Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 47 (2) 255-264, 2021 DOI: https://doi.org/10.32708/uutfd.973523 ÖZGÜN ARAŞTIRMA Hipotalamusta İyonotropik Glutamat Reseptör Ekspresyonu: İmmunohistokimyasal Lokalizasyon Çalışması Duygu GÖK YURTSEVEN1, Gonca TOPAL2, F. Zehra MİNBAY1, Özhan EYİGÖR1 1 Bursa Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Bursa. 2 Bursa Uludağ Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıp-Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Bursa. ÖZET Merkezi sinir sisteminde (MSS) nöron fonksiyonlarının düzenlenmesinde çok çeşitli nörotransmitter madde rol oynar. Glutamat, hipotala- musta en önemli eksitatör amino asit nörotransmitterlerden biri olarak yer alır ve nöronlar üzerindeki düzenleyici işlevini iyonotropik ve metabotropik olarak iki alt ailede sınıflandırılan reseptörlerine bağlanarak gerçekleştirir. Glutamatın bazı nöroendokrin nöronlar üzerinde etkili olduğu yapılan elektrofizyolojik ve farmakolojik çalışmalarla belirlenmiştir. Çalışmamız kapsamında, glutamaterjik innervasyonun histomorfolojik olarak desteklendiği çalışmaların bulunmaması sebebiyle hipotalamik glutamat reseptör alt birimlerine odaklanılmıştır. İyonotropik glutamat reseptör alt birimlerinden AMPA (GluA1, GluA2, GluA3, GluA4), Kainik asit (GluK5, GluK1, GluK2, GluK3) ve NMDA’nın (GluN1, GluN2A) hipotalamustaki dağılımları immünohistokimya yöntemi kullanılarak araştırılmıştır. Dişi sıçanların beyin dokularından vibratom aracılığıyla alınan kesitler, hipotalamik nöronlardaki glutamat reseptör alt birimlerinin varlığı ve yoğunluğu açısından değerlendirilmiştir. Çalışmada, AMPA reseptörlerinden GluA1 ve GluA2’nin yaygın olarak hipotalamusta lokalize olduğu, GluA3 ve GluA4 immünoreaksiyonunun ise çok sınırlı olduğu; kainat reseptör alt birimlerinden GluK5’in çok yaygın olduğu ve GluK1/2/3 içeren nöronların daha az sayıda olduğu, NMDA reseptör alt birimlerinden GluN1’in ise hipotalamusta yoğun olarak bulunduğu saptanmıştır. Sonuç olarak, bu çalışma ile hipotalamik birçok nöronun iyon spesifik iGluR kanallarını farklı miktar ve yoğunlukta eksprese edebildiği, bunun da hedef nöronların glutamat tarafından farklı şekilde düzenlenmesine izin verebileceği gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Glutamat. Kainik Asit. AMPA. NMDA. Hipotalamus. Ionotropic Glutamate Receptor Expression in the Hypothalamus: An Immunohistochemical Localization Study ABSTRACT A wide variety of neurotransmitters play a role in the regulation of neuron functions in the central nervous system (CNS). Glutamate is the major excitatory amino acid neurotransmitter in the hypothalamus. Glutamate performs its regulatory function on neurons by binding to its receptors, which are classified in two subfamilies as ionotropic and metabotropic. It has been determined by electrophysiological and phar- macological studies that glutamate is effective on some neuroendocrine neurons. Due to the lack of studies supporting glutamatergic innerva- tion histomorphologically, our study focused on hypothalamic glutamate receptor subunits. The distributions of AMPA (GluA1, GluA2, GluA3, GluA4), kainic acid (GluK5, GluK1, GluK2, GluK3) and NMDA (GluN1, GluN2A) in the hypothalamus, which are ionotropic glutamate receptor subunits, were investigated using the immunohistochemistry method. Sections taken by vibratome from brain tissues of female rats were evaluated for the presence and density of glutamate receptor subunits in hypothalamic neurons. It was determined that the AMPA receptors subunits GluA1 and GluA2 are highly expressed in the hypothalamus while the synthesis of GluA3 and GluA4 is too limited. Very high number of GluK5-immunoreactive neurons was detected, where the expression of GluK1/2/3 was moderate. GluN1A, one of the NMDA receptor subunits, was found to be densely localized in the hypothalamus. In conclusion, with this study, many hypothalamic neurons can express ion-specific iGluR channels in different amounts and intensities, which would allow a differential regulation of the target neurons by glutamate. Key Words: Glutamate. Kainic Acid. AMPA. NMDA. Hypothalamus. Geliş Tarihi: 20.Temmuz.2021 Kabul Tarihi: 19.Ağustos.2021 Yazarların ORCID ID Bilgisi: Dr. Özhan EYİGÖR Duygu GÖK YURTSEVEN: 0000-0003-4969-3584 Bursa Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi, Gonca TOPAL: 0000-0003-0426-2684 Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı, Zehra MİNBAY: 0000-0001-5757-8450 Bursa. Özhan EYİGÖR: 0000-0003-3463-7483 Tel.: 0224 295 40 65 E-posta: oeyigor@uludag.edu.tr 255 D. Gök Yurtseven, ark. Glutamat memeli merkezi sinir sisteminde (MSS) Literatürde hipotalamik nöronların glutamat reseptör- yerleşik nöronların regülasyonunda rol alan başlıca lerini eksprese ettiklerine dair raporların olmasına eksitatör amino asit nörotransmitterdir1. Bilinç, rağmen, bu çalışmalar glutamat reseptörlerinin tüm alt öğrenme ve hafıza gibi normal beyin fonksiyonların ailelerini ya da alt ailelerin her alt birimini kapsama- yanı sıra MSS’nin gelişiminde, sinaps iletimi ve maktadır. Hipotalamik nöronların glutamaterjik etkile- eliminasyonu, hücre göçü, farklılanması ve ölümünde şiminde yer alma olasılığı olan reseptör alt birimleri- de major rol oynadığı bildirilmiştir2. Glutamat nin tümünü kapsayan ve ayrıca hipotalamik çekirdek- konsantrasyonunun en fazla olduğu yer sinir ler özelinde lokalizasyonlarını bir bütün olarak tanım- terminallerinin içidir3. Glutamat, presinaptik layan bir çalışma literatürde yoktur. Bu çalışmada; terminallerdeki veziküllerden voltaj bağımlı Ca2+ hipotalamik nöronlardaki glutamat reseptör ailelerinin kapılarının bulunduğu mekanizma ile salınır4. Gluta- tüm alt birimlerinin protein düzeyindeki ekspresyonla- mat sinaptik aralığa salınır salınmaz, pre- ya da