RESEARCH ARTICLES J Res Vet Med. 2020: 39 (2) 73-81 DOI:10.30782/jrvm.807799 Kemirgen Hipotalamusunda Glutamatın Atriyal Natriüretik Peptit Nöronları Üzerindeki Etkilerinin İmmünohistokimyasal Yöntemle Araştırılması Duygu GÖK YURTSEVEN1 Zehra MİNBAY1 Özhan EYİGÖR*1 1Bursa Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Bursa Received 09-10-2020 Accepted 04-11-2020 Özet Atriyal natriüretik peptit (ANP) organizmanın sıvı homeostazında önemli etkileri olan, özellikle de kan basıncı ile sıvı elektrolit dengesinin düzenlenmesinde rol oynayan bir peptittir. Yoğun olarak atrial kalp kası hücrelerince üretilen ANP, merkezi sinir siteminde (MSS) lokalize bir grup nöron tarafından da eksprese edilir. MSS’de nöronal ağlarda impuls iletiminde çok önemli rolü olan glutamaterjik sistemin ANP nöronlarını kontrol eden etkileri ile ilgili bilgi literatürde yer almamaktadır. Sunulan çalışma kapsamında, hipotalamusun supraoptik çekird- eğinde lokalize ANP nöronları üzerinde glutamat agonistlerinin etkileri ve bu nöronlarda eksprese olan glutamat reseptör alt birimlerinin varlığı, ikili immünoperoksidaz ve immünoflouresans yöntemler kullanılarak araştırılmıştır. Glutamat agonistlerinin etkilerini belirlemek üzere, kainik asit, AMPA ve NMDA, kontrol grupları için salin, antagonist olarak CNQX ve MK801 enjeksiyonu yapılan sıçanları içeren deney grupları oluşturulmuştur. ANP nöronlarındaki glutamaterjik innervasyonun belirlenmesinde veziküler glutamat transporter (VGluT) proteinleri ve nöronal aktivasyonun gösterilmesinde ise c-Fos immünoreaktivitesinin varlığı belirteç olarak kullanılmıştır. Çalışmaların so- nucunda; glutamat agonistlerinin ANP nöronlarında nöronal aktivasyonu anlamlı bir şekilde arttırdığı, bu artışın antagonistler ile anlamlı bir şekilde baskılanabildiği belirlenmiştir. Ayrıca ANP nöronlarının glutamat reseptörlerine ait alt birimlerden GluA1, GluA2, GluK1/2/3 ve GluK5’i eksprese ettikleri ve VGluT içeren glutamaterjik akson sonlanmalarıyla temasta oldukları saptanmıştır. Sonuç olarak, bu çalışma ile glutamatın ANP nöronlarında aktive edici etkiye sahip olduğu ve glutamat reseptörlerinin bu nöronlarca eksprese edildiği, dolayısıyla da bu nöronların glutamaterjik uyarıları alabilecek mekanizmaya sahip oldukları gösterilmiştir. Bu sonuçlar, ANP nöronlarının merkezi düzenlen- mesinde glutamaterjik sistemin önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmüştür. Anahtar Kelimeler: Atrial natriüretik peptit, Glutamat, Kainik Asit, c-Fos, VGluT. Sıçan. Investigation of Glutamatergic Effects on Atrial Natriuretic Peptide Neurons by Immunohistochemical Method in Rodent Hypothalamus Abstract Atrial natriuretic peptide (ANP) is a peptide that has important effects on the fluid homeostasis of the organism, particularly involved in the regulation of blood pressure and fluid electrolyte balance. ANP, which is intensely produced in the heart atrium, is also expressed in different peripheral and central organs. There is no knowledge in the literature regarding the control of ANP neurons in the central nervous system by the glutamatergic system. In our study, the effects of glutamate agonists on ANP neurons and the presence of glutamate receptor subunits expressed in these neurons were investigated using dual immunoperoxidase and immunofluorescence methods. In the present study, ANP neurons local- ized in the supraoptic nucleus (SON) of the hypothalamus were examined. In order to determine the effects of glutamate agonists, experimental groups were formed containing rats which were injected with kainic acid, AMPA and NMDA, saline for control groups and CNQX or MK801 as antagonists. VGluT protein was used as a marker for the determination of glutamatergic innervations in ANPergic neurons, and c-Fos immuno- reactivity was used as a marker for neuronal activation. It has been determined that glutamate agonists cause activation in a significant number of ANP neurons which can significantly be suppressed by antagonists. In addition, it was determined that the ANP neurons express GluA1, GluA2, GluK5 and GluK1/2/3, which are subunits of glutamate receptors, and are in contact with glutamatergic axon terminations containing VGluT. As a result, it has been shown that glutamate has an effect on the activation of ANP neurons and that glutamate receptors are expressed by these neurons, thus, these neurons possess the mechanism in order to receive glutamatergic stimulations. In conclusion, these results suggested that the glutamatergic system plays an important role in the central regulation of ANP neurons. Key Words: Atrial natriüretic peptid, Glutamate, Kainic Acid. c-Fos, VGluT, Rat. * Corresponding author: Prof. Dr. Özhan EYİGÖR Bursa Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Görükle Kampüsü, 16059, Bursa Tel: + 90 0533 517 7809 Fax: + 90 224 295 0019 E-posta: oeyigor@uludag.edu.tr 73 Eyigor et al. 2020 Giriş histokimya tekniği ile ANP nöronlarının glutamat agonist- lerinin uygulanması sonrasında aktive olup olmadıkları Natriüretik peptit ailesi, atriyal natriüretik peptit (ANP)1, ve olası aktivasyonun glutamat antagonistleri ile bloklanıp beyin natriüretik