Biotechnological Application Of Lichenase (β- 1,3 And 1,4 Glucanase). Ç.Ü Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi, Cilt (27-5): 121- 122. Ası, T. 1999. Tablolarla Biyokimya Cilt 2. Ankara. Atasağungil, M. 1965. Enzimler. Güzel İstanbul Matbaası, AnkaraAUTHOR(S) Ayhan, K. 2000. Gıdalarda Bulunan Mikroorganizmalar. Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölüm Yayını, 43–44. Sim Matbaacılık Ltd. Ankara. Bhandari, M.R., Kawabata, J. 2004. Assessment of antinutritional factors and bioavailability of calcium and zinc in wild yam (Dioscorea spp.) tubers of Nepal. Food Chemistry, 85: 281-287. Billington, D.C. 1993. The Inositol Phosphates. Chemical Synthesis and Biological Significance, Verlag Chemie, Weinheim. Bitar, K., Reinhold, J.G. 1972. Phytase and alkaline phosphatase activities in intestinal mucosae of rat, chicken, calf, and man. Biochemica Biophysica Acta, 268: 442-452. Buxbaum, E. 2007. Fundamentals of Protein Structure and Function. Springer, pp. 59- 63, West Indies. Casey, A., Walsh, G. 2003. Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus niger ATCC 9142. Bioresource Technology, 86: 183–188. 70 Casey, A., Walsh, G. 2004. Identification and characterization of a phytase of potential commercial interest. Journal of Biotechnology, 110, 313–322. Cheetham, P.S.J. 1995. Principles of industrial biocatalysis and bioprocessing. In: Handbook of Comprehensive Biotechnol., 3: 789-818. Choı, Y.M., Suh, H.J., Kım, J.M. 2001. Purification and properties of extracellular phytase from Bacillus sp. KHU-10. J. Prot. Chem. 20: 287–292. Choi, Y.M., Suh, H.J., Kim, J.M. 2001. Purification and properties of extracellular phytase from Bacillus sp. KHU-10. J. Prot. Chem., 20: 287-292. Cromwell, G.I., Coffey, R.D., Parker, G.R., Monegue H.J., Randolph, J.H. 1995. Efficacy of a recombinant-derived phytase in improving the bioavailability of phosphorus in corn-soybean meal diets for pigs. Journal of Animal Sciences, 71: 1831- 1840 Çon, A.H., Gökalp, H.Y. 1997. Gıda Mikrobiyolojisi. Pamukkale Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Ders Notları Yayın no: 007, 23 s. Mühendislik Fakültesi Basım Ünitesi. Denizli. Dalal, R.C. 1978. Soil organic phosphorus. Adv. Agronom., 29: 83-117. Danıels, M.J. 1992. Paper technology, 33(6): 14.WISEMAN, A., 1987. Handbook of Enzymes Biotechnology. Second Edition. Chapter 3. The Application of Enzymes in Industry p. 274-373. Day, P.R. 1996. Genetic modification of plants: significant issues and hurdles to success. Am. J. Clin. Nutr., 63:651S-656S. De Angelıs, M., Gallo, G., Corbo, M. R., Mcsweeney, P. L.H., Faccıa, M., Gıovıne, M., Gobbettı, M. 2003. Phytase activity in sourdough lactic acid bacteria: purification and characterization of a phytase from Lactobacillus sanfrancisensis CB1. Int. J. Food Microbiol., 87: 259-270. DeBoland, A.R., Garner, G.B., O’Dell, B.L. 1975. Identification and properties of „phytate‟ in cereal grains and oilseed products. