T. C. ULUDAĞ ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ MĐKROBĐYOLOJĐ ANABĐLĐM DALI SIĞIR SÜRÜLERĐNDE SOLUNUM SĐSTEMĐ VĐRUSLARININ ENFEKSĐYON DĐNAMĐĞĐNĐN SEROLOJĐK TAKĐBĐ VE KLĐNĐK OLGULARDAN VĐRUS TESPĐTĐ Pelin TUNCER (DOKTORA TEZĐ) Bursa-2013 T. C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI SIĞIR SÜRÜLERİNDE SOLUNUM SİSTEMİ VİRUSLARININ ENFEKSİYON DİNAMİĞİNİN SEROLOJİK TAKİBİ VE KLİNİK OLGULARDAN VİRUS TESPİTİ Pelin TUNCER (DOKTORA TEZİ) Danışman: Prof. Dr. Kadir YEŞİLBAĞ Bursa-2013 İÇİNDEKİLER TÜRKÇE ÖZET IV İNGİLİZCE ÖZET V GİRİŞ 1 GENEL BİLGİLER 3 Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV) 3 Parainfluenza Virus Tip 3 (PI-3) 5 İnfeksiyöz Bovine Rhinotracheitis Virus 1 (Bovine Herpesvirus 1, BHV-1) 7 Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) 10 Bovine Adenovirus Tip 3 (BAV-3) 13 Bovine Coronavirus (BCoV) 15 Tezin Amacı 17 GEREÇ ve YÖNTEM 18 GEREÇ 18 Örnekleme Yapılan İşletmeler 18 Örneklenen Hayvanlar 19 Etik Kurul İzin Belgesi ve Anket Formu 22 Kan Örnekleri 22 Svab Örnekleri 22 Akciğer Örnekleri 23 Hücre Kültürleri 24 Testlerde Kullanılan Kontrol Virusları 24 Ticari Antijen ELISA Kiti 27 İmmunoperoksidaz Testi 27 YÖNTEM 27 Serum Örneklerinin Hazırlanması 27 Svab Örneklerinin Hazırlanması 27 I Doku Örneklerinin Hazırlanması 28 Hücre Kültürleri 28 Virusların Üretilmesi 28 Virus Titresinin Belirlenmesi 29 Serolojik Çalışmalar 29 Serum Nötralizasyon 50 (SN50) Değerinin Belirlenmesi 29 Virolojik Çalışmalar 30 ELISA ile Antijen Tespiti 30 Virus İzolasyonu 31 İmmunoperoksidaz Testi 31 İstatistiki Analiz 32 BULGULAR 33 Virusların Titre Değerleri 33 Anket Sonuçları 33 Serolojik Çalışmalar 36 Büyük Ölçekli İşletmelerde (Hayvan Sayısı >100) Elde Edilen Bulgular 36 İşletme 1’e Ait Bulgular 36 İşletme 2’ye Ait Bulgular 40 İşletme 3’e Ait Bulgular 44 A. Dört Aylık Yaşta Aşı Uygulanan Buzağılar 44 B. Dört Aylık Yaşta Aşı Uygulanmayan Buzağılar 47 İşletme 4’e Ait Bulgular 52 Orta Ölçekli İşletmelerde (20 < Hayvan Sayısı >100) Elde Edilen Bulgular 56 İşletme 5’e Ait Bulgular 56 İşletme 6’ya Ait Bulgular 60 Küçük Ölçekli İşletmelerde (20 < Hayvan Sayısı) Elde Edilen Bulgular 64 İşletme 7’ye Ait Bulgular 64 İşletme 8’e Ait Bulgular 68 İşletme 9’a Ait Bulgular 72 İşletme 10’a Ait Bulgular 76 Bulguların İşletme Büyüklüklerine Göre Değerlendirilmesi 80 Büyük Ölçekli İşletmelere Ait Bulgular 80 Orta Ölçekli İşletmelere Ait Bulgular 85 II Küçük Ölçekli İşletmelere Ait Bulgular 89 Tüm Aşısız Buzağılara Ait Kümülatif Veriler 93 Yeni Enfeksiyonla Tanışan Buzağı Sayılarının Aylık Dağılımı 97 İstatistiki Analiz Sonuçları 99 İşletme Büyüklüklerine Göre Enfeksiyon Görülme Sıklığı 99 Dişi ve Erkek Buzağılarda Enfeksiyon Görülme Sıklığı 99 Aşılı ve Aşısız Buzağılarda Enfeksiyon Görülme Sıklığı 100 Buzağılara Maternal Antikor Geçişi 100 Klinik Bulguların Mevsimsel Dağılımı 100 Virolojik Çalışmalar 101 ELISA ile Antijen Tespiti Sonuçları 101 Dörtlü Antijen ELISA Sonuçları 101 BHV-1 Antijen ELISA Sonuçları 101 BVDV Antijen ELISA Sonuçları 101 Virus İzolasyon Sonuçları 104 İmmunoperoksidaz Testi (IPX) Sonuçları 105 BVDV Antijen ELISA ve İmmunoperoksidaz Testi Sonuçlarının Karşılaştırılması 107 TARTIŞMA ve SONUÇ 109 Enfeksiyonların Aşısız Buzağı Popülasyonundaki Seyri 110 İşletme Büyüklüklerine Göre Enfeksiyon Görülme Sıklığı 115 Dişi ve Erkek Buzağılarda Enfeksiyon Görülme Sıklığı 116 Aşılı ve Aşısız Buzağılarda Enfeksiyon Görülme Sıklığı 117 Buzağılara Maternal Antikor Geçişi 118 Virolojik Çalışmalar 119 ELISA ve İmmunoperoksidaz Testi 119 Persiste Enfeksiyon Tespiti 121 Sonuç 123 EK 126 KAYNAKLAR 131 TEŞEKKÜR 144 ÖZGEÇMİŞ 145 III ÖZET Bu tez çalışması ile Bursa’daki sığırlarda solunum yolu enfeksiyonuna neden olan önemli viral patojenlerden bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine parainfluenza virus tip 3 (PI-3), bovine herpesvirus 1 (BHV-1), bovine viral diarrhoea virus (BVDV), bovine adenovirus tip 3 (BAV-3) ve bovine coronavirus (BCoV) enfeksiyonlarının dinamiklerinin ortaya çıkarılması; böylece araştırılan her bir etkene karşı mevcut maternal antikorların gerileme dönemleri ve işletmelerde uygulanması gereken optimum aşılama zamanlarının ortaya konulması hedeflenmiştir. Bu amaçla serolojik çalışmalar için hayvan sayısına göre gruplanan işletmelerde aynı ay içinde doğan buzağılardan (n=112) yaşamlarının 1., 2., 3., 4., 6., 8., 10. ve 12. aylarında annelerinden ise 1. ay örneklemesi sırasında kan örneği alındı. Virolojik çalışmalar için ise mezbahadan lezyonlu akciğer doku örnekleri ve hem çalışma kapsamındaki işletmelerde hem de civar işletmelerdeki bulunan solunum yolu enfeksiyonu klinik belirtileri gösteren buzağılardan göz ve burun svabları toplandı. Antikor titrelerini belirleyebilmek için 8 defa örneklenen 112 hayvanın serum örneklerine serum nötralizasyon testi (SN50) uygulandı. Antijen tespiti amacıyla ticari ELISA kiti ile BRSV, PI-3, BVDV ve BHV-1 antijen taraması, virus izolasyonu ve nonsitopatojen BVDV suşlarının tespiti için immunoperoksidaz yöntemlerinden yararlanıldı. Çalışma sonunda BRSV, PI-3, BVDV, BAV-3 ve BCoV’ün buzağıları erken yaşta enfekte ettiği ve sürüdeki seronegatif buzağıların yıl boyunca enfeksiyonun sirkülasyonunda rol oynadığı belirlendi. BRSV, PI-3, BVDV, BAV-3’e karşı 3. ayda, BCoV’a karşı ise 4. ayda maternal antikorların kaybolmaya başladığı görülürken, BHV-1’e karşı maternal antikor varlığı tespit edilemedi. Sonuç olarak, maternal antikorların 2. aydan itibaren gerilemeye başladığı, buzağıların yeni enfeksiyonla 4.-8. aylarda karşılaştığı ve enfeksiyonların doğal olarak popülasyonda sirküle olduğu tespit edildi. Elde edilen bu verilere dayanılarak buzağılarda ilk aşılamanın 2.-4. aylar arasında yapılması ve pasif immunitenin aşı üzerinde yapabileceği olumsuz etkiyi en aza indirmek ve daha güçlü bir bağışıklık sağlayabilmek için 1 ay sonra tekrar dozunun uygulanmasının yararlı olacağı değerlendirildi. Anahtar kelimeler: Solunum sistemi virusları, Sığır, Enfeksiyon dinamiği, BRSV, PI- 3, BHV-1, BVDV, BAV-3, BCoV IV SUMMARY SEROLOGICAL DETECTION OF INFECTION DYNAMICS OF RESPIRATORY VIRUSES IN CATTLE HERDS AND VIRUS ISOLATION FROM CLINICAL CASES The aim of this PhD thesis is to reveal infection dynamics of bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine parainfluenza virus type 3 (PI-3), bovine herpesvirus 1 (BHV-1), bovine viral diarrhoea virus (BVDV), bovine adenovirus type 3 (BAV-3) and bovine coronavirus (BCoV) which are important viral pathogens of respiratory disease complex of ruminants. By this way regression period of maternally antibodies and optimum vaccination time can be recommended. Farms are grouped according to their animal population. For serological studies, blood samples are collected from calves (n=112) which are born in the same month and blood samples were gathered from these animals during their 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, 8th, 10th and 12th months old. Also blood samples were taken from calves’ mother during first sampling. For virological studies nose and eye swab samples were taken from clinically ill calves which are found from studied and unstudied farms. For detecting antibody titers serum neutralization test (SN50) was applied to blood sera. Besides detecting antigen commercial ELISA kit (BRSV, PI-3, BVDV and BHV-1 antigen detection kit), virus isolation and for non cytopathic BVDV strain immunoperoxidase test was used. At the end infection with BRSV, PI-3, BVDV, BAV-3 and BCoV at early ages of calves and role of seronegative calves in circulation of infections was determined. For BRSV, PI-3, BVDV, BAV-3 in the 3rd month and for BCoV in the 4th month maternally antibodies are started to decrease. During this period no maternal antibody was detected for BHV-1. In conclusion it was observed that maternally antibodies started to decrease from the 2nd month, first exposure of viruses to calves were encountered between 4th and 8th months and circulation of naturally infections were detected. On this basis, first vaccination should be done between 2nd and 4th month and it was judged that implementation of after 1 month booster shot can be useful. V Key words: Respiratory viruses, Ruminant, Infection dynamic, BRSV, PI-3, BHV-1, BVDV, BAV-3, BCoV VI GİRİŞ Sığır solunum yolu enfeksiyonları buzağı yetiştirilen sürülerde en sık rastlanan problemdir (1). Yeni doğanlarda postpartum dönemde birçok fizyolojik değişiklik meydana gelir. Bu sırada çeşitli sindirim ve solunum yolu hastalıklarının belirtileri şiddetli olarak gözlemlenebilir. Özellikle anneden buzağıya kolostrum yoluyla geçen antikorların mevcut olmaması hastalık insidensinin daha da artmasına neden olan ana faktördür (2). Ayrıca kötü bakım şartları altında ve kalabalık ortamda barındırma gibi stres yaratan koşulların adrenokortikal immunsupresyona neden olduğu ve yalnız buzağılarda değil her yaştaki hayvanlarda hastalık görülme riskini artırdığı bilinmektedir (1). Sığır solunum sistemi enfeksiyonları yetiştiriciyi olduğu kadar ülke ekonomisini de direkt ilgilendirdiği için son derece önemlidir. Bu enfeksiyonlara ilişkin maddi kayıplar; hayvan ölümleri, canlı ağırlık kaybı, verim düşüklüğü, veteriner hekim ücretleri ve ilaç maliyetlerinden ileri gelmektedir. Örneğin; 1991 yılında Amerika Birleşik Devletleri’nde (ABD) solunum yolu enfeksiyonlarının meydana getirdiği ekonomik kaybın 600 milyon doların üzerinde olduğu tahmin edilmektedir (3). Solunum yolu enfeksiyonlarının etiyolojisinde tek bir etken bulunabileceği gibi birden fazla viral etkene de rastlanabilir (4). Bunlar arasında en önemli olanlar bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine herpesvirus tip 1 (BHV-1), bovine parainfluenza virus tip 3 (PI-3), bovine viral diarrhoea virus (BVDV) ve bovine adenovirus serotip 1-2-3 ve 7’dir (BAV-1, BAV-2, BAV-3, BAV-7) (4-10). Bovine rhinovirus, bovine coronavirus ve bovine reovirus serotip 3’ün de zaman zaman sığırların solunum sisteminden izole edildiği görülmüştür (10-15). Bu etkenlere Mycoplasma bovis ve Mannhemia haemolytica, Histophilus somni ve Pasteurella multocida gibi bakteriyel etkenlerin de eşlik edebileceği ve oluşan çoklu enfeksiyon tablolarında prognozun kötüleştiği birçok araştırmada gösterilmiştir (5, 6, 8, 16-18). Sığırlarda solunum sistemi enfeksiyonlarından izole edilen ilk etken BHV-1’dir (4). Yapılan bir çalışmada hem solunum yolu hem de enterik bulguları olan bir hayvanda PI-3 ve BVDV bir arada görülmüş, başlangıçta BVDV’nin yalnız enterik problemlere yol açtığı düşünülse de daha sonra solunum sistemini de etkilediği anlaşılmıştır. Parainfluenza-3 etkeninin solunum sisteminde BVDV’nin yanında BRSV ve adenovirus gibi birden fazla 1 virusla birlikte bulunduğu gösterilmiştir. İlerleyen dönemlerde ABD’de BAV-1 ve BAV- 2, İngiltere’de ise BAV-3’ün solunum sistemi enfeksiyonlarındaki rolü tanımlanmıştır. BRSV ise 1970 yılının başında 2 yaşından küçük sığırlardan izole edilmiştir (4). BRSV ve BCoV’un sürülerde subklinik olarak kaldığını ve enfeksiyonun devamlılığının bu şekilde sağlandığını gösteren veriler bulunmaktadır (18-20). Birçok araştırmacı solunum sistemi enfeksiyonlarında primer etkenin virus olduğunu daha sonra tabloya bakterilerin katıldığını düşünmektedir. Örneğin; PI-3 ve BVDV hücresel immunite üzerine etki ederek immunosupresyona neden olur, böylece hayvan sekonder enfeksiyonlara predispoze hale gelir (4). Türkiye genelinde sığırlarda BRSV’nin %44,6-%94,4; PI-3’ün %38,2-%92,8; BHV-1’in %17,1-%74; BAV-3’ün %14,2-%92,3; BCoV’nin ise %4,4-%100 arasında değişen seroprevalans değerlerine sahip olduğu tespit edilmiştir (21-28). BVDV’nin seroprevalans değerleri ise kamu işletmelerinde %0,6-%90, halk elindeki hayvanlarda %45 olarak belirlenmiştir (29). Bu tez çalışması ile Bursa’daki sığırlarda solunum yolu enfeksiyonuna neden olan önemli viral patojenlere ilişkin enfeksiyon dinamiklerinin ortaya çıkarılması hedeflenmiştir. Böylece araştırılan her bir etkene karşı mevcut maternal antikorların gerileme dönemleri ve işletmelerde uygulanması gereken optimum aşılama zamanlarını ortaya koymanın mümkün olabileceği değerlendirilmiştir. 2 GENEL BİLGİLER Sığırların solunum sistemi enfeksiyonlarında en sık karşılaşılan viral etkenler bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine parainfluenza virus tip 3 (PI-3), bovine herpesvirus tip 1 (BHV-1), bovine viral diarrhoea virus (BVDV), bovine adenovirus serotip 3 (BAV-3) ve bovine coronavirustur (BCoV). Bu virusların oluşturdukları enfeksiyonlara ilişkin genel bilgiler aşağıda sunulmuştur. Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV) Bovine respiratory syncytial virus, Mononegavirales dizinindeki Paramyxoviridae ailesinde Pneuomovirus genusu içerisinde sınıflandırılmıştır. Bu ailedeki virionlar zarflı ve helikal simetrili nükleokapsid ile çevrili ve 150-300 nm çapındadır. Viral zarfta hemaglütinin (H) ve füzyon (F) glikoproteinleri olarak isimlendirilen iki viral glikoprotein ve 1-2 adet glikozillenmemiş viral protein bulunmaktadır. Hemaglütinin glikoproteini virusun konak hücreye adsorbsiyonundan sorumludur. Virusun hücre reseptörlerine adsorbe olmasını inhibe eden nötralizan antikorlar bu glikoproteine karşı oluşur. Füzyon glikoproteini ise virus penetrasyonunda, virus partikülünün hücreden hücreye nakledilmesinde ve enfekte hücrelerin birleşerek sinsityum oluşturmasında görev alır (30). Nöyraminidaz aktivitesi yeni nesil virionların konak hücreden ayrılması ve müköz membranlardaki müsin inhibitörlerinin yıkımlanmasında rol alır. Füzyon proteini bu ailedeki tüm genuslarda bulunur fakat BRSV’nin yer aldığı Pneumovirus genusunda hemaglütinin glikoproteini mevcut değildir, bunun yerine virus adsorbsiyonundan ve immuniteden sorumlu olan fakat hemaglütinasyon ve nöyraminidaz özelliği göstermeyen G proteini bulunur (31). Tek iplikçikli ve negatif anlamlı olan BRSV RNA’sının uzunluğu 15-16 kb’dır. Viral genom 11 adet protein kodlayan 10 adet subgenomik RNA’ya transkribe olur (32). Etken sitoplazmada çoğalır ve plazma membranından zarfını alarak tomurcuklanır. Parainfluenza-3 virusu ile benzer sitopatojenik etki oluşturan BRSV konak hücrelerde intrasitoplazmik ve intranüklear inklüzyon cisimcikleri ile sinsityum meydana getirerek ürer (33). 3 Tüm paramyxoviruslarda olduğu gibi BRSV çevre şartlarına oldukça duyarlıdır ve virion yapısı dondurup-çözdürme işleminde bile zarar görebilir. Virus ısı, genel amaçlı dezenfektanlar ve yağ eriticileriyle kolaylıkla inaktive olur (31). BRSV 1967 yılında Japonya, Belçika ve İsviçre’de tespit edilmiş; kısa bir süre sonra da İngiltere ve ABD’de ilk virus izolasyonu gerçekleşmiştir (34). Danimarka’da yapılan bir çalışmada BRSV’nin buzağı pnöymonisinde en sık rastlanan virus olduğu görülmüştür (35). Günümüzde enfeksiyonun tüm dünyada yaygın olduğu bilinmektedir. BRSV enfeksiyonları özellikle süt emen buzağılarda ve genç hayvanlarda pnöymoni, intersitisyel pulmoner ödem ve amfizeme neden olmaktadır. Yaşla ilişkisi olduğu düşünülen enfeksiyonun genellikle 6 aylıktan küçük buzağılarda görüldüğü saptanmıştır (36). Hastalık sıkışık olarak barındırılan hayvanlarda genellikle kış aylarında görülse de yaz aylarında ortaya çıktan vakalarda gözlemlenmiştir (20). Etken solunum yolu ekskretleri ile saçılmakta ve duyarlı bireyler tarafından aerosol ya da damlacık yolu ile alınmaktadır (36). Doğal enfeksiyondan sonra oluşan bağışıklığın kısa süreli olabileceği ve re-enfeksiyonların sıkça görülebileceği hatta seropozitif buzağılarda kolostrum ile aktarılan maternal antikorların enfeksiyona karşı etkili bir koruma sağlayamayabileceği, ancak yüksek titrede maternal antikor varlığının hastalığın şiddetini azaltabileceği ve bu hayvanların enfeksiyonu subklinik olarak geçirdiği bildirilmiştir (20, 37). BRSV ile subklinik enfekte hayvanlar sürü için virus kaynağıdır ve stres durumlarında virus duyarlı bireylerde akut enfeksiyona neden olabilmektedir (34, 37). Hastalık; ateş, abdominal solunum, letarji, rhinitis, nazal akıntı ve öksürük gibi solunum yolu enfeksiyonu belirtileri ile baş gösterir (30). Olgunun intersitisyel ödem ve amfizeme kadar ilerlemesi şiddetli bronkopnöymoniye hatta ölüme neden olabilir (36). Salgın durumlarında morbidite yüksek olsa bile mortalite genellikle düşük düzeylerde kalmaktadır. Virus enfekte olan buzağılarda silier epitelin 8-10 gün içerisinde yıkımlanmasına dolayısıyla hayvanın sekonder enfeksiyonlara açık hale gelmesine neden olmaktadır. Karakteristik olarak, akciğerlerde parainfluenza-3 enfeksiyonunda görülenlerden daha büyük yapıda sinsityel hücreler görülür (38). Olguya mikoplazma ve bakterilerin karıştığı durumlarda ise akciğerlerde amfizeme ek olarak konsolidasyon alanları görülebilmektedir (34). 4 Ülkemizde BRSV’ye karşı yapılan serolojik taramalarda %44,6 ile %94,4 oranları arasında değişen seropozitif sığır varlığı saptanmıştır (23, 24, 28). Koyun ve keçilerde de BRSV için yapılan seroprevalans çalışmalarında yüksek oranlarda seropozitivite belirlenmiştir (39, 40). Bu durum koyun ve keçi popülasyonunun sığırlar için enfeksiyon kaynağı olabileceğini düşündürmektedir. Enfeksiyonun teşhisi için virus izolasyonu sığır hücre kültürlerinde yapılabilmektedir. Ancak paramyxoviruslar çevre koşullarına oldukça duyarlı olduğu için izolasyonda başarı oranı düşüktür. Serolojik incelemeler için nötralizasyon, komplement fikzasyon, agar jel immunodiffuzyon ve immunofloresan testlerinden yararlanılabilmektedir (41). Virolojik incelemeler için nazal svablardan direkt ELISA, immunufloresan testi ve RT-PCR yapılabilmektedir (38, 42-45). Enfeksiyondan korunma için stres faktörlerinden mümkün olduğunca kaçınılması ve uygun bakım-besleme şartlarının oluşturulması önemlidir. Etkene yönelik birçok inaktive veya attenüe aşı geliştirilmiş ve kullanıma girmiştir (30, 46). Parainfluenza Virus Tip 3 (PI-3) BRSV ile aynı ailede (Paramyxoviridae) yer alan PI-3 virusu Respirovirus genusu içerisinde sınıflandırılmaktadır. Zarflı ve negatif anlamlı olan virion tek iplikçikli RNA genomu taşır (5). Bu genusta yer alan virusların hemaglütinin glikoproteini aynı zamanda nöyraminidaz aktivitesi (HN) de taşır (31). PI-3 virusunun esas çoğalma bölgesi solunum sistemi epitel hücreleridir (47). Ancak monositlerde çoğalmaya bağlı olarak viremi de gerçekleşebilir (48). PI-3 enfeksiyonları tüm dünyada yaygın olarak görülmekte ve etken tek başına enfeksiyon meydana getirdiğinde BRSV’ye göre daha hafif bir hastalık tablosu oluşturmaktadır. PI-3’ün solunum sistemi hastalıklarının etiyolojisinde BRSV, adenovirus ve BVDV ile birlikte rol aldığı gösterilmiştir (4). Deneysel olarak yapılan bir çalışmada PI-3’ün tek başına daha hafif seyirli bir hastalık oluşturduğu, BHV-1 ile beraber hayvana verildiğinde ise hastalığın şiddetinin arttığı gözlemlenmiştir (49). Solunum yolu ile vücuda alınan etken (50) buzağılarda ateş, nazal akıntı, depresyon, dispne ve öksürük ile seyreder. Birçok hayvanda çok az klinik belirti görülürken bazı hayvanlarda (özellikle stres altında 5 olanlarda) sadece anterior akciğer lobunda yangısal konsolidasyon alanlarının meydana geldiği intersitisyel pnöymoni gelişebilir. Virus bronşiol ve alveolar epitel hücrelerinde intrasitoplazmik inklüzyon cisimcikleri ve sinsityum meydana getirerek ürer (51). Etkenin alveolar makrofajları enfekte etmesi sonucu bu hücrelerin bakterileri öldürme yeteneğinde azalma olduğu, fagozom-lizozom füzyonunda kısıtlanma olduğu ve diğer fagositoz fonksiyonlarında inhibisyona neden olan arakhidonik asit gibi metabolitlerin oluşumunun arttığı hem in vivo hem de in vitro ortamlarda gösterilmiştir (52). Bu nedenle PI-3’ün löykositlerde immunosupresyona neden olması ve mukosilier sistemi tahrip etmesi diğer enfeksiyonlar için predizpozisyon yaratmasının ana nedeni olarak düşünülmektedir (5, 53). Virusun en önemli bulaşma yolu aerosoller ve nazal akıntılarla kontamine olmuş fomitlerdir (54). Ayrıca virus barsak içeriğinden, sütten ve aborte fötustan da izole edilmiştir (34). Fakat bu kaynakların bulaşma yönünden önemi henüz kesinleşmemiştir. İyileşen hayvanlarda güçlü fakat kısa süreli bir immun yanıtın oluştuğu hemaglütinasyon ve nöyraminidaz etkinliğini inhibe eden nötralizan antikorların varlığı ile saptanmıştır (34). İmmunitenin kısa süreli olması birkaç ay sonra aynı hayvanın tekrar enfekte olabileceğini göstermektedir. Türkiye’de yapılan araştırmalarda PI-3 virusunun varlığı gösterilmiş ve seroprevalans değerlerinin %38,2 - %92,8 arasında değiştiği saptanmıştır (23-26, 28, 55). PI-3’e yönelik olarak koyun ve keçilerde seropozitivite saptanmış olması bu enfeksiyonda da küçük ruminantların sığırlar için enfeksiyon kaynağı olabileceğini düşündürmektedir (40). Etkenin teşhisi için sığır hücre kültürlerine ekim, virus nötralizasyon, immunofloresan veya enzim immunoassay testlerinden yararlanılmaktadır (56). Serolojik incelemeler amacıyla hemaglütinasyon inhibisyon, serum nötralizasyon, immunofloresan ve indirekt ELISA kullanılmaktadır (50). Enfeksiyondan korunmak amacıyla mukozal yüzeylerde IgA oluşumunu sağlayan intranazal ve parenteral uygulanabilen pek çok aşı mevcuttur. PI-3 virus aşıları genellikle kombine aşı şeklinde hazırlanmaktadır (34). 6 İnfeksiyöz Bovine Rhinotracheitis Virus (Bovine Herpesvirus 1, BHV-1) İnfeksiyöz Bovine Rhinotracheitis virusu 1950’li yılların sonlarında izole edilmiştir (57). Virionlar; zarflı ve 120-200 nm çapındadır. Nükleokapsid ise ikosahedral simetrili ve 100 nm çapındadır. Genom linear ve çift iplikçikli olup 125-135 kb büyüklüğünde DNA’dan oluşmaktadır (58). Kapsid ile zarf arasındaki bölgede globüler yapıda proteinlerden oluşmuş bir tabaka (tegüment) bulunur (31). Herpesvirus virionları 6 adedi nükleokapsitte, 2 adedi DNA ilişkili olmak üzere toplamda 30 adet yapısal proteine sahiptir. Yaklaşık 12 adet olan glikoproteinler ise zarfta yer alır ve peplomer olarak isimlendirilir. Zarf glikoproteinlerinden biri olan glikoprotein E (gE) Fc reseptör aktivitesine sahiptir ve IgG’lere bağlanır (34). Virusun konak hücreye girişi virion zarfında yer alan glikoprotein peplomerlerinin hücre zarındaki reseptörlere tutunmasından sonra füzyon ya da endofagositoz yolu ile gerçekleşir. Virus çoğalması hücre çekirdeğinde meydana gelir. Virionlar zarfını çekirdek zarından tomurcuklanma sırasında alır ve endositik kesecikler içinde plazma membranına taşınır. Virus çoğalmasına bağlı olarak hücrelerde intranüklear inklüzyon cisimciklerini de içeren sitopatolojik etkiler görülür (59). Herpesviridae ailesi Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae ve Gammaherpesvirinae olarak isimlendirilen 3 alt aileye bölümlendirilmiştir. Bu alt ailelerin her biri kendilerine özgün persistens mekanizmalarına sahiptir (31). Tüm herpesvirus enfeksiyonlarında dönemsel ya da devamlı saçılımın olduğu latent persiste enfeksiyon meydana gelebilir (58). Alphaherpesvirinae alt ailesinde yer alan BHV-1 virusunun solunum sistemi enfeksiyonunun ardından trigeminal veya genital sistem enfeksiyonundan sonra sakral sinir gangliyonlarına yerleşerek latent kaldığı (60) ve latent enfeksiyonun stres, nakil, soğuk veya aşırı kalabalık gibi faktörlerin etkisiyle reaktive olabildiği gözlenmiştir (58, 61). Latent enfeksiyona sahip olan hayvanlarda reaktivasyon genellikle subkliniktir, fakat bu hayvanlar sürü içinde enfeksiyon kaynağı olarak rol alır (61). BHV-1; viral DNA’nın restriksiyon endonükleaz enzimi ile yapılan analizlerine göre; BHV-1.1 (solunum sistemi), BHV-1.2 (genital sistem) ve BHV-1.3 (ensefalit) olmak üzere üç alt gruba ayrılmıştır (62). Daha sonra BHV-1.3, BHV-5 adıyla ayrı bir virus türü olarak sınıflandırılmıştır (63). BHV-1.2 ise kendi içinde BHV-1.2a ve BHV-1.2b olarak iki alt gruba ayrılmıştır (61, 63). BHV 1.1.’in solunum sistemi enfeksiyonları yanında BHV 1.2a 7 ile birlikte aborta neden olabileceği, BHV 1.2b’nin ise abort olgularıyla ilişkisinin olmadığı gösterilmiştir (64, 65). Ayrıca BHV-1.2 suşlarının deneysel olarak solunum sisteminde hastalık yapabileceği ve bu enfeksiyonların klinik olarak fark edilemeyen primer enfeksiyon ya da reaktivasyon ile oluşan enfeksiyon şeklinde gelişebileceği bildirilmiştir (66, 67). Bovine herpesvirus 1 sığırlarda rhinotrakeitis, vulvovaginitis, balanopostitis, konjuktivitis, enteritis, abort, yeni doğanlarda generalize hastalık ve ensefalitis gibi birçok bozukluğa neden olmaktadır. Virusun nazal, oral ya da genital akıntılar ile saçılmaktadır (58). Bulaşma ise genellikle mukozal temasla olurken etkenin damlacık enfeksiyonu ile de yayıldığı gösterilmiştir (59). Etken solunum sisteminde subklinik, ılımlı veya şiddetli bir enfeksiyon meydana getirilebilir. Komplikasyonlar sonucunda morbidite %100’e, mortalite ise %10’a ulaşabilir. Başlangıçta ateş, depresyon, iştahsızlık ve önceleri seröz olan, daha sonra mukoprulent karakter kazanan bol nazal akıntı görülür. Nazal mukoza hiperemiktir. Burun boşluğunda tespit edilmesi güç olan lezyonlar meydana gelebilir. Dispne, ağızdan nefes alma, salivasyon ve genellikle lakrimasyonla beraber tek ya da çift taraflı konjuktivit görülür (34). Yeterli maternal bağışıklığa sahip olmayan 3 aylıktan küçük buzağılarda görülen herpesvirus enfeksiyonlarında hemen hemen tüm organ ve dokularda nekroz odakları oluştuğu görülmektedir (59). Üst solunum yollarında virus farenks ve tonsillerden sinirler ve lenfler aracılığıyla göze, beyine, lenf nodüllerine ve sindirim sistemine ulaşmaktadır. Buzağıların abomazumları ruminant olmayan canlıların midelerine benzemektedir. Virus abomazumda düşük pH ile karşılaşınca inaktive olur (68). Hayvanlarda pH yeterince düşük değilse (normal pH 1,7-2) virus inaktive olması gereken abomazumdan kolaylıkla geçerek sistemik enfeksiyon oluşturur ve latent kalabilir. Sindirim sisteminin kaudal kısmının pH’sı ise yaklaşık 7’dir. Sindirim sisteminden inaktive olmadan geçen virus genital sistemi kolaylıkla enfekte edebilir. Ayrıca etken viremi ile tüm organlara hatta gebelerde fötusa ulaşabilir ve gebelik abort ile sonlanabilir (59, 68). BHV-1 genellikle BVDV ve PI-3 viruslarıyla beraber görülmektedir. PI-3 virusuna benzer şekilde BHV-1’de akciğer sürfektan maddesine etki ederek hayvanın sekonder enfeksiyonlara duyarlı hale gelmesine neden olur (36). Bu nedenle birden fazla etkenin birlikte seyrettiği enfeksiyonların şiddeti daha fazladır. 