peptit (BNP)2 ve C-tipi natriüretik peptit bloklanmadığı araştırılmıştır. Ayrıca, bu nöronlardaki glu- (CNP)3 olmak üzere üç peptitden oluşur. ANP, beyinde- tamat reseptör alt birimlerinin ekspresyonunun incelen- ki su ve elektrolit içeriğini düzenleyen 126 amino asitlik mesi için ikili immünoflouresans tekniği kullanılmış, ANP atrial prohormondan kesilen 28 amino asitlik bir peptit- nöronları üzerindeki glutamaterjik sonlanmaların varlığı tir.4 Natriüretik peptitler periferik fonksiyonlarının yanı glutamaterjik belirteç olarak kullanılan veziküler glutamat sıra, merkezi sinir sisteminde hem nöromodülatör hem taşıyıcı proteinleri-2 (VGluT2) ve VGluT3 immünohisto- de nörotransmitter olarak görev yaparlar.5 İlk kez kalp kimyası ile değerlendirilmiştir. atriyumlarında yerleşik atriyal miyositlerce sentezlen- diği ve salgılandığı gösterilen ANP’nin6 ayrıca hipota- Materyal ve Metot lamik çekirdeklerde yerleşik nöronlarca da sentezlen- dikleri belirlenmiştir.7-9 Hipotalamusta paraventriküler Deney Hayvanlarının Hazırlanması çekirdekte (PVN)10, anteroventral periventriküler çekir- Çalışma, Üniversitemiz Hayvan Deneyleri Yerel Etik Ku- dekte (AVPV)11, suprakiazmatik çekirdekte (SCN)12,13, ar- rulu’nun (HADYEK) 19.04.2005/1 sayılı kararı ile etik kuat çekirdekte (ARC) ve supraoptik çekirdekte (SON)14,15 yönden uygun bulunarak yapıldı. Çalışmada, erişkin (60- ANP içeren nöron gövdeleri immünohistokimyasal yön- 90 günlük) Sprague Dawley cinsi dişi sıçanlar kullanıldı. temlerle ile gösterilmiştir. Sıçanların bulunduğu ortam ısısı 20-240C olacak şekilde Hipotalamusun birçok endokrin ve peptiterjik sistemi sabit tutulup, 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık (07.00- üzerinde etki gösteren glutamat, sinaptik mekanizmalar 19.00 arası aydınlık) döngüsü uygulandı ve hayvanlar ad aracılığıyla hipotalamustaki neredeyse tüm nöronları et- libitum olarak su ve yemle beslendi. kilemektedir. Eksitatör aminoasit nörotransmitterlerinin başında gelen glutamatın, nöroendokrin sistemlerin ve Dokuların Hazırlanması hipotalamus-hipofiz-endokrin sistem aksının düzenlen- Denekler derin eter anestezisi altında 0,13 M fosfat tam- mesinde önemli rolü vardır16,17. Glutamat reseptörleri, hem ponu ile hazırlanan %4 paraformaldehitin kullanıldığı eksitatör hem de inhibitör sinaptik iletişime aracılık eden transkardiyak perfüzyon fiksasyonu yöntemi kullanılarak membran proteinleridir18. Glutamatın iki farklı reseptör sakrifiye edildi. Bu yöntemde deneklerin göğüs kafesleri üst ailesinden biri olan iyonotropik glutamat reseptörleri açılarak kateter kalp apeksinden aortaya yerleştirildi ve sa- iyon-özgül reseptör kanalları oluştururlar19. İyonotropik bitlendi. Damar içi basınca uygun şekilde ayarlanan per- glutamat reseptörleri, glutamat agonistlerine olan bağlan- füzyon pompası yardımıyla öncelikle deneklerin dolaşım ma afiniteleri değerlendirilerek 3 alt gruba ayrılmaktadır; sistemleri % 0,9 NaCl (150 ml) ile temizlendi, sonrasında AMPA (α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoksazol propri- denek başına 400 ml fiksatif solüsyonu ile perfüzyon fik- onik asit), Kainat (KA, 2-karboksi-3-karboksimetil-4-i- sasyon işlemi gerçekleştirildi. Perfüzyon sonrası çıkarıla- zopropenilpirolidin) ve NMDA (N-metil-D-aspartat) rak aynı fiksatifte +4°C’de gece boyu post–fiksasyon uygu- reseptörleri20-23. Glutamat agonistleri, seçici olarak farklı lanan beyinlerden vibrotom ile 50 µm’lik koronal kesitler tipteki glutamat reseptörlerine bağlanarak taşıdıkları uya- alındı. Hipotalamusun rostra–kaudal ekseninin tamamını rıyı nöronlara aktarırlar ve nöronal aktivasyonu sağlarlar. içerecek şekilde alınan kesitler 5 seri halinde Tris–HCl Aktive olan nöronların belirlenmesinde kullanılan çeşitli tampon solüsyonu (pH 7.6) içine toplandı. Tris–HCl solüs- belirteçler mevcuttur. Bir transkripsiyon faktörü olan c-fos yonunda 3x10 dk. yıkanarak fiksatiften arındırılan kesit- geninin (ani-erken gen) ve bu genin protein ürünü olan ler kriyoprotektan solüsyon içerisinde –20°C’de saklandı. c-Fos’un geçici olarak ekspresyonu, bu geni taşıyan nöron- Daha sonra bu kesitlere aşağıda basamakları ayrıntılı bir ların aktive olduğunu belirlemede bir parametre olarak şekilde verilen protokoller kullanılarak indirekt immüno- kullanılmaktadır24,25. c-Fos proteini, uyarı alan bir nöronda peroksidaz yöntemi ya da ikili immünoflouresan yöntem- çok hızlı olarak (60-90 dakika içerisinde) sentezlenip çe- leri ile işaretlemeler yapıldı. kirdeğe translokalize olarak nöronda genetik aktivasyonu başlatır. Bu işlevi nedeniyle aktive olan nöronların belir- Deney Gruplarının Oluşturulması lenmesinde nöronal aktivasyon belirteci olarak kullanıl- Farklı glutamat reseptör agonistlerinin ANP nöronlarının maktadır26. aktivasyonuna olan etkisinin araştırılması amacıyla deney Bu çalışmada; c-Fos proteini varlığının nöronal aktivasyon grupları aşağıdaki gibi oluşturuldu. belirteci olması özelliğinden yararlanılarak, ikili immüno- a) AMPA/kainat reseptör agonisti kainik asitin nöron ak- 74 Eyigor et al. 2020 tivasyonuna etkisinin araştırılması: Denekler, her grupta 5 Louis, USA.), %0.1 sodyum azid (BDH, Prod. No: 30111, dişi