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 23: 1186-1189. Demirsoy, A. 1989. Yaşamın Temel Kuralları (Genel Biyoloji/Genel Zooloji). Cilt 1/Kısım 1. Meteksan Matbaacılık. Desphande, S., Cheryan, M., 1984. Effect of phytic acid, divalent cations and their interactions on α-amilase activity. J. Food Sci., 49: 516-519. Ekren, G. S. 2013. Fitaz Üreten Fungustan Enzimin Üretimi, Saflaştırılması Ve Karakterizasyonu.Yüksek Lisans Tezi, Adnan Menderes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Aydın. Ellestad, L.E., Angel, R., Soares Jr, J.H. 2002. Intestinal phytase II: A comparison of activity and in vivo phytate hydrolysis in three teleost species with differing digestive strategies. Fish Physiology and Biochemistry, 26: 259-273. 71 El-Toukhy, N. M. K.,Amany, S.Y., Mariam, G. M. M.2013. İsolation, purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis MJA. Afr. J. Biotechnol. Erdman, J.W., Poneros-Schneier, A. 1989. Phytic acid interactions with divalent cations in foods and in the gastrointestinal tract.Advances in Experimental Medicine and Biology, 249: 161–171. Ergün, A., Tuncer, ġ.D., Çolpan, Ġ. Yalçın, S., Yıldız, G., Küçükersan, M.K., Küçükersan, S., Önol, A.G., Muğlalı, Ö.H., ġehu, A., 2002. Yemler, Yem Hijyeni ve Teknolojisi. A.Ü. Veteriner Fakültesi, Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı, Ankara, 465 s Feil, B. 2001. Phytic Acid. Journal of New Seeds, 3: 1-35. Fox, M.R.S., Tao, S.H. 1989. Antinutritive effects of phytate and other phosphorilated derivatives. Nutrition Toxicology, 3: 59–96. Fredrikson, M., Biot, P., Larsson Alminger, M., Carlsson, N.G., Sandberg, A.S. 2001. Production process for high-quality pea-protein isolate with low content of oligosaccharides and phytate. J. Agric. Food Chem., 49: 1208-1212. Fu, S., Guo, S., Shen, Z., Zhang, Na., Qu, G., Gao, Na. 2011. Characterization of a Thermostable Alkaline Phytase from Bacillus licheniformis. International Conference on Agricultural and Biosystems Engineering, Advances in Biomedical Engineering Vols. 1-2. Geil, P.B., Anderson, J.W. 1994. Nutritional and health implications of dry beans: a review. J. Am. Coll. Nutr. 13: 549-558. Glick, B.R., Pasternak, J.J. 2003.Molecular Biotechnology. Amer. Soc. for Microbiol., Washtington, D.C. Golovan, S.P.,Wang, G., Zhang, J., Forsberg, C.W. 2000. Characterization and overproduction of the Escherichia coli appA encoded bifunctional enzyme that inhibits both phytase and acid phosphatase activities. Can. J. Microbiol., 46: 59-71 Gözükara, Engin M. 1990. Biyokimya, Ankara, Ofset Pepianat Ltd. Şti. Greaves, M.P., Anderson, G., Webley, D.M. 1967. The Hydrolysis of Inositolphosphates by Aerobacter aerogenes. Biochim. Biophys. Acta, 132: 412-418. Greiner, R., Haller, E., Konietzny, U., Jany, K.D. 1997. Purification and characterisation of a phytase from Klebsiella terrigena. Archives of Biochemistry and Biophysics, 341, 201–206. Greiner, R., Konietzny, U., Jany, K.D. 1993. Purification and characterization of two phytases from Escherichia coli. Arch Biochem Biophys 303: 107-113. Greiner, R., Larsson Alminger, M., Carlsson, N.G., Muzquiz, M., Burbano, C., Cuadrado, C., Pedrosa, M., Goyoaga, C. 2002. Pathway of dephosphorylation of myo-inositol hexakisphosphate by phytases of legume seeds. Journal of Agricultural Food Chemistry, 50: 6865-6870. 