HIYARDA (Cucumis sativus L.) KABAK SARI MOZAYİK VİRÜSÜ (ZYM V)’NE KARŞI DAYANIKLILIĞI KONTRO L EDEN GENLE BAĞLANTILI MOLEKÜLER İŞ ARETLEYİCİLERİN BELİRLENME Sİ Hasan Özgür ŞIĞ VA 1 T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HIYARDA (Cucumis sativus L.) KABAK SARI MOZAYİK VİRÜSÜ (ZYMV)’NE KARŞI DAYANIKLILIĞI KONTROL EDEN GENLE BAĞLANTILI MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLERİN BELİRLENMESİ Hasan Özgür ŞIĞVA Doç. Dr. Ahmet İPEK (Danışman) DOKTORA TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI BURSA-2015 Her Hakkı Saklıdır 2 TEZ ONAYI Hasan Özgür ŞIĞVA tarafından hazırlanan “Hıyar (Cucumis sativus L.) Bitkisinde Kabak Sarı Mozayik Virüsü (ZYMVV)’ne Karşı Dayanıklılığı Kontrol Eden Genin Genetik Haritasının Moleküler İşaretleyiciler Kullanılarak Oluşturulması” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı’nda DOKTORA TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Doç. Dr. Ahmet İPEK Başkan : Doç. Dr. Ahmet İPEK İmza Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Hatice GÜLEN İmza Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Himmet TEZCAN İmza Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Bitki Koruma Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Önder TÜRKMEN İmza Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Zeynel DALKILIÇ İmza Adnan Menderes Üniversitesi Ziraat Fakültesi, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Ali Osman DEMİR Enstitü Müdürü ../../….(Tarih) 3 U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü, tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; -tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, -görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, -başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, -atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, -kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, -ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. 18/03/2015 İmza Hasan Özgür ŞIĞVA 4 ÖZET Doktora Tezi HIYARDA (Cucumis sativus L.) KABAK SARI MOZAYİK VİRÜSÜ (ZYMV)’NE KARŞI DAYANIKLILIĞI KONTROL EDEN GENLE BAĞLANTILI MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLERİN BELİRLENMESİ Hasan Özgür ŞIĞVA Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Ahmet İPEK Bu doktora tezi çalışmasında, hıyar (Cucumis sativus L.)’da önemli bir virütik hastalık etmeni olan Kabak Sarı Mozaik Virüsü (ZYMV)’ne karşı dayanıklılık sağlayan gene bağlantılı moleküler işaretleyicilerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla daha önceden bu hastalığa karşı belirlenen homozigot dayanıklı ve homozigot hassas iki hıyar çeşidi kullanılmıştır. Bu ebeveynler bire bir melezlenerek F1 hibritleri elde edilmişitir. Elde edilen F1 populasyonundan rastgele seçilen 5 adet birey, kendilenerek 5 adet F2 populasyonu oluşturulmuştur. Elde edilen 5 adet F2 populasyonundan 1 tanesi seçilmiş ve bu populasyon bireylerinin her biri ekilerek F3 aşamasına gidilmiştir. F3 aşamasında elde edilen bireylerden 10 ar adet tohum alınarak bu bireylerde patojenisite testi yapılmıştır. Yapılan patojenisite testi sonucunda dayanıklı, hassas ve heterozigot guruplar belirlemiştir. Yapılan her bir kademede bitkiler 3-4 gerçek yaprak aşamasına geldiğinde bu bitkilerden tek tek yaprak numuneleri alınarak DNA izolasyonları yapılmıştır. F3 aşamasında yapılan patojenisite testi sonrasında belirlenen guruplar göz önünde alınarak hassas ana, dayanıklı baba, dayanıklı gurup-1, dayanıklı gurup-2, hassas gurup-1, hassas gurup-2 ve negatif kontrol (su) olmak üzere 8 gurup belirlenmiştir. Bu gurupların (negatif kontrol hariç) DNA ları alınarak, moleküler işaretleyiciler ile taramaları yapılmıştır. Moleküler işaretleyici taramalarında 170 adet SRAP, 586 adet SSR, 11 adet InDel ve 308 adet AFLP primer kombinasyonları kullanılmıştır. Yapılan moleküler tarama sonuçlarına göre, 170 adet SRAP primer kombinasyonlarından760 DNA bandı elde edilmiştir. Elde edilen bu DNA bandlarından 68 tanesi ilgili DNA larda polimorfizm göstermiş olup, polimorfizim oranı % 8,95’ tir. 586 adet SSR primerlerinden 52 tanesi ilgili DNAlarda polimorfizm göstermiş olup, polimorfizim oranı % 8,87’ dir. 11 adet InDel primerlerinden 32 adet DNA bandı elde edilmiş, elde edilen bu bantlardan 4 tanesi polimorfizm göstermiş olup polimorfizim oranı % 12,5’tir. Toplamda 308 adet AFLP kombinasyonu denenmiştir. Yapılan bu çalışmaların sonucunda E-ACA/MCA, EACA/M-CC, E/ACA/M-CT, E-AAC/M-CA, EAAC/M-CC, EAAC/M-CT, E-AAT/M-CAC, E-AAT/M-CAG, E-ACT/M-CAA primer kombinasyonları, daha önceden oluşturduğumuz ana, baba, F1 ve bulk guruplar üzerinde doğru açılımı verdiği gözlemlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Hıyar, ZYMV, SSR, SRAP, InDel, AFLP, moleküler markırlar 2015, ix, 98 sayfa i ABSTRACT PhD Thesis DETERMINATION of MOLECULAR MARKERS LINKED to the RESISTANCY CONTROL GENE TOWARDS ZUCCHINI YELLOW MOSAIC VIRUS (ZYMV) in CUCUMBER (Cucumis sativus L.) Hasan Özgür ŞIĞVA Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Science Department of Horticulture Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Ahmet İPEK In greenhouse cucumber (Cucumis sativus L.) cultivation, it is suggested that using of resistant variety is the most important method for battling to virus diseases. In this PhD thesis, we aimed that to determine of the genetic mapping via molecular markers of the resistancy toward Zucchini Yellow Mosaic Virus (ZYMV) in cucumber (Cucumis sativus L.). In view of this aim, we determined two parental lines that are resistant and susceptible to ZYMV. These parental lines were crossed in order to get F1 population. After we developed to F1 population, we selected 5 F1s randomly to get F2 populations. After developed 5 F2 populations, we selected only 1 F2 population and all of F2 progenies were selfed to get F3. In F3 stage, we selected randomly 10 F3 plants to do pathogenisity test. After pathogenisty test, we determined to resistant, susceptible and heterozygot plants in F2 population. All of these stages, we collected to fresh leaf samples in order to do DNA isolation. We determined to 8 groups that were bulk groups (resistant group-1, resistant group-2, susceptible group-1, susceptible group-2) with susceptible mother, resistant father and negative control (water). We screened all of these group with 170 SRAP, 586 SSR, 11 InDel and 308 AFLP primer combinations. According to molecular screening results, there were acquired 760 DNA bands from 170 SRAP primer combinations. Within 760 DNA bands, only 68 DNA band patterns showed polymorphism and the ratio of polymorphism was 8,95 %. Within 586 SSR markers, only 52 SSRs showed polymorphism and the ratio of polymorphism was 8,87 %. From 11 InDel markers, tehere were acquired 32 DNA band patterns, within 32 DNA band patterns, only 4 showed polymorphism and the ratio of polymorphism was 12,5 %. Within 308 AFLP primer combinations were done and E-ACA/MCA, EACA/M-CC, E/ACA/M-CT, E- AAC/M-CA, EAAC/M-CC, EAAC/M-CT, E-AAT/M-CAC, E-AAT/M-CAG, E-ACT/M- CAA primer combinations showed correct segregation on our parental lines, F1s and bulk groups. Key Words: Cucumber, ZYMV, SSR, SRAP, InDel, AFLP, Molecular markers 2015, ix, 98 pages ii TEŞEKKÜR Yapmış olduğum doktora tez çalışmamın her aşamasında engin bilgi ve deneyimlerini hiçbir zaman esirgemeyen danışman hocam Sayın Doç. Dr. Ahmet İPEK’e teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmamın her aşaması ile yakından ilgilenen, vermiş oldukları bilgi, görüş ve önerileri ile tezimin daha hızlı yürümesinde doğrudan katkı sağlayan çok değerli hocalarım Sayın Prof. Dr. Vedat ŞENİZ’e, Sayın Prof. Dr. Hatice GÜLEN’e, Sayın Doç. Dr. Himmet TEZCAN’a teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarımın her aşamasında yardım ve desteklerini esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Meryem İPEK’e ve değerli çalışma arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım. 3120013 nolu proje ile bu tez çalışmasının maddi anlamda desteklenmesini sağlayan TÜBİTAK-TEYDEP’e teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışması esnasında her türlü imkanlarını sunan MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş.’ye teşekkürlerimi sunarım. Hayatım boyunca beni her anlamda destekleyen, her zaman yanımda olan anne ve babama, gösterdiği sabır ve anlayışından dolayı eşim Zeynep Özlem DOĞAN ŞIĞVA’ya ve varlığıyla hayatımızı anlamlandıran neşe kaynağım, sevgili kızım Yağmur ŞIĞVA’ya teşekkürlerimi sunarım. Hasan Özgür ŞIĞVA 18/03/2015 iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET........................................................................................................................ i ABSTRACT ............................................................................................................ ii TEŞEKKÜR ........................................................................................................... iii İÇİNDEKİLER ...................................................................................................... iv SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ .......................................................... vi ŞEKİLLER DİZİNİ .............................................................................................. viii ÇİZELGELER DİZİNİ .......................................................................................... ix 1. GİRİŞ ................................................................................................................... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ ...................................................................................... 10 2.1. Markır Sistemleri ............................................................................................ 10 2.1.1. Morfolojik Markırlar .................................................................................... 10 2.1.2. Moleküler Temelli Markırlar ....................................................................... 11 2.1.2.1. Protein Temelli Moleküler Markır Sistemleri ........................................... 12 2.1.2.1.1. İzozimler (İzoenzimler) .......................................................................... 13 2.1.2.2. Hibridizasyon Temelli Moleküler Markır Sistemleri ................................ 14 2.1.2.2.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms; Sınırlayıcı Enzim Parça Uzunluk Çeşitliliği) .......................................................................... 14 2.1.2.3. PCR (Polymerase Chain Reaction; Polimeraz Zincir Reaksiyonu) Temelli Moleküler Markır Sistemleri .................................................................... 15 2.1.2.3.1. RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA; Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA) ................................................................................ 16 2.1.2.3.2. SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions; Sekansı Karakterize Edilmiş Çoğaltılmış Bölgeler) ............................................................ 17 2.1.2.3.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) ................................................................................ 17 2.1.2.3.4. SSRs (Simple Sequence Repeats; Basit Dizi Tekrarları) ....................... 18 2.1.2.4. Sekans Temelli Moleküler Markır Sistemleri ........................................... 19 2.1.2.4.1. SNP (Single Nucleotide Polymorphism; Tek Nükleotid Polimorfizmi) ......................................................................................................... 19 2.2. Hıyar’da (Cucumis sativus L.) Moleküler Markırlar ...................................... 20 2.3. Kabak Sarı Mozayik Virüsü ............................................................................ 23 3. MATERYAL VE YÖNTEM ............................................................................. 26 3.1. MATERYAL .................................................................................................. 26 3.2. YÖNTEM ........................................................................................................ 26 3.2.1. Haritalama Populasyonunun Oluşturulması ................................................. 26 iv 3.2.1.1. Ebeveyn Temini ........................................................................................ 26 3.2.1.2. F1 Populasyonlarının Oluşturulması ......................................................... 26 3.2.1.3. F2 Populasyonlarının Oluşturulması ......................................................... 27 3.2.1.4. F3 Populasyonun Oluşturulması ................................................................ 27 3.2.2. Patojenisite Testlerinin Yapılması ............................................................... 28 3.2.2.1. Virüs İnokulumunun Hazırlanması ve Bitkilere Aşılanması .................... 28 3.2.2.2. Hıyarlar'da in vivo virüs testlemeleri ........................................................ 28 3.2.2.3. Serolojik Çalışmalar ile Dayanıklılılığın Kontrol Edilmesi ...................... 29 3.2.3. Genetik Haritalama Çalışmaları ................................................................... 31 3.2.3.1. DNA İzolasyonu........................................................................................ 31 3.2.3.2. DNA Miktar ve Kalite Ölçümü ................................................................. 32 3.2.3.3. Moleküler Markırlar ve PCR İşlemleri ..................................................... 33 3.2.3.3.1. SSR (Simple Sequence Repeats; Basit Dizi Tekrarları) Moleküler Yöntemi ................................................................................................ 33 3.2.3.3.2. SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism; Dizi İlişkili Çoğaltılmış Polimorfizm) Moleküler Yöntemi ...................................................... 34 3.2.3.3.3. InDEL (Insertion-Deletion Polymorphisms; Eklenme ve Silinme Polimorfizmi) ......................................................................................................... 36 3.2.3.3.4. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) ................................................................................ 37 3.2.3.4. BSA (Bulk Segregant Analizi) .................................................................. 38 4. BULGULAR ...................................................................................................... 40 4.1. F1, F2 ve F3 Populasyonlarının Oluşturulması ................................................ 40 4.2. Patojenisite Testleri ......................................................................................... 40 4.3. Genetik Haritalama Çalışmaları ...................................................................... 42 4.3.1. DNA İzolasyonu........................................................................................... 42 4.3.2. DNA Miktar ve Kalite Ölçümü .................................................................... 43 4.4. PCR ve Moleküler Markır Analizleri .............................................................. 44 4.4.1. SSR (Simple Sequence Repeats; Basit Dizi Tekrarları) .............................. 44 4.4.2. SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism) ................................. 45 4.4.3. InDEL (Insertion-Deletion Polymorphisms)................................................ 46 4.4.4. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................... 47 4.6. Haritalama Populasyonunun Test Edilmesi .................................................... 48 5. TARTIŞMA VE SONUÇ .................................................................................. 50 KAYNAKLAR ...................................................................................................... 53 EKLER ................................................................................................................... 62 ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................... 98 v SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama ºC Santigrad derece kDa Kilodalton lux Birim yüzeye düşen ışık aksı (Luminous flux) mg Miligram mM Milimolar ml Mililitre ng Nanogram nm Nanometre pH Hidrojenin gücü (Power of Hydrogen) rpm Dakikada dönme sayısı (Revolutions per minute) U Birim (Unit) µg Mikrogram µl Mikrolitre Kısaltmalar Açıklama AFLP Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Length Polymorphism) AP-PCR Rastgele Seçilmiş Primerin Polimeraz Zincir Reaksiyonu(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction) BSA Bulk Segreant Analizi CAPS Bölünerek Çoğaltılmış Polimorfik DNA (Cleaved Amplified Polymorphic DNA) CMV Hıyar Mozaik Virüsü (Cucumber Mosaic Virus) CVYV Hıyar Damar Sarılığı Virüsü (Cucumber Vein Yellowing Virus) DAFs DNA Parmakizi Çoğaltımı (DNA Amplification Fingerprinting) DAS-ELISA (Double-Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) DNA Deoksiribo Nükleik Asit EST İfade Edilmiş Dizi Etiketleri (Expressed Sequences Tag) InDEL Insertion DeletionNucleotide Polymorphism (Eklenme ve Silinme Nükleotid Polimorfizmi) ISSR Basit Dizi Tekrarları Arası Polimorfizm (Inter Simple Sequence Repeat) NTP Nükleotid 3 Fosfat (Nucleotide Tri Phosphate) PIC Polimorfizm Bilgi İçeriği (Polymorphism Information Content) PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction) PRSV Papaya Ring Spot Virus (Papaya Halkalı Leke Virüsü) vi RAPD Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (Random Amplified Polymorphic DNA) RFLP Sınırlayıcı Enzim Parça Uzunluk Çeşitliliği (Restriction Fragment Length Polymorphisms) RNA Ribo Nükleik Asit SCAR Sekansı Karakterize Edilmiş Çoğaltılmış Bölgeler (Sequence Characterized Amplified Regions) SFR Süper İnce Çözünürlüklü (Super Fine Resolution) SNP Tek Nükleotid Polimorfizmi (Single Nucleotide Polymorphism) SPAR Tek Primer Çoğaltım Reaksiyonu (Single Primer Amplification Reaction) SqMV Kabak Mozayik Virüsü (Squash Mosaic Virus) SSR Basit Dizi Tekrarları (Simple Sequence Repeats) STRs Kısa Bitişik Tekrarlara (Short Tandem Repeats) STS Hedef Dizilimli DNA Bölgeleri (Sequence Tagged Site) UV Mor Ötesi (Ultra Violet) WMV II Karpuz Mozayik Virüsü II (Watermelon Mosaic Virus II) ZYMV Kabak Sarı Mozaik Virüsü (Zucchini Yellow Mosaic Virus) vii ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 3.1. Hıyar bitkisinde virüs inokülasyonu. .................................................. 28 Şekil 3.2. Hıyar bitkisinde ZYMV hastalığının gösterdiği simptomlar .............. 29 Şekil 3.3. Hıyar bitkisinde DAS-ELISA prosedürü. ........................................... 30 Şekil 4.1. ZYMV patojenisite testi sonu sonuçlarına...........................................41 göre hassas ve dayanıklı çıkan bitki numuneleri Şekil 4.2. Bazı SSR primerlerinin genotipleme tarama jel görüntüleri .............. 45 Şekil 4.3. Bazı SRAP primer kombinasyonlarının genotipleme tarama jel görüntüleri. ......................................................................................... 46 Şekil 4.4. Bazı InDel primerlerinin genotipleme tarama jel görüntüleri ............ 47 Şekil 4.5. Bazı AFLP primer kombinasyonlarının genotipleme tarama jel görüntüleri. ......................................................................................... 48 viii ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 1.1. Ülkeler bazında toplam sebze üretim miktarları .................................. 2 Çizelge 1.2. Ülkeler bazında hıyar üretim miktarları ............................................... 3 Çizelge 1.3. Bölgelere göre örtü altı üretim değerleri .............................................. 4 Çizelge 1.4. 100 gr hıyar meyvesinin besin değerleri .............................................. 7 Çizelge 2.1. Hıyar ’da kabak sarı mozaik virüsü hastalığına karşı kullanılan 1-9 skalası.............................................................................................. 11 Çizelge 2.2. Morfolojik ve yaygın olarak kulanaılan bazı moleküler markırların polimorfizm seviyesi, dominansi durumu ve PCR temelli olup olmamasına göre kıyaslanması .......................................................... 13 Çizelge 2.3. Kabak sarı mozayik virüsünün sınıflandırması.................................. 25 Çizelge 3.1. SSR master mix protokolü ................................................................. 33 Çizelge 3.2. SSR sıcaklık döngü protokolü ........................................................... 34 Çizelge 3.3. SRAP master mix protokolü .............................................................. 35 Çizelge 3.4. SRAP sıcaklık döngü protokolü ........................................................ 35 Çizelge 3.5. InDel master mix protokolü ............................................................... 36 Çizelge 3.6. InDel sıcaklık döngü protokolü ......................................................... 36 Çizelge 3.7. AFLP selektif amplifikasyon PCR master mix protokolü ................. 38 Çizelge 3.8. AFLP selektif amplifikasyon sıcaklık döngü protokolü .................... 38 Çizelge 4.1. DAS-ELISA sonuçlarına göre F2:3 populasyonunun 2 χ testi sonuçları ...................................................................................................... 42 Çizelge 4.2. Bulk guruplar ve bitki numaraları ...................................................... 42 ix 1. GİRİŞ Sebze üretimi, ekolojik koşulların uygun olduğu açık alanlar dışında örtü altında da yapıldığından yıl boyunca sürdürülebilen bir üretim faaliyetidir. Ticari anlamda sebze üretimi 19. yüzyılın ikinci yarısından sonra başlamış, sanayinin gelişmesi ile modern alet ve ekipmanların tarıma girmesi, tohum, gübre, ilaç gibi tarımsal girdilerin yaygın olarak kullanılması sonucu sebzecilik sektörü 20. yüzyılda hızla gelişmiştir. Dünya nüfusunun artması ve insanların beslenme alışkanlıklarının değişmesi sektörün gelişmesine katkı sağlamıştır. FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations)'nun 2012 yılı istatistiklerine göre Dünya üzerinde toplamda 57 273 114 hektar alanda 1 106 133 866 ton sebze üretilmektedir (www.fao.org). FAO’nun 2012 verilerine göre dünya genelinde 161 793 834 ton üretim ile domates en fazla üretimi yapılan sebze olmakla birlikte bunu 105 372 341 ton ile karpuz, 82 851 732 ton ile kuru soğan, 70 104 972 ton ile lahana ve 65 134 078 ton ile hıyar takip etmektedir. Ülkemizde tropik bitkiler hariç pek çok sebze türü yetiştirilebilmektedir. FAO'nun 2012 yılı verilerine göre 1 111 702 hektar alanda 27 818 918 ton sebze üretilmiş olup, toplam bitkisel üretim değerinin %25'ini oluşturmuştur. Türkiye sebze üretimi bakımından Dünyada Çin, Hindistan ve ABD'nin ardından dördüncü sırada bulunurken, Avrupa’da ise ilk sırada yer almaktadır (www.fao.org). Dünya sebze üretimi bakımından en çok üretim yapılan 10 ülke ve üretim miktarları Çizelge 1.1.’de verilmiştir. Sebze üretiminin en fazla yapıldığı Ege, Akdeniz ve Marmara bölgeleri tür ve çeşit yönünden de zengindir. Bu bölgeleri Marmara ve Orta Anadolu'nun kuzeyi, Karadeniz, Güneydoğu Anadolu, Orta Anadolu'nun Doğusu, Orta Anadolu'nun güneyi ve Doğu Anadolu'nun kuzeyi izlemektedir. Bölgeler içerisinde verimlilik bakımından Akdeniz Bölgesi ilk sırada olup, ardından sırasıyla Ege, Marmara ve Karadeniz Bölgeleri gelmektedir. Türkiye'de üretilen sebzenin %82'si açıkta, %18'i örtü altında yetiştirilmektedir. Sebze üretim miktarında 1990'lı yıllardan bu yana önemli gelişmeler yaşanmıştır. Türkiye, sera alanları bakımından Akdeniz ülkeleri içerisinde üçüncü sırada yer almaktadır. Teknik bilgi gerektirmesi ve üretim maliyetinin yüksek olmasına rağmen örtü altı sebze yetiştiriciliği karlı bir tarımsal üretim biçimidir. Türkiye'de 1 1940'lı yıllarda Akdeniz sahil kuşağında başlayan örtü altı yetiştiriciliği faaliyetleri, hibrit çeşitlerin de kullanımı ile sebze tarımına önemli katkı sağlamıştır (Abak ve ark. 1994, Sevgican 1999, Karagöz 2003). Çizelge 1.1. Ülkeler bazında toplam sebze üretim miktarları Sıra Ülkeler Üretim (mt) 1 Çin Halk Cumhuriyeti 573 935 000 2 Hindistan 109 140 990 3 Amerika Birleşik Devletleri 35 947 720 4 Türkiye 27 818 918 5 İran 23 485 675 6 Mısır 19 825 388 7 Rusya Federasyonu 16 084 372 8 Meksika 13 599 497 9 İspanya 12 531 000 10 İtalya 12 297 645 Örtü altı yetiştiriciliğindeki hızlı gelişme 1980'li yılların sonunda hibrit tohum ithalinin başlanması ve ihracat şansının artmasıyla başlamıştır. Örtü altı yetiştiriciliği, iklimin uygun olduğu Akdeniz, Ege ve Marmara kıyıları ile mikro klima alanlarında yaygınlaşmıştır. Örtü altı sebze yetiştiriciliği, yıl boyu üretim sağlanabilmesi, ihracat imkânı olması ve istihdama katkısı nedeniyle önemli bir üretim şeklidir. Türkiye'nin örtü altı üretim alanı 2005 yılı verilerine göre 469 bin dekardır. Bu alanın %14'ü cam, %86'sı plastik örtülerden oluşmaktadır (Tüzel 2001, Karagöz 2003). Hıyar (Cucumis sativus L.), Cucurbitales takımından Cucurbitaceae (Kabakgiller) familyasından, tek yıllık, 2n=14 kromozoma sahip, sarılıcı bir kültür bitkisi olup, 2 metreye kadar boylanabilmektedir (Seçmen ve ark. 1997). Genom uzunluğu yaklaşık olarak 367 Mb olmakla birlikte Cucurbitaceae familyası üyelerinin içinde en küçük genoma sahiptir (Han ve ark. 2008, Ren ve ark. 2009). Sıcak iklim kaynaklı olan bu familya üyeleri genel olarak toplam sıcaklık isteklerinin yüksek olmalarından dolayı yazlık sebzeler gurubunda yer alırlar. Hıyar en eski kültüre alınan bitkilerden biridir. 