FULLEREN NANOPARTİKÜLLERİNİN RADYASYONA MARUZ BIRAKILAN A549 İNSAN AKCİĞER EPİTEL HÜCRELERİ ÜZERİNDEKİ KORUYUCU ETKİLERİNİN MİKRONÜKLEUS VE gH2AX TEST YÖNTEMLERİ KULLANILARAK ARAŞTIRILMASI Mümün COŞKUN T.C. ULUDAĞ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FULLEREN NANOPARTİKÜLLERİNİN RADYASYONA MARUZ BIRAKILAN A549 İNSAN AKCİĞER EPİTEL HÜCRELERİ ÜZERİNDEKİ KORUYUCU ETKİLERİNİN MİKRONÜKLEUS VE gH2AX TEST YÖNTEMLERİ KULLANILARAK ARAŞTIRILMASI Mümün COŞKUN Doç. Dr. Tolga ÇAVAŞ (Danışman) YÜKSEK LİSANS TEZi BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bursa – 2013 Her Hakkı Saklıdır ÖZET Yüksek Lisans Tezi FULLEREN NANOPARTİKÜLLERİNİN RADYASYONA MARUZ BIRAKILAN A549 İNSAN AKCİĞER EPİTEL HÜCRELERİ ÜZERİNDEKİ KORUYUCU ETKİLERİNİN MİKRONÜKLEUS VE gH2AX TEST YÖNTEMLERİ KULLANILARAK ARAŞTIRILMASI Mümün COŞKUN Uludağ Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Tolga ÇAVAŞ Bu çalışmada, fullerenol nanopartiküllerinin radyasyona maruz bırakılan A549 insan akciğer epitel hücreleri üzerindeki koruyucu etkileri sitokinez bloke mikronükleus ve gH2AX fokus testleri kullanılarak araştırılmıştır. Çalışmamızda fullerenol ve radyasyonun tek başlarına oluşturdukları sitotoksik etkilerin belirlenmesi amacıyla klonojenik test uygulanmıştır. Çeşitli dozlarda fullerenol (10 – 1600 µg/L) ve radyasyona (0,5 – 8 Gy) maruz bırakılan A549 hücrelerinde hayatta kalış eğrileri hazırlanmıştır. Klonojenik test sonuçlarına göre fullerenol konsantrasyonları (100, 200, 400 µg/L) ve radyasyon dozları (1 Gy ve 2 Gy) belirlenmiştir. Genotoksisitenin belirlenmesi için kromozomal kırıkları gösteren mikronükleus (MN) ve çift iplik DNA kırıklarını gösteren gH2AX fokus testleri kullanılmıştır. Genotoksisite testleri sonucunda fullerenolün test edilen konsantrasyonlarda herhangi bir toksik etkiye yol açmadığı belirlenmiştir. Radyasyonun ise 1 Gy ve 2 Gy dozlarda hem MN hem de hücre başına düşen ortalama gH2AX fokus sayısını anlamlı düzeyde arttırdığı belirlenmiştir. Kombine uygulamalarda hücreler 1 Gy ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat ve 24 saat önce 100, 200 ve 400 µg/L’lik konsantrasyonlardaki fullerenol ile muamele edilmişlerdir. Elde ettiğimiz bulgular radyasyona maruz bırakılmadan önce fullerenol uygulanması durumunda A549 hücrelerinde hem sitotoksik hem de genotoksik etkilerde anlamlı düzeylerde azalmalar olduğunu göstermiştir. Radyasyondan koruma etkisinin 24 saatlik fullerenol uygulamasında daha güçlü olduğu belirlenmiştir. Elde ettiğimiz bulgular fullerenol nanopartiküllerinin radyasyon ile indüklenmiş serbest radikallerin neden olduğu sitotoksisite ve genotoksisiteye karşı koruyucu etki potansiyelini ortaya koymuştur. Anahtar Kelimeler: Fullerenol, Nanopartiküller, Radyasyon, Sitotoksisite, Genotoksisite, Radyoprotektif etki. 2013, xi + 130 sayfa i ABSTRACT MSc Thesis INVESTIGATION OF PROTECTIVE EFFECTS OF FULLEREN NANOPARTICLES IN IRRADIATED A549 HUMAN LUNG EPITHELIUM CELLS USING MICRONUCLEUS AND gH2AX ASSAYS Mümün COŞKUN Uludag University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr Tolga ÇAVAŞ The aim of this study was to investigate the protective effects of fullerenol nanoparticles on irradiated A549 human lung epithelium cells using cytokinesis-block micronucleus and gH2AX foci assays. In this study, clonogenic assay was carried out to determine the cytotoxic effects of fullerenol and radiation seperately. Surviving fraction curves of A549 cells which treated with various concentrations of fullerenol (10 – 1600 µg/L) and exposed to radiation doses (0,5 – 8 Gy) were drawn. Based on the clonogenic assay results, fullerenol concentrations (100, 200 and 400 µg/L) and radiation doses (1 Gy and 2 Gy) were established to use in genotoxicity assays. Micronucleus (MN) assay detecting chromosomal breaks and gH2AX foci assay indicating double strand DNA breaks (DSB) were used to determine genotoxicity. Results of the genotoxicity assays represented that tested concentrations of fullerenol didn’t cause any toxic effect. On the other hand 1 Gy and 2 Gy radiation doses induced both MN frequency and average number of gH2AX focus per cell significantly. In the combine test groups, cells were treated with 100, 200 ve 400 µg/L fullerenol during 1 and 24 hours before exposure to 1 Gy and 2 Gy irradiation. Results of the assays indicated that fullerenol treatment prior to irradiation decreased both cytotoxic and genotoxic effects in A549 cells significantly. Fullerenol treatment during 24 hours prior to irradiation exhibited a stronger radioprotection effect. Our findings demonstrate the protective effect potential of fullerenol nanoparticles against cytotoxicity and genotoxicity that caused by radiation induced free radicals. Keywords: Fullerenol, Nanoparticles, Radiation, Cytotoxicity, Genotoxicity, Radioprotective effect 2013, xi + 130 pages ii TEŞEKKÜR Tez konumun belirlenmesi, yürütülmesi ve bütün çalısmalarım boyunca bana rehber olan, ilgi ve yardımlarını esirgemeyen, öğrencisi olmaktan onur ve mutluluk duyduğum Sayın Hocam Doç. Dr. Tolga ÇAVAŞ’a, Tez deneylerimde, deneyimlerinden ve yardımlarından faydalandığım sevgili hocalarım Doç. Dr. Nilüfer ÇİNKILIÇ ve Arş. Gör. Özgür VATAN’a, Deney aşamalarında yardımları ile bana destek olan sevgili arkadaşlarım Arş. Gör. Dilek YILMAZ ve Özgün TEKSOY’a, Yüksek lisans eğitimim süresince birlikte eğitim gördüğüm ve arkadaşlıkları ile bana moral olan herkese, Tüm bu zahmetli süreçte destek ve yardımlarını devamlı üzerimde hissettiğim, evlatları olmaktan büyük gurur ve mutluluk duyduğum sevgili aileme, Sonsuz teşekkürlerimi sunarım. iii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.......................................................................................................................... i ABSTRACT................................................................................................................ ii TEŞEKKÜR................................................................................................................ iii SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ................................................................. vi ŞEKİLLER DİZİNİ.................................................................................................... ix ÇİZELGELER DİZİNİ............................................................................................... xi 1. GİRİŞ............................................................................................................ 1 2. GENEL BİLGİLER ve KAYNAK ARAŞTIRMASI................................... 3 2.1. Nanoteknoloji ve Nanomateryaller............................................................... 3 2.1.1. Tanımı ve Tarihçesi...................................................................................... 3 2.1.2. Nanomateryallerin Kullanım Alanları.......................................................... 5 2.1.3. Nanomateryallerin Sınıflandırılması............................................................. 7 2.1.4. Nanotoksikoloji............................................................................................. 9 2.1.5. Nanopartiküllerin Genotoksik Etkileri.......................................................... 11 2.1.5.1. Serbest Radikaller, Reaktif Oksijen Türleri ve Oksidatif Stres.................... 15 2.1.6. Antioksidanlar ve Nanopartiküllerin Antioksidan Etkileri........................... 21 2.2. Fullerenler..................................................................................................... 25 2.2.1. Fullerenlerin Genel Yapısı ve Özellikleri..................................................... 25 2.2.2. Fullerenlerin Türevlendirilmesi..................................................................... 28 2.2.2.1. Polihidroksi Fullerenler ve Fullerenol.......................................................... 29 2.2.3. C60 Fullerenlerin Toksikolojisi...................................................................... 30 2.2.4. C60 Fullerenlerin Antioksidan ve Sitoprotektif Etkileri................................ 35 2.2.4.1. C60 Fullerenlerin Antioksidan Etki Mekanizması......................................... 36 2.2.5. C60 Fullerenlerin Antiapoptotik Aktivitesi.................................................... 40 2.2.6. C60 Fullerenlerin Antikarsinojenik Etkileri................................................... 41 2.3. Radyasyon..................................................................................................... 48 2.3.1. İyonize Edici Radyasyonun Biyolojik Sistemlere Etkileri........................... 49 2.3.1.1. Suyun Radyolizisi......................................................................................... 52 2.3.1.2. İyonize Edici Radyasyonun RNA Molekülüne Etkileri............................... 53 2.3.1.3. İyonize Edici Radyasyonun Kromozomlara Etkisi....................................... 54 2.3.1.4. İyonize Edici Radyasyonun DNA Molekülüne Etkileri............................... 56 2.3.1.5. DNA Hasarı Onarım Mekanizmaları............................................................ 59 2.4. Toksisitenin Değerlendirilmesinde Kullanılan Bazı Test Yöntemleri.......... 61 2.4.1. Klonojenik Test............................................................................................. 61 2.4.2. Mikronükleus Testi....................................................................................... 62 2.4.3. γ-H2AX Fokus Testi..................................................................................... 66 3. MATERYAL ve METOT............................................................................. 70 3.1. Kullanılan Ekipman ve Sarf Malzemeler...................................................... 70 3.2. Fullerenol Çözeltisinin Hazırlanması ve Karakterizasyonu.......................... 72 3.2.1. Zeta potansiyeli ölçümü................................................................................ 72 3.2.2. Dinamik ışık saçılım (DLS) spektrofotomeresi analizi................................. 72 3.2.3. Transmisyon elektron mikroskopi (TEM) analizleri.................................... 73 3.3. Kullanılan Hücre Hattı (A549) ve Kültür İşlemleri...................................... 73 3.4. Hücrelerin ışınlandırılması............................................................................ 74 iv 3.5. Deney Planı................................................................................................... 75 3.5.1. Kontrol grupları............................................................................................ 75 3.5.2. Klonojenik test grupları................................................................................ 76 3.5.3. Genotoksisite test grupları............................................................................ 76 3.6. Klonojenik Test............................................................................................. 76 3.7. Sitokinez Bloke Mikronükleus Testi............................................................. 78 3.8. γ-H2AX Fokus Testi..................................................................................... 79 3.9. İstatistik Analizler......................................................................................... 81 4. BULGULAR................................................................................................. 82 4.1. Fullerenol Karakterizasyonu......................................................................... 82 4.2. Fullerenolün % Hayatta Kalış (Canlılık) Oranına Etkisi.............................. 82 4.3. Radyasyonun % Hayatta Kalış Oranına Etkisi............................................. 83 4.4. Fullerenol ve Radyasyon Kombine Uygulamalarının % Hayatta Kalış Oranına Etkisi............................................................................................................. 85 4.5. Fullerenolün Mikronükleus Oluşumu Üzerindeki Etkisi.............................. 87 4.6. Radyasyonun Mikronükleus Oluşumu Üzerindeki Etkisi............................. 88 4.7. Fullerenol ve Radyasyon Kombine Uygulamalarının Mikronükleus Oluşumu Üzerindeki Etkisi........................................................................................... 91 4.8. Fullerenolün Çekirdek Bölünme İndeksi (ÇBİ) Üzerindeki Etkisi............... 94 4.9. Radyasyonun Çekirdek Bölünme İndeksi Üzerindeki Etkisi........................ 96 4.10. Fullerenol ve Radyasyon Kombine Uygulamalarının Çekirdek Bölünme İndeksi Üzerindeki Etkisi.............................................................................. 97 4.11. Fullerenolün γ-H2AX Fokuslarının Oluşumu Üzerindeki Etkisi................. 101 4.12. Radyasyonun γ-H2AX Fokuslarının Oluşumu Üzerindeki Etkileri............. 103 4.13. Fullerenol ve Radyasyon Kombine Uygulamalarının γ-H2AX Fokuslarının Oluşumu Üzerindeki Etkileri........................................................................ 105 5. TARTIŞMA ve SONUÇ............................................................................... 110 KAYNAKLAR............................................................................................................ 118 ÖZGEÇMİŞ................................................................................................................ 130 v SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama ml Mililitre mg Miligram nm Nanometre µg/L Mikrogram / Litre Gy Gray mGy Miligray cGy Santigray KCl Potasyum klorür M Molar µM Mikromolar nM Nanomolar C Karbon CeO2 Seryum oksit Co-Cr Kobalt-Krom alaşımı O2 Oksijen molekülü 1O2 Singlet oksijen OH● Hidroksil radikali O ●– 2 Süperoksit anyonu (radikali) H2O2 Hidrojen peroksit -OH Hidroksil grubu -COOH Karboksil grubu -NH2 Amin grubu -CH Alken grubu -C=O Karbonil grubu TiO2 Titanyum dioksit vi Kısaltmalar Açıklama A549 İnsan akciğer kanseri epitel hücre hattı C3 Karboksifulleren türevi bir bileşik C60 Buckminster fulleren C60* Uyarılmış C60* molekülü nC60 C60 fulleren-Su süspansiyonu C60FWS Fullerene Water Solution (Sulu Fulleren Çözeltileri) C60HyFn Hydrated C60 fullerene (C60 fulleren hidratları) C60(OH)24 Polihidroksi fulleren ya da fullerenol CHO Çin Hamster Ovaryumu hücre hattı Cyt-B Sitokalasin-B ÇBİ Çekirdek Bölünme İndeksi ÇZK Çift Zincirli DNA Kırığı DF-1 Dendrofulleren-1 DLS Dinamik Işık Saçılım Spektrofotometresi F Fullerenol konsantrasyonları (F100 = 100 µg/L) GSH Glutatyon H2AX H2A histon varyantı γ-H2AX H2AX histonunun fosforillenmiş hali İR İyonize edici radyasyon MI Mononükleuslu hücrelerin sayısı MII Binükleuslu hücrelerin sayısı MIII Trinükleuslu hücrelerin sayısı, MIV Tetranükleuslu hücrelerin sayısı MDA Malondialdehit MMC Mitomisin-C MN Mikro Nükleus MRI Manyetik Rezonans Görüntüleme vii NP Nanopartikül PEG Polietilen glikol PVP Polivinil prolidon ROS Reactive Oxygen Species (Reaktif Oksijen Türleri) SOD Süperoksit dismutaz TEM Transmisyon Elektron Mikroskopisi THF Tetrahidrofuran TZK Tek Zincirli DNA Kırığı UV Ultraviyole ışık viii ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 2.1. Nanomateryal içeren ürünler ve sayıları.................................................. 4 Şekil 2.2. Nanomateryallerin kullanıldığı bazı alanlar............................................. 6 Şekil 2.3. Multifonksiyonel bir nanopartikül modeli............................................... 7 Şekil 2.4. Sıklıkla kullanılan bazı nanomateryaller.................................................. 8 Şekil 2.5. Bazı nanopartiküllerin nanoskaladaki yeri............................................... 8 Şekil 2.6. Nanotoksikoloji ile ilgili başlıca konular................................................. 11 Şekil 2.7. Nanopartiküllerin hücresel alınım mekanizmaları................................... 12 Şekil 2.8. Nanopartiküllerin indirekt genotoksisitesi................................................ 13 Şekil 2.9. Reaktif oksijen türlerini oluşturan faktörler............................................. 17 Şekil 2.10. Antioksidan savunma sistemi................................................................... 23 Şekil 2.11. Karbon atomunun allotropları.................................................................. 26 Şekil 2.12. C60’ın iki boyutlu ve üç boyutlu yapısı.................................................... 26 Şekil 2.13. R. B. Fuller’in Montreal fuarında yaptığı jeodezik kubbe....................... 27 Şekil 2.14. Bazı modifiye fulleren türevleri............................................................... 28 Şekil 2.15. Fulleren türevlerinin uygulama alanları................................................... 29 Şekil 2.16. Fullerenolün üç boyutlu yapısı................................................................ 30 Şekil 2.17. C60’ın Tip 1 ve Tip 2 fotokimyasal mekanizmaları.................................. 31 Şekil 2.18. Biyolojik çevrelerde fulleren aracılı ROS’ların oluşumu ve olası etkileri...................................................................................................... 32 Şekil 2.19. Tris – malonik asit C3 ve D3 türevleri...................................................... 34 Şekil 2.20. Uzak mesafeli, düzenli su katmanları ile çevrili bir C60HyFn modeli..... 38 Şekil 2.21. Sulu C60 fulleren etrafında şekillenmiş, uzak mesafeli ve düzenli su katmanlarınca kontrol edilen serbest radikallerin absorbsiyon, toplanma ve rekombinasyon mekanizmalarının olası bir şeması.................................. 39 Şekil 2.22. Elektromanyetik spektrum........................................................................ 48 Şekil 2.23. İyonize edici radyasyonun direkt ve indirekt etkisi.................................. 50 Şekil 2.24. Radyasyonun canlıdaki etki kademeleri................................................... 51 Şekil 2.25. Suyun radyolizisi...................................................................................... 54 Şekil 2.26. Tek ve çift zincirde DNA kırılmaları....................................................... 57 Şekil 2.27. UV radyasyonun neden olduğu baz değişikleri........................................ 59 Şekil 2.28. Klastojenler ve anojenler tarafından uyarılan hücrelerdeki MN’ler........ 63 Şekil 2.29. Sitokinezin bloklanması yöntemiyle MN içeren binükleat hücrenin oluşumu.................................................................................................... 64 Şekil 2.30. Sitokinezi bloklanmış MN yöntemi ile bazı sitogenetik anormalliklerin tayin edilmesi.................................................................................................... 66 Şekil 2.31. Memelilerde H2AX histonunun fosforilasyonu ve γ-H2AX’in fonksiyonu................................................................................................ 67 Şekil 2.32. γ-H2AX fokus testinin temel mekanizması.............................................. 69 Şekil 4.1. Suda çözülmüş C60OH(18-22) fullerenol nanopartiküllerinin TEM görüntüleri................................................................................................ 82 Şekil 4.2. Çeşitli konsantrasyonlarda fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde klonojenik test ile belirlenen % hayata kalış oranları............................. 83 Şekil 4.3. Radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde koloni oluşumları........ 84 ix Şekil 4.4. Çeşitli dozlarda radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde klonojenik test ile belirlenen % hayata kalış oranları............................................... 84 Şekil 4.5. Radyasyona maruz bırakmadan 1 saat önce çeşitli konsantrasyonlarda fullerenol ile muamele edilen A549 hücrelerinin % hayatta kalış oranları..................................................................................................... 85 Şekil 4.6. Radyasyona maruz bırakmadan 24 saat önce çeşitli konsantrasyonlarda fullerenol ile muamele edilen A549 hücrelerinin % hayatta kalış oranları..................................................................................................... 86 Şekil 4.7. Çeşitli konsantrasyonlarda fullerenole maruz bırakılan A549 hücrelerindeki mikronükleus frekansları (‰).................................................................. 87 Şekil 4.8. Sitokinez bloke A549 hücrelerinin genel görüntüsü................................ 88 Şekil 4.9. Çeşitli dozlarda radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerindeki mikronükleus frekansları (‰).................................................................. 89 Şekil 4.10. 2 Gy radyasyon grubunun sitokinez bloke A549 hücrelerinde MN oluşumları................................................................................................. 89 Şekil 4.11. Büyük bir MN içeren sitokinez bloke A549 hücresi................................ 90 Şekil 4.12. Orta boy MN içeren sitokinez bloke A549 hücresi.................................. 90 Şekil 4.13. 1 Gy radyasyon uygulamasından 1 saat ve 24 saat önce fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerindeki mikronükleus frekansları (‰)................. 91 Şekil 4.14. 2 Gy radyasyon uygulamasından 1 saat ve 24 saat önce fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerindeki mikronükleus frekansları (‰)................. 92 Şekil 4.15. 1 saat ve 24 saat süresince fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde 1 Gy radyasyona kaşı sağlanan % koruma oranları................................. 93 Şekil 4.16. 1 saat ve 24 saat süresince fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde 2 Gy radyasyona kaşı sağlanan % koruma oranları................................. 94 Şekil 4.17. Sitokalasin-B ile muamele edilmiş A549 hücrelerinde çeşitli nükleus formasyonları............................................................................................ 95 Şekil 4.18. Fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ değerleri.............. 96 Şekil 4.19. Radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ değerleri.............. 97 Şekil 4.20. Fullerenol ve 1 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ değerleri................................................................................................... 98 Şekil 4.21. Fullerenol ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ değerleri................................................................................................... 99 Şekil 4.22. Fullerenol’ün 1 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ koruma oranları........................................................................................ 99 Şekil 4.23. Fullerenol’ün 2 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ koruma oranları........................................................................................ 100 Şekil 4.24. Foci Counter programı ile γ-H2AX fokus sayılarının belirlenmesi......... 101 Şekil 4.25. A549 hücrelerinde γ-H2AX fokuslarının DAPI, FITC ve birleştirilmiş görüntüleri................................................................................................ 102 Şekil 4.26. Çeşitli konsantrasyonlarda fullerenole maruz bırakılan A549 hücrelerinde hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayıları............................... 103 Şekil 4.27. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde γ-H2AX fokuslarının DAPI, FITC ve birleştirilmiş görüntüleri................................................. 104 Şekil 4.28. Çeşitli dozlarda radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde, hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayıları......................................... 105 x Şekil 4.29. 1 Gy radyasyon uygulamasından 1 saat ve 24 saat önce fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerindeki hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayıları...................................................................................................... 106 Şekil 4.30. 2 Gy radyasyon uygulamasından 1 saat ve 24 saat önce fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerindeki hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayıları...................................................................................................... 107 Şekil 4.31. 1 saat ve 24 saat süresince fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde 1 Gy radyasyona kaşı sağlanan % koruma oranları................................. 108 Şekil 4.32. 1 saat ve 24 saat süresince fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde 2 Gy radyasyona kaşı sağlanan % koruma oranları................................. 109 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Genotoksisitesi çalışılan bazı nanopartiküller........................................ 12 Çizelge 2.2. Radikal ve radikal olmayan reaktif oksijen türleri................................. 17 Çizelge 2.3. Oksijenin indirgenmesi........................................................................... 18 Çizelge 2.4. Bazı antioksidan nanopartikül türleri ve biyolojik etkileri.................... 24 Çizelge 2.5. Çeşitli C60 preperasyonlarının başlıca ROS aracılı biyolojik etkilerine genel bakış.............................................................................................. 44 Çizelge 2.6. Radyasyonun genetik etkileri................................................................. 56 Çizelge 3.1. Çalışmalarda kullanılan ekipman........................................................... 70 Çizelge 3.2. Çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler............................................... 71 Çizelge 3.3. A549 hücrelerinde 1 saat ve 24 saatlik fullerenol uygulaması ve radyasyon ile gerçekleştirilen deney setleri............................................................. 