8 Enfeksiyon latent kalabildiği için viremi ya da saçılım dönemi haricinde etkenin kendisini tespit etmek zordur. Bu nedenle BHV-1’in teşhisi için daha çok serolojik yöntemler kullanılmaktadır. ELISA ile antijen tespiti genellikle aborte fötustan ve nekropsi materyalinden yapılmaktadır. BHV-1 enfeksiyonlarının teşhisinde virolojik olarak virusa duyarlı hücre hatları, virus nötralizasyon testi, elektron mikroskopi, direkt ELISA, direkt immunofloresan testi ve PCR yöntemleri kullanılmaktadır (58, 68). Virus izolasyonu, direkt ELISA ve direkt immunofloresan testleri karşılaştırıldığında en duyarlı yöntemin hücre kültüründe virus izolasyonu olduğu görülmüştür. Serolojik yöntemlerden ise serum nötralizasyon testi ve indirekt ELISA yaygın olarak kullanılmaktadır (68). Enfeksiyondan korunmak için uygun bakım ve besleme koşullarına uyulmalıdır. Enfeksiyonun yayılmasını kontrol altında tutabilmek amacıyla bovine herpesvirus 1 aşıları tek ya da birden fazla etken ile kombine olarak attenüe ya da inaktif aşılar şeklinde hazırlanmaktadır (58). Eradikasyon için sürüdeki enfeksiyonun yaygınlığına ve işletmenin ekonomik gücüne göre çeşitli yöntemler (aşılama, ayıklama, vb. ) tercih edilebilir (69, 70). Günümüzde BHV-1 eradikasyon programlarında marker aşılar önemli bir yer tutmaktadır. Marker BHV-1 aşıları daha çok gE delesyonu ile elde edilmektedir (71). Bunun yanında marker antijen (protein) inzersiyonuyla üretilen ve pozitif marker aşı olarak isimlendirilen aşılar ve subünit aşıların da kullanım olanağı bulunmaktadır. Marker aşılar canlı veya inaktive olabilir. Aşının her iki formu da humoral ve hücresel bağışıklığı sağlayarak virus saçılımını azaltmaktadır (58). Bulaşma riskinin yüksek olduğu sürülerde BHV-1 marker aşı kullanılabilir. Bu sürülerde spesifik izotiplendirme teknikleri kullanılarak marker aşılı hayvanlar ile enfekte hayvanlar kolaylıkla ayırt edilmektedir (55). Uygun mücadele programları oluşturulduğunda BHV-1 enfeksiyonlarının ülke düzeyinde eradike edilebileceği gösterilmiştir (70, 72-75). Türkiye’de sığırlarda BHV-1 virusuna karşı nötralizan antikorların varlığı ilk defa 1971 yılında saptanmıştır (76). Sonraki dönemlerde ülkemizde BHV-1’in yaygınlığına ilişkin birçok çalışma yapılmıştır. Bu çalışma verilerine göre sığırlarda BHV-1 seroprevalansının %17,1 ile %74 arasında değiştiği görülmektedir (21, 23-25, 28, 55, 77- 80). Manda, koyun ve keçilerde de etkene yönelik antikor tespit edilmesi ve küçük gevişgetirenler ile sığırlar arasında türler arası virus naklinin söz konusu olması, değişik ruminant türlerinin bir arada barındırılması ve aynı meralardan otlatılması gibi nedenlerle 9 diğer ruminantların sığır popülasyonu için enfeksiyon kaynağı olabileceği değerlendirilmektedir (40, 81-83). Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) New York’ta 1946 yılında klinik olarak bildirilen BVD’ye ilişkin ilk virus izolasyonu 1957 yılında gerçekleştirilmiştir (84, 85). Flaviviridae ailesinden Pestivirus genusuna dâhil edilen BVDV linear, pozitif anlamlı ve tek iplikçikli 12,5 kb büyüklüğünde bir RNA genomu taşımaktadır. BVDV’nin çıplak RNA’sı da enfeksiyöz özelliktedir. Viral genom tek bir open reading frame içerir. Sentezlenen poliprotein translasyon sonrasında enzimatik yolla parçalanarak 4 tane yapısal (C, Erns, E1, E2) ve 7 tane yapısal olmayan (P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) toplam 11 adet proteine ayrılır. NS2 (p54) ve NS3 (p80) proteinleri NS2-3 (p125) öncü proteininden köken alır. Bu öncü protein sitopatojen BVDV suşlarında ikiye ayrılarak NS2 ve NS3’ü oluşturur. Sitopatojen olmayan virus suşlarında ise NS2-3 olarak kalır (86, 87). Yapısal proteinlerden biri olan E2 glikoproteini özel bir öneme sahiptir. Çünkü BVDV enfeksiyonunda şekilllenen nötralize edici antikorların büyük bir bölümü E2 proteinine karşı oluşur. Ancak E2 proteini mutasyonel değişimlerden çok sık etkilenir. Dolayısıyla virusun antijenik yapısı farklılaşır. Böylece sahada enfeksiyon oluşturan suşlar arasında önemli antijenik/serolojik farklılıklar ortaya çıkar (88). Virus, reseptör ilişkili endositoz ile hücre içine girer ve hücre sitoplazmasında çoğalarak olgunlaşır. Yeni nesil virionlar ekzositoz yoluyla ya da hücre lizisi ile hücreden saçılır. Kübik simetrili olan virion yaklaşık 40-60 nm çapa sahiptir ve zarf taşımaktadır (89). Flaviviruslar çevre şartları ve dezenfektanların etkisiyle kolaylıkla inaktive olurlar (31). BVDV’nin sitopatojen (cpe) ve sitopatojen olmayan (nonsitopatojen, ncpe) iki biyotipi mevcuttur (90). Bu iki biyotipin de sığırlarda plasentayı geçebildiği bilinmektedir. Ek olarak sitopatojen biyotip nonsitopatojen biyotipe göre daha dayanıksızdır ve fötusta immun yanıtın oluşmasıyla kolaylıkla elimine edilebilir (91). 10 Etkenin BVDV-1 ve BVDV-2 olmak üzere iki genotipi vardır (92) BVDV-1’in 16 adet (1a-p) (93-97), BVDV-2’nin ise 4 adet (BVDV 2a-d) alt genotipi olduğu bilinmektedir (98). Solunum yolu enfeksiyonlarında her iki genotipin de varlığı gösterilmiş (99) ve BVDV 1b’nin solunum yolu enfeksiyonlarında baskın altgenotip olduğu tespit edilmiştir (100). Ülkemizde her iki biyotipin ve genotipin var olduğu bilinmektedir (88, 96, 101, 102). Saha enfeksiyonlarının %90’ından fazlasında nonsitopatojen suşların rol oynadığı bildirilmiştir (96, 103). Türkiye’deki yerel BVDV suşlarının önemli bir kısmının BVDV-1 içerisinde yer aldığı, ancak bazı izolatların daha önceki alt gruptan farklı olarak yeni bir alt grupta (BVDV-1l) yer alabileceği gösterilmiştir (96, 104). Dünyada yaygın bir hastalık olan BVD direkt temasla, tüm sekret ve ekskretlerle, kontamine fomitlerle, iatrojenik yolla, modifiye canlı aşılarla ve konjenital yolla, gerek fötal dönemde gerekse postnatal dönemde enfeksiyona neden olmaktadır (105). BVDV her yaştaki hayvanda enfeksiyon oluşturmaktadır. Buzağılarda maternal antikorların azalmasıyla birlikte enfeksiyona yakalanma riskinde de artış meydana gelir (34). BVDV enfeksiyonlarının patogenezi enfeksiyon sırasındaki virus suşu, virusun biyotipi, hayvanın yaşı, gebelik durumu, transplasental enfeksiyonun meydana gelmesi ve buna bağlı olarak immun toleransın şekillenmesi, gebeliğin ortalama 120. gününde fötal immun yanıtın oluşması gibi bir takım koşullardan etkilenir. Gebe olmayan hayvanlarda ateş, nazal ve oküler akıntı, eroziv stomatitis, löykopeni, ishal ve ineklerde süt veriminde azalma gözlemlenir (106). Gebe hayvanlardaki enfeksiyon tablosu ise virus suşuna ve gebeliğin dönemine yani fötusun yaşına bağlı olarak değişen klinik bulgularla sonuçlanmaktadır. Gebeliğin ilk trimesterinde virusun fötusa geçmesi genellikle resorbsiyon ve embriyonik ölümle sonuçlanır. Sığır fötuslarında immunokompedans gelişimi yaklaşık olarak fötal hayatın 90-120. günleri arasında yani ikinci trimesterin başlangıcında tamamlanmaktadır. Bu dönemde organogenezis ve fötal immun yanıtın gelişimi tamamlanır. Dolayısıyla birinci ve fötal immun yanıtın gelişim aşmasına bağlı olarak ikinci trimesterde nonsitopatojen BVDV suşu ile enfekte olan fötus etkene karşı antikor yanıtı oluşturamayabilir ve fötal ölüm olabileceği gibi yavru malformasyonlarla ya da düşük doğum ağırlığı ile dünyaya gelebilir. Yaşamaya devam edenler hayat boyu virus taşıyıcısı olarak kalır ve devamlı virus saçar. Bu şekilde oluşan enfeksiyon ‘immunotolere persiste enfeksiyon (PE)’ olarak isimlendirilir. Bu hayvanların yaklaşık %50’si 11 yaşamlarının ilk yılında ölürler. Persiste enfekte (PE) hayvanlarda postnatal dönemde homolog bir sitopatojen BVDV biyotipinin vücuda alınmasıyla ya da nonsitopatojen BVDV biyotipinde meydana gelen mutasyonel değişiklikler sonucunda mukozal hastalık (mucosal disease) (107) gelişimi gözlenir (108). PE hayvanların bir sürüde bulunma olasılığı %0.5’den %2’ye kadar değişebilir. Bu hayvanlar devamlı virus saçıcısı (99) konumunda olduklarından dolayı tüm sürü için çok büyük önem taşır. Yine immun yanıtın gelişim aşamasına bağlı olarak ikinci ve üçüncü trimester de virusla karşılaşan fötus genellikle antikor yanıtı oluşturur ve etkeni elimine ederek antikor pozitif olarak dünyaya gelir. Abort ise gebeliğin her döneminde meydana gelebilir (34). Etkenle daha önce herhangi bir teması olmayan sürülerde duyarlı hayvan sayısı fazla olduğundan BVDV’nin sürüye girmesiyle birlikte meydana getirdiği klinik tabloların daha ağır olması ve sürülerde büyük kayıplar oluşturması beklenebilir. In vivo ve in vitro çalışmalarda etkenin immun sistem üzerine pek çok etkisi olduğu gösterilmiştir (109). BVDV’nin alveolar makrofajlar üzerine etkilerinin araştırıldığı deneysel çalışmalarda (110, 111) kullanılan sitopatojen BVDV suşunun Fc ve komplement reseptörlerinin üretimini azalttığı tespit edilmiştir. Fagositik ve mikrobiyel aktiviteler yanında nötrofillerin kemotaktik etkilerinin de bozulduğu görülmüştür (110). Bu şekilde vücudun savunma mekanizmasında bir takım aksaklıklar meydana gelmekte ve hayvanın sekonder enfeksiyonlara olan duyarlılığı artmaktadır. Yapılan deneysel bir çalışmada BHV-1’in tek başına meydana getirdiği enfeksiyonda yalnız üst solunum yollarından izole edildiği, BVDV ile ortak oluşturulan enfeksiyonda ise hem üst, hem alt solunum yollarından ayrıca karaciğer, dalak, beyin ve barsaklardan izole edildiği görülmüştür (36). Farklı bir çalışmada ise yine BVDV’nin BHV-1’in patojenitesinde artışa neden olduğu saptanmıştır (10). BVDV’nin BHV-1 ve PI-3’ün yanında BRSV ile de sıklıkla sinerji gösterdiği ve diğer patojenlerle beraber seyrettiği zaman tek başına oluşturduğu enfeksiyondan daha şiddetli bir hastalık tablosu meydana getirdiği bildirilmiştir (36). Türkiye’de BVDV varlığı ilk kez 1964’te Öncül ve ark. (112) tarafından ortaya konulmuştur. Yine ülkemizde Burgu ve arkadaşları (113) tarafından yapılan bir çalışmada örneklenen 3360 sığırda seroprevalans değeri %64,2, persiste enfeksiyon oranı ise %0,25 olarak tespit edilmiştir. İşletme özellikleri ve yetiştiricilik tipi enfeksiyon prevalansına 12 direkt etkiyen faktörlerdir. İşletme büyüklüğü arttıkça sürüdeki seropozitif hayvanların oranının da arttığı görülmüştür (23). Türkiye’de entansif yetiştiricilik yapılan kapalı devlet işletmelerinde BVDV seroprevalansının %0,6-%70 arasında değiştiği tespit edilmiştir (29). Ülkemizde gerçekleştirilen çalışmalar enfeksiyonun tüm bölgelerde bulunduğunu göstermektedir (23-25, 28, 29, 55, 96, 114-117). Mandalarda Gür ve Akça’nın (83), koyun ve keçilerde Yeşilbağ ve Güngör’ün (40) gerçekleştirdiği çalışmalarında BVDV’ye karşı seropozitiflik tespit edilmiştir. Bu durum manda, koyun ve keçi popülasyonunun sığırlar için enfeksiyon kaynağı olabileceğini düşündürmektedir. BVDV enfeksiyonlarının laboratuvar teşhisinde virus izolasyonu, viral antijen tespiti, seroloji ve viral RNA tespitine yönelik testler kullanılmaktadır (118, 119). Hücre kültüründe nonsitopatojen BVDV biyotipine dâhil suşların üretilmesi direkt olarak tespit edilemediğinden bu etkenlere spesifik konjugatlarla gerçekleştirilen immunoperoksidaz ve immunofloresan testleri kullanılmaktadır (99, 120). Enfeksiyondan korunmak amacıyla sürünün durumuna, enfeksiyonun yaygınlığına ve işletmenin ekonomik gücüne göre önerilen çeşitli kontrol ve eradikasyon yöntemleri mevcuttur (121-123). Önerilen mücadele yöntemlerinin temeli PE hayvanların tespit edilerek sürüden ayıklanması ve sürüye yeni katılacak hayvanların BVDV yönünden kontrollerinin yapılmasına dayanmaktadır. BVDV’ye karşı kullanılan monovalan ve polivalan ticari aşılar mevcuttur. Bovine Adenovirus Tip 3 (BAV-3) Adenovirusların önemli bir bölümü insanlar ve hayvanlarda genellikle üst solunum yollarında ve bazen de gaitada saptanabilmekte ve çoğunlukla üst solunum yollarında subklinik enfeksiyon meydana getirmektedir (124). Mastadenovirus, Aviadenovirus, Atadenovirus, Siadenovirus ve Ichtadenovirus genuslarından oluşan Adenoviridae ailesi zarfsız, kübik simetrili ve 80-100 nm çapına sahip virionlardan oluşmaktadır (125). Kübik simetrik yapının birleşim köşelerinden çıkan 12 adet penton iplikciği bulunmaktadır. Bu yapılar adenoviruslara tipik bir morfoloji 13 kazandırır. Bu iplikcikler virionun konak hücreye tutunmasında görev alır ve virusa hemaglütinasyon aktivitesi kazandırır (31) . Etken çift iplikçikli 26-45 kb büyüklüğünde linear DNA genomu taşır (125). Virus replikasyonu konak hücrenin çekirdeğinde gerçekleşir. Olgunlaşan yeni nesil virionlar hücre lizisi ile konak hücreden saçılır. Sığır adenovirusları çoğaldığı hücrede intranüklear inklüzyon cisimcikleri oluşturur. Adenovirus genusu içerisinde değişik canlı türlerinde görülen yaklaşık 50 serotip mevcuttur (126). Adenovirus serotipleri farklı canlıların eritrositlerini aglütine edebilmektedir. Örneğin; BAV-1 rat eritrositlerini, BAV-2 hem rat, hem fare eritrositlerini BAV-3 ise maymun eritrositlerini aglütine etmektedir (127, 128). Sığır adenovirusları pH 2 ve pH 11’e, %0.25’lik tripsin çözeltisine, 30°C’de 50 dk süresince uygulanan ısıya ve hatta 7 gün boyunca uygulanan 41°C’lik ısıya dayanıklıdır. Fakat uygun konsantrasyonda kullanılan klorin türevi dezenfektanlara duyarlıdır (129). BAV-3 buzağılarda eozinofilik ve bazofilik karaktere sahip intranüklear inklüzyon cisimcikleriyle birlikte yaygın nekrotize bronşitis, bronşiolitis ve alveolitis meydana getirmektedir (130, 131). Bazı adenoviruslar (sığır adenoviruslarından serotip 3, 7, 9 ve insan adenoviruslarından serotip 12, 18) ise rodentler için onkojeniktir (127). Sığır adenoviruslarının bilinen 10 adet serotipi vardır. Bunlardan bovine adenovirus 1, 2, 3, 9 ve 10 Mastadenovirus, bovine adenovirus 4, 5, 6, 7 ve 8 ise Atadenovirus genusunda yer almaktadır (132). Adenoviruslar akciğer ve barsaklara affinitesi olan etkenlerdir (132). Genellikle asemptomatik seyreder veya hafif solunum yolu enfeksiyonuna neden olurlar (36, 133). Enfeksiyonun direkt solunum yolunu ya da fekal- oral yolu takip ederek bulaştığı bilinmektedir. Etkenin transplasental yolla geçtiği de gösterilmiştir ancak bu bulaşma yolunun görülme sıklığı hakkında kesin bir bilgi yoktur (132). Sekonder enfeksiyonların devreye girmesiyle enfeksiyon klinik olarak görülmeye başlanabilir. Enfeksiyon sonrası meydana gelen ağırlık kaybı, büyümede gerilik ve sekonder pnöymoni ile ağır ekonomik kayıplar meydana gelmekte bu durum enfeksiyonun yetiştiricilik yönünden ne kadar önemli olduğunu göstermektedir. Bazı olgularda hasta hayvanlar iyileşmekte fakat enfeksiyon sırasında oldukça zayıf düşmüş olanlar genellikle ölmektedir (134). Deneysel bir enfeksiyon sonrasında buzağılarda klinik olarak herhangi bir bulgu görülmezken patolojik olarak akciğerlerinde nekrotize ve proliferatif broşiolitis, bronkopnöymoni ve bronşiol epitel hücrelerinde intranüklear inklüzyon cisimcikleri görülmüştür (132). 14 Solunum yolu enfeksiyonuna sahip sığır sürülerinden BAV-3’ün izolasyonu 1979 yılında Lehmukhul ve arkadaşları (135) tarafından gerçekleştirilmiştir. Türkiye’de sığırlarda adenovirus enfeksiyonlarının varlığı ilk kez Toker tarafından 1983 yılında ortaya konulmuştur (136). Ülkemizde yapılan serolojik çalışmalarda BAV-1 ve BAV-3’e karşı %89,5 ve %92,3 gibi yüksek oranlarda seroprevalans değerleri saptanmıştır (23, 26, 28, 80, 137, 138). Koyun ve keçilerde ise BAV-1’e karşı %86, BAV-3’e karşı ise %93 gibi yüksek oranlarda seropozitivite saptanmış olması bu hayvanların sığırlar için enfeksiyon kaynağı olabileceğini düşündürmektedir (40). Adenovirus enfeksiyonlarının teşhisinde kullanılan virolojik yöntemler virus izolasyonu, virus nötralizasyon testi, direkt ELISA, direkt immunofloresan testi ve PCR iken, serolojik yöntemler ise serum nötralizasyon, agar jel presipitasyon, hemaglütinasyon inhibisyon ve indirekt ELISA testleridir (23, 139). Bovine Coronavirus (BCoV) Coronoviridae ailesi zarflı, 80-220 nm büyüklüğünde ve helikal simetrili virionlara sahiptir. Bu ailede Coronovirinae ve Torovirinae olmak üzere 2 alt aile mevcuttur. Coronavirinae alt ailesi; Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Deltacoronavirus ve Gammacoronavirus olmak üzere 4 genusa ayrılmaktadır. Bu genuslarda insan ve hayvanları enfekte edebilen birçok virus yer almaktadır. Fakat bovine coronavirusun bu sınıflandırmadaki yeri henüz kesin olarak belirlenmemiştir (140). Coronoviridae ailesindeki viruslar at nalı benzeri peplomerlere sahiptir. Coronovirus genomu tek iplikcikli ve pozitif anlamlı linear bir RNA’dır. Bilinen en büyük viral RNA genomudur (20-32 kb). Çoğalma sırasında komplementer RNA çıkarılır ve bundan 5-7 adet subgenomik mRNA sentezlenir. Virus sitoplazmada çoğalır. Viral zarf endoplazmik retikulum ya da golgi aygıtından köken alır ve virion hücreden tomurcuklanma yolu ile saçılır (31). Coronavirus enfeksiyonlarında akla ilk gelen tablo ishalle seyreden enfeksiyon tablosu olsa da buzağı pnöymoni salgınlarında da BCoV’un varlığı gösterilmiştir (6, 141-145). Park ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada (146) enterik coronavirusun buzağılarda hem sindirim, hem de solunum yollarına olmak üzere iki bölgeye de tropizmi olduğu ve bu 15 virusun solunum yolu etkenleri ile sinerjik etki yaratarak stres durumunda buzağılarda pnöymoniye neden olabileceği öngörülmüştür. Solunum yolundan izole edilen coronavirus ile enterik yoldan izole edilen coronavirusun biyolojik ve antijenik özellikleri yönünden bazı araştırmalarda herhangi bir fark tespit edilmezken (147, 148) diğer bazı araştırmalarda suşlar arasında bazı farkların olduğu ileri sürülmektedir (142, 149). Bu sonuçlar enterik coronavirus ve respiratorik coronavirus arasında çapraz bağışıklığın mümkün olabileceğini göstermektedir. Virusun epidemiyolojik karakterini anlayabilmek için virus saçılımı ile enterik ve solunum formları arasındaki ilişkinin açıklığa kavuşturulması gereklidir. Virusun saçılmasında artışa neden olan faktörler arasında diğer solunum sistemi viruslarında olduğu gibi nakil sırasında oluşan stresli koşullar ve kalabalık ortamlar sayılabilir. Türkiye’de sığır solunum sistemi enfeksiyonlarına yönelik yapılan bir araştırmada BCoV’un fekal ve nazal yoldan saçılımı arasında anlamlı bir ilişki bulunamamıştır (12). Fakat bu sonucun örneklenen hayvan sayısının az olmasından kaynaklabileceği yazar tarafından da öngörülmüştür. Türkiye’de yapılan bir araştırmada ishalli buzağıların %15,4’ünün sadece coronavirusu, %13,4’ün de hem coronavirus hem de rotavirusu birlikte saçtığı bildirilmiştir (150). Etkene karşı gelişen antikorların re-enfeksiyon olmadan yıllar sonra bile tespit edilebildiği gösterilmiştir (151). İşletmelerde yapılan seroprevalans çalışmalarında ishalli ve klinik olarak sağlıklı görünümlü buzağı ve erişkin sığırlarda %4,4 ile %100 arasında değişkenlik gösteren antikor varlığı saptanmıştır (27, 152-154 ). 16 Tezin Amacı Solunum sistemi enfeksiyonları sığır yetiştiriciliğine etki eden, buzağı ölümleri ve ekonomik olarak kayıplara neden olan önemli bir sorundur. Genellikle multifaktöriyel bir sorun olmasına karşın solunum sistemi enfeksiyonlarının büyük bir bölümünde virusların birincil etken olarak yer aldığı gösterilmiştir. Özellikle buzağılarda söz konusu enfeksiyonlara karşı maternal antikorların tespit edilme süresi ve yeni enfeksiyonlarla karşılaşma yaşının belirlenebilmesi proflaksi çalışmaları açısından önem taşımaktadır. Bu tez çalışması ile Bursa’daki sığırlarda solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan önemli viral patojenlerin sürü bazında enfeksiyon dinamiklerinin serolojik olarak takip edilmesi amaçlanmıştır. Böylece araştırılan her bir etkene karşı mevcut maternal antikorların gerileme dönemleri, buzağıların muhtemel ilk enfeksiyona maruz kalma yaşı ve işletmelerde uygulanması gereken optimum aşılama zamanlarına ilişkin verilerin elde edilmesi planlanmıştır. Ayrıca tez kapsamında virolojik çalışmaların da yürütülmesi ve elde edilen serolojik verilerin virolojik verilerle desteklenmesi hedeflenmiştir. 17 GEREÇ ve YÖNTEM Gereç Örnekleme Yapılan İşletmeler Tez çalışmasında kullanılan hayvanlar Bursa iline bağlı Karacabey, Mustafakemalpaşa ve Yenişehir ilçelerinde yer alan işletmelerden seçildi (Şekil-1). Bu kapsamda farklı bakım koşulları ve hayvan yoğunluğuna sahip 10 adet süt sığırı işletmesinden örnekleme yapıldı. Bu işletmeler hayvan sayısı 20’den az (küçük ölçekli işletme), 20-100 arası (orta ölçekli işletme) ve 100’den fazla (büyük ölçekli işletme) yetişkin hayvan olacak şekilde üç gruba ayrıldı. Çalışmada örneklemenin yapıldığı işletmelere ait bilgiler aşağıdaki tabloda sunudu (Tablo-1). Şekil-1. Örnekleme çalışmalarının yürütüldüğü bölgeler 18 Tablo-1. Araştırma kapsamında örnekleme yapılan işletmeler ve yetiştirme özellikleri İşletme no Bölge İşletme Hayvan sayısı İşletme büyüklüğü* türü İşletme 1 Karacabey Büyük 500-1000 arası Yarı açık İşletme 2 Karacabey Büyük >1000 Yarı açık İşletme 3 Karacabey Büyük >1000 Yarı açık İşletme 4 Yenişehir Büyük 500-1000 arası Yarı açık İşletme 5 Mustafakemalpaşa Orta 20- 100 arası Yarı açık İşletme 6 Mustafakemalpaşa Orta 20- 100 arası Yarı açık İşletme 7 Mustafakemalpaşa Küçük <20 Yarı açık İşletme 8 Mustafakemalpaşa Küçük <20 Kapalı ahır İşletme 9 Mustafakemalpaşa Küçük <20 Kapalı ahır İşletme 10 Mustafakemalpaşa Küçük <20 Kapalı ahır * Hayvan sayısı 20’den az olan işletmeler “küçük”, 20-100 arası olan işletmeler “orta” ve 100’den fazla olan işletmeler “büyük” ölçekli olarak sınıflandırılmıştır. Örneklenen Hayvanlar Çalışma kapsamında, yukarıda özellikleri verilen süt sığırı işletmelerinde bulunan Holstein ırkı hayvanlar kullanıldı. İncelenen enfeksiyonların buzağılarda aylık takibinin yapılabilmesi amacıyla söz konusu işletmelerde 1 aylık süre zarfında doğan buzağılar çalışmaya dâhil edildi ve kan örnekleri toplandı. Çalışmaya 129 adet buzağı ile başlanmış olmasına karşın çalışma süresince ölüm ve elden çıkarma gibi işlemlerden dolayı toplam 17 buzağı araştırma dışı kaldı. Böylece 1 yıllık süreç sonunda 112 adet buzağının tam verileri elde edilmiş oldu. Ayrıca çalışmada kullanılan tüm buzağılar sadece kendi annelerinin sütü ile beslendi. İşletme 2’de örneklenen 29 buzağının 14 adedi Haziran ayında, geriye kalan 15 adedi 30 gün sonra yani Temmuz ayında doğduğu için 2 grubun örneklemeleri arasında 1 aylık fark oldu. İşletme 3’te hem aşılı hem aşısız buzağılar örneklendiği için bu işletme içerisinde yapılacak değerlendirmeler aşılı ve aşısız buzağılar olmak üzere 2 gruba ayrılarak yapıldı. 19 Böylece işletmede bulunan 18 adet aşılı buzağı toplam popülasyona dâhil edilmedi. Dolayısıyla 94 adet buzağı aşısız toplam buzağı popülasyonunu oluşturdu (Tablo-2). Örneklenen buzağıların annelerinin bağışıklık durumunu saptamak ve maternal bağışıklık üzerine değerlendirmeler yapabilmek için buzağılardan yapılan ilk örnekleme sırasında buzağıların annelerinden de kan örneği alındı. İşletme 3’de bulunan 10 adet anne doğumdan hemen sonra işletmeden çıkarıldığı için bu hayvanlardan örnekleme yapılamadı. Dolayısıyla toplam 102 anneden kan örneği sağlanmış oldu. Takip edilen işletmelerde örnekleme yapılan buzağılar ve annelerine ait bilgiler Tablo-2’de sunuldu. 20 Tablo-2. Araştırma kapsamında örneklenen işletmelerden hayvanlara ait bilgiler İşletme no İşletme Buzağılara ait bilgiler Annelere ait bilgiler büyüklüğü Toplam Dişi Erkek Aşılı Aşısız Sayı Anneye uygulanan aşılar Sayı İşletme 1 Büyük 14 9 5 - 14 14 BVDV, BHV-1 ve BCoV İşletme 2 Büyük 31 31 - - 31 31 BVDV, BHV-1 ve BCoV İşletme 3 Büyük 39 18 21 18* 21 29** BVDV tip-1 ve tip-2, BHV-1, BRSV, PI-3 ve BCoV İşletme 4 Büyük 6 4 2 - 6 6 BVDV tip-1 ve tip-2, BHV-1, BRSV, PI-3 ve BCoV İşletme 5 Orta 9 5 4 - 9 9 BCoV İşletme 6 Orta 3 - 3 - 3 3 BCoV İşletme 7 Küçük 1 - 1 - 1 1 Aşısız İşletme 8 Küçük 5 3 2 - 5 5 Aşısız İşletme 9 Küçük 2 2 - - 2 2 Aşısız İşletme 10 Küçük 2 2 - - 2 2 Aşısız Toplam 10 112 74 38 18 94 102 *Bu işletmedeki dişi buzağılar inaktif BVDV tip 1ve 2, BHV-1, PI-3 ve BRSV içeren ticari aşı ile 4 aylık yaşta aşılanmışlardır. ** Bu işletmelerdeki 10 adet anne doğumdan hemen sonra işletmeden çıkarıldığı için bu annelerden örnekleme yapılamamıştır. Bu hayvanlardan 16 tanesi aşılı buzağıların annesi iken diğer 13 tanesinin aşısız buzağıların annesi olduğu kaydedildi. 21 Etik Kurul İzin Belgesi ve Anket Formu Tez çalışması sırasında hayvanlardan alınan kan ve svab örnekleri için gerekli izin Uludağ Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu (HADYEK) tarafından 23.02.2010 tarihli ve 2010-02/01 nolu karar ile onaylandı. İşletmelere ait olası risk faktörlerini belirleyebilmek amacıyla işletmelerde çalışan sorumlu veteriner hekimler ile birlikte doldurulmak üzere EK-1’de örneği sunulan anket formu kullanıldı. Kan Örnekleri Tez çalışması kapsamında 04/06/2010 - 29/07/2010 tarihleri arasında doğan 112 adet buzağıdan doğumu takiben 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 ve 12 aylık olduklarında serolojik incelemeler için kan örneği alındı. Buzağılardan yapılan ilk örnekleme sırasında buzağıların annelerinden (102 adet) de antikoagulansız tüplere kan örnekleri alınarak değerlendirildi. Svab Örnekleri Çalışma süresince solunum yolu enfeksiyonu klinik belirtileri gösteren hayvanlardan svab örnekleri toplandı. Sahadaki virus sirkülasyonunun takip edileblmesi amacıyla örnekler hem tez kapsamındaki 10 işletmeden, hem de tez kapsamında olmayan işletmelerden temin edildi. Burun ve göz akıntısı görülen hayvanlarda her iki bölgeden svab alınırken sadece burun akıntısı görülen hayvanlardan yalnız burun svabı örnekleri alındı. Bu kapsamda toplam 80 adet burun svabı ve örneklenen hayvanların 18 adedinden de göz svabı örneklendi (Tablo- 3). 22 Tablo-3. Svab örnekleri ve örnekleme dönemleri Svab sayısı Örnekleme dönemi ve Örneğin alındığı işletme Burun Göz mevsimi İşletme 6 1 - Ağustos 2010 -Yaz İşletme 7 1 - Kasım 2010 - Sonbahar İşletme 2 2 2 Kasım 2010 - Sonbahar İşletme 1 1 1 Kasım 2010 - Sonbahar İşletme 2 11 4 Aralık 2010 - Kış İşletme 9 3 3 Aralık 2010 - Kış İşletme 2 7 - Ocak 2011 - Kış İşletme 1 1 - Ocak 2011 - Kış İşletme 3 1 - Ocak 2011 - Kış M.Kemalpaşa kapalı işletme 1* 4 1 Ocak 2011 - Kış İşletme 2 1 1 Nisan 2011 - İlkbahar İşletme 4 1 - Haziran 2011- Yaz İşletme 4 1 1 Temmuz 2011 - Yaz İşletme 4 13 3 Eylül 2011 - Sonbahar Muğla kapalı işletme* 12 - Kasım 2011- Sonbahar İşletme 4 1 - Aralık 2011 - Kış Yenişehir kapalı işletme 1* 2 2 Haziran 2012 - Yaz M.Kemalpaşa kapalı işletme 2* 9 - Haziran 2012 - Yaz Yenişehir kapalı işletme 2* 8 - Haziran 2012 - Yaz Toplam 80 18 *: Düzenli takip edilen işletmeler haricindeki işletmeler Akciğer Örnekleri Tez çalışmasında öngörülen virolojik çalışmaları gerçekleştirebilmek amacıyla takip edilen işletmelere ilave olarak mezbaha çalışmaları da yürütüldü. Bu amaçla çalışmanın yürütüldüğü işletmelerden bağımsız olarak mezbahada kesilen hayvanların lezyonlu 3 akciğerlerinden 5 cm büyüklüğünde doku örnekleri alındı (Tablo-4). 23 Tablo-4. Akciğer dokularının örneklenme dönemleri Örnekleme yapılan bölge Örnek Örnekleme dönemi sayısı Mustafakemalpaşa* 1 07/01/2011 Çalı/Bursa 5 13/12/2011 Çalı/Bursa 13 19/12/2011 Çalı/Bursa 13 26/12/2011 Çalı/Bursa 7 02/01/2012 Toplam 39 *: Örnekleme sırasında ağır solunum problemi gösteren ve ölen 10 günlük buzağı Hücre Kültürleri Araştırmada kullanılan virusların üretilmesi, titrasyonu ve serolojik test aşamalarında Justus-Liebig Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Enstitüsü’nden daha önce temin edilmiş olan Madin Derby Bovine Kidney (MDBK) hücre hattı kullanıldı. Hücre kültürleri tez çalışması süresince pestivirus kontaminasyonu yönünden düzenli olarak kontrol edildi. Testlerde Kullanılan Kontrol Virusları Çalışma kapsamındaki serolojik testlerde kullanılmak üzere Justus-Liebig Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Enstitüsü’nden orijin alan BRSV-Atue suşu, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı’ndan orijin alan BVDV NADL referans suşu, BHV-1 Cooper referans suşu, PI-3 SF-4 referans suşu, BAV serotip 3 virus suşu ve Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’nden sağlanmış olan BCoV-Mebus suşu kullanıldı. Tamamı sitopatojenik karakterde olan söz konusu viruslar Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı virus koleksiyonundan temin edildi. 