RESEARCH ARTICLES J Res Vet Med. 2019: 39(2) 106-114 DOI:10.30782/jrvm.659950 Mezenkimal Kök Hücrelerin Tanımlanması ve Proliferasyon Özellikleri Ece ÇERÇİ1 Hatice ERDOST1* 1 Bursa Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı 16059, Görükle, Bursa, Turkey Received 16-12-2019 Accepted 12-10-2020 Özet Mezenkimal kök hücreler (MKH), canlılarda diğer kök hücrelere oranla yüksek oranda bulunan ve terapötik etkinliğe sahip farklılaşmamış hücrelerdir. Bu çalışmada, yağ dokudan izole edilen pasaj 3 hücrelerinde, MKH özelliklerinin tanımlanması, Ki-67 antikorunun immunolo- kalizasyonu, hücre gelişim analizi ile proliferasyonun değerlendirilmesi amaçlandı. Pasaj 3 hücreleri adiposit, osteoblast ve kondroblastlara farklılaştırılarak Oil Red O, Alizarin Red ve Alcian Blue teknikleri ile boyandı. MKH karakterizasyonu; kök hücre yüzey işaretleyicilerinden CD90 ve CD105 ile pozitif; CD45 ve CD11b ile negatif ekspresyonu tanımlandı. Sonuç olarak çalışmada; yağ doku kökenli pasaj 3 hücrelerinin; immünofenotipik karakterizasyonu, osteojenik, kondrojenik, adipojenik yönde farklılaşma yetenekleri saptanarak, Ki-67 immunpozitif hücrelerde optimal hücresel hemostaza sahip olduğu ve terapötik açıdan sağlıklı mezenkimal kök hücre proliferasyonunun gerçekleştiği gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Kök Hücre Farklılaşması, İmmunofenotiplendirme, Ki-67, Hücre Gelişim Analizi. Identification of Mesenchymal Stem Cells and Proliferation Properties Abstract Mesenchymal stem cells(MSCs) are undifferentiated cells that have a therapeuticefficacy compared to other stem cells. The aim of this study was to determine the MSC characteristics of passage 3 cells isolated from adipose tissue, immunolocalization of Ki-67 antibody, and to eval- uate proliferation by cell growth analysis. Passage 3 cells were differentiated into adipocytes, osteoblasts and chondroblasts and stained with Oil Red O, Alizarin Red and Alcian Blue techniques. MSCs characterization was identified by stem cell surface markers positive expression of CD90 and CD105 negative expression of CD45 and CD11b. As a result; fat tissue origin passage in 3 cells have been shown that immunophenotypic characterization, differentiation in osteogenic, chon- drogenic, adipogenic aspects have been described as also in preserving optimal cellular hemostasis by Ki-67 positive immunpositive cells; it has been shown that optimal cellular hemostasis is maintained. Keywords: Stem Cell Differentiation, Immunophenotyping, Ki-67, Analyse of Cell Development. Giriş kaynaklı büyüme faktörünün (PDGF), anjiyopoietin-1’in (ANG-1), interlökin-11’in (IL-11), prostaglandin’in Kök hücreler; canlı organizmadaki doku ve organları oluş- (PGF-2), stromal faktör-1’in (SDF-1), hepatosit büyüme turan aynı zamanda büyüme faktörleri, sitokinler ve hor- faktörünün (HGF), insülin benzeri büyüme faktörü-1’in monlar gibi parakrin etki yapan hücrelerdir. Kök hücreler; (IGF-1) salgılanmasını ve hücre füzyonu ile hücresel reje- vasküler endotel büyüme faktörünün (VEGF), trombosit nerasyonu indüklemektedirler. Kök hücreler; çoğalma ve * Corresponding author: Hatice ERDOST Telefon: +90224 294 12 62 Fax: +90224 294 12 02 e-posta adresi: edost@uludag.edu.tr 106 Çerçi ve Erdost 2020 çok yönlü farklılaşma potansiyeline sahip olan