75 xi 1. GİRİŞ Nobel Fizik Ödülü sahibi Richard Feyman, ilk kez 1959 yılında “nanobilim” kavramını gündeme getirmiştir (Feyman 1999). Drexler 1986 yılında nanoteknolojinin dikkat çekici olanaklara sahip olduğunu belirtmiştir. Zaman içerisinde, nanoteknolojide yaşanan hızlı gelişmelerin insanlar ve ekosistem için büyük yararları olduğu kadar önemli zararları olabileceği konusu tartışılır hale gelmiştir (Seaton ve Donaldson 2005). C60 fulleren nanopartikülleri ya da diğer adıyla Buckminster fullerenler 1985 yılında Kroto ve ark. tarafından keşfedilmiştir. Karbon (C) atomunun üçüncü doğal allotropu olan Buckminster fullerenler, 60 C atomunun birbirine bağlanarak oluşturduğu bir kafes yapısına sahiptir (Andrievsky ve ark. 2009). Günümüzde C60 fullerenler tüketici ürünlerinde ve tıp alanında yoğun kullanım potansiyeline sahiptir. Fujitani ve ark. (2008) Frontier Carbon adlı firmanın yıllık C60 üretiminin 40 ton olduğunu bildirmiştir. Farre ve ark. (2010)’nın çeşitli atık sularda yaptıkları analizlerde ise 15 – 20 µg/L’ye varan konsantrasyonlarda C60’a rastlanmıştır. Gittikçe artan kullanım potansiyelleri dolayısıyla C60 fullerenlerin toksisitesinin değerlendirilmesi bir zorunluluk haline gelmiştir. Literatürde C60 fullerenlerin toksisiteleri ile ilgili birçok çalışma yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar kullanılan test yöntemi, organizma veya hücre hattı, çözücü ve saflık gibi faktörlere bağlı olarak değişiklik göstermektedir. Bu doğrultuda yapılan bir çok toksisite çalışmasında genelde C60 fullerenlerin toksik olmadığı yönünde bir eğilim vardır. (Nelson ve ark. 1993, Yamago ve ark. 1995, Baierl ve ark. 1996, Moussa ve ark. 1996, Jia ve ark. 2005, Mori ve ark. 2005, Kolosnjaj ve ark. 2007, Baker ve ark. 2008). Günümüzde canlılar düşük ama sürekli radyasyon ortamı içinde yaşamaktadır (Akın 1981). Doğal radyasyonun yanında konforu arttıran elektronik aletler, tıbbi teşhis ve tedavide kullanılan radyoloji aygıtları ve enerji kaynağı olarak kullanılan nükleer reaktörler gibi yapay radyasyon kaynakları da insan sağlığını tehdit etmektedir (Göksel 1973). Radyasyona maruz kalınması sonucu organizmada birtakım moleküler değişiklikler meydana gelmektedir. İyonize edici radyasyon hücresel düzeyde DNA, RNA, kromozomlar, proteinler ve lipit membran gibi yapılarla etkileşerek hücreyi ölüme sürüklemektedir (Steel 1997, Özalpan 2001). İyonize edici radyasyon DNA’ya 1 ve kromozomlara doğrudan zarar verebildiği gibi suyun radyolizisi neticesinde oluşan reaktif oksijen türleri (ROS) aracılığıyla indirekt DNA hasarı da oluşturabilmektedir (Lipscomb ve ark. 1992, Kaya ve ark. 1996). İyonize edici radyasyonun DNA molekülünde oluşturduğu hasarların en önemlileri zincir kırılmaları (Olive 1998), baz hasarları, baz kayıpları, denatürasyon bölgelerinin oluşması ve DNA çapraz bağlanmalarıdır (McMillan ve Steel 1997). Kanser tedavisinde halen en etkili yöntemlerden biri olan radyoterapinin normal dokular üzerindeki yukarıda bahsedilen zararlı etkilerini önlemek amacıyla radyasyona karşı koruyucu etki gösteren bazı ajanlar araştırmak gerekli hale gelmiştir (Kalpana ve ark. 2009). Bu anlamda, C60 fulleren türevlerinin antioksidan ve radyoprotektif özellikleri bazı in vivo ve in vitro çalışmalarla araştırılmış ve olumlu sonuçlar elde edilmiştir (Rzigalinski 2005, Markovic ve Trajkovic 2008). Bu tez çalışmasında, hidroksil (-OH) gruplarının eklenmesiyle elde edilen ve polihidroksi fulleren ya da fullerenol (C60(OH)n (~n = 18–22)) olarak adlandırılan C60 türevinin, radyasyona maruz bırakılan A459 insan akciğer epitel hücre hattı üzerindeki koruyucu etkilerinin, sitokinez bloke mikronükleus ve gH2AX (γ-H2AX) fokus testleri kullanılarak araştırılması amaçlanmıştır. Polihidroksi fulleren nanopartiküllerinin insan hücrelerindeki in vitro radyoprotektif etkilerinin ilk kez araştırılacak olması tez çalışmamızın özgünlüğünü oluşturmaktadır. 2 2. GENEL BİLGİLER VE KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Nanoteknoloji ve Nanomateryaller 2.1.1. Tanımı ve Tarihçesi Nano ön eki Yunanca’da cüce anlamına gelen “nanos” kelimesinden türemiştir. Nanoteknoloji terimi ise en az bir boyutu 100 nanometre (nm)’den küçük olan materyallerin tasarımı, üretimi, montajı ve karakterizasyonu gibi süreçleri ifade etmektedir. Bu anlamda nanoteknoloji, nanomateryallerden elde edilen minyatür fonksiyonel sistemlerin uygulamalarını disiplinler arası araştırma – geliştirme faaliyetleri çerçevesinde incelemektedir (Hoyt ve Mason 2008). Nanoteknoloji endüstrisi, uzay mühendisliğinden nanoelektroniğe ve çevre ıslahından medikale kadar birçok alana uygulanabilme potansiyeline sahip olup ekonomi ve bilim alanında önemli avantajlar vaat ederek hızla büyümeye devam etmektedir. Nanomateryallerin bizlere sunduğu yararlı fiziko-kimyasal özellikleri nedeniyle mühendislik ürünü yeni nanomateryallerin tasarlanması ve geliştirilmesi konuları bu endüstride önemli bir yere sahip olmuştur. Bunların arasında çelik benzeri metallerden daha sert ve daha dayanıklı materyallerin ısı ve elektrik iletkenliğinin arttırılması, katalitik aktivitenin arttırılması ve gelişmiş optik özelliklere sahip olma gibi konular yer almaktadır. 2009’da yapılan araştırmalar 800’den fazla tüketici ürününün nanomateryal içerdiğini göstermiştir. Nanomateryal içeren bu ürünler Şekil 2.1’de gösterilmiştir. Bu ürünlerin satılması ile 2007’de yaklaşık 147 milyar dolar gibi bir gelir elde edilirken bu durumun 2015’e kadar 3,1 trilyon dolara ulaşacağı tahmin edilmektedir. Dolayısıyla nanomateryallere olan maruziyetin ileriki yıllarda dramatik bir şekilde artacağı düşünülmektedir (Singh ve ark. 2009). 3 Şekil 2.1. Nanomateryal içeren ürünler ve sayıları (Singh ve ark. 2009) Biyoloji dünyası için nanoteknolojinin geçmişi üç milyar yıldan fazladır. Çünkü, ilk canlı hücrenin varlığından bu yana hayatsal faaliyetleri yürütme maksatlı nanometre boyutlarındaki çeşitli fonksiyonel yapılar yani hücresel komponentler, canlı hücreler içerisinde imal edilmektedir. Bu yapıları anlatılan tanımlara uyarlayacak olursak komponentlerin yani organellerin her birinin hücresel faaliyetlerde canlılığın devamı için özgün görevleri vardır. Doğada benzer pek çok örnekle karşılaşmak mümkündür (Goorsell 2000, Yılmaz 2006). Nanomateryallerin bir türü olan nanopartiküller, genelde modern bilimin keşiflerinden biri olarak düşünülse de aslında çok daha uzun bir geçmişe sahiptir. 9.yy.’da, Mezopotamya’da, sanatkarlar çanak ve çömlekleri parlatmak amacıyla nanopartiküllerden yararlanmışlardır. Orta Çağ ve Rönesans dönemlerinde, çömlekçilikte, altın ve bakır renkli metalik parlaklığı koruma amacıyla cilalama işlemleri yapılmıştır. Cilalama işlemlerinde gümüş ve bakır nanopartikülleri seramik sırın camsı matriksinde homojen olarak dağılarak ince bir tabaka oluşturmuş ve atmosferik oksidasyonu engellemiştir. Sanatkarlar, bakır ve gümüş tuzlarını oksitlerle birlikte sirke, toprak boyası ve kil karışımına eklemişler ve bu karışımı önceden sırlanmış çömlek yüzeyine uygulamışlardır. Daha sonra bu çömleği 600 °C’de fırınlayarak çömlek yüzeyinde renk veren ve optik özellikler gösteren bu nanopartikülleri elde etmişlerdir (Rawson, 1984). 4 1970 – 1980’li yıllarda, Amerika ve Japonya’da nanopartiküllerle ilgili ilk esaslı çalışmalar yapılırken, nanopartikül terimi yerine daha çok -çok küçük parçacıklar anlamına gelen- “Ultrafine Particles (UFP)” terimi kullanılmıştır. Bununla birlikte 1990’larda, Amerika’da “Ulusal Nanoteknoloji Girişimi Programı” faaliyete geçmeden önce nanopartikül teriminin kullanımı daha fazla rağbet görmüştür (Kiss ve ark. 1999, Buzea ve ark. 2007). 2.1.2. Nanomateryallerin Kullanım Alanları Nanomateryaller boyutlarından dolayı, elektronik, fotonik, manyetik, yapısal ve mekanik niteliklerinde makroskopik ölçekten farklılık gösterirler. Bu farklılığın nedenleri ise, yüksek yüzey/hacim oranları ve nano boyutlu yapılarda ortaya çıkan kuantum etkileridir. Bu kuantum özelliklerinden dolayı nanoteknoloji, bilimin tüm alanlarında kullanılmaktadır. Arıtma, remediasyon, nanosensörler gibi çeşitli çevre uygulamalarında da nanoteknoloji son yıllarda hızla ve başarılı bir şekilde uygulanmaktadır (Kaplan, Karanfil ve ark. 2007). Atmosferde bulunan nanopartiküller doğal ya da insan kaynaklı olarak istenmeden üretilebilmektedir. Yangın, erozyon ve volkanik faaliyetler gibi doğal olaylar nanopartikül oluşumuna yol açabilmektedir. Airborne Particles Expert Group’un United Kingdom’daki 1996 yılı raporuna göre istenmeden üretilen primer nanopartiküllerin %60’ı karayolu taşımacılığı ile, %23’ü ise endüstriyel ve ticari üretim, enerji üretimi ve evsel ısınma süreçlerinde yanma ürünü olarak ortaya çıkmıştır. Diğer taraftan onlarca endüstri sektörü ticari amaçla birçok nanopartikül üretmekte ve bunlar pigment, reçine ve kozmetik gibi alanlarda kullanılmaktadır. Gün geçtikçe nanopartiküllere dayalı yeni ürünlerin üretimi artmaktadır. Özellikle imal edilen nanopartiküller ve bunlara dayalı ürünler risk analizinin öncül hedefleri olmuşlardır (JA Borm, Robbins ve ark. 2006). Nanoteknoloji ürünü olan nanomateryallerin ve nanopartiküllerin kullanıldığı bazı alanlar Şekil 2.2’de gösterilmiştir. 5 Şekil 2.2. Nanomateryallerin kullanıldığı bazı alanlar Nanoteknolojinin tıp açısından kullanımı hastalıkların tanısı, tedavisi, ilaç uygulamaları gibi alt başlıkları içermektedir. Tıbbi tanı amacı ile kullanılabilmeleri için nanocihazlar ve nanopartiküller; nanotüpler, nanokonsollar ve nanokablolar, nanoelektromekanik transistör ve biosensörler içerisine adapte edilebilmektedirler. Medikal ve moleküler görüntüleme açısından nanopartiküller, nanomateryaller ve nanocihazların geniş bir şekilde kullanılabilir olması nanoteknolojinin yeni filizlenen bir dalını oluşturmaktadır. Potansiyel görüntüleme ajanlarından en iyi ikisi, kuantum tanecikleri ve manyetik nanopartiküllerdir. Hastalıkların tedavisi açısından nanoteknolojinin incelenmesi öncelikle nanoterapi terminolojisini ortaya çıkartmaktadır. Nanoterapide hedef ilaç dağılımları, gen terapileri ve antitümör tedavilerdir. Şekil 2.3’te bu amaçla tasarlanan bir multifonksiyonel nanopartikül modeli gösterilmiştir (Türk Nöroşirürji Derneği 2007). 6 Şekil 2.3. Multifonksiyonel bir nanopartikül modeli (Zhe Liu ve ark. 2010) 2.1.3. Nanomateryallerin Sınıflandırılması Nanomateryal terimi, en az bir boyutu 1 – 100 nm aralığında olan materyalleri tanımlamak için kullanılmaktadır. Nanomateryallerin içerisinde nanopartiküller, nanofiberler, nanotüpler ve nanokompozitler yer almaktadır (JA Borm, Robbins ve ark. 2006). Amerikan Çevre Koruma Örgütü (USEPA) nanomateryalleri, 1) Karbon bazlı nanomateryaller (karbon nanotüpler ve fullerenler) 2) Metal bazlı nanomateryaller (nano-gümüş, nano-altın, TiO2, metal oksitler) 3) Dendrimerler (nano ölçekli polimerler) 4) Nanokompozitler olmak üzere 4 ana kısma ayırmıştır. Belli başlı bazı nanomateryaller Şekil 2.4’te gösterilmiştir. 7 Şekil 2.4. Sıklıkla kullanılan bazı nanomateryaller Nanomateryallerin önemli bir kısmını oluşturan nanopartiküller ise 0,1 – 100 nm büyüklüğündeki nanomateryallerdir. Nanopartiküller amorf, kristalin, sferik, iğneli vs. şekillerde olabilirler ve 1 – 100 atom ya da molekülden oluşurlar (EPA Partikül boyutu terminolojisi). Bazı nanopartiküllerin nanoskaladaki yeri ise Şekil 2.5’te gösterilmiştir. Şekil 2.5. Bazı nanopartiküllerin nanoskaladaki yeri (Nanomedicine, 2008) 8 2.1.4. Nanotoksikoloji Nanomateryallerin kullanımının artması sonucu bu materyallerin çevreye salınımlarının artacağı düşünülmektedir. Bu materyallerin alıcı ortamlarda ve insan sağlığı üzerindeki etkileri konusunda çalışmalara son 10 yılda hız verilmesine rağmen hala cevaplandırılması gereken birçok soru ve literatürde eksik noktalar mevcuttur (Dreher 2004, UK Royal Society Report 2004). Bir çok araştırmacı nanomateryallerin toksikolojik etkileri, alıcı ortamlara salınımları, taşınımları, karakterizasyonu, risk değerlendirilmesi konularında çalışmalar yapmıştır ve çalışmalar halen devam etmektedir (Morgan 2005, Thomas ve Sayre 2005). Nanoteknolojik ürünlerin kullanım alanlarının yaygınlaşması sonucu insanlar, diğer canlılar ve alıcı ortamlar doğrudan veya dolaylı olarak nanomateryallere maruz kalmaktadır. Çevresel ortamlara salınan nanomateryallerin çevresel ortamlardaki taşınımı, miktarları, bozunumu, dönüşümü ve nihai akibetleri tam bilinmemektedir (European Commission 2004). Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda, alıcı ortamlarda nanomateryallerin biyolojik olarak bozunma ve birikme, diğer kirleticilerle birlikte taşınma veya bünyelerine daha toksik kirleticileri bağlayarak onların taşınımını artırma, diğer kirleticilerle kimyasal ya da fiziksel reaksiyona girebilme potansiyelleri belirtilmiştir (USEPA 2007). Nanomateryallerin davranış modellemelerinde doğal nanopartiküllerin davranışları baz alınmaktadır. Ancak, bu nanomateryallerin su fazında çözünürlüğünün ve reaktivitesinin arttırılması için yüzey kimyaları çeşitli modifikasyon teknikleri ile değiştirilmektedir. Uygulanan yüzey modifikasyonları aynı model yaklaşımlarının uygulanmasını güçlendirmekte ve hatalı sonuçlar verebilmektedir (Wiesner 2006). Nanopartiküllerin insan sağlığı üzerindeki etkilerini belirlemek için toksikolojik çalışmalar yapılmıştır (Wiesner 2006). Nanomateryallerin toksik özellikleri kimyasal kompozisyon, miktar, çözünürlük, şekil, yüzey alanı ve yüzey yükü gibi parametrelere 9 bağlıdır. Ayrıca nanopartiküllerin üretiminden kaynaklanan safsızlıklar da toksisitesini etkilemektedir. Farklı canlı türleri ve bitkiler nanomateryallere farklı hassasiyetler göstermektedir. Yüzey kaplamada ve güneş kremleri gibi kozmetik ürünlerde sıklıkla kullanılan TiO2’nin hücresel absorbsiyonunun toksik bir etkisi yoktur. Ancak bu partiküllerin sucul ortamlara karışmaları algler ve su pireleri üzerinde toksik etki yapmaktır (Oberdörster ve ark. 2004a). Fulleren nanopartikülünün balıklarda beyin hasarına sebep olduğunu tespit edilmiştir (Oberdörster ve ark. 2004b). Bakterilere karşı çok toksik olan fullerenin balık türleri için yapılan toksikolojik çalışmalarda çelişkili sonuçlar elde edilmiştir (Colvin 2003, Oberdörster ve ark. 2004b). Saf olmayan karbon nanotüplerin solunumu veya ağız yoluyla alınımı deney hayvanlarında akciğer hasarlarına ve deri tarafından absorblandığında toksik etkiye sebep olduğu gözlenmiştir (Lam ve ark. 2004, Donaldson ve ark. 2006). Sonuç olarak, literatürde güvenilir ve yeterli sayıda araştırma olmadığından nanopartiküllerin ekolojik yaşama etkileri konusunda daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir (Kaplan, Karanfil ve ark. 2007). Bu anlamda Şekil 2.6’da Nanotoksikoloji alanıyla ilgili önemli konular gösterilmiştir. 10 Şekil 2.6. Nanotoksikoloji ile ilgili başlıca konular (Arora ve ark. 2012) 2.1.5. Nanopartiküllerin Genotoksik Etkileri Genotoksik etki ya da genotoksisite bir hücrenin genetik materyalinin bütünlüğünü etkileyen zararlı bir olayı tanımlamaktadır. Belirli bazı kimyasal bileşikler ve radyasyon tipleri bu tarz zararlı bir etkiye sahiptir. Genotoksik bileşiklerin çoğu DNA ile etkileşme afinitesine sahiptir. Bu durum ise onları canlılar için potansiyel mutajenik ya da karsinojenik ajanlar haline getirmektedir. Bazı bileşikler direkt olarak DNA ile etkileşim içerisine girmese bile çeşitli indirekt mekanizmalarla DNA hasarına ve dolaylı genotoksisiteye neden olabilmektedir (Bal ve ark. 2011). Nanopartiküller solunum yoluyla, dermal veya oral yolla vücut içerisine girdiklerinde birkaç direkt ya da indirekt mekanizma ile DNA hasarına neden olurlar. Nanopartiküllerin hücre içerisine alınmasında hangi mekanizmaların rol oynadığı Şekil 2.7’de gösterilmiştir. 11 Hücre içerisine giren nanopartiküller yeterince küçük boyutta iseler nüklear membrandan difüzyonla geçerler, nüklear por kompleksleri boyunca taşınırlar ya da mitoz esnasında nüklear membranın çözünmesiyle birlikte nükleusun etrafını sararlar. Nükleus içerisine lokalize olan nanopartiküller ile DNA ya da DNA ilişkili proteinler arasındaki direkt etkileşim genetik materyalin fiziksel olarak hasar görmesine yol açar. Şekil 2.7. Nanopartiküllerin hücresel alınım mekanizmaları (Krug ve ark. 2006) Alternatif olarak, nanopartiküllerin DNA molekülü ile fiziksel olarak etkileşimde bulunmadığı fakat hücre bölünmesinde rol oynayan proteinler gibi bazı hücresel proteinlerle etkileşimde bulunduğu indirekt bir mekanizma ile DNA hasarı oluşabilmektedir. Ayrıca bu indirekt etkileşimler, hücreyi genotoksisiteye sürükleyen oksidatif stres, inflamasyon ve anormal sinyal yanıtları gibi diğer hücresel tepkileri indüklemektedir (Şekil 2.8) (Singh, Manshian ve ark. 2009). Genotoksisitesi çalışılan bazı nanopartiküller; çalışılan organizmalar, kullanılan deneysel sistemler ve elde edilen bulgular ile birlikte Çizelge 2.1’de özetlenmiştir. 12 Şekil 2.8. Nanopartiküllerin indirekt genotoksisitesi (Singh ve ark. 2009) Çizelge 2.1. Genotoksisitesi çalışılan bazı nanopartiküller Materyal Organizma Test yöntemi Bulgular Referans Altın İnsan fetal 8-OHdG - Oksidatif Li ve ark. nanopartikülü akciğer ölçmek üzere DNA hasarı 2008 (AuNP) fibroblast HPLC - Hücre hücre hattı ölümünde artış (MRC-5) yok - Bazı DNA tamir genlerinin down- regülasyonu 13 Materyal Organizma Test yöntemi Bulgular Referans Gümüş Fare DNA tamir Rad51, p53 ve Ahamed nanopartikülü embriyonik proteinlerinin fosfo-H2AX ve ark. (AgNP) kök hücre ve ekspresyonu; proteinlerinin 2008 fibroblastları H2AX artan (MES ve fosforilasyonu ekspresyonu MEF) Kobalt-Krom Primer insan - MN testi - Önemli Papageor- alaşım dermal - Kometi testi miktarda giou ve nanopartikülü fibroblastları - 8-MTT ve süperoksit ark. 2007 (Co-Cr NP) LDH testleri (O ●–2 ) ve hidroksil (OH●) radikallerinin oluşumu - Mn frekansı, % komet kuruğu ve sitotoksisitede doza bağlı artış Titanyum Periferal kan - MN testi - Hücre Kang ve oksit lenfositleri - Komet testi viabilitesinde ark. 2008 nanopartikülü (PBL) doza ve (TiO2 NP) zamana bağlı düşüş - MN frekansı ve ROS oluşumunda doza bağlı artış 14 Materyal Organizma Test yöntemi Bulgular Referans Su-C60 Periferal kan - Komet testi Genotoksik Dhawan fulleren lenfositleri yanıt ve ark. süspansiyonu (PBL) oluşumunda 2006 (nC60) doza bağlı artış Suda Çin Hamster - MN testi Genotoksisite- Yasuharu çözünebilen Ovaryumu nin artması ve C60 fulleren hücre hattı (MN Naoharu nanopartikülü (CHO) frekansındaki 2006 (C60(OH)24) artış) Çok katmanlı Tip II - Ex vivo ve Ex vivo ve Muller ve karbon pnömosit in vitro MN in vitro MN ark. 2008 nanotüpler (AT-II) ve testi testlerinde (MWCNT) meme kanseri doza bağlı hücre hattı olarak MN (MCF-7) frekansında önemli ölçüde artış 2.1.5.1. Serbest Radikaller, Reaktif Oksijen Türleri ve Oksidatif Stres Yapılarında eşleşmemiş elektron içeren atom veya moleküller serbest radikaller olarak tanımlanmaktadır. Serbest radikaller hücrede metabolik dengenin bir parçası olarak devamlı yapılırlar (Urso ve Clarkson 2003). Canlı organizma için önemli olan yapıları, fiziksel ve kimyasal özellikleri, hücresel kaynakları, rol oynadıkları tepkimeler ve etkileri ile çeşitli klinik durumların patogenezinde rol oynayan serbest radikaller, atomik yörüngelerinde eşleşmemiş elektron bulundurarak, bağımsız olarak varolabilen moleküllerdir. Eşleşmemiş elektronun kazandırdığı en önemli özellik birçok radikal ile bu elektronun paylaşılabilir olmasıdır (Dormandy 1983, Halliwell ve Gutterrigde 1989). 15 Serbest radikaller 3 yolla meydana gelirler (Halliwell ve Gutterrigde 1990): 1) Kovalent bağlı normal bir molekülün, her bir parçasında ortak elektronlardan birisinin kalarak homolitik bölünmesi. X : Y → X· + Y· 2) Normal bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron atomların birinde kalır. Böylece serbest radikaller değil, iyonlar meydana gelir. X : Y X:⎯ → + Y+ 3) Normal bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi A + e- -→ A· Oksidatif stres, hücre içerisinde serbest oksijen radikallerinin ya da reaktif oksijen türlerinin (ROS) artmasına ve antioksidan seviyelerinin düşmesine bağlı olarak bozulan redoks dengesini tanımlamaktadır (Singh, Manshian ve ark. 2009). Organizmada oksidatif strese neden olan radikal yapımı endojen ve çevresel faktörleri içeren çeşitli mekanizmalarla gerçekleşir (Young ve Woodside 2001). Endojen faktörler mitokondriyal sızıntı, solunumsal patlama, enzim reaksiyonları ve otooksidasyon tepkimeleridir. Çevresel faktörlerin başlıcaları ise sigara dumanı, hava kirliliği, ultraviyole ışınları, iyonize edici radyasyon ve ksenobiotiklerdir (Şekil 2.9) (Young ve Woodside, 2001). 16 Şekil 2.9. Reaktif oksijen türlerini oluşturan faktörler Radikal ve radikal olmayan reaktif oksijen türleri ise Çizelge 2.2’de gösterilmiştir. Çizelge 2.2. Radikal ve radikal olmayan reaktif oksijen türleri REAKTİF TÜRLERİ Radikal Non-Radikal Hidroksil (OH●) Peroksinitrit (ONOO-) Alkoksil (L(R)O●) Hipoklorit (-OCl) Hidroperoksil (HOO●) Hidroperoksit (L(R)OOH) Peroksil (L(R)OO●) Singlet oksijen (1O2) Nitrik oksit (NO●) Hidrojen peroksit (H2O2) Süperoksit anyonu (O ●–2 ) Ozon (O3) Önemli oksidatif stres ajanları olan reaktif oksijen türleri moleküler oksijenin elektron transferiyle suya kadar indirgenmesi sırasında oluşmaktadır. Bu yol 4 elektron gerektirir ve bu yolda oluşan reaktif ara moleküller süperoksit (O ●–2 ), hidrojen peroksit (H2O2) ve 17 hidroksil (OH●) radikalleridir (Fridovich 2001, Nordberg ve Arner 2001). Moleküler oksijenin suya indirgenme basamakları Çizelge 2.3’te gösterilmiştir. Çizelge 2.3. Oksijenin indirgenmesi O2 + e + H + HO ●→ 2 Hidroperoksil radikali HO ●2 → H + + O ●–2 Süperoksit radikali O ●–2 + 2 H + + e → H2O2 Hidrojen peroksit H2O2 + e → OH - + OH● Hidroksil radikali OH● + e + H+ → H2O Nanopartiküllerin neden olduğu genotoksik etkilerin arasında oksidatif stres mekanizması da yer almaktadır. ROS’lar DNA, protein ve lipitler gibi hücresel makromoleküllerle zararlı bir şekilde etkileşime girerek homeostaziyi bozabilen son derece reaktif moleküllerdir. Tek ve çift iplikteki DNA kırılmaları, 8-hidroksideoksi- guanozin (8-OHdG) adduct oluşumu ve benzeri baz modifikasyonları, DNA çapraz bağlanmaları gibi ROS ile indüklenmiş DNA hasarları tamir edilemez ise karsinogenezin başlamasına ve ilerlemesine neden olabilir (Singh, Manshian ve ark. 2009). İyonize edici radyasyona maruz kalınması ile oluşan serbest radikaller DNA’yı etkileyerek hücrede mutasyona neden olur. Sitotoksik etki, büyük oranda nükleik asit baz modifikasyonlarından kaynaklanan kromozom değişikliklerine veya DNA’daki diğer değişikliklere bağlıdır. OH● radikali deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer. H2O2 zarlardan kolayca geçip hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücrede fonksiyon bozukluğuna ve hatta hücre ölümüne neden olabilir (Meram ve Aktaran 2002, Özkan ve Fışkın 2004). Hücre içerisindeki ROS kaynakları primer ve sekonder olmak üzere iki kısıma ayrılır. Primer ROS’lar (Örn. O ●–2 , H2O2) metabolik olaylar aracılığıyla ya da oksijen aktivasyonu ile açığa çıkabilmektedir. Hücresel koşullarda üretilen O ●–2 anyonu, katalitik aktivitesi çok yüksek bir enzim olan süperoksit dismutaz (SOD) tarafından katalizlenerek H2O2’ye çevrilmektedir. 18 SOD reaksiyonu aşağıda görüldüğü gibidir: 2O ●–2 + 2H +  H2O2 + O2 In vivo ortamda oluşan sekonder ROS’ların (OH● radikallerinin) çoğu ise H2O2’nin Fenton reaksiyonuna göre metal katalizli bozunmasıyla açığa çıkmaktadır. Fenton reaksiyonu aşağıda gösterilmiştir: Mn+ + H2O M (n+1) ● 2  + OH + OH – Fenton reaksiyonundaki M harfi bir geçiş metalini temsil etmektedir (Singh, Manshian ve ark. 2009). Belirli bazı nanopartiküllerden salınan kadmiyum (Cd), krom (Cr), kobalt (Co), bakır (Cu), demir (Fe), nikel (Ni), titanyum (Ti) ve çinko (Zn) gibi geçiş metali iyonları, H2O2 ve O ●–2 gibi hücresel metabolik oksijen ürünlerinin OH ● radikaline dönüşmesine neden olabilir. OH● radikali ise DNA’ya zarar veren en önemli türdür. Ferröz demir (Fe+2) de moleküler oksijenden (O2) H2O2 oluşumuna neden olabilir. Oluşan H2O2 hücre ve çekirdek membranından difüzyonla geçerek DNA’ya bağlı Fe ile etkileşir ve OH● radikallerinin açığa çıkmasına yol açar. Bu durum, kromatindeki DNA ve histon proteinleri arasında Timin – Tirozin çapraz bağlarının oluşmasına neden olur. Ayrıca serbest Fe iyonları OH● radikali ile indüklenmiş pürin ve primidin modifikasyonlarına sebep olabilmektedir. Dolayısıyla Fe bileşeni içeren nanopartiküller, hücre içinde Fenton reaksiyonu ile son derece reaktif OH● radikallerinin oluşmasını körükleyen ilave kaynaklar niteliğindedir. Ayrıca H2O2’nin O ●– 2 ile tepkimeye girmesi neticesinde yine OH ● radikallerinin oluşumu söz konusudur. Haber – Weiss tepkimesi olarak bilinen bu olay katalizörsüz ortamda oldukça yavaş gerçekleşir ve şu şekilde gösterilmiştir: H ●– ● –2O2 + O2  OH + OH + O2 19 Demir katalizörlü tepkimeler ise çok daha hızlıdır. Katalizörlü tepkimede demir önce ferrik formdan (Fe+3) O ●–2 ile ferröz forma (Fe +2) indirgenir. Ferröz form Fenton tepkimesi ile ferrik forma tekrar yükseltgenirken OH● ve OH־ üretilir (Akkuş 1995, Gutteridge 1995). Demir katalizörlü tepkime şu şekilde gerçekleşmektedir: O ●–2 + Fe +3 +2 O2 + Fe (I) Fe+2 + H2O2  Fe +3 + OH● + OH– (II) O ●–2 + H2O2  OH ●+ OH– + O2 (III) Nanopartiküllerin yapılarında geçiş metalleri bulundurmalarına ilave olarak geniş yüzey alanına sahip olmaları da ROS oluşumunu teşvik etmektedir. O nedenle daha küçük boyuttaki nanopartiküller oksidatif stresi daha fazla indüklemektedir. Park ve arkadaşları (2008), yaptıkları bir çalışmada, titanyum dioksit (TiO2) nanopartiküllerinin perinüklear dağılımı ile aynı bölgede buna bağlı olarak oluşan ROS ilişkisini floresan bir ajan yardımıyla göstermişlerdir. Yapılan birçok araştırmada, nanopartiküllerin Komet ve Mikronükleus testleri ile belirlenmiş genotoksik etkilerinin oksidatif DNA hasarına bağlı olduğu gösterilmiştir. Ayrıca oksidatif stres, antioksidan savunmanın azalmasına bağlı olarak, mitojen aktif protein kinazı (MAPK) ve nüklear faktör kappa B (NF-kB) transkripsiyon faktörünü içeren spesifik sinyal yolaklarını aktive ederek pro-inflamatuar sitokinlerin salınmasına yol açmaktadır. Bu sinyalizasyon kaskadı neticesinde bir savunma reaksiyonu olan inflasmayon başlar. İnflamasyonda nötrofil gibi inflamatuar hücrelerden daha fazla ROS salınımı gerçekleşir. Bu durum ise daha önceden bahsedilen olayların kısır döngü şeklinde devam etmesine ve partikül maruziyetine dayalı patolojik olayların ortaya çıkmasına neden olmaktadır (Singh, Manshian ve ark. 2009). 20 2.1.6. Antioksidanlar ve Nanopartiküllerin Antioksidan Etkileri Antioksidan terimi, okside olabilen substrata göre ortamda daha az derişimde bulunan ve bu substratın oksidasyonunu belirgin şekilde geciktiren veya engelleyen madde olarak tanımlanabilir. Bu tanıma göre antioksidanların fizyolojik rolü, serbest radikalleri içeren kimyasal tepkimelerin sonucunda hücresel bileşenlere gelebilecek zararı önlemektir (Young ve Woodside 2001). Hunter ve Preedy (2011) ideal bir antioksidanda bulunması gereken özellikleri şu şekilde belirtilmiştir: 1) Beyin, kalp ve akciğer gibi oksidatif stresin yoğun olduğu bölgelere hızlı bir şekilde yayılabilmek 2) Düşük konsantrasyonlarda etkili olabilmek 3) ROS üretiminin olduğu bölgelerde güçlü bir etkiye sahip olup uzun süre bozunmadan kalabilmek 4) Toksik olmayıp organizmalar, dokular ve hücreler tarafından kolayca tolere edilebilmek Antioksidanların dört farklı şekilde etki gösterdiği bilinmektedir (Akkuş 1995): 1) Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya daha zayıf yeni moleküle çevirme toplayıcı etkidir. Antioksidan enzimler, trakeobronşiyal mukus ve küçük moleküller bu tip etki gösterirler. 2) Serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürme bastırıcı etkidir. Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler. 3) Serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etki zincir kırıcı etkidir. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler. 4) Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın onarılması onarıcı etkidir. Antioksidanlar, endojen kaynaklı veya eksojen kaynaklı olabilirler (Akkuş, 1995). Endojen antioksidanlar; enzim ve enzim olmayanlar olmak üzere iki sınıfa ayrılırlar. 