post- rının belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik sinaptik membrandaki reseptörlerine bağlanır ve onları olarak iyonotropik reseptörlerden kainat (GluK5, aktive eder5. Glutamat aracılı nörotransmisyon, iyo- GluK1, GluK2, GluK3), AMPA (GluA1, GluA2, notropik (iyon kanalı reseptörleri) ve metabotropik GluA3, GluA4) ve NMDA (GluN1, GluN2A) alt reseptörler (G-protein-bağlı reseptörler) üzerinden birimlerinin hipotalamustaki lokalizasyonları ile hipo- gerçekleşir1,6,7. talamik çekirdeklerdeki yoğunlukları immünohisto- İyonotropik glutamat reseptörleri, hızlı eksitatör kimyasal yöntem kullanılarak araştırılmıştır. postsinaptik potansiyel oluşturarak nöronal depolarizasyon yaparken metabotropik reseptörler, nörotransmisyonda modülatör olarak işlev Gereç ve Yöntem görmektedir8. İyonotropik glutamat reseptörleri, farklı glutamat agonistlerine verdikleri yanıtlar karşılaştırıla- Deney Hayvanlarının Hazırlanması rak 3 alt gruba ayrılmaktadır; Kainat (KA, 2-karboksi- 3-karboksimetil-4-izopropenilpirolidin), AMPA (α- Çalışmada, 200-250 gr ağırlığında erişkin (2-3 aylık) amino-3-hidroksi-5- metil-4-isoksazol proprionik Sprague Dawley cinsi dişi sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar 0 asit)/ quisqualate ve NMDA (N-metil-D-aspartat) 25 C oda ısısında, 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık reseptörleri9-11. Bu reseptörlerin en ilgi çekici özellik- (07.00-19.00 arası aydınlık) dönemler şeklinde ayar- lerinden biri, memeli beynindeki ekspresyon profilleri lanmış ortamda tutulup, ad libitum olarak beslendi. ile alt birim kompozisyonuna dayanan kanal özellikle- Çalışmada kullanılan deney hayvanları, Uludağ Üni- rinin çeşitliliğidir. AMPA reseptörleri GluA1-4, kainat versitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi’nin reseptörleri GluK1-5 ve NMDA reseptörleri GluN1, 19.04.2005/1 sayılı kararı ile etik yönden uygun bulu- GluN2A-D, GluN3A-B alt birimlerinden oluşur9,11. Bu narak kullanıldı. alt birimler homomerik (tek bir alt birim) ya da hete- romerik (birden fazla farklı alt birim kombinasyonu) Dokuların Hazırlanması olarak iyon kanalları oluştururlar ki bunlar fonksiyo- nel reseptör kanallarıdır12-14. Farklı reseptör grubuna Herhangi bir enjeksiyon yapılmayan 10 dişi denek, a ait iyon kanallarının glutamatın farklı fizyolojik etkile- derin eter anestezisi altında 0.13 M fosfat tamponu ile b rinde aracı olduklarını belirleyen çalışmalar vardır15,16. hazırlanan %4 paraformaldehitin kullanıldığı Bu nedenle glutamaterjik innervasyon alan nöron transkardiyak perfüzyon fiksasyonu yöntemi gruplarında eksprese olan farklı reseptör alt birimleri- kullanılarak sakrifiye edildi. Bu yöntemde deneklerin nin belirlenmesi önem kazanmaktadır. göğüs kafesleri açılarak kateter kalp apeksinden aortaya yerleştirildi ve sabitlendi. Deneklerin kan Hipotalamus farklı organların fizyolojik yanıtlarını basıncına uygun şekilde ayarlanan perfüzyon koordine ederek homeostazın sağlanmasından sorumlu pompasına bağlı bu katater yardımıyla öncelikle beyin bölgesidir. Bunu gerçekleştirirken dış çevreden gelen, diğer beyin bölgelerinden alınan ve viseral deneklerin dolaşım sistemleri %0.9 serum fizyolojik afferentlerle ulaşan sinyalleri entegre eder ve böylece (NaCl, 150 ml) kullanılarak temizlendi, sonrasında uygun bir nöroendokrin yanıtın ortaya çıkmasını sağ- denek başına taze hazırlanmış 400 ml fiksatif ile lar. Bunun sonucunda hipotalamus organizmanın perfüzyon fiksasyon işlemi gerçekleştirildi. Perfüzyon besin ve sıvı alımı dengesi, enerji kullanımı, vücut sonrası çıkarılarak aynı fiksatifte +4°C’de gece boyu ağırlığı, kan basıncı, susama, vücut ısısı ve uyku dön- post-fiksasyon uygulanan beyinlerden vibrotom ile güsü gibi birçok günlük fonksiyonlarının düzenlenme- 30-50 µm’lik koronal kesitler alındı. Hipotalamusun sinde önemli bir rol oynar17. Hipotalamik fonksiyonla- rostra-kaudal ekseninin tamamını içerecek şekilde rın gerçekleşmesinde nörosekretuvar ya da nöroendok- alınan kesitler 5 seri halinde Tris-HCl tampon c rin hücreler (nöronlar) rol alırlar. Bu nöronlara ait solüsyonu (pH 7.6) içine toplandı. Tris-HCl hücre gövdeleri hipotalamus içerisinde çok sayıda solüsyonunda 3x10 dk. yıkanarak fiksatiften gruplar oluştururlar. Glutamatın hipotalamik nöroen- arındırılan kesitler kriyoprotektan madde d içinde – dokrin nöronlar üzerindeki düzenleyici etkisi bilin- 20°C’de saklandı. mektedir18. 256 Hipotalamusda Glutamat Reseptör Ekspresyonu İmmünohistokimyasal İşlemler antikorlar için belirlenen optimum dilüsyonlar Tablo İmmünohistokimyasal işlemlerin tümü cam I’de özetlenmiştir. sintilasyon viyallerindeki yüzen kesitlere uygulandı. İmmünohistokimya uygulaması öncesinde kesitler – Tablo I. Çalışmada kullanılan antikorların özellikleri 20°C’den oda sıcaklığına çıkartılarak solüsyon Optimum sıcaklığının ortam ısısına yükselmesi beklendi. Test Edilen Optimum Tedarikçi Katalog Antikor Dilüsyonlar İnkübasyon Sıcaklık Firma Numarası Takiben, kriyoprotektan maddeden arındırılmak üzere Süresi Tavşan anti– kesitler tampon ile yıkandı. Çalışmanın tüm GluA1 1:1000 48 saat +4 0C Chemicon AB1504 aşamalarında tampon madde olarak Tris-HCl Fare anti– 1:1000 24 saat +4 0C Chemicon MAB397 solüsyonu kullanıldı. Tamponda yıkama ve GluA2 Fare anti– inkübasyon işlemleri, orbital sallayıcı yardımı ile GluA3 1:1000 72 saat +4 0C Chemicon MAB5416 uygun ajitasyonla gerçekleştirildi. Kriyoprotektandan Tavşan anti– 1:500 72 saat +4 0C Chemicon AB1508 arındırılan kesitlere spesifik olmayan bağlanmayı GluA4 Tavşan anti– Jennes & antikor azaltmak için bloklayıcı tampon uygulandı. Çalışmada 0 kullanılacak tüm sekonder antikorların eşekte GluK5 1:2000 Tüm gece +4 C Eyigör referans no: R52–4 üretilmiş olması nedeniyle bloklayıcı ajan olarak Fare anti– 0GluK1/2/3 1:2000 48 saat +4 C Chemicon