özelleşme- proliferasyon aşamasında Ki-67 antikoru için G2/M fazın- miş hücrelerdir.1-2 da hücre çekirdeğinde pozitif reaksiyon gösterdiğini belir- Kök hücreler, farklılaşma (plastisite) yetenekleri açısından; lemişlerdir.18 totipotent, pluripotent ve multipotent olarak sınıflandırıl- Bu çalışmada yağ dokudan izole edilen pasaj 3 hücreleri- maktadır.3 Totipotent özelliğine sahip olduğu bilinen tek nin, MKH özelliklerini tanımlamak için adipojenik, oste- kök hücre tipi, embriyonel hücrelerdir ve canlıdaki bütün ojenik ve kondrojenik yönde farklılaştırılması, kök hücre hücrelere farklılaşabilirler. Pluripotent kök hücreler ise, yüzey işaretleyicileri ile fenotipik karakterizasyonun sap- mezodermal (kemik, kas, kıkırdak, kan gibi), ektodermal tanması, Ki-67 antikorunun immunlokalizasyonu ve hücre (nöron, deri, saç gibi) ve endodermal (hepatositler, pank- gelişim analizinin değerlendirilmesi amaçlandı. reatik beta hücreleri, sindirim sistemi hücreleri gibi) kö- kenli, vücuttaki farklılaşmış tüm hücre tiplerini oluştura- Materyal ve Metot bilme potansiyeline sahip hücrelerdir. Erişkin kök hücreler Hayvan Modeli ve Doku İzolasyonu de; multipotent kök hücre özelliğindedir ancak farklılaşma Çalışmada standart diyet ile beslenen 300 g canlı ağırlıkta, kapasitesi embriyonik kök hücrelere göre çok daha sınırlı- 12 haftalık yaşta, erkek Sprague Dawley ırkı sıçanlar (n=5) dır. 4 kullanıldı. Çalışma Bursa Uludağ Üniversitesi Deney Hay- MKH ilk olarak; Friedenstein ve ark. (1976) tarafından ke- vanları Yerel Etik Kurulu tarafından onaylandı (Karar No: mik iliğinden izole edilmiştir ve yağ doku kökenli MKH 2017-12/01). Asepsi-antisepsi kurallarına uygun olarak; ise ilk kez Zuk ve ark. (2001) tarafından izole edilmiş ve bu di-etil eter anestezisi altında servikal dislokasyon sonra- hücreler (ADSCs) olarak tanımlanmıştır.5-7 sında sıçanlardan steril koşullar altında 5 g abdominal yağ Günümüzde MKH kaynakları olarak; kemik iliği, yağ do- dokusu toplandı. Takiben yağ doku örnekleri steril 50 ml kusu, sinoviyal membran, iskelet kası, dermis, perisit, kı- falkonlar içerisinde Ca ve Mg içermeyen phosphate-buffe- kırdak, tendon, trabeküler kemik, göbek kordonu, akciğer, red saline (DPBS) (Millipore, BSS-1006, Almanya) ile hüc- diş pulpası, amniotik sıvı, fetal karaciğer ve periferal kan re kültür laboratuvarına transfer edildi. gibi dokular kullanılmaktadır.7-12 Bir gram yağ dokusu, preadipositler olarak adlandırılan yaklaşık 350.000 mul- Hücre İzolasyonu tipotent hücre ve yaklaşık 5000 kök hücre içerir. Bu sayı, MKH’ler adipoz dokulardan non-enzimatik yöntem kul- kemik iliğinde bulunan kök hücre sayısından 35 kat daha lanılarak izole edildi.13 Yağ doku örnekleri steril 50 ml ha- fazladır. Başka bir deyişle, yağ dokusu kemik iliğinden çok cimli deionized phosphate buffered saline (DPBS) içeren daha fazla sayıda kök hücre içerir. Aynı zamanda yağ do- falkonlara aktarıldı. Örnekler hücre kültür laboratuvarın- kusundan yapılan izolasyon yöntemi kemik iliğine göre da laminar kabin içerisine transfer edildi. Steril 60 mm minimal invaziftir.13 Yağ dokudaki kök hücreler; labora- steril hücre kültürü petrilerinde yoğun bir şekilde DPBS tuvar ortamında subkültür denilen pasajlama protokolleri ile durulandı. Yağ dokusu; steril iki adet bistüri ucu ile yak- kullanılarak ileri pasajlar