POLİELEKTROLİT NANOLİPOZOMLAR İLE HAVLICAN (Alpinia officinarum HANCE) EKSTRAKTININ ENKAPSÜLASYONU, KARAKTERİZASYONU VE BİYOER İŞİLEBİLİRLİĞİNİN ANALİTİK YÖNTEMLER İLE A RAŞTIRILMASI İlkyaz PATIR T.C. BURSA ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ POLİELEKTROLİT NANOLİPOZOMLAR İLE HAVLICAN (Alpinia officinarum HANCE) EKSTRAKTININ ENKAPSÜLASYONU, KARAKTERİZASYONU VE BİYOERİŞİLEBİLİRLİĞİNİN ANALİTİK YÖNTEMLER İLE ARAŞTIRILMASI İlkyaz PATIR 0000-0002-3503-2550 Prof. Dr. Saliha ŞAHİN (Danışman) YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI BURSA – 2023 Her Hakkı Saklıdır TEZ ONAYI İlkyaz PATIR tarafından hazırlanan “POLİELEKTROLİT NANOLİPOZOMLAR İLE HAVLICAN (Alpinia officinarum HANCE) EKSTRAKTININ ENKAPSÜLASYONU, KARAKTERİZASYONU VE BİYOERİŞİLEBİLİRLİĞİNİN ANALİTİK YÖNTEMLER İLE ARAŞTIRILMASI” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Başkan : Prof. Dr. Saliha ŞAHİN İmza 0000-0003-2887-5688 Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Prof. Dr. Asım OLGUN İmza 0000-0002-0657-334X Bursa Uludağ Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Burcu BEKDEŞER İmza 0000-0003-4555-2434 İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa, Mühendislik Fakültesi, Kimya Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Hüseyin Aksel EREN Enstitü Müdürü ../../…. i B.U.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü tez yazım kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında; - tez içindeki bütün bilgi ve belgeleri akademik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi, - görsel, işitsel ve yazılı tüm bilgi ve sonuçları bilimsel ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu, - başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda ilgili eserlere bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunduğumu, - atıfta bulunduğum eserlerin tümünü kaynak olarak gösterdiğimi, - kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapmadığımı, - ve bu tezin herhangi bir bölümünü bu üniversite veya başka bir üniversitede başka bir tez çalışması olarak sunmadığımı beyan ederim. …/…/……… İlkyaz PATIR ii TEZ YAYINLANMA FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI Enstitü tarafından onaylanan lisansüstü tezin/raporun tamamını veya herhangi bir kısmını, basılı (kâğıt) ve elektronik formatta arşivleme ve aşağıda verilen koşullarla kullanıma açma izni Bursa Uludağ Üniversitesi’ne aittir. Bu izinle Üniversiteye verilen kullanım hakları dışındaki tüm fikri mülkiyet hakları ile tezin tamamının ya da bir bölümünün gelecekteki çalışmalarda (makale, kitap, lisans ve patent vb.) kullanım hakları tarafımıza ait olacaktır. Tezde yer alan telif hakkı bulunan ve sahiplerinden yazılı izin alınarak kullanılması zorunlu metinlerin yazılı izin alınarak kullandığını ve istenildiğinde suretlerini Üniversiteye teslim etmeyi taahhüt ederiz. Yükseköğretim Kurulu tarafından yayınlanan “Lisansüstü Tezlerin Elektronik Ortamda Toplanması, Düzenlenmesi ve Erişime Açılmasına İlişkin Yönerge” kapsamında, yönerge tarafından belirtilen kısıtlamalar olmadığı takdirde tezin YÖK Ulusal Tez Merkezi / B.U.Ü. Kütüphanesi Açık Erişim Sistemi ve üye olunan diğer veri tabanlarının (Proquest veri tabanı gibi) erişimine açılması uygundur. iii ÖZET Yüksek Lisans Tezi POLİELEKTROLİT NANOLİPOZOMLAR İLE HAVLICAN (Alpinia officinarum HANCE) EKSTRAKTININ ENKAPSÜLASYONU, KARAKTERİZASYONU VE BİYOERİŞİLEBİLİRLİĞİNİN ANALİTİK YÖNTEMLER İLE ARAŞTIRILMASI İlkyaz PATIR Bursa Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Galangin yüksek antioksidan aktivitesi ve geniş biyolojik spektrumu sebebiyle dünyanın çeşitli bölgelerinde yüzyıllardır ilaç olarak kullanılan Alpinia officinarum Hance bitkisinin temel bileşenidir. Yüksek biyoaktivitesinin yanında zayıf çözünürlüğü ve oksidatif kararsızlığından dolayı düşük biyoerişilebilirliğe ve biyoyararlanıma sahiptir. Bu sorunun üstesinden gelmek ve galanginin biyoerişilebilirliğini arttırabilmek için galangin yüklü polielektrolit lipozomlar geliştirilmiştir. Öncelikle Alpinia officinarum Hance rizomlarından galangin ekstraksiyonu gerçekleştirilerek HPLC-DAD ile ekstraktın fenolik bileşik profili ve içeriği belirlenmiştir. Spektroskopik yöntemler kullanılarak ekstraktın toplam fenolik madde içeriği, flavonoid içeriği ve toplam antioksidan kapasitesi belirlenmiştir. Kemometrik optimizasyon yöntemlerinden RSM-CCD kullanılarak maksimum enkapsülasyon etkinliğinde lipozomlar üretebilmek için optimum koşullar belirlenmiştir. Optimizasyon sonucunda lipozomlar %93,77 enkapsülasyon etkinliği ile üretilmiştir. Elde edilen optimum lipozomların yüzeyi kitosan ve gam arabik ile modifiye edilmiştir. Elde edilen polielektrolit lipozomların in vitro simüle vücut sıvısında salım davranışı ve kinetik modeli, in vitro gastrointestinal sistemde salım davranışı, biyoerişilebilirliği ve stabilitesi incelenmiştir. Çalışmalar sonunda geliştilen lipozomal sistemin galanginin biyoerişilebilirliğini 3 kat arttırdığı belirlenmiştir. Ayrıca geliştirilen sistemin simüle fizyolojik sıvıda ve simüle gastrointestinal koşullarda galangini koruduğu tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Galangin, lipozom, katman-katman kaplama, biyoerişilebilirlik, optimizasyon 2023, xii + 122 sayfa. iv ABSTRACT MSc Thesis INVESTIGATION OF ENCAPSULATION, CHARACTERIZATION AND BIOACCESSIBILITY OF LESSER GALANGAL (Alpinia officinarum HANCE) EXTRACT WITH POLYELECTROLITE NANOLIPOSOMES BY ANALYTICAL METHODS İlkyaz PATIR Bursa Uludağ University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Saliha ŞAHİN Galangin is the main constituent of Alpinia officinarum Hance, which has been used as a medicine for centuries in various parts of the world due to its high antioxidant activity and broad biological spectrum. Despite its high bioactivity, it has low bioaccessibility and bioavailability due to its poor solubility and oxidative instability. To overcome this problem and to increase the bioaccessibility of galangin, galangin-loaded polyelectrolyte liposomes were developed. Firstly, galangin was extracted from Alpinia officinarum Hance rhizomes and the phenolic compound profile and content of the extract were determined by HPLC-DAD. Total phenolic content, flavonoid content and total antioxidant capacity of the extract were determined by spectroscopic methods. Optimum conditions were determined to produce liposomes with maximum encapsulation efficiency using RSM-CCD, one of the chemometric optimisation methods. As a result of the optimisation, liposomes were produced with 93.77% encapsulation efficiency. The surface of the obtained optimum liposomes was modified with chitosan and gum arabic. The release behaviour and kinetic model of the obtained polyelectrolyte liposomes in vitro simulated body fluid, release behaviour in vitro gastrointestinal system, bioaccessibility and stability were investigated. At the end of the studies, it was determined that the developed liposomal system increased the bioaccessibility of galangin 3-fold. In addition, it was determined that the developed system protects galangin in simulated physiological fluid and simulated gastrointestinal conditions. Key words: Galangin, liposome, layer-by-layer deposition, bioaccessibility, optimization 2023, xii + 122 pages. v TEŞEKKÜR Lisans ve yüksek lisans eğitimim boyunca her anlamda bana danışmanlık yapan, tecrübeleri, deneyimleri ve bilimsel yaklaşımıyla bana yeni kapılar açan ve yol gösteren sevgili danışman hocam Prof. Dr. Saliha ŞAHİN’e teşekkürlerimi sunarım. Lisans ve yüksek lisans eğitimimde her konuda akademik ve teknik desteğini esirgemeyen Doç. Dr. Önder AYBASTIER ve Doç. Dr. Aslı GÖÇENOĞLU SARIKAYA’ya teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmam süresince bilgi birikimini ve tecrübelerini esirgemeyen Dr. Büşra Karkar’a ve değerli Kromatografi Araştırma Grubu’ndaki çalışma arkadaşlarım, Yüksek Kimyager Gizem BAYAÇLI, Elif TÜLEK, Serenay EYÜBOĞLU’na teşekkürlerimi sunarım. Tüm yaşantım ve eğitim hayatım boyunca en büyük idolüm ve bulunduğum noktaya gelmemdeki en büyük destekçim olan sevgili amcam Prof. Dr. Süleyman PATIR’a ve her konuda beni destekleyen ve arkamda duran sevgili aileme teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmamı FGA-2023-837 kodlu proje kapsamında destekleyen Bursa Uludağ Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri birimine teşekkür ederim. İlkyaz PATIR …/…/……. vi İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET .......................................................................................................................... iv ABSTRACT ............................................................................................................... v TEŞEKKÜR ............................................................................................................... vi SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ................................................................ ix ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................... xi ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................... xii 1. GİRİŞ ..................................................................................................................... 1 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI ................................ 3 2.1. Alpinia officinarum Hance .................................................................................. 3 2.2. Galangin .............................................................................................................. 13 2.3. Enkapsülasyon ..................................................................................................... 18 2.4. Lipozom .............................................................................................................. 20 2.4.2. Lipozomların sınıflandırılması ......................................................................... 26 2.4.3. Lipozom hazırlama yöntemleri ........................................................................ 29 2.4.5. Lipozomların avantajları ve dezavantajları ...................................................... 37 2.5. Katman Katman (LbL) Biriktirme Yöntemi ....................................................... 39 3. MATERYAL ve YÖNTEM ................................................................................... 42 3.1. Materyal .............................................................................................................. 42 3.1.1. A. officinarum rizomu ...................................................................................... 42 3.1.2. Tez kapsamında kullanılan cihazlar ................................................................. 42 3.1.3. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar ........................................................... 44 3.1.4. Tez kapsamında kullanılan sarf malzemeler .................................................... 45 3.1.5. Tez kapsamında kullanılan çözeltiler ............................................................... 46 3.2. Yöntem ................................................................................................................ 48 3.2.1. A. officinarum rizomlarından galangin ekstraksiyonu ..................................... 48 3.2.2. Kromatografik analiz ....................................................................................... 48 3.2.3. Spektroskopik analizler .................................................................................... 49 3.2.4. Kemometrik analizler ....................................................................................... 51 3.2.5. Galangin yüklü lipozomların hazırlanması ...................................................... 55 3.2.7. Galangin yüklü lipozomların kitosan-gam arabik ile modifiye edilmesi ......... 55 3.2.8. Lipozomların karakterizasyonu ........................................................................ 57 3.2.9. In vitro ilaç salım çalışması .............................................................................. 58 3.2.10. İlaç salım kinetiği ........................................................................................... 58 3.2.11. In vitro gastro-intestinal sindirim çalışması ................................................... 61 3.2.12. Biyoerişilebilirlik çalışması ........................................................................... 61 3.2.13. Depolama stabilitesi ....................................................................................... 62 4. BULGULAR ve TARTIŞMA ................................................................................ 63 4.1. A. officinarum Ekstraktında Bulunan Fenolik Maddelerin Analizi .................... 63 4.2. Spektroskopik Analizler ...................................................................................... 66 4.3. Kemometrik Analizler ......................................................................................... 68 4.4. Lipozomların Karakterizasyonu .......................................................................... 77 4.5. In vitro İlaç Salım Çalışması ............................................................................... 83 4.6. İlaç Salım Kinetiği .............................................................................................. 85 4.7. In vitro Gastrointestinal Sindirim Çalışması ....................................................... 90 4.8. Biyoerişilebilirlik Çalışması ................................................................................ 94 v ii 5. SONUÇ ................................................................................................................ 101 KAYNAKLAR ........................................................................................................ 104 ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................... 121 v iii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama °C Santigrat derece A Absorbans cal Kalori cm Santimetre dk Dakika g Gram kg Kilogram L Litre M Molarite m Metre mg Miligram mL Mililitre mM Milimolar mm Milimetre mV Milivolt N Normalite nm Nanometre ppm Milyonda bir kısım R2 Korelasyon katsayısı sa Saat t Zaman y Yanıt α Alfa β Beta µg Mikrogram µL Mikrolitre µm Mikrometre μM Mikromolar ix Kısaltmalar Açıklama ABTS 2,2-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit) AFM Atomik kuvvet mikroskobu ANOVA Varyans analizi AO Alpinia officinarum Hance CCD Merkezi Kompozit Dizayn CH Kitosan CHOL Kolesterol DF Serbestlik derecesi DLS Dinamik ışık saçılımı DSC Diferansiyel taramalı kalorimetri FE-SEM Alan Emisyonlu Taramalı elektron mikroskobu FTIR Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi GA Galangin GAE Gallik asit eşdeğeri GUA Gam arabik GUV Dev unilamellar veziküller HPLC-DAD Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi-Diod Serili Dedektör IC50 Yarı maksimum inhibisyon konsantrasyonu LBL Katman katman biriktirme yöntemi LOD Tespit sınırı LOQ Tayin sınırı LUV Büyük unilamellar veziküller MLV Multilamellar veziküller MS Ortalamaların karesi MVV Multivesiküler veziküller O Optimum OLV Oligolamellar veziküller PBS Fosfat tamponlu salin PC L-α-Fosfatidilkolin PDI Polidispersite indeksi PEG Polietilen glikol PVDF Poliviniliden florür QE Kuersetin eşdeğeri RE Rutin eşdeğeri RSM Yanıt Yüzey Metodolojisi SGF Simüle mide sıvısı SIF Simüle bağırsak sıvısı SS Karelerin toplamı SUV Küçük ünilamellar veziküller TE Troloks eşdeğeri TEM Geçirimli elektron mikroskobu TGA Termogravimetrik analiz ULV Unilamellar veziküller UV-GB Ultraviyole/Görünür bölge XRD X-ışını kırınımı x ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. A. officinarum kısımları ................................................................... 3 Şekil 2.2. A. officinarum kısımları ................................................................... 4 Şekil 2.3. A. officinarum fenolik bileşikleri ..................................................... 7 Şekil 2.3. A. officinarum fenolik bileşikleri (Devam) ...................................... 8 Şekil 2.3. A. officinarum fenolik bileşikleri (Devam) ...................................... 9 Şekil 2.3. A. officinarum fenolik bileşikleri (Devam) ...................................... 10 Şekil 2.4. Enkapsülasyon işlemi ....................................................................... 18 Şekil 2.5. Enkapsülasyon ile elde edilen partikül sistemleri ............................ 19 Şekil 2.6. İlk gözlemlenen lipozomlar ............................................................. 20 Şekil 2.7. Lipozom ve lipozomların yapısal bileşeni ....................................... 21 Şekil 2.8. Fosfolipitlerin etkileşimleri .............................................................. 22 Şekil 2.9. Kolesterol ve fosfolipitlerin etkileşimi ............................................ 22 Şekil 2.10. Lipozomların oluşumu ..................................................................... 23 Şekil 2.11. Lipozomların sınıflandırılması ......................................................... 28 Şekil 2.12. İnce film hidrasyon yöntemi ............................................................ 30 Şekil 2.13. Ters faz buharlaştırma yöntemi ....................................................... 31 Şekil 2.14. Solvent enjeksiyon yöntemi ............................................................. 32 Şekil 2.15. Deterjan diyalizi yöntemi ................................................................. 33 Şekil 2.16. LbL yöntemi ile film oluşumu ......................................................... 40 Şekil 2.17. LbL yönteminin lipozomlara uygulanması ...................................... 41 Şek}l 3.1. Galang}n yüklü l}pozomların hazırlanması ...................................... 55 Şek}l 3.2. Galang}n yüklü l}pozomların mod}f}ye ed}lmes} ............................. 56 Şekil 4.1. A. officinarum ekstraktının HPLC-DAD kromatogramı .................. 63 Şekil 4.2. Enkapsülasyon etkinliğine PC ve CHOL etkisi ............................... 72 Şekil 4.3. Enkapsülasyon etkinliğine PC ve GA etkisi .................................... 73 Şekil 4.4. Enkapsülasyon etkinliğine CHOL ve GA etkisi .............................. 74 Şekil 4.5. Lipozomların FE-SEM görüntüleri .................................................. 78 Şekil 4.6. Lipozomların FTIR spektrumu ........................................................ 82 Şekil 4.7. Lipozomların ilaç salım grafiği ........................................................ 83 Şekil 4.8. O-Lipozom kinetik model grafikleri ................................................ 85 Şekil 4.8. O-Lipozom kinetik model grafikleri (Devam) ................................. 86 Şekil 4.9. CH-Lipozom kinetik model grafikleri ............................................. 86 Şekil 4.9. CH-Lipozom kinetik model grafikleri (Devam) .............................. 87 Şekil 4.10. GUA-CH-Lipozom kinetik model grafikleri ................................... 88 Şekil 4.10. GUA-CH-Lipozom kinetik model grafikleri (Devam) .................... 89 Şekil 4.11. Kümülatif galangin salım grafiği ..................................................... 90 Şekil 4.12. Kontrol ve lipozomlarda galanginin biyoerişilebilirlik yüzdesi ...... 94 Şekil 4.13. Stabilite çalışması 0. gün ................................................................. 96 Şekil 4.14. Stabilite çalışması 1. gün ................................................................. 97 Şekil 4.15. Stabilite çalışması 7. gün ................................................................. 97 Şekil 4.16. Stabilite çalışması 14. gün ............................................................... 98 Şekil 4.17. Stabilite çalışması 21. gün ............................................................... 99 Şekil 4.18. Stabilite çalışması 28. gün ............................................................... 99 xi ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. A. officinarum taksonomisi ............................................................. 3 Çizelge 2.2. A. officinarum aktiviteleri ............................................................. 11 Çizelge 2.3. Galangin’in fiziksel ve kimyasal özellikleri ................................... 13 Çizelge 2.4. Galangin için kullanılan taşıyıcı sistemler ...................................... 16 Çizelge 2.5. Lipozom hazırlama yöntemleri ....................................................... 29 Çizelge 2.6. Lipozom karakteristiği ve karakterizasyon teknikleri ..................... 34 Çizelge 3.1. Kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları ....................................... 42 Çizelge 3.1. Kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları (Devam) ........................ 43 Çizelge 3.2. Kullanılan kimyasallar .................................................................... 44 Çizelge 3.2. Kullanılan kimyasallar (Devam) ..................................................... 45 Çizelge 3.3. Çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler ........................................ 45 Çizelge 3.4. HPLC-DAD gradient hareketli faz programı .................................. 48 Çizelge 3.5. Folin-Ciocalteu yöntemi için kalibrasyon verileri .......................... 49 Çizelge 3.6. ABTS yöntemi için kalibrasyon verileri ......................................... 50 Çizelge 3.7. Toplam flavonoid analizi için kalibrasyon verileri ......................... 50 Çizelge 3.8. CCD için faktörler ve kodlanmış seviye değerleri .......................... 52 Çizelge 3.9. CCD çizelgesi ................................................................................. 53 Çizelge 4.1. A. officinarum ekstraktının HPLC analizi verileri .......................... 63 Çizelge 4.2. A. officinarum ekstraktının spektroskopik analiz sonuçları ............ 66 Çizelge 4.3. Deneysel ve tahmini enkapsülasyon etkinliği yüzdeleri ................. 69 Çizelge 4.4. Lipozom üretimi için ANOVA analizi verileri ............................... 70 Çizelge 4.5. İkinci derece polinom denklemi ...................................................... 70 Çizelge 4.6. Lipozom üretimi için optimum koşullar ......................................... 75 Çizelge 4.7. Lipozom üretimi için tahmini ve deneysel değerler ....................... 75 Çizelge 4.8. Lipozomların hidrodinamik çap verileri ......................................... 77 Çizelge 4.9. Lipozomların boyut verileri ............................................................ 78 Çizelge 4.11. Lipozomların zeta potansiyel verileri ............................................. 80 Çizelge 4.12. Lipozomların polidispersite indeksi verileri ................................... 81 x ii 1. GİRİŞ Fenolik bileşikler binlerce farklı yapıda çeşitlilik gösteren sekonder bitki metabolitleridir. Genellikle bitkiler tarafından enfeksiyon, radyasyon gibi çeşitli stres koşullarında üretilirler. Fenolik bileşikler yapılarında en az bir fenol grubu içerir. Bu fenol grubu, bir veya daha fazla hidroksil grubuna sahip aromatik bir halkadan oluşur. Fenolik bileşikler sahip oldukları yapı itibariyle güçlü antioksidan özellikler gösterirler. Yüksek antioksidan aktiviteleri sebebiyle serbest radikal süpürme özellikleri kanser, kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar gibi kronik ve oksidatif strese bağlı bozuklukların önlenmesine yardımcı olur. Ayrıca antimikrobiyal, anti-inflamatuvar, antikanser ve kardiyoprotektif aktiviteler gibi antioksidan kapasiteleri ile ilgili başka biyolojik etkilere de sahiptirler. Bununla birlikte, fenolik maddelerin çoğu, özellikle lipofilik olanlar, moleküler ve fizikokimyasal özelliklerine bağlı olarak vücutta düşük seviyelerde çözünürlük, stabilite, biyoyararlanım ve hedef doku özgüllüğüne sahiptir. Ayrıca, her bir fenolik madde sınıfı farklı kimyasal yapılara, çözünürlüğe ve oksidasyon duyarlılığına sahiptir. Fenolik bileşiklerin biyoerişilebilirliği ve biyoyararlanımı, biyofonksiyonel özelliklerinin ve olası faydalı etkilerinin göstergesi olarak kabul edilir. Fenolik bileşiklerden daha fazla yararlanma için gastrointestinal sindirim sırasında biyoaktif bileşiklerin salınımı ve çözünürlüğü için bir ipucu olarak biyoerişilebilirlik, biyoyararlanım için önemli bir faktördür. Örneğin, kurkumin, kuersetin, rutin veya polimetoksile flavonoidler gibi lipofilik biyoaktif maddelerin biyoyararlanımı, zayıf çözünürlükleri, yüksek erime noktaları ve kimyasal kararsızlıkları nedeniyle sınırlıdır. Fenolik bileşiklerin suda düşük çözünürlükleri ve biyoyararlanımlarının sistemik yoldan uygulanmalarını sınırlandırdığı düşünüldüğünde, uygun taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi klinik terapötikler için büyük önem taşımaktadır. Biyoaktif bileşenlerin biyoerişilebilirliğini ve biyoyararlanımını arttırmak için, moleküllerin kimyasal modifikasyonları, dozaj formülasyonları, diğer diyet bileşenleri ile kombinasyon ve bunların mikro/nano partikül taşıyıcı sistemlerine dahil edilmesi dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanılmaktadır. Bu yaklaşımlar arasında enkapsülasyon en popüler ve en uygulanabilir olanıdır. Enkapsülasyon, nanometre ile milimetre boyutlarında kapsüller 1 oluşturmak için bir duvar malzemesi ile aktif bileşenleri korumak için kullanılan bir teknolojidir. Enkapsülasyon ile fenolik bileşiklerin depolama sırasında ısı, ışık, nem ve oksijen gibi dış ortamdan kaynaklanan faktörler sebebi ile bozulması önlenir, çözünürlüğü arttırılır, gastrointestinal sistemde stabil kalması sağlanır ve sonuçta biyoerişilebilirliğini ve biyoyararlanımını arttırılır. Bu tez çalışmasında yüksek antioksidan aktiviteye ve geniş biyolojik spektruma sahip ancak düşük çözünürlük ve yüksek hidrofobiklik, oksidatif kararsızlık gibi dezavantajları nedeniyle vücutta düşük biyoerişilebilirliğe ve dolayısıyla düşük biyoyararlanıma sahip olan galangin için lipozomal bir taşıyıcı sistemin geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu doğrultuda Alpinia officinarum Hance bitkisinden galangin ekstraksiyonu gerçekleştirilerek kemometrik optimizasyon teknikleri ile maksimum enkapsülasyon etkinliğinde polielektrolit lipozomlar geliştirilmiştir. Elde edilen polielektrolit lipozomlardaki galanginin biyoerişilebilirliği simüle gastrointestinal koşullarda incelenmiştir. 