2 Hıyar bitkisinin tarihte 5000 yıldır var olduğu ve ana vatanının Hindistan olduğu çeşitli kaynaklarda gösterilmektedir (Kirkbride, 1993). Hindistan’dan Çin’in doğusuna, Asya’nın batısına, Kuzey Afrika ve Güney Avrupa’ya yayılmıştır. Yazılı kaynaklara göre ilk defa 1494 yılında Haiti’de kültüre alınarak dünyaya tanıtılmıştır. 2012 FAO verilerine göre, ülkemiz hıyar yetiştiriciliğinde 1 741 878 mt ile dünyada Çin’den sonra 2. sırada gelmektedir. Türkiye’yi İran, Rusya, Ukrayna ve ABD takip etmektedir. Dünya hıyar üretimi bakımından en çok üretim yapılan 15 ülke ve üretim miktarları Çizelge 1.2.’de verilmiştir. Ülkemizde her bölgede üretimi yapılan bir sebze olmakla birlikte toplam üretimin %44'ü Akdeniz bölgesinden elde edilmektedir. Bu bölgeyi sırasıyla %11 Ege, %9,8 Marmara, %9 Orta kuzey bölgesi izlemektedir. Hıyar üretimi, toplam sebze üretimimiz içerisinde %5’ lik bir paya sahiptir. İlgili üretimlerin bölgelere göre payları Çizelge 1.3.’te verilmiştir. Çizelge 1.2. Ülkeler bazında hıyar üretim miktarları (www.fao.org) Sıra Ülkeler Üretim (mt) 1 Çin 48 000 000 2 Türkiye 1 741 878 3 İran İslam Cumhuriyeti 1 600 000 4 Rusya Federasyonu 1 281 788 5 Ukrayna 1 020 600 6 Amerika Birleşik Devletleri 901 060 7 İspanya 713 200 8 Meksika 640 508 9 Mısır 613 880 10 Japonya 586 500 11 Polonya 520 868 12 Endonezya 511 525 13 Irak 505 000 14 Özbekistan 435 000 15 Hollanda 410 000 3 Hıyar (Cucumis sativus L.) bitkisinin morfolojisi, ana kök kazık köklü olup 5-10 cm uzunluğa kadar uzayabilir. Ana kök ve yan kökler toprak altında çok fazla derine gitmezler ve toprağın üst tabakalarında bitkinin gelişim durumuna göre 50-100 cm kadar yanlara yayılabilirler. Hıyar bitkisinin toprak nemine karşı afinitesi oldukça yüksektir. Bu sebepten dolayı kökler genellikle yüzeysel büyür ve uygun çevresel koşullarda ortalama 20-25 cm derinliğe kadar gelişebilir. Ana kökten oluşan yan köklerin büyümesi ve dallanmasıyla kök saçak kök görünümü alır. Özellikle çok fazla su tutan ve drenajı kötü olan topraklarda ana ve yan kök gelişimi iyi olmaz. Hıyar bitkisinin morfolojik olarak gelişmesi, tarla koşullarında ana gövde uygun şartlarda ortalama 100-300 cm’ye kadar gelişebilir. Ana gövde vejetatif evrede yeşil-koyu yeşil renkte iken meyve oluşumuyla birlikte renk sarı yeşil, açık sarı ve sarı renge dönüşür. (Robinson ve Decker-Walters 1997, Sevgican 1999, Vural ve ark. 2000). Çizelge 1.3. Bölgelere göre örtü altı üretim değerleri 50% 45% 40% 44% 35% 30% 25% 26% 20% 15% 10% 11% 5% 10% 9% 0% Akdeniz Ege Bölgesi Marmara Orta ve Kuzey Diğer Bölgeler Bölgesi Bölgesi Anadolu Bölgesi Hıyar bitkisinin ana gövdesi otsu yapıda olup sürünücü ve tırmanıcı özelliktedir. Genel olarak gövde köşeli ve tüylü yapıdadır. Sürünücü özellikte olduğu için gövde, yan dalları ve meyveleri taşıyacak ve dik duracak güçte değildir. Hıyar bitkisinde yapraklar, ana gövdeye uzun bir sapla bağlı olarak boğumlardan çıkar. Yapraklar çeşit özelliği ve yetiştirme ortamına bağlı olarak farklı büyüklük ve şekillerde olabilir, özellikle nemli ve ılıman ortamlarda 25-30 cm genişliğe kadar ulaşabilirler. Yaprak kenarları düz veya dişli yapıda olabilir, üst yüzeyi düz ve parlak, alt yüzeyleri dalgalı, mat ve tüylüdür. 4 Yaprak sapı uzun ve ortası oluklu, üzeri tüylü ve dikenlidir. Bitkinin bir yere tutunarak sarılmasını ve böylelikle tırmanıcı özellik kazanmasını sağlayan yapılara sülük adı verilir. Sülükler genel olarak metamorfoza uğramış yapraklar olarak bilinirler. Hıyar bitkisinde çiçekler ise genellikle monoik yani tek evciklidir. Aynı bitki üzerinde hem erkek hem de dişi çiçekler farklı yaprak koltuklarından çıkar, bu bitkilere monoik yani tek evcikli bitkiler denir. Monoik bitkilerde erkek çiçekler dişi çiçeklerden önce meydana gelir. Erkek ve dişi çiçekler kademeli bir şekilde gövde üzerinde sıralanır ve genellikle dişi çiçekler yan dallar üzerinde meydana gelir. Genel olarak Hıyar bitkisinde dişi çiçeklerin erkek çiçeklere göre bulunma olasılığı daha düşüktür. Erkek çiçeklerin çiçek sapı kısadır. Çiçek tablası üzerinde beş adet sepal (çanak yaprak), beş adet açık sarı renkli petal (taç yaprak) ve beş adet stamen (erkek organ) bulunmaktadır. Hıyar bitkisinde polen taşınımı genellikle arı gibi böceklerle sağlanır. Bunun nedeni hıyarda polenin olgunlaştığında dağılmayıp, jelatinimsi bir madde ile yapışık durumda kalmasıdır. Dişi çiçeklerde çiçek sapı erkek çiçek sapından daha uzundur. Çiçek sapının ucunda meyve taslağı bulunur. Meyve taslağının uç kısmında erkek çiçekte olduğu gibi beş adet sepal, beş adet petal, beş adet kısırlaşmış stamen ve ortada üç karpelli bir pistil bulunur (Sevgican 1999, Vural ve ark. 2000). Hıyar yetiştiriciliğinde genel olarak, eşit şekil ve büyüklükte meyve alınabilmesi ve yüksek verim değerlerine ulaşılabilmesi için partenokarpik çeşitlere yönelim vardır. Bitkilerde döllenme olmaksızın meyve oluşumuna partenokarpi bu çeşit üremeye ise partenogenez adı verilmektedir (King 1947, Sjut V. ve Bangerth F. 1984.). Örtü altı hıyar yetiştiriciliğinde kullanılan çeşitlerin tamamı %100 dişi çiçek oluşturan ve tozlanma ya da döllenmeye ihtiyaç duymadan meyve tutabilen partenokarpik çeşitlerdir. Hıyar bitkisinde, meyveler çeşit özelliğine bağlı olarak farklı şekillerde olabilmektedir. Uzun yuvarlak, silindirik, kama, tokmak vb. olabilir. Meyvelerin enine kesiti yuvarlak üçgen ve dörtgen olabilmektedir (Robinson ve Decker-Walters 1997, Sevgican 1999, Vural ve ark. 2000) Hıyar, ılıman iklimlerde yetiştirilen dolayısıyla düşük ve yüksek sıcaklıklardan çok kolay etkilenebilen bir sebzedir. Özellikle soğuklara karşı çok hassas olup sıcaklık sıfırın altına düştüğü durumlarda bitki gelişimi çok etkilenir. Düşük sıcaklıklarda üşüme, yüksek sıcaklıklarda fungal hastalıklar ve aşırı su kaybı nedeniyle bitki gelişimi 5 yavaşlar. Tohumların iyi bir çimlenme gösterebilmesi için toprak sıcaklığının minimum 11 °C olması gerekir. Çimlenme için en elverişli toprak sıcaklığı ise 11-18 ºC arasındadır. Toprak sıcaklığının artmasına paralel olarak tohum çimlenme hızı da artar. Özellikle yaz dönemlerinde, hava sıcaklıklarının yüksek ve nispi nemin düşük olduğu koşullarda, normal sulamaya ek olarak sulama yapılarak bitki su düzenin uygun koşullar altında tutulması sağlanır. Bunun yapılamadığı durumlarda bitkide metabolik gelişim yavaşlayarak verim kalitesinde azalmalara ve dolayısıyla verim kayıplarına yol açabilir. Bu sorunla karşılaşmamak için ekim tarihlerine özen göstererek, özellikle ilkbaharda don tehlikesinin geçmesine müteakip ekimlerin yapılması gerekmektedir. Gün ışığından dolaylı olarak faydalanır, burada en önemli unsur, hıyar bitkisi gün ışığının miktar ve zaman oranına bağlı olarak erkek çiçek oluşumunun değişmesidir. Özellikle 6000-8000 lux aralığındaki bir ışıklanma miktarı ile 12 saat ışıklanma süresi erkek/dişi çiçek oluşum oranının sınırıdır. Bu değerlerin üzerinde çıkıldığında bitkide dişi çiçek oranı artarken, altındaki değerlerde erkek çiçek oluşumuna yönlendiği gözlemlenmiştir (Robinson ve Decker-Walters 1997, Sevgican 1999, Vural ve ark. 2000). Toprak isteği bakımından oldukça seçici olan hıyar özellikle organik maddelerce zengin, tuz konsantrasyonu düşük, su tutma kapasitesi yüksek ve kireç içermeyen topraklarda daha iyi gelişim göstermektedir. Özellikle ağır bünyeli, nem miktarı fazla, soğuk ve kurak topraklarda yetiştirilen hıyar bitkilerinde, toprak özelliklerinden kaynaklanan verim kayıpları gözlemlenmiştir. Özellikle ağır bünyeli topraklarda çiçek oluşumunun gecikmesine bağlı verim kayıpları gözlemlenmiştir. Bunlara ek olarak, abiyotik stres koşullarından dolayı köklerde çürümeler, köklerin patojenlere karşı korumasız kalması ve bu sebeplerden dolayı da bitki gelişim bozkluklarıda gözlemlenen bir diğer önemli noktadır. Hafif yapılı topraklarda uygun gübrelemenin yapılması ve organik madde ilavesi gibi bazı uygulamalar yapılması durumunda hıyar yetiştiriciliğinde kullanılabilir. Hıyar yetiştiriciliğinde toprak pH’sı diğer bir önemli kriterdir. Özellikle pH değerinin asidik karakterde olması istenir. En uygun pH değerleri 5,5-5,8 arasıdır. Daha yüksek asiditeye sahip topraklada bitki Mg elementini bünyesine alamaz ve bitkide Mg eksikliği meydana gelir (Sevgican 1999, Vural ve ark. 2000). Hıyar bitkisinin besin değerlerine bakılacak olursa 100 gr hıyar meyvesi 12 kalori içermektedir. 100 g meyvede; 96 g su, 0,6 g protein, 0,1 g yağ, 2,2 g karbohidrat, 45 U 6 Vitamin A, 0,03 mg vitamin B1, 0,02 mg. Vitamin B2, 0,3 mg Niacin, 12 mg Vitamin C, 12 mg Kalsiyum, 0,3 mg Demir, 15 mg Magnezyum ve 24 mg Fosfor bulunmaktadır. İlgili değerler Çizelge 1.4.’te verilmiştir (Anonim, 2012) Çizelge 1.4. 100 gr hıyar meyvesinin besin değerleri Besin Maddesi Miktar 1 Kalori 12 cal 2 Su 96 g 3 Protein 0,6 g 4 Yağ 0,1 g 5 Karbohidrat 2,2 g 6 A Vitamini 45 IU 7 B1 Vitamini 0,03 mg 8 B2 Vitamini 0,02 mg 9 Niacin 12 mg 10 C Vitamini 12 mg 11 Kalsiyum 0,3 mg 12 Demir 15 mg 13 Magnezyum 24 mg 14 Fosfor 24 mg Türkiye'de örtü altı tarımda kullanılan tohumluğun parasal değeri yaklaşık 100 milyon dolar olup, bunun yaklaşık %40'lık kısmı yerli tohum firmalarının ıslah ederek geliştirdikleri çeşitlerden karşılanabilmektedir. Örtü altı tarımında kullanılan tohumluğun tamamına yakını F1 hibrit çeşitlerden oluşmaktadır. Hıyar, özellikle örtü altı yetiştiriciliğinde domates ve karpuzdan sonra en önemli tarımsal ürünlerden birisidir. Yılda yaklaşık 150 milyon adet hıyar tohumu kullanılmakta olup, bunun %80'i yurtdışından ithalatla karşılanmaktadır (Abul-Hayja ve Al-Shahwan 1991, Robinson ve Decker-Walters 1997). Virüslerin neden olduğu hastalıkları ülkemizdeki örtü altı hıyar yetiştiriciliğinin en önemli sorunlarından biridir. Önemli bir verim ve kalite kaybına yol açan virüs 7 hastalıklarının herhangi bir kimyasal yöntemle mücadelesi yoktur. Virüsle mücadelede izlenebilen iki yol vardır. Bunlar, dayanıklı çeşit kullanmak ya da virüsleri taşıyan vektör zararlılarla kimyasal mücadele yapmaktır. Kullanılan kimyasal ilaçlar bıraktıkları kalıntılarla çevre ve insan sağlığı açısından olumsuz sonuçlar doğurmaktadırlar. Özellikle örtü altı hıyar yetiştiriciliğinde iki hasat arasındaki sürenin 2-3 gün gibi kısa bir süre oluşu dayanıklı çeşit ıslahının insan ve çevre sağlığı açısından önemini artırmaktadır. (Abul-Hayja ve Al-Shahwan 1991, Robinson ve Decker-Walters 1997, Desbiez ve Lecoq 1997, Decker-Walters ve ark. 2001). Hıyarda görülen önemli virüs hastalıklarından bazıları hıyar mozaik virüsü (CMV), hıyar damar sarılığı virüsü (CVYV) ve kabak sarı mozaik virüsü (ZYMV) hastalıklarıdır. En yaygın olarak gözlenen virüs hastalıkları arasında ZYMV tarafından etkilenen hıyar seralarında önemli oranda verim kayıpları gözlenmektedir (Pitrat ve ark. 1984, Providenti ve ark. 1984, Desbiez ve Lecoq 1997). Potyvirüslerden olan bu etmen son yıllarda hem tarım alanları hem de bitki türleri açısından hızla yaygınlaşmaktadır. Bu virüsün yoğun zarar yaptığı sezonlarda zararın toplam örtü altı hıyar üretiminde büyük kayıplara neden olabilmekte bu da tüketici ve üreticileri direk olarak etkilemektedir. (Lecoq ve Pitrat 1984). ZYMV`ye karşı genetik olarak dayanıklı hıyar elde edilmesi, konvansiyonel ıslah yöntemleri kullanılarak yapılmaktadır. Bu çalışmalarda, özellikle hastalığa karşı dayanıklı bitkilerin seçilmesi aşamasında, bitkilerin ilgili hastalık patojeni ile testlenmesi uzun zaman almakta ve çok fazla iş gücü gerektirmektedir. Özellikle patojen inokülasyonu ve sonrasında patojenler sıcaklık, nem gibi çevresel koşullardan çok kolay etkilenebilmekte ve dolayısıyla kesin sonuçlar veremeyebilmekte ve ıslah çalışmalarının yavaş ilerlemesine neden olmaktadır. Bunlara ek olarak, ZYMV`ye karşı dayanıklılık geninin geriye melezleme ıslah yöntemi ile kültür çeşitlerine aktarılırken, aktarılan dayanıklılık geninin çekinik olmasından dolayı dayanıklılık genini taşıyan heterozigot bitkilerin belirlenmesi için test melezlemelerinin yapılması zorunluluktur. Test melezlemelerinin yapılması ise hem gerekli olan iş gücü miktarını hem de maliyetleri önemli ölçüde arttırmaktadır. Son yıllarda ıslah çalışmalarında sıklıkla kullanılan moleküler işaretleyiciler destekli seleksiyonda ise istenilen özelliğin seçimi bu özelliğe bağlantılı olduğu önceden belirlenen moleküler işaretleyiciler kullanılarak 8 yapılmaktadır. Islah çalışmalarında, herhangi bir hastalığa karşı dayanıklı bitkilerin seçilmesi aşamasında DNA temelli moleküler markırların kullanılması bitkilerin üzerinde çalışılan hastalığa karşı dayanıklılık genini taşıyıp taşımadığı çok erken dönemde (fide aşamasında) belirlenmesine olanak vermektedir. Bu tespit, konvansiyonel ıslah çalışmalarında yapılan testlere oranla çok daha güvenilir olmakta ve çok kısa zamanda yapılabilmektedir. Ayrıca gerekli iş gücü miktarını ve maliyetini de önemli ölçüde düşürmektedir. Kullanılan moleküler işaretleyicilerin yapısına bağlı olarak bir çeşidin o hastalığa karşı dayanıklı, heterozigot veya hassas olduğunun tespit edilmesi mümkündür. ZYMV`ye karşı dayanıklılığı kontrol eden genler hakkında yapılan literatür taramaları sonucu dayanıklılık mekanizması kalitatif karakterde olduğu belirlenmiş ve tek bir çekinik gen tarafından kontrol edilmektedir (Park ve ark., 2004). Bu hastalığa karşı dayanıklılık sağlayan gene bağlantılı moleküler markırlar geliştirilmiştir (Park ve ark., 2004) fakat yapılan ön çalışmalarda bu moleküler markırın geliştirilmesi için yapılan melez populasyonlarında kullanılan genitör ile Türkiye’de ıslahı yapılan genitörlerin aynı olmadığı gözlemlenmiştir. Bu nedenle, Park ve ark. (2004) tarafından geliştirilen moleküler işaretleyicinin kullanılması mümkün olmamaktadır. Amano ve ark. (2013) tarafından geliştirilen en son markır CAPS markırı olmakla birlikte henüz kendi populasyonlarımızda deneme imkanı olmamıştır. Bu tez çalışması ile birlikte elde edilecek moleküler markır(lar), konvansiyonel ıslah programlarına moleküler teknikleri entegre ederek modern DNA ve istatistiksel analiz yöntemleriyle daha etkin kılmak, hıyarda ZYMV'ye karşı oluşturulan hıyar populasyonlarında güvenilir bir şekilde çalışan moleküler markırlar belirlemek, hıyarda ZYMV'ye dayanıklı hıyar çeşitlerinin geliştirilmesi, ithal çeşitlere oranla üreticilere daha ekonomik fiyatla tohumluk temin edilmesi ve virüs hastalıklarından dolayı oluşan önemli ekonomik kayıpları ortadan kaldırmak için kullanılacaktır. 9 2. KAYNAK ÖZETLERİ Bu bölümde yapılan tez çalışmasında bahsi geçen, moleküler markır teknolojileri ve ilgili hastalık etmeni olan ZYMV (Zucchini Yellow Mosaic Virus, Kabak Sarı Mozayik Virüsü) hakkında kaynak bilgiler verilmiştir. Hıyar bitkisinin yanı sıra özellikle kabakgiller familyasına ait diğer türlerle ilgili de bilgilere yer verilmiştir. 2.1. Markır Sistemleri Genel kapsamda biyolojik sistemlerin tümünde kullanılan markırlar, bitki teknolojilerinde; ıslah çalışmaları, genetik çeşitliliğin belirlenmesi, ebeveyn seçimi, haritalama çalışmaları gibi çalışmalarda yoğun olarak kullanılmaktadır. Sözlük anlamı işaret, imleç, belirteç olan markırlar; organizmalar arasındaki farklılıkları ortaya koyabilmek adına belirlenen morfolojik, biyokimyasal ya da DNA temelli parametrelerdir. Markırlar yapılarına göre 2 ye ayrılmaktadır. Moleküler markırlar ise yapılarına göre kendi içerisinde 4 e ayrılır. Bunlar; 1. Morfolojik Markırlar 2. Moleküler Markırlar a. Protein Temelli Moleküler Markır Sistemleri b. Hibridizasyon Temelli Moleküler Markır Sistemleri c. PCR Temelli Moleküler Markır Sistemleri d. Sekans Temelli Moleküler Markır Sistemleri 2.1.1. Morfolojik Markırlar Bitkinin dış görünüşünden gözlemlenebilen karakterlerin tümüne verilen addır. Genel kapsamda bu karakterler, bitki anatomisi ve morfolojisi ile ilgili karakterler olup bitkinin yaprak şekli, çiçek yapısı, meyve büyüklüğü, rengi, vb. bütün özellikleri morfolojik markır olarak adlandırılabilir (Tanksley ve McCouch 1997). Bu markırlar daha çok konvansiyonel ıslah çalışmalarında moleküler temelli markırların keşfinden önce kullanılan yöntemler olarak da bilinirler. Morfolojik temelli markırlar niteleyici karakterler olduklarından dolayı sonuçlar gözlemi yapan kişiye göre değişebilmektedir. Bu sebepten dolayı, morfolojik karakterizasyon yapılırken 1-5 ya da 1-9 skalası adı 10 verilen ve yapılan o gözlem için belirli değer aralıkları verilen özellikli skalalar kullanılır. Morfolojik marker skalalarına örnek Çizelge 2.1.’de verilmiştir. Çizelge 2.1. Hıyar ’da kabak sarı mozaik virüsü hastalığına karşı kullanılan 1-9 skalası Numara Reaksiyon 1 Belirti yok 3 Aşağıdaki yapraklarda hafif mozaik oluşumu Aşağıdaki yapraklarda açık mozaik oluşumu ve yukarı yapraklarda 5 hafif mozaik belirtisi 7 Yukarı yapraklarda orta derecede mozaik belirtisi 9 Bütün yapraklarda şiddetli mozaik oluşumu. Morfolojik markırlar; çevresel koşullardan kolaylıkla etkilenebilmeleri, sınırlı sayıda bulunmaları, bitki vejetasyonu döneminde farklı şekillerde olabilmeleri ve pleiotropik gen hareketlerinden dolayı diğer morfolojik karakterlerden etkilenebilmeleri morfolojik markırların en önemli dezavantajlarıdır (Tanksley ve McCouch 1997). Genel anlamda, morfolojik markırlar, yabani tiplerin mutant formlarıdır ve birçok morfolojik markır bitkinin sağlıklı olarak gelişebilmesinde negatif etkilere sahip olabilmektedir. Bu sebepten dolayı çok sayıda morfolojik markır bulmak zordur. 2.1.2. Moleküler Temelli Markırlar Bitkide gözle görülemeyen, daha çok hücre içerisinde gen, DNA ya da protein sekans seviyelerindeki farklılıkların ölçülebildiği parametrelerin tümüne verilen addır (Wang ve ark. 2007, Gostimsky ve ark. 2005). DNA gen ya da amino asit sekanslarındaki farklılıklar kullanılır. Moleküler markırların fenotipik olarak nötral özelliktedirler. Bu özellikleri konvansiyonel morfolojik markır yöntemlerine oranla önemli bir avantaj sağlamaktadır. Moleküler markırlar doğal yapılarına göre 4 guruba ayrılmaktadır (Katzir ve ark. 1996, Danin-Poleg ve ark. 2000, López-Sesé ve ark. 2002, Korzun 2003, Zeid ve ark. 2003, Aggarwal ve ark. 2006). 11 Bunlar; 1. Protein Temelli Moleküler Markır Sistemleri 2. Hibridizasyon Temelli Moleküler Markır Sistemleri 3. PCR Temelli Moleküler Markır Sistemleri 4. Sekans Temelli Moleküler Markır Sistemleri FAO/IAEA (Food and Agriculture Organization of the United Nations/ International Atomic Energy Agency)’nin hazırlamış olduğu “Gıda ve Tarımda Nüklear Teknikler ve Bölümleri” adlı çalışmada ideal bir genetik markır şu kriterlere sahip olması gerektiği ifade edilmiştir.  Fenotip üzerinde zararlı bir etkisi olmamalıdır.  Ekspresyon seviyesinde eş baskın özellikte olmalıdır.  Tek kopya olmalıdır.  Kullanım açısından ekonomik olmalıdır.  Yüksek oranda polimorfizm içermelidir.  Kolay belirlenebilir olmalıdır.  Poliploidi çalışmalarında genom spesifik özellikte olmalıdır.  Analizleri otomasyona uygun olmalıdır. Moleküler markırların morfolojik markırlara göre üstün yönleri polimorfizm seviyelerinin yüksek olması, bol miktarda bulunabilmesi ve eş baskın olması gösterilebilir (Katzir ve ark. 1996, Danin-Poleg ve ark. 2000, López-Sesé ve ark. 2002, Korzun 2003, Zeid ve ark. 2003, Aggarwal ve ark. 2006). Morfolojik markırlar ile yaygın olarak kullanılan bazı moleküler markırların polimorfizm seviyeleri, dominansi durumları ve PCR temelli olup olmamamlarına göreki durumları Çizelge 2.2’de verilmiştir. 2.1.2.1. Protein Temelli Moleküler Markır Sistemleri DNA’nın protein kodlayan bölümleri tarafından üretilen proteinlerin taranmasına dayalı bir sistemdir. Proteinlerin taranması sonucu DNA’nın bazı bölgelerindeki farklılıklar 12 ortaya çıkarılabilir. Bu sistemlere örnek İzozimler verilebilir (Perl-Treves ve ark. 1985, Knerr ve Staub 1992, Katzir ve ark. 1996, Korzun 2003, Zeid ve ark. 2003). Çizelge 2.2. Morfolojik ve yaygın olarak kulanaılan bazı moleküler markırların polimorfizm seviyesi, dominansi durumu ve PCR temelli olup olmamasına göre kıyaslanması Markır Tipleri PCR Temelli Polimorfizm Oranı Baskınlık Durumu Morfolojik Hayır Düşük Baskın/Çekinik/Eşbaskın İzozim Hayır Düşük Eşbaskın RFLP Hayır Düşük Eşbaskın RAPD Evet Orta-Yüksek Baskın STS/EST Evet Yüksek Eşbaskın/Dominant SCAR Evet Yüksek Eşbaskın CAPS Evet Yüksek Eşbaskın SSR Evet Yüksek Eşbaskın ISSR Evet Yüksek Baskın AFLP Evet Yüksek Baskın SNP Evet Yüksek Eşbaskın 2.1.2.1.1. İzozimler (İzoenzimler) İzoenzimler olarakta adlandırılan izozimler, katalitik özellikleri bakımından birbirine çok benzeyen, fakat izoelektrik nokta veya elektroforetik hareketlik gibi özellikleri bakımından farklılık gösteren farklı amino asit sekanslarına sahip enzimlere verilen addır. Diğer bir ifade ile protein yapıları farklı, fakat katalizledikleri kimyasal reaksiyon aynı olan enzimlere izoenzim adı verilmektedir (Perl-Treves ve ark. 1985, Knerr ve ark. 1989, Knerr ve Staub 1992, Akashi ve ark. 2002, Korzun 2003, Zeidler 2000). Aynı hücrede ya da dokuda, farklı dizilimlerde bulunan izozimlerin yöneteceği tepkimeler bir farklılaşmaya yol açabilir. İzoenzimlerin varlığı bir dokuda belirli bir gereksinimi karşılamak üzere metabolizmanın veya gelişim döneminin ince ayar yapmasına olanak sağlar. Biyokimyada, izoenzimler (veya izozimler) enzim izoformları (birbirine çok benzeyen varyantlar)’dır. 13 İzozimler, diğer enzimler ile birlikte hücre organizasyonunda oluşan çeşitli metabolik yolaklar ve fonksiyonlarda spesifik rol oynarlar. İzozimler genel olarak hücresel boyutta moleküler heterojenite gösterirler (Knerr ve ark. 1989, Knerr ve Staub 1992, Zeidler 2000). İzozimlerin diğer yöntemlere göre bazı avantaj ve dezavantajları vardır. Bunlar; diğer yöntemlere oranla daha ucuzdurlar, analiz metodolojisine göre daha basit ve hızlı sonuca ulaşılabilir, eş baskın özellik gösterirler. Dezavantajları ise her bir izozim için farklı protokollerin olması, protokol esnasında herhangi bir şekilde müdahele söz konusu olmaması, sınırlı sayıda bulunmaları doku ve (veya) gelişme dönemi spesifik olmalarıdır. 2.1.2.2. Hibridizasyon Temelli Moleküler Markır Sistemleri Bu tip moleküler markır sistemleri, belirlenmiş olan problar ile ilgili genomik DNA arasındaki hibridizasyon temeline dayanmaktadır. Bu tip moleküler markır sistemlerine örnek RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) verilebilir. 2.1.2.2.