T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA ÖRNEKLERİNDE AROMATİK AMİNLERİN GAZ KROMATOGRAFİSİ KÜTLE SPEKTROMETRESİ (GC-MS) İLE TAYİNLERİNDE KATI FAZ EKSTRAKSİYONU UYGULAMALARI Ümran SEVEN YÜKSEK LİSANS TEZİ KİMYA ANABİLİM DALI BURSA 2006 i GIDA ÖRNEKLERİNDE AROMATİK AMİNLERİN GAZ KROMATOGRAFİSİ KÜTLE SPEKTROMETRESİ (GC-MS) İLE TAYİNLERİNDE KATI FAZ EKSTRAKSİYONU UYGULAMALARI ÖZET Çok sayıda doğal ve sentetik boyar maddeler, renk etkinliğini artırmak için gıda katkı maddesi olarak kullanılabilmektedir. Bu durum; kırmızı renkli Sudan I, II, III ve IV azo boyar maddelerinin biber salçasında illegal olarak kullanımı ile tehlikeli hale gelmektedir. Bu tür örneklerde Sudan boyalarının karakterizasyon ve kantifikasyon çalışmaları için hassas ve seçici analitik metotlar gerekmektedir. Aromatik aminlerin gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile tayinlerine yönelik pek çok çalışma olmasına karşın; bu bileşiklerin kaynama noktalarının GC-MS tayinine uygun olmaması nedeni ile önerilen metotlar genellikle sıvı kromatografisine (LC) dayalıdır. Çalışmamızda , biber salçasında illegal olarak kullanılabilecek Sudan I, II, III ve IV boyar maddelerinin tespit ve kantitatif tayinleri için GC-MS analizine dayalı bir analitik metot geliştirilmiştir. Bu amaçla Sudan boyalarına kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış; boyar maddelerin parçalanma ürünleri, GC-MS ile karakterize edilmiştir. Bu parçalanma ürünleri de Sudan boyar maddelerini temsil etmek için kullanılmıştır. İndirgenmeyi etkileyen ve ekstraksiyon verimini artıran; indirgenme sıcaklığı, indirgenme süresi, indirgen miktarı ve indirgeme çözeltisinin pH değeri parametreleri incelenmiş ve optimum parametrelerin boyar maddeye bağlı olarak değiştiği tespit edilirken optimizasyon çalışması için de kemometrik yöntemden yararlanılmıştır. Biber salçasından Sudan boyalarının etkin bir şekilde izole edilebilmesi için aseton ekstraksiyonu uygulanmıştır. Ayrıca; Sudan I-IV boyar maddelerinin deriştirilmesine yönelik katı faz ekstraksiyonunun etkinliği araştırılmıştır. Doğrulama çalışması için örneklere aseton ekstraksiyonu uygulanmış, C18 katı faz kolonlarında matriks etkilerinden ayırma işlemi sonrası LC-ESI-MS ile analiz yapıldıktan sonra iki kromatografik metot karşılaştırılmıştır. Anahtar Kelimeler: Sudan boyaları, azo boyaları indirgenmesi, biber salçası, katı faz ekstraksiyonu, GC-MS, LC-MS. ii DETERMINATION OF AROMATIC AMINES IN FOOD PRODUCTS BY SOLID PHASE EXTRACTION AND GAS CHROMATOGRAPHY MASS SPECTROMETRY (GC-MS) ABSTRACT Azo dyes may used as an additive in food samples to save or increase the color of food products. Like Sudan dyes some of them are illegally used. The red colored azo dyes classified as Sudan I, II, III, IV are considered to be carcinogenic. Despite this effect, they have been found as a contaminant in food samples. Therefore, sensitive selective and accurate analytical methods are needed for characterization and quantification studies. However gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analysis is one of the most common method for aromatic amines, proposed methods are generally based to liquid chromatography (LC) for Sudan dyes because of their unsuitable boiling points for GC-MS analysis. The aim of this work was to develop indirect method for Sudan dyes for GC- MS analysis. Determination of Sudan dyes in chilly paste by the means of their degradation products is described. For the analysis of degradation products, chemical reduction is performed. The amine products were characterized by GC-MS and these reduction products were used as a fingerprint of Sudan dyes. The parameters that can affect the reduction; such as reduction temperature, reduction time, reducing agent amount and pH of reduction solution were studied and found that these parameters are related with the nature of dye. Optimization studies are performed by chemometric method. Acetone extraction was applied to chilli paste in order to extract Sudan dyes from real samples. Solid phase extraction efficiency was investigated for the enrichment studies of Sudan I-IV dyes. For confirmation studies, direct method was used; the real samples extracted with acetone and separated from matrix effects with C18 for LC-ESI- MS analysis and the two chromatographic methods were compared. Keywords: Sudan dyes, azo dye reduction, chilly paste, solid phase extraction, GC-MS, LC-MS. iii İÇİNDEKİLER Sayfa No ÖZET i ABSTRACT ii İÇİNDEKİLER iii SİMGELER DİZİNİ ix ŞEKİLLER DİZİNİ xi ÇİZELGELER DİZİNİ xix 1. GİRİŞ 1 2. KURAMSAL BİLGİLER VE KAYNAK ARAŞTIRMASI 3 2.1. Moleküler Kütle Spektrometri 3 2.1.1. Moleküler Kütle Spektrometrenin Temel İlkeleri 3 2.1.2. Kütle Spektrometrenin Bileşenleri 4 a) İyon Kaynağı 4 b) Kütle Analizörü 7 2.1.3. Kütle Spektrometrenin Uygulamaları 8 2.2. Kütle Spektrometrenin Birlikte Kullanıldığı Kromatografik Yöntemler 8 2.2.1. Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (GC-MS) 8 2.2.2. Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (LC-MS) 10 2.3. Ultraviyole-Görünür Bölge (UV-VIS) Moleküler Absorpsiyon Spektrofotometri 11 2.4. Katı Faz Ekstraksiyonu 13 2.4.1. Katı Faz Ekstraksiyon Kolonlarının Dolgu Maddelerinin Fonksiyonel Grupları ve Yapıları 14 2.4.2. Katı Faz Ekstraksiyon Mekanizmaları, Örnek İçin Bilinmesi Gereken Temel Özellikler ve Çözgen Polariteleri 15 2.5. Kemometrik Yöntemler 15 iv 2.5.1. Merkezi Kompozit Dizayn 16 2.6. Azo Boyaları 17 2.6.1. Azo Boyalarının Sentezi ve İndirgenmesi 18 2.6.2. Azo Boyalarının Kimyasal İndirgenmesi ve İndirgenme Yolu İle Analizleri 21 2.6.3. Azo Boyalarının Mutajenik ve Kanserojenik Etkisi 23 2.7. Aromatik Aminler 24 2.7.1. Aromatik Aminlerin Ekstraksiyonu ve Ekstraksiyon Tekniklerinin Karşılaştırılması 27 2.7.2. Aromatik Aminlerin Tayin Yöntemleri 28 2.8. Sudan Boyaları 29 2.8.1. Sudan Boyalarının Kimyasal Yapıları 29 2.8.2. Sudan Boyalarının Fiziksel Özellikleri 31 2.8.3. Sudan Boyalarının IARC Sınıflandırması 31 2.8.4. Sudan Boyalarının Önemi ve Kullanımı 33 2.8.5. Sudan Boyalarının Toksisiteleri 33 2.8.6. Sudan Boyalarının Ekstraksiyonu ve Analizi 34 3. MATERYAL VE YÖNTEM 36 3.1. MATERYAL 36 3.1.1. Çalışmada Kullanılan Aletler 3.1.1.1. Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi 36 3.1.1.2. Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi 36 3.1.1.3. Ultraviyole-Görünür Bölge Spektrofotometresi 36 3.1.1.4. pH-Metre 37 3.1.1.5. Ultrasonik Karıştırıcı 37 3.1.1.6. Etüv 37 3.1.1.7. Döner Vakumlu Buharlaştırıcı 37 3.1.1.8. Terazi 37 3.1.1.9. Santrifüj Aleti 37 3.1.1.10. Katı Faz Ekstraksiyon Sistemi 38 v 3.1.1.11. Saf Su Cihazı 38 3.1.2. Çalışmada Kullanılan Kimyasallar ve Çözeltiler 38 3.1.2.1. Kimyasallar 38 3.1.2.1.1. Analitik Saflıktaki Kimyasallar 38 3.1.2.1.2. Sarf Malzemeler 39 3.1.2.2. Çözeltiler 40 3.1.2.2.1. UV-VIS Analizlerinde Kullanılan Boya Çözeltilerinin Hazırlanması 40 a) Katı Faz Ekstraksiyonu Çalışmaları İçin Boya Çözeltilerinin Hazırlanması 40 b) Çözünürlüğün pH İle Değişiminin İncelenmesi İçin Boya Çözeltilerinin Hazırlanması 40 c) pH Ayarlanmasında Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanması 41 3.1.2.2.2. GC-MS Analizlerinde Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanması 41 a) Sodyum Ditiyonit İndirgeme Çözeltisinin Hazırlanması 41 b) pH=1,5 Tampon Çözeltisinin Hazırlanması 41 3.1.2.2.3. LC-MS Ölçümlerinde Kullanılan Boya Çözeltilerinin Hazırlanması 42 3.2. YÖNTEM 42 3.2.1. Katı Faz Ekstraksiyonu 42 a) Sudan Boyaları İçin Çözücü Seçimi 42 b) Sudan Boyaları İçin En Uygun Elüsyon Çözücüsünün Belirlenmesi 44 3.2.2. Kalitatif GC-MS Analizleri 46 a) S I Boyar Maddesi İle Yapılan Kalitatif Çalışma 46 b) S II Boyar Maddesi İle Yapılan Kalitatif Çalışma 48 c) S III Boyar Maddesi İle Yapılan Kalitatif Çalışma 48 d) S IV Boyar Maddesi İle Yapılan Kalitatif Çalışma 49 e) Gerçek Örnek (Salça) Çalışması 50 vi f) Karışım Halindeki S I, S II, S III ve S IV Boyar Maddelerinin Analizi 51 3.2.3. Kalitatif LC-MS Analizleri 51 a) LC-MS Analizi İçin Gerçek Örnek Çalışması 51 3.2.4. Kantitatif Analiz 52 3.2.4.1. Örnek Hazırlama Prosedürü 52 a) 20 mg Sudan Boyası İle Yapılan Kantitatif Çalışma 52 b) Gerçek Örnekler İçin Ekstraksiyon Çalışması 52 c) Gerçek Örneklerde Geri Kazanımın Belirlenmesi 52 d) pH Değişiminin Geri Kazanım Üzerine Etkisinin İncelenmesi 53 e) Kemometrik Yöntem İle En Uygun Şartların Belirlenmesi 53 3.2.4.2. Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometresi Çalışma Koşulları 54 a) Kalitatif Analiz Programı 55 i) Kalitatif Analiz Programı-1 55 ii) Kalitatif Analiz Programı-2 56 b) Kantitatif analiz programı 57 4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI VE TARTIŞMA 59 4.1. UV-VIS İle İlgili Çalışmalar 59 4.1.1. S I Boyar Maddesinin UV-VIS Spektrumları 59 4.1.2. S II Boyar Maddesinin UV-VIS Spektrumları 61 4.1.3. S III Boyar Maddesinin UV-VIS Spektrumları 63 4.1.4. S IV Boyar Maddesinin UV-VIS Spektrumları 65 4.2. Sudan Boyar Maddelerinin Katı Faz Ekstraksiyonu 67 4.2.1. Sudan Boyaları İçin Çözünürlük Çalışmaları 67 4.2.2. Sudan Boyalarının Elüsyon Çalışmaları 77 4.3. GC-MS İle İlgili Kalitatif Çalışmalar 82 4.3.1. S I Boyar Maddesinin GC-MS Analizi 82 4.3.2. S II Boyar Maddesinin GC-MS Analizi 86 4.3.3. S III Boyar Maddesinin GC-MS Analizi 90 4.3.4. S IV Boyar Maddesinin GC-MS Analizi 93 4.3.5. Gerçek Örneklerle Çalışmalar 97 vii 4.3.6. pH=6 Ortamında Karışım Halindeki S I, S II, S III ve S IV Boyar Maddelerinin Kalitatif Analizi 98 4.4. LC-MS İle İlgili Kalitatif Çalışmalar 103 4.5. GC-MS İle İlgili Kantitatif Çalışmalar 114 4.5.1. 20 mg S I Boyası İle Yapılan Kantitatif Analiz Çalışması 115 4.5.2. 20 mg S II Boyası İle Yapılan Kantitatif Analiz Çalışması 115 4.5.3. 20 mg S III Boyası İle Yapılan Kantitatif Analiz Çalışması 116 4.5.4. 20 mg SIV Boyası İle Yapılan Kantitatif Analiz Çalışması 117 4.5.5. Gerçek Örnek Çalışması 118 4.5.5.1. Gerçek Örneklerde Ekstraksiyon Çalışması 118 4.5.5.2. Gerçek Örneklerden Geri Kazanım Çalışmaları 120 a) Gerçek Örneklerden S I Boyar Maddesinin Geri Kazanımı 120 b) Gerçek Örneklerden S II Boyar Maddesinin Geri Kazanımı 121 c) Gerçek Örneklerden S III Boyar Maddesinin Geri Kazanımı 121 d) Gerçek Örneklerden S IV Boyar Maddesinin Geri Kazanımı 122 4.6. UV-VIS Analizi İle pH Değişiminin Geri Kazanıma Etkisinin İncelenmesi 123 4.7. Farklı pH Değerlerinde Kimyasal İndirgeme İşlemi Yapılmasının Sudan Boyar Maddelerinin Geri Kazanımına Etkisi 125 4.7.1. pH=1,5 Ortamında Çalışılmasının Sudan Boyar Maddelerinin Geri Kazanımına Etkisi 125 4.7.2. pH=1,5 Ortamında Isıl İşlem Olmaksızın, Oda Sıcaklığında ve Ultrasonik Karıştırıcıda Çalışılmasının S II Boyar Maddesinin Geri Kazanımına Etkisi 126 4.7.3. pH=4 Ortamında Çalışılmasının S IV Boyar Maddesinin Geri Kazanımına Etkisi 127 4.7.4. pH=1,5 Ortamında S III Boyar Maddesinin Parçalanma Ürününe Ait Kalibrasyon Eğrisi 128 viii 4.8. Kemometrik Yöntem 129 5. SONUÇ 132 KAYNAKLAR 134 EKLER 145 TEŞEKKÜR 146 ÖZGEÇMİŞ 147 ix SİMGELER DİZİNİ GC : Gaz Kromatografisi MS : Kütle Spektrometresi GC-MS : Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi HPLC : Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi LC : Sıvı Kromatografisi LC-MS : Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi UV : Ultraviyole UV/VIS : Ultraviyole-Görünür Bölge EI : Elektron İmpakt ESI : Elektrosprey İyonlaştırma CI : Kimyasal İyonlaştırma CE : Kapiler Elektroforez H2O2 : Hidrojen Peroksit DNA : Deoksiribonükleik Asit TLC : İnce Tabaka Kromtografisi IARC : Uluslarası Kanser Araştırma Teşkilatı MAK : Maximale Arbeintsplatz Konzentration LLE : Sıvı Sıvı Ekstraksiyon SPE : Katı Faz Ekstraksiyon SPME : Katı Faz Mikroekstraksiyon SFE : Süperkritik Akışkan Ekstraksiyon MAE : Mikrodalga Yardımlı Ekstraksiyon IR : İnfrared m/z : Kütle/Yük tR : Alıkonma Zamanı LOD : Gözlenebilme Sınırı LOQ : Tayin Sınırı x KISALTMALAR Abs : Absorbans SD : Sodyum Ditiyonit ST : Sitrat Tampon S I : Sudan I S II : Sudan II S III : Sudan III S IV : Sudan IV t-BME : ter-Butil Metil Eter dak. : Dakika %R : Yüzde geri kazanım xi ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1.1.1. Moleküler iyon oluşumu Şekil 2.1.2.1. Bir kütle spektrometresinin basitleştirilmiş şematik modeli Şekil 2.1.2.2. EI kaynağının şematik görünümü Şekil 2.1.2.3. Kuadrupol kütle analizörünün şematik modeli Şekil 2.2.1.1. GC-MS’te gözlenen kromatogram ve bunlara ait kütle spektrumlarının basit bir şematik gösterimi Şekil 2.2.2.1. LC-MS’in şematik gösterimi Şekil 2.2.2.2. Elektrosprey iyonlaştırmanın şematik gösterimi Şekil 2.3.1. Moleküler absorbansın şematik gösterimi Şekil 2.3.2. Bir tekstil boyasının absorbans spektrumu Şekil 2.4.1. Katı faz ekstraksiyonunun basit bir şematik gösterimi Şekil 2.4.1.1. Bazı dolgu maddelerinin polarite artışlarına ait sıralama Şekil 2.4.2.1. Bazı çözücülerin polaritele artışlarına ait sıralama Şekil 2.6.1.1. Azo boyalarının sentezi ve indirgen parçalanması Şekil 2.6.1.2. Bir azo boyasından indirgen parçalanma yolu ile aromatik amin oluşumu Şekil 2.6.1.3. Azo boyalarının indirgenmesinin şematik modeli Şekil 2.6.3.1. Aromatik amin ve aromatik nitro bileşikleri için basitleştirilmiş metabolik yol Şekil 3.2.1.1. Sudan boyaları için uygun çözücü belirlenmesine yönelik katı faz ekstraksiyon şeması Şekil 3.2.1.2. Sudan boyaları için uygun elüsyon çözücüsü belirlenmesine yönelik katı faz ekstraksiyon şeması Şekil 3.2.2.1. S I’ in GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması Şekil 3.2.2.2. Kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış S I’ in GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması Şekil 3.2.2.3. S II’ nin GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması Şekil 3.2.2.4. S III’ ün GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması Şekil 3.2.2.5. S IV’ ün GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması Şekil 3.2.2.6. Salça örneğinin GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması Şekil 4.1.1.1. Metanolde 7 mg/L S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu xii Şekil 4.1.1.2. Asetonitrilde 7 mg/L S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.1.3. Etil asetatta 7 mg/L S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.2.1. Metanolde 7 mg/L S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.2.2. Asetonitrilde 7 mg/L S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.2.3. Etil asetatta 7 mg/L S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.3.1. Metanolde 7 mg/L S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.3.2. Asetonitrilde 7 mg/L S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.3.3. Etil asetatta 7 mg/L S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.4.1. Metanolde 7 mg/L S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.4.2. Asetonitrilde 7 mg/L S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.1.4.3. Etil asetatta 7 mg/L S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.1. Suda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.2. Metanolde hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.3. Asetonda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.4. Hekzanda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.5. Suda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.6. Metanolde hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.7. Asetonda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.8. Hekzanda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.9. Suda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.10. Metanolde hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu xiii Şekil 4.2.1.11. Asetonda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.12. Hekzanda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.13. Suda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.14. Metanolde hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.15. Asetonda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.16. Hekzanda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.2.1. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan asetonitril ile elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.2.2. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan etil asetat ile elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.2.3. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan asetonitril ile elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.2.4. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan etil asetat ile elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.2.5. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan asetonitril ile elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.2.6. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan etil asetat ile elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.2.7. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan asetonitril ile elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.2.8. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan etil asetat ile elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.3.1.1. 500 mg/L S I boyar maddesinin GC-MS kromatogramı Şekil 4.3.1.2. 500 mg/L S I boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.1.3. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I için GC-MS kromatogramı xiv Şekil 4.3.1.4. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.1.5. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I boyar maddesinin kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.1.6. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I için m/z=50-100 aralığında elde edilen GC-MS kromatogramı Şekil 4.3.1.7. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I boyar maddesinin m/z=50-100 tarama aralığında elde edilen kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.1.8. 102 mg/L anilin için GC-MS kromatogramı Şekil 4.3.1.9. 102 mg/L aniline ait kromatogramdaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.2.1. 500 mg/L S II boyar maddesinin kromatogramı Şekil 4.3.2.2. 500 mg/L S II boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.2.3. Kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S II boyar maddesinin kromatogramı Şekil 4.3.2.4. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S II boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.2.5. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S II boyar maddesinin m/z=50- 130 aralığında elde edilen GC-MS kromatogramı Şekil 4.3.2.6. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S II boyar maddesinin m/z=50- 130 aralığında elde edilen GC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.3.1. 600 mg/L S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramı Şekil 4.3.3.2. İndirgeme işlemi uygulanmış 600 mg/L S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramı Şekil 4.3.3.3. İndirgeme işlemi uygulanmış 600 mg/L S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.3.4. İndirgeme işlemi uygulanmış 600 mg/L S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.3.5. 102 mg/L anilin için m/z=50-100 aralığında elde edilen kütle spektrumu Şekil 4.3.3.6. 102 mg/L anilin için m/z=82-215 aralığında elde edilen kütle spektrumu xv Şekil 4.3.4.1. 1000 mg/L S IV boyar maddesinin GC-MS kromatogramı Şekil 4.3.4.2. İndirgeme işlemi uygulanmış 1000 mg/L S IV boyar maddesinin GC-MS kromatogramı Şekil 4.3.4.3. İndirgeme işlemi uygulanmış 1000 mg/L S IV boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.5.1. Biber salçası için kalitatif analiz sonucu elde edilen kromatogram Şekil 4.3.5.2. Salça kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=21,733) Şekil 4.3.5.3. Salça kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=38,383) Şekil 4.3.6.1. Karışım halindeki sudan boyar maddelerine indirgenme işlemi uygulandığında elde edilen kromatogram Şekil 4.3.6.2. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.6.3. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.6.4. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 3 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.6.5. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 4 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.6.6. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 5 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.6.7. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 6 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.4.1. 20 mg/L S I boyar maddesinin LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.2. 20 mg/L S I boyar maddesinin LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,4 dak.) Şekil 4.4.3. 20 mg/L S I boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S I’ i karakterize eden 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,15 dak.) Şekil 4.4.4. 20 mg/L S II boyar maddesinin LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.5. 20 mg/L S II boyar maddesinin LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,35 dak.) Şekil 4.4.6. 20 mg/L S II boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S II’yi karakterize eden 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,7 dak.) xvi Şekil 4.4.7. 20 mg/L S III boyar maddesinin LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.8. 20 mg/L S III boyar maddesinin LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) Şekil 4.4.9. 20 mg/L S III boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S III’ü karakterize eden 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,95 dak.) Şekil 4.4.10. 20 mg/L S IV boyar maddesinin LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.11. 20 mg/L S IV boyar maddesinin LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) Şekil 4.4.12. 20 mg/L S IV boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S IV’ü karakterize eden 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,35 dak.) Şekil 4.4.13. 20 mg/L S IV boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S IV’ü karakterize eden 3 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=4,5 dak.) Şekil 4.4.14. 1 numaralı salça ekstraktının (kör örnek-1) LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.15. 1 numaralı salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) Şekil 4.4.16. 2 numaralı salça ekstraktının (kör örnek-2) LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.17. 