21 Enzim olan endojen antioksidanlar şunlardır: Süperoksit dismutaz (SOD), Glutatyon peroksidaz (GSH-Px), Glutatyon S-Transferazlar (GST), Katalaz (CAT), Mitokondriyal sitokrom oksidaz sistemi, Hidroperoksidaz. Enzim olmayan bazı endojen antioksidanlar ise şunlardır: Melatonin, Seruloplazmin, Transferrin, Miyoglobin, Hemoglobin, Ferritin, Bilirubin, Glutatyon, Sistein, Metiyonin, Ürat, Laktoferrin ve Albümin. Eksojen antioksidanlar; vitaminler, ilaçlar ve gıda antioksidanları olmak üzere sınıflandırılabilirler. Vitamin eksojen antioksidanlar şunlardır: α-tokoferol (E vitamini), β-karoten, Askorbik asit (C vitamini), Folik asit (folat). İlaç olarak kullanılan eksojen antioksidanlar olarak: Ksantin oksidaz inhibitörleri (allopürinol, oksipürinol, pterin aldehit, tungsten), NADPH oksidaz inhibitörleri (adenozin, lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, nonsteroid anti-inflamatuar ilaçlar, diphenyline iodonium), Rekombinant süperoksit dismutaz, Trolox-C (E vitamini analoğu), Endojen antioksidan aktiviteyi artıranlar (GSH-Px aktivitesini arttıran ebselen ve asetilsistein), Nonenzimatik serbest radikal toplayıcılar (mannitol, albümin), Demir redoks döngüsü inhibitörleri (desferroksamin), Nötrofil adezyon inhibitörleri, Sitokinler (TNF ve IL-1), Barbitüratlar, Demir şelatörleri örnek olarak verilebilir. Gıdalardaki eksojen antioksidanlar: Bütil hidroksitoluen (BHT), Bütil hidroksianizol (BHA), Sodyum benzoat, Etoksikuin, Propil gallat ve Fe-süperoksit dismutaz’dır. Antioksidanlar etki şekillerine göre serbest radikal oluşumunu önleyenler ve zincir kıran ajanlar olarak iki sınıfa ayrılmaktadır (Akkuş, 1995). Serbest radikal oluşumunu önleyenler şunlardır: Metal bağlayıcılar (transferrin, albumin, seruloplazmin), Süperoksit dismutaz (SOD), Katalaz (CAT), Glutatyon peroksidaz (GSH-Px). 22 Zincir kıran ajanlar suda ve yağda eriyenler olarak 2’ye ayrılmıştır. Suda eriyen zincir kırıcı ajanlar şunlardır: Glutatyon, Ürat, Sistein, Askorbat (C vitamini). Yağda eriyen zincir kırıcı ajanlar ise şunlardır: α-tokoferol (E vitamini), Übikinon, β-karoten. Antioksidanların serbest radikallere karşı ortaya koyduğu hücresel savunma Şekil 2.10’da gösterilmiştir. Şekil 2.10. Antioksidan savunma sistemi Nanotıp; biyomedikal bilimler, fizik ve mühendislik gibi disiplinler arası etkileşimlerle ortaya çıkan en son teknolojiyi insan sağlığını korumak ve iyileştirmek için kullanmaktadır. Antioksidan nanopartiküllerin potansiyel terapötikler olarak ortaya çıkması, bu disiplinler arası hummalı çalışmaların önemli bir sonucudur. Fulleren türevleri, altın, platin ve seryum oksit gibi antioksidan nanopartiküller etkili birer serbest radikal tutucudur. Bu nanopartiküller nörodejeneratif, kardiovasküler, inflamatuar hastalıklar ve kanser gibi oksidatif stres ile ilgili hastalıkların tedavisinde kullanım potansiyeline sahiptir (Hunter ve Preedy 2011). Çizelge 2.4’te antioksidan etkiye sahip bazı nanopartiküllerin biyolojik faaliyetleri özetlenmiştir. 23 Çizelge 2.4. Bazı antioksidan nanopartikül türleri ve biyolojik etkileri Nanopartikül Biyolojik faaliyeti Kaynaklar C. elegans’ın yaşam süresini arttırıcı etki Kim ve ark. 2008 Sigara dumanının neden olduğu Onizawa ve ark. Platin oksidatif hasarın inhibisyonu 2009 Saitoh ve ark. Kanserli hücre gelişiminin inhibisyonu 2009 Farelerde antidiyabetik ajan. BarathManiKanth Hiperglisemi durumunda oluşan ve ark. 2010 Altın oksidatif stresi ve organ hasarını azaltır Osteoporozisin azaltılmasında Ok-Joo ve ark. antioksidan etki 2010 Antioksidan, Nöroprotektif ve Markovic ve Radyoprotektif etki. Ayrıca İskemi – Trajkovic 2008 Reperfüzyon yaralanmalarına karşı Fulleren koruyucu etki ve türevleri Doxorubicin toksisitesine karşı koruyucu Injac ve ark. 2008 etki Endotelyal hücreleri NO ile indüklenmiş Lao ve ark. 2009 hasara karşı koruyucu etki Nöronal yaşam süresini ve Drosophila Rzigalinski ve yaşam süresini uzatır ark. 2006, 2009 Rzigalinski ve Travmatik beyin yaralanmalarında ark. 2009a; koruyucu etki Whiting ve ark. Seryum oksit 2009 Rzigalinski ve Alzheimer ve Parkinson hastalıklarında ark. 2009b; Singh nöroprotektif etki ve ark. 2007 24 Nanopartikül Biyolojik faaliyeti Kaynaklar Schubert ve ark. In vitro nöroprotektif etki 2006 Rzigalinski 2005; Colon ve ark. In vivo ve in vitro radyoprotektif etki 2009 Rzigalinski ve Mitokondriyal koruyucu ark. 2009b Seryum oksit Kardiyoprotektif etki Niu ve ark. 2007 Retina hücrelerinin ışıkla indüklenmiş Chen ve ark. 2006 oksidatif stresten korunması Rzigalinski ve ark. 2006; Anti-inflamatuar faaliyetler Rzigalinski ve Clark 2005; Hirst ve ark. 2008 2.2. Fullerenler 2.2.1. Fullerenlerin Genel Yapısı ve Özellikleri Fullerenler, Karbon (C) atomunun üçüncü doğal allotropları olup kapalı kafes şeklindeki yapılardır. C atomunun allotropları Şekil 2.11’de gösterilmiştir. Kroto ve ark. tarafından 1985 yılında keşfedilen fullerenler inert bir gaz ortamında grafitin buharlaştırılıp yoğunlaştırılması ile elde edilmiştir. Kroto ve arkadaşları, grafitin lazer ile buharlaştırılması neticesinde Cn (n burada 20 den büyük sayılar) kümelerinin oluştuğunu görmüştür (Kroto ve ark. 1985). Elde edilen bu karışımdaki karbon kümelerinin dağılımı uçuş zamanlı kütle spektrometresi ile incelenmiş ve C60 ile C70 miktarının fazla olduğu gözlenmiştir. Bütün fulleren türleri arasında en fazla bulunan tür ise C60’tır. Şekil 2.12’de C60’ın iki ve üç boyutlu yapısı görülmektedir. 25 Şekil 2.11. Karbon atomunun allotropları a) Diamant, b) Grafit, c) Lonsdaleite, d) C60 fulleren, e) C540 fulleren, f) C70 fulleren, g) Amorf karbon, h) Tek duvarlı karbon nano- tüp (SWCNT) Şekil 2.12. C60’ın iki boyutlu (solda) ve üç boyutlu (sağda) yapısı 26 C60, Amerikalı Mimar Richard Buckminster Fuller’in 1967 Montreal fuarında yaptığı jeodezik kubbenin şekline benzediği için araştırmacılar bu yeni keşfedilen yapıyı, Buckminster Fulleren olarak adlandırmışlardır (Şekil 2.13). Şekil 2.13. R. B. Fuller’in Montreal fuarında (1967) yaptığı jeodezik kubbe Buckminster fullerenler, 60 C atomunun sp2,5 bağlarıyla birbirine bağlanarak oluşturduğu, 20 hekzagon ve 12 pentagondan meydana gelen 32 yüzlü bir yapıya sahip, psuedo-aromatik moleküllerdir. Pentagonlar arasında C5 – C5 tek bağları, hekzagonlar arasında ise C5 = C6 çift bağları bulunmaktadır. Buckminster fullerenler yaklaşık olarak 1 nm çapında olup trunkat ikozahedral simetri gösterir ve bu şekliyle bir futbol topuna benzetilir. Buckminster fullerenler futbol topuna benzediği için Buckyballs olarakta adlandırılırlar (Andrievsky ve ark. 2009). Rusya’daki Shunga – Karelia bölgesi civarında fullerenlerin doğal olarak oluştuğu görülmüştür. Shungit denilen son derece mertamorfoza uğramış bir kömürde ve Fulgurit denilen, yere yıldırım düştüğünde oluşan camsı bir taşta bir miktar fulleren bileşiği tespit edilmiştir (Buseck ve ark. 1992, Daly ve ark. 1993). Bunun dışında yaklaşık 65 milyon yıldan 2 milyar yıla kadar uzanan bir süre içerisinde meteor yağmurları ve kuyruklu yıldız çarpışmaları ile dünya dışı fulleren taşınımının olabileceği ve yine çarpışmanın etkisiyle oluşan ortamda fulleren bileşiklerinin meydana gelebileceği gibi bazı görüşler de ileri sürülmektedir (Becker ve ark. 1996). 27 2.2.2. Fullerenlerin Türevlendirilmesi Fullerenlerin 1985 yılında keşfedilmesinden günümüze kadar uzanan süre içerisinde bu bileşikler üzerinde yapılan çalışmalar gittikçe artmıştır. Günümüzde yapılan çalışmalar daha çok fulleren türevlerinin genişletilmesi ile ilgilidir (Cataldo ve ark. 2008). Fullerenler sahip oldukları yapısal özellikleri itibariyle kimyasal modifikasyonlara uygun bileşiklerdir. Dolayısıyla bunları çeşitli modifikasyonlarla türevlendirerek farklı fiziksel ve kimyasal özellikteki yapılar haline getirmek mümkündür. Örneğin; Fulleren nanopartiküllerinin hidrofilik özelliklerini arttırmak için yüzeylerine hidroksil (-OH), karboksil (-COOH) ve amin (-NH2) grupları eklenebilir ya da fulleren kafesi içerisine metal atomları sokularak endohedral metallofullerenler elde edilebilir. Bu metal atomları fulleren kafesine elektron verirken kafesin tam merkezinde konumlanmaktadır. Endohedral metallofullerenler Manyetik Rezonans ve X-ışını görüntüleme tekniklerinde (MRI ve XRI) radyoizleyici olarak kullanılabilirler (Bosi ve ark. 2003). Çeşitli fonksiyonel gruplarla modifiye edilmiş bazı fulleren türevleri Şekil 2.14’te gösterilmiştir. Şekil 2.14. Bazı modifiye fulleren türevleri 28 Yapısında çeşitli fonksiyonel gruplar bulunduran ve makul elektron ilgisi gösteren fullerenler, homojen olarak çözündüğünde; nöroproteksiyon, radyoproteksiyon, apoptoz, tümör tedavisi, fotodinamik tedavi ve AIDS tedavisi gibi alanlarda kullanılabilme potansiyeline sahip olmaktadır (Trajkovic ve ark. 2005). Bu anlamda, fulleren türevlerinin kullanıldığı bazı uygulama alanları Şekil 2.15’te gösterilmiştir. Şekil 2.15. Fulleren türevlerinin uygulama alanları (Cataldo ve ark. 2008) 2.2.2.1. Polihidroksi Fullerenler ve Fullerenol Polihidroksi fullerenler ya da fullerenol, fulleren yüzeyine belirli sayıda hidroksil grubu (-OH) eklenmesiyle oluşur. Kimyasal formülleri C60(OH)n’dir (n = 18 – 22).. Fullerenolün üç boyutlu yapısı Şekil 2.16’da gösterilmiştir. 29 Fullerenoller, suda çok iyi çözünme, kan – beyin bariyerini geçebilme, molekül başına birçok oksijen radikali yakalayabilme ve mükemmel bir antioksidan olma gibi özellikleriyle ön plana çıkmaktadır (Trajkovic ve ark. 2005). Şekil 2.16. Fullerenolün üç boyutlu yapısı 2.2.3. C60 Fullerenlerin Toksikolojisi Moleküler oksijen (O2), sahip olduğu benzersiz elektronik konfigürasyon dolayısıyla birbirine enerjik olarak çok yakın üç elektronik formda bulunabilmektedir. Bunlar temel triplet form, uyarılmış triplet ve uyarılmış singlet formlardır. Uyarılmış singlet forma singlet oksijen (1O2) denilmektedir. Singlet oksijen, yapısında eşleşmemiş elektron içermediği için serbest radikal değildir fakat sahip olduğu elektronların dönme yönlerinin farklılığından dolayı oksijenden daha reaktif bir moleküldür (Ellis ve Kneser 1933). En genel anlamda singlet oksijen oluşumu fotosensitizasyon ile gerçekleşmektedir. Fotosensitizasyon olayında, belirli bir dalgaboyu aralığındaki ışığın fotosensitizer 30 tarafından absorbe edilmesi neticesinde uyarılmış haldeki sensitizerden oksijenin temel triplet haline enerji transferi gerçekleşmektedir (Clo ve ark. 2007). C60 fullerenler çok etkili singlet oksijen üreticileridir. Bunlar UV ışınları kuvvetle absorbe ederken görünür bölge ışınlarını kısmen absorbe ederler (Kratschmer ve ark. 1990, Leach ve ark. 1992). Absorplanan ışık enerjisi ile C60 molekülü uyarılmış hale geçmekte (1C60*) ve Şekil 2.17’de gösterilen Tip 1 ve Tip 2 fotokimyasal mekanizmalarla O ●–2 ya da 1O2 oluşumuna yol açmaktadır. Hücre içerisinde oluşan 1O2, diğer moleküllerle etkileştiğinde ya içerdiği enerjiyi onlara aktarır ya da hücre membranındaki poliansatüre yağ asitleriyle doğrudan tepkimeye girerek lipit peroksitlerin oluşumuna neden olur. (Yamakoshi ve ark. 1998). Şekil 2.17. Tip 1 (Yük transferi) ve Tip 2 (Enerji transferi) fotokimyasal mekanizmalarının şematik gösterimi (*, C60‘ın uyarılmış singlet ve triplet hallerini belirtmektedir) Tıp alanındaki potansiyel kullanımı ve tüketici ürünleri açısından C60 toksisitesinin değerlendirilmesi kesin bir ön koşuldur. C60 fullerenler muhtemel bir ROS kaynağı olduğu için C60‘ın su ekosistemleri ile etkileşimi, endüstriyel seri üretimi ve sulu ortamlarda istenmeyen fulleren aggregatlarının oluşması gibi konularda bazı haklı kaygılar ortaya çıkmıştır. Bilindiği üzere aşırı ROS üretimi antioksidan kapasiteyi alt ederek oksidatif strese ve ciddi bir sitotoksik ya da mutasyonel hücre hasarına yol açmaktadır (Nelson ve ark. 1993). Biyolojik çevrelerde C60 fulleren aracılı ROS’ların oluşumuna bağlı olarak gözlenebilecek etkiler Şekil 2.18’de gösterilmiştir. 31 Şekil 2.18. Biyolojik çevrelerde fulleren aracılı ROS’ların oluşumu ve olası etkileri (NF-kB: Nüklear faktör – kappa B, MAPK: Mitojen – aktif protein kinaz) C60, güçlü bir ışık kaynağına maruz kalmadığı sürece yeterli ROS üretimi gerçekleştiremez. Bu doğrultuda, yapılan birçok klasik toksisite çalışmasında, geniş konsantrasyon aralıklarında uygulanan çeşitli C60 preparasyonlarının in vivo ve in vitro sitotoksik veya genotoksik etkilere yol açmadığı belirtilmiştir (Nelson ve ark. 1993, Yamago ve ark. 1995, Baierl ve ark. 1996, Moussa ve ark. 1996, Jia ve ark. 2005, Mori ve ark. 2005, Kolosnjaj ve ark. 2007, Baker ve ark. 2008). Bununla birlikte C60‘ın toksik olmadığı anlayışı Sayes ve arkadaşlarının 2004’te yaptığı bir çalışma ile çelişmektedir. Solvent değiştirme metodu ile hazırlanmış ve türevlendirilmemiş Tetrahidrofuran (THF)/C60 nanopartikülleri, suda çözünebilir fulleren türevlerinden farklı olarak, hazırlanma ve hücrelere uygulanma esnasında ortam 32 ışığına maruz kaldığı taktirde yüksek miktarda ROS üretmekte ve oldukça düşük konsantrasyonlarda (nM) bile insan hücrelerini öldürmektedir. Sayes ve arkadaşları söz konusu sitotoksik aktivitenin hücre membranının ROS aracılı lipit peroksidasyonu ile gerçekleştiğini göstermişlerdir (Sayes ve ark. 2004). Sayes ve arkadaşları, THF/C60 tarafından üretilen oldukça yüksek miktarlardaki sitotoksik ROS’un, saf C60‘ın doğal bir özelliği olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Bununla birlikte fulleren kafesinin türevlendirilmesindeki artışa bağlı olarak ROS oluşumunun ve sitotoksisitenin düştüğünü göstererek hipotezlerini desteklemişlerdir (Sayes ve ark. 2004). Bu hipotez aynı zamanda, çeşitli fonksiyonel grupların fulleren çekirdeğine kovalent olarak bağlanmasıyla birlikte C60‘ın fotofiziksel özelliklerinin değişmesi ve singlet oksijen oluşturma veriminin düşmesine ilişkin yapılan çalışmalarla tutarlılık göstermektedir (Prat ve ark. 1999, Bensasson ve ark. 2001, Chin ve ark. 2008). Benzer şekilde, THF ile hazırlanmış C60 ve polihidroksile C60 bileşikleri direkt olarak ROS oluşturma ve sitotoksik kapasiteleri açısından kıyaslandığında, THF ile hazırlanmış C60 sitotoksisitesinin intraselüler ROS birikimi ile ilişkili olduğu ve antioksidan uygulama ile önlenebileceği, polihidroksile C60 bileşiğinin gösterdiği düşük toksisitenin ise ROS’tan bağımsız olduğu bulunmuştur (Zhu ve ark. 2006). Elde edilen sonuçlar saf C60‘ın potansiyel toksisitesi hakkındaki bilinçlenmeyi arttırırken, alternatif bir teori de THF/C60’ın ROS aracılı sitotoksisitesinin kafes içerisine giren THF kalıntılarının varlığından kaynaklandığını ileri sürmektedir (Andrievsky ve ark. 2005). Son varsayımı destekler nitelikte yapılan bir çalışmada, suda uzun süre karıştırılarak elde edilen saf C60 süspansiyonunun çeşitli akuatik organizmalarda ve memeli hücre kültürlerinde daha az toksik olduğu bulunmuştur (Oberdorster ve ark. 2006, Zhu ve ark. 2006, Markovic ve ark. 2007). Beuerle ve arkadaşlarının 2007 yılında ortaya koyduğu bir çalışmada, genel olarak pozitif yüklü fulleren türevlerinin negatif yüklü olanlara göre daha yüksek bir toksisite gösterdiği belirlenmiştir. Bununla birlikte Şekil 2.19’da görülen tris – malonik asit 33 türevleri gibi bazı anyonik bileşiklerin dekarboksilasyona yol açarak toksisiteyi arttırdığı da belirtilmiştir. Şekil 2.19. Tris – malonik asit C3 ve D3 türevleri C60‘ın biyogüvenliğine ilişkin oldukça ikna edici veriler olmasına rağmen, onun potansiyel toksik etkilerini küçümsemek ve dikkate almamak akılsızca bir davranış olacaktır. Buna bağlı olarak, uzun süre suda karıştırılarak hazırlanan C60 nanopartiküllerinin ve suda çözünebilir C60 türevlerinin çeşitli deneysel sistemlerde hala toksik ve mutajenik etkiler gösterdiği ortaya çıkarılmıştır (Rajagopalan ve ark. 1996, Tsuchiya ve ark. 1996, Ueng ve ark. 1997, Chen ve ark. 1998, Bosi ve ark. 2004, Oberdorster 2004, Dhawan ve ark. 2006, Yamawaki ve Iwai 2006, Baun ve ark. 2007, Roberts ve ark. 2008) Özetle, C60’a bağlı toksisitenin değerlendirilmesinde; kullanılan C60 türevlerinin hazırlanma yöntemleri, fonksiyonel grupları, ışığa duyarlılıkları, diğer kontaminantlarla etkileşimleri ve kullanılan deneysel sistem oldukça önemli kriterlerdir. C60 türevlerinin farklı sitotoksik etkiler göstermesinde her türevin hücre membranıyla etkileşiminin ve intraselüler boşluğa girişinin farklı şekillerde gerçekleşmesi rol oynamaktadır. Yüksek hidrofobik ya da hidrofilik yüzey alana sahip toksik katyonik türevlerin, toksik olmayan nötral ve anyonik türevlere göre hücre membranına daha kolay girdiği gösterilmiştir (Bosi ve ark. 2004). 34 2.2.4. C60 Fullerenlerin Antioksidan ve Sitoprotektif Etkileri C60 fullerenler, sahip olduğu yapısal özellikler ve ROS’lara karşı gösterdiği yüksek reaktivite nedeniyle Krusic ve arkadaşları (1991) tarafından “radikal süngeri” olarak nitelendirilmiştir (Krusic ve ark. 1991). Suda çözünebilen fullerenoller ve hekzasülfobütil fullerenler, O ●–2 giderici aktiviteleri çalışılan ilk türevlerdir. Özellikle hekzasülfobütil fullerenlerin µM düzeyindeki konsantrasyonlarda kullanıldıklarında bile doza bağlı olarak % 95’e varan oranlarda O ●–2 giderici aktivite gösterdiği ortaya konmuştur (Chi ve ark. 1998, 2002). Fullerenollerde bu etkinliğin 1 mM konsantrasyonda % 40 civarında olduğu belirtilmiştir (Chiang ve ark. 1995, Mirkov ve ark. 2004). O ●–2 giderici aktivitede gözlenen bu farklılığın karbon kafese eklenen fonksiyonel gruplarla ilişkili olduğu ileri sürülmüştür (Cataldo ve ark. 2008) Quick ve ark. (2008), fulleren türevlerinin SOD enzimini taklit eden SOD-mimetik özelliklere sahip olduğunu bildirmiştir. O ●–2 radikallerini giderme aktivitesi açısından, tris – malonil C60 türevlerinin SOD ile kıyaslanabilir seviyede olduğunu ifade eden Quick ve arkadaşları aynı zamanda bir tris – malonik asit C60 türevi olan C3 bileşiğinin, O ●–2 dismutasyonunu enzim benzeri katalitik bir antioksidan aktivite ile gerçekleştirdiğini ortaya koymuştur (Quick ve ark. 2008). Ayrıca C3 bileşiğinin fare beynindeki oksidatif stresi düşürdüğü, bilişsel performansı arttırdığı ve farelerin yaşam süresini uzattığı belirtilmiştir (Ali ve ark. 2008). Son yıllarda C60 fulleren hidratlarının (C60HyFn) antioksidan kapasiteleri kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır. Bu bileşiklerin beklenmedik bir şekilde, çok düşük konsantrasyonlarda bile 103 – 104 civarında OH● radikalini nötralize edebildikleri belirtilmiştir. Ayrıca antioksidan kapasiteye sahip olan bu bileşiklerin nöroprotektif, anti-kanser, anti-inflamatuar ve anti-aterojenik etkiler gösterdiği ortaya konmuştur (Andrievsky ve ark. 2005). 35 Bogdanovic ve ark. (2008), fullerenolün, hücre tipine ve uygulanan doza bağlı olarak oksidatif strese maruz kalan hücrelerdeki antioksidatif kapasiteyi ve antioksidan enzimlerin aktivitesini arttırdığını belirtmiştir. Mitokondri ile etkileşime girebilmeleri ve ROS’ları bilinen antioksidanlardan daha etkili bir şekilde gidermeleri dolayısıyla fullerenollerin ve malonik asit – C60 türevleri gibi suda çözünebilen karboksifullerenlerin sitoprotektif antioksidan olarak kullanım potansiyeline sahip olduğu belirtilmiştir. Fullerenol ve karboksifulleren bileşiklerinin ROS deaktivasyonuna bağlı sitoprotektif özellik göstermesinin altında yatan mekanizma genel olarak bu bileşiklerin, apoptotik kaskadın oksidatif stres aracılı indüksiyonu ile olan etkileşimlerine dayanmaktadır. Fulleren ile muamelenin, TNF ya da UV ile tetiklenen kaspaz aktivasyonunu etkili bir şekilde azalttığı ve DNA fragmentasyonunu önlediği bildirilmiştir (Edinger ve Thompson 2004, Chirico ve ark. 2007, Harhaji ve ark. 2008). İlginç bir şekilde, sitotoksik ROS oluşturan THF/C60 nanopartikülleri γ-ışınına maruz bırakıldığında sitotoksik özelliklerini kaybederek memeli hücrelerini oksidatif strese bağlı ölümden koruyabilmiştir (Isakovic ve ark. 2006). PVP, PEG ya da γ-siklodekstrinle modifiye edilmiş farklı C60 nanopartikülleri ise ROS giderme kapasiteleri ve hedeflenmiş ROS tipleri açısından farklılık göstermektedir (Huang ve ark. 2003, Xiao ve ark. 2005). 2.2.4.1. C60 Fullerenlerin Antioksidan Etki Mekanizması Şimdiye kadar, C60 fullerenlerin yüksek antioksidatif potansiyelleri serbest radikallerin karbon kafesinin çift bağlarına hemen bağlanabilme özelliği ile belirlenmiştir. C60 kafesinin sahip olduğu 30 çift bağ teorik olarak 60 radikal tutabilmektedir. Bu radikal tutma işlemi ise aşağıdaki reaksiyonlara göre gerçekleşmektedir (Wang ve ark. 1999). 36 >C = C< + OH● >C(OH) − ● C< + OH●  >C(OH) – C(OH)< OH● + C60(OH)n  [C60(OH) ● ● n+1] ; H + C60(OH)n  [C60(OH) ● n H] Bununla birlikte Andrievsky ve arkadaşlarının 2009’da yaptığı bir çalışma, serbest radikallerin fulleren çekirdeğinin çift bağlarına direkt olarak bağlanma mekanizmasına alternatif olarak C60HyFn’nin farklı bir antiradikal etkiye sahip olduğunu ileri sürmektedir. (C60HyFn = C60@(H2O)n’in stabil donör – akseptör kompleksi) C60HyFn’nin radikal giderici etkisi çözeltideki C60 konsantrasyonuyla ters bir ilişki içerisindedir. Buna göre 10−9 – 10−11 M gibi son derece seyreltik C60 çözeltilerindeki her bir C60 molekülü, teorik olarak karbon moleküllerine bağlama kapasitesinin (bir C60 molekülü için 60 OH● radikali) çok daha üzerindeki miktarlarda OH● radikalini gidermiştir. 10−9 – 10−11 M konsantrasyon aralığındaki oldukça seyreltik sulu fulleren çözeltilerinde (C60FWS) ise bir C60HyFn molekülü yaklaşık olarak 10 3 – 104 gibi müthiş miktarlardaki OH● radikallerini nötralize edebilme yeteneğindedir. Andrievsky ve arkadaşlarının yapmış olduğu araştırmanın sonuçları; C60HyFn’nin 10 −6 – 10−11 M konsantrasyon aralığında ters orantılı ve stokiyometrik olmayan bir antiradikal etki özelliğini ortaya koymuştur. Bu fenomenin, radikallerin C60 moleküllerine direkt olarak bağlanma mekanizmasına dayanarak açıklanması zordur. Bunun için önerilen basit bir mekanizmada düzenli C60 – su kompleksinden bahsedilmektedir. Söz konusu mekanizma Şekil 2.20’de gösterilmiştir. Eksik elektron içeren C60 çekirdeğinin hidrofobik hidrasyonundan dolayı H2O dipol bağları tarafından kararlı su katmanları oluşturulur. Radyasyon ile indüklenmiş OH● radikallerinin oluşumu ve sonraki ortadan kaldırılma süreci bu heterojen düzenli su katmanlarında gerçekleşmektedir (Andrievsky ve ark. 2002, 2005, Chaplin 2000). Bu kavrama uygun olarak hidrofilik yüzeylere yakın su molekülleri uzun mesafeli, stabil ve düzenli su katmanları oluşturarak 10 – 100 µm mesafelere kadar genişlemekte ve binlerce su katmanı meydana getirmektedir. Benzer şekilde C60HyFn, sulu ortamlarda uzun mesafeli ve düzenli su katmanlarının oluşumunu indüklemektedir. 37 Şekil 2.20. Uzak mesafeli, düzenli su katmanları ile çevrili bir C60HyFn modeli (Andrievsky ve ark. 2009) Bu durumda, Şekil 2.21’de görüleceği üzere, heterojen ve düzenli su ortamı; suyun radyolizisi ile oluşan sulu serbest radikallerin kendi bölgelerindeki lokalizasyonunu ve konsantrasyonunu düzenlemektedir. Bu düzenlenme ise sulu serbest radikalleri çevreleyen su kabukları ile düzenli su ortamının yapı benzerliğinden ileri gelmektedir. Serbest radikallerin böyle sulu ortamda birikmesi, onların bu ortamda karşılaşma olasılıklarını ve akabinde stabil (radikal olmayan) moleküllerin oluşumu ile sonlanan rekombinasyonlarını (serbest radikallerin kendi kendilerine nötralize olmasını) arttırmaktadır (Andrievsky ve ark. 2005, Crowell ve ark. 2004). Başka bir deyişle C60HyFn’nin diğer antikoksidanlara göre (tokoferoller, karotinoidler, bioflavonoidler, askorbik asit v.s.) bu sıradışı antiradikal özellikleri; o ve onun nano boyuttaki diğer kümeleri tarafından indüklenen uzun mesafeli ve düzenli su kabukları vasıtasıyla serbest radikallerin birikimini ve deaktivasyonunu katalizleme yeteneğine dayanmaktadır. C60HyFn’nin olası ikinci indirekt antiradikal etki mekanizması ise; 38 suyun radyolizisi ile oluşan primer ürünlerin C60’ı saran düzenli ve viskoz su katmanlarında meydana gelmesine dayanmaktadır. Bu viskoz katmanlarda meydana gelen serbest radikallerin difüzyonu ise büyük ölçüde sınırlandırılmaktadır. Bu olası etki mekanizmasına göre fulleren ile düzenlenmiş sulu ortamda serbest radikaller mekansal olarak birbirlerinden ayrılamazlar. Dolayısıyla da serbest radikal oluşumundan hemen sonra hızlıca rekombine olarak bazı moleküler ürünler oluştururlar. Şekil 2.21. Sulu C60 fulleren etrafında şekillenmiş, uzak mesafeli ve düzenli su katmanlarınca kontrol edilen serbest radikallerin absorbsiyon, toplanma ve rekombinasyon mekanizmalarının olası bir şeması (Andrievsky ve ark. 2009) Şekil 2.21’de görüldüğü gibi suyun radyolizisi ile oluştuğu varsayılan sulu R1, R2, R3 ve R radikalleri OH●4 , H ●, HO ● ● ●−2 , CO2, O₂ ve sulu e − radikalleri ile eşdeğer 39 düşünülmektedir. Bu serbest radikaller OH● + H● H O ; OH● + OH● → 2 → H2O2 ; H● + H● → H2 gibi basit rekombinasyon reaksiyonları ile H2O, H2O2, H2, O2 ve H2CO3 gibi nötral moleküler ürünler oluşmaktadır. C60HyFn varlığındaki serbest radikal eliminasyonunun bu indirekt ve katalitik benzeri mekanizması bazı deneysel verilerle desteklenmiş ve doğal C60 fullerenlerin ROS ile indüklenmiş oksidatif modifikasyona karşı son derece yüksek stabilite gösterdiği ortaya konmuştur. Ultrasonik muamele ile hazırlanan C60 – su süspansiyonu, 6 mGy gibi yüksek bir radyasyon dozuna uzun süre maruz bırakılmış ve C60 moleküllerinin sadece %5’lik bir kısmının yıkıma uğradığı görülmüştür. Sulu C60 çözeltilerinin radyolizisi ile gerçekleşen bu yıkım neticesinde polimerizasyon, karbon iskeletinin parçalanması, alken (-CH) ve karbonil (-C=O) gruplarının oluşması, hidroksil (OH●) radikallerinin açığa çıkması gibi olaylar gerçekleşmektedir. Suda çözünebilen fonksiyonel fullerenlerin radyasyon ile indüklenmiş hasarlara karşı göstermiş olduğu yüksek etkinlik onların olası in vivo ROS giderme aktiviteleri ile açıklanmaktadır. Bununla birlikte fulleren türevlerinin taşıdıkları fonskiyonel gruplara bağlı olarak ROS giderme kapasiteleri de değişiklik göstermektedir. 4 karboksil grubu (-COOH) taşıyan bir fulleren bileşiğinde OH● radikali giderme aktivitesi gözlenmemiştir. Dolayısıyla karbon kafesine eklenen fonksiyonel gruplara ya da radikallere bağlı olarak OH● radikalini bağlayabilme yeteneği azalmaktadır. Ayrıca antioksidatif aktivite gösteren sulu C60 bileşiklerinin boyut olarak genelde 20 – 200 nm aralığında yer aldığı belirtilmiştir (Andrievsky ve ark. 2009). 2.2.5. C60 Fullerenlerin Antiapoptotik Aktivitesi Apoptozis, 25 kDa ağırlığında dimerik bir protein olan Transforme – edici Büyüme Faktörü β (TGF-β)’nın ana rol oynadığı programlanmış bir hücre ölüm mekanizmasıdır. Bu süreçte ortama ROS salınımı gerçekleşirken bunu durdurmanın ya da en azından azaltmanın tek yolu antioksidan muamelesidir. Önceden kısaca antioksidan özelliklerine değinilen tris – malonik asit C3 ve D3 fulleren türevleri, Hep3B hepatik tümör 40 hücrelerinde TGF-β’nın indüklediği ROS’ları nötralize ederek apoptozisi önlemiştir (Huang ve ark. 1998). Ayrıca yapılan bir diğer çalışmada hekzasülfobütil fulleren türevinin iskemi – reperfüzyon sonucu oksidatif strese maruz kalan böbrek hücrelerindeki antiapoptotik etkisi ortaya konmuştur (Chien ve ark. 2001). İskemik durumu takip eden organ reperfüzyonu, apoptoziste doruğa ulaşan bir dizi hücresel modifikasyonu beraberinde getirmektedir. Apoptotik hücre ölümünün yoğunluğu hem in vivo’da hem de in vitro’da ROS’ların nötralizasyonuyla yakından ilişkilidir. C3 bileşiği, epitel hücrelerde, hücreler ve matriks arasındaki adezyonun kaybı ve hücresel büzülme ile karakterize anoikia durumunu ve artan substrat ihtiyacı ile indüklenen apoptotik hücre ölümünü azaltmaktadır (Straface ve ark. 1999). Bunun dışında serebellar granül hücrelerinde ve periferal kan mononüklear hücrelerinde de C3 bileşiğinin etkileri çalışılmıştır (Bisaglia ve ark. 2000, Monti ve ark. 2000). 