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms; Sınırlayıcı Enzim Parça Uzunluk Çeşitliliği) Hibridizasyon temelli moleküler markır sistemlerinden biridir. Genom üzerinde meydana gelen birçok mutasyon çeşitli nükeotidlerin kaybolmasına, eklenmesine ya da kaymasına neden olur, böylelikle genom üzerindeki bu kesim bölgelerinin parçalanmasına ya da yeni kesim bölgelerinin oluşmasına neden olur (Garcia-Mas ve ark. 2000). Bu metoda göre DNA, çeşitli restriksüyon enzimleri (EcoRI, EcoRV, MseI, HindIII, MvaI, BamHI, vb) ile kesilerek küçük parçalara ayrılır. Elde edilen bu küçük DNA parçacıkları spesifik ve karakteristik nüleotid dizilerine sahiptirler. Bu küçük DNA parçacıkları agaroz jel elektroforez yöntemi ile birbirlerinden ayrıldıktan sonra southern hibridizasyonu yöntemi ile naylon membran üzerine aktarılır, böylelikle DNA boyut büyüklüklerine göre birbirinden ayrılmış olur.. Radyoaktif ya da kemolüminesans problarla işaretlenen bu DNA parçacıkları hibridize edilerek görünür hale getirilir (Garcia-Mas ve ark. 2000).Bu yöntemin kendine göre bazı avantaj ve dezavantajları vardır. Avantajları, sınırsız sayıda lokusa sahiptirler, eş baskın özellik gösterirler ve herhangi bir sekans bilgisine gerek duyulmaz. Dezavantajları ise diğer yöntemlere göre 14 oldukça pahalı bir yöntemdir, bol miktarda DNA’ya ihtiyaç duyulur, çok fazla iş gücü gerektirir ve otomasyona uygun bir yöntem değildir. 2.1.2.3. PCR (Polymerase Chain Reaction; Polimeraz Zincir Reaksiyonu) Temelli Moleküler Markır Sistemleri PCR (Polymerase Chain Reaction; Polimeraz Zincir Reaksiyonu), her hangi bir canlının genomu üzerinde bilinen iki nokta arasında kalan özgün bir bölgenin in vitro koşullarda enzimatik olarak çoğaltılması işlemidir. PCR işlemi, in vitro ortamda DNA’da istenilen özel bir bölgenin nükleik asitlerinin uygun koşullarda çoğaltılması esasına dayanır. PCR işleminin gerçekleşebilmesi için ortamda DNA, PCR tampon çözeltisi, MgCl2, ileri ve geri primerler, nükleotid tri fosfatlar (adenin, guanin, sitozin ve timin), taq DNA polimeraz enzimi ve su bulunması gerekir. Bunların aynı ortamda çeşitli sıcaklıklarda tepkimeye girerek istenilen bölge(ler) çoğaltılabilir. PCR işlemi 3 aşamadan oluşur bunlar;  Denatürasyon (Denaturation) Aşaması; PCR karışımı yüksek sıcaklıklarda ısıtılarak DNA-DNA ve DNA-primer komplekslerinin denatüre olması sağlanır. Sıcaklık genellikle 94-95 ºC dir.  Bağlanma (Annealing) Aşaması: Sıcaklık primerlerin tek zincirli DNA’ya bağlanmasına izin verilen değerlere düşürülür. Sıcaklık primerlerin yapısına bağlı olarak 37-65 ºC arasında değişir.  Uzama (Extension) Aşaması: Karışım 72 ºC ye çıkarılarak dNTP nin polimeraz ile optimal düzeyde etkileşime girmesi sağlanır. Teorik olarak hedef DNA molekülü her bir çevrimde duplike olur. 35 döngülük bir PCR 35 işlemi sonunda 1 molekül DNA parçasından 2 (34 359 738 368) molekül DNA parçası oluşur. PCR temelli moleküler markır sistemleri, diğer markır sistemlerine oranla daha güvenilir, hızlı ve ucuz olmalarından dolayı daha yaygın kullanılan yöntemler olarak karşımıza çıkmaktadır. Temel olarak hepsi PCR teknolojisine dayanmakla birlikte bu sistemlere örnek RAPD (Random Amplifed Polymorphic DNA), SCAR (Sequence Characterized Amplifed Region), SSR (Simple Sequence Repeats) ve AFLP (Amplifed 15 Fragment Length Polymorphisms) verilebilir (Arumuganathan ve Earle 1991, Blears ve ark. 1998, Li ve Quiros 2001, Chiba ve ark. 2003) PCR temelli markır sistemleri 3 ana guruba ayrılırlar. Bunlar;  DNA çoğaltımı için tek bir primer dizisi kullanılan sistemler (RAPD, SPAR, DAF, AP-PCR, vb.),  DNA çoğaltımı için bir çift primer dizisi kullanılan sistemler (AFLP)  DNA çoğaltımı için bir çift primer dizisi kullanılan fakat primerlerin oluşturulabilmesi için genomik nükleotid dizisine ihtiyaç duyulan sistemler (AMP-FLPs, STRs, SSRs, CAPS) dir. 2.1.2.3.1. RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA; Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA) DNA’nın 8-12 nükleotidden oluşan tek bir primer kullanılarak PCR yönemi ile çoğaltılmasına dayanır. Bu yöntem ile çoğaltılan DNA parçacıklarının agaroz ya da poliakrilamid jelde belirli bir elektrik akımı altında büyüklüğüne göre ayrılması esasına dayanmaktadır. Sonuçlar “var” ya da “yok” olarak tanımlanır (Cho ve ark. 1998, Decker-Walters ve ark. 2001, Mliki ve ark. 2003). RAPD yöntemi; ucuz olması, teknik olarak çok basit olması, herhangi bir sekans bilgisine ihtiyaç duymaması, birden fazla bilgi içermesi gibi özellikleriyle ön plana çıkmaktadır (Mliki ve ark. 2003, Gostimsky ve ark. 2005). Yapılan bir çalışmada izozimler oranla çok daha fazla polimorfizm tespit edilmiştir (Staub ve ark. 1999). Teorik olarak 3-15 arasında PCR ile çoğaltılan DNA parçacığı verebilir (Gostimsky ve ark. 2005). Diğer taraftan, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini düşük olması, dominant karakterde olması ve ekzonlarla birlikte intron bölgelerde de çoğalması dezavantajları olarak sayılabilir (Kennard ve ark. 1994, Serquen ve ark. 1997, Cho ve ark. 1998). Bu metod, genetik haritalamalarda, F1 tanımlamalarında, hat tanımlamalarında, ıslah çalışmalarında, BSA (Bulk Segreant Analizi) çalışmalarında, genetik çeşitlilik, genetik safiyet ve DNA parmak izi çalışmalarında, markır destekli seleksiyonlarda, tohum 16 testlemelerinde ve harita temelli gen klonlamalarında kullanılmaktadır (FAO/IAEA 2002). 2.1.2.3.2. SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions; Sekansı Karakterize Edilmiş Çoğaltılmış Bölgeler) SCAR markırları, RAPD, AFLP, ISSR gibi marker sistemlerinden geliştirilebilirler (Gostimsky ve ark. 2005). Polimorfik olduğu belirlene DNA bandı, agaroz veya poliakrilamit jelden kesilir, klonlanır ve sekanslanır. Sekanslanan bu bölgede uygun primer çiftleri oluşturularak SCAR markırları elde edilmiş olur (Gostimsky ve ark. 2005). Çok küçük mikterda DNA’ya ihtiyaç duyması, yüksek oranda tekrarlanabilirlik olması, güvenilir olması, eş baskın özellikte ve türe özgü olması SCAR markır sistemlerinin en önemli avantajlarındandır. Diğer taraftan, çok hassas bir yöntem ve geliştirilmesinin çok pahalı olması ise dezavantajlarıdır (FAO/IAEA 2002). Bu metod, genetik haritalamalarda, F1 hibrit tanımlamalarında, hat tanımlamalarında, ıslah çalışmalarında, BSA (Bulk Segreant Analizi) çalışmalarında, genetik çeşitlilik, genetik safiyet ve DNA parmak izi çalışmalarında, markır destekli seleksiyon çalışmalarında, tohum testlemelerinde ve harita temelli gen klonlamalarında kullanılmaktadır (FAO/IAEA 2002). 2.1.2.3.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) AFLP markır sistemi, DNA’daki polimorfizmleri tespit etme bakımından, diğer markır sistemlerine oranla daha hassas bir sistemdir. Bu sistem, total DNA’nın iki DNA kesim (restriksiyon) enzimi ile küçük parçalara ayrılarak, bu parçaların seçici olarak çoğaltılması işlemine dayanmaktadır. (Vos ve ark. 1995, Blears ve ark. 1998, Cho ve ark. 1998). Bu yöntem genel kapsamda 4 ana bölüme ayrılmaktadır, bunlar;  Genomik DNA nın restriksiyon enzimleri ile kesilmesi  Adaptörlerin bağlanması (ön selektif amplifikasyon)  Selektif Amplifikasyon  Görüntüleme 17 Bu yöntemde genel olarak iki adet restriksiyon endonükleaz kullanılır ve bu yöntemin özgünlüğünü ortaya koymaktadır (Vos ve ark. 1995, Blears ve ark. 1998, Cho ve ark. 1998). Bu endonükleazlar DNA yı büyüklü küçüklü birçok parçaya ayırırlar. Genel olarak, AFLP yönteminde, EcoRI/MseI, PstI/MseI enzim çiftleri kullanmaktdır. DNA küçük parçalara ayrıldıktan sonra restriksiyon enzimlerine özgü adaptörleri bu küçük DNA parçacıklarına eklenir. Eklenen adaptörlerin DNA dizileri primer olarak kullanılarak DNA parçacıkları selektif olarak çoğaltılırlar. AFLP ürünlerinin görüntülenmesinde gümüş boyama yöntemi ile poliakrilamid jel kullanılır ( Vos ve ark. 1995, Blears ve ark. 1998, Garcia-Mas ve ark. 2000, Ferriol ve ark. 2003, Zeid ve ark. 2003). Ayrıca bu metodlar için çeşitli spesifik cihazlarda mevcuttur. Çok az miktarda DNA ya ihtiyaç duyması, daha önceden belirlenmiş herhangi nükleotid dizisi bilgisine ihtiyaç duymaması, herbitki türüne uygulanabilir olması ve otomasyona uygun olması AFLP metodunun avantajlarıdır. Dominant markırlar olması, iş gücü bakımından kapsamlı ve karmaşık olması ise en önemli dezavantajları olarak görülmektedir (FAO/IAEA 2002). AFLP metodu, genetik haritalamalarda, F1 tanımlamalarında, hat tanımlamalarında, ıslah çalışmalarında, BSA (Bulk Segreant Analizi) çalışmalarında, genetik çeşitlilik, genetik safiyet ve DNA parmak izi çalışmalarında, markır destekli seleksiyonlarda, tohum testlemelerinde ve harita temelli gen klonlamalarında kullanılmaktadır (FAO/IAEA 2002). 2.1.2.3.4. SSRs (Simple Sequence Repeats; Basit Dizi Tekrarları) Mikrosatellitler olarakta bilinen SSR markırları, DNA nın ardışık tekrar bölgelerine verilen addır (Danin-Poleg ve ark. 2000, Chiba ve ark. 2003, Garcia-Mas ve ark. 2004). SSR markırları genel anlamda türe özgü spesifik olarak geliştirilirler ve bu özelliği SSR markırlarının moleküler markır teknolojilerinde arasında çok önemli yöntem olmasına neden olmuştur (Garcia-Mas ve ark. 2004). Genel olarak bu mikrosatellitler 2-5 bp uzunluğunda ve 9 ila 45 tekrarlı DNA bölgeleridir (Danin-Poleg ve ark. 2001, Nagaraj ve ark. 2006, Wang ve ark. 2007). Hıyarda en çok gözlenen SSR motifleri TGA, GAT, CTT, GGA, AT and CT (Garcia-Mas ve ark. 2000). Genomik ve EST (Expressed Sequences Tag) bölgelerinin nükleotid dizilerinin saklandığı veri bankaları SSR markırlarının geliştirilmesi için kullanılan önemli kaynaklardır. Bu kaynaklardan elde edilen nükleotid dizileri çeşitli bilgisayar programları yardımı ile SSR motifleri için 18 taranabilir ve tespit edilen SSR motiflerini çoğaltmak için primerler belirlenir. Bu programlara örnek olarak;  MISA (the Microsatellite),  SSRFinder,  BuildSSR,  SSRIT (SSR Identification Tool),  TRF (Tandem Repeat Finder),  TROL (Tandem Repeat Occurence Locator),  Sputnik verilebilir. 2 ila 5 tekrar bölgesine sahip SSR motiflerinden en sık üçlü nükleotid tekrarları gözlemlenir. Bunu sırası ile ikili, dörtlü ve beşli tekrar dizileri takip eder. SSR markırlarının avantajları; çok fazla oranda çeşitlilik gösterirler, tekrarlanabilirliği çok yüksektir, eş baskın özelliktedirler ve lokusa özgü markırlardır (Garcia-Mas ve ark. 2000, Danin-Poleg ve ark. 2001, FAO/IAEA 2002). Dezavantajları ise geliştirme maliyetleri oldukça yüksektir, primer geliştirmek için genom sekans bilgilerine ihtiyaç vardır (Schmidt 2002, Wang ve ark. 2007). SSR metodu, genetik haritalamalarda,F1 tanımlamalarında, hat tanımlamalarında, ıslah çalışmalarında, BSA (Bulk Segreant Analizi) çalışmalarında, genetik çeşitlilik, genetik safiyet ve DNA parmak izi çalışmalarında, markır destekli seleksiyonlarda, tohum testlemelerinde ve harita temelli gen klonlamalarında kullanılabilir (FAO/IAEA 2002, Tanaka ve ark. 2006, Wang ve ark. 2007). 2.1.2.4. Sekans Temelli Moleküler Markır Sistemleri Genom sekansı temeline dayalı moleküler markır sistemlerinden biridir. Örnek olarak SNP (Single Nucleotide Polymorphism) verilebir. 2.1.2.4.1. SNP (Single Nucleotide Polymorphism; Tek Nükleotid Polimorfizmi) SNP markırları diğer markırlara oranla genomda en çok bulunan moleküler markır tipleridir. Özellikle EST ler SNP ler için iyi bir kaynaktır. Herhangi bir genomun sekansında meydana gelen ve sadece tek bir nükleotidin değişmesine bağlı olarak meydana gelen SNP ler, doğada en sık rastlanan mutasyonlardandır. Bu mutasyonlar 19 sonucu canlılar arasındaki varyasyonlar oluşmaktadır (Grada ve Weinbrecht 2013). SNP oluşmasında eklenme ve silinme (InDel) nükleotid dizisi değişimine neden olan temel nedenlerdendir. SNP oluşumları genel olarak DNA içerisinde intron adı verilen ve herhangi bir proteini kodlamayan DNA bölgelerinde yaygın olarak görülmektedir. Ekzonlarda meydana gelen SNP’ler aminoasit dizisinin değişimine neden olabileceği gibi aminoasit dizisinde herhangi bir değişikliği neden olmayabilir ve gen ürününde değişiklik olmaz. Mısırda ortalama her 60–120 baz çiftinde bir SNP gözlenirken bu oran, insanlarda tahminen 1000 baz çiftinde bir SNP olarak tanımlanmıştır. Çeşitli sekanslama yöntemlerinin geliştirilmesine bağlı olarak özellikle EST temelli genetik varyasyon çalışmaları yaygın olarak yapılmaktadır. Son yıllarda geliştirilen yeni nesil sekanslama yöntemleri ile birlikte SNP moleküler markırlarının geliştirlmesi kapsamında çok büyük ilerlemeler kaydedilmiştir. Bu yöntemler, geliştirme maliyetlerini aşağıya çekerek kullanımının daha büyük alanlara yayılmasına olanak vermiştir (Grada ve Weinbrecht, 2013) Bu metodun avantajları, çok miktarda bulunabilmesi, çalışma maliyetlerinin diğer markır sistemlerine oranla daha ucuz olması, yüksek polimorfizm içermesi, güvenilirliğinin yüksek olması ve otomasyona uygun bir yöntem olması sayılabilir. Dezavantajları ise, eski nesil dizileme yöntemlerinin geliştirme maliyetlerinin çok yüksek olması, çalışabilmek için spesifik ekipmanlara ihtiyaç olması sayılabilir fakat yeni nesil DNA dizileme yöntemlerinin geliştirilmesi ile birlikte geliştirme maliyetleri önemli oranda düşümüştür (FAO/IAEA 2002, Grada ve Weinbrecht 2013). SNP metodu, genetik haritalamalarda, F1 tanımlamalarında, hat tanımlamalarında, ıslah çalışmalarında, BSA (Bulk Segreant Analizi) çalışmalarında, genetik çeşitlilik, genetik safiyet ve DNA parmak izi çalışmalarında, markır destekli seleksiyonlarda, tohum testlemelerinde ve harita temelli gen klonlamalarında kullanılabilir. 2.2. Hıyar’da (Cucumis sativus L.) Moleküler Markırlar Hıyar bitkisinde, ZYMV'ye karşı dayanıklılık genlerinin belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalarda; ZYMV'ye dayanıklılığın tek bir çekinik allel tarafından kontrol edildiğini ortaya konulmuştur (Providenti 1987, Abul-Hayja ve Al-Shahwan 1991, Kabelka ve ark. 1997). Bu kapsamda, Hıyar'da ZYMV'ye dayanıklı F1 çeşitlerini elde etmek 20 amacıyla yapılacak olan ıslah çalışmalarında ebeveynlerin her ikiside çekinik alleller açısından homozigot olmak zorundadır (Providenti 1987). ZYMVye karşı dayanıklılık mekanizması hıyarda ve kavunda çalışılmıştır (Park ve ark. 2004). Ancak iki türde farklı dayanıklılık mekanizmaları ortaya çıkmıştır. SSR moleküler markırlarının kullanılmasıyla elde edilen haritada bu virüse dayanıklılıkla ilgili lokuslar farklılık göstermiştir. Bu çalışma bu türün evrimi boyunca farklı dayanıklılık mekanizması geliştirdiğini ortaya koymuştur. Bu nedenle, kavun için geliştirilen moleküler işaretleyicilerin hıyarda kullanılması mümkün olmadığını göstermektedir. Dolayısıyla hıyar için özel genetik haritalar ve moleküler markırların geliştirilmesi zorunlu hale gelmiştir (Cho ve ark. 1998, Stepansky ve ark. 1999, Decker-Walters ve ark. 2001, Mliki ve ark. 2003). Bitkisel genetik bağlantı haritaları, fiziksel haritalama, moleküler işaretleyici yardımıyla seleksiyonu (MAS) ve haritaya dayalı gen klonlaması için gerekli ön çalışmalardan birisidir. Belirli özellikteki açılım gösteren populasyonların (F2, geriye melez, yarı döl, tam döl) ve çok sayıda işaretleyici ile birlikte yapılan istatiksel analizler sonucu elde edilir. Yeboah ve ark. (2007) yaptıkları çalışmalarda SRAP ve ISSR teknolojisi ile 112 F2 pupulasyonunda her iki işaretleyicide genellikle dominant işaretleyici ürettiklerinden kaydedilen bütün işaretleyiciler açısından 3 (var):1(yok) oranına uygun segregasyon göstermişlerdir. Yine aynı çalışmada kaydedilen bütün ISSR işaretleyicileri %13 oranında polimorfizm gösterirken SRAP işaretleyicileri ise %26 oranında polimorfizm göstermişlerdir. Toplam 62 lokus 7 bağlantı gurubuna dağılmiştır. Bu işaretleyiciler MAS çalışmalarında, genetik kaynakların karakterizasyonunda ve bitkilerden işaretleyicilerin örneklemesinde (marker sampling) kullanılma potansiyeline sahiptir (Cho ve ark. 1998, Stepansky ve ark. 1999, Decker-Walters ve ark. 2001, Mliki ve ark. 2003). ZYMV dayanıklık mekanizması resesif tek gen tarafından kontrol edilmektedir (Providenti 1987, Kabelka ve ark. 1997, Park ve ark. 2004, Amano ve ark. 2013). Tek gen tarafından kontrol edilen karakterlerin çok genle kontrol edilen karakterlere oranla MAS süreçleri daha hızlı ve kolay olacaktır(Gilbert-Albertini ve ark. 1993, Danin-Poleg ve ark. 1997, Kabelka ve Grumet 1997). Park ve ark. (2004) tarafından geliştirilen moleküler işaretleyiciler, özellikle hassas bireylerin tespitinde başarısız olabilmektedir. Yapılan ön çalışmalarda bu moleküler 21 markırın Türkiye’de yapılan ıslah çalışmalarında kullanılan ıslah materyalleri üzerinde herhangi bir açılım vermediği gözlemlenmiştir. Amano ve ark. (2013) tarafından yapılan en son çalışmanın sonuçları ıslah materyalleri üzerinde henüz denenmemiştir. Moleküler markırlar, genom üzerinde bulunan ve yüksek oranda polimorfizme sahip nükleotid dizileri olarakta tanımlanabilir. Genom üzerindeki bu farklılıklar PCR (Polymerase Chain Reaction) adı verilen özel bir polimerizasyon yöntemi ile tespit edilebilir (Gostimsky ve ark. 2005). Kural olarak, iki organizmanın genomları arasında ne kadar az nükleotid dizisi farklılığı varsa, bu iki organizma birbirlerine o kadar fazla benzer. Bu teknikler kullanılarak özellikle, DNA temelli moleküler markırlara dayalı ıslah seleksiyonları, genetik çeşitlilik, genetik safiyet, DNA parmak izi çalışmalrı, kromozomal haritalama, vb. gibi çalışmalar yapılabilmektedir (Gostimsky ve ark. 2005). Son yıllarda yapılan çalışmalarda, hıyarda genetik çeşitlilik ve filogenetik akrabalık çalışmalarında morfolojik ve moleküler temelli markır sistemlerinin kullanıldığı gözlemlenmiştir (Tanaka ve ark. 2006). Bu tipteki çalışmalara yönelik ilk yayınlar 1985 yılına aittir. Perl-Treves ve ark. (1985) 21 farklı Cucumis türünde 29 adet izozim protein markırlarını kullanarak yapmıştır. Bu çalışmayı takiben Knerr ve ark. (1989) 18 izozim markırları kullanarak hıyarda genetik çeşitlilik çalışmaları yapmışlardır. Dijkhuizen ve ark. (1996) hıyarda ilk olarak RFLP moleküler markır metodunu kullanarak genetik çeşitlilik çalışması yapmıştır. Miliki ve ark (2003) ise yine RAPD moleküler markırlarını kullanarak farklı hıyar tiplerinde genetik çeşitliliğe bakmışlardır. Watcharawongpaiboon ve Chunwongse (2007) hıyarda genetik çeşitlilik kapamında SSR markırlarını ilk olarak kullanan araştırıcılardır. Bu çalışmada 16 hıyar çeşidinde 57 farklı SSR markırı kullanılmış ve ortalama markır başına 3,6 polimorfik band elde edilmiştir. Jing ve ark. (2012) dünyanın çeşitli bölgelerinden toplanmış 3342 hıyar çeşidi üzerinde 23 farklı SSR markırı kullanılarak genetik çeşitlilik çalışması yapmış, bu çalışma sonucunda hıyarda core kolleksiyonlarının oluşturulması amaçlanmıştır. Yang ve ark. (2009) 99 farklı hıyar çeşidinde 7 farklı AFLP moleküler markırlarını kullanarak genetik çeşitlilik çalışması yapmıştır. Toplamda 382 adet band elde edilmiş olup bunlardan sadece 179’unun polimorfik olduğunu tespit etmişlerdir. 22 Hıyar’da farklı moleküler markır sistemleri ile yapılmış çok sayıda haritalama çalışmaları vardır. Serquen ve ark. (1997), RAPD moleküler markırlarını kullanarak gerçekleştirmiştir. Yapılan bu çalışmada markırlar arası uzaklıklıarın ortalama olarak 8,4 cM olduğu tespit edilmiştir. Staub ve ark. (2006) tarafından yapılan bir başka haritalama çalışmasında ise partenokarpik meyve oluşumundan sorumlu genlerin tespit edilmesi üzerine yapılmıştır. Bu çalışmaların yanı sıra Huang ve ark. (2009) ilk olarak hıyar genomunu dizileyerek yayımlamışlardır. Bu çalışmayı takiben Li ve ark (2011) yeni nesil dizileme sistemlerini kullanarak hıyar genomunu dizilemişlerdir. 2.3. Kabak Sarı Mozayik Virüsü Yapılan son araştırmalara göre, ülkemizde kültürü yapılan bitki çeşitlerinde ekonomik olarak zarara neden olduğu belirlenmiş 528 farklı hastalık etmeninin olduğu bildirilmiştir. Genel kapsamda bu hastalıklarla gerekli mücadele sağlanamadığı takdirde, ürün kayıpları ortalama % 35-40 seviyelerinde olmaktadır. Bu oran ilgili hastalık etmeninin çeşidine ve yoğunluğuna bağlı olmakla birlikte % 100 lere kadar çıkabilmektedir. Bitkisel üretimde ekonomik yönden oldukça önemli değerlere ulaşan bu kayıpların önlenmesi bitki koruma çalışmalarını yeterli önemi vermek gerekmektedir. Kültür bitkilerinde yüksek oranda verim kaybına neden olan biyotik stres etmenleri bakteri, fungus, virüs ya da parazitik bitki kaynaklı olabilmektedir. Bu hastalık etmenleri içerisinde bitki virüs hastalıkları, özellikle diğer hastalık etmenlerinden farklı olarak kimyasal mücadelesi olmaması nedeni ile kültürü yapılan bitkilerin yetiştiriciliğini tehdit eden en önemli problemlerden biri olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu hastalık etmenleri, bitkilerde normal gelişme düzenini bozarak çeşitli morfolojik ve fizyolojik bozukluklara neden olarak verimde önemli düşüşlere neden olabilmektedir (Lisa ve ark. 1981, Lecoq ve Pitrat 1984, Lisa ve Lecoq 1984, Luis ve ark. 1998, Lecoq ve ark. 2002). Şu ana kadar Cucurbitaceae familyasına ait bitkilerde toplamda 32 adet virüs ve virüs benzeri hastalık etmeni bildirilmiştir. Bu hastalık etmenlerinin içerisinde en önemlileri; Hıyar Mozayik Virüsü (Cucumber Mosaic Virus, CMV), Kabak Mozayik Virüsü (Squash Mosaic Virus, SqMV), Kabak Sarı Mozayik Virüsü (Zucchini Yellow Mosaic 23 Virus ZYMV), Kıvırcık Tepe Virüsü (Curly Top Virus, CTV), Hıyar Yeşil Benek Mozaik Virüsü (Cucumber Green Mottle Mosaic Virus, CGMMV), Papaya Halkalı Nokta Virüsü (Papaya Ring Spot Virus, PRSV), Karpuz Mozayik Virüsü II (Watermelon Mosaic Virus II, WMV II) gösterilebilir (Lisa ve Lecoq, 1984; Purcifull ve ark., 1984; Gilbert ve Albertini, 1995). Bu hastalık etmenlerinden özellikle Kabak Sarı Mozayik Virüsü (ZYMV), Cucurbitaceae familyası yetiştiriciliğini tehdit eden, bitkilerde yaprak ve meyvelerde önemli deformasyonlara yol açarak ekonomik olarak büyük ürün kayıplarına yol açan en önemli virüslerden bir tanesi olarak bilinmektedir (Lovisolo, 1980; Lecoq, 1991). Bu virüsler özellikle Aphis citricola Patch, A. gossypii Glover, Macrosiphum euphorbiae (Thomas), ve Myzus persicae (Sulzer) gibi yaprak bitleri ile non-persistent olarak taşınır (Yuan ve Ullman 1996). Kabak Sarı Mozayik virüsü dünyada ilk olarak 1973 yılında İtalya’da saptanmış ve tanımlanmıştır (Lisa ve ark. 1981). Bu tanımlamanın ardından dünyanın değişik bölgelerinde bu hastalık etmeni tanımlanarak raporlanmıştır (Lisa ve Lecoq 1984, Davis 1986, Desbiez ve Lecoq 1997). Genel kapsamda bakıldığında bu hastalık etmeni, 5 farklı kıtada 22 farklı ülkede yayılım gösterdiği ve büyük zaralar verdiği bilinmektedir (Providenti 1984). Ülkemizde ise, 1984 yılında ilk olarak Yılmaz ve Davis tarafından tanımlanmış olup literatüre aktarılmıştır (Yılmaz ve Davis 1984). Kabak Sarı Mozayik virüsü potyvirüsler familyası üyesi olup yaklaşık 750 nm boyutunda, kıvrımlı ipliksi viron yapıya sahiptir. İlgili sınıflandırma Çizelge 2.3.’te verilmiştir. Genetik yapısına bakıldığında, yaklaşık 9600 nükleotidten oluşan tek zincirli RNA ihtiva etmektedir. RNA’nın etrafı 36 kDa büyüklüğünde bir protein kılıf ile çevrilidir. Kabak Sarı Mozayik virüsünün çok az sayıda ırkları ve patotipler rapor edilmiştir. ZYMV virüsü cucurbitaceae familyası üyelerinde özellikle yaprak laminasında çeşitli nekrozlar, bitkide bodurluk, yapraklarda kloroz, deformasyon, mozayik yapılar, genç sürgünlerde iplikleşmeye ve çiçek azalması gibi çeşitli fizyolojik ve morfolojik simptomlara neden olmaktadır (Lecoq ve Pitrat, 1984; Providenti, 1984; Blua ve Perring, 1992). Meyve ve yapraklarda şiddetli deformasyon şeklinde simptomlara neden olan bu virüs hastalığından dolayı % 80’lere varan verim kayıpları gözlemlenmiştir (Simmons ve ark. 2008). 24 Çizelge 2.3. Kabak sarı mozayik virüsünün sınıflandırması Kabak Sarı Mozayik Virüsü Sınıflandırması Gurup: Gurup IV ((+)ssRNA) Takım: Atanmamış Aile: Potyviridae Sınıf: Potyvirus Tür: Kabak Sarı Mozatik Virüsü ZYMV ile mücadelede kullanılan herhangi bir kimyasal mücadele uygulanamamaktadır. Daha çok vektörlere karşı kimyasal mücadele uygulanması, arazinin malç veya plastik örtülerle kaplanması, ayrıca dayanıklı bitki çeşitlerinin kullanılması gibi yöntemler tavsiye edilmektedir (Lisa ve ark. 1981, Lecoq ve Pitrat 1984, Lisa ve Lecoq 1984, Summers ve ark. 1995, Clought ve Hamm 1995, Lecoq ve ark. 2002). 