olmak üzere 3 grup olacak şekilde sınıflandırıldı (n=5/ BDH Laboratory Supplies Poole, BH15 1TD, England) ve grup): %0.2 Triton–X 100 (BDH, Prod. No: 43700, BDH Labora- Grup I (Kontrol grubu): Deneklere intraperitoneal (i.p.) tory Supplies Poole, BH15 1TD, England) içeren Tris_HCl fizyolojik tuzlu su enjeksiyonu (300 l/denek) yapıldı. tamponu bloklayıcı tampon olarak seçildi. Ayrıca, kullanı- Grup II (Kainik asit grubu): Deneklere i.p. yolla kainik asit lan tüm primer ve sekonder antikorlar bloklayıcı tampon (Calbiochem., LA) 2.5 mg/kg dozunda (300 l/denek) ve- ile sulandırıldı. rildi. Grup III (CNQX grubu): Kainik asit enjeksiyonundan 15 i. c-Fos ve ANP Kolokalizasyonunun Belirlenmesi için dk. önce AMPA–kainat reseptör antagonisti olan CNQX İkili İndirekt İmmunoperoksidaz İşaretleme Protokolü (Ascent Scientific North Sumerset, UK) 1 mg/kg dozunda Kesitler Tris-HCI tamponda yıkanarak kriyoprotektandan i.p. yolla (300 l/denek) verildi. arındırılmalarının ardından sıra ile spesifik olmayan bo- b) AMPA reseptör agonisti AMPA’nın nöron aktivasyonu- yanmasının engelenmesi amacıyla %10’luk normal at seru- na etkisinin araştırılması: Denekler her grupta 5 dişi ola- mu ile 2 saat, tavşan poliklonal anti-c-Fos (1:20.000, Calbi- cak şekilde 3 gruba ayrıldı (n=5/grup). ocem, PC-38, Lot#:D10669) antikoru ile oda sıcaklığında Grup I (Kontrol grubu): Deneklere i.p. fizyolojik tuzlu su tüm gece ve biyotinli eşek anti-tavşan IgG (1:300, Jackson enjeksiyonu (750 l/denek) yapıldı. Immuno Research Laboratories, Inc. West Grove, PA) ile 2 Grup II (AMPA grubu): Deneklere i.p. yolla AMPA (As- saat inkübe edildi. Takiben yıkanan kesitler avidin-biotin cent Scientific North Sumerset, UK) 5 mg/kg dozunda kompleksi (ABC Elite Kit, Vector Laboratories, Burlinga- (750 l/denek) verildi. me, CA) solüsyonunda ile 60 dk. bekletildi. Yıkamanın ar- Grup III (CNQX grubu): AMPA enjeksiyonundan 15 dk. dından, kesitlere substrat kromojen solüsyonu (Ni–DAB) önce AMPA–kainat reseptör antagonisti olan CNQX 2 mg/ 4 dk. süreyle uygulandı. Yıkaması yapılan kesitler, tekrar 2 kg dozunda i.p. yolla (300 l/denek) verildi. saat süreyle %10’luk normal at serumuna alındı. Kobay an- c) NMDA reseptör agonisti NMDA’nın nöron aktivasyo- ti-ANP (1:1000, Peninsula, T-5004, Lot#:040847) primer nuna etkisinin araştırılması: Her grupta 5 dişi olmak üzere antikoru ile oda sıcaklığında 24 saatlik inkübasyonun ar- denekler 3 grup olacak şekilde sınıflandırıldı (n=5/grup). dından tamponda arındırılan kesitler eşek anti-kobay IgG Grup I (Kontrol grubu): Deneklere i.p. fizyolojik tuzlu su sekonder antikoru (1:200) ile 2 saat muamele edildi. Avi- enjeksiyonu (2 ml/denek) yapıldı. din-biotin kompleksi (ABC) solüsyonu ile 1 saatlik inkü- Grup II (NMDA grubu): Deneklere i.p. yolla NMDA (As- basyonun sonrasında yıkanan kesitlere substrat kromojen cent Scientific North Sumerset, UK) 100 mg/kg dozunda solüsyonu olan DAB (diaminobenzidine) uygulandı. Lam- (2 ml/denek) verildi. lara alınan ve kurutulan kesitler ışık mikroskopi inceleme Grup III (MK–801 grubu): NMDA enjeksiyonundan 15 öncesi DPX (BDH) ile kapatıldı. dk. önce NMDA reseptör antagonisti olan MK–801 (As- cent Scientific North Sumerset, UK) 1 mg/kg dozunda i.p. ii. ANP nöronlarında Glutamaterjik Sinir Sonlanmala- yolla (300 l/denek) verildi. rında Veziküler Glutamat Taşıyıcıları VGluT2 ve VG- Enjeksiyonlar 10:00–11:00 saatleri arasında yapıldı. Son luT3’ün Gösterilmesi İçin İmmunoperoksidaz Boyaması enjeksiyonlardan 90 dk. sonra tüm denekler derin eter Yukarıda c-Fos ve ANP kolokalizasyon boyamaları için anestezisi altında yukarıda ayrıntıları verilen yöntemle verilen protokol aynen uygulandı. c-Fos antikoru yerine sakrifiye edilerek seri beyin kesitleri hazırlandı ve aşağıda Tablo 1’de detayı verilen VGluT2 veya VGluT3 antikorları verilen immünohistokimyasal yöntemle işaretlendi. kullanıldı. İmmünohistokimya iii. ANP Nöronlarında AMPA (GluA1, GluA2) ve Kainat İmmünohistokimyasal işlemlerin tümü cam sintilasyon vi- (GluK5 ve GluK1/2/3) Reseptör Alt Birim Protein Eks- yallerindeki yüzen kesitlere uygulandı. Kesitlerin yıkama presyonlarının İkili İmmünoflouresans Yöntem ile Belir- ve inkübasyon işlemleri orbital sallayıcı yardımı ile uygun lenmesi ajitasyonla gerçekleştirildi. İmmünohistokimyasal işaretle- Kesitler, bloklayıcı tampon ile 2 saat bekletildikten son- me prosedürü sırasında, kesitlerin yıkanması aşamalarında ra, kobay anti–ANP antikoru ve glutamat reseptör alt bi- ve ABC ile substrat kromojen solüsyonlarının hazırlanma- rimlerinden birine ait bir antikoru içeren primer antikor sında Tris-HCl tamponu kullanıldı. Spesifik olmayan bağ- karışımda inkübe edildi. Karışımdaki antikorlar Tablo 1’de lanmayı azaltmak amacıyla %10 normal at serumu (Sigma, verilen dilüsyonlarda hazırlandı ve inkübasyon süresi, ka- Cat No: H1138, Sigma-Aldrich, Co., 3050 Spruce Street, St. rışımdaki en uzun süre inkübasyon gerektiren antikora 75 Eyigor et al. 2020 göre belirlendi. Yıkamanın ardından, sekonder antikor denek için aynı koordinatta olmasına dikkat edildi. uygulamasına geçildi. GluK1/2/3 ile işaretlenecek kesit- İkili immünoperoksidaz işaretlenmiş kesitlerde hem tüm ler