2.2.6. C60 Fullerenlerin Antikarsinojenik Etkileri Fullerenlerin, moleküler oksijenin son derece reaktif ROS’a geçişini fotosensitize edebilme potansiyelleri onları kanser hücrelerinin fotodinamik tedavi ile öldürülmesi alanında umut verici adaylar yapmaktadır. Bu terapötik uygulamanın asıl avantajı ise seçiciliktir. Çok iyi odaklanmış bir ışın demetinin vücut yüzeyinden tümör bölgesine ya da optik fiberler yardımıyla dahili tümörlere uygulanması sonucu fotosensitize edici ajanın tümör – spesifik aktivasyonu gerçekleşmektedir (Brown ve ark. 2004). Çeşitli suda çözünebilen C60 türevlerinin serviks, larinks, akciğer ve kolon karsinomu gibi farklı kanserli hücre kültürlerine karşı gösterdikleri etkili fotodinamik aktivite yapılan birçok çalışma ile ortaya konmuştur (Mroz ve ark. 2007). C60 fullerenlere porfirin gibi diğer bazı fotosensitizerlerin bağlanması ile oluşan ikililerde benzersiz fotofiziksel özellikler ve redox özellikleri ortaya çıkmaktadır. Bu 41 özellikleri barından C60 – porfirin ikilisi, oksijenin nisbi yokluğunda bile oldukça yüksek bir ROS – aracılı sitotoksisite kapasitesine sahiptir (Alvarez ve ark. 2006). Görünüşe göre fulleren türevlerinin antikarsinojenik aktivitesi hem singlet oksijen hem de süper oksit anyonunun oluşumuna bağlı olup (Alvarez ve ark. 2006, Mroz ve ark. 2007) fulleren kafesinin türevlendirilme genişliği ile ters ilişki göstermektedir (Yang ve ark. 2002, Mroz ve ark. 2007). Fulleren kafesine kovalent olarak bağlanan fonksiyonel grup sayısı arttığında fulleren kafesinin türevlendirilme genişliğine bağlı olarak ROS oluşturma kapasitesi azalmaktadır (Prat ve ark. 1999, Bensasson ve ark. 2001, Chin ve ark. 2008). Ayrıca yapı – aktivite ilişkisi ile ilgili yapılan bir araştırmada -OH grubu gibi daha fazla singlet oksijen yakalayan gruplara sahip C60 türevlerinin, aynı sayıda -CH grubu içeren veya daha az singlet oksijen yakalayan gruplara sahip C60 türevlerine kıyasla daha düşük bir fotodinamik aktivite gösterdiği ortaya çıkmıştır (Mroz ve ark. 2007). Suda çözünebilir C60 türevlerinin fotodinamik antitümör aktivitesi, programlanmış hücre ölümü olarak bilinen apoptozisin başlamasını gerektirmektedir (Alvarez ve ark. 2006, Mroz ve ark. 2007). Bu tip hücre ölümü, kaspaz enzim ailesinin aktivasyonu ve DNA’nın fragmentasyonu ile karakterize olup plasma membranı yıkıma uğramadan gerçekleşmektedir. Akabinde bir inflamasyonu durumu olmadan apoptotik hücrelerin fagositlerce tanınıp ortadan kaldırılması gerçekleşir (Edinger ve Thompson 2004). Bu durum suda çözünebilir C60 türevlerinin seçici mitokondriyal lokalizasyonu ile tutarlılık göstermektedir (Foley ve ark. 2002, Chirico ve ark. 2007) ve ROS ile indüklenen mitokondriyal disfonksiyonun, apoptozisin mitokondriyal yolağındaki başlatıcı adımı teşkil ettiği düşünülmektedir (Edinger ve Thompson 2004). Suda çözünebilir C60 türevlerinin aksine SDS, Tween gibi bilinen sürfaktanların eklenmesiyle ya da PEG ve PVP gibi polimerlerle kaplanarak hazırlanan C60 nanopartikülleri gelişigüzel bir şekilde kansere karşı gösterdikleri fotodinamik aktiviteler için test edilmiştir. Şaşırtıcı bir biçimde türevlendirilmemiş C60, fonksiyonelize edilmiş suda çözünebilir fullerenlere kıyasla daha yüksek bir singlet 42 oksijen kuantum verimi göstermiştir ve dolayısıyla çok daha iyi fotosensitizer özelliğe sahiptir (Prat ve ark. 1999, Bensasson ve ark. 2001, Chin ve ark. 2008). Ayrıca, tümörlerin anormal genişlikteki vasküler porları nedeniyle artan permeabilite ve tümörlerdeki bozulmuş lenfatik süzülme nedeniyle oluşan birikimden (Modi ve ark. 2006) dolayı birkaç yüz nanometreye kadar değişen boyutlardaki C60 nanopartikülleri büyük olasılıkla yüksek intra tümör konsantrasyonlarına ulaşmaktadır. Aslında PEG/C60 konjugatının tümör dokusunda normal dokuya göre daha fazla birikmesi ve dokuda daha uzun süre kalması, bu konjugatı, bilindik bir fotosensitizer olan porfirine göre daha güçlü tümör baskılayıcı fotodinamik etkiye sahip bir ajan yapmaktadır (Tabata ve ark. 1997). Çizelge 2.5’te çeşitli C60 türevlerinin ROS aracılı biyolojik etkileri özetlenmiştir. 43 Çizelge 2.5. Çeşitli C60 preperasyonlarının başlıca ROS aracılı biyolojik etkilerine genel bakış Fulleren Türevleri Deneysel Sistem ROS Biyolojik Etkiler Referanslar İn vitro eksitotoksik ve Jin ve ark. 2000, ↓ Nöroproteksiyon apoptotik nöronal ölüm Dugan ve ark. 2006, Chen ve ark. 2004, In vitro H2O2 ya da Nitrik oksit ↓ Hücre ölümünün önlenmesi Isakovic ve ark. sitotoksisitesi 2006, Akciğerde iskemi – reperfüzyon yaralanması ↓ Vasküler hasarın azalması Chen ve ark. 2004 Mitokonriyal Suda çözünebilir depolarizasyonun inhibisyonu, C60 türevleri In vitro TNF sitotoksisitesi ↓ kaspaz aktivasyonu ve Harhaji ve ark. 2008 apoptotik hücre ölümü İnsan lens epitel hücrelerinde Sitotoksisite C60(OH)n in vitro uygulama ↑ PS (Apoptozis) Roberts ve ark. 2008 Badireddy ve ark. Bakteriyofaj uygulaması ↑ PS Bakteriyofaj inaktivasyonu 2007 Mastosit ve bazofillerin in vivo In vivo ve in vitro histamin Ryan ve ark. 2007 44 ve in vitro modellerdeki ↓ salınımının inhibisyonu anafilaksi uygulamaları Hücre döngüsünün Kanser hücrelerinin in vitro durdurulması, hücre Rancan ve ark. 2002, ↑ PS kültürü gelişiminin baskılanması Yang ve ark. 2002 Mitokonriyal Keratinosit ve hepatositlerin depolarizasyonun azalması, Huang ve ark. 1998, UV ya da TGF-β ile ↓ kaspaz aktivasyonu ve Fumelli ve ark. 2000, indüklenmiş apoptozisi apoptotik hücre ölümü Chirico ve ark. 2007 Suda çözünebilir Dugan ve ark. 1997, C60 türevleri Lotharius ve ark. İn vitro eksitotoksik ve ↓ Nöroproteksiyon 1999, Bisaglia ve ark. apoptotik nöronal ölüm 2000, Yaşlanmış sinir sistemi, Malonik asit radyasyon ile indüklenmiş Dugan ve ark. 1997, türevleri beyin hasarı, kortikal Lin ve ark. 2002, enfarktüs, ALS ve Parkinson Nöroproteksiyon, yaşam Dugan ve ark. 2001, ↓ hastalıklarının hayvan süresinin artması Daroczi ve ark. 2006, modelleri Quick ve ark. 2008 Sülfobütil C60 Farelerde fokal serebral iskemi ↓ Nöroproteksiyon Huang ve ark. 2001 45 Kanser hücrelerinin in vitro Kanserli hücrelerin ölümü Prolidinyum ↑ PS Mroz ve ark. 2007a kültürü (Apoptozis) türevleri Bakterilere in vitro uygulama ↑ PS Bakteriyel ölüm Tegos ve ark. 2005 Suda çözünebilir Kanser hücrelerinin in vitro Kanserli hücrelerin ölümü C60 -porfirin kültürü ↑ PS Alvarez ve ark. 2006 C60 türevleri (Apoptozis) Kanser hücrelerinin in vitro Şeker türevleri kültürü ↑ PS Kanserli hücrelerin ölümü Mikata ve ark. 2003 Keratinositlerin UV ile indüklenmiş ölümü ↓ Hücre ölümünün önlenmesi Xiao ve ark. 2006 In vitro kondrosit apoptozunun PVP/C In vitro kondrosit apoptozisi 60 ve in vivo kıkırdak yıkımının ↓ Yudoh ve ark. 2007 ve osteoartrit hayvan modeli azalması Tabata ve ark. 1997, Sürfaktan kaplama, PEG/C60 Kanserin in vivo uygulaması ↑ PS Tümör gerilemesi Liu ve ark. 2007, solvent değiştirme Fare karaciğer mikrozomlarına ↑ PS ya da sonikasyon Siklodekstrin/C60 yerleşme Lipit peroksidasyonu Kamat ve ark. 1998 ile hazırlanmış C 60 Toksin ile indüklenmiş ↓ Gharbi ve ark. 2005 nanopartikülleri Tween/C60 Karaciğerin korunması karaciğer hasarı 46 Sayes ve ark. 2004, Membran lipit peroksidasyonu, Sayes ve ark. 2005, Normal ve kanserli hücrelerin mitokondriyal depolarizasyon, Isakovic ve ark. 2006, Isakovic ve in vitro kültürü ↑ MAPK aktivasyonu, hücre THF/C60 ark. 2006, Markovic ölümü (Nekrozis) ve ark. 2007 Mitokondriyal depolarizasyon, Kanser hücrelerinin in vitro kaspaz aktivasyonu, ↑ Harhaji ve ark. 2008 TNF uygulaması Sürfaktan kaplama, apoptoz/nekroz solvent değiştirme Hücre döngüsünün Normal ve kanserli hücrelerin durdurulması, otofaji; normal ya da sonikasyon THF/C in vitro kültürü ↑ Harhaji ve ark. 2007 60 hücreler daha az etkilenir ile hazırlanmış C60 Balık ile in vivo uygulama ↑ Oksidatif beyin hasarı, ölüm Oberdorster, 2004 nanopartikülleri Sonifikasyon ile Kasermann ve hazırlanmış C Virüslerin in vitro uygulaması ↑ PS Virüs inaktivasyonu 60 Kempf, 1997 (PS: Fotosensitizasyon, TNF: Tümör nekrozu faktörü, TGF: Transforme edici büyüme faktörü, ALS: Amyotrofik Lateral Skleroz, MAPK: Mitojen aktif protein kinaz) 47 2.3. Radyasyon Radyasyon, yüksek hızda partiküllerin ve elektromanyetik dalgaların enerjisi olarak tanımlanıp, iyonize ve iyonize olmayan radyasyon olarak iki gruba ayrılmaktadır. İyonize radyasyonlar, bir atom ya da molekülden bir elektron kopararak iyonlaşmaya yol açarlar. Kütleli yapıya sahip partiküler radyasyon ve foton enerjili dalga karakterinde elektromanyetik radyasyon olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Alfa (α) ve beta (β) partikülleri, elektron, proton ve nötronlar partiküler iyonize edici radyasyon tiplerini oluşturur. X ve γ ışınları ise, iyonlaştırıcı yeteneğe sahip yüksek enerjili fotonlardan oluşan elektromanyetik radyasyonlardır. Bunlar özellikleri açısından büyük oranda birbirlerine benzerler ancak meydana geliş şekilleri farklıdır. X ışınları çekirdek dışında oluşan elektron kaynaklı ışınlardır. γ ışınları ise, radyoaktif bir çekirdeğin kararlı hale geçmesi esnasında parçalanarak açığa çıkan fazla enerjinin, çekirdekten dışarı atılması sonucunda oluşur (Özalpan 2001, Algüneş 2002). Buna bağlı olarak Şekil 2.22’de elektromanyetik spektrum gösterilmiştir. Şekil 2.22. Elektromanyetik spektrum 48 2.3.1. İyonize Edici Radyasyonun Biyolojik Sistemlere Etkileri İyonize edici radyasyonun bütün şekilleri hücrelerdeki etkilerini çarpıştıkları atom ve moleküllerde elektronların yerini değiştirerek gösterir ve böylece iyonizasyon meydana gelir. Hedeflenen atoma enerji transferi veya herhangi bir kaynaktan gelen ışınsal enerji saniyenin çok küçük bir kısmında oluşmasına rağmen, biyolojik etkiler dakikalar içinde değil, yıllar sonra bile ortaya çıkabilir. İyonize edici radyasyonun oluşturduğu hasarlar genellikle suyun radyolizisiyle oluşan serbest radikallerin indüksiyonuyla olabildiği gibi iyonize edici radyasyon DNA’yı doğrudan da zedeleyebilir. Serbest radikaller, hücre membranları ve nükleik asitlerle birleşerek mutasyonlara ya da hücre ölümünü indükleyen otokatalitik reaksiyonun başlamasına neden olurlar (Lipscomb ve ark. 1992, Kaya ve ark. 1996). İyonize edici radyasyonun canlıda oluşturduğu etkileri üç basamakta sıralamak mümkündür. İyonize edici radyasyon enerjisinin canlı dokuya transferi sonucunda, dokuyu oluşturan atom ve moleküllerde meydana gelen iyonlaşma ve uyarılma, radyasyon etkisinin ilk kademesi olan fiziksel kademeyi oluşturur. Bunu izleyen kimyasal kademede, hasar görmüş atom ve moleküller diğer hücresel yapılar ile reaksiyona girerek serbest radikallerin ortaya çıkmasına neden olurlar. Organizmada radyasyonun etkisi ile oluşan bu tür moleküler değişiklikler, son kademe olan biyolojik kademeyi başlatır. Bu kademede çeşitli hasarlara yol açan enzimatik reaksiyonlar meydana gelir (Özalpan 2001, Steel 1997). İyonize edici radyasyon, DNA, nükleus ve sitoplazmada değişim yaratır, kromatinlerde hasar oluşturur, mitozu etkiler ve hücreler arası iletişim bozukluğuna neden olur. İyonize radyasyona maruz kalan hücreler tarafından IL-1, IL-6, TNF-β ve PDGF (Platelet orijinli büyüme faktörü) gibi proinflamatuar ve profibrotik sitokinler salınır (Lipscomb ve ark. 1992, Özdemir ve Demiral 2001). İyonize edici radyasyonun biyolojik etkileri arasında; hücre siklusunu durdurulması, apoptozis, kromozomal kırılma, gen amplifikasyonu, delesyon ve mikroçevrede değişime yol açma gibi olaylar yer almaktadır (Bennet 1999). 49 İyonize edici radyasyonun neden olduğu moleküler değişiklikler; Şekil 2.23’te görüleceği üzere ya radyasyonun kendisi ile direkt olarak ya da yakın moleküllerle etkileşimlerin ve bunun sonucunda ortaya çıkan ikincil reaksiyonların bir sonucu olarak dolaylı yoldan gelişebilmektedir. Şekil 2.23. İyonize edici radyasyonun direkt ve indirekt etkisi Tüm moleküller iyonize edici radyasyondan zarar görebilmekte olup, etkileşimler son derece karmaşıktır. Bu etkileşimlerde DNA makromolekülleri en olası hedeflerdir. Radyasyon DNA molekülünün küçük bir bölümünü (örneğin bir tek geni) veya taşınan bilginin bir kısmını tahrip ederek ya da değiştirerek, bir veya pek çok yerinde, DNA’nın tek ya da iki zincirini kırabilir. Zarar; çok defa onarılabilmekle birlikte, bazı durumlarda, hücrenin ölümü veya şekil degiştirmesi tarzında izlenebilir (Taner 2009). Şekil 2.24’te radyasyonun canlıdaki etki kademeleri şematize edilmiştir. 50 Şekil 2.24. Radyasyonun canlıdaki etki kademeleri (Dertinger ve Jung 1970) 51 Radyasyon sonrası oluşabilecek üç tür hasar vardır (Kaya ve ark. 1996): 1) Letal Hasarlar: Onarılamayacak kadar büyük olup, hücreyi hemen ölüme götürür. Bu durum, hücrelerde fonksiyon kaybı ve bölünme yeteneği kaybı şeklinde ortaya çıkar. Bu tip hasarlar genellikle tek bir radyasyon dozunun etkisiyle DNA zincirlerindeki nükleotidlerin bozulması sonucunda gerçekleşir. 2) Subletal Hasarlar: 2. bir doz eklenmediği sürece, normal şartlar altında saatler içinde hücrenin tamir edebileceği hasarlardır. Bir sonraki bölünmede ya da olumsuz ortam koşullarının devamı halinde gelişebilir ve uygun koşullarda onarılması mümkündür. Bu durumda hücrenin kendini tamir yeteneğine bağlı olarak hasar giderilebilir. Bu daha çok kanserli olmayan hücreler için geçerlidir. Kanserli hücrelerin önemli bir kısmı bu yeteneğe sahip değildir. Bunun sonucunda biriken subletal hasarlar hücrenin ölümüne yol açar. Oluşan bir kısım hasar ise, hücrenin bulunduğu fiziksel veya kimyasal koşullara bağlı olarak, ölüme yol açabilir ya da tamir olayını başlatabilir. 3) Potansiyel Letal Hasarlar: Bunlar ışınlanmadan sonra hücrenin bulunduğu ortam koşuluna göre değişkenlik gösteren hasarlardır. Normal koşullarda hasar ölümcüldür fakat çevresel etkilerin manipülasyonu ile birlikte hasar tamir edilebilir. 2.3.1.1. Suyun Radyolizisi İnsan vücudunun % 70 – 80'i sudan oluşmaktadır. Canlı hücre ya da doku ışınlandığında radyasyon enerjisinin büyük oranda su molekülleri tarafından soğurulma olasılığı çok yüksektir. Bu durumda su molekülleri iyonlaşırlar ve pozitif yüklü su molekülü ile hızlı bir serbest elektron oluşur. 52 H O R a d y a s y o n H O+ –2 2 + e Bu serbest elektron, su içinde bir başka su molekülü tarafından yakalanıncaya kadar yol alır ve bu su molekülü ile birleşerek onu negatif bir su molekülü haline getirir. e- + H –2O  H2O Bu reaksiyonlar sonunda oluşan H + 2O ve H O – 2 kararlı değildir ve her biri parçalanarak bir iyon ve bir serbest radikal oluşturur. H2O + H+ + OH● H O–2 H ●  + OH– Oluşan serbest radikaller çiftleşmemiş elektronları içerirler ve çok etkindirler. Hücre içerisinde birçok reaksiyona neden olabilirler. Örneğin iki OH● birleşerek H2O2 oluşturur. Benzer reaksiyonlar, hücrenin diğer bileşenleriyle de oluşabilir. Bu tür reaksiyonlar; dokularda uyanlmış iyonlar, uyarılmış moleküller ve diger tür serbest radikallerin oluşmasına neden olur (Yıldırım 1985). Şekil 2.25’te suyun radyolizisi şematize edilerek gösterilmiştir. 2.3.1.2. İyonize Edici Radyasyonun RNA Molekülüne Etkileri RNA molekülleri, DNA molekülünde taşınan genetik bilgilerin protein sistemine aktarılmasını ve protein sentezinin bu bilgilere uygun şekilde gerçekleşmesini sağlarlar. Radyasyonun etkisi ile bu moleküllerin fonksiyonlarında bazı değişikliklerin meydana geldiği saptanmıştır. Radyasyonun RNA sentezine etkileri ile ilgili çalışmaların sayısı DNA’ya oranla daha azdır ve bunların hemen hepsinde total RNA sentezine olan etkileri incelenmiştir. Bu sebeple farklı RNA tiplerinin ayrı ayrı incelenmesi ve karşılaştırılması bakımından yeterli değildir. Bu çalışmalarda elde edilen sonuçlar, genel olarak total RNA sentezinin DNA sentezine oranla daha dirençli olduğunu göstermektedir (Özalpan 2001). 53 Şekil 2.25. Suyun radyolizisi (H2O*: uyarılmış su molekülü, ●e –aq : akuatik elektron) 2.3.1.3. İyonize Edici Radyasyonun Kromozomlara Etkisi Kromozomların radyasyon etkisine karşı çok duyarlı oldukları ve 0,1 Gy den daha düşük dozlarda bile bitki, hayvan ve insan kromozomlarında kırılmaların olduğu saptanmıştır. İyonize edici radyasyonların kromozomlara etkileri ışınlamadan sonraki ilk bölünmenin metafaz veya anafaz evrelerinde izlenebilir. Bu evreler kromozom yapılarının belirgin olduğu evrelerdir (Sparrow ve Moses 1952). Eğer bir hücreye radyasyon uygulanırsa, kromozomlarda kırılmalar oluşur. Kromozomların kırılan uçları yapışkan özellik taşırlar ve diğer bir kırık uca yapışabilirler. Kırılan parçaların yeniden yapışma olasılıkları, oksijen ve ATP varlığında 54 artar. Kromozom kırılmaları ve bundan sonra meydana gelen yapışma olayları çeşitli şekilerde gerçekleşebilir. Bunları aşağıdaki şekilde sıralamak mümkündür: 1) Kırılan parça eski yerine yapışabilir. Bu durumda, sonraki mitozda herhangi bir değişiklik olmaz. 2) Kırılan parça yapışmaz ve bu durum sonraki mitozda delesyon olarak adlandırılan bir aberasyon şeklinde saptanır. 3) Kırılan parça bir diğer kırık uca yapışabilir. Bu durumda, sonraki mitozda ileri derecede kromozom aberasyonları gözlenir. Metafaz ve anafazda izlenen aberasyonları iki gruba ayırmak mümkündür. Bunlar kromozom tip ve kromatit tip aberasyonlar olarak adlandırılır (Ahluwalia 2009). Kromozom tip aberasyonlar S fazından önce radyasyona maruz kalınması sonucu oluşur. Eğer replikasyondan önce hasar tamir edilmezse, kardeş kromatitlerin her ikisi de hasarlı olur. G1 fazında yapılan ışınlamalar sonucu en fazla gözlenen kromozom tipi aberasyonlar: terminal delesyonlar, simetrik parça değişimleri ve asimetrik parça değişimleridir. Kromatit tip aberasyonlar S fazından sonra radyasyona maruz kalınması sonucu oluşur. Eğer hücreler S fazı esnasında radyasyona maruz kalırlarsa her iki tip aberasyon gözlenir. G2 fazında yapılan ışınlamalar sonucu en fazla gözlenen kromatit tip aberasyonlar; terminal delesyon, izoromatit delesyon, simetrik parça değişikliği, asimetrik parça değişikliği ve triradial aberasyondur. Eğer hücreler profaz safhasında radyasyona maruz kalırlarsa kromatidlerin alt ünitelerinde subkromatid aberasyonlar gözlenir (Tubiana ve ark. 1990, Özalpan 2001). Yapısal kromozom değişiklikleri proto-onkogenlerin aktivasyonuna ve tümör supressor genlerin eliminasyonuna neden olur ve bunların sonucunda tümörogenez olayı başlatılır. Bu yüzden oluşan kromozom aberasyonlarını inceleyerek kanserler hakında öngörülerde bulunabiliriz (Heim ve Meltman 1996). Radyasyona maruz kalma sonucu oluşan özel bir kromozom aberasyon tipi de mikronükleus oluşumudur. Bu aberasyon bir asentrik fragment veya tam bir 55 kromozomun mitoz esnasında kutuplara çekilmeyip nükleus dışında kalması sonucu oluşur. Mikronükleus oluşumunun analizi, radyasyon hasarları ile ilgili basit duyarlı bir test yöntemidir. Ancak bu durum diploit hücreler için geçerlidir. Mikronükleus analizi için, ışınlanmış hücrelerde sitokalasin-B uygulanarak sitoplazma bölünmesi engellenir ve bu yolla iki yavru nükleusun birlikte bulunduğu binükleuslu hücreler ve bu hücrelerin sitoplazmaları içinde yer alan mikronükleuslar değerlendirilir (Prosser ve ark. 1988, Vrhovac-Garaj 1999). Radyasyonun neden olduğu gen ve kromozom mutasyonlarına bağlı olarak gözlenen hastalıklardan bazıları Çizelge 2.6’da verilmiştir. Çizelge 2.6. Radyasyonun genetik etkileri (Coggle 1977) GENETİK ETKİ NEDEN OLDUĞU HASTALIK GEN MUTASYONLARI Dominant gen mutasyonları Polidaktili, Retinoblastoma, Huntington hastalığı Resesif gen mutasyonları Orak hücre anemisi, Kistik fibroz, Tay-Sachs Eşey kromozomuna bağlı gen Renk körlüğü, Hemofili mutasyonları KROMOZOM MUTASYONLARI Sayısal değişiklikler Down sendromu, embriyonik ölüm Yapısal değişiklikler Embriyonik ölüm, fiziksel bozukluklar, zeka geriliği 2.3.1.4. İyonize Edici Radyasyonun DNA Molekülüne Etkileri İyonize edici radyasyonun DNA molekülünün yapı, fonksiyon ve sentezine olan etkileri ile ilgili çok sayıda araştırma yapılmıştır. Bu araştırmalar genel olarak radyasyonun DNA’ya etkisinin doza, zamana ve hücrenin siklustaki durumuna bağlı olduğunu göstermektedir. İyonize edici radyasyonun DNA molekülünde oluşturduğu hasarların en önemlileri zincir kırılmaları (Olive 1998), baz hasarları, baz kayıpları, denatürasyon bölgelerinin oluşması ve DNA çapraz bağlanmalarıdır (McMillan ve 56 Steel 1997). Zincir kırılmalarının DNA molekülünde ortaya çıkan en önemli hasar grubunu oluşturduğu kabul edilmektedir. Bu hasarlar, Şekil 2.26’da görüleceği üzere tek zincir kırılmaları ve çift zincir kırılmaları şeklinde 2 gruba ayrılır. Tek zincir kırılmaları, DNA molekülünün çift zincirlerinden bir tanesinde, şeker – fosfat iskeletinde meydana gelen bir kopma şeklinde oluşurlar. Bu tür kırılmalar, düşük iyonizasyon yoğunluklu radyasyonlar tarafından meydana getirilen en yaygın hasarlardır. Çoğunlukla OH● radikallerinin etkisi sonucu oluşurlar. Çift zincir kırılmaları ise, her iki zincirdeki şeker – fosfat iskeletinde meydana gelen kopmalar ile ya da iki tek zincir kırılmasının birbirine çok yakın ve karşılıklı bölgelerde oluşması sonucunda ortaya çıkarlar. Bu tip zincir kırılmalarının oluşması için yüksek iyonizasyon yoğunluğuna sahip radyasyonlar gerekmektedir (Friedberg 1995). Şekil 2.26. Tek ve çift zincirde DNA kırılmaları DNA molekülünün, iyonize edici radyasyon için ilk hedef olduğu düşünülmektedir ve hücre ölümlerinin ana nedenlerinin başında yanlış onarılan ya da onarılamayan DNA hasarları yer alır. İyonize edici radyasyon, diploid bir hücrede Gy başına yaklaşık 1000 tane tek zincir kırığı (TZK) ve 40 tane çift zincir kırığı (ÇZK) oluşturur (Olive 1998). DNA çift zincir kırıkları, DNA hasarları içerisindeki en sitotoksik hasarlar olarak kabul edilir. İyonize edici radyasyon tarafından indüklenip, tamir edilmeden kalırlarsa hücre ölümüne neden olabilirler. Ayrıca yanlış onarılmış bir DNA çift zincir kırığı genomik kararsızlığa ve kromozomal translokasyonlara neden olabilir (Mehaney ve ark. 2009). 57 İyonize edici radyasyon dışında, iyonize olmayan UV radyasyonun etkisi ile DNA molekülünde ortaya çıkabilecek diğer yapısal değişiklikler, baz hasarları ve baz kayıplarıdır. Bu hasarlar açısından pirimidinler pürinlere karşı 2 kat daha fazla hassastırlar. En hassas baz ise Timin’dir. Baz hasarları ve baz kayıpları genellikle şeker yapısında kimyasal değişikliklere yol açar. Bu değişiklikler N-glikozit bağının hidrolizi sonucu meydana gelirken, şeker molekülündeki hasarlar genellikle nükleotit zincirinde kırılmalarının oluşmasına sebep olur. Bazların radyosensitivitelerinin artan şekilde sıralanışı şöyledir (McMillan ve Steel 1997): Timin > Sitozin > Adenin > Guanin. UV radyasyon etkisiyle, tek zincir kırığı olan iki komşu baz, bir kovalent bağ ile bağlanıp aralarında dimer olarak adlandırılan bir siklobütan halka yapısı oluşturabilir ve bu dimerler DNA replikasyonunu engelleyebilirler. En stabil dimerler Timin dimerleridir. Bu dimerler, radyasyona maruz kalan bölgelerde cilt kanserlerinin indüksiyonunda rol oynarlar. Radyasyonun bir başka etkisi de pirimidin bazlarının hidrasyonudur. Pirimidin hidratları genetik kodun değişiminde rol oynarlar. Bu hidratlara bir örnek, sitozin bazının beş ve altıncı bağlarının açılması ve araya su molekülünün eklenmesi ile oluşan sitozin hidrat molekülüdür (Tubiana ve ark. 1990). UV radyasyonun neden olduğu baz değişiklikleri Şekil 2.27’de görülmektedir. İyonize radyasyonun diğer etkileri; DNA molekülünün fonksiyon kaybı, inhibisyonu ve transformasyon yeteneğinin azalmasıdır. Eğer bu tür etkiler onarılmazsa hücrenin ölümüne yol açarlar (Dertinger ve Jung 1970). Radyasyonun DNA sentezine etkisinin genel olarak inhibe edici nitelikte olduğunu söylemek mümkündür. Radyasyonun DNA sentezine etkileri ile ilgili olarak aşağıda sıralanan genellemeleri yapmak mümkündür: 1) Hızlı ve yavaş bölünen hücrelerde DNA sentezinin başlamasına karşı farklı duyarlıklıktadır. 2) S fazında yapılann ışınlamalar DNA sentezini inhibe etmektedir. 58 3) G1 fazında yapılan ışınlamalar DNA sentezini bazı hücrelerde inhibe eder, bazı hücrelerde etkilemez. 4) DNA sentezi G1 fazındaki ışınlamalardan etkileniyor ise, bu etkiyi S fazına göre daha düşük dozlarda elde etmek mümkündür. Şekil 2.27. UV radyasyonun neden olduğu baz değişikleri İyonize radyasyonun DNA sentezinde oluşturduğu diğer bir etki de, düzensiz DNA sentezidir. Bu olay, hücre siklusunun G1 ve G2 fazlarında da DNA sentezi yapılması durumudur. Bu sentez S fazındaki senteze göre daha yavaştır ve hasar görmüş hücrelerdeki hasarın onarımı için yapılır (Özalpan 2001). 2.3.1.5. DNA Hasarı Onarım Mekanizmaları UV radyasyon neticesinde DNA’da oluşan primidin dimerleri; bakterilerde, mantarlarda, bitkilerde ve plasentalı memeliler hariç çoğu omurgalı canlıda fotoreaktivasyon olayı ile düzeltilmektedir (Friedberg 2003). DNA zincirlerinde fosfodiester bağlarının kopmasına bağlı olarak oluşan basit zincir kırıkları ise DNA ligaz enzimi tarafından hemen onarılmaktadır (Klug ve Cummings 2002, Cooper ve 59 Hausman 2006). Alkilleyici ajanların neden olduğu O6-metilguanin yapısı O6- metilguanin DNA metil transferaz enzimi tarafından normal guanine döndürülür (Onur ve ark. 2009). Tüm prokaryot ve ökaryot organizmalarda bulunan en önemli onarım mekanizması ise eksizyon (kesip – çıkarma) onarımıdır. Eksizyon onarım mekanizmasında DNA’daki hasarlı bazın ya da oligonükleotid parçaların çıkartılıp bu bölgenin doğru bazlarla doldurulması ve oluşan çentiğin ligasyonla kapatılması ana prensiptir. DNA zincirlerinde meydana gelen lezyonlar baz eksizyon ve nükleotid eksizyon tamir mekanizmaları ile onarılmaktadır (Kulaksız ve Sancar 2007). Prokaryot ve ökaryotlarda, DNA replikasyonu esnasında normal bazların yanlış eşleşmeleri ile oluşan hata, hatalı eşleşme eksizyon tamiri ile düzeltilmektedir (Debeleç ve Kantarcı 2006). DNA’da oluşan çift zincir kırıkları (ÇZK) ise homolog rekombinasyon (HR) veya homolog olmayan uçların birleştirilmesi (HOUB) mekanizması ile tamir edilmektedir. HOUB mekanizması homolog rekombinasyondan farklı olarak, onarıma kılavuzluk yapmak için uzun homolog bir diziye gerek duymaz. Çift zincir kırıklarının tamiri için HR’nin mi yoksa HOUB mekanizmasının mı kullanılacağı hücre döngüsünün evresine bağlıdır. Hücre döngüsünün, kardeş kromatitlere kolayca erişilebildiği, S ve G2 evrelerinde HR etkindir. HOUB mekanizması homolog bir diziye gerek duymadığı için hata eğilimli bir mekanizmadır (Shrivastav ve ark. 2008). Hata eğilimli bir diğer mekanizma ise SOS tamir mekanizmasıdır. Bu mekanizma, yüksek oranda DNA hasarının olduğu ve diğer tamir mekanizmalarının başarılı olamadığı durumlarda devreye giren acil cevap sistemidir. DNA sentezi sırasında, DNA polimerazın lezyona rağmen replikasyonu devam ettirmesi sağlanır fakat replikasyonun doğruluğundan fedakarlık edilir (Klug ve Cummings 2002, Cooper ve Hausman 2006). 