25 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bu araştırma, 2010-2014 yılları arasında Uludağ Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü’nün Biyoteknoloji Laboratuvarı ile MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş. Bursa merkez yerleşkesinde bulunan AR&GE Seraları, Patoloji Seraları ile Patoloji ve Biyoteknoloji laboratuvarlarında yürütülmüştür. 3.1. MATERYAL Yapılan bu doktora araştırmasında MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş.’ye ait hıyar tohum ıslah materyalleri ebeveyn olarak kullanılmıştır. Ebeveyn olarak kullanılan bu ıslah materyalleri populasyon oluşturmak amacıyla MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş. bünyesinde bulunan Bursa AR&GE seralarında yetiştirilmiştir. 3.2. YÖNTEM 3.2.1. Haritalama Populasyonunun Oluşturulması Yapılan bu araştırmada, haritalama populasyonunun oluşturulması kapsamında ebeveynlerin temini F1, F2 ve F3 populasyonları oluşturulmuştur. 3.2.1.1. Ebeveyn Temini Bu araştırmada kullanılan Kabak Sarı Mozaik Virüsü (ZYMV)'ne dayanıklı olan baba ile hassas olan anne, MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş.’ye ait hıyar ıslah gen havuzundaki hatlardan tedarik edilmiştir. 3.2.1.2. F1 Populasyonlarının Oluşturulması Doktora tezi kapsamında F1, F2 ve F3 populasyonlarının oluşturulması amacıyla, MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş.’ye ait hıyar ıslah gen havuzundan ebeveynler patojenisite testine tabi tutularak Kabak Sarı Mozayik Virüsü’ne karşı genetik durumları belirlenmiştir. Belirlenen bu ıslah materyallerinden ebeveyn olarak seçilen birey (BTL_HTP_1) Kabak Sarı Mozaik Virüsüne karşı homozigot dayanıklı, baba ebeveyn olarak seçilen birey (BTL_HTP_2) ise homozigot hassastır. Seçilen ebeveynler MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş. Bursa merkez yerleşkesinde bulunan AR-GE ıslah seralarında her bir ebeveynden 10 ar adet tohum olmak üzere viyollere ekilmiştir. 26 Ekimde, daha önceden hazırlanan %70 torf, %30 perlit karışımı kullanılmıştır. Bitkiler, 3-4 gerçek yaprak aşamasına geldiklerinde bu bitkilerin her birinden ayrı ayrı yaprak örnekleri alınmıştır. Alınan yaprak örnekleri MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş. Bursa merkez yerleşkesinde bulunan biyoteknoloji laboratuvarında özel olarak vakumlanmış fermuarlı torbalara konularak -80 ºC’de saklanmıştır. Diğer taraftan ebeveyn bitkiler 15x22 cm ebatındaki saksılara şaşırtılmıştır. Her bir ana ve baba ebeveyn birbirleri ile ayrı ayrı melezlenerek 10 adet F1 populasyonu yapılmıştır. Bitkiler melezlemelerin yapılması için AR-GE ıslah seralarında yetiştirilmiş ve hasadı yapılmıştır. 3.2.1.3. F2 Populasyonlarının Oluşturulması Elde edilen 10 adet F1 melez kombinasyonundan 1 tanesi seçilerek diğer melez kombinasyonları, ileride herhangi bir sorunla karşılaşılması durumunda kullanılmak amacı ile yedek olarak soğuk hava depolarında özel olarak saklanmıştır. Seçilen F1 populasyonundan 5 adet tohum, F2 populasyonlarını oluşturmak amacı ile viyollere ekimi yapılmıştır. Ekimde, daha önceden hazırlanan %70 torf, %30 perlit karışımı kullanılmıştır. Bitkiler, 3-4 gerçek yaprak aşamasına geldiklerinde, bitkilerden yaprak örnekleri alınmıştır. Alınan yaprak örnekleri MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş. biyoteknoloji laboratuvarında özel olarak vakumlanmış fermuarlı torbalara konularak - 80 ºC’de saklanmıştır. Diğer taraftan ebeveyn bitkiler 15x22 cm ebadındaki saksılara şaşırtılmıştır. Bitkiler kendilemelerin yapılması için AR-GE ıslah seralarında yetiştirilmiş ve kendilenen çiçeklerden elde edilen meyvelerin hasadı yapılmıştır. 3.2.1.4. F3 Populasyonun Oluşturulması Elde edilen 5 adet F2 populasyonundan 1 tanesi (200 adet F2 birey) F3 populasyonunu oluşturmak amacı ile viyollere ekilmiştir. Ekimde, daha önceden hazırlanan %70 torf, %30 perlit karışımı kullanılmıştır. Geri kalan 4 adet F2 populasyonu, ileride herhangi bir sorunla karşılaşılması durumunda yedek olarak soğuk hava depolarında özel olarak saklanmıştır. 200 adet F2 bitkisinden DNA izolasyonu için yaprak numuneleri alındıktan sonra kendilenerek her bir F2 bitkisinin tohumları ayrı ayrı hasat edilmiş ve dolayısıyla 200 adet F3 populasyonu elde edilmiştir. 27 3.2.2. Patojenisite Testlerinin Yapılması Elde edilen F3 bitkileri ile birlikte hassas ana ve dayanıklı baba ebeveynler patojenisite testlemelerine tabi tutulmuşlardır. Bu testlemelerin yapılması aşamasında sırası ile virüs inokulumunun hazırlanması ve bitkilere aşılanması, in vivo virüs testlemeleri ve serolojik çalışmalar ile dayanıklılığın tespit edilmesi aşamaları bulunmaktadır. 3.2.2.1. Virüs İnokulumunun Hazırlanması ve Bitkilere Aşılanması Hasadı yapılan F3 bitkilerden her bir F2:3 meyvelerinden rastgele alınan 10 adet tohum, patojenisite testleri için daha önceden hazırlanan %70 torf, %30 perlit karışımı ile doldurulmuş viyollere ekilmiştir. Ekim tarihini takiben 10 gün sonra ZYMV izolatı hazırlanarak ilgili F3 bitkilere inokülasyonu yapılmıştır. -20 ºC de saklanan ZYMV ile bulaşık yapraklar pH’ı 7 olan fosfat tampon çözeltisinde porselen havanlarda ezilmiştir ve içerisine carborandum tozu konulmuştur. Sünger yardımı ile 10 günlük fidelerin kotiledonlarına, hazırlanan bu izolat sürülmüştür. (Yardımcı ve Korkmaz 2004). Yapılan çalışmalar ile ilgili bazı görseller Şekil 3.1.’de verilmiştir Şekil 3.1. Hıyar bitkisinde virüs inokülasyonu. 3.2.2.2. Hıyarlar'da in vivo virüs testlemeleri Mekanik bulaştırma yapılan bu bitkiler 1 gece yüksek nem ve karanlıkta inkübe edilerek ertesi gün seraya alınmıştır. İnokulasyondan yaklaşık 2 hafta sonra morfolojik gözlemler alınarak her bir F2:3 bireyinin virüs ile bulaşık olup olmadığı çeşitli morfolojik belirteçler göz önünde bulunarak ortaya çıkarılmıştır. Bu belirteçler Şekil 3.2.’de görsel olarak verilmiştir. İlk gözlemlerin ardından tekrar virüs inokülasyonu 28 yapılmış ve bu 2. inokulasyonun ardından yaklaşık 2 hafta sonra morfolojik gözlemler tekrar alınmıştır. Alınan her iki sonuç kıyaslanarak nihai tablo oluşturulmuştur. Sağlıklı Bitki Az Sararma Yoğun Sararma Yoğun Mozaik Şekil 3.2. Hıyar bitkisinde ZYMV hastalığının yaprak üzerinde gösterdiği simptomlar 3.2.2.3. Serolojik Çalışmalar ile Dayanıklılılığın Kontrol Edilmesi Morfolojik gözlemlerden sonra DAS-ELISA (Clarck ve Adams 1977) testine tabi tutulmuştur. Yapılan yöntemin protokolü aşağıda verilmiştir. Bu işlemlerin ardından analizler yapılıp sonuçlar oluşturulmuştur. Yapılan çalışmanın güvenilirliğini artırmak amacı ile yukarıda anlatılan işlemler 1 ay sonra tekrar yapılmıştır. Elde edilen bu iki veri ışığında F2 bitkilerin dayanıklı ve hassas gurupları oluşturulmuştur. Yapılan DAS- ELISA testlerine göre hazırlanan nihai sonuç oluşturulmuştur. Yapılan çalışmalara ait bazı görseller Şekil 3.3.’te verilmiştir. 29 Şekil 3.3. Hıyar bitkisinde DAS-ELISA prosedürü. DAS-ELISA Protokolü: •Kaplama tamponu ile kullanılacak optimum konsantrasyona göre sulandırılmış γ- globulinden Microtiter ELISA plate‘nin her bir çukuruna 200 μl konmuş ve plate üzeri kapatılarak 37 ºC de 2-3 saat inkübe edilmiştir. •İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile tüm kuyucuklar üç kez yıkanmış. Yıkama tamponu üç dakika süreyle kuyucuklarda bekletilmiş ve ters çevrilerek plate boşaltılmıştır. •Alt alta gelecek şekilde her çift kuyucuğa 200 μl örnek tamponu ile hazırlanmıştır. Örnekler düzenlenmiş plana göre konmuş ve plate‘in üzeri kapatılıp 4 ºC de bir gece boyunca inkübe edilmiştir. •İnkübasyondan sonra plateler yıkama tamponu ile tüm kuyucuklar üç kez yıkanmıştır. Yıkama tamponu üç dakika süreyle kuyucuklarda bekletilerek ve ters çevrilerek plate boşaltılmıştır. •Konjugate tamponu ile optimum kullanılacak konsantrasyona göre sulandırılacak konjugate‘dan her bir kuyucuğa 200 μl konulacak ve plate 37 ºC de 2-3 saat inkübasyona bırakılmıştır. •İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile tüm kuyucuklar üç kez yıkanmıştır. Yıkama tamponu üç dakika süreyle kuyucuklarda bekletilmiş, ters çevrilerek plate boşaltılmış ve kağıt havlu üzerine vurarak kuruması sağlanmıştır. 30 •Substrat tamponunda taze olarak hazırlanmış substrattan (1mg/ml p-nitrophenyl phosphate) her bir kuyucuğa 200 μl konmuş ve 30-60 dakika veya gerekli görüldüğünde daha uzun süre oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilmiştir. •İnkübasyon süresi sonunda, gerekli olduğu durumlarda reaksiyonu durdurmak için her bir çukura 20-50 μl 3 M NaOH ilave edilmiştir. •Ölçümler ELISA okuyucusu ile 405 nm dalga boyunda yapılmıştır. Her testlemede sağlıklı bitki (kontrol), negatif kontrol, pozitif kontrol ve buffer kullanılmıştır. Sağlıklı kontrol için 405 nm de elde edilen absorbans değerinin en az iki katı ve daha fazla absorbans değeri veren örnekler pozitif olarak kabul edilmiştir. 3.2.3. Genetik Haritalama Çalışmaları Yapılan bu araştırmada, genetik haritalama çalışmaları kapsamında DNA izolasyonu, DNA miktar ve kalite ölçümü, moleküler markırlar ve PCR İşlemleri, Bulk Segregant Analazi ve haritalama populasyonunun test edilmesi aşamaları yapılmıştır. 3.2.3.1. DNA İzolasyonu Melezleme ve kendilemeler esnasında; ana ve baba ebeveynler, F1 ve F2 bireylerinden elde edilen yaprak numunelerinin DNA izolasyonu, “Wizard Genomic DNA Prufication” ( Promega, Madison, WI 53711, ABD) DNA izolasyon kiti ile yapılmıştır. DNA izolasyonu için bitkilerin 3-4 yaprak aşamasındaki gerçek yaprakları kullanılmıştır. Örnek toplama işlemi buz üzerinde yapılmış ve DNA izolasyonu yapılıncaya kadar –80 ºC de poşetler içerisinde saklanmıştır. DNA izolasyonu ile ilgili ayrıntılı protokolü aşağıda verilmiştir. DNA İzolasyon Protokolü: •750 μl Nuclei Lysis çözeltisi ilave edilerek dokuyu ıslatmak için 1-3 saniye vortekslenmiştir. •65 ºC de 30 dakika inkübe edilmiştir. •3 μl RNase solusyonu ilave edilmiştir. 31 •5-10 kez ters yüz edilerek karıştırılmıştır. •37 ºC’de 15 dakika inkübe edilmiştir. •5 dakika süresince oda sıcaklığına ulaşması için beklenmiştir. •200 μl Protein Precipitation çözeltisi ilave edilir ve 20 saniye şiddetli bir şekilde vortekslenmiştir. •5 dakika 10 000 rpm de santrifüjlenmiştir. •DNA içeren sıvı kısım, içinde 600 μl oda sıcaklığında izopropanol bulunan tüplere aktarılmıştır. •Yavaşça hafif iplikçik şekilde DNA görülünceye kadar 30-40 defa ters yüz edilmiştir. •10 000 rpm de 1 dk boyunca santrifüjlenir. Sulu kısım dikkatlice uzaklaştırılmıştır. •600 μl %70 lik etanol ilave edilir ve yavaşça karıştırılır ters düz edilerek DNA yıkanmış ve 5 dakika 10 000 rpm de santrifüjlenmiştir. •Etanol dikkatlice uzaklaştırılmıştır (DNA çökeltisi çok gevşek bir durumda olduğundan azami dikkat edilmelidir). •Tüpü temiz bir absorbant kağıt havlu üzerinde ters çevirerek 15 dakika bekletilmiştir. 100 μl DNA Rehydration tampon çözeltisi (Tris-EDTA) ilave edilip 65 ºC'de en az 2 saat inkübe edilmiştir. Belirli aralıklarla hafifçe titreştirerek karıştırılmıştır (Alternatif olarak gece boyunca oda sıcaklığında bekletilebilir). •DNA‘lar hafifçe vortekslenerek, 10.000 rpm de 5 dakika boyunca santrifüjlenmiştir. Elde edilen DNA lar -20 ºC de saklanmıştır. 3.2.3.2. DNA Miktar ve Kalite Ölçümü DNA miktar ve kalite ölçümünde “Eppendorf Biophotometer plus” spektrofotometre cihazı kullanılmıştır. DNA ların bu cihazda 230, 260 ve 280 nm'de okumaları gerçekleştirilmiş, elde edilen sonuçlara göre ultra saf su ile gerekli sulandırma işlemleri yapılarak PCR işlemine hazır hale getirilmiştir. Sulandırma işleminde her bir DNA 32 örneğinin konsantrasyonu 50-100 ng/µl olacak şekilde ayarlanarak DNA örnekleri -20 ºC de saklanmıştır. 3.2.3.3. Moleküler Markırlar ve PCR İşlemleri Bu araştırma kapsamında daha önceden tespit edilen ve PIC (Polymorphism Information Content) değerlerine göre çeşitli makalelerden derlenmiş co-dominant SSR ve InDEL moleküler markırların yanı sıra dominant SRAP ve AFLP primer kombinasyonları kullanılmıştır. Doktora araştırması kapsamında 586 adet SSR, 169 adet SRAP, 11 adet InDEL moleküler markırları ile 308 AFPL primer kombinasyonları kullanılmıştır (Park ve ark. 2000, Ferriol ve ark. 2003, Witkowicz ve ark. 2003). 3.2.3.3.1. SSR (Simple Sequence Repeats; Basit Dizi Tekrarları) Moleküler Yöntemi Bu çalışmada, daha önceden çeşitli kaynaklardan derlenmiş 586 adet SSR moleküler işaretleyicisi kullanılmıştır (Watcharawongpaiboon ve Chunwongse 2007, Fukino ve ark. 2008, Hu ve ark. 2010). İlgili SSR moleküler markırlar Ek-1’de verilmiştir. Her bir SSR primeri için master mix ve sıcaklık döngüleri ilgili kaynakların verdiği bilgiler doğrultusunda yapılmıştır. İlgili protokoller Çizelge 3.1 ve 3.2’teverilmiştir. Çizelge 3.1. SSR master mix protokolü Kimyasallar Miktar 1 10x PCR Buffer 2.5 µl 2 MgCl2 (25 mM) 1.5 µl 3 dNTP (10 mM) 0.6 µl 4 Forward Primer 0.5 µl 5 Reverse Primer 0.5 µl 6 Taq DNA Polimeraz (5U) 0.4 µl 7 Saf Su 15.5 µl 8 DNA (50-100 ng/µl) 3.0 µl TOPLAM 25.0 µl 33 Çizelge 3.2. SSR sıcaklık döngü protokolü 1 94 ºC 3 dakika 94 ºC 30 saniye 2 50 ºC 45 saniye 36 x 72 ºC 1 dakika 3 72 ºC 5 dakika SSR analizlerinde elde edilecek bantların büyüklüklerinin birbirine çok yakın olması ve bu bantları ayırmada güçlüklerin olması nedenleriyle, elektroforez işlemleri SFR (Super Fine Resolution) agaroz jeli kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen PCR ürünleri, %4 lük SFR agaroz jel üzerinde 90 V elektrik akımı altında 3 saat yürütüldükten sonra jel görüntüleme sisteminde, UV ışık altında görüntülenmiştir. Elde edilen veriler analiz edilerek istenilen segregasyonun var olup olmadığı kontrol edilmiştir. 3.2.3.3.2. SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism; Dizi İlişkili Çoğaltılmış Polimorfizm) Moleküler Yöntemi Bu çalışmada, daha önceden çeşitli kaynaklardan derlenmiş 170 adet SRAP moleküler işaretleyicisi kullanılmıştır (Li ve ark. 2001, Yeboah ve ark. 2007, Ferriol ve ark. 2003, Meng ve ark. 2012). İlgili SRAP moleküler markır kombinasyonları Ek-2’de verilmiştir. Her bir SRAP primer kombinasyou için master mix ve sıcaklık döngüleri ilgili kaynakların verdiği bilgiler doğrultusunda yapılmıştır. İlgili protokoller Çizelge 3.3 ve 3.4’te verilmiştir. 34 Çizelge 3.3. SRAP master mix protokolü Kimyasallar Miktar 1 10x PCR Buffer 2.0 µl 2 MgCl2 (25 mM) 0.8 µl 3 dNTP (10 nmM) 0.8 µl 4 Forward Primer 0.6 µl 5 Reverse Primer 0.5 µl 6 Taq DNA Polimeraz (5U) 0.4 µl 7 Saf Su 16.9 µl 8 DNA (50-100 ng/µl) 3.0 µl TOPLAM 25.0 µl Çizelge 3.4. SRAP sıcaklık döngü protokolü 1 94 ºC 2 dakika 94 ºC 45 saniye 2 35 ºC 45 saniye 4x 72 ºC 1 dakika 94 ºC 45 saniye 3 50 ºC 45 saniye 34x 72 ºC 1 dakika 4 72 ºC 7 dakika SRAP analizlerinde elde edilen bantların büyüklüklerinin birbirine çok yakın olması ve bu bantları ayırmada güçlüklerin olması nedenleriyle, elektroforez işlemleri SFR (Super Fine Resolution) agaroz jeli kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen PCR ürünleri, %4 lük SFR agaroz jel üzerinde 90 V elektrik akımı altında 3 saat yürütüldükten sonra jel görüntüleme sisteminde, UV ışık altında görüntülenmiştir. Elde edilen veriler analiz edilerek istenilen segregasyonun var olup olmadığı kontrol edilmiştir. 35 3.2.3.3.3. InDEL (Insertion-Deletion Polymorphisms; Eklenme ve Silinme Polimorfizmi) Bu çalışmada, daha önceden çeşitli kaynaklardan derlenmiş11 adet InDel moleküler işaretleyicisi kullanılmıştır (http://www.icugi.org/cgi- bin/cmap/viewer?ref_map_set_acc=11;ref_map_accs=140). İlgili InDel moleküler markır Ek-3’te verilmiştir. Her bir InDel primeri için master mix ve sıcaklık döngüleri ilgili kaynakların verdiği bilgiler doğrultusunda yapılmıştır. İlgili protokoller Çizelge 3.5. ve 3.6.’da verilmiştir. Çizelge 3.5. InDel master mix protokolü Kimyasallar Miktar 1 10x PCR Buffer 2.0 µl 2 MgCl2 (25 mM) 0.8 µl 3 dNTP (10 mM) 0.8 µl 4 Forward Primer 0.6 µl 5 Reverse Primer 0.5 µl 6 Taq DNA Polimeraz (5U) 0.4 µl 7 Saf Su 16.9 µl 8 DNA (50-100 ng/µl) 3.0 µl TOPLAM 25.0 µl Çizelge 3.6. InDel sıcaklık döngü protokolü 1 94 ºC 2 dakika 94 ºC 45 saniye 2 35 ºC 45 saniye 4x 72 ºC 1 dakika 94 ºC 45 saniye 3 50 ºC 45 saniye 34x 72 ºC 1 dakika 4 72 ºC 7 dakika 36 InDel analizlerinde elektroforez işlemleri SFR (Super Fine Resolution) agaroz jeli kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen PCR ürünleri, % 4 lük SFR agaroz jel üzerinde 90 V elektrik akımı altında 3 saat yürütüldükten sonra jel görüntüleme sisteminde, UV ışık altında görüntülenmiştir. Elde edilen veriler analiz edilerek istenilen segregasyonun var olup olmadığı kontrol edilmiştir. 3.2.3.3.4. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi) Temel olarak herhangi bir organizmaya ait genomik DNA’nın bazı spesifik restriksiyon enzimleri ile kesimi sonucu oluşan küçük DNA fragmentlerinin bir grubunun selektif amplifikasyonu esasına dayanan bir yöntemdir. Bu kapsamda AFLP Sistem II kiti (İnvitrogen, Omaha, NE, ABD) kullanılmıştır. Seçici çoğaltma için primerlere 2 adet seçici nükleotid eklenmiş, restriksiyon ve ligasyon işlemleri bu seçici nükleotidlere göre belirlenmiştir. Seçici çoğaltma için de üretici firmanın önerdiği reaksiyon ve sıcaklık döngüsü kullanılmıştır. Seçici olarak çoğaltılan DNA parçacıkları Li-Cor 4300 DNA analiz cihazı kullanılarak büyüklüğüne göre ayrıştırılmış ve veri analizleri yapılmıştır. AFLP Sistem II kitinde 8 adet EcoRI primeri ve 8 adet de MseI primeri bulunmaktadır. Analizler için ilk olarak bu primerlerle yapılabilecek olan 64 primer kombinasyonu denenmiş, çıkan sonuçlara göre 244 adet AFLP kombinasyonu daha denenerek toplamda 308 adet AFLP kombinasyonu denenmiştir. AFLP yönteminde kullanılan AFLP primer kombinasyonları Ek-4’te verilmiştir. Üretici firmanın önerdiği reaksiyon ve sıcaklık döngüleri ise Çizelge 3.7. ve 3.8.’de verilmiştir. 37 Çizelge 3.7. AFLP selektif amplifikasyon PCR master mix protokolü Kimyasal Miktar 1 10x PCR Master Mix 1.25 µl 2 MgCl2 (25 mM) 0.85 µl 3 dNTP 1.25 µl 4 EcoRI-I 0.5 µl 5 EcoRI-II 0.5 µl 6 MseI 1.5 µl 7 Taq DNA Polymerase 0.15 µl 8 sdH2O 4.5 µl DNA 2.0 µl Çizelge 3.8. AFLP selektif amplifikasyon sıcaklık döngü protokolü 1 95 ºC 5 dakika 94 ºC 40 saniye 2 65 ºC 1 dakika 13x 72 ºC 1 dakika 40 saniye (-0.7 azalt) 94 ºC 40 saniye 3 56 ºC 45 saniye 23x 72 ºC 1 dakika 40 saniye 4 72 ºC 5 dakika 3.2.3.4. BSA (Bulk Segregant Analizi) Araştırma kapsamında yapılan Bulk Segregant analizi, (Michelmore ve ark. 1991) tarafından tanımlanan yönteme göre yapılmıştır. Michelmore ve ark. (1991) bulk segregant analizinde üzerinde çalışılan bir karaktere bağlı olmayan bir moleküler işaretleyicinin bağlantılıymış gibi gözükmesi olasılığını 2[[1-(1/4)^n ] [1/4]^n ] denkleminden yararlanarak hesaplamıştır. Bu denklem doğrultusunda bulk yapılan birey sayısı 5 olduğunda, üzerinde çalışılan bir karaktere bağlı olmayan bir moleküler işaretleyicinin bağlantılıymış gibi gözükmesi olasılığını %0,2, bulk yapılan birey sayısı 38 10 olduğunda ise % 0,0002 olmaktadır. Yapılan bu çalışmada kullanılan 10 bitkinin DNA'sı bulk yapıldığından bağlantılı olduğu belirlenen moleküler işaretleyicilerin güvenilirliği oldukça yüksek olduğu saptanmıştır. Belirlenen bu moleküler işaretleyicilerin ZYMV hastalığına dayanıklılık sağlayan gene olan uzaklığı tüm F2 bitkilerine ait DNA örnekleri kullanılarak belirlenmiştir. 39 4. BULGULAR 4.1. F1, F2 ve F3 Populasyonlarının Oluşturulması Araştırma kapsamında MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş.’ ye ait hıyar ıslah gen havuzundan ebeveynler, F1 populasyonlarının oluşturulması amacıyla, patojenisite testine tabi tutularak Kabak Sarı Mozayik Virüsü’ne karşı dayanıklılık durumları belirlenmiştir. Belirlenen bu ıslah materyallerinden BTL_HTP_1 kodlu ebeveyn homozigot dayanıklı, BTL_HTP_2 kodlu birey ise homozigot hassas özellikte olup, BTL_HTP_1 baba, BTL_HTP_2 is ana olarak kullanılmıştır. Ebevenylerin homozigot olup olmadıkları döl kontrolü yapılarak belirlenmiştir. Seçilen ebeveynler MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş.Bursa merkez yerleşkesinde bulunan AR&GE ıslah seralarında her bir ebeveynden 10 adet tohum viyollere ekilmiştir. Her bir ana ve baba ebeveyn birbirleri ile ayrı ayrı melezlenerek 10 adet F1 populasyonu oluşturulmuştur. Bitkiler melezlemelerin yapılması için AR-GE ıslah seralarında yetiştirilmiş ve hasadı yapılmıştır. Elde edilen 10 adet F1 melez kombinasyonundan 1 tanesi F2 populasyonu oluşturmak için kullanılmıştır. F2 populasyonlarını oluşturmak için kullanılan F1 populasyonundan 5 adet tohum viyollere ekilmiştir. Bitkiler kendilenerek AR-GE ıslah seralarında yetiştirilmiş ve hasadı yapılmıştır. Elde edilen 5 adet F2 populasyonundan 1 tanesi (200 adet F2 birey) F3 populasyonunu oluşturmak amacı ile viyollere ekilmiştir. 200 adet F2 bitkisi kendilenmiş, F2 bitkilerinin tohumları ayrı ayrı hasat edilmiş ve 200 adet F3 populasyonu elde edilmiştir. 4.2. Patojenisite Testleri F2 bitkilerininin kendilenmesi sonucu elde edilen F3 bitkilerden her bir F2:3 meyvelerinden rasgele alınan 10 adet tohum, patojenisite testine tabi tutulmuştur. İnokülasyonu yapılan ve seraya aktarılan F2:3 bitkilerin hem morfolojik gözlemleri yapılmış hem de DAS-ELISA (Clarck ve Adams 1977) yöntemi kullanılarak bitkilerin virüse karşı reaksiyonu belirlenmiştir. Bu çalışmada toplamda 2000 adet F3 tohumu ile 20 adet ebeveyn tohumları (10 adet ana, 10 adet baba) patojenisite testi için ekilmiştir. Ekilen bu tohumlardan 198 tanesi 40 çeşitli nedenlerden dolayı testlemeye alınamamıştır. Geri kalan 1822 adet bitki ile testleme yapılmış ve bu bitkilerden 1201 tanesi ZYMV’ye karşı çeşitli simptomlar gösterirken, 595 tanesinin sağlıklı olduğu gözlemlenmiştir. Dayanıklı ve hassas bitkilere ait örnek resimler Şekil 4.1. de verilmiştir. Detaylı bilgiler Ek-5’ te verilmiştir. 200 adet F3 bitkisinden 12 bitki, tohumların çimlenmemesi ya da çimlenmiş bitkilerin hayatını kaybetmesi gibi nedenlerden dolayı testlemeye alınamamış, geri kalan 188 bitkiden 46 tanesi homozigot dayanıklı, 91 tanesi heterozigot hassas, 51 tanesi ise homozigot hassas çıkmıştır. Dayanıklı çıkan F2 populasyonu bireylerinden 5 tanesinde bütün bitkiler, 12 tanesinde 9 bitki, geri kalan 29 bitkide ise 8 bitki dayanıklı çıkmiştir. Hassas çıkan F2 populasyonu bireylerinden 12 tanesinde bütün bitkiler, 21 tanesinde 9 bitki, 18 tanesinde ise 8 bitki hassas çıkmıştır. Elde edilen veriler ışığında, Patojenisite testlemesi sonucu 2000 adet F3 bitkisinin % 9,9’u çeşitli nedenlerden dolayı testlemeye alınmamıştır. % 60,01’inde çeşitli simptomlar gözlenirken, %29,75’inde ise herhangi bir belirti gözlemlenmemiştir. A B Şekil 4.1. ZYMV patojenisite testi sonu sonuçlarına göre hassas ve dayanıklı çıkan bitki numuneleri. A- Hassas, B-Dayanıklı 2 Yapılan χ testi sonuçlarına göre elde ettiğimiz DAS-ELISA ve Fenotipik gözlem 2 sonuçları 1:2:1 açılımına uygun olduğu gözlenmiştir. χ test sonuçları Çizelge 4.1 de verilmiştir. 41 2 Çizelge 4.1. DAS-ELISA sonuçlarına göre F2:3 populasyonunun χ testi sonuçları Populasyon Teste Alınan Bitki Sayısı 2 Toplam Bitki Negatif Negatif/Pozitif Pozitif χ F2:3 (DAS-ELISA sonuçları) 188 46 91 51 0,795 F2:3 (Fenotipik gözlemler) 188 39 97 52 0,368 Elde edilen sonuçlara göre test edilen 10 bitkinin hepsinde ya da 9 unda dayanıklı ya da hassas sonuçları veren bitkiler seçilerek dayanıklı ve hassas bulk guruplar oluşturulmuştur. Elde edilen bu bulk guruplar BR1, BR2, BS1 ve BS2 olmak üzere 4 ayrı guruba ayrılarak ilgili bitkilerin DNA ları alınıp genotipleme analizleri için hazır hale getirilmiştir. İlgili guruplar ve bitki numaraları Çizelge 4.2.’de verilmiştir. 4.3. Genetik Haritalama Çalışmaları 4.3.1. DNA İzolasyonu Haritalama populasyonlarının oluşturulması sırasında; ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinden elde edilen yaprak numunelerinin DNA izolasyonu 3-4 yaprak aşamasındaki gerçek yaprakları kullanılarak yapılmıştır. Çizelge 4.2. Bulk guruplar ve bitki numaraları No Bitki Numarası Bulk Gurup 1 F2_1_2 BR-1 2 F2_1_5 BR-1 3 F2_1_18 BR-1 4 F2_1_27 BR-1 5 F2_1_33 BR-1 6 F2_1_34 BR-1 7 F2_1_39 BR-1 8 F2_1_40 BR-1 9 F2_1_41 BR-2 10 F2_1_44 BR-2 42 Çizelge 4.2. devam Bulk guruplar ve bitki numaraları No Bitki Numarası Bulk Gurup 11 F2_1_45 BR-2 12 F2_1_50 BR-2 13 F2_1_53 BR-2 14 F2_1_55 BR-2 15 F2_1_61 BR-2 1 F2_1_64 BS-1 2 F2_1_67 BS-1 3 F2_1_68 BS-1 4 F2_1_69 BS-1 5 F2_1_72 BS-1 6 F2_1_74 BS-1 7 F2_1_76 BS-1 8 F2_1_77 BS-1 9 F2_1_81 BS-1 10 F2_1_82 BS-2 11 F2_1_95 BS-2 12 F2_1_100 BS-2 13 F2_1_101 BS-2 14 F2_1_108 BS-2 15 F2_1_119 BS-2 16 F2_1_131 BS-2 17 F2_1_134 BS-2 4.3.2. DNA Miktar ve Kalite Ölçümü DNA miktar ve kalite ölçümünde Biophotometer plus (Eppendorf GmbH, Hamburg, Almanya) spektrofotometre cihazı kullanılmıştır. DNA ların bu cihazda 230, 260 ve 280 nm'de okumaları gerçekleştirilmiştir. Elde edilen DNA lar 21,6 µg/ml ile 1267,9 µg/mL arasında değişmektedir. 