öncelikle biotinli eşek anti–fare IgG ya da biotinli eşek ANP immünopozitif nöronlar hem de c-Fos-pozitif ANP anti–tavşan IgG (1:200, Jackson Immuno Research Labo- nöronlarının sayıları belirlendi ve her denek için c-Fos ratories Inc. West Grove, PA) ile 1.5 saat ve ardından Texas işaretli ANP nöronlarının tüm ANP nöronlara oranı he- Red–Streptoavidin (1:100, Vector Laboratories) ile 2 saat saplandı. Elde edilen verilerin deney grupları arası varyans inkübasyona bırakıldı. Diğer alt birim proinlerininin gös- analizi ANOVA ile, istatistiki anlamlılık karşılaştırması ise terilmesinde de sekonder antikor karışımı olarak FITC Student–Newman–Keuls testi ile yapıldı. İstatistiki anlam- işaretli eşek anti–kobay IgG (1:300, Jackson Immuno Re- lılık sınır değeri olarak p<0.05 alındı. search Laboratories, Inc. West Grove, PA) ve Cy3 işaretli ANP nöronlarında glutamat reseptör alt birimlerinin eks- eşek anti–tavşan IgG (1:300, Jackson Immuno Research presyonunun araştırıldığı ikili immünoflouresan işaretli Laboratories, Inc. West Grove, PA) ya da FITC işaretli eşek kesitlerde, ilgili reseptör proteininin ANP ile kolokalize anti–kobay IgG (1:300) ve TexasRed işaretli eşek anti–fare olup olmadığı belirlendi. Konvansiyonel floresan mikros- IgG (1:200) karışımı kullanıldı. Yıkanan kesitler lamlara kop kullanımında sinyalin çok hızlı kaybolması nedeniyle alınarak kurutuldu ve Prolong® Antifade Kit (Molecular kantitatif değerlendirme yapılamadı. Preparatlar ikili bo- Probes, Oregon, USA) ile kapatıldı. yanan nöronların varlığı ve yoğunluğu açısından değerlen- dirildi. Preparatların İncelenmesi ve İstatistiksel Analiz İmmünoperoksidaz boyaması yapılan kesitlerin incelemesi Bulgular Olympus BX–50 fotomikroskopta, ikili immünoflouresans İmmünohistokimyasal İşaretlemelerin Değerlendirilmesi yöntemle işaretlenen kesitlerin incelemesi ise Olympus İmmünohistokimya tekniği kullanılarak yapılan iki- BX–FLA Reflected Light Flourescence Attachment adapte li immün işaretlemelerde, sitoplazmada eksprese oldu- Tablo 1. Çalışmada kullanılan antikorların özellikleri ğu bilinen ANP proteini DAB kromojeni kullanılarak renklendirildi ve oluşturulan komplekse ait sinyaller ışık mikroskobunda kahverengi olarak belirlendi. Çekirdekte lokalize c-Fos proteini-antikor kompleksi ise nikel amon- yum sülfatla zenginleştirilmiş DAB (Ni-DAB) uygulaması ile görünür hale getirildi ve koyu mavi-siyah olarak izlen- di. Hem çekirdeğinde (koyu mavi-siyah boyanma) hem de sitoplazmasında (kahverengi boyanma) işaretlenme olan nöronlar ikili işaretlenmiş olarak kabul edildi. İkili immü- noflouresan işaretlemeler ile nöronlardaki ANP proteini, yeşil renkte sinyal veren florokromlarla, glutamat reseptör alt birim proteinleri ise kırmızı renkte sinyal veren flo- rokromlarla işaretlendi. * Parantez içindeki dilüsyon immünoflouresans (IF) çalışmalar- ANP Nöronlarının Hipotalamusta Dağılımı da kullanılmıştır. OS: Oda sıcaklığı Atrial natriüretik peptit nöronlarına ait immünreaksiyona özellikle supraoptik ve paraventriküler çekirdeklerde rast- landı. Bu çekirdeklerde çok sayıda nöronun ANP-pozitif edilmiş Olympus BX50 mikroskopla 40X objektif kullanı- olduğu, paraventriküler çekirdekte çoğunlukta olan parvo- larak dijital kamera (Olympus DP71 CCD color camera, selüler nöronların ise ANP sentezlediği görüldü (Şekil 1). 1,5 million pixel) ile bilgisayar ekranına alınan görüntüler Ayrıca anteroventral periventriküler çekirdekte (AVPV), üzerinde anında tarama yapılarak gerçekleştirildi. suprakiazmatik çekirdekte (SCN) ve arkuat çekirdekte Çalışmalar kapsamında yapılan tekli ve ikili işaretlemeler (ARC) az sayıda ANP nöronu saptandı. sonucu hazırlanan kesitlerin koordinatları Paksinos’un sı- çan beyin atlasına27 göre belirlendi. SON için kullanıla- ANP Nöronlarının Glutamaterjik Aktivasyonu cak kesitler bregma –0.48 mm ile –1.44 mm koordinatları Çalışmalarımızda ANPerjik sistemin glutamaterjik regü- arasında seçildi. Bu aralıklarda rostrakaudal düzlemde hi- lasyonunu belirleyici sonuçlar elde edilmiştir. ANP nöron- potalamusun 5 farklı seviyesinden alınan kesitlerde sayım larının glutamat agonistlerinin etkisiyle nöronal aktivas- işlemleri yapıldı. Kesitlerin birbirine eşit uzaklıkta ve her yon gösterdikleri belirlenmiştir. 76 Eyigor et al. 2020 ANP Nöronları ve VGluT İçeren Akson Sonlanmaları ANP nöronlarının hem VGluT2 hem de VGluT3 protei- nini içeren akson sonlanmaları ile süperpoze olduğu gö- rüldü. VGluT2 veya VGluT3 immünreaktivitesi gösteren akson son düğmecikleri ANP-pozitif nöronlar üzerinde koyu renkli noktalar olarak izlendi (Şekil 3). Şekil 2: Kainik asit uygulamasının ANP nöronlarındaki c-Fos ekspresyonuna etkisi (A-C). Kontrol grubunda (A) SON’deki ANP nöronlarında c-Fos ekspresyonu görülmezken, kainik asit verilmiş grupta (B) çok sayıda ANP nöronunun aktive olduğu (çekirdekte c-Fos pozitif), CNQX’in etkisiyle de c-Fos-pozitif ANP nöron sayısının azaldığı (C) izlenmektedir. ANP nöron- larında AMPA’nın etkisiyle c-Fos aktivasyonu (D-F). Kontrol Şekil 1: SON (A) ve PVN’de (B) yerleşik ANP nöronları. OK: grubunda ANP nöronlarında c-Fos ekspresyonu görülmezken optik kiazma, 3V: Üçüncü ventrikül (D), AMPA