ile çoğaltılabilir ve canlı kalabi- laşık 3 mm çapında mins işlemi yapıldı ve steril enjektör lirler. Primer kültür tekniği ile dokudan direk izole edi- ucu ile T25 plastik hücre kültür flasklarının yüzeyine imp- len kök hücreler; in-vitro koşullar altında çoğaltılabilirler. lante edildi. Daha sonra primer hücre izolasyonu için; taze MKH'ler çeşitli gelişme faktörlerinin etkisi ile in-vitro ve besiyeri (Cyagen, RAXMD-03011-440, China) içeriğine in-vivo ortamda farklılaşabilme kapasitesine sahiptirler.14 100 ünite/ml penicillin-100 μg/ml streptomycin (Gibco, Hücre döngüsü dört ayrı fazdan oluşur: Gap1 (G1), sen- TMS-AB2-C, USA), 2 mM L-glutamine (Gibco, G7513, tez (S), Gap2 (G2) ve mitoz (M) fazıdır.15 Sobecki ve ark. USA) %20 heat-inactivated Fetal Bovine Serum(FBS) (Gi- (2017) Ki-67 monoklonal antikorunun mitotik evrede tüm bco, TMS-013-B, USA) ilave edilerek flasklara 5’er ml besi- omurgalı hücrelerinde eksprese edilen bir nükleer protein yeri eklendi. Flasklara ekilen örnekler %96 nem, %5 CO2 olduğunu bildirmektedir.16 Sobecki ve ark. (2017) normal içeren 37° C etüv ortamında inkube edildi. hücrelerde Ki-67’nin; hücre döngüsü başlangıcında, proli- ferasyonun göstergesi olduğunu; hücre bölünmesinin G2 Hücre Gelişim Analizi (Cell Growth Curve) evresinde en yüksek seviyede salındığını ve hücre döngüsü 35 mm plastik hücre kültür petrilerine 3×105 oranında boyunca arttığını, mitozda zirveye ulaştığını belirtmek- hücre ekildi. Proliferasyon potansiyelinin kontrolü için 7 tedir.16 Landberg ve ark. (1990) hücresel proliferasyonu gün süre ile her gün 6’şar petriye (n=42) subkültür sonrası Ki-67 ile değerlendirerek ve G0/G1 evresinde Ki-67’nin hücre sayımı (HS) uygulandı. Total HS sonuçları ile popü- ekspresyonunun görülmediğini; S ve G2/M evresinde lasyonun iki katına çıkma süresi (PDT) ve sayısı (PDN) çekirdekte pozitif reaksiyon olduğunu saptamışlardır.17 analiz edildi. Bu amaçla; N0 başlangıçta ekilen hücre sayı- Gronthos ve ark. (2001) ise; mezenkimal kök hücrelerdeki sını ve N ise ekim sonrası ulaşılan son hücre sayısını ifade 107 Çerçi ve Erdost 2020 etmektedir. PDT hesaplanması için; PDT = Hücre kültürü ara ile besiyeri tazelendi. 21 gün sonra hücreler Alizarin zamanı (CT) / Popülasyonun dublikasyon oranı ile PDN = Red ile boyandı.22 log N / N0 × 3.31 formülasyonları kullanıldı.19 Ki-67 Antikorunun İmmunhistokimyasal Lokalizasyonu Kondrojenik farklılaştırma Pasaj 3 hücrelerde Ki-67 monoklonal antikorunun (Ther- Pasaj 3 hücreler; 96 kuyucuklu hücre kültürü kaplarına mo Fisher Scientific, # MA5-14520, USA) immunohisto- (1×106 cells/cm2) ekilen hücreler standart besiyeri ile %80 kimyasal lokalizasyonunun saptanması için; T25 flask- konfluense ulaştırıldı. Hücrelere kondrojenik besiyeri (BI, lardaki %70 konfluense ulaşan hücreler %0.25 Tripsin/ 05-220-1 ve 05-220-1, İsrail), (4.5 g / l D-glukoz, 350 pM EDTA (PAN-Biotech, P10-019100, Almanya) solusyonu L-prolin, 100 nM deksametazon ve 10 ng / ml TGF-p3 tak- ile subkültüre edildi. Hücreler; 24 kuyucuklu plastik hücre viye edilmiş besiyeri) eklenerek 3 gün ara ile besiyeri taze- kültürü plakalarındaki (n=7) ilk 6 kuyucuğa; 4x104 hücre/ lendi ve 21 gün sonunda hücreler Alcian Blue ile boyandı.21 kuyucuk oranında ekildi. 