2 2. KURAMSAL TEMELLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Alpinia officinarum Hance Alpinia officinarum Hance (A. officinarum), Zingiberaceae familyasına ait çok yıllık tıbbi bitkidir (Çizelge 2.1) (Dixit vd., 2014). Çin’e özgü bir bitki olan A. officinarum günümüzde Hindistan, Vietnam, Tayland gibi uzak doğu ülkelerinde yaygın olarak yetiştirilmektedir (Gomaa vd., 2022; Kadam vd., 2022). A. officinarum Çin’de ‘Gao linang jiang’, Hindistan’da ‘Chitrarathai chooranam’, İran’da ‘Khoulanjan’, Japonya’da ‘Ryokyo’, Fas’ta ‘Khoudenjal’, Tayland’da ‘Kha Ling’, Fransa’da ‘Petite galangal’, Hollanda’da ‘Galanga’ ve Türkiye’de ‘Havlıcan’ olarak bilinir (Abubakar vd., 2018). Çizelge 2.1. A. officinarum taksonomisi Alem Plantae Şube Tracheophyta Sınıf Liliopsida Takım Zingiberales Familya Zingiberaceae Cins Alpinia Tür Alpinia officinarum Hance Erişim Tarihi: 26.05.2023 (https://sterpaglie.wordpress.com/alpinia-officinarum-hance/) Şekil 2.1. A. officinarum kısımları 3 A. officinarum bitkisi yaklaşık 2 m yüksekliğindedir (Şekil 2.1). Çiçekler kısa, basit terminal başaklardır, tübüler kaliks ve üç lobdan oluşan beyaz korollaya sahiptir. Kırmızı damarlı büyük oval bir labellum vardır. Her çiçekte anter taşıyan tek bir stamen ve alt yumurtalıklı bir pistil ve ince bir stil bulunur. Yapraklar paralel, düz damarlı, keskin, yaklaşık 30 cm uzunluğunda ve 5-10 cm genişliğindedir (Attokaran, 2017). Rizomlar koyu kırmızımsı kahverengi renge sahiptir (Koçak ve Yılmaz, 2022; Wilson, 2015). İç kısımda koyu renkli bir merkez, daha geniş, soluk renkli bir katmanla çevrilidir ve bu katman kurudukça koyulaşır (Şekil 2.2). Kokusu aromatik, tadı ise keskindir (Lim, 2016). Erişim Tarihi: 26.05.2023 (https://www.amaperbene.it/galanga-alpinia-officinarum- hance/) Şekil 2.2. A. officinarum kısımları 4 A. officinarum hem Ayurveda hem de Çin tıbbında çok eski zamanlardan beri (Çin’de MS 500) ve Avrupa’da Orta Çağ’dan beri kullanılmaktadır (Kadam vd., 2022). A. officinarum rizomu, Çin’de ilk kez (MS 500 civarı) Ünlü Hekimlerin Ek Kayıtları (Ming Yi Bie Lu) ve Çin Farmakopesi’nin çeşitli baskılarında ilaç olarak kaydedilmiştir (Zhou vd., 2018). Güney Afrika, Asya ve Avrupa’da da yüzyıllardır baharat ve ilaç olarak bilinmektedir (Ye vd., 2019). Rizomun esas olarak sindirim sistemi üzerinde etkili olan, aynı zamanda ağrıyı dindiren, ateşi düşüren ve bakteri ve mantar enfeksiyonlarını kontrol eden çok etkili bir bitki olduğu bildirilmektedir (Lim, 2016). A. officinarum geleneksel Çin tıbbında karın ağrısı, kusma ve hıçkırığın yanı sıra ishal için kullanılır. Hindistan ve güneybatı Asya’da midevi, antienflamatuar, balgam söktürücü ve sinir toniği olarak kabul edilir. Hıçkırık, hazımsızlık, mide ağrısı, romatoid artrit ve ateş tedavisinde kullanılır. Batı’da ise çoğunlukla gaz, hazımsızlık, kusma ve mide ağrısı için kullanılır. Ağız ülserlerini ve diş eti ağrılarını hafifletmek için infüzyonu önerilir (Chevallier, 2016). Vietnam’da haşlanmış rizomdan elde edilen meyve suyu sindirimi uyarmak, mide ağrısı ve sıtmayı tedavi etmek için kullanılır (Hanh ve Binh, 2014). Şarap veya sirke içinde ezilmiş rizom, saçkıran cilt enfeksiyonları için topikal olarak kullanılır (Lim, 2016). Türkiye’de topikal hemostatik ajan olarak onaylanan Ankaferd kan durdurucunun bitkisel bileşenlerinden biridir. İlaç olarak kullanımının yanı sıra birçok Asya ve Avrupa ülkesinde baharat ve yiyeceklerde aroma verici olarak da kullanılmaktadır. Rusya’da sirke ve yerel bir likör olan nastoikayı tatlandırmak için, Hindistan’da ise parfümlerde ayrıca meyve ve sebzelerde koruyucu olarak kullanılır (Abubakar vd., 2018). Indrayan vd. (2009) tarafından A. officinarum rizomlarının besin içeriği enerji 348,9 cal/100 g, nem %12,4, ham protein %5,25, karbohidrat %76,9, ham yağ %2,26, ham lif %17, kül %3,22, K 3570 ppm, Ca 438,8 ppm, Na 152,8 ppm, Mg 569,5 ppm, Fe 85,50 ppm, Mn 72,30 ppm, Zn 9,331 ppm, Cu 0,753 ppm, Ni 21,02 ppm ve Cr 0,680 ppm olarak belirlenmiştir (Lim, 2016). A. officinarum aynı zamanda karbohidratlar, alkaloidler, glikozitler, fenolik bileşikler, proteinler, serbest amino asitler, saponinler, terpenoidler, tanenler ve steroidlerin varlığı ile geniş bir içeriğe sahiptir (Dixit vd., 2014; Srividya vd., 2010). Bitkinin en aktif kısmı rizomudur (Koçak ve Yılmaz, 2022). A. officinarum rizomu fenolik bileşikler, diarilheptanoidler ve uçucu yağlar açısından zengindir ve flavonoidler temel bileşenleridir (Zhou vd., 2018). 5 Yasukawa vd. (2008), A. officinarum rizomlarının metanol ekstraktının çeşitli fraksiyonlarında 7-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1-fenil-4-hepten-3-on, 5-hidroksi-7-(4- hidroksi-3-metoksifenil)-1-fenil-3-heptanon, 5-metoksi-7-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1- fenil-3-heptanon, 5-metoksi-1,7-difenil-3-heptanon, 1,7-difenil-4-hepten-3-on ve 7-(4- hidroksifenil)-1-fenil-4-hepten-3-on bulunduğunu bildirmişlerdir (Şekil 2.3 ve Şekil 2.4). Matsuda vd. (2009), A. officinarum rizomlarının aseton ekstraktının çeşitli fraksiyonlarında galangin, kamferid, kamferol, pinobanksin, zingeron, 3-fenilpropanoik asit, 3,5-dihidroksi-1,7-difenilheptan, 7-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1-fenil-hept-4-en-3- on, 5-hidroksi-1,7-difenil-3-heptanon, 5-hidroksi-7-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1-fenil- 3-heptanon bileşiklerini izole etmişlerdir (Şekil 2.3 ve Şekil 2.4). Köse vd. (2015), A. officinarum rizomlarının hidroetanolik ekstraktında kaemferol, p- kumarik asit, apigenin, luteolin, kuersetin ve isoramnetin, bunlara ek olarak etanol ekstraktında p-hidroksibenzoik asit, su ekstraktında ise kamferol, p-kumarik asit, apigenin ve isoramnetin bulunduğunu bildirmişlerdir. Zhang vd. (2015), A. officinarum rizomları ve toprak üstü kısımlarını kullanarak elde ettikleri metanol ekstraktında krisin, pinocembrin, tektokrisin, apigenin, galangin, 3-hidroksimetil galangin, asasetin, kaempferol, kaemferid, kuersetin, isoramnetin, luteolin, izalpinin, rutin, heksahidroksikurkumin, hannokinol bileşiklerini tespit etmişlerdir. Li vd. (2021), A. officinarum rizomlarının etanol ekstraktında kuersetin, kaemferol, kurkumin ve galangin, Zhang vd. (2014), A. officinarum rizomlarının etanol ekstraktında pinocembrin, galangin, 3-O-metilgalangin, kamferid ve pinobanksin, Song vd. (2021), A. officinarum rizomlarının su ekstraktında protokatekuik asit, epikateşin ve galangin tespit ederken, Pirzadeh vd. (2021), A. officinarum rizomlarının hidroalkolik ekstraktında kuersetin, kaemferol ve galangin tespit etmiştir. 6 Galang'n 3-O-met'l galang'n P'nocembr'n Kr's'n Kampferol Ap'gen'n Kuerset'n 3-O-met'l kuerset'n Şekil 2.3. A. officinarum fenolik bileşikleri 7 İzalp'n'n Kamfer'd Tektokr's'n Ep'kateş'n Asaset'n P'nobanks'n Kuerset'n-7-met'l eter Luteol'n Şekil 2.3. A. officinarum fenolik bileşikleri (Devam) 8 p-kumarik asit Ramnos(tr(n Z(ngeron İsoramnet(n Hannokinol p-hidroksibenzoik asit Rut(n 3-fenil propanoik asit Şekil 2.3. A. officinarum fenolik bileşikleri (Devam) 9 Kurkumin Heksah.droks.kurkum.n 5-h.droks.-7-(4-h.droks.-3-metoks.fen.l)-1-fen.l-3-heptanon 7-(4-h.droks.fen.l)-1-fen.l-4-hepten-3-on 3,5-d.h.droks.-1,7-d.fen.lheptan Şekil 2.3. A. officinarum fenolik bileşikleri (Devam) 1 0 A. officinarum’ un yüksek biyoaktif bileşen içeriği sayesinde antioksidan, antibakteriyel, anti-inflamatuar, antikanser, anti-genotoksik, antifungal ve anti-tümör gibi çeşitli tıbbi aktivitelere sahip olduğu bildirilmiştir (Çizelge 2.2) (Awad vd., 2020). Çizelge 2.2. A. officinarum aktiviteleri Biyoaktif fraksiyon / Bileşik Aktivite Kaynak Su ekstraktı Anti-atopik dermatit Song vd., 2021 Metanol ekstraktı Fu vd., 2022 Etanol ekstraktı Xavier ve Agatheeswaran, 2010 Diarilheptanoidleri Anti-bakteriyel Zhang vd., 2010 5-hidroksi-7-(4-hidroksi-3- metoksifenil)-1-fenil-3-heptanon Subramanian vd., 2009 Kloroform ekstraktı Anti-emetik Shin vd., 2002 Metanol ekstraktı Yasukawa vd., 2008 Etanol ekstraktı Lee vd., 2009 Diterpenleri Anti-enflamatuvar Wen vd., 2016 5-hidroksi-7-(4-hidroksi-3- metoksifenil)-1-fenil-3-heptanon Subramanian vd., 2009 Su ekstraktı Anti-fotoyaşlanma Jung vd., 2022 Esansiyel yağı Anti-fungal Tongchure ve Chanprapai, 2022 Diarilheptanoidleri An vd., 2008 Kloroform, su, etanol, petrol eteri Suja ve Chinnaswamy, ekstraktı Anti-kanser 2008 Galangin Heo vd., 2001 Su, etanol, su/etanol ekstraktı Anti-kolinerjik Köse vd., 2015 1 1 Çizelge 2.2. A. officinarum aktiviteleri (Devam) Biyoaktif fraksiyon / Bileşik Aktivite Kaynak Su, etanol, su/etanol ekstraktı Anti-melanom Matsuda vd., 2009 Su, etanol ekstraktı Avci vd., 2020 Anti-mikrobiyal Etanol ekstraktı Srividya vd., 2010, Huang vd., 2008 Metanol ekstraktı Dou vd., 2010 Ly vd., 2003 Su, etanol ekstraktı Avci vd., 2020 Etanol ekstraktı Anti-oksidan Srividya vd., 2010 Esansiyel yağı Nguyen vd., 2019 Su, etanol, su/etanol ekstraktı Köse vd., 2015 Metanol ekstraktı Omoregie vd., 2013 Anti-proliferatif Ghil, 2013 Etanol ekstraktı Samarghandian vd., 2014 Galangin Yakufu vd., 2021 Anti-tümör Aseton/su ekstraktı Matsuda vd., 2009 Diarilheptanoidleri Konno vd., 2011 7-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1- fenil-4E-hepten-3-on, (5S)-5- Anti-viral hidroksi-7-(4-hidroksifenil)-1- Sawamura vd., 2010 fenil-3-heptanon Etanol ekstraktı Gong vd., 2020 Galangin, kamferid, Gastroprotektif 3-metoksigalangin Lin vd., 2020 Galangin Anti-genotoksik Heo vd., 2001 1 2 2.2. Galangin Galangin, A. officinarum, Alpinia galanga, Plantago major L., Alnus pendula Matsum ve Scutellaria galericulata L., Helichrysum aureonitens bitkilerinde bulunan flavonoidlerin flavonol sınıfına ait doğal bir polifenoldür (Chen vd., 2022; Tuli vd., 2022; Wang vd., 2021). Galangin diğer bitkilerin yanı sıra özellikle A. officinarum rizomlarında çok yüksek oranda bulunur ve A. officinarum’un ana aktif bileşenidir (Lu vd., 2021). A. officinarum rizomlarında 2,63-11,1 mg/g arasında değişen konsantrasyonda galangin bulunmaktadır (Mak vd., 2018). Galangin’in önemli fiziksel ve kimyasal özellikleri Çizelge 2.3’te verilmiştir. Çizelge 2.3. Galangin’in fiziksel ve kimyasal özellikleri Ad Galangin Sinonim Norizalpinin, 4H-1-benzopiran-4-on, 3,5,7- trihidroksi-2-fenil, 3,5,7-trihidroksiflavon Yapı Molekül formülü C15H10O5 Molekül ağırlığı 270,24 g/mol Kütle 270,05282342 g Erime noktası 214-215°C Renk Soluk-koyu sarı Çözünürlük Kloroform, diklorometan, etil asetat, dimetilsülfoksit, aseton ve etanolde çok iyi çözünür, suda az çözünür. Fiziksel hal Katı pKa 6,28 (en güçlü asidik), -3,9 (en güçlü bazik) λmax 360 nm 1 3 Çizelge 2.3’te verilen galanginin yapısına bakıldığında A halkasının C5 ve C7 pozisyonunda, C halkasının C3 pozisyonunda olmak üzere üç hidroksil grubuna, C halkasının C4 pozisyonunda okso grubuna ve C halkasının C2 ve C3 pozisyonunda bir çift bağa sahiptir. Galanginin sahip olduğu hidroksil grupları ve 4-okso grubu ile konjuge haldeki C2-C3 çift bağı ile elektron delokalizasyonu yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir (Ami vd., 2007). Yüksek antioksidan aktivitesinin yanı sıra galangin geniş biyolojik spektruma sahiptir. Galangin anti-kanser, anti-inflamatuvar, anti-mikrobiyal, anti-iskemik, anti-hipertropik, anti-vitiligo, anti-obezite, anti-artirit, anti-diyabetik, nöroprotektif, hepatoprotektif aktiviteler göstermektedir (Mak vd., 2018). Çeşitli çalışmalar galanginin hepatoselüler karsinom, kolon kanseri, yumurtalık kanseri, insan meme kanseri, melanom ve prostat kanseri gibi farklı kanser hücreleri üzerinde antikanser etkiler gösterdiğini bildirmiştir (Chen vd., 2019; Rampogu vd., 2021). Bu çeşitli terapötik aktivitelere düşük sitotoksisite ve genotoksisite eşlik eder (Ye vd., 2019). Alfwuaires (2022), galanginin sıçanlarda metotreksat kaynaklı karaciğer hasarına karşı hepatoprotektif etkisini incelemiştir. Sıçanlara 10 gün boyunca galangin ve 7. günde tek doz metotreksat (20 mg/kg) uygulanmıştır. Metotreksat hepatik reaktif oksijen türlerini, nitrik oksidi, malondialdehiti ve pro-enflamatuvar sitokinleri arttırmış ve antioksidan enzimleri azaltmıştır. Galangin, metotreksat uygulanan sıçanlarda karaciğer hasarını hafifletmiş, karaciğer fonksiyonunu, oksidatif stresi ve inflamasyon belirteçlerini iyileştirmiş ve hücre içi antioksidanları arttırmıştır. Bu sonuçlar galanginin metotreksat kaynaklı karaciğer hasarına karşı hepatoprotektif etkiye sahip olduğunu göstermektedir. Chen vd. (2022), galanginin Parkinson hastalığı üzerine aktivitesini araştırmışlardır. Çalışmanın sonuçlarına göre galangin, Parkinson hastalığının bir göstergesi olan dopaminerjik nöronların dejenerasyonunu inhibe etmiştir ve reaktif oksijen türlerinin üretimini azaltmıştır. Bu sonuçlar galanginin parkinson hastalığının tedavisinde etkili bir ajan olabileceğini göstermektedir. 1 4 Lu vd. (2007), A. officinarum flavonoidlerinin B16 fare melanom hücrelerinde melanin biyosentezi, tirozinaz inhibisyonu ve UV absorpsiyonu üzerindeki beyazlatıcı etkileri araştırmışlardır. Galangin 1,632 mg /105 hücre melanini 1,161 mg /105 hücreye düşürürken, melanin üretimini 29 mg/mL (107,4 mM) konsantrasyonda %28,86 oranında inhibe ettiğini ve tirozinazı 21,23 μg/mL’den az konsantrasyonda rekabetçi inhibisyon göstererek inhibe ettiğini ayrıca galanginin UV-B bölgede 270-290 nm aralığında geniş bir absorpsiyon bandı gösterdiğini bildirmişlerdir. Bulgular galanginin beyazlatıcı ve antikanser bir ajan olabileceğini göstermektedir. Galangin çeşitli hastalıkların tedavisi için yüksek aktiviteler gösterse de kullanımı sınırlıdır. Çizelge 2.3’te verildiği üzere galanginin suda çözünürlüğünün düşük olması (Abbas vd., 2023; Prasad ve Kumari, 2022), sıcaklık, pH ve ışıktan kolaylıkla etkilenmesi (Lu vd., 2021), bunlara ek olarak oksidatif stabilitesinin yetersizliği ve bağırsak emiliminin zayıf olması sonucunda oldukça düşük biyoyararlanıma sahiptir (Hajipour vd., 2021; Jeong vd., 2016; Kim vd., 2014; Li vd., 2018; Sabry vd., 2021). Ye vd. (2019) çalışmalarında galanginin sıçan plazma ve dokusundaki farmakokinetiğini incelemişlerdir. Farmakokinetik sonuçları galanginin hızlı emildiğini (tmax 0,25 sa) ve üç farklı dozajdan sonra hızlı elimine olduğunu (t1/2 <1,1 sa) ortaya koymuştur. Doku dağılım analizi galanginin karaciğer, böbrek, dalak ve akciğerde bol miktarda, beyinde ise daha az miktarda bulunduğunu göstermiştir. Galanginin biyoyararlanımı ise yaklaşık %7,6’dır. Chen vd. (2015), galangin çözeltisinin oral ve intravenöz uygulamasından sonra sıçan plazmasındaki galangin metabolitlerini tanımlayarak, galangin ve metabolitlerinin farmakokinetik davranışlarını araştırmışlardır. Çalışmaya göre sıçan plazmasındaki başlıca galangin metabolitleri glukuronidler ve sülfatlardır. Galangin’in sıçanlara oral uygulanmasından sonra galangin glukuronidasyona uğrarken, intravenöz uygulanmasından sonra sülfatlanmaya uğramıştır. Çalışma sonunda serbest galanginin yaklaşık %3,67 gibi çok düşük oral biyoyararlanım gösterterdiğini bildirmişlerdir. Curti vd. (2019), kahverengi propolis ekstraktında en yüksek miktarda bulunan galangin ve krisinin biyoyararlılıklarını incelemek için sıçanlara akut ve uzun süreli oral uygulamanın ardından serum galangin ve krisin miktarlarını belirlemişlerdir. Hem akut 1 5 hem de uzun süreli uygulamanın ardından, fare plazmasında ne galangin ne de krisin tespit edilememiştir. Ancak akut uygulamadan 5 dk sonra galanginin glukuronid metaboliti tespit edilebilmiştir. Bu da galanginin oral uygulamadan sonra hızla glukuronidasyona uğradığını bunun da düşük biyoyararlanıma sebep olduğunu göstermektedir. Galanginin sahip olduğu düşük biyoyararlanımdan kaynaklanan sınırlamaların üstesinden gelmek için çeşitli taşıyıcı sistemler önerilmiştir (Tuli vd., 2022). Literatürde galangin için kullanılan taşıyıcı sistemlerin bir kısmı Çizelge 2.4’te verilmiştir. Çizelge 2.4. Galangin için kullanılan taşıyıcı sistemler Taşıyıcı sistem Aktivite Kaynak Lipozom Antioksidan Landi-Librandi vd., 2011 Lipozom Antioksidan Landi-Librandi vd., 2012 Hidrojel Antibakteriyel Jeong vd., 2016 Lipozom Hepatoprotektif Zhu vd., 2018 Selenyum nanopartikül Antikanser Li vd., 2018 Polimerik misel Hipoürisemik Zhu, vd., 2018 Lipozom Antitümör Yao vd., 2019 Polimerik misel Karaciğer Patil vd., 2019 Niozom Antikanser Sabry vd., 2021 Mikro emülsiyon Antioksidan Lu vd., 2021 Nano lipit taşıyıcı Antikanser Hajipour vd., 2021 Nanopartikül Karaciğer Mohammadi vd., 2022 Nanopartikül Hepatik fibrozis Xiong vd., 2023 Altın nanopartikül Antikanser Qaddoori ve Al-Shmgani, 2023 1 6 Patil vd. (2019), karaciğer hedefli galangin yüklü galaktozillenmiş pluronik F68 polimerik miselleri hazırlamışlardır ve hazırlanan misellerin biyodağılımı değerlendirilmiştir. Galangin çözeltisine kıyasla galangin yüklü misellerin biyodağılım çalışmaları, karaciğerdeki galangin miktarında 15 dk sonra yaklaşık 2,6 kat ve 30 dk sonra yaklaşık 7,18 kat kadar önemli bir artış göstermiştir. Bu da galanginin misellere yüklenmesi ile galanginin metabolize olmasını ve eliminasyonunu yavaşlatmıştır. Abbas vd. (2022), meme kanseri tedavisinde etkili bir ajan olabilecek galangin/β- siklodekstrin kompleksi geliştirmişlerdir. Serbest galanginin MCF-7 hücre hatlarındaki sitotoksik etkisi üzerine IC50 değeri 32,45 μg/mL iken galangin/β-siklodekstrin kompleksinin IC50 değeri 21,09 μg/mL’dir. 50 μg/mL serbest galanginin MCF-7 hücre hatlarındaki sitotoksik etkisi %64,33 iken galangin/β-siklodekstrin kompleksinin %83,33’tür. Elde edilen sonuçlara göre serbest galangine kıyasla daha az konsantrasyonda galangin/β-siklodekstrin kompleksi kullanılarak daha yüksek biyoaktivite elde edilmiştir ve biyoyararlanım arttırılmıştır. Qaddoori ve Al-Shmgani (2023), galangin yüklü altın nanopartiküller geliştirmişlerdir. Serbest galangin (100 μM) MCF-7 meme kanseri hücrelerini %60,14 inhibe ederken galangin yüklü altın nanopartiküller %66,34 inhibe etmiştir. Galangin yüklü altın nanopartiküller, serbest galanginden daha yüksek sitotoksik etkilere sahiptir ve bunun nedeni serbest galangine kıyasla hücrelere nüfuz etme, hücrelerde birikme ve hücrelere strese sokarak apoptoza yol açma yeteneğinin gelişmiş olmasıdır. Xiong vd. (2023), hepatik fibrozis tedavisi için galangin yüklü nanopartiküller geliştirmişlerdir. Çalışmaya göre oral yolla uygulanan serbest galangin ve galangin- nanopartiküller karşılaştırıldığında, serbest galanginin yarılanma ömrü 3,64 ± 0,11 iken galangin yüklü nanopartiküllerin 7,09 ± 0,35’tir. Serbest galangin fare serumunda 12 sa tespit edilebilirken, galangin yüklü nanopartiküller 24 sa boyunca tespit edilebilmiştir. Fare serumundaki galangin konsantrasyonu ise serbest galangine göre 2,55 kat daha yüksektir. Bu sonuçlar kullanılan nanopartiküler sistemin galanginin biyoyararlanımda önemli bir artışa neden olduğunu ve galanginin hidrofobik özelliğinden kaynaklanan düşük biyoyararlanım sınırlamasının üstesinden gelindiğini göstermiştir. 1 7 2.3. Enkapsülasyon Enkapsülasyon, birçok alanda kullanıma uygun olan ancak biyoyararlanımı düşük olan polifenoller gibi biyoaktif bileşiklerin biyoyararlanımını, çözünürlüğünü, stabilitesini, çevresel etkenlerden korunmasını ve kontrollü ilaç salınımını arttırmaya odaklanan bir tekniktir (Subramani ve Ganapathyswamy, 2020). Enkapsülasyon tekniği ile polifenoller, pigmentler, probiyotikler, vitaminler, mineraller, peptitler ve ilaçlar (Khorasani vd., 2018; Zabot vd., 2022) kapsüllenebilir. Bu teknik, biyoaktif bileşiklerin karbonhidrat, lipit ve polimer gibi bir duvar malzemesi ile kaplanarak nano veya mikro boyutlu kapsüller üretilmesi işlemidir (Şekil 2.5) (Witika vd., 2021). Enkapsülasyon işlemi 1- 1000 μm aralığında kapsüllerin oluşturulduğu mikroenkapsülasyon ve 1-1000 nm aralığında kapsüllerin oluşturulduğu nanoenkapsülasyon olmak üzere ikiye ayrılır (Saifullah vd., 2019). Şekil 2.4. Enkapsülasyon işlemi Nanoenkapsülasyon enkapsülasyon etkinliği, ilaç yükleme kapasitesi, hedefleme, stabilite, biyoyararlanım ve kontrollü salım profilini önemli ölçüde geliştirdiği için uzun yıllardır birçok alanda ilgi görmektedir (Shishir vd., 2018). Bu teknikle partiküller, kapsüller, niozomlar, küreler, emülsiyonlar, miseller, dendrimerler, jeller, kristaller ve lipozomlar gibi nano boyutlu ilaç taşıyıcı sistemler (Şekil 2.6) geliştirilmekte ve üretilmektedir (Witika vd., 2020). 1 8 Şekil 2.5. Enkapsülasyon ile elde edilen partikül sistemleri Nanoenkapsülasyonun avantajları şu şekilde sıralanabilir; • Kapsüllenen biyoaktif bileşenin stabilitesini arttırır (Pateiro vd., 2021), • Kapsüllenen biyoaktif bileşeni pH, sıcaklık gibi çevresel faktörlerden korur, kimyasal ve biyolojik parçalanmasını engeller (Bratovcic ve Suljagic, 2019; Pateiro vd., 2021), • Kapsüllenen biyoaktif bileşenin istenmeyen reaksiyonlara girmesi engellenir (Zabot vd., 2022), • Kapsüllenen biyoaktif bileşenin depolama süresini arttırır ve raf ömrünü uzatır (Zabot vd., 2022), • Kapsüllenen biyoaktif bileşenin kontrollü olarak salınmasını sağlar (Bratovcic ve Suljagic, 2019), • Kapsüllenen biyoaktif bileşenin biyoyararlanımını arttırır (Paolino vd., 2021), • Kapsüllenen biyoaktif bileşenin çözünürlüğünü arttırır (Paolino vd., 2021), • İstenmeyen tat ve kokuyu maskeler (Khorasani vd., 2018). 1 9 2.4. Lipozom Lipozomlar, bir veya birkaç eşmerkezli kapalı lipit çift katmana sahip, amfifilik moleküllerden (ağırlıklı olarak fosfolipitler) oluşan küresel nano boyutlu veziküllerdir (Tomsen-Melero vd., 2022). Lipozomlar hücre zarını taklit eden yapay taşıyıcı sistemlerdir (Abuwatfa vd., 2022). 1960’lı yıllarda Cambridge Babraham Enstitüsü’nde lipitlerin, özellikle de fosfolipitlerin kanın pıhtılaşma süreci üzerindeki etkisini inceleyen Alec D. Bangham (1921-2010), tesadüfen ilk lipozomları gözlemlemiştir (Rommasi ve Esfandiari, 2021). Dr. Bangham, kurutulmuş lipitlerin yeterli miktarda suyla temas ettiğinde kendiliğinden yeniden düzenlendiğini fark etmiş ve lipitlerin kendiliğinden yeniden düzenlenmesinin lipitler ve su arasında itme etkisi yaratan etkileşimler tarafından yönlendirildiğini göstermiştir. Bu gerçek, amfifilik moleküllerin uzayda dağılımına katkıda bulunarak küresel bir şekil tanımlar ve moleküler etkileşimlerle sistemin Gibbs serbest enerjisini en aza indirir. Bu açıklamaya göre, ince bir lipit tabakası hidratlandığında ateş balonu şeklini alarak katlanmaya başlar. Sonunda, lipit tabakası kapanarak iç çekirdeğe su hapseder ve küresel bir şekil alır (Trucillo vd., 2020). Dr. Bangham 1964 yılında yayınladığı bir araştırma makalesinde ilk lipozomları bildirilmiştir (Şekil 2.7) (Rommasi ve Esfandiari, 2021). Başlangıçta veziküller ‘‘Banghasomes’’ veya ‘‘çok katmanlı smektik mezofazlar’’ olarak adlandırılmış, daha sonra Gerald Weissmann tarafından yağ anlamına gelen ‘‘lipos’’ ve vücut anlamına gelen ‘‘soma’’ kelimelerinden türetilmiş ‘‘liposomes’’ kelimesi önerilmiştir (Riaz vd., 2018). Şekil 2.6. İlk gözlemlenen lipozomlar 2 0 Lipozomların yapısal bileşeni fosfolipitler ve kolesteroldür (Juhairiyah ve de Lange, 2021). Fosfolipit molekülleri, sulu fazlara (iç ve dış) çekilen polar bir baş gruba ve su tarafından itilen uzun bir hidrokarbon zincirinden oluşan apolar bir kuyruk grubuna sahiptir. Polar baş kolin (C5H14NO+), fosfat (PO43-) ve gliserolden (C3H8O3) oluşurken, polar olmayan kuyruk hidrokarbon zincirinden (yağ asidi) oluşur (Şekil 2.8) (Shishir vd., 2019). Şekil 2.7. Lipozom ve lipozomların yapısal bileşeni Fosfolipitler suya maruz kaldığında, lipitler ve su molekülleri arasındaki hidrofilik etkileşimler, Van der Waals etkileşimleri ve hidrojen bağı yoluyla kendiliğinden kapalı çift katmanlı tabakalar oluşturur (Şekil 2.9) (Shishir vd., 2019). 2 1 Şekil 2.8. Fosfolipitlerin etkileşimleri Kolesterol molekülleri ise baş bölgesindeki hidroksil grubu ile hidrojen bağı yoluyla fosfolipitlerin karbonil (C=O) grubuyla etkileşime girerken, alkil zinciri fosfolipitlerin lipofilik bölgesine yönelir (Şekil 2.10) (Shishir vd., 2019). Şekil 2.9. Kolesterol ve fosfolipitlerin etkileşimi Fosfolipit moleküllerinin apolar kuyruklarının çift katmanlı tabakanın iç kısmına yönlenerek oluşturdukları su içermeyen hidrofobik bölgeye hidrofobik bileşenler yerleşirken, polar baş gruplarının sulu faza yönlenerek merkezde oluşturduğu hidrofilik 2 2 bölgeye hidrofilik bileşenler yerleşir (Şekil 2.11). Böylece lipozomlar hem hidrofilik hem de hidrofobik bileşenleri yapılarında enkapsüle ederler (Ajeeshkumar vd., 2021). Şekil 2.10. Lipozomların oluşumu Lipozomlar, nanometreden mikrometreye kadar değişen farklı partikül boyutuna sahip küresel bir şekle sahiptir (Ajeeshkumar vd., 2021). Lipozomlar antibiyotikler, proteinler, peptitler, boyalar, nükleik asitler, antioksidanlar ve enzimler gibi çok çeşitli molekülleri enkapsüle edebilir. Ayrıca kararsız bileşikleri de enkapsüle ederek fonksiyonel özelliklerini koruyabilir (Trucillo vd., 2020). Bir ilaç dağıtım sistemi olarak lipozomlar, terapötik bileşikleri stabilize ederek, hücresel ve doku alımının önündeki engelleri aşarak bileşiklerin in vivo hedef bölgelere biyo-dağılımını iyileştirir. Lipozom içine yüklenen ilaç, enzimatik bozulma, kimyasal ve immünolojik inaktivasyon ve hızlı plazma klirensi gibi fizyolojik olarak meydana gelen olaylara karşı korunur ve ilacın etkisinin iyileştirilmesine ve uzatılmasına katkıda bulunur. İlaç lipozomun içinde olduğundan, sağlıklı dokuya maruz kalması en aza indirilerek hastalıklı dokuya ulaşması sağlanır ve serbest ilaç formuna kıyasla istenmeyen yan etkiler azaltılır (Guimarães vd., 2021). Lipozom teknolojisi stabiliteyi korumak, salınımı kontrol etmek ve biyoyararlanımlarını arttırmak için hedef bileşiklerin enkapsüle edilmesinde gelişmiş ve etkilidir. (Ajeeshkumar vd., 2021). Lipozomlar biyolojik olarak parçalanabilirler ve aynı zamanda sistemik ve sistemik olmayan uygulamalar için düşük toksisiteye sahip olmaları ve immünojenik olmamaları ile karakterize edilirler. Ayrıca benzer yapıya sahip oldukları hücreler tarafından kolayca alındıkları için genellikle insan vücudu ile biyouyumlu olarak kabul edilmektedirler (Trucillo vd., 2020). 2 3 2.4.1. Lipozom bileşenleri Lipitler Fosfolipitler biyolojik membranların başlıca yapısal bileşenleridir (Bhupathyraaj, 2013). Lipozomlar hücre zarının yapay bir taklidi olduğu için lipit bileşimi çok önemlidir ve partikül boyutu, sertlik, akışkanlık, stabilite ve elektrik yükü gibi lipozom özelliklerini güçlü bir şekilde etkiler. Lipozomlar hem doğal hem de sentetik fosfolipitlerden elde edilebilirler (Nsairat vd., 2022). Doğal fosfolipitler genellikle soya fasülyesi, yumurta sarısı gibi çeşitli doğal kaynaklardan elde edilir. Fosfolipitler polar baş gruplarına göre fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinositol, fosfatidilgliserol ve fosfatidik asit olarak sınıflandırılır (Magsoudi vd., 2022; Nsairat vd., 2022). Lesitin olarak da bilinen fosfatidilkolinler lipozom bileşeni olarak en sık kullanılan fosfolipitlerdir (Bhupathyraaj, 2013). Diğer amfipatik moleküllerden, misel yapılara kıyasla çift katmanlı tabakalar oluşturmaları bakımından farklılık gösterirler. Nispeten düşük maliyetleri, net yükten yoksun olmaları ve kimyasal inertlikleri nedeniyle tipik olarak lipozomların ana bileşeni olarak kullanılırlar (Singh vd., 2019). Sentetik fosfolipitler, doğal fosfolipitlerin çeşitli bölgelerinde gerçekleştirilen spesifik kimyasal modifikasyonlarla elde edilir. Doğal fosfolipitlerin baş gruplarında, alifatik zincirlerinde ve alkollerinde yapılan değişiklikler, daha kararlı olduğu kanıtlanmış çeşitli sentetik fosfolipitleri oluşturur. Lipozom bileşinde sıklıkla kullanılan sentetik fosfolipitler Distearoil fosfatidilkolin, Dipalmitoil fosfatidilkolin, Dioleoil fosfatidilkolin, Distearoil fosfatidilgliserol, Dipalmitoil fosfatidilgliserol, Dioleoil fosfatidiletanolamin, Distearoil fosfatidiltanolamine, Dilauril fosfotidilkolin, Dimiristoil fosfatidilkolin, Dilauril fosfatidiletanolamin, Dimirenzoil fosfatidiletanolamin, Dilauril fosfatidilgliserol ve Distearoil fosfotidilserin ve türevleridir (Bhupathyraaj, 2013; Guimarães vd., 2021). 2 4 Kolesterol Kolesterol çeşitli doğal membranlarda ve hücre zarında bulunan önemli bir bileşendir. Kolesterol, lipozomların hazırlanmasında ve kimyasal özelliklerinde önemli bir role sahiptir (Beltrán-Gracia vd., 2019). Çift tabaka kalınlığını arttırma, membran birleştirme ve membran geçirgenliğini azaltma özelliğine sahiptir (Shishir vd., 2019). Kolesterol kendi başına çift tabaka oluşturmaz, ancak yüksek konsantrasyonlarda fosfolipit membranlara dahil edilir (Singh vd., 2019). Kolesterol, büyük ölçüde lipozomların çift tabaka özelliklerini iyileştirmek için kullanılmıştır. Membran akışkanlığını, çift tabaka stabilitesini geliştirir ve suda çözünen moleküllerin membrandan geçirgenliğini azaltır (Laouini vd., 2012). Hidrofobik etkileşimler nedeniyle hidroksil grubu hidrofilik bölgeye yakın ve aromatik halkaları çift tabaka içindeki yağ asidi zincirine paralel olacak şekilde fosfolipit zincirine yerleşir. Yoğun halkaların neden olduğu mekanik sertlikteki artış nedeniyle akışkanlık, su ve fizyolojik sıvı geçirgenliği azalır, böylece lipozom çift tabakası stabilize olur (Beltrán-Gracia vd., 2019; Sforzi vd., 2020). Kolesterol, fosfolipitlerle güçlü hidrojen bağları oluşturduğundan ve lipitlerin genel yoğunlaşmasını arttırdığından, iki tabakanın suda çözünür moleküllere karşı geçirgenliğini azaltır (Juszkiewicz vd., 2020). Kolesterol yokluğunda lipozomlar genellikle albümin, transferrin, makroglobulin ve yüksek yoğunluklu lipoproteinler dahil olmak üzere proteinlerle etkileşime girer. Bu etkileşim lipozomların yapısını bozar ve sonuç olarak ilaç dağıtım sistemleri olarak kapasitelerini azaltır. Kolesterol ayrıca lipozom membranlarının bağırsak ortamı stresine karşı yapısal stabilitesi için de çok önemlidir (Beltrán-Gracia vd., 2019). Kolesterolün varlığı ilaçların enkapsülasyon etkinliğini ve salım profilini de etkileyebilir (Juszkiewicz vd., 2020). İki tabakanın sertliğini arttırarak ve geçirgenliğini azaltarak hidrofilik ilaçların tutulmasını iyileştirir, ancak hidrofobik ilaçlar için, yalnızca ilaç girişi lipozomun enkapsülasyon kapasitesinden daha azsa enkapsülasyonu iyileştirir (Singh vd., 2019). Kinin gibi hidrofobik ilaçların salınımını engeller ve uzun lipit zincirlerinin yanında lokalize olarak sterik engel oluşturduğundan enkapsülasyon etkinliğini azaltır. Lipitlerin polar başlıkları ile etkileşime giren hidrofilik ilaçlar söz konusu olduğunda, kolesterol de kapsüllenen miktarlarını sınırlar, ancak aynı zamanda lipozomlardan salım hızlarını da arttırır (Juszkiewicz vd., 2020). 