60 2.4. Toksisitenin Değerlendirilmesinde Kullanılan Bazı Test Yöntemleri 2.4.1. Klonojenik Test Klonojenik test, bir hücrenin geniş bir koloni ya da klon oluşturacak şekilde üreme kabiliyetini korumasına ve süresiz olarak prolifere olabilmesine dayanmaktadır. Bu şekilde üreyen hücrelere klonojenik hücreler denilmektedir. Diğer taraftan, DNA ve protein sentezleme özelliğini koruyan, 1 – 2 mitoz geçiren fakat yeterli düzeyde prolifere olup koloni oluşturamayan hücreler ölü olarak nitelendirilmektedir. Bu nedenle koloni sayımı yapılırken en az 50 hücre içeren koloniler sayılmaktadır. Eğer bir petriye 50 hücre ekiliyorsa bu petride oluşacak koloni sayısının 0 – 50 arasında değişiklik göstermesi beklenir. Hücreler herhangi bir ajanla muamele edilmediği taktirde ideal olarak beklenen koloni sayısı 50’dir. Fakat büyüme ortamının optimal olarak hazırlanamaması ve hatalı hücre sayımı gibi bazı nedenlerden dolayı çoğu zaman bu ideal sayıya ulaşılamaz. Kaplama Etkinliği (KE) ya da Plating Efficiency (PE) terimi ise petriye ekilen hücrelerden prolifere olarak koloni oluşturanların %’sini ifade etmektedir. Örneğin; 50 hücre ekilen bir petride sonuç olarak 25 koloni sayılıyorsa PE: %50 olarak hesaplanır. Hücre sağkalım fraksiyonu (SF), belirli bir konsantrasyonda uygulanan ajan ile buna bağlı olarak üreme yeteneğini koruyabilen ve koloni oluşturan hücre sayısı arasındaki ilişki olarak tanımlanmaktadır. İlk zamanlarda, klonojenik test radyasyonun hücreler üzerindeki etkisinin değerlendirilmesinde kullanılırken şu an daha çok klinik uygulamalardaki çeşitli ajanların sitotoksik etkilerinin incelenmesinde kullanılmaktadır. Bunların arasında çeşitli kemoterapi ajanları ve bunların radyasyon ile kombine uygulamaları yer almaktadır. (Munshi ve ark. 2005). 61 2.4.2. Mikronükleus Testi Mikronükleus (MN)’lar hücrenin mitoz bölünmesi sırasında ortaya çıkan, esas çekirdeğe dahil olmayan, tam kromozom veya asentrik kromozom fragmanlarından köken alan oluşumlar olarak tanımlanmaktadır. Bu oluşumlar genellikle hücre siklusunu kontrol eden genlerdeki eksikliklerden, mitotik iğdeki hatalardan, kinetokordan veya mitotik aygıtın diğer parçalarından ve kromozomal hasarlardan kaynaklanmaktadır. MN sayısındaki artış, çeşitli ajanların hücrelerde oluşturduğu sayısal ve yapısal kromozom düzensizliklerinin indirekt göstergesi olarak değerlendirilmektedir. Anöploidiyi uyaran ajanlar, sentromer bölünme hatalarına ve iğ iplikçiklerinde fonksiyon bozukluklarına yol açarak; klastojenler ise kromozom kırıkları oluşturarak MN oluşumuna yol açmaktadırlar. Bu nedenle hücrelerde MN sayısında artış saptanması somatik hücrelerdeki genomik kararsızlığın bir göstergesi olarak kabul edilmektedir (Vanparys ve ark. 1990, Kirsch-Volders ve ark. 1997, Stopper ve Müler 1997, Choy 2001, Demirel ve Zamani 2002). MN testi, değerlendirmesi oldukça kolay, ekstra kültür işlemi basamağı olmadan da uygulanabilen ve farklı hücre tiplerinde kullanılabilen bir testtir. MN testi, klastojenik etkili bileşikler tarafından oluşturulan kromozomal hasarların değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılan standart genotoksisite test sistemi içerisinde yer alır ve in vivo ve in vitro olarak uygulanabilir. MN’ler hücre döngüsü boyunca meydana gelen hasar nerede olursa olsun hücre bölünmesi süresince oluşur. Aksine, kromozomal aberasyonlar, hücre döngüsü aşamalarının herhangi birinde meydana gelebilir (Yırtıcı 2007). Ayrıca, sitogenetik harabiyetin tespitinde, kromozom analizine göre kolay uygulanabilmesi, daha fazla sayıda hücre sayılması ve istatistiksel yönden daha anlamlı sonuçlar elde edilmesi gibi avantajları sayesinde yaygın kullanım alanı bulan bir tekniktir (Schmid 1975, Vanparys ve ark. 1990, Garewal ve ark. 1993, Cheng ve ark. 1996, Duffaud ve ark. 1997, Kirsch-Volders ve ark. 1997, Stopper ve Müler 1997, Fenech 2000, Krishna ve Hayashi 2000, Widel ve ark. 2001, Demirel ve Zamani 2002). MN testi 1950’lerde bitki hücrelerinde kromozom hasarının ölçülmesinde, 1970’lerde hayvan hücrelerinde ve daha sonra kültüre edilmiş insan lenfositlerinde kimyasal 62 karsinojenleri belirlemeye yönelik bir test olarak kullanılmaya başlanmıştır (Schmid 1975, Widel ve ark. 2001, Demirel ve Zamani 2002). Birçok araştırmacı MN testi için çeşitli teknikler kullanmıştır. Bunların başında lenfosit hücre kültürleri ve direkt kemik iliği veya periferal kan hücrelerinin analizi gelmektedir. Bazı araştırmacılar geliştirdikleri modifiye metotlarla anöploidiye yol açan ajanlar ile klastojenleri birbirinden ayırmada MN büyüklük farkından yararlanmışlardır. Klastojenlerce uyarılan hücrelerde asentrik kromozomal fragmentler içeren küçük ebatlı MN’ler oluşmasına rağmen, anojenlerce uyarılan hücrelerde tam kromozom içeren daha büyük ebatlı MN’ler ortaya çıkmaktadır (Şekil 2.28) (Von Ledebur ve Schmid 1973, Heddle ve Countryman 1976, Högstedt ve Karlsson 1985). Eastmond ve Tucker aynı amaçla antikinetokor antikorları kullanarak kinetokor pozitif MN’lerin tam bir kromozom, kinetokor negatif MN’lerin ise asentrik kromozom fragmenti içerdiğini ve bu yöntemin anöploidi uyaran ajanları klastojenlerden ayırmada daha kesin bir yol olduğunu vurgulamışlardır (Eastmond ve Tucker 1989). Şekil 2.28. Klastojenler ve anojenler tarafından uyarılan hücrelerdeki MN’ler Daha sonra Fenech ve Morley tarafından, küf mantarlarının metabolitlerinden olan Sitokalasin-B (Cyt-B) ile mitoz geçiren hücrelerde sitokinezi durdurma esasına dayanan ve bir hücre siklusunu tamamlayan hücrelerin binüklear görünümleriyle ayırt edilmesine olanak sağlayan modifiye bir teknik geliştirilmiştir (Fenech ve Morley 1986). 63 Cyt-B, bölünen hücrenin ikiye ayrılmasını uyaran mikroflamentleri oluşturacak olan aktin molekülüne bağlanarak aktin polimerizasyonunu inhibe etmektedir. Bu inhibisyondan dolayı aktine bağlı tüm hareketler engellenmekte ve sitokinez inhibe olmaktadır (Şekil 2.29). Sitokinezi bloklama metodu ile bazı kinetik problemler ortadan kalkmış ve in vitro MN tekniğinin uygulanmasındaki güvenilirlik artmıştır (Fenech 2000, Aardema ve Kirsch-Volders 2001, Choy 2001, Demirel ve Zamani 2002). Standart lenfosit kültürlerine uygun konsantrasyonda Cyt-B eklenmesiyle, çekirdek bölünmesini tamamlamış ancak sitoplazmik bölünmesini gerçekleştirememiş çift çekirdekli hücrelerde, MN bulunduran hücrelerin oranı tespit edilmektedir (Fenech ve Morley 1986, Demirel ve Zamani 2002). Şekil 2.29. Sitokinezin bloklanması yöntemiyle MN içeren binükleat hücrenin oluşumu Sitokinezi bloklanmış hücrelerde, binükleat hücrelerde ve MN sayımında şu kriterler kullanılmaktadır (Heddle 1976, Titenko-Holland ve ark. 1997, Fenech 2000): 1) Hücreler çift nükleusa sahip olmalıdır ve belirgin sitoplazmasıyla yuvarlak veya oval görünümlü olmalıdır. 2) Nükleuslar belirgin nükleus zarıyla çevrili yuvarlak veya oval olmalıdır. 3) MN çapı ana nükleusun 1/3’ü kadar veya daha küçük olmalıdır. 4) MN’ler yuvarlak ve oval şekillerde olmalıdır. 64 5) MN’ler ana nükleustan açık bir şekilde ayrılmış olmalıdır veya mikronüklear sınırlar nüklear sınırlardan ayırt edilebilir olmalıdır. 6) Boya alma yoğunluğu ana nükleus ile aynı olmalıdır. 7) Sadece sitokinezi bloke edilmiş çift çekirdekli hücrelerdeki MN’lerin sayılması esas alınmalıdır. Bu modifiye yöntem ile hücrelerin sadece MN içerip içermediği saptanmakta ve bu sayım işlemi kromozom anormallikleri testine göre daha hızlı gerçekleşmektedir. Bütün halde kromozom şeklinde MN oluşumuna neden olan ve kromozomal anormallik testleriyle çalışılması güç olan anöploidiyi indükleyici ajanlar da bu testle kolaylıkla saptanabilmektedir (Aardema ve Kirsch-Volders 2001, Lorge ve ark. 2007). Ayrıca kimyasal bir madde uygulanmış hücrelerden oluşan yavru hücrelerdeki MN’lerin incelenmesi, en az bir hücre bölünmesi yoluyla yavru hücrelere geçen genetik hasarı ifade etmektedir. Yani iki çekirdekli hücrelerdeki MN’lerin sayılması ile hücrenin bir kez bölünmüş olduğu ispatlanmış olur. Sitokinezi bloklanmış hücrelerde MN yöntemi kullanılarak kromozom kırıkları, kromozom kaybı, disentrik kromozom oluşumu gibi yeniden düzenlenmeler ile gen amplifikasyonu ve apoptosis gibi olayların frekansı da değerlendirilebilir. MN içeriğindeki kromozomal fragmentler, direkt DNA kırıklarından veya DNA sentez hatalarından kaynaklanabilir. Onarılmamış kromozom kırıkları, bir disentrik kromozom ve bir asentrik fragment oluşumu ile yeniden düzenlenmelere öncüllük edebilir. Genellikle disentrik kromozomların sentromerleri anafazda nükleuslar arasında nükleoplazmik köprü oluşturur ve asentrik fragment MN’yi oluşturur (Şekil 2.30). Asentrik fragmentlerin ve kromatid veya kromozom kırıklarının ya da tam bir kromozomun anafazda geri kalması sonucu oluşan MN’ler, telofazdaki nükleusların dışında kalan küçük nükleuslar olarak görülmektedir (Surralles ve ark. 1995, Aardema ve Kirsch-Volders 2001). 65 Şekil 2.30. Sitokinezi bloklanmış MN yöntemi ile bazı sitogenetik anormalliklerin tayin edilmesi 2.4.3. γ-H2AX Fokus Testi H2AX histonu, H2A histon ailesinin spesifik bir varyantı olup ilk kez 1980 yılında West ve Banner tarafından tanımlanmıştır. Banner ve Pantazis, 1981 yılında H2AX histonunun asetile ve fosforile olabileceğini ortaya koymuştur. Daha sonraki yıllarda ise H2AX histonunun birtakım proteinler tarafından asetillenme ve poliubikitinasyon olayları sonucu kromatin yapısından çıkarılabildiği anlaşılmıştır. H2AX histonunu H2A ailesinin diğer üyelerinden ayıran özelliği ise evrimsel süreçte korunmuş –KKATQASQEY karboksi terminal motifine sahip olmasıdır. Karboksi terminalin 139. pozisyondaki Serin aminoasidi (Ser139), çift zincirli DNA kırığı (ÇZK) oluşan bölgelerde hızlı bir şekilde fosforilasyona uğramaktadır. H2AX histon fosforilasyonu olarak bilinen bu olay, Fosfatidilinositol-3 kinaz benzeri kinaz (PIKK) ailesi üyeleri; Ataksi Telanjiektazi Mutantı (ATM) kinaz, Ataksi Telanjiektazi Mutantı ve Rad3 ilişkili (ATR) kinaz ve DNA’ya bağımlı protein kinaz tarafından gerçekleştirilmektedir. H2AX histonunun fosforilasyonu, kromatinde ÇZK oluşan bölgenin her iki ucundan başlayarak megabaz çifti uzunluğundaki geniş mesafelere kadar yayılmaktadır (Löbrich ve ark. 2010). 66 İyonize radyasyonun (İR) veya radyomimetik ajanların etkisiyle meydana gelen ÇZK, hücrede DNA tamiri sürecini başlatan bir dizi olayı tetiklemektedir. Bu süreçte ilk olarak, MRN kompleksi ÇZK olan bölgeyi tanıyarak DNA uçlarına bağlanmaktadır. Aynı zamanda ATM kinazın bu bölgede toplanmasını sağlayarak ATM kinaz ile etkileşmekte ve onu aktive etmektedir. Aktive olan ATM kinaz ise H2AX histonunu ve DNA tamirinde rol oynayan bazı proteinleri fosforile etmektedir. H2AX histonu, fosforilasyon neticesinde γ-H2AX histon molekülüne dönüşmektedir. Daha sonra DNA hasarı kontrol noktası proteini 1’in mediyatörü (MDC1), γ-H2AX molekülünün oluşturduğu sinyali algılayarak γ-H2AX’e bağlanmaktadır. Bir protein kinaz olan CK2, MDC1 proteinini fosforilleyerek daha fazla MRN – ATM kompleksinin fosforile bölgede toplanmasını ve bu bölgeye bağlanmasını sağlamaktadır. Hasarlı bölgeye yeni gelen ATM kinazlar ise hemen yanındaki H2AX histonunu fosforillemektedir. Aynı şekilde tekrarlanan döngü ile hasarlı bölgenin her iki tarafında megabaz büyüklüğünde γ-H2AX domainleri oluşmaktadır. Dolayısıyla, MDC1 – γ-H2AX etkileşimi, DNA tamir proteinlerinin hasarlı bölgede toplanması ve tutulması için bir platform teşkil etmektedir (Şekil 2.31) (Van Attikum ve Gasser 2009). Şekil 2.31. Memelilerde H2AX histonunun fosforilasyonu ve γ-H2AX’in fonksiyonu (Van Attikum ve Gasser 2009) DNA tamir proteinlerinin DNA’ya daha kolay ulaşabilmesi amacıyla Histon Asetil Transferazlar (HAT) tarafından kırılma bölgesinde histon değişimi gerçekleşmekte ve γ-H2AX’in yerine H2AZ histonu getirilmektedir. Kırılma bölgesinden megabaz 67 uzaklıktaki bölgelere kadar PP2A ve PP4C fosfatazları tarafından γ-H2AX’in defosforilasyonu gerçekleşmektedir (Altaf ve ark. 2009). ÇZK tamiri sürecinde; kırılma bölgelerinde, mayotik rekombinasyonda, sınıf değiştirme rekombinasyonunda, V(D)J rekombinasyonunda, apoptotik sindirimde ve uç bölgeleri kapatılmamış telomerlerde H2AX fosforilasyonu görülmektedir. Ayrıca replikasyon çatalının tamir edilmemiş tek zincirli DNA kırığı ile karşılaşarak çökmesi ve neticede basit bir ÇZK oluşması durumunda da H2AX fosforilasyonu gözlenmektedir (Ismail ve Hendzel 2008). γ-H2AX fokus testinde H2AX histonunun fosforilasyonu ile oluşan γ-H2AX molekülleri, immunofloresan boyama yöntemi kullanılarak hazırlanan preperatlarda, floresan mikroskop altında γ-H2AX fokusları olarak görülebilmektedir. Her bir ÇZK için yaklaşık 2000 γ-H2AX molekülü oluşmakta ve bu moleküllerin immonufloresan olarak işaretlenmesiyle bir γ-H2AX fokusu ortaya çıkmaktadır. Dolayısıyla her γ-H2AX fokusu bir ÇZK’ya karşılık gelmektedir. Bir ÇZK için binlerce γ-H2AX molekülünün oluşması bu testin ÇZK’nın belirlenmesindeki duyarlılığını ortaya koymaktadır. Ayrıca ÇZK’nın tamir edilmesi ile o bölgedeki γ-H2AX fokusun ortadan kalkması arasında çok yakın bir ilişki olduğu bilinmektedir. Bu noktadaki bir sınırlama ise düşük sitotoksik dozların kullanımını esas almaktadır. Genomda, 100 – 150 civarı ÇZK oluşturan düşük sitotoksik dozlar (Örn: 1 Gy İR) kullanıldığında oluşan fokus sayısı ile ÇZK arasındaki oran çok daha anlamlıdır. γ-H2AX fokusları DNA tamir proteinlerine göre çok daha duyarlı bir ÇZK belirtecidir. Çünkü DNA tamir proteinleri hücre içinde sürekli bulunurken γ-H2AX fokusları ÇZK oluşan bölgelerde hızlı bir şekilde oluşmakta ve ÇZK tamirine bağlı olarak aynı oranda ortadan kalkmaktadır. (Ismail ve Hendzel 2008). G1 ve G2 fazlarında iyonize radyasyona (İR) maruz kalan hücrelerde ATM kinaza veya DNA-PK’a bağlı H2AX fosforilasyonu gerçekleşmekte ve oluşan γ-H2AX fokusları nüklear bölgede belirgin bir şekilde görülebilmektedir. Eğer hasar çok fazla ise fokuslar nüklear bölgenin etrafında hale şeklinde yayılma gösterebilmektedir. Maruz kalınan İR dozuna bağlı olarak fokus büyüklüğü ve yoğunluğu da artmaktadır. G1 ve G2 fazlarında oluşan fokusların her biri İR ile indüklenmiş DNA hasarını yani ÇZK’yı belirtmektedir. 68 Bununla birlikte, S fazında, replikasyon çatalı, tamir edilmemiş tek zincirli DNA kırığı (TZK) ile karşılaşarak çökebilmekte ve bu esnada basit ve tek uçlu bir ÇZK oluşabilmektedir. Bu durumda, yine ATM kinaza bağlı olarak ÇZK bölgesinde γ-H2AX fosforilasyonu gerçekleşmektedir. Dolayısıyla S fazında İR’ye maruz kalan hücrelerde an itibariyle oluşan γ-H2AX fokuslarından bazıları İR ile indüklenmiş ÇZK’ları yansıtmayabilmektedir. Replikasyon çatalının çökmesine bağlı olarak oluşan bu tek uçlu ÇZK’lar çok kısa bir süre içerisinde HR ile tamir edilebilmektedir. Bu sebeple yapılan incelemelerde bu ÇZK’ların tamiri için ATR’ye bağımlı ATM aktivasyonunun gerektiği ileri sürülmüştür. İR’den 15 dakika sonra yapılan incelemelerde ise ÇZK’ların tamir sürecinde ATR’den bağımsız ATM aktivasyonunun etkin olduğu anlaşılmıştır. Yani İR’den 15 dk sonra S fazında gözlenen fokusların büyük bir çoğunluğu direkt olarak İR’nin oluşturduğu ÇZK’ları belirtmektedir. S fazında oluşan γ-H2AX molekülleri, G1 ve G2 fazlarındaki gibi belirgin ve ayrık fokuslar oluşturmamaktadır. Bunun yerine yeşil çayır görünümünü andıran nükleus çapında bir boyanma ile karakterize fokuslar oluşmaktadır (Löbrich ve ark. 2010). Şekil 2.32’de görüleceği üzere γ-H2AX fokus testinin temelini immunofloresan boyama yöntemi oluşturmaktadır. Bu yöntemde hücreler, önce anti-fosfo histon H2AX antikoru ile daha sonra da florokrom boya ile işaretlenmiş sekonder antikor ile bir süre inkübe edilmektedir. Böylece ortaya çıkan sinyal/fokus sayılarının belirlenmesi ile ÇZK oranları belirlenebilmektedir. Şekil 2.32. γ-H2AX fokus testinin temel mekanizması 69 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Kullanılan Ekipman ve Sarf Malzemeler Tez çalışmalarımız Uludağ Üniversitesi Biyoloji Bölümü bünyesinde bulunan hücre kültürü ve genetik toksikoloji laboratuvarında yürütülmüştür. Deney çalışmalarımızda kullanılan cihazlar Çizelge 3.1’de, sarf malzemelerin adları, markaları ve katalog numaraları ise Çizelge 3.2’de gösterilmiştir. Çizelge 3.1. Çalışmalarda kullanılan ekipman Ekipman Marka / Model Floresan/Işık mikroskop NIKON – ECLIPSE 80i Görüntüleme sistemi KAMERAM Radyasyon Işınlama Cihazı SIEMENS MD2 (M6V FOTON) -80oC derin dondurucu ELCOLD Distile su cihazı MP MINI PURE – DEST UP Su banyosu NÜVEBATH NBS Ultrasonik su banyosu BANDELIN – RK 31 Isıtmalı manyetik karıştırıcı MTOPS – MS300HS Hassas terazi (Max: 220/82 g) SHIMADZU – AUW220D Kaba Terazi (Max: 2000 g) RADWAG – WTB2000 Azot tankı INT. CRYOGENICS – IC 20R pH metre HANNA – HI 221 -20oC derin dondurucu ALASKA – ADF 06 V +4oC cam kapaklı buzdolabı HORECA – HRS 375 CHL Soğutmalı santrifüj SIGMA – 2-16PK Etüv (37oC ve %5 CO2 takviyeli) BINDER – CB 150 Class II steril kabin (laminar flow) THERMO Inverted mikroskop SOIF +4oC Standard Buzdolabı BEKO Hücre sayım cihazı ROCHE 70 Çizelge 3.2. Çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler Sarf Malzeme Firma / Katalog No 8 kuyucuklu lamlar BD BIOCOAT – LOT:87501 Steril pipetler (5,10 ve 25 ml’lik) COSTAR STRIPETTE Serolojik pipet tabancası BIOHIT MIDI PLUS Steril 15 ml lik tüpler FALCON Steril flasklar (T-12,5, T-25 ve T-75) FALCON Steril petriler (60 ve 100 mm’lik) FALCON Etil alkol AY-KİM Metanol MERCK 1060082500 Asetik asit MERCK 1000632511 Potasyum MERCK 1049361000 Sitokalasin-B SIGMA C6762 Giemsa MERCK 1092040500 Kristal viyole MERCK 1159400100 Polihidroksi-C60 BUCKYUSA BD-301 Paraformaldehit SIGMA – ALDRICH P6148 Triton X-100 GERBU 2000 Bovine Serum Albumin SIGMA- ALDRICH A9418 Anti-H2AX primer antikor PIERCE MA-5 15310 Alexa Fluor 488 sekonder antikor INVITROGEN – A11008 RPMI-1640 (500 ml) LONZA 12-702F DPBS (500 ml) SIGMA 08537 Penisilin – Streptomisin THERMO SH40003.12 Sodyum piruvat (100 ml) THERMO SH30239.01 L-Glutamin (100 ml) SIGMA – ALDRICH G7513 Fetal Bovine Serum SIGMA – ALDRICH F9665 % 0,25 Tripsin-EDTA SIGMA – ALDRICH T4049 DPBS/Modified THERMO SH30028.02 DAPI/antifade boyası VECTASHIELD H-1200 71 3.2. Fullerenol Çözeltisinin Hazırlanması ve Karakterizasyonu Çalışmalarımızda kullandığımız suda çözülebilir fulleren formu olan ve poli-hidroksi fulleren olarak da adlandırılan fullerenol C60(OH)n (n: 18 – 22) Bucky USA firmasından toz formunda temin edilmiştir. 200 mg toz fullerenol 4 ml steril distile su içerisinde çözüldükten sonra oda sıcaklığında saklanmış ve deneylerden önce istenilen konsantrsayonları elde etmek üzere RPMI besiyeri ile seyreltilmiştir. Fullerenol çözeltisi deneyler esnasında her kullanımdan önce ultrasonik su banyosunda 15 dk boyunca sonifike edilmiştir. Hazırlamış olduğumuz fullerenol çözeltisinin karakterizasyon işlemleri ise zeta potansiyeli ölçümü, dinamik ışık saçılım spektrofotometresi (DLS) ve transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) analizleri ile gerçekleştirilmiştir. 3.2.1. Zeta potansiyeli ölçümü Zeta Potansiyeli kısaca tanecikler arasındaki itme veya çekme değeri ölçümü olarak tanımlanabilir (Hunter, 1981). Zeta potansiyeli partikülün yüzey yüküne bağlı olup genellikle 15 mV’dan yüksek ya da -15mV’dan küçük değere sahip partiküller stabil olarak kabul edilirler. Bu yük partiküllerin bir araya gelerek aggregat oluşturmalarını engelleyen bir güç olarak görev aldığından dolayı nano çalışmalarında kullanılacak bir çözeltideki partiküllerin zeta potansiyelinin belirlenmesi büyük önem arz etmektedir. Çalışmamızda hazırlanan süspansiyondaki fullerenol partiküllerinin zeta potansiyeli 25 oC’de Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Ins.) cihazı kullanılarak belirlenmiştir. 3.2.2. Dinamik ışık saçılım (DLS) spektrofotometresi analizi Toksisite çalışmalarında kullanmak üzere hazırlamış olduğumuz fullerenol çözeltisindeki patiküllerin büyüklükleri Malvern CGS-3 model (Malvern Inst.) dinamik 72 ışık saçılım spektrofotometresi kullanılarak 25 oC sıcaklıkta ve 90 derece açıda ölçülmüştür. 3.2.3. Transmisyon elektron mikroskopi (TEM) analizleri Hem fullerenol partiküllerinin büyüklük ve dağılımı hakkında veri elde etmek hem de DLS analizi ile elde edilen verileri konfirme etmek için transmisyon elektron mikroskobik (TEM) analizler gerçekleştirilmiştir. Bunun için hazırlanan çözeltimizden alınan örnekler 300 mesh’lik bakır gridler üzerine damlatıldıktan sonra bir gece boyunca kurumaya bırakılmışlardır (Dhawan ve ark. 2006). Kurutma sonrasında gridler FEI marka Technai Spirit G2 model 120 kV Transmisyon elektron mikroskobu altında incelenmişlerdir. Uygun görüntü alanına rastlanıldığında ise Morada marka 11 megapiksel TEM kamerası (Soft Imaging system) kullanılarak fotoğraf çekimleri yapılmıştır. 3.3. Kullanılan Hücre Hattı (A549) ve Kültür İşlemleri Çalışmalarımızda insan adenokarsinom alveolar bazal epitel hücreleri (A549) kullanılmıştır. A549 hücreleri filtre kapaklı T-75 flasklarda, RPMI-1640 besiyerinde, % 5 CO2 takviyeli 37 oC’lik etüvlerde kültüre alınmışlarıdır. Hücreler rutin olarak 2 günde bir beslenmiş ve % 85 doluluğa ulaştıklarında pasajlanmışlardır. A549 hücrelerinin pasajlanma prosedürü: Gerekli Sarf Malzemeler Gerekli Kimyasallar 15 ml steril tüpler Steril PBS Çözeltisi Steril serolojik ve pastör pipetleri Tripsin-EDTA (% 0,25’lik) T-75 Flasklar RPMI-1640 Besiyeri 73 1) Pasaj doluluğuna ulaşan T-75 flaskındaki besiyeri aspire edilerek uzaklaştırılmıştır. 2) Hücreler uygun 5 ml PBS ile yıkandıktan sonra ve PBS uzaklaştırılmıştır. 3) Flasklara daha sonra 3 ml tripsin eklenerek 1 – 2 dk beklenmiştir. 4) İnvert mikroskop altında hücrelerin zeminden ayrıldığı kontrol edilmiş ve tripsin reaksiyonunu durdurmak için flasklara aynı miktarda besiyeri eklenmiştir. 5) Flasktaki hücre süspansiyonu steril serolojik pipet ile toplanarak önceden etiketlenmiş olan15 ml’lik falcon tüplerine aktarılmıştır. 6) Tüp içerisindeki hücreler +4 oC’de, 1000 rpm’de, 5 dk santrifüj edilmiştir. 7) Daha sonra süpernatant hücrelerin üzerinde yaklaşık 100 µl kalacak şekilde aspire edildikten sonra kalan pellet 5 ml besiyeri içinde yeniden süspanse edilmiştir. 8) Hücre sayım cihazı ile süspansiyondaki toplam hücre sayısı belirlendikten sonra yeni flasklara ekilecek hücre miktarını elde etmek için gerekli olan süspansiyon miktarı belirlenmiş ve taze besiyeri içeren flasklara aktarılmıştır. 9) Yeni ekim yapılan flasklardaki hücreler 37 oC’lik etüvde inkübe edilmişlerdir. 3.4. Hücrelerin ışınlandırılması Flaskların ve 8 odacıklı kültür lamlarının içerisindeki hücrelerin ışınlama işlemi, 6-MV X-ışınları kullanılarak, Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyoterapi Merkezinde gerçekleştirilmiştir. T-25 flasklarının filtreli kapakları iyice kapatılıp ağız kısımları kontaminasyonun önlemesi amacıyla sıkıca streç film ile sarılmıştır. 8 kuyucuklu kültür lamları steril petriler içerisinde, flasklar ile birlikte özel bir steril taşıma kabı içerisinde ışınlamaya götürülmüşlerdir. Radyasyon uygulama dozları (0.5 – 8 Gy) lineer hızlandırıcı (Siemens Mevatron MD2) kullanılarak dakikada 2 cGy olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Verilen toplam doz, flaskların uygulama pozisyonundaki duruşlarının bilgisayarlı tomografik görüntülerine dayanarak, radyoterapi planlama sistemi (CMS-XİO) ile hesaplanmıştır. Işınlama işlemini takiben örnekler normal olarak in vivo gerçekleşen DNA tamirinin oluşmasına izin vermek amacıyla bir saat süresince 37 oC’de inkübe edilmişlerdir. 74 3.5. Deney Planı Fullerenol ve radyasyona tek başlarına ve kombine halde maruz bırakılan A549 hücreleri ile yapılan klonojenik, mikronükleus ve γ-H2AX testlerimize ait genel deney planı ve dozlama grupları Tablo 3.1’de verilmiştir. Çizelge 3.3. A549 hücrelerinde 1 saat ve 24 saatlik fullerenol (F) uygulaması ve radyasyon ile gerçekleştirilen deney setleri Fullerenol Fullerenol + Radyasyon Kontrol Radyasyon µg/L 1 saat 24 saat 100 F 100 + 1 Gy F 100 + 1 Gy Negatif K. 1 saat 200 1 Gy F 200 + 1 Gy F 200 + 1 Gy 400 F 400 + 1 Gy F 400 + 1 Gy Solvent K. 100 F 100 + 2 Gy F 100 + 2 Gy 24 saat 2 Gy Pozitif K. 200 F 200 + 2 Gy F 200 + 2 Gy 400 F 400 + 2 Gy F 400 + 2 Gy 3.5.1. Kontrol grupları Deneylerimizde negatif, pozitif ve solvent olmak üzere üç tip kontrol grubu kullanılmıştır. Negatif Kontrol grubu: Herhangi bir ajana maruz kalmayan kontrol grubu. Solvent Kontrol: Solvent (su) kontrol grubumuzda final konsantrasyonu % 0,05’i geçmeyecek şekilde steril distile su kullanılmıştır. Pozitif Kontrol: Genotoksisite karşılaşmalarında ve test sistemlerinin doğru çalışıp çalışmadığını kontrol amacıyla 0,05 M’lık H2O2 kullanılmıştır. 75 3.5.2. Klonojenik test grupları Fullerenol’ün sitotoksik etkilerinin belirlenmesi amacıyla A549 hücreleri 24 saat süresince 10, 50, 100, 200, 400, 800 ve 1600 µg/L konsantrasyonlarında fullerenole maruz bırakılmışlardır. Radyasyonun sitotoksik etkilerinin belirlenmesi amacı ile A549 hücreleri 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 ve 10 Gy radyasyona maruz bırakılmışladır. Klonojenik test sonuçlarına göre %75’den daha yüksek yaşayabilirlik oranı gösteren düşük sitotoksik etkiye sahip değerler seçilerek genotoksisite testleri gerçekleştirilmiştir. 3.5.3. Genotoksisite test grupları Genotoksisite test grupları klonojenik test sonuçlarına göre seçilen fullerenol (100, 200 ve 400 µg/L fullerenol) ve radyasyon (1 ve 2 Gy) dozları ile belirlenmiştir. Kombine testlerde üç farklı dozda uygulanan fullerenol, radyasyon ışınlandırmalarından 1 saat ve 24 saat önce olmak üzere iki farklı sürede uygulanmıştır. 3.6. Klonojenik Test Bir toksik etkiye maruz bırakılan hücrelerin tutunma ve bölünebilme yeteneklerini belirlenmesine dayanan klonojenik test, sitotoksik etkilerin belirlenmesinde sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Klonojenik test sonucunda elde edilen bulgular bize genotoksisite testlerinde kullanılacak konsantrasyonların/dozların belirlenmesi esnasında yön göstermektedir (Munshi ve ark. 2005). Klonojenik testte % 75’den daha yüksek hayatta kalış oranı veren (düşük sitotoksik) konsantrasyonlar seçilmektedir. A549 hücreleri ile yürütülen klonojenik test aşamalarını şöyle sıralayabiliriz: 1) Yaklaşık 25 pasaj sayısına sahip olan A549 hücreleri pasajlama prosedüründe anlatıldığı üzere tripsinleme yolu ile 15 ml’lik steril tüplere toplanmışlardır. 2) Hücre süspansiyonundan sayım yapılarak tüpteki toplam hücre sayısı belirlenmiştir. 76 3) Tüp içerisindeki hücreler +4 oC’de, 1000 rpm’de, 5 dk santrifüj edildikten sonra süpernatant aspire edilerek kalan pellet yeniden süspanse edilmiş ve dozlanacak T-25 flasklara 30.000 hücre/flask olacak şekilde ekim yapılmıştır. 4) Flasklara ekilen A549 hücreleri yaklaşık iki gün sonra %80 ve üzeri konfluent hale geldiği zaman dozlanmışlar ve 24 saat süresince inkübe edilmişlerdir. 5) İnkübasyon süresinden sonra flaskların içindeki besiyeri aspire edilerek uzaklaştırıldıktan sonra hücreler tripsinlenerek etiketlenmiş olan tüplere toplanmışlardır. 6) Elde edilen hücre süspansiyonundan trypan blue yöntemiyle canlı hücre sayımı yapıldıktan sonra her konsantrsyon için 60 mm’lik dört adet petriye 500 canlı hücre ekildikten sonra petriler yaklaşık 10 gün süresince koloni oluşumları için inkübe edilmişlerdir. 7) Bu esnada, petriler invert mikroskopta düzenli aralıklarla incelenerek koloni gelişimi kontrol edilmiş ve hücreler üç günde bir taze besiyeri ile beslenmişlerdir. 8) İnkübasyon süresi sonunda kolonilerin oluşmasını takiben petrilerdeki besiyeri uzaklaştırılmış, adından PBS ile yıkanma işlemi yapıldıktan sonra hücreler absolute etanol ile 10 dk fiske edilmişlerdir. 9) Fiksasyon işlemini takiben hücreler 5 dk süresince kristal viyole ile boyanmışlardır. 