2 numaralı salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) Şekil 4.4.18. S I boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.19. S I boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) Şekil 4.4.20. S I boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,05 dak.) Şekil 4.4.21. S II boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.22. S II boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,4 dak.) Şekil 4.4.23. S II boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,65 dak.) Şekil 4.4.24. S III boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.25. S III boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) xvii Şekil 4.4.26. S III boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,95 dak.) Şekil 4.4.27. S III boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 3 numaralı pike ait kütle spektrumu(tR=3,05 dak.) Şekil 4.4.28. S IV boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.29. S IV boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) Şekil 4.4.30. S IV boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,35 dak.) Şekil 4.4.31. S IV boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 3 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=4,55 dak.) Şekil 4.4.32. S I-IV boyar maddeleri katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı Şekil 4.4.33. S I-IV boyar maddeleri katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,9-4,7 dak.) Şekil 4.5.1.1. S I boyar maddesinin kromatogramında gözlenen anilin pikine ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.5.2.1. S II boyar maddesinin kromatogramında gözlenen 2,4-ksilidin pikine ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.5.3.1. S III boyar maddesinin kromatogramında gözlenen anilin pikine ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.5.4.1. S IV boyar maddesinin kromatogramında gözlenen o-toluidin pikine ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.5.5.1.1. Salça ekstraktı için GC-MS kromatogramı Şekil 4.5.5.1.2. Salça ekstraktına ait kromatogramdaki 1 numaralı pik için kütle spektrumu Şekil 4.5.5.1.3. Salça ekstraktına ait kromatogramdaki 2 numaralı pik için kütle spektrumu Şekil 4.6.1. S I boyar maddesinin pH=1,5-12 aralığında UV-VIS spektrumları Şekil 4.6.2. S II boyar maddesinin pH=1,5-12 aralığında UV-VIS spektrumları Şekil 4.6.3. S III boyar maddesinin pH=1,5-12 aralığında UV-VIS spektrumları Şekil 4.6.4. S IV boyar maddesinin pH=1,5-12 aralığında UV-VIS spektrumları xviii Şekil 4.7.4.1. pH=1,5 ortamında S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramında gözlenen anilin pikine ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.8.1. pH=1,5 ortamında ve optimum koşullarda S III boyar maddesinin indirgenme ürünü pikine ait kalibrasyon eğrisi xix ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1.2.1. Moleküler kütle spektroskopide kullanılan iyon kaynakları Çizelge 2.7.1. MAK aminler listesi Çizelge 2.8.1.1. Sudan boyalarının kimyasal yapıları ve bazı karakteristik özellikleri Çizelge 2.8.2.1. Sudan boyalarının bazı fiziksel özellikleri Çizelge 2.8.3.1. Sudan boyalarının IARC sınıflandırılması Çizelge 3.2.3.1. LC-MS analiz şartları Çizelge 3.2.4.1.1. Merkezi kompozit dizayn (kodlanmış değerler) Çizelge 3.2.4.1.2. Merkezi kompozit dizayn (gerçek değerler) Çizelge 3.2.4.2.1. Kalitatif salça çalışması için kolon sıcaklık programı Çizelge 3.2.4.2.2. Kalitatif analiz programı-1 için gaz kromatografisi (GC) şartları Çizelge 3.2.4.2.3. Kalitatif analiz programı-1 için kütle spektrometresi (MS) şartları Çizelge 3.2.4.2.4. Kalitatif analiz programı-2 için kolon sıcaklık programı Çizelge 3.2.4.2.5. Kalitatif analiz programı-2 için GC şartları Çizelge 3.2.4.2.6. Kalitatif analiz programı-2 için MS Şartları Çizelge 3.2.4.2.7. S I, S II, S III ve S IV boyar maddelerinin kantitatif analizi için kolon sıcaklık programı Çizelge 3.2.4.2.8. S I, S II, S III ve S IV boyar maddeleri maddelerinin kantitatif analizi için GC şartları Çizelge 3.2.4.2.9. S I boyar maddesinin kantitatif analizi için MS şartları Çizelge 3.2.4.2.10. S II boyar maddesinin kantitatif analizi için MS şartları Çizelge 3.2.4.2.11. S III boyar maddesinin kantitatif analizi için MS şartları Çizelge 3.2.4.2.12. S IV boyar maddesinin kantitatif analizi için MS şartları Çizelge 4.2.1.1. S I’ in farklı çözücülerdeki UV-VIS spektrumlarından tespit edilen maksimum absorbans değerleri Çizelge 4.2.1.2. S II’ in farklı çözücülerdeki UV-VIS spektrumlarından tespit edilen maksimum absorbans değerleri Çizelge 4.2.1.3. S III’ ün farklı çözücülerdeki UV-VIS spektrumlarından tespit edilen maksimum absorbans değerleri Çizelge 4.2.1.4. S IV’ ün farklı çözücülerdeki UV-VIS spektrumlarından tespit edilen maksimum absorbans değerleri xx Çizelge 4.2.2.1. Sudan boyalarının metanol, asetonitril ve etil asetattaki standart çözeltilerinin UV-VIS absorbansları ile katı faz ekstraksiyonu sonucu tespit edilen absorbans değerleri Çizelge 4.3.2.1. İndirgeme işlemi yapılmadan ve kimyasal indirgeme işlemi uygulandıktan sonra S I ve S II boyar maddelerinin kromatogramlarında görülen moleküler iyon piklerine ait pik alanları Çizelge 4.3.4.1. S I boyar maddesinin teorik ve deneysel parçalanma ürünleri Çizelge 4.3.4.2. S II boyar maddesinin teorik ve deneysel parçalanma ürünleri Çizelge 4.3.4.3. S III boyar maddesinin teorik ve deneysel parçalanma ürünleri Çizelge 4.3.4.4. S IV boyar maddesinin teorik ve deneysel parçalanma ürünleri Çizelge 4.3.6.1. Karışım halindeki sudan boyalarının kromatogramlarındaki piklerin karşılaştırılması Çizelge 4.5.5.2.1. S I’ in salça örneklerinden geri kazanımı çalışmalarında, GC-MS kromatogramlarında gözlenen anilin pikine ait alan değerleri Çizelge 4.5.5.2.2. S II’ nin salça örneklerinden geri kazanımı çalışmalarında, GC-MS kromatogramlarında gözlenen 2,4-ksilidin pikine ait alan değerleri Çizelge 4.5.5.2.3. S III’ ün salça örneklerinden geri kazanımı çalışmalarında, GC-MS kromatogramlarında gözlenen anilin pikine ait alan değerleri Çizelge 4.5.5.2.4. S IV’ ün salça örneklerinden geri kazanımı çalışmalarında, GC-MS kromatogramlarında gözlenen o-toluidin pikine ait alan değerleri Çizelge 4.7.1.1. Sudan boyar maddelerinin pH=1,5 ve pH=6 ortamlarında parçalanma ürünlerine ait GC-MS kromatogramlarından belirlenen alan değerleri Çizelge 4.7.2.1. S II boyar maddesinin pH=6 ortamında ısıl işlem uygulandığında ve pH=6 da ısıl işlem olmadan çalışılması sonucu GC-MS kromatogramlarında gözlenen parçalanma ürününe ait ortalama alan değerleri Çizelge 4.7.3.1. Farklı pH değerlerinde S IV boyar maddesinin GC-MS kromatogramlarında gözlenen parçalanma ürününe ait ortalama alan değerleri Çizelge 4.8.1. S III boyasının kimyasal indirgenmesinde sıcaklık ve indirgen miktarının optimizasyonu için deneysel koşullar Çizelge 4.8.2. S III boyasının kimyasal indirgenmesinde sıcaklık ve indirgen miktarının optimizasyonu çalışmalarında her bir deney koşulunu gösteren deneysel plan xxi Çizelge 4.8.3. Optimizasyon çalışmalarında, S III boyasının kimyasal olarak indirgenmesi sonucu, indirgenme ürününe ait olarak her bir deneysel koşulda belirlenen alan değerleri 1 1. GİRİŞ Sentetik veya doğal çok sayıda boyar madde gıda katkı maddesi olarak kullanılabilmektedir. En yaygın kullanılan sentetik renklendirici maddeler, azo boyar maddeleridir. Bunlar gıda maddelerin görüntü açısından arzu edilen forma dönüştürülmesi için çok sayıda gıda maddesine eklenerek tüketicilere sunulmaktadırlar. Bazı sentetik boyar maddelerin gıdalarda bulunabileceği sınır değerler mevcutken; bazılarının ise gıdalarda hiçbir seviyede bulunmasına müsaade edilmemektedir. Sudan I-IV azo boyar maddeleri gıdalardaki yasaklı boyalara örnek olarak gösterilebilir. Buna rağmen şiddetli kırmızı-turuncu renkleri nedeni ile çok sayıda gıda maddesinde illegal olarak kullanıldığı tespit edilmiştir. Bir gıda maddesinde ilk olarak sudan I boyar maddesinin tespit edildiği 2003 yılından itibaren yapılan çalışmalarla kanserojen etkisi tespit edildiğinden; ithal edilen ürünlerin sudan boyası içermediği yönünde analiz sertifikası olması gibi gereklilikler getirilirken, Sudan boyası tespit edilen ürünlerin ithalatı yasaklanmış; ürünler geri gönderilmiş ya da imha edilmesi istenmiştir. Bazı azo boyalarının indirgenerek toksik aril aminleri oluşturabilme olasılıkları olduğu bilinmektedir (Pielesz 1999, Garrigos ve ark. 2002). Bu tür toksik aril amin içerikli azo boyalarının kullanımı yasaktır (Nachiyar ve Rajakumar 2004). İndirgenme yalnızca kimyasal ortamda değil, farklı yöntemlerle de gerçekleştirilebilir. Bunlar arasında özellikle enzimatik indirgenme, azo boyalarının insan sağlığı açısından değerlendirilmesi gerekliliğini ortaya koymaktadır. Boyar maddelerin aril amin içeriklerinin tespiti için yaygın olarak kullanılan metotlar arasında boyar maddenin aril amin bileşenlerine parçalanması ve parçalanma ürünleri üzerinden GC-MS ile tayinleri bulunmaktadır. Özellikle sudan III, IV boyar maddeleri kaynama noktaları yüksek olduğu için GC-MS ile doğrudan tayin edilememekle birlikte bu boyalarının indirgenme ürünleri de aril amin bileşikleri olduğundan; parçalanarak tayin edilmeleri yönünde çalışmalar yapılmıştır. Çalışmamızda, sudan I-IV boyar maddeleri; özellikle geleneksel mutfağımızın vazgeçilmezlerinden biri olan salça örneklerine katıldığında aynı anda veya her birinin ayrı ayrı nasıl tespit edileceklerine yönelik analitik metot gelişimi üzerinde durulmuştur. Karmaşık yapılı bir matriksten sadece bu boyar maddelerin alınmasına yönelik katı faz ve sıvı sıvı ekstraksiyonunun etkinlikleri ve boyar maddelerin eş zamanlı tayinlerine 2 yönelik parametreler incelenmiştir. Parçalanmayı etkileyen parametrelerin optimizasyonu için kemometrik yöntemden yararlanılmıştır. Geliştirilen dolaylı analitik metot yanında bu boyar maddelerin doğrudan tayinine yönelik LC-MS analizleri de karşılaştırma amaçlı olarak uygulanmıştır. 3 2. KURAMSAL BİLGİLER VE KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Moleküler Kütle Spektrometri 2.1.1. Moleküler Kütle Spektrometrenin Temel İlkeleri Kütle spektrometresi (MS), moleküler kütle tayininde kullanılan bir tekniktir. Bir kütle spektrometre molekülden yüklü parçacıklar (iyonlar) oluşturur. Bu iyonlardan yararlanarak da bileşiğin moleküler kütlesi ve kimyasal yapısı hakkında bilgi edinilir (http://www.chem.arizona.edu/massspec/intro_html/intro.html). Kütle spektrometrik analizin ilk basamağı, analitin gaz halinde iyonlarını elde etmektir. Şekil 2.1.1.1.’de görüldüğü gibi molekülün elektron akışı ile bombardımanı sonucu bir elektron kaybı gerçekleşmiş ve M.+ moleküler iyonu oluşmuştur. Formüldeki noktanın da belirttiği gibi bu iyon radikal halindedir ve molekül ağırlığı molekülünki ile aynıdır. Yüksek enerjili elektronlar ile analit molekülleri arasındaki çarpışmalar moleküle, genel olarak onu uyaracak kadar yüksek enerji verir. Uyarılmış molekülün durulması sık sık parçalanma şeklinde olur ve daha düşük kütleli iyonlar açığa çıkar. Elektron çarpması sonucu elde edilen pozitif yüklü iyonlar, kütle spektometrenin slit aralığından geçirilir ve kütle/yük (m/z) oranına ayarlanmış bir ekranda kütle spektrumu halini alır (Skoog ve ark. 1998). M: + e- M.+ + 2e- Şekil 2.1.1.1. Moleküler iyon oluşumu Kütle spektrumundaki her yatay çizgi spesifik m/z değerine sahip iyonu gösterirken bunların uzunlukları da bağıl yoğunluklarını simgeler. En şiddetli iyonun bolluğu 100 alınır ve temel pik olarak gösterilir. Geri kalan piklerin yükseklikleri bu temel pike oranlanarak temel pikin yüzdesi cinsinden uygun yükseklikte verilir.Kütle spetrometresinde elde edilen pek çok iyon tek yüke sahip olduğu için m/z aynı zamanda kütle değeridir. Modern kütle spektrometrelerinin ayırma gücü bir atom kütle birimi olduğu için molekül kütlelerinin doğru belirlenmesine imkan verir. Spektrumda en yüksek kütleli iyon, moleküler iyon olarak değerlendirilir. Daha düşük kütleli iyonlar 4 ise moleküler iyonun parçalanma ürünleridir (Skoog ve ark. 1998, http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/MassSpec/masspec1.htm). 2.1.2. Kütle Spektrometrenin Bileşenleri Bir kütle spektrometre Şekil 2.1.2.1.’de gösterildiği gibi dört temel bileşene ayrılabilir. NUMUN E SİNYAL İŞLEME Dedektör Giriş GÖSTERGE Analizör Kaynak VAKUM (10-5-10-8 Torr) Şekil 2.1.2.1. Bir kütle spektrometresinin basitleştirilmiş şematik modeli KAYNAK: http://minyos.its.rmit.edu.au/~rcmfa/ SKOOG, D.A., F.J. HOLLER, T.A. NIEMAN. 1998. Enstrümantal Analiz İlkeleri. Bilim Yayıncılık, Ankara. s.512. İyonlar çok reaktif ve kısa ömürlü olduğu için, bunların oluşumu ve hareketi vakum altında olmalıdır. Atmosfer basıncı 760 Torr (mm Hg) iken; burada 10-5-10-8 Torr basınç söz konusudur (http://minyos.its.rmit.edu.au/~rcmfa/ ). a) İyon Kaynağı İyon kaynağı spektrometrenin en önemli kısımlarından biridir. Kütle spektrumlarının görünüşü kullanılan iyonlaştırma yöntemine şiddetle bağlıdır. Moleküler kütle spektrometrelerinde kullanılan iyon kaynakları Çizelge 2.1.2.1.’de özetlenmiştir. 5 Çizelge 2.1.2.1. Moleküler kütle spektroskopide kullanılan iyon kaynakları Teme Tip Adı ve Kısaltması İyonlaştırıcı Gaz Fazı Elektron impakt (EI) Enerjik elektronlar Kimyasal iyonlaştırma (CI) Reaktif gaz iyonları Alan iyonlaştırma (FI) Yüksek-potansiyelli elektrot Desorpsiyon Alan desorpsiyonu (FD) Yüksek-potansiyelli elektrot Elektrosprey iyonlaştırma (ESI) Yüksek elektrik alanı Matriks yardımlı desorpsiyon iyonlaştırma (MALDI) Lazer demeti Plazma desorpsiyonu (PD) 252Cf’ nin fisyon ürünleri Hızlı atom bombardımanı (FAB) Enerjik atom demeti İkincil iyon kütle spektrometri (SIMS) Enerjik iyon demeti Termosprey iyonlaştırma (TS) Yüksek sıcaklık KAYNAK: SKOOG, D.A., F.J. HOLLER, T.A. NIEMAN. 1998. Enstrümantal Analiz İlkeleri. Bilim Yayıncılık, Ankara. s.500. Desorpsiyon kaynaklı kütle spektrometreleri uçucu olmayan, termal olarak kararsız ve mol kütlesi 105 daltona kadar olan yüksek molekül ağırlıklı numunelere uygulanabilirken gaz fazı iyon kaynaklarının kullanımı kaynama noktaları 500°C’den küçük termal olarak kararlı maddeler ile sınırlıdır, çoğunlukla mol kütleleri 103 daltondan daha küçük bileşikler incelenebilir. İyon kaynakları sert ve yumuşak kaynaklar olarak sınıflanır. Sert kaynaklar molekülleri yüksek enerjili uyarılmış hallere çıkarmaya yetecek enerji aktarırlar. Durulma bağ kopması şeklinde olur ve m/z oranı moleküler iyonunkinden küçük iyonlar oluşur. Yumuşak kaynaklar analiti daha az parçalar, kütle spektrumlarında moleküler pik çoğu zaman görülür ve bunun yanında birkaç başka pik bulunur. Sert kaynaklar yapı aydınlatmada kullanılırken, yumuşak kaynaklar molekül veya moleküllerin mol kütlelerinin doğru olarak tayininde yararlıdır (Skoog ve ark. 1998). 6 En yaygın kullanılan iyonlaştırma tekniği elektron impakt (EI) ve buna alternatif olarak da kimyasal iyonlaştırmadır (CI). İlk teknikte molekülden bir elektron kaybı ve M+. radikal katyonu ile gösterilen moleküler iyon piki oluşumu ile sonuçlanan bir elektron bombardımanı söz konusudur. Moleküler iyon piki ilgili bileşiğin molekül kütlesini verir. Yüksek enerji nedeni ile bu moleküler iyon karakteristik bağıl yoğunluğa sahip daha küçük iyonlara parçalanır. Bu da karışımdaki ilgilenilen bileşiğin diğer bileşenlerden ayrılması ve moleküler yapının tanınmasını sağlayan parmakizini oluşturur. Kimyasal iyonlaşma ise metan veya uygun başka bir gazın iyonlaşması ile başlar. Oluşan iyon, [M+H]+ moleküler iyonunu oluşturmak üzere numune molekülünü (M) iyonlaştırır. EI ile karşılaştırıldığında molekülün iyonlaşması için daha az enerjili bir yöntem olduğu için daha az parçalanma gerçekleşir; bu nedenle de molekülün ayrıntılı yapısı halkında daha az bilgi edinilir. Fakat EI ile analit molekülünün daha ileri düzeyde parçalanması gerçekleşebileceği için moleküler iyon bazen dedekte edilemediği halde CI ile moleküler iyon piki tespit edilebilir. Bu nedenle iki teknik birbirini tamamlar. EI nın şematik olarak gösterilişi Şekil 2.1.2.2.’de verilmiştir. Örnek molekülleri (siyah noktalar) ısıtılan telden yayınlanan yüksek enerjili elektronlarla (mavi çizgiler) bombardıman edilir. Bu kaynak EI olarak adlandırılır. Gaz ve uçucu sıvı örneklerin bir rezarvuardan iyon kaynağına akması sağlanırken; uçucu olmayan katı veya sıvılar doğrudan verilebilir. Elektron bombardımanı ile oluşan katyonlardan (kırmızı noktalar) odaklanmış olanlar dedektöre ulaşır. Hafif iyonlar magnetik alan etkisi ile yön değiştirir. İyonlar, magnetik alandan etkilenir ve magnetik alan kuvvetine göre dedektöre odaklanır; elektronik olarak dedekte edilerek bilgisayara aktarılır. (http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/MassSpec/masspec1.htm) 7 hızlandırma slitleri İtici elektrot Isıtıcı tel Odaklanmamış ağır iyonlar Magnetik alan 500-8000 Gauss Örnek 10-2 torr İyon kaynağı Odaklanmamış hafif 10-7 torr iyonlar dedektör Odaklanmış iyon demeti Şekil 2.1.2.2. EI kaynağının şematik görünümü KAYNAKLAR: http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/MassSpec/masspec1.htm SKOOG, D.A., F.J.HOLLER, T.A.NIEMAN. 1998. Enstrümantal Analiz İlkeleri. Bilim Yayıncılık, Ankara. s.502. b) Kütle Analizörü Çeşitli kütle analizörleri bulunmaktadır. Bunlar; iyon tuzaklı, kuadrupol, manyetik sektör, uçuş-zamanlı, çift-odaklamalı gibi farklı türlerdedir. En yaygın kullanılanları ise kuadropol ve iyon tuzaklı analizörlerdir. Kuadrupol kütle analizörünün şematik modeli Şekil 2.1.2.3.’ te gösterilmiştir. Kütle analizöründe iyonlar kütle ve yüklerine göre ayrılırlar. Ayrılan iyonlar dedektörde tespit edilir ve sayılır, bilgisayara gönderilir, bilgisayarda veri şeklinde okunur. (http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/gcms.html, http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/MassSpec/masspec1.htm) 8 Kuadrupol çubuklar Dedektör İyonlar Çıkış sliti (dedektöre) Kararlı iyon (dedekte edilebilir) Kararsız iyon Kaynak sliti (dedekte edilemez) Şekil 2.1.2.3. Kuadrupol kütle analizörünün şematik modeli KAYNAK: http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/gcms.html 2.1.3. Kütle Spektrometrenin Uygulamaları Moleküler kütle spektrometri pek çok alanda kullanılmaktadır. Saf bileşiğin kütle spektrumu mol kütlesi ve molekül formülü hakkında bilgi vermektedir. Parçalanma şekli yapısal bilgi verirken spektrum karşılaştırılması veya bilgisayarlı kütüphane tarama sistemlerinden yaralanılarak bileşik teşhisi yapılır (Skoog ve ark. 1998). 2.2. Kütle Spektrometrenin Birlikte Kullanıldığı Kromatografik Yöntemler 2.2.1. Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (GC-MS) Numune doğrudan kütle spektrometresinin iyonlaşma kaynağına verilebileceği gibi, çoğunlukla iyonlaşma kaynağı ile son bulan bir kromatografik teknik de kullanılabilir. Kütle spektrometresi ile birlikte kullanılabilen tekniklere örnek olarak gaz kromatografisi (GC), yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve kapiler elektroforez (CE) verilebilir. (http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/MStut/mstutorial.htm) 9 Kütle spektrometresi ile tespit edilebilen bileşik gaz fazında verilmeli ve saf olmalı, yani karışım halinde olmamalıdır. Pek çok gerçek örnek ise karışım olduğu için bunları ayırmak ve buharlaştırmak için kullanılabilecek en uygun yöntem kütle spektrometresini gaz kromatografisine bağlamaktır. Bileşenler uçucu olmayan bir sıvı ile kaplı GC kolonundan, kaynama noktalarına ve kolon-taşıyıcı gaz etkileşimlerine göre ayrılırlar. Gaz faz ile etkileşim ne kadar fazla ise ayrım o kadar hızlıdır. Bileşenin, enjeksiyon portundan dedektöre ulaşıncaya kadar geçen süre olarak tanımlanan alıkonma zamanı da kendisine özgüdür. GC ile elde edilen şiddete karşı zaman dedektör sinyali eğrisi, bileşenlerin elüsyonunu simgeler ve kromatogram olarak adlandırılır. Kromatogramdaki her pik de bir bileşeni simgeler. Pik alanı karışımdaki bileşenin miktarını simgelerken; alan ile konsantrasyon arasında normal şartlarda lineer bir ilişki söz konusudur (http://www.oberlin.edu/chem/Secondary/ExpDev/GCMSIntro.pdf). GC-MS; kompleks karışımların ayrımı, tespit ve tayinlerinin yapılabildiği bir tekniktir. Bu nedenle de molekül kütlesi düşük olan yüzlerce bileşiğin analizi için idealdir. Bir bileşiğin GC-MS ile analiz edilebilmesi için termal olarak kararlı ve yeterince uçucu olması gerekmektedir. Ayrıca fonksiyonel gruplu bazı bileşiklerin, veri kalitesini etkileyecek adsorpsiyon problemlerini önlemek için, analiz öncesi türevlendirme gibi bazı kimyasal modifikasyonları gerekebilmektedir. Örnekler organik çözücüde çözülmüş olarak verildiği için de toprak, sediment, doku gibi örneklerin organik çözücüye alınması için çeşitli teknikler gerekir. Örnek, GC girişine enjekte edilir; buharlaşır ve taşıyıcı gaz (genellikle helyum) ile kolondan süpürülür. Örnek bileşenleri, kolon dolgu maddesi (durgun faz) ve taşıyıcı gaz (hareketli faz) ile etkileşimlerine göre ayrılırlar. Şekil 2.2.1.1.’ deki kromatogramda gözlenen pikler böyle bir ayrımın sonucudur Kolon, buradan elüe edilen bileşiklerin iyonlarına dönüştürüldüğü iyon kaynağı ile son bulur. Ayrılan bileşikler burada iyonlaştırma sonrası kütle spektrometresine aktarılırlar. 10 1.pikin kütle spektrumu Kromatogram 2.pikin kütle spektrumu Şekil 2.2.1.1. GC-MS’te gözlenen kromatogram ve bunlara ait kütle spektrumlarının basit bir şematik gösterimi KAYNAK: http://www.chem.arizona.edu/massspec/intro_html/intro.html 2.2.2. Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (LC-MS) Kütle spektrometri, uçucu olmayan bileşenler içeren numunelerin analizi için sıvı kromatografisi ile birleştirilmiştir. LC-MS, Şekil 2.2.2.1.’de şematik olarak gösterilmiştir. GC’den farklı olarak burada hareketli faz sıvıdır ve bu sıvı faz analit moleküllerini içinde bulundukları çözelti fazından, belli uzunluk ve çaptaki kolon yardımı ile ayırır. Enjeksiyon Karıştırıcı valfi & pompa Kütle kolon spektrometresi Mobil faz çözücüleri Şekil 2.2.2.1. LC-MS’in şematik gösterimi KAYNAK: http://ch309c.chem.lsu.edu/mswiki/index.php/Liquid_chromatography-mass _spectrometry İyonlaştırma kaynağı olarak kullanılan yöntemlerden biri, elektrosprey iyonlaştırmadır (ESI). Elektrosprey iyonlaştırmanın şematik modeki Şekil 2.2.2.2.’de verilmiştir. ESI, atmosfer basıncında ve oda sıcaklığında gerçekleşir. Numune çözeltisi, paslanmaz çelikten iğne şeklinde bir kapiler ile, dakikada birkaç mikrolitre hız sağlanarak pompalanır. İğneye, etrafındaki silindirik elektroda göre birkaç kilovolt potansiyel uygulanır. Oluşan çok küçük ve elektrik yüklü damlacıklar, daha sonra bir 11 çözücü giderme kapilerinden geçer. Burada çözücü buharlaşır ve elektrik yükleri analit moleküllerine tutunur. Çözücü buharlaşıp damlacıklar küçülürken yük yoğunluğu artar ve iyonlar, gaz fazına desorbe olur (Skoog ve ark. 1998). Skimmer Analit/solvent Transfer Analit- İğne şeklinde kapiler damlacıkları kapileri Kütle eluent akışı spektrometresi N2(g) akışı Koni (kurutucu gaz) ATMOSFER BASINCI Pompalama Şekil 2.2.2.2. Elektrosprey iyonlaştırmanın şematik gösterimi KAYNAK: http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/hplcms.html 2.3. Ultraviyole-Görünür Bölge (UV-VIS) Moleküler Absorpsiyon Spektrofotometri Moleküler absorpsiyon spektroskopi, b cm ışın yoluna sahip ışık geçirgen bir kapta bulunan bir çözeltinin geçirgenliğinin veya absorbansının ölçümüne dayanır. Şekil 2.3.1.’de görüldüğü gibi UV-VIS moleküler absorbans spektroskopisinde örnekten ultraviyole veya görünür ışık geçirilir. Işın demetinin bir kısmı olduğu gibi geçerken bir kısmı ise örnek tarafından absorplanır. Geçirgenlik (T), P/P○ ile; absorbans ise –logT ile belirtilir. Normal olarak absorbans, absorpsiyon yapan analit derişimi ile doğrusal olarak değişir. Bunun sonucu Beer yasası aşağıdaki eşitlik ile verilebilir. A=-logT=log(P○/P)=εbC (2.3.-1.) C= Analit derişimi, b= Işın yolu, ε= Absorplayıcı türün molar absorptivitesi P○ = Örnek hücresine gelen ışık şiddeti, P= Örnek hücresinden geçen ışık şiddeti 12 Gelen ışık Geçen ışık Örnek Şekil 2.3.1. Moleküler absorbansın şematik gösterimi KAYNAK: http://faculty.kutztown.edu/betts/html/UV_Vis_Absorbance.htm Molekül tarafından ışığın tüm dalga boyları eşit oranda absorplanmaz. Bir absorpsiyon spektrumu da ışığın hangi dalga boylarının absorplandığını gösterir. Aşağıdaki absorbans spektrumu, bir tekstil boyasından farklı dalga boylu ışığın geçirilmesi ve geçen ışık şiddetinin ölçülmesi ile elde edilmiştir. Absorplanan dalga boyları pikleri gösterirken; çukurlar da absorplanmayan dalga boylarını temsil eder. Dalga boyu UV Mavi Yeşil Sarı Kırmızı Şekil 2.3.2. Bir tekstil boyasının absorbans spektrumu KAYNAK: http://faculty.kutztown.edu/betts/html/UV_Vis_Absorbance.htm UV (Ultraviyole) veya görünür alanda absorpsiyon genellikle bağ elektronlarının uyarılmasından kaynaklanır; bunun sonucu olarak absorpsiyon piklerinin dalga boyları, incelenen türdeki bağların tipleri ile ilişkilendirilebilir. Bu yüzden moleküler absorpsiyon spektroskopisi bir moleküldeki fonksiyonel grupları tanımak için yararlıdır; ancak daha önemlisi UV-VIS absorpsiyon spektroskopisinin ışık absorplayan gruplar taşıyan bileşiklerin kantitatif tayinine uygulanmasıdır. Absorbans 13 Tüm organik bileşikler elektromanyetik ışını absorplayabilir, çünkü hepsinin daha üst enerji düzeylerine uyarılacak değerlik elektronları vardır. Çoğu tek bağı oluşturan elektronlara ilişkin uyarma enerjileri yeterince yüksektir öyle ki bunların ışın absorpsiyonu, vakum ultraviyole bölgesi diye bilinen (λ<185 nm) ve atmosfer bileşenlerinin de kuvvetli absorpsiyon gösterdiği bölge ile kısıtlıdır. Bu bölge ile deneysel güçlükler nedeni ile organik bileşiklerin spektrofotometrik araştırmalarının çoğu 185 nm’den daha yüksek dalga boylu bölgede yapılır. Daha uzun dalga boylu UV ve görünür bölge (VIS) ışınının absorpsiyonu, nispeten düşük uyarma enerjili değerlik elektronları taşıyan ve kromofor olarak adlandırılan sınırlı sayıda fonksiyonel grup ile kısıtlanmıştır. Kromoforları içeren organik moleküllerin elektronik spektrumları genellikle karmaşıktır, çünkü titreşim geçişlerinin elektronik geçişler ile çakışması üst üste binen absorpsiyon çizgilerinin karmaşık bir bileşimini doğurur. Bunun sonucunda da çoğu kez sürekli görünen geniş bir absorpsiyon bandı ortaya çıkar. Bu spektrumların karmaşık yapısı ayrıntılı kuramsal analizi güç ya da olanaksız kılsa da verilen bir absorpsiyon spektrumundan sorumlu elektronik geçişlerin türlerine ilişkin kalitatif veya yarı kantitatif ifadeler molekül orbital düşüncelerinden çıkarılabilir. Kromoforlara ait teorik olarak belirlenen maksimum absorbans dalga boyu değerleri molekülün yapısal ayrıntılarından ve çözücüden etkileneceği gibi oksokrom adı verilen ve bu maksimumları daha uzun dalga boylarına kaydırıp absorpsiyon şiddetini artıran fonksiyonel grupların etkisi de söz konusudur (Skoog ve ark. 1998). 