2 5 2.4.2. Lipozomların sınıflandırılması Lipozomlar boyut ve lamellar yapılarına, yüklerine, bileşimlerine ve kullanım alanlarına göre üç kısıma ayrılabilir (Jash vd., 2021; Reshna vd., 2022; Wang, 2021). Boyut ve lamellar yapılarına göre lipozomlar: Boyutlarına göre lipozomlar multilamellar veziküller, multivesiküler veziküller, oligolamellar veziküller, ünilamellar veziküller olarak sınıflandırılırlar (Andra vd., 2022); • Multilamellar veziküller (MLV): >500 nm (>5 lamel) • Multivesiküler veziküller (MVV): >1000 nm (1 lamel) • Oligolamellar veziküller (OLV): 100-1000 nm (2-5 lamel) • Ünilamellar veziküller (ULV): - Küçük ünilamellar veziküller (SUV): 20-100 nm (1 lamel) - Büyük unilamellar veziküller (LUV): >100 nm (1 lamel) - Dev unilamellar veziküller (GUV): >1000 nm (1 lamel) Eğer çok sayıda çift katman sulu çözeltiyi hapsediyorsa, bunlar multilamellar veziküller (MLV) olarak adlandırılır (Şekil 2.12). Az sayıda çift katman olması durumunda, MLV’ler oligolamellar veziküller (OLV) olarak adlandırılır (Şekil 2.12). Eğer tek bir çift katmanlı vezikül birçok eşmerkezli olmayan çift katmanlı vezikülü kapsıyorsa o zaman multiveziküler vezikül (MVV) olarak bilinir (Şekil 2.12). Eğer bir çift tabaka iç ve dış sulu fazı ayırıyorsa o zaman unilamellar veziküller (ULV) olarak bilinirler (Şekil 2.12). ULV’ler LUV, SUV ve GUV olmak üzere üç kısıma ayrılır. LUV’ler SUV ve MLV’lere göre nispeten daha büyük hacme sahip oldukları için yaygın olarak hidrofilik molekülleri enkapsüle etmek için kullanılırlar. Aksine, MLV’ler birkaç hidrofobik çift katmanlı bölgeye sahip olduklarından hidrofobik molekülleri enkapsüle etmek için kullanılırlar (Has ve Sunthar, 2020). 2 6 Yüklerine göre lipozomlar: Yüklerine göre lipozomlar anyonik, katyonik ve nötral olmak üzere sınıflandırılırlar: • Anyonik Lipozomlar: Karboksilik, fosforik veya sülfonik asit gibi negatif yüklü fonksiyonel ligandların lipitlere konjuge edilmesiyle oluşturulur. Yüzey yükleri negatiftir (Wang, 2021). • Katyonik Lipozomlar: Amonyum, sülfonyum veya fosfonyum iyonları gibi katyonik ligandların lipitlere konjuge edilmesiyle oluşturulur. Yüzey yükleri pozitiftir (Wang, 2021). • Nötral (Zwitteriyonik) Lipozomlar: Nötral lipozomlar ise izoelektrik noktalarına ve çevresel pH’a bağlı olarak negatif ve pozitif arasında tam yük değişimi gösterir (Wang, 2021). Bileşimleri ve kullanım alanlarına göre lipozomlar: • Konvansiyonel lipozomlar: Farmasötik ilaç dağıtımı için kullanılan birinci nesil lipozomlar olarak bilinir. Esas olarak doğal fosfolipit veya lipitler ile birleştirilir ve lipit çift tabaka oluşturur. • Katyonik lipozomlar: Pozitif yüklü lipitler içerir. Negatif yüklü DNA ile etkileşimi nedeniyle gen terapisi için yaygın olarak kullanılmaktadır. • pH’ya duyarlı lipozomlar: pH’a duyarlı lipitlere sahip lipozomlar, dış pH değiştiğinde dengesizleşir. Genellikle nötr/hafif alkali pH’dan asidik pH’ya doğru değişir. Lipit, 1/4 kat veya daha büyük pH duyarlı bileşen ile titre edilebilir bir grup içerir. 2 7 • Uzun sirkülasyonlu lipozomlar: Uzun süre dolaşımda kalan lipozomlar, ilacın spesifik bölgeye veya organa iletimini arttırır ve ayrıca sistemik dolaşımdaki dolaşım süresini uzatır. Lipozomların yüzeyi PEG-fosfolipitler, vinil bazlı lipopolimerler ve PEG’e bağlı ligand spesifik parçalı polimerler gibi polimerlerle modifiye edilir. • İmmünolipozomlar: Lipozom yüzeyine bağlanan antikorlar içerir. Bu antikorlar, lipozoma enkapsüle edilmiş bileşenin istenilen bir bölgeye iletme kabiliyetini geliştirir. Antikorlar lipozomlara ya kovalent çapraz bağ ile ya da hidrofobikliği arttırarak bağlanır (Balakrishnan vd., 2022). Şekil 2.11. Lipozomların sınıflandırılması 2 8 2.4.3. Lipozom hazırlama yöntemleri Lipozomların hazırlanması için çeşitli yöntemler mevcuttur (Çizelge 2.5). Lipozom hazırlama yöntemleri geleneksel ve modern yöntemler olmak üzere iki kısma ayrılır. Her yöntemin kendi avantajları ve dezavantajları vardır, ayrıca farklı hazırlama yöntemleri lipozomların morfoloji, yükleme kapasitesi, boyut ve kapsülleme verimliliği gibi özelliklerini etkiler (Singh vd., 2019). Çizelge 2.5. Lipozom hazırlama yöntemleri Geleneksel Yöntemler Modern Yöntemler İnce-Film hidrasyonu (Bangham yöntemi) Liyofilizasyon Deterjan diyalizi Süperkritik destekli lipozom oluşumu Ters faz buharlaştırma Mikroakışkan yöntemi Solvent enjeksiyonu Membran kontaktörü Geleneksel lipozom hazırlama yöntemleri genellikle yüksek enkapsülasyon etkinliğine sahip lipozomların üretilmesi, hızlı ve basit prosedüre sahip olmaları, komleks donanım gerektirmemeleri nedeniyle ucuz olmalarından dolayı sıklıkla kullanılırlar. Ancak büyük kütleli üretim için kolayca ölçeklenebilir bir süreç elde etmenin zorluğu ve yüksek enkapsülasyon etkinliği elde etmenin zorlukları, deterjan ve organik çözücü kalıntılarına sahip lipozomların elde edilmesi geleneksel lipozom hazırlama tekniklerinin temel dezavantajları arasında yer almaktadır. Bu kritik sorunların üstesinden gelmek amacıyla, lipozomların hazırlanması için modern yöntemler geliştirilmiştir. Modern yöntemler düşük organik çözücü kalıntısı içeren lipozomların hazırlanması, büyük ölçekli üretim için uygun olmaları, boyut kontrolü sağlamaları gibi avantajlara sahiptir. Ancak modern yöntemlerin yüksek basınç, yüksek sıcaklık, sterilizasyon ihtiyaçları, uzun süreli prosesler ve yüksek donanım gerektirmesi nedeniyle çok maliyetli olması uygulanabilirliklerini kısıtlamaktadır (Lombardo ve Kiselev, 2022). Geleneksel lipozom hazırlama tekniklerinden en çok kullanılanları ince film hidrasyon yöntemi, ters faz buharlaştırma yöntemi, çözücü enjeksiyon yöntemi, deterjan diyalizi yöntemleridir (Liu vd., 2022). 2 9 İnce film hidrasyon yöntemi İnce film hidrasyonu lipozomları hazırlamak için kullanılan en eski yöntemdir. Bu yöntem üç temel adımı içerir (Ahmed vd., 2019). İlk adımda fosfolipitler ve kolesterol organik bir çözücü (diklorometan, kloroform, etanol, kloroform-metanol karışımı) içinde çözülür. İkinci adımda çözücü buharlaştırılarak uzaklaştırılır (45-60°C). Üçüncü adımda ise kurutulmuş lipit film bir tampon çözelti ile hidratlanır (Şekil 2.13). Elde edilen lipozomların boyutu ekstrüzyon, sonikasyon ya da homojenizasyon yöntemi ile ayarlanır. Saflaştırma işlemi için ultrafiltrasyon, ultrasantrifügasyon, diyaliz ya da kolon kromatografisi kullanılır (Liu vd., 2022). Şekil 2.12. İnce film hidrasyon yöntemi İnce film hidrasyonu yöntemi ile MLV’ler meydana gelir. Yöntemin avantajları arasında basit bir prosedür olması nedeniyle kolay uygulanabilir olması ve yüksek enkapsülasyon etkinliği sağlaması yer almaktadır. Yöntemin dezavantajları arasında büyük miktarda organik çözücü kullanımı, hidrofilik ilaçlar için daha düşük enkapsülasyon etkinliği, sterilizasyon ihtiyacı ve parçacık boyutu kontrolünün zor olması yer almaktadır (Lombardo ve Kiselev, 2022). 3 0 Ters faz buharlaştırma yöntemi Bu yöntemde lipitler organik bir çözücüde (dietil eter/kloroform, dietil eter/izopropil eter veya kloform/metanol karışımı) çözülür ve ters misel oluşumunu meydana gelir. Daha sonra çözeltiye belirli bir miktarda sulu faz (tampon) eklenir. Lipitler su ve yağ arasındaki arayüzde kendilerini yeniden düzenleyerek yağ içinde su (W/O) mikroemülsiyonu oluşturur. W/O mikroemülsiyonu, homojen bir dispersiyon oluşumunu kolaylaştırmak için mekanik veya sonikasyon yöntemleriyle emülsifiye edilebilir. Lipozomların enkapsülasyon etkinliğini arttırmak amacıyla, genellikle sulu faza bir fosfat tamponu eklenir. Sürekli bir döner buharlaştırmanın kullanılması, viskoz bir jel oluşana kadar organik çözücünün uzaklaştırılmasını sağlar. Organik çözücünün yavaş eliminasyonu ters misellerin bozulmasını destekler ve ardışık lipozom oluşumunu (LUV) sağlar. Belirli bir kritik noktada jel çökerken, çözelti ortamındaki fazla fosfolipitler ters misellerin etrafına dağılarak su damlacıklarının etrafında bir lipit çift tabakası oluşturur ve bu da lipozom oluşumuyla sonuçlanır (Lombardo ve Kiselev, 2022). Şekil 2.13. Ters faz buharlaştırma yöntemi Ters faz buharlaştırma yöntemi ile MLV ve LUV lipozomlar meydana gelir. Yöntemin en önemli avantajları prosesin kolay olması ve yüksek enkapsülasyon etkinliği sağlamasıdır. Yöntemin dezavantajları arasında büyük miktarda organik çözücüye ve sterilizasyon işlemine ihtiyaç duyulması, hassas ilaçlar için uygun olmaması ve zaman alıcı olmasıdır (Liu vd., 2022; Lombardo ve Kiselev, 2022; Singh vd., 2019). 3 1 Solvent enjeksiyon yöntemi Solvent enjeksiyonu, lipitlerin organik faza çözülmesini ve ardından lipozomlar oluşturmak için lipit çözeltisinin su ortamına enjekte edilmesini içerir (Şekil 2.15). Bu yöntemin avantajı, dar partikül boyutu dağılımına sahip küçük lipozomların suya tek aşamalı etanol lipit solüsyonu enjeksiyonu ile elde edilebilmesi ve ekstrüzyon veya sonikasyon gibi işlemlere gerek duyulmamasıdır. Bu yöntemin dezavantajları, heterojen seyreltik lipozomlar, etanolden kurtulmanın zor olması ve biyoaktif makromolekülleri inaktive etme olasılığının yüksek olmasıdır. Etanol enjeksiyonundan farklı olarak, eter enjeksiyon yöntemindeki eter sulu faz ile karışmaz ve sulu faz, çözücünün nihai lipozomdan uzaklaştırılması için ısıtılır. Eter-lipit çözeltisinin, sıcaklığı eterin kaynama noktasının üzerinde olan sıcak bir sulu faza enjekte edilmesini içerir. Eter su ile temas ettiğinde buharlaşır ve dağılmış lipitler esas olarak tek lamelli veziküller oluşturur. Etanol enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, eter enjeksiyonu çözücüyü nihai lipozomdan uzaklaştırma avantajına sahiptir. Böylece bu işlem uzun süre çalışabilir ve yüksek kapsülleme oranına sahip konsantre lipozom ürünleri oluşturabilir. Yöntemin dezavantajları, heterojen popülasyon ve organik çözücüler içinde kapsüllenmiş maddelerin yüksek sıcaklıkta çözünmesidir (Liu vd., 2022; Lombardo ve Kiselev, 2022; Singh vd., 2019). Şekil 2.14. Solvent enjeksiyon yöntemi 3 2 Deterjan diyalizi yöntemi Deterjan diyalizi yöntemiyle lipitler bir deterjan çözeltisi kullanılarak çözünürleştirilir ve hidratlanır. Karıştırma ile deterjan fosfolipitlerle birleşir (hidrofobik kısımları sulu faz ile doğrudan etkileşimden korur) ve böylece karışık (deterjan/lipit) miseller oluşur. Deterjanın art arda (aşamalı olarak) uzaklaştırılmasıyla, karışık miseller lipitler açısından daha zengin hale gelir ve unilamellar veziküllerin oluşumuna yol açar (Şekil 2.16). Yaygın olarak kullanılan deterjanlar, sodyum kolat, Triton X-100, sodyum deoksikolat ve alkil glikozittir (Lombardo ve Kiselev, 2022). Deterjan diyalizi farklı yollarla gerçekleştirilebilir. Deterjan diyalizi için en basit yöntem, bir tampon aracılığıyla seyreltme yöntemidir (10 ila 100 kat). Karışık bir lipit-deterjan sisteminin sulu çözeltisinin bir tampon ile seyreltilmesi ile oluşan misellerin boyutu ve polidispersitesi artar. Son olarak, sistem karışık misel faz sınırının ötesinde seyreltildiği için polidispers misellerden veziküllere spontane bir geçiş meydana gelir (Lombardo ve Kiselev, 2022; Liu vd., 2022). Şekil 2.15. Deterjan diyalizi yöntemi Deterjan diyalizi yöntemi ile 40 ile 180 nm arasında değişen partikül boyutlarına sahip üniform tek lamelli lipozomlar meydana gelir. Bu yöntemin avantajı, oluşan lipozomların çok büyük enkapsülasyon hacmine ve iyi dağılmış boyuta sahip tek lamelli veziküller olmasıdır. Deterjan diyalizi yöntemi, nihai düşük lipozom konsantrasyonu ve hidrofobik bileşiklerin düşük hapsetme etkinliği gibi temel dezavantajlara sahiptir. Ayrıca ortamda kalan deterjanı uzaklaştırmak için diğer yöntemlerin kullanılmasının gerekliliği ekstra bir dezavantajdır. 3 3 2.4.4. Lipozomların karakterizasyonu Lipozomlar; • Ortalama boyut, • Boyut dağılımı (polidispersite indeksi), • Yüzey yükü (zeta potansiyeli), • Şekil ve morfoloji, • Lamellarite, • Enkapsülasyon etkinliği, • Faz davranışı (veya polimorfizm) ile karakterize edilirler. Lipozomların karakteristik özellikleri ve karakterizasyon teknikleri Çizelge 2.6’da verilmiştir (Nsairat vd., 2022). Çizelge 2.6. Lipozom karakteristiği ve karakterizasyon teknikleri Lipozom Karakteristiği Karakterizasyon Tekniği Ortalama boyut Dinamik ışık saçılımı (DLS), Tarama ve Geçirimli elektron mikroskobu (SEM/TEM), Kriyojenik-TEM (Cryo- TEM) ve Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) Boyut dağılımı DLS Yüzey yükü DLS Şekil ve morfoloji SEM, TEM, cryo-TEM, AFM Lamellarite Cryo-TEM, NMR Enkapsülasyon etkinliği Kromatografik ve/veya spektroskopik yöntemler Faz davranışı X-ışını kırınımı (XRD), Diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) ve Termogravimetrik analiz (TGA) 3 4 Lipozomların ortalama boyutu, ilaç yüklü lipozomların in vivo salınımını belirlemek için çok önemlidir ve lipozomların hazırlanma yöntemi ile fosfolipit bileşimine bağlıdır. Boyut ve boyut dağılımını değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanılır. SEM, TEM gibi yöntemler ile lipozomların boyutu, lipozomun çift tabaka kalınlığı ve tabakalar arası mesafe belirlenebilir. Lipozom boyutu, parenteral uygulamalar, topikal kullanım ve inhalasyon amaçlı kullanıma dayalı olarak farklı lipozom preparatları için izlenmelidir. Lipozomal boyutun kontrolü için sonikasyon, ekstrüzyon ve homojenizasyon gibi çok sayıda prosedür mevcuttur (Andra vd., 2022). Polidispersite indeksi (PDI) değeri, lipozom boyutunun homojenlik ve dağılım derecesini göstermektedir ve 0 ile 1 arasında bir değere sahiptir. Lipozom örneğinin boyutunu ölçerken, PDI değerinin 0,3’ten küçük olması, lipozomların kabul edilebilir ve tek tip boyutta olduğunu gösterirken, yüksek PDI değeri, boyutun çok geniş bir şekilde dağıldığını göstermektedir. Çok daha yüksek PDI değeri ise lipozomların boyutunun kontrol edilemez hale geldiğini ve lipozomların topaklanabileceğini göstermektedir. PDI değerini belirlemek için TEM, SEM, AFM ve DLS en sık kullanılan yöntemlerdir. DLS yöntemi, kullanım kolaylığı ve güvenilir sonuçları nedeniyle partikül boyutunu ve PDI’yı ölçmek için en popüler yöntemdir. DLS teknolojisi, farklı doğal ortamlardaki lipozomların boyutunu değerlendirebilir ve birkaç nanometreden birkaç mikrometreye kadar geniş bir ölçüm kapasitesine sahiptir (Wang vd., 2022). Lipozomların genel net yükü genellikle yüzey veya zeta potansiyeli olarak ifade edilir. Lipozomların bu özelliği, süspansiyondaki partiküller arasındaki elektrostatik etkileşimlerin kontrolünde önemli bir fiziksel özellik olarak kabul edilir. Zeta potansiyel ölçümleri, lipozomlar gibi kolloidal sistemlerin çevrelerindeki ortamdaki kararlılığını tahmin etmek için kullanılır (Guimarães vd., 2021). Lipozom üzerindeki yük, lipozomun yapısına bağlı olarak pozitif, negatif ya da nötrdür. Bu zeta potansiyeli, lipozomal süspansiyonun agregasyonunu önleyerek stabil olmasını sağlar. Yük taşıyan parçacıklar birbirini iter, böylece zeta potansiyeli +30 mV’tan yüksek ve -30 mV’tan düşük olan lipozomlar kararlı kabul edilir. Zeta potansiyeli genellikle DLS ile belirlenir (Filipczak vd., 2020). 3 5 Lamellarite, lipozomların çift lipidik katman sayısını temsil eder (Trucillo vd., 2020). Lamellarite, enkapsülasyon etkinliği ve ilaç salım profili üzerindeki etkileri nedeniyle daha ileri lipozomal uygulamalar üzerinde etkili olabilecek bir özelliktir (Guimarães vd., 2021). Lamellarite genellikle TEM analizi ile belirlenir. Bu analiz, lipozomların sınıflandırılmasına katkıda bulunmanın yanı sıra potansiyel uygulamalarını ve uygulama etkinliklerini belirler (Trucillo vd., 2020). Enkapsülasyon etkinliği, lipozom içindeki enkapsüle madde miktarının toplam tartılan maddeye oranı olarak tanımlanır. Enkapsülasyon etkinliğini belirlemek için serbest ilaç diyaliz, jel filtrasyonu veya santrifüjleme yoluyla lipozomla enkapsüle edilmiş olandan ayrılır. Ancak, bu yöntemler lipozom yıkımına ve kapsüllenmiş ilacın salınmasına neden olabilir. Bunlar arasında diyaliz en nazik olanıdır, aynı zamanda da en çok zaman alan ve enstrümantal olarak en zorlayıcı yöntemdir. Bu nedenle jel filtrasyonu ve santrifüjleme daha sık kullanılmaktadır. Ayırma işleminden sonra lipozom yapısı bozulur ve kromatografik veya spektroskopik yöntemlerle madde miktarı belirlenir (Tomnikova vd., 2022). Lipozomların faz davranışı ilaç salımı veya lipozomal bileşenlerin hedef hücrelerdeki işlevleri sırasındaki çeşitli faz geçişlerini gösterir. Faz geçişleri, fosfolipit membranların akışkanlığını anlamak, lipozom üretmek ve kullanmak için çok önemlidir, çünkü lipozomal membranın özellikleri, geçirgenlik, füzyon, agregasyon ve protein bağlanması lipozomların faz davranışlarına bağlıdır. Lipozomların faz davranışı X-ışını kırınımı (XRD), Diferansiyel taramalı kalorimetri (DSC) ve Termogravimetrik analiz (TGA) ile değerlendirilir (Kumar vd., 2022). Lipozom karakterizasyonundaki bir diğer parametre de şekil ve morfolojidir. SEM, TEM, AFM gibi çeşitli mikroskop yöntemleriyle lipozomların şekli ve morfolojisi görselleştirilmektir (Sopyan vd., 2020). 3 6 2.4.5. Lipozomların avantajları ve dezavantajları Lipozomların avantajları arasında; • Yüksek yüzey alanı-hacim oranı (Aguilar-Pérez vd., 2020), • Yüzey modifikasyon kabiliyeti (Lee, 2020), • Artan etkinlik ve terapötik indeks (Rao vd., 2019), • Yüksek ilaç yükleme kapasitesi (Magsoudi vd., 2022), • Düşük toksisite (Honda vd., 2013), • Yüksek biyoyararlanım (Balakrishnan vd., 2022), • Yüksek geçirgenlik (Kumar vd., 2022), • Yüksek biyouyumluluk (Sercombe vd., 2015), • Sürekli ve kontrollü salım sistemi (Akbarzadeh vd., 2013), • Hem hidrofilik hem hidrofobik bileşenleri enkapsülleme yeteneği (Nakhaei vd., 2021), • Lipofilik ve amfifilik ilaçların çözünürlüğünün iyileştirilmesi (Akbarzadeh vd., 2013), • Süspansiyon, aerosol, yarı katı ve toz gibi farklı formlarda bulunabilirliği (Magsoudi vd., 2022) yer almaktadır. Lipozomların dezavantajları arasında; • Yüksek üretim maliyeti (Nakhaei vd., 2021), • Kısa yarılanma ömrü (Magsoudi vd., 2022), • Fosfolipitlerin hidrolize (Wang, 2021) ve oksidasyona uğraması (Rao vd., 2019), • Zayıf stabilite (Maja vd., 2020), • Kapsüllenmiş ilaç/moleküllerin sızıntısı ve füzyon (Akbarzadeh vd., 2013), • Gastrointestinal sistemde dayanıksızlık (Lee, 2020), • Zayıf biyodağılım (Boehm, 2016), • Sıvı halde fiziksel kararsızlık (Kumar vd., 2022) yer almaktadır. 3 7 Geleneksel lipozom dispersiyonları uzun süreli depolama, ışık, sıcaklık değişimi, asidik ve bazik ortam gibi harici stres faktörlerinin bir sonucu olarak kararsız olabilir ve bu da potansiyel olarak kısa raf ömrü ile sonuçlanabilir. Lipozomlar topaklanabilir, çökelebilir, partikül boyutunda artış meydana gelebilir bu da kapsüllenmiş bileşiklerin sızmasına veya bozulmasına neden olabilir (Cui vd., 2021; Li vd., 2021). Buna ek olarak, lipozomlar genellikle oral preparatlarda kullanılır, ancak vücutta emilirken ve sindirilirken asitlerden ve enzimlerden kolayca etkilenebilir (Cui vd., 2021). Gastrointestinal sistemdeki pH, safra tuzları ve enzimler lipozom membranını destabilize edebilir. Midenin asidik pH’si ve lipazlar, lipozomları oluşturan fosfolipitlerin ester bağlarını hidrolize eder. Safra tuzları yüzey aktif maddeler gibi davranarak lipozom membranının çözünmesine yol açar (Sebaaly vd., 2021). Oral uygulama için belirgin avantajları olmasına rağmen, sindirim enzimlerine karşı dayanıksızlığı, düşük stabiliteye sahip olması, enzimatik bozunmaları, ilaçların hedef bölgelerine ulaşmadan önce meydana gelen hızlı sızıntı nedeniyle uygulamayı kısıtlamaktadır (Kumar vd., 2020; Sağıroğlu, 2021). Geleneksel lipozomlar, kullanımlarıyla ilgili sorunların üstesinden gelmek için yüzey işlevselleştirme olanağı ve alanı sağlar. Bu amaçla lipozomların lipit bileşimini değiştirmek, gangliosidler veya sialik asit ile ya da polimerlerle yüzey modifikasyonu yoluyla lipozomların arayüzey özelliklerini ayarlamak, lipozomların dahil olduğu etkileşimleri (yani lipozom-lipozom, lipozom-serum proteinleri) değiştirmek için yaygın olarak kullanılan yaklaşımlardır. Lipozomların polimerlerle yüzey modifikasyonu lipozomların yüzeyine polimer aşılanması ve lipozom yüzeyinin fiziksel olarak polimerlerle kaplanması yolları ile gerçekleştirilir. Lipozomların dış yüzeyi, spesifik olmayan (elektrostatik, dipol-yük, hidrojen-bağı, Van der Waals) etkileşimler yoluyla polimerlerin adsorpsiyonuna izin verir. Tek bileşenli hidrofilik polimerlerin lipozom yüzeyine doğrudan adsorpsiyonu, modifiye edilmiş polimerlerin lipit çift katmanına dahil edilmesi, polimerlerin yüzeye çapraz bağlanması ve zıt yüklü polimerlerin katman katman (LbL) biriktirilmesi en yaygın kullanılan yaklaşımlar arasındadır (Cao vd., 2022). 3 8 2.5. Katman Katman (LbL) Biriktirme Yöntemi Katman katman (LbL) biriktirme yöntemi, sulu çözeltiden yüklü polielektrolitleri bir araya getirmek için çok yönlü ve basit bir tekniktir. Decher tarafından 1921 yılında nanoyapılı filmler oluşturmak için LbL yöntemi kullanılarak polielektrolitlerin bir araya getirilmesine ilişkin yapılan ilk çalışmadan bu yana, konu ilaç dağıtımı da dahil olmak üzere çeşitli biyomedikal uygulamalar için geniş çapta araştırılmıştır. LbL yöntemi başlangıçta düz alt tabakalar üzerinde gösterilmiş ve daha sonra küresel alt tabakalara doğru genişletilmiştir (Kurapati vd., 2019). LbL yöntemi basitçe zıt yüklü malzemelerin çok katmanlarını sırayla biriktirerek ultra ince bir film üretimini ifade eder. Genel olarak, LbL işlemi, substrat yüzeyinde tamamlayıcı malzemelerin adsorpsiyonunu sağlamak için yüklü bir substratın polikatyon ve polianyon çözeltilerine sırasıyla maruz bırakılmasını içerir (Liu vd., 2019). LbL yönteminde elektrostatik çekim, hidrojen bağı, hidrofobik etkileşimler, yük transferi, Van der Waals kuvvetleri ve kovalent bağ etkileşimleri uygulansa da elektrostatik çekim, LbL yapılarının oluşturulmasında en yaygın kullanılan itici güçtür (Cao vd., 2022; Hermal vd., 2020). Polielektrolitler, yüklü olabilen veya uygun koşullar altında yüklü hale gelebilen fonksiyonel gruplar taşıyan makromoleküllerdir (Anirudhan vd., 2017). LbL yönteminde sentetik polielektrolitler (poli (etilenimin), poli (akrilik asit), poli (metakrilik asit), poli (L-Lisin)), yarı sentetik polielektrolitler (ksantan, modifiye kitosan) ve doğal polielektrolitler (kitosan, aljinik asit, hyaluronik asit, kolajen, jelatin, kondroitin sülfat, pektin, dekstran, gamlar) kullanılır. İyonik yüklerine bağlı olarak, polielektrolitler polianyonlar, polikatyonlar ve poliamfolitler (amfoterik hem pozitif hem de negatif yüklü) olarak sınıflandırılabilir (Petrila vd., 2021, Criado-Gonzalez vd., 2021. Polielektrolit çoklu katmanlar, polielektrolitlerin LbL yöntemi kullanılarak diğer yüklü/yüksüz moleküllerle kendi kendine birleşmesiyle elde edilen ince organik filmlerdir. İlk katman, zıt yüklere sahip bir desteğin yüzeyinde bir polielektrolitin adsorpsiyonu ile oluşturulur. Daha sonra, polielektrolit katmanları adsorbe edilebilir ve substratın iyonik yükünün bir fonksiyonu olarak Substrat/ (Polikatyon/Polianyon)n veya Substrat/(Polianyon/Polikatyon)n yapısına sahip nanoyapılı bir film oluşturulabilir (Şekil 2.17) (Petrila vd., 2021 (Richardson vd., 2016)). 3 9 Şekil 2.16. LbL yöntemi ile film oluşumu LbL yönteminde substrat olarak ilaçlar, peptitler, DNA, hormonlar ve enzimler, lipit veziküller, nanopartiküller lipozomlar da dahil olmak üzere birçok farklı taşıyıcı sistem kullanılabilir (Şekil 2.18) (Patil vd., 2022; Song vd., 2023). LbL substrat olarak veziküller veya lipozomlar kullanıldığında fazla bağlanmamış malzemenin uzaklaştırılması daha da karmaşık hale gelmekte ve bazı durumlarda her bir çift katman için üç farklı adımı içermektedir: § İlk katmanlama çözeltisi, ilk katmanı oluşturmak için veziküller/lipozomlar içeren seyreltilmiş bir süspansiyona eklenir; § İkinci katmanlama çözeltisi, polielektrolitle modifiye edilmiş veziküller/lipozomlar içeren dispersiyona eklenir ve ilk katmanın biriktirilmesinden sonra ortaya çıkan fazla bağlanmamış malzeme, ikinci katmanın ve interpolielektrolit komplekslerinin oluşumuna yol açar; 4 0 § İnterpolielektrolit kompleksleri santrifüjleme yoluyla çökeltilir ve polielektrolitle modifiye edilmiş vezikülleri/lipozomları içeren bir dispersiyon elde edilir (Jeon vd., 2015; Mateos-Maroto vd., 2022). Şekil 2.17. LbL yönteminin lipozomlara uygulanması LbL yöntemi lipozom lipit bileşimini değiştirmek karşılaştırıldığında, LbL lipozom stabilitesini iyileştirmek için ekonomik ve basitleştirilmiş bir yöntem olarak tanımlanmıştır. LbL’nin en önemli avantajlarından biri kaplama katmanlarının lipit hidrolizini önlemek, çevresel stabiliteyi arttırmak ve bileşiklerin salınımını kontrol etmek için bariyer görevi görebilmesidir (Chun vd., 2013; Song vd., 2023). LbL yöntemiyle lipozomların yüzeyinin modifiye edilmesi, aktif maddelerin taşınmasının ve salınmasının iyileştirilmesi, dolaşım süresinin uzatılması, kalın polimer tabakası nedeniyle oksijene maruz kalmanın ve dolaylı olarak lipit oksidasyonunun azalması ve yüklü bileşenlerin sızıntısının azalması gibi olumlu etkilere sahiptir (Pasarin vd., 2023). Böylece pH ve iyonik güç dahil olmak üzere çevresel koşullar, gastrointestinal sistemde depolama ve sindirim açısından lipozomların stabilitesinde önemli bir rol oynamaktadır (Liu vd., 2016). Ayrıca farmakokinetik profiller gibi özellikleri geliştirerek in vivo biyolojik performansı da arttırabilirler (Jeon vd., 2015). LbL, özellikle en dış katmanın çok yönlülüğü, ilaç dağıtım sistemlerine sterik stabilite, aktif hedefleme, çevresel duyarlılık ve bunlarla sınırlı olmamak üzere çok çeşitli özellikler ve işlevler sağlar (Patil vd., 2022). Sadece bileşim, nanometre aralığında kalınlık, yüzey yükü, geçirgenlik ve esneklik açısından ayarlanabilir özelliklere sahip katmanlı bir sistem oluşturma kabiliyetine sahiptir (Sakr vd., 2015). 4 1 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal 3.1.1. Alpinia officinarum rizomu Tez kapsamında kullanılan A. officinarum Türkiye/Bursa/Nilüfer ilçesinde bulunan bir aktardan ticari olarak satın alınmıştır ve daha sonra analizler için kullanılmıştır. 3.1.2. Tez kapsamında kullanılan cihazlar Tez kapsamında yapılan çalışmalarda kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları Çizelge 3.1’de verilmiştir. Çizelge 3.1. Kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları Cihaz Marka ve Model Kullanım Amacı Analitik terazi Mettler Toledo, A. officinarum ve analizlerde MS105DU kullanılacak kimyasalların tartımında kullanıldı. Galangin ekstraksiyonunda, Çoklu manyetik karıştırıcı Wisd, MS-MP8 lipozomların kaplanmasında ve çözeltilerin hazırlanmasında kullanıldı. Döner buharlaştırıcı Bibby Scientific, RE100 Lipozomların hazırlanmasında kullanıldı. FE-SEM (Alan Emisyonlu Lipozomların yüzey Taramalı Elektron Carl Zeiss, Gemini morfolojisinin ve boyutunun Mikroskobu) belirlenmesinde kullanıldı. FTIR (Fourier Dönüşümlü Perkin Elmer, Spectrum Lipozomların yapı Kızılötesi Spektroskopisi) 100 analizlerinde kullanıldı. Lipozom çözeltilerinin Liyofilizatör Labconco, FreeZone 2,5 Plus liyofilize edilmesi için kullanıldı. 4 2 Çizelge 3.1. Kullanılan cihazlar ve kullanım amaçları (Devam) Cihaz Marka ve Model Kullanım Amacı Lipozomların pH metre Hanna, HI 221 hazırlanmasında ve çözeltilerin hazırlanmasında kullanıldı. Saf su cihazı Elga Purelab, Option Q Analizlerde kullanılan saf DV25 suyun ve ultra saf suyun temininde kullanıldı. Lipozomların Santrifüj Hettich, EBA 20 hazırlanmasında ve enkapsülasyon etkinliği analizinde kullanıldı. In vitro ilaç salım ve Sıcaklık programlı çalkalayıcı Mikrotest, MCI 55 D gastrointestinal sindirim analizlerinde kullanıldı. Ultrasonik banyo ISOLAB, 621.06.003 Lipozomların ve örneklerin hazırlanmasında kullanıldı. In vitro ilaç salım, UV-GB gastrointestinal sindirim ve Spektrofotometresi Varian, Cary 50 Conc stabilite analizlerinde kullanıldı. Havlıcanda bulunan Yüksek performanslı sıvı galanginin kalitatif, kantitatif kromatografisi-Diod serili Agilent Technologies, dedektör (HPLC-DAD) 1200 Series analizinde ve enkapsülasyon etkinliğinin belirlenmesinde kullanıldı. Lipozomların hidrodinamik Zeta Potansiyel ölçüm Malvern, Zetasizer Nano- çap, zeta potansiyeli ve cihazı ZS polidispersite indeksinin belirlenmesinde kullanıldı. 