72 Guerrero-Olazarán, M., Rodríguez-Blanco, L., Carreon-Treviño, J. G., Gallegos López, J. A., Viader-Salvadó, J.M. 2010.Expression of a bacillus phytase c gene in pichia pastoris and properties of the recombinant enzyme. Instituto de biotecnología, facultad de ciencias biológicas, Universidad autónoma de nuevo león, san nicolás de los garza, Nuevo león, México. Han, Y.M., Lei, X.G. 1999. Role of glycosylation in the functional expression of an Aspergillus niger phytase (phyA) in Pichia pastoris. Arch. Biochem. Biophys., 364: 83- 90. Han, Y.M., Yang, F., Zhou, A.G., Miller, E.R., Ku, P.K., Hogberg, M.G., Lei, X.G. 1997. Supplemental phytases of microbial and cereal sources improve dietary phytate phosphorus utilization by pigs from weaning through finishing. Journal of Animal Science, 75: 1017–1025. Haros, M., Rosell, C.M., Benedito, C. 2001. Fungal phytase as a potential breadmaking additive. Eur. Food Res. Technol., 213: 317-322. Hegeman, C.E., Grabau, E.A. 2001. A novel phytase with sequence similarity to purple acid phosphatases is expressed in cotyledons of germinating soybean seedlings. Plant Physiology, 126: 1598–1608. Honke, J., Kozlowska, H., Vıdal-Valverde, C., Frıas, J., Gorecky, R. 1998. Changes in quantities of inositol phosphates during maturation and germination of legume seeds. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A, 206: 279-283 Horikoshi, K., 1999. Alkaliphiles: some Applications of Their Products for Biotechnology. Microbiol. Mol.Biol.Rev.,63:735-750 Howson, S.J., Davis, R.P. 1983. Production of phytate hydrolysing enzymes by some fungi. Enzyme Microb Technol., 5: 377-389. In, M.J., Jang, E.S., Kım, Y.J., Oh, N.S. 2004. Purification and Properties of an Extracellular Acid Phytase from Pseudomonas fragi Y9451. J. Microbiol. Biotechnol., 14(5), 1004-1008. Iqbal, T.H., Lewis, K.O., Cooper, B.T. 1994. Phytase activity in the human and rat small intestine. Gut, 35: 1233-1236. Irving, G.C.J., Cosgrove, J. 1971. Inositolphosphate Phosphatase of Microbial Origin. Observation on the Nature of the Active Center of Bacterial (Pseudomonas sp.) Phytase. Austral. J. Biol., 24: 1559-1564. IUPAC-IUB (Commission on Biochemical Nomenclature). 1977. Nomenclature of phosphorus containing compounds of biochemical importance. Eur. J. Biochem., 79: 19. Jog, S.P., Garchow, B.G., Mehta, B.D., Murthy, P.P.N. 2005. Alkaline phytase from lily pollen: Investigation of biochemical properties. Archives Biochemistry Biophysics, 440: 133–140. Kalaichelvan, P. T. 2012.Extracellular production of Phytases by a Native Bacillus subtilis Strain. Annals of Biological Research, , 3 (2):979-987 73 Kaynar, P., Beyatlı Y. 2006. Balıklardan İzole Edilen Bacillus Cinsi Bakterilerin Bazı Metabolik Özelliklerinin Belirlenmesi, Plazmid DNA ve Protein Profillerinin İncelenmesi. Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi, 4(3), 1-30. Kerovuo, J. 2000. A Novel Phytase from Bacillus. Characterization and Production of the Enzyme. Academic Dissertation, p. 68, Helsinki. Kerovuo, J., Lauraeus, M., Nurminem, P., Kalkkinen N., Apajalahti, J. 1998. Isolation, characterization, molecular gene cloning, and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 64: 2079-2085. Kerovuo, J., Tynkkynen, S. 2000. Expression of Bacillus subtilis phytase in Lactobacillus plantarum 755 Letters in Applied Microbiology, 30, 325-329 Kırk, O., Borchert, T.V., Fuglsang, C.C., 2002. Industrial enzymeapplications. Current Opinion in Biotechnology. 