2.4. Katı Faz Ekstraksiyonu Katı faz ekstraksiyonu; çevre, gıda, klinik, ilaç ve endüstri gibi pek çok alanda uygulanabilen etkin bir ayırma ve deriştirme tekniğidir. Genellikle uygun dolgu maddeleri (sorbentleri) içeren küçük kolon veya kartuşlar ile uygulanır (Bhaskar ve ark. 2004). Katı faz ekstraksiyonu, hızlı ve etkin bir örnek hazırlama tekniğidir. Hacmi mikrolitre ile birkaç yüz mililitre arasında değişen örnek çözeltileri, seçici dolgu maddeleri ile doldurulmuş kolonlardan geçirilir. Örnek çözeltisinde bulunan ve kolonda tutulan ilgili bileşikler, dolgu maddesinden uygun çözücü ile ekstrakte edilir. Katı faz ekstraksiyonunun şematik olarak gösterimi Şekil 2.4.1.’de verilmiştir. 14 Kolon uygun Örnek Örnek çözücüler ile kolondan çözeltisindeki şartlandırılır. geçirilir istenen bileşiklerin kolonda tutulması sağlanır. Kolonda tutunan bileşikler uygun çözücü ile elue edilir. Şekil 2.4.1. Katı faz ekstraksiyonunun basit bir şematik gösterimi KAYNAK: 'BAKER'-10 SPE Applications Guide. 1984. Vol.2, p.96-110. 2.4.1. Katı Faz Ekstraksiyon Kolonlarının Dolgu Maddelerinin Fonksiyonel Grupları ve Yapıları Bazı dolgu maddeleri, polaritelerine göre Şekil 2.4.1.1.’de sıralanmıştır. Apolar (polar olmayan) Oktadesil (C18), Oktil(C8), Butil (C4), Siklohekzil ( ), Fenil (C6H5) Polar Siyano (CN), Kiselguhr(SiOH), Silika Jel (SiOH), Diol(COHCOH), Amino(NH2), Florisil(SiOn) Alumina (Al2O3) Anyon değiştiriciler 1○, 2○- Amino (NH2/NH), kuarterner amin (N+) Katyon değiştiriciler Karboksilik asit (COOH), Sülfonik asit (-SO3H) Şekil 2.4.1.1. Bazı dolgu maddelerinin polarite artışlarına ait sıralama KAYNAK: 'BAKER'-10 SPE Applications Guide. 1984. Vol.2, p.96-110. POLARİTE ARTIŞI 15 2.4.2. Katı Faz Ekstraksiyon Mekanizmaları, Örnek İçin Bilinmesi Gereken Temel Özellikler ve Çözücü Polariteleri Katı faz ekstraksiyon mekanizmaları özetle; adsorpsiyon, bağlı-faz dağılma, normal faz, ters faz, iyon-çifti ters faz, iyon değişimi, boyut eleme, geniş gözenek katı faz ekstraksiyonu şeklinde verilebilir Katı faz ekstarksiyonu öncesi yapıya ilişkin molekül ağırlığı, çözünürlük, fonksiyonel grup (veya gruplar), polarite, pH/pKa göz önüne alınmalıdır. Çözücü polarite sıralaması da Şekil 2.4.2.1.’ de verilmiştir. Hekzan İzooktan Karbon Tetraklorür Kloroform Metilen Klorür Tetrahidrofuran Etil Eter Etil asetat Aseton Dioksan Asetonitril İzopropanol Metanol Su Asetik Asit Şekil 2.4.2.1. Bazı çözücülerin polarite artışlarına ait sıralama KAYNAK: 'BAKER'-10 SPE Applications Guide. 1984. Vol.2, p.96-110. 2.5. Kemometrik Yöntemler Kemometri; bilgisayar, istatistik ve matematiksel yöntemlerin kimyasal verilere uygulanmasıdır. Ne var ki, tüm bu metotların limitleri ve varsayımları tam olarak anlaşılmadan kimyasal problemlerin çözümüne yönelik istatistiksel metotların kullanılması uygun olmamaktadır. Kimyasal veriler tek değişkenli olabildiği gibi çoğu zaman bir çok değişkene bağlı olabilmektedir. Bu değişkenlerin her birinin analiz başlangıcında eşit öneme sahip olduğu önemle düşünülen bir noktadır. Çok değişkenli verilerin analizinde çoğu zaman kemometrik metotlar kullanılmaktadır. Deneysel parametrelerin klasik yöntemlerle optimizasyonunda değişkenlerden biri sabit POLARİTE ARTIŞI 16 tutulurken diğer değişkenler faklı oranlarda alınarak bu değişkenlerin etkileri incelenir. Bu işlem her bir değişken için tekrarlanır. Fakat klasik yöntemlerde parametrelerde arasında da etkileşim olabileceği ve eğer etkileşim oluyorsa bu iki parametre arasındaki etkileşimin diğerlerini etkileyebileceği hesaplanamamaktadır. Bu nedenle bu yöntem yeterli değildir. Kemometrik tekniklerde ise; hangi parametreler etkilidir, bu parametrelerin etkisi ne kadardır ve bu parametrelerin etkileşim miktarları ne ölçüdedir gibi sorulara yanıt aranmaktadır. Bu amaca yönelik bir çok kemometrik optimizasyon tekniği geliştirilmiştir. Kemometrik optimizasyon tekniklerinde optimum koşulların sağlanabilmesi için deneysel dizaynlar oluşturulur. Bu dizaynlar deneysel çalışmanın planlı bir şekilde, zaman kaybı olmadan ve yeterli sayıda yapılmasını sağlar. Değişik amaçlara yönelik çeşitli deneysel dizayn yöntemleri vardır. Verilerin kemometrik analizi için bilgisayar programlarına ihtiyaç duyulmaktadır. En yaygın kullanılan programlama ortamları arasında MATLAB ve VISUAL BASIC sayılabilir. Bunların dışında bazı hazır programlar da kullanılmaktadır. Bunlar değişik kemometri alanında çalışan gruplar ticari olarak piyasaya sunulmaktadır. Bazıları şunlardır. CAMO, ElGENVECTOR RESEARCH, INFOMETRIX, UMETRICS gibi firmalardır (Demir 2003). 2.5.1. Merkezi Kompozit Dizayn Faktoriyel dizaynlar her bir faktörün etkilerini genel olarak inceleyen yöntemlerdir. Her bir faktörün optimum koşullarının bulunması merkezi kompozit dizayn yöntemi ile yapılır. Buradaki deney sayısı aşağıdaki formüle göre belirlenir. Deney sayısı=2k + 2k +1 (k=faktör sayısı) (2.5.1.-1) Formüldeki 2k full faktoriyel veya fraksiyonlu faktoriyel dizayndaki deney sayılarını, 2k star dizayn deney sayısını ve 1 ise orta seviyedeki deney sayısını gösterir. 2k’ daki seviyeler (-1) ve( +1), 2k’dakiler ± α, 1’deki ise (0)’dır. Α değeri dairesel ve ortagonal dizayna göre farklı seviyeler alır. 17 Dairesel dizaynda α aşağıdaki formüle göre hesaplanır. α= ± 4 2k (2.5.1.-2) Ortagonal dizaynda ise α aşağıdaki formüle göre hesaplanır. α= ± k (2.5.1.-3) 2.6. Azo Boyaları Boya ve pigment gibi renklendiriciler önemli endüstriyel kimyasallardır (Golka ve ark. 2004). Boyar maddelerin bir grubunu oluşturan azo boyaları; tekstil, kağıt, deri, benzin, katkı maddeleri, gıda maddeleri, oyuncak, plastik, baskı mürekkepleri, ilaç, kozmetik ürünlerinde yaygın olarak kullanılan ve kromofor azo grupları (-N=N-) ile karakterize edilen sentetik organik boyar maddelerdir (Garrigos ve ark. 2002, Bhaskar ve ark. 2003, Gnanamani ve ark. 2004, Calbiani ve ark. 2004, Ahlström ve ark. 2005). Kromofor azo grupları, 400-750 nm aralığında görünür bölge ışığını absorplama veya yansıtma yolu ile renk oluşumundan sorumludurlar (Davies ve ark. 2006). Azo boyaları, boya endüstrisinde kullanılan boyaların en geniş sınıfını oluştururlar (Zhang ve ark. 2005). Tekstil boyalarının %80’i azo boyalarıdır (Pielesz 1999). Bu boyalar, ucuz oldukları ve hızlı renk verdikleri için 19.yy’ın ikinci yarısından itibaren çok sayıda endüstriyel alanda yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Ahlström ve ark. 2005). 1800’ lü yılarda güvenilirliğine dair bilgi olmaksızın yaygın olarak kullanılan sentetik boyalar, gıdaların işlem görmeleri sırasında kaybolan doğal renginin sağlanması veya doğal olarak renksiz olan gıdaların tüketiciler üzerindeki çekiciliğini artırmak için kullanılabilmektedirler (Tripathi ve ark. 2007). Bununla birlikte bu tür sentetik boyaların gıdalarda ve içeceklerde kullanımına yasalarca belirli limitler getirilmiştir. Limit değerler, gıda türüne ve boyar madde yapısına bağlı olarak değişen belirli aralıktadır (Chanlon ve ark. 2005). Sudan I (S I), Sudan II (S II), Sudan III (S III) ve Sudan IV (S IV) boyar maddeleri de gıdalarda bulunmasına izin verilmeyen sentetik boyar maddelerdendir. 18 2.6.1. Azo Boyalarının Sentezi ve İndirgenmesi Azo boyar maddeleri; genellikle diazolanmış aminlerin (diazonyum bileşiği) fenol veya başka bir amin (aromatik aminlerle) bileşiği ile reaksiyona girmesi sonucu sentezlenen, bir veya daha fazla azo bağı içeren sentetik organik renklendiricilerdir (Calbiani ve ark. 2004, Ahlström ve ark. 2005, Sponza ve Işık 2005). Yaklaşık iki bin boya bu şekilde sentezlenmiş olmakla birlikte bunların beş yüzden fazlası kanserojen aromatik amin kökenlidir (Gnanamani ve ark. 2004, Gnanamani ve ark. 2005). Hayvanlar üzerinde yapılan bazı denemeler sonucunda azo boyar maddelerinin kanserojen oldukları tespit edilmiştir. Bu maddelerin aromatik aminlere parçalanması toksik etkilerini açıklamaktadır. Bu boyalar kimyasal, biyolojik veya fotolitik yol ile parçalanabilmekte; indirgenme sonrasında genellikle aromatik R-NH2 verecek şekilde parçalanma ürünleri oluşturmaktadırlar. Bu boyar maddelerin çeşitli yollarla insan metabolizmasına alınması durumunda, biyolojik indirgenme sonucu toksik aminlerin oluşumu tespit edilmiştir (Pielesz 1999). Azo boyalarının indirgenmesi kimyasal ortamda gerçekleşebileceği gibi; karaciğer veya diğer organlardaki azo redüktazlar veya bağırsak bakterilerinin etkisi sonucu insan organizmasında enzimatik indirgenme şeklinde de olabilir (Oh ve ark. 1997). Literatürde; biyolojik (mikroorganizmalarla) (Gnanamani ve ark. 2004, Gnanamani ve ark. 2005, Kumar ve ark. 2005, Khehra ve ark. 2006), fotokimyasal yöntem (Cisneros ve ark. 2002), metalik demir (Fe (0)) (Feng ve ark. 2000) ile, fenton sistemi (Fe2+/Hidrojen peroksit (H2O2)) ve fenton benzeri sistem (Fe3+/H2O2) reaksiyonları (Hsueh ve ark. 2005), radyolitik yöntem (Zhang ve ark. 2005), radyasyon indüklenmiş yöntem (Wojnarovits ve ark. 2005), ultrasonik yöntem (Gültekin ve İnce 2006, Inoue ve ark. 2006), ozonlama yöntemi (Zhao ve ark. 2004, Gültekin ve İnce 2006), H2O2 varlığında UV ışığı ile fotooksidatif olarak (Modirshahla ve Behnajady 2006) veya ozon-ultrases kombinasyonu ile (Gültekin ve İnce 2006) indirgeme işlemi yapılabileceği belirtilmektedir. İndirgenme ile renksizleşme, oksijensiz ortamda biyolojik veya kimyasal olarak meydana gelebilmektedir; mikrobiyal anlamda ise mikroorganizma enzimleri etkindir. İndirgemede saf mikroorganizma kültürleri vaya karışım kültürlerinin kullanıldığı termofilik şartlar da belirtilmiştir (Dos Santos ve ark. 2006). Kromofor azo grupları boyar maddelerin mikrobiyal etkiye ve oksijenli ortamda renksizleşmeye dayanıklılığını 19 artırmaktadır. Biyolojik indirgenme oksijenli ve oksijensiz ortam mikroorganizmaları, mantar, antinomycetes ve alg gibi çeşitli mikroorganizmalar ile yapılmıştır. Bunlardan antinomycetes ve mantar türleri ile indirgeme boyanın oksidatif olarak aktivasyonudur, katyonik türler oluşur ve boya molekülü suyun nükleofilik saldırısına açık hale gelir. Bakteriyel indirgeme, genellikle oksijensiz şartlarda indirgenmiş koenzimin elektron vericisi olarak davrandığı azoredüktaz ilavesi ile azo bağlarının kopmasını içeren enzimatik biyotransformasyon basamağı ile başlar. Oksijenli ortamda ise azo bağları pratik olarak bakterilerce parçalanmamaktadır. Ancak bazı sülfo gruplu azo boyalarının oksijenli ortamda bakterilerce indirgenmesi de literatürde görülmektedir; burada oksijenin varlığına rağmen, başlangıç basamağında oksijene ilgisiz azo redüktaz enzimi ile azo bağının indirgenmesi söz konusudur. Oksijensiz şartlar altında çok sayıda bakteri bu indirgen parçalanmayı katalizler; sonunda mutajen ve kanserojen aromatik aminler oluşur. Azo bağlarının indirgenerek kopması sonucu bu tür aromatik aminleri verdiği bilinen bazı azo boyaları yasaklanmıştır (Nachiyar ve Rajakumar 2004). Azo boyalarının sentezi ve indirgen parçalanması Şekil 2.6.1.1.’de verildiği gibidir. SENTEZ: Diazolama Kenetlenme Ar-NH2 Ar-N +Cl-HCl, NaNO 2 Ar-N=N-Ar ' 2 Ar'-H A romatik Diazo bileşiği Azo boyası a min İNDİRGEN PARÇALANMA: Azo bağının kopması Ar-N=N-Ar' Kimyasal veya enzima tik in d i r g e n m e Ar-NH2 + Ar '-NH2 Azo boyası Aromatik aminler Şekil 2.6.1.1. Azo boyalarının sentezi ve indirgen parçalanması KAYNAK: OH,S.W., M.N.KANG, C.W.CHO VE M.W.LEE. 1996. Detection of carcinogenic amines from dyestuffs or dyed substrates. Dyes and Pigments, 33(2):119- 135. 20 Azo boyalarının indirgen parçalanması, Şekil 2.6.1.2.’ deki genel yapı üzerinde de gösterilebilir: indirgenme Şekil 2.6.1.2. Bir azo boyasından indirgen parçalanma yolu ile aromatik amin oluşumu KAYNAK: PIELESZ,A., I.BARANOVSKA, A.RYBAK, A.WLOCHOWICZ. 2002. Detection and determination of aromatic amines as products of reductive splitting from selected azo dyes. Ecotoxicology and Environmental Safety, 53:42-47. Şekil 2.6.1.3.’te azo boyasından aromatik aminlerin nasıl oluştuğu özetlenmektedir. Boyar maddelerden aminlerin oluşmasını sağlayan bu metotlar; fotolitik ve kimyasal indirgenme ile biyoindirgenmedir. Azo boyar maddeleri aerobik şartlarda indirgenmeye karşı direnç göstermesine rağmen anaerobik şartlar altında kolaylıkla aromatik aminlere indirgenebilmektedir. İndirgenme; öncelikle bağırsak bakterileri, karaciğer hücreleri ve deri mikro florasındaki azoredüktazlar tarafından azo bağlarının kopması ile meydana gelir (Pielesz 1999, Pielesz ve ark. 2002). 21 Fotolitik indirgenme Kimyasal indirgenme Biyolojik indirgenme Hidroksilasyon, İndirgenme oksidasyon, k1 hidroliz… vb. Ve/veya k İleri biyoindirgenme 2 Şekil 2.6.1.3. Azo boyalarının indirgenmesinin şematik modeli KAYNAK: PIELESZ,A. 1999. The process of the reduction of azo dyes used in dyeing textiles on the basis of infrared spectroscopy analysis. Journal of Molecular Structure, 512-513:337-344. 2.6.2. Azo Boyalarının Kimyasal İndirgenmesi ve İndirgenme Yolu İle Analizleri İndirgenme, azo boyalarının indirgenme reaksiyonu sonucu azo bağlarından parçalanarak karşılık gelen aromatik aminlerin oluşması olarak tanımlanabilmektedir. Bu amaçla; sodyum ditiyonit, kalay (Sn) (II) klorür, oda sıcaklığında metalik çinko (Zn) ve metanolde amonyum format/formik asit kullanılabileceği gibi, elektrokimyasal işlemler de uygulanabilir. İndirgeme, bileşiğin doğrudan GC’ deki ısıtılmış enjeksiyon portuna verilerek de başarılmıştır (Ahlström ve ark. 2005). Renksizleşme kimyasal olarak sülfit, sistein, askorbat veya Fe2+ gibi biyojenik indirgenler ile de meydana gelebilmektedir (Dos Santos ve ark. 2006). Sodyum ditiyonit ve Sn(II) klorür kullanımına dair karşılaştırma çalışmaları literatürde incelenmiştir. Bu amaçla on altı yaygın azo boyasının indirgen parçalanma 22 prosedürleri iki indirgen için de karşılaştırılmıştır. Kaynayan metanolde sodyum ditiyonit ile indirgeme farklı boyar maddeler için farklı sodyum ditiyonit miktarı gerekliliğini göstermiştir. Diğer indirgen için işlemler de kaynayan metanolde yapılmış ve renksizleşme sonrası sodyum karbonat ilave edilerek, aminler etil asetat ile ekstrakte edilmiştir. Daha fazla ürün oluşturan ve bu nedenle daha etkin olan ikinci indirgenin daha tercihli olduğunu söylense de bu alandaki etkinliklerinin tam karşılaştırılması için daha fazla değerlendirme yapılması gerekliliği vurgulanmaktadır (Ahlström ve ark. 2005). Literatürde tekstil ürünlerine yönelik genel test metodu olarak, sulu alkali çözeltide sodyum ditiyonit ile yapılan indirgenme verilmektedir. İndirgenmiş çözeltinin ekstraksiyonu için etil asetat, ayırma ve belirleme işlemleri için TLC (ince tabaka kromatografisi), GC, LC (sıvı kromatografisi) teknikleri kullanılabilmekle birlikte; doğrulama imkanı veren GC-MS’ten yararlanıldığı görülmektedir (Oh ve ark. 1996). Literatür verileri incelendiğinde ekstraksiyon için ayrıca diklormetan, metanol, veya asetik asit metil esteri önerildiği görülmektedir. Tekstil ürünleri için kaynama sıcaklığındaki 1M NaOH içinde sodyum ditiyonit varlığında yapılan indirgeme daha zorlayıcı koşullar sağlarken; pH=6 tampon ortamında, 70°C’ de yapılan indirgemenin daha yumuşak koşullar sağladığı belirtilmiştir (Pielesz 1999, Pielesz ve ark. 2002). Oluşan aromatik aminlerin miktarı ise boyar madde yapısına ve indirgenme koşullarına bağlı olarak farklılık göstermektedir (Pielesz ve ark. 2002). Boyaların amin içeriklerinin tayini için çoğunlukla tekstil ve deri ürünlerine uygulanan genel proses, sulu ortamda sodyum ditiyonit kullanılarak yapılan indirgen parçalanma işlemini takiben solvent ekstraksiyonu ve oluşan aminlerin sıvı veya gaz kromatografisi ile tayinidir. Bu yöntem oyuncaklarda kullanılan boyar maddeler gibi alanlarda da uygulama alanı bulmuştur. Literatürde; bu yöntemin farklı boyar maddelere uygulanmasında, indirgenme işleminin optimizasyonu için kemometrik yöntemlerden yararlanıldığı görülmektedir. Ayrıca; boyar madde içeren çözeltide renksizleşmenin gerçekleştiği şartlarda azo boyasının parçalanmasının tamamlandığı varsayımının yapılabileceği de belirtilmektedir (Garrigos ve ark. 2002). 23 2.6.3. Azo Boyalarının Mutajenik ve Kanserojenik Etkisi Boya molekülü biyolojik olarak inaktif olmasına karşılık (Eskilsson ve ark. 2002) derideki veya çevredeki mikroorganizmalar, azo bağlarını koparabilir ve karşılık gelen aminleri oluşturabilir. Böylece; çözünebilen azo boyaları ter veya tükürük yolu ile vücuda alındığında, karaciğer enzimleri ve sindirim sistemindeki mikro flora tarafından karşılık gelen aromatik aminlerine parçalanmaktadır. Benzidin, 4-aminobifenil ve 2- naftilamin gibi bazı aromatik aminler Uluslararası Kanser Araştırma Teşkilatı (IARC) tarafından insan kanserojenleri olarak sınıflandırılmıştır. Bu aromatik aminler doğrudan temas veya çevresel etkileşim yoluyla sağlık açısından risk oluşturmaktadırlar (Weisburger 2002, Bhaskar ve ark. 2003). Literatür incelendiğinde azo boyar maddelerinin tek başlarına mutajenik aktivite etkilerinin çok az olduğu görülmektedir. Mutajenik etkinin asıl kaynağı, boyar maddelerin yapılarındaki amin içerikleridir. Boya için esas tehlike kriteri, bunların; ter, tükürük veya mide özsuyu ile teması sonrasında aromatik aminlere indirgenebilme özellikleridir. Bununla birlikte organizmada toksik aminlerin oluşumundan esas sorumlu olan, boyar maddenin biyolojik indirgenmesidir (Pielesz 1999, Pielesz ve ark. 2002). Aromatik aminlerin insanlar üzerindeki kanserojenik etkisi ilk kez 1985 yılında Alman cerrah Ludwig Rehn tarafından boya endüstrisinde çalışan ve aniline maruz kalan erkekler arasında yüksek oranda üriner kanser oluştuğunun rapor edilmesi ile ortaya çıkmıştır. Bu konudaki epidemiyolojik çalışmalar detaylandırıldığında, boya endüstrisinde kullanılan benzidin 4-aminobifenil ve 2-naftilamin gibi aromatik aminlere uzun süreli maruz kalınmasının kanser oluşumunu arttırdığı gözlenmiştir (Ahlström ve ark. 2005). Aromatik aminlerin genetoksik (mutajenik) ve kanserojenik etkilerinin nedeni DNA (deoksiribonükleik asit) moleküllerine bağlanabilecek reaktif ara ürünler veren ve N-hidroksillenme ile başlayıp esterleşme ve asetillenme gibi reaksiyonlar üzerinden devam eden biyolojik aktivasyon olarak saptanmıştır. Bu durum Şekil 2.6.3.1.’de gösterilmiştir. Nitrozoaril ve N-hidroksiaril ara ürünleri ile hemoglobin ve DNA arası etkileşimler de aromatik aminlerin toksisitelerini açıklamada göz önüne alınmaktadır (Pinherio ve ark. 2004). Kanserojen etkinin moleküler mekanizması kısaca değerlendirilecek olursa; ilk basamakta N-hidroksillenme veya N-asetillenme ve ikinci 24 basamakta açiloksi aminleri veren O-açillenme gerçekleşir. Oldukça reaktif nitrenyum ve karbonyum iyonları oluşumu sonrası bu elektrofilik reaktanlar, hücre genetik materyali DNA ve RNA (ribonükleik asit)’ ya kovalent olarak bağlanır. Bu durum mutasyonu tetiklemekle birlikte mutasyon da tümör oluşumuna götürür (http://mst.dk/udgiv/publications/1999/87-7909-548-8/pdf/87-7909-546-1.pdf). Nitrozo türevi Hidroksilamin türevi Amin Hemoglobin DNA Şekil 2.6.3.1. Aromatik amin ve aromatik nitro bileşikleri için basitleştirilmiş metabolik yol KAYNAK: WEISS, T., J. ANGERER. 2002. Simultaneous determination of various aromatic amines and metabolites of aromatic nitro compounds in urine for low level exposure using gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 778:179–192. Tüketiciler, azo boyaları ve bunların indirgenme ürünleri ile doğrudan veya dolaylı olmak üzere iki yolla temas etmektedirler. Boyanmış oyuncak veya deri kıyafetlerin çocuklar tarafından emilmesi ağız yolu ile yani doğrudan temasa; cilde yakın kıyafetlerden terleme ve sürtünme sonucu deri adsorpsiyonu ise dolaylı temasa örnek verilebilir. (Ahlström ve ark. 2005). 2.7. Aromatik aminler Azo boyaları genellikle sodyum ditiyonit veya Sn (II) klorür kullanılarak kimyasal indirgeme ile oluşan aromatik aminleri aracılığı ile dolaylı olarak tayin edilir (Ahlström ve ark. 2005). Aromatik aminler ise genellikle yapılarında bir veya daha fazla aromatik halka ve bunlara bağlı bir veya daha fazla amino grubuna sahip kimyasal bileşikler olarak tanımlanırlar. En basit yapılı anilinden; konjüge aromatik veya heterohalkalı yapıya veya birden fazla sübstitüe gruba sahip oldukça kompleks yapıya 25 kadar değişen aralıkta yer alabilirler. Çevredeki aminlerin ana kaynağı yağ rafinerisi, sentetik polimerler, boyalar, yapıştırıcı, plastik, ilaç, saç boyaları, pestisit ve patlayıcılar gibi ürünlerle ilgili çeşitli kimya endüstrileri olabileceği gibi; otomobil eksozları, proteince zengin gıdaların yanması veya pirolizi, orman yangınları, sigara dumanı, et ürünlerinin ısıl işleme maruz kalması gibi endüstriyel olmayan kaynaklı da olabilmektedir (Pinheiro ve ark. 2004). Sübstitüe aromatik aminler kimya endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Bu maddeler endüstriyel proses işlemleri sırasında ve sonrasında çevreye direkt olarak atılabilirler. Azo boyar maddeleri dışında fenilkarbamat, fenilüre ve anilin herbisitlerinden de dolaylı yolla amin bileşikleri oluşabilmektedir. Aromatik aminler kolaylıkla toprağa nüfuz ederek yer altı suyu için kirletici özellik teşkil ederler. Bu nedenle içme suyunda; ayrıca meyve sularında, şekerleme ve diğer gıdalarda da eser düzeylerde bulunabilirler (Singh ve ark. 2003). Aromatik aminler ve türevleri doğal kanserojen etkileri ve toksisiteleri nedeni ile önemli çevresel kirleticilerdendir (Singh ve ark. 2003). Bu nedenle mutajenik ve kanserojenik etkilerinden şüphelenilen aromatik aminler gibi çevresel konulara giderek artan bir ilgi mevcuttur. Aminler genellikle azo boyalarının kimyasal veya biyolojik indirgenme ürünleridir. Isıl işlem görmüş gıda maddelerinden de aromatik amin oluşumu tespit edilmiştir (Chiang ve ark. 1999). Kanserojen aromatik amin veren azo boyalarının ithali,üretimi ve kullanımı ise yasaktır (Pielesz ve Wlochowicz 2001). Aromatik aminler MAK (Maximale Arbeintsplatz Konzentration) III A1 ve MAK III A2 ; ayrıca IARC ve ETAD (Ekolojik ve Toksikolojik Boyarmadde Üreticileri Birliği) listelerinde sınıflandırılmıştır (Pielesz 1999, Pielesz ve Wlochowicz 2001). Bu maddelerin yasaklılar listelerinde yer alması, azo gruplarından parçalanarak, bir veya daha fazla ve kanserojen özellik gösteren amin türlerinin oluşabilme özelliklerinden kaynaklanmaktadır (Pielesz 1999). Almanya’da tekstil ürünlerinde MAK aminlerin varlığı kesinlikle yasaktır. Türkiye’de 1 Mart 1995 tarihinden itibaren tekstilde yüz otuz azo boyası kullanımı bu aromatik aminler nedeni ile yasaklanmıştır. Buna rağmen etkinlikleri ve düşük maliyeti nedeni ile hala kullanılmaktadırlar (Sponza ve Işık 2005). MAK aminler Çizelge 2.7.1.’de verilmiştir. 