100 µg/ml’nin üstünde değere sahip DNA örnekleri ultra saf su 43 ile sulandırılarak miktarları 50-100 µg/ml’ye çekilmiştir. Ayarlanan DNA örnekleri -20 ºC de saklanmıştır. DNA kalitesinin ölçülmesi adına 260/280 ve 260/230 oranlarına bakılmıştır. 260/280 oranları genel olarak istenilen değerler arasında olmakla birlikte 10 bitkinin değerleri ölçülememiştir. 260/230 oranlarında ise 13 bitkinin değerleri ölçülememiştir. Elde edilen DNA’lar ayrıca % 3’lük agaroz jelde 120 V elektrik altında 1 saat yürütülmüş ve DNA varlığı gözlemlenmiştir. DNA izolasyonundan sonra elde edilen DNA miktarları ile DNA’nın kalitesini gösteren 260/280 ve 230/280 oranları Ek-6.’da verilmiştir. 4.4. PCR ve Moleküler Markır Analizleri Araştırma kapsamında daha önceden tespit edilen ve PIC (Polymorphism Information Content) değerleri dikkate alınarak lieratürde yeral makalelerden tespit edilmiş co- dominant SSR, SRAP ve InDEL moleküler markırları ve dominant AFLP moleküler markırları kullanılmıştır. Doktora araştırması kapsamında 586 adet SSR, 170 adet SRAP, 11 adet InDEL moleküler markırları ile 308 AFPL primer kombinasyonları kullanılmıştır. 4.4.1. SSR (Simple Sequence Repeats; Basit Dizi Tekrarları) Bu çalışmada, 586 adet SSR moleküler markırının ebeveyn hatlar F1 ve bulk DNA örnekleri arasındaki açılımı incelenmiştir. Yapılan bu genotipleme çalışmasında elde edilen veriler analiz edilerek istenilen segregasyonun var olup olmadığı da kontrol edilmiştir. Elde edilen verilere göre 586 adet SSR primerinden sadece 52 tanesinde ebeveynler arasında polimorfizmin olduğu görülmüş ve polimorfizm oranı ise % 8.87’dir. Yapılan SSR analizi ile ilgili örnek jel görüntüsü Şekil 4.2.’de verilmiştir. Şekil 4.2.’de görüldüğü üzere A, B, D, E ve F panellerinde görülen CSN257, ECM80, SSR2736, SSR3049 ve SSR3056 moleküler markırları, monomorfik özellikte olduğu ve sadece CSN076 (Şekil 4.1.C) moleküler markırının polimorfik görülmektedir. Elde edilen bu polimorfik primerler, mevcut ana ve baba ebeveynler, F1, dayanıklı ve hassas bulk guruplarında dayanıklılık geni ile birlikte açlım gösterip göstermediğine bakılmış ve hiçbir SSR markırının dayanıklılık geni ile birlikte açılım göstermediği 44 gözlemlenmiştir. Bu nedenle bu polimorfik SSR markırlarından hiçbirinin dayanıklılık geni ile bağlantılı olmadığı tespit edilmiştir. A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B C A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 D F E Şekil 4.2. Bazı SSR primerlerinin genotipleme tarama jel görüntüleri. (A-CSN257, B-ECM80, C-CSN076, D- SSR2736, E- SSR3049, F-SSR3056, A: Ana ebeveyn, B: Baba ebeveyn, BR1: Dayanıklı bulk gurup 1, BR2: Dayanıklı bulk gurup 2, BS1: Hassas bulk gurup 1, BS2: Hassas bulk gurup 2) 4.4.2. SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism) Toplam 170 adet SRAP primer kombinasyonu (17 adet ME ve 10 adet EM) kullanılmıştır. Elde edilen veriler analiz edilerek istenilen segregasyonun var olup olmadığı kontrol edilmiştir. Yapılan çalışmalar sonucunda toplamda 760 adet DNA bandı elde edilmiş olup bu bantlardan 68 tanesi polimorfik olduğu gözlemlenmiştir. Polimorfizm oranı % 8,95’tir. Yapılan SRAP analizi ile ilgili örnek jel görüntüsü Şekil 4.3.’te verilmiştir. Polimorfizm gösteren bantların hiç birinin dayanıklılık geni ile birlikte açılım göstermediği tespit edilmiştir. 45 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 B A C A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 D E F Şekil 4.3. Bazı SRAP primer kombinasyonlarının genotipleme tarama jel görüntüleri. (A-ME-3/EM-6, B- ME-3/EM-8, C- ME-3/EM-9, D- ME-3/EM-14, E- ME-3/EM-18, F- ME-3/EM-20, A: Ana ebeveyn, B: Baba ebeveyn, BR1: Dayanıklı bulk gurup 1, BR2: Dayanıklı bulk gurup 2, BS1: Hassas bulk gurup 1, BS2: Hassas bulk gurup 2) 4.4.3. InDEL (Insertion-Deletion Polymorphisms) Literatürden tespit edilmiş toplam 11 adet InDel moleküler işaretleyicisi genotipleme çalışması için kullanılmıştır. Elde edilen veriler analiz edilerek bu markırların dayanıklılık geni ile birlikte açılım gösterip göstermediğine dikkat edilmiştir. Yapılan çalışmada daha önceden sentezlettirilen ve ilgili standardizasyon çalışmaları yapılan 11 adet InDel primeri ile toplam 32 adet DNA bandı elde edilmiş olup bu bantlardan 4 tanesi polimorfizm göstermişitir. Polimorfizm oranı tüm bantlarda % 12,5’tir. Polimorfizm gösteren bantların hiç biri dayanıklılık geni ile birlikte açılım göstermediği gözlemlenmiştir. Yapılan InDel analizi ile ilgili bazı örnek jel görüntüsü Şekil 4.4.’te verilmiştir. 46 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B C A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 A B F1 BR1 BR2 BS1 BS2 D E F Şekil 4.4. Bazı InDel primerlerinin genotipleme tarama jel görüntüleri. (A-AB032936_2, B-CM1.15, C-CM1.41, D-CM2.20, E-EAACMCAC391-395STS, F- EAAGMCAG154STS, A: Ana ebeveyn, B: Baba ebeveyn, BR1: Dayanıklı bulk gurup 1, BR2: Dayanıklı bulk gurup 2, BS1: Hassas bulk gurup 1, BS2: Hassas bulk gurup 2) 4.4.4. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Yapılan bu çalışma sonucunda toplamda 308 adet farklı AFLP primer kombinasyonu genotipleme çalışması için denenmiştir. Elde edilen jel görüntüleri incelenerek polimorfik AFLP markırlarının dayanıklılık geni ile birlikte açılım gösterip göstermediği tespit edilmiştir. Her bir AFLP primer kombinasyonundan 3-12 arasında polimorfik bant edilmiştir. Elde edilen bu polimorfik bantların toplama oranı % 6,75’tir. Bu kombinasyonlardan E-ACA/MCA, EACA/M-CC, E/ACA/M-CT, E-AAC/M-CA, EAAC/M-CC, EAAC/M-CT, E-AAT/M-CAC, E-AAT/M-CAG, E-ACT/M-CAA kombinasyonları, daha önceden oluşturduğumuz ana, baba, F1 ile 6 adet dayanıklı ve 6 adet hassas guruplar üzerinde doğru açılımı verdiği gözlemlenmiştir. Yapılan AFLP analizi ile ilgili bazı örnek jel görüntüsü Şekil 4.5.’te verilmiştir. 47 A B F1 R1. 2. 3. 4.5.6 S1. 2. 3. 4. 5. 6 A B F1 R1. 2. 3. 4.5.6 S1. 2. 3. 4. 5. 6 A B F1 R1. 2. 3. 4.5.6 S1. 2. 3. 4. 5. 6 A B C Şekil 4.5. Bazı AFLP primer kombinasyonlarının genotipleme tarama jel görüntüleri. A-E-ACA/MCA, B-EACA/M-CC, C-E/ACA/M-CT, A: Ana ebeveyn, B: Baba ebeveyn, R1: Dayanıklı birey 1, 2, 3, 4, 5, 6, S1: Hassas birey 1, 2, 3, 4, 5, 6) 4.6. Haritalama Populasyonunun Test Edilmesi Bulk segregant analizi sonucu ZYMV hastalığına dayanıklılık sağlayan gene bağlantılı, moleküler işaretleyiciler belirlenmiştir. Daha sonra ZYMV hastalığına dayanıklılık sağlayan gen ile bu gene bağlantılı moleküler işaretleyiciler arasındaki genetik mesafe, F2 bitkileri kullanılarak belirlenmiştir. Haritalama populasyonun test edilmesi amacıyla, tespit edilen ve bulk guruplarda istenilen açılımı sağlayan AFLP marker kombinasyonlarından E-ACA/M-CA & E- ACA/M-CC, E-AAC/M-CA & E-AAC/M-CC primer kombinasyonları bütün F2 populasyonunda denenmiştir. Yapılan bu çalışmada toplam 200 adet F2 bitkisinden 12 tanesi skorlamaya uygun olmadığı gözlemlenmiş olup geri kalan 188 bitki ancak skorlanabilmiştir. Skorlanan bu 188 F2 bitkisinden 175 tanesi istenilen açılımı sağlamış olup sadece 13 tanesinde fenotipik karakterizasyon ile genotipik karekterizasyon örtüşmemiştir. Toplamda % 93,08 oranında örtüşme gözlemlenmiştir. Detaylı bilgiler Ek 7’ de verilmiştir. 48 Elde edilen bu veriler ışığında bulmuş olduğumuz AFLP moleküler işaretleyicisi, hıyar bitkisinde Kabak Sarı Mozayik Virüsü’ne karşı dayanıklılığı sağlayan gen bölgesine 6,91 cM uzaklıkta olduğu tespit edilmiştir. 49 5. TARTIŞMA VE SONUÇ ZYMV`ye karşı dayanıklılığı kontrol eden genler hakkında yapılan literatür taramaları sonucu dayanıklılık mekanizması kalitatif karakterde olduğu belirlenmiş ve tek bir çekinik gen tarafından kontrol edilmektedir (Park ve ark., 2004, Amanao ve ark., 2013). Yapmış olduğumuz bu çalışmada elde ettiğimiz sonuçlar ZYMV’ye karşı dayanıklılığın çekinik tek gen ile kontrol edildiği belirlenmiştir. Bu hastalığa karşı dayanıklılık sağlayan gene bağlantılı moleküler markırlar geliştirilmiştir (Park ve ark., 2004) yapılan ön çalışmalarda bu moleküler markırın geliştirilmesi için yapılan melez populasyonlarında kullanılan genitör ile Türkiye’de ıslahı yapılan genitörlerin aynı olmadığı gözlemlenmiştir. Bu nedenle, Park ve ark. (2004) tarafından geliştirilen moleküler işaretleyicinin kullanılması mümkün olmamaktadır. Park ve ark. (2000) yapmış oldukları ilk çalışmada ZYMV’ye karşı hassas ST8 ve dayanıklı TMG1 isimli ebeveynleri kullanmışlardır. Bu ebeveynlerden elde edilen F1 hibritlerden rastgele seçilen bireyler kendilenerek F2 bireylerini, bu F2 bireylerinden rastgele seçilen bireyler 4 jenerasyon kendilenerek F6 bireyleri elde edilmiştir. Elde edilen bu F6 bireylerden DNA izolasyonları yapılarak fenotiplemeleri yapılmıştır. Yapılan fenotipleme sonucunda belirlenen bulk gurupların DNA’larından genotipleme çalışmalarının yapılabilmesi için RFLP, RAPD ve AFLP analizlerine tabi tutulmuştur. Yapılan RFLP analizlerinde ebeveynler arasında 20 adet polimorfik band elde edilmiş ve bunlardan 17 tanesi populasyonda gözlemlenmiştir. Serquan ve ark. (1997) tarafından haritalanmış 37 adet RAPD primeri denenmiş olup bunlardan ebeveynler arası polimorfizm gösteren 55 adet band elde edilmiştir. Primer başına 1,5 oranında polimorfik band elde edilmiş olup bu bandlardan hiçbiri eş-baskın özellikte değildir. AFLP analizinde 37 AFLP kombinasyonu kullanılmış olup yaklaşık 3000 band elde edilmiştir. Bunlardan 339 tanesi polimorfik özellikte olup, toplam bandların %11 ine denk gelmektedir. Elde edielen bu verilere göre E14/M60-F-73 ve E16/M49-F-52 AFLP moleküler markır kombinasyonları 3:1 ile 4:1 arasında bir segregasyon göstermiştir. Çalışılan AFLP primer kombinasyonlarından E15/M47-F-197 ZYMV ye karşı dayanıklılığı kontrol eden gen bölgesi ile birlikte açılım göstermiştir. Park ve ark. (2004) yapmış oldukları çalışmada, PI414723 kodlu gen kaynağı ile Dulce melezinden oluşturulan 112 adet F2 ile PI414723 kodlu gen kaynağı ile Vedrantais 50 melezinden elde edilen 64 F6 populasyonları kullanılmıştır. Elde edilen fenotipleme sonucunda elde edilen veriler ışığında genotipleme çalışmaları yapılmış ve AFLP (E15/M47-F-197) markır kombinasyonu zym lokusu için uygun ko-segregasyon göstermiştir. Elde edilen bu veriler ışığında yapılan istatistiksel analizler sonucunda bu markır ilgili gen bölgesine 5.2 cM ile bağlantılı bulunmuştur. Elde edilen bu AFLP markırı SCAR markırına çevrilerek dual PCR’a uygun hale getirilmiştir. Park ve ark. (2004) tarafından geliştirilen SCAR primerleri, kendileininde yayınlarında belirttiği üzere her dayanıklı çeşitte doğru sonuç verememektedir. Park ve ark. (2000, 2004) tarafından yapılan bu çalışmalarda kullanılan ebeveynler ile kendi yaptığımız çalışmamızda kullanılan ebevynler gen kaynağı bakımından farklılık göstermektedir. Dolayısıyla geliştirdiğimiz bu markır, Park ve ark. (2004) tarafından geliştirilen markırın tespit edemediği dayanıklı genetik kaynakları tespit etmesi umulmaktadır. Amano ve ark. (2013) yapmış oldukları çalışmada, A-192-18 ile CS-PMR1 ebeveynlerinde elde edilen F1, F2 ve gerimelez populasyonları kullanılmıştır. Yapılan 192-18 yüksek çözünürlüklü haritalama çalışması sonucunda zym lokusunda yeni CAPS markırları ve bu lokus ile ilişkili olduğu düşünülen aday genin bulunduğunu rapor etmiştir. Modern ıslah teknikleri her ne kadar biyotik stres koşullarına karşı dayanıklı ve yüksek verime sahip bitkiler geliştirmeye olanak sağlasa da, bu çalışmalar sonucunda ıslahı yapılan bitkilerde genetik varyasyonların daraldığı gözlemlenmektedir (Tanksley ve McCouch 1997). Özellikle ıslah kaynağı olarak kullanılan populasyonlar içinde melezlemeler, populasyonlar arası melezlemelere oranla çok daha fazla yapıldığından dolayı genellikle her populasyonun kendine has allel ve haplotipleri oluşmakta ve bu populasyon içerisinde genetik çeşitlilik, dolayısıyla bu bireylerin oluşturacağı heterozis oranı oldukça düşük olmaktadır (Jing ve ark 2012). Bu kavram, herhangi bir populasyon içerisindeki genlerin allelik varyasyon oranlarını düşürmeye ve dramatik olarak heterojeniteyi kaybetmeye neden olur. Yaptığımız bu çalışmada kullandığımız SSR, SRAP, InDEL ve AFLP moleküler markırlarının ebeveynler ve F1 arasında verdiği polimorfizm oranları sırası ile % 8,87, %8,95, %12,5 ve %6,75’tir. Jing ve ark. (2012) dünyanın farklı bölgelerinden toplanan 3342 hıyar çeşidinde yapmış oldukları genetik 51 çeşitlilik çalışması sonucunda toplamda 72,960 veri noktası elde ettiklerini, elde edilen bu veri noktalarının 61,976 tanesinin monomorfik karakterde olduğunu, geri kalan 10984 veri noktasından sadece 2,055 tanesinin polimorfik karakterde olduğu gözlemlenmiştir. Bu oran toplam veri noktaları içerisinde % 2,8’e denk gelmektedir. Bu sonuçlar, tez çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçları doğrulamaktadır. Bu çalışma ile bulunan AFLP primer kombinasyonlarının dominant yapıya sahip olması, teknik açıdan diğer yöntemlere göre daha zor ve uzun zaman almasıgibi zorluklarından dolayı, MAS çalışmalarında etkin bir şekilde kullanılabilmesi için SCAR markırlarına çevrilerek eş baskın özellikte markırlar geliştirilmesi gerekmektedir. Ayrıca morfolojik verilerine sahip olduğumuz F2 populasyonu NGS (Next Generation Sequencing; İleri Jenerasyon Sekanslama) yöntemleri yardımıyla, SNP verileri elde edilerek ZYMV ile ilişkili SNP markırları da geliştirilebilir. 52 KAYNAKLAR Abak, K., Sevgican, A., Çolakoğlu, H., Eryüce, N., Gül, A., Baytorun, N., Çelikel, G., Paksoy, M., 1994. Sera Tarımında Topraksız Yetiştirme Üzerinde Araştırmalar. TOAG-884 Abul-Hayja, Z., Al-Shahwan, I. 1991. Inheritance of resistance to zucchini yellow mosaic virus in cucumber. J. Plant Dis. Prot, 98: 301–304. Aggarwal, R.K., Hendre, P.S. H, Varshney, R.K., Bhat, P.R., Krishnakumar, V., Singh, L. 2006. Identification, characterization and utilization of EST-derived genic microsatellite markers for genome analyses of coffee and related species. Theor Appl Genet, 114: 359–372. Anonim. 2012. USDA’s Supplemental Nutrition Assistance Program. http://www.fns.usda.gov/snap/.Amano, M., Mochizuki, A., Kawagoe, Y., Iwahori, K., Niwa, K., Svoboda, J., Maeda, T., Imura, Y. 2013. High-resolution mapping of zym, a recessive gene for Zucchini yellow mosaic virus resistance in cucumber. Theor Appl Genet. 126(12):2983-93. Arumuganathan, K., Earle, E. 1991. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Mol Biol Rep, 9:208–218 Blears, M.J., De Grandis, S.A., Lee, H., Trevors, J.T. 1998. Amplified fragment length poymorphism (AFLP): a review of the procedure and its applications. Journal of Industrial. Microbiology and Biotechnology, 21: 99-114. Blua, M.J. ve Perring, T.M. 1992. Alatae production and population increase of aphid vectors on virus-infected host plants. Oecologia, October II 1992, Volume 92, Issue 1, pp 65-70 Chiba, N., Suwabe, K., Nunome, T., Hirai, M. 2003. Development of microsatellite markers in Melon (Cucumis melo L.) and their application to major Cucurbit crops. Breeding Science, 53: 21-27. 53 Cho, Y.G., McCouch, S.R., Kuiper, M., Kang, M.R., Pot, J., Groenen, J.T.M., Eun, M.Y. 1998. Integrated map of AFLP, SSLP and RFLP markers using a recombinant inbred population of rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet., 97: 370–380. Clarck, M.F., Adams, A.N. 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme- linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol., 34: 475- 483. Clought, G. H., ve Hamm, P.B. 1995. Coat Protein Transgenic Resistance to Watermelon Mosaic and Zucchini Yellow Mosaic Virus in Squash and Cantaloupe. Plant Dis. 79:1107-1109. Danin-Poleg, Y., Paris, H.S., Cohen, S., Rabinowitch, H.D., Karchi, Z. 1997. Oligogenic inheritance of resistance to zucchini yellow mosaic virus in melons. Euphytica, 93:331–337 Danin-Poleg, Y., Reis, N., Baudraco-Arnas, S., Pitrat, M., Staub, J.E., Oliver, M., Arus, P., DeVicente, C.M., Katzir, N. 2000. Simple sequence repeats in Cucumis mapping and map merging. Genome, 43:963–974 Danin-Poleg, Y., Reis, N., Tzuri, G., Katzir, N. 2001. Development and characterization of microsatellite markers in Cucumis. Theor Appl Genet., 102:61–72 Davis, R.F.1986. Partial characterization of Zucchini yellow mosaic virus isolated from squash in Turkey. Plant Disease 70, 735-738. Decker-Walters, D.S., Staub, J.E., López-Sesé, A.I., Nakata, E. 1997. Diversity in landraces and cultivars of bottle gourd (Lageneria siceraria; Cucurbitaceae) as assessed by random amplified polymorphic DNA. Genetic Resource and Crop Evolution, 48: 369-380. Desbiez, C., Lecoq, H. 1997. Zucchini yellow mosaic virus. Plant Pathol, 46:809–829 Dijkhuizen, A., Kennard, W.C., Havey, M.J., Staub, J.E. 1996. RFLP Variation and Genetic Relationships in Cultivar Cucumber. Euphytica, 90: 79–87. 54 Ferriol, M., Picó, B., Nuez. F. 2003. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers. Theor Appl Genet., 107:271–282. Garcia-Mas, J., Oliver, M., Gómez-Paniagua, H., De Vicente, M.C. 2000. Comparing AFLP, RAPD and RFLP markers for measuring genetic diversity in melon. Theor Appl Genet., 101:860-864. Garcia-Mas, J., Monforte, A.J., Arús, P. 2004. Phylogenetic relationships among Cucumis species based on the ribosomal internal transcribed spacer sequence and microsatellite markers. Plant Syst. Evol,. 248: 191-203. Gilbert-Albertini, F., Lecoq, H., Pitrat, M., Nicolet, J.L. 1993. Resistance of Cucurbita moschata to watermelon mosaic virüs type 2 and its genetic relation to resistance to zucchini yellow mosaic virus. Euphytica, 69: 231–237. Gilbert-Albertini, F., Pitrat, M., Lecoq, H. 1995. Inheritance of resistance to zucchini yellow fleck virus in Cucumis sativus L. HortScience, 30: 336–337. Gostimsky, S.A., Kokaeva, Z.G., Konovalov, F.A. 2005. Studying Plant Genome Variation Using Molecular Markers. Russian Journal of Genetics, 41-4: 378-388. Grada A. ve Weinbrecht K. 2013. Next-Generation Sequencing: Methodology and Application, Journal of Investigative Dermatology, 133,.248 Han, Y.H., Zhang, Z.H., Liu, J.H., Lu, J.Y., Huang, S.W., Jin WW. 2008. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenetic and Genome Research, 2008, 122(1): 80-88. Huang, S., Li, R., Zhang, Z., Li, L., Gu, X., Fan, W., Lucas, W.J., Wang, X., Xie, B., Ni, P. 2009. The genome of the cucumber, Cucumis sativus L. Nature Genetics 41:1275-1281 55 Jing, L., Jianjian, Q., Qiuxiang, S., Di, S., Shengping, Z., Guangjin, S., Hang, L., Zhanyong, S., Yiqun, W., Yi, S., Xingfang, G., Xixiang, L., Xiaoguo, Z., Jinzhe, Z., van Treuren, R., van Dooijeweert, W., Zhonghua, Z., Sanwen, H. 2012. Genetic Diversity and Population Structure of Cucumber (Cucumis sativus L.), PLoS ONE, 7: 10 Kabelka, E., Grumet, R. 1997. Inheritance of resistance to the Moroccan watermelon mosaic virus in cucumber line TMG1 and cosegregation with zucchini yellow mosaic virus resistance. Euphytica, 95: 237–242. Kabelka, E., Ullah, Z., Grumet, R. 1997. Multiple alleles for zucchini yellow mosaic virus resistance at the zym locus in cucumber. Theor. Appl. Genet., 95: 997–1004. Karagöz, A., 2003. Plant genetic resources conservation in Turkey. Acta Horticulturae 598: 17-25. Katzir, N., Danin-Poleg, Y., Tzuri, G., Karchi, Z., Lavi, U., Cregan, P.B. 1996. Length polymorphism and homologies of microsatellites in several Cucurbitaceae species. Theor Appl Genet., 93:1282–1290 Kennard, W.C., Poetter, K., Dijkhuizen, A., Meglic, V., Staub, J.E., Havey, M.J. 1994. Linkages among RFLP, RAPD, isozyme, diseaseresistance, and morphological markers in narrow and wide crosses of cucumber. Theor Appl Genet., 89:42–48 Kirkbride, J.H. 1993. Biosystematic monograph of the genus Cucumis (Cucurbitaceae). Parkway Publishers, Boone, North Carolina. Knerr, L., Staub, J., Holder, D., May, B. 1989. Genetic diversity in Cucumis sativus L. assessed by variation at 18 allozyme loci. Theor. Appl. Genet., 78: 119–128. Knerr, L.D., Staub, J.E. 1992. Inheritance and linkage relationships of isozyme loci in cucumber (Cucumis sativus L.). Theor. Appl. Genet., 84: 217–224. Korzun, V. 2003. Molecular markers and their applications in cereals breeding, in: Proceeding of merker assisted selection 17-18 October 2003, Turin/Italy. 56 Lecoq, H., Pitrat, M. 1984. Strains of zucchini yellow mosaic virus in muskmelon (Cucumis melo L.). Phytopathol., 111:165–173 Lecoq, H., Lemaire J.M., and Wipf-Scheibel, C. 1991. Control of zucchini yellow mosaic virus in squash by cross protection. Plant Disease 75:208–211. Lecoq, H., Desbiez, C., Wipf-Scheibel, C., Girard, M., Pitrat, M. 2002. Durability of zucchini yellow mosaic virus resistances in cucurbits. In: Maynard DN (ed) Cucurbitaceae 2002. ASHS Press, 294–300 Li, G., Quiros, C.F. 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor Appl Genet., 103:455–461. Li, Z., Zhang, Z., Yan, P., Huang, S., Fei, Z., Lin, K. 2011. RNA-Seq improves annotation of protein-coding genes in the cucumber genome. BMC Genomics 12:540 Lisa, V., Boccardo, G., D'Agostino, G., Dellavalle, G., d'Aquilio, M. 1981. Characterization of a potyvirus that causes zucchini yellow mosaic. Phytopathology, 71:667-672. Lisa, V., Lecoq, H. 1984. Zucchini yellow mosaic virus. Descriptions of Plant Viruses, no. 282. Commonwealth Mycological Institute and Association of Applied Biologists, New England. Lopez-Sesé, A.I., Staub, J., Katzir, N., Gómez-Guillamón, M.L. 2002. Estimation of between and within accession variation n selected Spanish melon germplasm using RAPD and SSR markers to asses strategies for large collection evaluation. Euphytica, 127: 41-51. Lovisolo O.1980. Virus and viroid diseases of cucurbits. Acta Horticulturae, 88: 33-71. Luis, L.A., Alvarez, J.M., Alonso, P.J.L., Bernal, J.J., Garcia, A.F., Lavina, A., Batlle, A.M.E. 1998. Occurrence, distribution, and relative incidence of mosaic viruses infecting field-grown melon in Spain. Plant Dis., 82:979–982 57 Mliki, A., Staub, J.E., Zhangyong, S., Ghorbel, A. 2003. Genetic diversity in African Cucumber (Cucumis sativus L.) provides potential for germplasm enhancement. Genetic Resources and Crop Evolution, 50: 461-468.82 Nagaraj, S.H., Gasser, R.B., Ranganathan, S. 2006. A hitchhiker’s guide to expressed sequence tag (EST) analysis. Briefings in Bioinformatics, 8:6-21. Park, Y.H., Sensoy, S., Wye, C., Antonise, R., Peleman, J., Havey, M.J. 2000. A genetic map of cucumber composed of RAPDs, RFLPs, AFLP markers and loci conditioning resistance to papaya ringspot and zucchini yellow mosaic viruses. Genome, 43:1003–1010 Park, Y., Katzir, N., Brotman, Y., King, J., Bertrand, F., Havey, M. 2004. Comperative mapping of ZYMV resistance in cucumber (Cucumis sativus L.) and melon (Cucumis melo L.). Theor Appl Genet 109:707-712 Perl-Treves, R., Zamir, D., Navot, N., Galun, E. 1985. Phylogeny of Cucumis based on isozyme variability and its comparison with plastome phylogeny. Theor Appl Genet., 71:430–436 Pitrat, M., Lecoq, H. 1984. Inheritance of zucchini yellow mosaic virus resistance in Cucumis melo L. Euphytica, 33:57–61 Providenti, R., Gonsalves, D., Humaydan, H. 1984. Occurrence of zucchini yellow mosaic virus in cucurbits from Connecticut, New York, Florida, and California. Plant Dis., 68: 443–446. Providenti, R. 1987. Inheritance of resistance to a strain of zucchini yellow mosaic virus in cucumber. HortScience, 22: 102–103. Purcifull, D.E., Adlerz, W.C., Simone, G.W., Hiebert, E., Christie, S. R. 1984. Serological relationships and partial characterization of zucchini yellow mosaic virus isolated from squash in Florida. Plant Dis., 68:230-233. Ren, Y., Zhang, Z., Liu, J., Staub, J.E., Han, Y. 2009. An Integrated Genetic and Cytogenetic Map of the Cucumber Genome. PLoS ONE 4: e5795. 