13: 345-351. Kim, D.H., Oh, B.C., Choi, W.C., Lee, J.K., Oh, T.K. 1999.Enzymatic evaluation of Bacillusamyloliquefaciens phytase as a feed additive. Biotechnol Lett, 21: 925–7 Kim, H., Kim, Y., Lee, J., Kim, K. and Kim, Y. 2003. Isolation and characterization of a phytase with improved properties from Citrobacter braakii. Biotechnology Letters, 25: 1231-1234. Kim, Y.O., Kim, H.K., Bae, K.S., Yu, J.H., Oh, T.K. 1998. Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp. DS11. Enzyme Microb Technol., 22: 2-7. Konietzny, U., R. Greiner. 2003. Phytic acid: Nutritional Impact. In: Encyclopedia of Food Science and Nutrition, B. Caballero, L. Trugo, P. Finglas (Eds.), Elsevier, London, UK, 4555-4563. Konietzyn, U., R. Greiner. 2004. Bacterial phytase: Potential application, in vivo function and regulation of its synthesis. Brazilian Journal of Microbiology, 35: 11-18. Kornegay, F. E. T. 2001. Digestion of Phosphorus and Other Nutrients: The Role of Phytases and Pactors Influencing Their Activity. Enzymes in Farm Animal Nutrition. Ed., M.R.Bedford, G.G. Partridge, CABI Publishing, UK. pp: 237-272. Kumar, V., Sinha, A.K., Makkar, H.P.S., Becker, K., 2010. Dietary roles of phytate and phytase in human nutrition. Food Chemistry 120, 945– 959 Kutlu, H.R. 2000. Kanatlı Rasyonlarında Enzim Kullanımı, Çiftlik Dergisi, 194: 84-88. Kvist, S., Carlsson, J.M., Lawther, J.M., DeCastro, F.B. 2005. Process for the fractionation of cereal brans. US patent application US 20050089602. Laboure, A.M., Gagnon, J., Lescure, A.M. 1993. Prufication and characterization of a phytase (myo-inositol-hexakisphosphate phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during germination. Biochemical Journal, 295: 413-419. 74 Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227:680-685. Lata, S., Rastogi, S., Kapoor, A., Imran, M. 2013. Optimization of culture conditions for the production of phytase from Aspergillus heteromorphus MTCC 10685. International Journal of Advanced Biotechnology and Research, Vol 4, Issue 2, pp 224- 235 Lehmann, M., Kostrewa, D., Wyss, M., Brugger, R., D’Arcy, A., Pasamontes, L. 2000. From DNA sequence to improved functionality: using protein sequence comparisons to rapidly design a thermostable consensus phytase. Protein Eng. 13: 49– Lei, X.G., Porres, J.M., Mullaney, E.J., Brinch-Pedersen, H. 2007. Phytase: source, structure and application. In: Industrial Enzymes (Section E) (Polaina, J. And MacCabe, A. P.), Springer, pp. 505–529, The Netherlands Lei, X.G., Stahl, C.H. 2001. Biotechnological development of effective phytases for mineral nutrition and environmental protection. Appl. Microbiol. Biotechnol., 57: 474- 481. Lennette, E.H., Balows, A., Hausler, J.W.JR., Shadomy, J.H. 1985. Manual of clinical microbiology. USA, 1149 pp. Liener, I.E., 1994. Implications of antinutritional components in soybean foods. Crit. Rev. Fd. Sci. Nutr. 34: 31-67. Lin, S. 1997. Identification of Contamination Sources of B. cereus in Pasteurized Milk. A Thesis Presented to Faculty of Graduate Studies of University of Guelph.109 p. Canada. Liu, B.L., Rafiq, A., Tzeng, Y.M., Rob, A., 1998. The induction and characterization of phytase and beyond. Enzyme Microbiol. Technol. 22: 415-424. Loewus, F. 2002. Biosynthesis of phytate in food grains and seeds. In: Food Phytases, N.R. Reddy, S.K. Sahte (Eds.), CRC Pres, Boca Raton, Florida, USA, 53-61. Lopez, H.W., F. Leenhardt, C. Coudray and C. Rèmèsy. 