26 Çizelge 2.7.1. MAK aminler listesi CAS Molekül MAK AMİNLER Numarası Ağırlığı (g/mol) Benzidin 92-87-5 184 MAK III A1 4-aminobifenil 92-67-1 169 4-Kloro-o-toluidin 95-69-2 141 2-Naftilamin 91-59-8 143 o-Aminoazotoluen 97-56-3 225 2-amino-4-nitrotoluen 99-55-8 152 p-Kloranilin 106-47-8 127 2,4-Diaminoanisol 615-05-4 138 4,4'-Diaminodifenilmetan 101-77-9 198 3,3'-Diklorbenzidin 91-94-1 252 3,3'-Dimetoksibenzidin(o-dianisidin) 119-90-4 244 MAK III A2 3,3'-Dimetilbenzidin (o-tolidin) 119-93-7 212 3,3'-Dimetil-4,4'-diaminodifenilmetan 838-88-0 226 p-kresidin 120-71-8 137 4,4'-Metilen-bis-(2-kloranilin) 101-14-4 266 4,4'-Oksidianilin 101-80-4 200 4,4'-Tiyodianilin 139-65-1 216 2-Metilanilin (o-toluidin) 95-53-4 107 2,4-Tolulendiamin 95-80-7 122 2,4,5-Trimetilanilin 137-17-7 135 KAYNAKLAR: PIELESZ,A.1999. The process of the reduction of azo dyes used in dyeing textiles on the basis of infrared spectroscopy analysis, Journal of Molecular Structure, vol.511-512, p.337-344. PIELESZ, A., A. WLOCHOWICZ, W. BINIAS. 2000. The evaluation of structural changes in wool fibre keratin treated with azo dyes by Fourier Transform Infrared Spectroscopy, Spectrochimica Acta Part A, vol.56, p.1409-1420 CIONI, F., G. BARTOLUCCI, G. PIERACCINI, S. MELONI, G. MONETI.1999. Development of a solid phase microextraction method for dedection of the use of banned azo dyes in coloured textiles and leather. Rapid Communications in Mass Spectrometry, vol13, p.1833-1837. http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/chemidheavy.jsp Bazı azo boyaları, indirgen şartlar altında MAK aminleri olarak isimlendirilen ve Çizelge 2.7.1.’ de gösterilen yasaklı aromatik aminlere parçalanmaktadır. Bu aminlerin sadece alerjik etkileri değil; aynı zamanda toksik ve mutajenik etkileri de belirtildiği için (Pielesz 1999, Pielesz ve ark. 2002) tekstil endüstrisinde kullanımları çeşitli standartlara göre kesinlikle yasaktır. Fakat bu boyalar yasaklamalara rağmen halen kullanılmakta olup kullanılma problemi yasal olarak tam anlamı ile çözülememiştir (Pielesz ve ark. 2000). Örneğin benzidin, Hindistan’da iki yıl önce yasaklanmasına karşın; düşük maliyetli olması sebebi ile tekstil endüstrisinde hala 27 yaygın olarak kullanılmaktadır (Pielesz 1999). Yasaklanmış olan maddeler, listeler halinde açıkça belirtilmektedir ve potansiyel olarak zararlı olabilecek bileşikler de sürekli olarak listeye eklenmektedir (Pielesz 1999). Yasaklı aminler sert analiz şartlarında diğer parçalanma reaksiyonları ile değil; sadece azo gruplarının indirgenmesi ile oluşmalıdır. Bu nedenle biyotoksisite açısından organizmadaki enzimler ile parçalanabilecek azo boyaları yasaklılar kapsamındadır. Çünkü; karaciğerdeki azo redüktazlar ve deri bakterileri sadece azo bağlarını parçalayabilmekte; diğer bağları parçalayamamaktadır (Pielesz 1999). 2.7.1. Aromatik Aminlerin Ekstraksiyonu ve Ekstraksiyon Tekniklerinin Karşılaştırılması Tüm analitik prosedürler içersinde en az gelişmiş kısım, muhtemelen ekstraksiyon basamağıdır. Ekstraksiyon için sıvı-sıvı ekstraksiyon (LLE), katı faz ekstraksiyon (SPE), katı faz mikroekstraksiyon (SPME), soxhlet ekstraksiyon; ayrıca süperkritik akışkan ekstraksiyon (SFE) ve mikrodalga yardımlı ekstraksiyon (MAE) teknikleri kullanılabileceği gibi (Eskilsson ve ark. 2002); sıvı faz mikroekstraksiyon tekniği de önerilmektedir (Pinheiro ve ark. 2004). SFE ve MAE’nin daha az çözücü kullanımı, hızlı ekstraksiyon gibi avantajları vardır. SFE metodu ekstraksiyon süresini de kısaltır. MAE, SFE ve soxhlet ekstraksiyonu en genel anlamda karşılaştırıldığında MAE en iyisidir fakat en önemli dezavantajı ekstraksiyondaki daha az seçiciliktir (Ahlström ve ark. 2005). SPE tekniği daha az çözücü gerektirmesine rağmen, örnekte partiküler yapının varlığı, kartuşların tıkanmasına neden olabilir. SPME nispeten yeni bir teknik olup; PAWLISZYN ve arkadaşları tarafından geliştirildiği belirtilmiştir. En önemli avantajı, ekstraksiyon sırasında çözücü kullanımını gerektirmemesidir (Chang ve ark. 2003). LLE, yeterli geri kazanım değerine ulaşmak için yüksek hacimde solvent kullanmayı gerektirmektedir. Bu yüksek orandaki çözücünün uzaklaştırılması ise hem zaman hem de enerji kaybına neden olmaktadır. Son yıllarda LLE’nin yerini SPE almıştır. SPE’nin avantajları ise daha az çözücü gereksinimi, matriks bileşenlerinin uzaklaştırılması ve otomasyona elverişliliğidir (Less ve ark. 1998). Yine son yıllarda 28 Plum ve ark. tarafından örnek hazırlamada solvent gerektirmeyen bir metot, piroliz GC-MS tekniği ile, tekstil ürünlerindeki azo boyalarından oluşan yedi aromatik aminin kalitatif tayininin yapılabilirliği belirtilmiştir. Bu metotta, aminler analiz sistemine termal olarak ekstrakte edilmekte bu nedenle de ön indirgeme basamağına gerek kalmamaktadır. Saf üç azo boyası ile yapılan başlangıç çalışmalarında aminlerin pik alanı olarak ölçülen geri kazanımlarına pirolizer sıcaklığının etkisi incelenmiştir. Boyalar sıcaklık değişimine farklı yanıt verse de; yüksek sıcaklık değerleri, aminlerin daha ileri parçalanmasına yol açtığı ve bu nedenle daha düşük geri kazanımlara sebep olduğu için; 500 °C gibi ortalama sıcaklık değerinin tercih edilebileceği belirlenmiştir. Bu tekniğin iki büyük dezavantajı, yüzde geri kazanımın matrikse büyük ölçüde bağlı olması ve yüksek örnek hacimlerinin enjeksiyon bölmesindeki kirliliği artırmasıdır. Bu durum ise tayini etkilemektedir (Ahlström ve ark. 2005). 2.7.2. Aromatik Aminlerin Tayin Yöntemleri Literatürde, düşük düzeyde aromatik amin tayini için TLC, GC, GC-MS, HPLC-(DAD (diod serisi dedektör) veya floresans dedektörlü) (Pielesz ve ark. 2002) gibi çeşitli analitik yöntemler ile çalışıldığı görülmektedir. TLC ve GC daha çok kalitatif amaçlı kullanılırken; kantitatif amaçlar için HPLC daha iyi bir seçim olmaktadır. Bu tayin için infrared (IR) spektrometri (Pielesz ve Wlochowicz 2001), UV-VIS spektrofotometri (Zatar ve ark. 1998, Pinheiro ve ark. 2004), voltametri, potansiyometri, CE (Pinheiro ve ark. 2004), Fourier dönüşümlü- infrared (FT-IR) spektrometri, LC-MS ve kapiler zon elektroforez (Pielesz 1999, Ahlström ve ark. 2005) ile; ayrıca ön işlem basamağı gerekmeden ters-faz sıvı kromatografisi- elektrospray iyonlaştırma-kütle spektrometresi/kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) (Mortensen ve ark. 2005) ile çalışıldığı görülmektedir. Bunlara ek olarak farklı türevlendirme yöntemlerine dayalı GC-MS analizleri de uygulanmıştır (Jodynis- Liebert ve Bennasir 2000, Singh ve ark. 2002, Smith ve ark. 2003). 29 2.8. Sudan Boyaları Mayıs 2003’te Fransa’da, Hindistan’dan ithal edilen pul biberlerde Sudan I tespit edildiği yayınlanmıştır (Cornet ve ark. 2006). Bunun üzerine Avrupa birliği hızlı bir alarm sistemi için harekete geçmiş ve alınan Avrupa Birliği komisyon kararı (2003/460/EC) gereğince, gıdalarda kullanımı yasaklanmıştır. Bu komisyon kararı ilk olarak Sudan II, III ve IV (Scarlet Red) boyar maddelerini de içerecek şekilde; daha sonra da sadece pul biberlerle sınırlı kalmayıp pek çok gıda maddesini içerecek şekilde (2004/92/EC, 2005/402/EC) genişletilmiştir (Comission Decision 2003/460/EC, 2004/92/EC). Sudan boyaları kanserojen olduğundan şüphelenilen primer aromatik aminlere metabolize olduğu için Avrupa Birliği ülkelerince, gıda ürünlerinde kullanımına izin verilmemektedir. Bu nedenle Haziran 2003 tarihinden itibaren ithalatçı ve üreticilere ilgili gıda ürünleri için sudan I-IV içermediği yönünde analiz sertifikası sağlama zorunluluğu getirilmiştir (Waite ve ark. 2006). 2005/402/EC sayılı komisyon kararı gereği, palmiye yağı da dahil; kırmızı biber, köri, hint safranı gibi baharatları içeren çok sayıda gıda maddesinin sudan boyaları içermediği yönünde sertifikalı olması gerekmektedir. Kararın alındığı tarihten itibaren İngiltere’de yüz altmıştan fazla gıda maddesinin sudan boyası içerdiği için imha edilmesi istenmiştir (Cornet ve ark. 2006). 2.8.1. Sudan Boyalarının Kimyasal Yapıları S I, S II, S III ve S IV boyar maddelerinin yapıları Çizelge 2.8.1.1.’de görülmektedir. 30 Çizelge 2.8.1.1. Sudan boyalarının kimyasal yapıları ve bazı karakteristik özellikleri HO N H3C N NN CH3 HO SUDAN I (S I) SUDAN II (S II) Molekül formülü= C16H12N2O Molekül formülü= C18H16N2O * *M=248,284 g/mol M=276,337g/mol HO CH3 CH HO3 N N N N N N N N SUDAN III (S III) SUDAN IV (S IV) Molekül formülü= C22H16N4O Molekül formülü= C24H20N4O *M=352,395 g/mol *M=380,449 g/mol *M= Molekül kütlesi KAYNAK: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ 31 2.8.2. Sudan Boyalarının Fiziksel Özellikleri S I, S II, S III ve S IV boyar maddelerinin bazı fiziksel özellikleri Çizelge 2.8.2.1.’de görülmektedir. Çizelge 2.8.2.1. Sudan boyalarının bazı fiziksel özellikleri FİZİKSEL ÖZELLİK Sıcaklık=25°C BOYAR Erime Noktası Sudaki Çözünürlük Buhar Basıncı MADDE (°C ) (mg/L) (mm Hg) SUDAN I 134* 0,674** 7,3×10-8** SUDAN II 166* 0,055** 1,17×10-8** SUDAN III 195* - - SUDAN IV 186** - - * = TEORİK DEĞER ** = TAHMİNİ DEĞER KAYNAK: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ 2.8.3. Sudan Boyalarının IARC Sınıflandırması Sudan I-IV boyar maddelerinin bazı özellikleri ve IARC (Uluslararası Kanser Araştırma Teşkilatı) sınıflandırması Çizelge 2.8.3.1.’de görülmektedir. 32 Çizelge 2.8.3.1. Sudan boyalarının IARC sınıflandırması BOYAR *CAS RN ** (C.I.) BAZI SİSTEMATİK IARC MADDE ve YAYGIN İSİMLERİ SINIFLANDIRMASI 1-Fenilazo-2-naftol 2-Naftalenol,1-(fenilazo)- 2-Naftol,1-(fenilazo)- 1-(Fenilazo)-2-naftalenol 1-Benzoazo-2-naftol S I 842-07-9 12055 1-Fenilazo-beta-naftol Grup 3 2-Hidroksi-1-fenilazonaftalen 2-Hidroksinaftil-1-azobenzen 2-Naftolazobenzen C.I.Solvent Yellow 1-[(2,4-Dimetilfenil)azo]-2-naftalenol 1-(2,4-Ksililazo)-2-naftol 1-(o-Ksililazo)-2-naftol 1-Ksililazo-2-naftol S II 3118-97-6 12140 2-Naftalenol, 1-((2,4-dimetilfenil)azo)- Grup 3 2-Naftol, 1-(2,4-ksililazo)- C.I.Solvent Orange 7 Sudan Red 1-((4-(Fenilazo)fenil)azo)-2-naftalenol 1-((p-(Fenilazo)fenil)azo)-2-naftol 1-(Fenilazofenilazo)-2-hidroksinaftalen 2-Naftol,1-((p-(fenilazo)fenil)azo)- S III 85-86-9 26100 2-Naftalenol,1-((4-(fenilazo)fenil)azo)- Grup 3 Solvent red 23 CI 26100 D & C Red no. 17 1-((2-Metil-4-((2- metilfenil)azo)fenil)azo)-2-naftalenol 2-Naftalenol, 1-((2-metil-4-((2- metilfenil)azo)fenil)azo)- 2-Naftol, 1-((4-(o-tolilazo)-o-tolil)azo)- CI 26105 S IV 85-83-6 26105 Scarlet red Solvent red 24 Grup 3 1-(4-o-Tolilazo-o-tolilazo)-2-naftol 2',3-Dimetil-4-(2- hydroksinaftilazo)azobenzen *CAS RN= CAS kayıt numarası **C.I. =Renk indeksi (Colour index) KAYNAK: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ 33 2.8.4. Sudan Boyalarının Önemi ve Kullanımı İzin verilen gıda renklendiricileri ve maksimum müsaade edilir seviyeleri Council Directive 94/36/EC’de belirtilmektedir. Sudan boyaları ise gıdalarda kullanımına müsaade edilmeyen; buna rağmen illegal olarak kullanılan boyar maddelerdendir (Cornet ve ark. 2006). Azo boyaları sınıfına dahil olan sudan boyaları, iyonik olmayan ve yağda çözünen boyalar olup; tekstil endüstrisinde, kimya endüstrisinde örneğin çözücüleri, yağ ve mumları renklendirmede, benzin, dizel, makine yağı, plastik ve polimerlerde, baskı mürekkepleri, dövmeler, ayakkabı ve döşeme cilalarında ve boya ürünlerinde yaygın olarak kullanılırken; gıdalarda da kullanılabilmektedir. (Calbiani ve ark. 2004, Puoci ve ark. 2004, Zhang ve ark. 2005, Cornet ve ark. 2006). Örneğin Sudan I, şiddetli kırmızı-turuncu rengi nedeni ile gıdalarda; özellikle pul biberlerde katkı maddesi olarak kullanılan sentetik azo boyasıdır. Ayrıca; et türevi gıdaların tipik kırmızı renginin korunmasında da Sudan I kullanılabildiği belirtilmektedir (Mazzetti ve ark. 2004, Puoci ve ark. 2004). Pek çok sos çeşidi, salam, zeytinyağı gibi gıdalarda pul biberler baharat olarak kullanılmaktadır (Mazzetti ve ark. 2004). Bu boyalara pul biberlerde kirlilik düzeyinde rastlanabildiği için; bu kontamine pul biberlerinin kullanıldığı çorbalar, soslar ve hazır yemekler sudan boyaları kaynağı haline gelirler. Çin ve Avrupa’da gıda ürünlerinde sudan boyalarının varlığı tespit edilmiş ve bu durum tüketiciler arasında panik yaratmıştır. Bu nedenle kompleks matrikslerden bu boyar maddelerin tespit ve tayini için hassas, seçici ve doğru analitik metot geliştirilmesi gerekliliği ortaya çıkmıştır (Zhang ve ark. 2005). 2.8.5. Sudan Boyalarının Toksisiteleri Sudan I-IV olarak bilinen bu boyar maddelerin, laboratuvar çalışmaları ile, insanlar ve hayvanlar üzerindeki kanserojen etkileri tespit edilmiştir. Sudan boyaları insanlar açısından kanserojendir ve bu nedenle de hiçbir düzeyi insanlar için güvenilir değildir. Buna rağmen pul biberlerde kirlilik düzeyinde, bazı baharatlar ve bunların kullanıldığı fırınlanmış gıdalarda düşük seviyelerde bulunabilmektedirler (Tateo ve Bononi 2004, Zhang ve ark. 2005). 34 Sudan I müsaade edilen bir boya olmamakla birlikte genotoksik kanserojen olarak değerlendirilmiştir (Calbiani ve ark. 2004). Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalarda karaciğerde veya üriner sistemde tümör oluşumuna neden olduğu in vitro ve in-vivo çalışmalarla kanıtlanmıştır (Stiborova ve ark. 1995, Stiborova ve ark. 1998, Stiborova ve ark. 1999, Mazzetti ve ark. 2004). Cytochrome P450 1A1 enzimi ile insan karaciğerindeki kanserojenik etkisi de incelenmiştrir (Stiborova ve ark. 2002, Stirobova ve ark. 2005). Bu nedenle gıda maddelerinde hiçbir amaçla ve hiçbir seviyede kullanımına izin verilmemektedir. Sudan II, Sudan I’in dimetil türevidir ve fare dokularına enjekte edilmesi sonucu özellikle mesane kanseri gelişimi gözlenmiştir. Sudan I, II, III ve IV, IARC tarafından grup 3 kategorisinde belirtilmiştir; yani insanlara doğrudan kanserojen etkileri yoktur (Calbiani ve ark. 2004). Bununla birlikte Sudan I’in gıda maddelerinde kullanımı, gıda maddeleri yönetmeliklerinde yasaklanmıştır (Ma ve ark. 2006). 2.8.6. Sudan Boyalarının Ekstraksiyonu ve Analizi Kırmızı bibere dayalı gıda maddelerinden ekstrakte edilebilir renklendirici pigment maddelerinin ekstraksiyonu için literatürde; aseton, mikrodalga ekstraksiyonu, su-aseton, dioksan, etanol, metanol, tetrahidrofuran karışımları ile; ve süperkritik karbondioksit (CO2) ekstraksiyonu ile ilgili çalışmalar mevcuttur (Csiktusnadi Kiss ve ark. 2000, Krajayklang ve ark. 2000, Perva-Uzunalic ve ark. 2004,). İlgili literatür verilerinde de belirtildiği gibi sudan boyalarının ekstraksiyonu için uygun çözücüler; aseton, etanol, asetonitril, dimetilsülfoksit, dimetilformamid (DMF) olarak belirtilirken (Ma ve ark. 2006, Cornet ve ark. 2006, Wu ve ark. 2006); tespit ve tayinleri için yaygın olarak kullanılan metotlar ise UV-VIS, LC ve LC-MS teknikleridir; ayrıca gıda örneklerinde özellikle eser düzeyde bulunan Sudan boyası kalıntılarının analizi için LC- MS uygun bir teknik olarak belirtilmiştir (Calbiani ve ark. 2004, Ghanadzadeh ve ark. 2000, Zhang ve ark. 2005, Ma ve ark. 2006). LC tekniği Avrupa komisyonu tarafından da önerilmektedir. Ayrıca LC-ESI-MS (sıvı kromatografisi-elektrosprey iyonlaştırma-kütle spektrometresi) tekniği de doğrulama amaçlı olarak literatürde kullanılmaktadır (Mazzetti ve ark. 2004, Wu ve ark. 2006). Literatürde yaygın olarak çalışılan Sudan boyası olan S I’ in varlığını tespit etmek için HPLC, GC-MS gibi 35 değişik metotlar geliştirilmiştir. Bununla birlikte eğer eser düzeyde kullanılmış ise tespiti için LC-MS/MS (sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi/kütle spektrometresi) gibi daha pahalı cihazlar gerekmektedir (Puoci ve ark. 2004). Bu boyar maddenin ekstraksiyonu için benzen veya toluen kullanıldığına yönelik veriler mevcuttur. Örneğin bir çalışmada, sıvı-sıvı ekstraksiyonu ile pul biberlerden etanol ile ekstrakte edilirken; metanolün de aynı ya da farklı gıda matriksleri için kullanılabileceği önerilmektedir Başka bir çalışmada ise soxtec ekstraksiyon sistemi ile gıda örneklerinden petrol eteri- etanol karışımı ile ekstrakte edilmiştir (Mazzetti ve ark. 2004). Gıdalardaki sentetik boyar maddelerden olan Sudan I ve Sudan III varlığının araştırıldığı bir çalışmada; ayırma ve tespit için kağıt kromatografisi, kantitatif tayin için de spektrofotometrik yöntem uygulanmış; analizlenen öneklerden bazılarında bu boyar maddelerinin var olduğu tespit edilmiştir (Tripathi ve ark. 2005). S I’ in düşük düzeyde olması durumunda, UV-VIS spektrumuna dayalı HPLC tekniği ile bu boyar maddenin karakterizasyonu gerçekleştirilememektedir (Tateo ve Bononi 2004). Yaygın olarak kullanılan LC tekniği, yağda çözünen boyalar sınıfına dahil edilen Sudan boyalarının, spektrumun görünür bölgesindeki absorbans özelliklerine dayanır. Boyar maddelerin yapısal özellikleri nedeni ile UV-VIS spektrumlarına dayalı HPLC analizi ile ayrımları zordur (Ma ve ark. 2006). Sudan boyalarının tayinlerine yönelik TLC, LC-ESI- MS/MS, HPLC-APCI-MS (yüksek basınçlı sıvı kromatografisi-atmosferik basınç kimyasal iyonlaştırma-kütle spektrometresi), HPLC-DAD-ESI-MS (yüksek basınçlı sıvı kromatografisi-diyod serisi dedektör-elektrosprey iyonlaştırma-kütle spektrometresi, APCI–MS (atmosferik basınç kimyasal iyonlaştırma-kütle spektrometresi) ve izotop seyreltme, GPC (jel geçirgenlik kromatografisi) ile ön işlem sonrası HPLC-MS (yüksek basınçlı sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi) tayini, IR, plasmon rezonans ışık saçılma teknikleri literatürde dikkat çekmektedir (Marshall 1977, Di Donna ve ark. 2004, Mazzetti ve ark. 2004, Tateo ve Bononi 2004, Ma ve ark. 2006, Wu ve ark. 2006). Bir çalışmada, palmiye yağındaki bu boyaların kalitatif analizleri için TLC tekniği belirtilmekle birlikte; eş zamanlı tayinleri için HPLC-PDAD (yüksek basınçlı sıvı kromatografisi-fotodiyod serisi dedektör) yöntemi uygulanmıştır (Cornet ve ark. 2006). Azo grubu boyar maddeler içinde yer alan Sudan boyaları fonksiyonel fenol grupları üzerinden yükseltgenirken aynı redoks reaksiyonu vermeleri nedeni ile toplam Sudan miktarı belirlenebilmiştir (Wu ve ark. 2006). 36 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. MATERYAL 3.1.1. Çalışmada Kullanılan Aletler 3.1.1.1. Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi GC-MS analizleri için Shimadzu marka GC-17A model gaz kromatografisi, dedektör olarak QP-5000 model kütle spektrometresi; ayrıca AOC-20i otomatik enjektör sistemi kullanılmıştır. Analitik kolon; 30 m uzunluğunda, 0,25 mm iç çap ve 0,25 µm film kalınlığına sahip HP-5 kapiler kolondur. Salça bileşenlerinin aydınlatılması için Shimadzu marka GC-17A model gaz komatografisi, dedektör olarak QP-5050A model kütle spektrometresi; ayrıca AOC-20i otomatik enjektör sistemi kullanılmıştır. Bu analizde ise; 30 m uzunluğunda, 0,25 mm iç çap ve 0,25 µm film kalınlığına sahip Optima-5-MS kolonundan yararlanılmıştır. 3.1.1.2. Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi Çalışmada, karşılaştırma metodu olarak Agilent marka 1100 LC-MSD Trap SL model LC-MS kullanılmıştır. Analitik kolon 30 mm uzunluğunda 2,1 mm iç çap ve 3,5 mikron gözenek çapına sahip Zorbax SB-C18 kolonudur. 3.1.1.3. Ultraviyole-Görünür Bölge Spektrofotometresi UV-VIS ölçümleri Varian marka Cary 5000 model UV-VIS-NIR spektrofotometre ile alınmış olup; ölçümlerde 1 cm’lik kuvartz hücrelerden yararlanılmıştır. Çalışma aralığı 200-900 nm olarak taranmıştır. Ayrıca; katı-faz ekstraksiyonu çalışmalarında Shimadzu marka UV-2100 model spektrofotometre, 1cm’lik kuvartz hücreler ile ve 220-800 nm tarama aralığında çalışılmıştır. UV-VIS- NIR spektrofotometresinde türev alma olanağı mevcuttur. 37 3.1.1.4. pH-Metre Çalışmada, pH 526 model Multical marka pH-metre kullanılmıştır. 3.1.1.5. Ultrasonik Karıştırıcı Çalışmada, ELMA Ultrasonic LC 30 ile Ultrasonic LC 30 H marka ve modellerinde ultrasonik karıştırıcılar kullanılmıştır. 3.1.1.6. Etüv Deneysel işlemler sırasında, hava sirkülasyonlu Heraeus marka etüv kullanılmıştır. 3.1.1.7. Döner Vakumlu Buharlaştırıcı Deneysel işlemler sırasında, BÜCHI Vacuum Controller V-800, Rotavapor R- 200, BÜCHI Vac V-500, BÜCHI Heating Bath B-490 parçalarından oluşan BUCHI marka döner vakum buharlaştırıcı; 500 mbar basınçta, 50 °C ’de, çevirme hızı 30 olacak şekilde ayarlanarak kullanılmıştır. 3.1.1.8. Terazi Deneysel işlemler sırasında, ±0,00001 g duyarlıklı Scaltec SBC 21 marka ve modelindeki analitik terazi ile ±0,0001 g duyarlıklı Gec Avery marka analitik terazi kullanılmıştır. 3.1.1.9. Santrifüj Aleti Çalışmada, MSE MISTRAC marka 2000 model santrifüj cihazı kullanılmış; ve bu cihaz, deneysel işlemler sırasında 2500 devir/dak. hızla çalıştırılmıştır. 38 3.1.1.10. Katı Faz Ekstraksiyon Sistemi Kalitatif LC-MS analizlerinde, BAKER’-10 SPE System (J.T.Baker Chemical Company, Phillipsburg, NJ 08865, USA) katı faz ekstraksiyon sistemi, Varian Bond Elut C18 (100 mg/1,5 ml) katı faz ekstraksiyon kolonları ile birlikte kullanılmıştır. Ayrıca; Sudan boyalarının katı faz ekstraksiyonu çalışmalarında yine aynı katı faz ekstraksiyon kolonları ile birlikte Watson-Marlow 505S peristaltik pompadan yararlanılmıştır. 3.1.1.11. Saf Su Cihazı Çalışmada kullanılan saf su, Milli-Q Millipore cihazı kullanılarak hazırlanmıştır. 3.1.2. Çalışmada Kullanılan Kimyasallar ve Çözeltiler 3.1.2.1. Kimyasallar 3.1.2.1.1. Analitik Saflıktaki Kimyasallar • ACROS ORGANICS, 147060250, C.A.S.= 842-07-9, EINECS= 212-668-2, Lot=A019108001, Sudan I (C16H12N2O), M=248,28 g/mol) ACROS ORGANICS, 190150250, C.A.S.= 3118-97-6, EINECS= 221-490-4, Lot=A005453001, Sudan II (C18H16N2O), M=276,33 g/mol) ACROS ORGANICS, 419800250, C.A.S.= 85-86-9, EINECS= 201-638-4, Lot=A019579701, Sudan III (C22H16N4O), M=352,39 g/mol) ACROS ORGANICS, 419810250, C.A.S.= 85-83-6, EINECS= 201-635-8, Lot=A019554501, Sudan IV (C24H20N4O), M=380,45 g/mol) Merck, 1.01260 Anilin (C6H5NH2, 1L=1,02 kg, M=93,13 g/mol) Merck, 1.00013.2500, Aseton (CH3COCH3, 58,08 g/mol) Riedel-de Haen, 24201, Aseton (1L=0,790-0,792 kg, M=58,08 g/mol) 39 Merck, 1.00030, Asetonitril (CH3CN, 1L=0.786 kg, M=41,05 g/mol) Riedel-de Haen 05003, Derişik amonyak (der.NH3, %26, d=0.892g/cm3 - 0.919g/cm3, M=17,0304 g/mol) PANREAC, 131020.1612, Derişik hidroklorik asit (der.HCl, %37, d=1,19 g/ml, M=36,46 g/mol) Riedel-de Haen 07006, Derişik nitrik asit (der.HNO3, %65, d=1,40 kg/L, M=63,01 g/mol) Merck, 1.00864, Etil asetat (CH3COOC2H5, 88,10 g/mol) LACHEMA, 51038 0800, Etil asetat (1L=0,90 kg, M=88,10 g/mol) Merck, 1.15093.0001 Extrelut NT Refill pack kolon dolgu materyali, Extrelut NT 20. Merck, 1.00264.1000, Formik asit (CH2O2, M=46,03 g/mol) Merck, 1.06009.2500, Metanol (GC-MS analizleri için, CH3OH, M=32,04 g/mol) Merck, 1.06007.2500, Metanol (LC-MS analizleri için) DOP, 13.00001.2500, Metanol (1L=0,79 kg, 32,04 g/mol) Merck, 1.04368.2500 n-hekzan (CH3(CH2)4CH3, 1L=0,66 kg, M=86,18 g/mol) Merck, 1.09437.1000, pH=6 (20°C ), sitrat tamponu Merck, 1.09435.1000, pH=4 (20°C ), sitrat tamponu Merck, 1.06507.0500, Sodyum ditiyonit (Na2S2O4, M=174,11 g/mol) Merck, 1.01843.2500, t-butil metil eter ((CH2)3COCH3, M=88,15 g/mol) Merck, 6432.1000, Trisodyum sitrat dihidrat (C6H5Na3O7.2H2O, M=294,10 g/mol) Azot gazı (%99,998 saflıkta) 3.1.2.1.2. Sarf Malzemeler Filtrak marka siyah bant süzgeç kağıdı 0,45 µm PVDF filtre Screw-Cap marka 1,8 ml hacimli vial 20 ml hacimli, ısıya dayanıklı vida kapaklı renkli vial 250 ml’ lik armudi balon 40 50 ml’ lik falcon tüp 100-1000 µl hacim aralığında çalışabilen Eppendorf mikropipet 10-100 µl hacim aralığında çalışabilen Eppendorf mikropipet Varian, Bond Elut C18 katı faz ekstraksiyon kolonları (100 mg/1,5 ml) Pastör pipet 3.1.2.2. Çözeltiler 3.1.2.2.1. UV-VIS Analizlerinde Kullanılan Boya Çözeltilerinin Hazırlanması a) Katı Faz Ekstraksiyonu Çalışmaları İçin Boya Çözeltilerinin Hazırlanması Asetonda 200 mg/L stok S I, S II, S III ve S IV çözeltileri hazırlanmıştır. Bunun için 1,1-1,6 mg aralığında boyar madde tartılıp; uygun hacimde (5,5-8 ml) aseton ile ultrasonik karıştırıcıda çözülmüştür. Bu stok çözelti metanol, asetonitril, etil asetat, su, aseton ve hekzan kullanılarak 7 mg/L ve 10 ml hacmine seyreltilmiştir. 