MAB379 normal at serumu seçildi. Bloklayıcı tampon, Tris-HCl Mouse anti– Pharmin- tamponunda, %10 normal at serumu (Sigma, Cat No: GluN1 (IgG) 1:500 48 saat OS gen 556,308 H1138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), bakteri Mouse anti–GluN2A (IgG) 1:2000 48 saat OS Millipore MAB5216 oluşumunu engelleyen %0.1 sodyum azid (BDH, Prod. OS: oda sıcaklığı No: 30111, BDH Laboratory Supplies, Poole, İngiltere) ve yüzey gerilimini azaltıp antikorların Hipotalamusta AMPA (GluA1, GluA2, GluA3, GluA4), hücre içine girişini kolaylaştıran %0.2 Triton-X 100 Kainat (GluK5 ve GluK1/2/3) ve NMDA (GluN1, (BDH, Prod. No: 43700, BDH Laboratory Supplies, GluN2A) Reseptör Dağılımlarının Belirlenebilmesi Poole, İngiltere) içerecek şekilde hazırlandı. Bloklama İçin İmmünohistokimya Boyama Protolokü işlemini primer antikor inkübasyonu takip etti. Kullanılan tüm primer ve sekonder antikorlar Kriyoprotektandan çıkarılan kesitler Tris-HCI tam- bloklayıcı tampon ile sulandırıldı. Primer antikor ponda 3x10 dk. yıkanarak zemin boyanmasının mas- inkübasyonunu takiben yıkanan kesitler uygun kelenmesi amacıyla %10’luk normal at serumu ile 2 sekonder antikorlar içeren solüsyona alındı ve uygun saat süreyle inkübe edildi. Primer antikor uygulama- sürelerde inkübe edildi. İşaretleme için kromojen sında kesitler tablo I’de verilen dilüsyon ve sürelerde solüsyonu kullanılacak kesitler üreticisinin verdiği inkübe edildi. Tris-HCI tamponu ile 3x10 dk. yıkama- bilgilere göre Tris-HCl tamponda avidin-biotin nın ardından kesitler, kullanılan primer antikoru solüsyonunda (ABC Elite Kit, Vector Laboratories, tanıyan ve biyotin konjuge sekonder antikorlar (1:100- Burlingame, CA) inkübe edildi. Oluşan kompleksi 1:200; Jackson Immuno Research Laboratories, Inc. görünür hale getirmek amacıyla kesitlere son işlem West Grove, PA) ile 2 saat inkübe edildi. Sekonder olarak kromojen madde uygulaması yapıldı. Avidin- antikordan Tris-HCI tamponunda yıkama ile arındırı- biotin kompleksi peroksidaz enzimi ile işaretli olduğu lan kesitler avidin-biotin kompleksi (ABC Elite Kit, için kromojen madde olarak diaminobenzidine (DAB, Vector Laboratories, Burlingame, CA) solüsyonu ile 1 Sigma, D5637, St. Louis, MO) seçildi. Kromojen saat süreyle inkübe edildi. Yıkamanın ardından, kesit- solüsyonu, 100 ml Tris-HCl tamponda, 50 mg DAB lere substrat kromojen solüsyonu (DAB) uygulandı. ve 5 µl hidrojen peroksit eklenerek hazırlandı. Kesitler Tris-HCI tamponu ile yıkanan kesitler lamlara alınıp bu son aşamadan sonra yıkanarak lamlara alındı. kurutuldu. Kuruyan kesitler ışık mikroskopi inceleme Kuruyan kesitler ışık mikroskopi inceleme öncesi öncesi DPX ile kapatıldı. DPX ile kapatıldı. Bu çalışmalar sırasında test edilen a Sorenson’un Fosfat Tamponunun Hazırlanışı. Solüsyon A [Na2HPO412H2O (0.13 M), (Merck, CAS no:10039-32-4, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya)] 46.54 g/lt, Solüsyon B [KH2PO4 (0.13 M), (ChemCruz, CAS no:7778-77-0, sc-203211, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX.)] 17.68 g/lt. Her iki solüsyon buzdolabında saklanır. Solüsyon A üzerine solüsyon B eklenerek pH 7.4’e ayarlanır. b %4 Paraformaldehit Hazırlanışı. 100 ml distile suda 40 gr paraformaldehit (Merck, Cat. No: 104005, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) magnetik karıştırıcı ve ısıtıcı üzerinde 58°C’ye kadar ısıtılarak çözülür. Sıcaklık kesilir. 1 N NaOH (Merck, CAS1310-73-2, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) ilave edilir ve solüsyon berraklaşıncaya kadar karıştırılır. Filtre kağıdından süzülür. Fosfat tamponu ile 1 lt’ye tamamlanır. pH ölçümü yapılarak konsantre hidroklorik asit ya da 1 N NaOH ile son pH 7.4’e ayarlanır. c Tris Tamponu (0.05 M) Hazırlanışı. Trizma base (Merck, Cat. No: 108387, Merck KGaA, Darmstadt, Almanya) 6 g, distile su 1000 ml. Konsantre hidroklorik asit ile pH 7.6’ya ayarlanır. d Kriyoprotektan Hazırlanışı. 0.05 M Tris tamponu (500 ml), sükroz (BDH, Prod. No: 302997, BDH Laboratory Supplies, Poole, İngiltere) (300 g), etilen glikol (Sigma-Aldrich, Lot≠ STBH2872, Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, MO) (300 ml) ve polivinilprolidon (Amresco, Cat. No: 1512B22, Solon, OH) (10 g). Maddeler verilen sıraya göre eklenir. Distile su ile 1 litreye tamamlanır. 257 D. Gök Yurtseven, ark. Preparatların İncelenmesi AMPA Reseptörleri İmmünoperoksidaz boyaması yapılan kesitlerin ince- Yapılan immünoperoksidaz boyamalarında hipotala- lemesi, Olympus BX–50 fotomikroskopta 40X musta GluA1, GluA2, GluA3 ve GluA4 alt birimlerine objektif kullanılarak dijital kamera (Olympus DP71 ait immünoreaksiyonun mikroskobik olarak değerlen- CCD color camera, 1,5 million pixel, Tokyo, Japonya) dirilmesiyle bu alt birimlerin dağılım paterni belirlendi. ile bilgisayar ekranına alınan görüntüler üzerinde Buna göre GluA1 ve GluA2’nin hipotalamusta daha anında tarama yapılarak gerçekleştirildi. Çalışmalar yoğun olarak yer aldığı, GluA3 ve GluA4’ün çok daha kapsamında yapılan tekli işaretlemeler sonucu hazırla- az sayıdaki nöronda eksprese olduğu ve seçici bir nan kesitlerin koordinatları sıçan beyin atlasına19 göre dağılım gösterdikleri tespit edildi. belirlendi. Supraoptik çekirdek (SON) için bregma – 0.48 mm ile –1.44 mm, paraventriküler çekirdek GluA1: GluA1 immünoreaktif hücrelere preoptik (PVN) için bregma –1.32 mm ile –1.92 mm, lateral bölgede anteroventral periventriküler nukleus (AVPe) hipotalamus (LH) için ise bregma –2.04 mm ile –3.60 ve medial preoptik nukleusda (MPO) rastlandı. İşaretli mm koordinatları arasındaki kesitler seçildi. Bu nöronlar AVPe’de orta yoğunlukta izlenirken MPO’da aralıklarda rostrakaudal düzlemde hipotalamusun 5 çok sayıda nöron görüldü. Median preoptik nukleusda farklı seviyesinden alınan kesitlerde inceleme yapıldı. (MnPO) az ile orta yoğunlukta