24 Çalışmanın virolojik incelemeler kısmında yürütülen immunoperoksidaz testinde ise kontrol virusu olarak BVDV-FLK (FLK hücre hattından izole edilen bir nonsitopatojen BVDV suşu) kullanıldı. Tez çalışmasında kullanılan virusların MDBK hücre kültüründe oluşturduğu sitopatolojik etkilerin invert ışık mikroskobu ile elde edilen görüntüleri Şekil- 2’de yer almaktadır. 25 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-2. Tez çalışmasında kullanılan virusların hücre kültüründe oluşturduğu sitopatolojik etkiler (x10 büyütme) 26 Ticari Antijen ELISA Kiti Klinik olgulardan ve mezbahadan toplanan örneklerde virolojik teşhis amacıyla BVDV, BHV-1, BRSV ve PI-3 olmak üzere 4 virusun tespitine olanak sağlayan (BioK 240, Biox Diagnostics, Belçika), yalnız BVDV tespitine olanak sağlayan bir kit (Herdcheck, İsviçre) ve yalnız BHV-1 tespitine olanak sağlayan bir kit (BioK 335/1, Biox Diagnostics, Belçika) ayrı ayrı kullanıldı. Her üç antijen ELISA kiti de ticari olarak temin edildi. İmmunoperoksidaz Testi İmmunoperoksidaz testinde kullanılmak üzere daha önce Justus-Liebig Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Enstitüsünden temin edilen ve tüm BVDV suşlarını tanıdığı bildirilen (155) monoklonal antikor 1/4/7 kullanıldı. İki aşamalı olan biotin ile işaretli anti- mouse konjugatı (Pierce, 31800, ABD) ve streptavidin-HRPO konjugatı (Pierce, 21124, ABD) ticari olarak temin edildi. Yöntem Serum Örneklerinin Hazırlanması Vakumlu katkısız tüplere alınan kan örnekleri soğuk zincir altında hızlı bir şekilde laboratuvara ulaştırıldı. Soğutmalı santrifüjde (Nüve, NF 800R, Türkiye) 10 dakika, +4ºC’de, 3000 rpm hızda santrifüj edilen kan örneklerinden serumlar çıkarıldı. Ayrılan serumlar stok tüplerine aktarılarak 56°C’de 30 dakika süresince su banyosunda (Nüve, BM 402, Türkiye) inaktive edildi ve test aşamasına kadar -20°C’de muhafaza edildi. Svab Örneklerinin Hazırlanması Steril 2 ml phosphate buffered saline (PBS) içeren tüplere konularak soğuk zincir altında ivedilikle laboratuvara ulaştırılan svab örnekleri soğutmalı santrifüjde +4ºC’de, 3000 rpm’de 20 dk santrifüj edildikten sonra süpernatant ayrılarak stok tüpüne konuldu. Takiben 200 nm 27 filtreden geçirildikten sonra test aşamasına kadar -80°C derin dondurucuda (Revco, Elite, ABD) dondurularak muhafaza edildi. Doku Örneklerinin Hazırlanması Akciğer örneklerinin homojenizatları virus izolasyonu ve ELISA uygulamalarında kullanılmak üzere homojenizatör (Sartorius, Potter S, Almanya) ve havan yardımıyla PBS içerisinde homojenize edildi. Hazırlanan süspansiyon soğutmalı santrifüjde +4ºC’de, 3000 rpm’de 20 dk santrifüj edildikten sonra süpernatant ayrılıp 200 nm filtreden geçirilerek stok tüpüne konuldu. Hazırlanan homojenizatlar test aşamasına kadar -80°C’de dondurularak muhafaza edildi. Hücre Kültürleri Araştırmada kullanılan MDBK hücre kültürlerinin hazırlanmasında pestivirus kontaminasyonu yönünden test edilmiş olan %10 oranında fötal dana serumu (FDS) (PAA Laboratories GmbH, Avusturya) ilave edilen Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (BIOCHROM, Almanya) kullanıldı. Hücre kültürlerine ayrıca olası bakteri ve mantar kontaminasyonunu engellemeye yönelik olarak 100 UI/ml oranında Penisilin, 100 mg/ml Streptomisin ve 250 mg/ml Amfoterisin B solüsyonu kullanıldı. Virusların Üretilmesi 2 Tüm viruslar 150 cm ’lik tek kullanımlık hücre kültür şişesinde (Orange Scientific, Belçika) hazırlanan MDBK hücre kültürlerine ekilerek üretildi. Bu amaçla adsorsiyona bağlı yöntem kulanılarak virus inokulasyonu gerçekleştirildi (156). Yöntem kısaca şu şekilde uygulandı: Bir gün önce hazırlanan kültür içerisindeki vasat boşaltılarak hücre kültürü steril PBS ile yıkandı ve şişe hacminin %1’i oranında virus ekildi. Kültürler 37ºC’ye ayarlı ve %5 CO2 28 ihtiva eden inkübatöre (Jouan, TGO 150, Fransa) kaldırılarak 1 saat süre bekletildi. Hücre kültür şişeleri 15 dakikalık periyotlarla hareket ettirilerek inokulumun tüm hücreler ile temas etmesi sağlandı. Süre sonunda kültür şişelerine serumsuz vasat (DMEM) ilave edilerek inkübatör kaldırıldı. Oluşan sitopatolojik etki günlük olarak invert ışık mikroskobu (Nikon Eclipse TS100, Japonya) ile takip edildi. Virus üremesine bağlı olarak hücre kültüründe gözlemlenen sitopatolojik etki %70-80 civarındayken kültürler -80°C’ye ayarlanmış derin dondurucuya kaldırılarak donduruldu. Takiben 37°C’ye ayarlanmış su banyosunda çözdürülerek hücrelerin tamamen parçalanması sağlandı ve virus partikülleri açığa çıkarıldı. Elde edilen kültür sıvısı +4ºC’de, 3000 rpm’de 20 dk santrifüj edildi ve süpernatant 1,5 ml ependorf tüplere (CITOTEST, Çin) porsiyonlanarak testlerde kullanılmak üzere -80°C’ye ayarlanmış derin dondurucuda muhafaza edildi. Virus Titresinin Belirlenmesi Üretilen virusların ilgili testlerde kullanılabilmeleri için titreleri sulandırma yöntemiyle belirlendi (156). Bu amaçla virusun DMEM içerisinde 10 basamak olacak şekilde 10 katlı (Log 10) sulandırması hazırlandı. Hazırlanan virus sulandırmalarının her basamağından 96 gözlü pleytte (Corning, ABD) ayrılan 4 göze 100 µl konuldu. Ayrıca hücre kontrol gözüne 100 µl DMEM ve virus kontrol gözüne 50 µl DMEM ile 50 µl sulandırılmamış virus konuldu. Test için kullanılan tüm gözlere hücre yoğunluğu 300.000 hücre/ml olacak şekilde hazırlanmış MDBK hücre süspansiyonundan 50 µl eklendi ve 37ºC’deki %5 CO2 ihtiva eden inkübatör kaldırıldı. Günlük olarak invert ışık mikroskobu ile hücrelerde oluşan sitopatolojik etki takip edildi. Elde edilen veriler Spearman-Kaerber yöntemine (156) göre değerlendirilerek virus titreleri belirlendi. Serolojik Çalışmalar Serum Nötralizasyon 50 (SN50) Değerinin Belirlenmesi Serum örneklerinde ilgili virusa karşı mevcut antikor titrelerini belirlemek amacıyla SN50 testi uygulandı. Test Frey ve Liess (157) tarafından açıklanan yönteme göre gerçekleştirildi. 29 Bu aşamada 96 gözlü mikropleytlerde her serum örneği için iki göz ayrıldı ve ilk gözlere BHV-1 ve BRSV için 1:2’lik; PI-3, BVDV, BCoV için 1:5’lik; BAV-3 için ise 1:16’lık sulandırmalar olacak şekilde serum örneklerinden 50 µl konuldu. Her örnek için 6 basamak ilerleyecek şekilde (sırasıyla 1:2-1:64, 1:5-1:160, 1:16-1:512) iki katlı sulandırmalar hazırlandı. Hücre kontrol (HK) gözüne 100 µl, virus kontrol (VK) gözüne ise 50 µl hücre üretme vasatı konuldu. Hücre kontrol gözü dışındaki tüm gözlere titresi oranında sulandırılmış test virusundan 50 µl konulduktan sonra mikropleytler 37ºC’deki %5 CO2 ihtiva eden inkübatörde BHV-1 için 2 saat, diğer viruslar için 1’er saat süreyle nötralizasyona bırakıldı. İnkübasyondan sonra tüm gözlere 300.000 hücre/ml olacak şekilde hazırlanan ve %10 FDS içeren MDBK hücre süspansiyonundan 50 µl eklendi. Mikropleytler inkübatöre kaldırıldı ve günlük olarak invert ışık mikroskobu ile takip edildi. Son sulandırma basamağında bile antikor pozitif sonuç veren örnekler sulandırma basamakları uzatılarak tekrar test edildi. Bu aşamada sulandırma basamakları BHV-1 için 1:2048’e, BAV-3 için 1:4096’ya, PI-3, BVDV, BCoV için 1:10240’a ve BRSV için 1:16384’e kadar yükseltildi. Elde edilen antikor titrelerinin bir işletme içerisinde ve test edilen hayvan popülasyonunda değerlendirebilmesi amacı ile geometrik ortalama değerleri kulanıldı. Virolojik Çalışmalar ELISA ile Antijen Tespiti Hazırlanan svab örnekleri ve akciğer homojenizatları (toplam 137 adet örnek) BVDV, BHV-1, BRSV ve PI-3 antijenlerine yönelik olarak ticari antijen ELISA kiti (BioK 240, Biox Diagnostics, Belçika) kullanılarak test edildi. Test sonucunda birden fazla hayvanda şiddetli klinik olgular bulunmasına karşın sadece 1 adet akciğer dokusunun BVDV antijeni yönünden pozitif sonuç elde edilmesi üzerine tüm örnekler yalnız BVDV antijenlerine (Herdcheck, İsviçre) ve yalnız BHV-1 antijenlerine (BioK 335/1, Biox Diagnostics, Belçika) yönelik ticari antijen ELISA kitleri ile tekrar test edildi. Test protokolleri üretici firmaların önerdiği şekilde uygulandı. Test pleytleri ELISA okuyucuda (Thermo-Multiskan EX, Finlandiya) 450 nm dalga boyunda okutularak değerlendirildi. 30 Virus İzolasyonu Virus izolasyonu amacıyla Özkul ve arkadaşlarının (119) izlediği protokolde bir takım modifikasyonlar yapıldı ve işlem aşağıda açıklanan şekilde uygulandı. Svab ve akciğer örneklerinden elde edilen süpernatantlar MDBK hücre kültürüne ekildi. Virus izolasyonu amacıyla 24 gözlü hücre kültür pleytlerinin her gözüne (Corning, ABD) 100.000 hücre/ml oranında hazırlanan MDBK hücre kültürü süspansiyonundan 1 ml konuldu. Ertesi gün her örnekten bir göze 200 µl ekim yapıldı. Ekim yapılan hücre kültür pleytleri 5 dk oda sıcaklığında çalkalayıcıda (Heidolph Unimax 1010, Almanya) bekletildikten sonra 37ºC’deki %5 CO2 ihtiva eden inkübatöre kaldırıldı. Gözlerdeki vasat 24 saat sonra değiştirildi ve pleytler 3-5 gün süresince sitopatolojik değişimleri saptayabilmek için invert ışık mikroskop ile incelendi. Sürecin sonunda pleytler -80°C’ye kaldırılarak donduruldu. Aynı işlem dondurulan gözlerin 37ºC’deki su banyosunda çözdürülmesi ve ekim için üst sıvılarının kullanılması yoluyla 2 defa daha tekrarlandı (toplam 3 kör pasaj). Örneklerdeki muhtemel nonsitopatojen BVDV suşlarının tespitine yönelik olarak 3. kör pasaj sonunda immunoperoksidaz testi uygulandı. İmmunoperoksidaz Testi Araştırmada, muhtemel nonsitopatojen BVDV suşlarını tespit edebilmek amacıyla immunoperoksidaz testi kullanıldı. Bu amaçla temel olarak Özkul ve arkadaşlarının (119) kullandığı test protokolü uygulandı. Hücre kültür pleytinin her gözünde 100.000 hücre/ml olacak şekilde hazırlanan hücre kültürüne bir günlük inkübasyonu takiben kör pasaj üst sıvılarından 200 µl ekim yapıldı. İnkübasyonu takiben pleytler ters çevrilerek vasat uzaklaştırıldı ve hücreler 1/3’lük PBS ile 3 kez yıkandı. Hücrelerin fikzasyonu 80°C’ye ayarlanmış inkübatörde (Nüve ES110) 3 saat bekletilerek gerçekleştirildi. Yıkama işleminden sonra hücre duvarı geçirgenliğini artırmak amacıyla tüm gözlere 200 µl O-D-glikopyranosid (Sigma, 03757, ABD) konuldu ve pleytler 5 dakika oda sıcaklığında tutuldu. Tween-PBS (%0,05, Tween 20) içerisinde 1:40 oranında sulandırması hazırlanan anti-BVDV monoklonal antikorundan (1/4/7) tüm gözlere 200 µl konuldu ve pleytler 90 dk süreyle 37°C’ye ayarlanmış inkübatörde inkübasyona bırakıldı. İki 31 aşamalı konjugattan ilki olan biotin ile işaretli anti-mouse konjugatının (Pierce, 31800, ABD) Tween-PBS (%0,05, Tween 20) içerisinde 1:400 oranında sulandırması hazırlandı ve tüm gözlere 200 µl konularak pleytler 90 dk 37°C’de inkübe edildi. Her inkübasyon periyodundan sonra pleytler 1/3’lük PBS ile 3 kez yıkandı. Daha sonra yine Tween-PBS (%0,05, Tween 20) içerisinde 1:300 oranında sulandırılan streptavidin-HRPO konjugatından (Pierce, 21124, ABD) tüm gözlere 200 µl konuldu. Pleytler 90 dk 37°C’de inkübe edildikten sonra 5 kez yıkandı ve tüm gözlere 200 µl substrat çözeltisi (AEC/DMF (Sigma, A5754) (2 mg/0. 3 ml) 300 µl, sodyum asetat buffer 4,7 ml, H2O2 %0.05) konuldu. Pleytler 15-30 dakika oda sıcaklığında inkübe edildikten sonra reaksiyonu durdurmak için substrat uzaklaştırılarak tüm gözlere PBS konuldu. Hücre içi kırmızı-kahverengi boyanma tespit edilen test gözleri pozitif olarak değerlendirildi. İstatistiki Analiz Bu tez çalışmasında antikor titrelerinin bir işletme içerisinde ve test edilen hayvan popülasyonunda grup ortalamalarını belirlemek amacı ile geometrik ortalama değerleri kullanıldı. Seropozitiften seronegatife geçen hayvan sayılarının işletme büyüklüğü, cinsiyet ve aşılı-aşısız gruplarda değişiminin istatistiksel kontrölü ‘Fisher’in Kesin Ki-Kare Metodu’ ile yapıldı. Buzağıların maternal antikor titreleri ile anne antikor titreleri arasındaki ilişki incelenirken ise ‘Spearman Korelasyon Analizi’nden yararlanıldı. 32 BULGULAR Virusların Titre Değerleri Serum nötralizasyon testinde kullanılmak üzere üretilen virusların titre değerleri Tablo- 5’de sunulmuştur. Tablo-5. Testlerde kullanılan virusların titre değerleri * Virus 100DKID50 -5 BVDV 10 /0,1 ml -4,75 BHV-1 10 /0,1 ml -4,75 PI-3 10 /0,1 ml -3,5 BAV-3 10 /0,1 ml -3,5 BCoV 10 /0,1 ml -2,25 BRSV 10 /0,1 ml *100DKID50: Doku kültürü infektif doz 50 Anket Sonuçları Tez kapsamında çalışmaya dâhil edilen işletmelere ait risk faktörlerini belirleyebilmek amacıyla işletmelerde çalışan sorumlu veteriner hekimler tarafından doldurulan anket formundan elde edilen bilgiler Tablo 6’da verilmiştir. Anket incelendiğinde biyogüvenlik kurallarının büyük ölçekli işletmelerde titizlikle uygulandığı, orta ve küçük ölçekli işletmelerde ise tam olarak uygulanamadığı sonucuna ulaşılmıştır. 33 Tablo-6. Örnekleme yapılan işletmelere ait risk faktörleri* İşletme Girişte Sürü Dışarıdan Karantina Çiftliğin Hayvan Buzağılar büyüklüğü dezenfeksiyon geçmişi 2 hayvan bölümü var kendi grupları bireysel havuzu var yıldan alınıyor mı? hekimi var homojen barındırılıyor mı? uzun mu? mu? mı? mi? mu? İşletme 1 Büyük Evet Evet Hayır Evet Evet Evet Evet İşletme 2 Büyük Evet Evet Hayır Evet Evet Evet Evet İşletme 3 Büyük Evet Evet Hayır Evet Evet Evet Evet İşletme 4 Büyük Evet Evet Evet Hayır Evet Evet Evet İşletme 5 Orta Hayır Evet Hayır Evet Hayır Hayır Hayır İşletme 6 Orta Hayır Evet Hayır Evet Evet Hayır Evet İşletme 7 Küçük Evet Evet Hayır Hayır Hayır Hayır Hayır İşletme 8 Küçük Hayır Evet Evet Evet Evet Hayır Hayır İşletme 9 Küçük Hayır Evet Evet Hayır Hayır Hayır Hayır İşletme 10 Küçük Hayır Evet Evet Hayır Hayır Hayır Hayır *Çalışma kapsamındaki işletmelerden örneklenen buzağı sayıları arasında önemli sayıda fark olduğu için belirlenen risk faktörlerinin enfeksiyonlar üzerine direkt etkileri istatistiki olarak değerlendirilememiştir. 34 Tablo-6 (devam). Örnekleme yapılan işletmelere ait risk faktörleri * Günlük ortalama Çevredeki işletmeler Ahırın temizlik İnek ve buzağı Hasta ve sağlıklı ziyaretçi sayısı ile mesafe (kuş durumu barınaklarının hayvanlar arasındaki uçuşu) uzaklığı mesafe İşletme 1 2 3 km İyi 10-15 m 2 m İşletme 2 2 3 km İyi 45 m 30 m İşletme 3 10 3 km İyi 11 m 5 m İşletme 4 5 2 km İyi 40 m 10 m İşletme 5 5 500 m Orta 10 m 10 m İşletme 6 15 1 km İyi 6 m 1 m İşletme 7 1 200 m Kötü 12 m - İşletme 8 2 200 m İyi 20 m 10 m İşletme 9 2 200 m Orta 2 m - İşletme 10 2 200 m Orta 2 m - *Çalışma kapsamındaki işletmelerden örneklenen buzağı sayıları arasında önemli sayıda fark olduğu için belirlenen risk faktörlerinin enfeksiyonlar üzerine direkt etkileri istatistiki olarak değerlendirilememiştir. 35 Serolojik Çalışmalar Büyük Ölçekli Đşletmelerde (Hayvan Sayısı >100) Elde Edilen Bulgular Đşletme 1’e Ait Bulgular Đşletme 1’de bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-3, -4, -5 ve -6’da sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 14 olduğu Đşletme 1’de BRSV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren hafif azaldığı (Şekil-3), buzağıların 3. ayda bu etkene maruz kaldığı ve buna bağlı olarak antikor titrelerinde artış şekillendiği (Şekil-4) belirlendi. PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren hızla düşmeye başladığı ve buzağıların 4. ve 6. aylar arasında bu etkene maruz kaldığı belirlendi. PI-3 için antikor titre değerlerinin 10. ayda saptanan azalış hariç seropozitif buzağı sayısı ile doğru orantılı seyrettiği saptandı. Başlangıçta BHV-1’e karşı maternal antikora sahip herhangi bir buzağı tespit edilemezken buzağıların bu etkenle 8. ve 10. aylar arasında karşılaştığı gözlemlendi. Antikor titrelerinin seropozitif buzağı sayısı ile düşük seviyede olsa da paralel seyrettiği görüldü. BVDV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının yine 2. ayda düşmeye başladığı ve buzağıların 6. ve 8. aylar arasında bu enfeksiyona maruz kaldığı görüldü. BVDV için de antikor titrelerindeki değişimin seropozitif buzağı sayısındaki değişim ile uyumlu olduğu tespit edildi. Seropozitif hayvan sayıları temel alındığında BAV-3; PI-3’ün çizdiği tabloyu tekrar ederken BCoV ise BVDV ile aynı tabloyu verdi (Şekil-3). BAV-3 ve BCoV içinde seropozitif buzağı sayısı ile antikor titre grafiğinin uyum içerisinde seyrettiği belirlendi (Şekil-4). Annelerin serumlarında yapılan incelemeler sonucunda en düşük seropozitif hayvan sayısının ve antikor titre değerinin BHV-1’e ait olduğu görüldü (Şekil-5). Diğer etkenlere karşı seropozitif olan anne sayısının %92 (13/14) üzerinde olduğu, annelerdeki en yüksek antikor titre değerinin ise (1:285.2) BCoV’a ait olduğu belirlendi (Şekil-6). 36 İŞLETME 1 16 14 14 14 14 14 14 14 14 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 11 10 10 BRSV 9 PI-3 8 8 BHV-1 7 7 BVDV 6 6 6 5 BAV-3 4 BCoV 2 2 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=14 Şekil-3. Đşletme 1’de enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 37 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 1 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 593,98 243,63 312,06 441,33 799,44 312,06 593,98 463,73 PI-3 275,83 84,06 6,11 3 38,06 237,75 102,47 160 BHV-1 0 0 0 0 0 0 1,12 1,21 BVDV 551,66 158,17 6,54 2,68 4,12 32,86 182,68 245,87 BAV-3 121,81 81,97 3,12 1,28 2,43 52,5 86,86 16,81 BCoV 320 118,87 13,03 2,96 4,55 23,65 219,17 109,58 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=14 Şekil-4. Đşletme 1’de enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 38 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 1 14 14 14 14 14 14 14 14 14 13 13 2 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-5. Đşletme 1’de seropozitif olduğu saptanan anne sayısı İŞLETME 1 285,2 300 250 200 152,2 128 150 95,1 100 50 21,71,6 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-6. Đşletme 1’deki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 39 Đşletme 2’ye Ait Bulgular Đşletme 2’de bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-7, -8, -9 ve -10’da sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 31 olduğu Đşletme 2’de BRSV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının ve antikor titre değerinin 2. ile 10. aylar arasında dalgalı seyrettiği ve buzağıların enfeksiyonla ilk defa 3. ve 4. aylar arasında karşılaştığı görüldü (Şekil-7,-8). PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren 6. aya kadar hızla düştüğü, buzağıların 6. ve 8. aylar arasında bu enfeksiyonla karşı karşıya kaldığı ve antikor titre değerlerinin bu tablo ile uyumlu olduğu belirlendi. BHV-1’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının ise başlangıçta da az olduğu görülürken bu hayvanların sayısının 4. aya kadar azaldığı ve 4. ve 6. aylar arasında örneklenen hayvanların bu etkene maruz kaldığı tespit edildi. Antikor titrelerinin de bu tablo ile paralel seyrettiği saptandı (Şekil-8). BVDV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren 4. aya kadar azaldığı ve bu hayvanların 4. ve 6. aylar arasında enfeksiyona maruz kaldığı tespit edildi. Yine antikor titre değeri eğrisinin seropozitif buzağı sayısı eğrisi ile uyumlu olduğu görüldü. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 4. aydan itibaren düşmeye başladığı ve buzağıların esasen 6. ve 8. aylar arasında bu enfeksiyona maruz kaldığı tespit edildi. Antikor titre değerleri düşük olsa da yükseliş eğrisinin burada da seropozitif buzağı sayısı ile paralel seyrettiği görüldü. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 3. ayda hafif bir azalış gösterdiği ve buzağıların 4. ve 6. aylar arasında bu etkenle karşılaştığı görüldü. Annelerin serumlarında yapılan incelemeler sonucunda BHV-1 antikoru tespit edilen anne sayısının düşük ve antikor titrelerinin geometrik ortalamalarının sıfıra yakın olduğu görüldü. Diğer 5 virusa karşı hemen hemen tüm annelerde antikor varlığı tespit edilirken (Şekil-9), en yüksek antikor titresi (1:535,1) BCoV’a karşı saptandı (Şekil-10). 40 İŞLETME 2 35 31 31 31 31 31 30 30 30 30 30 30 29 29 29 29 29 28 28 28 27 27 27 26 26 25 25 23 22 BRSV 20 PI-3 18 17 BHV-1 15 15 14 14 14 BVDV 12 BAV-3 10 9 BCoV 5 5 2 1 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=31 Şekil-7. Đşletme 2’de enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 41 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 2 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 334,78 139,97 125,16 320,14 228,92 684,71 500,67 523,57 PI-3 58,07 42,77 10,78 2,95 0 2,89 8,57 10,09 BHV-1 1,5 1,2 1,04 0 1,02 2,92 2,23 4,18 BVDV 45,41 66,89 7,23 2,18 76,55 188,6 209,48 33,31 BAV-3 42,79 42,79 18,31 32 4,1 17,23 37,42 41,04 BCoV 161,27 116,15 65,94 16,24 78,85 306,23 69,5 58,12 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=31 Şekil-8. Đşletme 2’de enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 42 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 2 31 31 31 31 31 31 31 3130 30 31 7 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-9. Đşletme 2’de seropozitif olduğu saptanan anne sayısı İŞLETME 2 600 535,1 400 218,9 200 87,4 66,4 78,2 1,27 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-10. Đşletme 2’deki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 43 Đşletme 3’e Ait Bulgular A. Dört Aylık Yaşta Aşı Uygulanan Buzağılar Đşletme 3’te bulunan aşılı buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-11 ve -12’de sunulmuştur. Đşletme 3’te 18 adet buzağıya 4. aylarında BVDV tip 1 ve 2, BHV-1, PI-3 ve BRSV içeren ticari aşı uygulaması yapıldığı için enfeksiyonların doğal seyrini incelemek 4. aydan itibaren söz konusu olamadı. Dolayısıyla bu buzağılar aşı uygulanmayan buzağılardan ayrı bir grup olarak incelendi. BRSV’ye karşı maternal antikor taşıyan aşılı buzağı sayısında 2. ayda hafif bir azalış görülürken; 3. ayda antikora sahip buzağı sayısının tekrar arttığı ve bu aydan itibaren antikor taşıyan buzağı sayısında bir değişiklik olmadığı belirlendi (Şekil-11). Antikor titrelerinin ise dalgalı seyrettiği tespit edildi (Şekil-12). PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının birer ay aralıkla dalgalandığı gözlemlendi. PI-3’e karşı ilk üç ay içerisinde buzağıların antikor titrelerinde azalma görülürken 4. ayda antikor titresinin en yüksek seviyeye ulaştığı, sonrasında ise dalgalı seyrettiği belirlendi. Örneklemenin başlangıcında BHV-1’e karşı maternal antikor tespit edilen buzağı sayısında 6. ayda ani bir azalış gözlendi, bu azalışın 10. ayda sıfıra ulaşarak 12. ayda tekrar yükselişe geçtiği, ortalama antikor titre değerlerinin ise 4. aydaki aşılamaya rağmen sürekli azalış eğiliminde olduğu saptandı (Şekil-12). BVDV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren düzenli şekilde düştüğü ve 8. ve 10. aylar arasında buzağıların muhtemelen etkenle karşılaştığı belirlendi. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısındaki esas azalmanın 3. aydan itibaren olduğu, 6. ayda enfeksiyona sahip buzağı sayısında artışın gözlenmesiyle birlikte bu ayda buzağıların etkenle karşı karşıya kaldığı görüldü. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 3. aydan itibaren düzenli olarak azaldığı ve 8. ay itibariyle buzağılarda antikor tespit edilmediği görüldü. Bu grupta yer alan hayvanlarda BVDV, BAV-3 ve BCoV antikor titrelerinin 3. aydan itibaren önemli düzeyde azaldığı ve bu durumun 4. ayda uygulanan aşılamadan etkilenmediği anlaşılmaktadır. 44 İŞLETME 3 (AŞILI BUZAĞILAR) 20 18 18 18 18 18 18 18 18 17 17 17 17 16 15 15 15 14 14 13 13 12 BRSV PI-3 10 10 10 9 BHV-1 8 8 BVDV BAV-3 6 6 BCoV 4 4 3 3 2 2 2 1 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=:18 Şekil-11. Đşletme 3’de enfeksiyonlara göre aşılı seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 45 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 3 (AŞILI BUZAĞILAR) 1200 1000 800 600 400 200 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 1024 1064,2 290,52 574,7 322,53 552,99 492,65 422,32 PI-3 209,5 46,66 15,67 209,5 44,34 65,98 54,43 35,19 BHV-1 8 3,56 2,61 2,24 1,21 1,21 0 1,03 BVDV 838 244,38 26,22 10,96 4,52 1,54 2,47 0 BAV-3 123,16 26,39 40,31 5,05 9,69 5,87 9,69 18,66 BCoV 122,19 83,14 53,76 8,37 1,3 0 0 0 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=18 Şekil-12. Đşletme 3’de enfeksiyonlara göre aşılı buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 46 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * B. Dört Aylık Yaşta Aşı Uygulanmayan Buzağılar Đşletme 3’te bulunan aşısız buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-13, -14, 15 ve -16’da sunulmuştur. Đşletme 3’te yer alan 21 adet buzağıya araştırma sürecinde herhangi bir aşı uygulaması yapılmamış olması bu buzağılarda enfeksiyonların doğal seyrinin takip edilebilmesine olanak sağlamıştır. Bu buzağılar arasında BRSV’ye karşı maternal antikor taşıyan buzağı sayısında 3. ayda hafif bir azalış saptanırken; 3. ve 12. aylar arasında seropozitif buzağı sayısının sürekli olarak yüksek seyrettiği tespit edildi. Bu işletmede başlangıçta oldukça yüksek (1:1024) olan BRSV ortalama antikor titre değerlerinin 6. aya kadar azaldığı, sonraki dönemlerde ise belirli bir düzeyde seyrettiği görüldü (Şekil-14). PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 3. aydan itibaren düştüğü, buzağıların etkenle 6. ve 8. aylar arasında karşılaştığı ve kısa süren enfeksiyon tablosunun 8. aydan itibaren hızlı bir şekilde azalarak sıfırlandığı belirlendi. Bu tablonun antikor titresi eğrisi uyum içinde seyrettiği görüldü. Örnekleme döneminin başlangıcında BHV-1’e karşı maternal antikor tespit edilen buzağı sayısının 3. aydan itibaren azaldığı ve 6. ayda sıfıra ulaştığı, ortalama antikor titrelerinin de çok düşük düzeylerde seyrettiği saptandı. BVDV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren düzenli şekilde azaldığı ve 12. ayda sıfırlandığı, antikor titre eğrisinde ise başlangıçtan itibaren ciddi bir azalış şekillendiği ve 3. aydan itibaren minimal seviyede seyrettiği belirlendi. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. ayda azaldığı ve örneklenen buzağıların etkenle muhtemelen ilk defa 3. ayda karşılaştığı saptandı. Antikor taşıyan buzağı sayısındaki esas azalmanın 4. ayda olduğu ve 6. ayda enfeksiyona sahip buzağı sayısında artışın gözlenmesiyle birlikte bu ayda buzağıların tekrar etkenle karşı karşıya kaldığı değerlendirildi. Aynı dalgalanma 8 ve 12. aylar arasında da görüldü. Burada antikor titre eğrisinin seropozitif buzağı sayısına benzer şekilde dalgalı seyrettiği görüldü. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 4. aydan itibaren hızla azaldığı belirlendi ve 8. ay itibariyle buzağılarda antikor tespit edilmedi. Antikor titre grafiğinde de ilk aydan itibaren başlayan gerilemenin 8. ay ve sonrasında minimal düzeye ulaştığı tespit edildi. Annelerde incelenen etkenlere karşı mevcut antikor durumuna ve bu antikorların geometrik ortalamalarına bakıldığında; BAV-3 için 1 anne hariç, diğer 5 etken içinse tüm 47 annelerin antikor taşıdığı saptandı. BAV-3 ve BHV-1’e karşı mevcut antikorların titrelerinin oldukça düşük olduğu, diğer 4 enfeksiyona karşı ise 1:132.1 (PI-3) ve üzeri miktarda antikor taşıdıkları görüldü. 