200 mg/L stok boya çözeltileri; su, hekzan, metanol ve aseton kullanılarak 1 mg/L, 35 ml hacmine seyreltilmiştir. Hazırlanan 1 mg/L konsantrasyonlu çözeltiler ile metanolde 7 mg/L’ lik çözeltiler, Sudan boyalarının katı faz ekstraksiyonunda uygun çözücü belirlenirken; suda 1 mg/L’lik boya çözeltileri ile metanol, asetonitril ve etil asetatta 7 mg/L’lik çözeltiler ise uygun elüsyon çözücüsü belirlenirken kullanılmıştır. b) Çözünürlüğün pH İle Değişiminin İncelenmesi İçin Boya Çözeltilerinin Hazırlanması UV-VIS analizleri için, 100 mg/L konsantrasyon değerinde S I, S II, S III ve S IV çözeltileri hazırlanmıştır. Bunun için her bir boyar maddeden 25 mg tartımlar alınarak bir miktar saf suda çözülüp 250 ml’ye saf su ile tamamlanmıştır. Balonlara magnetik karıştırıcı konularak karanlıkta, 14 saat karıştırıcıda karıştırılmış; çözeltiler bu süre sonunda bir saat ultrasonik karıştırıcıda tutulduktan sonra siyah bant süzgeç kağıdından süzülmüştür. Her bir çözeltinin orijinal pH değeri ölçüldükten sonra; der. 41 HNO3, 0,5 N HNO3, der. NH3, ve 0,5 N NH3 çözeltileri kullanılarak pH’ları, pH=1,5-4- 6-8-10-12 değerlerine ayarlanmıştır. Bu şekilde hazırlanan çözeltilerin absorbansları, 200-900 nm aralığında taramalı olarak UV-VIS spektrofotometresi ile ölçülmüştür. c) pH Ayarlanmasında Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanması Analizler sırasında, pH ayarlanması için iki farklı çözelti kullanılmıştır: 0,5 N HNO3 çözeltisinin hazırlanması: Derişik nitrik asit çözeltisinden 3,46 ml alınarak saf su ile 100 ml’ ye tamamlanır. 0,5 N NH3 çözeltisinin hazırlanması: Derişik amonyak çözeltisinden 3,67 ml alınarak saf su ile 100 ml’ ye tamamlanır. 3.1.2.2.2. GC-MS Analizlerinde Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanması a) Sodyum Ditiyonit İndirgeme Çözeltisinin Hazırlanması Çalışmada, 200 mg/ml konsantrasyonlu taze hazırlanmış sodyum ditiyonit (SD) indirgeme çözeltisi kullanılmıştır. Bu çözelti, 600 mg sodyum ditiyonit katısının beherde, 3 ml saf suda çözülmesi ile hazırlanmıştır. b) pH=1,5 Tampon Çözeltisinin Hazırlanması Ortam pH değerini pH=1,5’ a ayarlamak için aşağıda belirtildiği şekilde tampon çözelti hazırlanmıştır (Bobrov 1975) 0,1 M sodyum sitrat (A çözeltisi, 29,410 g C6H5Na3O7.2H2O bir miktar saf suda çözülüp 1 L’ ye saf su ile seyreltilerek hazırlanmıştır.) ve 0,1 M HCl (B çözeltisi, derişik hidroklorik asit çözeltisinden 0,83 ml alınarak saf su ile 100 ml’ye tamamlanarak hazırlanmıştır.) çözeltileri hazırlanmıştır. A çözeltisinden 22,2 ml alınıp 0,1 M HCl ile 100 ml’ye seyreltilmiş; yine 0,1 M HCl ile pH değeri tam olarak pH=1,5’ a ayarlanmıştır. 42 3.1.2.2.3. LC-MS Ölçümlerinde Kullanılan Boya Çözeltilerinin Hazırlanması LC-MS analizleri için S I, S II, S III ve S IV boyar maddelerinin her birinden, metanolde 100 mg/L konsantrasyonlu stok çözeltiler hazırlanmıştır. Bu stok çözeltilerden yine metanol kullanılarak seyreltme ile 20 mg/L’ lik çözeltiler hazırlanmış ve LC-MS’ de gerçek örnekler öncesi cihaza verilerek, her bir boyar madde için alıkonma zamanları belirlenmiştir. 3.2. YÖNTEM 3.2.1. KATI FAZ EKSTRAKSİYONU a) Sudan Boyaları İçin Çözücü Seçimi S I, S II, S III, S IV boyar maddeleri için katı faz ekstraksiyonu ile deriştirmenin etkinliğini incelemek amacı ile öncelikle en uygun çözücünün belirlenmesi işlemi gerçekleştirilmiştir. Seçilen, polariteleri birbirinden farklı dört çözücü ile uygulanan deneysel işlemler sırası ile Şekil 3.2.1.1.’ de belirtildiği gibidir. 43 Asetonda 200 mg/L Sudan boyar maddesi Metanolde Suda Metanolde Asetonda Hekzanda 7 mg/L 1 mg/L 1 mg/L 1 mg/L 1 mg/L (10 ml) (35 ml) (35 ml) (35 ml) (35 ml) A çözeltisi B çözeltisi C çözeltisi D çözeltisi E çözeltisi C18 katı faz kolonları 3 ml metanol ile şartlandırılır Kolonlardan 1,5 ml örnek çözeltisi çözücüsü (su, metanol, aseton veya hekzan) geçirilir B, C, D ve E çözeltileri kolonlardan 15 devir/dak. hızla kuruluğa kadar geçirilir Kolondaki örnekler 5 ml metanol ile elüe edilir UV-VIS spektrofotometresi ile taramalı olarak ölçüm yapılır Şekil 3.2.1.1. Sudan boyaları için uygun çözücü belirlenmesine yönelik katı faz ekstraksiyon şeması 44 Metanolde hazırlanmış 7 mg/L konsantrasyonundaki her bir standart boya çözeltisinin UV-VIS spektrumlarındaki maksimum absorbans değerleri, katı faz ekstraksiyonu uygulanmış ve metanol ile kolonlardan elüe edilmiş çözeltiler ile karşılaştırılmış ve standart çözeltilere en yakın absorbans değerinin gözlendiği çözücü, en uygun çözücü olarak belirlenmiştir. b) Sudan Boyaları İçin En Uygun Elüsyon Çözücüsünün Belirlenmesi S I, S II, S III ve S IV boyar maddelerinin her biri için en uygun çözücü belirlendikten sonra belirlenen bu çözücüde hazırlanan çözeltiler bu kez de seçilen farklı polaritede elüsyon çözücüleri kullanılarak Şekil 3.2.1.2.’ de belirtildiği gibi çalışılmıştır. Kolona yüklenen örneklerin elüsyonu için 5 ml asetonitril ve etil asetat kullanılmış; ayrıca bir önceki basamakta elde edilen metanol elüsyonu spektrumlarından bu basamakta da yararlanılmıştır. Boyar maddelerin UV-VIS’ deki maksimum absorbans değerleri, elüsyon çözücüsüne karşılık gelen standart çözeltilerinin absorbans değerleri ile karşılaştırıldığında; standart çözelti absorbansına en yakın absorbans şiddetinin gözlendiği çözücü en uygun elüsyon çözücüsü olarak belirlenmiştir. 45 Asetonda 200 mg/L Sudan boyar maddesi Metanolde Asetonitrilde Etil asetatta Bir önceki basamakta belirlenen 7 mg/L 7 mg/L 7 mg/L en uygun çözücüde, 1 mg/L (35 (10 ml) (10 ml) (10 ml) ml) Sudan I, II, III, IV boyaları A çözeltisi B çözeltisi C çözeltisi (sırası ile D,E,F,G çözeltileri) C18 katı faz kolonları 3 ml metanol ile şartlandırılır Kolonlardan 1,5 ml örnek çözeltisi çözücüsü geçirilir D, E, F ve G çözeltileri kolonlardan 15 devir/dak. hızla kuruluğa kadar geçirilir Kolondaki Kolondaki Kolondaki örnekler 5 ml örnekler 5 ml örnekler 5 ml metanol ile asetonitril ile etil asetat ile elüe edilir elüe edilir elüe edilir UV-VIS spektrofotometresi ile taramalı olarak ölçüm yapılır. Şekil 3.2.1.2. Sudan boyaları için uygun elüsyon çözücüsü belirlenmesine yönelik katı faz ekstraksiyon şeması 46 3.2.2. Kalitatif GC-MS Analizleri a) S I Boyar Maddesi İle Yapılan Kalitatif Çalışma Kimyasal indirgeme işlemi uygulanmamış standart S I boyası ile kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış S I boyar maddesinin GC-MS analizine yönelik şemalar Şekil 3.2.2.1. ve Şekil 3.2.2.2.’ de verilmiştir. Metanolde 500 mg/L S I çözeltisi GC-MS analizi Şekil 3.2.2.1. S I’ in GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması 47 17 ml pH=6 sitrat tamponu (ST) 20 mg S I eklenir Etüvde 70°C’ de 30 dak. ısıtılır 200 mg/ml SD çözeltisi eklenir Etüvde 70°C’ de 30 dak. ısıtılır Oda sıcaklığına soğutulur ve extrelut kolona aktarılır Extrelut kolondan 80 (4×20)ml t-butil metil eter (t-BME) ile ekstrakte edilir Önce döner vakum buharlaştırıcıda yoğunlaştırılır, daha sonra azot atmosferinde kuruluğa kadar uçurulur Kalıntı, 2 ml metanol fazına alınır; standart çözelti ile aynı konsantrasyon değerine seyreltilir ve GC-MS ile analiz edilir Şekil 3.2.2.2. Kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış S I’ in GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması KAYNAK: ASU B-82.02/2. 1998-01. Nachweis der Verwendung Bestimmter Azofarbstoffe aus textilen Bedarfsgegenständen. Beuth Verlag, 10772 Berlin. 48 b) S II Boyar Maddesi İle Yapılan Kalitatif Çalışma Kimyasal indirgeme işlemi uygulanmamış standart S II boyasının analiz şeması Şekil 3.2.2.3.’ te verilmiştir. S I boyar maddesi için Şekil 3.2.2.2.’ de verilen işlemler; kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış S II boyar maddesinin GC-MS analizi için ve 20 mg S II boyası kullanılarak uygulanmıştır. Metanolde 500 mg/L S II çözeltisi GC-MS analizi Şekil 3.2.2.3. S II’ nin GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması c) S III Boyar Maddesi İle Yapılan Kalitatif Çalışma Kimyasal indirgeme işlemi uygulanmamış standart S III boyasının analiz şeması Şekil 3.2.2.4.’ te verilmiştir. S I boyar maddesi için Şekil 3.2.2.2.’ de verilen işlemler; kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış S III boyar maddesinin GC-MS analizi için ve 20 mg S III boyası kullanılarak uygulanmıştır. Metanolde 600 mg/L S III çözeltisi GC-MS analizi Şekil 3.2.2.4. S III’ ün GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması 49 d) S IV Boyar Maddesi İle Yapılan Kalitatif Çalışma Kimyasal indirgeme işlemi uygulanmamış standart S IV boyasının analiz şeması Şekil 3.2.2.5.’ te verilmiştir. S I boyar maddesi için Şekil 3.2.2.2.’ de verilen işlemler; kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış S IV boyar maddesinin GC-MS analizi için ve 20 mg S IV boyası kullanılarak uygulanmıştır. Metanolde 1000 mg/L S IV çözeltisi GC-MS analizi Şekil 3.2.2.5. S IV’ ün GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması 50 e) Gerçek Örnek (Salça) Çalışması Salça örneğine uygulanan deneysel işlemler Şekil 3.2.2.6.’da gösterilmiştir. 17 ml pH=6 ST Etüvde 70°C ’ de 30 dak. ısıtılır 5 g salça eklenir Etüvde 70°C’ de 30 dak. ısıtılır 200mg/ml SD çözeltisi eklenir Etüvde 70°C’ de 30 dak. ısıtılır Oda sıcaklığına soğutulur Extrelut kolona aktarılır,160 (8×20)ml t-BME ile ekstrakte edilir Önce döner vakum buharlaştırıcıda yoğunlaştırılır, daha sonra azot atmosferinde kuruluğa kadar uçurulur Kalıntı, 2 ml metanol fazına alınır GC-MS ile analiz edilir Şekil 3.2.2.6. Salça örneğinin GC-MS analizine yönelik deneysel işlem şeması 51 f) Karışım Halindeki S I, S II, S III ve S IV Boyar Maddelerinin Analizi Karışım halinde S I, S II, S III ve S IV boyar maddelerin kalitatif analizlerinin mümkün olup olmadığını belirlemek için; her biri yaklaşık 0.06 mmol olan S I-S IV boyalarının karışımı 20 mg S I yerine kullanılarak, ayrıntıları Şekil 3.2.2.2.’ de belirtilen prosedüre göre çalışılmıştır. 3.2.3. Kalitatif LC-MS Analizleri a) LC-MS Analizi İçin Gerçek Örnek Çalışması Yaklaşık 2 g salça örnekleri 50 ml’ lik falcon tüplere tartılmış; dördüne, 0,005 g Sudan boyar maddeleri eklenirken bir örneğe de karışım çalışması için her bir boyar maddeden 0,005 g eklenmiştir. Örnekler 25 ml aseton ile 2500 devir/dak. hızda 15 dak. santrifüjlenmiştir. C18 mini kolonlar katı faz ekstraksiyon sistemine takılarak 2 ml metanol ile vakum altında şartlandırılmıştır. Çözücü tamamen uzaklaştıktan sonra örneklere ait santrifügatlar kolonlara yüklenmiş, son damlaya kadar süzülmesi beklendikten sonra 10 ml metanol ile elüsyon gerçekleştirilmiştir. LC-MS analizi, Çizelge 3.2.3.1.’de verilen şartlarda uygulanmıştır. Çizelge 3.2.3.1. LC-MS analiz şartları Metanolde % 0,1 formik asit (*h/h) /Sulu Elüent formik asit,% 0,1 (h/h) [97/3 h/h] Akış Hızı 0,2 ml/dak. İyon Modu Pozitif (ESI iyon kaynağı) Enjeksiyon Hacmi 10 µL/dak. Kolon Sıcaklığı 35°C Nebulizer (Sprey Basıncı) 30 psi Kuru Gaz (N2) 5 L/dak. Kurutma sıcaklığı 280°C Tarama Aralığı 70-400 (m/z) Hedef Kütle 277 (m/z) *h= HACİM 52 3.2.4. Kantitatif Analiz 3.2.4.1. Örnek Hazırlama Prosedürü a) 20 mg Sudan Boyası İle Yapılan Kantitatif Çalışma Her bir boyar maddeden 20 mg tartım alınarak Şekil 3.2.2.2.’de belirtilen işlemler uygulanmıştır. Elde edilen örnekler uygun derişimlerde seyreltilmiş ve her birinin GC-MS kromatogramında gözlenen parçalanma ürünlerine ait kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur. b) Gerçek Örnekler İçin Ekstraksiyon Çalışması Salçadan Sudan boyalarının alınması için gerçek örneklere aseton ekstraksiyonu uygulanmıştır. Yaklaşık 5 g salça örneği 50 ml’ lik falcon tüplerde 10 ml aseton içerisine alındıktan sonra 2500 devir/dak. hızda 15 dak. santrifüjlenmiştir. 4 ml santrifügat alınarak üzerine 13 ml pH=6 tamponu eklenmiş ve Şekil 3.2.2.2.’de belirtilen işlem basamakları uygulanmıştır. Kalıntı, 2 ml metanolde çözülerek pastör pipet ile viale alınmış ve GC-MS ile analiz edilmiştir. c) Gerçek Örneklerde Geri Kazanımın Belirlenmesi Yaklaşık 5 g , dört salça örneğine 50 ml’ lik falcon tüplerde 20 mg S I, S II, S III ve S IV boyar maddeleri ayrı ayrı eklenmiş ve her bir örneğe 10 ml aseton ilave edilerek, 2500 devir/dak. hızda 15 dak. santrifüjlenmiştir. Bu şekilde elde edilen örneklerin her birinden 4 ml santrifügat alınmış ve üzerlerine 13 ml pH=6 tamponu eklenerek Şekil 3.2.2.2.’de belirtilen işlemler uygulanmıştır. Her bir kalıntı 10 ml metanolde çözülmüş ve başlangıç boyar madde tartım değerleri temel alınarak S I için 100 mg/L, S II için 200 mg/L, S III için 550 mg/L ve S IV için 450 mg/L konsantrasyonuna seyreltilerek GC-MS ile analiz edilmiştir. Bu analiz sonucunda parçalanma ürünlerine ait olan ve kromatogramlardan elde edilen alan değerleri, 20 mg 53 standart boyar madde ile çalışıldığında parçalanma ürünleri için elde edilen kalibrasyon eğrilerine ait denklemlerde yerine konularak deneysel konsantrasyon değerleri; oradan da yüzde geri kazanım (%R) değerleri belirlenmiştir. d) pH Değişiminin Geri Kazanım Üzerine Etkisinin İncelenmesi pH değişiminin etkisini görmek amacı ile UV-VIS taramalı absorbans ölçümlerinden elde edilen maksimum absorbans değerlerine göre; Sudan I boyar maddesine pH=1,5’ te, Sudan II boyar maddesine pH=1,5’ te ısıl işlem uygulayarak ayrıca pH=6’ da ısıl işlem uygulamadan ultrasonik karıştırıcıda, Sudan III boyar maddesine pH=1,5’te, Sudan IV boyar maddesine ise pH=1,5 ve pH=4’ te indirgeme işlemi uygulanmıştır. Analizler sonrası GC-MS kromatogramlarında gözlenen parçalanma ürünlerine ait alan değerleri, pH=6’ da elde edilen alan değerleri ile karşılaştırılarak her bir boyar madde için en uygun pH değeri belirlenmiştir. e) Kemometrik Yöntem İle En Uygun Şartların Belirlenmesi Optimizasyon için merkezi kompozit dizayn yöntemi kullanılarak, pH=6 ortamında en düşük yüzde geri kazanım veren Sudan III boyar maddesinin tayinine sodyum ditiyonit derişimi (x1) ve reaksiyon sıcaklığının (x2) etkisi incelenmiştir. Çizelge 3.2.4.1.1.’de kodlanmış değerlerden oluşan merkezi kompozit dizayn ve Çizelge 3.2.4.1.2.’de gerçek deneysel değerlerin verildiği dizayn setleri gösterilmiştir. Çizelge 3.2.4.1.1. Merkezi kompozit dizayn (kodlanmış değerler) -1,41 -1 0 +1 +1,41 x1 0,295 0,5 1 1,5 1,705 x2 21,8 30 50 70 78,2 54 Çizelge 3.2.4.1.2. Merkezi kompozit dizayn (gerçek değerler) Kod Değer Deneysel Değer Deney No x1 x2 x1 (M) x2 (°C ) 1 -1 -1 0,5 30 2 +1 -1 1,5 30 3 -1 +1 0,5 70 4 +1 +1 1,5 70 5 -1,41 0 0,295 50 6 +1,41 0 1,705 50 7 0 -1,41 1 21,8 8 0 +1,41 1 78,2 9 0 0 1 50 Çizelge 3.2.4.1.2. verileri kullanılarak en uygun SD derişimi ve sıcaklık değerinin belirlenmesi çalışmalarında, bu iki faktör dışındaki tüm deneysel parametreler her bir deney için sabittir. Her örneğin GC-MS kromatogramlarında parçalanma ürünlerine ait alan değerleri kullanılarak excel programında hesaplamalar yapılmıştır. y = b1x1 + b2x2 + b11x 2 1 + b 222x2 +b12x1x2 denkleminin x1 ve x2’ ye göre türevleri alınıp sıfıra eşitlendiğinde bu değişkenler teorik olarak x1= 0,5904 ve x2 = -0,2507 olarak belirlenmiştir. Daha sonra gerçek değerlerin belirlenmesi amacı ile x1=(x1(gerçek)-0 değeri(orta değer))/(0 değeri ile ±1 arasındaki fark) ve x2=( x2(gerçek)-0 değeri)/(0 değeri ile ±1 arasındaki fark) eşitliklerinden yararlanılmıştır. 3.2.4.2. Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometresi Çalışma Koşulları Örnek analizi için kalitatif ve kantitatif amaçlı olmak üzere genel olarak iki farklı GC-MS programı kullanılmış olup bu programlar sırası ile aşağıda özetlenmiştir. 55 a) Kalitatif Analiz Programı Kalitatif analiz işlemlerinde iki farklı model GC-MS ile çalışılmış ve iki farklı program üzerinden örnek analizleri gerçekleştirilerek sonuçlar buna göre değerlendirilmiştir. i) Kalitatif Analiz Programı-1 Şekil 3.2.2.5.’te ayrıntıları belirtilen salça çalışması sonucu elde edilen örnek, Çizelge 3.2.4.2.1., Çizelge 3.2.4.2.2. ve Çizelge 3.2.4.2.3.’te belirtilen GC-MS analiz şartlarında çalışılmıştır. Çizelge 3.2.4.2.1. Kalitatif salça çalışması için kolon sıcaklık programı GC sıcaklık programı Sıcaklık artışı Sıcaklık Bekleme süresi (°C/dak.) (°C) (dak.) - 60 1,00 10 190 0,00 3 235 0,00 10 260 5,00 10 280 10,00 Çizelge 3.2.4.2.2. Kalitatif analiz programı-1 için gaz kromatografisi (GC) şartları Enjeksiyon Sıcaklığı 250°C Arayüzey Sıcaklığı 300°C Kolon Basıncı 98 kPa Toplam Akış 45 ml/dak. Taşıyıcı Gaz Helyum Taşıyıcı Gaz Akış Hızı 1,6 ml/dak. Enjeksiyon Modu Splitless Dedektör MS (Taramalı mod) Enjeksiyon Hacmi 1 µL 56 Çizelge 3.2.4.2.3. Kalitatif analiz programı-1 için kütle spektrometresi (MS) şartları Başlangıç zamanı (dak.) 6,50 Tarama Aralığı (m/z) 50-350 ii) Kalitatif Analiz Programı-2 Şekil 3.2.2.5.’te ayrıntıları belirtilen salça çalışması haricindeki tüm kalitatif analiz işlemlerindeki GC-MS şartları Çizelge 3.2.4.2.4., Çizelge 3.2.4.2.5. ve Çizelge 3.2.4.2.6.’da belirtildiği gibidir. Çizelge 3.2.4.2.4. Kalitatif analiz programı-2 için kolon sıcaklık programı GC sıcaklık programı Sıcaklık artışı Sıcaklık Bekleme süresi (°C/dak.) (°C) (dak.) - 60 - 8 300 5 Çizelge 3.2.4.2.5. Kalitatif analiz programı-2 için GC şartları Enjeksiyon Sıcaklığı 250°C Arayüzey Sıcaklığı 280°C Kolon Basıncı 100 kPa Toplam Akış 50 ml/dak. Taşıyıcı Gaz Helyum Taşıyıcı Gaz Akış Hızı 1,6 ml/dak. Enjeksiyon Modu Splitless Dedektör MS (Taramalı mod) Enjeksiyon Hacmi 1 µL 57 Çizelge 3.2.4.2.6. Kalitatif analiz programı-2 için MS Şartları Başlangıç zamanı (dak.) 3,50 Tarama Aralığı (m/z) 50-400 b) Kantitatif analiz programı Kantitatif analiz programı her boyar madde için aynı olmakla birlikte sadece MS şartları Çizelgeler 3.2.4.2.7.,-8.,-9.,-10.,-11.’de belirtildiği gibi farklılık göstermektedir. Çizelge 3.2.4.2.7. S I, S II, S III ve S IV boyar maddelerinin kantitatif analizi için kolon sıcaklık programı GC sıcaklık programı Sıcaklık artışı Sıcaklık Bekleme süresi (°C/dak.) (°C) (dak.) - 60 - 8 200 - Çizelge 3.2.4.2.8. S I, S II, S III ve S IV boyar maddeleri maddelerinin kantitatif analizi için GC şartları Enjeksiyon Sıcaklığı 250°C Arayüzey Sıcaklığı 280°C Kolon Basıncı 100 kPa Toplam Akış 50 ml/dak. Taşıyıcı Gaz Helyum Taşıyıcı Gaz Akış Hızı 1,6 ml/dak. Enjeksiyon Modu Splitless Dedektör MS (Taramalı mod) Enjeksiyon Hacmi 1 µL 58 Çizelge 3.2.4.2.9. S I boyar maddesinin kantitatif analizi için MS şartları Başlangıç zamanı (dak.) 3,50 Tarama Aralığı (m/z) 90-162 Çizelge 3.2.4.2.10. S II boyar maddesinin kantitatif analizi için MS şartları Başlangıç zamanı (dak.) 3,50 Tarama Aralığı (m/z) 115-172 Çizelge 3.2.4.2.11. S III boyar maddesinin kantitatif analizi için MS şartları Başlangıç zamanı (dak.) 3,50 Tarama Aralığı (m/z) 85-215 Çizelge 3.2.4.2.12. S IV boyar maddesinin kantitatif analizi için MS şartları Başlangıç zamanı (dak.) 3,50 Tarama Aralığı (m/z) 103-245 59 4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI VE TARTIŞMA 4.1. UV-VIS İle İlgili Çalışmalar 4.1.1. S I Boyar Maddesinin UV-VIS Spektrumları 4.1.1.1. Metanolde 7 mg/L S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Metanolde, S I boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 478,5 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,588 olarak belirlenmiştir. 60 Şekil 4.1.1.2. Asetonitrilde 7 mg/L S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Asetonitrilde, S I boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 474,5 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,505 olarak belirlenmiştir. Şekil 4.1.1.3. Etil asetatta 7 mg/L S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu 61 Etil asetatta, S I boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 470,5 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,389 olarak belirlenmiştir. Metanol, asetonitril ve etil asetatın polarite sırası küçükten büyüğe doğru etil asetat, asetonitril, metanol şeklindedir. Çözücü polaritesi arttıkça, S I boyar maddesi için, maksimum absorbans yaptığı dalga boyunun daha yüksek değer aldığı ve absorbans şiddetinin arttığı belirlenmiştir. 4.1.2. S II Boyar Maddesinin UV-VIS Spektrumları Şekil 4.1.2.1. Metanolde 7 mg/L S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu S II boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 495,5 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,459 olarak belirlenmiştir. 62 Dalga boyu (nm) Şekil 4.1.2.2. Asetonitrilde 7 mg/L S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Asetonitrilde, S II boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 486,5 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,389 olarak belirlenmiştir. Şekil 4.1.2.3. Etil asetatta 7 mg/L S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Absorbans 63 Etil asetatta, S II boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 483,4 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,383 olarak belirlenmiştir. S II boyar maddesi için; çözücü polaritesi arttıkça maksimum absorbans yaptığı dalga boyunun daha yüksek değer aldığı ve absorbans şiddetinin arttığı belirlenmiştir. 4.1.3. S III Boyar Maddesinin UV-VIS Spektrumları Şekil 4.1.3.1. Metanolde 7 mg/L S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu S III boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 504,5 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,672 olarak belirlenmiştir. 64 Dalga boyu (nm) Şekil 4.1.3.2. Asetonitrilde 7 mg/L S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Asetonitrilde, S III boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 503,0 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,761 olarak belirlenmiştir. Şekil 4.1.3.3. Etil asetatta 7 mg/L S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Absorbans 65 Etil asetatta, S III boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 501,8 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,701 olarak belirlenmiştir. S III boyar maddesi için; çözücü polaritesi arttıkça maksimum absorbans yaptığı dalga boyunun daha yüksek değer aldığı belirlenmiştir. 4.1.4. S IV Boyar Maddesinin UV-VIS Spektrumları Şekil 4.1.4.1. Metanolde 7 mg/L S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu S IV boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 515,5 nm ve maksimum absorbans değeri de 0,692 olarak belirlenmiştir. 66 Dalga boyu (nm) Şekil 4.1.4.2. Asetonitrilde 7 mg/L S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Asetonitrilde, S IV boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 513,0 nm ve maksimum absorbans değeri de 1,009 olarak belirlenmiştir. Şekil 4.1.4.3. Etil asetatta 7 mg/L S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Absorbans 67 Etil asetatta, S IV boyar maddesinin maksimum absorpsiyon yaptığı dalga boyu 512,2 nm ve maksimum absorbans değeri de 1,022 olarak belirlenmiştir. Çözücü polaritesi arttıkça S IV boyar maddesinin maksimum absorbans yaptığı dalga boyu daha yüksek bir değer alırken; absorbans şiddetinde azalma olduğu belirlenmiştir. Çizelge 2.8.1.1.’de görüldüğü gibi S I ve S II boyar maddelerinin yapılarındaki tek fark, S II boyar maddesindeki bir metil (-CH3) grubudur. Bu grubun, maksimum absorpsiyon dalga boyunu daha büyük bir değere kaydırdığı tespit edilmiştir. S IV boyar maddesinin S III boyar maddesinden farkı ise yapısındaki iki metil grubudur. Bu iki metil grubu, maksimum absorpsiyon dalga boyunu daha büyük bir değere kaydırmış; aynı zamanda absorpsiyon şiddetini de artırmıştır. Bu gibi gruplar kendileri absorpsiyon yapmadıkları halde absorpsiyon dalga boyunu daha uzun dalga boylarına (kırmızıya) kaydıran; ve absorpsiyon şiddetini artıran oksokromlardır. 