1 ve 7 gün arasında takip edile- rek her gün için bir hücre kültür kabına fikzasyon işlemi MKH’lerin Fenotiplendirilmesi uygulandı. Pasaj 3 hücrelerin MKH karakterinin belirlenmesi ama- Canlı hücrelerin tespiti için; -20°C’de 15 dakika süre ile cıyla; 24 kuyucuklu plastik hücre kültürü kaplarına 4×104 metanolle (Merck Millipore; M106009.2500, Alman- hücre/kuyucuk oranında hücre ekildi. Standart immuno- ya) fikzasyon yapıldı. 4 kez DPBS ile yıkandı ve Triton-X histokimyasal protokol uygulandı. Mezenkimal kök hücre 100 (Sigma; T8787,USA) ile 10 dakika permeabilizasyon yüzey markırı olan primer antikorlar; CD90 (1/500 anti- sağlandı. Phosphate Buffer Saline (PBS) (Sigma; P4417- kor dilusyonu Abcam, İngiltere, ab225) ile CD105 (1/50 100TAB, USA) ile yıkanan hücreler, endojen peroksidaz antikor dilusyonu Abcam, İngiltere, ab156756) ve CD11b aktivitesini önlemek için % 3’lük hidrojen peroksit içinde (1/100 antikor dilusyonu Abcam, İngiltere, ab8879) ile he- bekletildi ve oda sıcaklığında 5 dakika blocking uygula- matopoetik markır olan; CD45 (1/100 antikor dilusyonu ması yapıldı. Ki-67 için 1:100 oranında hazırlanan primer Abcam, İngiltere, ab10558) kullanıldı. Primer antikor in- antikor (Thermo Fischer Scientific; #MA5-14520, USA) kübasyon aşaması +4ºC’de 18 saat uygulanarak devamında ile +4° C’de 18 saat inkubasyon gerçekleştirildi. Streptavi- immunohistokimyasal kit (Thermo Scientific™, TP-125- din peroksidaz reaksiyonu için; sekonder antikor (Thermo HL, Amerika) protokolü uygulandı. Koromojen olarak Scientific™, TP-125-HL, USA) ile 10 dakika inkubasyon DAB (Abcam, ab64238, İngiltere) ve çekirdek boyaması yapıldı. Diaminobenzidin (DAB) (Abcam, ab6428, İngilte- için Harris Hematoksilen kullanıldı. re) kromojen 5 dakika uygulandı. Çekirdek boyaması için preparatlara Harris Hematoksilen uygulandı ve preparatlar İstatistiksel Analiz araştırma mikroskobunda (Nikon Eclipse 80i, Japon) ince- Pasaj 3 hücrelerin proliferasyonu Ki-67 ekspresyonun sa- lendi; 7 gün süre ile rastgele, beş mikroskobik alanda her yısal değerleri, PDN, PDT değerleri arasındaki farklılıklar bir grup için 500 hücre 20X’lik objektifte sayıldı. 20 için one way ANOVA testleri uygulandı. İstatistiksel fark- lılığının tanımlanması için SPSS 23 programı kullanıldı Adipojenik farklılaştırma (SPSS version 23, IBM Corporation, USA). Pasaj 3 hücreler; 24 kuyucuklu hücre kültürü kabına (1×105 cells/cm2) ekildikten sonra Dulbecco’s Modified Bulgular Eagles Medium (DMEM) ile %80 konfluense ulaştırıldı. Non-enzimatik yöntemle yağ dokudan izole edilen hücre- Hücrelere adipojenik farklılaşma besiyeri (BI, 05-200-1 lerin; ilk 24 saatte plastik yüzeye tutundukları, göç fazına and 05-201-1, İsrail), (100 uM indometazin, 10 ug / ml geçtikleri ve fibroblastoid görünüme sahip oldukları göz- insülin, 500 uM 3-izobutilmetilksantin ve 1 uM deksame- lendi(Şekil 1 A-B). Fibroblastoid forma sahip hücrelerden tazon ilave edilen) eklendi ve 3 gün ara ile besiyeri tazele- oluşan homojen hücre popülasyonu 2. ve 3. pasajda da yo- nerek 2 hafta sonrasında hücreler Oil Red O ile boyandı.21 ğun olarak saptandı. Biz de çalışmamızda izolasyon aşamasından sonra %5-10 Osteojenik farklılaştırma konfluenste T25 flasklara ekilen Pasaj 1 hücreleri, 5 gün- Pasaj 3 hücreler; 24 kuyucuklu hücre kültürü kaplarına de %50 konfluense ulaştı. Pasaj 2 hücreleri 4 günde %70 (1×105 cells/cm2) ekildi. Hücreler DMEM