58 Robinson, R.W., Decker-Walters, D.S. 1997. Cucurbits. CAB International, New York, p 226 Seçmen, Ö., Gemici, Y., Leblebici, E., Görk, G., Bekat, L. 1986. Tohumlu Bitkiler Sistematiği E.Ü.FEN Fak. Kitaplar Ser. no:116, İzmir, 446 S. Serquen, F.C., Bacher, J., Staub, J.E. 1997. Mapping and QTL analysis of horticultural traits in a narrow cross in cucumber (Cucumis sativus L.) using random- amplified polymorphic DNA markers. Mol. Breed., 3: 257–268. Sevgican, A. 1999. Örtüaltı Sebzeciliği. Cilt I. E.Ü. Ziraat Fakültesi Yayınları No:528. ISBN 975-483-384-2, İzmir. Schmidt, R. 2002. Plant genome evolution: lessons from comparative genomics at the DNA level. Plant Mol Biol., 48:21–37 Simmons, H.E., Holmes, E.C., Stephenson, A.G. 2008. Rapid evolutionary dynamics of zucchini yellow mosaic virus. Journal of General Virology 89:1081–1085. Staub, J.E., Serquen, F. C., Horejsi, T., Chen, Jin-feng. 1999. Genetic diversity in cucumber (Cucumis sativus L.): IV. An evaluation of Chinese germplasm. Genetic Resources and Crop Evolution 46: 297–310. Staub, J.E., Robbins, M.D., Chung, S.M., Sun Z. 2006. History and Application of Molecular Markers for Cucumber improvement. Cucurbitaceae 2006. Summers, C.G., Stapleton, J.J., Newton, A.S., Duncan, R. A., ve Hart, D. 1995. Comparison of Sprayable and Film Mulches in Delaying the Onset of Aphid- Transmitted Virus Diseases in Zucchini Squash. Plant Dis. 79:1126-1131. Tanaka, K., Nishitani, A., Akashi, Y., Sakata, Y., Nishida, H., Yoshino, H. Kato, K. 2006. Molecular characterization of South and East Asian Melon, Cucumis melo L., and the origin of group Conomon var. makuwa and var. conomon revealed by RAPD analysis. Euphytica, 153: 233-247. Tanksley, S.D., ve S. R. McCouch. 1997. Seed Banks and Molecular Maps: Unlocking Genetic Potential from the Wild. Science 277. 59 Tüzel, İ.H., Tüzel, Y., Gül, A., Meriç, M.K., Yavuz, Ö., Eltez, R.Z., 2001. Comparison of open and closed systems on yield, water and nutrient consumption and their environmental impact. Acta Horty. 554: 221-228. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., Zabeau, M. 1995. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res., 23: 4407–4414. Vural, H., Eşiyok, Dursun., Duman, İbrahim. 2000. Kültür Sebzeleri (Sebze Yetiştirme), Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü, ISBN:975- 90790-0-2 Wang, Y.H., Joobeur, T., Dean R. A., Staub, J.E. 2007. Cucurbits. Watcharawongpaiboon, N. and Chunwongse, J. 2007. Development and Characterization of Microsatellite Markers from an Enriched Genomic Library of Cucumber (Cucumis sativus). Genome Mapping and Molecular Breeding in Plants 1439-0523.2007.01425 Witkowicz J., Urbańczyk-Wochniak E., Przybecki Z. 2003. AFLP marker polymorphism in cucumber (Cucumis sativus L.) near isogenic lines differing in sex expression. Cell Mol Biol Lett., 8(2):375-81. Yang, F., Lin, L., Mingyuan, L., Huazhong, R. 2009. Genetic Diversity and Phylogenetic Relationship of Chinese Warty Cucumber Germplasm Based on AFLPs. Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica, 642 (2) Yardımcı, N. ve Korkmaz, S. 2004. Studies on Spread and Identification of Zucchini Yellow Mosaic Virus Disease in the North-West Mediterraneanen Region of Turkey by Biological Indexing and Double-Stranded RNA Analysis. Plant Pathology Journal 3(1): 1-4 Yeboah, M. A., Xuehao, C., Feng, C., Liang, G., & Gu, M. 2007. A genetic linkage map of cucumber (Cucumis sativus L.) combining SRAP and ISSR markers. African Journal of Biotechnology , 6, 2784-2791. 60 Yılmaz, M.A. ve Davis R.F.1984. Purification and particle morphology of TMV, CMV and ZYMV isolated from various cultivated crops grown along the Mediterranean Coast of Turkey. J. Turkish Phytopathology, 13, 20-28. Yuan, C., and Ullman D.E. 1996. Comparison of efficiency and propensity as measures of vector importance in Zucchini yellow mosaic potyvirus transmission by Aphis gossypii and A. craccivora. Phytopathology 86:698–703. Zeid, M., Schön, C., Link, W. 2003. Genetic diversity in recent elite faba bean lines using AFLP markers. Theor Appl Genet., 107:1304–1314. Zeidler, M. 2000. Electrophoretic Analaysis of Plant Isozymes. Acta Universitatis Plackianae Olomucensis Facultas Rerum Naturalim. Biologica 38 EKLER 61 Ek-1. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 1 CSN084 TCCTTTGTCACTCACTGTGCTTCC TGTTGCAGAGGGAAGCATCTTTTT 2 CSN051 ATCAACGATTGATCCATCACCATC AAGACTTGACCACATGCATGGAA 3 CMBR41 GTACCGCCTAGGGTTTCTCC CGAGGAAGAGAGAGAAGGGG 4 SSR3411 GTTGGAGTCGTGGAGAGAGC ATTTGAAGGGAGACGTGTGG 5 SSR4278 GAGGGAAGAAAATTGAAAGCAA CCGATAGTGTCAGCCCACTT 6 CU421 AAATCCACCTCTTCGTTGGA GGGTGATACAAGGAGCGAAG 7 CS27 GCTGAGTTATGGGGAAAGCA ATGTTGTTGGACCCCTTCAA 8 SSR1737 GATGATGATGGTCATCGTGG TCAAAGGATGGAAGAGGTGG 9 SSR1115 ATTCCCAATCCCAAAAAGGT CTCCTCCTCCAATGAGCAAG 10 SSR1091 CTCATCTCCGAACTCCCAAC TGGTAACAAGGTGGATCGAA 11 CMN21_55 TCATTGATCTTTTGCTTTTGC TGGTAGCAAACATCTGCCTG 12 SSR262 CCGTTGGTCTTGGACTCTCA TGTAAAAGTGATCAGGAGGGTCT 13 SSR190 TTCTGAAACGACACCTCCAG TCCCCTTCTAATTTACCTTCCA 14 CSJCT662 ACGTCGTAAAACCATCGGAGTC GCTTCCAAGCGTCAAAGGTATC 15 SSR231 GAGGTTGGGAAATTGGGAAT TATTCAAACACAAAGCCCGC 16 SSR10134 CCAAAACCAAAAGCAAAATCC AAATTTGCCAGGAACACCAG 17 CU84b GGATTCGACTGTCTCAACCG CATCATGCCATTTCATCGAC 18 SSR5793 CCCTCTGCTGCACATTATCC TGCACCAAGCAATAACTTGTC 19 SSR5723 TGGCTTTTCTGTCACGTCC TCCATGGTACAACAAGAATCACA 20 CU742 TGCTTTTCAGTACCTCCCTCA GGAAGAGCTGCCACTGCTAC 21 SSR5124 TCTTTACCAATTTTATGGTGATGTT AATCAAGGGTGCAAATGTCA 22 GCM206 TGGGCTACCTCTATCCTTTCTT AATCCCCAAAATCTCAACCA 23 SSR3222 TCCACAGTCTTGCATTTGCT ATCCCCTCGATTCACATCAA 24 SSR479 GGACGCCACGATTCTACAAG GGATGTTCGAGTTGCAGACC 25 SSR2733 TTGTTAGGTAAGCCATGCCC TTTGCCTGAGGAAGAATCTGA 26 CU1680 CCCACCGTTATCCTCATTTC AGAAGGCAAAGGCAAATTCA 27 SSR2734 TGTTGTTGGACCCCTTCAAT TGTCAAAGGAGGAGGTGGAG 28 SSR160 TGAATGAAAAACGTGATGTTGA TTGGAAAAGCCTCTCATTCG 29 CMN21_88 CAGTCCTCCCCTTCTTCTCC TCAGTCGCAACAGCAAGAAC 30 CSN135 ATTCGATCTCTATATTTTACTCC CACAATGTTTGACATATAGAC 31 CMBR103 TGGTTGAGGAAGACTACCATCC TCCACTAAAGTTTCCTTATGTTAT 32 CMBR83 CGGACAAATCCCTCTCTGAA GAACAAGCAGCCAAAGACG 33 CMBR95 TTGACCTTTTACGGTGGTCC CGGACAAATCCCTCTCTGAA 34 CSWCT04 ACTATTGGGTCTCTCCTA GACCCGAGGTTATTATT 35 CMTC160A GTCTCTCTCCCTTATCTTCCA GATGGTGCCTTAGTTGTTCCG Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 62 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 36 CSN310 AAAATTGCCCAGTATGTGTTT TGCATCTATACTTTGTCAAGTC 37 CSN242 TCCTTTTATACCACTAGGTCAACCCAT ATAGCCTGACCATCTAATCGCCAA 38 GCM295 CCTATGTGCTTCCTTCAATCA CGCATAATTCAATGAAAATGAGT 39 CSWCTT02 CATCCTCATTCATGGCGGAGTGTG GAATTTGTTAAAAATGTACATTAA 40 CSN052 ATGGGTTTCCAAATGTTTGTCTCG CATCTCCATGCATTCCACTCTCAT 41 SSR30 TGAAATTGCTTACCCTTTGACC CCATGTTTTGTAGGGATCGAG 42 SSR1286 CCGAAAACCATTGTTCAAGC TTTAGCTTAGTTTCCAAGCACTGA 43 SSR1253 CGCTGGATTTGTTTGTGAAAT AATGTCGGGGAGTGTCACAT 44 CU1594 CTACACCGGCGGACATTACT GAGCGAAGAATGAGAGGTGG 45 SSR1374 GGGAGATTCTCAAAATGGATGA TTGCGTGTAAGGAACGTCAC 46 CU1817 GAAACTCCAAGGAACCCCTC TGCATTGTCTGGTGATCCAT 47 SSR4035 TCCGCTTCGAGTACGCAT ACAAGAATGCTGGAGATGGC 48 SSR218 CGATCTTCGAGTTTCGCAAT ATCCAACGGCTCTCATTCAC 49 CU1458 GCTCTGTTCCTTAGGGAGGG GGGGTTTTGGTTTTTGGTTT 50 SSR3610 GGGGAAATACGTGAAAGAGG GGTCAAATGTCAAAGAGCGG 51 ECM92 TCAGACTCCATTTCAGAGCCTA CAAGGAGCTCTCCCCATTATT 52 SSR2634 GGGTTTGTGACACGTTTCCT GGCAAAGGCAACAAGTTTCT 53 SSR11596 TCACATAGGCTTGCTCCAAA TCAAACACCGCGAAAGAGAT 54 CU2297A TTCATATTCTAGTGTCAGCCAAACA TGAGTGGTGAGGGATTCACA 55 CU2239b TTTCTTCTTCGCAGTCACCA AGGTCAGCCCCAAATTCTCT 56 SSR5748 TGTGGCCTGTGCTAAAATGA TTTGGAAAAGCTAAAGCCCA 57 SSR204 AACCCTATTTGCACGCATTC GAGAAACAGCTGGAATTGGG 58 SSR3084 GACAAGGGATTCATCCGAGA CAGACCCTGAAGCGGATAAA 59 SSR289 AGGACGAGGCTAATGGGAGT TTACAAGTCCCCCTCAAACG 60 SSR10874 CTGGTTATAAATTCTGATGGTGATT ATGCTGCCATGTTACTCGTG 61 ECM115 TTCCACATGTCTCTGCCAAA TAGCCGGTGGAAATGGATTA 62 SSR6722 TCTCGTTTATGTGGATTAGTCGAG TATGTTCACCCAATGCTCCA 63 CMCTN2 CTGAAAGCAGTTTGTGTCGA AAAGAAGGAAGAGGCTGAGA 64 SSR10522 TTCCTTTTGTTTTTGGTATGGG ATGTCTGCTTTGCTGGCTTT 65 SSR11468 CCGTTTCACCGCTCATTTTA TCACAAGTGGCCAAAACAAA 66 CSN257 TGGAGAAAAAGAAGAAGTGGGTGA CAAGTGGGTCGTGAATTTTGTTTA 67 CSN076 ATCTATAATACTACATGCACAC AATTGCACTTACAATGAGA 68 ECM80 CGTCCCCTTGTTACTACCTCA AAATCCTCCCTACATATATTATGC 69 SSR2736 AATCCACTCCACAGGCTCAC CGTAGAGAAGCGCCTTGGTA 70 SSR3049 AGAGAAGAGTGCAACCAATGC TGTACGATCTTGTGGCTAGAGAA 71 SSR3056 TTGCCTGTCACATGATCAAAA TGCCTTCCATGTAAAAGCAC 72 ECM53 CTACCAGTTGTTGCGGCTCT TCCCAATTCCATAGCAGAGG Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 63 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 73 SSR2132 CAATTGGTATGAGTGAAAGATAAGC CTCTGGTCCACCCAATCCT 74 SSR33797 GACCCATGGGGTTATCAGAA TCTTGATGGCCGATCTATCC 75 SSR5012 GCCCTAGGCTTCGTCTTCTT TTCTACAACTGGCCAAACCC 76 CMN21_33 ATTCTTCAACAAGCCATCCG GGAAATTAGCACCAAGCGAA 77 SSR5572 GCAAACCATAAGTTTCCCCA GATCGATATTGCAACGAATTACA 78 CU832 CGTGTTTTCTCAGATTTCCCA CACTTCCCTTATCAACCCCA 79 SSR5891 GTTTGGGTATAGGGAGACCG TGAGATGTCGAGAACTCCATACA 80 SSR6210 TTGGAAAAGTCGCCAAACTT TCCATGTCTGCTTTTGATTCC 81 SSR10282 GGCACTCATTTCGGTTGACT CACGGACACAAATCACAATG 82 SSR1056 AAAGGGAAAGGTAAATTGCCA AGCAGTTCGGATGATATTGGA 83 CSN209 CCTGAACACAAATCTAAAAGAGCAGGA AGCATAAGCCTACGACCTACGGG 84 SSR7505 GACAGGACCGTTAACCCAAA CTCCCTCTTTCCCTCACTCC 85 ECM134 TCTTTCCTCTGCAAATCCTTCT TGCTAAAGCTACATGCTGTCCT 86 TJ10 ACGAGGAAAACGCAAAATCA TGAACGTGGACGACATTTTT 87 SSR2008 TTGTCCTGGAAATTGGTGAA GGTGGGAAGTTTGTAAATGAGAA 88 CMBR153 TCAAAGACAAGAAGACCAACCA TGTGCTAAGAGAGAGAGAGAAGA 89 CMBR43 AGAGATGCTCCCTACACTGC TCAAGCAAACCCTAATCGGT 90 CMBR57 GCTCTGAAGAGTGGAATGAGAGA CCATTTGGGAAGTAGGCATC 91 CMN61_14 TGCAGGATCAAGAATCAAGTTC ACGAACTCCGGCATAATCAC 92 CSN002 AAAATGGGAAAAGTGGA GCCTTAACTAAATGACAAA 93 CSN018 TGTCTTTCCCTCAAACTACACCCC CCAAATGGGGTTCAACAAAGAAA 94 CSN069 GATGTATGCTTATTTATACCCAA AGAAAATTAATCAAGACCTCTC 95 CSN147 CCACCCAACCAAAAAGCAGTAAAC GATGGGAGCAAATGTTGGTTTTGT 96 CSN153 TGGGTTTGCACACTCAAGAGAAAG AACATGAGAGTTCTCTTGCCCACC 97 CSN160 GTAGCAGAAGCCTCACCGGAGTAA CTTGTAGCAGAAGGCTTCCACGTT 98 CSN161 GTCCTTTCTGCCATTTTCTTGGGT CCCAAATTTAGTGGCTTCAACATC 99 CSN166 CGTTCCTTCCCACTCTTCACATTT TTTGATGATGATGATGATGAGCCG 100 CSN171 TGCACAACAGTGTTTAGCTTGATGA TGAAGCCGAAGTAGATGAGACCT 101 CSN191 TAGATTTTTCATGAAGGGCGTTGG CGTCATTGTGACTGGAGGTAGCAT 102 CSN201 TCAACTTACACACACCCACACAAAA GTGGTTCTCATTCCAGTTTATTTG 103 CSN251 ACCGACAAGCAGAGAGAAGAAAGC ATTTGGACTCATTTTGAGCACCGT 104 CSN284 AGCACCCCGGTATTTCTCTTTGAT TAAAGAGGCGAAAAGTTCGGAAG 105 CSN306 TTTCCTCCCCTTTCCTTCATTCTC CAACCCAAATGCTTAGAGAACCC 106 GCM246 AAAACGGAGATGTGGAGGAC TTAAGCAAGCAGCCAAAATG 107 CSN025 AAATAGACTTTGACCCTTTT GTCTGTATTTCAAATCTAACTC 108 SSR10368 TGTTCCGGCTCTTCAGAGAT GCCCGTATTTTATAAATAGTTTCA 109 CSJCT323 TCGATCTTGTAGAAAGCAAGGA CAAGCAAATTCCCATTCACC Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 64 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 110 CSN066 GGATCCGAAATAGAGAAAGGAAA GTTGTTTGGGTGTTAATGTGAAA 111 SSR2697 TGCTAACCCAACCAAACAAA CTGCCATTTCAAGCTATGGG 112 CU1791 AATGATGCACGAACAAACCA ATTGGCCCGAAGTAGGTCTT 113 SSR5899 TAAGAGCAAAAATCCCACGC AGCTCAATCAACGTCAAGAGAA 114 SSR1949 AGGAAAACCGGAAGCAGAAT TCCACAGAACAACCGTGAAA 115 SSR3598 TCAACAACAAGACAACCCCA TGGTCCCTTTTGATTTCTGG 116 SSR7130 CCACACACACACACAGTCACA TCCCATTGTCCCTCACTCTC 117 CSJCT42 GAGAGCCCCACCACCAGTCT GGATCCATGGCGCCTATAAATAC 118 SSR12 TCTCACCATGGTCACCTAATG GGTCATTGAAGAGTCAAGTTGG 119 SSR7209 CTGTCTGCAGAGCCATCTGA CCATCAAGTTGAGGAGCAAA 120 SSR2803 ATTGCTCCCAAGCAACTTGA ATTTCAAACCTCCAAGGCTG 121 CU1830 TCCTTTCCCCCATAATGACA GGTGGTTATGGTGGTGGTTC 122 SSR4482 GGAATGAATAAGTTCTGGAAGAAG CTTCCCATCAAAAAGCCTCA 123 SSR6225 TGTATCATTCCAATCCCTCCA CGAAGTCCAAATTGATAAAGGC 124 SSR203 AATAGCTCGAAAATGATGGCA CCTCAAAGAGGATCAAGCGA 125 SSR2895 GAGTTGGCAAGTCACGTTGT TTTCCCTCATTATGCCATCC 126 CSJCT435 TCAACTGGTAGTTGGGAAACCT CTGTCAATCAATGCTTCAGCTC 127 CSWTA13 AGATGGGCAGTTAGAGTTGATGCT CATTTAAAGCCTCATCAACACCTC 128 CSWTA04 TAAACATATGTGATTATACAGCAA GTGTTTTGGTGTTATGTGAATATC 129 GCM344 TCATCAGTCAGTAAGAGAGAGAGAG ATGTGACCTGATCCCATTGA 130 SSR6447 AAGTATGACGACACCCTTCG CGCAAAACCGAAAGGTACATA 131 CSJCT315 CCACGAAATACAGATCAGCAAC CACGTTACATTGGACGAGAGAT 132 CSWCT32 GCATTAAATTGGAAAGGGGAATCA TGTCCTTTAATTTGGAAATTGAAT 133 CSJCT14 TTCCACGTTACATTGGACGA AGAATTCATGGCCTGCAGAT 134 CSN140 TGTTTGCTGCCCTAGGGTTTCTTA TTAGAAGTGCATGATGCTCACAG 135 CU174 ATTGTTGTAATGGGTTGGGG TTCCAAGCAAACTGAAACCC 136 CSN259 TTGTTTGTGACATCGTGGTGGTTA CCAAATCTTTCCCAATCCATCTTG 137 CSJCT661 GGGTCATACCCAAAAGGGAGA TCTTGCTTTAGCCGACAACTCA 138 SSR772 AGAAGCGTTGGGGGAAAATA TGCTACCTCACATGGTTTTG 139 SSR11439 CGTAATTCCGCATCGTTTTT CGAGAACATGATCGTCTCCA 140 SSR2166 TCGATTTCAAACACTCCACTTG TCAAACAAACTACATGCCACAA 141 SSR2693 TTTCAGCCATTGGTTTCCAT CCAAAGCCAGTACAGCGTTA 142 CSWCT13B TGTGATCAACCAACTTCA GAATTATGGGTTCATTTT 143 CSN061 ACTTCAATCTCATATACTGTG TACCACTGGGATCCTAA 144 SSR2459 TCGGAAGATGGGTTATTTGG TGACCCCTCACATTCTCTCC 145 SSR7081 GGCGACTTTGGAGTGTAACAA GGAAAGATATTCTCAGGGAATCT 146 CMAGN32 CAGATTAGAAGAAAAAGAGG AGCAGACAGCATATAAAGCT Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 65 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 147 CSN114 CTTTCAAAATTCGAGGCAAAACCC TGATCCAATGATGTAAGAGGGTG 148 CSN197 ACAAGAAAACCCCACAAATGCAAG CGAAAGCCTGAAAAGGGCAAAAT 149 CSN220 TCATCGATCCAACTAAAACACCCC ATCGAACCACAAAGGGGTAAGTG 150 CSWTA05 GCATGAGCTCGAGCTGGTGTAGTG CGCCTGTTTTCATTTTGATTGGTT 151 TJ24 AAACACGGGCTTGAAGAAAA CCCAGAAGGTGAGAGAGACCT 152 GCM106 CAATTCAGTGAGAGAGAGAG ACCGAATACACATGATTACA 153 SSR1191 TTCTTTCAAATGCCCATCAA AAAGATATGGGTGGGAGCAA 154 CU1792a ATGAGCATTGAGCAGTCACG GGTGTATTTGTGAGGGGTGG 155 CSN282 GGAAAATGAAATCATGTGCTCCTTC TCGTCATTCTAAGTTACCTGGTTT 156 CSWATT02 CCAGTACAAATAACATCCCGAAGC CAAACCTCTTTCAGTACCGGAATA 157 SSR2123 TGGAAAATGACAGCAACCAA CCATTCTTCCTTTCCACGAA 158 CSWCT25 AAAGAAATTAAGTCAATCAAACCG CCCACCAATAGTAAAATTATACAT 159 SSR4910 CAACACCCATTCATTGACAAA TCTGCAAAGCTCAGAAGCAA 160 CMN01_74 GCTTTCCCTTCCCTCGTATC AATTGCACGCACAAAGTACA 161 SSR2460 CTCAGAAACCCTTCCACCAA CTGTACCGCGAGGACAGTTT 162 CS52 GCCTCAACCAAACATCCAAT ACAACCTTGCCATCTGGTTC 163 SSR5267 TGCAGCCTAATTTAAACCCC TGTGAAGAAGTCAGACGCAAA 164 CSN095 CAGAAGCCTTGCAACTCTTAGGAA TGTTTCAGTGTCTCAGGTCCATCC 165 CSWCT29 TGGACGAGTTGCTCTTGTAAGCCT ATCAAACTTGGCATGTGGCATGA 166 CSWCT03 TTCTCAGAACTGCCACTG CACTCTTGAGGGGAAAAA 167 CSJCT77 TCAGAGTGAATGAGCTCATGGAAG TGACGTCCGCAAGGACACAG 168 CSJCT720 CCAACGGAGGTCTGAACG CAGCGGAGAAAGGCTCAG 169 SSR842 CGCCCAAATTGAACGAATAA CCTCCGCCTTTCTTTCTTTT 170 CSJCT674 TAGAAAGGAAGGGATGTGATTAGG ACAGGTGGTTAGAGGTTAGAGCT 171 CSWCT05B ATACGAACTCTTTTATTTTATAGG ATTAAGGAGATAAGAATTGTGTT 172 CSN116 GTGCGTTGGAAGAAAGAAAGGAAA ATGTGGAGCAAGTGTTGTCTCGTC 173 SSR5946 CCTGAGAATCGAAGGTCACA GCCATCACTAACTGACGCCT 174 CU2063 GAGAAACCAAAAACAGACCCC AGACCGGGAGACAGAGGAAT 175 CU886 CAACTCTGTTCCCTAAACTTCTTCTC CCACTGTTTCTTCTATTCATCTTCT 176 CSJCT266N CTGTGGTTGGGTTGGAAATCTC GGGAGGCAGTAGACACATCC 177 SSR2086 CCAGAAGGCTAAAGGTGGAG GTAATGTTCTGGCCAAGCG 178 CU934 CTCCACGAACCTTCCTTCAC ATTGTTCGGCTTGGTTCAAT 179 SSR973 TTGGGGCTGTTCTAATTTCG TCGTTGTTGAAGCCAAAGAA 180 CSN263 ATTACAACCACAAGTGGCGAGACA AGCTGATTTCACCACAGCTTCAAA 181 SSR6240 TTGAACATGAAAAGTATTGGCG TTGCAACTAAGGTGTGCTATTCTC 182 SSR158 GTGATCAGGAATGGTTTGGG ATCTTCTTCTCCACCACCGC 183 SSR300 TGCCGACAAAGAGTTTTTCA TGCTAATTCATTCATACTTTGTCA Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 66 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 184 SSR19 ATTCTCGTGAACCATCACCC ACTTTTGCCACTTGGCACTT 185 SSR1643 TGCAGGTCGACAATTCAATAA TCAAAAGGCACATGTGATGTC 186 CSN227 GCTAAACTCCCACGCATCAAACTT CCAGAGAGTGGAGAGCAAATGGA 187 CSWGCA01 AGTGATGGTGCAGGGCTATCTTAT TTGTCTTCCCTCCTCTTCTCGTCT 188 SSR233 AACCATAAAGTCGGGAGGGT GGGAAAGGCAGGAGAAAAAC 189 SSR1582 AATGCGAATTATGCGATATGA AATGCCGGTCTCTACAATGC 190 CSN126 GCAGAAGCCTTATTCTCCCAGAG AATTGGTGTATTTGTGAGGGGTGG 191 CSN208 TGCATCTGGTCTCCTTCTTCTTGT AATGAGGCTTTTTGGAAGAGGAG 192 SSR7198 AACAACAGTTGCATTTTTAGATTTT GGTGAGAATTTGTTGGTCTATCG 193 CSWCT16B CTTATGGTCGGAGAAG CTCAGATAACCCAAAATA 194 CU2345 TCATTTGGGTGAGCATTTGA GCCAAAGTCGACATGCTTCT 195 CMBR145 TGTGACAATGTGCAACCAG AAAAATGGTGTTAAACGACATGG 196 SSR259 TCCACGTAGACATTGTGAGGTC CGAGTGTAGCTCAATTAATATGGT 197 SSR2385 CGCTCTCTCTCCACTTTTGG AAAAGTGACCGTTGGAGTGC 198 CSN293 TCATGTTCAAATCTCATTCCCCCT ATAAAGAACACACATGGTGGTGG 199 SSR3940 GATTCTCCGGAAACGGATTT GTCGTTTTCCGCGATTCTAC 200 SSR3962 CTTTTTGGGGACCCTTCATT CACGAATGCTGCTCTAACCA 201 CSN287 AGGGAGATAGTATGACAAGATTTCCTC AGTGGGGTTGAGCAAGTTGAAGA 202 SSR1148 CGGAGAAAGGCTCAGAAACA TGCACGCACATAAACTAGGG 203 SSR4252 AAAGAACACACATGGTGGTGG AAGGAGTGTTTGAATAGGCCG 204 SSR3357 AAAAGGGCAAGTCAAAACCC GGGGAGGAAGAGAGACCCTT 205 SSR4637 ATCTGGTACCGCTGTTTTGC GTGTTTGATGTACGCGGTTG 206 CMCTN86 GTGACAGTTATCAAGGATGC AAGGGAATGCATGTGGAC 207 SSR215 GGAGCCCTAGTAGGAAACCG GGACCACGTGAAAGATTCAGA 208 CMN05_87 GTCCCTCACATTCTCCTCCA TTCGGAGGATTGGTATTTGC 209 SSR3076 GGGATGTAGGAGGGGATTGT TCGTTTATGACAGCATTTCCA 210 CSN183 TGGACCACGTGAAAGATTCAGAAA GCCTACAACTATCCCAAATGGAG 211 CSWTA11B GGTAGGCAATCAAAGAGTGGATGG AACATATAGGAATCTAACAAAGT 212 CSN244 CACAACGTGTGTGCAACTAAACGA TGTTTCCCTTCTCCATGCTCCTTA 213 SSR6585 GCAGGTCATACTCTTTAATTATTCCA TGTTATCATCGCCATACCCA 214 CU1094 TGCTAAAACAATGCAGCACA TAACAACCCCATCAAAAGGC 215 SSR4847 TCGTGCCTCATTTGGTAGTG GCCAAGGTAACGAATTGCAT 216 SSR477 TATTGCGATGGTTTGACGTG GCAAATTCCGGAGTTCGTTA 217 CSN266 TTTTAGGTGCCATCCTTGACTTGG TCCTAAGGTATTGATTCCACGATT 218 CSN159 TGGTTCAGAAAGGGGAAAATCAGA TTTCACACCATTTACGGTTATGGG 219 CSN172 TCTCAACCCAGATTTGACCTACCA CCCCTGGAAGTAAAGGTGACACT 220 CSN184 CTTTATCTTCGGCTTTGATGTCCG TCCATAGCAGTTCCCAATGTCCTT Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 67 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 221 CSWCT13B ATAGGGCAATTTGTCTCT CACTGGGATCCTAACAAC 222 CSWCT17 TTGAATTATGGGTTCATTTTT GACAATGATAAACTTCCCTGA 223 CSWCT24B ATCGCTTTATCTTCGGCTTTGAGT AATCCATAGCAGTTCCCAATGTCC 224 CMTCN56 CTTTTCTCTTCTTCTATTCTC ATCCAAAAGGAATCGGAAAG 225 CSN121 GCATGCGACATTTTGGATTCTTC CCCATGACCGAAAGAGGAATATG 226 CSN145 AGTTCCAGGTCAGATCTCTT TCGATCCAATAATATTGGGATGG 227 CSN157 GAAGCTCCTCAAACCATT ACTATGTTGAAAGATTGATCCT 228 CSN181 ATCTTGTCCGTTTGCTTGATCCAT GTGATTTTGGCTACTCCAAGGTCG 229 CSN295 GCAACTAACCCATAAATGAAGAGATGC TCAAAAGGCAATGGACCTTACAC 230 CSWCT06B TTTAAATTCTTCCTAACC TTTGCTTTGCATTTGGAT 231 CU2994_1 CATGATCCAACCATGATCCA GGCTAAATCCATGGGCACTA 232 CU2994_2 TGATCCAACCATGATCCAGA GGCTAAATCCATGGGCACTA 233 CU2994_3 CCATGATCCAGAAGACGACA GGCTAAATCCATGGGCACTA 234 CU2998_1 AAAGGGGTTTCCATTCTTCTG CTCTGTCCTTTGCAGCATCA 235 CU2998_2 GGGGTTTCCATTCTTCTGTCT CTCTGTCCTTTGCAGCATCA 236 CU2998_3 AGGGGTTTCCATTCTTCTGTC CTCTGTCCTTTGCAGCATCA 237 CU3009_1 ACGGTGAGTTCCTCGTCATC CTCTATTTTCCATTCCGCCA 238 CU3009_2 TCCTCAACGGTGAGTTCCTC CTCTATTTTCCATTCCGCCA 239 CU3009_3 CGGTGAGTTCCTCGTCATCT CTCTATTTTCCATTCCGCCA 240 CU3015_1 GGACATGGAGATCGAGGAAA GAATTCGTGGATGAAAGGGA 241 CU3015_2 GGACATGGAGATCGAGGAAA CGTGGATGAAAGGGAAGAGA 242 CU3015_3 GGACATGGAGATCGAGGAAA TCGTGGATGAAAGGGAAGAG 243 CU3031_1 AATGAAGGAAAAGATCCGGC GTGTTGTCGGCACAATTGAC 244 CU3031_2 AATGAAGGAAAAGATCCGGC TACAAGTTCTTGGCTCCCGT 245 CU3031_3 AATGAAGGAAAAGATCCGGC GTGTTGTCGGCACAATTGAC 246 CU3035_1 TCCCAAACTCATCTCATCACC GGCTCTGCCATTGTGTTTTT 247 CU3035_2 AAATGGGGTCTCCCATAATTG TTTTTCCATCTGAGGGGATG 248 CU3035_3 AATGGGGTCTCCCATAATTG TTTTTCCATCTGAGGGGATG 249 CU3056_1 CTGAGAAAATTGGCCTTTCG TCCTGTACCTTCGTCTTGGG 250 CU3056_2 CTGAGAAAATTGGCCTTTCG CCTGTACCTTCGTCTTGGGA 251 CU3056_3 TGAGAAAATTGGCCTTTCGT TCCTGTACCTTCGTCTTGGG 252 CU3073_1 GAGCAACCTCAGCATCACAA TTTGGGTAGCCAAGAAATCG 253 CU3073_2 CCTCAGCATCACAAAGGACA TTTGGGTAGCCAAGAAATCG 254 CU3073_3 AGAGCAACCTCAGCATCACA TTTGGGTAGCCAAGAAATCG 255 CSJCT10N TGTAAAACGACGGCCAGTAACTCTCATGGGAAACAGAG ATTCTTCTCAACCTCTTCCT 256 CSJCT 22 TGTAAAACGACGGCCAGTCCGTTCTGGCGCGCGATAGA CGTGGATAACGCGCAACTAACC 257 CSJCT 77 TGTAAAACGACGGCCAGTTCAGAGTGAATGAGCTCATG TGACGTCCGCAAGGACACAG Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 68 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 258 CSJCT 108 TGTAAAACGACGGCCAGTGCCCGTTCTGGCGCGCGATA GTGGATAACGCGCTCAACTAACC 259 CSJCT 14 TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCTTGAAAGAGCCGAGAA TCAAAAGGCTTTGGAGGGAG 260 CSJCT 156 TGTAAAACGACGGCCAGTTCGTGGATAACGCGCTCAAC GCGATAGAAAAAGAGAGCG 261 CSJCT 254 TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAACTATAGCCATTGATTT TCAACACCTCCTCAACACT 262 CSJCT 29 TGTAAAACGACGGCCAGTAACACCTCGAGCAAGAGCAG GGGTTTGAATCTCCCAGTCC 263 CSJCT 358 TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTGAACAACCAAGAGAG TGAGGGAGCGGTTGATTAGAG 264 CSJCT 390 TGTAAAACGACGGCCAGTGAATTTAGGCATAGAGAGAA CCCTAAACAGAAGACTTTGCTAC 265 CSJCT 565 TGTAAAACGACGGCCAGTGAAAGAGCGGGAGAAATGG AAGCGGTGGGAATTGAATTGGTT 266 CSJCT 598 TGTAAAACGACGGCCAGTTCCCAAACATAGAATGCGAT CTGTCTGTTTTTCGATCTTGTAGA 267 CSJCT 619 TGTAAAACGACGGCCAGTAACAAAGAACTAAGCAATTC CTTAGGAGAAGCCAAGACACTAG 268 CSJCT 651 TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGCGGGAGAAATGGAAA CGGTGGGAATTGAATTGGTT 269 CSJCT 656 TGTAAAACGACGGCCAGTTCCTACAACTCAAAGGGCCA GAAGTGGAGTGGAGTGGAGTGA 270 CSJCT 661 TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTCATACCCAAAAGGGA TCTTGCTTTAGCCGACAACTCA 271 CSJCT 664 TGTAAAACGACGGCCAGTAAGTGGGCTCGATTGGAAGA CCGTCGCCTTTCTCAAGTTC 272 CSJCT 726 TGTAAAACGACGGCCAGTGAAGAGACGGCTCCTTTCAG CCCGATTTGTCGTCTCTCTC 273 CSJCT 933 TGTAAAACGACGGCCAGTGATGACATGGACATGTCTGC AAGATCTCTCCCATCTACCAACTT 274 CSJCT 944 TGTAAAACGACGGCCAGTGGCCTAGAATTTAGGCATAG GCTGTCTTTATGTTTCTGCAAC 275 YCZ-SCAR GGGGAATGAGTGGATGCAAGATG GGGTAGTTGGCGATTGACATTG 276 YCZ-SCAR GGCTATTGTACCCTATGAACAAC GTAGCACAAATAGGATTTAAGGT 277 YCZ-CAP-1 GACCTTAAATCCTATTTGTGCTAC GCGGCTTGGACTTGGCTCAAC 278 YCZ-CAP-2 CATTCGTTGATGTGGAAGACCTGTC CAGAAGCAGAGCCGTCACTCTCC 279 M1 GCTTTGGAAAGAATTGTAAACG CAGTTGTAAAAGTGAGAGCTTGG 280 M2 ATTACAAGTTAGGGGACAATGAAAG CGACCTTGGTGAATTAGAGATTA 281 M3 CACTCTAATCTCTAATTCACCAAGG TGGGGGTTTTCTTGAGAGTT 282 M4 TGTTCTTCAAATCACGTATCCT TGGGCAGAATTTGAACTTGT 283 8164 ATGTGTGATTTGCAGATTTTCATAG ACCTTCCCTGATCGACTCCT 284 SCBC469 TTGAGCGAAAAATACATACC TGACAAACTTTAGGCTGACAT 285 SCL19 TCGAGGAACATCTTTACTT TTATTCTTATGTTGATCGCTTGTC 286 SCK7 CTCACGCAAAGCCCTCAGA TAGAAACTTCGAATAATCAGACA 287 SCAA9 CGACCCGCCTCACTTAGC GTCTTCACCGGCATTTTG 288 SCAO7 TGCGAGCCAAATCCCATCT AGTGGAGTGGAGACGCAGAGA 289 SCAI4 GAAGTCCGTGTCTATTATTGAT ATTACATTGTGGCAGTCTTTC 290 SCBC403 CGGATTTGACGGTAACT AAGGTCGAGGGATGTGC 291 SCL18 ATTTGGTTATTATTTTTATTC AACTCACCTCAAGATTTAGA 292 SCU15 ATCCAGCGCATTCTTTAG TTCGGCGGACTTGCTTTGGTGT 293 SCAN5 GGTATTGGTATGTTTTTCTATTTC GGTTTTACATCAGCCATCCT 294 SCBC519 AGATATAAGCGTTGTGAGGAT ATTATGATAGATTCGTTTTTACC Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 69 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 295 SCAK5 GGTATTGGTATGTTTTTCTATTTC GGTTTTACATCAGCCATCCT 296 SCK15 TCCTGCCAAATAAGAGA TGCCAATCGATCCTAAAAC 297 SCAO12 CCTGTCATCTTTGCTCCTAACTAA CTACGGATAAATCACCTGGACCTT 298 CMGA15 CGGCAAGACGATTGGCAGC ATCACCGTAGCGAAGCACC 299 CMCT44 TCAACTGTCCATTTCTCGCTG CCGTAAAGACGAAAACCCTTC 300 CMACC146 CAACCACCGACTACTAAGTC CGACCAAACCCATCCGATAA 301 CMCTT144 CAAAAGGTTTCGATTGGTGGG AAATGGTGGGGGTTGAATAGG 302 CMTC47 GCATAAAAGAATTTGCAGAC AGAATTGAGAAGAGATAGAG 303 CMCCA145 GAGGGAAGGCAGAAACCAAAG GCTACTTTTGTGGTGGTGG 304 CMGA172 CAATCGCAGATACTTCCACG TGCTTGTCCCAACGGTGTCAT 305 CMTC123 CGGATTGTACTTATTGCCAAG CATGTGCATGTGTGCATGTAC 306 CMGT108 CTCCTTCAAACATTGTGTGTG GAGATAGGTATAGTATAGGGG 307 CMTAA166 GGAACAGACACCTCTTCTGAG TCCGTCTACAAGCGTGACTGT 308 CMGA165 CTTGTTTCGAGACTATGGTG TTCAACTACAGCAAGGTCAGC 309 CMCT160A GTCTCTCTCCCTTATCTTCCA ACGGTGTTTGGTGTGAGAAG 310 CMTC160A GTCTCTCTCCCTTATCTTCCA GATGGTGCCTTAGTTGTTCCG 311 CMCT505 GACAGTAATCACCTCATCAAC GGGAATGTAAATTGGATATG 312 CSCTTT15 GTTTGATAATGGCGGATTGT GTAGAAATGAAGGTATGGTGG 313 CSGTT15b ACCTTGTTGATTCGGTTCTCC AGTTCGGTTTAACTACCCACG 314 CSTCC813 GTTGTGCTGCCCAATAGTTG CACCACTTCTTCCACCGAA 315 CSCT335 CCTTCACTTCCATCTTCATC CGGTCCTTCATTTCATAGAC 316 CMTC51 ATTGGGGTTTCTTTGAGGTGA CCATGTCTAAAAACTCATGTGG 317 CSAT214 TTGAGTACCATTGTCATAGAT TTAGTTTAATTTCATCTCTGT 318 CSAT425 TAGGGCAGGTATTATTTCAG ACGGACTGATTTAGTATAGGC 319 CSCCT571 CCTTTCTGCTGTTTCTTCTTC GAAGGAAGGAGTGAGGGGAAG 320 CSTA050 GAATTATGCAGATGGGTCTT CAAGAAGATCAAATGATAGC 321 UW044613 GGCATTCGCATCTTTTATCC CCAGAATCATTCACATGGCA 322 UW044536 GGTATGTGTCAATGCTCCACA CAAATCTCAAACCCCTTAGTCG 323 SSR11654 AGACCCTTTCCAGGAACCAT CAGAGGTGTCTAAGCTCCCG 324 SSR20705 CCTTTCCTTACCCATCCCAT ACCCATTTGAATCAGCTTCG 325 UW045196 