48 İŞLETME 3 (AŞISIZ BUZAĞILAR) 25 21 21 21 21 21 21 21 20 20 20 20 19 19 19 18 18 17 17 16 16 15 BRSV 14 13 13 PI-3 12 BHV-1 11 10 10 BVDV 8 BAV-3 7 BCoV 6 5 4 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=21 Şekil-13. Đşletme 3’de enfeksiyonlara göre aşısız seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 49 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 3 (AŞISIZ BUZAĞILAR) 1200 1000 800 600 400 200 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 1024 736,12 420,01 312,06 273,46 344,55 292,13 333,36 PI-3 149,77 70,1 23,58 14,54 4,34 61,57 27,85 20,67 BHV-1 3,87 2 2,13 1,39 0 0 0 0 BVDV 723,14 237,75 30,07 12,76 7,96 2,15 1,93 0 BAV-3 83,34 43,06 14,49 3,39 4,71 18,87 9,12 37,74 BCoV 280,42 170,91 52,08 11,41 1,45 0 0 0 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titrelerinin değerleri geometrik ortalaması, n= 21 Şekil-14. Đşletme 3’de enfeksiyonlara göre aşısısız buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 50 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 3 29 29 29 29 29 29 29 29 29 29 29 28 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil- 15. Đşletme 3’de seropozitif olduğu saptanan anne sayısı İŞLETME 3 1000 825,8 800 600 492 516,1 400 132,1 200 19,8 16,7 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil- 16. Đşletme 3’deki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 51 Đşletme 4’e Ait Bulgular Đşletme 4’te bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-17, -18, -19 ve -20’de sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 6 olduğu Đşletme 4’de BRSV’ye karşı maternal antikor taşıyan buzağı sayısında 1. ayda azalış görülürken 2. ve 3. aylar arasında buzağıların enfeksiyona maruz kaldıkları ve seropozitif hayvan sayısının arttığı tespit edildi. Antikor titrelerinin de bu tabloya uygun olduğu ayrıca 8. ayda en yüksek seviyeye ulaştığı ve sonrasında azalmaya başladığı saptandı. PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının esasen 3. aydan itibaren azaldığı, ayrıca 4. ve 6. aylar arasında enfekte buzağıların sayısında artış olduğu belirlendi. Örneklemenin başlangıcında BHV-1’e karşı hiçbir buzağıda antikor tespit edilemezken 3. ve 6. aylar arasında enfekte buzağı sayısında artış saptandı. BVDV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. ayda düştüğü fakat 3. ve 4. aylar arasında artarak esas azalışın 12. ayda yaşandığı tespit edildi. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 3. ayda azaldığı, 3. ile 6. aylar arasında antikor taşıyan buzağı sayısında dalgalanma olduğu ve 6. aydan başlayan düzenli artışla 10. ayda tüm buzağıların enfekte olduğu görüldü. PI-3, BHV-1, BVDV ve BAV-3 için antikor titre eğrilerinin seropozitif buzağı sayısı eğrileri ile uyumlu seyrettiği belirlendi. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısında örnekleme süresince herhangi bir değişiklik saptanmazken, antikor titrelerinin dalgalı seyrettiği görüldü. Đşletme 4’de BHV-1 dışındaki tüm etkenlere karşı hemen hemen tüm annelerde antikor varlığı tespit edilirken bu antikorların ortalama titre değerlerinin 1:27.2 (PI-3) ile 1:285 arasında değiştiği saptandı. 52 İŞLETME 4 7 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 5 5 BRSV 4 4 4 4 4 4 PI-3 BHV-1 3 3 BVDV BAV-3 2 2 BCoV 1 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=6 Şekil-17. Đşletme 4’de enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 53 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 4 1200 1000 800 600 400 200 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 228,07 28,5 812,74 912,28 645,07 1024 574,7 287,35 PI-3 30,58 11,69 8,58 2,15 35,63 226,27 226,27 253,98 BHV-1 0 0 0 1,58 4,48 11,31 5,65 5,65 BVDV 403,17 285,08 6,56 71,27 80 320 253,98 43,25 BAV-3 28,5 57,01 8,97 90,5 2,24 20,15 181,01 181,01 BCoV 71,27 403,17 35,63 80 113,13 100,79 100,79 160 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=6 Şekil-18. Đşletme 4’de enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 54 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 4 6 6 6 6 6 6 6 6 6 5 5 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-19. Đşletme 4’de seropozitif olduğu saptanan anne sayısı İŞLETME 4 285 300 250 200 161,2 150 100 63,4 40,3 50 27,2 0 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-20. Đşletme 4’deki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 55 Orta Ölçekli Đşletmelerde (20 < Hayvan Sayısı >100) Elde Edilen Bulgular Đşletme 5’ e Ait Bulgular Đşletme 5’te bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-21, -22, -23 ve -24’de sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 9 olduğu Đşletme 5’de BRSV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 6. ile 12. aylar arasında hafif bir azalış olduğu görüldü. Đlk altı aydaki antikor titrelerinin dalgalı seyrettiği 6. ile 10. aylar arasındaki azalışın yerini 10. aydan itibaren yükselişe bıraktığı görüldü (Şekil-22). PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 1. aydan itibaren arttığı, 4. ayda enfekte buzağı sayısının azaldığı ve buzağıların 4. ve 6. aylar arasında bu etkenle karşı karşıya kaldığı belirlendi. BHV-1’e karşı antikora sahip buzağı sayısının ise 2. ve 3. aylar arasında arttığı ve 3. ay itibariyle hızla düşerek 6. ayda sıfırlandığı görüldü. Her iki etken için de seropozitif buzağı sayısındaki tablo ile antikor titre değerleri tablosunun uyumlu olduğu görüldü. Bu işletmede başlangıçta BVDV’ye karşı maternal antikora sahip herhangi bir buzağı yokken enfekte buzağı sayısının 2. ayda hızla arttığı, 3. ve 6. aylar arasında düştüğü ve 6. ve 8. aylar arasında buzağıların tekrar enfeksiyona maruz kaldıkları belirlendi. Antikor titre değerlerinin ise ilk 3 ayda arttığı, 4. aydaki düşüşten sonra 8. ayda tekrar yükseldiği görüldü. Böylece bu işletmedeki buzağıların 1 yaşına kadar 2 kez BVDV enfeksiyonuna maruz kaldığı belirlendi. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren hızla düşmeye başladığı ve buzağıların 6. ve 8. aylar arasında bu etkene maruz kaldığı tespit edilirken, 8 ve 10. aylar arasında görülen azalışı takiben hızlı bir yükseliş saptandı. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının ise 3. aydan itibaren azaldığı ve buzağıların 6. ve 8. aylar arasında bu etkenle karşılaştığı görüldü. BAV-3 ve BCoV için de antikor titre eğrilerinin seropozitif buzağı sayılarındaki değişimle uyumlu olduğu belirlendi. Örneklenen tüm annelerin BRSV, BVDV ve BAV-3’e karşı, 7 annenin BHV-1 ve BCoV’a karşı ve 4 annenin PI-3’e karşı seropozitif olduğu belirlendi. Annelerdeki antikor titrelerinin geometrik ortalamaları incelendiğinde en yüksek antikor titresinin 1:877.8 ile BRSV’ye karşı, en düşük antikor titresinin ise 1:5.1 ile PI-3’e karşı olduğu görüldü. 56 İŞLETME 5 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 7 7 6 6 6 6 6 BRSV PI-3 5 5 5 BHV-1 4 4 BVDV BAV-3 3 3 3 BCoV 2 2 2 1 0 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=9 Şekil-21. Đşletme 5’de enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 57 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 5 1200 1000 800 600 400 200 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 552,99 348,36 812,74 438,9 298,63 237,02 237,02 1024 PI-3 2,15 30,97 15,48 3,97 33,45 25,19 37,03 63,49 BHV-1 2,93 2,72 2,51 1,16 0 0 0 0 BVDV 0 21,6 93,32 3,68 13,3 126,99 100,79 592,55 BAV-3 138,24 16 6,34 1,85 1,25 1,58 2,93 561,84 BCoV 160 186,64 40 3,08 5,15 108,86 148,14 296,27 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=9 Şekil-22. Đşletme 5’de enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 58 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 5 9 9 9 9 9 9 9 9 9 7 7 4 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-23. Đşletme 5’de seropozitif olduğu saptanan anne sayısı İŞLETME 5 1000 877,8 800 600 400 217,7 149,3 200 82,2 5,1 25,3 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-24. Đşletme 5’deki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 59 Đşletme 6’ya Ait Bulgular Đşletme 6’da bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-25, -26, -27 ve -28’de sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 3 olduğu Đşletme 6’da BRSV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 6. ve 8. aylar arasında hafif bir azalış gösterdiği, 8. ve 10. aylar arasında ise buzağıların etkenle karşılaştığı saptandı. PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren 6. aya kadar düştüğü, 6. ve 8. aylar arasında buzağıların bu etkenle karşı karşıya kaldığı belirlendi. BHV-1’e karşı örneklemenin hiçbir döneminde antikor varlığı saptanamadı. BVDV’ye karşı antikora sahip buzağı sayısı 1. ve 2. aylar arasında artış gösterirken devamında ise düzenli şekilde azalış gösterdi. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren hızla düşmeye başladığı ve buzağıların 4. ve 6. aylar arasında BAV-3’e maruz kaldığı ve 8. aya kadar şekillenen ikinci azalışın muhtemel re-enfeksiyonla tekrar yükseldiği tespit edildi. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren düzenli azaldığı görüldü. Tüm etkenler için buzağıların antikor titrelerindeki değişimlerin ilgili tablolarla uyumlu olduğu belirlendi. Annelerin serumlarında yapılan incelemeler sonucunda BHV-1 ve BCoV hariç diğer 4 virusa karşı hemen hemen tüm annelerin seropozitif olduğu saptandı. Antikor titrelerinin geometrik ortalamaları incelendiğinde ise BCoV ve BHV-1’e karşı titre değerlerinin sıfır olduğu görülürken, diğer etkenlere karşı tespit edilen antikor titre değerlerinin en düşük 1:23.3 ile BVDV’ye, en yüksek 1:406.3 ile BRSV’ye karşı olduğu saptandı. 60 İŞLETME 6 3,5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2,5 BRSV 2 2 2 2 2 2 2 2 PI-3 BHV-1 1,5 BVDV BAV-3 1 1 1 1 BCoV 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=3 Şekil-25. Đşletme 6’da enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 61 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı s İŞLETME 6 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 812,74 1290,15 1290,15 406,37 812,74 101,59 203,18 161,26 PI-3 20 50,39 18,56 5,84 0 126,99 63,49 31,74 BHV-1 0 0 0 0 0 0 0 0 BVDV 14,73 40 14,73 4,64 4,3 0 0 0 BAV-3 128 101,59 8 2,51 2 0 64 16 BCoV 37,13 37,13 2,71 1,7 0 0 0 0 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=3 Şekil-26. Đşletme 6’da enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 62 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 6 3 3 3 3 3 3 3 3 3 2 0 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-27. Đşletme 6’da seropozitif olduğu saptanan anne sayısı İŞLETME 6 500 406,3 400 300 200 80 100 6423,3 0 0 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-28. Đşletme 6’daki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 63 Küçük Ölçekli Đşletmelerde (20 < Hayvan Sayısı) Elde Edilen Bulgular Đşletme 7’ye Ait Bulgular Đşletme 7’de bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-29, -30, -31 ve -32’de sunulmuştur. Đşletme 7’de yalnız 1 adet buzağı örneklenerek takip edilebildiği için burada geometrik ortalama alınamadı, dolayısıyla ham veriler kullanıldı. Örneklenen buzağının BRSV’ye karşı devamlı ve yüksek titrede antikor taşıdığı, PI-3’e karşı maternal antikorların 3. ayda gerilemeye başladığı ve buzağının 8. ve 10. aylar arasında etkenle karşılaştığı belirlendi. BHV-1’e karşı örneklemenin hiçbir döneminde antikor varlığı saptanamadı. BVDV’ye karşı mevcut maternal antikorun 3. ayda azalmaya başladığı, buzağının etkenle 6. ve 8. aylar arasında karşılaştığı ve oluşan bağışıklığın kısa süreli olduğu görüldü. BAV-3’e karşı mevcut maternal antikorların 1. aydan itibaren düştüğü ve buzağının 4. ve 6. aylar arasında BAV-3 enfeksiyonuna maruz kaldığı tespit edildi. BCoV’a karşı olan maternal antikorun 3. aydan itibaren düştüğü ve sıfırlandığı görüldü. Tüm etkenler için buzağının seropozitiflik grafiği ile antikor titre grafiğinin uyumlu olduğu belirlendi. Anneye yapılan testler sonucu BHV-1 ve BCoV hariç diğer 4 etkene karşı 1:80 (PI-3) ve 1:1024 (BRSV) titre değerleri arasında değişen antikor mevcudiyeti saptandı. 64 İŞLETME 7 1,2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,8 BRSV PI-3 0,6 BHV-1 BVDV 0,4 BAV-3 BCoV 0,2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=1 Şekil-29. Đşletme 7’de enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 65 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 7 2500 2000 1500 1000 500 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 2048 2048 1024 512 128 256 2048 128 PI-3 10 20 10 0 0 0 40 80 BHV-1 0 0 0 0 0 0 0 0 BVDV 40 80 20 0 0 80 0 0 BAV-3 128 0 0 0 2 32 32 32 BCoV 80 80 20 0 0 0 0 0 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=1 Şekil-30. Đşletme 7’de enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 66 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-31. Đşletme 7’de seropozitif olduğu saptanan anne sayısı İŞLETME 7 1200 1024 1000 800 600 320 400 128 200 80 0 0 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-32 Đşletme 7’deki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 67 Đşletme 8’e Ait Bulgular Đşletme 8’de bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-33, -34, -35 ve -36’da sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 5 olduğu Đşletme 8’de tüm buzağıların BRSV’ye karşı tüm örnekleme dönemlerinde antikor taşıdığı, antikor titre değerlerinin ise 3. ayda en yüksek seviyeye ulaştığı ancak dalgalı seyrettiği saptandı. PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. ayda arttığı, bu artışın 3. aydan itibaren azalışa geçtiği ve buzağıların 8.-10. aylar arasında etkenle tekrar karşılaştığı görüldü. BHV-1’e karşı örneklemenin hiçbir döneminde antikor saptanamadı. BVDV’ye karşı antikora sahip buzağı sayısı başlangıçta sıfır iken 2. ayda tüm buzağılarda antikor saptandı. Dördüncü ayda enfekte buzağıların sayısındaki azalışın 6. ve 8. aylar arasında gerçekleşen muhtemel re- enfeksiyonla tekrar arttığı görüldü. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısında 2. ayda görülen artıştan sonra antikor taşıyan buzağı sayısının 3. aydan itibaren düşmeye başladığı ve buzağıların 6. ve 8. aylar arasında BAV-3’e maruz kaldığı saptandı. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren düzenli azalış gösterdiği görüldü. Dördüncü ve altıncı aylar arasında gerçekleşen ilk enfeksiyon sonrasında 8. ve 10. aylar arasındaki muhtemel re-enfeksiyonla birlikte tüm buzağılarda antikor varlığı görüldü. PI-3, BHV-1, BVDV, BAV-3 ve BCoV için antikor titre değerlerine ait eğrilerin seropozitif buzağı sayısı eğrileri ile uyumlu olduğu saptandı. Annelerin serumlarında yapılan testler sonucunda BHV-1 dışındaki viruslara karşı tüm annelerin seropozitif olduğu ve antikor titrelerinin geometrik ortalamalarının 1:16 (BAV-3) ile 1:675.5 (BRSV) arasında değiştiği belirlendi. 68 İŞLETME 8 6 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 4 4 4 4 BRSV PI-3 3 3 3 3 BHV-1 BVDV 2 2 2 BAV-3 BCoV 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=5 Şekil-33. Đşletme 8’de enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 69 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 8 700 600 500 400 300 200 100 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 194,01 222,86 588,13 222,86 194,01 337,79 294,06 194,01 PI-3 3,01 22,97 11,48 2,18 0 0 91,89 91,89 BHV-1 0 0 0 0 0 0 0 0 BVDV 0 11,48 60,62 3,01 2,75 69,64 60,62 640 BAV-3 55,71 24,25 48,5 12,12 5,27 36,75 64 32 BCoV 91,89 10,98 12,61 0 1,9 0 69,64 557,15 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n= 5 Şekil-34. Đşletme 8’de enfeksiyonlara göre buzağılarda ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 70 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 8 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-35. Đşletme 8’de seropozitif olduğu saptanan anne sayısı 675,5 İŞLETME 8 700 557,1 600 500 400 320 300 200 105,5 100 0 16 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-36. Đşletme 8’deki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 71 Đşletme 9’a Ait Bulgular Đşletme 9’da bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-37, -38, -39 ve -40’da sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 2 olduğu Đşletme 9’da buzağıların her ikisinin de BRSV’ye karşı tüm örnekleme dönemlerinde değişen titrede antikor taşıdığı saptandı. PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 3. ayda azaldığı ve buzağıların 4. ve 6. aylar arasında etkenle karşılaştığı görüldü. BHV-1 enfeksiyonunun örneklemenin 8. ve 10. ayları arasında sürüye girdiği belirlendi. Ancak 1 buzağıda saptanan bu zayıf antikor titresinin kısa sürede kaybolduğu değerlendirildi. BVDV’nin ise 2. ve 3. aylar arasında ilk enfeksiyonu başlattığı belirlendi. Antikor titre değerlerinin öncelikle 2. ayda arttığı sonrasında ise azaldığı görüldü. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 4. aydan sonra düştüğü tespit edildi. Bu etkene karşı antikor titre değerlerinin ilk 4 ayda dalgalı seyrettiği, 4. aydan itibaren ise seropozitif buzağı sayısı ile uyumlu olarak azaldığı belirlendi. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının da 4. aydan itibaren azaldığı ve 6. ayda sıfırlandığı görüldü. Antikor titre eğrisinin bu tablo ile uyumlu olduğu tespit edildi. Her iki annenin serum örnekleri BHV-1 hariç diğer 5 virusa spesifik antikorlar yönünden pozitif sonuç verdi. Saptanan antikorların titre değerlerinin geometrik ortalamaları incelendiğinde en yüksek titrenin BRSV’ye (1:2896.3) karşı saptandığı bunu sırasıyla BCoV (1:113.1), PI-3 (1:80), BAV-3 (1:22.6) ve son olarak BVDV’nin (1:14.1) izlediği görüldü. 72 İŞLETME 9 2,5 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1,5 BRSV PI-3 BHV-1 1 1 1 1 1 1 BVDV BAV-3 BCoV 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=2 Şekil-37. Đşletme 9’da enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 73 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 9 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 2896,3 32 2048 362,03 181,01 1024 1024 362,03 PI-3 28,28 14,14 10 0 20 160 320 113,13 BHV-1 0 0 0 0 0 0 2,23 0 BVDV 14,14 113,13 3,16 0 0 0 0 0 BAV-3 22,62 45,25 32 45,25 4 1,41 5,65 5,65 BCoV 113,13 226,27 10 7,07 0 0 0 0 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=2 Şekil-38. Đşletme 9’da enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 74 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 9 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-39. Đşletme 9’da seropozitif olduğu saptanan anne sayısı 2896,3 İŞLETME 9 3000 2500 2000 1500 1000 500 80 0 14,1 22,6 113,1 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-40. Đşletme 9’daki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 75 Đşletme 10’a Ait Bulgular Đşletme 10’da bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-41, -42, -43 ve -44’de sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 2 olduğu Đşletme 10’da buzağıların her ikisinin de BRSV’ye karşı tüm örnekleme dönemlerinde ve değişen titrelerde antikor taşıdığı saptandı. PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 3. ayda azaldığı ve buzağıların 6. ve 8. aylar arasında etkenle karşılaştığı görüldü. BHV-1’e karşı örneklemenin hiçbir döneminde enfeksiyon saptanamadı. BVDV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 4. aydan itibaren düştüğü ve buzağıların etkene 10. aydan sonra maruz kaldığı belirlendi. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren azaldığı ve buzağıların etkenle 8.-10. aylar arasında karşılaştığı belirlendi. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 4. aydan itibaren azaldığı görüldü. PI-3, BVDV, BAV-3 ve BCoV’a karşı antikor titre değerlerinin 2. ayda arttığı, daha sonraki sürecin seropozitif buzağı sayısı eğrileri ile uyum içinde seyrettiği saptandı. Annelerin serum örneklerinin ikisi de BHV-1 hariç diğer 5 virusa spesifik antikorlar yönünden pozitif sonuç verdi. Saptanan antikorların titre değerlerinin geometrik ortalamaları incelendiğinde en yüksek titrenin BRSV’ye (1:256) karşı olduğu bunu sırasıyla BCoV (1:160) ve PI-3 (1:160), BAV-3 (1:32) ve son olarak BVDV’nin (1:28.2) izlediği görüldü. 76 İŞLETME 10 2,5 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1,5 BRSV PI-3 BHV-1 1 1 1 1 1 1 1 BVDV BAV-3 BCoV 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=2 Şekil-41. Đşletme 10’da enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 77 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı İŞLETME 10 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 512 362,03 256 181,01 1448,15 362,03 512 32 PI-3 56,56 113,13 40 4,47 2,23 160 80 56,56 BHV-1 0 0 0 0 0 0 0 0 BVDV 14,14 56,56 40 40 6,32 4,47 20 0 BAV-3 45,25 128 4 0 0 0 4 4 BCoV 28,28 640 56,56 113,13 12,64 25,29 25,29 6,32 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=2 Şekil-42. Đşletme 10’da enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titresinin aylar bazında seyri 78 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * İŞLETME 10 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-43. Đşletme 10’da seropozitif olduğu saptanan anne sayısı İŞLETME 10 300 256 250 200 160 160 150 100 32 50 28,2 0 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-44. Đşletme 10’daki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 79 Bulguların Đşletme Büyüklüklerine Göre Değerlendirilmesi Büyük Ölçekli Đşletmelere Ait Bulgular Büyük ölçekli işletmelerde bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-45, -46, -47 ve -48’de sunulmuştur. Büyük ölçekli işletmelerden birisinde 18 adet aşılı buzağı yer aldığı için bu buzağılar değerlendirilmeye alınmamış, dolayısıyla çalışma kapsamında değerlendirilen aşısız buzağı sayısı 72 olmuştur. Büyük ölçekli işletmelerde bulunan aşısız tüm buzağılar ele alındığında BRSV’ye karşı maternal antikor taşıyan buzağı sayısında 1. ve 3. aylar arasında görülen azalışın buzağıların 4. ayda etkenle karşılaşmasından sonra yükselişe döndüğü görüldü. PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren düştüğü, buzağıların enfeksiyonla 6. ve 8. aylar arasında karşılaştığı ve örnekleme periyodunun sonuna kadar enfeksiyonun buzağılar arasında düzenli şekilde yayıldığı gözlemlendi. BHV-1’e karşı maternal antikor tespit edilen buzağı sayısının diğer enfeksiyonlara kıyasla oldukça düşük (n=27) olduğu ve bu sayının 6. aya kadar azaldığı, 6. ve 8. aylar arasında buzağıların muhtemel yeni enfeksiyona maruz kaldığı tespit edildi. BVDV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren düştüğü ve 4. ile 6. aylar arasında buzağıların etkene maruz kaldıkları tespit edildi. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren 6. aya dek azaldığı ve örneklenen buzağıların etkenle ilk defa 6. ve 8. aylar arasında karşılaştığı saptandı. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren azaldığı ve 6. aydan itibaren belli bir düzeyde kaldığı görüldü. BRSV antikor titresinin en yüksek düzeyde olduğu (1:502.23), ilk ay düşüş gösteren antikor titresinin 2. aydan itibaren düzenli artış gösterdiği belirlendi (Şekil-46). BRSV’yi takiben BCoV ve BVDV antikor titrelerinin yüksek düzeylerde (1:202 ve 1:198) başladığı ancak tüm enfeksiyonlara ilişkin antikor titre değerlerinin hızlı bir şekilde azalarak 3.-6. aylar arasında minimal düzeyde seyrettiği ve 6. aydan sonra bir miktar artış gösterdiği görüldü. Seropozitif buzağı sayılarında olduğu gibi antikor titre değerleri arasında da en düşük değerler BHV-1’e karşı elde edildi. Đşletme 3’te 10 adet annenin serum örneği hayvanların işletmeden çıkarılması nedeniyle alınamamıştı. Bu hayvanlardan 5 tanesi aşısız buzağıların anneleri olduğu için 80 toplam anne sayısından (n=72) düşüldüğünde büyük ölçekli işletmelerde değerlendirmeye alınan toplam anne sayısı 67’ye inmiş oldu. Büyük ölçekli işletmelerdeki toplam aşısız buzağıların annelerinin serum örneklerinde incelenen etkenlere karşı seropozitiflik durumuna ve bu antikor titrelerinin geometrik ortalamalarına bakıldığında, tüm etkenlere karşı en az 25 annenin antikor taşıdığı görülürken, en düşük ortalama antikor titresinin BHV-1’e karşı (1:2.2), en yüksek antikor titresinin ise BCoV’a karşı (1:396.3) olduğu saptandı. 81 BÜYÜK ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 80 772 72 72 72 7270 701 7701 7169 70 67 6866 67 64 60 6601 60 61 60 55 53 53 50 51 48 BRSV 45 4454 45 4543 43 PI-3 40 40 36 BHV-1 BVDV 30 31 31 31 27 BAV-3 20 BCoV 18 19 16 10 11 7 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=72 Şekil-45. Büyük ölçekli işletmelerde enfeksiyonlara göre seropozitif aşısız buzağı sayısının aylar bazında seyri 82 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı BÜYÜK ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 600 500 400 300 200 100 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 502,23 221,57 248,71 369,07 335,2 497,42 447,44 426,41 PI-3 98,26 50,56 11,9 4,59 4,19 23,92 25,72 27,85 BHV-1 1,81 1,33 1,27 1,14 1,14 1,94 1,67 2,22 BVDV 198,46 129,17 10,66 5,08 22,5 38,07 52,83 18,06 BAV-3 61,58 49,82 11,42 9,69 3,67 22,26 33,31 38,1 BCoV 202,27 144,86 42,67 12,02 14,55 31,95 26,01 21,87 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=72 Şekil-46. Büyük ölçekli işletmelerde enfeksiyonlara göre aşısız buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 83 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * BÜYÜK ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 67 67 66 67 67 67 67 67 6765 64 25 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-47. Büyük ölçekli işletmelerde seropozitif olduğu saptanan anne sayısı BÜYÜK ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 396,3 400 300 245,6 200 103,2 96,7 100 58,3 2,2 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-48. Büyük ölçekli işletmelerdeki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 84 Orta Ölçekli Đşletmelere Ait Bulgular Orta ölçekli işletmelerde bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-49, -50, -51 ve -52’de sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 12 olduğu orta ölçekli 2 işletmede BRSV’ye karşı seropozitif buzağı sayısının 8. ayda hafif bir azalış gösterdiği, ancak takip eden örnekleme döneminde yine tüm hayvanların seropozitif olduğu tespit edildi. PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. ayda arttığı ve 3. aydan itibaren seropozitif sayısında azalış olduğu, 6. ve 8. aylar arasında ise tekrar artış gerçekleştiği belirlendi. BHV-1’e karşı maternal antikor taşıyan buzağı sayısının genel olarak 3. ve 4. aylar arasında azaldığı saptandı ve 6. ay itibariyle antikor taşıyan buzağı sayısı sıfıra indiği görüldü. BVDV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısı başlangıçta oldukça az iken, 2. ayda sayıda artış olduğu, sonrasında 6. aya kadar azaldığı ve 6. ile 8. aylar arasında muhtemel re-enfeksiyonun gerçekleştiği tespit edildi. BAV-3’e karşı maternal antikor taşıyan buzağı sayısının 2. aydan itibaren düşmeye başladığı ve 4. ve 10. aylar arasında buzağıların ilk defa enfeksiyonla tanıştıkları belirlendi. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren düzenli olarak azalış gösterdiği, buzağıların 6. ay itibariyle etkene maruz kaldığı görüldü. BAV-3’e karşı 4. ve 8. aylar arasında geç gelişen antikor yanıtı hariç diğer etkenlere ait antikor titre değerlerinin seropozitif buzağı sayısı eğrileri ile uyumlu olduğu saptandı. Orta ölçekli her iki işletmedeki annelerin serumlarından yapılan incelemeler sonucunda tüm etkenlere karşı en az 7 hayvanda antikor varlığı saptandı. Antikor titre değerlerinin ise 1:724 (BRSV) ile 1:10.2 (PI-3) arasında değiştiği belirlendi. 85 ORTA ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 14 12 12 12 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 10 10 10 9 9 9 BRSV 8 8 8 8 PI-3 7 BHV-1 6 6 6 6 6 BVDV 5 5 BAV-3 4 4 BCoV 3 2 2 2 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=12 Şekil-49. Orta ölçekli işletmelerde enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 86 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı ORTA ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 608,87 483,26 912,28 430,53 383,56 191,78 228,07 645,07 PI-3 3,76 34,97 16,2 4,38 13,9 37,75 42,37 53,39 BHV-1 2,24 2,11 2 1,12 0 0 0 0 BVDV 1,95 25,19 58,82 3,9 10,03 37,82 31,81 120,1 BAV-3 135,61 25,39 6,72 2 1,41 1,41 6,34 230,8 BCoV 111,05 124,65 20,41 2,65 3,41 33,7 42,46 71,41 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=12 Şekil-50. Orta ölçekli işletmelerde enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 87 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * ORTA ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 12 12 12 12 12 12 12 12 11 7 7 7 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-51. Orta ölçekli işletmelerde seropozitif olduğu saptanan anne sayısı ORTA ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 800 724 600 400 200 124,6 120,8 10,2 11,3 27,3 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-52. Orta ölçekli işletmelerdeki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 88 Küçük Ölçekli Đşletmelere Ait Bulgular Küçük ölçekli işletmelerde bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-53 -54, -55 ve -56’da sunulmuştur. Örneklenen buzağı sayısının 10 olduğu küçük ölçekli işletmelerde buzağıların tümünün BRSV’ye karşı tüm örnekleme dönemlerinde ve değişen titrede antikor taşıdığı saptandı. PI-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. ayda arttığı ve 3. aydan itibaren seropozitif buzağıların sayısında azalma olduğu, 8. ve 10. aylar arasında ise muhtemel re-enfeksiyonun gerçekleştiği değerlendirildi. Örneklemenin başlangıcında BHV-1’e karşı hiçbir buzağıda antikor tespit edilemezken, 10. ayda enfekte buzağı sayısında küçük bir artış saptandı. BVDV’ye karşı maternal antikora sahip buzağı sayısı başlangıçta oldukça az iken, 2. ayda sayıda artış olduğu, 3. ve 6. aylar arasında azaldığı ve enfeksiyonun 6. ve 8. aylar arasında tekrar gerçekleştiği tespit edildi. BAV-3’e karşı maternal antikor varlığı saptanan buzağı sayısının 2. ay itibariyle düşmeye başladığı ve buzağıların 6. ve 10. aylar arasında etkene maruz kaldıkları belirlendi. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren düzenli azaldığı, buzağıların 8. ve 10. aylar arasında etkene maruz kaldığı görüldü. Tüm etkenlere yönelik antikor titre eğrilerinin seropozitif buzağı sayısı eğrileri ile uyum içinde seyrettiği saptandı. Küçük ölçekli işletmelerde de en yüksek maternal antikor titresi BRSV’ye karşı elde edildi (1:512). Hızlı azalan BRSV antikor titresinin 3. aydan itibaren tekrar yükseldiği ve dalgalı bir seyir izlediği belirlendi. Diğer enfeksiyonlara ilişkin titre değerlerinin zamanla azalış eğiliminde olduğu ancak PI-3 antikor titresinde özellikle 10. ayda önemli bir yükseliş olduğu gözlendi (Şekil-54). Küçük ölçekli her iki işletmedeki annelerin serumlarından yapılan incelemeler sonucunda BHV-1 hariç diğer 5 virusa karşı en az 9 hayvanda olmak üzere antikor varlığı saptandı. Antikor titre değerlerinin ise 1:24.2 (BAV-3) ile 1:776 (BRSV) arasında değiştiği görüldü. 89 KÜÇÜK ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 12 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 8 8 8 8 8 7 7 7 7 BRSV PI-3 6 6 6 BHV-1 5 5 BVDV 4 4 4 4 BAV-3 3 3 3 BCoV 2 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=10 Şekil-53. Küçük ölçekli işletmelerde enfeksiyonlara göre seropozitif buzağı sayısının aylar bazında seyri 90 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı KÜÇÜK ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 512 207,93 675,58 256 274,37 415,87 512 147,03 PI-3 9,56 28,28 14,14 1,99 2,13 7,61 105,56 85,74 BHV-1 0 0 0 0 0 0 1,17 0 BVDV 4,17 30,31 27,66 3,63 2,4 17,45 14,17 25,29 BAV-3 48,5 27,85 18,37 7,46 3,24 9,18 21,11 14,92 BCoV 74,64 55,32 17,02 3,8 2,29 1,9 15,92 34,13 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=10 Şekil-54. Küçük ölçekli işletmelerde enfeksiyonlara göre buzağılardaki ortalama antikor titrelerinin aylar bazında seyri 91 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * KÜÇÜK ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-55. Küçük ölçekli işletmelerde seropozitif olduğu saptanan anne sayısı KÜÇÜK ÖLÇEKLİ İŞLETMELER 776 800 600 400 200 105,5 139,2 127 0 24,2 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-56. Küçük ölçekli işletmelerdeki seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 92 Tüm Aşısız Buzağılara Ait Kümülatif Veriler Toplam aşısız popülasyonda bulunan buzağılar ve annelerine ilişkin seropozitif hayvan sayıları ve bunlardaki ortalama antikor titre değerleri Şekil-57, -58, -59 ve -60’da sunulmuştur. Toplam aşısız buzağı popülasyonu incelendiğinde buzağıların tümünün BRSV’ye karşı tüm örnekleme dönemlerinde ve değişen titrelerde antikor taşıdığı saptandı. PI-3’e karşı antikora sahip buzağı sayısının 1. ve 2. aylar arasında arttığı ve 2. aydan itibaren 6. aya kadar azaldığı, buzağıların etkenle muhtemelen 6. ve 8. aylar arasında tekrar karşılaşması sonucu enfeksiyonun buzağılar arasında düzenli şekilde yayıldığı gözlemlendi. BHV-1’e karşı maternal antikor tespit edilen buzağı sayısının 6. aya kadar azaldığı, 6. ve 8. aylar arasında ise buzağıların enfeksiyona maruz kaldığı tespit edildi. BVDV’ye karşı antikora sahip buzağı sayısının 1. ve 2. aylar arasında arttığı, daha sonra giderek düştüğü, 4. ve 8. aylar arasında buzağıların enfeksiyonla tekrar karşılaştığı saptandı. BAV-3’e karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 1. aydan itibaren 6. aya dek azaldığı ve örneklenen buzağıların etkenle ilk defa 6. ve 8. aylar arasında karşılaştığı saptandı. BCoV’a karşı maternal antikora sahip buzağı sayısının 2. aydan itibaren azaldığı ve 6. ve 10. aylar arasında antikor taşıyan buzağı sayısının arttığı ve 10. ay itibariyle antikor taşıyan buzağı sayısının sabitlendiği belirlendi. BRSV ve BHV-1 hariç diğer 4 etkene yönelik antikor titre eğrilerinin seropozitif buzağı sayısı eğrileri ile uyum içinde seyrettiği saptandı. Đşletme 3’te 10 adet annenin serum örneği hayvanların elden çıkarılması nedeniyle alınamamıştı. Alınan serum örneklerinin içerisindeki aşılı hayvanların annelerine ait olan 5 adet serum çıkarıldığında, toplam aşısız buzağı sayısı 94 iken bunlara ilişkin anne sayısı 89’da kaldı. Tüm aşısız buzağıların annelerinden sağlanan serum örneklerinde incelenen etkenlere karşı mevcut antikor durumuna ve bu antikor titrelerinin geometrik ortalamalarına bakıldığında, annelerin hemen hemen tamamının BHV-1 hariç diğer viral etkenlere karşı antikor taşıdığı ve en yüksek antikor titre değerinin BRSV’ye (1:323.3), en düşük titre değerinin ise BHV-1’e (1:2.5) karşı olduğu saptandı. 93 TOPLAM AŞISIZ POPÜLASYON 100 94 94 94 94 94 92 92 90 91 91 91 91 88 88 86 84 8 865 82 80 80 78 77 73 74 70 70 7169 69 63 60 59 60 60 BRSV 56 53 54 53 PI-3 50 51 50 BHV-1 42 40 BVDV 33 BAV-3 30 31 31 BCoV 24 23 20 20 13 10 7 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay Örnekleme dönemleri n=94 Şekil-57. Tüm aşısız buzağılar arasında seropozitif birey sayısının aylar bazında seyri 94 S e r o p o z i t i f b u z a ğ ı s a y ı s ı TOPLAM AŞISIZ POPÜLASYON 600 500 400 300 200 100 0 1. ay 2. ay 3. ay 4. ay 6. ay 8. ay 10. ay 12. ay BRSV 515,78 243,12 326,52 362,03 333,83 432,12 416,48 401,41 PI-3 50,56 45,35 12,61 4,18 4,55 22,44 31,85 34,11 BHV-1 1,75 1,37 1,31 1,12 1,1 1,66 1,5 1,84 BVDV 72,98 89,86 14,67 4,74 15,99 35,01 43,05 23,84 BAV-3 66,4 42,97 11,23 7,71 3,2 14,25 25,68 43,4 BCoV 168,51 128,27 35,22 8,77 9,93 23,83 26,28 26,67 Örnekleme dönemleri/Ortalama antikor titresi *: Buzağılardaki antikor titre değerlerinin geometrik ortalaması, n=94 Şekil-58. Tüm aşısız buzağılara ilişkin antikor titre değerlerinin aylar bazında seyri 95 A n t i k o r t i t r e s i ( 1 : X ) * TOPLAM AŞISIZ POPÜLASYON 89 89 89 89 89 89 89 86 86 83 83 32 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Seropozitif hayvan sayısı Test edilen hayvan sayısı Şekil-59. Toplam popülasyonda seropozitif olduğu saptanan anne sayısı TOPLAM AŞISIZ POPÜLASYON 400 323,3 300 243,1 200 104,2 75,7 100 58,2 2,5 0 BRSV PI-3 BHV-1 BVDV BAV-3 BCoV Şekil-60. Toplam popülasyonda seropozitif annelerin ortalama antikor titre değerleri (1:X) 96 Yeni Enfeksiyonla Tanışan Buzağı Sayılarının Aylık Dağılımı Đşletme büyüklüğünün, cinsiyet faktörünün ve aşılı-aşısız gruplarda enfeksiyonların görülme sıklığının incelenebilmesi amacıyla örneklemenin yapıldığı her ay için enfeksiyonla yeni tanışan buzağı sayısı belirlendi. Daha sonra maternal antikorların gerileme zamanı ve buzağıların yeni enfeksiyonlarla karşılaştığı muhtemel zaman dilimleri göz önüne alınarak enfeksiyonla yeni tanışan buzağı sayıları 1.-4. aylar ve 6.-12. aylar arasında olmak üzere iki grupta toplanarak gruplandırıldı. Tablo-7. Đşletme büyüklüklerine göre enfeksiyonla yeni tanışan buzağı sayıları Gruplar 1.-4. aylar 6.-12. aylar BRSV 6 3 PI-3 4 43 BHV-1 13 29 Büyük ölçekli işletmeler BVDV 9 41 BAV-3 13 55 BCoV 2 13 BRSV 0 2 PI-3 5 5 BHV-1 4 0 Orta ölçekli işletmeler BVDV 9 0 BAV-3 1 10 BCoV 0 6 BRSV 0 0 PI-3 2 7 BHV-1 0 0 Küçük ölçekli işletmeler BVDV 5 0 BAV-3 0 7 BCoV 1 4 97 Tablo-8. Cinsiyete göre enfeksiyonla yeni tanışan buzağı sayıları Gruplar 1.-4. aylar 6.-12. aylar BRSV 4 3 PI-3 6 35 BHV-1 10 30 Dişi BVDV 17 33 BAV-3 8 42 BCoV 3 15 BRSV 2 2 PI-3 5 20 BHV-1 7 2 Erkek BVDV 7 9 BAV-3 6 29 BCoV 0 8 Tablo-9. Aşılı-aşısız gruplarda enfeksiyonla yeni tanışan buzağı sayıları Gruplar 1.-4. aylar 6.-12. aylar BRSV 1 0 PI-3 1 1 BHV-1 4 1 Aşılı BVDV 1 9 BAV-3 3 14 BCoV 0 0 BRSV 1 1 PI-3 0 11 BHV-1 6 0 Aşısız BVDV 0 6 BAV-3 4 14 BCoV 0 0 98 İstatistiki Analiz Sonuçları İşletme Büyüklüklerine Göre Enfeksiyon Görülme Sıklığı İşletme büyüklükleri ile enfeksiyon düzeyleri arasındaki ilişkinin incelenmesi için örneklemenin yapıldığı her ayda yeni enfeksiyonla tanışan buzağı sayısı belirlendi (Tablo- 7). Daha sonra maternal antikorların gerileme zamanı ve buzağıların yeni enfeksiyonlarla karşılaştığı muhtemel zaman dilimleri göz önüne alınarak enfeksiyonla yeni tanışan buzağı sayıları 1.-4. aylar ve 6.-12. aylar arasında olmak üzere iki grupta toplanarak gruplandırıldı. Ortaya çıkan iki grup (1.-4. ay ve 6.-12. ay arası) için işletme büyüklükleri arasında ‘Fisher’in Kesin Ki-Kare’ yöntemi kullanılarak karşılaştırma yapıldı. Yapılan analiz sonucunda BRSV, BAV-3 ve BCoV için büyük, orta ve küçük ölçekli işletmeler arasında enfeksiyonların görülme sıklığı için herhangi bir fark saptanamadı (sırasıyla p=0.182, p=0.580, p=0.758). PI-3, BHV-1 ve BVDV için ise enfeksiyonların görülme sıklığı bakımından işletme büyüklükleri arasında anlamlı farklılıklar olduğu tespit edildi (p=0.006, p=0.015, p<0.001). PI-3 ve BHV- 1 için büyük-orta ölçekli işletmeler arasında anlamlı bir fark olduğu (p=0.0053, p=0.0146), BVDV’nin ise hem büyük-orta hem de büyük-küçük işletmeler arasında görülme sıklığı açısından anlamlı düzeyde farklı olduğu tespit edildi (p<0.001, p=0.006) Dişi ve Erkek Buzağılarda Enfeksiyon Görülme Sıklığı Dişi ve erkek hayvanlardaki enfeksiyon düzeylerinin incelenmesi için hayvanlar yukarıda anlatıldığı üzere iki grupta toplandı (Tablo-8). Fisher’in Kesin Ki-Kare yöntemi kullanılarak yapılan analiz sonucunda BRSV, PI-3, BVDV, BAV-3 ve BCoV için dişi ve erkek hayvanlar arasında enfeksiyonların görülme düzeyi için herhangi bir fark saptanamadı (p>0.05, p=0.735, p=0.556, p>0.05, p=0.529). BHV-1 enfeksiyonunun görülme sıklığının ise dişi ve erkek buzağılar arasında anlamlı düzeyde farklı olduğu ve dişilerde görülme olasılığının daha yüksek olduğu saptandı (p=0.005). 99 Aşılı ve Aşısız Buzağılarda Enfeksiyon Görülme Sıklığı İşletme 3’te 4. ayda aşı uygulaması yapılan 18 adet buzağı ile aşı uygulanmayan 21 adet buzağı arasında enfeksiyonların düzeylerine ilişkin inceleme yapılabilmesi için hayvanlar yukarıda anlatıldığı gibi gruplandı (Tablo-9). ‘Fisher’in Kesin Ki-Kare’ yöntemi kullanılarak yapılan analiz sonucunda aşılı ve aşısız buzağılar arasında BRSV, PI- 3, BHV-1, BVDV BAV-3, BCoV enfeksiyonlarının görülme sıklığı arasında herhangi bir fark saptanamadı (p>0.05, p=0.154, p=0.455, p>0.05, p>0.05, p>0.05). Buzağılara Maternal Antikor Geçişi Annelerin serum örneklerinde tespit edilen antikor titreleri ile buzağıların 1. aylarında tespit edilen maternal antikor titreleri arasındaki ilişki istatistiki olarak araştırıldı. Analiz sonucunda BCoV hariç diğer 5 etken için pozitif yönde korelasyon saptandı. Korelasyon katsayıları ve p değerleri şu şekilde sıralandı. BRSV için r= 0.241, p=0.015; PI-3 için r= 0.483, p<0.001; BHV-1 için r= 0.574, p=0.001; BVDV için r=0.264, p=0.007; BAV-3 için r= 0.248, p=0.012; BCoV için r=0.04132, p=0.752. Klinik Bulguların Mevsimsel Dağılımı Solunum enfeksiyonu klinik bulgusuna sahip buzağılardan yapılan örnekleme sonucunda 1 adet örnek ilkbahar sezonunda, 22 adet örnek yaz sezonunda, 29 adet örnek sonbahar sezonunda ve 28 adet örnek ise kış sezonunda temin edildi (Tablo-3). Klinik bulguların mevsimsel dağılımının istatistiki olarak incelenmesinde ‘Fisher’in Kesin Ki- Kare’ yöntemi kullanıldı. Yapılan analiz sonucunda ilkbahar sezonuna göre diğer 3 sezonda incelenen enfeksiyonların görülme riskinin daha yüksek olduğu saptandı (p<0.001). 100 Virolojik Çalışmalar ELISA ile Antijen Tespiti Sonuçları Dörtlü Antijen ELISA Sonuçları Tez çalışması kapsamında örneklenen toplam 137 adet svab ve doku örneği BVDV, BHV-1, BRSV ve PI-3 antijenlerine yönelik olarak ticari antijen ELISA kiti ile test edildi. Bu testte sadece 1 adet doku örneği pozitif sonuç verdi. BHV-1 Antijen ELISA Sonuçları Çalışma kapsamında değerlendirilen 80 adet burun svabı, 18 adet göz svabı ve 39 adet akciğer olmak üzere toplam 137 adet örnek BHV-1 antijen ELISA kiti ile test edildi ve tüm örneklerde negatif sonuç alındı. BVDV Antijen ELISA Sonuçları 80 adet burun svabı, 18 adet göz svabı ve 39 adet akciğer örneği BVDV antijen ELISA kiti ile test edildi (Şekil-62). Testin sonucunda 8 adet burun svabında, 2 adet göz svabında ve 3 adet akciğer doku örneğinde olmak üzere toplam 13 adet örnekte (%9.48) BVDV antijenlerinin varlığı belirlendi. Geriye kalan 72 adet burun svabı, 16 adet göz svabı ve 36 adet akciğer örneği ise negatif sonuç verdi. Pozitif sonuç veren svab örneklerinin 2 tanesinin 4 ay ara ile aynı hayvandan alınmış olması ve örnekleme sırasında 7. ayda ölmesi nedeniyle çalışma kapsamından çıkarılan 1026 numaralı buzağının yaşıtlarına göre gelişim geriliği göstermesi (Şekil- 61) bu bireylerde muhtemel persiste enfeksiyon olabileceğini düşündürdü. Bu nedenle söz konusu işletmede (İşletme-2) yer alan ve svab örnekleri BVDV antijen ELISA kitinde pozitif sonuç veren buzağılar persiste BVDV enfeksiyonu yönünden incelendi. Bu aşamada çalışma sürecinde örneklenmiş olan svab örneklerinde BVDV antijeni saptanan üç buzağının (Buzağı no:16, 42 ve 1026) tüm serum örnekleri ve annelerinin serumları 101 BVDV antijen ELISA’ya tabi tutuldu. Her 3 buzağının tüm serum örnekleri (1.-12. aylar, 8 örnek) ve bir buzağının (no: 16) annesinden sağlanan serum örneği BVDV antijenleri yönünden pozitif sonuç verdi. Böylece her 3 buzağının da BVDV ile PE olduğu belirlenmiş oldu. İşletmedeki 16 nolu PE buzağının annesinde ise tek serum örneğinde çalışma yapılmış olması sebebiyle annenin persiste enfeksiyon durumu ile ilgili kesin bir değerlendirme yapılamadı (Tablo-10). 102 A B Şekil-61. A-B: Yaşıtlarına göre gelişim geriliği gösteren 1026 numaralı buzağı 103 Şekil-62. Svab ve doku örneklerine uygulanan BVDV antijen ELISA (Dış bakı) Virus İzolasyon Sonuçları Değerlendirmeye alınan 80 adet burun svabı, 18 adet göz svabı ve 39 adet akciğer örneği olmak üzere toplam 137 adet örnek MDBK hücre kültürüne ekilerek birbirini takip eden 3 kör pasaj işlemine tâbi tutuldu. Süreç sonunda hiçbir örneğin ekildiği hücre kültüründe sitopatolojik etki saptanamadı. Virus izolasyonu işlemi PE olduğu değerlendirilen buzağıların ve annelerinin serum örneklerine de uygulandı. Bu örneklerin ekildiği hücre kültürlerinde de sitopatolojik etki yaratan herhangi bir virus üremesi tespit edilemedi. 104 İmmunoperoksidaz Testi (IPX) Sonuçları Kör pasaj işlemine tabi tutulmuş 137 adet örnek nonsitopatojen BVDV varlığı yönünden test edilmek üzere immunoperoksidaz testine alındı. Test sonucunda 5 adet burun svabı ile 5 adet akciğer örneği olmak üzere toplam 10 örnek nonsitopatojen BVDV yönünden pozitif olarak tespit edildi (Şekil-63). PE olduğu antijen ELISA ile belirlenen 3 buzağıdan ikisine (buzağı no: 16 ve 42) ait birer serum örneğinde nonsitopatojen BVDV tespit edildi. Örneklerin 16 nolu buzağının 1. ayına ait ve 42 nolu buzağının 4. ayına ait serum örnekleri olduğu belirlendi. A B C D Şekil-63. Çalışma kapsamında uygulanan immunoperoksidaz testinde elde edilen görüntüler A: İmmunoperoksidaz testinde pleytin görünümü, B: Serum örneği (x4 büyütme) C: Svab örneği (x10 büyütme), D: Akciğer örneği (x20 büyütme) 105 Tablo-10. PE buzağıların serum ve svab örnekleri ile annelerinin serum örneklerine uygulanan SN50, BVDV antijen ELISA ve virus izolasyonu- İmmunoperoksidaz testi sonuçları Hayvan No Örnekleme 1 2, 2 16 numaralı buzağı 1026 numaralı buzağı * 42 numaralı buzağı dönemleri Antikor Serum Svab** Antikor Serum Svab** Antikor Serum Svab** titresi titresi titresi AgELISA IPX Burun Göz Ag ELISA IPX Burun Göz Ag ELISA IPX Burun Göz 1. ay 0 + + 1:160 + - 1:640 + - 2. ay 1:5 + - 1:20 + - 1:640 + - 3. ay 1:10 + - 1:5 + - 0 + - 4. ay 1:5 + - 0 + - 0 + + 6. ay 1:40 + - + + 0 + - + + 0 + - + 8. ay 1:40 + - - 0 + - 10. ay 1:20 + - + - 0 + - 12. ay 1:20 + - 0 + - Anne 1:160 + - 1:640 - - 1:640 - - 1 2 : Haziran ayı doğumlu buzağı, : Temmuz ayı doğumlu buzağı *1026 nolu buzağının örnek toplama sürecinde 7. ayda ölmesi nedeniyle 6. aydan sonraki serum örnekleri mevcut değildir. Dolayısıyla bu hayvana ait örnekler SN50 değerlendirilmesine alınmamıştır. ** Hayvanlardan sadece klinik belirtilerin olduğu dönemde örnekleme yapılmıştır. BVDV antijen ELISA’da pozitif sonuç veren svab örnekleri virus izolasyonu- immunoperoksidaz testinde ise negatif sonuç vermiştir. +: Pozitif, -: Negatif 106 BVDV Antijen ELISA ve İmmunoperoksidaz Testi Sonuçlarının Karşılaştırması Numunelerden hazırlanan 137 adet inokulumdan yapılan BVDV antijen ELISA sonucunda 13 adet örnek pozitif, 1 örnek şüpheli pozitif sonuç verirken 123 adet örnek negatif sonuç verdi (Tablo-11). Virus izolasyonu çalışmalarını takiben yapılan immunoperoksidaz testinde ise ELISA ile uyumlu olarak 2 örnek pozitif sonuç verirken, ELISA’da negatif olan 8 örnek immunoperoksidaz testinde pozitif sonuç verdi. Kalan 127 örnek ise immunoperoksidaz testinde negatif olarak değerlendirildi. İki testin herhangi birisinde pozitif sonuç veren 22 örneğin 3. pasaj üst sıvılarına tekrar BVDV antijen ELISA uygulandı ve 7 örnek pozitif sonuç verdi. Bu testin sonucu ile immunoperoksidaz testinin sonuçları karşılaştırıldığında ise 7 örneğin her iki testte de pozitif olduğu görülürken, immunoperoksidaz testinde pozitif olup ELISA’da negatif olan 3 örnek tespit edildi. Kalan 12 örnek de yine immunoperoksidaz testi ile uyumlu olarak negatif sonuç verdi. 107 Tablo-11. BVDV yönünden pozitif olduğu saptanan svab ve doku örneklerine ilişkin veriler* Sıra İşletme no/ Hayvan Örnek Direkt numuneden IPX sonucu 3. kör pasaj üst sıvısı no Mezbaha no yapılan ELISA sonucu ELISA sonucu 1 2 16 Göz svabı + - - 2 2 16 Burun svabı + - - 3 2 1026 Burun svabı + - - 4 2 1026 Göz svabı + - - 5 2 42 Burun svabı + - - 6 2 16 Burun svabı + - - 7 Muğla 3343 Burun svabı - + - 8 Muğla 7174 Burun svabı + + + 9 Mezbaha 8 Akciğer + - - 10 Mezbaha 15 Akciğer - + + 11 Mezbaha 16 Akciğer + + + 12 Mezbaha 17 Akciğer - + + 13 Mezbaha 18 Akciğer - + + 14 Mezbaha 21 Akciğer - + + 15 Mezbaha 24 Akciğer + - - 16 Yenişehir 1 729 Burun svabı - + - 17 Yenişehir 2 616 Burun svabı - + - 18 Yenişehir 2 505 Burun svabı - + + 19 Yenişehir 2 8710 Burun svabı + - - 20 Yenişehir 2 2954 Burun svabı + - - 21 Yenişehir 2 5825 Burun svabı + - - 22 Yenişehir 2 5826 Burun svabı ?+ - - Toplam 13 (+), 1 (?+), 8(-) 10 (+), 12(-) 7 (+), 15 (-) *Tabloda yer almayan örnekler her iki testte de negatif olarak saptanmıştır, +: Pozitif, -: Negatif, ?+: Şüpheli pozitif 108 TARTIŞMA ve SONUÇ Sığır solunum yolu enfeksiyonları buzağı yetiştirilen sürülerde en sık rastlanan problem olmasının yanı sıra (1) yetiştiriciyi olduğu kadar ülke ekonomisini de direkt ilgilendirdiği için son derece önemlidir. Bu enfeksiyonlara ilişkin maddi kayıplar; hayvan ölümleri, canlı ağırlık kaybı, verim düşüklüğü, veteriner hekim ücretleri ve ilaç maliyetlerinden ileri gelmektedir. Örneğin; 1991 yılında ABD’de sığır solunum yolu enfeksiyonlarının meydana getirdiği ekonomik kaybın 600 milyon doların üzerinde olduğu tahmin edilmektedir (3). Sığırların solunum yolu enfeksiyonlarının oldukça yaygın ve ekonomik yönden önemli olması (3) nedeniyle bu tez çalışmasında süt sığırı işletmelerinde solunum sistemi viral hastalıklarının 1 yıl süresince serolojik takibi yapılmıştır. Buradaki temel amaç serolojik testlerle araştırılan her bir etkene karşı mevcut maternal antikorların gerileme dönemleri, buzağıların muhtemel ilk enfeksiyona maruz kalma yaşı ve buzağılar için optimum aşılama zamanıyla ilgili veriler toplamak ve öneriler geliştirmektir. Bu çalışmalara paralel olarak yürütülen virolojik çalışmalarla da solunum yolu enfeksiyonlarından virus tespitine gidilmiş ve daha sonra yapılabilecek muhtemel çalışmalar için temel olabilecek veriler elde edilmiştir. Çalışmada solunum sistemi enfeksiyonlarında en sık karşılaşılan etkenlerden bovine respiratory syncytial virus (BRSV), bovine herpesvirus 1 (BHV-1), bovine parainfluenza virus tip 3 (PI-3), bovine viral diarrhoea virus (BVDV), bovine adenovirus tip 3 (BAV-3) ve yine sığırların solunum sisteminden izole edilen bovine coronavirus (BCoV) (4-10, 12- 14) yönünden incelemeler yapılmıştır. Sığır sürülerinde erişkin hayvanlar genellikle yukarıda açıklanan patojenlere karşı bağışık durumdadır. Bu viruslara ilişkin hastalık tabloları daha çok maternal immuniteden aktif immuniteye geçiş döneminde olan genç hayvanlarda görülmektedir (37). Bu nedenle araştırmada kullanılan hayvanlardaki örnekleme çalışmaları 1 aylık yaştan başlanarak 12 aylık yaşa kadar sürdürülmüştür. 109 Enfeksiyonların Aşısız Buzağı Popülasyonundaki Seyri Örneklenen 112 adet buzağının 18’ine 4. aylarında BRSV, PI-3, BVDV tip 1- tip 2 ve BHV-1’e yönelik karma aşı uygulandığından bu hayvanlarda incelenen enfeksiyonların doğal seyrini izlemek mümkün olmamıştır. Geriye kalan 94 buzağıda 1 yıllık süreç boyunca tespit edilen seropozitif buzağı sayısı incelendiğinde (Şekil-57) tüm etkenlerin aşısız toplam popülasyon içerisinde devamlı var olduğu görülmüştür. Bu çalışmada olduğu gibi birçok araştırmada da sığır solunum yolu enfeksiyonlarında birden fazla etkenin birlikte görüldüğü gösterilmiştir (4, 36). Bu durumun BRSV, PI-3 ve BCoV’ün subklinik, BHV-1’in latent persiste ve BVDV’nin ise immunotolere persiste olarak sürü içerisinde kalabilme mekanizmalarından (7, 18-20, 158, 159) ileri gelebileceği değerlendirilmektedir. Bu çalışmada BRSV’nin örneklenen aşısız popülasyonda hemen hemen sabit düzeyde seyretmesinin Hägglund ve arkadaşlarının (7) çalışması ile uyumlu olduğu görülmüştür. Bu durumun maternal bağışıklığın kısa süreli olması nedeniyle farklı bağışıklık durumunda olan hayvan sayısının fazla olması sonucu sürüde virus sirkülasyonun devamlı olmasından (160) kaynaklanabileceği düşünülmüştür. Ek olarak BRSV maternal antikorlarının etkenin replikasyonunu ve saçılmasını önleyemediği (20), maternal antikor titresi yüksek olan hayvanlarda da enfeksiyonun gerçekleştiği (34), enfeksiyonun subklinik olarak sürü içerisinde kalabileceği, re-enfeksiyonlarla sıkça karşılaşabileceği ve seropozitif buzağılarda da enfeksiyon şekillenebileceği gösterilmiştir (20). Ek olarak kazanılmış bağışıklık sonrası BRSV’ye karşı oluşan antikorların re-enfeksiyon olmadan yıllar sonra bile tespit edilebildiği gösterilmiştir (151, 161). Dolayısıyla tespit edilen antikorların daha önce geçirilmiş bir enfeksiyondan dolayı kazanılmış bağışıklıktan ileri gelebileceği de unutulmamalıdır. Toplam aşısız popülasyona ait seropozitif buzağı sayısı (Şekil-57) ve antikor titresi geometrik ortalama grafiği incelendiğinde (Şekil-58) BRSV’nin tüm aylarda %96’nin üzerinde seropozitivite ve bununla birlikte diğer etkenlerle kıyasladığında daha yüksek antikor titresi ile seyrettiği açıkça görülmektedir. Elvander’in (161) çalışmasında da serokonverte buzağı sayısının PI-3, BVDV ve BCoV enfeksiyonlarına kıyasla en fazla BRSV enfeksiyonunda olduğu görülmüştür. Dolayısıyla bu çalışmada BRSV ile ilgili elde edilen veriler daha önce Elvander (161) tarafından bildirilen verileri desteklemektedir. Yine aynı çalışmada akut BRSV salgınlarında risk altındaki popülasyonda yer alan özellikle yetişkin sığırlar ile gebe ya da yeni doğum yapmış ineklerin daha ağır hastalık 110 tabloları sergiledikleri görülmüştür. Daha sonra enfeksiyonun genç hayvanlar üzerinden endemik olarak sürü içerisinde kaldığı bildirilmiştir. Buna göre PI-3, BHV-1, BVDV, BAV-3 ve BCoV’ün sığır solunum sistemi hastalıkları kompleksi için direkt risk faktörü olmayabileceği, esas etkenin BRSV olduğu ve diğer etkenlerin ise sığır solunum yolu hastalıkları kompleksine katkıda bulunduğu Raaperi ve arkadaşlarının çalışmasına (162) paralel olarak söylenebilmektedir. PI-3 ve BVDV’nin immunsupresyon mekanizmaları sayesinde çok etkenli solunum sistemi enfeksiyonlarına ve bu enfeksiyonların şiddetinin artmasına neden olduğu ve bu şekilde ana etken olarak değil de hazırlayıcı etkenler olarak değerlendirilebilecekleri düşünülmektedir (4, 163). Diğer taraftan örneklenen tüm buzağı popülasyonu dikkate alındığında (Şekil-57) seropozitif buzağı sayıları bakımından PI-3 ve BVDV enfeksiyonlarının benzer bir seyir izlediği anlaşılmaktadır. Bu araştırmada ele alınan etkenlerin bulaşma stratejilerine bağlı olarak örneklenen popülasyondaki yaygınlıkları da değerlendirilebilir. Örneğin; BVDV, BHV-1 ve BRSV’nin deneysel olarak hava yolu ile yayılabildiği gösterilmiştir (164). Fakat BCoV için Ohlson ve arkadaşlarının (165) yaptığı çalışmada yakın mesafedeki sürülerin bir kısmı BCoV pozitif çıkarken, bir kısmıysa BCoV negatif çıkmıştır. Dolayısıyla hava yolu ile bulaşmanın BCoV epidemiyolojisinde geçerli olmayabileceği düşünülmüştür. Bu çalışmada da BCoV’la ilgili olarak destekleyici veriler elde edilmiştir. BCoV ile ilgili olarak tespit edilen seropozitifliklerin muhtemel bir nedeninin de erken yaşam dönemlerinde geçirilen gastrointestinal enfeksiyonlar olabileceği göz ardı edilmemelidir. Maternal antikorların zamana bağlı olarak gerilemesine uyumlu olarak BCoV yönünden seropozitif buzağı sayısının düzenli azaldığı (Şekil-57) ve yeni/ani bir artış göstermediği anlaşılmaktadır. Paralel olarak antikor titre değerleri de gerileme göstermiştir. BRSV, PI-3, BHV-1 ve BAV-3 enfeksiyonları için örneklemenin 8. ayında; BVDV ve BCoV için ise örneklemenin 6. ayında seropozitif buzağı sayısında artış olduğu tespit edilmiştir. Bu ayların diğer çalışmalarda (20, 166) olduğu gibi kış sezonuna denk geldiği görülmüştür. Buna uyumlu olarak klinik belirtilerin görüldüğü 80 hayvandan alınan svab örneklerinin mevsimsel dağılımının; ilkbaharda %1.25, yaz aylarında %27.5, sonbaharda % 36.25 ve kış aylarında %35 şeklinde olduğu belirlenmiştir. Bu durum özellikle yaz, sonbahar ve kış aylarının solunum sistemi hastalıkları için risk faktörü olduğunu teyit etmektedir (p<0.001). 