10) Boyama işlemini takiben invert mikroskopta en az 40 hücre içeren koloni büyüklükleri belirlenmiş ve böylece her bir petrideki koloniler sayılarak elde edilen sonuçlar tablo haline getirilmiştir. Aşağıda belirtilen formül ile yüzde yaşayabilirlik oranı (sitotoksisite) hesaplanmıştır. Petri başıma düşen ortalama koloni sayısı Yaşayabilirlik (sitotoksisite) = --------------------------------------------------- x 100 Kontrol petrisindeki ortalama koloni sayısı 77 3.7. Sitokinez Bloke Mikronükleus Testi Yapısal ve sayısal kromozom bozuklukların tespit edilmesine olanak sağlayan mikronükleus testi genotoksik etkilerin belirlenmesi amacıyla kullanılmıştır. A549 hücrelerinde Sitokalasin-B ile sitokinez bloke yöntemine dayalı olarak gerçekleştirilen mikronükleus testinin (Fenech ve Morley 1986) aşamalarını şöyle sıralayabiliriz: 1) Yaklaşık 25 pasaj sayısına sahip olan A549 hücreleri pasajlama prosedüründe anlatıldığı üzere tripsinleme yolu ile 15 ml’lik steril tüplere toplanmışlardır. 2) Hücre süspansiyonundan sayım yapılarak tüpteki toplam hücre sayısı belirlenmiştir. 3) Tüp içerisindeki hücreler +4 oC’de, 1000 rpm’de, 5 dk santrifüj edildikten sonra süpernatant aspire edilerek kalan pellet yeniden süspanse edilmiş ve dozlanacak T25 flasklara 30.000 hücre/flask olacak şekilde ekim yapılmıştır. 4) Flasklara ekilen A549 hücreleri yaklaşık iki gün sonra %80 ve üzeri konfluent hale geldiği zaman dozlanmışlar ve 24 saat süresince inkübe edilmişlerdir. 5) 24 saatlik dozlama işlemini takiben hücreler tekrar beslenmiş ve her bir flaska Sitokalasin-B (5 µg/ml final konsantrasyon) eklenerek 1 gün inkübe edilmişlerdir. 6) Sitokalasin-B ile 1gün inkübasyondan sonra flasklar pasajlama prosedüründe tarif edildiği üzere tripsinlenerek önceden etiketlenmiş olan tüplere toplanmışlardır. 7) Tüpler +4 oC’de, 1000 rpm’de, 5 dk santrifüj edildikten sonra süpernatant hücrelerin üzerinde yaklaşık 200 µl kalacak şekilde aspire edilmiştir. 8) Tüplere oda sıcaklığındaki taze hazırlanmış hipotonik (0,075 M KCl) çözeltisinden 5 ml eklenerek ~3 dk süresince hücrelerin şişmesi için beklenmiştir. 9) Bu süre sonunda tüpler +4 oC’de, 1000 rpm’de, 5 dk santrifülendikten sonra hipotonik uzaklaştırılmış ve hücrelerin üzerien yavaşca taze hazırlanmış karnoy fiksatifi (3:1 metanol: glasiyel asetik asit) 5 ml oluncaya kadar eklenmiştir. 10) Fiksasyon işlemi arka arkaya 2 kez tekrarlandıktan sonra hücreler önceden temizlenmiş lamlar üzerine yayılarak kurumaya bırakılmışlardır. 11) Kuruyan lamlar şale içerisinde % 5’lik giemsa boyası ile 15 dk boyandıktan sonra lamlar sudan geçirilmiş ve analiz zamanına kadar kurutularak saklanmışlardır. 12) Hazırlanan preparatlarda mikronükleus taşıyan binükleuslu hücre frekansının yanı sıra tek, çift, üçlü ve dörtlü nükleus taşıyan hücrelerin sayıları kaydedilmiştir. 78 Her bir grup için preparatlardan 2000 hücre sayılarak, bu hücreler arasından mikronüleus taşıyan çift nükleuslu hücre frekansları yanında, bir (MI), iki (MII) üç (MIII) ve dört (MIV) nükleus taşıyan hücrelerin sayısı da kaydedilmiştir. Klonojenik sitotoksisite testi yanında, sitokinez bloke mikronükleus testinde sitokalasin- B uygulaması nedeniyle birikim gösteren çok çekirdekli hücrelerin sayısındaki değişimler incelenerek de sitotoksisite hakkında bilgi sahibi olunabilmektedir. Çekirdek bölünme indeksi (ÇBİ) olarak da adlandırılan ve aşağıdaki formüle göre hesaplanan bu değer bize kimyasal veya fiziksel bir maddenin sitotoksik etkisini göstermede önemli bilgiler sağlar (Kirsh-Volders ve ark. 2003). ÇBİ = (MI + 2xMII + 3xMIII + 4xMIV) / N ; N = MI + MII + MIII + MIV Bu çalışmada da farklı doz grupları için ÇBİ değerleri toplam 1000 hücre üzerinden hesaplanmış ve ikincil sitotoksisite verileri elde edilmiştir. 3.8. γ-H2AX Fokus Testi Fullerenol ve radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerindeki DNA çift iplik kırıklarının tespiti amacıyla kullanılan γ-H2AX fokus testi 8 kuyucuklu kültür lamları içerisinde gerçekleştirilmiştir (Watters ve ark. 2009). Fokusların sayılması işlemi ise Foci Counter 1.0 (Anna Jucha) yazılımı kullanılarak bilgisayar aracılığı ile gerçekleştirilmiştir. γ-H2AX testinde kullanılacak olan kimyasallar deneyden önce taze olarak aşağıda belirtildiği şekilde hazırlanmıştır. % 4 Paraformaldehit 200 mg paraformaldehit 5 ml distile suda ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda çözülmüştür. 79 % 1 BSA 100 mg BSA tartılarak 10 ml distile suda çözülmüştür. % 0.2’lik Triton X-100 9,98 ml DPBS üzerine 20 µl Triton X-100 eklenmiştir. Primer Antikor 1/500 primer antikor: 1,3 ml BSA üzerine 4 µl primer antikor eklenmiştir. Sekonder Antikor 1/500 sekonder antikor: 1,3 ml BSA üzerine 4 µl sekonder antikor eklenmiştir. γ-H2AX test prosedürü şu şekildedir (Watters ve ark. 2009): 1) Yaklaşık 25 pasaj sayısına sahip olan A549 hücreleri pasajlama prosedüründe anlatıldığı üzere tripsinleme yolu ile 15 ml’lik steril tüplere toplanmışlardır. 2) Hücre süspansiyonundan sayım yapılarak tüpteki toplam hücre sayısı belirlendikten sonra γ-H2AX testi için kullanılacak olan 8 kuyucuklu kültür lamlarına 8.000 hücre/kuyucuk olacak şekilde ekim yapılmış ve 750 µl besiyeri eklenmiştir. 3) İnkübasyon süresi sonunda hücreler ilgili ajanlarla 24 saat maruz bırakılmışlardır. 4) 24 saatlik uygulama süresi sonunda kuyucukların içindeki besiyeri aspire edilerek uzaklaştırıldıktan sonra hücreler 300 µl PBS/kuyucuk ile 2 kez yıkanmışlardır. 5) PBS uzaklaştırıldıktan sonra kuyucuklara direkt 100’er µl taze hazırlanmış % 4’lük paraformaldehit eklenerek oda sıcaklığında 10 dk fiksasyon işlemi yapılmıştır. 6) Hücreler daha sonra 3 kez, 300 µl PBS ile yıkandıktan sonra kuyucuklara 100’er µl % 0,2 Triton X-100 eklenir ve oda sıcaklığında 10 dk inkübe edilerek hücreler permeabilize hale getirilir. 7) Hücreler tekrar 3 kez PBS ile yıkandıktan sonra kuyucuklara 100’er µl % 1’lik BSA eklenmiş ve oda sıcaklığında 20 dk bekletilmiştir. 80 8) Bu süre sonunda BSA uzaklaştırıldıktan sonra her kuyucuğa %1’lik BSA ile 1/500 oranında seyreltilmiş olan primer monoklonal anti-fosfo histon H2AX antikorundan 100’er µl eklenmiş ve oda sıcaklığında 1,5 saat süresince inkübe edilmiştir. 9) İnkübasyondan sonra hücreler tekrar 3 kez PBS ile yıkanmış ve bu kez kuyucuklara % 1’lik BSA içerisinde 1/500 oranında seyreltilmiş Alexa-Fluor 488 işaretli sekonder antikor eklendikten sonra ile oda sıcaklığında ve karanlıkta 1 gece boyunca inkübasyona bırakılmıştır. 10) Bu süre sonuında PBS ile tekrar yıkama yapıldıktan sonra kuyucuklar çıkarılmış ve lamdaki hücreler antifade/DAPI ile boyandıktan sonra kapatılarak saklanmışlardır. 11) Preparatlar fluresoan mikroskopta DAPI filtresi ile incelenmişlerdir. FITC filtresi kullanılarak hücreler fotoğraflanmıştır. 12) Fotoğraflanarak seçilen her bir çekirdekteki sinyal/fokus sayıları foci counter yazılımı kullanılarak belirlenmiş ve ardından ortalama fokus/hücre sayısı hesaplanmıştır. 13) Her bir doz grubu için 50+50 olmak üzere 100 hücre analiz edilmiş ve deneyler en az iki kez olmak üzere tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir. 3.9. İstatistik Analizler Klonojenik sitotoksisite verileri Kruskall-Wallis testi kullanılarak analiz edilmişlerdir. Normal dağılım gösterdiği belirlenen Mikronükleus ve γ-H2AX testlerinden elde edilen verilerin karşılaştırılması için parametrik testler kullanılmıştır. Varyans analizi ANOVA’yı takiben LSD (Least significant difference) testi kullanılarak karşılaştırılmışlardır. Doza bağımlı yanıtların karşılaştırılmasında ise regresyon analizi kullanılmıştır. Tüm istatistik analizler SPSS 11 yazılımı kullanılarak bilgisayarda gerçekleştirilmiştir. 81 4. BULGULAR 4.1. Fullerenol Karakterizasyonu Fullerenol karakterizasyonu transmisyon elektron mikroskopi, zeta potansiyel ve DLS analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Hazırlamış olduğumuz fullerenol çözeltisinin zeta potansiyeli değeri -30 mV olarak belirlenmiştır. Bu değer çözeltimizin stabil olduğunu göstermektedir. DLS ve TEM analizlerinden elde edilen bulgular ise partikül boyutlarının 100 nm’den küçük oldıuğunu göstermiştir. Ortalama fullerenol nanopartikül boyutu 35 ± 15 nm olarak belirlenmiştir. TEM ile çekilmiş olan ve homojen partikül dağılımını gösteren fotoğraf Şekil 4.1’de gösterilmiştir. Şekil 4.1. Suda çözülmüş C60OH(18-22) fullerenol nanopartiküllerinin TEM (Transmisyon Elektron Mikroskobik) görüntüleri (x135.000) 4.2. Fullerenolün % Hayatta Kalış (Canlılık) Oranına Etkisi Tez çalışmamızda kullanılacak fullerenol konsantrasyonlarının belirlenmesi amacıyla A549 hücreleri 10, 50, 100, 200, 400, 800 ve 1600 µg/L konsantrasyonlarındaki fullerenol nanopartiküllerine maruz bırakılarak klonojenik test uygulanmıştır. 82 Elde edilen sonuçlara göre test gruplarının % hayatta kalış oranları Şekil 4.2’de gösterilmiştir. 100 80 60 40 20 0 0 10 50 100 200 400 800 1600 Fullerenol Konsantrasyonları (ug/L) Şekil 4.2. Çeşitli konsantrasyonlarda fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde klonojenik test ile belirlenen % hayata kalış oranları Şekil 4.2’de görüldüğü üzere maksimum fullerenol konsantrasyonu olan 1600 µg/L, canlılığı % 80’e, 800 µg/L’lik fullerenol dozu ise canlılığı % 83’e düşürmüştür. 10 ve 50 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonlarında % 95’in üzerinde hayatta kalış gözlenmiştir. 100, 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonlarında sırasıyla % 95, % 90 ve % 85 hayatta kalış gözlenmiştir. Çalışmamızda esas olarak seçilmesi gereken düşük sitotoksik konsantrasyonların % 75 ve üzeri canlılık göstermesi gerekmektedir. Bu anlamda, 800 ve 1600 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları, doğada bir canlının maruz kalabileceğinden çok daha fazla fullerenol içermektedir. 10 ve 50 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonlarında ise % 95’in üzerinde hayatta kalış gözlendiği için anlamlı bir sitotoksik etki görülmemiştir. Dolayısıyla genotoksisite testlerimizde kullanılacak fullerenol konsantrasyonları 100, 200 ve 400 µg/L olarak belirlenmiştir. 4.3. Radyasyonun % Hayatta Kalış Oranına Etkisi Tez çalışmamızda kullanılacak radyasyon dozlarının belirlenmesi amacıyla A549 hücreleri 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 ve 10 Gy radyasyona maruz bırakılarak klonojenik test 83 % Hayatta Kalış uygulanmıştır (Şekil 4.3). Elde edilen sonuçlara göre test gruplarının % hayatta kalış oranları Şekil 4.4’de gösterilmiştir. Şekil 4.3. Radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde koloni oluşumları 100 80 60 40 20 0 0 0.5 1 2 4 6 8 10 Radyasyon Dozları (Gy) Şekil 4.4. Çeşitli dozlarda radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde klonojenik test ile belirlenen % hayata kalış oranları 84 % Hayatta Kalış Şekil 4.4’de görüldüğü üzere 4 Gy ve üzerindeki radyasyon dozları canlılığı % 50’nin altına düşürmüş, 10 Gy’de ışınlandırılan tüm hücreler ise ölmüştür. 0,5 Gy’de canlılık % 83’e, 1 Gy’de ise % 80’e inmiştir. 2 Gy’de ise canlılık % 65’e kadar düşmüştür. Radyasyonun neden olduğu sitotoksisite açısından 0,5 ile 1 Gy dozları arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Bu nedenle genotoksisite testlerimizde kullanılacak radyasyon dozları 1 ve 2 Gy olarak belirlenmiştir. 4.4. Fullerenol ve Radyasyon Kombine Uygulamalarının % Hayatta Kalış Oranına Etkisi Kombine uygulamalarda, A549 hücreleri radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat ve 24 saat önce fullerenolün 100, 200 ve 400 µg/L’lik konsantrasyonları ile muamele edilmiştir. Daha sonra hücreler tek başlarına ve kombine olarak 1 Gy ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılmış ve klonojenik test prosedürü uygulanmıştır. Klonojenik test sonuçlarının değerlendirilmesiyle ortaya çıkan % hayatta kalış oranları Şekil 4.5 ve 4.6’de gösterilmiştir. 100 Kontol F100 F200 F400 80 60 40 20 Kontrol 1gy 2GY Şekil 4.5. Radyasyona maruz bırakmadan 1 saat önce çeşitli konsantrasyonlarda fullerenol ile muamele edilen A549 hücrelerinin % hayatta kalış oranları 85 % Hayatta Kalış Şekil 4.5’te görüldüğü gibi 1 Gy radyasyona maruz bırakılan Kontrol grubunda % 62 canlılık gözlenmiştir. Bununla birlikte, 1 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat önce 100 µg/L’lik fullerenol ile muamele edilen gruptaki (F100) hücreler % 65’lik bir hayatta kalış sergilemişlerdir. Aynı şekilde 200 µg/L’lik fullerenol ile muamele edilen grupta (F200) bu canlılık oranı, Kontrol ve F100 grubuna göre artarak % 73’e kadar çıkmıştır. F400 grubundaki hücrelerin hayatta kalış oranı ise % 70’tir. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan Kontrol grubundaki hayatta kalış oranı % 28’e kadar düşüş gösterirken F100 grubunda bu oran yaklaşık % 47’dir. F200 ve F400 gruplarında, % hayatta kalış oranları 2 Gy Kontrol grubuna göre artış göstermekle birlikte F100 grubunun sahip olduğu değere ulaşamamıştır. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan F200 ve F400 gruplarının % hayatta kalış oranları sırasıyla % 36 ve % 39’dur. 100 Kontol F100 F200 F400 80 60 40 20 Kontrol 1gy 2GY Şekil 4.6. Radyasyona maruz bırakmadan 24 saat önce çeşitli konsantrasyonlarda fullerenol ile muamele edilen A549 hücrelerinin % hayatta kalış oranları Şekil 4.6’da, 1 Gy radyasyona maruz bırakılan Kontrol grubu % 63 canlılık gösterirken 1 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 24 saat önce 100 µg/L’lik fullerenol ile muamele edilen grupta (F100) bu oran % 60’a kadar düşmüştür. 1 Gy radyasyona maruz bırakılan F200 ve F400 gruplarındaki canlılık, Kontrol ve F100 gruplarına göre artış göstermiştir. F200 grubunda % 80 ve F400 grubunda % 90 hayatta kalış gözlenmiştir. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan gruplardan, Kontrol grubundaki canlılık % 30’a kadar 86 % Hayatta Kalış düşerken 24 saatlik fullerenol gruplarındaki canlılık Kontrol grubuna göre doza bağlı olarak artış göstermiştir. Hayatta kalış oranları F100 için % 42, F200 için % 50 ve F400 için % 55 olarak belirenmiştir. Regresyon analizi sonuçları fullerenol’ün 24 saatlik uygulamasının radyasyonun yol açtığı sitotoksik etkileri doza bağlı olarak azalttığını göstermiştir (R2=0,90, p<0,001). 4.5. Fullerenolün Mikronükleus Oluşumu Üzerindeki Etkisi Tez çalışmamızda kullanılan fullerenol konsantrasyonlarının mikronükleus oluşumu üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla A549 hücreleri 100, 200 ve 400 µg/L fullerenole 24 saat süresince maruz bırakılmış ve MN testi prosedürü uygulanmıştır. Her test grubu için oluşan ‰ mikronükleus (MN) frekansı Şekil 4.7’de verilmiştir. 50 *** 40 30 20 10 0 Kontrol SK PK F100 F200 F400 Şekil 4.7. Çeşitli konsantrasyonlarda fullerenole maruz bırakılan A549 hücrelerindeki mikronükleus frekansları (‰) (***p<0,001) Şekil 4.7’de, Kontrol ve Solvent Kontrol (SK) gruplarının MN frekansı ‰ 8 iken fullerenol gruplarının MN frekansları; F100 için ‰ 5, F200 için ‰ 6 ve F400 için ‰ 7 şeklindedir. Pozitif Kontrol (PK) grubu ise ‰ 41’lik MN frekansı ile p<0,001 87 Mikronükleus Frekansı (‰) düzeyinde anlamlı bir artış göstermiştir. Hasarsız sitokinez bloke hücrelere ait fotoğraf Şekil 4.8’de gösterilmiştir. Şekil 4.8. Sitokinez bloke A549 hücrelerinin genel görüntüsü (Büyütme x400) 4.6. Radyasyonun Mikronükleus Oluşumu Üzerindeki Etkisi Tez çalışmamızda kullanılacak radyasyon dozlarının mikronükleus oluşumu üzerindeki etkisini araştırmak amacıyla A549 hücreleri 1 Gy ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılmıştır. MN testi ile yapılan incelemeler sonucunda her test grubu için oluşan ‰ MN frekansı Şekil 4.9’da verilmiştir. Şekil 4.9’da, Kontrol ve SK gruplarının MN frekansı ‰ 8 olarak görülmektedir. PK grubu ile 1 Gy ve 2 Gy radyasyon gruplarının MN frekansları, Kontrol ve SK gruplarına göre p<0,001 düzeyinde anlamlı bir artış göstermiştir. PK grubunun MN frekansı ‰ 41 iken bu değer 1 Gy radyasyon için ‰ 55 ve 2 Gy radyasyon için ‰ 78’dir. 88 100 ***-a 80 60 *** *** 40 20 0 Kontrol SK PK 1GY 2GY Şekil 4.9. Çeşitli dozlarda radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerindeki mikronükleus frekansları (‰) (***Kontrole fark p<0,001, ***-a 1 Gy’e fark p<0,05) Radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde MN oluşumları Şekil 4.10, 4.11 ve 4.12’de gösterilmiştir. Şekil 4.10. 2 Gy radyasyon grubunun sitokinez bloke A549 hücrelerinde MN oluşumları (Büyütme x400) 89 Mikronükleus Frekansı (‰) Şekil 4.11. Büyük bir MN içeren sitokinez bloke A549 hücresi (Büyütme x1.200) Şekil 4.12. Orta boy MN içeren sitokinez bloke A549 hücresi (Büyütme x1.200) 90 4.7. Fullerenol ve Radyasyon Kombine Uygulamalarının Mikronükleus Oluşumu Üzerindeki Etkisi Fullerenol ve radyasyon kombine uygulamalarının mikronükleus oluşumu üzerindeki etkisinin araştırılması amacıyla A549 hücreleri, 100, 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları ile radyasyona maruz bırakma işleminden 1 saat ve 24 saat önce dozlanmıştır. Daha sonra hücreler tek başlarına ve kombine olarak 1 Gy ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılmış ve MN test prosedürü uygulanmıştır. MN testi sonuçlarının değerlendirilmesiyle her test grubu için ortaya çıkan ‰ MN frekansları Şekil 4.13 ve 4.14’te gösterilmiştir. 70 1 Saat 60 24Saat * * 50 ** ** *** 40 30 20 10 0 1GY 1G+F100 1G+F200 1G+F400 Şekil 4.13. 1 Gy radyasyon uygulamasından 1 saat ve 24 saat önce fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerindeki mikronükleus frekansları (‰) (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) Şekil 4.13’te, 1 Gy radyasyon grubunun MN frekansı ‰ 56 olarak görülmektedir. 1 Gy radyasyona maruz bırakılan fullerenol gruplarından; 1 saatlik F100 grubunun MN frekansı p<0,05 düzeyinde anlamlı bir azalma göstererek ‰ 47’ye ve 24 saatlik F100 grubunun MN frekansı ise p<0,01 düzeyinde anlamlı bir azalma göstererek ‰ 41’e düşmüştür. 1 saatlik F200 grubunun MN frekansı ‰ 45’e düşerken bu düşüş, p<0,05 düzeyinde anlamlıdır. 24 saatlik F200 grubunun MN frekansı p<0,01 düzeyinde anlamlı 91 Mikronükleus Frekansı (‰) bir azalma göstererek ‰ 39’a düşmüştür. 1 saatlik F400 grubunun MN frekansı ‰ 49 olmakla birlikte 1 Gy radyasyon grubuna göre gözlenen bu düşüş anlamlı değildir. 24 saatlik F400 grubunun MN frekansı p<0,001 düzeyinde anlamlı bir azalma göstererek ‰ 37’ye düşmüştür. 90 1 Saat 75 * * 24 Saat ** ** 60 ** 45 30 15 0 2GY 2G+F100 2G+F200 2G+F400 Şekil 4.14. 2 Gy radyasyon uygulamasından 1 saat ve 24 saat önce fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerindeki mikronükleus frekansları (‰) (*p<0,05, **p<0,01) Şekil 4.14’te, 2 Gy radyasyon grubunun MN frekansı ‰ 76 olarak görülmektedir. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan fullerenol gruplarından; 1 saatlik F100 grubunun MN frekansı ‰ 67 olmakla birlikte 2 Gy radyasyon grubuna göre gözlenen bu düşüş anlamlı değildir. 24 saatlik F100 grubunun MN frekansı ‰ 59’a düşmüştür ve bu azalma p<0,01 düzeyinde anlamlıdır. 1 saatlik F200 grubunun MN frekansı p<0,05 düzeyinde anlamlı bir azalma göstererek ‰ 64’e, 24 saatlik F200 grubunun MN frekansı ise yine p<0,05 düzeyindeki anlamlı bir azalma ile ‰ 61’e düşmüştür. 1 saatlik F400 grubunun MN frekansı ‰ 58’e, 24 saatlik F400 grubunun MN frekansı ise ‰ 56’ya düşmüştür ve bu azalmalar p<0,01 düzeyinde anlamlıdır. Fullerenol ve radyasyon kombine uygulamalarının radyasyon dozlarına göre MN frekansında anlamlı azalmalara neden olması fullerenol konsantrasyonlarının 92 Mikronükleus Frekansı (‰) radyasyona karşı gösterdiği koruyucu etki olarak değerlendirilmiştir. 1 saatlik ve 24 saatlik kombine uygulamaların 1 Gy ve 2 Gy radyasyona karşı gösterdiği % koruma oranları Şekil 4.15 ve 4.16’da verilmiştir. 40 F 100 ug F 200 ug F 400 ug 35 30 25 20 15 10 5 0 1 saatlik ugulama 24 saatlik uygulama Şekil 4.15. 1 saat ve 24 saat süresince fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde 1 Gy radyasyona kaşı sağlanan % koruma oranları Şekil 4.15’te, 1 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik fulleren gruplarından; F100 grubu % 15, F200 grubu % 18 ve F400 grubu % 10 oranında radyasyona karşı koruma sağlamıştır. 24 saatlik fulleren gruplarından; F100 grubu % 27, F200 grubu % 31 ve F400 grubu ise % 35 oranında radyasyona karşı koruma sağlamıştır. Regresyon analizi sonuçları fullerenol’ün 24 saatlik uygulamasının 1 Gy radyasyonun yol açtığı genetik hasar oranını doza bağlı olarak azalttığını göstermiştir (R2 = 0,92, p<0,001). Şekil 4.16’da 2 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik fulleren gruplarından; F100 grubu % 7, F200 grubu % 15 ve F400 grubu % 25 oranında radyasyona karşı koruma sağlamıştır. 24 saatlik fulleren gruplarından; F100 grubu % 22, F200 grubu % 19 ve F400 grubu ise % 28 oranında radyasyona karşı koruma sağlamıştır. 93 MN testi için % koruma Regresyon analizi sonuçları fullerenol’ün 1 saatlik (R2 =0,92, p<0,001) ve 24 saatlik (R2 = 0,88, p<0,01) uygulamalarının 2 Gy radyasyonun yol açtığı genetik hasar oranını doza bağlı olarak azalttığını göstermiştir. 35 F 100 ug F 200 ug F 400 ug 30 25 20 15 10 5 0 1 saatlik ugulama 24 saatlik uygulama Şekil 4.16. 1 saat ve 24 saat süresince fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde 2 Gy radyasyona kaşı sağlanan % koruma oranları 4.8. Fullerenolün Çekirdek Bölünme İndeksi (ÇBİ) Üzerindeki Etkisi Çalışmamızda kullanılan fullerenol konsantrasyonlarının herhangi bir sitotoksik etkisinin olup olmadığını belirlemek amacıyla, MN testi sonucunda aşağıdaki formüle göre ÇBİ değerleri hesaplanmıştır. ÇBİ = (MI + 2xMII + 3xMIII + 4xMIV) / N ; N = MI + MII + MIII + MIV (MI: Mononükleuslu hücrelerin sayısı, MII: Binükleuslu hücrelerin sayısı MIII: Trinükleuslu hücrelerin sayısı, MIV: Tetranükleuslu hücrelerin sayısı) Hesaplamada göz önüne alınan çoklu çekirdek yapıları ise Şekil 4.17’de gösterilmiştir. 94 MN testi için % koruma Şekil 4.17. Sitokalasin-B ile muamele edilmiş A549 hücrelerinde çeşitli nükleus formasyonları. A) Mononükleat, B) Binükleat, C) Trinükleat, D) Tetranükleat ve E) Pentanükleat hücreler (Büyütme x1.000) 100, 200 ve 400 µg/L fullerenol ile 24 saat süresince muamele edilen test gruplarının ÇBİ değerleri Şekil 4.18’de verilmiştir. 95 2,4 2 1,6 *** 1,2 0,8 0,4 0 K SK PK 100 200 400 Fullerenol ug/L Şekil 4.18. Fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ değerleri (***p<0,001) Şekil 4.18’de görüldüğü üzere Kontrol ve Solvent Kontrol gruplarının ÇBİ değeri aynı olup 1,9 olarak belirlenmiştir. PK grubunun ÇBİ değeri kontrol grubuna göre p<0,001 düzeyinde anlamlı bir azalma göstererek 1,4’e düşmüştür. Fullerenol gruplarının ÇBİ değerleri sırasıyla; F100 için 1,9, F200 ve F400 için 1,8 olup kontrol grubuna göre anlamlı bir düşüş göstermemiştir. 4.9. Radyasyonun Çekirdek Bölünme İndeksi Üzerindeki Etkisi Çalışmamızda kullanılan radyasyon dozlarının klonojenik test ile belirlenmiş sitotoksik etkilerini doğrulamak amacıyla, MN testi sonucunda ÇBİ değerleri hesaplanmıştır. 1 Gy ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılan test gruplarının ÇBİ değerleri Şekil 4.19’da verilmiştir. Şekil 4.19’da görüldüğü üzere Kontrol ve SK gruplarının ÇBİ değeri aynı olup 1,9 olarak belirlenmiştir. PK grubunun ÇBİ değeri kontrol grubuna göre p<0,001 düzeyinde anlamlı bir azalma göstererek 1,4’e düşmüştür. 1 Gy radyasyon grubunun ÇBİ değeri p<0,01 düzeyinde anlamlı bir azalma ile 1,5’e ve 2 Gy radyasyon grubunun ÇBİ değeri p<0,001 düzeyinde anlamlı bir azalma ile 1,4’e düşmüştür. 96 Çekirdek Bölünme İndeksi (ÇBİ) 2 1,6 ** *** *** 1,2 0,8 0,4 0 K SK PK 1 GY 2GY Radyasyon Şekil 4.19. Radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ değerleri (**p< 0,01, ***p<0,001) 4.10. Fullerenol ve Radyasyon Kombine Uygulamalarının Çekirdek Bölünme İndeksi Üzerindeki Etkisi Fullerenol ve radyasyon kombine uygulamalarının ÇBİ üzerindeki etkisinin araştırılması amacıyla A549 hücreleri radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat ve 24 saat önce 100, 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları ile muamele edilmiştir. Daha sonra hücreler tek başlarına ve kombine olarak 1 Gy ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılmış ve MN test prosedürü uygulanmıştır. MN testi sonuçlarının değerlendirilmesiyle ortaya çıkan ÇBİ değerleri Şekil 4.20 ve 4.21’de gösterilmiştir. Şekil 4.20’te 1 Gy radyasyon grubunun ÇBİ değeri 1,5 olarak görülmektedir. 1 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik ve 24 saatlik F100 gruplarının ÇBİ değerlerinde 1 Gy radyasyon grubuna göre anlamlı bir artış gözlenmemiş olup her iki grup için bu değer 1,6 olarak belirlenmiştir. 1 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik F200 grubunun ÇBİ değeri p<0,01 düzeyinde anlamlı bir artış ile 1,8’e ve 24 saatlik F200 97 Çekirdek Bölünme İndeksi (ÇBİ) grubunun ÇBİ değeri p<0,05 düzeyinde anlamlı bir artış ile 1,7’ye yükselmiştir. 1 saatlik ve 24 saatlik F400 gruplarının ÇBİ değeri aynı şekilde p<0,05 düzeyinde anlamlı bir artış ile 1,7’ye çıkmıştır. 2 ** * * 1 Saat 24 Saat * 1,6 1,2 0,8 0,4 0 1 GY 1 GY+100 1 GY+200 1GY+400 Radyasyon Şekil 4.20. Fullerenol ve 1 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ değerleri (*p< 0,05, **p<0,01) Şekil 4.21’de 2 Gy radyasyon grubunun ÇBİ değeri 1,3 olarak görülmektedir. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik ve 24 saatlik F100 gruplarının ÇBİ değerleri 2 Gy radyasyon grubuna göre p<0,05 düzeyinde anlamlı bir artış ile 1,5’e ulaşmıştır. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik F200 grubunun ÇBİ değeri p<0,05 düzeyinde anlamlı bir artış ile 1,6’ya ve 24 saatlik F200 grubunun ÇBİ değeri ise p<0,01 düzeyinde anlamlı bir artış ile 1,7’ye yükselmiştir. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik ve 24 saatlik F400 gruplarının ÇBİ değerleri aynı şekilde p<0,01 düzeyinde anlamlı bir artış ile 1,7’ye çıkmıştır. Regresyon analizi sonuçları fullerenol’ün 24 saatlik uygulamasının 1 Gy radyasyonun yol açtığı sitotoksik etki oranını doza bağlı olarak azalttığını göstermiştir (R2 = 0,91, p<0,001). 98 Çekirdek Bölünme İndeksi (ÇBİ) 2 1 Saat 24 Saat ** ** ** * * 1,6 * 1,2 0,8 0,4 0 2GY 2GY+100 2 GY+200 2 GY+400 Radyasyon Şekil 4.21. Fullerenol ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ değerleri (*p< 0,05, **p<0,01) 25 1 Saat 24 Saat 20 15 10 5 0 100 200 400 Fullerenol (ug/L) Şekil 4.22. Fullerenol’ün 1 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ koruma oranları 99 ÇBİ için % Koruma Oranı Çekirdek Bölünme İndeksi (ÇBİ) Şekil 4.22’de görüleceği üzere 1 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik F100 grubu radyasyona karşı % 7, 24 saatlik F100 grubu ise % 12 koruma sağlamıştır. 1 saatlik F200 grubu 1 Gy radyasyona karşı % 20 koruma sağlarken 24 saatlik F200 grubu % 18 koruma sağlamıştır. 1 saatlik F400 grubu 1 Gy radyasyona karşı % 14 koruma sağlarken 24 saatlik F400 grubu % 21 oranında koruma sağlamıştır. Şekil 4.23’te görüldüğü üzere 2 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik F100 grubu radyasyona karşı % 8, 24 saatlik F100 grubu ise % 14 koruma sağlamıştır. 1 saatlik F200 grubu 2 Gy radyasyona karşı % 16 koruma sağlarken 24 saatlik F200 grubu % 23 koruma sağlamıştır. 1 saatlik F400 grubu 2 Gy radyasyona karşı % 22 koruma sağlarken 24 saatlik F400 grubu % 20 oranında koruma sağlamıştır. Regresyon analizi sonuçları fullerenol’ün 1 saatlik (R2 = 0,87, p<0,01) ve 24 saatlik (R2 = 0,89, p<0,01) uygulamalarının 2 Gy radyasyonun yol açtığı genetik hasar oranını doza bağlı olarak azalttığını göstermiştir. 