2002. Minerals and phytic acid interactions: Is it a real problem for human nutrition? Int. J. Food Sci. Technol., 37: 727-739. Maenz, D.D., Classen, H.L. 1998. Phytase activity in the small intestinal brush border membrane of the chicken. Poultry Science, 77: 557–563. Mao, W., Pan, R., Fredman, D., 1992. High production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in a fed-batch fermentation using synthetic medium. J. Indust. Microbiol. 11: 1-6 Metin, K. 2007. Moleküler Biyoloji Teknikleri II: Protein Analiz Teknikleri. Moleküler Biyoloji (Yıldırım, A., Bardakcı, F., Karataş, M. ve Tanyolaç, B.), Nobel Yayıncılık, Sayfa 555-598, Ankara. 75 Miksch, G., Kleist, S., Friesh, K., Flaschel, E. 2002. Overexpression of the phytase from E. coli and its extracellular production in bioreactors. Appl. Microbiol. And Biotech., p.253. Mitchell, D.B., Vogel, K., Weimann, B. J., Pasamontes, L., Van Loon, A.P.G.M. 1997. The phytase subfamily of histidine acid phosphatases: isolation of genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila. Microbiology, 143: 245-252. Mullaney, E.J., Daly, C.B., Kim, T., Porres, J.M., Lei, X.G., Sethumadhavan, K., Ullah, A.H.J. 2002. Site-directed mutagenesis of Aspergillus niger NRRL 3135 phytase at residue 300 to enhance catalysis at pH 4.0, Biochem. Biophys. Res. Commun. 297: 1016–1020. Mullaney, E.J., Ullah, A.H.J. 2003.The term phytase comprises several different classes of enzymes. Biochem Biophys Res Comm 312: 179-184 Nelson, D.L., Cox, M.M. 2004. Enzymes. Lehninger Principles of Biochemistry (Nelson, D.L., Cox, M.M). W. H. Freeman, p. 190-249,Madison. Nelson, T.S., Shieh, T.R., Wodzinski, R.J., and Ware, J.H. 1968. The availability of phytate phosphorus in soya bean meal before and after treatment with a mold phytase. Poultry Science, 47: 1842-1848. Oh, B.C., Choi, W.C., Park, S., Kim, Y.O., Oh, T.K. 2004. Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytase. Appl Microbiol Biotechnol 63: 362-372. Özler, A. 2009. Malatya kayısısından (Prunus armeniaca L.) pektinesteraz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu. Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, Ankara. Pandey, A., Szakacs, G., Soccol, C.R., Rodriguez-Leon, J.A, And Soccol, V.T., 2001. Production, Purification and Properties of Microbial phytases. Bioresource Technol., 7: 203-214. Pasamontes, L., Haiker, M., Wyss, M., Tessier, M. and van Loon, A.P.G.M. 1997. Gene cloning and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus. Applied Environmental Microbiology, 63: 1696-1700. PekĢen, E., Ark, C., 2005. Antibesinsel maddeler ve yemeklik tane baklagillerin besleyici değerleri, OMÜ Ziraat Fakültesi Dergisi, 20 (2) : 116-117 Pfeffer, M. 1872. Comprehensive study of aleurone grains, identification of globoid and approximation of its chemical nature. Johrb. Wiss. Bot. 8: 429-574. Phillippy, B.Q., Johnston, M.R., Tao, S.H., Fox, M.R. 1998. Inositol phosphates in processed foods. J Food Sci 53: 496-499. Phillippy, B.Q., Wyatt, C.J. 2001. Degradation of phytate in foods by phytases in fruits and vegetable extracts. Journal of Food Science, 66: 535-539. 