işaretli nöron vardı Kesitlerin birbirine eşit uzaklıkta (lateral (Şekil 1A). Anterior hipotalamik bölge incelendiğinde, hipotalamusta 350 µm’lik aralıkla) ve her denek için PVN’de özellikle magnosellüler nöronların bulunduğu aynı koordinatta olmasına dikkat edildi. Kesitler, hipo- kısımlarda yoğun GluA1 işaretlenmesi gözlendi (Şekil talamik nöronlardaki iyonotropik glutamat reseptör alt 1B). SON’de çok sayıda nöronun GluA1-pozitif oldu- birimlerinin varlığı ve yoğunluğu açısından semi- ğu belirlendi (Şekil 1C). Suprakiazmatik çekirdekte kantitatif olarak değerlendirildi (Tablo II). Belirli bir (SCN) yoğun aksonal boyanma izlenirken az sayıda hipotalamik çekirdekteki nöronların çoğu ilgili alt nöron gövdesinin immünoreaktif olduğu tespit edildi birimi eksprese ediyorsa “+++”, orta düzeydeki eksp- (Şekil 1D). Ventromedial çekirdekte (VMH) yaygın resyon için “++”, hafif düzeyde ekspresyon varsa “+” işaretli hücre gözlenirken, çekirdeğin özellikle dorso- ve immünopozitifliğin olmadığı bölgeler için “–” medial ve santral bölümlerinde ventrolateral kısmına olucak şekilde immunoperoksidaz reaksiyonların göre daha yoğun sayıda immünoreaktif hücre belirlen- yoğunlukları sınıflandırıldı. di (Şekil 1E). Arkuat çekirdekte (ARC) az sayıda, ancak sitoplazmik antijen-antikor reaksiyonunun yo- ğun olduğu bölgede GluA1-pozitif nörona rastlandı Bulgular (Şekil 1F). Lateral hipotalamus incelendiğinde peri- fornikal alanda yoğunlaşmış GluA1-pozitif nöronlar Bu çalışmada, glutamat reseptör alt birimlerinin hipo- görüldü (Şekil 1G). talamustaki yerleşim özellikleri ile hipotalamik çekir- deklerdeki yoğunlukları immünohistokimyasal yakla- şımla araştırıldı. Tablo II. Glutamat reseptör alt birimlerinin hipotalamik çekirdeklerdeki dağılımları ve immün reaksiyon düzey- leri Hipotalamik Bölgeler AMPA Reseptör Alt Birimi Kainat Reseptör Alt Birimi NMDA Reseptör Alt Birimi GluA1 GluA2 GluA3 GluA4 GluK5 GluK1/2/3 GluN1 GluN2A Preoptik Seviye Median preoptik nukleus (MnPO) ++ – – – +++ + +++ – Anteroventral Periventriküler Nukleus (AVPe) ++ ++ + – +++ +++ +++ – Medial Preoptik Nukleus (MPO) +++ ++ + – ++ + +++ – Lateral Preoptik Alan – – – – – – – – Anterior Seviye Anterior Periventriküler Nukleus (APeV) – + – – – + +++ – Suprakiazmatik Nukleus (SCN) + ++ + – + + +++ – Paraventriküler Nukleus (PVN) +++ ++ – – +++ ++ +++ – Supraoptik Nukleus (SON) +++ ++ + + +++ +++ +++ – Lateral Hipotalamik Alan (LH) – – – – – – – – Tuberal Seviye Arkuat Nukleus (ARC) ++ + + + +++ +++ + – Ventromedial Nukleus (VMH) +++ + + – +++ +++ + – Dorsamedial Nukleus (DMH) – + – – ++ – + – Lateral Hipotalamik Alan (LH) +++ – – – +++ – +++ – Yoğun düzeydeki ekspresyon için “+++”, orta düzeydeki ekspresyon için “++” ve hafif düzeydeki ekspresyon için “+”, immünpozitifliğin olmadığı bölgeler için “–” ifadeleri kullanılmıştır. 258 Hipotalamusda Glutamat Reseptör Ekspresyonu GluA4: GluA4 içeren nöronlara çok az sayıda arkuat (Şekil 3D) ve supraoptik (Şekil 3E) çekirdeklerde rastlandı. Şekil 2. Hipotalamusun farklı seviyelerindeki GluA2 im- Şekil 1. münreaktivitesi. Preoptik hipotalamik alanda yer alan Hipotalamusun farklı seviyelerindeki GluA1 im- AVPe, periventriküler çekirdek (Pe) ve MPO’da (A) münreaktivitesi. (A) Preoptik bölgedeki AVPe, MPO, lokalize GluA2-pozitif nöronlar görülmektedir. Ante- MnPO’da lokalize GluA1-pozitif nöronlar görülmek- rior seviyedeki PVN (B), SCN (C) ve SON’de (D) tedir. Anterior hipotalamusta PVN’de özellikle mag- GluA2 ekspresyonu izlenmektedir. Tuberal seviyede nosellüler nöronların bulunduğu kısımlarda (B), dorsomedial ve ventromedial çekirdek (E) ile arkuat SON’de (C) ve SCN’ta (D) yoğun GluA1 işaretlenmesi çekirdekte (F) GluA2 alt birimini eksprese eden hücre- izlenmektedir. Mediobazal hipotalamusta VMH’da ler görülmektedir. 3V: Üçüncü ventrikül, f: forniks, (E), arkuat çekirdekte (F) ve lateral hipotalamusun ox: optik kiazma. perifornikal alanında (G) yoğunlaşmış GluA1- immünoreaktivitesi belirlenmiştir. 3V: Üçüncü ventrikül, f: forniks, ox: optik kiazma, ME: median eminens. GluA2: Hipotalamusun preoptik bölgesinde AVPe’de orta düzeyde bir GluA2 ekspresyonu izlendi. MPO’da GluA2-pozitif nöron sayısının daha fazla olduğu an- cak nöronlardaki immün reaksiyonun orta düzeyde kaldığı belirlendi. Az sayıda işaretli nörona perivent- riküler alanda rastlandı (Şekil 2A). Anterior hipotala- mus seviyesi incelendiğinde, PVN’de (Şekil 2B) biraz daha fazla olmakla birlikte SCN (Şekil 2C) ve SON’de (Şekil 2D) orta düzeyde nöron yoğunluğu görüldü. Mediobazal hipotalamusta dorsomedial (Şe- kil 2E) ve arkuat (Şekil 2F) çekirdeklerde az sayıda nörona rastlandı. Ventromedial çekirdekte ise dağınık Şekil 3. yerleşimli nöronlar görüldü (Şekil 2E-F). Hipotalamusun farklı seviyelerindeki GluA3 ve GluA4 GluA3: Çok az sayıda ve dağınık yerleşimli GluA3- immünreaktivitesi. GluA3 ekspresyonunun sınırlı pozitif nörona AVPe, MPO, SON, SCN, ARC, VMH olduğu, çok az sayıda nöronun AVPe (A), SON’de (B) ve dorsomedial hipotalamusta (DMH) rastlandı (Şekil ve SCN’de (C) yerleştiği izlenmektedir. GluA4 eksp- 3A-C). Lateral hipotalamus da dahil olmak üzere diğer resyonuna ise ARC (D) ile SON’deki (E) birkaç nö- alanlarda işaretli nöron görülmedi. ronda rastlanmıştır. 3V: Üçüncü ventrikül, ox: optik kiazma. 