111 Klinik olgulardan virus tespiti için alınan svablar içinde BVDV pozitif sonuç veren örneklerin yarısının kış aylarına diğer yarısının ise yaz aylarına denk geldiği görülmüştür. Yine seropozitif buzağı sayısına bakarak buzağıların 8-10 aylık yaşlar arasında BRSV, PI- 3, ve BCoV virusları ile enfeksiyona yakalandığı ve bu sonucun Hägglund ve arkadaşlarının (7) yaptığı çalışmaya paralel olduğu görülmüştür. Birçok çalışmada (20, 37, 166) buzağıların muhtemelen 9 aylık yaşta BRSV ve PI-3’e yakalandıkları gösterilmiştir. Ayrıca örneklemenin 8. ayında tüm enfeksiyonlar için seropozitif buzağı sayısında artış olması incelenen tüm etkenlerin aynı anda popülasyon içinde doğal olarak sirküle olduğunu göstermektedir. Örneklenen aşısız popülasyon ele alındığında diğer 4 etkenden (BRSV, BHV-1, BAV- 3, BCoV) farklı olarak BVDV’ye yönelik seropozitif buzağı sayısının ve ortalama antikor titresinin 2. ayda arttığı görülmüştür (Şekil-57 ve -58). BVDV’ye karşı gelişen antikor yanıtının enfeksiyonu takiben 2-3 hafta içerisinde tespit edilebilecek düzeye geldiği bilinmektedir (167). Bu durum maternal antikorların yanında erken dönem enfeksiyonlarından kaynaklanan antikor yükselmesinin de olabileceğini göstermiştir. Dolayısıyla doğumu takiben erken dönemlerdeki buzağılar arasında BVD virusunun sirkülasyon halinde olabileceği veya intrauterin enfeksiyon gerçekleştirmiş olabileceğine işaret etmektedir. Doğal olarak 1. ayda tespit edilen antikorların bir bölümünün maternal kaynaklı olmayabileceği de değerlendirilebilir. PI-3 için de 2. ayda seropozitif buzağı sayısının arttığı fakat BVDV’den farklı olarak ortalama antikor titre değerinin azaldığı görülmüştür (Şekil-57 ve 58). Burada da erken dönem enfeksiyonlarının varlığı akla gelmektedir. PI-3 için ortalama antikor titresindeki azalmanın ise enfekte olan buzağılarda düşük titrede antikor yanıtının gelişmesinden ve aynı zamanda maternal antikorlarda yüksek oranda yıkımlanmanın meydana gelmesinden kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Antikor titrelerinin geometrik ortalamaları incelendiğinde (Şekil-58) BRSV’nin tüm örnekleme dönemlerinde yüksek titrede antikor varlığı ile seyrettiği görülmüştür. PI-3, BVDV ve BCoV etkenlerine karşı buzağılardaki antikorların 4. ayda, BAV-3’e karşı 6. ayda en düşük seviyeye ulaştığı, BHV-1 için ise tüm örnekleme dönemlerinde çok düşük bir antikor titre ortalaması şekillendiği tespit edilmiştir. Bu süreç içinde enfekte olan buzağılar olsa da geometrik ortalamaların düşmesine esasen maternal antikorların hızlı yıkımlanmasının neden olduğu değerlendirilmiştir. Maternal antikor miktarının annelerin 112 bağışıklık durumuna, kolostrum kalitesine ve kolostrum miktarına bağlı olarak değişmekle birlikte BRSV, PI-3, BHV-1 ve BVDV için maternal antikorların tespit edilemeyecek seviyeye gelmesinin 6 aya kadar sürebildiği birçok çalışmada gösterilmiştir (160, 168- 172). Bu çalışmada her ne kadar tüm örnekleme dönemlerinde tespit edilebilir düzeylerde ortalama antikor titresi görülse de bu titrelerin özellikle 3. aydan itibaren çok düşük düzeylere gerilediği görülmektedir. BHV-1’e karşı ise seropozitif buzağı sayısının diğer etkenlere göre az olmasıyla birlikte 1. ay dâhil olmak üzere örneklemenin her döneminde antikor titrelerinin geometrik ortalama değerlerinin oldukça düşük olduğu tespit edilmiştir. Dolayısıyla BHV-1’e yönelik maternal antikorlara ilişkin yorum yapılması sağlıklı olmayacaktır. Bu durumun bireysel olarak örneklenen buzağıların etkene yönelik düşük titrede antikor taşımasından ve tüm örnekleme süresince seropozitif buzağı sayısının oldukça sınırlı olmasından kaynaklandığı değerlendirilmektedir. Örneklenen buzağıların annelerinin bir kısmı BAV-3 dışındaki viruslara karşı aşılı olduğundan annelerin verilerine bakılarak bu viruslar için değerlendirme yapma imkânı yoktur. Ancak antikor varlığına ve titre değerlerine bakılarak BAV-3’ün anne popülasyonunda doğal olarak sirküle olduğu söylenebilir (Şekil-59 ve 60). Örneklenen aşısız buzağı popülasyonunda elde edilen veriler kullanılarak büyük, orta ve küçük ölçekli işletmeler için ayrı ayrı değerlendirme yapmak mümkün olmuştur. Buna göre; büyük ölçekli işletmelerde tüm etkenlerin sürü içerisinde doğal olarak sirküle olduğu seropozitif buzağı sayısındaki ve ortalama antikor titrelerindeki değişime (Şekil 45 ve 46) bakılarak söylenebilmektedir. BRSV ve BCoV için 10. ve 12. aylar arasında antikor taşıyan buzağı sayısının stabil hale gelmesinden dolayı bu dönemde sürü bağışıklığının sağlandığı değerlendirilmiştir. Büyük ölçekli işletmeler içinde yer alan İşletme 1 ve 2’de annelere BVDV tip 1 ve tip 2, BHV-1 ve BCoV’a, İşletme 3 ve 4’te ise BVDV tip 1 ve tip 2, BHV-1, BRSV, PI-3 ve BCoV’a yönelik aşı uygulandığından annelerin bu etkenlere karşı taşıdığı antikorların aşı kaynaklı olabileceği düşünülmektedir (Şekil 47 ve 48). Dolayısıyla annelerden elde edilen veriler sadece BAV-3’ün sürü içerisinde doğal olarak sirküle olduğunu desteklemektedir. Orta ölçekli işletmelerde seropozitif buzağı sayısındaki ve ortalama antikor titrelerindeki değişime bakıldığında (Şekil-49 ve 50) BHV-1 hariç diğer 5 enfeksiyonun sürü içerisinde doğal olarak sirküle olduğu görülmektedir. BRSV, PI-3, BVDV ve BCoV için 8. ve 12. aylar arasında antikor taşıyan buzağıların sayısının sabitlenmesinden dolayı 113 sürü bağışıklığının sağlandığı görülmektedir. Büyük ölçekli işletmelerden (Şekil-45) farklı olarak orta ölçekli işletmelerde BHV-1 antikoru tespit edilen buzağı sayısının zamanla sıfırlandığı görülmektedir. Bu durum söz konusu işletmelerde BHV-1 sirkülasyonunun çok sınırlı düzeyde olduğunu teyit etmektedir. Orta ölçekli işletme grubunda yer alan İşletme 5 ve 6’da annelere enterik BCoV’a yönelik aşı uygulanmıştır. Dolayısıyla annelerin serumları incelendiğinde elde edilen tablodaki BCoV antikorlarının aşıdan mı yoksa doğal enfeksiyondan mı kaynakladığı ayırt edilememektedir (Şekil-51 ve 52). Anne ve buzağıların test sonuçları birlikte incelendiğinde ise BHV-1 hariç diğer enfeksiyonların doğal olarak sirküle olduğu görülmektedir. Küçük ölçekli işletmelerde ise hiçbir hayvana aşı uygulanmadığı için tüm etkenlerin bu işletmelerde doğal olarak sirküle olduğu değerlendirilmiştir (Şekil-53 ve 54). BRSV’ye karşı artan ve azalan titre değerlerinde antikor seyri görüldüğünden seropozitif hayvan sayısı sabit olsa bile enfeksiyonun sürü içerisinde seropozitif hayvanlar arasında sirküle olabildiğini göstermektedir. Bu durum antikor varlığının hayvanlarda tekrar BRSV enfeksiyonu gelişmesini engelleyemediğine işaret etmektedir. Bu grupta yer alan işletmelerin hiçbirisinde annelere aşı uygulanmamıştır. Dolayısıyla BHV-1 hariç diğer 5 enfeksiyonun sürü içerisinde doğal olarak seyrettiği annelere ait grafiklerden de (Şekil-55 ve 56) anlaşılmaktadır. Bu araştırmada elde edilen verilere bakıldığında muhtemel re-enfeksiyon tabloları çalışma boyunca açıkça izlenebilmektedir. Örneğin; İşletme 4’te PI-3 yönünden (Şekil-17 ve 18), İşletme 6’da BAV -3 yönünden (Şekil-25 ve 26), İşletme 8’de BVDV ve BCoV yönünden (Şekil-33 ve 34), orta ölçekli işletmelerde BVDV yönünden (Şekil-49 ve 50) ve küçük ölçekli işletmelerde PI-3 yönünden (Şekil-53 ve 54) seropozitif buzağı sayısında ve antikor titrelerinde görülen paralel dalgalanmalar söz konusu etkenlerin sürü içerisinde dolaştığını ve muhtemel re-enfeksiyonlara neden olduğunu göstermektedir. Büyük ölçekli işletmelerde BRSV için seropozitif buzağı sayısındaki dalgalanmanın enfekte olan buzağıların iyileşme süreci ile yeni enfekte olan buzağıların aynı döneme denk gelmesinden kaynaklandığı, dolayısıyla seropozitif buzağı sayısı artarken antikor titrelerinin geometrik ortalamasındaki azalışın (Şekil-45 ve 46) normal olduğu düşünülmüştür. Annelerin serumlarında yapılan incelemeler sonucunda BHV-1 antikoru tespit edilen anne sayısının işletme 1, 2 ve 4’te düşük olması (Şekil-5, 9, 19) bu işletmelerde BHV-1’e 114 ilişkin maternal antikor saptanan buzağı sayısının neden az olduğunu açıklamaktadır (Şekil-4, 8, 18). Ek olarak söz konusu işletmelerin annelere yönelik aşılama programı uyguladığı dikkate alındığında her üç işletmenin de annelere uygulanan aşılama ile BHV-1 yönünden istenilen verimi alamadığı anlaşılmaktadır (Şekil-5, 9, 19). Özetle; elde edilen verilerde görüldüğü üzere toplam popülasyon incelendiğinde seropozitif buzağı sayısının BRSV ve BHV-1 için 2. ayda, PI-3, BVDV, BAV-3 ve BCoV için 3. ayda azaldığı görülürken maternal antikorların BRSV için 2. ayda, PI-3, BVDV, ve BCoV için 4. ayda, BAV-3 için ise 6. ayda en düşük seviyeye ulaştığı, BHV-1’e karşı ise örneklemenin her döneminde sıfıra yakın düzeyde antikor tespit edildiği görülmektedir. Buzağıların tüm etkenlere yönelik yeni enfeksiyonlarla 4. ve 8. aylar arasında kalan zaman diliminde karşılaştığı görülmüştür. Bu verilere istinaden söz konusu viruslara yönelik olarak buzağılarda ilk aşılamanın 2. ve 3. aylar arasında yapılması ayrıca pasif immunitenin aşı üzerinde yapabileceği olumsuz etkiyi en aza indirmek ve daha güçlü bir bağışıklık sağlayabilmek için 1 ay sonra tekrar dozunun yapılması önerilebilir. Diğer taraftan bazı viruslar için 8.-12. aylar arasında yeniden virus sirkülasyonu olduğu ve seropozitif buzağı sayısının arttığı görülmektedir (Şekil-57). Bu durum 2. aşılamadan 5-6 ay sonra tekrar bir aşılama yapılabileceğini işaret etmektedir. İşletme Büyüklüklerine Göre Enfeksiyon Görülme Sıklığı Bazı yazarlar farklı yaş gruplarında BRSV, BHV-1 ve BVDV için sürü büyüklüğü ile seropozitif hayvan sayısı arasında pozitif yönde ilişki olduğunu savunmaktadır (23, 173- 175). Bu tez çalışmasında 1 yaşından küçük buzağılarda maternal antikorların gerilemesi ve enfeksiyonların doğal seyrinin belirlenebilmesi açısından işletme büyüklükleri ile enfeksiyonların görülme/yayılma oranlarını değerlendirmekte mümkün olabilmiştir. Üç grup işletmede seropozitif buzağı sayısının zamana göre değişimi incelendiğinde (Şekil-45, -49, -53) BRSV, BCoV ve BAV-3 enfeksiyonları için işletme grupları arasında her hangi bir fark bulunamamıştır. İstatisiki olarak PI-3 ve BHV-1’in büyük ölçekli işletmelerde, BVDV’nin ise hem büyük hem de orta ölçelikli işletmelerde daha fazla görüldüğü tespit edilmiştir. Ayrıca BVDV’nin büyük ölçekli işletmelere, BCoV’un ise orta ölçekli işletmelere diğer işletme tiplerine kıyasla 1 ay erken girdiği belirlenmiştir. 115 Bu çalışmada elde edilen veriler ışığında her etken için sürü büyüklüğü ile seropozitif hayvan sayısının paralel olmayabileceği görülmüştür. Bu noktada seropozitif hayvan sayısının sürü büyüklüğü ile ilişkilendirilmesinden çok sürüdeki seronegatif yani duyarlı birey sayısı ve işletmelerin bulunduğu bölgelerdeki enfeksiyonların prevalansı ile ilişkilendirilmesi gerektiği vurgulanmalıdır. Bu konudaki önemli bir diğer unsur da virusun bulaşma yolu ve bireyler arasında yayılma hızıdır. Sürü büyüklüğü, bir bölgedeki çiftlik-hayvan yoğunluğu, hayvanların birbirleriyle olan direkt temasları ve işletmelere günlük giden ziyaretçi sayısı, biyogüvenlik kurallarının ne kadarının uygulandığı, vb. faktörler enfeksiyonların yayılımlarındaki temel risk faktörleri olarak sıralanabilir. Bu kriterler dikkate alındığında işletme büyüdükçe hayvan sayısı, hayvanların birbirleri ile olan teması ve ziyaretçi sayısı artacağından ana risk faktörü olarak sürü büyüklüğünün ele alınması yanlış bir yaklaşım değildir. Daha önce yapılan araştırmalarda (23, 175) hayvanlardan bir defa örnek alınarak belirlenen seroprevalans değerleri ile işletme büyüklüğü arasında ilişki kurulmuş ve değerlendirilmiştir. Bu çalışmada ise örneklenen popülasyon 1 yıl boyunca takip edilerek işletme büyüklükleri ile enfeksiyonla yeni tanışan hayvan sayısı arasında değerlendirme yapılmıştır. Dolayısıyla bu araştırmada tespit edilen farklılıklar olgulara yaklaşım farklılığından kaynaklanmakla birlikte daha geçerli sonuçlar sunabilir. Dişi ve Erkek Buzağılarda Enfeksiyon Görülme Sıklığı Araştırma kapsamında ele alınan toplam 94 adet aşısız buzağı popülasyonu içinde 38 adet erkek ve 56 adet dişi buzağı bulunmaktadır. Dolayısıyla araştırılan enfeksiyonların görülme sıklığının cinsiyetler arasında herhangi bir fark taşıyıp-taşımadığının değerlendirilmesi de mümkün olmuştur. PI-3 enfeksiyonlarının dişilerde daha fazla görüldüğü bildirilmiştir (176). Bu çalışmada ele alınan popülasyonda yaşamın ilk 1 yıllık döneminde PI-3 enfeksiyonları yönünden gruplar arasında önemli bir fark tespit edilememiş ve etkenin her iki grupta da 8. aydan sonraki dönemde yoğun olarak yeni enfeksiyonlara neden olduğu tespit edilmiştir. Bu araştırmada Durham ve Hassard’ın (176) çalışmasına zıt olarak BRSV için de iki grup arasında istatistiki fark tespit edilememiştir. 116 Elde edilen veriler araştırılan enfeksiyonlar arasında yalnızca BHV-1 enfeksiyonunun dişilerde istatistiki olarak daha fazla görüldüğüne işaret etmektedir (p=0.0051). Durham ve Hassard’ın (176) çalışmasında da küçük bir farkla da olsa 4-10 aylık buzağılar arasında dişilerdeki prevalansın daha yüksek olduğu görülmektedir. Bazı çalışmalarda BVDV enfeksiyonu için cinsiyetler arasında herhangi bir fark tespit edilemezken (175), Durham ve Hassard (176) 4-10 aylık buzağılar içinde dişilerde daha yüksek seroprevalans değeri saptadıklarını bildirmiştir. Bu çalışmada BVDV enfeksiyonunun her iki grupta da benzer sıklıkta görüldüğü fakat etkenin seropozitif erkek buzağı sayısında sadece 2. ayda, seropozitif dişi buzağı sayısında ise 6-10. aylar arasında olmak üzere daha geç yükselişe neden olduğu görülmüştür. BAV-3’e karşı mevcut maternal antikorların erkek buzağılarda daha hızlı gerilediği, etkenin erkeklerde 6. aydan, dişilerde ise 8. aydan sonra yoğun olarak enfeksiyona neden olduğu ve enfeksiyonun dişi buzağılar arasında yayılım hızının daha fazla olduğu görülmüştür. BCoV’un ise dişileri 8. ay, erkekleri ise 10. aydan sonra daha yoğun olarak enfekte ettiği ve yayılım hızının dişilerde daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Sonuç olarak bu çalışmada BHV-1 hariç diğer etkenlerin oluşturdukları enfeksiyonların cinsiyetler arasında istatistiki açıdan önemli herhangi bir fark taşımadığı tespit edilmiştir. BHV-1’in ise dişilerde yüksek oranda görülebileceği belirlenmiştir. Şüphesiz ki işletmelerdeki dişi hayvan sayısı, erkek-dişi bireylerin ayrılması, bakım- korunma, vb. uygulamalar bu oranlar üzerine etki yaratabilecek faktörlerdir. Aşılı ve Aşısız Buzağılarda Enfeksiyon Görülme Sıklığı İncelenen enfeksiyonların doğal seyrinin izlendiği bu çalışmada toplam popülasyondan ayrı olarak incelenmesi gereken aşılı buzağıların yer aldığı İşletme 3’te dişi buzağılara 4 aylık yaşlarında BVDV tip 1, tip 2, BRSV, PI-3 ve BHV-1 etkenlerini içeren kombine aşı uygulanmıştır. İstatistiki analiz sonucunda aşılı ve aşısız buzağılar arasında, enfeksiyonla yeni tanışan buzağı sayıları temel alındığında, incelenen tüm enfeksiyonlar yönünden önemli herhangi bir fark saptanamamıştır. 117 Aşılama sonrası BHV-1 ve BVDV yönünden seropozitif hayvan sayısındaki azalışın hızlandığı görülmektedir (Şekil-11). Elde edilen antikor titrelerinin geometrik ortalamaları incelendiğinde (Şekil-12), aşılamayı takip eden süreçte aşının içinde yer alan tüm etkenlere yönelik antikor titre ortalamalarında azalma şekillenmiştir. Bu durumun maternal antikorların varlığı sırasında aşı ile oluşması beklenen aktif immunitenin baskılanmasından ve aşının kısa süre içinde tekrar dozunun yapılmaması ile aktif bağışıklığın uyarılmamasından kaynaklanabileceği şeklinde değerlendirilebilir (46, 168, 169, 177). Aşı uygulamasıyla arzu edilen bağışıklık düzeylerinin elde edilememe sebepleri olarak aşının muhafaza, nakil ve uygulama koşulları da göz ardı edilmemesi gereken faktörlerdir. Buzağılara Maternal Antikor Geçişi Sığırlarda plasenta yapısı nedeniyle anne karnında iken buzağıya antikor geçişi söz konusu değildir. Dolayısıyla buzağılar maternal antikorları ancak doğumdan sonraki ilk 12 saat içinde kolostrum ile alabilmektedir (178-180). Maternal antikor geçişinin değerlendirilmesinde bireysel olarak anne ve yavruda (1. ay) elde edilen antikor titre değerlerinin korelasyonuna bakılmıştır. Bu çalışmada kolostral antikorların yavruya geçişi bireysel veriler üzerinden incelendiğinde BRSV, PI-3, BHV-1, BVDV ve BAV-3 için pozitif yönde anlamlı bir korelasyon olduğu saptanmıştır. BCoV antikorları için ortalamalar açısından yüksek değerler görülse de (Şekil-58 ve 60) bireysel olarak anneler ve buzağılardaki antikor titre değerleri arasında korelasyon saptanamamıştır. Bu durumun muhtemel sebeplerinden birisi BCoV’a karşı gebeliğin son dönemlerinde aşılama yapılarak antikor titresinin artırılması ve kolostrumla geçen antikor miktarının yükseltilmesi olabilir. Bu durumda annedeki antikor titresi doğum sonrası dönemde hızla gerilemekte ancak buzağılardaki maternal antikor yıkımlanması normal seyrini izlemektedir. 118 Virolojik Çalışmalar ELISA ve İmmunoperoksidaz Testi Tez kapsamında yer alan virolojik çalışmalar antijen ELISA kitleri (dörtlü antijen ELISA, BVDV antijen ELISA, BHV-1 antijen ELISA), virus izolasyonu ve takiben immunoperoksidaz testi olmak üzere 3 farklı yöntem kullanılarak yürütülmüştür. Dörtlü antijen ELISA ile test edilen 137 adet örnekten sadece 1 adet doku örneği pozitif sonuç vermiştir. Ancak BVDV antijeni yönünden pozitif olabileceğinden şüphe duyulan farklı bir örneğin BVDV antijen ELISA kiti ile test edilmesiyle pozitif sonuç alınması tüm örnekleri bir defa da BVDV antijen ELISA kitiyle tarama gerekliliğini doğurmuştur. Dörtlü antijen ELISA kitinin sonuçları ile BVDV antijen ELISA kitinin sonuçları arasındaki uyumsuzluğun örnekleme sırasında virus saçılımının az olmasına bağlı olarak kitin duyarlılığının düşük olmasından ya da kit üretiminde problem olmasından kaynaklanabileceği şeklinde değerlendirilmiştir. Bu olasılıklar dikkate alınarak yine dörtlü antijen ELISA kiti içeriğinde yer alan etkenlerden ve tek etkene yönelik üretimi gerçekleştirilen bir diğer kit olan BHV-1 yönünden de tekli antijen ELISA kiti kullanılarak tüm örnekler test edilmiştir. Bu test sonucunda da tüm örneklerin BHV-1 antijeni yönünden negatif olduğu saptanmıştır. Örnekleme sürecinde hem çalışma kapsamında yer alan hem de çalışma kapsamında olmayan işletmelerdeki solunum yolu enfeksiyonu klinik belirtileri gösteren buzağılardan svab örnekleri temin edilmiştir. Burun ve göz akıntısı görülen hayvanlarda her iki bölgeden svab örneği alınırken sadece burun akıntısı görülen hayvanlardan yalnız burun svabı örnekleri alınmıştır. Bu kapsamda toplam 80 adet burun svabı ve bu hayvanların 18 adedinden de göz svabı örneklenmiştir. Değişik zamanlarda klinik bulgu göstermesi sebebiyle bir kereden fazla örneklenen hayvanlar (4 hayvan) toplamdan çıkarıldığında çalışma süresince 76 adet buzağının solunum yolu enfeksiyonu klinik belirtileri gösterdiği görülmektedir. Bu hayvanlar içinde 12 tanesin (%15.78) ve mezbahadan toplanan 39 adet akciğer dokusundan ise 7 tanesinin (%17.94) BVDV antijenleri yönünden pozitif olduğu tespit edilmiştir. Örneklenen her üç materyalde de (burun svabı, göz svabı, akciğer) BVDV antijeni saptanması (Tablo-11) rutin teşhis çalışmalarında bu örneklerin uygun teşhis materyalleri olduğunu teyit etmektedir. 119 Tablo-11’de görüldüğü üzere direkt numuneden yapılan ELISA, immunoperoksidaz ve 3. kör pasaj üst sıvısından yapılan ELISA sonuçları arasında bir takım uyumsuzluklar ortaya çıkmıştır. Her üç testte pozitif sonuç veren 2 örnekte hücrede üreme yeteneğine sahip enfektif virionların yoğun miktarda olduğu anlaşılmaktadır. Direkt numuneden yapılan ELISA’da pozitif, immunoperoksidaz testinde negatif sonuç veren 12 örnekte ise hücrede üreme yeteneğine sahip olmayan virusların (inaktif ya da defektif virus partikülleri) varlığı düşünülebilir. Direkt numuneden yapılan ELISA’da negatif, immunoperoksidaz testinde ise pozitif sonuç veren 8 örnekte hücre kültürlerinde üreyebilen enfektif virus partiküllerinin olduğu anlaşılmaktadır. Bu durum orijinal örnekte çok az sayıda virus bulunması nedeniyle virusun ELISA’da saptanamayabileceği ancak hücrede kültüre edildikten sonra immunoperoksidaz testi ile enfekte hücrelerin tespit edilebilmesiyle açıklanabilir. Nitekim 3 kör pasaj işlemini takiben uygulanan immunoperoksidaz testinde oldukça sınırlı sayıda enfekte hücrenin tespit edilmesi de bu yaklaşımı doğrular niteliktedir (181). Virolojik çalışmalarda immunoperoksidaz testinde pozitif sonuç alınmasına karşın gerek orijinal örneğe gerekse 3. kör pasaj üst sıvısına uygulanan ELISA’da negatif sonuç veren 3 örnek saptanmıştır. Normal koşullar altında beklenmeyen bir tablo olduğu için sonuçları teyit edebilmek amacıyla hem immunoperoksidaz testi, hem de BVDV antijen ELISA birer kere daha tekrarlanmış ve aynı sonuçlar elde edilmiştir. Her iki immunoperoksidaz testinde de enfekte hücre sayısının oldukça az olduğu görülmüştür (Şekil-63C). Virus izolasyonu ve takiben uygulanan immunoperoksidaz testinin BVD virus tespitine yönelik olarak oldukça duyarlı bir yöntem olduğu daha önce gösterilmiştir (181). Bu noktada BVDV antijen ELISA kitinin çok az sayıda virus partikülü bulunan durumlarda yeterli performans gösterememesi söz konusu olabilir. Diğer taraftan ELISA rns kitinde kullanılan monoklonal antikor yapısal bir protein olan (E ) glikoproteinine spesifite göstermektedir. Yapısal proteinlerde meydana gelen mutasyonlar saha suşları açısından oldukça önemli bir konudur (182). Bu tür değişimler virus suşlarının farklılaşması yanında teşhis faaliyetlerini olumsuz etkilemekte ve teşhis kitlerinin duyarlılığını da azaltabilmektedir (182, 183). Bu tez çalışmasında uygulanan immunoperoksidaz testinde kullanılan monoklonal antikor süspansiyonu yapısal olmayan bir protein olan NS3’e karşı üretilmiş 3 farklı monoklonal antikorun (1/4/7) birleştirilmesiyle elde edilmiş ve tüm pestivirus gruplarını tanıyabildiği gösterilmiştir (155). Dolayısıyla kullanılan ELISA kitinin teşhis kapasitesinin test edilen örneklerde 120 bulunan yerel BVDV suşlarının tespitinde yetersiz kalabileceği de göz önünde bulundurulmalıdır. Bu konunun daha fazla sayıda virus suşu ve/veya saha örneğiyle ayrıca değerlendirilmesi yararlı olabilir. Bunlara ek olarak günümüzde BVD virusunun tespiti için kullanılan ELISA kitlerinin ağırlıklı olarak persiste enfeksiyon tespitine yönelik olduğu ve akut enfeksiyonların tespitinde yetersiz kalabildiği de bazı araştırmacılar tarafından dile getirilmektedir (184). Birçok çalışmada ELISA’nın güvenilir sonuçlar verdiği bildirilmiş olsa da (185, 186) bu tez çalışmasında elde edilen bulgular teşhis faaliyetlerinde ELISA sonuçlarının tek başına yeterli olamayabileceğini ve virus izolasyonu - immunoperoksidaz testi uygulamalarıyla desteklenmesinin yararlı olacağını göstermektedir Bu çalışmada uygulanan ELISA protokolleri ve virus izolasyonu çalışmalarıyla bazı örneklerde BVDV saptanırken diğer solunum sistemi viruslarının tespiti yapılamamıştır. Bu durumu yaratan başlıca sebep uygulanan teşhis yöntemlerinin sınırlandırıcı etkisi olabilir. Sığır solunum sistemi enfeksiyonlarına yol açan ncpe BVDV dışındaki virusların tamamı sitopatojenik niteliktedir. Bu araştırmada uygulanan virus izolasyonu çalışmalarında hiçbir örneğin ekildiği hücre kültürlerinde cpe tespit edilememiştir. Başta BRSV ve PI-3 olmak üzere solunum sistemi enfeksiyonlarına yol açan virusların çevre şartlarına aşırı duyarlı olduğu ve kısa sürede enfektivitesini kaybedebildiği bilinmektedir (187). Dolayısıyla virus izolasyonu çalışmalarında BVDV dışındaki viruslar için pozitif sonuç alınamaması örneklerde virus bulunmamasından kaynaklanabileceği gibi bu örneklerdeki virusların kolaylıkla inaktive olmasından da kaynaklanmış olabilir. Bu tür örneklerle yapılan teşhis çalışmalarında direkt olarak doku hücrelerine uygulanacak immunohistokimyasal testler (187) ve PCR protokollerinin (187) de duyarlı sonuçlar verebileceğini göz önünde bulundurmak gerekir. Persiste Enfeksiyon Tespiti İşletme 2’de bir buzağıdan 4 ay ara ile alınan svab örneklerinde ELISA kiti ile BVDV’nin tespit edilmesi, bu hayvanla aynı işletmede yer alan farklı 2 buzağının daha svab örneklerinin aynı test ile pozitif sonuç vermesi ve 1 buzağıda yaşıtlarına göre gelişim geriliği gözlemlenmesi (Şekil-61) işletmede muhtemel persiste enfeksiyon varlığını düşündürmüştür. Yapılan testler sonucu 3 buzağının BVDV ile PE olduğu belirlenmiş ve bu buzağılardan birinin annesinde de BVDV enfeksiyonu tespit edilmiştir (Tablo-10). 