grubunda c-Fos-pozitif nöron sayısının arttığı Kainik asit etkisi: Kontrol grubunda göz ardı edilebilecek izlenmektedir (E). CNQX etkisiyle aktive olan nöron sayısında kadar az sayıda c-Fos içeren ANP nöronu görüldü (orta- ise azalma görülmemiştir. (F). ANP nöronlarına NMDA’nın lama %0,04). Kainik asit etkisiyle c-Fos pozitif nöron sa- etkisi (G-I). Kontrol grubunda (G) c-Fos içeren ANPerjik nöron yısı %48’e yükselirken, non-NMDA reseptör antagonisti görülmezken, NMDA’nın etkisiyle aktive nöron sayısının arttığı CNQX bu oranı yarı yarıya azaltarak %23’e geriletmiştir. (H), MK-801 uygulaması sonrası ise bu oranın neredeyse kon- Yapılan istatistiki incelemeler, hem kainik asitin c-Fos’u trol seviyesine gerilediği görülmektedir (I). eksprese eden ANP nöron sayısını arttırıcı etkisinin, hem de CNQX’in bu artışı baskılayıcı etkisinin anlamlı olduğu- ANP Nöronlarında Glutamat Reseptör Alt Birimlerinin Eks- nu gösterdi (p<0.05), (Şekil 2A-C). presyonu AMPA etkisi: ANP nöronlarının bir kısmının glutamat ANP nöronlarında AMPA reseptörlerine ait alt birimler- agonisti AMPA’ya duyarlı olduğu, AMPA uygulamasını den GluA1 ve GluA2’ye ait ekspresyon belirlendi. Kainat takiben bu nöronların çekirdekte lokalize c-Fos immüno- reseptörlerinden GluK5 alt biriminin çok sayıda ANP-po- reaksiyonunun belirlenmesiyle aktive oldukları görüldü. zitif hücrede sentezlendiği izlendi. GluK1/2/3 antikoru Ancak antagonist uygulaması bu artış üzerinde bir etki özellikle SON’de yerleşik ANP nöronlarında immün reak- göstermemiştir (Şekil 2D-F). siyon verdi (Şekil 4). NMDA etkisi: Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, NMDA uygulanan grupta çok sayıda nöronun c-Fos’u eks- prese ettiği dolayısıyla bu nöronların aktive oldukları tespit edildi. Deneklere MK-801 antagonistinin verilmesinin ar- dından, SON’de aktive olan ANP nöron sayısının baskılan- dığı belirlendi (Şekil 2G-I). 77 Eyigor et al. 2020 Şekil 4: SON’de yerleşik ANP nöronlarında GluA1, GluA2 ve GluK1/2/3 reseptör protein ekspresyonları. ANP nöronları yeşil renkte, GluA1, GluA2 ve GluK1/2/3 reseptör proteinini eksprese eden nöronlar kırmızı renkte görülmektedir. Sağ pan- elde üstüste bindirilmiş mikrofotoğraflarda sarı renkte görülen nöronlar, glutamat reseptörü ile kolokalizasyon gösteren ANP nöronlarıdır. OK: optik kiazma Merkezi olarak uygulanan osmotik, kolinerjik ve anjio- Şekil 3: Atrial natriüretik peptit nöronlarının VGluT2 (A) ve tensinerjik stimülasyonların hem ANP salınımını arttır- VGluT3 (B) içeren akson sonlanmalarıyla (siyah oklar) olan dığı, hem de supraoptik ve magnoselüler paraventriküler ilişkisi. çekirdeklerdeki c-Fos-pozitif nöronların sayısını kayda Tartışma ve Sonuç değer şekilde arttırdığı bildirilmiştir32. Glutamatın, ANP Atrial natriüretik peptit ve reseptörleri beyinde geniş bir nöronlarının bulunduğu bilinen AVPV’ye direkt olarak 33 şekilde dağılım gösterirler. Ancak anteroventral üçüncü verildiğinde kan basıncını azalttığı rapor edilmiştir . ANP ventrikül bölgesi, bazal medial hipotalamus, beyin sapı antagonistinin bu etkiyi ortadan kaldırdığının aynı grup tarafından gösterilmesi34ve çevresel organlar bu peptitin eksprese edildiği en belir- ANP nöronlarının glutamaterjik gin bölgeler olarak tanımlanmıştır28,29. ANP immünreak- uyarı alabildiğini düşündürmektedir. Çalışmamızda gluta- tif nöronlar, hipotalamusun supraoptik, paraventriküler mat agonisti kainik asitin enjeksiyonu sonrası, supraoptik ve periventriküler çekirdeği ile median eminens’in akson çekirdekteki c-Fos-pozitif ANP nöronlarının oranı kont- ve nöronlarında tespit edilmiştir30. Çalışmalarımız kapsa- rolleriyle karşılaştırıldığında bu sayının yaklaşık 50 kat mında yapılan immünohistokimyasal boyamalarda ANP arttığı gözlendi. Artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu nöronlarının beyindeki hipotalamik yerleşimleri belirlen- belirlendi. Aynı şekilde, AMPA ve NMDA uygulamaları- miştir. ANP sentezleyen nöronların literatürdeki bilgilerle nın da çok sayıda ANP nöronunu etkileyerek aktivasyona uyumlu olarak30 en fazla sayıda SON’de ve PVN’nin par- neden olduğu belirlendi. c-Fos ekspresyonu nöronlarda voselüler bölgesinde lokalize oldukları görülmüştür. AVPV genetik aktivasyona yönelik bir etkinin ortaya çıktığını be- ve PVN’de lokalize bir kısım ANP nöronlarına ait akson- lirten bir gösterge olduğuna göre 35 ANP nöronlarında, sen- lar, median eminens ve nörohipofizde sonlanırlar. Burada teze ve/veya salgılamaya yönelik bir genetik hareketliliğin, portal damarların kan akımını arttıracak şekilde vazodila- glutamat tarafından tetiklendiğini söylemek mümkün- tasyona neden olurlar. Hipotalamus kaynaklı ANP’nin pe- dür. Daha önceki çalışmalarda da glutamat agonistlerinin riferik etkilerini, hipotalamustaki diğer nöronal sistemleri benzer etkilerinin varlığı oksitosin, oreksin, nöronostatin etkileyerek, nörohipofizden salınacak endotelin, α-mela- ve nesfatin-1 gibi farklı nöroendokrin nöronlarda göste- 36-40 nosit uyarıcı hormon, vazopressin veya oksitosin gibi pep- rilmiştir . Çalışmamızda glutamat agonistlerinin ANP titleri regüle ederek gösterebileceği de düşünülmektedir31. nöronlarını aktive ettiğinin gösterilmesi, bu