25 1 Saat 24 Saat 20 15 10 5 0 100 200 400 Fullerenol (ug/L) Şekil 4.23. Fullerenol’ün 2 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde ÇBİ koruma oranları 100 ÇBİ için % Koruma Oranı 4.11. Fullerenolün γ-H2AX Fokuslarının Oluşumu Üzerindeki Etkisi Tez çalışmamızda kullanılan fullerenol konsantrasyonlarının γ-H2AX fokuslarının oluşumu üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla A549 hücreleri 100, 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonlarına 24 saat süresince maruz bırakılmış ve γ-H2AX fokus testi prosedürü uygulanmıştır. Fokus sayım işlemleri “Foci Counter” adlı yazılım kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Şekil 4.24). A549 hücrelerindeki fokus oluşumları ise Şekil 4.25’te gösterilmiştir. Şekil 4.24. Foci Counter programı ile γ-H2AX fokus sayılarının belirlenmesi 101 a) b) c) Şekil 4.25. A549 hücrelerinde γ-H2AX fokus oluşumları (Büyütme x400) a) DAPI boyalı çekirdekler, b) FITC işaretli γ-H2AX fokusları, c) Birleştirilmiş görüntü 102 Test sonuçlarının değerlendirilmesiyle birlikte her test grubu için hücre başına düşen ortalama fokus sayıları Şekil 4.26’da gösterilmiştir. 120 100 ** 80 60 40 20 0 Kontrol SK PK F100 F200 F400 Şekil 4.26. Çeşitli konsantrasyonlarda fullerenole maruz bırakılan A549 hücrelerinde hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayıları (** p<0,01) Şekil 4.26’da görüldüğü üzere Kontrol ve SK gruplarının hücre başına düşen ortalama fokus sayıları arasında anlamlı bir fark yoktur. Kontrol grubu için ortalama fokus sayısı 37 iken SK grubu için bu değer 39’dur. Benzer şekilde fullerenol grupları arasında hücre başına düşen ortalama fokus sayısı açısından anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. Fullerenol gruplarının hücre başına düşen ortalama fokus sayıları F100 ve F200 için 41, F400 için 43’tür. PK grubunda, hücre başına düşen ortalama fokus sayısı p<0,01 düzeyinde anlamlı bir artış göstererek 90’a çıkmıştır. 4.12. Radyasyonun γ-H2AX Fokuslarının Oluşumu Üzerindeki Etkileri Tez çalışmamızda kullanılan radyasyon dozlarının γ-H2AX fokuslarının oluşumu üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla A549 hücreleri 1 Gy ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılmış ve γ-H2AX fokus testi prosedürü uygulanmıştır (Şekil 4.27). 103 Ortalama fokus sayısı/hücre a) b) c) Şekil 4.27. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde a) FITC filtresi ile γ-H2AX fokusları b) DAPI filtresi ile çekirdek c) Birleştirilmiş görüntü 104 Test sonuçlarının değerlendirilmesiyle birlikte her doz grubunda, hücre başına düşen ortalama fokus sayıları Şekil 4.28’de gösterilmiştir. 100 ** ** 80 ** 60 40 20 0 Kontrol SK PK 1 GY 2 GY Şekil 4.28. Çeşitli dozlarda radyasyona maruz bırakılan A549 hücrelerinde, hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayıları (** p<0,01) Şekil 4.28’de Kontrol ve SK grupları arasında hücre başına düşen ortalama fokus sayıları açısından anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Kontrol grubu için hücre başına düşen ortalama fokus sayısı 37 iken SK grubu için 39’dur. 1 Gy radyasyon grubu için hücre başına düşen ortalama fokus sayısı 73’e, 2 Gy radyasyon grubu için ise 80’e çıkmıştır. Her iki grupta da p<0,01 düzeyinde anlamlı bir artış gözlenmiştir. PK grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı 90 olup aynı şekilde gözlenen bu artış p<0,01 düzeyinde anlamlıdır. 4.13. Fullerenol ve Radyasyon Kombine Uygulamalarının γ-H2AX Fokuslarının Oluşumu Üzerindeki Etkileri Fullerenol ve radyasyon kombine uygulamalarının γ-H2AX fokuslarının oluşumu üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla A549 hücreleri radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat ve 24 saat önce 100, 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları ile muamele edilmiştir. Daha sonra hücreler tek başlarına ve kombine 105 Ortalama fokus sayısı/hücre olarak 1 Gy ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılmış ve sonrasında γ-H2AX fokus testi prosedürü uygulanmıştır. Test sonuçlarının değerlendirilmesiyle birlikte her test grubunda, hücre başına düşen ortalama fokus sayıları Şekil 4.29 ve 4.30’da gösterilmiştir. 90 1 Saat 24 Saat 80 70 * * * 60 ** **** 50 40 30 20 10 0 Kontrol 1GY 1GY+F100 1GY+F200 1GY+F400 Şekil 4.29. 1 Gy radyasyon uygulamasından 1 saat ve 24 saat önce fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerindeki hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayıları (*p<0,05, **p<0,01) Şekil 4.29’da görüldüğü üzere Kontrol grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı 37 iken 1 Gy grubunda bu değer 73’e kadar çıkmıştır. 1 Gy radyasyona maruz bırakılan fullerenol gruplarından; 1 saatlik F100 grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı 60’a, 24 saatlik F100 grubunun ise 59’a düşmüştür. Her iki grupta p<0,05 düzeyinde anlamlı bir azalma gözlenmiştir. 1 saatlik F200 grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı p<0,01 düzeyinde anlamlı bir azalma göstererek 51’e düşmüştür. 24 saatlik F200 grubu için bu değer 60’tır ve p<0,05 düzeyinde anlamlı bir azalma görülmüştür. 1 saatlik F400 grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı 53, 24 saatlik F400 grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı ise 54’tür. Her iki grupta gözlenen düşüşler p<0,01 düzeyinde anlamlıdır. 106 Ortalama fokus sayısı/hücre Şekil 4.30’da görüldüğü üzere Kontrol grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı 37 iken 2 Gy radyasyon grubunda bu değer 78’e çıkmıştır. 90 1 Saat 24 Saat 80 70 * * * 60 * ** ** 50 40 30 20 10 0 Kontrol 2GY 2GY+F100 2GY+F200 2GY+F400 Şekil 4.30. 2 Gy radyasyon uygulamasından 1 saat ve 24 saat önce fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerindeki hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayıları (*p<0,05, **p<0,01) 2 Gy radyasyona maruz bırakılan fullerenol gruplarından; 1 saatlik F100 grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı p<0,05 düzeyinde anlamlı bir azalma göstererek 52’ye, 24 saatlik F100 grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı ise p<0,01 düzeyinde anlamlı bir azalma göstererek 49’a düşmüştür. 1 saatlik F200 grubunda hücre başına düşen ortalama fokus sayısı p<0,05 düzeyindeki anlamlı bir azalma ile 61’e ve 24 saatlik F200 grubunda p<0,01 düzeyindeki anlamlı bir azalma ile 50’ye düşmüştür. 1 saatlik F400 grubunun hücre başına düşen ortalama fokus sayısı 60, 24 saatlik F400 grubunun ise 61’dir. Her iki grubun hücre başına düşen ortalama fokus sayısında p<0,05 düzeyinde anlamlı bir azalma görülmüştür. Fullerenol ve radyasyon kombine uygulamalarının radyasyon dozlarına göre hücre başında düşen ortalama fokus sayısında anlamlı azalmalara neden olması fullerenol konsantrasyonlarının radyasyona karşı gösterdiği koruyucu etki olarak 107 Ortalama fokus sayısı/hücre değerlendirilmiştir. 1 saatlik ve 24 saatlik kombine uygulamaların 1 Gy ve 2 Gy radyasyona karşı gösterdiği % koruma oranları Şekil 4.31 ve 4.32’de verilmiştir. 35 F 100 ug F 200 ug F 400 ug 30 25 20 15 10 5 0 1 saatlik ugulama 24 saatlik uygulama Şekil 4.31. 1 saat ve 24 saat süresince fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde 1 Gy radyasyona kaşı sağlanan % koruma oranları Şekil 4.31’de, 1 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik fullerenol gruplarından; F100 grubu % 20, F200 grubu % 30 ve F400 grubu % 27 oranında radyasyona karşı koruma sağlamıştır. 24 saatlik fullerenol gruplarından F100 grubu % 21, F200 grubu % 19 ve F400 grubu ise % 26 oranında radyasyona karşı koruma sağlamıştır. Şekil 4.32’de ise 2 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik fullerenol gruplarından; F100 grubu % 32, F200 grubu % 20 ve F400 grubu % 23 oranında radyasyona karşı koruma sağlamıştır. 24 saatlik fullerenol gruplarından F100 grubu % 35, F200 grubu % 33 ve F400 grubu da % 20 oranında radyasyona karşı koruma sağlamıştır. Regresyon analizi sonuçları fullerenol’ün 1 ve 24 saatlik uygulamasının 1 Gy ve 2 Gy radyasyonun yol açtığı ve γ−H2AX testi ile belirlenen genetik hasar oranını konsantrasyondan bağımsız olarak azalttığını göstermiştir (R2 = 0,70). 108 γ-H2AX testi için % koruma 40 F 100 ug F 200 ug F 400 ug 35 30 25 20 15 10 5 0 1 saatlik ugulama 24 saatlik uygulama Şekil 4.32. 1 saat ve 24 saat süresince fullerenol’e maruz bırakılan A549 hücrelerinde 2 Gy radyasyona kaşı sağlanan % koruma oranları 109 γ-H2AX testi için % koruma 5. TARTIŞMA VE SONUÇ İyonize edici radyasyonun bütün şekilleri hücrelerdeki etkilerini çarpıştıkları atom ve moleküllerde elektronların yerini değiştirerek göstermekte ve böylece iyonizasyon meydana gelmektedir (Lipscomb ve ark. 1992, Kaya ve ark. 1996). İyonize edici radyasyonun biyolojik etkileri arasında, lipit membranın peroksidasyonu, hücre siklusunu durdurulması, apoptozis, kromozomal kırılmalar, kromozomal ve kromatid tip aberasyonlar, delesyonlar ve gen amplifikasyonları gibi olaylar yer almaktadır (Bennet 1999). İyonize edici radyasyona maruz kalınması sonucunda oluşan serbest radikaller sitotoksik ve genotoksik etkilere yol açmaktadırlar. Örneğin OH● radikali; deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girerek, H2O2 ise zarlardan kolayca geçip hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücrede fonksiyon bozukluğuna ve hatta hücre ölümüne neden olabilmektedir (Meram ve Aktaran 2002, Özkan ve Fışkın 2004). Radyoterapi, günümüzde kanser vakalarının bir çoğunda ya tek başına ya da cerrahi ve kemoterapi kombinasyonları ile küratif olarak kullanılan bir tedavi yöntemidir. Radyoterapide; tanımlanmış tümör hacmine, tümörü çevreleyen sağlıklı dokuya en az zarar verecek şekilde, yüksek doğrulukla ölçülmüş radyasyon dozunu vermek esastır (Perez ve Brady 1998). Bu çerçevede, radyoterapinin sağlam dokular üzerindeki zararlı etkilerini önlemek amacıyla radyoprotektif ajanlar olarak da adlandırılan ve radyasyonda karşı koruyucu etkiye sahip olan kimyasalların araştırılması ve kullanılması gerekli hale gelmiştir (Kalpana ve ark. 2009). Radyoprotektif ajanların en iyi bilinen grubu Sülfidril (-SH) bileşikleri ve amifostindir (Priyadarsini 1997). Son zamanlarda ise curcumin (Srinivasan ve ark. 2006) ve sesamol (Prasad ve ark. 2005) gibi çeşitli fenolik bileşiklerin, bazı doğal flavonoid türlerinin (Devipriya ve ark. 2008) yanında seryum oksit (Colon ve ark. 2009) ve fulleren türevleri (Rzigalinski 2005, Markovic ve Trajkovic 2008) gibi bazı nanopartiküllerin de potansiyel radyoprotektif, antioksidan ajanlar olarak etkileri araştırılmıştır. Sülfidril radyoprotektörleri ve benzer şekilde geliştirilen bazı sentetik bileşiklerin hücre içerisinde kısa sürede bozunması ve toksik etkileri dolayısıyla sınırlı bir kullanıma sahip 110 olduğu bilinmektedir (Maisin 1998, Capizzi ve Oster 2000). Bununla birlikte, son yıllarda nanobilim ve nanoteknolojideki hızlı gelişmelere paralel olarak nanopartiküllerin bu alanda kullanılabilme potansiyellerinin araştırılması gündeme gelmiştir (Bosi ve ark. 2003). Bu gelişmelere bağlı olarak; dokular ve hücreler tarafından kolayca tolere edilebilme, oksidatif stresin yoğun olduğu bölgelere hızlı bir şekilde yayılabilme, düşük konsantrasyonlarda etkili olabilme ve hücre içerisinde uzun süre bozunmadan aktif kalabilme gibi ideal antioksidan özelliklere sahip nanopartiküller tasarlamanın mümkün olabileceği bildirilmiştir (Hunter ve Preedy 2011). Buradan hareketle bu tez çalışmasında C60 fullerenlerin suda çözünebilen bir formu olan polihidroksi fulleren (fullerenol) nanopartiküllerinin radyoprotektif etki potansiyelinin insan akciğer epitelyum hücrelerinde in vitro olarak araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla ilk olarak fullerenol’un olası sitotoksik ve ardından genotoksik etkileri araştırılmıştır. Bizim çalışmamızda yürütülen sitotoksisite deneylerimizde fullerenol’ün test edilen konsantrasyonlarda herhangi bir sitotoksik etkiye sahip olmadığını belirlenmiştir. Fullerenol sitotoksisitesi ile ilişkili olarak yürütülen sınırlı sayıdaki çalışmada da benzer bulgular elde edilmiştir. Örneğin; Su ve ark (2010) fullerenol’ün çeşitli hücre hatları üzerindeki sitotoksik etkilerini incelemişler ve fullerenol’un sitotoksik etkilerinin hücre hattına bağımlı olarak değişebileceğini bildirmişlerdir. XTT testi ile yürütülen bu sitotoksisite çalışmasında fullerenolün Çin hamsteri ovaryum (CHO) ve akciğer (CHL) hücrelerinde yüksek oranda sitotoksik etki gösterirken, L929 hücre hattı üzerinde neredeyse hiçbir etki göstermediği bildirilmiştir. Bununla birlikte adı geçen çalışmada kullanılan konsantrasyonlar incelendiğinde, bizim çalışmamızda kullandığımız aralığa eş değer olan konsantrasyonlarda herhangi bir sitotoksik etkinin gözlenmediği tespit edilmiştir. Bir diğer çalışmada ise fullerenol yapısındaki hidroksil grubu sayısının hepatositlerde oluşacak olası sitotoksisiteye katkıda bulunabileceği, böylece yüksek sayıda (24) -OH grubu içeren fullerenollerin düşük sayıda (12) -OH içeren formlara göre daha toksik olabileceği gösterilmiştir (Nakagawa ve ark. 2011). Fullerenolün genotoksik etkileri hakkında ise son derece sınırlı sayıda çalışma yapılmıştır. Zakharenko ve ark. (1997), milimolar ve mikromolar 111 konsantrasyonlarındaki fullerenolün Escherichia coli ve Drosophila melanogaster modellerinde hehangi bir genotoksik etkiye neden olmadığını bildirmiştir. Niwa ve Iwai (2006), uzun süre nanomolar konsantrasyonlarındaki fullerenole maruz bırakılan hücre hatlarında MN frekansının arttığını belirtmiştir. Buna karşın fullerenol ile indüklenen mikronükleus oluşumunun kromozomal DNA hasarına bağlı olarak değil, hücre döngüsünün M fazında kromozomal DNA’nın başarısız bir şekilde bölünmesine bağlı olarak gerçekleştiği ileri sürülmüştür. Bizim sitotokisite çalışmalarından elde ettiğimiz test sonuçlarına göre genotoksisite çalışmalarımızda kullanmak üzere düşük sitotoksik etkiye sahip olan 100, 200 ve 400 µg/L’lik fulleren konsanstrasyonları seçilmiştir. Mikronükleus ve γ-H2AX genotoksisite testleri sonucunda fullerenolun test edilen konsantrasyonlarda A549 hücreleri üzerinde herhangi bir etkiye sahip olmadığı belirlenmiştir. Benzer bulgular fullerenolün Çin hamsteri ovaryumu hücre hattı (CHO- K1) üzerindeki genotoksik etkilerini sitokinez bloke mikronükleus testi aracılığıyla inceleyen Mrdanovic ve ark. (2009) tarafından da rapor edilmiştir. Bu araştırmacılar fullerenol ile muamele edilen CHO-K1 hücrelerindeki MN frekanslarının, doza bağımlı olarak azaldığını ve kontrol grubuna oranla da anlamlı şekilde düştüğünü bildirmiştir. Bu çalışmadan elde ettiğimiz bulgular fullerenolün sitotoksik ve genotoksik etkiye sahip olmadığı göstermiş olup radyoprotektif ajan olarak kullanılabilirliği çalışmamıza olanak sağlamıştır. Nitekim, yakın bir geçmişte yürütülen çalışmaların sonuçları, C60 fulleren nanopartikül türevlerinin antioksidan etki gösterdiklerini ve radyasyondan koruma alanında da umut vaat ettiklerini ortaya koyar niteliktedir (Rzigalinski 2005, Markovic ve Trajkovic 2008). Bu çalışmada A549 hücre hattı üzerinde yürüttüğümüz fullerenol + radyasyon kombine testlerinde üç farklı dozda uygulanan fullerenol, radyasyon ışınlandırmalarından 1 saat ve 24 saat önce olmak üzere iki farklı sürede verilmiştir. Fullerenolün radyasyona maruz bırakılan A549 hücre hatlarındaki genotoksik ve/veya koruyucu etkileri klonojenik test, sitokinez bloke mikronükleus testi ve γ-H2AX fokus testi kullanılarak araştırılmıştır. Sitotoksisitenin değerlendirilmesinde % hayatta kalış oranları ve ÇBİ değerleri kullanılarak sonuçlar doğrulanmıştır. Genotoksisitenin değerlendirilmesinde ise MN frekansları ve hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayıları göz önüne 112 alınmıştır. Çalışmamız bu yönleriyle literatürdeki diğer çalışmalardan farklı olup özgün bir değere sahiptir. Fullerenol türevleri ile yürütülen çalışmalar in vivo ve in vitro çalışmalar incelendiğinde genel olarak radyasyonun sitotoksik etkilerine karşı koruyucu potansiyele sahip oldukları belirlenmiştir. Örneğin Cai ve ark. (2010), fullerenolün fareler üzerindeki in vivo radyoprotektif etkisini belirlemek amacıyla radyasyona maruz bırakılmadan önce belli aralıklarla, intraperitonal yoldan fullerenol’e maruz bırakılan farelerde 30 günlük % hayatta kalış oranlarını incelemişlerdir. Elde edilen verilere göre; sadece radyasyona maruz bırakılan gruptaki farelerin 30 günlük yaşam süresini tamamlayamadığı, ancak fullerenol uygulanan gruptaki farelerin % 70’inin 30 gün boyunca hayatta kaldığı belirlenmiştir. Bu araştırmacılar fullerenol ile ön muamele işleminin, farelerde immün ve mitokondriyal fonksiyonları arttırmak, oksidatif hasarı ise azaltmak suretiyle yaşam süresini arttırıcı etki gösterdiğini bildirmişlerdir. Brown ve ark. (2010), C60 dendrofulleren (DF-1) bileşiğinin fareler üzerindeki in vivo radyoprotektif etkisini incelemiş ve radyasyon öncesi DF-1 bileşiği ile muamele edilen gruplarda 30 günlük % hayatta kalış oranlarının doza bağımlı olarak artış gösterdiği bildirilmiştir. Yine aynı çalışmada, DF-1 bileşiğinin prostatik adenokarsinom (DU145) hücre hattı üzerindeki in vitro radyoprotektif etkisini uygulama zamanına bağlı olarak incelenmiş ve DF1 uygulamasının hücrelerin hayatta kalış oranlarını anlamlı düzeyde artırdığı gözlenmiştir Daroczi ve ark. (2006) tarafından, DF-1 bileşiğinin, radyasyona maruz bırakılan zebra balığı embriyoları üzerindeki etkileri incelenmiş ve radyasyon öncesi DF-1 bileşiği ile ön muamele işleminin, radyasyon hasarını amifostine kıyasla ciddi bir şekilde azalttığı ifade edilmiştir. Buna karşılık radyasyondan 30 dakika sonra DF-1 ile muamelenin etkili olmadığı ve dolayısıyla söz konusu bileşiğin radyasyona maruziyet esnasında oluşan ROS’ları yakalayarak koruyucu özellik gösterdiği belirtilmiştir. Lin ve ark. (2000), karboksifulleren C3 bileşiğinin insan serviks kanseri hücre hattı (HeLa) üzerindeki radyoprotektif etkisini incelemiştir. Radyasyona maruz bırakılmadan önce C3 bileşiği ile muamele edilen grupların % hayatta kalış oranlarının doza bağımlı olarak artış göstermiştir. C3 bileşiğinin, radyasyon ile indüklenmiş O ●– ● 2 ve OH radikallerini giderici etkisi dolayısıyla radyoprotektif etki gösterdiği bildirilmiştir. 113 Bizim çalışmamızda 1 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat ve 24 saat önce fullerenol ile muamele edilen gruplarda; 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol dozları % hayatta kalış oranını kontrol grubuna göre anlamlı şekilde arttırmıştır. 2 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat ve 24 saat önce fullerenol ile muamele edilen gruplarda; uygulanan tüm dozlar % hayatta kalış oranını kontrol grubuna göre anlamlı şekilde arttırmıştır. Her iki radyasyon dozunda, 24 saatlik fullerenol uygulamasının 1 saatlik uygulamaya göre daha yüksek % hayatta kalış sağladığı tespit edilmiştir. Sitotoksisite testlerinden elde ettiğimiz bu koruyucu özelliğin diğer fullerenol türevlerinde olduğu gibi ROS giderici etkiden kaynaklandığı düşünülmektedir. Örneğin C3 bileşiğinin ROS giderici özelliğinin yanı sıra lipid membranlar içerisine daha iyi lokalize olarak etkili bir sitoprotektif özellik gösterdiği bildirilmiştir. (Dugan ve ark. 1997, Huang ve ark. 1998). Mirkov ve ark. (2004), fullerenolün NO● serbest radikalinin direkt olarak giderilmesinde etkili olduğunu bildirmiştir. Polivinilprolidon (PVP) / Polietilen glikol (PEG) gibi polimerlerde ya da γ-siklodekstrinde çözülmüş C60 türevlerinin, in vitro sistemlerde intraselüler ROS miktarını azalttığı ifade edilmiştir. (Xiao ve ark. 2005, Takada ve ark. 2006). Fullerenol ve radyasyon kombine uygulamalarında genotoksisite testlerinde elde ettiğimiz bulgular da sitotoksisite verilerini destekler niteliktedir. Radyasyon uygulaması A549 hücrelerindeki MN ve hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayısını yüksek oranda arttırmıştır. Bununla birlikte 1 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat önce fullerenol ile muamele edilen gruplarda; 100 ve 200 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları ‰ MN frekansını anlamlı şekilde azaltarak, radyasyona karşı, sırası ile % 15 ve % 18 koruma sağlamıştır. 24 saatlik fullerenol uygulamasında ise tüm konsantrasyonlar ‰ MN frekansını anlamlı şekilde azaltmış ve sırası ile % 27, % 31 ve % 35 koruma sağlamıştır. 2 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat önce fullerenol ile muamele edilen gruplarda; 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları ‰ MN frekansını anlamlı şekilde azaltarak sırası ile % 15 ve % 25 koruma sağlamıştır. 24 saatlik fullerenol uygulamasında ise tüm konsantrasyonlar 114 ‰ MN frekansını anlamlı şekilde azaltmış ve sırası ile % 22, % 19 ve % 28 koruma sağlamıştır. 100, 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları ile muamele edilen gruplar ve kontrol grubu arasında ÇBİ değeri açısından anlamlı bir farklılık gözlenmemiştir. 1 Gy ve 2 Gy radyasyon gruplarının ÇBİ değerleri ise kontrol grubuna göre anlamlı şekilde azalmıştır. Fullerenol ve radyasyon kombine uygulamalarında, 1 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik fullerenol gruplarında; 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları ÇBİ değerini 1 Gy radyasyon grubuna göre anlamlı şekilde arttırarak sırası ile % 20 ve % 14 oranında koruma sağlamıştır. 24 saatlik fullerenol gruplarında aynı şekilde 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları ÇBİ değerini anlamlı şekilde arttırarak sırası ile % 18 ve % 21 oranında koruma sağlamıştır. 2 Gy radyasyona maruz bırakılan 1 saatlik fullerenol gruplarında; tüm konsantrasyonlar ÇBİ değerini 2 Gy radyasyon grubuna göre anlamlı şekilde arttırarak sırası ile % 8, % 16 ve % 22 oranında koruma sağlamıştır. 24 saatlik fullerenol gruplarında aynı şekilde tüm konsantrasyonlar ÇBİ değerini anlamlı şekilde arttırarak sırası ile % 14, % 16 ve % 20 oranında koruma sağlamıştır. Her iki radyasyon dozunda, 24 saatlik fullerenol uygulamasının 1 saatlik uygulamaya göre gerek MN frekansı gerekse ÇBİ açısından daha yüksek koruma sağladığı tespit edilmiştir. Benzer bir çalışmada Mrdanovic ve ark. (2009), fullerenolün MMC ile indüklenmiş mikronükleus oluşumuna etkisini in vitro olarak incelemiş ve MN frekansının fullerenol dozuna bağımlı olarak azaldığını bildirmiştir. Bizim çalışmamızda ise 1 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 24 saat önce ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat önce fullerenol ile muamele edilen gruplarda; MN frekansının doza bağımlı olarak azaldığı ve bu azalmaya bağlı olarak radyasyona karşı sağlanan korumanın doza bağımlı olarak artış gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca 1 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 24 saat önce ve 2 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat ve 24 saat önce fullerenol ile muamele edilen gruplarda ÇBİ’nin ve radyasyona karşı sağlanan korumanın doza bağımlı olarak artış gösterdiği tespit edilmiştir. γ-H2AX testi ile yürüttüğümüz çalışmalarımızda da mikronükleus testinde olduğu gibi 1 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat önce ve 24 saat önce fullerenol ile muamele 115 edilen gruplarda; tüm fullerenol konsantrasyonları hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayısını anlamlı şekilde azaltmıştır. 1 saatlik fullerenol uygulamasında 100, 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları radyasyona karşı sırası ile % 20, % 30 ve % 27 oranında koruma sağlamıştır. 24 saatlik fullerenol uygulamasında ise sırası ile % 21, % 19 ve % 26 oranında koruma sağlanmıştır. 2 Gy radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat ve 24 saat önce fullerenol ile muamele edilen gruplarda; tüm fullerenol konsantrasyonları hücre başına düşen ortalama fokus sayısını anlamlı şekilde azaltmıştır. 1 saatlik fullerenol uygulamasında 100, 200 ve 400 µg/L’lik fullerenol konsantrasyonları, radyasyona karşı, sırası ile % 32, % 20 ve % 23 oranında koruma sağlamıştır. 24 saatlik fullerenol uygulamasında ise sırası ile % 35, % 33 ve % 20 oranında koruma sağlanmıştır. 1 Gy radyasyon için 1 saatlik fullerenol uygulamasının, 2 Gy radyasyon için ise 24 saatlik fullerenol uygulamasının daha yüksek koruma sağladığı tespit edilmiştir. Brown ve ark. (2010) tarafından yürütülen benzer bir çalışmada fulleren türevlerinden biri olan DF-1 bileşiğinin in vitro radyoprotektif etkisini incelenmiş ve DF-1 bileşiğinin doza bağımlı olarak γ-H2AX fokus sayısını azalttığı belirtilmiştir. Bizim çalışmamızda, radyasyona maruz bırakılmadan 1 saat ve 24 saat önce fullerenol ile muamele edilen grupların hücre başına düşen ortalama γ-H2AX fokus sayısının anlamlı şekilde azaldığı tespit edilmiştir. Fullerenol’ün etkilerine dair yürütülen çeşitli enzimatik çalışmalar da bulunmaktadır. Örneğin, Cai ve ark. (2010), radyasyona maruz bırakılmadan önce belli aralıklarla, intraperitonal yoldan fullerenol uygulanan farelerin karaciğerlerindeki hücre içi ROS, H2O2, SOD, GSH ve MDA miktarlarını incelemişlerdir. Elde edilen sonuçlara göre; radyasyon öncesi fullerenol ile muamele edilen farelerde oksidatif stres belirteçlerinden ROS, H2O2 ve MDA miktarlarının, fullerenol uygulanmayan gruplara göre daha düşük olduğu bildirilmiştir. Diğer taraftan radyasyon uygulamsı öncesi fullerenol ile muamele edilen farelerdeki SOD ve GSH miktarlarının radyasyona maruz bırakılmayan kontrol grubunun SOD ve GSH miktarları ile aynı düzeyde olduğu belirtilmiştir. Böylece fullerenolün, radyasyon ile indüklenmiş ROS’ları giderici etkisi olduğu dolayısıyla da hücre içi antioksidan enzimlerin aktivitelerini arttırıcı etki gösterdiği ifade edilmiştir 116 Fulleren türevlerinin göstermiş olduğu koruyucu etki temel olarak iki farklı mekanizma ile açıklanmaktadır. Direkt mekanizmada, C60 kafesinin yapısında bulunan 30 çift bağın teorik olarak 60 radikal tutabildiği belirtilmiştir (Wang ve ark. 1999). Anderson ve Barron (2005), fullerenolün poli-anyonik karbon kafesinin proton donörü ya da akseptörü olarak davranabildiğini ve bu özelliği ile reaktif oksijen türlerine karşı yüksek afinite gösterdiğini bildirmiştir. Andrievsky ve ark. (2009), C60 fulleren hidratlarının (C60HyFn) çok daha etkili indirekt bir antiradikal mekanizmaya sahip olduğunu bildirmiştir. Andrievsky ve ark. (2009)’na göre; C60HyFn hidrofilik özelliği sayesinde sulu ortamlarda uzun mesefali ve düzenli su katmanları oluşturmaktadır. Suyun radyolizisi ile oluşan serbest radikallerin difüzyonu büyük ölçüde bu düzenli ve viskoz su katmanları tarafından sınırlandırılmaktadır. Dolayısıyla C60HyFn ile düzenlenmiş sulu ortamda oluşan serbest radikaller mekansal olarak birbirlerinden ayrılamamakta ve hızlıca rekombine olarak bazı nötral moleküllere dönüşmektedir. 10−9 – 10−11 M konsantrasyon aralığındaki oldukça seyreltik sulu fulleren çözeltilerinde bir C60HyFn molekülünün yaklaşık olarak 103 – 104 gibi müthiş miktarlardaki OH● radikalini nötralize edebilme yeteneğinde olduğu belirtilmiştir. Kanser ve diğer bazı hastalıkların tedavisinde halen en etkili olan yöntemlerden biri radyoterapidir. Radyoterapinin amacı özetle, normal dokuya minimum hasar vererek kanserli hücrelerin yok edilmesidir (Perez ve Brady 1998). Bu anlamda, normal dokunun radyasyondan korunmasına yönelik çeşitli çalışmalar yapılmış ve radyasyona karşı koruyucu etki gösteren bazı ajanlar bulunmuş olmakla birlikte bu ajanların çoğunun yüksek toksisitelerine dayalı yan etkileri nedeniyle sınırlı kullanım alanına sahip olduğu belirtilmiştir (Maisin 1998, Capizzi ve Oster 2000, Kalpana ve ark. 2009). Çalışmamızda kullanılan fullerenol nanopartikülü ise uygulanan üç farklı dozda herhangi bir genotoksik etki göstermemiştir. Bunun yanında, fullerenol nanopartikülünün üç farklı dozunu ve iki farklı uygulama süresini kullanarak yaptığımız in vitro çalışmalarda radyasyona karşı % 35’e varan oranlarda koruma sağlanmıştır. Gerek in vivo gerekse in vitro modellerle yapılan çalışmalarda, herhangi bir toksik etkisinin gözlenmemesi ve serbest radikalleri etkili bir şekilde gidermesi dolayısıyla fullerenol nanopartiküllerinin radyoterapide koruyucu ya da genel antioksidan olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. 