121 Ancak annenin persiste enfeksiyon konumu mevcut verilerimizle kesin olarak teyit edilememiştir. PE buzağıların tüm serum örneklerinde ELISA ile BVDV antijen varlığı tespit edilmiştir (Tablo-10). Buna istinaden 3 buzağının aylık BVDV antikor titreleri incelendiğinde 1. ay örneklerinde 1:640, 1:160 ve 0 titre değerleri görülürken takip eden aylardaki örneklemelerde sadece bir buzağıda antikor varlığı saptanmıştır. PE buzağılar yaşam boyunca virolojik testlerde pozitif sonuç verirken genel olarak BVDV antikorları yönünden negatif konumdadırlar (188). PE 2 buzağıda (1026 ve 42) tespit edilen antikor titreleri anneden kaynaklanan maternal antikorlardır ve 3. ay itibariyle kaybolduğu görülmektedir. Nadir durumlarda da olsa PE hayvanlarda antikor gelişimi görüldüğü ve buna persiste enfeksiyonu oluşturan virus suşundan farklı (heterolog) bir BVDV suşuyla gerçekleşen enfeksiyonların neden olduğu gösterilmiştir (189). Bu araştırmada PE olduğu belirlenen 16 nolu buzağıda yaşamının 2. ayından itibaren BVDV antikorları tespit edilmeye başlanmıştır. Elde edilen bu bulgu BVDV ile PE buzağıların diğer bireyler gibi yaşamın erken dönemlerinde heterolog virus suşlarıyla gerçekleşecek enfeksiyonlara açık olduğunu göstermektedir. Diğer taraftan heterolog bir suşa karşı antikor yanıtının gelişmesinin PE bireylerden virus saçılımını veya kanlarında virus tespitini engellemediği de anlaşılmaktadır. Ancak bu araştırmada elde edilen veriler PE bireylerden saçılan veya kanlarında bulunan virus miktarının değişip değişmediği hakkında fikir yürütmeye yeterli değildir. İşletmedeki 16 nolu PE buzağının annesinde tek serum örneğinde çalışma yapılmış olması sebebiyle ve 1:640 titre değerinde antikor varlığı tespit edildiğinden annenin persiste enfeksiyon durumu ile ilgili kesin bir değerlendirme yapılamamıştır (Tablo-10). Yapılan bir çalışmada PE hayvanlarda BVDV maternal antikorlarının 3. aydan sonra tespit edilemediği, PE olmayan hayvanlarda ise maternal antikorların 8. aya kadar görülebildiği belirtilmektedir (175). Bu tez çalışmasında sadece PE buzağılarda değil aynı işletmede doğan 15 buzağının tümünde maternal antikorların erken gerileyebildiği görülmüştür. Dolayısıyla buradaki farkın annelerin bağışıklık durumundan yani kolostrum kalitesinden ya da kolosturumun içiriliş zamanından ileri gelme ihtimalinin daha yüksek olduğu anlaşılmaktadır. 122 Bir popülasyonda PE hayvan sayısının genellikle %0.5-2 arasında olması beklenirken (113, 114, 190-192), Taylor ve arkadaşlarının (193) çalışmasında olduğu gibi yüksek oranlara da rastlanabilmektedir. Bu çalışmada saptanan persiste enfeksiyon oranının %2.67 olması (3:112 buzağı) diğer çalışmalarla uyumlu iken, PE buzağıların tek bir işletmede olması nedeniyle bu işletmeden örneklenen popülasyona göre persiste enfeksiyon oranının daha yüksek (%10.34) olduğu görülmektedir. Bu durum söz konusu işletmede BVD virusunun belirli bir dönemde sirküle olduğu ve o dönemde gebeliğin ilk 90 gününde olan ineklerin yavrularında yüksek oranda persiste enfeksiyon riski yarattığını göstermektedir. Bu araştırmada serolojik incelemeler için örneklenen serumlar serum nötralizasyon testinde kullanılmak üzere 56°C’de 30 dk boyunca su banyosunda inaktive edilmiştir. İlerleyen aşamalardaki virolojik çalışmalarda bazı buzağılarda persiste enfeksiyon şüphesi ortaya çıktığında bu hayvanlara ait serum örnekleri hem antijen ELISA hem de virus izolasyonuna alınmıştır. Bu hayvanların serum örnekleri uygulanan tüm ELISA kitleri ile pozitif sonuç vermiş, 2 hayvanın birer örneğinde ise ncp BVDV izolasyonu yapılmıştır. Bu durum muhtemelen serumlara uygulanan inaktivasyon işleminin antijen ELISA kitinin performansı üzerine olumsuz etki yaratmadığını göstermektedir. Diğer taraftan inaktivasyon işleminin BVD virusunun enfektivitesini tamamen ortadan kaldırmaya yeterli olamayacağı da ortaya çıkarılmış bulunmaktadır. Bu veriler BVDV’nin çevresel şartlara nispeten daha dayanıklı olduğu ve tam olarak virus inaktivasyonu için uzun süreli ve yüksek ısı uygulanması gerekliliğini (194, 195) desteklemektedir. Sonuç Sığırların vücutlarına oranla akciğerlerinin küçük ve segmentli olması, kollateral ventilasyonun olmaması ve bağ dokunun fazla olması gibi anatomik ve fizyolojik nedenler bu hayvanlarda solunum yolu enfeksiyonlarına yatkınlığa neden olmaktadır (196). Bu nedenle sığır solunum sistemi enfeksiyonlarında korunmaya yönelik uygulamalar öncelik taşımaktadır. Bu araştırmada elde edilen sonuçlara göre; buzağılarda başta BRSV ve PI-3 olmak üzere sığır solunum sistemi viruslarına karşı oluşan kolostral bağışıklık son derece kısa sürelidir ve yaşamın 1. - 2. aylarından itibaren hızla gerilemektedir. Bu durum 123 buzağıları yeni enfeksiyon riskiyle erken dönemde karşı karşıya bırakmakta ve yaşamın ilk aylarından başlayarak bireyler yeni enfeksiyonlara maruz kalmaktadır. Sonuç olarak BRSV, PI-3, BVDV, BAV-3 ve BCoV’ün buzağıları erken yaşta enfekte ettiği ve sürüdeki seronegatif buzağıların yıl boyunca enfeksiyonun sirkülasyonunda rol oynadığı belirlenmiştir. Bunun yanında incelenen etkenlerden BHV-1 dışındakilere ilişkin yüksek seropozitiflik değerlerinin önceki çalışmalarla uyumlu olduğu tespit edilmiştir. İncelen işletmelerde BHV-1’in buzağılar arasında diğer enfeksiyonlardan farklı bir seyir izlediği açıkça ortaya konulmuştur. Bu kapsamda sığırcılık işletmelerinde BHV-1 epidemiyolojisinin ayrıca ele alınması daha doğru bir yaklaşım olacaktır. Bu araştırmada elde edilen verilere göre toplam popülasyon incelendiğinde seropozitif buzağı sayısının BRSV ve BHV-1 için 2. ayda, PI-3, BVDV, BAV-3 ve BCoV için 3. ayda azaldığı görülürken maternal antikorların BRSV için 2. ayda, PI-3, BVDV, ve BCoV için 4. ayda, BAV-3 içinse 6. ayda en düşük seviyeye ulaştığı, BHV-1’e karşı ise örneklemenin her döneminde sıfıra yakın düzeyde antikor tespit edildiği görülmektedir. Ancak işletmeler hatta buzağılar bireysel olarak incelendiğinde her etken için maternal antikor gerileme zamanının ve buzağıların etkene maruz kalma zamanının farklı olabildiği görülmektedir. Bu farklılık annenin antikor düzeyi, kolostrum kalitesi, kolostrumun veriliş zamanı ve miktarı, maternal antikorların yıkımlanma süresi ile birlikte bakım ve beslenme koşulları gibi indirekt etkilerden de ileri gelebilmektedir. Buzağılar için ilk aşılama yaşının belirlenmesinde bütün bu faktörlerinde dikkate alınması zorunlu görülmektedir. Bu araştırmada elde edilen veriler ışığında optimum aşılama zamanının 2. ayda başlaması önerilebilir. Ancak yukarıda sıralanan faktörler de göz önüne alınarak işletme bazında değerlendirmelerin yapılması daha sağlıklı sonuçlar doğuracaktır. Yukarıdaki bilgiler ışığında bu araştırmada ulaşılan sonuçları aşağıdaki şekilde sıralamak mümkündür: 1. Buzağılarda kolostrumla alınan maternal antikorlar 2. aydan itibaren gerilemeye başlamaktadır. 2. Buzağılar yeni viral enfeksiyonlarla büyük oranda 4.-8. aylarda karşılaşmaktadır. 124 3. BVDV ve PI-3 enfeksiyonları yaşamın çok erken dönemlerinde de (1. ay) gerçekleşebilmektedir. 4. İlk aşılamanın 2.-4. aylar arasında yapılması ve pasif immunitenin aşı üzerinde yapabileceği olumsuz etkiyi en aza indirmek için 1 ay sonra tekrar dozunun yapılması yararlı olacaktır. 5. PI-3, BHV-1 ve BAV-3’e karşı seropozitif buzağı sayısının 12. ayda tekrar arttığı izlenmiştir. Bu nedenle 2. aşılamadan 6 ay sonra tekrar aşılama yapılması işletme bazında hastalık kontrolü açısından yararlı olabilir. 6. Maternal bağışıklık düzeyini ve süresini uzatabilmek amacıyla doğum öncesinde annelere aşılama uygulaması yararlı olabilir. 7. Her işletme için risk faktörleri dikkate alınarak özel aşılama programları yapılmalıdır. 8. İşletmelerde özellikle BHV-1 ve BVDV gibi persiste seyirli enfeksiyonlar için uygun mücadele ve ayıklama çalışmaları yapılmalıdır. 9. Solunum sistemi enfeksiyonlarında virolojik teşhis çalışmaları yapılırken birden fazla teşhis yönteminin uygulanması daha başarılı sonuçlar doğurmaktadır. 125 EK EK-1: Anket Formu Bilgi Formu (Risk Faktörleri Değerlendirmesi) Vet. Hek. Pelin TUNCER 1. İşletmeye girişte dezenfeksiyon havuzu var mı? Evet Hayır 2. İşletmedeki sürü yeni mi oluşturulmuş yoksa en az iki yavru alınmış bir sürü mü? ……………………… 3. Sürüye dışarıdan hayvan alınıyor mu? Alınıyorsa hangi enfeksiyonlar yönünden test ediliyor? ……………………………………………………………………………… Evet Hayır 4. Karantina bölümü var mı? Var Yok 5. Çiftliğin kendi veteriner hekimi var mı? Evet Hayır 6. Dışarıdan hekim geliyorsa ne kadar sıklıkta geliyor? …………………………. 7. Çiftliğe dışarıdan gelen ziyaretçi (yem arabası, veteriner hekim) çok mu? (Aylık ortalama bir değer) Evet………………… Hayır 8. Yakın mesafede başka işletme ya da akarsu var mı? Varsa çiftlik ile arasındaki mesafe kuş uçuşu ne kadar? ……………………………. 126 9. Hayvanlar açık, yarı-açık ya da kapalı sistemde mi barındırılıyor? ……………………………… 10. Ahırın açık tarafı hangi yöne bakıyor? ………………………… 11. Ahırın temizlik durumu nasıl? Çok kötü Kötü Orta İyi Çok iyi 12. Ahır havalandırması yeterli mi? Evet Hayır 13. Ahırın aydınlatması yeterli mi? Evet Hayır 14. Hayvanların suluğu nasıl? Yalak Otomatik 15. Yalak ise su akıyor mu, durgun mu? …………………………….. 16. Suluk otomatik ise suluğun temizliği nasıl? İyi Kötü 17. Suyun soğukluğu nasıl? Soğuk Ilık 18. Yakın mesafede koyun-keçi bakılıyor mu? Aradaki mesafe yaklaşık ne kadar? Evet…………….. Hayır 19. Kaç hayvan bir arada bulunuyor? ……………………………… 20. Buzağı kolostrum/ağız sütünü yeterli alıyor mu? Evet Hayır 127 21. Verilen kolostrum taze mi dondurulmuş mu? Taze Dondurulmuş 22. İlk ağız sütü ne zaman içiriliyor? ………………………………….. 23. Anne doğurmadan önce sağılıyor mu? Evet Hayır 24. Buzağılar anneden kaçıncı gün ayrılıyor? …………………………. 25. Buzağı kendi annesini emerek mi, biberonla mı besleniyor? Emerek Biberonla 26. Sütü/kolostrumu yalnız annesinden mi alıyor yoksa birkaç ineğin sütü karıştırılarak (tank sütü) mı veriliyor? Anneden Karışık 27. Buzağı sütten kaçıncı gün kesiliyor? ………………………….. 28. Sütten kesim programı nasıl uygulanıyor? (Tükettiği yemin miktarına göre mi, gün hesabına göre mi?) …………………………………………………………………………………… 29. Sütten kesilen buzağılara hangi yem ham maddeleri veriliyor? ……………………………………………………………………………………. 30. Buzağıya kaba yem veriliyor mu? Evet Hayır 31. Buzağıya kaliteli(yonca) kaba yem ne zaman verilmeye başlanıyor? ……………………………….. 128 32. Buzağıya su ne zaman verilmeye başlanıyor ve ne sıklıkla su veriliyor (serbest- öğünlü)? 33. Buzağıya silaj ne zaman verilmeye başlanıyor? ………………………………… 34. Buzağıya saman ne zaman verilmeye başlanıyor? …………………………………. 35. Buzağı yeminin protein, yağ içeriği nedir? ………………………………….. 36. Buzağılarda ne sıklıkla ishal görülüyor? ………………………………….. 37. İnekler ve buzağılar bir arada mı, ayrı ayrı mı barındırılıyor? ………………………………….. 38. İnekler ve buzağılar arası mesafe kaç metre? …………………………………. 39. Buzağılar yavru kulübelerinde tek tek mi, bir arada mı duruyorlar? Tek Bir arada 40. İneklere bakan bakıcı ile buzağılara bakan bakıcı farklı kişiler mi? Evet Hayır 41. Beraber barındırılan hayvanların yaş dağılımı homojen mi heterojen mi? Homojen Heterojen 42. Uygulanan aşı var mı? Varsa aşı takvimi nasıl? Evet Hayır …………………………………………………………………………………… 43. Hasta ve sağlıklı hayvanlar ayrılıyor mu? Evet Hayır 129 44. Hasta ve sağlıklı hayvanlar arası mesafe yaklaşık kaç metre? ……………………………. 45. Hasta ve sağlıklı hayvanlara bakan bakıcı farklı kişiler mi? Evet Hayır 46. Sürünün süt verimi kaç kilo? …………………. 47. Sürüde kaç tane gebe hayvan var? (Döl tutma oranı nedir?) …………………………….. 48. Atık oluyor mu? Oluyorsa ne kadar sıklıkta? Evet …………….. Hayır 49. İshal görülüyor mu? Görülüyorsa ne kadar sıklıkta? Evet ……………. Hayır 50. Tedavide genellikle kullanılan ilaçlar nelerdir? ……………………………..………………………………………………… İşletmenin Adı: İşletmenin Adresi: Tarih: Formu Dolduran Kişinin Adı Soyadı: İmza: 130 KAYNAKLAR 1. GULLIKSEN SM, LIE KI, LØKEN T, ØSTERÅS O. Calf mortality in Norwegian dairy herds. Journal of Dairy Science, 92: 2782-2795, 2009. 2. THE MERCK VETERINARY MANUAL. 10th edition. Editör KAHN CM. Merk&co. Inc, USA, 2010. 3. SMITH RA. Effects of feedlot disease on economics, production and carcass value. Bovine Practitioner, 33: 125-128, 2000. 4. MORENO-LOPEZ J. Acute respiratory disease in cattle. Editör : DINTER Z, MOREIN B. Virus Infections of Ruminants, volume 3, Elsevier, Netherlands, page 551-553, 1990. 5. VALARCHER JF, HÄGGLUND S. Viral respiratory infections in cattle. World Buiatrics Congress, France, sayfa 2006. 6. AUTIO T, POHJANVIRTA T, HOLOPAINEN R, RIKULA U, PENTIKÄINEN J, HUOVILAINEN A, RUSANEN H, SOVERI T, SIHVONEN L, PELKONEN S. Etiology of respiratory disease in non-vaccinated, non-medicated calves in rearing herds. Veterinary Microbiology, 119: 256-265, 2007. 7. HÄGGLUND S, SVENSSON C, EMANUELSON U, VALARCHER JF, ALENIUS S. Dynamics of virus infections involved in the bovine respiratory disease complex in Swedish dairy herds. The Veterinary Journal, 172: 320-328, 2006. 8. HÄRTEL H, NIKUNEN S, NEUVONEN E, TANSKANEN R, KIVELÄ SL, AHO P, SOVERI T, SALONIEMI H. Viral and bacterial pathogens in bovine respiratory disease in Finland. Acta Veterinaria Scandinavica, 45: 193-200, 2004. 9. GULLIKSEN SM, JOR E, LIE KI, LØKEN T, ÅKERSTEDT J, ØSTERÅS O. Respiratory infections in Norwegian dairy calves. Journal of Dairy Science, 92: 5139-5146, 2009. 10. RICHER L, MAROIS P, LAMONTAGNE L. Association of bovine viral diarrhea virus with multiple viral ınfections in bovine respiratory disease outbreaks. The Canadian Veterinary Journal, 29: 713-717, 1988. 11. DECARO N, CAMPOLO M, DESARIO C, CIRONE F, D’ABRAMO M, LORUSSO E, GRECO G, MARI V, COLAIANNI ML, ELIA G, MARTELLA V, BUONAVOGLIA C. Respiratory disease associated with bovine coronavirus infection in cattle herds in Southern Italy. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 20: 28-32, 2008. 12. HASÖKSÜZ M, KAYAR A, DODURKA T, ILGAZ A. Detection of respiratory and enteric shedding of bovine coronaviruses in cattle in Northwestern Turkey. Acta Veterinaria Hungarica, 53: 137-146, 2005. 13. PEIRIS JSM, LAI ST, POON LLM, GUAN Y, YAM LYC, LIM W, NICHOLLS J, YEE WKS, YAN WW, CHEUNG MT, CHENG VCC, CHAN KH, TSANG DNC, YUNG RWH, NG TK, YUEN KY. Members of the SARS Study Group. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. The Lancet, 361: 1319-1325, 2003. 14. KSIAZEK TG, GOLDSMITH C, EMERY S, COMER JA, NGHIEM KH, HUMPHREY C, PADDOCK CD, DERISI J, LEDUC JW, The SARS Working Group. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. The New England Journal of Medicine, 348: 1953-1966, 2003. 15. KUROGI H, INABA Y, TANAKA Y, ITO Y, SATO K, OMORI T. Isolation and properties of reovirus from cattle in an outbreak of acute respiratory disease. National Institute of Animal Health Quarterly, 16: 39-48, 1976. 131 16. DABO SM, TAYLOR JD, CONFER AW. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease. Animal Health Research Reviews, 8: 129-150, 2008. 17. RICE JA, CARRASCO-MEDINA L, HODGINS DC, SHEWEN PE. Mannheimia haemolytica and bovine respiratory disease. Animal Health Research Reviews, 8: 117-128, 2008. 18. HECKERT RA, SAIF LJ, MYERS GW, AGNES AG. Epidemiologic factors and isotype-specific antibody responses in serum and mucosal secretions of dairy calves with bovine coronavirus respiratory tract and enteric tract infections. American Journal of Veterinary Research, 52: 845-851, 1991. 19. VALARCHER JF, BOURHY H, LAVENU A, BOURGES-ABELLA N, ROTH M, ANDREOLETTI O, AVE P, SCHELCHER F. Persistent infection of B lymphocytes by bovine respiratory syncytial virus. Virology, 291: 55-67, 2001. 20. VAN DER POEL WH, KRAMPS JA, MIDDEL WG, VAN OIRSCHOT JT, BRAND A. Dynamics of bovine respiratory syncytial virus infections: a longitudinal epidemiological study in dairy herds. Archives of Virology, 133: 309- 321, 1993. 21. BİLGE S. Kan ve süt serumu örneklerinde IBR-IPV antikorlarının nötralizasyon testi ile araştırılması ve süt örneklerinden virus izolasyonu. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 45: 313-321, 1998. 22. ÖZKUL A, ÇABALAR M, BİLGE S, AKÇA Y, BURGU İ. Süt sığırcılığı işletmelerinde rastlanan IBR/IPV ve BVD virus enfeksiyonlarının infertilite olgularındaki rolü. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 42: 381-387, 1995. 23. YEŞİLBAĞ K, GÜNGÖR B. Seroprevalence of bovine respiratory viruses in North-Western Turkey. Tropical Animal Health and Production, 40: 55-60, 2008. 24. ALKAN F, ÖZKUL A, KARAOĞLU MT, BİLGE S, AKÇA Y, BURGU İ, YEŞİLBAĞ K, OĞUZOĞLU TÇ. Sığırlarda viral nedenli solunum sistemi enfeksiyonlarının seroepidemiyolojisi. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 44: 1-8, 1997. 25. YILDIRIM Y, BURGU İ. Kuzeydoğu Anadolu bölgesindeki sığırlarda mavidil (BT), BHV-1, PI-3, EBL ve BVD enfeksiyonlarının seroprevalansı. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 52: 113-117, 2005. 26. EROL N, GÜR S, YILDIRIM Y, TAN MT. A serological investigation on parainfluenza-3 (PI-3) and bovine adenovirus (BAV) infections in dairy cow enterprises in Aydın province. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 13: 43-47, 2007. 27. ALKAN F, BİLGE-DAĞALP S, CAN-ŞAHNA K, ÖZGÜNLÜK İ. Sığırlarda coronavirus enfeksiyonunun epidemiyolojisi. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 50: 59-64, 2003. 28. DUMAN R, YAVRU S, KALE M, AVCI O. Seroprevalence of viral upper respiratory infections in dairy cattle. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 15: 539-542, 2009. 29. BURGU İ, ALKAN F, ÖZKUL A, YEŞİLBAĞ K, KARAOĞLU T, GÜNGÖR B. Türkiye’de süt sığırcılığı işletmelerinde bovine viral diarrhea virus (BVDV) enfeksiyonunun seroepidemiyolojisi ve kontrolü. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 50: 127-133, 2003. 30. VALARCHER JF, TAYLOR G. Bovine respiratory syncytial virus infection. Veterinary Research, 38: 153-180, 2007. 31. YEŞİLBAĞ K. Genel Viroloji, Medipres, Malatya, page 63-69, 2010. 132 32. ACHENBACH JE, TOPLIFF CL, VASSILEV VB, DONIS RO, ESKRIDGE KM, KELLING CL. Detection and quantitation of BRSV using real time quantitative RT-PCR and quantitative competitive RT-PCR assays. Journal of Virological Methods, 121: 1-6, 2004. 33. KINGSBURY DW. Paramyxoviridae and Their Replication. In: Fields Virology. Eds. Fields, B.N. & Knipe, DM. Ravens Press. New York, pp. 945-96, 1990. 34. MURPHY FA, GIBBS EPJ, HORNIZEK MC, STUDDERT MJ. Veterinary Virology, 3rd edition, Academic Press, USA, page 119-566, 1999. 35. LARSEN LE, TJØRNEHØJ K, VIUFF B, JENSEN NE, UTTENTHAL A. Diagnosis of enzootic pneumonia in Danish cattle: reverse transcription-polymerase chain reaction assay for detection of bovine respiratory syncytial virus in naturally and experimentally infected cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 11: 416-22, 1999. 36. HODGINS DC, CONLON JA, SHEWEN PE. Chapter 12 Respiratory viruses and bacteria in cattle. Editor: BROGDEN KA, GUTHMILLER JM. Polymicrobial disease, ASM Press, USA, page 33-229, 2002. 37. KIMMAN TG, ZIMMER GM, WESTENBRINK F, MARS J, VAN LEEUWEN E. Epidemiological study of bovine respiratory syncytial virus infections in calves: influence of maternal antibodies on the outcome of disease. The Veterinary Record, 123: 104-109, 1988. 38. ROSENQUIST BD. Isolation of respiratory syncytial virus from calves with acute respiratory disease. The Journal of Infectious Diseases, 130: 177-182, 1974. 39. GÖKÇE E, ERDOĞAN HM. Neonatal kuzularda pnömoni: yaygınlığı ve etki eden kimi risk faktörleri. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 14: 223-228, 2008. 40. YEŞİLBAĞ K, GÜNGÖR B. Antibody prevalence against respiratory viruses in sheep and goats in North-Western Turkey. Tropical Animal Health and Production, 41: 421-425, 2009. 41. WELLEMANS G. Bovine respiratory syncytial virus. Virus infections of ruminants, volume 3, Elsevier, Netherlands, page 363-375, 1990. 42. POSPISIL Z, MENSIK J, VALICEK L. Isolation and identification of a bovine respiratory syncytial virus in Czechoslovakia. Acta Veterinaria Brno, 47: 79-86, 1978. 43. KIMMAN TG, ZIMMER GM, STRAVER P J, DE LEEUW PW. Diagnosis of bovine respiratory syncytial virus infections improved by virus detection in lung lavage samples. American Journal of Veterinary Research, 47: 143-147, 1986. 44. VILCEK S, ELVANDER M, BALLAGI-PORDÁNY A, BELÁK S. Development of nested PCR assays for detection of bovine respiratory syncytial virus in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology, 32: 2225-2231, 1994. 45. ALKAN F, ÖZKUL A, BİLGE-DAĞALP S, YEŞİLBAĞ K, OĞUZOĞLU T Ç, AKÇA Y, BURGU İ. Virological and serological studies on the role of PI-3 virus, BRSV, BVDV and BHV-1 on respiratory infections of cattle. I. the detection of etiological agents by direct Immunofluorescence technique. Deutsche Tierarztliche Wochenschrift, 107: 193-195, 2000. 46. ELLIS JA, WEST K, CORTESE V, KONOBY C, WEIGEL D. Effect of maternal antibodies on induction and persistence of vaccine-induced immune responses against bovine viral diarrhea virus type II in young calves. Journal of American Veterinary Medical Association, 219: 3351-3356, 2001. 133 47. TSAI KS, THOMSON RG. Bovine parainfluenza type 3 virus infection: ultrastructural aspects of viral pathogenesis in the bovine respiratory tract. Infection and Immunity, 11: 783-803, 1975. 48. ADAIR BM, BRADFORD HEL, BRYSON DG, FOSTER JC, MCNULTY MS. Effect of parainfluenza-3 virus challenge on cell-mediated immune function in parainfluenza-3 vaccinated and non-vaccinated calves. Research in Veterinary Science, 68: 197-199, 2000. 49. GHRAM A, REDDY PG, MORRILL JL, BLECHAR F, MINOCHA HC. Bovine herpesvirus-1 and parainfluenza-3 virus interactions: clinical and immunological response in calves. Canadian Journal of Veterinary Research, 53: 62-67, 1989. 50. BRYSON DG. Parainfluenza-3 virus in cattle. Virus infections of ruminants, volume 3, Elsevier, Netherlands, page 319-334, 1990. 51. TIMONEY JF, GILLESPIE JA, SCOTT FW, BARLOUGH JE. Epidemiology of viral infections. Editor: HAGAN WA, TIMONEY JF. Hagan an Bruner’s microbiology and infectious diseases of domestic animals, 8th edition, Cornell University Press, US, page 461-500, 1988. 52. LAEGREID WW, LIGGITT HD, SILFLOW R. M, EVERMANN JR, TAYLOR SM, LEİD RW. Reversal of virus-induced alveolar macrophage bactericidal dysfunction by cyclooxygenase inhibition in vitro. Journal of Leukocyte Biology, 45: 293-300, 1989. 53. BRIGGS RE, KEHRLI M, FRANK GH. Effect of infection with parainfluenza-3 virus and infectious rhinotracheitis virus on neutrophil functions in calves. American Journal of Veterinary Research, 49: 682-686, 1988. 54. CARRIERE PD, MAXIE MG, WILKIE BN, SAVAN M, VALLI VEO, JOHNSON JA. Exposure of calves to aerosols of parainfluenza-3 virus and Pasteurella haemolytica. Canadian Journal of Comparative Medicine 47: 422-432, 1983. 55. ERTÜRK A, ÇİZMECİ ŞG, BARUT MF. Sığırlarda solunum sistemi enfeksiyonlarının viral etiyolojisi (2002-2005). Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi, 17: 1-2, 2006. 56. SHARP JM. Parainfluenza-3 virus in sheep. Editor: DINTER Z, MOREIN B. Virus infections in ruminants, volume 3, Elsevier, Netherlands, page 335-339, 1990. 57. STUDDERT MJ. Bovine Herpesvirus. Editor: GRANOFF A, WEBSTER RG. Encyclopedia of virology, Volume 1, 2nd edition, Academic Press, UK, page 180- 183, 1999. 58. NANDI S, KUMAR M, MANOHAR M, CHAUHAN RS. Bovine herpes virus infections in cattle. Animal Health Research Reviews, 10: 85-98, 2009. 59. MUYLKENS B, THIRY J, KIRTEN P, SCHYNTS F, THIRY E. Bovine herpesvirus 1 infection and infectious bovine rhinotracheitis. Veterinary Research, 38: 181-209, 2007. 60. ROCK DL, HAGEMOSER WA, OSORIO FA, REED DE. Detection of bovine herpesvirus type 1 RNA in trigeminal ganglia of latently infected rabbits by in situ hybridization. Journal of General Virology, 67: 2515-2520, 1986. 61. GU X, KIRKLAND PD. Infectious Bovine Rhinotracheitis. Australia and New Zealand Standard Diagnostic Procedures, Elizabeth Macarthur Agricultural Institute, 2008. 62. METZLER AE, MATILE H, GASSMANN U, ENGELS M, WYLER R. European isolates of bovine herpesvirus 1: a comparison of restriction endonuclease sites, polypeptides and reactivity with monoclonal antibodies. Archives of Virology, 85: 57-69, 1985. 134 63. D’OFFAY JM, ELY RW, BALDWIN CA, WHITENACK DL, STAIR EL, COLLIN JK. Diagnosis of encephalitic bovine herpesvirus type 5 (BHV-5) infection in cattle: virus isolation and immunohistochemical detection of antigen in formalin-fixed bovine brain tissues. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 7: 247-251, 1995. 64. EDWARDS S, WHITE H, NIXON P. A study of the predominant genotypes of bovid herpesvirus 1 found in the UK. Veterinary Microbiology, 22: 213-223, 1990. 65. MILLER JM, WHETSTONE CA, VAN DER MAATEN MJ. Abortifacient property of bovine herpesvirus type 1 isolates that represent three subtypes determined by restriction endonuclease analysis of viral DNA. American Journal of Veterinary Research, 52: 458-461, 1991. 66. SPILKI FR, ESTEVES PA, DE LIMA M, FRANCO AC, CHIMINAZZO C, FLORES EF, WEIBLEN R, DRIEMEIER D, ROEHE PM. Comparative pathogenicity of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) subtypes 1 (BHV-1.1) and 2a (BHV-1.2a). Pesquisa Veterinaria Brasileira, 24: 43-49, 2004. 67. EDWARDS S, NEWMAN RH, WHITE H. The virulence of British isolates of bovid herpesvirus 1 in relationship to viral genotype. British Veterinary Journal, 147: 216-231, 1991. 68. STRAUB OC. Infectious bovine rhinotracheitis virus. Virus infections of ruminants, volume 3, Elsevier, Netherlands, page 71-108, 1990. 69. VONK NOORDEGRAAF A, BUIJTELS JA. DIJKHUIZEN AA, FRANKEN P, STEGEMAN JA, VERHOEFF J. An epidemiological and economic simulation model to evaluate the spread and control of infectious bovine rhinotracheitis in the Netherlands. Preventive Veterinary Medicine, 36: 219-238, 1998. 70. ACKERMANN M, ENGELS M. Pro and conta BHV-1-eradication. Veterinary Microbiology, 113: 293-302, 2006. 71. DONG XN, CHEN YH. Marker vaccine strategies and candidate CSFV marker vaccines. Vaccine, 25: 205-230, 2007. 72. PAISLEY LG, THARALDSEN J, JARP J. A retrospective analysis of the infectious bovine rhinotracheitis (bovine herpes virus-1) surveillance program in Norway using Monte Carlo simulation models. Preventive Veterinary Medicine, 50: 109-125, 2001. 73. NYLIN B, MADSEN KG, RØNSHOLT L. Reintroduction of bovine herpes virus type 1 into Danish cattle herds during the period 1991-1995: a review of the investigations in the infected herds. Acta Veterinaria Scandinavica, 39: 401-413, 1998. 74. NOORDEGRAAF AV, JALVINGH AW, DE JONG MC, FRANKEN P, DIJKHUIZEN AA. Evaluating control strategies for outbreaks in BHV1-free areas using stochastic and spatial simulation. Preventive Veterinary Medicine, 44: 21-42, 2000. 75. NUOTIO L, NEUVONEN E, HYYTIÄINEN M. Epidemiology and eradication of infectious bovine rhinotracheitis/infectious pustular vulvovaginitis (BHV-1/IPV) virus in Finland. Acta Veterinaria Scandinavica, 49: 3-9, 2007. 76. ERHAN M, ONAR B, CSANTOS L, HOPKINS IG. Serological survey on some virus and beadsonia disease of cattle, sheep and horse. Journal of Veterinary Center and Research Institute (Pendik), 4: 56-58, 1971. 77. TAN MT, YILDIRIM Y, EROL N, GÜNGÖR AB. The seroprevalence of bovine herpes virus type 1 (BHV-1) and bovine leukemia virus (BLV) in selected dairy cattle herds in Aydın province, Turkey. Turkish Journal of Veterinary and Animal Science, 30: 353-357, 2006. 135 78. GENCAY A, BİLGE-DAĞALP S, ŞAHNA K. C, PINAR D, BAŞARAN Z. Kayseri bölgesindeki sığırlarda bovine herpesvirus tip 1 (BHV-1) enfeksiyonunun seroprevalansı. Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Veteriner Dergisi, 23: 47-52, 2009. 79. ÇABALAR M, AKÇA Y. Fertilite problemli ineklerde enfeksiyöz bovine rhinotracheitis-enfeksiyöz pustular vulvovaginitis (BHV-1-IPV) virus izolasyonu ve seroepidemiyolojisi. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 41: 337-349, 1994. 80. BURGU İ, AKÇA Y. Gelemen Devlet Üretme Çiftliği sığırlarında bazı viral enfeksiyonlara karşı serolojik araştırmalar. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 29: 506-512, 1982. 81. YEŞİLBAĞ K, BİLGE-DAĞALP S. Koyunlarda bovine herpesvirus-1 enfeksiyonunun seroprevalansı. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 53: 141-143, 2006. 82. YEŞİLBAĞ K, BİLGE-DAĞALP S, OKUR-GÜMÜŞOVA S, GÜNGÖR B. Studies on herpesvirus infections of goats in Turkey: Prevalance of antibodies to bovine herpesvirus 1. Revue de Medecine Veterinaire, 154: 772-774, 2003. 83. GÜR S, AKÇA Y. BVD seropozitif mandalarda BHV-1/IPV ve sığır vebasının seroepidemiyolojisi. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 55: 45-50, 2008. 84. LEE KM, GILLESPIE JH. Propagation of virus diarrhea virus of cattle in tissue culture. American Journal of Veterinary Research, 18: 952-953, 1957. 85. UNDERDAHL NR, GRACE OD, HOERLEIN AB. Cultivation in tissue-culture of cytopathogenic agent from bovine mucosal disease. Experimental Biology and Medicine, 94: 795-797, 1957. 86. DONIS RO, DUBOVI EJ. Differences in virus-induced polypeptides in cells infected by cytopathic and noncytopathic biotypes of bovine virus diarrhea-mucosal disease virus. Virology, 158: 168-173, 1987. 87. KÜMMERER BM, TAUTZ N, BECHER P, THIEL HJ, MEYERS G. The genetic basis for cytopathogenicity of pestiviruses. Veterinary Microbiology, 77: 117-128, 2000. 88. YEŞİLBAĞ K, BURGU İ. Epitopic characterization of Turkish Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) isolates using monoclonal antibodies. Acta Veterinaria Hungarica, 51: 237-244, 2003. 89. HIETALA SK, CROSSLEY BM. Virus replication. Editor: GOYAL SM, RIDPATH JF. Bovine viral diarrhea virus diagnosis, management, and control, Blackwell Publishing, USA, page 81-89, 2005. 90. VAN DER POEL WHM, SCHOLL AT. Approach for control of infectious diseases in cattle herds. Editors: BRAND A, NOORDHUIZEN JPTM, SCHUKKEN YH. Herd health and production management in dairy practice, 3rd edition, Wageningen Press, Netherlands, page 475, 2001. 91. OĞUZOĞLU TÇ. Gevişgetiren hayvanlarda virusların neden olduğu transplasental enfeksiyonlar. Sayfa: 11, Seminer, Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, 1997. 92. RIDPATH JF. BVDV genotypes and biotypes: practical implications for diagnosis and control. Biologicals, 31: 127-131, 2003. 93. VILCEK S, PATON DJ, DURKOVIC B, STROJNY L, IBATA G, MOUSSA A, LOITSCH A, ROSSMANITH W, VEGA S, SCICLUNA MT, PAIFI V. Bovine viral diarrhoea virus genotype 1 can be separated into at least eleven genetic groups. Archives of Virology, 146: 99-115, 2001. 136 94. NAGAI M, HAYASHI M, ITOU M, FUKUTOMI T, AKASHI H, KIDA H, SAKODA Y. Identification of new genetic subtypes of bovine viral diarrhea virus genotype 1 isolated in Japan. Virus Genes, 36: 135-9, 2008. 95. JACKOVA A, NOVACKOVA M, PELLETIER C, AUDEVAL C, GUENEAU E, HAFFAR A, PETIT E, REHBY L, VILCEK S. The extended genetic diversity of BVDV-1: typing of BVDV isolates from France. Veterinary Research Communications, 32: 7-11, 2008. 96. YEŞİLBAĞ K, FÖRSTER C, BANK-WOLF B, YILMAZ Z, ALKAN F, ÖZKUL A, BURGU İ, ROSALES SC, THIEL HJ, KÖNIG M. Genetic heterogeneity of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) isolates from Turkey: Identification of a new subgroup in BVDV-1. Veterinary Microbiology, 130: 258-267, 2008. 97. XUE F, ZHU YM, LI J, ZHU, LC, REN XG, FENG JK, SHI HF, GAO YR. Genotyping of bovine viral diarrhea viruses from cattle in China between 2005 and 2008. Veterinary Microbiology, 143: 379-383, 2010. 98. GIANGASPERO M, HARASAWA R, WEBER L, BELLOLI A. Taxonomic and epidemiological aspects of the bovine viral diarrhoea virus 2 species through the observation of the secondary structures in the 5’ genomic untranslated region. Veterinaria Italiania, 44: 319-345, 2008. 99. DEREGT D. Introduction and history. Editors: GOYAL SM, RIDPATH JF. Bovine viral diarrhea virus diagnosis management and control, Blackwell Publishing, USA, page 3-34, 2005. 100. FULTON RW, RIDPATH JF, SALIKI JT, BRIGGS RE, CONFER AW, BURGE LJ, PURDY CW, LOAN RW, DUFF GC, PAYTON ME. Bovine viral diarrhea virus (BVDV) 1b: predominant BVDV subtype in calves with respiratory disease. The Canadian Journal of Veterinary Research, 66: 181-190, 2002. 101. OĞUZOĞLU TÇ, MUZ D, YILMAZ V, ALKAN F, AKÇA Y, BURGU İ. Molecular characterization of bovine virus diarrhea viruses species 2 (BVDV-2) from cattle in Turkey. Tropical Animal Health and Production, 42: 1175-1180, 2010. 102. YILMAZ H, ALTAN E, RIDPATH J, TURAN N. Genetic diversity and frequency of bovine viral diarrhea virus (BVDV) detected in cattle in Turkey. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases, 35: 411-416, 2012. 103. FULTON RW, SALIKI JT, CONFER AW, BURGE LJ, D’OFFAY JM, HELMAN RG, BOLIN SR, RIDPATH JF, PAYTON ME. Bovine viral diarrhea virus cytopathic and noncytopathic biotypes and type 1 and 2 genotypes in diagnostic laboratory accessions: clinical and necropsy samples from cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 12: 33-38, 2000. 104. OĞUZOĞLU TÇ, MUZ D, YILMAZ V, TİMURKAN MÖ, ALKAN F, AKÇA Y, BURGU İ. Molecular characteristics of bovine viral diarrhoea virus 1 isolates from Turkey: approaches for an eradication programme. Transboundary and Emerging Diseases, 59: 303-310, 2012. 105. THURMOND MC. Virus transmission. Editor: GOYAL SM, RIDPATH JF. Bovine viral diarrhea virus diagnosis, management, and control, Blackwell Publishing, USA, page 91-104, 2005. 106. MOERMAN A, STRAYER PJ, DE JONG MC, QUAK J, BAANVINGER T, VAN OIRSCHOT JT. Clinical consequences of a bovine virus diarrhoea virus infection in a dairy herd: a longitudinal study. Veterinary Quarterly, 16: 115-119, 1994. 107. HOWARD CJ, BROWNLIE J, CLARKE MC. Comparison by the neutralization assay of pairs of non-cytopathogenic and cytopathogenic strains of bovine virus 137 diarrhoea virus isolated from cases of mucosal disease. Veterinary Microbiology, 13: 361-369, 1987. 108. BROWNLIE J, CLARKE MC, HOWARD CJ, POCOCK DH. Pathogenesis and epidemiology of bovine virus diarrhoea virus infection of cattle. Annals of Veterinary Research, 18: 157-166, 1987. 109. POTGIETER LN. Immunology of bovine viral diarrhea virus. The Veterinary Clinics of North America. Food Animal Practice, 11: 501-520, 1995. 110. WELSH MD, ADAIR BM, FOSTER JC. Effect of BVD virus infection on alveolar macrophage functions. Veterinary Immunology and Immunopathology, 46: 195-210, 1995. 111. LIU L, LEHMKUHL HD, KAEBERLE ML. Synergistic effects of bovine respiratory syncytial virus and non-cytopathic bovine viral diarrhea virus infection on selected bovine alveolar macrophage functions. Canadian Journal of Veterinary Research, 63: 41-48, 1999. 112. ÖNCÜL S, MERİÇ İ, KORKUT F. Türkiye’de ilk defa Lalahan Zootekni Araştırma Enstitusu Sığırlarında tespit edilen mucosal disease’in klinik yonu. Lalahan Zootekni Araştırma Enstitisü Dergisi, 4: 186-189, 1964. 113. BURGU İ, ALKAN F, YEŞİLBAĞ K. Türkiye’de sığırlarda persiste BVD virus enfeksiyonu. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 46, 169-177, 1999. 114. ALKAN F, YEŞİLBAĞ K, BURGU İ. Persiste enfekte sığırlarda BVDV’nin organ dağılımı. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 48: 111-115, 2001. 115. BULUT O, YAVRU S, YAPKIÇ O, KALE M, AVCI O, HASIRCIOĞLU S. Sütçü sığırların bovine herpesvirus 1 (bhv-1) ve bovine viral diarrhoea virus (bvdv) enfeksiyonları yönünden ELISA ile araştırılması. Hayvancılık Araştırma Dergisi, 16: 18-24, 2006. 116. YILDIRIM Y, YILMAZ V, KALAYCIOĞLU AT, BİLGE-DAĞALP SB, MAJARASHIN ARF, ÇELEBİ Ö, AKÇA D. An investigation of a possible involvement of BVDV, BHV-1 and BHV-4 infections in abortion of dairy cattle in Kars district of Turkey. Kafkas Universitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 17: 879- 883, 2011. 117. ÖZER E, DUMAN R. Study of bovine viral diarrhea virus (BVDV) infection in dairy cattle. Journal of Animal and Veterinary Advances, 10: 1557-1560, 2011. 118. SANDVIK T. Selection and use of laboratory diagnostic assays in BVD control programmes. Preventive Veterinary Medicine, 72: 3-16, 2005. 119. ÖZKUL A, YEŞİLBAĞ K, BURGU İ. Comparison of four diagnostic techniques for detecting bovine viral diarrhoea virus (BVDV) in buffy coat samples after long- term storage. Turkish Journal Veterinary and Animal Sciences, 26: 1043-1048, 2002. 120. BEZEK DM, BAKER JC, KANEENE JB. Immunofluorescence of bovine virus diarrhea viral antigen in white blood cells from experimentally infected immunocompetent calves. Canadian Journal of Veterinary Research, 52: 288-290, 1988. 121. LAUREYNS J, RIBBENS S, DE KRUIF A. Control of bovine virus diarrhoea at the herd level: reducing the risk of false negatives in the detection of persistently infected cattle. Veterinary Journal, 184: 21-26, 2010. 122. HOUE H, LINDBERG A, MOENİNG V. Test strategies in bovine viral diarrhea virus control and eradication campaigns in Europe. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 18: 427-435, 2006. 138 123. WALTER O, KLEMENS F. JOSEF K. BVDV infection risk in the course of the voluntary BVDV eradication program in Sytyria/Austria. Preventive Veterinary Medicine, 72: 127-132, 2005. 124. MACLACHLAN NJ, DUBOVI EJ. Fenner’s veterinary virology, 4th edition, Academic Press, China, page 203, 2011. 125. DAVISON AJ, BENKO M, HARRACH B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of General Virology, 84: 2895-2908, 2003. 126. WADELL G. Adenoviruses. Editor: GRANOFF A, WEBSTER RG, Encyclopedia of virology, Academic Press, UK, page 1-14, 1999. 127. SHENK TE. Adenoviridae: The viruses and their replication. Editor: KNIPE DM, HOWLEY PM, Fields Virology, volume 2, 4th edition, Lippincott Williams&Wilkins, USA, page 2266-2291, 2001. 128. TIMONEY JF, GILLESPIE JA, SCOTT FW, BARLOUGH JE. Bovine adenovirus infection. Editor: HAGAN WA, TIMONEY JF. Hagan and Bruner’s microbiology and infectious diseases of domestic animals, 8th edition, Cornell University Press, US, page 543-545, 1988. 129. BURKI F. Bovine adenoviruses. Editor : DINTER Z, MOREIN B. Virus infections of ruminants, volume 3, Elsevier, Netherlands, page 161-170, 1990. 130. NARITA M, YAMADA M, TSUBOI T, KAWASHIMA K. Bovine adenovirus type 3 pneumonia in dexamethasone-treated calves. Veterinary Pathology, 40: 128- 135, 2003. 131. NARITA M, YAMADA M, TSUBOI T, KAWASHIMA K. Immunohistopathology of calf pneumonia induced by endobronchial inoculation with bovine adenovirus 3. Veterinary Pathology, 39: 565-571, 2002. 132. THOMSON GR. Adenovirus infections. Edıtor: COETZER JAW, TUSTIN RC, Infectious diseases of livestock, volume 2, 2nd edition, Oxford University Press, page 819-826, 2004. 133. LEHMKUHL HD, CUTLIP RC, DEBEY BM. Isolation of a bovine adenovirus serotype 10 from a calf in the United States. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 11: 485-490, 1999. 134. BURGU İ, TOKER A. Türkiye’de sığır adenoviruslarının (Tip1-2-3) serolojik olarak tespiti. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 32: 223-230, 1985. 135. LEHMUKHUL HD, SMITH MH, GOUGH PM. Neutralizing antibody to bovine adenovirus serotype 3 in healthy cattle and cattle with respiratory tract disease. American Journal of Veterinary Research, 40: 580-583, 1979. 136. TOKER A. Sığır adenoviruslarında (tip-1, tip-2 ve tip-3) serolojik reaksiyonlarla tip ayırımı üzerinde araştırmalar. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 30: 245-258, 1983. 137. YILDIRIM Y, YILMAZ V, MAJARASHIN ARF. Kuzeydoğu Anadolu Bölgesi sınır illerinde bulunan sığırlarda viral solunum sistemi enfeksiyonlarının seroprevalansı. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 15: 601-606, 2009. 138. ALKAN F. Rapid diagnosis of bovine adenovirus subgroup 1 infections in cattle with acute respiratory disease by direct immunofluorescence technique. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 45: 181-184, 1998. 139. ZHU YM, YU Z, CAI H, GAO YR, DONG XM, LI ZL, SHI HF, MENG QF, LU C, XUE F. Isolation, identification, and complete genome sequence of a bovine adenovirus type 3 from cattle in China. Virology Journal, 8: 557, 2011. 140. http://www. ictvonline. org/virusTaxonomy. asp?bhcp=1. Erişim Tarihi: 01.01.2013 139 141. THOMAS LH, GOURLAY RN, STOTT EJ, HOWARD CJ, BRIDGER JC. A search for new microorganisms in calf pneumonia by the inoculation of gnotobiotic calves. Research in Veterinary Science, 33: 170-182, 1982. 142. STORZ J, STINE L, LIEM A, ANDERSON GA. Coronavirus isolation from nasal swab samples in cattle with signs of respiratory tract disease after shipping. Journal of the American Veterinary Medical Association, 208: 1452-1455, 1996. 143. SAIF LJ, REDMAN DR, MOORHEAD PD, THEIL KW. Experimentally induced coronavirus infections in calves: viral replication in the respiratory and intestinal tracts. American Journal of Veterinary Research, 47: 1426-1432, 1986. 144. DA SILVA MR, O’REILLY KL, LIN X, STINE L, STORZ J. Sensitivity comparison for detection of respiratory bovine coronaviruses in nasal samples from feedlot cattle by ELISA and isolation with the G clone of HRT-18 cells. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 11: 15-9, 1999. 145. LATHROP SL, WITTUM TE, LOERCH SC, PERINO LJ, SAIF LJ. Antibody titers against bovine coronavirus and shedding of the virus via the respiratory tract in feedlot cattle. American Journal of Veterinary Research, 61: 1057-1061, 2000. 146. PARK SJ, KIM GY, CHOY HE, HONG YJ, SAIF LJ, JEONG JH, PARK SI, KIM HH, KIM SK, SHIN SS, KANG MI, CHO KO. Dual enteric and respiratory tropisms of winter dysentery bovine coronavirus in calves. Archieves of Virology, 152: 1885-1900, 2007. 147. REYNOLDS DJ, DEBNEY TG, HALL GA, THOMAS LH, PARSONS KR. Studies on the relationship between coronaviruses from the intestinal and respiratory tracts of calves. Archives of Virology, 85: 71-83, 1985. 148. TSUNEMITSU H, YONEMICHI H, HIRAI T, KUDO T, ONOE S, MORI K, SHIMIZU M. Isolation of bovine coronavirus from feces and nasal swabs of calves with diarrhea. The Journal of Veterinay Medical Science, 53: 433-437, 1991. 149. HASÖKSÜZ M, LATHROP SL, GADFIELD KL, SAIF LJ. Isolation of bovine respiratory coronaviruses from feedlot cattle and comparison of their biological and antigenic properties with bovine enteric coronaviruses. American Journal of Veterinary Research, 60: 1227-1233, 1999. 150. ALKAN F. Buzağı ishallerinde rotavirus ve coronavirusların rolü. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 45: 29-37, 1998. 151. ALENIUS S, NISKANEN R, JUNTTI N, LARSSON B. Bovine coronavirus as the causative agent of winter dysentery: serological evidence. Acta Veterinaria Scandinavica, 32: 163-170, 1991. 152. OKUR GÜMÜŞOVA S, YAZICI Z, ALBAYRAK H, MERAL Y. Rotavirus and coronavirus prevalence in healthy calves and calves with diarrhoea. Medycyna Weterynaryjna, 63: 62-64, 2007. 153. HASIRCIOĞLU S, ŞİMŞEK A. Investigation of enteric bovine coronavirus infections in calves and the role of clinically healthy cattle in epidemiology of coronavirus infections. Veterinarium, 18: 43-49, 2007. 154. ÇABALAR M, KAYA A, ARSLAN S. Yeni doğan buzağıların ishal olgularında rotavirus ve coronavirus araştırılması. Veteriner Bilimleri Dergisi, 23: 103-106, 2007. 155. ROSALES SC. Charakterisierung ruminanter pestiviren mittels polymerasekettenreaktion und monoklonaler antikörper. Doktora tezi. Fachbereich Veterinarmedizin der Justus Liebig Universitat, Giessen, 2004. 156. YEŞİLBAĞ K. Viroloji Laboratuvar Uygulamaları. Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayınları Yayın No: 2004-1, Bursa, sayfa 32-37, 2004. 140 157. FREY HR, LIESS B. Vermehrungskinetik und verwendbarkeit eines stark zytopatogenen VD-MD virusstamnes für diagnostische untersuchungen mit der mikrotiter method. Zentralblatt für Veterinarmedizin Reihe B, 18: 61-71, 1971. 158. LIN XQ, O’REILLY KL, STORZ J, PURDY CW, LOAN RW. Antibody responses to respiratory coronavirus infections of cattle during shipping fever pathogenesis. Archieves of Virology, 145:2335-2349, 2000. 159. BROCK KV. The persistence of bovine viral diarrhea virus. Biologicals, 31: 133- 135, 2003. 160. BAKER JC, AMES TR, MARKHAM RJ. Seroepizootiologic study of bovine repiratory syncytial virus in a dairy herd. American Journal of Veterinary Research, 47: 240-245, 1986. 161. ELVANDER M. Severe respiratory disease in dairy cows caused by infection with bovine respiratory syncytial virus. Veterinayr Record, 138: 101-105, 1996. 162. RAAPERI K, BOUGEARD S, ALEKSEJEV A, ORRO T, VILTROP A. Association of herd BRSV and BHV-1 seroprevalence with respiratory disease and reproductive performance in adult dairy cattle. Veterinaria Scandinavica, 54: 4-13, 2012. 163. KELLING CL, TOPLIFF CL. Bovine maternal, fecal and neonatal responses to bovine viral diarrhea virus infections. Biologicals, 1: 20-25, 2012. 164. MARS MH, BRUSCHKE CJM, van OIRSCHOT JT. Airborne transmission of BHV1, BRSV, and BVDV among cattle is possible under experimental conditions. Veterinary Microbiology, 66: 197-207, 1999. 165. OHLSON A, EMANUELSON U, TRAVEN M, ALENIUS S. The relationship between antibody status to bovine corona virus and bovine respiratory syncytial virus and disease incidence, reproduction and herd characteristics in dairy herds. Acta Veterinaria Scandinavica, 52: 37-43, 2010. 166. STOTT EJ, THOMAS LH, COLLINS AP, CROUCH S, JEBBETT S, SMITH GS, LUTHER PD, CASWELL R. A survey of virus infections of the respiratory tract of cattle and their association with disease. Journal of Hygiene, 85: 257-270, 1980. 167. HOWARD CJ, CLARKE MC, SOPP P, BROWNLIE J. Immunity to bovine virus diarrhoea virus in calves: the role of different T-cell subpopulations analysed by specific depletion in vivo with monoclonal antibodies. Veterinary Immunology and Immunopathology, 32: 303-314, 1992. 168. FULTON RW, BRIGGS RE, PAYTON ME, CONFER AW, SALIKI JT, RIDPATH JF, BURGE LJ, DUFF GC. Maternally derived humoral immunity to bovine viral diarrhea virus (BVDV) 1a, BVDV 1b, BVDV2, bovine herpesvirus-1, parainfluenza-3 virus, bovine respiratory syncytial virus, Mannheimia haemolytica and Pasteurella multocida in beef calves, antibody decline by half-life studies and effect on response to vaccination. Vaccine, 22: 643-649, 2004. 169. MENANTEAU-HORTA AM, AMES TR, JOHNSON DW, MEISKE JC. Effect of maternal antibody upon vaccination with infectious bovine rhinotracheitis and bovine virus diarrhea vaccines. Canadian Journal of Comparative Medicine, 49: 10- 14, 1985. 170. VAN DER POEL WH, MIDDEL WG, SCHUKKEN YH. Antibody titer against bovine respiratory syncytial virus in colostrum-fed dairy calves born in various seasons. American Journal of Veterinary Research, 60: 1098-1101, 1999. 171. MUNOZ-ZANZI CA, THURMOND MC, JOHNSON WO, HIETALA SK. Predicted ages of dairy calves when colostrum-derived bovine viral diarrhea virus antibodies would no longer offer protection against disease or interfere with 141 vaccination. Journal of the American Veterinary Medical Association, 221: 678- 685, 2002. 172. CORIA MF, McCLURKIN AW. Duration of active and colostrum-derived passive antibodies to bovine viral diarrhea virus in calves. Canadian Journal of Comparative Medicine, 42: 239-243, 1978. 173. NORSTRÖM M, SKJERVE E, JARP J. Risk factors for epidemic respiratory disease in Norwegian cattle herds. Preventive Veterinary Medicine, 44: 87-96, 2000. 174. TRAVEN M, BJÖRNEROT L, LARSSON B. Nationwide survey of antibodies to bovine coronavirus in bulk milk from Swedish dairy herds. Veterinary Record, 144: 527-529, 1999. 175. MOCKELIŪNIENE V, SALOMSKAS A, MOCKELIŪNAS R, PETKEVICIUS S. Prevalence and epidemiological features of bovine viral diarrhoea virus infection in Lithuania. Veterinary Microbiology, 99: 51-57, 2004. 176. DURHAM PJK, HASSARD LE. Prevalence of antibodies to infectious bovine rhinotracheitis, parainfluenza 3, bovine respiratory syncytial and bovine viral diarrhea viruses in cattle in Saskatchewan and Alberta. Canadian Veterinary Journal, 31: 815-820, 1990. 177. BRAR JS, JOHNSON DW, MUSCOPLAT CC, SHOPE RE Jr, MEISKE JC. Maternal immunity to infectious bovine rhinotracheitis and bovine viral diarrhea viruses: duration and effect on vaccination in young calves. American Journal of Veterinary Research, 39: 241-244, 1978. 178. SMITH EL, HOLM A. The transfer of immunity to the new-born calf from colostrum. Unpublished. 1948. 179. FUKAI K, SAKAI T, FUJITA K, ABE S. Evalution of serum neutralizing antibodies to bovine coronavirus in cows and their calves using Hmlu-1 cells. Indian Journal of Medical Research, 108: 8-11, 1998. 180. BOLIN SR, RIDPATH JF. Assessment of protection from systemic infection or disease afforded by low to intermediate titers of passively acquired neutralizing antibody against bovine viral diarrhea virus in calves. American Journal of Veterinary Research, 56: 755-759, 1995. 181. GOYAL SM. Diagnosis. Editors: GOYAL SM, RIDPATH JF. Bovine viral diarrhea virus daignosis, managment and control. Blackwell Publishng, Iowa, page 199, 2005. 182. GONES SD. The evolution of bovine viral diarrhea: a review. The Canadian Veterinary Journal, 43: 946-954, 2002. 183. GRIPSHOVER EM, GIVENS MD, RIDPATH JF, BROCK KV, WHITLEY EM, rns SARTIN EA. Variation in E viral glycoprotein associated with failure of immunohistochemistry and commercial antigen capture ELISA to detect a field strain of bovine viral diarrhea virus. Veterinary Microbiology, 125: 11-21, 2007. 184. DUBOVI EJ. Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus. Biologicals, 41: 8-13, 2013. 185. HORNER GW, THAM KM, ORR D, RALSTON J, ROWE S, HOUGHTON T. Comparison of an antigen capture enzyme-linked assay with reverse transcription- polymerase chain reaction and cell culture immunoperoxidase tests for the diagnosis of ruminant pestivirus infections. Veterinary Microbiology, 43: 75-84, 1995. 186. KAMPA J, STAHL K, RENSTRÖM LHM, ALENIUS S. Evaluation of a commercial Erns-capture ELISA for detection of BVDV in routine diagnostic cattle serum samples. Acta Veterinaria Scandinavica, 49: 7-14, 2007. 187. ENDERS G. Paramyxoviruses. Editor: BARON S. Medical Microbiology, 4th edition, page: The University of Texas Medical Branch at Galveston, Texas, 1996. 142 188. Mc CLURKIN AW, LITTLEDIKE ET, CUTLIP RC, FRANK GH, CORIA MF, BOLIN SR. Production of cattle immunotolerant to bovine viral diarrhea virus. Canadian Journal of Comparative Medicine. 48: 156-161, 1984. 189. LINDBERG ALE. Bovine viral diarrhoea virus infections and its control. Veterinary Quarterly, 25: 1-16, 2003. 190. BOLIN SR, McCLURKIN AW, CORIA MF. Frequency of persistent bovine viral diarrhea virus infection in selected cattle herds. American Journal of Veterinary Research, 46: 2385-2387, 1985. 191. HOWARD TH, BEAN B, HILLMAN R, MONKE DR. Surveillance of persistent bovine viral diarrhea virus infection in four artifical insemination centers. Journal of the American Veterinary Medical Assocciation, 196: 1951-1955, 1990. 192. BOCK RE, RODWELL BJ, McGOWAN M. Detection of calves persistently infected with bovine pestivirus in a sample of dairy calves in South-eastern Queensland. Australian Veterinary Journal, 75: 656-659, 1997. 193. TAYLOR LF, JANZEN ED, ELLIS JA, van den HURK JV, WARD P. Performance, survival, necropsy and virological findings from calves persistently infected with the bovine viral diarrhea virus originating from a single Saskatchewan beef herd. The Canadian Veterinary Journal, 38: 29-37, 1997. 194. RUIBAL BRUNET IJ, NOA ROMERO E, RIVERO MAS AT, MARTIN GARCIA RZ. Inactivation of BVDV (experimental model for hepatitis C) using low pH and heat treatment in intravenous human immunoglobulins. Sangre, 44: 352- 356, 1999. 195. SAUERBREI A, WUTZLER P. Testing thermal resistance of viruses. Archives of Virology, 154:115-119, 2009. 196. CARRINGTON CAP. The role of Mycoplasma species in bovine respiratory disease complex in feedlot cattle in South Africa. PhD Thesis. University of Pretoria. 2007. 143 TEŞEKKÜR Doktora eğitim programına beni kabul eden ve bunca deneyim kazanmamı sağlayan bu tez konusunu bana güvenerek veren danışman hocam sayın Prof. Dr. Kadir YEŞİLBAĞ başta olmak üzere saha çalışmam sırasında bana yardımcı olan Vet. Hek. Burak Güven’e, Vet. Hek. Ersin ÖZER’e, Vet. Hek. Rahmi DARICI’ya, Vet. Hek. Ali ALKAN’a, Dr. Abdurrahman ÖZLÜER’e, Vet. Hek. Hasan Can BEKTAŞ’a ve Ziraat Mühendisi Elif ABDULLAOĞLU’na, istatistik çalışmalarımda kapılarını ardına kadar açan Doç. Dr. Faruk BALCI ve Araş. Gör. Ender UZABACI’ya sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum. Bursa’ya gelmeme vesile olan ve desteğini hiçbir zaman esirgemeyen Uzm. Vet. Hek Ersin CANPOLAT’a, bu zor ve uzun süreç sırasında hep yanımda olan, her daim sıkıntılarımı paylaşan çok sevgili dönem arkadaşım Araş. Gör. Gizem ALPAY’a ve son olarak aramıza yeni katılan Dokt. Öğr. Eda Baldan ÖNER’e yaptığı önemli katkılardan dolayı sonsuz minnetimi sunuyorum. Herkesten önce beni okutarak bugünlere getiren, bana her zaman destek olarak başarılarımla gurur duyan, yıldığım anda beni tekrar motive ederek devam etmemi sağlayan ve beni dünyanın en şanslı insanı gibi hissettiren anneme ve babama, yanımda oldukları için her gün şükrettiğim ablama ve kardeşime sonsuz minnetimi ve sevgilerimi sunuyorum. Elde ettiğim tüm başarıları biricik aileme ithaf ediyorum. 144 ÖZGEÇMİŞ Ankara’da 1984 yılında dünyaya gelen Pelin TUNCER, TED Ankara Koleji’nden mezun olduktan sonra Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi’ni 2007 yılında bitirerek üniversite eğitimi tamamlamış ve Veteriner Hekim ünvanını almaya hak kazanmıştır. Aynı yıl Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Viroloji Bilim Dalı doktora öğrencisi olarak eğitimine başlamıştır. Araştırma görevlisi olarak 2009’da ataması yapılmış ve doktora eğitimini 2013 yılında tamamlamıştır. Uluslararası indekslerce taranan ve yurtiçi dergilerde yer alan araştırma makaleleri ve derlemeleri bulunmaktadır. AKADEMİK FAALİYETLER: Yurt dışı faaliyetler: * 2012, Inst. for Virology, Justus-Liebig University Faculty of Veterinary Medicine, Giessen, Almanya (2 ay, proje çalışması) Katıldığı Kurslar: * Deney hayvanları kullanım kursu. U.Ü. Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu. 2008. * Monoklonal antikor üretimi ve home-made ELISA. 30.03-10.04.2009 ve 29.06-17.07. 2009 Tübitak, Gebze. Proje çalışması. * Viral hastalıkların tanısında PCR teknolojisi 2009-2010 Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji ABD. Lisansüstü yaz okulu dersi. * Optimization techniques for western blot, immunoprecipitation and immunohistochemistry. 27 Nisan 2012, İzmir. * Mikroskop ve kontrast yöntemleri, floresan mikroskopi yöntemleri ve ileri görüntüleme teknikleri. 22 Mayıs 2012, Bursa. * Araştırma projesi hazırlama ve yazma eğitimi (TÜBİTAK). 1-2 Kasım 2012/28-30 Kasım 2012, Bursa. * Bilimsel yazar çalıştayı, Elsevier. 31 Mayıs 2013, Uludağ Üniversitesi, Bursa. 145 Üye olduğu organizasyonlar: - Veteriner Hekimleri Mikrobiyoloji Derneği 146