4.2. Sudan Boyar Maddelerinin Katı Faz Ekstraksiyonu 4.2.1. Sudan Boyaları İçin Çözünürlük Çalışmaları Çözünürlük çalışmaları farklı polaritede dört çözücü (su, metanol, aseton ve hekzan) seçilerek gerçekleştirilmiştir. Şekil 3.2.1.1.’deki şemaya göre hazırlanan çözeltilerin UV-VIS spektrumları Şekil 4.2.1.1-Şekil 4.2.1.16’da verilmiştir. Şekil 4.2.1.1. Suda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu 68 Şekil 4.2.1.2. Metanolde hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.3. Asetonda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu 69 Şekil 4.2.1.4. Hekzanda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu S I boyar maddesi için UV-VIS spektrumlarından tespit edilen maksimum dalga boyuna ait absorbans değerleri Çizelge 4.2.1.1.’ de verilmiştir. Çizelge 4.2.1.1. S I’ in farklı çözücülerdeki UV-VIS spektrumlarından tespit edilen maksimum absorbans değerleri Çözücü Absorbans Su 0,1860 S I Metanol 0,0137 Aseton 0,0067 Hekzan 0,0315 70 Şekil 4.2.1.5. Suda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.6. Metanolde hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu 71 Şekil 4.2.1.7. Asetonda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.8. Hekzanda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu S II için UV-VIS spektrumlarında tespit edilen maksimum dalga boyuna ait absorbans değerleri Çizelge 4.2.1.2.’ de verilmiştir. 72 Çizelge 4.2.1.2. S II’ nin farklı çözücülerdeki UV-VIS spektrumlarında tespit edilen maksimum absorbans değerleri Çözücü Absorbans Su 0,167 S II Metanol 0,013 Aseton 0,009 Hekzan 0,020 Şekil 4.2.1.9. Suda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu 73 Şekil 4.2.1.10. Metanolde hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.11. Asetonda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu 74 Şekil 4.2.1.12. Hekzanda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu S III için UV-VIS spektrumlarında tespit edilen maksimum dalga boyuna ait absorbans değerleri Çizelge 4.2.1.3.’ de verilmiştir. Çizelge 4.2.1.3. S III’ ün farklı çözücülerdeki UV-VIS spektrumlarında tespit edilen maksimum absorbans değerleri Çözücü Absorbans Su 0,078 S III Metanol 0,016 Aseton 0,008 Hekzan 0,037 75 Şekil 4.2.1.13. Suda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.14. Metanolde hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu 76 Şekil 4.2.1.15. Asetonda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.1.16. Hekzanda hazırlanmış ve metanol ile C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu S IV için UV-VIS spektrumlarında tespit edilen maksimum dalga boyuna ait absorbans değerleri Çizelge 4.2.1.4.’ de verilmiştir. 77 Çizelge 4.2.1.4. S IV’ ün farklı çözücülerdeki UV-VIS spektrumlarında tespit edilen maksimum absorbans değerleri Çözücü Absorbans Su 0,124 S IV Metanol 0,021 Aseton 0,005 Hekzan 0,027 Her bir boyar maddenin belirtilen çözücülerde çözülüp katı faz ekstraksiyonu uygulandıktan sonra UV-VIS spektrumlarından tespit edilen absorbans değerleri, elüsyonlar metanol ile yapıldığından, Şekil 4.1.1.1., Şekil 4.1.2.1., Şekil 4.1.3.1. ve Şekil 4.1.4.1.’de verilen standart çözeltilere ait UV-VIS spektrumlarındaki absorbans değerleri ile karşılaştırılmıştır. Karşılaştırma sonucunda en yüksek absorbans değeri sulu çözeltilerde tespit edildiği için, en uygun çözücünün su olduğuna karar verilmiştir. Bu da boyar maddelerin polaritelerinin yüksek olduğunu; bu nedenle de polar ortamda daha çok çözündüğünü göstermiştir. Bu nedenle bir sonraki aşamada uygun elüsyon çözücüsü belirlemek için, bu boyaların sudaki çözeltileri hazırlanmıştır. 4.2.2. Sudan Boyalarının Elüsyon Çalışmaları Katı fazda tutunan boyaların elüsyonunda, uygun çözücü belirlemek amacı ile farklı polaritede üç çözücüden (metanol, asetonitril ve etil asetat) yararlanılmıştır. Şekil 3.2.1.2.’de verilen katı faz ekstraksiyon şemasına göre hazırlanan çözeltilerin UV-VIS spektrumları Şekil 4.2.2.1-Şekil 4.2.2.16’da verilmiştir. 78 Dalga boyu (nm) Şekil 4.2.2.1. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan asetonitril ile elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Şekil 4.2.2.2. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan etil asetat ile elüe edilmiş S I boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Dalga boyu (nm) Şekil 4.2.2.3. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan asetonitril ile elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Absorbans Absorbans 79 Şekil 4.2.2.4. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan etil asetat ile elüe edilmiş S II boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Dalga boyu (nm) Şekil 4.2.2.5. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan asetonitril ile elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Absorbans 80 Şekil 4.2.2.6. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan etil asetat ile elüe edilmiş S III boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Dalga boyu (nm) Şekil 4.2.2.7. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan asetonitril ile elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu Absorbans 81 Şekil 4.2.2.8. C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan etil asetat ile elüe edilmiş S IV boyar maddesinin UV-VIS spektrumu C18 katı faz ekstraksiyon kolonundan metanol ile elüe edilmiş sudan boyar maddelerinin UV-VIS spektrumları Şekil 4.2.1.1., 4.2.1.5., 4.2.1.9., 4.2.1.13.’te görülmektedir. Standart çözeltilerin absorbans değerleri ile katı faz ekstraksiyonu uygulanmış ve belirtilen elüsyon çözücüleri ile elüe edilmiş örnek çözeltilerinin UV-VIS spektrumlarından elde edilen absorbans değerleri Çizelge 4.2.2.1’de verilmiştir. Çizelgedeki veriler karşılaştırıldığında, standart çözeltilere en yakın absorbans değerleri tespit edildiğinden orta polaritedeki etil asetatın genel olarak en uygun elüsyon çözücüsü olduğuna karar verilmiştir. Bununla birlikte çözünürlük veriminin düşük olması ve Sudan boyaları için uygun olabilecek çözücülerin uçuculuklarının sınırlayıcı etken olması nedeni ile katı faz ekstraksiyonu, deriştirme amaçlı olarak gerçek örneklere uygulanmamıştır. 82 Çizelge 4.2.2.1. Sudan boyalarının metanol, asetonitril ve etil asetattaki standart çözeltilerinin UV-VIS absorbansları ile katı faz ekstraksiyonu sunucu tespit edilen absorbans değerleri Katı faz Katı faz Standart ekstraksiyonu Standart ekstraksiyonu Çözücü Çözücü çözelti uygulanmış çözelti uygulanmış çözelti çözelti S I Etil asetat 0,389 0,325 S II Etil asetat 0,383 0,315 Asetonitril 0,505 0,177 Asetonitril 0,389 0,222 Metanol 0,588 0,014 Metanol 0,459 0,013 Etil asetat 0,701 0,836 Etil asetat 1,022 0,367 S III S IV Asetonitril 0,761 0,190 Asetonitril 1,009 0,764 Metanol 0,672 0,016 Metanol 0,692 0,021 4.3. GC-MS İle İlgili Kalitatif Çalışmalar 4.3.1. S I Boyar Maddesinin GC-MS Analizi 500 mg/L konsantrasyonlu S I boyar maddesinin indirgenme işlemi yapılmadan elde edilen kromatogramı ve bu kromatogramda gözlenen pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.1.1. ve Şekil 4.3.1.2.’de verilmiştir. (x100,000) 7.5 TIC 5.0 2.5 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Zaman (dak.) Şekil 4.3.1.1. 500 mg/L S I boyar maddesinin GC-MS kromatogramı Bağıl yoğunluk 1 83 % 100.0 115 51 77 143 75.0 50.0 248 65 63 25.0 89 93 101 78 102 128 171 249 54 71 90 105 113 0.0 124 219 156 165 189 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 m/z Şekil 4.3.1.2. 500 mg/L S I boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Aynı şartlar altında; 500 mg/L konsantrasyonlu S I boyar maddesinin kimyasal indirgeme işlemi uygulandıktan sonra elde edilen kromatogramı ve bu kromatogramda gözlenen piklere ait kütle spektrumları Şekil 4.3.1.3., Şekil 4.3.1.4. ve Şekil 4.3.1.5.’te verilmiştir. (x100,000) TIC 7.5 5.0 2.5 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Zaman (dak.) Şekil 4.3.1.3. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I için GC-MS kromatogramı Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 2 84 % 100.0 93 75.0 66 50.0 25.0 52 54 63 78 91 0.0 59 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 m/z Şekil 4.3.1.4. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu % 100.0 115 51 77 143 75.0 50.0 248 65 63 25.0 89 101 78 102 128 171 249 53 113 189 219 0.0 71 124 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 m/z Şekil 4.3.1.5. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I boyar maddesinin kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.1.3.’teki kromatogram m/z=50-100 aralığında tarandığında Şekil 4.3.1.6.’ daki kromatogram ve Şekil 4.3.1.7.’deki spektrum elde edilmektedir. Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 85 (x100,000) 2.0 TIC 1.5 1.0 0.5 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Zaman (dak.) Şekil 4.3.1.6. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I için m/z=50-100 aralığında elde edilen GC-MS kromatogramı % 100.0 93 75.0 66 50.0 52 25.0 54 63 0.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 m/z Şekil 4.3.1.7. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S I boyar maddesinin m/z=50-100 tarama aralığında elde edilen kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Metanolde hazırlanmış standart anilin çözeltisi ile çalışıldığında elde edilen GC- MS kromatogramı ve kromatogramdaki pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.1.8. ve Şekil 4.3.1.9.’da verilmiştir. Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 86 (x100,000) TIC 1.5 1.0 0.5 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Zaman (dak.) Şekil 4.3.1.8. 102 mg/L anilin için GC-MS kromatogramı % 100.0 93 75.0 66 50.0 52 25.0 54 63 78 92 0.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 m/z Şekil 4.3.1.9. 102 mg/L aniline ait kromatogramdaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Anilin standardı ile çalışıldığında elde edilen kütle spektrumundan aniline özgü karakteristik m/z değerleri belirlenmiştir. Bu spektrum, S I boyar maddesinin parçalanma ürünlerinden biri olan ve indirgeme işlemi uygulanmış boyar madde kromatogramında görülen anilinin yapısını doğrulayıcı niteliktedir. 4.3.2. S II Boyar Maddesinin GC-MS Analizi 500 mg/L konsantrasyonlu S II boyar maddesinin indirgeme işlemi yapılmadan elde edilen kromatogramı ve bu kromatogramda gözlenen pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.2.1. ve Şekil 4.3.2 .2.’de verilmiştir. Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 87 (x100,000) 7.5 TIC 5.0 2.5 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Zaman (dak.) Şekil 4.3.2.1. 500 mg/L S II boyar maddesinin kromatogramı % 100.0 115 77 105 75.0 143 51 50.0 79 276 65 89 106 25.0 101 120128 247 259 54 66 113 156 277 71 94 129 169 207 231 0.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 m/z Şekil 4.3.2.2. 500 mg/L S II boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu 500 mg/L konsantrasyonlu ve kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış S II boyar maddesinin kromatogramı ve bu kromatogramda gözlenen piklere ait kütle spektrumları Şekil 4.3.2.3. ve Şekil 4.3.2.4.’te verilmiştir. Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 88 (x100,000) 7.5 TIC 5.0 2.5 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 zaman (dak.) Şekil 4.3.2.3. Kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S II boyar maddesinin kromatogramı % 100.0 115 77 75.0 105 51 143 79 276 50.0 63 91 106 120 89 247 25.0 101 128 54 66 93 129 259 0.0 58 207 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 m/z Şekil 4.3.2.4. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S II boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.2.3.’teki kromatogram m/z=50-130 aralığında tarandığında Şekil 4.3.2.5.’teki kromatogram ve Şekil 4.3.2.6.’daki spektrum elde edilmektedir. Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 89 (x100,000) 2.0 TIC 1.5 1.0 0.5 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Zaman (dak.) Şekil 4.3.2.5. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S II boyar maddesinin m/z=50- 130 aralığında elde edilen GC-MS kromatogramı % 100.0 106 121 75.0 51 50.0 52 77 25.0 65 63 91 59 0.0 50 60 70 80 90 100 110 120 m/z Şekil 4.3.2.6. İndirgeme işlemi uygulanmış 500 mg/L S II boyar maddesinin m/z=50- 130 aralığında elde edilen GC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu S I ve S II boyar maddelerinin kromatogramları ve kütle spektrumları incelendiğinde işlem görmemiş boya kromatogramındaki 1 numaralı pikin ilgili boyanın moleküler iyon pikine karşı geldiği; işlem görmüş boya kromatogramındaki piklerin moleküler iyon pikine ve boyanın parçalanma ürünlerine ait olduğu kütle spektrumlarından anlaşılmıştır. Kromatogramlardan elde edilen sayısal veriler Çizelge 4.3.2.1.’de verilmiştir. Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 90 Çizelge 4.3.2.1. İndirgeme işlemi yapılmadan ve kimyasal indirgeme işlemi uygulandıktan sonra S I ve S II boyar maddelerinin kromatogramlarında görülen moleküler iyon piklerine ait pik alanları Boyar Moleküler iyon piki Alan madde Kromatogram Alıkonma Pik alanı azalma zamanı (dak.) yüzdesi *Şekil 4.3.1.1. 26,628 1452617 S I ** %50,00 Şekil 4.3.1.3. 26,617 740845 *Şekil 4.3.2.1. 29,144 983480 S II ** %51,77 Şekil 4.3.2.3. 29,111 474273 *= İndirgeme işlemi yapılmadan elde edilen kromatogram **= İndirgeme işlemi yapıldıktan sonra elde edilen kromatogram Kimyasal indirgeme işlemi yapılmış S I ve S II boyar maddelerinin kromatogramlarında gözlenen moleküler iyon pikleri, aynı konsantrasyondaki standart S I ve S II boyar maddeleri ile karşılaştırıldığında ilgili boyaların bir kısmının parçalanmamış olduğu söylenebilir. Bu parçalanma sayısal olarak değerlendirilecek olursa S I’in %50’si parçalanmaya uğrarken; S II boyar maddesi için bu oran %51,77 olarak tespit edilmiştir. S I ve S II boyalarının kütle spektrumları incelendiğinde parçalanma ürünlerinin sırası ile anilin ve 2,4-ksilidin olduğu görülmektedir. 4.3.3. S III Boyar Maddesinin GC-MS Analizi 600 mg/L konsantrasyonlu sudan III boyar maddelerinin indirgeme işlemi yapılmadan ve indirgeme işlemi yapıldıktan sonra elde edilen kromatogramları Şekil 4.3.3.1. ve Şekil 4.3.3.2.’de verilmiştir. 91 (x100,000) TIC 1.5 1.0 0.5 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Zaman (dak.) Şekil 4.3.3.1. 600 mg/L S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramı 600 mg/L konsantrasyonlu ve kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış sudan III boyar maddesinin m/z=85-215 aralığındaki kromatogramı ve bu kromatogramda gözlenen piklere ait kütle spektrumları Şekil 4.3.3.2., Şekil 4.3.3.3. ve Şekil 4.3.3.4’te verilmiştir. (x10,000) 4.0 TIC 3.0 2.0 1.0 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 Zaman (dak.) Şekil 4.3.3.2. İndirgeme işlemi uygulanmış 600 mg/L S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramı Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 2 92 % 100.0 93 75.0 50.0 25.0 0.0 93.350 93.375 93.400 93.425 93.450 m/z Şekil 4.3.3.3. İndirgeme işlemi uygulanmış 600 mg/L S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu % 100.0 92 75.0 50.0 25.0 120 197 0.0 90 105 115 128 141 151 167 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 m/z Şekil 4.3.3.4. İndirgeme işlemi uygulanmış 600 mg/L S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu 102 mg/L standart anilin çözeltisinin m/z=50-100 ve m/z=85-215 tarama aralıklarında elde edilen kütle spektrumları Şekil 4.3.3.5. ve Şekil 4.3.3.6.’da verilmiştir. Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 93 % 100.0 93 75.0 66 50.0 52 25.0 54 63 78 92 0.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 m/z Şekil 4.3.3.5. 102 mg/L anilin için m/z=50-100 aralığında elde edilen kütle spektrumu % 100.0 93 75.0 50.0 25.0 0.0 92.25 92.50 92.75 93.00 93.25 93.50 93.75 94.00 m/z Şekil 4.3.3.6. 102 mg/L anilin için m/z=85-215 aralığında elde edilen kütle spektrumu 4.3.4. S IV Boyar Maddesinin GC-MS Analizi 1000 mg/L konsantrasyonlu standart boya çözeltisi ile yine aynı konsantrasyonda ve kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış S IV boyar maddesinin m/z=103-245 aralığındaki kromatogramı ve bu kromatogramda gözlenen pike ait kütle spektrumu Şekil 4.3.4.1., Şekil 4.3.4.2. ve Şekil 4.3.4.3.’te verilmiştir. Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 94 (x100,000) 1.5 TIC 1.0 0.5 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 Zaman (dak.) Şekil 4.3.4.1. 1000 mg/L S IV boyar maddesinin GC-MS kromatogramı (x100,000) TIC 1.5 1.0 0.5 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 Zaman (dak.) Şekil 4.3.4.2. İndirgeme işlemi uygulanmış 1000 mg/L S IV boyar maddesinin GC-MS kromatogramı % 100.0 106 75.0 107 50.0 25.0 0.0 104.5 105.0 105.5 106.0 106.5 107.0 107.5 108.0 m/z Şekil 4.3.4.3. İndirgeme işlemi uygulanmış 1000 mg/L S IV boyar maddesinin kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 95 S III ve S IV boyar maddelerinin kaynama noktaları GC-MS analizine uygun olmadığı için, işlem görmemiş halleri için elde edilen kromatogramlarında, beklenildiği gibi, bu boyaları temsil eden pik veya pikler gözlenmemiştir. Bu nedenle sadece parçalanma ürünleri üzerinden karakterizasyon yapılabileceği tespit edilmiştir. Kimyasal indirgeme işlemi uygulandığında S III ve S IV için belirlenen parçalanma ürünleri sırası ile anilin ve o-toluidindir. Ayrıca S III boyar maddesinin kromatogramında gözlenen m/z=197 piki de S III’ ün, S I boyar maddesinden farklı karakteristik bir parçalanma ürününü temsil etmektedir. Bu parçalanma ürününün molekül kütlesi 197 g/mol değerindedir ve Çizelge 4.3.4.3.’ te görülmektedir. S I, S II, S III, S IV boyar maddelerinin teorik ve deneysel parçalanma ürünleri Çizelge 4.3.4.1., Çizelge 4.3.4.2., Çizelge 4.3.4.3. ve Çizelge 4.3.4.4.’te gösterilmiştir. Çizelge 4.3.4.1. S I boyar maddesinin teorik ve deneysel parçalanma ürünleri Anilin 1-Amino-2-naftol NH2 H N O Sudan I 2 H Molekül kütlesi 93 g/mol 159 g/mol *Kaynama noktası (KN) (°C ) 184,1 - Deneysel tespit + - *KAYNAK:http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ 96 Çizelge 4.3.4.2. S II boyar maddesinin teorik ve deneysel parçalanma ürünleri 2,4-Ksilidin 1-Amino-2-naftol NH Sudan II 2 OH H3C NH2 CH3 Molekül kütlesi 121 g/mol 159 g/mol *KN (°C ) 214 - Deneysel tespit + - *KAYNAK: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ Çizelge 4.3.4.3. S III boyar maddesinin teorik ve deneysel parçalanma ürünleri Anilin 1-Amino-2-naftol 1,4-Fenilendiamin 4-Aminoazobenzen NH 2 Sudan III H2N OH H N NH N N NH 2 2 2 Molekül kütlesi 93 g/mol 159 g/mol 108 g/mol 197 g/mol *KN (°C ) 184,1 - 267 - Deneysel tespit + - - + *KAYNAK: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ 97 Çizelge 4.3.4.4. S IV boyar maddesinin teorik ve deneysel parçalanma ürünleri o-Toluidin 1-Amino-2-naftol o-Aminoazotoluen 2,5-Diaminotoluen NH 2 CH OH CH3 CH3 3 CH3 Sudan IV N N NHNH 22 H2N NH2 Molekül 93 g/mol 159g/mol 197 g/mol 108 g/mol kütlesi *KN(°C ) 200,3 - **102 273,5 Deneysel + - - - tespit *KN= Kaynama Noktası (°C ) **= Erime Noktası (°C ) KAYNAK: http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ Kaynama noktaları yüksek olan parçalanma ürünleri gözlenmezken; tam gerçekleşmeyen ya da daha ileri düzeyde gerçekleşebilecek olan parçalanma, teorik ve deneysel olarak belirlenen parçalanma ürünleri arasında farklılık oluşturabilecektir. 4.3.5. Gerçek Örneklerle Çalışmalar Şekil 3.2.2.6.’ da ayrıntıları verilen gerçek örnek çalışması için elde edilen GC- MS kromatogramı Şekil 4.3.5.1.’de verilmiştir. 2 1 zaman (dak.) Şekil 4.3.5.1. Biber salçası için kalitatif analiz sonucu elde edilen kromatogram Bağıl yoğunluk 98 Şekil 4.3.5.1.’de verilen salça kromatogramında gözlenen 1 ve 2 numaralı piklerin salçayı karakterize ettiği düşünülmüş olup; bunlara ait kütle spektrumları Şekil 4.3.5.2. ve Şekil 4.3.5.3.’te verilmiştir. Kütle spektrumlarına dayalı GC-MS kütüphane karşılaştırma sonuçları, 1,2-benzendikarboksilli asit bis(2-metilpropil) ester; ftalik asit dibütil ester; 1,2-benzendikarboksilli asit diizooktil ester; bis(2-etilhekzil) ftalat; m-nitro ftalik asit gibi yapıları işaret ettiğinden kromatogramdaki bu piklerin, biber yapısından gelebilecek α ve β-karoten, capsanthin gibi karetenoidler (Meyer 1961), 2-izobutil-3- metoksipirazin gibi bileşikler ile karışımda kullanılabilecek domatesten gelebilecek 3- metilbutanal, metional gibi farklı aroma bileşikleri ve sitrik veya malik asit gibi karbaksilli asitlerden (Belitz ve ark 2004) kaynaklanabileceği düşünülmüştür. m/z Şekil 4.3.5.2. Salça kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=21,733) m/z Şekil 4.3.5.3. Salça kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=38,383) 4.3.6. pH=6 Ortamında Karışım Halindeki S I, S II, S III ve S IV Boyar Maddelerinin Kalitatif Analizi Karışım halindeki sudan boyar maddelerinin Şekil 3.2.2.2.’deki prosedüre göre çalışılması sonucu elde edilen GC-MS kromatogramı ve bu kromatogramdaki piklere ait Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 99 kütle spektrumları Şekil 4.3.6.1., Şekil 4.3.6.2., Şekil 4.3.6.3., Şekil 4.3.6.4., Şekil 4.3.6.5., Şekil 4.3.6.6. ve Şekil 4.3.6.7.’ de verilmiştir. (x100,000) TIC 5.0 5 4.0 6 3.0 2.0 4 1.0 1 2 3 0.0 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 Zaman (dak.) Şekil 4.3.6.1. Karışım halindeki sudan boyar maddelerine indirgenme işlemi uygulandığında elde edilen kromatogram % 100.0 93 75.0 66 50.0 25.0 52 54 63 73 57 78 0.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 m/z Şekil 4.3.6.2. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 2 3 4 5 6 100 % 100.0 106 75.0 52 50.0 51 77 25.0 63 73 65 80 0.0 50 60 70 80 90 100 m/z Şekil 4.3.6.3. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu % 100.0 106 121 75.0 52 50.0 51 77 25.0 6365 9193 0.0 50 60 70 80 90 100 110 120 m/z Şekil 4.3.6.4. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 3 numaralı pike ait kütle spektrumu Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 101 % 100.0 51 92 65 75.0 77 50.0 25.0 120 197 66 54 78 0.0 105 115 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 m/z Şekil 4.3.6.5. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 4 numaralı pike ait kütle spektrumu % 100.0 51 77 115 75.0 143 50.0 65 248 25.0 89 66 93 101 53 7871 94 102 128 171 249 0.0 124 156 165 189 219 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 m/z Şekil 4.3.6.6. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 5 numaralı pike ait kütle spektrumu Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 102 % 100.0 115 77 75.0 105 143 50.0 51 79 65 276 25.0 53 89 91 101 120 247 93 133 156 259 277 0.0 57 71 207 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 m/z Şekil 4.3.6.7. Sudan boyaları karışımı için elde edilen kromatogramdaki 6 numaralı pike ait kütle spektrumu Kromatogramlar ve parçalanma ürünlerine ait değerlendirme Çizelge 4.3.6.1.’de özetlenmektedir. Çizelge 4.3.6.1. Karışım halindeki sudan boyalarının kromatogramlarındaki piklerin karşılaştırılması Boyar Kromatogramdaki m/z madde pik numarası değeri Parçalanma ürünü S I 1 93 Anilin 5 249 S I (Parçalanmayan kısım) S II 3 121 2,4-Ksilidin 6 277 S II (Parçalanmayan kısım) S III 1 93 Anilin 4 197 4-Aminoazobenzen S IV 2 106 o-Toluidin Kromatogramda gözlenen piklerin kütle spektrumları değerlendirildiğinde her bir boyayı temsil eden ve Çizelge 4.3.4.1.-Çizelge 4.3.4.4.’ te belirtilen bir parçalanma ürününün bulunması S I, II, III ve IV boyar maddelerininin eş zamanlı tayinlerinin mümkün olduğunu göstermektedir. Bağıl yoğunluk 103 4.4. LC-MS İle İlgili Kalitatif Çalışmalar Sudan boyar maddeleri için, standart boyar madde ve gerçek örnek çalışması ile elde edilen LC-MS kromatogramları ve kromatogramlarda gözlenen piklere ait kütle spektrumları Şekil 4.4.1.-Şekil 4.4.17’de verilmiştir. Intens. x107 2 7 6 5 4 3 1 2 0 1 2 3 4 5 T im e [m in] Şekil 4.4.1. 20 mg/L S I boyar maddesinin LC-MS kromatogramı Intens. +MS, 1.3-1.5min (#212-#238) x106 288.0 3 316.0 2 1 198.8 172.7 190.7 232.8 110.9 158.7 212.8 250.7 278.9 332.0 348.9 391.0 0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.2. 20 mg/L S I boyar maddesinin LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,4 dak.) 104 x107 +MS, 2.1-2.2min (#338-#349) 248.8 4 3 2 1 0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.3. 