259 D. Gök Yurtseven, ark. Kainat Reseptörleri rior kısmında çok az sayıda nöron görülürken, poste- Hipotalamusta kainat reseptörlerinden GluK5’in çok romedial yerleşimli belirgin immünoreaktif akson sayıda nöronda eksprese olduğu ve yoğun bir dağılım varlığı tespit edildi (Şekil 5F). Anterior periventriküler özelliği gösterdiği belirlendi. Düşük afiniteli kainat çekirdekte (APeV) dağınık yerleşimli immünopozitif reseptör alt birimleri olan GluK1, GluK2 ve GluK3’ün nöronlar belirlendi (Şekil 5D). Mediobazal hipotala- belirlenmesi için her üç alt birimi de tanıyacak bir musta ise VMH (Şekil 5G) ve arkuat çekirdekte (Şekil ortak sekanstan elde edilen GluK1/2/3 antikoru ile 5H) çok sayıda GluK1/2/3’ü eksprese eden nöron yapılan boyamalarda, bu antikorun da hipotalamusta gözlendi. yerleşik nöronlarda immün reaksiyon verdiği ve dağı- lımının yaygın olduğu belirlendi. GluK5: GluK5 reseptör alt birimine ait immün reaksi- yon gösteren nöronlara tüm hipotalamik çekirdeklerde ve alanlarda rastlandı. Preoptik bölgede, en yoğun GluK5-pozitif nöron grupları MnPO’da (Şekil 4A) ve AVPe’de (Şekil 4B) yerleşikti. MPO’da (Şekil 4A) orta yoğunlukta ve alana dağılmış şekilde lokalize, ancak güçlü immün reaksiyon veren nöronlar tespit edildi. Anterior hipotalamusta, PVN’de hem parvosel- lüler hem de magnosellüler kısımlarında çok sayıda immünopozitif nöron izlendi. Magnosellüler nöronla- rın GluK5 ekspresyonunun parvosellüler nöronlara göre daha fazla olduğu tespit edildi (Şekil 4C). Bu seviyede, üçüncü ventrikül çevresindeki periventrikü- ler alanda GluK5 içeren nöronlar görüldü (Şekil 4D). SCN’de çok az sayıda GluK5-pozitif nörona rastlandı (Şekil 4E). Çekirdeğin hemen çevresinde medial alan- da dağınık yerleşimli GluK5’i eksprese eden nöronlar görüldü. SON’de çok sayıda GluK5 içeren ve sitop- lazmik GluK5 miktarı fazla olan nöron gözlendi. Bu nöronların magnosellüler nöronlar olduğu belirlendi Şekil 4. (Şekil 4F). Mediobazal bölgede en yoğun GluK5- Hipotalamusun farklı seviyelerindeki GluK5 im- pozitif nöron içeren çekirdeğin ARC’de olduğu belir- münreaktivitesinin dağılımı. En yoğun GluK5-pozitif lendi. Median eminensin dış zonundaki aksonal yapı- nöron içeren preoptik bölge çekirdekleri olarak larda yoğun GluK5 boyaması görüldü (Şekil 4H). MnPO (A) ve AVPe (B) görülmektedir. Üçüncü ventri-külün lateralinde yer alan MPO’da (A) orta yoğunluk- VMH’ın anteromedial kısmında işaretli nöron sayısı ta ve alana dağılmış nöronlar izlenmektedir. Anterior fazla iken posterolateral kısmında daha az sayıda hipotalamus bölgesindeki PVN’de magnosellüler GluK5 eksprese eden nöron saptandı. Supraoptik nöronlar daha belirgin olmak üzere parvosellüler retrokiazmatik çekirdekteki (SOR) nöronlarda da nöronların büyük bir kısmında GluK5 immün reaksi- yoğun GluK5 reaksiyonu görülmektedir (Şekil 4G). yonu izlenmektedir (C). Üçüncü ventrikül çevresindeki Lateral hipotalamik alanda dağınık olarak yayılmış periventriküler alanda GluK5-pozitif nöronlar izlen- nöronların yanı sıra özellikle perifornikal bölgede mektedir (D). SCN’de çok az sayıda GluK5-pozitif GluK5 nöronlarının yoğunlaştığı ve belirgin bir sayıya nörona rastlanırken, çekirdeğin medialine komşu çok eriştiği görüldü. Dorsomedial hipotalamik çekirdekte sayıda GluK5 nöronu görülmektedir (E). SON’in çok orta düzeyde bir ekspresyon ve işaretli nöron sayısı sayıda GluK5-pozitif nöron içerdiği, bu nöronlarda belirlendi (Şekil 4G). yoğun reaksiyon olduğu görülmektedir. Nöron büyük- GluK1/2/3: Hipotalamusta GluK5-pozitif nöronlar lükleri itibariyle işaretli nöronların magnosellüler kadar çok olmamakla birlikte, kainat reseptör alt bi- nöronlar olduğu anlaşılmaktadır (F). Mediobazal rimlerinden GluK1, 2, 3’ü tanıyan antikor ile işaretli hipotalamusta yerleşik arkuat çekirdekte yoğun bo- çok sayıda nöron tespit edildi. Preoptik alanda, nöron- yanmış çok sayıda nöron görülmektedir (H). Median ların AVPe’de yoğunlaştığı daha az miktarda hücrenin eminensin dış zonunda yoğun boyalı aksonal yapılar ise MnPO ve MPO’da lokalize olduğu belirlendi (Şe- dikkati çekmektedir (H). VMH’ın anteromedial kıs- kil 5A, B). PVN’de posterior magnosellüler, medial mında işaretli nöronların daha fazla sayıda olduğu parvosellüler ve dorsal parvosellüler bölümlerde belir- görülürken, posterolateral kısmında daha az sayıda gin, medial parvosellüler alanda ise daha az sayıda GluK5’i eksprese eden nöron izlenmektedir. SOR’deki nöronun GluK1/2/3-pozitif olduğu görüldü (Şekil 5C). nöronlarda da yoğun GluK5 reaksiyonu görülmekte- SON’de magnosellüler nöronların çoğunda yoğun dir (G). 3V: Üçüncü ventrikül, f: forniks, ox: optik sitoplazmik tutulum izlendi (Şekil 5E). SCN’nin ante- kiazma, ac: anterior komissür. 260 Hipotalamusda Glutamat Reseptör Ekspresyonu GluN1: Preoptik seviyede, medial septal nukleus (MS), lamina terminalis’in vascular organı (VOLT) ile AVPe’de, medial preoptik alandaki ventromedial preoptik çekirdek (VMPO) ile ventrolateral preoptik çekirdekte (VLPO) ve forniks çevresindeki nöronlarda yoğun bir GluN1 ekspresyonu gözlendi (Şekil 6A-B). Anterior seviyede perifornikal nukleusda (PeF), PVN’in (Şekil 6C) özellikle posterior magnoselüler kısmında belirgin olmak üzere, SON’de (Şekil 6D) ve retrokiazmatik supraoptik çekirdekte (SOR) (Şekil 6E) çok sayıda GluN1-pozitif nöronun lokalize olduğu görüldü. Tuberal seviyedeki alanda lokalize ARC’de, VMH’de ve DMH’de daha az sayıda GluN1’i ekspre- se eden nöron tespit edildi (Şekil 6E). Tuberal seviye- deki lateral hipotalamus incelendiğinde perifornikal alanda yoğunlaşmış GluN1-pozitif nöronlar görüldü (Şekil 6F). Şekil 5. Hipotalamusun farklı seviyelerindeki GluK1/2/3 im- münreaktivitesi. GluR1, 2, 3’ü tanıyan antikor ile işaretli nöronların preoptik alanda AVPe’de (A, B) yoğunlaştığı, daha az miktarda hücrenin ise MnPO (A) ve MPO’da (A, B) lokalize olduğu izlenmektedir. Anterior hipotalamik çekirdeklerden PVN’in posterior Şekil 6. magnosellüler, medial parvosellüler ve dorsal par- Hipotalamusun farklı seviyelerindeki GluN1 im- vosellüler bölümlerde belirgin (C), SON’deki magno- münreaktivitesi. Preoptik seviyede, AVPe’de (A), sellüler nöronların çoğunda yoğun (E), SCN’nin ante- VMPO’da (A) ve VLPO’daki (B) nöronlarda yoğun rior kısmında çok az sayıda (F) ve periventriküler GluN1 ekspresyonu gözlenmektedir. Anterior seviyede, çekirdekte (D) dağınık yerleşimli GluK1/2/3- PVN’in (C) özellikle posterior magnoselüler kısmında immünopozitif nöronlar görülmektedir. Mediobazal belirgin olmak üzere, SON’de (D) ve SOR’da (E) çok hipotalamusta VMH (G) ve ARC’de (H) GluK1/2/3’ü sayıda GluN1-pozitif nöronun lokalize olduğu görül- eksprese eden nöronların dağılımı izlenmektedir. 