nöronların 78 Eyigor et al. 2020 glutamaterjik uyarıları ya direkt olarak kendi sentezlediği Glutamat reseptörleri aynı alt birimlerle homomerik, farklı reseptörler aracılığı ile ya da indirekt olarak glutamat sen- alt birimlerle heteromerik reseptör kompleksleri oluştura- sitif internöronlar aracılığı ile algıladığını düşündürmek- rak fonksiyonel hale gelirler45-47. Çalışmamız sonucunda tedir. Çalışmalarda agonist etkilerinin anlamlı bir şekilde fonksiyonel reseptör kanalı oluşturabilecek reseptör alt uygun antagonistlerce baskılandığı belirlendi. Kainik asit birimlerinin SON’de yerleşik ANPerjik nöronlarca sentez- ve AMPA antagonisti olarak işlev gören CNQX’in özel- lendiği belirlenmiştir. Bu sonuçlar ANP nöronlarında tek likle kainat reseptörü antagonizmasında etkili olduğu be- başına kanal oluşturamayan GluK5 ile homomerik GluK1, lirlendi. NMDA reseptör antagonisti MK-801’in etkisiyle GluK2 veya GluK3 birimlerinin bir araya gelerek fonksiyo- de aktive olan nöron sayısının kontrol seviyesine geriledi- nel heteromerik kainat-seçici reseptörleri oluşturabileceği- ği tespit edildi. Antagonistlerin anlamlı bir şekilde aktive ni ya da düşük afiniteli homomerik fonksiyonel alt birim- olan ANP nöronu sayılarını azaltmaları, glutamatın ANP lerin (GluK1, GluK2 ve GluK3) kainat reseptör kompleksi nöronlarındaki düzenleyici etkisinin özgün olduğunu dü- oluşturabileceğini düşündürmektedir. Benzer şekilde ANP şündürmektedir. SON’nin, hem kendi içindeki glutama- nöronlarında eksprese edildiğini gösterdiğimiz GluA1 terjik nöronlardan hem de PVN, suprakiazmatik çekirdek veya GluA2 alt birimleri kendi başlarına ya da birlikte (SCN), ventromedial çekirdek (VMH), dorsomedial çekir- bulunarak fonksiyonel AMPA-seçici glutamat reseptörü dek (DMH), preoptik alan ve mamillar çekirdekte yerleşik oluşturabilirler. Dolayısıyla reseptörlerin ANP nöronla- glutamat nöronlarından innervasyon aldığı bildirilmiştir41. rında eksprese edildiklerinin belirlenmesi, bu nöronların Bizim yayınlanmamış verilerimizde bu alanlardan SON, glutamat tarafından direkt olarak regüle edilebileceğini PVN ve SCN’de yerleşik nöronların aktive olduklarının be- düşündürmektedir. Bu çalışmalarda floresan sinyalin hızlı lirlenmesi, ANP nöronlarının, agonistlere aktivasyon yanı- kaybolması nedeniyle kantitatif bir değerlendirmenin ya- tının oluşmasında bu alanlardaki glutamaterjik nöronlar- pılamaması önemli bir eksikliktir. Ancak bulgular, kanti- dan uyarı alıyor olabileceğini düşündürdü. tatif olmasa da ANP nöronlarında glutamat resptörlerinin Glutamaterjik nörotransmisyonda yer alan glutamatın etki sentezlenebildiğini göstermesi açısından önemlidir. mekanizması ile reseptörlerinin alt birim kompozisyonları Nörotransmitter glutamatın nöron gövdesinden akson hakkında pek çok çalışma vardır23,42. İn situ hibridizasyon sonlanmalarına aksonal taşınımında aracı olan veziküler tekniği kullanılarak elde edilen veriler, NMDA reseptör ai- glutamat taşıyıcı proteinler, sadece glutamaterjik nöron- lesinden GluN1’in, AMPA reseptör ailesinden GluA1’in ve larda bulunması açısından sinir bilimleri çalışmalarında kainat reseptör ailesinden GluK5 alt birim mRNA'larının glutamat nöronlarının spesifik işaretleyicisi olarak kulla- hipotalamusta en çok ve en yaygın bulunan alt birimler ol- nılmaktadır48-50. VGluT1, VGluT2 ve VGluT3 olmak üzere duğunu gösterirken; NMDA reseptör ailesinden GluN2C üç izoformu olan bu proteinlerin51 immünohistokimyasal ve GluN2D, AMPA reseptör ailesinden GluA3, GluA4 ve olarak işaretlenmesi sonucu glutamaterjik akson sonlan- kainat reseptör ailesinden GluK1, GluK2 ve GluK3 mR- maları butonlar şeklinde görülür52,53. VGluT immünohis- NA'larının daha az hücrede ve daha zayıf bir hibridizas- tokimyası yoğun olarak diğer nöronlara temas eden im- yon sinyaliyle bulunduğunu göstermiştir43. Northern blot münopozitif düğmeciklerin işaretlenmesi ve dolayısıyla analiziyle yapılan bir başka çalışmada da GluA1 ve GluA2 bu nöronların glutamaterjik innervasyon aldıklarının be- transkriptlerinin GluA3-4 ve GluK1-3 transkriptlerinden lirlenmesine yönelik kullanılmaktadır. Nöroendokrin sis- daha yüksek yoğunlukta bulunduğu bildirilmiştir44. İn situ temlerin düzenlenmesinde glutamaterjik innervasyonların hibridizasyon tekniğinin kullanıldığı bir diğer çalışmada belirlenmesinde de sıklıkla VGluT immünohistokimyası ise SON’deki kainat reseptör alt birimlerinin varlığı mRNA kullanılmaktadır54. c-Fos’u eksprese eden ANPerjik nöron- düzeyinde araştırılmış, GluK5’in çok yüksek GluK1’in ise ların VGluT içeren sonlanmalarla sinaptik temasta olma- düşük yoğunlukta eksprese edildiği gösterilmiştir. Aynı ları, glutamaterjik sistemin direkt olarak ANP nöronlarını çalışmada, AMPA reseptör alt birimlerinden GluA2’nin etkileyebileceğini göstermesi açısından önem taşımaktadır. orta yoğunlukta, GluA1 ve GluA3’ün düşük yoğunlukta Sonuç olarak; ANP nöronlarının glutamat agonistlerine eksprese edildiği bildirilmiştir43. Ancak literatürde ANP aktivasyon yanıtı vermeleri, üst merkezlerden ya da hipo- nöronlarının glutamaterjik uyarıları alması için gerekli talamus içerisinden gelen eksitatör glutamaterjik uyarıları olan glutamat