4 3 3.1.3. Tez kapsamında kullanılan kimyasallar Tez kapsamında yapılan çalışmalarda kullanılan kimyasallar Çizelge 3.2’de verilmiştir. Çizelge 3.2. Kullanılan kimyasallar Kimyasal Adı Firma Katalog Numarası ABTS Sigma-Aldrich A1888 Alüminyum klorür Merck 101084 Asetik asit Merck 100063 Asetonitril Sigma-Aldrich 34851 Bakır (II) sülfat pentahidrat Sigma-Aldrich 209198 Disodyum hidrojen fosfat ISOLAB 960066 Etanol Merck 100983 Folin-Ciocalteu reaktifi Sigma-Aldrich F9252 Etanol Merck 100983 Folin-Ciocalteu reaktifi Sigma-Aldrich F9252 Formik asit Merck 100264 Galangin Extrasynthese 1114 S Gallik asit Sigma-Aldrich 27645 Gam Arabik Sigma-Aldrich G9752 Hidroklorik asit Merck 100314 Kitosan Sigma-Aldrich 448877 Kolesterol Biosynth FC28806 Kuersetin Sigma-Aldrich Q4951 4 4 Çizelge 3.2. Kullanılan kimyasallar (Devam) Kimyasal Adı Firma Katalog Numarası Metanol Merck 106007 Pankreatin Sigma-Aldrich P3292 Pepsin Sigma-Aldrich 77160 Potasyum dihidrojen fosfat ISOLAB 960066 Potasyum persülfat Merck 105091 Safra tuzu Edukim F0499 Sodyum asetat trihidrat Sigma-Aldrich S8625 Sodyum hidroksit Sigma-Aldrich 795429 Sodyum karbonat Sigma-Aldrich 791768 Sodyum klorür TEKKİM 170540 Sodyum potasyum tartarat Sigma-Aldrich 217255 Soya Fosfatidilkolin Tito E322 Troloks Sigma-Aldrich 238813 3.1.4. Tez kapsamında kullanılan sarf malzemeler Tez kapsamında kullanılan sarf malzemeler Çizelge 3.3’te verilmiştir. Çizelge 3.3. Çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler Malzeme Adı Firma Katalog Numarası Özellikleri Diyaliz torbası Biobasic TX0112 44 mm x 2 m Mikropipet Eppendorf Z683825 100 – 1000 μL Mikropipet Eppendorf Z683833 500 – 5000 μL 4 5 3.1.5. Tez kapsamında kullanılan çözeltiler Toplam fenolik madde analizinde kullanılan çözeltiler § Folin-Ciocalteu çözeltisi (2 N): Folin-Ciocalteu reaktifinin 1:3 oranında saf su ile seyreltilmesiyle hazırlanmıştır. § Gallik asit çözeltisi (1000 ppm): 0,1 g gallik asit az miktarda metanol ile çözülüp 100 mL’ye metanol ile tamamlanarak hazırlanmıştır. § Lowry A çözeltisi: 0,1 M NaOH içinde %2’lik Na2CO3 çözülerek hazırlanmıştır. § Lowry B çözeltisi: %1’lik NaKC4H4O6 içinde %5’lik CuSO4 çözülmesiyle hazırlanmıştır. § Lowry C çözeltisi: Lowry A ve Lowry B çözeltileri 50:1 oranında karıştırılarak hazırlanmıştır. ABTS analizinde kullanılan çözeltiler § ABTS radikal çözeltisi: 7 mM ABTS çözeltisi içinde 2,45 mM K2S2O8 su ile çözülerek 24 sa boyunca karanlık ortamda bekletilmiştir. 24 sa sonra ABTS radikal çözeltisi su ile 1:10 oranında seyreltilerek hazırlanmıştır. § Troloks çözeltisi (1000 ppm): 0,1 g troloks metanol ile çözülüp toplam hacim 100 mL’ye tamamlanarak hazırlanmıştır. Kromatografik analizlerde kullanılan çözeltiler § Galangin çözeltisi (1000 ppm): 0,1 g galangin metanol ile çözülerek balon jojede 100 mL hacme tamamlanmıştır. § Formik asit çözeltisi (%1): 10 mL derişik formik asit çözeltisi bir miktar ultra saf su içerisinde çözülürek son hacim ultra saf su ile 1 L’ye balon jojede tamamlanmıştır. 4 6 Galangin yüklü lipozomların hazırlanmasında kullanılan çözeltiler § Kolesterol çözeltisi (5 mg/mL): 500 mg kolesterol etanol ile çözülürek balon jojede 100 mL hacme tamamlanmıştır. § Fosfatidilkolin çözeltisi (20 mg/mL): 2 g soya fosfatidilkolin etanol ile çözülürek balon jojede 100 mL hacme tamamlanmıştır. Galangin yüklü lipozomların modifiye edilmesinde kullanılan çözeltiler § Kitosan çözeltisi (%0,625): 0,6250 g kitosan 99,3750 g, %1 glasiyel asetik asit içeren ultra saf su ile çözülerek 12 sa 200 rpm karıştırma hızında karıştırılmıştır ve 0,45 µm PVDF filtreden süzülürek 1 N NaOH ile pH 5,5’e ayarlanmıştır. § Gam arabik çözeltisi (%2): 2 g gam arabik 98 g ultra saf su ile çözülürek 12 sa 200 rpm karıştırma hızında karıştırılmıştır. Hazırlanan çözelti 0,45 µm PVDF filtreden süzülürek 1 N NaOH ile pH 5,5’e ayarlanmıştır. In vitro ilaç salım analizinde kullanılan çözeltiler § Standart galangin çözeltisi (1000 ppm): 100 mg galangin metanol ile çözülürek balon jojede 100 mL hacme tamamlanmıştır. § Fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS): 7,6500 g NaCl, 0,7240 g Na2HPO4 ve 0,2100 g KH2PO4 ultra saf su ile çözülerek 1 L’ye tamamlanmış ve 1 N NaOH ile pH 7,4’e ayarlanmıştır. In vitro gastrointestinal sindirim analizinde kullanılan çözeltiler § Simüle mide sıvısı çözeltisi (SGF): 1 g NaCl ve 1,6 g pepsin saf su ile çözülerek toplam hacim 500 mL’ye tamamlanmıştır ve pH 2,0 ± 0,2 ayarlanmıştır. § Simüle bağırsak sıvısı çözeltisi (SIF): 3,4 g KH2PO4 ve 38,5 mL 0,2 N NaOH saf su ile çözülmüştür. Hazırlanan çözeltiye 0,625 g pankreatin ve 1,5 g safra tuzu eklenerek çözelti hacmi 500 mL’ye tamamlanmıştır ve pH 7,0 ± 0,2’ye ayarlanmıştır. 4 7 3.2. Yöntem 3.2.1. A. officinarum rizomlarından galangin ekstraksiyonu A. officinarum rizomlarından galangin ekstraksiyonu için 20 g öğütülmüş rizom tartılarak yuvarlak tabanlı cam şişelere koyulmuştur. Şişelere 100 mL etanol eklenerek ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda oda sıcaklığında 4 sa karıştırılmıştır. Elde ed}len ekstrakt kullanılana kadar 4°C’de buzdolabında saklanmıştır. 3.2.2. Kromatografik analiz A. officinarum ekstraktında bulunan fenolik maddelerin analizi A. officinarum ekstraktında bulunan fenolik maddelerin belirlenmesi için yüksek performanslı sıvı kromatografisi-fotodiod serili dedektör cihazı (HPLC-DAD) kullanılmıştır. HPLC-DAD cihazı otomatik örnekleyici, degazer, ikili pompa ve fotodiyot serili dedektör içermektedir. Analiz için enjeksiyon hacmi 10 µL ve akış hızı 0,6 mL/dk’dır. Kullanılan analiz programı %1’lik formik asit ve asetonitrilden oluşan gradient hareketli faz programıdır (Çizelge 3.4). Analizler C18 (XBridge®, 3,5 μm, 4,6 x 250 mm) kolonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Toplam analiz süresi 36 dk’dır (Şahin vd., 2016). Çizelge 3.4. HPLC-DAD gradient hareketli faz programı Hareketli faz bileşimi Süre (dk) %1’lik formik asit (%) Asetonitril (%) 0 90,0 10,0 10 87,0 13,0 20 58,5 41,5 25 30,0 70,0 35 90,0 10,0 36 90,0 10,0 4 8 3.2.3. Spektroskopik analizler A. officinarum ekstraktının toplam fenolik madde miktarı, toplam flavonoid miktarı ve toplam antioksidan kapasite değeri aşağıdaki yöntemlerle belirlenmiştir. Toplam fenolik madde analizi A. officinarum ekstraktının toplam fenolik madde analizi Folin-Ciocalteu yöntemi ile belirlenmiştir (Singleton vd., 1965). Bu yöntemde 100 μL ekstrakt üzerine 1900 μL saf su, 2500 μL Lowry C çözeltisi ve 0,25 mL seyreltilmiş Folin-Ciocalteu reaktifi eklenip 30 dk karanlıkta bekletilmiştir. Örneklerin 750 nm’de absorbansları ölçülmüştür. Folin- Ciocalteu yönteminde standart olarak gallik asit kullanılmıştır. Kalibrasyon grafiği oluşturmak için farklı derişimlerde gallik asit çözeltileri hazırlanmıştır (Çizelge 3.5). Çizelge 3.5. Folin-Ciocalteu yöntemi için kalibrasyon verileri Konsantrasyon aralığı (ppm) Doğru denklemi R2 1-60 y= 0,0314x - 0,0015 0,9978 Her bir standardın 750 nm dalga boyunda absorbansı okunarak kalibrasyon grafiği çizilmiştir. Kalibrasyon grafiğinden yararlanarak toplam fenolik madde “mg gallik asit eş değeri (GAE)/g örnek” cinsinden belirlenmiştir (Karkar ve Şahin, 2022; Şahin vd., 2014). Toplam antioksidan kapasite analizi A. officinarum ekstraktının toplam antioksidan kapasite analizi ABTS yöntemi ile belirlenmiştir. 100 μL örnek, 3900 μL etanol ve 1 mL seyreltilmiş ABTS çözeltisi eklenerek 6 dk sonra 734 nm’de absorbansları ölçülmüştür (Aörnek). Ölçümler sonucunda örnekler için % inhibisyon değerleri Eşitlik 3.1’e göre hesaplanmıştır. A − A % İnhibisyon = !ö# ö#$%!A × 100 (3.1) !ö# 4 9 ABTS antioksidan kapasite analizi çalışmalarında standart olarak troloks kullanılmıştır. Kalibrasyon grafiği oluşturmak için farklı konsantrasyonlarda troloks çözeltileri hazırlanmıştır (Çizelge 3.6). Her bir standardın 734 nm dalga boyunda absorbansı okunarak % inhibisyon değerleri hesaplanmıştır ve troloks miktarına (mg) göre grafiğe geçirilmiştir. Kalibrasyon grafiğinden yararlanarak toplam antioksidan kapasite “mg troloks eşdeğeri (TE)/g örnek” cinsinden belirlenmiştir (Karkar vd., 2021; Re vd., 1999). Çizelge 3.6. ABTS yöntemi için kalibrasyon verileri Konsantrasyon aralığı (ppm) Doğru denklemi R2 0,3-10 y = 8,8122x – 2,2937 0,9981 Toplam flavonoid analizi A. officinarum ekstraktının toplam flavonoid analizi alüminyum klorür kolorimetrik yöntemi ile belirlenmiştir (Formagio vd., 2014). 0,5 mL örnek, 1,5 mL %95’lik etanol, 0,1 mL %10’luk AlCl3.6H₂O çözeltisi, 0,1 mL 1 M NaC₂H3O₂.3H₂O çözeltisi ve 2,8 mL saf su ile karıştırılmıştır ve 30 dk boyunca karanlıkta bekletilmiştir. Örnek absorbansları 415 nm’de UV-GB spektrofotometresi ile ölçülmüştür. Toplam flavonoid analizinde standart olarak kuersetin kullanılmıştır. Kalibrasyon grafiği oluşturmak için farklı konsantrasyonlarda kuersetin (QE) çözeltileri hazırlanmıştır (Çizelge 3.7). Her bir standardın 415 nm dalga boyunda absorbansı grafiğe okunarak % inhibisyon değerleri hesaplanarak troloks miktarına (mg) göre grafiğe geçirilmiştir. Kalibrasyon grafiğinden yararlanarak ekstraktların antioksidan kapasite değerleri “mg kuersetin eşdeğeri (QE)/g örnek” şeklinde hesaplanmıştır. Çizelge 3.7. Toplam flavonoid analizi için kalibrasyon verileri Konsantrasyon aralığı (ppm) Doğru denklemi R2 0,5-10 y = 0,1053x – 0,0061 0, 9996 5 0 3.2.4. Kemometrik analizler Galangin yüklü lipozomların hazırlanması için ince film hidrasyon tekniği kullanılmıştır. Galangin yüklü lipozomların maksimum enkapsülasyon etkinliği ile üretilebilmesi için çeşitli parametreler Merkezi Kompozit Dizayn-Yanıt Yüzey Metodolojisi (RSM-CCD) ile optimize edilmiştir. Birçok durumda, bazı kontrol edilebilir değişkenleri (faktörleri) bir yanıtla ilişkilendiren teorik model ya mevcut değildir ya da çok karmaşıktır. Bu durumda, faktörler ve yanıt arasındaki ilişki hakkındaki bilgilerin ampirik bir şekilde elde edilmesi gerekir. Box ve Wilson tarafından tanıtılan yanıt yüzeyi metodolojisi (RSM), amacı ampirik bir modelle ortaya konan problemleri analiz etmek olan matematiksel ve istatistiksel teknikler bütünüdür (Sarabia ve Ortiz, 2009). RSM deneysel tasarımı ve buna eşlik eden doğrusal regresyon analizini kullanır (Fu, 2015). Deneysel tasarıma dayalı yanıt yüzeyi metodolojisi (RSM), deneylerin tasarlanması ve etki süreci değişkenlerinin optimize edilmesi için kullanılır (Kumari ve Gupta, 2019). Daha basit bir tanımla RSM, ilgilenilen bir yanıt olan y ile x1, x2, …, xk ile gösterilen bir dizi ilişkili kontrol (veya girdi) değişkeni arasında uygun bir fonksiyonel ilişkinin geliştirilmesinde kullanılır (Khuri ve Mukhopadhyay, 2010). RSM’nin amaçları aşağıdaki gibidir (Sarabia ve Ortiz, 2009): • Deneysel değişkenliği (saf hata) güvenilir bir şekilde tahmin etmek, • Önerilen model ile deneysel veriler arasındaki uyumluluğu garanti etmek (uyum eksikliğini tespit etmeyi kolaylaştırmak), • Gözlenen yanıtı, deneysel alan içinde deney yapılmayan noktalarda mümkün olduğunca tam ve kesin olarak tahmin etmek, • Elde edilen sonuçlara göre deneylerin farklı alternatiflerle gerçekleştirilmesi için sıralı stratejiler önermek, • Ekonomik maliyet, zaman ve diğer pratik sınırlamalar açısından yüksek verimliliği korumak, • Belirsizlik koşulları altında karar vermeyi mümkün kılmak, belirsizliği azaltmak. 5 1 Bu doğrultuda lipozom üretimi için kullanılan dört faktörlü (PC: L-α-Fosfatidilkolin, CHOL: kolesterol, GA: galangin), beş seviyeli RSM-CCD kullanılmıştır. RSM-CCD için için kullanılan faktörler ve kodlanmış seviye değerleri Çizelge 3.8’de verilmektedir. Çizelge 3.8. CCD için faktörler ve kodlanmış seviye değerleri Faktörler Seviye -2 -1 0 1 2 PC oranı (mg:mL) 1 3 5 7 9 CHOL oranı (mg:mL) 0,2 0,6 1 1,4 1,8 Ultrasonikasyon zamanı (dk) 15 25 35 45 55 GA oranı (mg:mL) 0,055 0,110 0,165 0,220 0,275 Merkezi kompozit dizaynda faktörler ve 5 seviye aralığı belirlendikten sonra deney sayısı (N), Eşitlik 3.2 ile belirlenir. N = 2k + 2k + 1 + x0 (3.2) k, faktör sayısı ve x0, tekrarlanan deney sayısını ifade etmektedir. Formüldeki 2k full faktöriyel veya fraksiyonlu faktöriyel dizayndaki deney sayılarını, 2k star dizayn deney sayısını ve 1 ise orta seviyedeki deney sayısını göstermektedir. 2k’daki seviyeler (-1) ve (+1), 2k’dakiler ±α, 1’deki ise (0) dır. Optimizasyon çalışmaları için 30 deney (24+2.4+6=30) yapılmıştır. Dairesel dizaynda α Eşitlik 3.3 kullanılarak hesaplanmaktadır (Şahin vd., 2016). α = ± 4 2k (3.3) Merkezi kompozit dizayn çizelgesi Çizelge 3.9’da verilmiştir. 5 2 Çizelge 3.9. CCD çizelgesi Faktörler x1 x2 x3 x4 Deney PC oranı CHOL oranı Ultrasonikasyon GA oranı (mg:mL) (mg:mL) zamanı (dk) (mg:mL) 1 3 0,6 25 0,2 2 7 0,6 25 0,2 3 3 1,4 25 0,2 4 7 1,4 25 0,2 5 3 0,6 45 0,2 6 7 0,6 45 0,2 7 3 1,4 45 0,2 8 7 1,4 45 0,2 9 3 0,6 25 0,4 10 7 0,6 25 0,4 11 3 1,4 25 0,4 12 7 1,4 25 0,4 13 3 0,6 45 0,4 14 7 0,6 45 0,4 15 3 1,4 45 0,4 16 7 1,4 45 0,4 17 1 1 35 0,3 18 9 1 35 0,3 19 5 0,2 35 0,3 20 5 1,8 35 0,3 21 5 1 15 0,3 22 5 1 55 0,3 23 5 1 35 0,1 24 5 1 35 0,5 25 5 1 35 0,3 26 5 1 35 0,3 27 5 1 35 0,3 28 5 1 35 0,3 29 5 1 35 0,3 30 5 1 35 0,3 5 3 RSM-CCD kapsamında yapılan 30 deney için enkapsülasyon etkinliği hesaplanarak yanıt değerleri için Design Expert 7.0.0 (Stat-Ease inc. USA) programı kullanılarak ANOVA analizi yapılmıştır. ANOVA analizi yapılarak Eşitlik 3.4’te verilen ikinci dereceden denklem ile tahmini değerler ve dört faktör için optimum değerler hesaplanmıştır. Bulunan optimum faktör değerlerinde yapılmış 3 tekrarlı deneyler ile deneysel enkapsülasyon etkinliği hesaplanarak modelle bulunan tahmini değerler ile karşılaştırılmıştır. ( ( . ( 𝑦 = 𝑏& +4𝑏'𝑥' +4𝑏 +''𝑥' +4 4 𝑏',𝑥'𝑥, (3.4) ')* ')* ')* ,)'-* y: yanıt, b0: sabit terim, bi: doğrusal etkileşim sabiti, bii: parabolik etkileşim sabiti, bij: parametre etkileşim sabiti, xi ve xj: bağımsız değişkenler Eşitlik 3.4’te verilen eşitlik ile tanımlanan model RSM’de yaygın olarak kullanılmaktadır. Böyle bir model üç yönlü olarak ele alınır ve amaçları şu şekildedir (Khuri ve Mukhopadhyay, 2010): 1. y ile x1, x2, …, xk arasında, kontrol değişkenlerinin belirli kombinasyonları için yanıt değerlerini tahmin etmek amacıyla kullanılabilecek, yaklaşık da olsa bir ilişki kurmak, 2. Hipotez testi yoluyla seviyeleri x1, x2, …, xk ile temsil edilen faktörlerin anlamlılığını belirlemek, 3. Belirli bir ilgi bölgesi üzerinde maksimum (veya minimum) yanıtla sonuçlanan x1, x2, …, xk optimum kombinasyonlarını belirlemek. ANOVA analizi sonucunda maksimum enkapsülasyon etkinliğinin sağlanmasında etkili olan faktörler belirlenmiştir. RSM kullanılarak etkili faktörlerin ikili etkileşimlerinin enkapsülasyon etkinliği üzerindeki etkisi yanıt yüzey grafikleri çizilerek incelenmiştir. 5 4 3.2.5. Galangin yüklü lipozomların hazırlanması Galangin yüklü lipozomlar ince film hidrasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. Galangin yüklü lipozomların hazırlanması için Çizelge 3.8’de verilen PC oranı, CHOL oranı, ultrasonikasyon zamanı ve GA oranı kullanılarak 30 deney yapılmıştır. Şekil 3.1. Galangin yüklü lipozomların hazırlanması PC (0,1-0,9 mg:mL), CHOL (0,2-0,8 mg:mL) ve GA, (0,1-0,5 mg:mL) cam balonlarda etanol ile (toplam hacim 25 mL) çözülmüştür ve 40°C’de ultrasonik banyoda (15-55 dk) bekletilmiştir. Daha sonra etanol döner buharlaştırıcı ile 55°C’de uzaklaştırılmıştır (Şekil 3.1). Elde edilen ince lipit film, 55°C’de 10 mL ultra saf su ile hidratlanmıştır. Daha sonra elde edilen dispersiyon 0,45 µm PVDF filtreden süzülmüştür (Zhu vd., 2018). 3.2.6. Galangin yüklü lipozomların enkapsülasyon etkinliğinin belirlenmesi Galangin yüklü lipozomların enkapsülasyon etkinliğinin belirlenmesi için lipozomlar 6 sa boyunca 6000 rpm’de santrifüjlenmiştir ve santrifügat HPLC-DAD ile analiz edilmiştir. Eşitlik 3.5’e göre enkapsülasyon etkinliği hesaplanmıştır: GA − GA Enkapsülasyon etkinliği (%) = /0ş20$34ç 678%#$090$9GA × 100 (3.5) /0ş20$34ç GAbaşlangıç: başlangıç galangin konsantrasyonu, GAsupernatant: enkapsüle edilmeyen galangin konsantrasyonu 5 5 3.2.7. Galangin yüklü lipozomların kitosan-gam arabik ile modifiye edilmesi Elde edilen optimum lipozomlar kitosan (polikatyon, CH) ve gam arabik (polianyon, GUA) ile katman katman biriktirme tekniği ile kaplanmıştır. Lipozomlar önce CH ile kaplanarak pozitif yüklenmiş, daha sonra GUA ile kaplanarak tekrar negatif yüklenmiştir. Optimum lipozomların (O-Lipozom) CH ile kaplanması için, 10 mL O-Lipozom, 10 mL CH çözeltisinin içerisine şırınga ile damla damla eklenmiş ve 1 sa boyunca 200 rpm’de çoklu manyetik karıştırıcıda karıştırılmıştır. 1 sa sonunda pH 5,5’e ayarlanarak 30 dk santrifüjlenerek 0,45 µm PVDF filtreden süzülmüştür. CH kaplı optimum lipozomların (CH-Lipozom) gam arabik ile kaplanması için, 20 mL kitosan kaplı optimum lipozom 20 mL GUA çözeltisine damla damla eklenmiştir ve 1 sa boyunca 200 rpm’de çoklu manyetik karıştırıcıda karıştırılmıştır. 1 sa sonunda pH 5,5’e ayarlanarak 30 dk santrifüjlenerek 0,45 µm PVDF filtreden süzülmüştür (Şekil 3.2). Elde edilen gam arabik- kitosan kaplı lipozomlar (GUA-CH-Lipozom) kullanılana kadar +4°C’de buzdolabında saklanmıştır (Liu vd., 2013). Şekil 3.2. Galangin yüklü lipozomların modifiye edilmesi 5 6 3.2.8. Lipozomların karakterizasyonu Lipozomların karakterizasyonu morfoloji, boyut, hidrodinamik çap, polidispersite indeksi, zeta potansiyeli ve FTIR analizleri ile gerçekleştirilmiştir. FTIR analizi Lipozomların yapısal karakterizasyonu FTIR analizi ile gerçekleştirilmiştir. FTIR analizi ile lipozomlara galangin yüklenmesinin ve yüzey modifikasyonunun lipozomların yapısında meydana getirdiği değişiklikler incelenmiştir. Lipozomların FTIR analizi 400- 4000 cm-1 frekans aralığında gerçekleştirilmiştir. Analiz öncesinde örnekler liyofilize edilmiştir (-85°C, 0,1 mbar, LabConco Freezone). FTIR analizi Bursa Uludağ Üniversitesi Kimya Bölümü’nden hizmet alımı şeklinde gerçekleştirilmiştir. Morfoloji ve boyut analizi Lipozomların yüzey morfolojisi FE-SEM ile belirlenmiştir. Analiz öncesinde örnekler liyofilize edilmiştir (-85°C, 0,1 mbar, LabConco Freezone). Liyofilize örnekler karbon bantlar üzerine konularak numune tutuculara yerleştirilmiştir ve yüzeyleri palladyum- altın alaşımı ile kaplanmıştır. Görüntüleme 3,00 kV çözünürlük ve 20,00 KX büyütmede gerçekleştirilmiştir. Morfoloji ve boyut analizi Bursa Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarı’nda hizmet alımı şeklinde gerçekleştirilmiştir. Hidrodinamik çap, polidispersite indeksi ve zeta potansiyeli analizi Lipozomların hidrodinamik çapı, polidispersite indeksi ve zeta potansiyeli Dinamik Işık Saçılımı (DLS)’nı temel alan Malvern Zetasizer Nano-ZS kullanılarak belirlenmiştir. Lipozom numuneleri 30 dk homojenize edilmiş ve ardından 1:10 oranında ultra saf su ile seyreltilmiştir. Seyreltilen numuler 10 dk sonike edilerek ölçümler gerçekleştirilmiştir. Ölçümler 25°C de üç tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. Hidrodinamik çap, polidispersite indeksi ve zeta potansiyeli analizleri Gazi Üniversitesi Merkez Laboratuvarı’nda hizmet alımı şeklinde gerçekleştirilmiştir. 5 7 3.2.9. In vitro ilaç salım çalışması Lipozomların in vitro ilaç salım çalışması diyaliz yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Diyaliz torbaları 40 x 90 mm boyutunda kesilmiş ve 1 gece ultra saf su içerisinde bekletilmiştir. 10 mL O-Lipozom, CH-Lipozom ve GUA-CH-Lipozom diyaliz torbalarına koyulmuştur. Diyaliz torbaları 90 mL pH 7,4 fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi içeren balonlara koyulmuştur. Balonlar 37°C sıcaklığa ve 100 rpm çalkalama hızına ayarlanarak sıcaklık programlı çalkalayıcıya yerleştirilmiştir ve 5 sa boyunca her 30 dk da bir balonlardan örnek alınıp şişelere PBS çözeltisi eklenmiştir. Örneklerin absorbansı 360 nm’de UV-GB spektrofotometresinde okunmuştur. Ortama salınan galangin miktarı, standart galangin çözeltisi kullanılarak hazırlanan kalibrasyon grafiği kullanılarak hesaplanmıştır (Briuglia vd., 2015; Panwar vd., 2010). 3.2.10. İlaç salım kinetiği Lipozomların galangin salım mekanizmasını belirlemek için in vitro salım çalışmasından elde edilen veriler çeşitli ilaç salım kinetik modelleri kullanılarak işlenmiştir. Salım verileri Korsmeyer-Peppas, Hixson-Crowell, Higuchi, sıfırıncı dereceden ve birinci dereceden kinetik modellerine uydurulmuştur (Solanki vd., 2020). Sıfırıncı derece kinetik model Sıfırıncı dereceden salım kinetiği, salım hızının ilacın konsantrasyonundan bağımsız olduğu ve bir ilacın taşıyıcı sistemden sabit salımını tanımlar (Fr ve Venkatesham, 2023). Bu modele göre ilaç seviyesi dağıtım boyunca sabit kalır. Sıfırıncı dereceden ilaç salım kinetiği için model grafiği, kümülatif ilaç salımına (Q) karşı zaman (t) ile çizilir (Baishya, 2017; Lu ve Hagen, 2020). Sıfıncı derece kinetik model denklemi şu şekildedir: 𝑄 = 𝑄& + 𝑘 × 𝑡 (3.6) Q: t anında salınan ilaç miktarı, Q0: başlangıç ilaç miktarı, t: zaman, k: salım sabiti 5 8 Birinci derece kinetik model Birinci dereceden salım kinetiği, salım hızının ilacın konsantrasyonuna bağlı olduğu bir taşıyıcı sistemden ilaç salımını tanımlar (Fr ve Venkatesham, 2023). Bu modele göre ilaç salım hızı ilacın konsantrasyonu ile doğru orantılıdır, konsantrasyon arttıkça ilaç salım hızı artar. Birinci dereceden ilaç salım kinetiği için model grafiği kalan ilacın logaritmasına (%) karşı zaman (t) ile çizilir (Baishya, 2017; Lu ve Hagen, 2020). Birinci derece kinetik model denklemi şu şekildedir: 𝑄E (;<×>)𝑄 = 1 − 𝑒 (3.7) & Q: t anında salınan ilaç miktarı, Q0: başlangıç ilaç miktarı, t: zaman, k: salım sabiti Higuchi kinetik modeli Higuchi salım kinetiği, ilaçların katı bir dozaj formundan salınımını zamana bağlı bir sürecin karekökü olarak tanımlar (Fr ve Venkatesham, 2023). Bu modele göre serbest bırakılan ilaç konsantrasyonu zamanın karekökü ile artar (Trucillo, 2022). İlaç difüzyon ve çözünme yoluyla salınabilir (Ekenna ve Abali, 2022). Higuchi modeli katı bir ilacın granüler bir matristen salınması, çevredeki sıvının eş zamanlı olarak nüfuz etmesini, ilacın çözünmesini ve ilacın interstisyel kanallar veya gözenekler yoluyla dışarı sızmasını içerir (Singhvi ve Singh, 2011). Higuchi ilaç salım kinetiği için model grafiği kümülatif ilaç salımına (Q) karşı zamanın karekökü (t) ile çizilir (Baishya, 2017; Lu ve Hagen, 2020). Higuchi kinetik model denklemi şu şekildedir: * 𝑄 = 𝑘 × 𝑡 @+ (3.8) Q: t anında salınan ilaç miktarı, Q0: başlangıç ilaç miktarı, t: zaman, k: salım sabiti 5 9 Korsmeyer-Peppas kinetik modeli Polimerik bir sistemden ilaç salımını zamanın bir fonksiyonu olarak, fraksiyonel ilaç salımı olarak tanımlar (Singhvi ve Singh, 2012; Trucillo, 2022). Korsmeyer-Peppas ilaç salım kinetiği için model grafiği log kümülatif % ilaç salımına karşı log zaman ile çizilir (Baishya, 2017; Lu ve Hagen, 2020). Grafiğin eğimi ‘n’ ilaç salım mekanizmasını gösterir. n değeri 0,45 ise difüzyon salımı ya da Fickian salımıdır, zamanın kareköküne bağlıdır. 0,45 < n < 0,89 ise Fickian olmayan salımdır, difüzyon ve şişmedir, zamana bağlıdır, birinci derecedendir. n > 0,89 ise salım şişme kontrollüdür, zamandan bağımsızdır ve sıfırıncı dereceden Vaka II taşımasıdır (Ekenna ve Abali, 2022). Korsmeyer-Peppas kinetik model denklemi şu şekildedir: 𝑄 E A𝑄 = 𝑘 × 𝑡 & (3.9) Q: t anında salınan ilaç miktarı, Q0: başlangıç ilaç miktarı, t: zaman, k: salım sabiti, n: difüzyonel salım üssü (ilaç salım mekanizmasını gösterir) Hixson-Crowel kinetik modeli Hixson ve Crowell salım kinetiği, katı bir dozaj formundan ilaç salım hızının, ilaç partiküllerinin yüzey alanı ve dozaj formunda kalan ilaç miktarının küp kökü ile ilişkili olması ile tanımlanır (Fr ve Venkatesham, 2023). Bu modele göre ilaç salım hızı difüzyon ile değil partikül çözünme hızı ile sınırlıdır. Hixon-Crowel salım kinetiği için model grafiği zamana karşı kalan ilaç yüzdesinin küp kökü ile çizilir (Ekenna ve Abali, 2022). Hixson-Crowel kinetik model denklemi şu şekildedir: 𝑄*@. G *@ = 𝑘 × 𝑡 𝑄 . (3.10) & Q: t anında salınan ilaç miktarı, Q0: başlangıç ilaç miktarı, t: zaman, k: salım sabiti 6 0 3.2.11. In vitro gastro-intestinal sindirim çalışması Lipozomların gastro-intestinal sindirim koşullarında galangin salım davranışını belirlemek için ardışık in vitro gastro-intestinal sindirim çalışması gerçekleştirilmiştir. Mide sindirimi için 20 mL O-Lipozom, CH-Lipozom, GUA-CH-Lipozom ve kontrol olarak 9,5 mg/mL galangin ekstraktı balonlara koyularak ve üzerlerine 20 mL SGF eklenmiştir. 37°C’de 100 rpm’de 2 sa boyunca sıcaklık programlı çalkalayıcıda karıştırılmıştır. 0-120 dk boyunca örnek alınıp, şişelere SGF eklenmiştir ve örnekler buz kasetleri içeren soğuk su banyosuna yerleştirilerek sindirim reaksiyonu durdurulmuştur. Daha sonra deney tüpleri 30 dk 6000 rpm’de santrifüjlenmiştir. Bağırsak sindirimi için mide sindirimi sonunda şişelere 40 mL SIF eklenerek bağırsak sindiriminde gerçekleştirilen işlemler gerçekleştirilmiştir. 240 dk boyunca 30 dk aralıklarla toplanan santrifügatların absorbansı 360 nm’de UV-GB spektrofotometresinde ölçülmüştür. Standart galangin çözeltisi kullanılarak çizilen kalibrasyon grafiği ile örneklerdeki galangin konsantrasyonu belirlenmiştir. 3.2.12. Biyoerişilebilirlik çalışması Simüle gastro-intestinal ortamda galanginin biyoerişilebilirliğinin belirlenmesi için in vitro sindirim çalışmasından sonra toplanan örneklerler kullanılmıştır. Örnekler 30 dk boyunca 6000 rpm’de santrifüjlenmiştir. Toplanan süpernatantın biyoaktif bileşiğin çözündüğü misel fraksiyonu olduğu varsayılmıştır. Süpernatantın absorbansı UV-GB spektrofotometresi ile 360 nm’de ölçülerek standart galangin kalibrasyon eğrisi ile misel fazındaki galangin miktarı belirlenmiştir. Galanginin biyoerişilebilirliği Eşitlik 3.11 ile hesaplanmıştır (Altin vd., 2018; Maria Leena vd., 2020; Tan vd., 2014). GA Biyoerişilebilirlik (%) = BC6%2GA × 100 (3.11) 9D820B GAmisel: misel fazındaki galangin miktarı (mg), GAtoplam: lipozomlarda (O-Lipozom, CH- Lipozom, GUA-CH-Lipozom) bulunan toplam galangin miktarı (mg) 6 1 3.2.13. Depolama stabilitesi Lipozomların stabilite çalışması 10 mL O-Lipozom, CH-Lipozom, GUA-CH-Lipozom 28 gün boyunca +4°C’de buzdolabında, -24°C’de buzdolabında ve oda sıcaklığında bekletilerek gerçekleştirilmiştir. 0.gün olarak kabul edilen başlangıç gününde, 1, 7, 14 ve 28. günlerde depolanan lipozomlardan örnekler alınarak, 6000 rpm’de 2 sa santrifüjlenmiş ve enkapsülasyon etkinliği UV-GB spektrofotometresi ile belirlenmiştir. Standart galangin çözeltisi kullanılarak çizilen kalibrasyon grafiği ile örneklerdeki galangin konsantrasyonu belirlenmiştir. 6 2 4. BULGULAR ve TARTIŞMA 4.1. A. officinarum Ekstraktında Bulunan Fenolik Maddelerin Analizi A. officinarum ekstraktında bulunan fenolik maddelerin belirlenmesi için gerçekleştirilen HPLC-DAD analizi sonucunda elde edilen kromatogram Şekil 4.1’de verilmiştir. 