ile %80 konf- konfluense ulaştı. Pasaj 3 hücreleri 7 günde %70 konflu- luense ulaştırıldı. Daha sonra bu hücrelere; DMEM yerine ense ulaştı. Pasaj 3 hücrelerinin, hücre canlılığı açısından osteojenik farklılaşma besiyeri (BI, 05-440-1B, İsrail), (250 homojen dağılım gösterdiği saptandı (Tablo 1, Şekil 2A). uM askorbik asit, 10 mM P-gliserofosfat ve 100 nM deksa- Canlı hücrelerin proliferasyon bulgularında; 1. gün ile metazon ile takviye edilmiş besiyeri) ilave edildi ve 3 gün karşılaştırıldığında; 3-6. günlerde P < 0.001 düzeyinde 108 Çerçi ve Erdost 2020 Şekil 1 A. Primer hücre izolasyon aşamasında bulunan göç fazındaki hücreler (ok başları), B. Fibroblastoid yapıdaki plastik yüzeye tutunan hücreler (ok başları) (Bar 25μ). farklılık bulunuyorken; 7. gün P < 0.05 düzeyinde istatik- lık göstermekteyken, 4, 5, 6. günlerde P < 0.001 düzeyinde sel anlamda önem saptandı. PDN değerleri için; 1. gün ile istatistiksel önem arz ettiği saptandı (Tablo 1, Şekil 4). karşılaştırılınca 2, 7. günlerde P < 0.05 düzeyinde farklılık bulunuyorken; 3-6. günlerde ise P < 0.001 düzeyinde is- Tablo 1. Pasaj 3 Hücre Sayısı (HS), hücre populasyonuun iki katına çıkma sayısı (PDN), hücre proliferasyonun iki katına çıkma süresi (PDT) ve Ki-67 ekspresyonu (%) Ortalama±SE değerleri. Farklı günler için gruplar arasında istatistiki anlamda farklılıklar aynı satırda * P < 0.05, ** P < 0.001 olarak göster- ilmektedir. tatiksel anlamda farklılıklar belirlendi (Tablo 1, Şekil 2B). PDT bulgularında ise; 6. günde farklılık gözlenmezken; 1, 2, 3, 4, 5 ve 7. günlerde P < 0.001 düzeyinde istatiksel an- lamda farklılıklar saptandı. PDT sayısının 7 gün boyunca düzenli artış gösterdiği belirlendi (Tablo 1, Şekil 2C). Pasaj 3 hücrelerde Ki-67 antikorunun nükleer alanda, nük- 7 gün süresince pasaj 3 hücrelerin sayısı (HS / Proliferasyon) ve leoplazmik sahanın tümünde ve özellikle nukleolus bölge- hücre gelişimi sinde pozitif reaksiyonu gösterdiği belirlendi (Şekil 3 A-B). (PDN ve PDT). Proliferasyonun arttığı mitotik fazda Ki-67 antikorunun immunolokalizasyonu istatistiki anlamda değerlendirildi- ğinde; 2 ve 3. günlerde P < 0.05 düzeyinde istatiksel farklı- 109 Çerçi ve Erdost 2020 Şekil 3 A-B. Pasaj 3 MKH’lerdeki Ki-67’nin yoğun olarak nukleolus bölgesinde olmak üzere tüm nukleuslarda (ok) immunpozitif reaksiyonu (Bar 25μ). Şekil 4. Ki-67 ekspresyonu; 4-6. günler arasında 2 ile 3. günlere oranla proliferasyonun daha fazla olduğu görülmektedir. Pasaj 3 hücrelerinin 7. günde adipositlere farklılaştığı, Oil 28 günde sferoidal yapıda gözlendi ve Alcian Blue ile boya- red O pozitif lipid damlacıklarının varlığı ile belirlendi (Şe- narak kondroblast hücreleri saptandı (Şekil 5). kil 5 A-B). Aynı zamanda Pasaj 3 hücreleri osteoblastlara Pasaj 3 hücrelerinde; CD90 ile CD105’te pozitif ekspresyon farklılaştırıldı; osteoblast hücre morfolojisi özellikle 28. saptanırken (Şekil 6 A-B); CD11b ile CD45’in negatif reak- günde gözlendi ve Alizarin Red boyama metodu ile oste- siyon verdiği gözlendi (Şekil 6 C - D). oblast farklılaşması tespit edildi (Şekil 5 C-D). Kondrob- last hücrelerine farklılaştırılan 3. pasaj hücreleri yaklaşık 110 Çerçi ve Erdost 2020 Şekil 5. A. Pasaj adipostilere farklılaştırılmış hücreler B. Oil Red O ile boyanan yağ hücreleri C. 3. Pasaj osteoblastlara farklılaştırılmış hücreler D. Alizarin Red ile boyanan osteoblast hücreleri E. 3. Pasaj kondroblastlara farklılaştırılmış hücreler F. Alcian Blue ile boyanan kondroblast hücreleri (Bar 25 μm). 