reseptörlerini eksprese ettiklerine dair bir direkt veya internöronlar aracılığı ile, indirekt olarak algı- bilgi yoktur. Çalışma sonuçlarımız, non-NMDA glutamat layabilecek mekanizmaya sahip olduklarına işaret etmekte- reseptör proteinlerinin (AMPA reseptör alt birimlerinden dir. Bu nöronların fonksiyonel glutamat reseptörü oluştu- GluA1 ve GluA2, kainat reseptör alt birimlerinden GluK5 rabilecek AMPA ve kainat altbirimlerini sentezlediklerinin ve GluK1/2/3) supraoptik çekirdekte lokalize ANP nöron- saptanması ve üzerlerinde VGluT proteini içeren akson larınca sentezlendiğini göstermiştir. sonlanmalarının belirlenmesi, glutamatın ANP nöronları 79 Eyigor et al. 2020 üzerindeki düzenleyici etkisini direkt olarak da göstere- organ and neural systems involved in maintaining body bileceğini düşündürmektedir. Sonuçlar bütün olarak de- fluid homeostasis. Brain Res. Bull. 1985;15(6):595-601. ğerlendirildiğinde, organizmanın sıvı homeostazında glu- 12. Kawata M, Ueda S, Nakao K, et al. Immunohisto- tamaterjik sistemin ANP nöronları üzerinden önemli bir chemical demonstration of alpha-atrial natriuretic rolü olabileceği söylenebilir. İleri çalışmalarda, aktive olan containing neurons in the rat brain. Histochemistry ANP nöronlarında hangi reseptörlerin eksprese edildiği- 1985;83(1):1-3. nin üçlü işaretleme teknikleriyle gösterilmesi glutamatın 13. Saper CB, Hurley KM, Moga MM, et al. Brain natri- reseptör-spesifik etkilerinin belirlenmesi açısından önemli uretic peptides: Differential localization of a new fam- olacaktır. ily of neuropeptides. Neurosci. Lett. 1989;96(1);29-34. 14. Farina LE, Lipari D, Dieli F, et al. Atrial natriuretic pep- Teşekkür: Bu makalede yer alan laboratuvarımıza ait tide secretion during development of the rat supraop- sonuçlar, TÜBİTAK tarafından desteklenen 104S286 nolu tic nucleus. Eur. J. Histochem. 2005;49(4):379-384. proje kapsamında yapılan çalışmalardan elde edilmiştir. 15. Lipari EF, Lipari A, Dieli F, et al. ANP presence in the hypothalamic suprachiasmatic nucleus of developing Kaynaklar rat. Ital. J. Anat. Embryol. 2007;112(1):19-25. 1. de Bold AJ, Borenstein HB, Veress AT, et al. A rapid 16. Brann DW, Mahesh VB. Excitatory amino acids: and potent natriuretic response to intravenous in- function and significance in reproduction and neu- jection of atrial myocardial extract in rats. Life Sci. 1981;28(1):89-94. roendocrine regulation. Front. Neuroendocrinol. 2. Sudoh T, Kangawa K, Minamino N, et al. A new natri- 1994;15(1):3-49. uretic peptide in porcine brain. Nature 1988;332:78- 17. Brann DW, Zamorano PL, Chorich LP, et al. Steroid 81. hormone effects on NMDA receptor binding and 3. Sudoh T, Minamino N, Kangawa K, et al. C-type natri- NMDA receptor mRNA levels in the hypothalamus uretic peptide (CNP): a new member of natriuretic and cerebral cortex of the adult rat. Neuroendocrinol- peptide family identified in porcine brain. Biochem. ogy 1993;58(6):666-672. Biophys. Res. Commun. 1990;168(2):863-70. 18. Gereau RW, Swanson GT, eds. The Glutamate Recep- 4. Flynn, TG, de Bold ML, de Bold AJ. The amino acid se- tors. 1st ed. Totowa NJ: Humana Press; 2008. quence of an atrial peptide with potent diuretic and 19. Hollmann M, Heinemann S. Cloned glutamate recep- natriuretic properties. Biochem. Biophys. Res. Com- tors. Annu. Rev. Neurosci. 1994;17:31-108. mun. 1983;117(3):859-65. 20. Bettler B, Mulle C. Neurotransmitter receptors II. 5. Hodes A, Lichtstein D. Natriuretic hormones in brain AMPA and kainate receptors. Neuropharmacology function. Front. Endocrinol. 2014;5:1-13. 1995;34(2):123-139. 6. Edwards BS, Zimmerman RS, Schwab TR, et al. Atri- 21. Mori H, Mishina M. Structure and function of the al stretch, not pressure, is the principal determinant NMDA receptor channel. Neuropharmacology controlling the acute release of atrial natriuretic factor. 1995;34(10):1219-1237. Circ. Res. 1988;62(2):191-195. 22. Kew JN, Kemp JA. Ionotropic and metabotropic glu- 7. Tanaka I, Misono KS, Inagami T. Atrial natriuretic factor tamate receptor structure and pharmacology. Psycho- in rat hypothalamus, atria and plasma: determination pharmacology 2005;179(1):4-29. by specific radioimmunoassay. Biochem. Biophys. Res. 23. Niciu MJ, Kelmendi B, Sanacora G. Overview of glu- Commun. 1984;124(2):663-668. tamatergic neurotransmission in the nervous system. 8. Saavedra JM. Regulation of atrial natriuretic pep- Pharmacol Biochem Behav 2012;100(4):656-64. tide receptors in the rat brain. Cell Mol Neurobiol 24. Sagar SM, Sharp FR, Curran T. Expression of c-Fos pro- 1987;7(2):151-173. tein in brain: metabolic mapping at the cellular level. 9. Chriguera RS, Rocha MJA, Antunes-Rodriguesa J, et al. Science. 1988;240(4857):1328-1331. Hypothalamic atrial natriuretic peptide and secretion 25. Hoffman GE, Smith MS, Verbalis JG. c-Fos and related of oxytocin. Brain Res. 2001;889(1-2):239-242. immediate early gene products as markers of activity 10. Palkovits M, Eskay RL, Antoni FA. Atrial natriuretic in neuroendocrine systems. Front. Neuroendocrinol. peptide in the median eminence is of paraventricular 1993;14(3):173-213. nucleus origin. Neuroendocrinology 1987;46(6):542- 26. Eriksson M, Ceccatelli S, Uvnäs-Moberg K, et al. Expres- 544. sion of Fos-related antigens, oxytocin, dynorphin and 11. Johnson AK. The periventricular anteroventral third galanin in the paraventricular and supraoptic nuclei of ventricle (AV3V): its relationship with the subfornical lactating rats. Neuroendocrinology 1996;63:356-367. 