3V: mektedir. Tuberal seviyedeki çekirdeklerden ARC’de, Üçüncü ventrikül, ox: optik kiazma, ac: anterior VMH’da ve DMH’de az sayıda, lateral hipotalamik komissür. alanda (F) çok sayıda GluN1’i eksprese eden hücreler tespit edilmiştir. 3V: Üçüncü ventrikül, ox: optik NMDA reseptörleri kiazma. NMDA reseptörlerinden GluN1’in çok sayıdaki hipo- talamik alanda ve nöronda eksprese olduğu, yoğun bir GluN2A: GluN2A reseptör alt ünitesi ile ilgili incele- dağılım özelliği gösterdiği belirlendi. nen kesitler, elimizdeki antikorun spesifik ve yeterli boyama yapmaması nedeniyle değerlendirilememiştir. 261 D. Gök Yurtseven, ark. sinaptik girdilerin üçte birinden fazlasının glutamat- Tartışma ve Sonuç pozitif olduğu bilinmektedir29. Hipotalamusun belirli alanlarına spesifik30-32 ya da tek Çalışmalarımız kapsamında yapılan immünohistokim- bir alt birimin hipotalamusta belirlenmesine yönelik33- yasal boyamalarda, iyonotropik glutamat reseptör alt 35 immünohistokimyasal çalışmalar literatürde var birimlerinden AMPA reseptör ailesine ait alt üniteler olmasına rağmen, genel dağılımı belirleyen çalışma olan GluA1, GluA2, GluA3, GluA4, kainat reseptör sayısı oldukça azdır. Bu tekniğin kullanılarak yapıldı- ailesine ait alt üniteler GluK5 ve GluK1/2/3 ve ğı bir başka çalışmada, sıçan red nuklesundaki gluta- NMDA reseptör ailesine ait GluN1 alt birimini eksp- mat reseptör alt birimlerin ekspresyonu araştırılmış rese eden nöronların hipotalamustaki dağılım ve hipo- olup, işaretlenen nöronların immünoreaktivite ve sayı- talamik çekirdeklerdeki yerleşim düzenleri belirlen- larının ilgili reseptörün alt birim proteinlerine bağlı miştir. olarak değiştiği gösterilmiştir. Aynı çalışmada, red İyonotropik glutamat reseptörlerinin hipotalamusta nukleusun magnoselüler kısmındaki nöronların GluA2, dağılım motifini mRNA düzeyinde gösteren in situ GluA4, GluK2/3, GluK5, GluN1 ve GluN2A reseptör hibridizasyon çalışmaları literatürde mevcuttur20,21. In proteinleri için immünopozitif boyanma, parvoselüler situ hibridizasyon tekniğinin kullanıldığı ve AMPA kısmındaki nöronlar için düşük-orta yoğunlukta bir reseptör ailesinden GluA1-4’ün araştırıldığı bir çalış- boyanma gösterdikleri bildirilmiştir36. SON’de lokali- mada, GluA1 ve GluA2’nin hipotalamus boyunca ze magnoselüler nörosekretuar nöronların (MNC) güçlü bir ekspresyon gösterdiği, GluA3 ve GluA4 alt eksitabilitesinin glutamat tarafından düzenlendiği birimlerinin ise daha düşük yoğunlukta eksprese edil- bilinmektedir. NMDA reseptörleri, MNC’lerin sinap- diği bildirilmiştir22. Aynı tekniğin kullanıldığı başka tik plastisitesine aracılık eden, bu nöronların hormon bir çalışmada ise, kainat reseptör ailesinden GluK5, salınımlarını en üst düzeye çıkaran elektriksel aktivite- AMPA reseptör ailesinden GluA1 ve GluA2, NMDA leri için gerekli iyonotropik glutamat reseptör alt bi- reseptör ailesinden GluN1, GluN2A ve GluN2B rimlerindendir. SON'daki GluN1 ve GluN2 alt birim- mRNA’larının çok yüksek yoğunlukta, diğer alt birim- lerinin ekspresyon profillerinin mRNA ve protein lerin (GluK1-3, GluA3-4, GluN2C-2D) ise daha zayıf seviyelerinde araştırıldığı bir çalışmada; GluN1, bir hibridizasyon sinyali ile saptandığı gösterilmiştir23. GluN2B ve GluN2D alt birimlerinin güçlü, GluN2A Farklı çalışmalarda ise GluA1 ve GluA2 immünoreak- alt biriminin ise daha zayıf bir ekspresyon paterni tivitesi ve mRNA sinyalleri hipotalamusta medial sergilediği gösterilmiştir37. preoptik nukleus, ARC, SCN, SON ve PVN’de göste- Merkezi sinir sisteminde, GluN2A alt birimine ait rilirken, GluA3 ve GluA4’ün hipotalamik çekirdekler- ekspresyon bölgeseldir ve geçici olarak çeşitlilik gös- de daha az eksprese edildiği bildirilmiştir20,24,25. terir. Bu alt birimin doğuma kadar eksprese edilmediği, Hipotalamusun preoptik seviyesinden tuberal en yüksek ekspresyon seviyesinin hipokampüs ve seviyesine kadar olan tüm bölgeleri göz önüne korteksde izlendiği bildirilmiştir38,39. Supraoptik çe- alındığında; nöron sayısının fazla olduğu, sitoplazmik kirdekteki NMDAR alt ünitelerinin ekpresyon profil- tutulumun yoğun gözlendiği GluA1 ve GluA2 lerinin araştırıldığı başka bir çalışmada, mRNA düze- ekspresyonuna rastlanırken, GluA3 ve GluA4 alt yinde GluN1 ve GluN2 alt birimlerinin tümünün güçlü birimleri için dağınık yerleşimli, daha az sayıda bir şekilde eksprese edildiği, protein düzeyinde ise immünopozitif hücreye rastlanmıştır. sadece GluN1, GluN2B ve GluN2D’nin güçlü immü- Sıçan hipotalamusu, korteks gibi beyin bölgeleriyle noreaktivite gösterdiği bildirilmiştir37. Çalışmamız karşılaştırıldığı zaman orta derecede NMDA reseptör kapsamında yapmış olduğumuz immünohistokimyasal bağlama alanları gösterilmiş26 olmakla birlikte non- boyamalarda, GluN1 alt ünitesinin pek çok hipotala- NMDA reseptörleri ile karşılaştırıldığında bu oranın mik çekirdekte lokalize olduğu gösterilmiştir. GluN2A düşük olduğu bildirilmektedir27. Hipotalamusta yaygın alt birimine ait protein ekspresyonuna ise, beyin kesit- GluN1 mRNA varlığı in situ hibridizasyon çalışmaları lerinde rastlanmamıştır. Bu alt birime ait olan özgül ile belirlenirken14,23,28 çalışmamızda bu alt birimin antikorun çok yüksek konsantrasyonda bile sinyal nöronlardaki yoğun şekildeki lokalizasyonu immüno- vermemesi, dilüsyon denemesi dışında uygulanan histokimyasal teknik kullanılarak gösterilmiştir. antijen retrieval protokolünün de sorunu çözücü bir Glutamatın hipotalamustaki dağılımı ile ilgili ultrast- katkısının olmaması sebebiyle çalışma kapsamında rüktürel