111 Çerçi ve Erdost 2020 Şekil 6 A - B. Pasaj 3 hücrelerdeki CD 90 ile CD 105’in sitoplazma membranında pozitif; C - D. CD 11b ile CD 45’in negatif immu- nolokalizasyon (Bar 100 μm). Tartışma ve Sonuç plato fazından sonraki 6 ve 7. günlerde konfluens sonrası Birçok çalışmada, uzun süre hücrelerin kültüre edilmesi- mitotik faaliyetin dengeli olarak azalması ile PDT arasında nin stres sinyalleri oluşumuna ve stres faktörlerinin indük- zıt bir ilişki olduğunu saptadık. Hücre proliferasyonunun siyonu ile hücrelerin canlılığının azalmasına sebep olduğu maksimum seviyeye ulaşmasından sonra mitozun yavaşla- belirtilmektedir.23-25 Gronthos ve ark. (2001) ile Osnes-Rin- dığı ve proliferasyon süresinin uzadığı görüldü. Bu durum; gen ve ark. (2016); uzun süre subkültüre edilen MKH’lerde hücre popülasyonunun optimal canlılığını koruduğunu, sitogenetik bozukluk, telomer kısalması ile hücresel yaş- hücresel sağ-kalım yanıtının dengelenmiş olduğunu ve lanma, aktin kümülasyonu ve adezyonun azalması gibi be- hücresel hemostazisin sağlandığını göstermektedir. lirtileri tanımlayarak, 3’ten fazla pasajın doğru olmayaca- Gronthos ve ark. (2017) yapmış olduğu çalışmada Ki-67 ğını bildirmektedirler.18,26 Bu açıdan tümör supressor aktif immunpozitif MKH’lerde; kök hücre farklılaşma kapasi- ve kronik yolakların etkinliğinin, aşırı differensiasyonun, tesinin arttığı ve kök hücre potansiyelinin korunduğunu aşırı proliferasyonun, hücre yaşlanmasının, oksidatif stre- belirtenlenmiştir.18 Yapmış olduğumuz çalışmada ise pasaj sin ve apoptozis indüksiyonunun oluşmaması için çalışma- 3 kök hücrelerinde Ki-67 immunpozitif MKH’lerde hüc- mızda hücre poliferasyonu pasaj 3 ile sınırlandırıldı. resel hemostazisin korunmasının ve optimal kök hücre Osnes-Ringen ve ark. (2016) ile Ross ve Hall (1995) Ki-67 proliferasyonunun kök farklılaşmasını olumlu etkilediğini ekspresyonunun; hücre proliferasyonunu tanımlamada uy- gözlemledik. gun bir antikor olduğunu belirtmektedirler.26-27 Heidari ve Heidari ve ark. (2013) yağ doku kökenli mezenkimal kök ark. (2013) yağ dokusu kökenli mezenkimal kök hücreler- hücrelerin başlangıç ekimi sonrasında; 3-6. günler arasın- de 7. günde plato fazının oluştuğunu ve hücrelerdeki geliş- da pasaj 3 hücre gelişiminde devamlı artış saptandığını, me eğrisinin artış göstermediğini saptamışlardır.28 Biz de 6. günde hücre proliferasyonunun plato fazına ulaştığını, çalışmamızda Ki-67 immunpozitif pasaj 3 hücre hattının 7. günde proliferasyonun stabil seviyesini koruduğunu 112 Çerçi ve Erdost 2020 belirtmişlerdir.28 Çalışmamızda da Heidari ve ark. (2013) 4. Gardner RL. Stem Cells: Potency, plasticity and public çalışmasında olduğu gibi hücrelerin 4-6. günler arasında perception. J Anat. 2002;200:277-282. 2-3. günlere oranla daha fazla Ki-67 immunpozitif hücre- 5. Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN, et al. lerin varlığının gözlenmesi proliferasyonun daha fazla ol- Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse duğunu göstermektedir. Aynı zamanda; logaritmik hücre hematopoietic organs. Exp Hematol. 1976;4(5):267- gelişim eğrisinde de benzer bulguların saptanması hücre- 274. sel proliferasyonu tanımlamaktadır. PDT değerlerinin 1. 