80 Eyigor et al. 2020 27. Paxinos G, Watson C, eds. The rat brain in stereotax- supraoptic nucleus area of the rat hypothalamus. Eur. ic coordinates. 6th edition, Elsevier Academic Press, J. Neurosci. 2002; 16(1);55-68. Amsterdam; 2009. 42. Malarkey EB, Parpura V. Mechanisms of glutamate 28. Gutkowska J, Antunes-Rodrigues J, McCann SM. Atri- release from astrocytes. Neurochem. Int. 2008;52(1- al natriuretic peptide in the brain and pituitary gland. 2):142-154. Physiol. Rev. 1997;77(2):465-515. 43. Eyigor O, Centers A, Jennes L. Distribution of iono- 29. McCann SM, Antunes-Rodrigues J, Jankowski M, et tropic glutamate receptor subunit mRNAs in the rat al. Oxytocin, vasopressin and atrial natriuretic pep- hypothalamus. J. Comp. Neurol. 2001;434(1):101-124. tide control body fluid homeostasis by action on their 44. van den Pol AN, Hermans-Borgmeyer I, Hofer M, et receptors in brain, cardiovascular system and kidney. al. Ionotropic glutamatereceptor gene expression in Prog. Brain Res. 2002;139:309-328. hypothalamus: localization of AMPA kainate and 30. Chriguer RS, Rocha MJ, Antunes-Rodrigues J, et al. NMDA receptor RNA with in situ hybridization. J. Hypothalamic atrial natriuretic peptide and secretion Comp. Neurol. 1994;343(3):428-44. of oxytocin. Brain Res. 2001;889(1-2):239-242. 45. Monyer H, Sprengel R, Schoepfer R, et al. Heteromeric 31. Gutkowska J, Antunes-Rodrigues J, McCann SM. Atrial NMDA receptors: molecular and functional distinc- natriuretic peptide in brain and pituitary gland. Physi- tion of subtypes. Science 1992;256(5060):1217-1221. ol. Rev. 1997;77(2):465-515. 46. Howe JR. Homomeric and heteromeric ion channels 32. Lauand F, Ruginsk SG, Rodrigues HLP, et al. Glucocor- formed from the kainatetype subunits GluR6 and KA2 ticoid modulation of atrial natriuretic peptide, oxyto- have very small, but different, unitary conductances. J. cin, vasopressin and Fos expression in response to os- Neurophysiol.1996;76(1):510-519. motic, angiotensinergic and cholinergic stimulation. 47. Alt A, Weiss B, Ogden AM, et al. Pharmacological Neuroscience 2007;147(1):247-57. characterization of glutamatergic agonists and antag- 33. Ku YH, Zhang T. Brain atriopeptin mediates AV3V de- onists at recombinant human homomeric and hetero- pressor response. Peptides 1994;15(6):1053-1056. meric kainate receptors in vitro. Neuropharmacology 34. Ku YH, Li YH. Inhibitory effect of atriopeptinergic 2004;46(6):793-806. neurons in AV3V region on AngiotensinII pressor sys- 48. Takamori S, Rhee JS, Rosenmund C, et al. Identifi- tem in rat brain. Peptides 2004;25(4):615-620. cation of a vesicular glutamate transporter that de- 35. Hoffman GE, Smith MS, Verbalis JG. c-Fos and related fines a glutamatergic phenotype in neurons. Nature immediate early gene products as markers of activity 2000;407(6801):189-94. in neuroendocrine systems. Front. Neuroendocrinol 49. Moriyama Y, Yamamoto A. Glutamatergic chemical 1993;14(3):173-213. transmission: Look! Here, There, and anywhere. J. Bio- 36. Minbay FZ, Eyigor O, Cavusoglu I. Kainic acid activates chem. 2004;135(2):155-63. oxytocinergic neurons through non-NMDA gluta- 50. Takamori S. VGLUTs: 'Exciting' Times for Glutamater- mate receptors. Int. J. Neurosci. 2006;116(5):587-600. gic Research?. Neurosci Res 2006; 55(4):343-351. 37. Eyigor O, Minbay Z, Cavusoglu I. Activation of orexin 51. Liguz-Lecznar M, Skangiel-Kramska J. Vesicular Glu- neurons through non-NMDA glutamate receptors ev- tamate Transporters (VGLUTs): the Three Musketeers idenced by c-Fos immunohistochemistry. Endocrine of Glutamatergic System. Acta Neurobiol. Exp. (Wars) 2010;37(1):167-72. 2007;67(3):207-18. 38. Eyigor O, Minbay Z, Kafa IM. Glutamate and Orexin 52. Kaneko T, Fujiyama F. Complementary distribution of Neurons. Vitam. Horm: Sleep Hormones 2012;89:209- vesicular glutamate transporters in the central nervous 222. system. Neurosci. Res. 2002;42(4):243-250. 39. Serter Kocoglu S, Gok Yurtseven D, Minbay FZ, et al. 53. Kaneko T, Fujiyama F, Hioki H. Immunohistochem- Glutamatergic activation of neuronostatin neurons ical localization of candidates for vesicular gluta- in the periventricular nucleus of the hypothalamus. mate transporters in the rat brain. J. Comp. Neurol. Brain Sci. 2020;10(4);217. 2002;444(1):39-62. 40. Gok Yurtseven D, Serter Kocoglu S, Minbay Z, et al. 54. Hisano S, Nogami H. Transporters in the neurohypoph- Immunohistochemical evidence for glutamatergic ysial neuroendocrine system, with special reference to regulation of nesfatin-1 neurons in the rat hypothala- vesicular glutamate transporters (BNPI and DNPI): a mus. Brain Sci. 2020;10(9):630. Review. Microsc. Res. Tech. 2002;56(2):122-131. 41. Csaki A, Kocsis K, Kiss J, et al. Localization of putative glutamatergic/aspartatergic neurons projecting to the 81