çalışmalar, suprakiazmatik, ventromedial, GluN2A proteinine ait ekspresyon elde edilememiştir. arkuat ile parvosellüler ve magnosellüler paraventrikü- Sıçan ve maymunda yapılan çalışmalar, hipotalamusta ler nukleuslarda presinaptik butonlarda glutamat im- kainat reseptörlerinin NMDA reseptörlerine benzer munopozitifliği gösterdiğini bildirmiştir18,25. İmmüno- dağılım paterni olduğunu göstermiştir27. Preoptik reaktif glutamat aksonlarının tüm mediobazal hipota- seviyede ve mediobazal hipotalamusta ise özellikle lamus bölgelerindeki hücre gövdeleri ve dentritik arkuat nukleus ile median eminenste kainat uzantılar ile temas ettiği18 ve supraoptik nukleusta reseptörlerinin yoğun olduğu gözlenmiştir23,27. yerleşik magnosellüler nöroendokrin hücrelerdeki İmmünohistokimyasal çalışmalar GluK1 reseptör 262 Hipotalamusda Glutamat Reseptör Ekspresyonu proteininin, AVPE, SCN, PVN, SON, ve ARC’de40, lere terapötik yaklaşımlarda araştırmacılara bilgi sağ- GluK2 ve GluK5 reseptör proteininin hipotalamusta layacaktır. yaygın dağılımına karşın ekspresyonun özellikle AVPE, PVN’nin posterior magnosellüler ve medial Etik Kurul Onay Bilgisi: parvosellüler bölümünde, SCN ve ARC’de41 yoğun Onaylayan Kurul: Uludağ Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kulla- olduğunu gösterdi. Yapmış olduğumuz çalışmada, nım Komitesi GluK5 reseptör alt birimine ait immün reaksiyon gös- Onay Tarihi: 19.04.2005 Karar No: 2005/1 teren nöronlara tüm hipotalamik çekirdeklerde ve Araştırmacı Katkı Beyanı: alanlarda rastlanırken, GluK1/2/3’ü tanıyan antikorla Fikir ve Tasarım: Ö.E., F.Z.M.; Veri toplama ve işleme F.Z.M., işaretli nöronlara sadece AVPE, PVN, SON, ARC ve D.G.Y., G.T.; Analiz ve verilerin yorumlanması Ö.E., F.Z.M., VMH’de rastlanmıştır. D.G.Y., G.T.; Makalenin önemli bölümlerinin yazılması F.Z.M., D.G.Y. Çalışma sonuçlarımız, non-NMDA ve NMDA gluta- mat reseptör alt birim proteinlerinin pek çok hipota- Destek ve Teşekkür Beyanı: Bu makalede yer alan sonuçlar, TÜBİTAK tarafından desteklenen lamik çekirdekte lokalize nöronlarca sentezlendiğini 104S286 nolu proje kapsamında yapılan çalışmalardan elde edilmiş- göstermiştir. Ayrıca immün boyamalardaki benzerlik- tir. lerin, bu bölgelerdeki hücrelerin glutamaterjik girdiye benzer şekilde yanıt verebileceğini göstermektedir. Çıkar Çatışması Beyanı: Makale yazarının çıkar çatışması beyanı yoktur. Son yıllarda hem iyonotropik hem de metabotropik glutamat reseptör alt tiplerinin moleküler olarak gö- rüntülenebilmesinde kullanışlı olabilecek ligandlar Kaynaklar üzerinde çalışılmaktadır42. Beyin fonksiyonunda glu- tamaterjik sinyalizasyonun merkeziliği ve çeşitliliği 1. Niciu MJ, Kelmendi B, Sanacora G. Overview of glutamatergic göz önüne alındığında, glutamat reseptörlerinin mole- neurotransmission in the nervous system. Pharmacol Biochem küler olarak görüntülenebilmesi için selektivitesi ve Behav 2012;100:656-64. sensitivitesi daha az yöntemlere sahip olduğumuz 2. Nakanishi S. Molecular Diversity of Glutamate Receptors and aşikardır. Çalışmalarda çoklu işaretleme tekniği kulla- Implications for Brain Functions. Science 1992;258:597-603. nılamadığı için her bir nöronda hangi alt birimlerin 3. Danbolt NC. Glutamate Uptake. Prog Neurobiol 2001;65:1-105. ko-eksprese olduğunu söylemek bu yaklaşımla müm- 4. Meldrum BS. Glutamate As a Neurotransmitter in the Brain: kün değildir. Review of Physiology and Pathology. J Nutr 2000;130:1007S-15S. Çalışmalarımızda kullanılan immünohistokimya tek- 5. Van Den Pol AN, Wuarin JP, Dudek FE. Glutamate Neurot- niği antikorların özgünlüğü seviyesinde sonuç ver- ransmission in the Neuroendocrine Hypothalamus. Brann DW, mektedir. Bu özellik immünohistokimya tekniğine Mahesh VB (eds). Excitatory Amino Acids: Their Role in Neu- belirli bir düzeyde limitasyon getirmektedir. Çalış- roendocrine Function. 1st edition. Boca Raton: CRC Press; 1996. 1-54. mamızdan elde edilen sonuçların literatürde yer alan 6. Hollmann M, Heinemann S. Cloned glutamate receptors. Annu ve glutamat reseptör alt birimlerinin mRNA seviye- Rev Neurosci 1994;17:31-108. sinde ekspresyonunu gösteren çalışmalarla karşılaştırı- 7. Ozawa S, Kamiya H, Tsuzuki K. Glutamate receptors in the larak bir bütün olarak değerlendirilmesi uygun olacak- mammalian central nervous system. Prog Neurobiol tır. Çalışmamızda laboratuvar ve deney hayvanları 1998;54:581-618. yetiştirme merkezimizin şartları doğrultusunda sadece 8. Koles L, Wirkner K, Illes P. Modulation of Ionotropic Gluta- dişi denekler kullanılmıştır. Hipotalamusta yer alan mate Receptor Channels. Neurochem Res 2001;26:925-32. farklı nöronlarda protein ekspresyonunun cinsiyete 9. Bettler B, Mulle C. Neurotransmitter receptors II. AMPA and bağlı olarak değişiklik gösterebileceği bilinmektedir. kainate receptors. Neuropharmacology 1995;34:123-139. Bu kapsamda çalışmamızda erkek deneklerin kulla- 10. Kew JN, Kemp JA. Ionotropic and metabotropic glutamate receptor structure and pharmacology. Psychopharmacology nılmamış olması çalışmanın limitasyonudur. 