20 mg/L S I boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S I’i karakterize eden 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,15 dak.) Intens. x108 2 1.0 0.8 0.6 0.4 1 0.2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 T ime [min] Şekil 4.4.4. 20 mg/L S II boyar maddesinin LC-MS kromatogramı Intens. +MS, 1.3-1.4min (#216-#234) x106 2.5 288.0 308.9 2.0 1.5 1.0 172.7 190.7 232.8 0.5 300.9158.7 212.8 110.9 244.8 260.8 332.0 354.7 369.0 391.0 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.5. 20 mg/L S II boyar maddesinin LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,35 dak.) 105 x107 +MS, 2.7-2.7min (#433-#446) 8 276.8 6 4 2 0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.6. 20 mg/L S II boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S II’yi karakterize eden 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,7 dak.) Intens. x107 1 2 5 4 3 2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 T ime [min] Şekil 4.4.7. 20 mg/L S III boyar maddesinin LC-MS kromatogramı Intens. +MS, 1.4-1.5min (#221-#239) x106 202.7 288.0 2.5 2.0 1.5 308.9 1.0 260.8 244.8 348.9 0.5 184.8 216.8 232.8 364.8162.8 278.9 392.9 110.9 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.8. 20 mg/L S III boyar maddesinin LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) 106 x107 +MS, 1.9-2.0min (#314-#322) 3.0 352.8 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.9. 20 mg/L S III boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S III’ü karakterize eden 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,95 dak.) Intens. x107 6 2 5 4 3 3 1 2 0 1 2 3 4 5 6 7 T ime [min] Şekil 4.4.10. 20 mg/L S IV boyar maddesinin LC-MS kromatogramı Intens. +MS, 1.3-1.6min (#216-#252) x106 1.5 288.0 308.9 198.9 1.0 232.8 0.5 188.7 278.9 352.9 110.9 172.7 242.0 260.8 364.8 391.0 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.11. 20 mg/L S IV boyar maddesinin LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) 107 Intens. +MS, 2.3-2.4min (#373-#383) x107 380.9 3 2 1 262.8 0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.12. 20 mg/L S IV boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S IV’ü karakterize eden 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,35 dak.) x107 +MS, 4.4-4.6min (#721-#752) 2.0 380.9 1.5 1.0 0.5 198.8 232.8 286.9 308.9 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.13. 20 mg/L S IV boyar maddesinin LC-MS kromatogramında S IV’ü karakterize eden 3 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=4,5 dak.) In tens. x107 1 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 0 1 2 3 4 5 6 7 T im e [m in] Şekil 4.4.14. 1 numaralı salça ekstraktının *(kör örnek-1) LC-MS kromatogramı *Kör örnek-1= Ev yapımı salça 108 Intens. +MS, 1.3-1.6min (#217-#254) x107 1.0 202.7 0.8 0.6 0.4 308.8 0.2 232.7 260.7 286.8 338.7 382.7179.7 218.6 244.7 300.8 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.15. 1 numaralı salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) Intens. x107 1 4 3 2 0 1 2 3 4 5 6 7 T ime [min] Şekil 4.4.16. 2 numaralı salça ekstraktının *(kör örnek-2) LC-MS kromatogramı *Kör örnek-2= Analizlerde kullanılan hazır salça Intens. +MS, 1.4-1.5min (#230-#239) x107 202.7 0.8 0.6 0.4 0.2 218.6 308.8 143.7 162.7 179.7 232.7244.7 260.7 286.8 324.8 338.7 364.8 382.7 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.17. 2 numaralı salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) 109 Intens. x107 2 5 4 1 3 2 0 1 2 3 4 5 T ime [m in] Şekil 4.4.18. S I boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı Intens. +MS, 1.3-1.6min (#216-#253) x106 202.7 6 4 2 218.7 308.9 382.8 145.8 162.8 179.8 232.8 264.7 286.9 300.8 324.9 338.8 354.7 0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.19. S I boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) Şekil 4.4.20. S I boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,05 dak.) 110 Intens. x108 2 0.8 1 0.6 0.4 0.2 0 1 2 3 4 5 T ime [min] Şekil 4.4.21. S II boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı Intens. +MS, 1.3-1.5min (#216-#239) x107 202.7 274.0 0.8 0.6 0.4 302.0 318.0 0.2 218.7 330.1 346.0 382.8 179.8 232.8245.9 289.9 362.0 264.7 374.1 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.22. S II boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,4 dak.) Şekil 4.4.23. S II boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,65 dak.) 111 Intens. x107 1 2 4 3 3 2 0 1 2 3 4 5 6 7 T ime [min] Şekil 4.4.24. S III boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı Intens. +MS, 1.4-1.5min (#221-#239) x107 202.7 0.8 0.6 0.4 0.2 218.7 308.9 382.8 145.8 165.8 179.8 232.8 264.7 286.9 324.9 338.7 354.7 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.25. S III boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) Intens. +MS, 1.9-2.0min (#305-#327) x107 352.9 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 198.8 232.8 286.9 308.9 0.00 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.26. S III boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,95 dak.) 112 Intens. +MS, 2.9-3.2min (#476-#512) x106 8 352.8 6 4 2 198.8 308.9232.8 286.9 0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.27. S III boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 3 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=3,05 dak.) Intens. x108 1 1.50 1.25 1.00 0.75 2 0.50 3 0.25 0 1 2 3 4 5 T ime [min] Şekil 4.4.28. S IV boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı Intens. +MS, 1.4-1.5min (#226-#244) x107 274.0 3 318.0 2 302.0 1 346.0 330.1 362.0 202.7 245.9 374.1261.9 290.0 390.1 0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.29. S IV boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,45 dak.) 113 Intens. +MS, 2.3-2.4min (#376-#385) x107 380.9 2 1 198.8 262.8 286.9 308.9 331.0 353.0 0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.30. S IV boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 2 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=2,35 dak.) Intens. +MS, 4.5-4.6min (#731-#754) x107 380.9 1.0 0.5 198.8 232.8 286.9 308.9 0.0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.31. S IV boyar maddesi katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 3 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=4,55 dak.) Intens. x107 1 8 6 4 2 0 5 10 15 20 25 T ime [min] Şekil 4.4.32. S I-IV boyar maddeleri katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramı 114 Intens. +MS, 1.9-4.7min (#310-#771) x106 380.9 6 276.8 4 352.9 248.8 2 308.9 198.8 232.8 110.9 212.8 300.9 0 100 150 200 250 300 350 m/z Şekil 4.4.33. S I-IV boyar maddeleri katılmış salça ekstraktının LC-MS kromatogramındaki 1 numaralı pike ait kütle spektrumu (tR=1,9-4,7 dak.) Şekil 4.4.32’deki bir numaralı pik dışındaki diğer iki pik salçayı ve S IV boyar maddesinin kromatogramında daha önce de gözlenen ikinci karakteristik pikini temsil etmektedir. Şekil 4.4.32.’de görüldüğü gibi, 1,9-4,7 dakikaları arasında boyar maddelere ait kromatogramlar üst üste çakışmıştır. Bu da boyar maddelerin daha öncesinde ayrı ayrı elde edilen LC-MS kromatogramlarında tespit edilen alıkonma zamanlarının birbirine yakın olmasından kaynaklanmaktadır. Karışıma ait kütle spektrumunda (Şekil 4.4.33.) her boyar madde için karakteristik olan ve ilgili boyaların molekül kütlelerini veren pikler görülmektedir. Salçaya boyar madde katılması sonucu elde edilen kromatogramlarda, kör örnek çalışmalarının da kanıtladığı gibi, salçayı karakterize eden tek bir pik tespit edilmekle birlikte; kromatogramda gözlenen diğer pik veya piklerin boyar maddelerin karakteristik pikleri veya safsızlıklarından kaynaklanabileceğini düşündüren pikleri olduğu kütle spektrumlarından anlaşılmıştır. Sonuç olarak; katı-faz ekstraksiyonunun örnek hazırlamada uygulanan deneysel şartlarda deriştirmede etkin olmasa da; matriks bileşenlerinden ayırma amaçlı olarak kullanılabileceği belirlenirken LC-MS analizi ile de, indirgeme gibi bir kimyasal ön işlem gerekmeksizin sudan boyar maddelerinin analiz edilebileceği görülmüştür. 4.5. GC-MS İle İlgili Kantitatif Çalışmalar Kantitatif analiz için; S I, S II, S III ve S IV boyar maddelerinin temel parçalanma ürünleri sırası ile anilin, 2,4-ksilidin, anilin ve o-toluidin seçilerek, kimyasal indirgeme işlemi uygulanmış farklı konsantrasyonlardaki boyar maddelerin bu parçalanma ürünlerine ait kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur. 115 4.5.1. 20 mg S I Boyası İle Yapılan Kantitatif Analiz Çalışması 20 mg S I boyar maddesinin Şekil 3.2.2.2.’de belirtilen prosedüre göre çalışılması sonucu elde edilen ekstrakt; başlangıçtaki boyar madde tartım değerine göre 100, 200, 300, 400, 500 mg/L’lik çözeltiler elde edilecek şekilde seyreltilmiştir. Her bir konsantrasyon değeri için beş tekrarlı çalışma sonucu elde edilen kromatogramlarda gözlenen anilin pikine ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.5.1.1.’de verilmiştir. 160000 y = 326,26x - 17409 2 140000 R = 0,9884 120000 100000 80000 60000 40000 LOD= 44,51 mg/L LOQ= 148,38 mg/L 20000 0 0 100 200 300 400 500 600 Konsantrasyon (mg/L) Şekil 4.5.1.1. S I boyar maddesinin kromatogramında gözlenen anilin pikine ait kalibrasyon eğrisi 4.5.2. 20 mg S II Boyası İle Yapılan Kantitatif Analiz Çalışması 20 mg S II boyar maddesinin Şekil 3.2.2.2.’de belirtilen prosedüre göre çalışılması sonucu elde edilen ekstrakt; başlangıçtaki boyar madde tartım değerine göre 200, 400, 500, 600 mg/L’lik çözeltiler elde edilecek şekilde seyreltilmiştir. Her bir konsantrasyon değeri için beş tekrarlı çalışma sonucu elde edilen elde edilen Alan 116 kromatogramlarda gözlenen 2,4-ksilidin pikine ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.5.2.1.’de verilmiştir. 90000 80000 y = 148,65x - 20746 70000 R2 = 0,8837 60000 50000 40000 30000 LOD= 90,03 mg/L LOQ= 300,09mg/L 20000 10000 0 0 100 200 300 400 500 600 700 Konsantrasyon (mg/L) Şekil 4.5.2.1. S II boyar maddesinin kromatogramında gözlenen 2,4-ksilidin pikine ait kalibrasyon eğrisi 4.5.3. 20 mg S III Boyası İle Yapılan Kantitatif Analiz Çalışması 20 mg SIII boyar maddesinin Şekil 3.2.2.2.’de belirtilen prosedüre göre çalışılması sonucu elde edilen ekstrakt; başlangıçtaki boyar madde tartım değerine göre 200, 300, 500, 600 mg/L’lik çözeltiler elde edilecek şekilde seyreltilmiştir. Her bir konsantrasyon değeri için beş tekrarlı çalışma sonucu elde edilen elde edilen kromatogramlarda gözlenen anilin pikine ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.5.3.1.’de verilmiştir. Alan 117 80000 y = 128,79x - 3615,6 70000 R2 = 0,9888 60000 50000 40000 30000 20000 LOD= 87,95 mg/L 10000 LOQ= 293,17 mg/L 0 0 100 200 300 400 500 600 700 Konsantrasyon (mg/L) Şekil 4.5.3.1. S III boyar maddesinin kromatogramında gözlenen anilin pikine ait kalibrasyon eğrisi 4.5.4. 20 mg S IV Boyası İle Yapılan Kantitatif Analiz Çalışması 20 mg S IV boyar maddesinin Şekil 3.2.2.2.’de belirtilen prosedüre göre çalışılması sonucu elde edilen ekstrakt; başlangıçtaki boyar madde tartım değerine göre 200, 300, 400, 700, 900, 1000 mg/L’lik çözeltiler elde edilecek şekilde seyreltilmiştir. Her bir konsantrasyon değeri için beş tekrarlı çalışma sonucu elde edilen elde edilen kromatogramlarda gözlenen o-toluidin pikine ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.5.4.1.’de verilmiştir. Alan 118 600000 y = 623,57x - 105790 500000 R 2 = 0,997 400000 300000 200000 100000 LOD= 116,05 mg/L LOQ= 386,84 mg/L 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Konsantrasyon (mg/L) Şekil 4.5.4.1. S IV boyar maddesinin kromatogramında gözlenen o-toluidin pikine ait kalibrasyon eğrisi 4.5.5. Gerçek Örnek Çalışması 4.5.5.1. Gerçek Örneklerde Ekstraksiyon Çalışması Salça örneğinin kalitatif analizi sonucu, kromatogramda salçayı karakterize eden çok sayıda pik gözlenmesi özellikle ayırma amaçlı olarak ekstraksiyon teknikleri kullanılması gerekliliği ortaya çıkarmıştır. Bu amaçla Sudan boyar maddelerinin gerçek örneklerden ekstraksiyonu için genel olarak önerilmiş bir yöntem olan aseton ekstraksiyonu (Calbiani ve ark. 2004) uygulanmıştır. 5 g salça/10 ml aseton ekstraksiyonu sonucu elde edilen ekstraktın 4 ml’sine 13 ml pH=6 tamponu eklenmesi ve örneğin Şekil 3.2.2.2.’de belirtilen prosedüre göre çalışılması sonucu elde edilen GC- MS kromatogramı Şekil 4.5.5.1.1.’de verilmiştir. Bu kromatogramda salçayı karakterize eden 1 ve 2 numaralı piklere ait kütle spektrumları ise Şekil 4.5.5.1.2. ve Şekil 4.5.5.1.3.’te görülmektedir. Kromatogram ve spektrumlar değerlendirilip herhangi bir ekstraksiyon tekniği uygulanmadan elde edilen Şekil 4.3.5.1.’deki kromatogram ile Alan 119 karşılaştırıldığında; salçayı karakterize eden pik sayısındaki azalma nedeni ile aseton ekstraksiyonunun matriks etkilerinden ayırmada etkili olduğu tespit edilmiştir. (x10,000) 7.5 TIC 5.0 2.5 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 Zaman (dak.) Şekil 4.5.5.1.1. Salça ekstraktı için GC-MS kromatogramı % 100.0 147 75.0 50.0 207 25.0 0.0 150 160 170 180 190 200 m/z Şekil 4.5.5.1.2. Salça ekstraktına ait kromatogramdaki 1 numaralı pik için kütle spektrumu Bağıl yoğunluk Bağıl yoğunluk 1 2 120 % 100.0 147 75.0 50.0 25.0 0.0 146.950 146.975 147.000 147.025 147.050 m/z Şekil 4.5.5.1.3. Salça ekstraktına ait kromatogramdaki 2 numaralı pik için kütle spektrumu 4.5.5.2. Gerçek Örneklerden Geri Kazanım Çalışmaları Salça örneğinde doğal olarak tespit edilemeyen sudan boyar maddelerinin analizi için uygulanan metodun işlevselliğini görmek amacı ile salça örneklerine dışarıdan sudan boyar maddeleri katılmıştır. 3.2.4.1.c.’de belirtildiği şekilde hazırlanan ve Şekil 3.2.2.2.’de belirtilen deneysel işlemlerin uygulandığı örneklerin, GC-MS analizi sonucu elde edilen kromatogramlarında, Sudan boyar maddeleri için kantitatif analizde temel alınan parçalanma ürünleri tespit edilmiştir. a) Gerçek Örneklerden S I Boyar Maddesinin Geri Kazanımı 100 mg/L konsantrasyonundaki S I boyası için altı tekrarlı analiz sonucu elde edilen kromatogramda gözlenen anilin pikine ait alan değerleri Çizelge 4.5.5.2.1.’de verilmiştir. Buradan elde edilen ortalama alan değeri Şekil 4.5.1.1.’de verilen kalibrasyon eğrisinde yerine konulduğunda anilin için deneysel konsantrasyon değeri 71,13 mg/L ve yüzde geri kazanım değeri de %71,13 olarak belirlenmiştir. Bağıl yoğunluk 121 Çizelge 4.5.5.2.1. S I’in salça örneklerinden geri kazanımı çalışmalarında, GC-MS kromatogramlarında gözlenen anilin pikine ait alan değerleri 5791 8734 4386 4425 4223 7220 Ortalama alan = 5797 b) Gerçek Örneklerden S II Boyar Maddesinin Geri Kazanımı 200 mg/L konsantrasyonlu S II boyası için altı tekrarlı analiz sonucu elde edilen kromatogramda gözlenen 2,4-ksilidin pikine ait alan değerleri Çizelge 4.5.5.2.2.’de verilmiştir. Buradan elde edilen ortalama alan değeri Şekil 4.5.2.1.’de verilen kalibrasyon eğrisinde yerine konulduğunda 2,4-ksilidin için deneysel konsantrasyon değeri 186,93 mg/L ve yüzde geri kazanım değeri de %93,46 olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.5.5.2.2. S II’nin salça örneklerinden geri kazanımı çalışmalarında, GC-MS kromatogramlarında gözlenen 2,4-ksilidin pikine ait alan değerleri 9350 5983 8466 5955 5507 6985 Ortalama alan = 7041 c) Gerçek Örneklerden S III Boyar Maddesinin Geri Kazanımı 550 mg/L konsantrasyonlu S III boyası için altı tekrarlı analiz sonucu elde edilen kromatogramda gözlenen anilin pikine ait alan değerleri Çizelge 4.5.5.2.3.’te verilmiştir. Buradan elde edilen ortalama alan değeri Şekil 4.5.3.1.’de verilen 122 kalibrasyon eğrisinde yerine konulduğunda anilin için deneysel konsantrasyon değeri 147,13 mg/L ve yüzde geri kazanım değeri de % 26,75 olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.5.5.2.3. S III’ün salça örneklerinden geri kazanımı çalışmalarında, GC-MS kromatogramlarında gözlenen o-toluidin pikine ait alan değerleri 12487 16902 18369 19017 12965 12258 Ortalama alan = 15333 d) Gerçek Örneklerden S IV Boyar Maddesinin Geri Kazanımı 450 mg/L konsantrasyonlu S IV boyası için beş tekrarlı analiz sonucu elde edilen kromatogramda gözlenen o-toluidin pikine ait alan değerleri Çizelge 4.5.5.2.4.’te verilmiştir. Buradan elde edilen ortalama alan değeri Şekil 4.5.4.1.’de verilen kalibrasyon eğrisinde yerine konulduğunda o-toluidin için deneysel konsantrasyon değeri 176,64 mg/L ve yüzde geri kazanım değeri de % 39,25 olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.5.5.2.4. S IV’ün salça örneklerinden geri kazanımı çalışmalarında, GC-MS kromatogramlarında gözlenen o-toluidin pikine ait alan değerleri 3806 2920 5009 6379 3661 Ortalama alan = 4355 S I ve S II boyar maddelerine ait yüksek geri kazanım değerleri, metodun etkinliğini gösterirken; S III ve S IV boyar maddeleri için farklı modifikasyonların 123 gerekliliği ortaya çıkmıştır. Bu amaçla en düşük geri kazanım veren S III temel alınarak çalışmalar yapılmıştır. 4.6. UV-VIS Analizi İle pH Değişiminin Geri Kazanıma Etkisinin İncelenmesi Sudan boyar maddelerine ait sulu çözeltiler pH=1,5-4-6-8-10-12 değerlerine ayarlanmış ve bu çözeltilerin 200-900 nm aralığında taramalı olarak UV-VIS spektrumları alınmıştır. Elde edilen spektrumlar Şekil 4.6.1., Şekil 4.6.2., Şekil 4.6.3. ve Şekil 4.6.4.’te verilmiştir. Dalgaboyu (nm) Şekil 4.6.1. S I boyar maddesinin pH=1,5-12 aralığında UV-VIS spektrumları 124 Dalgaboyu (nm) Şekil 4.6.2. S II boyar maddesinin pH=1,5-12 aralığında UV-VIS spektrumları Dalgaboyu (nm) Şekil 4.6.3. S III boyar maddesinin pH=1,5-12 aralığında UV-VIS spektrumları 125 Dalgaboyu (nm) Şekil 4.6.4. S IV boyar maddesinin pH=1,5-12 aralığında UV-VIS spektrumları Maksimum absorbans değerlerinin gözlendiği pH değerleri, çözünürlüğün en çok olduğu değer seçilerek bu pH değerlerinde Şekil 3.2.2.2.’ye göre tekrar çalışılmış, gözlenen parçalanma ürünlerine ait alan değerleri pH=6’da elde edilen alan değerleri ile kıyaslanarak her Sudan boyar maddesi için en uygun pH değeri belirlenmiştir. 4.7. Farklı pH Değerlerinde Kimyasal İndirgeme İşlemi Yapılmasının Sudan Boyar Maddelerinin Geri Kazanımına Etkisi 4.7.1. pH=1,5 Ortamında Çalışılmasının Sudan Boyar Maddelerinin Geri Kazanımına Etkisi Ortam, pH=1,5 değerine ayarlandığında S I, S II, S III ve S IV boyar maddelerinin GC-MS kromatogramlarında gözlenen anilin, 2,4-ksilidin, anilin ve o- toluidin piklerine ait beş tekrarlı analiz sonucu elde edilen ortalama alan değerleri ve aynı parçalanma ürünlerinin pH=6’daki alan değerleri Çizelge 4.7.1.1.’de verilmiştir. 126 Çizelge 4.7.1.1. Sudan boyar maddelerinin pH=1,5 ve pH=6 ortamlarında parçalanma ürünlerine ait GC-MS kromatogramlarından belirlenen alan değerleri Ortalama alan değeri Ortalama alan değeri Boyar madde (pH=6) (pH=1,5) S I 76070 10500 S II 51053 2982 S III 32809 215041 S IV 88438 56544 4.7.2. pH=1,5 Ortamında Isıl İşlem Olmaksızın, Oda Sıcaklığında ve Ultrasonik Karıştırıcıda Çalışılmasının S II Boyar Maddesinin Geri Kazanımına Etkisi Parçalanmada ısıl işlemin etkin olup olmadığının incelenmesi için, en yüksek geri kaxzanım değerinin tespit edildiği S II boyar maddesi temel alınarak çalışmalar yapılmıştır. Kimyasal indirgeme işlemi; pH=6’da, oda sıcaklığında ve boyar maddenin indirgen madde ile ultrasonik karıştırıcıda tutulması ile gerçekleştirilmiştir. Bu işlem sonucu elde edilen GC-MS kromatogramı, aynı pH değerinde ve 70°C’lik ısıl ortamda gerçekleştirilen kimyasal indirgeme sonucu elde edilen GC-MS kromatogramı ile karşılaştırılmıştır. Karşılaştırmada yine beş tekrarlı çalışma yapılmış ve her iki durumda da kromatogramlarda gözlenen 2,4-ksilidine ait alan değerleri temel alınmıştır. Sonuçlar Çizelge 4.7.2.1.’de verilmiştir. Çizelge 4.7.2.1. S II boyar maddesinin pH=6 ortamında ısıl işlem uygulandığında ve pH=6 da ısıl işlem olmadan çalışılması sonucu GC-MS kromatogramlarında gözlenen parçalanma ürününe ait ortalama alan değerleri Isıl işlem uygulandığında Isıl işlem uygulanmadığında ortalama alan (pH=6) ortalama alan (pH=6) S II 51053 31205 Çizelge 4.7.2.1.’deki veriler karşılaştırıldığında, S II boyar maddesinin ısıl işlem olmadan da parçalanmaya yatkın olduğu görülmektedir. 127 4.7.3. pH=4 Ortamında Çalışılmasının S IV Boyar Maddesinin Geri Kazanımına Etkisi Ortam, pH=4 değerine ayarlanıp kimyasal indirgeme yapıldığında S IV boyar maddesinin GC-MS kromatogramında gözlenen o-toluidin pikine ait beş tekrarlı analiz sonucu elde edilen ortalama alan değeri ile; diğer çalışılan pH ortamları ve elde edilen alan değerleri Çizelge 4.7.3.1.’de verilmiştir. Çizelge 4.7.3.1. Farklı pH değerlerinde S IV boyar maddesinin GC-MS kromatogramlarında gözlenen parçalanma ürününe ait ortalama alan değerleri Boyar Ortalama alan Ortalama alan Ortalama alan madde (pH=1,5) (pH=4) (pH=6) S IV 56544 83020 88438 S I boyar maddesinin farklı pH değerinde parçalanma ürününe ait ortalama alan değerleri karşılaştırıldığında pH=6’daki alan değerleri ile pH=1,5’taki alan değerinin birbirine yakın olduğu tespit edilmiştir. S II için de durum aynı olmakla birlikte, ısıl işlem olmadan da Sudan boyar maddelerinin parçalanma etkinliği S II çalışması ile doğrulanmıştır. Bu da boyar maddelerin parçalanmaya dirençli olmadığını göstermektedir. S IV boyar maddesi ile yapılan çalışmalar, diğer deneysel parametreler sabitken sadece pH değişiminin kalibrasyonda farklılık yaratmayacağı sonucunu göstermiştir. S III için ise pH=1,5 değerinin kimyasal indirgemede daha etkili olduğu tespit edilmiştir. 128 4.7.4. pH=1,5 Ortamında S III Boyar Maddesinin Parçalanma Ürününe Ait Kalibrasyon Eğrisi S III boyar maddesi için, pH=1,5 ortamında çalışılmasının pH=6 ortamına kıyasla parçalanma ürünü için daha yüksek alan değeri vermesi nedeni ile pH=1,5 ortamında çalışılarak geri kazanıma etkisi incelenmiştir. pH değişimi dışındaki diğer deneysel parametreler sabit tutulmuş ve Şekil 4.7.4.1.’de gösterilen yeni kalibrasyon eğrisi oluşturulmuştur. 50000 y = 58,706x - 6730,7 45000 R2 = 0,995 40000 35000 30000 25000 20000 15000 LOD= 44,51 mg/L 10000 LOQ= 148,38 mg/L 5000 0 0 200 400 600 800 1000 Konsantrasyon (mg/L) Şekil 4.7.4.1. pH=1,5 ortamında S III boyar maddesinin GC-MS kromatogramında gözlenen anilin pikine ait kalibrasyon eğrisi Salça örneğine 500 mg/L S III katılması sonrası beş tekrarlı analiz ile elde edilen ortalama alan değeri 8263,33; deneysel konsantrasyon değeri 255,41 ve yüzde geri kazanım ise %51,10 olarak belirlenmiştir. Yüzde geri kazanımın arttığı tespit edildiğinden optimum şartların belirlenmesi için örnek olarak S III boyar maddesi alınarak kemometrik yöntemden yararlanılmıştır. Alan 129 4.8. Kemometrik Yöntem Optimizasyon için kullanılan değişkenler sıcaklık ve sodyum ditiyonit indirgeni miktarıdır. Bu değişkenler temel alınarak merkezi kompozit dizayn yöntemi uygulanmıştır. Sıcaklık ve indirgen miktarı hariç; diğer deneysel koşullar sabit tutulmuş ve iki değişken için deneysel koşullar Çizelge 4.8.1.’de; deneysel plan da Çizelge 4.8.2.’de belirtilmiştir. Çizelge 4.8.1. S III boyasının kimyasal indirgenmesinde sıcaklık ve indirgen miktarının optimizasyonu için deneysel koşullar -1,41 -1 0 +1 +1,41 x1 (SD derişimi, M) 0,295 0,5 1 1,5 1,705 x2 (Sıcaklık, ºC) 21,8 30 50 70 78,2 Çizelge 4.8.2. S III boyasının kimyasal indirgenmesinde sıcaklık ve indirgen miktarının optimizasyonu çalışmalarında her bir deney koşulunu gösteren deneysel plan Kod Değer Deneysel Değer Deney No x1 x1 x1 (M) x2(°C ) 1 -1 -1 0,5 30 2 +1 -1 1,5 30 3 -1 +1 0,5 70 4 +1 +1 1,5 70 5 -1,41 0 0,295 50 6 +1,41 0 1,705 50 7 0 -1,41 1 21,8 8 0 +1,41 1 78,2 9 0 0 1 50 130 Deneysel olarak belirlenen anilin alanları Çizelge 4.8.3.’te görülmektedir. Çizelge 4.8.3. Optimizasyon çalışmalarında, S III boyasının kimyasal olarak indirgenmesi sonucu, indirgenme ürününe ait olarak her bir deneysel koşulda belirlenen alan değerleri Deney y (indirgenme ürününün No alan değeri) 1 74498 2 54600,44 3 122912,2 4 28118,8 5 167298,1 6 67398,86 7 20166,38 8 277142,1 9 34378,11 y=b1x1+b2x2+b x 211 1 +b 222x2 +b12x12 denkleminin katsayıları (4.8.3.