76 Polaina, J., MacCabe, A.P. 2007. Industrial Enzymes: Structure, Function and Applications. Springer. The Netherlands Powar, V.K., Jagannathan, V. 1982. Purification and properties of phytatespecific phosphatase from Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 151: 1102-1108. Publishers Inc., New York, p 1-11. Purva, V., Uttam, C.B. 2004. Production studies and catalytic properties of phytases (myo-inositolhexakisphosphate phosphohydrolase): an overview, Enzyme Micob. Technol. 35: 3-4. Raboy, V. 2001. Seeds for a better future: Low phytate grains help to overcome malnutrition and reduce pollution. Trends in Plant Science, 6: 458-462. Raghavendra, P., Halami, P.M. 2009. Screening, selection and characterization of phytic acid degrading lactic acid bacteria from chicken intestine. International Journal of Food Microbiology 133, 129-134. Rande, B. D., Augusto, E.S.Jr., Sharon, N., Christopher, M. A. C. 2011.Production and characterization of phytase fromBacillus spp. as feed additive in aquaculture. AACL Bioflux, Volume 4, Issue 3. Rao, B.M., Tanksale, M.A., Ghathe, S.M., Deshpande, V.V. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology, 62: 597-635. Reddy, N.R., Sathe, S.K., Salunkhe, D.K. 1982. Phytases in legumes and cereals. Advances in Food Research, 28: 1-92. Robert, PH., Nordin, BEC., J. Am. Coll. Nutr. 2002, 21,239. Rodriguez, E., Wood, Z.A., Karplus, P.A., Lei, X.G. 2000a. Site-directed mutagenesis improves catalytic efficiency and thermostability of Escherichia coli pH 2.5 acid phosphatese/phytase expressed in Pichia pastoris. Arch. Biochem. Biophys., 382: 105-112. Rose, A. R. 1912. A resume of the literature on inosite-phosphoric acid with special reference to the relation of that substance to plants. Biochem. Bull. 2: 21-49. Sandberg, A.S., Brune, M., Carlsson, N.G., Hallberg, L., Skoglund, E., Rossander- Hulthèn, L. 1999. Inositol phosphates with different numbers of phosphate groups influence iron absorption of human. Department of Food Science, Chalmers University of Technology, University of Göteborg, Sahlgrenska Hospital, Göteborg, Sweden. Sarıkaya, E. 1995. α-Amilaz üreten bazı Bacillus suşlarının gelişme parametreleri, enzim özellik ve üretim koşullarının optimizasyonu. Doktora Tezi, AÜ Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara. Sarkar, S., B., Sreekanth, S. Kant, R. Banarjee, B.C. Bhattacharyya, 1998. Production and optimization of microbial lipase. Bioproc. Engineer., 19: 29-32. 77 Sasirekha, B., Bedashree, T., Champa, K.L. 2012. Optimization and partial purification of extracellular phytase from Pseudomonas aeruginosa p6. Eur. J. Exp. Biol. 2: 95-104. Schallmey, M., Sıngh., A. and Ward, O. P. 2004. Developments in the Use of Bacillus Species for Industrial Production. Canadian Journal of Microbiology, 50: 1-17. Schulze, E. And Wıntersteın, E. 1896. Physiol. Chem. 40:120?????? Scott, J.J., Loewus, F.A. 1986. A calcium-activated phytase from pollen of Lilium longiflorum, Plant Physiol. 82: 333-335. Seo, M-J., Kım, J-N., Cho, E-A., Park, H., Choı, H-J., Pyun, Y-R., 2005. Purification and Characterization of a Novel Extracellular Alkaline Phytase from Aeromonas sp. J. Microbiol. Biotechnol., 15(4), 745-748. Shah, V., Parekh, L.J. 1990. Phytase from Klebsiella sp. No. PG-2: Prufication and Properties. Indian J. Biochem. Biophys., 27: 98-102. Shamna, K. S., Rajamanikandan, K. C. P., Kumar, M.D. J., Balakumaran, M. D., Shimizu, M., 1992. Purification and characterization of a phytase from Bacillus Simell, M., Trunen, M., Piironen, J. And Vara, T. 1989. Feed and food applications of phytase.Lecture at 3rd Meet.