2005;179:4-29. Sonuç olarak, bu çalışmada sunulan bulgular hipota- 11. Mori H, Mishina M. Structure and function of the NMDA lamusta fonksiyonel glutamat reseptörü oluşturabile- receptor channel. Neuropharmacology 1995;34:1219-37. cek tüm alt birimlerin sentezlendiğini göstermesi açı- 12. Alt A, Weiss B, Ogden AM et al. Pharmacological characteri- sından önemlidir. Hipotalamusta lokalize olan hedef zation of glutamatergic agonists and antagonists at recombinant human homomeric and heteromeric kainate receptors in vitro. nöronlardaki glutamaterjik fonksiyonun daha iyi ay- Neuropharmacology 2004;46:793-806. dınlatılabilmesi için, iGluR'lerin alt birimlerinin loka- 13. Howe JR. Homomeric and heteromeric ion channels formed lizasyonlarının gösterilmesi glutamaterjik innervasyo- from the kainate type subunits GluR6 and KA2 have very small, nun gösterilebilmesi açısından bir belirteç olarak kul- but different, unitary conductances. J Neurophysiol 1996;76: lanılabilir. Bu çalışmadan çıkan sonuçlar belirli hipo- 510-19. talamik alanda yerleşik nöronların glutamaterjik ola- 14. Monyer H, Sprengel R, Herb A, et al. Heteromeric NMDA rak hedeflenmesinde yol gösterici olacaktır. Aynı Receptors: Molecular and Functional Distinction of Subtypes. Science 1992;256:1217-21. zamanda hipotalamusta yer alan nöroendokrin sistem- 263 D. Gök Yurtseven, ark. 15. Lerma J, Paternain AV, Naranjo J R, Mellstrom B. Functional Hormone-Neuronal Interactions in the Monkey Hypothalamus. kainate-selective glutamate receptors in cultured hippocampal Endocrinology 1994;134:858-68. neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 1993;90:11688-92. 30. Gu G, Varoqueaux F, Simerly RB. Hormonal Regulation of 16. Paternain AV, Herrera MT, Nieto MA, Lerma J. GluR5 and Glutamate Receptor Gene Expression in the Anteroventral Pe- GluR6 kainate receptor subunits coexist in hippocampal neu- riventricular Nucleus of the Hypothalamus. J Neurosci rons and coassemble to form functional receptors. J Neurosci 1999;19:3213-22. 2000;20:196-205. 31. Kawakami S. Glial and Neuronal Localization of Ionotropic 17. Molina PE, (eds). Endocrine Physiology. 4th edition. New Glutamate Receptor Subunit-Immunoreactivities in the Median York: Mc Graw-Hill; 2004. Eminence of Female Rats: GluR2/3 and GluR6/7 Colocalize 18. Van Den Pol AN, Wuarin JP, Dudek FE. Glutamate, the Domi- With Vimentin, Not With Glial Fibrillary Acidic Protein nant Excitatory Transmitter in Neuroendocrine Regulation. Sci- (GFAP). Brain Res 2000;858:198-204. ence 1990;250:1276-8. 32. Michel S, Itri J, Colwell CS. Excitatory Mechanisms in the 19. Paxinos G, Watson C, (eds). The rat brain in stereotaxic coor- Suprachiasmatic Nucleus: the Role of AMPA/KA Glutamate dinates. 6th edition. Elsevier Academic Press: Amsterdam; Receptors. J Neurophysiol 2002;88;817-28. 2009. 33. Petralia RS, Wenthold RJ. Light and Electron Immunocytoc- 20. Herman JP, Eyigor O, Ziegler DR, Jennes L. Expression of hemical Localization of AMPA-Selective Glutamate Receptors Ionotropic Glutamate Receptor Subunit mRNAs in the Hypot- in the Rat Brain. J Comp Neurol 1992;318:329-54. halamic Paraventricular Nucleus of the Rat. J Comp Neurol 34. Petralia RS, Wang YX, Wenthold RJ. Histological and Ultrast- 2000;422:352-62. ructural Localization of the Kainate Receptor Subunits, KA2 21. Van Den Pol AN, Hermans-Borgmeyer I, Hofer M, Ghosh P, and GluR6/7, in the Rat Nervous System Using Selective Anti- Heinemann S. Ionotropic Glutamate-Receptor Gene Expression peptide Antibodies. J Comp Neurol 1994;349:85-110. in Hypothalamus: Localization of AMPA, Kainate, and NMDA 35. Warembourg M, Leroy D. AMPA Glutamate Receptor Subu- Receptor RNA with in Situ Hybridization. J Comp Neurol nits in the Guinea Pig Hypothalamus: Distribution and Coloca- 1994;343:428-44. lization with Progesterone Receptor. J Comp Neurol 22. Sato K, Kiyama H, Tohyama M. The differential expression 2002;453:305-21. patterns of messenger RNAs encoding non-N-methyl-D- 36. Minbay FZ, Serter S, Gok Yurtseven D, Eyigor O. Immunohis- aspartate glutamate receptor subunits (GluR1-4) in the rat brain. tochemical localization of ionotropic glutamate receptors in the Neuroscience 1993;52:515-39. rat red nucleus. Bosnian J Basic Med 2017;17:29–37. 23. Eyigor O, Centers A, Jennes L. Distribution of ionotropic 37. Doherty FC, Sladek CD. NMDA receptor subunit expression in glutamate receptor subunit mRNAs in the rat hypothalamus. J the supraoptic nucleus of adult rats: dominance of NR2B and Comp Neurol 2001;431:101-24. NR2D. Brain Res 2011;1388:89-99. 24. Brann DW, Mahesh VB. Excitatory Amino Acids: Function 38. Portera-Cailliau C, Price DL, Martin LJ. N-methyl-D-aspartate and Significance in Reproduction and Neuroendocrine Regula- receptor proteins NR2A and NR2B are differentially distributed tion. Front Neuroendocrinol 1994;15:3-49. in the developing rat central nervous system as revealed by su- 25. Van Den Pol AN. Glutamate and Aspartate Immunoreactivity bunit-specific antibodies. J Neurochem 1996;66:692-700. in Hypothalamic Presynaptic Axons. J. Neurosci 1991;11:2087- 39. Wenzel A, Fritschy JM, Mohler H, Benke D. NMDA receptor 101. heterogeneity during postnatal development of the rat brain: 26. Brann DW, Zamorano PL, Chorich LP, Mahesh VB. Steroid differential expression of the NR2A, NR2B, and NR2C subunit Hormone Effects on NMDA Receptor Binding and NMDA Re- proteins. J Neurochem 1997;68:469-78. ceptor mRNA Levels in the Hypothalamus and Cerebral Cortex 40. Eyigor O, Minbay Z, Cavusoglu I, Jennes L. Localization of of the Adult Rat. Neuroendocrinology 1993;58:666-72. Kainate Receptor Subunit GluR5-Immunoreactive Cells in the 27. Cotman CW, Monaghan DT, Ottersen OP, Storm-Mathisen J. Rat Hypothalamus. Brain Res Mol Brain Res 2005;136: 38-44. Anatomical Organization of Excitatory Amino Acid Receptors 41. Minbay FZ, Eyigor O, Oksitosin Nöronlarında Kainat Reseptör and Their Pathways. Trends Neurosci 1987;10:273-80. Alt Birimlerinin Sentezi: İmmünohistokimyasal Çalışma. Ulu- 28. Kus L, Handa RJ, Sanderson JJ, Kerr JE, Beitz AJ. Distribution dağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 2020;46:357-363. of NMDAR1 Receptor Subunit mRNA and [125I]MK-801 42. Kim JH, Marton J, Ametamey SM, Cumming P. A Review of Binding in the Hypothalamus of Intact, Castrate and Castrate- Molecular Imaging of Glutamate Receptors. Molecules DHTP Treated Male Rats. Mol Brain Res 1995;28:55-60. 2020;25:47-9. 29. Goldsmith PC, Thind KK, Perera AD, Plant TM. Glutamate- Immunoreactive Neurons and Their Gonadotropin-Releasing 264