1400 1200 1000 800 Galangtn 600 400 200 0 0 5 10 15 20 25 30 35 Z aman (dk) Şekil 4.1. A. officinarum ekstraktının HPLC-DAD kromatogramı HPLC kromatogramına göre alıkonma zamanı 32,61 dk olan bileşenin galangin olduğu belirlenmiştir (Çizelge 4.1). Galangin miktarı standart galangin çözeltisiyle hazırlanan kalibrasyon eğrisi ile belirlenmiştir. Çizelge 4.1. A. officinarum ekstraktının HPLC analizi verileri Fenolik Alıkonma Kalibrasyon R2 LOD LOQ Miktar bileşen zamanı (dk) denklemi (mg/L) (mg/L) (mg/g) Galangin 32,61 y= 52,487x - 3,4043 0,9994 0,0114 0,0380 11,5694 6 3 Şiddet (mAU) HPLC kromatogramına göre en şiddetli pik galangine aittir ve A. officinarum ekstraktının ana bileşeni galangindir. HPLC analizi sonucunda, A. officinarum ekstraktında bulunan galangin miktarı 11,5694 mg/g olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.1). Tao vd. (2006), çalışmalarında on iki farklı bölgeden toplanan A. officinarum rizomlarının biyoaktif flavonoid içeriğini belirlemek için rizomlardan metanol ekstraktı hazırlayarak HPLC analizi gerçekleştirmişlerdir. A. officinarum rizomlarının metanol ekstraktının HPLC analizi sonucunda her ekstraktta galangin ve 3-O-metil galangin olmak üzere iki bileşen tespit edilmiştir. Galangin miktarı ekstrakttaki 3-O-metil galangin miktarından yaklaşık on kat fazla bulunmuştur; analiz edilen tüm örneklerde galangin içeriği 2,63- 11,6 mg/g arasında değişirken, 3-O-metil galangin içeriği 0,240-1,13 mg/g arasında değişmiştir. Bu sonuçlara göre galangin A. officinarum rizomlarının metanol ekstraktının temel bileşenidir. Fang vd. (2018) A. officinarum rizomlarının etil asetat ekstraktındaki antioksidan bileşiklerin görüntülenmesi için DPPH-HPLC analizi gerçekleştirmişlerdir. Buna göre ekstraktlara DDPH reaktifi eklenerek ve eklenmeden HPLC analizi yapılmıştır. Analiz sonunda HPLC kromatogramında iki temel bileşen piki vardır ve DPPH reaktifinin eklenmesiyle bu bileşenlerin pikleri neredeyse yok olmuştur. Buna göre bu pikler A. officinarum etil asetat ekstraktının antioksidan aktivitesinden sorumlu olan bileşiklerdir. HPLC kromatogramına göre iki bileşenden birinin piki diğerinden yaklaşık 2 kat daha şiddetlidir. Bu iki pik hedeflenerek yüksek hızlı karşı akım kromatografisi (HSCCC) ile ayrılmıştır. Sonuç olarak, sırasıyla %99,3 ve %98,5 saflıkta 107 mg bileşik I ve 29 mg bileşik II, 270 mg A. officinarum etil asetat ekstraktından HSCCC ile tek adımda ayrılmış ve saflaştırılmıştır. Saflaştırılan iki bileşiğin yapısı ESI-MS, 1H NMR ve 13C NMR ile aydınlatılmıştır. Buna göre bileşik I galangin, bileşik II kamferiddir, galangin A. officinarum etil asetat ekstraktının temel bileşenidir. Jiao vd. (2019), çalışmalarında on beş farklı bölgeden toplanan A. officinarum rizomlarının etanol ekstraktının (%95) HPLC analizi sonucunda, ekstraktın galangin, galangin-3-metil eter, pinobaksin, kamferid-4-metil eter, 5-hidroksi-1-fenil-7-(4- hidroksifenil)-3-heptanon, 7-(4-hidroksifenil)-1-fenil-4-hepten-3-on, 5-hidroksi-7-(4- 6 4 hidroksi-3-metoksifenil)-1-fenil-3-heptanon, 7-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1-fenil-4- hepten-3-on, 5-hidroksi-1,7-di fenil-3-heptanon içerdiğini belirlemişlerdir. HPLC kromatogramları incelendiğinde ise en şiddetli pikin galangine ait olduğu görülmektedir. Bu doğrultuda farklı bölgelerden toplanmış olsalar da A. officinarum etanolik ekstraktlarının ana bileşeni galangindir ve galangin miktarının 5,46 ile 13,14 mg/g aralığında değişmektedir. Lin vd. (2020), A. officinarum etanol ekstraktının (%80) LC-MS/MS analizi sonucunda ekstraktın kamferid, 3-metil galangin ve galangin olmak üzere üç temel bileşen içerdiğini ve kromatogramda bu bileşenlerden en şiddetli pike ve dolayısıyla en yüksek konsantrasyona galanginin sahip olduğunu belirtmişlerdir. Pirzadeh vd. (2021), A. officinarum rizomlarının hidroalkolik (%40 etanol) ekstraktının HPLC analizi sonucunda ekstraktın kamferol, kuersetin ve galangin içerdiğini ve galangin miktarının 5,8 mg/g olduğunu belirlemişlerdir. Li vd. (2021), A. officinarum’nun %95 etanolik ekstraktının ana bileşeninin galangin olduğunu bildirmiştir. Lee vd. (2017), A. officinarum ekstraktının temel bileşenin galangin olduğunu ve miktarının 1,69 mg/g olduğunu bildirmişlerdir. Wang vd. (2022), geliştirdikleri HPLC-DAD-CAD metodu ile A. officinarum metanol ekstraktında dört diarilheptanoid; 5-hidroksi-7-(4-hidroksifenil)-1-fenil-3-heptanon, 5- hidroksi-7-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1-fenil-3-heptanon, 5-metoksi-1,7-difenilheptan- 3-on, 5-hidroksi-1,7-difenil-3-heptanon ve dört flavonoid; pinocembrin, galangin, kampferid-4′-metil eter, galangin-3-metil eter belirlemişlerdir. Yukarıda verilen çalışmalar incelendiğinde, kullanılan çözücü ve ekstraksiyon tekniği değişse bile her A. officinarum ekstraktında galangin tespit edilmiştir. Buna ek olarak her ekstraktın temel bileşenin galangin olduğu ve en yüksek konsantrasyonda bulunduğu belirtilmiştir. Bu doğrultuda elde edilen sonuçlar literatürdeki pek çok benzer çalışma ile uyumludur. 6 5 4.2. Spektroskopik Analizler A. officinarum ekstraktının spektroskopik analizleri sonucunda elde edilen verilen çizelge 4.2.’de verilmiştir. Buna göre A. officinarum ekstraktının toplam fenolik madde içeriği 113, 6100 ± 3,2854 GAE/g, toplam antioksidan kapasitesi 28,8121 ± 0,0074 mg TE/g ve toplam flavonoid içeriği 5,7593 ± 0,0644 mg QE/g olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.2. A. officinarum ekstraktının spektroskopik analiz sonuçları Folin-Ciocalteu ABTS Toplam Flavonoid (mg GAE/g örnek) (mg TE/g örnek) (mg QE/g örnek) 113,6100 ± 3,2854 28,8121 ± 0,0074 5,7593 ± 0,0644 Dou vd. (2010), A. officinarum metanol ekstraktının etil asetat, aseton-metanol ve metanol ile fraksiyonlarının toplam fenolik madde içeriğini belirlemişlerdir. Buna göre fenolik madde içeriği sırasıyla aseton-metanol fraksiyonu > etil asetat fraksiyonu > metanol fraksiyonu > ham metanol ekstraktı (221,36 ± 2,79 > 139,55 ± 0,58 > 128,94 ± 1,67 > 98,64 ± 1,35 mg GAE/g) şeklindedir. Xia vd. (2010), A. officinarum etanol ekstraktının (%70) 359,6 ± 6,1 mg GAE/g fenolik madde ve 289,9 ± 5,3 mg RE/g flavonoid içerdiğini belirtmiştir. Lin vd. (2015), A. officinarum metanolik ekstraktının, 4927,8 ± 101,1 mg GAE/100 g fenolik madde ve 593,2 ± 22,2 mg QE/100 g toplam flavonoid içerdiğini, su ekstraktının ise 1354,3 ± 23,1 mg GAE/100 g toplam fenolik madde ve 59,1 ± 0,5 mg QE/100 g toplam flavonoid içerdiğini ve etil asetat ekstraktının 1834,7 ± 211,9 mg GAE/100 g toplam fenolik madde ve 221,4 ± 67,1 mg QE/100 g toplam flavonoid içerdiğini bildirmişlerdir. Krishnaveni vd. (2017), A. officinarum rizomlarının toplam fenolik madde içeriğinin 33,0 ± 0,00 mg/g, flavonoid içeriğinin 2,00 ± 0,00 mg/g ve toplam antioksidan kapasitesinin 18,00 ± 2,12 mg/g olduğunu bildirmişlerdir. Zhang vd. (2017), A. officinarum su ekstraktının 5,20 ± 0,14 mg GAE/g fenolik bileşik, 14,38 ± 1,67 mg QE/g flavonoid içerdiğini bildirmişlerdir. 6 6 Antioksidan aktivite bitkinin yapısında bulunan çeşitli bileşenlerden kaynaklanır. Bu bileşenlerden en fazla katkıyı sağlayan ise fenolik bileşiklerdir (Muflihah vd., 2021). Bu katkının temel nedeni öncelikle fenolik hidroksil gruplarıdır (Carocho ve Ferreira, 2013). Fenolik hidroksil gruplarının çokluğu antioksidan aktiviteyi arttırır. Bunun yanı sıra flavonoid yapısının C halkasının 4 pozisyonunda okso grubunun varlığı, C halkasının 2- 3 pozisyonunda bir çift bağın varlığı ve elektron delokalizasyonu antioksidan aktiviteye katkı sağlar (Bubols vd., 2013). Galanginin flavonoid halkasında yer alan 3 (C halkası), 5 ve 7 pozisyonunda (A halkası), olmak üzere üç hidroksil grubu, 4 pozisyonunda okso grubu (C halkası) ve C halkasının 2 ve 3 pozisyonunda bir çift bağa ve elektron delokalizasyonuna sahip olması yüksek antioksidan aktivitesini yapısal olarak açıklamaktadır. Literatürde sıklıkla antioksidan kapasite ile toplam fenolik madde ve toplam flavonoid ilişkisi ele alınmıştır. Muflihah vd. (2021), çalışmalarında antioksidan kapasite, toplam fenolik madde ve toplam flavonoid arasındaki ilişkiyi incelemişlerdir. Çalışma sonucuna göre antioksidan aktivite ile toplam fenolik madde arasında daha güçlü bir korelasyon elde ederek, bitkilerin antioksidan kapasitesi ile toplam fenolik madde arasında toplam flavonoidden daha güçlü pozitif ilişki olduğunu ortaya koymuşlardır. Nur vd. (2019) da çalışmalarında toplam fenolik maddenin ve toplam flavonoidin antioksidan kapasite üzerindeki etkilerini incelemişlerdir. Antioksidan kapasite ile toplam fenolik madde arasında güçlü bir korelasyon bulunurken, toplam flavonoidle bulunamamıştır. Literatür incelendiğinde de toplam fenolik maddenin artışıyla antioksidan kapasitede artış gözlenmektedir (Olajire ve Azeez, 2011; Sant’Ana vd., 2014 Azieana vd., 2017; Osman vd., 2020). Elde ettiğimiz sonuçlar literatürle uyumlu olmakla birlikte, bitkinin fenolik madde içeriği, flavonoid içeriği ve bunlarla bağıntılı olarak toplam antioksidan kapasitesi yetiştirilme bölgesi, ekstraksiyon prosedürü gibi faktörlerden etkilenmektedir. 6 7 4.3. Kemometrik Analizler Lipozomların çeşitli amaçlara yönelik kullanımında verimliliğini etkileyen en önemli faktör enkapsülasyon etkinliğidir. Enkapsülasyon etkinliği lipozomlara yüklenmek istenen bileşenin yükleme başarısını gösterir. Enkapsülasyon etkinliğinin yüksek olması lipozomlara yüklenen bileşenin hedeflenen amaca yönelik işlevselliğini başarıyla yerine getireceğenin göstergesidir. Ancak enkapsülasyon etkinliği lipozom üretiminde kullanılan yapısal bileşenlerin miktarlarından ve hazırlama tekniğinin çeşitli adımlarından kolaylıkla etkilenebilir. Bu nedenle bu faktörlerin optimizasyonu yüksek enkapsülasyon etkinliğini sağlamak açısından büyük önem arz etmektedir. Maksimum enkapsülasyon etkinliği ile lipozomların üretilmesi için lipozom üretim parametreleri RSM-CCD kullanılarak optimize edilmiştir. Optimizasyon için değişkenlerin seçilmesi sürecinde literatür incelenerek en önemli faktörler olarak lipozomların yapısal bileşenleri olan fosfatidilkolin, kolesterol, yapıya yüklenecek olan bileşen olan Galangin ve ince film hidrasyon yönteminde önemli bir basamak olan ultrasonikasyon süresi seçilmiştir. Seçilen değişkenler için belirlenen seviyeler çeşitli ön denemeler sonucunda seçilmiştir. Buna göre PC oranı (1-9 mg:mL), CHOL oranı (0,2-1,8 mg:mL), Ultrasonikasyon zamanı (15-55 dk) ve GA oranı (0,1-0,5 mg:mL)’dır. Değişkenlerinin en uygun kombinasyonu lipozom üretimi için optimum koşulları belirlemek amacıyla araştırılmıştır. En yüksek enkapsülasyon etinliğine sahip lipozomları üretmek için 30 deney yapılmıştır. Deneysel ve tahmini enkapsülasyon etkinliği yüzdeleri Çizelge 4.3’te verilmiştir. 6’sı tekrar 30 deney arasında, deney 17 (PC oranı; 1 mg:mL, CHOL oranı; 1 mg:mL, Süre; 35 dk, GA oranı; 0,3 mg:mL) %93,19 ile en yüksek enkapsülasyon etkinliğine ve deney 23 (PC oranı; 5 mg:mL, CHOL oranı; 1 mg:mL, Süre; 35 dk, GA oranı; 0,1 mg:mL) %7,87 ile en düşük enkapsülasyon etkinliğine sahiptir. 6 8 Çizelge 4.3. Deneysel ve tahmini enkapsülasyon etkinliği yüzdeleri Enkapsülasyon etkinliği (%) Deney Deneysel değer Tahmini değer 1 34,43 34,04 2 21,38 23,64 3 40,52 40,63 4 20,83 17,22 5 30,14 29,91 6 21,30 21,83 7 32,88 35,38 8 12,34 14,31 9 53,87 53,43 10 32,08 28,51 11 71,02 69,42 12 29,75 31,50 13 41,48 44,02 14 20,02 21,44 15 59,64 58,91 16 24,00 23,32 17 93,19 92,55 18 46,37 46,56 19 19,43 18,60 20 26,70 27,07 21 26,93 29,91 22 21,02 17,59 23 7,87 6,54 24 34,06 34,94 25 19,29 18,96 26 14,64 18,96 27 16,56 18,96 28 22,24 18,96 29 17,73 18,96 30 23,32 18,96 6 9 Çizelge 4.3’te verilen tahmini ve deneysel enkapsülasyon etkinlikleri incelendiğinde deneysel ve tahmini değerler birbirine yakındır. Bu da oluşturulan deneysel dizayn sonucunda elde edilen modelin enkapsülasyon etkinliğini tahmin etmede başarılı olduğunu göstermektedir. Çizelge 4.4. Lipozom üretimi için ANOVA analizi verileri Kaynak Lipozom üretimi (R2 = 0,9860) DF SS MS F değeri p-değeri Model 14 9676,57 691,18 75,63 <00001 Lack of fit 10 81,20 8,12 0,73 0,6887 Pure error 5 55,89 11,18 Çizelge 4.4’e göre, ikinci dereceden polinom modeli, ANOVA’dan elde edilen 0,0001’den küçük bir p-değeri, yanıt ile önemli parametreler arasındaki gerçek ilişkiyi gösterecek niteliktedir. Model F değerinin 75,63 olması, modelin %95 güven aralığında olduğunu göstermektedir. ANOVA analizi enkapsülasyon etkinliği ile PC oranı, CHOL oranı, Ultrasonikasyon zamanı ve GA oranı gibi lipozom üretim parametreleri arasındaki ilişkinin ikinci dereceden olduğunu ve iyi bir regresyon katsayısına (R2 = 0,9860) sahip olduğunu göstermektedir (Çizelge 4.4). Enkapsülasyon etkinliği için ikinci dereceden denklem Çizelge 4.5.’te verilmiştir. Çizelge 4.5. İkinci derece polinom denklemi Yanıt İkinci derece polinom denklemi Enkapsülasyon etkinliği (%) y = 44,26 – 22,38x1 + 9,17x2 – 7,03x3 + 19,53x4 – 3,25 x1x 2 – 7,26 x1x4 – 4,70 x x 2 2 4 + 12,65x1 7 0 Enkapsülasyon etkinliği açısından, lipozom üretiminde önemli faktörler (p-değeri < 0,05) x1, x2, x3, x4, x1x2, x1x4, x2x4, x12 ve en az etkili faktörler x1x3, x2x3, x3x4, x22, x32, x42’dir. PC oranı, x1 (p-değeri < 0,0001) ve PC oranının karesi, x12 (p-değeri < 0,0001) enkapsülasyon etkinliğini etkileyen en önemli faktörlerdir. PC’ler lipozomların ana bileşenleridir, bu nedenle lipozom üretimi için PC oranı CHOL, GA ve Ultrasonikasyon zamanından çok daha önemlidir. Maherani vd. (2012) lipozomların enkapsülasyon etkinliğini en çok etkileyen faktörün lipit bileşimi olduğunu belirterek, maksimum enkapsülasyon etkinliği için yalnızca lipit bileşimini optimize etmiştir. Optimize edilen lipozom bileşiminde ana bileşenler galangin, fosfatidilkolin ve kolesteroldür. Lipozomlar sadece fosfatidilkolinlerin varlığıyla üretilebilir, ancak yapısal morfoloji, stabilite ve aktif maddeleri enkapsüle edebilmeleri için gerekli olan alanların oluşturulmasında en etkili değişken kolesterol olmadan maksimum aktivite ile üretilemezler. Bu nedenle enkapsülasyon etkinliği açısından etkili faktörlerin kolesterol, galangin ve fosfatidilkolin olması şaşırtıcı değildir. Yanıt yüzey analizi Lipozom üretim parametreleri ile enkapsülasyon etkinliği arasındaki önemli etkileşimler yanıt yüzey grafikleri ile gösterilmiştir. Yanıt yüzey grafikleri yalnızca yanıt değer üzerinde etkili olan faktörlerin ikili etkileşimlerini göstermektedir. Buna göre yanıt yüzey grafikleri PC, CHOL ve GA oranlarının birbirleriyle etkileşimlerini ele almaktadır. Şekil 4.2’de PC oranı ve CHOL oranının, Şekil 4.3’te PC oranı ve GA oranının, Şekil 4.4’te CHOL oranı ve GA oranının enkapsülasyon etkinliği üzerindeki etkileri ve bunların birbirleriyle etkileşimleri gösterilmektedir. 7 1 180 140 100 60 20 1.80 1.40 1.00 3.00 1.00 5.00 Ko Ble:s Ktroolle osrtaenroı l( omragn:mý L 0.60 ) 7.00 PC oran ıA (:m FgK: morLan) ý 9.00 0.20 Şekil 4.2. Enkapsülasyon etkinliğine PC ve CHOL etkisi Şekil 4.2’de verilen yanıt yüzey grafiğine göre hem CHOL oranı hem de PC oranı enkapsülasyon etkinliğini arttırmada etkilidir. Buna göre, CHOL oranı sabit tutulur ve PC oranı azaltılırsa, enkapsülasyon etkinliği azalır. Ancak PC oranı daha fazla azaltılırsa, enkapsülasyon etkinliği artmaya başlar. En yüksek enkapsülasyon etkinliği en düşük PC ve CHOL oranında gözlenmektedir. Enkapsülasyon etkinliğinin arttırılmasında PC oranı olumsuz, CHOL oranı ise olumlu bir etkiye sahiptir (Xiong vd., 2009). Lipozom oluşumu için PC miktarının çok yüksek olması istenmez çünkü PC miktarı arttıkça oluşacak lipozomu stabilize edecek CHOL miktarının da artması gerekir. CHOL molekülleri lipozom oluşumu için lipit moleküllerinin daha iyi paketlenmesini sağlayarak enkapsülasyon etkinliğini arttırır (Ahmed vd., 2019). 7 2 Enka pSsOülNaUsyÇo 2n3 E0t3k2i0n2li2ğ i (%) 220 167.5 115 62.5 10 1.00 0.50 3.00 0.40 5.00 0.30 PC o r aAn: ıF (Km ogra:mnýL ) 7.00 0.20 DG:A G aolraanngıi n(m/çgöz:mücLü) o rani 9.00 0.10 Şekil 4.3. Enkapsülasyon etkinliğine PC ve GA etkisi Şekil 4.3’te, PC ve GA oranın enkapsülasyon etkinliği üzerindeki ikili etkileşimleri verilmektedir. Buna göre GA oranı sabit tutulduğunda ve PC oranı azaldığında enkapsülasyon etkinliği azalmakta, ancak PC oranı daha da azaldığında enkapsülasyon etkinliği artmaya başlamaktadır. En yüksek enkapsülasyon etkinliği en düşük PC oranı ve en yüksek GA oranında, en düşük enkapsülasyon etkinliği ise en düşük GA oranı ve en yüksek PC oranında gözlenmektedir. PC oranının artışı enkapsülasyon etkinliğini olumsuz etkilemektedir ve enkapsülasyon etkinliği arttırmak için yüksek bir PC oranı istenmemektedir (Xiong vd., 2009). Ayrıca, PC oranındaki artış, lipozom oluşumunda istenmeyen bir durum olan daha büyük boyutlu lipozomların oluşmasına katkıda bulunmaktadır (Hashemi vd., 2018). Bu nedenle istenilen yüksek enkapsülasyon etkinliğine sahip lipozomların üretilmesi için düşük PC oranı ve yüksek GA oranı kullanılmalıdır. 7 3 Enka p SsOülNaUsyÇo 2n3 0E3t2k0in2l2i ğ i (%) 140 107.5 75 42.5 10 1.80 1.40 0.10 1.00 0.20 C H BO: LKo olerasnteı r(oml ogr:amnLý) 0.30 0.60 0.40 0.20 0.50 G DA: G oarlaannıg (imn/gç:ömzüLc)ü orani Şekil 4.4. Enkapsülasyon etkinliğine CHOL ve GA etkisi Şekil 4.4’te, CHOL ve GA oranın enkapsülasyon etkinliği üzerindeki ikili etkileşimleri verilmektedir. CHOL oranı ve GA oranı enkapsülasyon etkinliğini eşit oranda etkilemektedir ve birbirleri ile zıt etkiye sahiptirler. CHOL oranı sabit tutulup GA oranı arttırıldığında enkapsülasyon etkinliği düşmekte, ancak GA oranı sabit tutulup CHOL oranı arttırıldığında ise enkapsülasyon etkinliği artmaktadır. En yüksek enkapsülasyon etkinliği en yüksek CHOL oranı ve en yüksek GA oranında gözlenmektedir. Lipozomun bileşimindeki CHOL miktarındaki artış, yapının daha katı hale gelmesine neden olur (Refaat vd., 2021). Yüksek sertlik ile lipit çift tabakanın geçirgenliği azalır ve ilaç sızıntısı önlenir, bu da yüksek enkapsülasyon etkinliği ile sonuçlanır. CHOL molekülleri, lipozomların lipit çift tabakasının orta bölgesinde hidrofobikliği arttırarak lipit zincirleri arasında boşluklara neden olur. Bu da hidrofobik moleküllerin lipit çift tabakasındaki boşluklara hapsedilmesini kolaylaştırır ve enkapsülasyon etkinliğini arttırır (Deniz vd., 2010). GA hidrofobik bir moleküldür ve GA’nın enkapsülasyon etkinliği CHOL oranının artmasıyla artmıştır. 7 4 Enkap SsüOlaNsUyÇo 2n3 E03tk20in2l2i ğ i (%) Lipozom üretim koşullarının optimizasyonu Çizelge 4.6’da lipozom üretimi için optimum koşullar gösterilmektedir. Lipozom üretimi için optimum koşullar şu şekildedir; PC oranı 1,50 mg:mL, CHOL oranı 0,88 mg:mL, Ultrasonikasyon zamanı 24,73 dk ve GA oranı 0,19 mg:mL’dir. Çizelge 4.6. Lipozom üretimi için optimum koşullar Optimum lipozom üretim koşulları PC oranı CHOL oranı Ultrasonikasyon GA oranı (mg:mL) (mg:mL) zamanı (dk) (mg:mL) 1,50 0,88 24,73 0,19 Çizelge 4.7’de lipozom üretimi için tahmini ve deneysel yanıt gösterilmektedir. Optimum koşullarda tahmini enkapsülasyon etkinliği %93,77, optimum koşullar altında elde edilen deneysel enkapsülasyon etkinliği yüzdesi ise %93,77 ± 0,05’tir. Bu sonuç, deneysel yanıt ile öngörülen yanıtın uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu uyum, modelin geçerliliğini %95 güven aralığında doğrulamaktadır. Dolayısıyla, CCD modeli lipozom üretimi için maksimum enkapsülasyon etkinliğini tahmin etmede doğru ve güvenilirdir. Çizelge 4.7. Lipozom üretimi için tahmini ve deneysel değerler Yanıt Maksimum değerler Tahmini Deneysel Enkapsülasyon etkinliği (%) 93,77 93,77 ± 0,05 7 5 Optimizasyon çalışmaları sonucunda elde edilen %93,77 ± 0,05 deneysel enkapsülasyon etkinliği, ince film hidrasyon yöntemi ile hazırlanan lipozomlar için nispeten yüksek bir değerdir. Çünkü düşük enkapsülasyon etkinliği ince film hidrasyon yönteminin bir dezavantajı olarak görülmektedir. Ancak bu görüşün aksine, birçok yazar galangin gibi lipofilik bileşenler için durumun böyle olmadığını bildirmiştir. Zhu vd. (2018), ince film hidrasyon yöntemiyle %92,36 enkapsülasyon verimliliğine sahip galangin yüklü lipozomlar üretmişlerdir ve yüksek enkapsülasyon etkinliğinin, galanginin soya fosfatidilkolinin hidrofobik bölgeleri ile yüksek etkileşiminden kaynaklanabileceğini bildirmişlerdir. Landi-Librandi vd. (2012), çalışmalarında galangin, kuersetin, mirisetin ve kampferol gibi lipofilik bileşenleri soya fosfatidilkolin-kolesterol ve soya fosfatidilkolin-kolesterol etil eter içeren lipozomal sistemlere enkapsüle etmiştir. Galanginin enkapsülasyon etkinliği %60-80 ve %80-95 aralığında bulunmuştur. Galangin, bu bileşenler arasında en yüksek enkapsülasyon etkinliği ile lipozomlara yüklenmiştir. Landi-Librandi vd. (2011), yaptıkları bir başka çalışmada aynı bileşenleri kullanarak lipozomal sistemler üretmiş ve benzer bir sonuca ulaşarak galangin içeren lipozomların en yüksek enkapsülasyon etkinliğine sahip olduğunu, en hidrofilik bileşen olan mirisetinin ise en düşük enkapsülasyon etkinliğine sahip olduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışma sonucunda enkapsülasyon etkinliğinin sebebinin en lipofilik bileşen olan galanginin lipozomların hidrofobik bölgeleri ile etkileşiminin daha az lipofilik ve hidrofilik bileşenlere göre daha yüksek olması olduğunu belirtmişlerdir. Bu çalışmada elde edilen yüksek enkapsülasyon etkinliği diğer çalışmalarla uyumlu olup, galanginin etkin kullanımında en büyük dezavantaj olan yüksek lipofilikliğin lipozomlara hapsedilmesi için bir avantaj olduğunu da göstermektedir. Yanıt yüzey grafikleri incelendiğinde de galangin miktarı arttıkça enkapsülasyon etkinliğinin arttığı gözlemlenmiştir. En yüksek enkapsülasyon etkinliğinin en yüksek galangin konsantrasyonunda elde edilmesi kolesterolün lipozomların hidrofobik bölgelerininin aktivitesini arttırması ile oldukça hidrofobik bir bileşen olan galanginin en yüksek aktivite ile bu bölgelere yerleşmesi ile sonuçlanmıştır. 7 6 4.4. Lipozomların Karakterizasyonu Lipozom formülasyonlarının boyutları, hidrodinamik çapları, zeta potansiyelleri ve polidispersite indeksi Çizelge 4.8’de verilmiştir. Çizelge 4.8. Lipozomların hidrodinamik çap verileri O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Hidrodinamik çap 234,40 ± 113,4 245,70 ± 249,3 567,00 ± 113 (nm) O-Lipozomun hidrodinamik çapı 234,4 ± 113,4 nm, CH-Lipozomun 245,7 ± 249,3 nm ve GUA-CH-Lipozomun 567 ± 113 nm’dir. O-Lipozom, büyük unilamellar veziküldür (LUV). O-Lipozomun ilk katman olarak kitosan ile kaplanması ortalama hidrodinamik çapta küçük bir artışa neden olurken, ikinci katman olarak arap zamkı ile kaplanması büyük bir artışa neden olmuştur. Hidrodinamik çaptaki bu artış lipozomların kitosan ve gam arabik ile başarıyla kaplandığının göstergesidir. Benzer şekilde Bonechi vd. (2021), çalışmalarında kitosan ve hyalüronik asit ile kapladıkları lipozomlarının hidrodinamik çaplarında artış gözlemlemişlerdir ve bu artışın sebebinin lipozomların yüzeyindeki kitosan ve hyalüronik asidin varlığının kanıtı olarak nitelendirmişlerdir. Ayrıca kaplama ile hidrodinamik çaptaki bu artışın nedeni kitosan ve arap zamkının su içerisinde zamanla şişerek lipozom yapısını genişletmesi ve agregasyonun meydana gelmesidir. Agregasyon olgusunu Madrigal-Carballo vd. (2010) ellagik asit yüklü kitosan-dekstran sülfat kaplı lipozomlarında gözlemlemişlerdir. Ellagik asit yüklü lipozomları (300 nm) kitosan ile kaplarken 3000 nm’den büyük agregatları gözlemlemişlerdir. Lipozomlar kitosandan sonra dekstran sülfat tabakası ile kaplandığında tekrar agregat oluşumunu gözlemlemişlerdir. Buna göre iki yüzey temas ettiğinde, arayüzeyde çift elektrik yükü tabakası oluşur ve ardından elektriksel çift tabaka boyunca elektron transferinden kaynaklanan çekici kuvvet nedeniyle yapışma gelişir ve sonuçta partiküllerin toplanarak agregatların oluşmasına yol açar. Mevcut çalışmada çok yüksek oranda agregasyon gözlemlenmese de hidrodinamik çaptaki iki kattan fazla artış agregasyonun göstergesidir. 7 7 Çizelge 4.9. Lipozomların boyut verileri O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Boyut (nm) 485,50 ± 128,41 208,05 ± 73,04 266,60 ± 8,49 Lipozomların morfolojisi FE-SEM tekniği ile değerlendirilmiştir. Şekil 4.5 lipozom formülasyonlarının FE-SEM görüntülerini göstermektedir. Şekil 4.5. Lipozomların FE-SEM görüntüleri. A) Yüklenmemiş lipozom B) O-Lipozom C) CH-Lipozom D) GUA-CH-Lipozom 7 8 Lipozomların yüzey özelliği, homojenliği, dağılımı ve boyutu morfolojileri ile tanımlanır. Morfoloji, ilaç taşıyıcılarının uygulama alanları ve hedef bölgeleri olarak lipozomların çeşitli özelliklerinin geliştirilmesi ve modifikasyonu ile doğrudan ilişkilidir (Zhang vd., 2019). Lipozomların boyutu, lipozomların kullanım amacı, hedefleri ve çevresel davranışları gibi birçok açıdan önemli bir rol oynamaktadır. Lipozomların hazırlanmasında ince film hidrasyon yöntemi kullanılmıştır ve bu yöntemin en büyük dezavantajlarından biri büyük boyutlu lipozomların oluşmasıdır (Maja vd., 2020). Şekil 4.5 a’ da gösterilen Kör lipozom neredeyse küresel bir şekle sahiptir ve gerçek boyutu 288,90 ± 78.91 nm olarak belirlenmiştir. Kör lipozom aglomere olmuş ve lipozomlar yüzeye gömülmüş gibi görünmektedir ve düzenli bir yapıya sahip değildir. Şekil 4.5 b’de gösterilen O-Lipozom küresel, düzenli bir yapıya sahiptir ve gerçek boyutu 485,5 ± 128,41 nm olarak belirlenmiştir. Şekil 4.5 c’de gösterilen CH-Lipozomu hafif küresel bir şekle sahiptir, aglomere olduğu ve homojen bir dağılıma sahip olmadığı için yapısı düzenli değildir ve gerçek boyutu 208,05 ± 73,04 nm olarak belirlenmiştir. O- Lipozomun CH ile kaplanması, düzensiz yapıda olmasına rağmen boyutta bir küçülme ile sonuçlanmıştır. Şekil 4.5 d’de gösterilen GUA-CH-Lipozom ise genel olarak düzenli bir yapıya ve küresel bir şekle sahiptir ve gerçek boyutu 266,60 ± 8,49 nm olarak belirlenmiştir. CH-Lipozomun GUA ile kaplanması yapıyı daha düzenli ve homojen hale getirmiştir. Bunlara ek olarak, yukarıda bahsedilen boyut ölçümünde kullanılan DLS tekniği, boyut ölçümünü etkilemek için hidrodinamik çap ölçümünü ve sulu ortamı kullanır. FE-SEM ile belirlenen boyut ile DLS ile belirlenen boyut arasındaki farkın nedeni bu olsa da FE- SEM ile belirlenen boyut daha doğru sonuçlar vermektedir. Lipozom formülasyonları morfolojileri değerlendirilmeden önce liyofilize edilmiştir. Bununla birlikte liyofilizasyonun lipozomal formülasyonların şekillerinde bozulmalara neden olduğu da görülmektedir. 7 9 Çizelge 4.10. Lipozomların zeta potansiyel verileri O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Zeta potansiyeli -48 ± 7 +40 ± 5 -6 ± 4 (mV) Zeta potansiyel değeri, lipozomların stabilitesinde ve hücre zarından adsorpsiyonunda önemli bir faktördür (Rasmussen vd., 2020). Lipozomların zeta potansiyeli -30 mV’den daha negatif ise anyonik, +30 mV’den daha pozitif ise katyonik ve -10 mV ile +10 mV arasında ise nötraldir (Wang vd., 2020). O-Lipozomun zeta potansiyeli -48 ± 7 mV’dir ve anyonik lipozomdur. Negatif zeta potansiyeli, lipozomun duvar malzemesi olarak negatif yüklü L-α-Fosfatidilkolin kullanılması nedeniyle beklenildiği gibidir. CH-Lipozomun zeta potansiyeli +40 ± 5 mV’dir ve katyonik bir lipozomdur. Negatif yüklü lipozomun CH ile kaplanmasıyla zeta potansiyel değeri -48 ± 7 mV’den +40 ± 5 mV’ye kaymıştır. Bu zeta potansiyeli CH’nin pozitif yüklü doğasından kaynaklanmaktadır. GUA-CH-Lipozomun zeta potansiyeli -6 ± 4 mV’dir ve nötr bir lipozomdur. Pozitif yüklü CH-Lipozomun negatif yüklü GUA ile kaplanmasıyla zeta potansiyel değeri +40 ± 5 mV’den -6 ± 4 mV’ye değişmiştir. GUA’nın hidrofilik olmasına rağmen, amfifilik bir polisakkarit omurgaya sahip olması ile CH’nin yüksek pozitif zeta potansiyeli birleştiğinde nötral lipozomlar elde edilmiştir. Negatif ve pozitif zeta potansiyeline sahip lipozomlar pH’a bağımlıdır ve çeşitli ortamlarda kullanımı kısıtlıdır, ancak nötr lipozomlar çevresel pH’ye bağlı olarak tam yük değişimi gösterir (Wang, 2021). Bu özellik nötr lipozomların çeşitli ortamlarda kullanımını arttırmaktadır. Örneğin yüklü nanopartiküllerin vücuttaki olumsuz farmakokinetiği göz önüne alındığında, klinik olarak onaylanmış nanopartikül-ilaç formülasyonlarının çoğu, dolaşım ömürlerini uzatmak ve vücuttaki hedef dokuların ilaca maruz kalmasını en üst düzeye çıkarmak için nötral yüzey yüküne sahiptir (Arias-Alpizar vd., 2020; Bobo vd., 2016). 8 0 Çizelge 4.11. Lipozomların polidispersite indeksi verileri O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Polidispersite indeksi 0,373 ± 0,035 0,389 ± 0,115 0,749 ± 0,272 Polidispersite indeksi partiküllerin boyut dağılımını tanımlar (Danaei vd., 2018). Polidispersite indeksinin 0,05 ile 0,5 arasında olması veziküllerin monodispers ve homojen olduğunu, 0,5 ile 1 arasında olması ise veziküllerin polidispers ve heterojen olduğunu gösterir (Wen vd., 2014). O-Lipozomun polidispersite indeksi 0,373 ± 0,035 ve CH-Lipozomun 0,389 ± 0,115’tir, O-Lipozom ve CH-Lipozom monodispers olup tek boyutlu dağılım göstermektedir. GUA-CH-Lipozomun polidispersite indeksi ise 0,749 ± 0,272’dir, GUA-CH-Lipozom polidispersdir ve farklı boyutsal dağılıma sahiptir. Lipozom formülasyonlarının kimyasal yapıları FTIR ile karakterize edilmiştir. FTIR analizi sonucunda elde edilen spektrum Şekil 4.6’da gösterilmektedir. Kör Lipozom 3363,94 cm-1’de O-H gerilme bandı göstermektedir. O-Lipozom 3357,36 cm-1’de geniş bir O-H gerilme bandı göstermektedir (Perez-Ruiz vd., 2018). GA’nın kör lipozomlara yüklenmesiyle oluşan hidrojen bağları yoğunluğu arttırırken, 3363,94 cm-1’deki düşük yoğunluklu O-H bandını 3357,36 cm-1’e kaydırmıştır. GA’nın boş lipozoma yüklenmesi yapıyı bozmadan küçük değişikliklere neden olmuştur. CH-Lipozom, 3223,63 cm-1’de N- H gerilme bandını maskeleyen geniş bir O-H gerilme bandı, 2927,28 cm-1’de CH’nin karakteristik C-H gerilme bandı, 1571,10 cm-1’de C-O ve C-N gerilme bantları, 1406,89 cm-1’de O-H ve C-H titreşimleri ve 1014,95 cm-1’de C-O gerilme bandı gösterir (Tavares ve Noreña, 2020). GUA-CH-Lipozom, 3262,53 cm-1’deki N-H gerilme bandını maskeleyen güçlü bir O-H gerilme bandı, 2923,24 cm-1’deki C-H gerilme bandı ve GUA’nın karakteristik bandı olan 1014,95 cm-1’deki C-O gerilme bandını göstermektedir. CH’nin 1571,10 cm-1 ve 1406,89 cm-1’deki karakteristik yüksek yoğunluklu C-N germe bantları 1560,19 cm-1 ve 1408,10 cm-1’e kaymış ve yoğunlukları büyük ölçüde azalmıştır. CH’nin 1571,10 cm-1 ve 1406,89 cm-1’deki karakteristik yüksek yoğunluklu C-N gerilme bantları 1560,19 cm-1 ve 1408,10 cm-1’e kaymış ve yoğunlukları büyük ölçüde azalmıştır. Bu durum, GUA’nın -COO- grubu ile CH’nin -NH2 grubu 8 1 arasındaki elektrostatik etkileşimden kaynaklanmaktadır (Hernández-Fernández vd., 2020). Elektrostatik etkileşim katman katman biriktirme metodunda en çok kullanılan itici kuvvetlerden biridir. Buna göre polikatyon CH ve polianyon GUA arasındaki elektrostatik etkileşimin başarıyla gerçekleştirildiği FTIR spektrumuna göre kanıtlanmıştır. Şekil 4.6. Lipozomların FTIR spektrumu 8 2 4.5. In vitro İlaç Salım Çalışması Lipozom formülasyonlarının ilaç salım profili Şekil 4.7’de verilmiştir. Buna göre 5 sa sonunda, O-Lipozomun GA salımı %48,13 ± 5,72, CH-Lipozomun %32,37 ± 2,28 ve GUA-CH-Lipozomun %23,84 ± 1,82 olarak bulunmuştur. O-Lipozomun kitosan ve ardından gam arabik ile kaplama işlemi GA salımını sırasıyla yaklaşık %33 ve %51’den fazla azaltmıştır. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 60 120 180 240 300 Zaman (dk) O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Şekil 4.7. Lipozomların ilaç salım grafiği 8 3 Kümülatif galangin salımı (%) Jeon vd. (2015), kuersetin yüklü kitosan-sodyum hyalüronat (HA-CH) ile kaplanmış çok katmanlı lipozomlar geliştirmişlerdir. Kaplanmamış lipozom, CH-Lipozom, HA-CH- Lipozom, 3 katmanlı HA-CH-Lipozom ve 5 katmanlı HA-CH-Lipozom’un in vitro ilaç salım profillerini incelemişlerdir. Buna göre kaplanmamış lipozom, diğer formülasyonlara kıyasla 24 saat içinde pH 7,4’te %50 olmak üzere nispeten hızlı kuersetin salınımı sergilemiştir. CH-Lipozom’dan 24 saat sonra salınan kuersetin miktarı, HA-CH- Lipozom’dan salınan kuersetin miktarına benzerdir ve yaklaşık %40’tır. 3 katmanlı HA- CH-Lipozom ve 5 katmanlı HA-CH-Lipozom’dan salınan kuersetin miktarı ise %20’nin altındadır. Buna göre geliştirilen formülasyonlarda, lipozomal yüzeyde biriken çift tabaka sayısındaki artış ile kuersetinin hızlı salımını engellenerek kontrollü salım sağlanmıştır. Bu sonuçlara göre, elektrostatik etkileşimler kullanılarak lipozom yüzeyinin polimerle modifiye edilmesinin, bir ilacın sürekli salımının kontrolüne katkıda bulunabileceği ve farklı dış pH koşullarında kapsüllenmiş ilaçların sızmasına karşı koruma sağlayabileceğini belirtmişlerdir. Lipozomların ilaç salım hızı, lipit çift tabakanın akışkanlığına, dolayısıyla membran geçirgenliğine bağlı olarak değişir (Li vd., 2009). Ayrıca polimerler fosfolipdlerden daha kararlıdır ve çeşitli blok yapılarının lipit ikincil katmanına interkalasyon sağlamaları, lipitlerin oksidatif bozulmaya yatkınlığını azaltmaları nedeniyle kullanılmaları avantajlıdır. Bununla birlikte, yüklü polimerlerle kaplanmış lipozomlar elektrostatik olarak iticidir ve kolloidal sistemlerde stabildir ayrıca kaplama aktif bileşiklerin salım hızını kontrol eden bir bariyer görevi görür (Pasarin vd., 2023). Lipozom yüzeyinin polielektrolit biyopolimer ile kaplanması yüzeyde gittikçe daha yoğun-kalın bir tabaka oluşturarak lipozomun akışkanlığını ve dolayısıyla lipit membranın geçirgenliğini azaltmış ve böylece ilaç salım hızını yavaşlatmıştır. Bu sonuçlar GA’nın lipozomlara enkapsülasyonunun ve LbL kaplamasının simüle edilmiş fizyolojik bir ortamda salımını azalttığını ve salımı kontrol ettiğini göstermektedir. GA gibi biyoaktif bileşenlerin salım profilinin iyileştirilmesi, biyoyararlanımlarının arttırılmasında önemli bir faktördür. 8 4 4.6. İlaç Salım Kinetiği O-Lipozomun, CH-Lipozomun ve GUA-CH-Lipozomun ilaç salım kinetiği çalışmalarına göre elde edilen kinetik model grafikleri ve modellere göre elde edilen regresyon katsayıları şekil 4.8, şekil 4.9, ve şekil 4.10’de verilmiştir. Sıfırıncı-Dereceden Model Birinci-Dereceden Model 50 40 1,95 30 1,85 20 1,75 10 0 1,65 0 2 4 0 2 4 Zaman (sa) Zaman (sa) Korsmeyer-Peppas Modeli Hixon-Crowell Modeli 2,0 1,0 1,6 0,8 1,2 0,6 0,8 0,4 0,4 0,2 0,0 0,0 0,0 0,5 0 2 4 Log zaman (sa) Zaman (sa) Şekil 4.8. O-Lipozom kinetik model grafikleri 8 5 Log kümülatif GA salımı (%) Kümülatif GA salımı (%) Küpkök kümülatif kalan GA (%) Log kümülatif kalan GA (%) Higuchi Modeli 50 45 40 35 Model R2 30 25 Sıfırıncı derece 0,9362 20 Birinci derece 0,9754 15 10 Korsmeyer-Peppas 0,5387 5 Hixon-Crowell 0,9642 0 0,0 1,0 2,0 Higuchi 0,9966 Karekök zaman (sa) Şekil 4.8. O-Lipozom kinetik model grafikleri (Devam) O-Lipozom’un ilaç salım modeli Higuchi Modeli’dir. Higuchi salım sabiti, k’nın değeri 21,788’dir. Sıfırıncı-Dereceden Model Birinci-Dereceden Model 35 2,00 30 1,96 25 20 1,92 15 1,88 10 1,84 5 0 1,80 0 2 4 0 2 4 Zaman (sa) Zaman (sa) Şekil 4.9. CH-Lipozom kinetik model grafikleri 8 6 Kümülatif GA salımı (%) Kümülatif GA salımı (%) Log kümülatif kalan GA (%) Korsmeyer-Peppas Modeli Hixon-Crowell Modeli 2,0 1,8 0,60 1,6 0,50 1,4 1,2 0,40 1,0 0,30 0,8 0,6 0,20 0,4 0,10 0,2 0,0 0,00 0,0 0,5 0 2 4 Log zaman (sa) Zaman (sa) Higuchi Modeli 35 30 25 Model R220 15 Sıfırıncı derece 0,8941 10 Birinci derece 0,9265 5 Korsmeyer-Peppas 0,5259 0 Hixon-Crowell 0,9610 0,0 1,0 2,0 Karekök zaman (sa) Higuchi 0,9976 Şekil 4.9. CH-Lipozom kinetik model grafikleri (Devam) O-Lipozom’un ilaç salım modeli Higuchi Modeli’dir. Higuchi salım sabiti, k’nın değeri 14,803’tür. 8 7 Kümülatif GA salımı (%) Log kümülatif GA salımı (%) Küpkök kümülatif kalan GA (%) Sıfırıncı-Dereceden Model Birinci-Dereceden Model 25 2,00 1,98 20 1,96 1,94 15 1,92 1,90 10 1,88 1,86 5 1,84 1,82 0 1,80 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 Zaman (sa) Zaman (sa) Korsmeyer-Peppas Modeli Hixon-Crowell Modeli 2,0 0,50 1,6 0,40 1,2 0,30 0,8 0,20 0,4 0,10 0,0 0,00 0,0 0,5 0 1 2 3 4 5 Log zaman (sa) Zaman (sa) Şekil 4.10. GUA-CH-Lipozom kinetik model grafikleri 8 8 Log kümülatif GA salımı (%) Kümülatif GA salımı (%) Küpkök kümülatif kalan GA (%) Log kümülatif kalan GA (%) Higuchi Modeli 25 20 Model R2 15 Sıfırıncı derece 0,8211 10 Birinci derece 0,8472 5 Korsmeyer-Peppas 0,5004 Hixon-Crowell 0,8383 0 0,0 1,0 2,0 Higuchi 0,9789 Karekök zaman (sa) Şekil 4.10. GUA-CH-Lipozom kinetik model grafikleri (Devam) Buna göre GUA-CH-Lipozomun salım modeli en yüksek regresyon katsayısına sahip olan Higuchi modelidir. Higuchi salım sabiti, k’nın değeri 10,866’dır. Elde edilen sonuçlara göre O-Lipozom, CH-Lipozom ve GUA-CH-Lipozomun salım profili Higuchi modeli ile uyumludur. Salınan galangin miktarı ile zaman arasında doğrusal bir ilişki olduğu bulunmuştur. Higuchi modeline göre ilaç salımı difüzyon yoluyla gerçekleşmektedir (Gibis vd., 2016). Higuchi salım sabitleri incelendiğinde O- Lipozom için k 21,788, CH-Lipozom için k 14,803 ve GUA-CH-Lipozom için k 10,86’dır. Buna göre k sabiti O-Lipozomun CH ile kaplanması sonucunda yaklaşık 1,5 kat, CH-Lipozomun GUA ile kaplanması sonucunda ise 2 kat azalmışmıştır. Lipozom yüzeyine eklenen her bir katman Higuchi salım sabitinin değerini düşürmüştür, bu da difüzyon hızının azaldığına işaret etmektedir. Bu sonuç lipozomların CH ve GUA ile modifiye edilmesinin galangin difüzyon hızını yavaşlatarak salımın kontrol edilmesinde başarılı olduğunu göstermektedir. Elde edilen sonuçlar Othman vd., (2022)’nin geliştirdiği kurkumin yüklü polimer kaplı lipozomların salım davranışı ile benzerdir. Buna göre polimer kaplı lipozomlarının salım modeli Higuchi modelidir ve lipozomun yüzeyine eklenen her bir katman ile salım sabiti k 2 kat azalmıştır. Difüzyon hızındaki bu azalış yüzeye eklenen katmanların varlığına bağlanmıştır. 8 9 Kümülatif GA salımı (%) 4.7. In vitro Gastrointestinal Sindirim Çalışması Lipozomların gastrointestinal sistemdeki galangin salım davranışının ve stabilitesinin belirlenmesi için in vitro simüle gastrointestinal sindirim çalışması gerçekleştirilmiştir. Kontrol olarak A. officinarum ekstraktı kullanılmıştır. Lipozomların ve A. officinarum ekstraktının in vitro gastrointestinal sindirim sürecince kümülatif galangin salım yüzdesi Şekil 4.11’de verilmiştir. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 Zaman (dk) Kontrol O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Şekil 4.11. Kümülatif galangin salım grafiği 9 0 Kümülatif galangin salımı (%) Grafiğe göre mide sindirimi sonunda A. officinarum ekstraktı, O-Lipozom, CH-Lipozom ve GUA-CH-Lipozomun kümülatif galangin salım oranları sırasıyla %18,42 ± 1,53, %7,51 ± 1,06, %5,36 ± 0,63 ve %4,75 ± 0,01’dir. Bağırsak sindirimi sonunda ise galangin salım oranları havlıcan ekstraktı için %71,12 ± 1,70, O-Lipozom için %56,41 ± 1,12, CH- Lipozom için %37,07 ± 0,30 ve GUA-CH-Lipozom için %10,88 ± 0,20’dir. Bu sonuçlara göre O-Lipozom galangin salımını yaklaşık %21, CH-Lipozom yaklaşık %48 ve GUA- CH-Lipozom yaklaşık %85 azaltmıştır. Bu da geliştirilen GUA-CH-Lipozomun gastrointestinal sistemde galangini etkili bir şekilde koruduğunu göstermektedir. Polimerler, ilaçların gastrointestinal bariyerler boyunca yapışmasını ve penetrasyonunu arttırabilen gelişmiş mukoadezif özellikleri nedeniyle lipozom kaplamaları olarak tercih edilmektedir. Yüklü polimerlerle kaplanmış lipozomlar elektrostatik olarak iticidir ve kolloidal sistemlerde stabildir; kaplama aynı zamanda aktif bileşiklerin salım hızını kontrol eden bir bariyer görevi görür (Pasarin vd., 2023). Literatürde pek çok çalışma LbL yöntemi ile modifiye edilmiş lipozomların aktif bileşenleri gastrointestinal sindirim koşullarından başarıyla koruduğunu bildirmiştir. Gomaa vd. (2017) çalışmalarında antimikrobiyal peptit (MccJ25) yüklü, pektin-süt protein izolatı (WPI), WPI-pektin, pektin ve WPI kaplı lipozomlar geliştirerek bunların gastrointestinal sistemdeki davranışlarını incelemişlerdir. Elde ettikleri sonuçlara göre tüm lipozomal formülasyonlar gastrointestinal sindirime direnç göstermiştir. Kaplanmamış lipozomlar gastrointestinal sistemde MccJ25’i korumuşlardır çünkü lipozomlardan salınan MccJ25 miktarı serbest MccJ25 miktarından oldukça düşük bulunmuştur. Anyonik lipozomlar, katyonik lipozomlara kıyasla daha az MccJ25 salımı göstermiştir. Tek katmanlı kaplanmış lipozomlar, kaplanmamış formülasyonlara kıyasla MccJ25’e geçici koruma sağlamıştır. WPI-pektin kaplı lipozomlar, in vitro sindirim sırasında MccJ25’e en iyi korumayı sunmuş ve sindirimin sonuna kadar MccJ25 salımı diğer formülasyonlardan önemli ölçüde daha düşük olmuştur. Pektin-WPI kaplı lipozomlar 2 saatlik sindirimden sonra tek kaplamalı lipozomlardan veya kaplamasız lipozomlardan önemli ölçüde daha düşük MccJ25 salımı göstermiştir. Dolayısıyla, çift kaplamanın MccJ25’e gastrointestinal sistem boyunca koruma sağladığı sonucuna varmışlardır. Benzer şekilde Xian vd. (2021), çalışmalarında selastrol (Cel) yüklü lipozomlar (Cel/Lipo) ve pektin-trimetil kitosan kaplı lipozomlar (Cel/PT-LbL) 9 1 geliştirmişlerdir. Serbest Cel, Cel/Lipo ve Cel/PT-LbL karşılaştırıldığında hem Cel/Lipo hem de Cel/PT-LbL Lipo sürekli ilaç salım profilleri sergilemiştir. SGF’deki ilk 2 saat boyunca serbest Cel, Cel/Lipo ve Cel/PT-LbL Lipo’dan sırasıyla %5,01, %2,50 ve %2,14 oranında Cel salınmıştır. Benzer şekilde, SIF’de Cel/Lipo ve Cel/PT-LbL Lipo’dan az miktarda Cel salınmıştır; bu da polimer kaplamanın mide ya da ince bağırsaklarda ilaç salınım patlamasını etkili bir şekilde ortadan kaldırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, polielektrolitlerin çift kaplaması nedeniyle, Cel/PT-LbL Lipo tüm deney süresi boyunca Cel/Lipo’dan daha yavaş ilaç salım profilleri sergilemiştir. Cui vd. (2021), çalışmalarında kito-oligosakkaritleri ince film hidrasyonu yoluyla kaplanmamış lipozomlara, kitosan kaplı lipozomlara ve sodyum aljinat-kitosan kaplı lipozomlara enkapsüle etmişlerdir. Hazırlanan lipozomların in vitro simüle gastrointestinal sistemde kito-oligosakkarit salım hızı incelendiğinde gastrik sindirimde kito-oligosakkaritlerin salımı hızlıdan yavaşa doğru eğilim göstermiştir. 75 dakikalık gastrik sindirimden sonra, kaplanmamış lipozom %50,14, kitosan kaplı lipozom %14,92 ve sodyum aljinat-kitosan kaplı lipozom %8,22 kito-oligosakkarit salımı gerçekleştirmiştir. 175 dakikalık gastrik sindirim sonunda kaplanmamış lipozom %55,02, kitosan kaplı lipozom %31,21 ve sodyum aljinat-kitosan kaplı lipozom %21,13 kito- oligosakkarit salımı gerçekleştirmiştir. In vitro simüle bağırsak sindiriminde ise sindirim süresi 300 dakika olduğunda, salım oranı %82,81 ± %1,73'e ulaşmıştır. Sindirim süresi 150 dakikaya ulaştığında, kitosan kaplı lipozom ve sodyum aljinat-kitosan kaplı lipozom sırasıyla %25,44 ± 1,14 ve %17,18 ± 0,63 kito-oligosakkarit salım oranlarına ulaşmıştır. Daha sonra, bu iki lipozom arasında kito-oligosakkarit salım oranında önemli bir değişiklik olmamıştır. Bu sonuçlara göre lipozomların bağırsak sıvısındaki salım oranı mide sıvısındakinden önemli ölçüde daha yüksektir. Bunun nedeni, bağırsak sıvısındaki tripsinin fosfolipitlerin dış tabakası üzerindeki hidrolitik etkisinin lipozomların hidrolitik olarak parçalanmasına ve büyük miktarda aktif madde salınmasına yol açması olabilir. Bununla birlikte, lipozomların yüzeyindeki kitosan ve sodyum aljinat, bağırsak sıvısındaki tripsinin lipozomların dış katmanındaki fosfolipitlerle temas etmesini önleyebilir, böylece lipozomların bütünlüğünü korur. Böylelikle yüzey modifikasyonu ile gastrointestinal sisteme karşı direnç gösterilerek lipozomların stabilitesi sağlanır. 9 2 Song vd. (2023), keten tohumu yağını lipozomlara enkapsüle etmişler ve daha sonra lipozom yüzeyini kitosan ve bezelya proteini izolatı hidrolizatı ile LbL yöntemi ile modifiye etmişlerdir. Lipozomun ve modifiye lipozomun gastrointestinal sindirim davraşını ve keten tohumu yağı salım oranını incelemişlerdir. In vitro simüle mide sindirimi sonunda lipozomdan salınan keten tohumu yağı oranı %11,8 iken modifiye lipozomda %8,8’dir. In vitro simüle bağırsak sindirimi sonunda ise bu oran lipozom için %45,2 iken modifiye lipozom için %27,1’dir. Bu sonuçlara göre mide sindirimi sırasında lipozomların düşük asidik pH’dan modifiye lipozomlardan daha fazla etkilendiği, modifiye lipozomların yüzeyindeki polimer katmanının lipozomları koruyarak keten tohumu yağının salınmasının yavaşlatıldığını bildirmişlerdir. Bağırsak sindiriminde ise pankreatinin fosfolipitlerin hidrolizini ve safra tuzlarının lipozom membranının parçalanmasını hızlandırması nedeniyle yüksek salım oranlarına ulaşıldığını ancak modifiye lipozomların yüzeyindeki polimer katmanının sertliği nedeniyle enzimlerin ve tuzların geçirgenliği azaltılarak daha düşük oranda salım meydana geldiğini bildirmişlerdir. Lipozomların mide sıvısında kararlı olması bağırsak sindirimi için daha fazla aktif madde taşınması açısından çok önemlidir çünkü bağırsak sıvısının bileşimdeki pankreatik enzimler ve tuzlar nedeniyle lipozomal yapının hasar görerek aktif maddenin yüksek oranda salınması yaygın bir fenomendir. Lipozomların bağırsaktan emilerek vücut dolaşımına girmeleri ve hedeflenen bölgeye aktif maddeleri maksimum seviyede taşıyarak biyoerişilebilirlik seviyesini maksimuma çıkarılması için gastrointestinal sisteme direnç göstermeleri gerekmektedir. Bu nedenle polielektrolit lipozomlarla yüzey modifikasyonu başarıyla uygulanan tekniklerdendir. Elde ettiğimiz sonuçlara göre GUA- CH-Lipozoma yüklenen galanginin %89,12’si, CH-Lipozoma yüklenen galanginin %62,93’ü ve O-Lipozoma yüklenen galanginin %43,59’u bağırsaktan emilerek dolaşıma karışacaktır. Bu sonuçlar LbL tekniğinin lipozomlara başarıyla uygulandığını ve elde edilen lipozom GUA-CH-Lipozomun gastrointestinal sindirim koşullarına karşı direnç göstererek galangini koruduğunu göstermektedir. 9 3 4.8. Biyoerişilebilirlik Çalışması Simüle in vitro gastrointestinal sindirim çalışması ile kontrol olarak havlıcan ekstraktı kullanılarak geliştirilen lipozomların galanginin biyoerişilebilirliği üzerine etkisi incelenmiştir. Lipozomların ve havlıcan ekstraktının galangin içeriği in vitro gastrointestinal sindirim öncesi ve sonrası ölçülerek gastrointestinal sistemde galanginin biyoerişilebilirliği hesaplanmıştır. Şekil 4.12’de havlıcan ekstraktında (kontrol) ve lipozomlarda bulunan galanginin biyoerişilebilirlik yüzdesi verilmiştir. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 tro l m m on oz o oz o om K Lip z ip po O- L i CH - L CH - A- GU Şekil 4.12. Kontrol ve lipozomlarda galanginin biyoerişilebilirlik yüzdesi Şekil 4.12’ye göre A. officinarum ekstraktında galanginin biyoerişilebilirliği %28,88 ± 2,39, O-Lipozomda 43,59 ± 1,12, CH-Lipozomda 62,93 ± 3,03 ve GUA-CH-Lipozomda 89,11 ± 2,00’dır. Buna göre galanginin lipozomlara enkapsüle edilmesi biyoerişilebilirliğini yaklaşık 1,5 kat arttırırken, lipozomların yüzeyinin kitosan ile kaplanması yaklaşık 2 kat ve kitosanla kaplı lipozomun yüzeyinin gam arabik ile kaplanmasıyla 3 kattan fazla arttırmıştır. 9 4 Biyoerişilebilirlik (%) Gómez-Mascaraque vd. (2017) çalışmalarında kurkumin yüklü lipozomları çeşitli konsantrasyonlardaki süt proteini konsentratı (WPC) ile kaplamışlardır. Gastrointestinal sindirim çalışması sonunda serbest kurkuminin biyoerişilebilirliği %3,2 ± 0,5, WPC (%0,1) kaplı lipozomda %5,4 ± 0,5, WPC (%0,2) kaplı lipozomda %5,3 ± 0,5 ve WPC (%0,4) kaplı lipozomda %4,8 ± 0,3’tür. Elde edilen sonuçlara göre, saf kurkuminin biyoerişilebilirliğinin beklendiği gibi çok düşük olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, WPC kaplı lipozomlar kurkumin içeriğinden bağımsız olarak biyoerişilebilirliğini önemli ölçüde arttırdığını (1,7 kat) belirtmişlerdir. Chen vd. (2020), çözünürlüğü çok düşük olan 7,8-dihidroksiflavonu lipozomlara yükleyerek lipozom yüzeyini laktoferrin, çapraz bağlı galaktolize laktoferrin ile modifiye etmişlerdir. Gastrointestinal sindirim çalışması sonucunda serbest 7,8-dihidroksiflavonun biyoerişilebilirliği %20 civarında bulunmuştur. Lipozomlardaki 7,8-dihidroksiflavonun biyoerişilebilirliği %51,85 iken, laktoferrin modifiye lipozomlarda %69, çapraz bağlı galaktolize laktoferrin ile modifiye lipozomlarda ise %81,05 bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara göre galaktolize laktoferrin ve lipozomal membran arasındaki güçlü elektrostatik etkileşimler ve hidrojen bağı, lipozomal membranın simüle edilmiş gastrointestinal sıvılardaki lipolitik enzimler tarafından parçalanmasını etkili bir şekilde önlediği ve 7,8-dihidroksiflavonun biyoerişilebilirliğinin dört kat arttırıldığı bildirilmiştir. Rubaka vd. (2023), Carissa spinarum ekstraktı yüklü lipozomların ve kitosan kaplı lipozomlardaki Carissa spinarum’un biyoerişilebilirliğini incelemişlerdir. Serbest Carissa spinarum’un gastrik fazdaki biyoerişilebilirliği %39,65 ± 2,4 iken lipozomlarda %51,08 ± 3,2 ve kitosan kaplı lipozomlarda %74,11 ± 1,3’dir. İntestinal fazda ise Carissa spinarum’un biyoerişilebilirliği %31,4 ± 2,8’den lipozomlarda %63,32 ± 5,3’e ve kitosan kaplı lipozomlarda %43,71 ± 3,3’e yükselmiştir. Carissa spinarum’un biyoerişilebilirliğindeki artış, gastrointestinal ortamda sindirim enzimlerinin varlığında oksidatif bozulmadan korunmalarına bağlanmıştır. 9 5 4.9. Stabilite Çalışması Lipozom formülasyonlarının stabiliteleri üç farklı sıcaklık koşulunda (+4°C, oda sıcaklığı ve -24°C) 28 gün süreyle incelenmiştir. Stabilite çalışmasının yanıtı olarak enkapsülasyon etkinliği kabul edilmiştir. Şekil 4.13’te 0. gün stabilitesi olarak lipozomların enkapsülasyon etkinliği (%) verilmiştir ve bu değer başlangıç değeri olarak kabul edilmiştir. Lipozom formülasyonlarının başlangıç (0. gün) enkapsülasyon etkinliği her üç koşul için de %93,77 ± 0,05 olarak belirlenmiştir. 100 75 50 25 0 +4 ℃ Oda sıcaklığı -24 ℃ O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Şekil 4.13. Stabilite çalışması 0. gün Şekil 4.14’te lipozomların 1. gün stabilite sonuçları verilmiştir. Buna göre O-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %81,80 ± 0,01, oda sıcaklığında %82,01 ± 0,20 ve - 24°C’de %90,70 ± 0,66’dır. CH-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %88,92 ± 0,01, oda sıcaklığında %89,01 ± 0,05 ve -24°C’de %93,24 ± 0,01’dir. GUA-CH- Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %93,52 ± 0,01, oda sıcaklığında %93,47 ± 0,01 ve -24°C’de %93,43 ± 0,01’dir. 1. günde enkapsülasyon etkinliğindeki en büyük değişim +4°C’de O-Lipozomda görülmüştür ve enkapsülasyon etkinliği yaklaşık %13 azalmıştır. 9 6 Enkapsülasyon etkinliği (%) 100 75 50 25 0 +4 ℃ Oda sıcaklığı -24 ℃ O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Şekil 4.14. Stabilite çalışması 1. gün Şekil 4.15’te lipozomların 7 günlük stabilite sonuçları verilmiştir. Buna göre O- Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %81,55 ± 0,54, oda sıcaklığında %81,53 ± 0, 15 ve -24°C’de %89,84 ± 0,68’dır. CH-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de 88,80 ± 0,47, oda sıcaklığında %87,82 ± 0,77 ve -24°C’de %93,21 ± 0,01’dir. GUA-CH- Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %93,40 ± 0,01, oda sıcaklığında %93,40 ± 0,01 ve -24°C’de %93,38 ± 0,01’dir. 100 75 50 25 0 +4 ℃ Oda sıcaklığı -24 ℃ O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Şekil 4.15. Stabilite çalışması 7. gün 9 7 Enkapsülasyon etkinliği (%) Enkapsülasyon etkinliği (%) Şekil 4.16’de lipozomların 14 günlük stabilite sonuçları verilmiştir. Buna göre O- Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %69,16 ± 0,1, oda sıcaklığında %70,77 ± 1,64 ve -24°C’de %88,77 ± 4,34’tür. CH-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %83,34 ± 0,01, oda sıcaklığında %84,06 ± 1,70 ve -24°C’de %92,15 ± 0,79’dur. GUA- CH-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %93,37 ± 0,01, oda sıcaklığında %93,31 ± 0,15 ve -24°C’de %93,32 ± 0,17’dir. 100 75 50 25 0 +4 ℃ Oda sıcaklığı -24 ℃ O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Şekil 4.16. Stabilite çalışması 14. gün Şekil 4.17’de lipozomların 21 günlük stabilite sonuçları verilmiştir. Buna göre O- Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %67,24 ± 0,01, oda sıcaklığında %68,81 ± 0,37 ve -24°C’de %88,73 ± 0,93’tür. CH-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %81,67 ± 1,55, oda sıcaklığında %82,28 ± 1,14 ve -24°C’de %91,94 ± 0,28’dir. GUA- CH-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %93,28 ± 0,31, oda sıcaklığında %93,18 ± 0,45 ve -24°C’de %93,19 ± 0,29’dur. 9 8 Enkapsülasyon etkinliği (%) 100 75 50 25 0 +4 ℃ Oda sıcaklığı -24 ℃ O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Şekil 4.17. Stabilite çalışması 21.gün 28 günlük stabilite çalışmasının sonunda (Şekil 4.18), O-Lipozom için enkapsülasyon etkinliği +4°C’de %67,01 ± 0,03, oda sıcaklığında %67,03 ± 0,44 ve -24°C’de %87,32 ± 0,94; CH-Lipozom için +4°C’de %79,99 ± 1,13, oda sıcaklığında %81,12 ± 0,53 ve - 24°C’de %90,43 ± 3,26; GUA-CH-Lipozom için +4°C’de %92,73 ± 0,51, oda sıcaklığında %93,09 ± 0,01 ve -24°C’de %93,15 ± 0,01’dir. 100 75 50 25 0 +4 ℃ Oda sıcaklığı -24 ℃ O-Lipozom CH-Lipozom GUA-CH-Lipozom Şekil 4.18. Stabilite çalışması 28.gün 9 9 Enkapsülasyon etkinliği (%) Enkapsülasyon etkinliği (%) Stabilite çalışmasının sonuçlarına göre, 28 gün sonunda O-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği +4°C’de ve oda sıcaklığında yaklaşık %29, -24°C’de yaklaşık %7 azalmıştır. CH-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği ise +4°C’de yaklaşık %15, oda sıcaklığında yaklaşık %14 ve -24°C’de yaklaşık %4 azalmıştır. Son olarak GUA-CH-Lipozomun enkapsülasyon etkinliği ise +4°C’de %1,1, oda sıcaklığında %0,72 ve -24°C’de %0,66 azalmıştır. Geleneksel lipozomlar genellikle düşük stabilite ve dayanıklılığa sahiptir. Lipozom yüzeyinin polielektrolit polimerler ile modifiye edilmesi, lipozomların bu olumsuz özelliklerinin üstesinden gelmek için bir çözüm olabilir (Hermal vd., 2020). 1 00 5. SONUÇ Bu çalışmada yüksek antioksidan aktivitesi ve biyofonksiyonel özellikleri sebebiyle çeşitli kültürlerde yüzyıllardır çeşitli formlarda ilaç olarak kullanılan Alpinia officinarum Hance bitkisinin temel bileşeni olan galanginin biyoerişilebilirliğinin arttırılması için polielektrolit lipozomlar geliştirilmiştir. Çalışmanın ilk bölümünde Alpinia officinarum Hance rizomlarından galangin ekstraksiyonu gerçekleştirilmiştir. Galangin ekstraksiyonu için geliştilecek lipozomların üretim tekniğine uyumlu olması amacıyla etanol seçilmiştir. HPLC-DAD ile ekstraktın kromatografik analizi gerçekleştirilerek fenolik bileşik profili ve içeriği belirlenmiştir. Analiz sonucunda ekstraktın temel bileşeninin galangin olduğu ve galangin konsantrasyonunun 11,5694 mg/g örnek olduğu belirlenmiştir. Daha sonra spektroskopik analizler ile ekstraktın toplam fenolik madde içeriği, flavonoid içeriği ve toplam antioksidan kapasitesi belirlenmiştir. Spektroskopik çalışmalar sonucunda ekstraktın toplam fenolik madde içeriği 113, 61 ± 2,28 mg GAE/g örnek, flavonoid içeriği 5,76 ± 0,06 mg QE/g örnek ve toplam antioksidan kapasitesi 28,81 ± 0,00 mg TE/g örnek olarak belirlenmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde galangin için lipozomal taşıyıcı sistem geliştirmek amacıyla kemometrik optimizasyon tekniklerinden RSM-CCD kullanılarak ultrasonikasyon zamanı, fosfatidilkolin, kolesterol ve galangin oranı optimize edilmiştir. Optimizasyon için 30 farklı deney gerçekleştirilerek maksimum enkapsülasyon etkinliğinde lipozomlar elde etmek için gerekli olan optimum koşullar belirlenmiştir. Buna göre lipozom üretimi için optimum koşullar şu şekildedir; ultrasonikasyon zamanı 24,73 dk, fosfatidilkolin oranı 1,50 mg:mL, kolesterol oranı 0,88 mg:mL ve galangin oranı 0,19 mg:mL’dir. Belirlenen optimum koşullar için tahmini enkapsülasyon etkinliği %93,77’dir. Optimum koşullarda gerçekleştirilen deneyler sonucunda elde edilen deneysel enkapsülasyon etinliği ise %93,77 ± 0,05’dir. Bu sonuçlar lipozom üretimi için geliştirilen modelin enkapsülasyon etkinliğini tahmin etmede başarılı olduğunu göstermektedir. Bu bölümde son olarak yüksek stabiliteyi sağlayabilmek için elde edilen 1 01 optimum lipozomların yüzeyi kitosan ve gam arabik kullanılarak katman katman biriktirme tekniği ile modifiye edilmiştir. Çalışmanın üçüncü kısmında polielektrolit lipozomlar karakterize edilmiştir. Karakterizasyon için FTIR analizi, boyut, morfoloji, hidrodinamik çap, zeta potansiyeli ve polidispersite indeksi analizleri gerçekleştirilmiştir. FTIR analizi sonucunda galanginin yapısının bozulmadan lipozomlara enkapsüle edildiği ve yüzey modifikasyonunun elektrostatik etkileşim ile gerçekleştiği gözlemlenmiştir. FE-SEM ile gerçekleştirilen boyut ve morfoloji analizi sonucunda lipozomların küresel yapıya, 266,60 ± 8,49 nm boyuta sahip olduğu tespit edilmiştir. DLS analizi ile hidrodinamik çapının 567 ± 113 nm, zeta potansiyelinin -6 ± 4 mV ve polidispersite indeksinin 0,749 ± 0,272 olduğu belirlenmiştir. Çalışmanın dördüncü ve son kısmında ise elde edilen polielektrolit lipozomların in vitro simüle vücut sıvısında salım davranışı ve kinetik modeli, in vitro gastrointestinal sistemde salım davranışı, biyoerişilebilirliği ve stabilitesi incelenmiştir. In vitro simüle vücut sıvısında salım çalışmasına göre polielektrolit lipozomlar 5 saat sonunda %23,84 oranında galangin salımı gerçekleştirmiştir ve kinetik salım modeli Higuchi modeli ile uyumludur. Higuchi modeline göre salım difüzyon yolu ile gerçekleştirilmektedir. In vitro gastrointestinal sindirim çalışmasına göre mide sindirimi sonunda polielektrolit lipozomlar %4,75 galangin salımı ve bağırsak sindirimi sonunda %10,88 galangin salımı gerçekleştirmiştir. Biyoerişilebilirlik çalışması sonucunda ise Alpinia officinarum Hance ekstraktındaki galanginin biyoerişilebilirliği %28,88 ± 2,39 iken polielektrolit lipozomlarda bu oran %89,11 ± 2,00’dır. Stabilite çalışmalarına göre ise 28 gün boyunca polielektrolit lipozomların enkapsülasyon etkinliği %93,77’den +4°C’de %92,73 ± 0,51’e, oda sıcaklığında %93,09 ± 0,01’e ve -24°C’de %93,15 ± 0,01’e gerilemiştir. Gerçekleştirilen çalışma sonunda geliştirilen polielektrolit lipozomlar galanginin biyoerişilebilirliğini 3 kattan fazla arttırmış, gastrointestinal koşullardan, simüle vücut sıvılarından ve farklı depolama koşullarından kaynaklanabilecek bozulmayı en aza indirerek stabil kalmasını sağlamıştır. Geliştirilen polielektrolit lipozom sistemi yalnızca 1 02 galangin için değil, galangin gibi yüksek hidrofobikliğe ve zayıf biyoyararlanıma sahip fenolik bileşikler için de uygulanabilir olduğu öngörülmektedir. 1 03 KAYNAKLAR Abbas, Z. S., Sulaiman, G. M., Jabir, M. S., Mohammed, S. A. A., Khan, R. A., Mohammed, H. A. ve Al-Subaiyel, A. (2022). Galangin/β-Cyclodextrin inclusion complex as a drug-delivery system for improved solubility and biocompatibility in breast cancer treatment. Molecules, 27(14), 4521. https://doi.org/10.3390/molecules27144521 Abbas, Z., Sulaiman, G., Jabir, M., Mohammed, H. ve Mohammed, S. (2023). Antioxidant properties of galangin with β-cyclodextrin: an in vitro and in vivo. Journal of Applied Sciences and Nanotechnology, 3(1), 80-89. https://doi.org/10.53293/jasn.2022.4876.1157 Abubakar, I. B., Malami, I., Yahaya, Y. ve Sule, S. M. (2018). A review on the ethnomedicinal uses, phytochemistry and pharmacology of Alpinia officinarum Hance. Journal of Ethnopharmacology, 224, 45-62. https://doi.org/10.1016/j.jep.2018.05.027 Abuwatfa, W. H., Awad, N. S., Pitt, W. G. ve Husseini, G. A. (2022). Thermosensitive polymers and thermo-responsive liposomal drug delivery systems. Polymers, 14(5), 925. https://doi.org/10.3390/polym14050925 Aguilar-Pérez, K. M., Avilés-Castrillo, J. I., Medina, D. I., Parra-Saldivar, R. ve Iqbal, H. M. N. (2020). Insight into nanoliposomes as smart nanocarriers for greening the twenty-first century biomedical settings. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 8, 579536. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.579536 Ahmed, K. S., Hussein, S. A., Ali, A. H., Korma, S. A., Lipeng, Q. ve Jinghua, C. (2019). Liposome: Composition, characterisation, preparation, and recent innovation in clinical applications. Journal of Drug Targeting, 27(7), 742-761. https://doi.org/10.1080/1061186X.2018.1527337 Ajeeshkumar, K. K., Aneesh, P. A., Raju, N., Suseela, M., Ravishankar, C. N. ve Benjakul, S. (2021). Advancements in liposome technology: Preparation techniques and applications in food, functional foods, and bioactive delivery: A review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 20(2), 1280-1306. Blackwell Publishing Inc. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12725 Akbarzadeh, A., Rezaei-Sadabady, R., Davaran, S., Woo Joo, S., Zarghami, N., Hanifehpour, Y., Samiei, M., Kouhi, M. ve Nejati-Koshki, K. (2013). Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale research letters, 8(1), 1-9. https://doi.org/10.1186/1556-276x-8-102 Alfwuaires, M. A. (2022). Galangin mitigates oxidative stress, inflammation, and apoptosis in a rat model of methotrexate hepatotoxicity. Environmental Science and Pollution Research, 29(14), 20279-20288. https://doi.org/10.1007/s11356-021- 16804-z Altin, G., Gültekin-Özgüven, M. ve Ozcelik, B. (2018). Chitosan coated liposome dispersions loaded with cacao hull waste extract: Effect of spray drying on physico- chemical stability and in vitro bioaccessibility. Journal of Food Engineering, 223, 91-98. https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2017.12.005 Amic, D., Davidovi-Amic, D., Belo, D., Rastija, V., Lui, B. ve Trinajsti, N. (2007). SAR and QSAR of the antioxidant activity of flavonoids. Current Medicinal Chemistry, 14(7), 827-845. https://doi.org/10.2174/092986707780090954 1 04 An, N., Zou, Z. Mei, Tian, Z., Luo, X. Zhen, Yang, S. L, ve Xu, L. Z. (2008). Diarylheptanoids from the rhizomes of Alpinia officinarum and their anticancer activity. Fitoterapia, 79(1), 27-31. https://doi.org/10.1016/j.fitote.2007.07.001 Andra, V. V. S. N. L., Pammi, S. V. N., Bhatraju, L. V. K. P. ve Ruddaraju, L. K. (2022). A comprehensive review on novel liposomal methodologies, commercial formulations, clinical trials and patents. BioNanoScience 12(1), 274-291. https://doi.org/10.1007/s12668-022-00941-x Anirudhan, T. S., Vasantha, C. S. ve Sasidharan, A. V. (2017). Layer-by-layer assembly of hyaluronic acid/carboxymethylchitosan polyelectrolytes on the surface of aminated mesoporous silica for the oral delivery of 5-fluorouracil. European Polymer Journal, 93, 572-589. https://doi.org/10.1016/j.eurpolymj.2017.06.033 Arias-Alpizar, G., Kong, L., Vlieg, R. C., Rabe, A., Papadopoulou, P., Meijer, M. S., Bonnet, S., Vogel, S., van Noort, J., Kros, A. ve Campbell, F. (2020). Light-triggered switching of liposome surface charge directs delivery of membrane impermeable payloads in vivo. Nature Communications, 11(1). https://doi.org/10.1038/s41467- 020-17360-9 Attokaran, M. (2017). Galangal: Lesser Alpinia officinarum Hance (Zingiberaceae). Natural Food Flavors and Colorants, Second Edition, 198-199. https://doi.org/https://doi.org/10.1002/9781119114796.ch54 Avci, A. G., Avci, E., Ozluk Cilak, G. ve Coskun Cevher, S. (2020). Antimicrobial and antioxidant activities of Zingiber officinale (Ginger) and Alpinia officinarum (Galangal). Hittite Journal of Science ve Engineering, 7(1), 45-49. https://doi.org/10.17350/HJSE19030000171 Awad, E., El-Fiqi, A., Austin, D. ve Lyndon, A. (2020). Possible effect of lesser galangal (Alpinia officinarum) extracts encapsulated into mesoporous silica nanoparticles on the immune status of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture Research, 51(9), 3674-3684. https://doi.org/10.1111/are.14717 Baishya, H. (2017). Application of mathematical models in drug release kinetics of Carbidopa and Levodopa ER Tablets. Journal of Developing Drugs, 6(2). https://doi.org/10.4172/2329-6631.1000171 Beltrán-Gracia, E., López-Camacho, A., Higuera-Ciapara, I., Velázquez-Fernández, J. B. ve Vallejo-Cardona, A. A. (2019). Nanomedicine review: Clinical developments in liposomal applications. Cancer Nanotechnology, 10(1), 1-40. https://doi.org/10.1186/s12645-019-0055-y Bhupathyraaj, M. (2013). Liposomal drug delivery systems-A review. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 23(1), 295-301. https://www.researchgate.net/publication/260640279 Bobo, D., Robinson, K. J., Islam, J., Thurecht, K. J. ve Corrie, S. R. (2016). Nanoparticle- Based Medicines: A Review of FDA-Approved Materials and Clinical Trials to Date. Pharmaceutical Research, 33(10), 2373-2387. Springer New York LLC. https://doi.org/10.1007/s11095-016-1958-5 Boehm, F. J. (2016). Design challenges and considerations for nanomedical device signal acquisition and propagation. Nanomedical Device and Systems Design: Challenges, Possibilities, Visions, 259-302. https://doi.org/10.1201/b15626-15 Bonechi, C., Tamasi, G., Donati, A., Leone, G., Consumi, M., Cangeloni, L., Volpi, V., Magnani, A., Cappelli, A. ve Rossi, C. (2021). Physicochemical characterization of 1 05 hyaluronic acid and chitosan liposome coatings. Applied Sciences, 11(24), 12071. https://doi.org/10.3390/app112412071 Borges Bubols, G., da Rocha Vianna, D., Medina-Remon, A., von Poser, G., Maria Lamuela-Raventos, R., Lucia Eifler-Lima, V. ve Cristina Garcia, S. (2013). The antioxidant activity of coumarins and flavonoids. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 13(3), 318-334. https://doi.org/10.2174/1389557511313030002 Bratovcic, A. ve Suljagic, J. (2019). Micro- and nano-encapsulation in food industry. Croatian Journal of Food Science and Technology, 11(1), 113-121. https://doi.org/10.17508/cjfst.2019.11.1.17 Briuglia, M. L., Rotella, C., McFarlane, A. ve Lamprou, D. A. (2015). Influence of cholesterol on liposome stability and on in vitro drug release. Drug Delivery and Translational Research, 5(3), 231-242. https://doi.org/10.1007/s13346-015-0220-8 Cao, Y., Dong, X. ve Chen, X. (2022). Polymer-modified liposomes for drug delivery: from fundamentals to applications. Pharmaceutics, 14(4), 778. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14040778 Carocho, M. ve Ferreira, I. C. (2013). A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives. Food and Chemical Toxicology, 51(1), 15- 25. https://doi.org/10.1016/j.fct.2012.09.021 Chen, D., Li, D., Xu, X. B., Qiu, S., Luo, S., Qiu, E., Rong, Z., Zhang, J. ve Zheng, D. (2019). Galangin inhibits epithelial-mesenchymal transition and angiogenesis by downregulating CD44 in glioma. Journal of Cancer, 10(19), 4499-4508. https://doi.org/10.7150/jca.31487 Chen, F., Tan, Y. F., Li, H. L., Qin, Z. M., Cai, H. D., Lai, W. Y., Zhang, X. P., Li, Y. H., Guan, W. W., Li, Y. B. ve Zhang, J. Q. (2015). Differential systemic exposure to galangin after oral and intravenous administration to rats. Chemistry Central Journal, 9(1). https://doi.org/10.1186/s13065-015-0092-5 Chen, Q. X., Zhou, L., Long, T., Qin, D. L., Wang, Y. L., Ye, Y., Zhou, X. G., Wu, J. M. ve Wu, A. G. (2022). Galangin exhibits neuroprotective effects in 6-OHDA-induced models of Parkinson’s disease via the Nrf2/Keap1 pathway. Pharmaceuticals, 15(8). https://doi.org/10.3390/ph15081014 Chen, Y., Xia, G., Zhao, Z., Xue, F., Gu, Y., Chen, C. ve Zhang, Y. (2020). 7,8- Dihydroxyflavone nano-liposomes decorated by crosslinked and glycosylated lactoferrin: storage stability, antioxidant activity, in vitro release, gastrointestinal digestion and transport in Caco-2 cell monolayers. Journal of Functional Foods, 65. https://doi.org/10.1016/j.jff.2019.103742 Chevallier, A. (2016). Encyclopedia of herbal medicine: 550 herbs and remedies for common ailments. Penguin. Cui, T., Jia, A., Yao, M., Zhang, M., Sun, C., Shi, Y., Liu, X., Sun, J. ve Liu, C. (2021). Characterization and caco‐2 cell transport assay of chito‐oligosaccharides nano‐ liposomes based on layer‐by‐layer coated. Molecules, 26(14), 4144. https://doi.org/10.3390/molecules26144144 Curti, V., Zaccaria, V., Sokeng, A. J. T., Dacrema, M., Masiello, I., Mascaro, A., D’antona, G. ve Daglia, M. (2019). Bioavailability and in vivo antioxidant activity of a standardized polyphenol mixture extracted from brown propolis. International Journal of Molecular Sciences, 20(5), 1250. https://doi.org/10.3390/ijms20051250 1 06 Danaei, M., Dehghankhold, M., Ataei, S., Hasanzadeh Davarani, F., Javanmard, R., Dokhani, A., Khorasani, S. ve Mozafari, M. R. (2018). Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics, 10(2), 57. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics10020057 Deniz, A., Sade, A., Severcan, F., Keskin, D., Tezcaner, A. ve Banerjee, S. (2010). Celecoxib-loaded liposomes: Effect of cholesterol on encapsulation and in vitro release characteristics. Bioscience Reports, 30(5), 365-373. https://doi.org/10.1042/BSR20090104 Dixit, A., Rohilla, A., Dixit, J. ve Singh, V. (2014). Qualitative analysis of various plant extracts of Alpinia officinarum. International Journal of Pharmaceutical, Chemical and Biological Sciences, 4(3), 505-508. Dou, J., Shouqin, Z., Zhang, J., Zhang, S., Liang, Q. ve Meng, Q. (2010). Chemical composition and antioxidant properties of the essential oil and methanol extracts of rhizoma Alpinia officinarum from China in vitro. African Journal of Biotechnology, 9(28), 4414-4421. Ekenna, I. C. ve Abali, S. O. (2022). Comparison of the use of kinetic model plots and DD Solver software to evaluate the drug release from Griseofulvin tablets. Journal of Drug Delivery and Therapeutics, 12(2-S), 5-13. https://doi.org/10.22270/jddt.v12i2-s.5402 Fang, L., Zhang, H., Zhou, J., Geng, Y. ve Wang, X. (2018). Rapid screening and preparative isolation of antioxidants from Alpinia officinarum Hance using HSCCC coupled with DPPH-HPLC assay and evaluation of their antioxidant activities. Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2018. https://doi.org/10.1155/2018/3158293 Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K. ve Torchilin, V. P. (2020). Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews, 156, 4- 22. https://doi.org/10.1016/j.addr.2020.06.022 Formagio, A. S. N., Volobuff, C. R. F., Santiago, M., Cardoso, C. A. L., Vieira, M. D. C. ve Pereira, Z. V. (2014). Evaluation of antioxidant activity, total flavonoids, tannins and phenolic compounds in Psychotria leaf extracts. Antioxidants, 3(4), 745-757. https://doi.org/10.3390/antiox3040745 Fr, S. ve Venkatesham, A. (2023). Comparison of the use of kinetic model plots by DD Solver software to evaluate the drug release from Rutin-Mesoporous SBA-15 complex. Fu, J., Wang, Y., Sun, M., Xu, Y. ve Chen, L. (2022). Antibacterial activity and components of the methanol-phase extract from rhizomes of pharmacophagous plant Alpinia officinarum Hance. Molecules, 27(13), 4308. https://doi.org/10.3390/molecules27134308 Fu, M. C. (2015). Handbook of simulation optimization. Springer. http://www.springer.com/series/6161 Gibis, M., Ruedt, C. ve Weiss, J. (2016). In vitro release of grape-seed polyphenols encapsulated from uncoated and chitosan-coated liposomes. Food Research International, 88, 105-113. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2016.02.010 Ghil, S. (2013). Antiproliferative activity of Alpinia officinarum extract in the human breast cancer cell line MCF-7. Molecular Medicine Reports, 7(4), 1288-1292. https://doi.org/10.3892/mmr.2013.1305 1 07 Gomaa, A. I., Martinent, C., Hammami, R., Fliss, I. ve Subirade, M. (2017). Dual coating of liposomes as encapsulating matrix of antimicrobial peptides: Development and characterization. Frontiers in Chemistry, 5(11). https://doi.org/10.3389/fchem.2017.00103 Gomaa, M. M., Fadly, E. El, Salama, M. A. ve Abdin, M. (2022). Production of biocomposite films from gum arabic and galangal extract to prolong the shelf life of agaricus bisporus. Journal of Polymers and the Environment, 30(11), 4787-4799. https://doi.org/10.1007/s10924-022-02551-w Gómez-Mascaraque, L. G., Casagrande Sipoli, C., de La Torre, L. G. ve López-Rubio, A. (2017). Microencapsulation structures based on protein-coated liposomes obtained through electrospraying for the stabilization and improved bioaccessibility of curcumin. Food Chemistry, 233, 343-350. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2017.04.133 Gong, J., Zhang, X., Tan, Y., Li, H., Hou, J. ve Zhang, J. (2020). Gastroprotective effect of the root extract of Alpinia officinarum Hance (Zingiberoside) against acute indomethacin-induced gastric injuries in rats: Involvement of H+/K8-ATPase and prostaglandin E receptors. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 19(9), 1887-1893. https://doi.org/10.4314/tjpr.v19i9.13 Guimarães, D., Cavaco-Paulo, A. ve Nogueira, E. (2021). Design of liposomes as drug delivery system for therapeutic applications. International Journal of Pharmaceutics, 601, 120571. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2021.120571 Hajipour, H., Nouri, M., Ghorbani, M., Bahramifar, A., Emameh, R. Z. ve Taheri, R. A. (2021). Targeted nanostructured lipid carrier containing galangin as a promising adjuvant for improving cytotoxic effects of chemotherapeutic agents. Naunyn- Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology, 394(12), 2353-2362. https://doi.org/10.1007/s00210-021-02152-9 Has, C. ve Sunthar, P. (2020). A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research, 30(4), 336-365. https://doi.org/10.1080/08982104.2019.1668010 Hashemi, S. H., Montazer, M., Naghdi, N. ve Toliyat, T. (2018). Formulation and characterization of alprazolam-loaded nanoliposomes: Screening of process variables and optimizing characteristics using RSM. Drug Development and Industrial Pharmacy, 44(2), 296-305. https://doi.org/10.1080/03639045.2017.1391834 Heo, M. Y., Sohn, S. J. ve Au, W. W. (2001). Anti-genotoxicity of galangin as a cancer chemopreventive agent candidate. Mutation Research, 488(2), 135-150. https://doi.org/10.1016/s1383-5742(01)00054-0 Hermal, F., Frisch, B., Specht, A., Bourel-Bonnet, L. ve Heurtault, B. (2020). Development and characterization of layer-by-layer coated liposomes with poly(L- lysine) and poly(L-glutamic acid) to increase their resistance in biological media. International Journal of Pharmaceutics, 586. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.119568 Hernández-Fernández, M. Á., García-Pinilla, S., Ocampo-Salinas, O. I., Gutiérrez-López, G. F., Hernández-Sánchez, H., Cornejo-Mazón, M., de Jesús Perea-Flores, M. ve Dávila-Ortiz, G. (2020). Microencapsulation of vanilla oleoresin (V. Planifolia andrews) by complex coacervation and spray drying: Physicochemical and microstructural characterization. Foods, 9(10). 1 08 https://doi.org/10.3390/foods9101375 Honda, M., Asai, T., Oku, N., Araki, Y., Tanaka, M. ve Ebihara, N. (2013). Liposomes and nanotechnology in drug development: Focus on ocular targets. International Journal of Nanomedicine, 8, 495-504. https://doi.org/10.2147/IJN.S30725 Huang, H., Wu, D., Tian, W. X., Ma, X. F. ve Wu, X. D. (2008). Antimicrobial effect by extracts of rhizome of Alpinia officinarum Hance may relate to its inhibition of b- ketoacyl-ACP reductase. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 23(3), 362-368. https://doi.org/10.1080/14756360701622099 Indrayan, A. K., Agrawal, P., Rathi, A. K., Shatru, A., Agrawal, N. K. ve Tyagi, D. K. (2009). Nutritive value of some indigenous plant rhizomes resembling ginger. Natural Product Radiance, 507-513. Islam Shishir, M. R., Karim, N., Gowd, V., Zheng, X. ve Chen, W. (2019). Liposomal delivery of natural product: A promising approach in health research. Trends in Food Science and Technology, 85, 177-200. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2019.01.013 Jash, A., Ubeyitogullari, A. ve Rizvi, S. S. H. (2021). Liposomes for oral delivery of protein and peptide-based therapeutics: challenges, formulation strategies, and advances. Journal of Materials Chemistry B, 9(24), 4773-4792. https://doi.org/10.1039/d1tb00126d Jeon, S., Yoo, C. Y. ve Park, S. N. (2015). Improved stability and skin permeability of sodium hyaluronate-chitosan multilayered liposomes by Layer-by-Layer electrostatic deposition for quercetin delivery. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 129, 7-14. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2015.03.018 Jeong, D., Kim, H. ki, Jeong, J. pil, Dindulkar, S. D., Cho, E., Yang, Y. H. ve Jung, S. (2016). Cyclosophoraose/cellulose hydrogels as an efficient delivery system for galangin, a hydrophobic antibacterial drug. Cellulose, 23(4), 2609-2625. https://doi.org/10.1007/s10570-016-0975-1 Jiao, H., Xu, S., Fan, C., Zhang, Q. ve Wang, Y. (2019). Chromatographic fingerprint analysis and quantitative evaluate the rhizomes of Alpinia officinarum Hance (lesser galangal). Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 28(10), 728-738. https://doi.org/10.5246/jcps.2019.10.069 Juhairiyah, F. ve de Lange, E. C. M. (2021). Understanding drug delivery to the brain using liposome-based strategies: Studies that provide mechanistic insights are essential. AAPS Journal, 23(6). https://doi.org/10.1208/s12248-021-00648-z Jung, J. M., Kwon, O. Y., Choi, J. K. ve Lee, S. H. (2022). Alpinia officinarum Rhizome ameliorates the UVB induced photoaging through attenuating the phosphorylation of AKT and ERK. BMC Complementary Medicine and Therapies, 22(1). https://doi.org/10.1186/s12906-022-03707-w Juszkiewicz, K., Sikorski, A. F. ve Czogalla, A. (2020). Building blocks to design liposomal delivery systems. International Journal of Molecular Sciences, 21(24), 1- 22. https://doi.org/10.3390/ijms21249559 Kadam, K., Kıyan, S., Uyanıkgil, Y., Karabey, F. ve Çetin, E. Ö. (2022). Investigation of acute effects of topical Alpinia officinarum (galangal) treatment in experimental contact type burns and comparison with topical silver sulfadiazine treatment. Ulusal Travma ve Acil Cerrahi Dergisi, 28(1), 15-26. https://doi.org/10.14744/tjtes.2020.69002 1 09 Karkar, B. ve Şahin, S. (2022). Determination of phenolic compounds profiles and antioxidant properties of oleaster (Elaeagnus angustifolia L.) grown in Turkey. European Food Research and Technology, 248(1), 219-241. https://doi.org/10.1007/s00217-021-03875-y Karkar, B., Şahin, S. ve Güneş, M. E. (2021). Evaluation of antioxidant properties and determination of phenolic and carotenoid profiles of chestnut bee pollen collected from Turkey. Journal of Apicultural Research, 60(5), 765-774. https://doi.org/10.1080/00218839.2020.1844462 Khorasani, S., Danaei, M. ve Mozafari, M. R. (2018). Nanoliposome technology for the food and nutraceutical industries. Trends in Food Science and Technology, 79, 106- 115.https://doi.org/10.1016/j.tifs.2018.07.009 Khuri, A. I. ve Mukhopadhyay, S. (2010). Response surface methodology. Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Statistics 2(2), 128-149. https://doi.org/10.1002/wics.73 Kim, H., Choi, J. M., Choi, Y., Tahir, M. N., Yang, Y. H., Cho, E. ve Jung, S. (2014). Enhanced solubility of galangin based on the complexation with methylated microbial cyclosophoraoses. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 79(3-4), 291-300. https://doi.org/10.1007/s10847-013-0351-9 Koçak, Ö. F. ve Yılmaz, F. (2022). Use of Alpinia officinarum rhizome in textile dyeing and gaining simultaneous antibacterial properties. Journal of Natural Fibers, 19(5), 1925-1936. https://doi.org/10.1080/15440478.2021.1889441 Konno, K., Sawamura, R., Sun, Y., Yasukawa, K., Shimizu, T., Watanabe, W., Kato, M., Yamamoto, R. ve Kurokawa, M. (2011). Antiviral activities of diarylheptanoids isolated from Alpinia officinarum against respiratory syncytial virus, poliovirus, measles virus, and herpes simplex virus type 1 in vitro. Natural product communications, 6(12). https://doi.org/https://doi.org/10.1177/1934578X1100601222 Köse, L. P., Gülçin, I., Gören, A. C., Namiesnik, J., Martinez-Ayala, A. L. ve Gorinstein, S. (2015). LC-MS/MS analysis, antioxidant and anticholinergic properties of galanga (Alpinia officinarum Hance) rhizomes. Industrial Crops and Products, 74, 712-721. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2015.05.034 Krishnaveni, M., Pg, A. ve Kr, A. (2017.). Comparative phytochemical analysis of Alpinia officinarum rhizome and Terminalia Chebula fruit. Pharmaceutical Sciences International Journal of Pharmacy and Biological Sciences, 7(1), 32-39. http://dx.doi.org/10.21276/ijpbs.2017.7.1.5 Kumar, G., Bhadoria, A. S. ve Patani, P. (2022). A complete review on liposome based drug delivery sysyem. Journal of Pharmaceutical Negative Results, 13, 2314-2322. https://doi.org/10.47750/pnr.2022.13.S05.363 Kumar, S., Dutta, J., Dutta, P. K. ve Koh, J. (2020). A systematic study on chitosan- liposome based systems for biomedical applications. International Journal of Biological Macromolecules, 160, 470-481. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.05.192 Kumari, M. ve Gupta, S. K. (2019). Response surface methodological (RSM) approach for optimizing the removal of trihalomethanes (THMs) and its precursor’s by surfactant modified magnetic nanoadsorbents (sMNP)-An endeavor to diminish probable cancer risk. Scientific Reports, 9(1). https://doi.org/10.1038/s41598-019- 54902-8 1 10 Kurapati, R., Groth, T. W. ve Raichur, A. M. (2019). Recent developments in layer-by- layer technique for drug delivery applications. ACS Applied Bio Materials, 2(12), 5512-5527. https://doi.org/10.1021/acsabm.9b00703 Landi-Librandi, A. P., Caleiro Seixas Azzolini, A. E., De Oliveira, C. A. ve Lucisano- Valim, Y. M. (2012). Inhibitory activity of liposomal flavonoids during oxidative metabolism of human neutrophils upon stimulation with immune complexes and phorbol ester. Drug Delivery, 19(4), 177-187. https://doi.org/10.3109/10717544.2012.679710 Landi-Librandi, A. P., De Oliveira, C. A., Caleiro Seixas Azzolini, A. E., Mariko Kabeya, L., Del Ciampo, J. O., Lopes Badra Bentley, M. V. ve Lucisano-Valim, Y. M. (2011). In vitro evaluation of the antioxidant activity of liposomal flavonols by the HRP-H2O2-luminol system. Journal of Microencapsulation, 28(4), 258-267. https://doi.org/10.3109/02652048.2011.559283 Laouini, A., Jaafar-Maalej, C., Limayem-Blouza, I., Sfar, S., Charcosset, C. ve Fessi, H. (2012). Preparation, characterization and applications of liposomes: State of the art. Journal of Colloid Science and Biotechnology, 1(2), 147-168. https://doi.org/10.1166/jcsb.2012.1020 Lee, J. J., Lee, J. H., Yim, N. H., Han, J. H. ve Ma, J. Y. (2017). Application of galangin, an active component of Alpinia officinarum Hance (Zingiberaceae), for use in drug- eluting stents. Scientific Reports, 7(1). https://doi.org/10.1038/s41598-017-08410-2 Lee, J. S., Kim, K. A., Jeong, S. H., Lee, S. G., Park, H. J., Kim, N. J. ve Lim, S. (2009). Anti-inflammatory, anti-nociceptive, and anti-psychiatric effects by the rhizomes of Alpinia officinarum on complete Freund’s adjuvant-induced arthritis in rats. Journal of Ethnopharmacology, 126(2), 258-264. https://doi.org/10.1016/j.jep.2009.08.033 Lee, M. K. (2020). Liposomes for enhanced bioavailability of water-insoluble drugs: In vivo evidence and recent approaches. Pharmaceutics, 12(3), 264. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics12030264 Li, C. Y., Cheng, S. E., Wang, S. H., Wu, J. Y., Hsieh, C. W., Tsou, H. K. ve Tsai, M. S. (2021). The anti-inflammatory effects of the bioactive compounds ısolated from Alpinia officinarum Hance mediated by the suppression of NF-kappaB and MAPK signaling. Chinese Journal of Physiology, 64(1), 32-42. https://doi.org/10.4103/CJP.CJP_81_20 Li, J., Zhai, J., Dyett, B., Yang, Y., Drummond, C. J. ve Conn, C. E. (2021). Effect of gum arabic or sodium alginate incorporation on the physicochemical and curcumin retention properties of liposomes. LWT, 139, 110571. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2020.110571 Li, N., Zhuang, C., Wang, M., Sun, X., Nie, S. ve Pan, W. (2009). Liposome coated with low molecular weight chitosan and its potential use in ocular drug delivery. International Journal of Pharmaceutics, 379(1-2), 131-138. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2009.06.020 Li, Y., Guo, M., Lin, Z., Zhao, M., Xia, Y., Wang, C., Xu, T. ve Zhu, B. (2018). Multifunctional selenium nanoparticles with Galangin-induced HepG2 cell apoptosis through p38 and AKT signalling pathway. Royal Society Open Science, 5(11), 180509. https://doi.org/10.1098/rsos.180509 Lim, T. K. (2016). Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants, 12. Springer International Publishing. 1 11 Lin, K., Wang, Y., Gong, J., Tan, Y., Deng, T. ve Wei, N. (2020). Protective effects of total flavonoids from Alpinia officinarum rhizoma against ethanol-induced gastric ulcer in vivo and in vitro. Pharmaceutical Biology, 58(1), 854-862. https://doi.org/10.1080/13880209.2020.1803370 Lin, L. Y., Peng, C. C., Yeh, X. Y., Huang, B. Y., Wang, H. E., Chen, K. C. ve Peng, R. Y. (2015). Antihyperlipidemic bioactivity of Alpinia officinarum (Hance) Farw Zingiberaceae can be attributed to the coexistance of curcumin, polyphenolics, dietary fibers and phytosterols. Food and Function, 6(5), 1600-1610. https://doi.org/10.1039/c4fo00901k Liu, G., Hou, S., Tong, P. ve Li, J. (2022). Liposomes: Preparation, characteristics, and application strategies in Analytical Chemistry. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 52(2), 392-412. https://doi.org/10.1080/10408347.2020.1805293 Liu, T., Wang, Y., Zhong, W., Li, B., Mequanint, K., Luo, G. ve Xing, M. (2019). Biomedical applications of layer-by-layer self-assembly for cell encapsulation: Current status and future perspectives. Advanced Healthcare Materials, 8(1), 1800939. https://doi.org/10.1002/adhm.201800939 Liu, W., Liu, J., Li, T., Liu, C. ve Liu, W. (2013). Improved physical and in vitro digestion stability of a polyelectrolyte delivery system based on layer-by-layer self- assembly alginate-chitosan-coated nanoliposomes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61(17), 4133-4144. https://doi.org/10.1021/jf305329n Liu, W., Liu, W., Ye, A., Peng, S., Wei, F., Liu, C. ve Han, J. (2016). Environmental stress stability of microencapsules based on liposomes decorated with chitosan and sodium alginate. Food Chemistry, 196, 396-404. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.09.050 Lombardo, D. ve Kiselev, M. A. (2022). Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics, 14(3), 543. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14030543 Lu, H., Chen, X. ve Xu, H. (2021). Preparation of galangin self-microemulsion drug delivery system and evaluation of its pharmacokinetics in vivo and antioxidant activity ın vitro. Pharmacognosy Magazine, 18(80), 1025-1034. Lu, Y. Hua, Wang, Z. Tao, Wei, D. Z. ve Xiang, H. Bo. (2007). Mechanism and inhibitory effect of galangin and its flavonoid mixture from Alpinia officinarum on mushroom tyrosinase and B16 murine melanoma cells. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 22(4), 433-438. https://doi.org/10.1080/14756360601141562 Ly, T. N., Shimoyamada, M., Kato, K. ve Yamauchi, R. (2003). Isolation and characterization of some antioxidative compounds from the rhizomes of smaller galanga (Alpinia officinarum Hance). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(17), 4924-4929. https://doi.org/10.1021/jf034295m Madrigal-Carballo, S., Lim, S., Rodriguez, G., Vila, A. O., Krueger, C. G., Gunasekaran, S. ve Reed, J. D. (2010). Biopolymer coating of soybean lecithin liposomes via layer-by-layer self-assembly as novel delivery system for ellagic acid. Journal of Functional Foods, 2(2), 99-106. https://doi.org/10.1016/j.jff.2010.01.002 Magsoudi, S., Hosseini, S. A. ve Ravandi, S. (2022). A Review on phospholipid and liposome carriers: synthetic methods and their applications in drug delivery. Journal of Chemical Reviews, 4(4), 346-363. https://doi.org/10.22034/JCR.2022.355104.1182 1 12 Maherani, B., Arab-Tehrany, E., Kheirolomoom, A., Reshetov, V., Stebe, M. J. ve Linder, M. (2012). Optimization and characterization of liposome formulation by mixture design. Analyst, 137(3), 773-786. https://doi.org/10.1039/c1an15794a Maja, L., Željko, K. ve Mateja, P. (2020). Sustainable technologies for liposome preparation. Journal of Supercritical Fluids, 165, 104984. https://doi.org/10.1016/j.supflu.2020.104984 Mak, K. K., Tan, J. J., Marappan, P., Katyayani Balijepalli, M., Choudhury, H., Ramamurthy, S. ve Rao Pichika, M. (2018). Galangin’s potential as a functional food ingredient. Journal of Functional Foods, 46, 490-553. https://doi.org/10.1016/j.j.2018.04.054 Maria Leena, M., Yoha, K. S., Moses, J. A. ve Anandharamakrishnan, C. (2020). Edible coating with resveratrol loaded electrospun zein nanofibers with enhanced bioaccessibility. Food Bioscience, 36, 100669. https://doi.org/10.1016/j.fbio.2020.100669 Mateos-Maroto, A., Fernández-Peña, L., Abelenda-Núñez, I., Ortega, F., Rubio, R. G. ve Guzmán, E. (2022). Polyelectrolyte multilayered capsules as biomedical tools. Polymers, 14(3), 479. https://doi.org/10.3390/polym14030479 Matsuda, H., Nakashima, S., Oda, Y., Nakamura, S. ve Yoshikawa, M. (2009). Melanogenesis inhibitors from the rhizomes of Alpinia officinarum in B16 melanoma cells. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 17(16), 6048-6053. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2009.06.057 Mohammadi, A., Kazemi, S., Molayousefian, I., Pirzadeh, M. ve Moghadamnia, A. A. (2022). Galangin nanoparticles protect acetaminophen-induced liver injury: A biochemical and histopathological approach. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2022. https://doi.org/10.1155/2022/4619064 Muflihah, Y. M., Gollavelli, G. ve Ling, Y. C. (2021). Correlation study of antioxidant activity with phenolic and flavonoid compounds in 12 indonesian indigenous herbs. Antioxidants, 10(10), 1530. https://doi.org/10.3390/antiox10101530 Nakhaei, P., Margiana, R., Bokov, D. O., Abdelbasset, W. K., Jadidi Kouhbanani, M. A., Varma, R. S., Marofi, F., Jarahian, M. ve Beheshtkhoo, N. (2021). Liposomes: structure, biomedical applications, and stability parameters with emphasis on cholesterol. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 9, 748 705886. https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.705886 Nguyen, T. T. A., Huynh, D. T. ve Rungraeng, N. (2019). Extraction and encapsulation of lesser galangal (Alpinia officinarum) essential oil using microwave pretreatment and spray drying. The Journal of Agriculture and Development, 18(3), 57-63. https://doi.org/10.52997/jad.9.03.2019 Nsairat, H., Khater, D., Sayed, U., Odeh, F., Al Bawab, A. ve Alshaer, W. (2022). Liposomes: structure, composition, types, and clinical applications. Heliyon, 8(5). Elsevier Ltd. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2022.e09394 Nur, S., Mubarak, F., Jannah, C., Winarni, D. A., Rahman, D. A., Hamdayani, L. A. ve Sami, F. J. (2019). Total phenolic and flavonoid compounds, antioxidant and toxicity profile of extract and fractions of paku atai tuber (Angiopteris ferox Copel). Food Research, 3(6), 734-740. https://doi.org/10.26656/fr.2017.3(6).135 Olajire, A. A. ve Azeez L. (2011). Total antioxidant activity, phenolic, flavonoid and ascorbic acid contents of Nigerian vegetables. African Journal of Food Science and Technology, 2(2), 22-29. http://www.interesjournals.org/AJFST 1 13 Omoregie, S. N., Omoruyi, F. O., Wright, V. F., Jones, L. ve Zimba, P. V. (2013). Antiproliferative activities of lesser galangal (Alpinia officinarum Hance Jam1), turmeric (Curcuma longa L.), and ginger (Zingiber officinale Rosc.) against acute monocytic leukemia. Journal of Medicinal Food, 16(7), 647-655. https://doi.org/10.1089/jmf.2012.0254 Osman, M. A., Mahmoud, G. I. ve Shoman, S. S. (2020). Correlation between total phenols content, antioxidant power and cytotoxicity. Biointerface Research in Applied Chemistry, 11(3), 10640-10653. https://doi.org/10.33263/BRIAC113.1064010653 Othman, A. K., El Kurdi, R., Badran, A., Mesmar, J., Baydoun, E. ve Patra, D. (2022). Liposome-based nanocapsules for the controlled release of dietary curcumin: PDDA and silica nanoparticle-coated DMPC liposomes enhance the fluorescence efficiency and anticancer activity of curcumin. RSC advances, 12(18), 11282-11292. https://doi.org/10.1039/D2RA00071G Panwar, P., Pandey, B., Lakhera, P. C. ve Singh, K. P. (2010). Preparation, characterization, and in vitro release study of albendazole-encapsulated nanosize liposomes. International Journal of Nanomedicine, 101-108. https://doi.org/10.2147/ijn.s8030 Paolino, D., Mancuso, A., Cristiano, M. C., Froiio, F., Lammari, N., Celia, C. ve Fresta, M. (2021). Nanonutraceuticals: The new frontier of supplementary food. Nanomaterials, 11(3), 1-20. https://doi.org/10.3390/nano11030792 Pasarin, D., Ghizdareanu, A. I., Enascuta, C. E., Matei, C. B., Bilbie, C., Paraschiv- Palada, L. ve Veres, P. A. (2023). Coating materials to increase the stability of liposomes. Polymers, 15(3), 782. https://doi.org/10.3390/polym15030782 Pateiro, M., Gómez, B., Munekata, P. E. S., Barba, F. J., Putnik, P., Kovačević, D. B. ve Lorenzo, J. M. (2021). Nanoencapsulation of promising bioactive compounds to improve their absorption, stability, functionality and the appearance of the final food products. Molecules, 26(6), 1547. https://doi.org/10.3390/molecules26061547 Patil, J., Girase, T., Patil, S. G., Suryawanshi, H. ve Patil, S. A. (2022). Conjugated polymeric liposomes: A hybrid carrier for contemporary drug delivery. Chemistry Proceedings, 12(1), 12. https://doi.org/10.3390/ecsoc-26-13640 Patil, S., Ujalambkar, V., Rathore, A., Rojatkar, S. ve Pokharkar, V. (2019). Galangin loaded galactosylated pluronic F68 polymeric micelles for liver targeting. Biomedicine and Pharmacotherapy, 112, 108691. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2019.108691 Perez-Ruiz, A. G., Ganem, A., Olivares-Corichi, I. M. ve García-Sánchez, J. R. (2018). Lecithin-chitosan-TPGS nanoparticles as nanocarriers of (-)-epicatechin enhanced its anticancer activity in breast cancer cells. RSC Advances, 8(61), 34773-34782. https://doi.org/10.1039/c8ra06327c Petrila, L. M., Bucatariu, F., Mihai, M. ve Teodosiu, C. (2021). Polyelectrolyte multilayers: An overview on fabrication, properties, and biomedical and environmental applications. Materials, 14(15). https://doi.org/10.3390/ma14154152 Phuong Hanh, N. ve Quoc Binh, N. (2014). Distribution of Alpinia (Zingiberaceae) and their use pattern in Vietnam. Journal of Biodiversity ve Endangered Species, 2(2), 121. https://doi.org/10.4172/2332-2543.1000121 1 14 Pirzadeh, M., Barary, M., Hosseini, S. M., Kazemi, S. ve Moghadamnia, A. A. (2021). Ameliorative effect of Alpinia officinarum Hance extract on nonylphenol-induced reproductive toxicity in male rats. Andrologia, 53(6), e14063. https://doi.org/10.1111/and.14063 Prasad, A. ve Kumari, S. (2022). Flavonoid: A mini review on Galangin. Asian Journal of Chemistry, 34(1), 18-24. https://doi.org/10.14233/ajchem.2022.23555 Qaddoori, M. H. ve Al-Shmgani, H. S. (2023). Galangin-Loaded gold nanoparticles: Molecular mechanisms of antiangiogenesis properties in breast cancer. International Journal of Breast Cancer, 2023. https://doi.org/10.1155/2023/3251211 Rampogu, S., Gajula, R. G. ve Lee, K. W. (2021). A comprehensive review on chemotherapeutic potential of galangin. Biomedicine and Pharmacotherapy, 141, 111808. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.111808 Rao, B. N., Reddy, K. R., Mounika, B., Fathima, S. R. ve Tejaswini, A. (2019). Vesicular drug delivery system: A review. International Journal of ChemTech Research, 12(05), 39-53. https://doi.org/10.20902/ijctr.2019.120505 Rasmussen, M. K., Pedersen, J. N. ve Marie, R. (2020). Size and surface charge characterization of nanoparticles with a salt gradient. Nature Communications, 11(1), 2337. https://doi.org/10.1038/s41467-020-15889-3 Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M. ve Rice-Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology & Medicine, 26(9–10), 1231–1237. https://doi.org/10.1016/s0891-5849(98)00315-3 Refaat, H., Mady, F. M., Sarhan, H. A., Rateb, H. S. ve Alaaeldin, E. (2021). Optimization and evaluation of propolis liposomes as a promising therapeutic approach for COVID-19. International Journal of Pharmaceutics, 592, 120028. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.120028 Reshna, K. R., Balakrishnan, P. ve Gopi, S. (2022). Systematic review on activity of liposomal encapsulated antioxidant, antibiotics, and antiviral agents. Journal of Liposome Research, 32(4), 340-353. https://doi.org/10.1080/08982104.2021.2024568 Riaz, M. K., Riaz, M. A., Zhang, X., Lin, C., Wong, K. H., Chen, X., Zhang, G., Lu, A. ve Yang, Z. (2018). Surface functionalization and targeting strategies of liposomes in solid tumor therapy: A review. International Journal of Molecular Sciences, 19(1), 195. https://doi.org/10.3390/ijms19010195 Rommasi, F. ve Esfandiari, N. (2021). Liposomal nanomedicine: Applications for drug delivery in cancer therapy. Nanoscale Research Letters, 16(1), 95. https://doi.org/10.1186/s11671-021-03553-8 Rubaka, C., Gathirwa, J. W., Malebo, H. M., Swai, H., Sibuyi, N. R. S., Hilonga, A. ve Dube, A. (2023). Chitosan-coated liposomes of Carrisa spinarum extract: synthesis, analysis and anti-pneumococcal potency. Bioinspired, Biomimetic and Nanobiomaterials, 12(1), 12-23. https://doi.org/10.1680/jbibn.22.00046 Sabry, S., El Hakim Ramadan, A., Elghany, M., Okda, T. ve Hasan, A. (2021). Formulation, characterization, and evaluation of the anti-tumor activity of nanosized galangin loaded niosomes on chemically induced hepatocellular carcinoma in rats. Journal of Drug Delivery Science and Technology, 61, 102163. https://doi.org/10.1016/j.jddst.2020.102163 1 15 Saifullah, M., Shishir, M. R. I., Ferdowsi, R., Tanver Rahman, M. R. ve Van Vuong, Q. (2019). Micro and nano encapsulation, retention and controlled release of flavor and aroma compounds: A critical review. Trends in Food Science and Technology, 86, 230-251. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2019.02.030 Sakr, O. S., Jordan, O. ve Borchard, G. (2015). Novel Layer-by-Layer deposition technique for the preparation of double-chambered nanoparticle formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences, 104(8), 2637-2640. https://doi.org/10.1002/jps.24507 Samarghandian, S., Hadjzadeh, M.-A.-R., Afshari, J. T. ve Hosseini, M. (2014). Antiproliferative activity and induction of apoptotic by ethanolic extract of Alpinia galanga rhizhome in human breast carcinoma cell line. BMC Complementary and Alternative Medicine, 14(1), 1-9. https://doi.org/10.1186/1472-6882-14-192 Sant’Ana, L. D. O., Buarque Ferreira, A. B., Lorenzon, M. C. A., Berbara, R. L. L. ve Castro, R. N. (2014). Correlation of total phenolic and flavonoid contents of brazilian honeys with colour and antioxidant capacity. International Journal of Food Properties, 17(1), 65-76. https://doi.org/10.1080/10942912.2011.614368 Sarabia, L. A. ve Ortiz, M. C. (2009). Response Surface Methodology. Comprehensive Chemometrics, 1, 345-390. Sawamura, R., Shimizu, T., Sun, Y., Yasukawa, K., Miura, M., Toriyama, M., Motohashi, S., Watanabe, W., Konno, K. ve Kurokawa, M. (2010). In vitro and in vivo anti- influenza virus activity of diarylheptanoids isolated from Alpinia officinarum. Antiviral Chemistry and Chemotherapy, 21(1), 33-41. https://doi.org/10.3851/IMP1676 Sebaaly, C., Trifan, A., Sieniawska, E. ve Greige-Gerges, H. (2021). Chitosan-coating effect on the characteristics of liposomes: A focus on bioactive compounds and essential oils: A review. Processes, 9(3), 1-47. https://doi.org/10.3390/pr9030445 Sercombe, L., Veerati, T., Moheimani, F., Wu, S. Y., Sood, A. K. ve Hua, S. (2015). Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology, 6, 286. https://doi.org/10.3389/fphar.2015.00286 Sforzi, J., Palagi, L. ve Aime, S. (2020). Liposome‐based bioassays. Biology, 9(8), 1- 28. https://doi.org/10.3390/biology9080202 Shin, D., Kinoshita, K., Koyama, K. ve Takahashi, K. (2002). Antiemetic principles of Alpinia officinarum. Journal of Natural Products, 65(9), 1315-1318. https://doi.org/10.1021/np020099i Shishir, M. R. I., Xie, L., Sun, C., Zheng, X. ve Chen, W. (2018). Advances in micro and nano-encapsulation of bioactive compounds using biopolymer and lipid-based transporters. Trends in Food Science and Technology, 78, 34-60. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2018.05.018 Singh, M., Devi, S., Rana, V. S., Mishra, B. B., Kumar, J. ve Ahluwalia, V. (2019). Delivery of phytochemicals by liposome cargos: recent progress, challenges and opportunities. Journal of Microencapsulation, 36(3), 215-235. https://doi.org/10.1080/02652048.2019.1617361 Singh N., Kushwaha P., Ahmad U. ve Abdullah M. (2019). Proliposomes: An approach for the development of stable liposome. Ars Pharm, 60(4), 231-240. http://dx.doi.org/10.30827/ars.v60i4.8517 Singhvi, G. ve Singh, M. (2012). Revıew: In-vıtro drug release characterızatıon models. International Journal of Pharmaceutical Studies and Research, 2(1), 77-84. 1 16 Singleton, V. L. ve Rossi, J. A. (1965). Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic and phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture, 16(3), 144–147. Solanki, D., Motiwale, M. ve Mahapatra, S. (2020). Study of drug release kinetics from sustained release matrix tablets of Acyclovir using natural polymer obtained from Colocasia Esculenta. International Journal of PharmTech Research, 13(3), 172-179. https://doi.org/10.20902/ijptr.2019.130306 Song, F., Chen, J., Zhang, Z. ve Tian, S. (2023). Preparation, characterization, and evaluation of flaxseed oil liposomes coated with chitosan and pea protein isolate hydrolysates. Food Chemistry, 404, 134547. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2022.134547 Song, H. K., Park, S. H., Kim, H. J., Jang, S. ve Kim, T. (2021). Alpinia officinarum water extract inhibits the atopic dermatitis-like responses in NC/Nga mice by regulation of inflammatory chemokine production. Biomedicine and Pharmacotherapy, 144. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2021.112322 Sopyan, I., Insan Sunan, K. ve Gozali, D. (2020). A Review: A Novel of efforts to enhance liposome stability as drug delivery approach. Systematic Reviews in Pharmacy, 11(6), 555-562. https://doi.org/10.31838/srp.2020.6.85 Srividya, A. R., Dhanabal, S. P., Misra, V. K. ve Suja, G. (2010). Antioxidant and antimicrobial activity of Alpinia officinarum. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 72(1), 145. https://doi.org/10.4103%2F0250-474X.62233 Subramani, T. ve Ganapathyswamy, H. (2020). An overview of liposomal nano- encapsulation techniques and its applications in food and nutraceutical. Journal of Food Science and Technology, 57(10), 3545-3555. https://doi.org/10.1007/s13197- 020-04360-2 Subramanian, K., Selvakkumar, C., Vinaykumar, K. S., Goswami, N., Meenakshisundaram, S., Balakrishnan, A. ve Lakshmi, B. S. (2009). Tackling multiple antibiotic resistance in enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) clinical isolates: a diarylheptanoid from Alpinia officinarum shows promising antibacterial and immunomodulatory activity against EPEC and its lipopolysaccharide-induced inflammation. International Journal of Antimicrobial Agents, 33(3), 244-250. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2008.08.032 Suja, S. ve Chinnaswamy, P. (2008). Inhibition of in vitro cytotoxic effect evoked by Alpinia galanga and Alpinia officinarum on PC-3 cell line. Ancient Science of Life, 27(4), 33. Şahin, S., Ari, F., Demir, C. ve Ulukaya, E. (2014). Isolation of major phenolic compounds from the extracts of Prunella L. species grown in Turkey and their antioxidant and cytotoxic activities. Journal of Food Biochemistry, 38(2), 248-257. https://doi.org/10.1111/jfbc.12043 Şahin, S., Aybastier, Ö. ve Demir, C. (2016). Optimization of ultrasonic‐assisted extraction of quercetin and cyanidin from Pyracantha Coccinea and their scavenging effect on free radicals. Journal of Food Biochemistry, 40(4), 472-479. https://doi.org/10.1111/jfbc.12236 Tan, C., Zhang, Y., Abbas, S., Feng, B., Zhang, X. ve Xia, S. (2014). Modulation of the carotenoid bioaccessibility through liposomal encapsulation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 123, 692-700. https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2014.10.011 1 17 Tao, L., Wang, Z. T., Zhu, E. Y., Lu, Y. H. ve Wei, D. Z. (2006). HPLC analysis of bioactive flavonoids from the rhizome of Alpinia officinarum. South African Journal of Botany, 72(1), 163-166. https://doi.org/10.1016/j.sajb.2005.06.007 Tavares, L. ve Noreña, C. P. Z. (2020). Encapsulation of ginger essential oil using complex coacervation method: Coacervate formation, rheological property, and physicochemical characterization. Food and Bioprocess Technology, 13(8), 1405- 1420. https://doi.org/10.1007/s11947-020-02480-3 Tomnikova, A., Orgonikova, A. ve Krizek, T. (2022). Liposomes: preparation and characterization with a special focus on the application of capillary electrophoresis. Monatshefte fur Chemie, 153(9), 687-695. https://doi.org/10.1007/s00706-022- 02966-0 Tomsen-Melero, J., Merlo-Mas, J., Carreño, A., Sala, S., Córdoba, A. veciana, J., González-Mira, E. ve Ventosa, N. (2022). Liposomal formulations for treating lysosomal storage disorders. Advanced Drug Delivery Reviews, 190, 114531. https://doi.org/10.1016/j.addr.2022.114531 Tongchure, S. ve Chanprapai, P. (2022). Antifungal properties of essential oils derived from three plants of Zingiberaceae family against Phytophthora parasitica Dastur. 10(1), 29. https://doi.org/10.3390/iocag2022-12324 Trucillo, P. (2022). Drug Carriers: A Review on the most used mathematical models for drug release. Processes, 10(6). https://doi.org/10.3390/pr10061094 Trucillo, P., Campardelli, R. ve Reverchon, E. (2020). Liposomes: From bangham to supercritical fluids. Processes, 8(9). https://doi.org/10.3390/pr8091022 Tuli, H. S., Sak, K., Adhikary, S., Kaur, G., Aggarwal, D., Kaur, J., Kumar, M., Parashar, N. C., Parashar, G., Sharma, U. ve Jain, A. (2022). Galangin: A metabolite that suppresses anti-neoplastic activities through modulation of oncogenic targets. Experimental Biology and Medicine, 247(4), 345-359. https://doi.org/10.1177/15353702211062510 Wang, C., Chao, I., Qin, Y., Zhang, W., Zhao, J., Zhang, Q. ve Li, S. (2022). Comparison for quantification of eight components in Alpinia officinarum Hance by using high- performance liquid chromatography coupled with diode array detector and charged aerosol detector with individual and substitute reference compound. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 210. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2021.114545 Wang, D. Y., van der Mei, H. C., Ren, Y., Busscher, H. J. ve Shi, L. (2020). Lipid-based antimicrobial delivery-systems for the treatment of bacterial infections. Frontiers in Chemistry, 7, 871. https://doi.org/10.3389/fchem.2019.00872 Wang, J., Gong, J. ve Wei, Z. (2022). Strategies for liposome drug delivery systems to improve tumor treatment efficacy. AAPS PharmSciTech, 23, 1-14. https://doi.org/10.1208/s12249-021-02179-4 Wang, L., Xue, J., Wei, F., Zheng, G., Cheng, M. ve Liu, S. (2021). Chemopreventive effect of galangin against benzo(a)pyrene-induced stomach tumorigenesis through modulating aryl hydrocarbon receptor in Swiss albino mice. Human and Experimental Toxicology, 40(9), 1434-1444. https://doi.org/10.1177/0960327121997979 Wang Y. (2021). Liposome as a delivery system for the treatment of biofilm-mediated infections. Journal of Applied Microbiology, 131(6), 2626-2639. https://doi.org/10.1111/jam.15053 1 18 Wen, M. M., Farid, R. M. ve Kassem, A. A. (2014). Nano-proniosomes enhancing the transdermal delivery of mefenamic acid. Journal of Liposome Research, 24(4), 280- 289. https://doi.org/10.3109/08982104.2014.911313 Wen, T., Wang, X.-K., Liu, C. ve Liu, H. (2016). Two Anti-inflammatory diterpenes from the rhizomes of Alpinia officinarum Hance. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 6(8). https://doi.org/10.20936/jpbms/160275 Wilson, L. (2015). Spices and Flavoring crops: Tubers and roots. Encyclopedia of Food and Health, 93-97. Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-384947- 2.00781-9 Witika, B. A., Makoni, P. A., Matafwali, S. K., Chabalenge, B., Mwila, C., Kalungia, A. C., Nkanga, C. I., Bapolisi, A. M. ve Walker, R. B. (2020). Biocompatibility of biomaterials for nanoencapsulation: Current approaches. Nanomaterials, 10(9), 16, 1-40. https://doi.org/10.3390/nano10091649 Witika, B. A., Makoni, P. A., Matafwali, S. K., Mweetwa, L. L., Shandele, G. C. ve Walker, R. B. (2021). Enhancement of biological and pharmacological properties of an encapsulated polyphenol: Curcumin. Molecules, 26(14), 4244. https://doi.org/10.3390/molecules26144244 Xavier, T. F. ve Agatheeswaran, S. (2010). Antibacterial effects of leaf extract of Alpinia officinarum. Journal of Tropical Medicinal Plants, 11(2). Xia, D. Z., Yu, X. F., Wang, H. M., Ren, Q. Y. ve Chen, B. M. (2010). Anti-Obesity and hypolipidemic effects of ethanolic extract from Alpinia officinarum Hance (Zingiberaceae) in rats fed high-fat diet. Journal of Medicinal Food, 13(4), 785-791. https://doi.org/10.1089/jmf.2009.1235 Xian, J., Zhong, X., Gu, H., Wang, X., Li, J., Li, J., Wu, Y., Zhang, C. ve Zhang, J. (2021). Colonic delivery of celastrol-loaded layer-by-layer liposomes with pectin/trimethylated chitosan coating to enhance its anti-ulcerative colitis effects. Pharmaceutics, 13(12), 2005. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics13122005 Xiong, Y., Guo, D., Wang, L., Zheng, X., Zhang, Y. ve Chen, J. (2009). Development of nobiliside A loaded liposomal formulation using response surface methodology. International Journal of Pharmaceutics, 371(1-2), 197-203. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2008.12.031 Xiong, Y., Wu, B., Guo, X., Shi, D., Xia, H., Xu, H. ve Liu, X. (2023). Galangin delivered by retinoic acid-modified nanoparticles targeted hepatic stellate cells for the treatment of hepatic fibrosis. RSC Advances, 13(16), 10987-11001. https://doi.org/10.1039/d2ra07561j Yakufu, M., Hailiwu, R., Cong, Y., Habaike, A., Wang, X. ve Abulizi, P. (2021). Antitumor activity of flavonoids from Alpinia officinarum hance on gastric cancer. European Journal of Inflammation, 19. https://doi.org/10.1177/20587392211051119 Yao, H., Lu, H., Zhang, J., Xue, X., Yin, C., Hu, J., Zou, R., Wang, L. ve Xu, H. (2019). Preparation of prolonged-circulating galangin-loaded liposomes and evaluation of antitumor efficacy in vitro and pharmacokinetics in vivo. Journal of Nanomaterials, 2019. https://doi.org/10.1155/2019/7236895 Yasukawa, K., Sun, Y., Kitanaka, S., Tomizawa, N., Miura, M. ve Motohashi, S. (2008). Inhibitory effect of the rhizomes of Alpinia officinarum on TPA-induced inflammation and tumor promotion in two-stage carcinogenesis in mouse skin. 1 19 Journal of Natural Medicines, 62(3), 374-378. https://doi.org/10.1007/s11418-008- 0243-2 Ye, W., Sun, W., Chen, R., Wang, Z., Cui, X., Zhang, H., Qian, S., Zheng, Q., Zhou, Y., Wan, J., Xu, J., Wang, X. ve Zhou, Y. (2019). Pharmacokinetics in rat plasma and tissue distribution in mice of galangin determined by UHPLC-MS/MS. Acta Chromatographica, 31(2), 120-125. https://doi.org/10.1556/1326.2017.00389 Zabot, G. L., Schaefer Rodrigues, F., Polano Ody, L., Vinícius Tres, M., Herrera, E., Palacin, H., Córdova-Ramos, J. S., Best, I. ve Olivera-Montenegro, L. (2022). Encapsulation of bioactive compounds for food and agricultural applications. Polymers, 14(19), 4194. https://doi.org/10.3390/polym14194194 Zhang, B. B., Dai, Y., Liao, Z. X. ve Ding, L. S. (2010). Three new antibacterial active diarylheptanoids from Alpinia officinarum. Fitoterapia, 81(7), 948-952. https://doi.org/10.1016/j.tote.2010.06.015 Zhang, H., Liang-Xiong, X. U., Wu, P. ve Wei, X. Y. (2014). Flavonoids from the aerial parts of Alpinia officinarum. Journal of Tropical and Subtropical Botany, 22(1), 89- 92. https://doi.org/10.3969/j.issn.1005-3395.2014.01.014 Zhang, J. Q., Wang, Y., Li, H. L., Wen, Q., Yin, H., Zeng, N. K., Lai, W. Y., Wei, N., Cheng, S. Q., Kang, S. L., Chen, F. ve Li, Y. B. (2015). Simultaneous quantification of seventeen bioactive components in rhizome and aerial parts of Alpinia officinarum Hance using LC-MS/MS. Analytical Methods, 7(12), 4919- 4926. https://doi.org/10.1039/c5ay00647c Zhang, L., Khoo, C., Rao Koyyal, S., de Pedro, N. ve Reddy, N. (2017). Antioxidant, anti-inflammatory and anticancer activities of ethanol soluble organics from water extracts of selected medicinal herbs and their relation with flavonoid and phenolic contents. Pharmacologia, 8(2), 59-72. https://doi.org/10.5567/pharmacologia.2017.59.72 Zhang, T., Su, M., Jiang, X., Xue, Y., Zhang, J., Zeng, X., Wu, Z., Guo, Y. ve Pan, D. (2019). Transepithelial transport route and liposome encapsulation of milk-derived ACE-Inhibitory peptide Arg-Leu-Ser-Phe-Asn-Pro. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 67(19), 5544-5551. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b00397 Zhou, Y.Q., Liu, H., He, M.X., Wang, R., Zeng, Q.Q., Wang, Y., Ye, W.C. ve Zhang, Q.W. (2018). A review of the botany, phytochemical, and pharmacological properties of galangal. Natural and Artificial Flavoring Agents and Food Dyes, 351- 396. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-811518-3.00011-9 Zhu, J., Wang, Q., Li, H., Zhang, H., Zhu, Y., Omari-Siaw, E., Sun, C., Wei, Q., Deng, W., Yu, J. ve Xu, X. (2018). Galangin-loaded, liver targeting liposomes: Optimization and hepatoprotective efficacy. Journal of Drug Delivery Science and Technology, 46, 339-347. https://doi.org/10.1016/j.jddst.2018.05.034 Zhu, J., Wang, Q., Zhu, Y., Adu-Frimpong, M., Li, H., Omari-Siaw, E., Jin, X., Yang, Q., Deng, W., Xu, X. ve Yu, J. (2018). Enhanced oral bioavailability and in vivo hypouricemic activity of galangin via polymeric micelles. Latin American Journal of Pharmacy, 37(9), 1818-1827. 1 20 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı İlkyaz PATIR Doğum Yeri ve Tarihi Bigadiç – 23/06/1994 Yabancı Dili İngilizce Eğitim Durumu Lise Aydın Efeler Anadolu Lisesi Ön Lisans Balıkesir Üniversitesi, Atınoluk Meslek Yüksek Okulu, Tıbbi ve Aromatik Bitkiler Programı, 2012-2014 (GANO: 3.56) Lisans Uludağ Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Kimya Bölümü, 2015-2020 (GANO: 3.41/4.00) Yüksek Lisans Uludağ Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Analitik Kimya Bölümü, 2020-2023 (GANO: 3.57/4.00) İletişim (e-posta) ilkyazpatir@gmail.com Yayınlar Karkar, B., Patır, İ., Eyüboğlu, S. ve Şahin, S. (2023). Development of an edible active chitosan film loaded with Nigella sativa L. extract to extend the shelf life of grapes. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 50, 102708. Karkar, B., Patır, İ. ve Şahin, S. (2023). Development of galangin-loaded nano-sized polyelectrolyte liposome: optimization and characterization. Polymer Bulletin, 1- 21. Projeler Galangin ekstraktının melanogenez özelliğinin belirlenmesi ve galangin yüklü lipozomların tirozinaz inhibitörü olarak cilt beyazlatıcı kremlerin geliştirilmesinde kullanılabilirliğinin araştırılması, Bursa Uludağ Üniversitesi, Genel Araştırma Projesi (GAP), No: FGA-2023-837 (Araştırmacı), devam ediyor. 1 21 Kongreler Patır, İ., Şahin, S. (2022, Eylül, 7-11). Galangin Yüklü Nano Lipozomların Geliştirilmesi. 10. Ulusal Analitik Kimya Kongresi Özet Bildiri Kitabı, Muğla, Türkiye. (Poster Sunumu) Patır, İ., Şahin, S. (2022, Kasım, 3-6). Effect of Synthetic and Natural Polymer Coating on Characteristics and Bioaccessibility of Galangin-loaded Liposomes. 4. Eurasia Biochemical Approaches and Technologies Congress Özet Bildiri Kitabı, Antalya, Türkiye. (Sözlü Sunum) Patır, İ., Tülek, E., Şahin, S. (2023-Haziran, 14-16). Amaranthus/Aljinat Hidrojellerin Boya Biyosorpsiyonunda Kullanımı; Kemometrik Optimizasyon (RSM-CCD), Denge ve Kinetik Çalışmaları. 21. Kromatografi Kongresi Özet Bildiri Kitabı, Aydın, Türkiye. (Poster Sunumu) Eğitimler ve Seminerler ISO 9001:2015 Kalite Yönetim Sistemi Temel Eğitimi, SİGMACERT, 15.12.2022 UKİT Bilim Söyleşileri, Bursa Uludağ Üniversitesi Kimya Topluluğu, 27-28 Aralık 2022 Nanopartiküler Sistemlerin Hazırlanması, İn Vitro ve İn Vivo Uygulamaları, 1-4 Şubat 2023. 1 22