CGGCTGGGTCATAAAAAGAA CATGTGCTCGCTTTTCCATA 326 SSR14697 GGGTCAACCTACCAACCGT CCTTACAGGGAAAACGGTGA 327 SSR10018 CTTTTGTTCTTGTGGAATGTGA ATTTGGGGATGGAGAGGTTC 328 SSR16881 CCCTCTCAACATTTTCCACAA CGAGGAGACTTGATGGGATG 329 SSR10839 TTGAATTCCTCTGCCCAATC TGGAATTTTGTTAGGGGGAA 330 UW084469 AAAAATAACCAAGAAAATAGACATTGA ATGGGATTTTTAAATCACCTTATA 331 UW073856 TGCAAACTCCTTACTTTTTCGG TCCAAATGGTTAGAAAATGGAGA Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 70 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 332 SSR01816 GCCATTATGTAGGGGTATGAAAA TCGAACTGATTAAGATTGCAAAA 333 UW005572 CAAATTGCAACATTTATGTCTGTG CCATCATTTTCCACGTTAGGA 334 SSR16055 CATCCTTTCGACTTTGATGC CTGCAAACGTGAAGAGAGCC 335 UW073923 CCTCCAGCAACATACAATGG TTGGATCATGCTTGTTTTGA 336 UW073982 CATGCCGTCTTTTGTTTCCT CCAACCTCACAACCCTCCTA 337 UW085111 GCGTATTTCAATGGCACAAC CAAATCCAATCAAATGCCTG 338 UW049617 TGGTTTTGGCCTTTGATTTC GCCTTGAACCCACATGCTAT 339 SSR00420 TAACAACCACCGATCTTCGC TTTGTATAAAGCTACCAAGGTTTC 340 SSR17196 GGGTCGAGATAAAGCCGTAA TCGAGCTCGTTGTCGAATAA 341 SSR03962 ATGGAGCCCTAATCACGTTG CCGGCCAAACCCTATAAGAG 342 UW084481 TTTTCATTTGATTTTATAACAGTGGA TGATCTGCATCGCTTCTTCA 343 SSR19914 ATGGTCCACCAAACAAATGG GCTGTACTTGGAATCACTTCCC 344 SSR05079 GAGGAAAATTCCAAAAATTGC TGCGAATTGGTCTCCTCTTT 345 SSR03680 AAATGAGTGCCAAAAGCCAT CCACCGAAAGAGATCAAACAA 346 SSR21747 CAGCTGTTCGAGATTCCGAG GAACAAATGGGGAGAGCAAA 347 SSR10963 AGCATGCAATTAATAGGCCA CAAACAAAAGTAAGAACAAAAAT 348 SSR11820 ACGACGCCGTATTTGCTTAG AAGCTCGTTCATTATTACCCAA 349 UW084642 GGAATAATGGGACCCCTACAA TGAACCAAGTCCACAATTGCTA 350 UW084812 AAACAAATTTCTTCAAATTGTGATATG GCATTATTGACAAGATGGTAATG 351 SSR00204 AACCCTATTTGCACGCATTC GAGAAACAGCTGGAATTGGG 352 UW084796 CAAAAGGTCAAAAAGGTGGTG TGCATTAAATTAGATTAGAAAAA 353 UW084786 GCTCCCTATTTCAATTTGTGG TGAAATTCAACCCAATATAAAGA 354 UW084848 TTTAAGCGCAACTCAACTCG GAAGGCTACTACCGTCTTTGTAT 355 UW084632 TTGTACGGATGTTCGGCTCT TCCTCCAACTGATCATCACC 356 UW084849 AAGGAGGGGACAAACAACATT TTCAAAAGCAAATTCATTACCC 357 UW041214 GGGAAGATCAATCGTCCAGA TCAAAGCATGATGATGAACGA 358 UW085088 CTGCGACATGCGATTTTCTA TTTAATTGGAATATTTCACAATAC 359 SSR00378 TCCCTAAAATTTCGACAACCC TTAGTATGGCTTGAACACCCA 360 SSR22203 GGTGAGCAAGGGTTTTCTTG AAGGCGTTCCGATGATTTTT 361 SSR10518 TCTAATTCGCTCCGGATGAT TTGCAGCGAACAATCCTGTA 362 UW082429 AGTTGTAGCCATGTGGAGGC AAATTTGCGTTAGTCTGATGGA 363 UW082557 CCACACTTCCTTCCTCATGC CAAAATAGTGGTTGCCCAAAA 364 UW084618 AATCCTCCATGGTTAGGGTAGA TGAAAATAAATGTGTTCCTGCAA 365 UW083140 CCACTTCCACTTTCACCACC TGAAACCAAAGTCCCACTCC 366 UW083192 CCCATCACTTACCCTTTCCA TCATGTCCGAAACCCCTTAC 367 SSR11909 AATAATACCAGTGGCCCCATC AAAGCTCCCTCCTCCCCTAC 368 SSR16916 AGCATGATGAGGATCCCTTG CCGAACTGCACAAAGTATGG Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 71 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 369 SSR12383 AACCATGGCTTAACGAGCAT TGCGAACTTTTTCCGTTTTC 370 UW084457 TCATAACTCCTTGGGGGTTG GTAAAGTTTGGATTCTATATGGTC 371 SSR15029 CCTGCTTCCCGTTCAAATTA TTGTTTCTCAGTCAAATAGCTTCG 372 SSR18640 GGCGTTGGGTTAAGCATTTA CGTGGGTTTTTACCGTCATT 373 SSR17769 CAATCAACTTCAAGTGTTGGGA AAAAGCTTCATTAGTCGCATGTT 374 SSR01573 CGTTAGGCCAAACAAAATTGA TGCAAACGTTTCTCTAGGCA 375 SSR02771 AAGTACACCAGCACTTGGGC CACACTCTTATGGCTTTCGTCA 376 SSR22545 TGATGAGCGATGCAGAGAAT TGCTTTGGTTTGGTGATTTG 377 SSR02051 CAGGTCATCTTCTCTTTGACTATACTT TGCTTTTATCCCCACTTTTCTT 378 UW084286 GATGAGATGGAGAGGGTTGG CACACGAAATAATGTCACTAAA 379 SSR03552 CCAACTTGGAAAATTGCTACA TTCAGTTCGCTCGTGAAAGA 380 UW079378 TGTTCTTCACATGCAATCCAA TTGAGCCAACACAAGAGAGC 381 SSR02132 CAATTGGTATGAGTGAAAGATAAGC CTCTGGTCCACCCAATCCT 382 SSR18428 CCATTCACTTCCTTTCCAGC TGGTTTCAAGACCACCCTCT 383 SSR20270 TTGGGATGTAGATGTCCGGT TCCCCAATCCAACTCCCTAT 384 SSR01056 AAAGGGAAAGGTAAATTGCCA AGCAGTTCGGATGATATTGGA 385 SSR07120 GATCAAAAGATCCAACTAATAACCA TCGTCCAAATAGTTGTTCTTACCA 386 SSR18311 GCGGATCAGAGAGGAAACAG GAAACAAACGTCCTCCTCCA 387 SSR05328 TGCAGACTGTAAAATAAATGGTGA CCGAGGCAGTAATCCAACAT 388 UW084838 GCAGCCTTATGCATTGTCTTT GGTCCTCATCCCTTGTATTCTG 389 SSR11397 GAGGATGAAATAGTTGTCACTGAA TGATGCCCAATAAAACCCTT 390 UW084840 NNACACGTAGTCAGAAAAACATATAAA TTAAACAAACCCAAATCTTTTCTT 391 UW084841 GACAAACATGTTAATCAGACACAAA TTGGCGGAGGTTAATCACAT 392 SSR06031 TGGGAAGAGAACCCTAGGAAA TTGCAATTACTCATCGCTGC 393 SSR23177 TGGATGAATGATGCCACAGT CAAAAGCCTGTCTTGGTAAAAA 394 SSR30236 TCAATTAAACGAGTGGCAAAGA GCCACGGGTTGACTACAAAT 395 SSR03066 CAAAACTTAAGGACCGAAAGGA ACATGGTTGGTTAGTGGCCT 396 SSR06791 TTTGTAGTTTGAGAACTCAAGTTGG TGGTGTTTGGTTGTCCTGAG 397 SSR10783 TGGGAAAATGGGAGTTTCAA CGAACCACCAGTATTGGACC 398 SSR07209 CTGTCTGCAGAGCCATCTGA CCATCAAGTTGAGGAGCAAA 399 SSR23549 TCACCCCCACTTTACTCCTC AGTCAATCAGTCAGCGCCTT 400 UW084401 CTTCATTCCCCCTTCCAAAT CGTCCATACATTGGGATCTTC 401 SSR14026 TACCGGAGAAATCATCGAGC TCGCTAAACTCCAACACGAA 402 UW018193 CATGCGATTCAATTGTGAAAA TGCAATTTGTCTCTTACACCTG 403 UW084415 TTCATTGAGTTTTACTAATGCCAAA GTCGTCGAAGCATTTTGTGA 404 SSR00012 TCTCACCATGGTCACCTAATG GGTCATTGAAGAGTCAAGTTGG 405 UW024693 TGAAAGAAAGATGGGGGAGA TTCCCCCTCAAATATTGCTG Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 72 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 406 SSR05899 TAAGAGCAAAAATCCCACGC AGCTCAATCAACGTCAAGAGAA 407 UW049135 TTATGAGGGGTCAGGTTGGA AAAAGGGGAAGGGAATTGTG 408 SSR22706 CATAAGCCTTTCAAGCTGGG CTGAGGTCTCCTGATGGAGG 409 UW058682 GGTGATGAGTTGGTTTTGTTCTT GCCAAAATCGTGGCATAAGT 410 UW058714 CAAGGGTTGGCCTGTTTTTA GGGGTGTGTGTGTGTGAGAG 411 UW083447 TGCTTGTGAAAGTCCTCGTG CTTTTGCTTTGCATCCCAGT 412 SSR06225 TGTATCATTCCAATCCCTCCA CGAAGTCCAAATTGATAAAGGC 413 SSR17389 AAGGACAAAGACAACATTAACAAAAA GGGTTCTACGAAGGAGAGCA 414 SSR11043 AGGTACGAAACAACGGCAAT TCGCACTCACTCTTTACCGA 415 SSR13456 ATGTGGGTGTGGAAAAATGG TAAAGGGGCAATTTGGTGAA 416 UW084381 TGACACGCTACCTTGAATTCTG AGGAACTGGAACTGCATGGT 417 SSR05415 GGGCATCATGACTAAATTCTCC GTCTTCCTGGGTTAGTGGGG 418 SSR03481 TGTCTGTCCTTTTCCCTCCTT AGAAACATGGTATGATATGTTGG 419 UW084598 TACCTCCATGCTCCATCACA TGGTGAAGTTAAAGGGTAAATCG 420 UW084449 TTTGTTTGTCGACCCAAAATAG TCCTTTATACTTGAAACCAAAAAG 421 SSR00276 CCAATTAATTATCCTCCCACGA AATTAAAGTGAGGAGTGGAATTT 422 SSR03820 AGAGGGCAAATTGGTGAATG TCCATCCTGTATGATTTGAGTTG 423 UW084372 GGCTCCATATGCCAAATGAC TGGTGAAAACTCCATGGTTG 424 SSR05515 TCATTTTGGCTGCAATTCAA GATTCTCCATCTCCACGCAT 425 UW084851 CCCAAATTACCTCATCAATTTTT TTTTTGAAGGATTTTGGGTATG 426 SSR18549 GACACATCGCATTTTCCAGA ATTAGGGGCTCCACAAAACA 427 UW084559 GGGGGAGATTGATAGTTGGAC CGCCTGTTCTTTCAACCATT 428 UW084196 TATCACCGCTTTGGATTATT CCCTTCCTCCTCATACTTTT 429 UW084295 GAGCAAGAACAGGAACAATC ATAGATATGTGGGTGTGGGA 430 UW084212 GACAACTGATAACCCATGCT TAATCATCCCCAACAATACC 431 UW084519 GGTAAGAGATGATCTTCGAAAGG TTCCATTCATATTCTTCCAATGC 432 UW084691 GTTGTCGTCGAGGTCCCTAT CTTTGCATGTAACGCCAAGT 433 SSR20165 CAATGGAGGAGGAGTTGGAG GGGGCAGGGTAGAAGAAATC 434 UW084351 GAAACACAAAGTTAAAACAAAAATCC GACATCACGACGTGGAACC 435 SSR07711 CCCAGGCATTTTCAAACACT ATGGTTGGTCCATCTTGCAC 436 UW084461 GGCTACAGGGACATAAATACACTT CGTTGTAATTACTTGGCCATCA 437 UW084654 GAAAACAGATTGATTGGTATCATTG CAAAGCAAGAAGTTTGGAGGT 438 UW084852 TCCACTAAATTTAACTTGGTATCAAAA CACTTGTGTGCAAGAAAATATTG 439 SSR10725 TGACCATCGGTGATAGAATTT CAAACCAACTCAACCTTGATAGA 440 SSR15321 TCAATGTAGGTAGAGCACCACG TCCAATTGCTTGACCAATGA 441 UW083711 AGCCTTGGTGAAAAGGAAAT GCCTACAATGACACACCAACC 442 UW002466 TGGAACCCAGAATCTAGCCTT GCCTACAATGACACACCAACC Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 73 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 443 UW084357 AAAACAAAACATAGTAATTAAGCCTTC TGAAATCTCTAGAAACAGGCGAC 444 SSR03529 TGAATTGAATAGACACAACAATATGC ACATGTTGGGACTCCATGTG 445 SSR00772 AGAAGCGTTGGGGGAAAATA TGCTACCTCACATGGTTTTG 446 SSR07100 CACACCATTTACGGTTATGGG CATTTGGTTCAGAAAGGGGA 447 SSR14180 TGGCAACATTGTGAATTGTG GAAGGGAGTACTGAGTTGCGA 448 UW084533 TTCCCTCTATCAACAATGTCCA TTTCCTTCTAAAAATTGAACTATC 449 SSR10911 CAGTACCAAGTCCCTTCCCA TGGGATCCTAACAACTCCATTT 450 SSR06303 AGCTCTCAACAACGAAGGGA TGACTTTCTTGATGGTACCGC 451 SSR15196 CAAACTTTGTTCAAAATCTCACCA AAAAGCAAACCTAGGGAGCA 452 UW084823 GGAAAGTGAAGAAGTAGGGTTTCA GGGTTTCCGCTGTTTCTTC 453 SSR03514 TAGGGTCCCCTTCCCTCATA GGGTACCCAAAAGCAAGTGA 454 SSR03943 TTTTTGGTGAAAAGGAACGTG CACAAAGCAAAATTGAGGGAA 455 SSR10224 AAGTGAGTTGCAATGGCTGA TCCATTGAGGTGATCTGAAAAA 456 SSR19343 ACCACGTGTATCTTCGCCTC TCAAATGCATTGAAGGCTGT 457 UW084824 AAGATCACTGCCTCAATCTCGTAT CTCACGTGCCGAGATTAAGAA 458 UW084820 AACCCTATGATTTAATTGGTTTTTC ACAAAACGCCAAAGTGGTTC 459 SSR16163 CCAATATTTGCATATGGTTTATCA CAATCTTTGCATTTTGCTTTTG 460 SSR11858 CCCTTCTCTCTCCTTCAATCC GTTTGCATGGTGAAATGTGG 461 SSR11219 GCCATTCAAGGTGTAAGACCA ATGTTGGTTGGGTTGGGTTA 462 SSR11343 GTGGGGTTGCTTTTGGATAA CAATGGTTGCTTTGCTTCAA 463 SSR02764 CCAAGAACCACAAAAGTGGC GTGAGGACGGAGATGAGAGC 464 SSR00019 ATTCTCGTGAACCATCACCC ACTTTTGCCACTTGGCACTT 465 SSR14290 TGAAACAAAATTCGAGGTGTGA TCACCACATTCTTTTTGGCA 466 SSR03940 GATTCTCCGGAAACGGATTT GTCGTTTTCCGCGATTCTAC 467 SSR21318 GACACCCCATTCCTCATCAT GCTTCATCACTCCCAATTCAG 468 SSR10954 TGCAAAACCAATTATTTGATATAGAGA TTTCGGCAAAAGAACTAGGAG 469 SSR10829 TGTAATGCCACGTCACACCT AAGCCAAAGGGGTTTGAAAT 470 SSR07248 CGATTGGAAAATATCGGCAC CGAATCGCCTTCAGTTCTTT 471 SSR03768 GATGCTTGTGAAAACTGGGG TTCCGTGGTTCAGTACCTTT 472 SSR13996 CAAATCTTAACCTTCTTTGCATCA TTGAATCCAACTCAAACTCATTG 473 SSR18564 CCAACGTTCCATATCCACCT AGTAGCCGACATGCATCAAA 474 UW084569 GATACAACCGCCGAGATCC TGTATTCCAATGCACTGTTGG 475 UW039897 CCCAGTTCGTGACTTTTCGT CCCAATTCTGTTTTCCTAATTGA 476 UW084428 GCCATGTTCACATGACCAAA CCCATGGATTCTTGGATCTG 477 SSR00126 TCCACTCTTGACCAATTTTGAG CACAAGAGGAAGCTATCGCA 478 SSR04252 AAAGAACACACATGGTGGTGG AAGGAGTGTTTGAATAGGCCG 479 SSR11985 GCTGCATTTCATTTAACGCTT TGGTCCATCCTCACCAATTT Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 74 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 480 SSR16005 CTCCACGAACCTTCCTTCAC ATTGTTGGGCTTGGTTCAAT 481 SSR21885 AAGATTCAGGAGGAGGGGAA AGTTCCACAAGGCACAGGTC 482 SSR19165 AATCCACGTTGGTTGTCGTT GAAGGGCCAAAAATGTTTCA 483 SSR13741 TTTCGCCCATGAAATTCTTC CAAAGAGGTTCACGTGGGTT 484 SSR10466 TGTTGTGAGCGGTTGTGATT CTGATGCTCACACGTGTCCT 485 SSR21936 TTGGTTGGAAAAAGGAAGGTT GGGCAGAGGCTTTTTCAATA 486 SSR01148 CGGAGAAAGGCTCAGAAACA TGCACGCACATAAACTAGGG 487 SSR21561 TTGGAATCAAACAAAGAAAGAAA GGCAAATTTTGGGTAGACGA 488 SSR00193 GCCAATCCAATGGAACAAGT TTGTAAACCAAAACCTTACCCC 489 SSR19755 TATCAGCGAGGGAAGGAAGA TAATTGCTGCATCGAAGACG 490 SSR19291 ATGGGAAGAAAAGTGGGACC AGATTTCCTCCCCAATTTCG 491 UW084828 TGAAATGACCCTAAAATTAAGCA TGTGTGTCTCCCAGTAGTGTTTG 492 SSR14861 ATTTCTTCCCCCACCAAAAC ATGAATCCTCCTCCCAGAGC 493 SSR18771 GCACGTGGGTCAAAGAATTT GTTGGTCAGCAAAAACGACA 494 UW084615 AAGGATTACATAAACCCTACCATGA AAGCAAAAATTGGCTGCTTTA 495 SSR18133 CGATTTCAAACAAATTGCTAACTG GGAGAGTCAAATCAAACATCCC 496 UW084364 CGGACGTTTTAGAGATTTTGC AAGTACTCCATGAGGGGGAAA 497 SSR05271 GGTACAATAGGGAGGCCCAT AGTGGGGGATGTAATGAAGG 498 UW085071 GGACTGAAATGCTATTTTCCA CAAGTGTTGTGTGATTATGAAGC 499 SSR05682 TGAAGGTTTTTCTCCAGCGT ATTCGCTCACTTCCGAAAAG 500 SSR20063 CCCACATTGGTCTCAACAAG GCAGTTATATTTTGAGGGGAGA 501 SSR17062 AGCTAGCCACGTAACACCGT CACTCTCAAAATTTAGCCACACA 502 UWSTS012 TTGGCTAATTTATGGTTGGTATG TCAAACTTCCTACCTCAACATTCA 503 UW084662 CACGGCTCTTATCGGTTAGT CACTAGGTCGTTCAAAGCAA 504 51-6CAPS CACACTCCTAAATTACGAAGTTGAAA AGATTTTCAGCCTTCATTCCA 505 UW062953 ACCAAATCGCTTCTGAGGTT GGCATGAAAGAAACACCGTT 506 51-14CAPS CGTGAACTCAACAAATAAAAAGACG AAACTGGGCAGCTAGAAAACA 507 UW084680 TGAGGCTTGATGGTTGTGTT CTTTATGCTGGATGATCCCC 508 UW084975 CAATCCTCGTTCATCGACAC GCCAACATCCACTTGTCAAC 509 CKX-indel GAAACGGTTCCAGGTAAGCA TCCCATTTCTTTATTTACTTCAGC 510 UW084979 CCTCACTGCCATTCTCTTCA CATTGGCCATTGTGAAAAAG 511 UW084686 AAACACCTTCTTGGTCCTACG GGACCCCTACCTAATGCTCA 512 UW084870 TTAATTTGGATTCGGCCTTC AAAATGGGGTGAGTGAGGAG 513 UW084875 CAAAACTCCCAAGGGAAAAA CATTCTTCTCGTCCCTCCAT 514 SSR18551 GATGTGCATGTGATCCAACAG TGAATCTACTTGGGTTCGTTGTT 515 UW084189 GAATCATGGAAGATTGGAGA TTTGGAAACACACAGATTCA 516 UW084033 GATATTTTTCCAACCTTCCC TGTGTGATTTTCATTGCTGT Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 75 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 517 UW084716 GATCCATTCCCCTTTCTTCA GAAAAGCATAGGACACGTCG 518 EC11 TCTTCGCAGTCACCATTTC CCTTCCTCTGTTTCTGTTCC 519 EC12 TATTCTTCTTTGCTACCCAT TAAGTTTATTTTCTGCTGTCTA 520 EC13 GCAATGAATCATGACCTCCA CTGAGAATTGGGAAGGGACA 521 EC15 ACCAAAAACAGACCCCTATG GAAAGGGAAAACAAACGAGG 522 EC18 TGCCATTTCATCGACTCTTC GCATTTCTGCTGTGGCTTAG 523 EC19 TTTCTCTCCAACTCACCCTG TACATCGGCTTTGCTCATCT 524 EC20 AAAGTTGCTCTTGTTTGTCC GAGGTGAATGGTGGTGGCT 525 EC22 CAGCAGAGAAACTCAATCCA CTGTTTACGGCTGCATTGGT 526 EC24 ACAACACAACCGCTTCTCGT TGAGCCCAAGCACATAACAG 527 EC27 GTTGGAAGGCACACAAAGTC CGAGATGATTGGAGGATGATG 528 EC28 CTGAGTTATGGGGAAAGCAA TGTTAGTGATGTTGTTGGACC 529 EC31 CTAACCAGCAGAACCCAATG GTATCCTGTTTCCAGCGAGA 530 EC34 GATCCCCATCATAATCACCC CAAAGGGCTACAATAACAAAC 531 EC35 ATCCACAACACAAAAACCAC AAGAAGAACAGCCAAGAATG 532 EC39 CCAAGTTTAAGTTATTTAGGAG GAAGAGGACGATAAAGATGA 533 EC41 AGCATGTGGAGGAGAAAGCA TTCATCATCGAGTGGGTCTG 534 EC47 CGATCTTTGTCATCCGACCT AGAACGAGCACGTTTTGAGC 535 EC49 CGTGTTTTCTCAGATTTCCCA CACTTCCCTTATCAACCCCA 536 EC50 GGAACAGGGAAATCCACCAT TCGCTTCATCTCCCTCCTCC 537 EC52 TCAAACACGAACCCGAAACG CAAGAAATTGCCAGGACGAG 538 EC56 TTTTTGGGGGTTTTTGAGAG AGCTTTGTTCCCTATCTTCC 539 CM01 TTGGAGGAGACAAAGGCATC TGCTTCAACCTCTTCTTCTGG 540 CM04 CATGGCGATGTTTTCTTTCA AAGGGAAAATTTTGGAAGTGG 541 CM05 TCCAACGAAATCCCACTGTT AGCCGTTCTTCCGGATAGTT 542 CM07 TTTCCCGCATTGATTTTCTC GAGAAACGCTTCCCACAAAC 543 CM09 GTCAAAAGCATCAGCAGCAA CAAGTTAGGCAAACCCCAAA 544 CM15 ACCATCCTCCCTTCCAAATC CAGAGAAGCAAGTGCAGCAG 545 CM16 TGCCTGTTGTGATTGAGGAG TTCTTCTTACCTCCGCCAAA 546 CM17 CCTTCATCATCATCATCGTCA GACCGGCAGTGGACATAGTT 547 CM21 CGGGGAATTTGTGCTCTATG CCCAAACAAAGCCAAAAGAA 548 CM22 AAGGATTTGGTGGTGCTGAC TTTCCATCTTGGGCTCCAAAC 549 CM23 TTCTTCATTTAGGGGCACTG AAAGGGGGCTCAACATTTTT 550 CM26 CCCTCGAGAAACCAGCAGTA CACCTCCGTTTTTCATCACC 551 CM28 GCCGCTGTAACGAATAATGG GAAGAAAACAGGGCATCCAA 552 CM30 TCAAACCTAAACCCTAAACCTAACC AGGATGATCGGGGAAGAAAT 553 CM33 TTGGCTTTTGGCTAATCTCC TGAAGGGGTAAAAAGGTTAAAAA Ek-1 devam. Hıyar SSR markırları ve primer sekans bilgileri 76 No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 554 CM38 TAGCATCTGATCGGAAAACC CAACCTCATCCGCCAAGAAT 555 CM39 GATTTCCCCTCCGAACTCTC TTGCCCTAAAACCCTCACAC 556 CM43 CTCTTCCAATCACCGCCTCT AAGGAGGAGCATGAGGGAAT 557 CM46 GCTCCGGCAAACCTTTTTAT GTGGACACGGTGATCACAAA 558 CM49 CCCCATCAGAAAGATGATGAA TCTTTGTTTCTTCAATGGGGTA 559 CM53 CTGCCGTGAAGGAGAAGAAC AGCCTCAATCCCCAATCTCT 560 CM55 CCTCTCTCTTTCCCCACCTC GAAACAGAAGGAGCCACAGC 561 CMAGN33 CTGTCTGCTATTCTCCACTTGG TGTATGCCACGTAGCGAAAC 562 CMAGN45 CCCACAAGAGAGAGAGAGAG GTGTGACAGGTAGATTGTTGG 563 CMAGN52 CCACCAACATAACACACAAC CTCTCACACTGTTGGGAAGA 564 CMAGN61 GGAGACACAAGGAATATGTG ATAACAAAGGGGCATAACAC 565 CMAGN68 GGAAGGAAATTAGCATGCAC GCCACTCTGTCTTTCTTCC 566 CMAGN73 ATCCAACTCGACCAAGAAAC CAGCTCTACAACAACATCTC 567 CMAGN75 TGGGTTTTCTTCTACTACTG TGCTTTTACTCTCATTCAAC 568 CMAGN79 CTTCACTAAAACTACAAGAG TTCCAACTTATTCATCCCAC 569 CMAT141 AAGCACACCACCACCCGTAA GTGAATGGTATGTTATCCTTG 570 CMAT35 GTGGGTCATCATTATTGTTA GCTTTTAGCCTATTAAGTTGC 571 CMATN101 GCTTGTCTTTGTGTTTGC GAGAACAAGACTCCTTAATCC 572 CMATN22 CGGCAATCATCTTATCTTTC AAGATTGAAGTGGGAAAATG 573 CMATN89 CACTACCTTAAAACAGAATTG GGACAATTTAGGGAGGATC 574 CMBR1 AGATGACCAAACCAAACCCA CAACGTTATGGGGATGAAGG 575 CMBR10 CCGTTTGGATTCAGGCTAGA ACCGGTTATCAAGGGTCCAT 576 CMBR100 GGACCAAACCAAACCCATTA ATGGGGATGAAGGGAGAAAG 577 CMBR101 GGTATTATTTGCCCCCACCT CAAAAGGAAAAGATAGGCCC 578 CMBR102 GGGAGCCCCTCATTTTCTC TTTTCAACCAACATCCACCC 579 CMBR103 TGGTTGAGGAAGACTACCATCC TCCACTAAAGTTTCCTTATGTTAT 580 CMBR104 CAAAAGGAAAAGAAAAAGACCAAA GGTATTATTTGCCCCCACCT 581 CMBR105 TGGTAAGCATTTTGAAATCACTTTT TTTGTATGGTTGGAGGGGAA 582 CMBR106 GTACCTCCGCCGTTGATCT TGAGATAATAAGAAATCCAACCC 583 CMBR107 TATGAAGCGCGCATAAACAG CGAATGTGAAATCTCTTCTCCC 584 CMBR108 TGTATTGCCACCGTGTCC GGCAAAGAAGAAGGAAGAGTGA 585 CMBR109 TGGAATGTACCGTGATGGGT ATACAGCAGATCCACAGGGG 586 CMBR011 CGTCAAAGATGAACATGGGA CCGCCAAGTTATTTTAGGTG Ek-2. SRAP primer kombinasyonları ve sekans bilgileri 77 Primer No Primer Adı Primer Sekansı Primer No Primer Adı Primer Sekansı 1 ME1 TGAGTCCAAACCGGATA 1 EM1 GACTGCGTACGAATTAAT 2 ME2 TGAGTCCAAACCGGAGC 2 EM2 GACTGCGTACGAATTTGC 3 ME3 TGAGTCCAAACCGGAAT 3 EM3 GACTGCGTACGAATTGAC 4 ME4 TGAGTCCAAACCGGACC 4 EM4 GACTGCGTACGAATTTGA 5 ME5 TGAGTCCAAACCGGAAG 5 EM6 GACTGCGTACGAATTGCA 6 ME6 TGAGTCCTTTCCGGTAA 6 EM8 GACTGCGTACGAATTCTG 7 ME7 TGAGTCCTTTCCGGTCC 7 EM9 GACTGCGTACGAATTGAT 8 ME8 TGAGTCCTTTCCGGTGC 8 EM14 GACTGCGTACGAATTCAG 9 ME9 TGAGTCCAAACCGGAGG 9 EM18 GACTGCGTACGAATTCCT 10 ME10 TGAGTCCAAACCGGAAA 10 EM20 GACTGCGTACGAAATTCTT 11 ME11 TGAGTCCAAACCGGAAC 12 ME12 TGAGTCCAAACCGGTAG 13 ME13 TGAGTCCAAACCGGCAT 14 ME14 TGAGTCCAAACCGGTCT 15 ME21 TGAGTCGTATCCGGTCT 16 ME22 TGAGTCGTATCCGGAGT 17 ME23 TGAGTCGTCTACGGTAG Ek-3. InDel primer sekans bilgileri No Markır Adı İleri Primer Sekansı Geri Primer Sekansı 1 AB032936_2 TCTCAACCATTCCTAAGACGG GTTGTGAGTTATGAGGAGATTG 2 CM1.15 ATTTCTTTTTCCTAATATTTAAC GAGAACTAATTCGTATGGTTTA 3 CM1.41 TTCATTTCAGATCTGGCTCTCTG AACAGCCTGAAAGTGAACCT 4 CM2.20 GATGATGGTTGAAGTTGGAGA TCATCACCAAAATGTTCATTAAGC 5 EAACMCAC391-395STS GAATTCAACCAAAAACCATAATCA ATATCAGGTCAAATCTATAATCCC 6 EAAGMCAG154STS GAATTCAAGGGCAGTGGTGCAAC TTAACAGAGTCTCCTCACCCTGATTT 7 EAAGMCAT280-282STS AACACTCCTGCTTTAACAGCATC AATGTAATCGTCATTCAGCAGTGT 8 EAAGMCTG171-179STS GAATTCAAGGTTATTTTCTCATCA TTAACTGGCAAGCGTTCTTCTAAG 9 L18-2H19A CCATCATAGTCAAATAAGAAATGA GGTAGATATGTGTGCGCTATTTTG 10 MC224 GCTTGCTACTTAACGTTTG GACATGCATAATGTGAGAAG 11 N6-1RTRANS TCTATGATTTTCAACAATTGGAAG GGTTTTCTTAAATAGAAGAACACC Ek-4. 308 adet AFLP primer kombinasyonları 78 M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- M- CA CA CA CC CT CC CG CG CC CT CT CG CG CT CAT CG CC CT CG CA C G A A C G T A T G T C G A E- AC X X X X X X X X X X X X X X X X X X A E- AA X X X X X X X X X X X X X X X X X X C E- AA X X X X X X X X X X G E- AC X X X X X X X X X X C E- AC X X X X X X C E- AA X X X X X X G E- X X X X X X X X X X X X X X X TA E- X X X X X X X X X X X X X X X TG E- X X X X X X X X X X X X X X X CC E- X X X X X X X X X X X X X X X CT E- X X X X X X X X X X X X X X X AT E- X X X X X X X X X X X X X X X AA E- X X X X X X X X X X X X X X X CG E- X X X X X X X X X X X X X X X CA E- X X X X X X X X X X X X X X X AG E- X X X X X X X X X X X X X X X TT E- X X X X X X X X X X X X X X X TC E- X X X X X X X X X X X X X X X AC E- X X X X X X X X X X X X X X X GG E- X X X X X X X X X X X X X X X GT E- X X X X X X X X X X X X X X X GC E- X X X X X X X X X X X X X X X CA Ek-5. DAS-ELISA testleri sonucu elde edilen F2 populasyonu ZYMV dayanıklılık sonuçları 79 Negatif Pozitif TEST SIRASI BİTKİ NUMARASI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ANA EBEVEYN N N N N N N N N N N 10 0 N BABA EBEVEYN P P P P P P P P P P 0 10 P 1 F2_1_1 N N N P N N N N P P 7 3 NP 2 F2_1_2 P P P P P P P P P N 1 9 P 3 F2_1_3 P P P P N N P P N P 3 7 NP 4 F2_1_4 N P N N P N N N N N 8 2 N 5 F2_1_5 N P N N N N P N N N 8 2 N 6 F2_1_6 P x x x x x x x x x 0 1 7 F2_1_7 N P P P N N N P N N 6 4 NP 8 F2_1_8 P P P P P P P P N P 1 9 P 9 F2_1_9 N P P P P P P P P P 1 9 P 10 F2_1_10 N N N P P N N N N N 7 3 NP 11 F2_1_11 P P P P N P P P P P 1 9 P 12 F2_1_12 P N P N P P N P N P 4 6 NP 13 F2_1_13 P N N N N N N N N P 8 2 N 14 F2_1_14 P P N N P x P P P P 2 7 P 15 F2_1_15 P P P P N x P P P P 3 7 NP 16 F2_1_16 N N P N N N P P P N 6 4 NP 17 F2_1_17 P P P N N P P N N P 4 6 NP 18 F2_1_18 P P P P P P P P P P 0 10 P 19 F2_1_19 P P N P N N P x P P 3 6 NP 20 F2_1_20 N N P P P P N P P P 3 7 NP 21 F2_1_21 P P N P P P P N N N 4 6 NP 22 F2_1_22 N P N P N P P P P x 3 6 NP 23 F2_1_23 N P N P N P P P P N 4 6 NP 24 F2_1_24 P N x N N x N P P N 5 4 NP 25 F2_1_25 P P N P N P P P N P 3 7 NP 26 F2_1_26 P P P N N P x P P N 3 6 NP 27 F2_1_27 P P P P P P x P P P 0 9 P 28 F2_1_28 P N x x N N N N N N 8 1 N 29 F2_1_29 P N P N N N N P P P 5 5 NP 30 F2_1_30 N P N N N P N N N N 8 2 N 31 F2_1_31 N N P P N N P P N x 5 4 NP 32 F2_1_32 N N N N N N N N P N 9 1 N 33 F2_1_33 x N N N N N N x N N 8 0 N Ek-5 devam. DAS-ELISA testleri sonucu elde edilen F2 populasyonu ZYMV dayanıklılık sonuçları 80 Negatif Pozitif BİTKİ NUMARASI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 34 F2_1_34 N P N N N N N N N N 9 1 N 35 F2_1_35 P N P N N N P P P P 4 6 NP 36 F2_1_36 N N P P N N P N P x 5 4 NP 37 F2_1_37 N N N N N N N N P P 8 2 N 38 F2_1_38 N P N P N P N N P N 6 4 NP 39 F2_1_39 P P P P P P P P P P 0 10 P 40 F2_1_40 P P x P x P P P P P 0 8 P 41 F2_1_41 P P P P P P P P P P 0 10 P 42 F2_1_42 P N P P N N N N P P 5 5 NP 43 F2_1_43 P N N P N P P P P P 3 7 NP 44 F2_1_44 P P P P P P P P P P 0 10 P 45 F2_1_45 P P N N P N P P P P 3 7 NP 46 F2_1_46 P P P P P x N N P N 3 6 NP 47 F2_1_47 N N P P P P P N N N 5 5 NP 48 F2_1_48 N N N N N N N N P P 8 2 N 49 F2_1_49 N P N N N N N N N N 9 1 N 50 F2_1_50 N N N N N N N N N N 10 0 N 51 F2_1_51 P P N x N N P N P N 5 4 NP 52 F2_1_52 N N x x x x x x x x 2 0 53 F2_1_53 N N x N N x N N N N 8 0 N 54 F2_1_54 N N P N N N N N x x 7 1 N 55 F2_1_55 N P N N N N N N N N 9 1 N 56 F2_1_56 N N N N N N P N P N 8 2 N 57 F2_1_57 x N N N N P x x N N 6 1 N 58 F2_1_58 N x N P P N P x x x 3 3 59 F2_1_59 N N P P x N P N P N 5 4 NP 60 F2_1_60 P x N x P P P N x N 3 4 61 F2_1_61 N N N N x N P N x N 9 1 N 62 F2_1_62 P N P P P P N P P N 3 7 NP 63 F2_1_63 P N P N N x N x x x 4 2 64 F2_1_64 N N N N N N N N N N 10 0 N 65 F2_1_65 N N N N N N P N N N 9 1 N 66 F2_1_66 N P P P P N N N N P 5 5 NP 67 F2_1_67 N N P N N N x N N N 8 1 N 68 F2_1_68 N x N N N N N N N N 9 0 N Ek-5 devam. DAS-ELISA testleri sonucu elde edilen F2 populasyonu ZYMV dayanıklılık sonuçları 81 Negatif Pozitif BİTKİ NUMARASI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 69 F2_1_69 P P P P P P P P P P 0 10 P 70 F2_1_70 P P P P P P P P P P 0 10 P 71 F2_1_71 P P P P P N N N P P 3 7 NP 72 F2_1_72 N N N N N N N N N N 10 0 N 73 F2_1_73 P P P P N P P N N P 3 7 NP 74 F2_1_74 P P N P P P P P P P 1 9 P 75 F2_1_75 N P P N N P P P P P 3 7 NP 76 F2_1_76 P P P P P P P P P P 0 10 P 77 F2_1_77 N N N N N x x N N N 8 0 N 78 F2_1_78 P P P P P N N P P P 2 8 P 79 F2_1_79 N N P N P P N P P P 4 6 NP 80 F2_1_80 N P N N N P N P P P 5 5 NP 81 F2_1_81 P P P P P x P P P P 0 9 P 82 F2_1_82 P P P P x P P P P P 0 9 P 83 F2_1_83 N P P N N x N P P N 5 4 NP 84 F2_1_84 N P N N N P N N N N 8 2 N 85 F2_1_85 N P N x N x P N N P 5 3 NP 86 F2_1_86 x P x P P P P P P P 0 8 P 87 F2_1_87 N N P P P P P P P P 2 8 P 88 F2_1_88 P N P P x P P P P P 1 8 P 89 F2_1_89 x x P N N P x P P x 2 4 90 F2_1_90 P P P P P x P P x x 0 7 P 91 F2_1_91 N N P N P N N N N N 8 2 N 92 F2_1_92 P N P P P x P N P P 2 7 NP 93 F2_1_93 N P N P P N P P x N 4 5 NP 94 F2_1_94 N x P P P P P P P P 1 8 P 95 F2_1_95 P P P P P P P P P P 0 10 P 96 F2_1_96 P P P P P P x P P P 0 9 P 97 F2_1_97 P P P x P P P P P P 0 9 P 98 F2_1_98 P P P x P P P P P P 0 9 P 99 F2_1_99 P P P P P P P P x P 0 9 P 100 F2_1_100 P P P P P P P P P P 0 10 P 101 F2_1_101 P P P P P P P P P P 0 10 P 102 F2_1_102 P P P P P P P P P x 0 9 P 103 F2_1_103 P P P P P P P P P x 0 9 P Ek-5 devam. DAS-ELISA testleri sonucu elde edilen F2 populasyonu ZYMV dayanıklılık sonuçları 82 Negatif Pozitif BİTKİ NUMARASI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 104 F2_1_104 P P P P x P P P x x 0 7 P 105 F2_1_105 P P P P P P P P P x 0 9 P 106 F2_1_106 P P P P P P N P P x 1 8 P 107 F2_1_107 P N P P N P P P P N 3 7 NP 108 F2_1_108 P P P P P P P P P P 0 10 P 109 F2_1_109 x P P P P x N N N x 3 4 NP 110 F2_1_110 P P P N N x P P x x 2 5 NP 111 F2_1_111 P P N N P N N P P P 4 6 NP 112 F2_1_112 N P P x P P N N x P 3 5 NP 113 F2_1_113 P P N P N P x x P x 2 5 NP 114 F2_1_114 x x P P N P P P P N 2 6 NP 115 F2_1_115 P N P P P P P P N N 3 7 NP 116 F2_1_116 P N N N N P N N N N 8 2 N 117 F2_1_117 P P P N N x x x x x 2 3 NP 118 F2_1_118 N P P P P P P P N P 2 8 NP 119 F2_1_119 N N N N N N N N N N 10 0 N 120 F2_1_120 P x P P P P P x x P 0 7 P 121 F2_1_121 P N P P P N N P P P 3 7 NP 122 F2_1_122 N N N P N P N P P P 5 5 NP 123 F2_1_123 N x P N N N N P P x 5 3 NP 124 F2_1_124 P P P P P P N N P N 3 7 NP 125 F2_1_125 P N N N P P P P P P 3 7 NP 126 F2_1_126 P N N P P P P N P P 3 7 NP 127 F2_1_127 N P P N N P P x N x 4 4 NP 128 F2_1_128 N N x x x x x x x x 2 0 129 F2_1_129 N N P P P N N P N x 5 4 NP 130 F2_1_130 N P N N P N N N N x 7 2 N 131 F2_1_131 N N N N P N N N x x 7 1 N 132 F2_1_132 N N N P N N N N N P 8 2 N 133 F2_1_133 P P P N N P N P P N 4 6 NP 134 F2_1_134 N N N N P P N N N N 8 2 N 135 F2_1_135 P P P N P N N N P P 4 6 NP 136 F2_1_136 N N P N P N N P P P 5 5 NP 137 F2_1_137 P N N N N N N N N N 9 1 N Ek-5 devam. DAS-ELISA testleri sonucu elde edilen F2 populasyonu ZYMV dayanıklılık sonuçları 83 Negatif Pozitif BİTKİ NUMARASI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 139 F2_1_139 N P P P P P N P N N 4 6 NP 140 F2_1_140 P P N N P P P P P N 3 7 NP 141 F2_1_141 P N P P P N N P P P 3 7 NP 142 F2_1_142 N N N P N P N P P P 5 5 NP 143 F2_1_143 N x P N N N N P P x 5 3 NP 144 F2_1_144 P P P P P P N N N x 3 6 NP 145 F2_1_145 P N N N P P P P P P 3 7 NP 146 F2_1_146 P N N P P P P N P P 3 7 NP 147 F2_1_147 N P P N N P P x N x 4 4 NP 148 F2_1_148 N N x x x x x x x x 2 0 149 F2_1_149 N N N P N N N N N N 9 1 N 150 F2_1_150 P P P P N P P P P P 1 9 P 151 F2_1_151 P N P N P P N P N P 4 6 NP 152 F2_1_152 P N N N N N N N N P 8 2 N 153 F2_1_153 P P N N P P P P x x 2 6 154 F2_1_154 N N N N N N P N N N 9 1 N 155 F2_1_155 x N N N N P x x N N 9 1 N 156 F2_1_156 N x N P P N P x x x 3 3 NP 157 F2_1_157 N P P P N N N P N N 6 4 NP 158 F2_1_158 P P P P P P P P N P 1 9 P 159 F2_1_159 N P P P P P P P P P 1 9 P 160 F2_1_160 N N N P P N N N N N 8 2 N 161 F2_1_161 P P P P N P P P P P 1 9 P 162 F2_1_162 P N P N P P N P N P 4 6 NP 163 F2_1_163 P N P P P x P N P P 2 8 P 164 F2_1_164 N P P N N x N P P N 5 4 NP 165 F2_1_165 N P N N N P N N P P 6 4 NP 166 F2_1_166 N P N x N x P N N P 5 3 NP 167 F2_1_167 x P x N x P x P P P 1 5 168 F2_1_168 N N P P P P N P P P 3 7 NP 169 F2_1_169 P N P P x P P P P P 1 8 P 170 F2_1_170 x x P N N P x P P x 2 4 171 F2_1_171 P P P P P x P P x x 0 7 NP 172 F2_1_172 P N N N P N N N N N 8 2 N 173 F2_1_173 P N P P P x P N N P 3 6 NP Ek-5 devam. DAS-ELISA testleri sonucu elde edilen F2 populasyonu ZYMV dayanıklılık sonuçları 84 Negatif Pozitif BİTKİ NUMARASI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 174 F2_1_174 N P N P P N P P x N 4 5 NP 175 F2_1_175 N x P P P P P P P P 1 8 P 176 F2_1_176 P N P P P N N P P P 3 7 NP 177 F2_1_177 N N N P N P N P P P 5 5 NP 178 F2_1_178 N x P N N N N P P x 5 3 NP 179 F2_1_179 P P P P P P N N P x 2 8 P 180 F2_1_180 P N N N P P P P P P 3 7 NP 181 F2_1_181 P N N P P P P N P P 3 7 NP 182 F2_1_182 N P P N N P P x N x 4 4 NP 183 F2_1_183 N N x x x x x x x x 2 0 184 F2_1_184 N N P P P N N P N x 5 4 NP 185 F2_1_185 N P N N P N N N N N 8 2 N 186 F2_1_186 P P P P N P P P P P 1 9 P 187 F2_1_187 P N P N P P N P N P 4 6 NP 188 F2_1_188 P N N N N P N N N N 8 2 N 189 F2_1_189 P P N N P P P P x x 2 8 P 190 F2_1_190 P P P P N x P P N P 3 7 NP 191 F2_1_191 N N P N N N N N N N 9 1 N 192 F2_1_192 P P P N N P P N N P 4 6 NP 193 F2_1_193 N P N N N P N N N N 8 2 N 194 F2_1_194 N P N x N x P N N P 5 3 NP 195 F2_1_195 x P x N x P x P P P 1 5 196 F2_1_196 N N P P P P P P P P 2 8 P 197 F2_1_197 P N P P x P P P P P 1 8 P 198 F2_1_198 x x P N N P x P P x 2 4 199 F2_1_199 P P P P P x P P x x 0 9 P 200 F2_1_200 P P N N N N N N N N 8 2 N Ek-6. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin DNA miktar ve kaliteleri Numara Bitki Kodu dsDNA Birim 260/280 260/230 A230 A260 A280 A340 85 1 BTL_HTP_1-1 56,6 µg/mL 1,130 0,990 0,114 0,113 0,100 0,066 2 BTL_HTP_1-2 119,9 µg/mL 1,170 1,040 0,231 0,240 0,205 0,149 3 BTL_HTP_1-3 74,0 µg/mL 1,380 1,250 0,118 0,148 0,107 0,041 4 BTL_HTP_1-4 30,3 µg/mL 1,760 1,980 0,031 0,061 0,034 0,000 5 BTL_HTP_1-5 64,2 µg/mL 1,360 1,190 0,108 0,128 0,094 0,043 6 BTL_HTP_1-6 60,2 µg/mL 1,370 1,270 0,095 0,120 0,088 0,041 7 BTL_HTP_1-7 290,6 µg/mL 1,130 1,000 0,581 0,581 0,515 0,403 8 BTL_HTP_1-8 246,8 µg/mL 1,090 0,970 0,507 0,494 0,454 0,376 9 BTL_HTP_1-9 325,8 µg/mL 1,160 1,010 0,643 0,652 0,562 0,402 10 BTL_HTP_1-10 69,9 µg/mL 1,300 1,060 0,132 0,140 0,108 0,057 11 BTL_HTP_1-11 332,6 µg/mL 1,160 1,060 0,629 0,665 0,574 0,431 12 BTL_HTP_1-12 11,5 µg/mL 1,370 1,340 0,017 0,023 0,017 0,007 13 BTL_HTP_1-13 57,8 µg/mL 1,350 1,090 0,106 0,116 0,086 0,041 14 BTL_HTP_1-14 323,9 µg/mL 1,160 0,840 NaN 0,648 0,557 0,389 15 BTL_HTP_1-15 167,1 µg/mL 1,350 1,160 0,289 0,334 0,248 0,121 16 BTL_HTP_1-16 149,1 µg/mL 1,330 1,230 0,242 0,298 0,224 0,120 17 BTL_HTP_1-17 268,5 µg/mL 1,170 1,000 0,539 0,537 0,460 0,339 18 BTL_HTP_1-18 296,7 µg/mL 1,190 0,900 0,659 0,593 0,498 0,336 19 BTL_HTP_1-19 112,1 µg/mL 1,380 1,000 0,224 0,224 0,162 0,072 20 BTL_HTP_1-20 186,5 µg/mL 1,260 0,960 0,388 0,373 0,297 0,174 21 BTL_HTP_1-21 265,5 µg/mL 1,190 0,970 0,549 0,531 0,447 0,300 22 BTL_HTP_1-22 472,1 µg/mL 1,060 1,000 0,940 0,944 0,888 0,781 23 BTL_HTP_1-23 226,1 µg/mL 1,220 1,000 0,452 0,452 0,370 0,235 24 BTL_HTP_1-24 127,5 µg/mL 1,210 0,960 0,267 0,255 0,210 0,140 25 BTL_HTP_1-25 63,3 µg/mL 1,330 0,960 0,132 0,127 0,095 0,048 26 BTL_HTP_1-26 155,2 µg/mL 1,250 1,130 0,274 0,310 0,248 0,166 27 BTL_HTP_1-27 67,6 µg/mL 1,450 1,260 0,108 0,135 0,093 0,039 28 BTL_HTP_1-28 87,3 µg/mL 1,350 1,320 0,132 0,175 0,130 0,071 29 BTL_HTP_1-29 168,6 µg/mL 1,320 0,980 0,344 0,337 0,255 0,132 30 BTL_HTP_1-30 335,8 µg/mL 1,100 1,010 0,666 0,672 0,613 0,514 31 BTL_HTP_1-31 195,7 µg/mL 1,370 1,140 0,342 0,391 0,286 0,137 32 BTL_HTP_1-32 162,7 µg/mL 1,290 0,870 0,375 0,325 0,252 0,130 33 BTL_HTP_1-33 147,7 µg/mL 1,250 1,010 0,293 0,295 0,236 0,139 34 BTL_HTP_1-34 104,1 µg/mL 1,330 1,130 0,185 0,208 0,157 0,080 35 BTL_HTP_1-35 159,3 µg/mL 1,200 0,890 0,357 0,319 0,265 0,176 36 BTL_HTP_1-36 104,5 µg/mL 1,120 1,010 0,207 0,209 0,186 0,145 37 BTL_HTP_1-37 52,4 µg/mL 1,240 1,060 0,099 0,105 0,085 0,044 Ek-6 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin DNA miktar ve kaliteleri 86 Numara Bitki Kodu dsDNA Birim 260/280 260/230 A230 A260 A280 A340 38 BTL_HTP_1-38 178,6 µg/mL 1,150 0,940 0,379 0,357 0,312 0,223 39 BTL_HTP_1-39 179,2 µg/mL 1,150 NaN 0,387 0,358 0,312 NaN 40 BTL_HTP_1-40 109,3 µg/mL 1,180 1,000 0,219 0,219 0,185 0,127 41 BTL_HTP_1-41 25,6 µg/mL 1,270 0,980 0,052 0,051 0,040 0,021 42 BTL_HTP_1-42 140,4 µg/mL 1,180 0,940 0,297 0,281 0,237 0,160 43 BTL_HTP_1-43 40,3 µg/mL 1,530 1,250 0,064 0,081 0,053 0,013 44 BTL_HTP_1-44 112,4 µg/mL 1,230 1,080 0,209 0,225 0,183 0,115 45 BTL_HTP_1-45 144,4 µg/mL 1,230 1,000 0,288 0,289 0,235 0,152 46 BTL_HTP_1-46 785,7 µg/mL 1,020 0,990 1,580 1,571 1,534 1,439 47 BTL_HTP_1-47 347,4 µg/mL 1,090 1,010 0,689 0,695 0,635 0,555 48 BTL_HTP_1-48 43,0 µg/mL 1,120 0,940 0,092 0,086 0,077 0,056 49 BTL_HTP_1-49 109,9 µg/mL 1,150 0,950 0,232 0,220 0,191 0,136 50 BTL_HTP_1-50 90,8 µg/mL 1,060 1,000 0,182 0,182 0,172 0,149 51 BTL_HTP_1-51 127,9 µg/mL NaN NaN NaN NaN NaN NaN 52 BTL_HTP_1-52 98,0 µg/mL 1,150 1,040 0,189 0,196 0,171 0,130 53 BTL_HTP_1-53 155,2 µg/mL 1,180 1,120 0,278 0,310 0,264 0,186 54 BTL_HTP_1-54 98,5 µg/mL 1,280 1,120 0,176 0,197 0,154 0,092 55 BTL_HTP_1-55 107,8 µg/mL 1,250 1,070 0,201 0,216 0,173 0,110 56 BTL_HTP_1-56 166,4 µg/mL 1,200 1,010 0,329 0,333 0,278 0,185 57 BTL_HTP_1-57 126,4 µg/mL 1,160 1,050 0,241 0,253 0,217 0,161 58 BTL_HTP_1-58 28,1 µg/mL 1,530 1,420 0,040 0,056 0,037 0,010 59 BTL_HTP_1-59 43,6 µg/mL 1,480 NaN 0,059 0,087 0,059 NaN 60 BTL_HTP_1-60 123,7 µg/mL 1,250 1,070 0,232 0,247 0,197 0,117 61 BTL_HTP_1-61 715,3 µg/mL 1,040 1,010 1,414 1,431 1,376 1,228 62 BTL_HTP_1-62 105,1 µg/mL 1,290 1,040 0,203 0,210 0,162 0,086 63 BTL_HTP_1-63 1267,9 µg/mL 1,040 NaN NaN 2,536 2,431 2,289 64 BTL_HTP_1-64 81,9 µg/mL 1,420 1,250 0,131 0,164 0,115 0,049 65 BTL_HTP_1-65 169,3 µg/mL 1,440 1,320 0,257 0,339 0,236 0,088 66 BTL_HTP_1-66 282,9 µg/mL 1,220 1,050 0,537 0,566 0,465 0,301 67 BTL_HTP_1-67 456,5 µg/mL 1,140 1,030 0,886 0,913 0,803 0,606 68 BTL_HTP_1-68 171,3 µg/mL 1,230 1,030 0,333 0,343 0,278 0,173 69 BTL_HTP_1-69 281,7 µg/mL 1,180 1,040 0,540 0,563 0,477 0,335 70 BTL_HTP_1-70 200,6 µg/mL 1,190 0,990 0,405 0,401 0,338 0,233 71 BTL_HTP_1-71 106,8 µg/mL 1,300 1,060 0,202 0,214 0,164 0,091 72 BTL_HTP_1-72 149,4 µg/mL 1,310 1,060 0,281 0,299 0,228 0,125 73 BTL_HTP_1-73 244,1 µg/mL 1,220 0,890 0,549 0,488 0,399 0,245 Ek-6 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin DNA miktar ve kaliteleri 87 Numara Bitki Kodu dsDNA Birim 260/280 260/230 A230 A260 A280 A340 74 BTL_HTP_1-74 431,9 µg/mL 1,060 1,040 0,832 0,864 0,818 0,714 75 BTL_HTP_1-75 279,5 µg/mL 1,250 0,950 NaN 0,559 0,446 0,265 76 BTL_HTP_1-76 751,7 µg/mL 1,080 1,000 1,511 1,503 1,388 1,169 77 BTL_HTP_1-77 70,1 µg/mL 1,720 1,570 0,090 0,140 0,082 0,007 78 BTL_HTP_1-78 84,8 µg/mL 1,560 1,390 0,122 0,170 0,109 0,030 79 BTL_HTP_1-79 217,9 µg/mL 1,290 1,040 0,420 0,436 0,337 0,189 80 BTL_HTP_1-80 71,0 µg/mL 1,560 1,420 0,100 0,142 0,091 0,025 81 BTL_HTP_1-81 331,1 µg/mL 1,220 0,910 0,731 0,662 0,544 0,342 82 BTL_HTP_1-82 88,5 µg/mL 1,300 1,220 0,145 0,177 0,136 0,064 83 BTL_HTP_1-83 149,8 µg/mL 1,240 1,100 0,271 0,300 0,242 0,158 84 BTL_HTP_1-84 93,6 µg/mL 1,260 1,060 0,177 0,187 0,149 0,092 85 BTL_HTP_1-85 771,2 µg/mL 1,080 0,960 1,606 1,542 1,432 1,196 86 BTL_HTP_1-86 88,3 µg/mL 1,090 0,870 0,202 0,177 0,162 0,136 87 BTL_HTP_1-87 54,1 µg/mL 1,600 1,210 0,089 NaN 0,068 0,013 88 BTL_HTP_1-88 286,8 µg/mL 1,160 0,960 0,596 0,574 0,496 0,362 89 BTL_HTP_1-89 178,3 µg/mL 1,300 1,090 0,328 0,357 0,275 0,162 90 BTL_HTP_1-90 284,4 µg/mL 1,330 1,040 0,548 0,569 0,429 0,223 91 BTL_HTP_1-91 191,8 µg/mL 1,300 1,080 0,354 0,384 0,296 0,167 92 BTL_HTP_1-92 342,0 µg/mL 1,190 0,960 0,710 0,684 0,575 0,393 93 BTL_HTP_1-93 179,1 µg/mL 1,200 1,020 0,351 0,358 0,298 0,199 94 BTL_HTP_1-94 268,9 µg/mL 1,220 0,950 0,566 0,538 0,439 0,282 95 BTL_HTP_1-95 472,8 µg/mL 1,110 0,970 0,973 0,946 0,850 0,679 96 BTL_HTP_1-96 53,1 µg/mL 1,560 1,390 0,076 0,106 0,068 0,020 97 BTL_HTP_1-97 35,4 µg/mL 1,250 1,020 0,070 0,071 0,057 0,036 98 BTL_HTP_1-98 198,6 µg/mL 1,210 0,970 0,411 0,397 0,330 0,218 99 BTL_HTP_1-99 114,1 µg/mL 1,090 0,940 0,243 0,228 0,209 0,177 100 BTL_HTP_1-100 195,9 µg/mL 1,090 1,030 0,380 0,392 0,361 0,317 101 BTL_HTP_1-101 277,7 µg/mL 1,100 1,050 0,527 0,555 0,506 0,419 102 BTL_HTP_1-102 294,2 µg/mL 1,080 1,020 0,577 0,588 0,543 0,474 103 BTL_HTP_1-103 277,9 µg/mL 1,110 0,970 0,574 0,556 0,500 0,413 104 BTL_HTP_1-104 334,2 µg/mL 1,160 1,030 0,648 0,668 0,576 0,436 105 BTL_HTP_1-105 207,5 µg/mL 1,150 1,060 0,393 0,415 0,361 0,278 106 BTL_HTP_1-106 58,8 µg/mL 1,530 1,370 0,086 0,118 0,077 0,027 107 BTL_HTP_1-107 170,8 µg/mL 1,170 1,040 0,328 0,342 0,293 0,213 108 BTL_HTP_1-108 35,1 µg/mL 1,640 1,180 0,060 0,070 0,043 0,006 109 BTL_HTP_1-109 58,3 µg/mL 1,240 0,990 0,118 0,117 0,094 0,061 Ek-6 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin DNA miktar ve kaliteleri 88 Numara Bitki Kodu dsDNA Birim 260/280 260/230 A230 A260 A280 A340 110 BTL_HTP_1-110 101,0 µg/mL 1,360 1,060 0,191 0,202 0,148 0,079 111 BTL_HTP_1-111 262,9 µg/mL 1,210 0,940 0,557 0,526 0,436 0,290 112 BTL_HTP_1-112 63,8 µg/mL 1,430 0,980 0,131 0,128 0,089 0,038 113 BTL_HTP_1-113 180,4 µg/mL 1,270 1,000 0,360 0,361 0,284 0,179 114 BTL_HTP_1-114 218,4 µg/mL 1,210 1,020 0,427 0,437 0,360 0,252 115 BTL_HTP_1-115 249,8 µg/mL 1,170 1,010 0,495 0,500 0,429 0,322 116 BTL_HTP_1-116 267,6 µg/mL 1,150 0,940 0,571 0,535 0,466 0,354 117 BTL_HTP_1-117 202,8 µg/mL 1,260 0,960 0,424 0,406 0,323 0,197 118 BTL_HTP_1-118 139,6 µg/mL 1,230 1,010 0,276 0,279 0,228 0,160 119 BTL_HTP_1-119 156,9 µg/mL 1,230 1,000 0,313 0,314 0,256 0,171 120 BTL_HTP_1-120 111,8 µg/mL 1,220 1,050 0,214 0,224 0,184 0,125 121 BTL_HTP_1-121 201,5 µg/mL 1,160 0,980 0,411 0,403 0,348 0,269 122 BTL_HTP_1-122 340,3 µg/mL 1,080 1,020 0,664 0,681 0,630 0,534 123 BTL_HTP_1-123 68,5 µg/mL 1,610 1,200 0,114 0,137 0,085 0,019 124 BTL_HTP_1-124 191,2 µg/mL 1,140 1,000 0,384 0,382 0,336 0,265 125 BTL_HTP_1-125 151,5 µg/mL 1,270 1,000 0,304 0,303 0,239 0,147 126 BTL_HTP_1-126 120,0 µg/mL 1,380 1,150 0,208 0,240 0,174 0,086 127 BTL_HTP_1-127 136,6 µg/mL 1,370 1,100 0,249 0,273 0,199 0,102 128 BTL_HTP_1-128 59,5 µg/mL 1,640 1,260 0,095 0,119 0,072 0,020 129 BTL_HTP_1-129 138,3 µg/mL 1,380 1,190 0,233 0,277 0,201 0,103 130 BTL_HTP_1-130 563,4 µg/mL 1,060 1,000 1,130 1,127 1,062 0,929 131 BTL_HTP_1-131 798,7 µg/mL 1,030 1,040 1,541 1,597 1,554 1,449 132 BTL_HTP_1-132 377,8 µg/mL 1,060 1,010 0,747 0,756 0,710 0,624 133 BTL_HTP_1-133 155,6 µg/mL 1,270 1,010 0,309 0,311 0,246 0,153 134 BTL_HTP_1-134 99,5 µg/mL 1,250 0,970 0,206 0,199 0,160 0,110 135 BTL_HTP_1-135 130,6 µg/mL 1,200 1,050 0,249 0,261 0,218 0,150 136 BTL_HTP_1-136 385,9 µg/mL 1,050 1,020 0,760 0,772 0,732 0,644 137 BTL_HTP_1-137 128,0 µg/mL 1,230 1,040 0,246 0,256 0,208 0,138 138 BTL_HTP_1-138 149,2 µg/mL 1,200 0,990 0,300 0,298 0,250 0,181 139 BTL_HTP_1-139 74,6 µg/mL 1,370 1,130 0,132 0,149 0,109 0,058 140 BTL_HTP_1-140 1122,8 µg/mL 1,020 1,030 2,186 2,246 2,195 2,129 141 BTL_HTP_1-141 119,8 µg/mL 1,230 1,010 0,238 0,240 0,195 0,133 142 BTL_HTP_1-142 84,2 µg/mL 1,260 1,050 0,160 0,168 0,134 0,088 143 BTL_HTP_1-143 176,1 µg/mL 1,150 1,000 0,354 0,352 0,307 0,238 144 BTL_HTP_1-144 89,6 µg/mL 1,150 1,220 0,127 0,155 0,110 0,051 145 BTL_HTP_1-145 19,4 µg/mL 1,410 0,980 0,039 0,039 0,028 0,015 Ek-6 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin DNA miktar ve kaliteleri 89 Numara Bitki Kodu dsDNA Birim 260/280 260/230 A230 A260 A280 A340 146 BTL_HTP_1-146 30,6 µg/mL 1,670 1,080 0,057 0,061 0,037 0,003 147 BTL_HTP_1-147 197,7 µg/mL 1,190 0,910 0,434 0,395 0,331 0,243 148 BTL_HTP_1-148 18,8 µg/mL 4,700 1,100 0,034 0,038 0,008 -0,022 149 BTL_HTP_1-149 52,5 µg/mL NaN 1,370 0,008 NaN -0,011 -0,029 150 BTL_HTP_1-150 118,3 µg/mL 3,270 1,240 0,030 0,037 0,011 -0,008 151 BTL_HTP_1-151 119,1 µg/mL NaN NaN -0,013 0,018 -0,011 -0,037 152 BTL_HTP_1-152 74,9 µg/mL 1,320 0,990 0,151 0,150 0,114 0,071 153 BTL_HTP_1-153 77,7 µg/mL 1,410 1,220 0,127 0,155 0,110 0,051 154 BTL_HTP_1-154 60,6 µg/mL 1,900 1,790 0,068 0,121 0,064 0,000 155 BTL_HTP_1-155 72,5 µg/mL NaN NaN -0,009 0,005 NaN NaN 156 BTL_HTP_1-156 120,5 µg/mL NaN NaN -0,013 0,001 -0,015 -0,030 157 BTL_HTP_1-157 35,4 µg/mL 1,520 1,030 0,069 0,071 0,047 0,021 158 BTL_HTP_1-158 34,9 µg/mL 2,780 1,960 0,036 0,070 0,025 -0,020 159 BTL_HTP_1-159 31,7 µg/mL 1,850 1,030 0,061 0,063 0,034 0,001 160 BTL_HTP_1-160 46,8 µg/mL 1,820 1,540 0,060 0,092 0,051 0,007 161 BTL_HTP_1-161 66,8 µg/mL 1,570 1,210 0,110 0,134 0,085 0,036 162 BTL_HTP_1-162 46,3 µg/mL 2,980 1,900 0,049 0,093 0,031 -0,030 163 BTL_HTP_1-163 25,3 µg/mL 2,570 1,210 0,042 0,051 0,020 -0,011 164 BTL_HTP_1-164 35,9 µg/mL 1,980 1,550 0,046 0,072 0,036 0,000 165 BTL_HTP_1-165 146,8 µg/mL 1,130 1,110 0,265 0,294 0,259 0,229 166 BTL_HTP_1-166 22,0 µg/mL 8,810 NaN 0,000 0,044 0,005 -0,030 167 BTL_HTP_1-167 31,6 µg/mL 2,030 1,790 0,035 0,063 0,031 0,000 168 BTL_HTP_1-168 120,4 µg/mL NaN NaN -0,021 0,000 -0,024 -0,043 169 BTL_HTP_1-169 111,4 µg/mL NaN 0,730 0,031 0,023 -0,009 -0,040 170 BTL_HTP_1-170 122,2 µg/mL 22,100 5,540 0,008 0,044 0,002 -0,032 171 BTL_HTP_1-171 58,6 µg/mL NaN NaN NaN NaN NaN NaN 172 BTL_HTP_1-172 79,8 µg/mL 1,770 1,620 0,099 0,160 0,090 0,017 173 BTL_HTP_1-173 35,9 µg/mL 3,780 1,030 0,070 0,072 0,019 -0,036 174 BTL_HTP_1-174 67,9 µg/mL 2,460 1,500 0,090 0,136 0,055 -0,030 175 BTL_HTP_1-175 52,8 µg/mL 3,170 2,200 0,048 0,106 0,033 -0,043 176 BTL_HTP_1-176 96,6 µg/mL 1,340 1,300 0,149 0,193 0,144 0,095 177 BTL_HTP_1-177 42,1 µg/mL 3,440 4,150 0,020 0,084 0,024 -0,039 178 BTL_HTP_1-178 30,2 µg/mL 2,700 4,000 0,015 0,060 0,022 -0,016 179 BTL_HTP_1-179 28,1 µg/mL 8,030 28,000 0,002 0,056 0,007 -0,040 180 BTL_HTP_1-180 130,5 µg/mL NaN NaN -0,012 -0,001 -0,027 -0,046 181 BTL_HTP_1-181 59,7 µg/mL 1,880 1,310 0,091 0,119 0,064 0,000 Ek-6 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin DNA miktar ve kaliteleri 90 Numara Bitki Kodu dsDNA Birim 260/280 260/230 A230 A260 A280 A340 182 BTL_HTP_1-182 27,0 µg/mL 2,870 1,210 0,044 0,054 0,019 -0,015 183 BTL_HTP_1-183 34,9 µg/mL 3,780 1,300 0,054 0,070 0,018 -0,033 184 BTL_HTP_1-184 69,4 µg/mL 1,730 0,910 0,153 0,139 0,080 0,006 185 BTL_HTP_1-185 62,4 µg/mL 1,840 1,480 0,085 0,125 0,068 0,001 186 BTL_HTP_1-186 68,1 µg/mL 1,690 1,120 0,121 0,136 0,080 0,017 187 BTL_HTP_1-187 34,5 µg/mL 2,150 1,020 0,067 0,069 0,032 -0,007 188 BTL_HTP_1-188 94,1 µg/mL 1,520 1,160 0,162 0,188 0,124 0,043 189 BTL_HTP_1-189 211,9 µg/mL 1,410 1,120 0,377 0,424 0,300 0,124 190 BTL_HTP_1-190 108,3 µg/mL 1,660 1,350 0,161 0,217 0,130 0,025 191 BTL_HTP_1-191 99,3 µg/mL 1,460 1,120 0,177 NaN 0,136 0,052 192 BTL_HTP_1-192 201,8 µg/mL 1,160 1,030 0,393 0,404 0,347 0,281 193 BTL_HTP_1-193 44,8 µg/mL NaN NaN 0,077 0,090 NaN NaN 194 BTL_HTP_1-194 89,1 µg/mL 1,970 1,690 0,105 NaN 0,090 -0,012 195 BTL_HTP_1-195 88,5 µg/mL 1,620 NaN 0,162 0,177 0,109 NaN 196 BTL_HTP_1-196 129,4 µg/mL 1,670 1,460 0,177 0,259 0,155 0,033 197 BTL_HTP_1-197 172,7 µg/mL 1,240 0,640 0,543 0,345 0,279 0,119 198 BTL_HTP_1-198 50,5 µg/mL 1,320 1,010 0,100 0,101 0,076 0,046 199 BTL_HTP_1-199 76,5 µg/mL 1,680 1,240 0,123 0,153 0,091 0,014 200 BTL_HTP_1-200 171,9 µg/mL 1,190 1,020 0,339 0,344 0,289 0,205 Ek-7. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin fenotipik ve genotipik karakterizasyon kıyaslaması. Fenotipik Karakterizasyon Genotipik Karekterizasyon 91 Negatif Pozitif TEST BİTKİ SIRASI NUMARASI 1 ANA EBEVEYN 10 0 N 0 2 BABA EBEVEYN 0 10 P 1 3 F2_1_1 7 3 NP 1 4 F2_1_2 1 9 P 0 5 F2_1_3 3 7 NP 1 6 F2_1_4 8 2 N 0 7 F2_1_5 8 2 N 0 8 F2_1_6 0 1 9 F2_1_7 6 4 NP 1 10 F2_1_8 1 9 P 1 11 F2_1_9 1 9 P 1 12 F2_1_10 7 3 NP 1 13 F2_1_11 1 9 P 1 14 F2_1_12 4 6 NP 0 15 F2_1_13 8 2 N 0 16 F2_1_14 2 7 P 1 17 F2_1_15 3 7 NP 1 18 F2_1_16 6 4 NP 1 19 F2_1_17 4 6 NP 1 20 F2_1_18 0 10 P 1 21 F2_1_19 3 6 NP 1 22 F2_1_20 3 7 NP 1 23 F2_1_21 4 6 NP 0 24 F2_1_22 3 6 NP 1 25 F2_1_23 4 6 NP 1 26 F2_1_24 5 4 NP 1 27 F2_1_25 3 7 NP 1 28 F2_1_26 3 6 NP 1 29 F2_1_27 0 9 P 1 30 F2_1_28 8 1 N 1 31 F2_1_29 5 5 NP 1 32 F2_1_30 8 2 N 0 33 F2_1_31 5 4 NP 1 34 F2_1_32 9 1 N 0 35 F2_1_33 8 0 N 0 36 F2_1_34 9 1 N 0 37 F2_1_35 4 6 NP 1 38 F2_1_36 5 4 NP 1 39 F2_1_37 8 2 N 0 40 F2_1_38 6 4 NP 1 Ek-7 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin fenotipik ve genotipik karakterizasyon kıyaslaması. 92 Fenotipik Karakterizasyon Genotipik Karekterizasyon Negatif Pozitif TEST BİTKİ SIRASI NUMARASI 41 F2_1_39 0 10 P 1 42 F2_1_40 0 8 P 1 43 F2_1_41 0 10 P 1 44 F2_1_42 5 5 NP 1 45 F2_1_43 3 7 NP 1 46 F2_1_44 0 10 P 1 47 F2_1_45 3 7 NP 1 48 F2_1_46 3 6 NP 1 49 F2_1_47 5 5 NP 1 50 F2_1_48 8 2 N 0 51 F2_1_49 9 1 N 1 52 F2_1_50 10 0 N 0 53 F2_1_51 5 4 NP 0 54 F2_1_52 2 0 55 F2_1_53 8 0 N 0 56 F2_1_54 7 1 N 0 57 F2_1_55 9 1 N 0 58 F2_1_56 8 2 N 0 59 F2_1_57 6 1 N 0 60 F2_1_58 3 3 61 F2_1_59 5 4 NP 1 62 F2_1_60 3 4 63 F2_1_61 9 1 N 0 64 F2_1_62 3 7 NP 1 65 F2_1_63 4 2 66 F2_1_64 10 0 N 0 67 F2_1_65 9 1 N 0 68 F2_1_66 5 5 NP 1 69 F2_1_67 8 1 N 0 70 F2_1_68 9 0 N 0 71 F2_1_69 0 10 P 1 72 F2_1_70 0 10 P 1 73 F2_1_71 3 7 NP 1 74 F2_1_72 10 0 N 0 Ek-7 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin fenotipik ve genotipik karakterizasyon kıyaslaması. 93 Fenotipik Karakterizasyon Genotipik Karekterizasyon Negatif Pozitif TEST BİTKİ SIRASI NUMARASI 75 F2_1_73 3 7 NP 1 76 F2_1_74 1 9 P 1 77 F2_1_75 3 7 NP 1 78 F2_1_76 0 10 P 0 79 F2_1_77 8 0 N 0 80 F2_1_78 2 8 P 1 81 F2_1_79 4 6 NP 1 82 F2_1_80 5 5 NP 1 83 F2_1_81 0 9 P 1 84 F2_1_82 0 9 P 1 85 F2_1_83 5 4 NP 1 86 F2_1_84 8 2 N 0 87 F2_1_85 5 3 NP 1 88 F2_1_86 0 8 P 1 89 F2_1_87 2 8 P 1 90 F2_1_88 1 8 P 0 91 F2_1_89 2 4 92 F2_1_90 0 7 P 1 93 F2_1_91 8 2 N 0 94 F2_1_92 2 7 NP 1 95 F2_1_93 4 5 NP 1 96 F2_1_94 1 8 P 1 97 F2_1_95 0 10 P 1 98 F2_1_96 0 9 P 1 99 F2_1_97 0 9 P 1 100 F2_1_98 0 9 P 1 101 F2_1_99 0 9 P 1 102 F2_1_100 0 10 P 1 103 F2_1_101 0 10 P 1 104 F2_1_102 0 9 P 1 105 F2_1_103 0 9 P 1 106 F2_1_104 0 7 P 1 107 F2_1_105 0 9 P 0 108 F2_1_106 1 8 P 1 Ek-7 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin fenotipik ve genotipik karakterizasyon kıyaslaması. 94 Fenotipik Karakterizasyon Genotipik Karekterizasyon Negatif Pozitif TEST BİTKİ SIRASI NUMARASI 109 F2_1_107 3 7 NP 1 110 F2_1_108 0 10 P 0 111 F2_1_109 3 4 NP 1 112 F2_1_110 2 5 NP 1 113 F2_1_111 4 6 NP 1 114 F2_1_112 3 5 NP 1 115 F2_1_113 2 5 NP 1 116 F2_1_114 2 6 NP 1 117 F2_1_115 3 7 NP 1 118 F2_1_116 8 2 N 0 119 F2_1_117 2 3 NP 1 120 F2_1_118 2 8 NP 1 121 F2_1_119 10 0 N 0 122 F2_1_120 0 7 P 1 123 F2_1_121 3 7 NP 0 124 F2_1_122 5 5 NP 1 125 F2_1_123 5 3 NP 1 126 F2_1_124 3 7 NP 1 127 F2_1_125 3 7 NP 0 128 F2_1_126 3 7 NP 1 129 F2_1_127 4 4 NP 1 130 F2_1_128 2 0 131 F2_1_129 5 4 NP 1 132 F2_1_130 7 2 N 0 133 F2_1_131 7 1 N 0 134 F2_1_132 8 2 N 0 135 F2_1_133 4 6 NP 1 136 F2_1_134 8 2 N 0 137 F2_1_135 4 6 NP 1 138 F2_1_136 5 5 NP 1 139 F2_1_137 9 1 N 0 140 F2_1_138 4 6 NP 1 141 F2_1_139 4 6 NP 1 142 F2_1_140 3 7 NP 1 Ek-7 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin fenotipik ve genotipik karakterizasyon kıyaslaması. 95 Fenotipik Karakterizasyon Genotipik Karekterizasyon Negatif Pozitif TEST BİTKİ SIRASI NUMARASI 143 F2_1_141 3 7 NP 1 144 F2_1_142 5 5 NP 1 145 F2_1_143 5 3 NP 1 146 F2_1_144 3 6 NP 1 147 F2_1_145 3 7 NP 1 148 F2_1_146 3 7 NP 1 149 F2_1_147 4 4 NP 1 150 F2_1_148 2 0 151 F2_1_149 9 1 N 0 152 F2_1_150 1 9 P 0 153 F2_1_151 4 6 NP 1 154 F2_1_152 8 2 N 0 155 F2_1_153 2 6 156 F2_1_154 9 1 N 0 157 F2_1_155 9 1 N 0 158 F2_1_156 3 3 NP 1 159 F2_1_157 6 4 NP 1 160 F2_1_158 1 9 P 1 161 F2_1_159 1 9 P 1 162 F2_1_160 8 2 N 0 163 F2_1_161 1 9 P 1 164 F2_1_162 4 6 NP 1 165 F2_1_163 2 8 P 1 166 F2_1_164 5 4 NP 0 167 F2_1_165 6 4 NP 1 168 F2_1_166 5 3 NP 1 169 F2_1_167 1 5 170 F2_1_168 3 7 NP 1 171 F2_1_169 1 8 P 1 172 F2_1_170 2 4 173 F2_1_171 0 7 NP 1 174 F2_1_172 8 2 N 0 175 F2_1_173 3 6 NP 1 176 F2_1_174 4 5 NP 1 Ek-7 devam. Ana ebeveyn, baba ebeveyn, F1 ve F2 bireylerinin fenotipik ve genotipik karakterizasyon kıyaslaması. 96 Fenotipik Karakterizasyon Genotipik Karekterizasyon Negatif Pozitif TEST BİTKİ SIRASI NUMARASI 177 F2_1_175 1 8 P 1 178 F2_1_176 3 7 NP 1 179 F2_1_177 5 5 NP 1 180 F2_1_178 5 3 NP 1 181 F2_1_179 2 8 P 1 182 F2_1_180 3 7 NP 1 183 F2_1_181 3 7 NP 1 184 F2_1_182 4 4 NP 1 185 F2_1_183 2 0 186 F2_1_184 5 4 NP 1 187 F2_1_185 8 2 N 0 188 F2_1_186 1 9 P 1 189 F2_1_187 4 6 NP 1 190 F2_1_188 8 2 N 0 191 F2_1_189 2 8 P 1 192 F2_1_190 3 7 NP 1 193 F2_1_191 9 1 N 0 194 F2_1_192 4 6 NP 1 195 F2_1_193 8 2 N 0 196 F2_1_194 5 3 NP 1 197 F2_1_195 1 5 198 F2_1_196 2 8 P 1 199 F2_1_197 1 8 P 1 200 F2_1_198 2 4 201 F2_1_199 0 9 P 1 202 F2_1_200 8 2 N 0 97 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Hasan Özgür Şığva Doğum Yeri ve Tarihi : Gaziantep/1978 Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Gaziantep Cumhuriyet Lisesi/1994 Lisans : Ege Üniversitesi/2004 Yüksek Lisans : İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü/2008 Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl : İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü/2005-2009 MAY Agro Tohumculuk San. Tic. A.Ş./2009-…. İletişim (e-posta) : hasansigva@gmail.com Yayınları : Frary, A., Sigva, H.O., Tan, A., Taskin, T., Inal, A., Mutlu, S., Haytaoglu, M., Doganlar, S. 2013. Molecular genetic diversity in the Turkish national melon collection and selection of a preliminary core set. J AmerSocHortSci., 138:50-56. Selale, H., Sigva, H.O., Celik, I., Doganlar, S., Frary, A. 2012. Water-soluble antioxidant potential of melon lines grown in Turkey. Inter J Food Prop., 15:145-156. Okmen, B, Sigva, H.O.,Gurbuz, N., Ulger, M.,Frary, A.,Doganlar, S. 2011. Quantitative trait loci (QTL) analysis for antioxidant and agronomically important traits in tomato (Lycopersiconesculentum).Turk J Agric Forest., 35:501-514. Frary, A., Göl, D.,Keleş, D., Ökmen, B., Pınar, H., Şığva, H.O., Yemenicioğlu, A., Doğanlar, S. 2010. Salt tolerance in Solanumpennellii: antioxidant response and related QTL. BMC Plant Biology, 10:58. Okmen, B.,Sigva, H.O., Mutlu, S., Doganlar. S., Yemenicioglu, A., Frary, A. 2009. Total antioxidantactivity and total phenolic contents in different Turkisheggplant (Solanummelongena L.) cultivars. Inter J of Food Prop., 12:616-624. Sigva, H.O., Secmen, O. 2009. Ethnobotanic Survey of Işklı (Çarpın), Dağdancık and Tokdemir in Gaziantep, Turkey, IUFS Journal of Biology, 68: 19-27 Frary, A., Keceli, M.A., Okmen, B., Sigva, H.O., Yemenicioglu, A., Doganlar, S. 2008. Water soluble antioxidant potential of Turkish pepper cultivars. Hortscience, 43:631-636 98