117 KAYNAKLAR Aardema, J.M., Kirsch-Volders, M. 2001. The in vitro micronucleus assay. In Choy WN, eds. Genetic toxicology and cancer risk assesment. New York. Marcel Dekker: 163 – 186 Ahmad, A., Robinson, A.R., Duensing, A., Van Drunen, E., Beverloo, H.B., Weisberg, D.B., Hasty, P., Hoeijmakers, J.H., Niedernhoffer, L.J. 2008. ERCC1- XPF endonuclease facilitates DNA doublestrand break repair. Mol Cell Biol; 28: 5082 – 5092 Akın, A. 1981. Temel Nükleer Tıp. A.Ü. Tıp Fakültesi yayını: 476 – 519 Akkuş, İ. 1995. Serbest Oksijen Radikalleri ve Fizyopatolojik Etkileri. Mimoza Basım Yayın ve Dağıtım, Konya: 1 – 15 Algüneş, Ç. 2002. Radyasyon Biyofiziği.1. Basım. Trakya Üniversitesi Yayınları, Edirne No: 51: 59 – 62 Ali, S.S., Hardt, L.L., Dugan, L.L. 2008. SOD activity of carboxyfullerenes predicts their neuroprotective efficacy: a structure-activity study. Nanomedicine xx: 1 – 12 doi:10.1016/j.nano.2008.05.003; 2008. Altaf, M., Auger, A, Covic, M., Cote, J. 2009. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol; 87: 35 – 50 Anderson, R., Barron, A.R. 2005. Reaction of hydroxyfullerene with metal salts: a route to remediation and immobilization, J. Am. Chem. Soc. 127: 10458 – 10459 Andrievsky, G.V., Klochkov, V.K., Derevyanchenko, L.I. 2005. Is C60 fullerene molecule toxic?! Fullerenes, Nanotubes Carbon Nanostruct 13: 363 – 376. Andrievsky, G.V., Bruskov, V.I., Tykhomyrov, A.A., Gudkov, S.V. 2009. Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects of hydrated C60 fullerene nanostuctures in vitro and in vivo. Free Radical Biology & Medicine 47: 786 – 793 Arora, S., Rajwade, J.M., Paknikar, K.M. 2012. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour, Toxicology and Applied Pharmacology 258: 151 – 165, Şekil 1 Bal, W., Protas, A.M., Kasprzak, K.S. 2011. Chapter 13. Genotoxicity of metal ions: chemical insights. Metal ions in toxicology: effects, interactions, interdependencies. Metal Ions in Life Sciences. 8. RSC Publishing: 319 – 373 Batty, D.P., Wood, D.W. 2000. Damage recognition in the nucleotide excision repair of DNA. Gene 241: 193 – 204 118 Becker, L., Poreda, R.J., Bada, J.L. 1996. Science 272: 249 – 252 Bennett, L.M. 1999. Breast cancer: genetic predisposition and exposure to radiation. Mol Carcinog 26: 143 – 149 Berroud, A., Le Roy, A., Voisin, P. 1996. Membrane Oxidative Damage Induced by Ionizing Radiation Detected by Flourescence Polarization. Radiat. Environ. Biophysics, 35: 289 – 295 Bogdanovic, V., Stankov, K., Icevic, I., Zikic, D., Nikolic, A., Solajic, S., Djordjevic, A., Bogdanovic, G. 2008. Fullerenol C60(OH)24 effects on antioxidative enzymes activity in irradiated human erythroleukemia cell line, J. Radiat. Res. 49: 321 – 327 Bohr, V.A., Smith, C.A., Okumoto, D.S., Hanawalt, P.C. 1985. DNA repair in an active gene: removal of pyrimidine dimers from the DHFR gene of CHO cells is much more efficient than in the genome overall. Cell 40: 359 – 369 Bollum, F.J., Andregg, J.W., Mcelya, A.B., Potter, V.R. 1960. Nucleic Acid Metabolism in Regenerating Rat Liver VII. Effect of X-Radiation on Enzymes of DNA Synthesis. Cancer Research. 20: 138 – 143 Bosi, S., Da Ros, T., Spalluto, G., Prato, G. 2003. Invited Review: Fullerene derivatives: an attractive tool for biological applications. European Journal of Medicinal Chemistry 38: 1 – 3 Brant, J.A., Labelle, J., Robichaud, C.O., Wiesner, M. 2007. Fullerenol cluster formation in aqueous solution. Implication for environmental release, J. Colloids Interface Sci. 314: 281 – 288 Brown, A.P., Chung, E.J., Urick, M.E., Shield, W.P., Sowers, A.L., Thetford, A., Shankavaram, U.T., Mitchell, J.B., Citrin, D.E. 2010. Evaluation of the fullerene compound DF-1 as a radiation protector. Radiation Oncology 2010, 5(34): 1 – 9 Buseck, P.R., Tsipursky, S.J., Hettich, S. 1992. Science 257: 215 – 217 Buzea, C., Pacheco, I., Robbie, K. 2007. Nanomaterials and Nanoparticles: Sources and Toxicity. Biointerphases 2(4): 17 – 71 Cai, X., Hao, J., Zhang, X., Yu, B., Ren, J., Luo, C., Li, Q., Huang, Q., Shi, X., Li, W., Liu, J. 2010. The polyhydroxylated fullerene derivative C60(OH)24 protects mice from ionizing-radiation-induced immune and mitochondrial dysfunction. Toxicology and Applied Pharmacology 243: 27 – 34 Capizzi, R.L., Oster, W. 2000. Chemoprotective and radioprotective effects of amifostine: an update of clinical trials. Int. J. Hematol. 72, 425 – 435 119 Cataldo, F., Da Ros, T., Milani, P. 2008. Carbon Materials: Chemistry and Physics. Volume 1: Medicinal Chemistry and Pharmacological Potential of Fullerenes and Carbon Nanotubes: 11 – 15, Şekil 1.1, 64 Cheng, T.J., Christiani, D.C., Xu, X., Wain, J.C., Wiencke, J.K., Kelsey, K.T. 1996. Increased micronucleus frequency in lymphocytes from smokers with lung cancer. Mutat Res; 349: 43 – 50 Chi, Y., Bhonsle, J.B., Canteenwala, T., Huang, J-P., Shiea, J., Chen, B-J., Chiang, L.Y. 1998. Novel watersoluble hexakis(4-sulfobutyl)fullerenes as potent free radical scavengers. Chem. Lett. 465 – 466 Chi, Y., Canteenwala, T., Chen, H.H.C., Jeng, U.S., Lin, T-L., Chiang, L.Y. 2002. Free radical scavenging and photodynamic functions of micelle-like hydrophilic hexa(sulfobutyl)fullerene (FC4S). Perspect. Fullerene Nanotechnol. 165 – 183 Chiang, L.Y., Lu, F-J., Lin, J-T. 1995. Free radical scavenging activity of water- soluble fullerenols. Chem. Commun. 1: 1283 – 1284 Choy, W.N. 2001. Genetic toxicology and cancer risk assessment. New York: Marcel Dekker: 163 – 186 Church, D.F., Pryor, W.A. 1985. Free Radical chemistry of cigerette smoke and its toxicological implications. Environ. Health Perspect; 64: 111 – 126 Cighetti, G., Duca, L., Bortone, L., Sala, S., Nava, I., Fiorelli, G, Cappellini, M.D. 2002. Oxidative Status and Malondialdehyde in β-thalassaemia Patients. Eıropean Journal of Clinical İnvestigation; 32: 55 – 601 Clarkson, P.M., Thompson, H.S. 2000. Antioxidants: What role do they play in physical activity and health ?. Am J Clin Nutr; 72: 637 – 646 Coggle, J.E. 1977. Biological Effects of Radiation. Wykeham Pubs. Ltd. London: 29 – 100 Colon, J., Hsieh, N., Ferguson, A., Kupelian, P., Seal, S., Jenkins, D.W., Baker, C.H. 2010. Cerium oxide nanoparticles protect gastrointestinal epithelium from radiation-induced damage by reduction of reactive oxygen species and upregulation of superoxide dismutase 2. Nanomedicine 6: 698 – 705 Cooper, G.M., Hausman, R.E. 2006. Hücre Moleküler Yaklaşım. Türkçe Çeviri. Üçüncü Baskı. İzmir Tıp Kitabevi, İzmir: 80 – 85, 192 – 230 Çıracı, S. 2005. Bilkent Ulusal Nanoteknoloji Araştırma Merkezi, Bilim ve Teknik Eki Yeni Ufuklar, 38(453): 1 – 10 Daly, T.K., Buseck, P.R., Williams, P., Lewis, C.F. 1993. Science 259: 1599 – 1601 120 De Boer, J., Hoeijmakers, J.H. 2000. Nucleotide excision repair and human syndromes. Carcinogenesis 21: 453 – 460 Debeleç, B.B., Kantarcı, G. 2006. Mutasyon, DNA Hasarı, Onarım Mekanizmaları, ve Kanserle İlişkisi. J Fac Pharm; 35(2): 149 – 170 Demirel, S., Zamani, A. 2002. MN tekniği ve kullanım alanları. Genel Tıp Dergisi; 12(3): 123 – 127 Devipriya, N., Sudheer, A.R., Srinivasan, M., Menon, V.P. 2008. Quercetin Ameliorates Gamma Radiation-Induced DNA Damage and Biochemical Changes in Human Peripheral Blood Lymphocytes. Mutation Research 654: 1 – 7 Dizdaroğlu, M., Jaruga, P., Birincioğlu, M., Rodriguez, H. 2002. Free Radical- Induced Damage To DNA: Mechanisms and Measurement. Free Radical Biology & Medicine, Vol. 32(11): 1102 – 1115, Şekil: 2 Dormandy, T.L. 1983. An approach to free radicals. Lancet; 322: 1010 – 1013 Duffaud, F., Orsiere, T., Villani, P., Pelissier, A.L., Volot, F., Favre, R. et al. 1997. Comparison between micronucleated lymphocytes rates observed in healthy subject and cancer patients. Mutagenesis; 12: 227 – 231 Eastmond, D.A., Tucker, J.D. 1989. Identification aneuploidy inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody. Environ Mol Mutagen; 13: 34 – 43 Farré, M., Pérez, S., Gajda-Schrantz, K., Osorio, V., Kantiani, L., Ginebreda, A., Barceló, D. 2010. First determination of C60 and C70 fullerenes and N- methylfulleropyrrolidine C60 on the suspended material of wastewater effluents by liquid chromatography hybrid quadrupole linear ion trap tandem mass spectrometry. Journal of Hydrology 383: 44 – 51 Fenech, M., Morley, A.A. 1986. Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: Effect of in vivo agening and dose X-irradiation. Mutat Res; 161: 193 – 198 Fenech, M. 2000. The in vitro micronucleus technique. Mutat Res; 455: 81 – 95 Feyman, R.P. 1999. The pleasure of finding things out. Helix Books Perseus Publishing, ISBN: 0-7382-0349-1 Cambridge, Massachusetts, 151 – 170 Fridovich, I. 2001. Oxidative Stres. Encyclopedia of Life Sciences. Nature Publishing Group Friedberg, E.C., Walker, G.C., Siede, W. 1995. DNA Repair and Mutagenesis. ASM Press, Washington: 91 – 453 121 Friedberg, E. C. 2003. DNA damage and Repair. Nature. 23(421): 436 – 440 Fujitani, Y., Kobayashi, T., Arashidanib, K., Kunugitab, N., Suemurac, K. 2008. Measurement of the Physical Properties of Aerosols in a Fullerene Factory for Inhalation Exposure Assessment. Journal of Occupational and Environmental Hygiene 5(6): 380 – 389 Garewal, H.S., Ramsey, L., Kaugars, G., Boyle, J. 1993. Clinical experience with the micronucleus assay. Cellular Biochem; 17: 206 – 212 Goorsell, D., Çıracı, S. 2000. Biomol. and Nanotech., American Scientist, 88(3): 230 Göksel, A. 1973. Radyasyonun Biyolojik Etkileri ve Radyasyon Korunması. İTÜ Matbaası: 126 – 184. Griffiths, Anthony, J.F. et al. 1999. "8: Chromosome Mutations: Chromosomal Rearrangements". Modern Genetic Analysis. W. H. Freeman and Company. ISBN 0- 7167-3118-5 Gutteridge, J.M.C. 1995. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage. Clin Chemistry; 41: 1819 – 1828 Halliwell, B., Gutterridge, J.M.C. 1984. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals anddisease.Biochem J.(219): 1 – 14 Halliwell, B., Gutterridge, J.M.C. 1989. Free radicals in biology and medicine. 2th Ed. Oxford: Clarendon Pres; 125 Halliwell, B., Gutterridge, J.M.C. 1990. Role of Free Radicals and Catalytic Metal İons in Human Disease: An overview. Methods Enzymol,; 49(3): 577 – 587 Heddle, J.A., Countryman, R.I. 1976. The production of micronuclei from chromosome aberration in irradiated cultures of human lymphocytes. Mutat Res; 41: 321 – 332 Hoeijmakers, J.H. 1993. Nucleotide excision repair II: from E.coli to yeast. Trends Genet 9: 211 – 217 Hoyt, V.W., Mason, E., 2008. Nanotechnology: emerging health issues. J. Chem. Health Saf. 15: 10 – 15 Högstedt, B., Karlsson, A. 1985. The size of micronuclei in human lymphocytes varies according to inducing agent used. Mutat Res; 156: 229 – 232 Hunter, R.J., Preedy, V.R. 2011. Nanomedicine in Health and Disease: 101 – 103, 214 Şekil 1 122 International Atomic Energy Agency, 2001. Cytogenetic analysis for radiation dose assessment - a manual, in: Technical Reports Series; 405: 81 – 86 Ismail, I.H., Hendzel, M.J. 2008. Review: The γ -H2A.X: Is It Just a SurrogateMarker of Double-Strand Breaks or Much More ? Environmental and Molecular Mutagenesis; 49: 73 – 82 Ja Borm, P., Robbins, D., Haubold, S., Kuhlbusch, T., Fissan, H., Donaldson, K., Schins, R., Stone, V., Kreyling, W., Lademann, J., Krutmann, J., Warheit, D., Oberdorster, E., 2006. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC: 2 – 5 Kaplan, Ş.Ş., Karanfil, T., Kitiş, M. 2007. Nanomateryallerin Potansiyel Çevresel Etkileri, 7. Ulusal Çevre Mühendisliği Kongresi (Yaşam Çevre Teknoloji): 2 – 3 Kaya, T., Adapınar, B., Özkan, R. 1996. Radyasyon Sağlığı ve Radyasyondan Korunma. Temel Radyoloji Tekniği. Eskişehir: Güneş & Nobel Tıp Kitabevi: 118 – 137 Keeney, S. et al. 1997. "Meiosis-specific DNA double-strand breaks are catalyzed by Spo11, a member of a widely conserved protein family". Cell 88(3): 375 – 384 Kinnula, V.L., Paakko, P., Soini, Y. 2004. Antioxidant enzymes and redox regulating thiol proteins in malignancies of human lung. FEEBS: 1 – 6 Kirsch-Volders, M., Elhajouji, A., Cundari, E., Van Hummelen, P. 1997. The in vitro micronucleus test: a multi-endpoint assay to detect simultaneously mitotic delay, apoptosis, chromosome breakage, chromosome loss and non-disjunction. Mutat Res; 392(1-2): 19 – 30 Kirsh-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M.J., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surrallés, J., Vanhauwaert, A., Wakata, A. 2003. Report from the in vitro micronucleus assay working group, Mutat. Res.; 540: 153 – 163 Kiss, L.B., Söderlund, J., Niklasson, G.A., Granqvist, C.G. 1999. New approach to the origin of lognormal size distributions of nanoparticles. Nanotechnology 10: 25 – 28 Klug, W.S., Cummings, M.R. 2002. Genetik Kavramlar. Altıncı Baskıdan Türkçe Çeviri. Palme Yayıncılık. Ankara: 477 – 481 Krishna, G., Hayashi, M. 2000. In vivo rodent micronucleus assay: protocol, conduct and data interpretation. Mutat Res; 455: 155 – 166 Krug, H.F., Kern, K., Wrle-Knirsch, J.M. 2006. Diabate in Nanomaterials - Toxicity, Health and Environmental Issues, (Ed.: C. Kumar), Wiley-VCH, Weinheim, (5)200: 153 – 185 123 Krusic, P.J., Wasserman, E., Keizer, P., Morton, J.R., Preston, K.F. 1991. Radical reactions of C60. Science 254: 1183 – 1185 Kulaksız, G., Sancar, A. 2007. Nükleotid Eksizyon Onarımı ve Kanser. Türk Biyokimya Dergisi; 32(3): 104 – 111 Kurutaş, B.E., İnanç, G.F., Kılınç, M. 2004. Serbest Radikaller. Arşiv; 13: 113 – 120 Li, G.M. 2008. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res; 18: 85 – 98 Lin, H.S., Lin, T.S., Lai, R.S., D’Rosario, T., Luh, T.Y. 2000. Fullerenes as a new class of radioprotectors. Int. J. radiat. Biol; 77(2): 235 – 239 Lipscomp, M., Cotran, R., Robbins, S. 1992. Environmental Diseases. Basic pathology. 5th ed. Philadelphia; W. B. Saunders: 217 – 274 Liu, Z., Kiessling, F., Gatjens, J. 2010. Advanced Nanomaterials in Multimodal Imaging: Design, Functionalization and Biomedical Applications. Hindawi Publishing Corporation Journal of Nanomaterials: 6 – 7, Şekil 3 – 4 Lodish, H. et al. 2000. "12.5: Recombination between Homologous DNA Sites: Double-Strand Breaks in DNA Initiate Recombination". Molecular Cell Biology. W. H. Freeman and Company. ISBN 0-7167-3136-3 Lorge, E., Lambert, C., Gervais, V., Becourt-Lhote, N., Delongeas, L., Claude, N. 2007. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation. Part II: Performances of the in vitro micronucleus test compared to the mouse lymphoma assay and the in vitro chromosome aberration assay. Toxicol Sci; 96(2): 214 – 217 Löbrich, M., Shibata, A., Beucher, A., Fisher, A., Ensminger, M., Goodarzi, A.A., Barton, O., Jeggo, P.A. 2010. γ-H2AX foci analysis for monitoring DNA double- strand break repair. Strengths, limitations and optimization. Landes Bioscience 2010, Cell Cycle 9(4): 662 – 669 Maisin, J.R. 1998. Bacq and Alexander Award lecture – chemical radioprotection: past, present, and future prospects. Int. J. Radiat. Biol. 73, 443 – 450 Marcon, E., Moens, P.B. 2005. "The evolution of meiosis: recruitment and modification of somatic DNA-repair proteins". Bioessays 27(8): 795 – 808 Markovic, Z., Trajkovic, V. 2008. Review: Biomedical potential of the reactive oxygen species generation and quenching by fullerenes (C60). Biomaterials 29: 1 – 13 Martin, L.J. 2008. DNA Damage and Repair: Relevance to Mechanisms of Neurodegeneration. J Neuropathol Exp Neurol; 67(5): 377 – 387 124 Meram, İ., Aktaran, Ş. 2002. Serbest Radikallerin Biomoleküller Üzerine Etkileri. Arşiv;11: 299 Mirkov, S.M., Djordjevic, A.N., Andric, N.L., Andric, S.A., Kostic, T.S., Bogdanovic, G.M., Vojinovic-Miloradov, M.B., Kovacevic, R.Z. 2004. Nitric oxide- scavenging activity of polyhydroxylated fullerenol, C60(OH)24. Nitric Oxide 11: 201 – 207 Mrdanovic, J., Solajic, S., Bogdanovic, V., Stankov, K., Bogdanovic, G., Djordjevic, A. 2009. Effects of fullerenol C60(OH)24 on the frequency of micronuclei and chromosome aberrations in CHO-K1 cells. Mutation Research 680: 25 – 30 Munshi, A., Hobbs, M., Meyn, R.E. 2005. Clonogenic Cell Survival Assay. Methods in Molecular Medicine, vol. 110: Chemosensitivity: Vol. 1: In Vitro Assays Edited by: R.D. Blumenthal © Humana Press Inc., Totowa, NJ Müftüoğlu, M. 2003. DNA Tamiri ve Erken Yaşlanma Sendromları. Türk Biyokimya Dergisi; 28(1): 20 – 24, Şekil: 1 Niwa, Y., Iwai, N. 2006. Genotoxicity in cell lines induced by chronic exposure to water-soluble fullerenes using micronucleus test, Environ. Health Prev. Med. 11: 292 – 297 Norbury, C.J., Hickson, I.D. 2001. Cellular responses to DNA damage. Annu Rev Pharmacol Toxicol 41: 367 – 401 Nordberg, J., Arner, E.S.J. 2001. Reactive Oxygen Species, Antioxidants and The Mammalian Thioredoxin System. Free Radical Biology and Medicine; 31(11): 1287 – 1317 Olive, P.L., 1998. The Role of DNA Single and Double Strand Breaks in Cell Killing by Ionizing Radiation. Radiation Research. 150: 42 – 51 Onur, E., Tuğrul, B., Bozyiğit, F. 2009. DNA Damage and Repair Mechanisms. Türk Klinik Biyokimya Dergisi; 7(2): 61 – 70 Özalpan, A. 2001. Temel Radyobiyoloji. Haliç Üniversitesi Yayınları, İstanbul ISBN: 975-8574-00-0: ? Özdemir, T., Demiral, A. 2001. Radyasyonun akciğer üzerine etkileri. Türk Onkoloji Dergisi 16: 36 – 41 Özkan, A., Fışkın, K. 2004. Serbest Oksijen Radikalleri, Karsinogenez ve Antioksidant Enzimler. Türk Hematoloji Onkoloji Dergisi; 14: 52 – 60 Pandey, B.N., Mishra, K.P. 2003. Oxidative Membrane Damage and Its Involvement in Gamma Radiation- induced Apoptotic Cell Death. Iran. J. Radiat. Res, 1(1): 17 – 22 125 Peltomaki, P. 2001. DNA mismatch repair and cancer. Mutat Res; 488: 77 – 85 Perez, A.C., Brady, L.W. 1998. Principles and Practice of Radiation Oncology (3rd) Prasad, N.R., Menon, V.P., Vasudev, V., Pugalendi, K.V. 2005. Radioprotective Effect of Sesamol on γ-Radiation Induced DNA Damage, Lipid Peroxidation and Antioxidants Levels in Cultured Human Lymphocytes. Toxicology 209: 225 – 235 Priyadarsini, K.I. 1997. Free radical reactions of curcumin in membrane models. Free Radic Biol Med 1997(23): 838 – 843 Prosser, J.S., Moquet, J.E., Lloyd, D.C., Edwards, A.A. 1988. Radiation Induction of micronuclei in human lyphocytes. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 199(1): 37 – 45 Quick, K.L., Ali, S.S., Arch, R., Xiong, C., Wozniak, D., Dugan, L.L.A. 2008. Carboxyfullerene, S. O. D. mimetic improves cognition and extends the lifespan of mice. Neurobiol. Aging 29: 117 – 128. Rawson, P.S. 1984. Ceramics. University of Pennsylvania Press. ISBN 0-8122-1156-1 Riboni, R.E., Botta, E., Stefanini, M., Numata, M., Yasui, A. 1992. Identification of the eleventh complementation group of UV-sensitive excision repair defective rodent mutants. Cancer Res 52: 605 – 607 Rzigalinski, B.A. 2005. Nanoparticles and cell longevity. Technol Cancer Res Treat 2005; 4(6): 651 – 659 Salles, B., Calsou, P., Mirey, G. 2011. DNA-PK, a Pharmacological Target in Cancer Chemotherapy and Radiotherapy? J Cancer Sci Ther S8(001): 3, Şekil 2 Schmid, W. 1975. The micronucleus test. Mutat Res; 31: 9 – 15 Seaton, A., Donaldson, K. 2005. Nanoscience, nanotoxicology, and the need to think small. Lancet; 365: 923 – 924 Shrivastav, M. et al. 2008. "Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice". Cell Research 18: 134 – 147 Singh, N., Manshian, B., Jenkins, G.J.S., Griffiths, S.M., Williams, P.M., Maffeis, T.G.G., Wright, C.J., Doak, S.H. 2009. NanoGenotoxicology: The DNA damaging potential of engineered nanomaterials, Biomaterials 30: 3891 – 3914, Şekil 3 Sluphaug, G., Kavli, B., Krokan, H.E. 2003. The interacting pathways for prevention and repair of oxidative DNA damage. Mutat Res; 531: 231 – 251 126 Srinivasan, M., Prasad, N.R., Menon, V.P. 2006. Protective effect of curcumin on γ- radiation induced DNA damage and lipid peroxidation in cultured human lymphocytes. Mutation Research. 611: 96 – 103 Stopper, H., Müler, O.S. 1997. Micronuclei as a biological endpoint for genotoxicity: A Minireview. Toxicol In Vitro; 11: 661 – 667 Sung, P., Klein, H. 2006. "Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions". Nature Reviews Molecular Cell Biology 7(10): 739 – 750 Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H., Marcos, R. 1995. Induction of micronuclei by five pyrethroid ınsecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures. Mutat Res; 341: 169 – 184 Şekeroğlu, V., Zülal Atlı-Şekeroğlu, Z. 2011. Derleme: Genotoksik hasarın belirlenmesinde mikronükleus testi. Turk Hij Den Biyol Derg, 2011; 68(4); Syf: 241 – 252, Şekil: 50 – 54 Taketo, M.M., Edelmann, W. 2009. Mouse Models of Colon Cancer. Gastroenterology. Volume 136, Issue 3: 780 – 798, Şekil: 5 Taner, A.C. 2009. İyonlaştırıcı Radyasyonların Biyolojik Etki Mekanizmaları. Türkiye Atom Enerjisi Kuırumu 2009. http://www.taek.gov.tr/bilgi-kosesi/radyasyondan- korunma/283-iyonlastirici-radyasyonun-biyolojik-etkileri.html Titenko-Holland, N., Windham, G., Kolachana, P., Reinisch, F., Parvarham, S., Osorio, A.M. et al. 1997. Genotoxicity of malathion in human lymphocytes assessed using the micronucleus assay in vitro and in vivo: a study of malathion-exposed workers. Mutat Res; 388(1): 85 – 95 Trajkovic, S., Dobric, S., Djordjevic, A., Dragojevic-Simic, V., Milovanovic, Z. 2005. Radioprotective Efficiency of Fullerenol in Irradiated Mice. Materials Science Forum Vol. 494: 549 – 554 Troelstra, C., Van Gool, A., De Wit, J., Vermeulen, W., Bootsma, D., Hoeijmakers, J.H. 1992. ERRC6, a member of a subfamily of putative helicases, is involved in Cockayne’s syndrome and preferential repair of active genes. Cell 71: 939 – 953 Tsurimoto, T. 1998. PCNA, a multifunctional ring on DNA. Biochim Biophys Acta 1443; 23 – 39 Tubiana, M., Dutreix, J., Wambersie, A. 1990. An Introduction to Radiobiology. Taylor & Francis Ltd, London: 270 127 Türk Nöroşirürji Derneği, 2007. Nanoteknoloji ve Nöroşirürji, Ocak 2007(14): 53, http://www.turknorosirurji.org.tr/pdf/nanotekn.pdf Urso, M.L., Clarkson, M.P. 2003. Oxidative stres, exercise, and antiooxidant supplemetation. Toxicology; 189: 41 – 54 Van Attikum, H., Gasser, S.M. 2009. Review: Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends in Cell Biology; 19(5): 1 – 11, Şekil 2 Van Gant, D., Hoeijmakers, J.H., Kanaar, R. 2001. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nature Rev. Genet. 2: 196 – 205, Şekil 3 Vanparys, P., Vermeiren, ., Sysmans, M., Temmerman, R. 1990. The micronucleus assay as a test for the detection of aneugenic activitiy. Mutat Res; 244: 95 – 103 Von Ledebur, M.M., Schmid, W. 1973. The micronucleus test: Methodological aspects. Mutat Res; 19: 109 – 117 Wang, J.X., Zhang, L.A., Li, B.X. 2002. Cancer incidence and risk estimation among medical x-ray workers in China, 1950 – 1995. Health Phys 82: 455 – 466 Wang, Z. 2001. Translesion synthesis by the UmuC family of DNA polymerases. Mutation Research/DNA Repair. Volume 486(2): 59 – 70, Şekil 2 Watters, G.P., Smart, D.J., Harvey, J.S., Austin, C.A. 2009. H2AX phosphorylation as a genotoxicity endpoint. Mutation Research; 679: 50 – 58 Widel, M., Kolosza, Z., Jedrus, S., Lukaszczyk, B., Raczek-Zwierzycka, K., Swierniak, A. 2001. Micronucleus assay in vivo provides significant prognostic information in human cervical carcinoma: The updated analysis. Int J Radiat Biol; 77: 631 – 636 Wilstermann, A.M., Osheroff, N. 2001. Base Excision Repair Intermediates as Topoisomerase II Poisons. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 276(49); Issue of December 7: 2, Şekil 1 Witte, P., Beuerle, F., Hartnagel, U., Lebovitz, R., Savouchkina, A., Sali, S., Guldi, D., Chronakis, N., Hirsch, A. 2007. Water-solubility, antioxidant activity and cytochrome C binding of four families of exohedral adducts of C60 and C70. Org. Biomol. Chem. 5: 3599 –3613 Yıldırım, H. 1985. Biyofizik. Anadolu Üniversitesi Basımevi, Eskişehir: 321 – 324 Yılmaz, A. 2006. Proteinlerin Yürüdüküklerini Keşfeden Bir Yıldızımız, Bilim ve Teknik, 460: 66 – 69 128 Yırtıcı, Ü. 2007. Tartrazinin Cyprinus carpio’daki genotoksik etkisinin MN yöntemi ile araştırılması. Yüksek Lisans Tezi, Erciyes Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, 2007. Young, I.S., Woodside, J.V. 2001. Antioxidants in health and disease, J Clin Pathol; 54: 176 – 186 Zakharenko, L.P.I., Zakharov, K., Vasyunina, E.A., Karamysheva, T.V., Danilenko, A.M., Nikiforov, A.A. 1997. Determination of genotoxicity of fullerene C60 and fullerol by the somatic mutation and recombination test in Drosophila melanogaster and SOS chromotest, Russ. J. Genet. 33: 327 – 330 Zhang, Y., Rohde, L.H., Emami, K., Hammond, D., Casey, R., Mehta, S.K., Jeevarajan, A.S., Pierson, D.L., Wu, H. 2008. Suppressed expression of non-DSB repair genes inhibits gamma-radiation induced cytogenetic repair and cell cycle arrest. DNA Repair (Amst); 7: 1835 – 1845 Zhang, Y., Rohde, L.H., Wu, H. 2009. Involvement of Nucleotide Excision and Mismatch Repair Mechanisms Current Genomics; 10(4) http://www.epa.gov/apti/bces/module3/category/category.htm 129 ÖZGEÇMİŞ Adı Soyadı : Mümün COŞKUN Doğum Yeri ve Tarihi : Kırcaali/BULGARİSTAN – 27.08.1985 Yabancı Dili : İngilizce Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl) Lise : Bursa Erkek Lisesi / 2000 – 2004 Lisans : E.Ü. F.E.F. Biyoloji Bölümü Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji/ 2005 – 2009 Yüksek Lisans : U.Ü. F.B.E. Biyoloji A.B.D. Genel Biyoloji B.D./ 2009 – 2013 SCI ve SCI Expanded Kapsamında Taranan Dergilerde Yayınlanmış Makaleler: Cavaş, T., Cinkilic, N., Vatan, O., Yilmaz, D., Coşkun, M. 2012. İn vitro Genotoxicity Evaluationof Acetamiprid in CaCo2 Cells Using the Micronucleus, Comet and Gamma-H2AX Foci Assays. Pesticide Biochemistry and Physiology, 104: 212-217 Uluslararası Bilimsel Toplantılarda Sunulan ve Bildiri Kitabında Özeti Basılan Bildiriler: Cinkilic, N., Cavas, D., Yilmaz, D., VATAN, O., Tuzun, E., Coskun, M. 2010. Evaluation of River Water Genotoxicity in Cultured Human Lymphocytes Using the Micronucleus Test and The Comet Assay. Genotoxicity in aquatic systems; Causes, effects and future needs. 3 rd International Symposium. 22-24 September 2010 Freiburg im Breisgau, Germany. Ulusal Bilimsel Toplantılarda Sunulan ve Bildiri Kitabında Özeti Basılan Bildiriler: Çavaş, T., Çinkılıç, N., Vatan, Ö., Çoşkun, M. 2011. Nano C60 Sulu Süspansiyonlarının İn vitro Genotoksik Etkilerinin İnsan Akciğer Fibroblast Hücre Hattı IMR 90 Üzerinde İncelenmesi. 12. Ulusal Tıbbi Biyoloji ve Genetik Kongresi 27-30 Ekim 2011 Antalya, Türkiye. 130