6. Caplan AI. Mesenchymal stem cells. Journal of ortho- günden 7. güne kadar optimal aralıktaki artışı; kök hücre paedic research: J Orthop Res 1991;9(5):641-650. bölünme siklusunun pasaj sonuna kadar normal düzeyde 7. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H et al. Multilineage cells ilerlediğini göstermektedir. from human adipose tissue: implications for cell-ba- İdeal MKH fenotipinin sağlanabilmesi için Dominici ve sed therapies. Tissue Eng. 2001;7(2):211-228. ark. (2006) ile Peng ve ark. (2008) kritik ölçütleri; fibrob- 8. Rosen ED, Hsu CH, Wang X, et al. EBP alpha induces last benzeri kök hücre formasyonu, kök hücre adezyonu, adipogenesis through PPARgamma: A unified pat- kök hücre migrasyonu, kök hücre plastisitesi, kök hücre hway. Genes Dev. 2002;16(1):22-26. yüzey işaretleyicilerinin pozitif ekpresyonu veya negatif 9. Bourin P, Bunnell BA, Casteilla L, et al. Stromal cel- reaksiyonu olarak tanımlamışlardır.29-30 Çalışmamızda bu ls from the adipose tissue-derived stromal vascular kriterler doğrultusunda fenotipik kök hücre yüzey işaret- fraction and culture expanded adipose tissue-derived leyicileri olarak kullandığımız CD90 ile CD105’in pozitif stromal/stem cells: a joint statement of the Internatio- ve CD45 ile CD11b’nin negatif immunolokalizasyonu ile nal Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and hücreler tanımlanmıştır. Kök hücrelerin proliferasyon sik- Science and the International Society for Cellular The- lusu boyunca taşımış olduğu Ki-67 protein ekspresyonu, rapy (ISCT). Cytotherapy. 2013;15(6):641-648. hücrelerdeki mitotik potansiyel ile hücresel rejenerasyonu 10. Liu L, Cheung TH, Charville GW, et al. Isolation of göstermektedir. Ki-67 varlığı ise, terapötik etkinin ve kök skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated hücre fenotipinin korunmasında etkindir.16,18,29-30 Çünkü cell sorting. Nat. Protoc. 2015;10:1612 -1624. terapötik açıdan transplantasyon sonrası Ki-67 immunpo- 11. Marx C, Silveira M, Nardi N, et al. Adipose-Derived zitif kök hücrelerin proliferasyonunun optimal seviyede ol- Stem Cells in Veterinary Medicine: Characterizati- ması sayesinde dokuya enjekte edilen kök hücre sayısının on and Therapeutic Applications. Stem Cells Dev. azalmaması, hücresel göç sırasında terapötik anlamda etki 2015;24(7):803-813. edeceği bölgeye hücrelerin ulaşabilmesi, transplante edile- 12. Pelttari K, Steck E, Richer W, et al. The use of mesench- cek kök hücrelerin hücresel sağ kalım düzeyinin azalma- ymal stem cells for chondrogenesis; Injury. Int. J. Care ması ve hücre yoğunluğunun korunabilmesi açısından da Injured. 2008;39S1: 58-65. önemli olabileceğini düşüncesindeyiz. 13. Özen A., Gül Sancak İ., Caylan A., Özgenç Ö. 2016. Sonuç olarak çalışmada; yağ doku kökenli pasaj 3 hücre- ‘’Isolation of adipose tissue-derived stem cells’’.Turk J lerinin; immünofenotipik karakterizasyonu, osteojenik, Vet Anim Sci. 40 (2): 137-141. kondrojenik, adipojenik yönde farklılaşma yetenekleri 14. Gimble JM, Guilak F. Adipose-derived adult stem cel- saptanarak, Ki-67 immunpozitif hücrelerinin PDT bulgu- ls: isolation, characterization, and differentiation po- larında optimal hücresel hemostaza sahip olduğu ve te- tential. Cytotherapy. 