-1) eşitliğinde görüldüğü gibidir. (y) Alan= -32039 x1 + 48177x2 + 42989x 2 1 + 58736x 2 2 -18724x1x2 (4.8.3.-1) Bu denklemin sırası ile x1 ve x2’ ye göre alınan türevleri alınıp sıfıra eşitlendiğinde x1 ve x2 değişkenleri teorik olarak -0,5904 ve -0,2507 olarak belirlenirken; bu teorik değerler xteorik= ((x(gerçek)-orta değer)/ (orta değer ile en yakını arası fark)) eşitliğinde yerine konduğunda değişkenlerin deneysel değerleri sırası ile x1=1,3 M ve x2=45°C olarak belirlenmiştir. Kemometrik yöntem ile optimum koşullar belirlendikten sonra S III için belirlenen bu optimum koşullarda deneysel olarak elde edilen kalibrasyon eğrisi Şekil 4.8.1.’de verilmiştir. 131 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 0 200 400 600 800 1000 1200 Konsantrasyon (mg/L) Şekil 4.8.1. pH=1,5 ortamında ve optimum koşullarda S III boyar maddesinin indirgenme ürünü pikine ait kalibrasyon eğrisi Kalibrasyon eğrisinden de görüldüğü gibi optimum koşullar, belirli boya derişimi için en yüksek alan değerini vermektedir. Bu da belirlenen miktardaki sodyum ditiyonitin yine belirlenen sıcaklıkta parçalayabileceği boya miktarının da sınırlayıcı etken olduğunu göstermiştir. Optimum konsantrasyon değeri olan 400 mg/L’ nin altındaki değerlerde boyar maddenin indirgenme ürününün daha ileri düzeyde parçalanmaya uğradığı; 400 mg/L’ nin üstündeki değerlerde ise bu parçalanma ürününe ait alan değerlerinin azaldığı tespit edilmiştir. Buradan, boyar madde miktarı azaldıkça kimyasal indirgen ile temastaki yüzey alanının arttığı; ancak belirli boyar madde derişiminin altındaki değerlerde indirgenin ileri düzeyde parçalanmalara yol açabildiği tespit edilmiştir. Şekil 4.8.1.’deki kalibrasyon eğrisinden de görülebileceği gibi özellikle indirgen derişimi optimum düzeyde iken bu ileri düzeydeki parçalanma önem kazanmaktadır. Alan 132 5. SONUÇ Sudan I, II, III ve Sudan IV boyaları; genetoksik ve mutajenik etkileri nedeni ile gıdalarda kullanımı yasal olmayan sentetik azo boyalarıdır. Buna rağmen kullanımları tamamen ortadan kaldırılamamıştır. Gıdalarda eser seviyede bulunabileceğinden; bu boyar maddelerin gıda ürünlerinde ilk kez tespit edildiği tarihten itibaren uygun analitik metot gelişimi önem kazanmıştır. Bizim çalışmamız da böyle bir analitik metot gelişimi üzerine odaklanmıştır. Yüksek molekül kütleleri nedeni ile literatürde Sudan boyalarının GC-MS çalışmalarına yer verilmemiş olmakla birlikte; çalışmamızda, bu boyar maddelerin tespit ve tayini için yaygın olarak kullanılan sıvı kromatografisine alternatif olarak GC-MS analizlerinin yapılabilirliği gösterilmiştir. Bu anlamda analiz tekniği açısından yenilik sunulmaktadır. Çalışmamız sonucunda; S I ve S II boyar maddelerinin, kaynama noktaları uygun olduğu için, doğrudan GC-MS analizlerinin yapılabileceği görülmüştür. Azo boyalarının kromofor azo grupları üzerinden indirgenebilme özellikleri bilindiğinden, S III ve S IV boyar maddelerinin parçalama yolu ile analizleri gerçekleştirilmiştir. Böylece daha küçük molekül kütleli ve kaynama noktaları GC-MS analizi için uygun parçalanma ürünleri anilin ve o-toluidin üzerinden karakterizasyon yapılmıştır. İndirgeyerek analiz yöntemi sadece S III ve S IV boyar maddelerine değil; S I ve S I boyar maddelerine de uygulanmıştır. Bu boyaların GC-MS analizleri sonucu karakteristik parçalanma ürünleri ise sırası ile anilin ve 2,4- ksilidin’dir. Boya yapısının parçalanması amacı ile kimyasal indirgeme yönteminden yararlanılmış ve tekstil ürünlerindeki yasaklı azo boyalarının tayininde yaygın olarak kullanılan referans metot temel alınarak sözü edilen parçalama işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu boyaların, ısıl işlem olmadan yapılan indirgeme işleminin de kanıtladığı gibi, parçalanmaya yatkın ve parçalanma ürünlerinin yasaklı aril amin listelerinde de görebileceğimiz aromatik aminler olduğu belirlenmiştir. Boyar maddelerin pH=1,5 ortamında çözünürlüğünün yüksek olduğu ve ısıl işlemle parçalama veriminin arttığı tespit edilmiştir. Mide pH değeri ve gıdaların pişirilmesi göz önüne alındığında toksisitelerinin belirlenmesinin zorunlu olduğu söylenebilir. Bu amaçla da ileri düzeyde indirgemeye neden olmayacak; fakat GC-MS analizi için de tespiti 133 mümkün kılacak oranda aril amin oluşumunun önemli olduğu görülmektedir. Kullandığımız sodyum ditiyonit indirgeninin de bu anlamda yeterli olduğu kanıtlanmıştır. S III için kemometri çalışmalarından da görüldüğü gibi yaygın olarak kullanılan indirgeme metodunun boyar madde doğasına bağlı olarak modifie edilmesi gerekliliği ortaya çıkmaktadır. LC-MS analizleri için salça matriksinden bu boyaların izole edilmesinde literatürde önerilen çözücülerden biri olan aseton ekstraksiyonunun yeterli olduğu belirlendiği için; GC-MS analizleri için de aseton ekstraksiyonuna dayalı örnek hazırlama metodu geliştirilmiştir. Her boyar madde için karakteristik parçalanma ürünleri tespit edildiğinden; uyguladığımız deneysel şartlarda LC-MS analizine oranla GC-MS analiz sonuçlarını kromatogramlar açısından karşılaştırırsak; GC-MS’te ayrımın daha iyi olduğu belirlenmiştir. Bu nedenle de GC-MS, parçalanma ürünleri üzerinden Sudan boyar maddelerinin eş zamanlı tayini için de uygun bir yöntemdir; Sudan boyar maddelerinin LC-MS ile doğrudan tayinlerine alternatif yöntem parçalanarak, GC-MS ile dolaylı tayinleridir. 134 KAYNAKLAR AHLSTROM, L-H., C.S. ESKILSSON, E. BJORKLUND. 2005. Determination of banned azo dyes in consumer goods. Trends in Analytical Chemistry, vol.24, no.1. AHLSTROM, L-H., J. RAAB, L. MATHIASSON. 2005. Application of standard addition methodology for the determination of banned azo dyes in different leather types. Analytica Chimica Acta, 552:76-80. ASU B-82.02/2. 1998-01. Nachweis der Verwendung Bestimmter Azofarbstoffe aus textilen Bedarfsgegenständen. Beuth Verlag, 10772 Berlin. 'BAKER'-10 SPE Applications Guide. 1984. Vol.2, p.96-110. BELITZ, H.-D., W. GROSCH, P. SCHIEBERLE. 2004. Food Chemistry 3rd revised Edition, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany. p.393,787,792. BHASKAR, M., A.GNANAMANI, R.J.GANESHJEEVAN, R.CHANDRASEKAR, S.SADULLA, G.RADHAKRISHNAN. 2003. Analyses of carcinogenic aromatic amines released from harmful azo colorants by Streptomyces SP. SS07. Journal of Chromatography A, 1018:117-123. BHASKAR,M., P.ARUNA, R.J.G.JEEVAN, G.RADHAKRISHNAN. 2004. β- Cyclodextrin-polyurethane polymer as solid phase extraction material for the analysis of carcinogenic aromatic amines. Analytica Chimica Acta, 509:39-45. BOBROV, N. 1975. Ju Lurie Handbook of Analytical Chemistry, Moscow. p.254. 135 CALBIANI, F., M. CARERI, L. ELVIRI, A.MANGIA, L.PISTARA, I.ZAGNONI. 2004. Development and in-house validation of a liquid chromatography-electrospray- tandem mass spectrometry method for the simultaneous determination of Sudan I, Sudan II, Sudan III and Sudan IV in hot chilli products. Journal of Chromatography A, 1042:123-130. CALBIANI, F., M. CARERI, L. ELVIRI, A. MANGIA, I. ZAGNONI. 2004. Accurate mass measurements for the confirmation of Sudan-azo dyes in hot chilli products by capillary liquid chromatography-electrospray tandem quadrupole orthogonal-acceleration time of flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1058:127-135. CHANG, W-Y., Y-H. SUNG, S-D. HUANG. 2003. Analysis of carcinogenic aromatic amines in water samples by solid-phase microextraction coupled with high-performance liquid chromatography. Analytica Chimica Acta, 495:109-122. CHANLON, S., L. JOLY-POTTUZ, M. CHATELUT, O. VITTORI, J.L. CRETIER. 2005. Determination of Carmoisine, Allura red and Ponceau 4R in sweets and soft drinks by differential pulse polarography. Journal of Food Composition and Analysis, 18:503–515. CHIANG, T-A., W. PEI-FEN, L.S. YING, L-F. WANG, Y.C. KO. 1999. Mutagenicity and aromatic amine content of fumes from heated cooking oils produced in Taiwan. Food and Chemical Toxicology, 37:125-134. CIONI, F., G. BARTOLUCCI, G. PIERACCINI, S. MELONI, G. MONETI. 1999. Development of a solid phase microextraction method for detection of the use of banned azo dyes in coloured textiles and leather. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 13:1833-1837. 136 CISNEROS, R.L., A.G. ESPINOZA, M.I. LITTER. 2002. Photodegradation of an azo dye of the textile industry. Chemosphere, 48:393-399. COMMISSION DECISION. 2003. On Emergency Measures Regarding Hot Chilli And Hot Chilli Products. 2003/460/EC. COMMISSION DECISION. 2004. On Emergency Measures Regarding Chilli And Chilli Products. 2004/92/EC. CORNET, V., Y. GOVAERT, G. MOENS, J.V. LOCO, J-M. DEGROODT. 2006. Development of a fast analytical method for the determination of sudan dyes in chilli- and curry-containing foodstuffs by high-performance liquid chromatography- photodiode array detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54:639-644. CSIKTUSNADI KISS,G.A., E.FORGACS, T.CSERHATI, T.MOTA, H.MORAIS, A.RAMOS. 2000. Optimisation of the microwave-assisted extraction of pigments from paprika (Capsicum annuum L.) powders. Journal of Chromatography A, 889:41–49. DAVIES, L.C., I.S. PEDRO, J.M. NOVAIS, S. MARTINS-DIAS. 2006. Aerobic degradation of acid orange 7 in a vertical-flow constructed wetland. Water Research, 40:2055-2063. DI DONNA, L., L. MAIUOLO, F. MAZZOTTI, D. DE LUCA, G. SINDONA. 2004. Assay of sudan I contamination of foodstuff by atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry and isotope dilution. Analytical Chemistry, 76(17):5104-5108. DEMİR, C. 2003. Kemometri Yaz Okulu-I Ders Notları. Uludağ Üniversitesi Fen- Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü-Tübitak Bursa Test ve Analiz Laboratuvarı. Bursa, 30 Haziran-4 Temmuz 2003. s.5-15. 137 DOS SANTOS, A.B., M.P. DE MADRID, F.A.M. DE BOK, A.J.M. STAMS, J.B. VAN LIER, F.J. CERVANTES. 2006. The contribution of fermentative bacteria and methanogenic archaea to azo dye reduction by a thermophilic anaerobic consortium. Enzyme and Microbial Technology, 39:38–46. ESKILSSON, C.S., R. DAVIDSSON, L. MATHIASSON. 2002. Harmful azo colorants in leather Determination based on their cleavage and extraction of corresponding carcinogenic aromatic amines using modern extraction techniques. Journal of Chromatography A, 955:215-227. FENG, W., D. NANSHENG, H. HELIN. 2000. Degradation mechanism of azo dye C. I. reactive red 2 by iron powder reduction and photooxidation in aqueous solutions. Chemosphere, 41:1233-1238. GARRIGOS, M.C., F. RECHE, M.L. MARIN, A. JIMENEZ. 2002. Determination of aromatic amines formed from azo colorants in toy products. Journal of Chromatography A, 976:309-317. GARRIGOS, M.C., F. RECHE, M.L. MARIN, K. PERNIAS, A. JIMENEZ. 2002. Optimization of the extraction of azo colorants used in toy products. Journal of Chromatography A, 963:427-433. GHANADZADEH, A., H. GHANADZADEH, G. GHASMI. 2000. On the molecular structure and aggregative properties of sudan dyes in the anisotropic host. Journal of Molecular Liquids, 88:299-308. GNANAMANI, A., M. BHASKAR, R. GANGA, G. SEKARAN, S. SADULLA. 2004. Chemical and enzymatic interactions of Direct Black 38 and Direct Brown 1 on release of carcinogenic amines. Chemosphere, 56:833-841. 138 GNANAMANI,A., M.BHASKAR, R.GANESHJEEVAN, R.CHANDRASEKAR, G.SEKARAN, S.SADULLA, G.RADHAKRISHNAN. 2005. Enzymatic and chemical catalysis of xylidine ponceau 2R and evaluation of products released. Process Biochemistry, 40:3497–3504. GOLKA, K., S. KOPPS, Z.W. MYSLAK. 2004. Carcinogenicity of azo colorants: influence of solubility and bioavailability. Toxicology Letters, 151:203-210. GULTEKİN, I., N.H. INCE. 2006. Degradation of aryl-azo-naphthol dyes by ultrasound, ozone and their combination: Effect of α-substituents. Ultrasonics Sonochemistry, 13:208–214. HSUEH, C.L., Y.H. HUANG, C.C. WANG, C.Y. CHEN. 2005. Degradation of azo dyes using low iron concentration of Fenton and Fenton-like system. Chemosphere, 58:1409–1414. İNTERNET KAYNAKLARI http://www.chem.arizona.edu/massspec/intro_html/intro.html http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/MassSpec/masspec1.htm http://minyos.its.rmit.edu.au/~rcmfa/ http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/gcms.html http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/MStut/mstutorial.htm http://www.oberlin.edu/chem/Secondary/ExpDev/GCMSIntro.pdf http://ch309c.chem.lsu.edu/mswiki/index.php/Liquid_chromatography- mass_spectrometry http://www.bris.ac.uk/nerclsmsf/techniques/hplcms.html http://faculty.kutztown.edu/betts/html/UV_Vis_Absorbance.htm http://mst.dk/udgiv/publications/1999/87-7909-548-8/pdf/87-7909-546-1.pdf http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/chemidheavy.jsp http://chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ 139 INOUE, M., F. OKADA, A. SAKURAI, M. SAKAKIBARA. 2006. A new development of dyestuffs degradation system using ultrasound. Ultrasonics Sonochemistry, 13:313–320. JODYNIS-LIEBERT, J., H.A.H. BENNASIR. 2000. Gas chromatographic method for the determination of toluidines in spiked urine samples. Journal of Chromatography B, 738:427-430. KHEHRA, M.S., H.S. SAINI, D.K. SHARMA, B.S. CHADHA, S.S. CHIMNI. 2006. Biodegradation of azo dye C.I. Acid Red 88 by an anoxic-aerobic sequential bioreactor. Dyes and Pigments, 70:1-7. KRAJAYKLANG, M., A. KLIEBER, P.R. DRY. 2000. Colour at harvest and post- harvest behaviour influence paprika and chilli spice quality. Postharvest Biology and Technology, 20:269-278. KUMAR, K., S. SARAVANA DEVI, K. KRISHNAMURTHI, S. GAMPAWAR, N. MISHRA, G.H.PANDYA, T.CHAKRABARTI. 2006. Decolorisation, biodegradation and detoxification of benzidine based azo dye. Bioresource Technology, 97:407-413. LESS, M., T.C. SCHMIDT, E. VON LÖW, G. STORK. 1998. Gas chromatographic determination of aromatic amines in water samples after solid-phase extraction and derivatization with iodine II. Enrichment. Journal of Chromatography A, 810:173-182. MA, M., X. LUO, B. CHEN, S. SU, S. YAO. 2006. Simultaneous determination of water-soluble and fat-soluble synthetic colorants in foodstuff by high-performance liquid chromatography-diode array detection-electrospray mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1103:170-176. MARSHALL, P.N. 1977. Thin-layer chromatography of Sudan dyes. Journal of Chromatography A, 136(2):353-357. 140 MAZZETTI, M., R. FASCIOLI, I. MAZZONCINI, G. SPINELLI, I. MORELLI, A. BERTOLI. 2004. Determination of 1-phenylazo-2-naphthol (Sudan I) in chilli powder and in chilli-containing food products by GPC clean-up and HPLC with LC/MS confirmation. Food Additives and Contaminants, 21(10):935-941. MEYER, L.H. 1961. Food Chemistry, Reinhold Publishing Corporation, United States of America. p.233. MODIRSHAHLA, N., M.A. BEHNAJADY. 2006. Photooxidative degradation of Malachite Green (MG) by UV/H2O2: Influence of operational parameters and kinetic modeling. Dyes and Pigments, 70:54-59. MORTENSEN, S.K., X.T. TRIER, A. FOVERSKOV, J.H. PETERSEN. 2005. Specific determination of 20 primary aromatic amines in aqueous food simulants by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1091:40-50. NACHIYAR, C.V., G.S. RAJAKUMAR. 2004. Mechanism of Navitan Fast Blue S5R degradation by Pseudomonas aeruginosa. Chemosphere, 57:165-169. OH, S.W., M.N. KANG, C.W. CHO, M.W. LEE. 1997. Detection of carcinogenic amines from dyestuffs or dyed substrates. Dyes and Pigments, 33:119-135. PERVA-UZUNALIC, A., M. SKERGET, B. WEINREICH, Z. KNEZ. 2004. Extraction of chilli pepper (var. Byedige) with supercritical CO2: Effect of pressure and temperature on capsaicinoid and colour extraction efficiency. Food Chemistry, 87:51- 58. PIELESZ, A. 1999. The process of the reduction of azo dyes used in dyeing textiles on the basis of infrared spectroscopy analysis. Journal of Molecular Structure, 511- 512:337-344. 141 PIELESZ, A., A. WLOCHOWICZ, W. BINIAS. 2000. The evaluation of structural changes in wool fibre keratin treated with azo dyes by Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Spectrochimica Acta Part A, 56:1409-1420. PIELESZ, A., A. WLOCHOWICZ. 2001. Semiempirical infrared spectra simulations for some aromatic amines of interest for azo dye chemistry. Spectrochimica Acta Part A, 57:2637-2646. PIELESZ, A., I. BARANOWSKA, A. RYBAK, A. WLOCHOWICZ. 2002. Detection and determination of aromatic amines as products of reductive splitting from selected azo dyes. Ecotoxicology and Environmental Safety, 53:42-47. PINHEIROA, H.M., E. TOURAUD, O. THOMAS. 2004. Aromatic amines from azo dye reduction: status review with emphasis on direct UV spectrophotometric detection in textile industry wastewaters. Dyes and Pigments, 61:121–139. PLUM, A., W. ENGEWALD, A. REHOREK. 2003. Rapid qualitative pyrolysis GC- MS analysis of carcinogenic aromatic amines from dyed textiles. Chromatographia Supplement 57:S243-S248. PUOCI, F., C. GARREFFA, F. IEMMA, R. MUZZALUPO, U.G. SPIZZIRRI, N. PICCI. 2004. Molecularly imprinted solid phase extraction for detection of sudan I in food matrices. Food Chemistry, 93(2):349-353. SINGH, V., M. GUPTA, A. JAIN, K.K. VERMA. 2003. Determination of aromatic primary amines at μg l-1 level in environmental waters by gas chromatography–mass spectrometry involving N-allyl-N'-arylthiourea formation and their on-line pyrolysis to aryl isothiocyanates. Journal of Chromatography A, 1010:243–253. SKOOG, D., F.J. HOLLER, T.A. NIEMAN. 1998. Enstrümantal Analiz İlkeleri, Bilim Yayıncılık, Ankara. s.253-258,330,331,332,335,499,500,502,509,512,524-528. 142 SMITH, C.J., G.L. DOOLY, S.C. MOLDOVEANU. 2003. New technique using solid-phase extraction for the analysis of aromatic amines in mainstream cigarette smoke. Journal of Chromatography A, 991:99-107. SPONZA, D.T., M. IŞIK. 2005. Toxicity and intermediates of C.I. Direct Red 28 dye through sequential anaerobic/aerobic treatment. Process Biochemistry, 40:2735–2744. STIBOROVA, M., B. ASFAW, E. FREI, H.H. SCHMEISER, M. WIESSLER. 1995. Benzenediazonium ion derived from sudan-I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chemical Research in Toxicology, 8(4):489-498. STIBOROVA, M., B. ASFAW, P. ANZENBACHER. 1988. Activation of carcinogens by peroxidase Horseradish peroxidase-mediated formation of benzenediazonium ion from a non-aminoazo dye, 1-phenylazo-2-hydroxynaphthalene (Sudan I) and its binding to DNA. FEBS LETTERS, 232(2):387-390. STIBOROVA, M., H.H. SCHMEISER, E. FREI. 1999. Prostaglandin H synthase- mediated oxidation and binding to DNA of a detoxication metabolite of carcinogenic Sudan I, 1-(phenylazo)-2,6-dihydroxynaphthalene. Cancer Letters, 146:53-60. STIBOROVA, M., V. MARTINEK, H. RYDLOVA, P. HODEK, E. FREI. 2002. Sudan I is a potential carcinogen for humans: Evidence for its metabolic activation and detoxication by human recombinant cytochrome P450 1A1 and liver microsomes. Cancer Research, 62(20):5678-5684. STIBOROVA, M., V. MARTINEK, H. RYDLOVA, T. KOBLAS, P. HODEK. 2005. Expression of cytochrome P450 1A1 and its contribution to oxidation of a potential human carcinogen 1-phenylazo-2-naphthol (Sudan I) in human livers. Cancer Letters, 220:145-154. 143 TATEO,F., M.BONONI. 2004. Fast determination of sudan I by HPLC/APCI-MS in hot chilli spices, and oven-baked foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52:655-658. TRIPATHI, M., S.K. KHANNA, M. DAS. 2007. Surveillance on use of synthetic colours in eatables vis a vis Prevention of Food Adulteration Act of India. Food Control, 18:211-219. WAITE, S., D. HANSEN, M. McGINLEY. 2006. Easy isocratic HPLC determination of Sudan dyes. LC GC NORTH AMERICA, 46-46 Suppl. S. WEISS, T., J. ANGERER. 2002. Simultaneous determination of various aromatic amines and metabolites of aromatic nitro compounds in urine for low level exposure using gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 778:179– 192. WEISBURGER, J.H. 2002. Comments on the history and importance of aromatic and heterocyclic amines in public health. Mutation Research, 506-507:9-20. WU, L.P., Y.F. LI, C.Z. HUANG, Q. ZHANG. 2006. Visual detection of sudan dyes based on the plasmon resonance light scattering signals of silver nanoparticles. Analytical Chemistry, 78(15):5570-5577. WOJNAROVITS, L., T. PALFI, E. TAKACS, S.S. EMMI. 2005. Reactivity differences of hydroxyl radicals and hydrated electrons in destructing azo dyes. Radiation Physics and Chemistry, 74(3-4):239–246. ZATAR, N.A., A.Z. ABU-ZUHRI, A.A. ABU-SHAWEESH. 1998. Spectrophotometric determination of some aromatic amines. Talanta, 47:883-890. 144 ZHANG, Y.P., Y.J. ZHANG, W.J. GONG, A.I. GOPALAN, K-P. LEE. 2005. Rapid seperation of Sudan dyes by reverse-phase high performance liquid chromatography through statistically designed experiments. Journal of Chromatography A, 1098:183- 187. ZHANG, S-J., H-Q. YU, Q-R. LI. 2005. Radiolytic degradation of Acid Orange 7: A mechanistic study. Chemosphere, 61:1003-1011. ZHAO, W., H. SHI, D. WANG. 2004. Ozonation of Cationic Red X-GRL in aqueous solution: degradation and mechanism. Chemosphere, 57:1189–1199. 145 EKLER TEZ KAPSAMINDA GERÇEKLEŞTİRİLEN BİLİMSEL FAALİYETLER KONGRELER Ümran SEVEN, Şeref GÜÇER; “Biber Salçasına Katılan Sudan Boyalarının Karakterizasyonu ve Sudan I' in (1-Fenilazo-2-naftol) GC-MS İle Kantitatif Olarak Belirlenmesi”, III. ULUSAL ANALİTİK KİMYA KONGRESİ, 5-7 Temmuz 2006, Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi, ÇANAKKALE. Bildiri Özetleri, s.57. Ümran SEVEN, Nihan KOYUNCU, Şeref GÜÇER; “Characterization Studies of Sudan Dyes in Chilli Products by Chromatographic Methods” 5th AEGEAN ANALYTICAL CHEMISTRY DAYS, 5-8 October 2006, Aristotle University of Thessaloniki, Chemistry Department, , Thessaloniki/GREECE. Book of Abstracts, p.80. 146 TEŞEKKÜR Yüksek Lisansım ve tez çalışmam boyunca bilimsel bakış açısı edinmemi sağlayan, öğrencisi olduğum için her zaman gurur duyduğum ve gurur duyacağım, hayatım boyunca her yönü ile hep örnek alacağım, tezimin en büyük mimarı, danışman hocam Sayın Prof. Dr. Şeref GÜÇER’e tüm emekleri, katkıları, ilgi ve sevgisi için sonsuz teşekkür ederim. Yardımlarını, sevgisini hiçbir zaman esirgemeyen ve tez çalışmalarım boyunca her zaman olumlu katkıları ile destek olan; yardımseverliği, pozitif ve sonsuz sevgi dolu kişiliği ile örnek alacağım Sayın Yrd.Doç.Dr. Belgin İZGİ’ye; Manevi ablam olarak gördüğüm Araş.Gör. Elif TÜMAY ÖZER’e; Deneysel çalışmalarım boyunca gösterdikleri katkıları hiçbir zaman unutamayacağım, başta Nihan KOYUNCU ve Murat KAYAR olmak üzere, tüm Tübitak-Bursa Test ve Analiz Laboratuvarı çalışanlarına; Yardımseverlikleri anlatmakla bitirilemeyecek olan ve kendilerini tanıdığım için yaşadığım mutluluğu tarif edemeyeceğim, her zaman olumlu katkılarını ve karşılıksız yardımlarını gördüğüm; bu nedenle de ayrı yerleri olan Araş.Gör. Yeliz FATURACI, Araş.Gör. Hasene MUTLU ve Araş.Gör.Bilgen OSMAN’ a; Lisans öğrenimimden başlayarak hep yanımda olan değerli arkadaşım Aylin Öztürk’ e; Geç tanımış olsam da manevi olarak yanımda olduklarını hissettiren arkadaşlarım Gülsüm Ekici ve Neslihan Fındıkkaya’ya; Ve tabi ki bugünlere gelmemde en büyük katkısı olan başta biricik anneciğim olmak üzere aileme; Sonsuz teşekkür ederim. 147 ÖZGEÇMİŞ 1982 yılında Kelkit/Gümüşhane’de doğdu. İlk, orta ve lise öğrenimini Aliağa/İzmir’ de tamamladı. 1999 yılında Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümünde lisans öğrenimine başladı. 2003 yılında Fen-Edebiyat Fakültesi Birincisi ve Kimya Bölümü Birincisi olarak mezun oldu. Aynı yıl, Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, Analitik Kimya Bilim Dalında Yüksek Lisans öğrenimine başladı. Ocak 2005 yılından itibaren de Uludağ Üniversitesi Fen- Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümünde Araştırma Görevlisi olarak çalışmaktadır.