İndustrial Applications of Enzymes, Barcelona, Spain. Simons, P., H. Versteegh, A.W. Jongbloed, P.A. Kemme, P. Slump, K.D. Bos, M.G.E. Wolters, R.F. Beudeker and G.J. Verschoor. 1990. Improvement of phosphorus availability by microbial phytase in broilers and pigs. British Journal of Nutrition, 64: 525-540. Singh, N. K., Joshi, D.K., Gupta, R. K. 2013.Isolation of Phytase Producing Bacteria and Optimization of Phytase Production Parameters. Jundishapur Journal of Microbiology, Vol. 6 Issue 5, p1. Soni, S.K., and Khire, J.M. 2007. Production and partial characterization of two types of phytase from Aspergillus niger NCIM 563 under submerged fermentation conditions. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 23: 1585-1593. Sreedevi,S., Reddy, B.N., 2013. Purification and Biochemical Characterization of Phytase from newly isolated Bacillus subtilis C43.Adv Bio Tech: 12(08): 01- 06 Sreedevi, S., Reddy, B.N. 2012. Isolation, screening and optimization of phytase production from newly isolated Bacillus sp. C4. Int J Pharm Biol Sci; 2(2): 218-231. Sreeramulu, G., Srınıvasa, D.S., Nand, K., And Joseph, R., 1996.Lactobacillus amylovorus as a phytase producer in submerged culture. Letters in Applied Microbiology, 23, 385–388. Sweeten, J.M. 1992. Livetock and poultry waste management: a national overview in: Blake, J.D., Magette, W.(eds) National livestock, poultry and aquaculture waste management. Amer Soc. Agric. Eng. St Joseph, Minnesota, pp: 4-15. 78 Tambe, S.M., Kaklij, G.S., Kelkar, S.M., Parekh, L.J. 1994. Two distinct molecular forms of phytase from Klebsiella aerogenes: Evidence for unusually small active enzyme peptide. Journal of Fermentation and Bioengineering Vol.77, No.l, 23-27. Temiz, A. 1994. Genel mikrobiyoloji uygulama teknikleri. Ankara, s. 26-120. Tran, T. T. 2010. Thermostable phytase from a Bacillus sp. (Heterologous production, mutation, characterizationand assay development). Doctoral Thesis, Department of BiotechnologyLund University, Sweden. Tran, T. T., Hashim, S. O., Gaber, Y., Mamo, G., Mattiasson B. and Hatti-Kaul, R. 2010. Thermostable alkaline phytase from Bacillus sp. MD2: effect of divalent metals on activity and stability.J. Ind. Microbiol Biotechnol. 37: 279–287 Trautwein, G. and Kuhlmann, K.P. 1982. İmmunofluoreszenz, Theorie and Praxis, Hannover, p:52. Van Etten, R.L. 1982. Human prostatic acid phosphatase: a histidine phosphatase. Annals of the New york Academy of Science, 390: 27-51. Van Hartingsveldt, W., C.M.J. Van Zeijl, M. Harteveld, R.J. Gouka, M.E.G. Suykerbuyk, R.G.M. Luiten, P.A. Van Paridon, G.C.M. Selten, A.E. Veenstra, R.F.M. Van Gorcom, and C.A.M.J.J. Van den Hondel. 1993. Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger. Gene, 127: 87-94. Vats, P.,Banerjee, U. C. 2005. Biochemical characterisation of extracellular phytase (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase) from a hyper-producing strain of Aspergillus niger van Teighem.J Ind Microbiol Biotechnol, 32: 141–147 Viveros, A., Centeno, C., Brenes, A., Canales, R., and Lozano, A. 2000. Phytase and acid phosphatase activities in plant feedstuffs. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48: 4009-4013. Vohra, A. and T. Satyanarayana. 2003. Phytases: Microbial sources, production, prufication, and potential biotechnological applications. Critical Reviews in Biotecnology, 23(1): 29-60 Wang, M., N.S. Hettiarachchy, M. Qi, W. Burks and T. Siebenmorgen. 1999. Preparation and functional properties of rice bran protein isolate. J. Agric. Food Chem., 47: 411-416. Weremko, D., Fandrejewski, H., Zebrowska, T., Han, K., Kim, J.H., and Cho, W. T. 1997. Bioavailability of phosphorus in feeds of plant origin for pigs Review. Asian- Australians Journal of Animal Sciences, 10: 551-566. Whitehurst, R.J., van Oort, M. 2010. Enzymes in Food Technology. Wiley-Backwell, pp. 388, USA. Wise, A., and Gilburt, D. J. 1982. Phytate hydrolysis in germfree and conventional rats. Applied Environmental Microbiology, 43: 753–756. WN. Jeri, Am. J. Clin. Nutr. 2005, 81,1232 79 Wolfgang, A. 2004. Enzymes in industry: Production and applications. Wileyvch Verlag GmbH&Co. KgaA, pp 485, Weinheim. Wolfson, D., Olmstead, S., Meıss, D., And Ralston, J. 2008. MakingSense of Digestive Enzymes. Klaire Labstm . A division of ProTheraR, Inc. Yanke, L. J., Bae, H.D., Selinger, L. B. and Cheng, K. J. 1998. Phytase activity of anaerobic ruminal bacteria. Microbiology, 144: 1565-1573. Yoon, S.J., Choı, Y.J., Mın, H.K., Cho, K.K., Kım, J.W., Lee, S.C., Jung, Y.H. 1996. Isolation and identification of phytase-producing bacterium, Enterobacter sp. 4, and enzymatic properties of phytase enzyme. Enzyme and Microbial Technol., 18: 449- 454. Yu, S.,Cowieson, A., Gilbert, C., Plumstead, P., Dalsgaard, S.2012.Interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters: Interactions of phytate and myo-inositol phosphate esters (IP1-5) including IP5 isomers with dietary protein and iron and inhibition of pepsin. Journal of Animal Science, 90:1824-1832. Zamudıo, M., Gonzales, A., And Medına, J.A. 2001.Lactobacillus plantarum phytase activity is due to non-specific acid phosphatase. Letters inApplied Microbiology, 32, 181-184. Zeman, N.W., Mccrea, J.M., 1985. Alpha-amylase Production Using a Recombinant DNA Organism. Cereal Foods World. 30(1) : 777-780. Zeman, N.W., Mccrea, J.M. 1985. Alpha-amylase Production Using a Zhou, J.R. and Erdman, J.W.Jr., 1995. Phytic acid in health and disease. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 35 (6): 495-508. Zhou, J.R. and Erdman, J.W.Jr., 1995. Phytic acid in health and disease. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 35 (6): 495-508. Zuo, R., Chang, J., Oıngqıang, Y., Chen, L., Chen, Q., Yang, X., Zheng, Q., Ren, G., Feng, H. 2010. Phytase gene expression in Lactobacillus and analysis of its biochemical characteristics. Microbiological Research 165, 329-335. 80 ÖZGEÇMĠġ Adı Soyadı : Dilara AKÇAKOCA Doğum Yeri ve Tarihi : İstanbul – 28.01.1990 Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl): Lise : Yalova Lisesi – 2005-2007 Lisans : Uludağ Üniversitesi – 2008-2012 Yüksek Lisans : Uludağ Üniversitesi – 2013/2015 Çalıştığı Kurum/Kurumlar: ------ İletişim (e-posta) : Dilara.akcakoca@gmail.com Yayınları* : ------- 81