2003;5(5): 362-369. rapötik açıdan sağlıklı mezenkimal kök hücre proliferas- 15. Cooper GM. The Cell: A Molecular Approach. 2nd ed. yonunun gerçekleştiği gösterildi. United States, USA: Sunderland (MA): Sinauer Asso- ciates; 2000. Kaynaklar 16. Sobecki M, Mrouj K, Colinge J, et al. Cell cycle regula- tion accounts for variability in Ki-67 expression levels. 1. Spees JL, Lee RH, Gregory CA. Mechanisms of me- Cancer Res. 2017;10. senchymal stem/stromal cell function. Stem Cell Res 17. Landberg G, Tan EM, Roos G. Flow cytometric mul- Ther. 2016;7(1):125. tiparameter analysis of proliferating cell nuclear anti- 2. Zakrzewski W, Dobrzyński M, Szymonowicz M, et gen/cyclin and Ki-67 antigen: a new view of the cell al. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res cycle. Exp Cell Res. 1990;187:111-118. Ther. 2019;10(1):68. 18. Gronthos S, Franklin DM, Leddy HA, et al. Surface 3. Murray PE, Hargreaves KM. Regenerative Endodonti- protein characterization of human adipose tissue-de- cs: A Review of Current Status and a Call for Action. J rived stromal cells. J Cell Physiol. 2001;189(1):54–63. Endod. 2007;33:377-390. 19. Eslaminejad B., Fallah N. Effects of BIO on prolifera- 113 Çerçi ve Erdost 2020 tion and chondrogenic differentiation of mouse mar- row-derived mesenchymal stem cells Vet Res Forum. 2013; 4 (2):69-76. 20. Pınarbaşı E. Apopitozis (Programlı Hücre Ölümü). Ed.: Yıldırım A, Bardakçı F, Karataş M, Tanyolaç B, Moleküler Biyoloji, 2. Baskı, Nobel Yayın Dağıtım, 425-470, 2010. 21. Chieregato K, Castegnaro S, Madeo D, et al. Epidermal growth factor, basic fibroblast growth factor and pla- telet-derived growth factor-bb can substitute for fetal bovine serum and compete with human platelet-rich plasma in the ex vivo expansion of mesenchymal stro- mal cells derived from adipose tissue. Cytotherapy. 2011;13(8):933-943. 22. Zheng H, Ziyou Yu Z, Deng M, et al. Fat extract im- proves fat graft survival via proangiogenic, anti-apop- totic and pro-proliferative activities. Stem Cell Res Ther. 2019;10:174. 23. Kim HJ. Stem cell potential in Parkinson’s disease and molecular factors for the generation of dopamine neurons. Biochim Biophys Acta. 2010; 1812(1):1-11. 24. Hass R, Kasper C, Böhm S, et al. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. J Cell Commun Signal. 2011;9(12):1-14. 25. Varga I, Miko M, Oravcová L et al. Ultra-structu- ral morphology of long-term cultivated white adi- pose tissue-derived stem cells. Cell Tissue Bank. 2015;16(4):639-647. 26. Osnes-Ringen Ø, Berg KH, Moe MC et al. Cell death pattern in lens epithelium of cataract patients. Acta Ophthalmol. 2016; 94(5): 514–520. 27. Ross W and Hall PA. Ki-67 from antibody to molecule to understanding? Clin. Mol. Pathol.1995;48:113-117. 28. Heidari B, Shirazi A, Akhondi MM., et al. Compari- son of proliferative and multilineage differentiation potential of sheep mesenchymal stem cells derived from bone marrow, liver, and adipose tissue. Avicenna J Med Biotechnol. 2013;5(2):104-117. 29. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal cri- teria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8: 315-317. 30. Peng L, Jia Z, Yin X, Zhang X, Liu Y, Chen P, Ma K, Zhou C. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, cartilage, and adipose tissue. Stem Cells Dev. 2008;17: 761–773. 114